PT701455E - Solucao semelhante a plasma - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Solução semelhante a plasma"

Cdinuu do invento O presente invento refere-se genericamente ao campo das soluções aquosas tais como soluções semelhantes a plasma utilizadas para perfundir um sujeito vivo que necessite de perfusão e que actuem como substitutos eficazes do sangue. O presente invento refere-se também a métodos de preservação da integridade biológica dos órgãos de um organismo mamífero dador (tal como mostrado pela superior integridade anatómica de órgãos e tecidos criopreservados de sujeitos perfundidos com a solução do presente invento) e a métodos de manutenção de um sujeito parcial ou substancialmente, completamente exangue a temperaturas substancialmente abaixo das normalmente mantidas por um mamífero.

Antecedentes do Invento

Conhecem-se dois métodos de preservação clinicamente aplicados a órgãos: (1) perfusão inicial durante cerca de 5 min com subsequente armazenamento a frio (2°C) e (2) perfusão contínua utilizando soluções contendo albumina ou plasma.

Muitas das soluções utilizadas para perfusão inicial com subsequente armazenamento a frio baseiam-se nas soluções de Collins et al. (1969) Lancet 2: 1219 e Sacks et ai (1973) Lancet 1: 1024. Ross et al. (1976) Transplantation 21: 498 compararam a preservação renal canina após lavagem e armazenamento durante 72 horas em várias soluções. Verificou-se que apenas os rins preservados numa solução de citrato hipertónico (CH) (compreendendo em parte K+ 80 mM, citrato 55 mM, 400 mOsmol/kg, pH 7,1) sobreviviam após 72 horas. As soluções de Collins e Sacks continham em parte K+ 115-126 mM, 290-430 mOsmol/kg, pH 7,0-7,3. Wall et al. (1977) Transplantation 23: 210 relataram a preservação hipotérmica de fígados humanos durante até cerca de 4 horas numa solução compreendendo em parte 250 mg de dextrose e 15 mEq de fosfato de potássio. Bishop & Ross (1978) Transplantation 25: 235 relataram que a função renal era melhor preservada na

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86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ solução de CH de Ross et al. (1976) supra, em vez de noutras sõíuÇões disponíveis. Fischer et al. (1985) Transp/antation 39: 122 verificaram que uma nova solução de preservação para armazenamento isquémico hipotérmico (compreendendo em parte Na+ 110 mM, K' 115 mM, 400 mOsmol/kg, Golvcnts C2C, ΐ IEFE3 110 mivi) era superior a outras soluções em utilização clínica, incluindo as de Collins, Sacks e CH.

Entre as soluções utilizadas para perfusão contínua de órgãos, Belzer et al. (1985) Transplantation 39: 118 relataram uma solução desenvolvida de novo que preservava a função renal quando rins eram perfundidos durante 48 horas e armazenados durante 24 horas (compreendendo em parte gluconato de sódio 80 mM, 22 mEq/l de K + , 128 mEq/l de Na", adenosina 4,9 mM, HEPES 10 mM, glutationa 3,0 mM, 3,75 g% de albimuna, pH 7,45). Kallerhoff et al. (1985) Transplantation 39: 485 examinaram o efeito da temperatura no pH de órgãos continuamente perfundidos com duas soluções diferentes (Euro-Collins: Na" 10 mM, K+ 115 mM, glucose 198 mM, 406 mOsmol/l, pH 7,2 a 20°C; HTK: Na+ 15 mM, K+ 10 mM, triptofano 2,0 mM, histidina 180 mM, manitol 30 mM, 310 mOsmol/l, pH 7,3 a 8°C). A temperaturas de incubação entre 5°C-35°C, a solução HTK mantinha o pH a valores consistentemente mais elevados que a solução de Euro-Collins.

Klebanoff & Phillips (1969) Cryobiology 6: 121 descrevem uma perfusão exangue hipotérmica de cães perfundidos com lactato de Ringer tamponado a de 7,1 a 16°C. Segall et al. (Patente U.S. N° 4923442) descrevem um substituto do sangue capaz de manter um sujeito e os seus órgãos a temperaturas abaixo de 20°C possuindo quatro soluções diferentes - uma solução base, uma solução indutora de cardioplegia, uma solução de manutenção de cardioplegia e uma solução de reanimação. A solução base contém electrólitos em concentração fisiológica, um agente oncótico macromolecular, um tampão biológico convencional eficaz a pH fisiológico, açúcar e K+ variando entre 4-5 mEq. A solução indutora de cardioplegia tinha uma concentração de K+ de 25-45 mEq; a solução de manutenção de cardioplegia tinha uma concentração de K+ de 15-45 mEq; e a solução de reanimação tinha uma concentração de K+ de 6-10 mEq. Segall et al. (Patente U.S. N° 5130230) descreveram ainda o sistema de quatro soluções, onde a solução de reanimação contém 0-10 mEq de K~.

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86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ WO-A-9218136 divulga soluções únicas de perfusão que não contêm iões de potássio, mas que contêm um tampão biológico convencional.

Sumário do Invento

Este invento apresenta métodos de utilização de uma solução única adequada para manter vivo um sujeito parcial ou substancialmente completamente sem sangue a temperaturas normais ou a temperaturas substancialmente abaixo das normalmente mantidas por um mamífero, geralmente inferiores a 37-38°C e superiores a -2°C, compreendendo níveis subfisiológicos e/ou fisiológicos de K" e Mg + ^; fisiológicos de Na", Ca ++, Cl'; um agente oncótico macromolecular; um ácido carboxílico orgânico ou sal deste; e um açúcar. A solução do presente invento pode ser utilizada como uma extensão do plasma à temperatura corporal normal. A solução do presente invento também é útil para manter a vida ou a integridade biológica de um sujeito perfundido e/ou dos seus órgãos durante e após exposição a condições hipotérmicas profundas. A solução pode também ser utilizada para manter um sujeito eutérmico num ambiente pressurizado com uma concentração aumentada de oxigénio até 100% de 02 durante períodos de tempo suficientes para permitir um restabelecimento adequado dos componentes sanguíneos do sujeito. A solução de acordo com o presente invento pode ser utilizada para perfundir e arrefecer um sujeito mamífero a temperaturas profundamente hipotérmicas em relação à temperatura normal do sujeito. A solução pode ser utilizada para manter o sujeito em hipotermia profunda durante longos períodos de tempo, normalmente mais de uma hora, da qual um sujeito intacto pode recuperar sem aparentes efeitos de doença duráveis.

Uma característica distintiva importante da solução do presente invento é a de que não requer soluções múltiplas para ser eficazmente administrada a um sujeito para fins de substituição do sangue, ou manutenção a temperatura baixa de um sujeito mamífero. A solução do presente invento pode ser utilizada em todas as fases de extensão do plasma ou substituição do sangue.

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Outra característica distintiva importante da solução do presente invento é a característica de uma quantidade subfisiológica de K+ em todos os passos da administração. Este requisito reduz o risco de suficiência cardíaca induzida por hipercaliemia que resulta em transfusão de sangue em primatas e humanos.

Outra característica distintiva importante da solução do presente invento é a ausência de um tampão biológico convencional. A ausência de um tampão biológico convencional na solução confere a importante vantagem médica de permitir que a solução seja esterilizada terminalmente pelo calor sem degradação dos componentes da solução. A solução do presente invento requer a presença de um ácido carboxílico orgânico, sal ou ésteres de cadeia curta deste. O ácido carboxílico orgânico, sal ou éster deste é um componente do sistema tampão dinâmico da solução capaz de manter uma gama de pH biologicamente apropriada quando utilizado num mamífero. A solução do presente invento requer a presença de um agente oncótico macromolecular suficiente para manter uma pressão osmótica fisiológica. O agente oncótico macromolecular utilizado na solução do presente invento pode ser (uma) proteína(s) ou amido(s).

Uma vantagem da solução é a de que esta pode ser utilizada num sujeito mamífero durante todas as fases da substituição do sangue desde a lavagem inicial do sangue do sujeito até à substituição total de todo, ou substancialmente todo, o sangue circulante.

Uma característica do presente invento é a de que este pode ser utilizado para manter um mamífero sem sangue e também durante reperfusão com sangue.

Descrição Detalhada das Concretizações Preferidas

Deve ser notado que tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem os correspondentes plurais a não ser que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma formulação" inclui misturas de diferentes formulações e a

5 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ referência a "ο método de tratamento" inclui referência a passos e métodos equivalentes conhecidos dos peritos na arte, e daí em diante.

Excepto quando definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na arte ao qual este invento pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste do presente invento, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

Os glóbulos vermelhos de primatas contêm elevadas concentrações de ião potássio (K + ). Quando o sangue de primatas é armazenado (tal como é o caso com virtualmente todo o sangue obtido de bancos de sangue), mesmo baixos níveis de lise dos glóbulos vermelhos resulta geralmente em elevadas concentrações de ião potássio. Isto deve-se à libertação de ião potássio do interior dos glóbulos vermelhos lisados dos primatas para o plasma que circunda as células. De forma concordante, o sangue será hipercaliémico quando infundido. 0 nível elevado de potássio pode ser difundido se o sangue for infundido em doentes com suficiente sangue em circulação uma vez que a elevada concentração de potássio é diluída. No entanto, o problema aumenta se o sangue de primatas for transfundido para uma solução de manutenção do tipo descrito na Patente U.S. 4924442, a qual contém elevadas concentrações de potássio. A concentração de ião potássio no sangue transfundido não será diluída para níveis seguros. Como resultado, pode ocorrer, e frequentemente ocorre, insuficiência cardíaca. A hipercaliemia está também associada a danos nos tecidos como resultado de queimaduras, acidentes, cirurgia, quimioterapia e outros traumatismos físicos. A arte anterior ensina que a preservação dos órgãos a baixas temperaturas requer a presença de elevadas concentrações de ião potássio para a manutenção da integridade dos tecidos. A solução de acordo com o presente invento contém uma quantidade subfisiológica de potássio. Assim, a solução permite a diluição da concentração de ião potássio em sangue transfundido armazenado. Como resultado, elevadas concentrações de ião potássio e potenciais arritmias cardíacas e insuficiência cardíaca causadas por estas podem mais facilmente ser controladas. A solução contendo uma quantidade subfisiológica de potássio é também útil para fins de substituição de sangue e manutenção de baixas temperaturas num sujeito. Por 6 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ "quantidade subfisiológica de potássio" entenda-se entre 0-5 mEq/l de K+ (0-5 mM), de preferência 2-3 mEq/l de K+ (2-3 mM). A solução do presente invento compreende uma mistura de materiais os quais, quando coiocados em solução aquosa, podem ser utilizados para perfundir um sujeito que os necessite. Enquanto que os materiais podem ser proporcionados como uma mistura seca à qual é adicionada água antes de esterilização por calor, a solução é de preferência proporcionada na forma de uma solução aquosa estéril. A solução do presente invento pode ser utilizada como uma solução única para todas as fases de procedimentos em que o sangue de um sujeito é removido e substituído ou um sujeito é arrefecido. Tais fases incluem hemodiluição ou extensão do plasma a temperaturas corporais normais, substituição e troca do sangue a temperaturas corporais hipotérmicas, substituição do sangue a temperaturas corporais substancialmente hipotérmicas, e aquecimento do sujeito. "Temperaturas corporais hipotérmicas" definem-se como 4-5°C abaixo das temperaturas corporais normais de 37-38°C. Por outras palavras, uma condição hipotérmica pode ser considerada como começando a temperaturas corporais de cerca de 32-35°C. "Temperaturas corporais substancialmente hipotérmicas" definem-se como temperaturas corporais imediatamente abaixo do ponto de congelação (-2°C) até cerca de 10°C. Por isso, as expressões "temperatura corporal hipotérmica" ou "hipotermia" tal como aqui utilizadas englobam temperaturas corporais de cerca de -2 a 3°C até cerca de 32-35°C. A solução do presente invento não inclui um tampão biológico convencional. Por "tampão convencional" entenda-se um composto que em solução, in vitro, mantém o pH numa determinada gama. Por "tampão biológico convencional" entenda-se um composto que num sistema isento de células mantém o pH na gama biológica de 7-8. Exemplos de tampões biológicos convencionais incluem ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2- hidroxipropanossulfónico (HEPES), ácido 3-(N-morfolino)propanossulfónico (MOPS), ácido 2-([2-hidroxi-1,1 -bis(hidroximetil)etil]amino)etanossulfónico (TES), ácido 3-[N-tris(hidroxi-metil)metilamino]-2-hidroxietil]-1- piperazinopropanossulfónico (EPPS), Tris[hidrolilmetil]aminometano (THAM) e Tris[hidroxilmetil]metilaminometano (TRIS). Os tampões biológicos 7 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ convencionais funcionam independentemente dos processos biológicos normais, p. ex., o tampão convencional não é metabolizado in vivo, e são mais potentes em sistemas isentos de células. A soiução do presente invento utiliza componentes biológicos normais para manter um pH biológico in vivo, um conceito denominado um "sistema de tamponamento dinâmico". 0 conceito de sistema de tamponamento dinâmico baseia-se na verificação, pelos inventores, de que compostos sem qualquer capacidade intrínseca de tamponamento na gama biológica, tais como lactato, capazes de ser metabolizados in vivo, actuam com outros componentes da solução para manter um pH biologicamente apropriado num animal, mesmo a temperaturas hipotérmicas e em condições essencialmente sem sangue. O sistema de tamponamento dinâmico do presente invento depende em parte da oxigenação e remoção de dióxido de carbono (C02); e permite mas não requer bicarbonato adicional (NaHC03). O tampão dinâmico do presente invento não tem, ou substancialmente não tem, qualquer capacidade para actuar como tampão fora de um sistema biológico, i.e., um tampão dinâmico mantém o pH na gama biológica in vivo mas não num ambiente isento de células. Um componente do sistema de tamponamento dinâmico do presente invento inclui um ácido carboxílico, um seu sal ou éster. Entenda-se por um ácido carboxílico, sal ou éster deste um composto possuindo a fórmula estrutural geral RCOOX, onde R é um alquilo, alcenilo ou arilo, de cadeia ramificada ou linear, contendo 1 a 30 carbonos, carbonos esses que podem ser substituídos, e de preferência uma das cadeias de carbonos que compõem a cadeia de carbonos de lactato, acetato, citrato, piruvato ou outros metabolitos biológicos; e X é hidrogénio ou sódio ou outro substituinte iónico biologicamente compatível que se possa ligar à posição do oxigénio, ou é um alquilo de cadeia curta, linear ou ramificada, contendo 1-4 carbonos, p. ex., -CH3, -CH2CH3.

Tal como mostrado na Tabela 1, uma solução tampão convencional típica (TRIS 25 mM) que tem um pH inicial de cerca de 7,7, mantém um pH acima de 7,2 com a adição de até 0,12 ml de uma solução de HCI 1,25 M. Em contraste, o pH de uma solução HLB (pH inicial 7,7) baixa abaixo de 7,2 com a adição de cerca de 0,01 ml de uma solução de HCI 1,25 M.

Quando a solução do presente invento é utilizada como um substituto do sangue a temperaturas hipotérmicas, é adicionado NaHC03 estéril de grau 8 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ médico à solução esterilizada pelo calor (solução HL). A solução contendo NaHC03 é chamada solução HLB. A capacidade de tamponamento da solução HLB em relação a um tampão biológico convencional num sistema isento de células é mostrada na Tabela 1. Sob condições in vivo com oxigenação, verificcu-cs que c solução !!LB mani.inha um pH acima de 7,3 em temperaturas que variavam de 1,6-36,1°C (Tabelas 2 e 3).

Quando a solução do presente invento é utilizada como uma extensão do plasma a temperaturas corporais normais, o pH in vivo é mantido na gama biológica sem a adição de NaHC03. A ausência de um tampão biológico convencional na solução do presente invento confere a importante vantagem médica de permitir que a solução seja terminalmente esterilizada pelo calor. Geralmente, é preferível que as soluções médicas sejam terminalmente esterilizadas pelo calor antes da utilização num doente. A expressão "terminalmente esterilizada pelo calor" ou "esterilizada pelo calor" tal como aqui utilizado refere-se ao processo que envolve o aquecimento de uma solução a 120°C durante 15 minutos sob pressão, i.e., mantendo condições de calor e pressão durante um período de tempo suficiente para matar todas ou substancialmente todas as bactérias e inactivar todos ou substancialmente todos os vírus da solução. Este procedimento é normalmente efectuado numa autoclave e também é conhecido como "autoclavagem". A finalidade da esterilização pelo calor é matar possíveis agentes infecciosos presentes na solução. Sabe-se que os agentes infecciosos toleram temperaturas até 100°C. É normalmente considerado na arte que o aquecimento de uma solução sob pressão a 120°C durante cerca de 15 minutos é suficiente para assegurar esterilidade.

Nenhuma das soluções de transplante ou substitutos de sangue que os inventores conhecem tolera esterilização terminal pelo calor. Sabe-se que a esterilização pelo calor de uma solução possuindo um pH acima de 7,0 resulta em substancial degradação de outros componentes da solução.

Pelo contrário, a solução do presente invento é concebida para ser esterilizada pelo calor com degradação mínima de outros componentes da solução, tais como açúcar. A solução HL é esterilizada pelo calor antes da utilização. Quando é desejável adicionar NaHCQ3 para formar a solução HLB, o 9 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ

NaHC03 é adicionado como uma solução 1 M estéril comercialmente disponível a uma solução HL estéril. Geralmente, são adicionados 5 ml de uma solução de NaHC03 1 M por litro de solução HL para formar 1 I de solução HLB. No entanto, pode ser adicionado mais NaHC03. A solução HLB do presente invento, ou os seus ácidos e sais orgânicos de tamponamento, podem também ser utilizados para manter tecidos e células de cultura in vitro. O sistema de tamponamento dinâmico da solução mantém tecidos e células de cultura ao pH biológico apropriado. Nós mostrámos que a adição de lactato e bicarbonato a células de cultura é suficiente para manter um crescimento e uma morfologia celulares normais. A solução do presente invento inclui um ácido carboxílico orgânico ou um seu sal. 0 termo "ácido carboxílico orgânico ou sal deste" inclui qualquer ácido carboxílico ou derivado de ácido carboxílico capaz de ser metabolizado pelo mamífero. Exemplos de ácidos carboxílicos e sais de ácidos carboxílicos adequados para utilização na solução do presente invento inclui lactato e lactato de sódio, citrato e citrato de sódio, gluconato e gluconato de sódio, piruvato e piruvato de sódio, succinato e succinato de sódio, e acetato e acetato de sódio. Nos Exemplos seguintes que descrevem a utilização de solução HLB, é utilizado lactato de sódio. Quando metabolizado in vivo, o lactato ajuda a manter os níveis de bicarbonato e funciona por isso como um componente do sistema de tamponamento dinâmico da solução para manter um pH biológico in vivo.

Para fins da posterior descrição do presente invento, a mistura de acordo com o presente invento será discutida como uma solução aquosa. A partir da seguinte descrição do presente invento, espera-se que um vulgar perito na arte seja capaz de proporcionar a mistura como uma mistura seca e faça os ajustamentos para quantidades de cloreto de sódio e sal orgânico de sódio conforme necessário para acomodar as quantidades de cloreto de sódio que se encontram em solução salina normal, a qual pode ser utilizada como diluente para a mistura seca de acordo com o presente invento. A quantidade de sais orgânicos de sódio é calculada de forma a considerar a concentração de iões sódio presentes no sangue do sujeito bem como a concentração de cloreto de sódio de qualquer solução à qual são adicionados os componentes secos. É adicionada uma quantidade de forma a 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ 10 que a concentração de ião sódio obtida a partir do sal orgânico de sódio seja suficiente para trazer a concentração de ião sódio na solução para uma concentração semelhante à do plasma fisiologicamente normal. Por isso, quando tida em conta a quantidade ou concentração de ião sódio obtido a partir do sal orgânico de sódio e cloreto de sódio, a concentração de ião sódio na solução é semelhante à concentração de ião sódio verificada no plasma fisiologicamente normal. A solução inclui também uma concentração de iões cálcio, sódio e magnésio a qual se encontra dentro da gama de concentrações fisiológicas normais dos referidos iões no plasma. Em geral, a concentração desejada destes iões obtém-se a partir dos sais cloreto dissolvidos, de cálcio, sódio e magnésio, e no caso do sódio, a partir de um sal orgânico dissolvido de sódio que também está em solução. A concentração de ião sódio está de preferência numa gama de 70 mM a cerca de 160 mM, sendo preferível numa gama de cerca de 1 30 a 150 mM. A concentração de ião cálcio está numa gama de cerca de 0,5 mM a 4,0 mM, de preferência numa gama de cerca de 2,0 mM a 2,5 mM. A concentração de ião magnésio está numa gama de 0 a 10 mM, de preferência numa gama de cerca de 0,3 mM a 0,45 mM. É importante não incluir quantidades excessivas de ião magnésio na solução de acordo com o presente invento porque elevadas concentrações de ião magnésio afectam negativamente a força da actividade contráctil cardíaca. Numa concretização preferida do invento, a solução contém quantidades subfisiológicas de Mg + + . A concentração de ião cloreto está na gama de 70 mM a 160 mM, de preferência na gama de 110-125 mM de Cl'. A solução inclui também uma quantidade de um açúcar hexose simples tal como glucose, frutose e galactose, dos quais a glucose é preferida. Na concretização preferida do presente invento são utilizados açúcares hexose nutritivos e pode ser utilizada uma mistura de açúcares. Em geral, a concentração de açúcar está numa gama entre 2 mM e 10 mM sendo preferida uma concentração de glucose de 5 mM. Às vezes, é desejável aumentar a 11 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ concentração de açúcar hexose de forma a diminuir a retenção de fluidos nos tecidos de um sujeito. Assim a gama de açúcar hexose pode ser estendida até cerca de 50 mM, se necessário, para prevenir ou limitar edema no sujeito em tratamento. 0 agente oncótico é constituído por moléculas cujo tamanho é suficiente para impedir a sua perda da circulação através da passagem através das fenestrações do leito capilar para os espaços intersticiais dos tecidos do corpo. Como grupo, os agentes oncóticos são exemplificados por extensores do plasma sanguíneo. A albumina de soro humano é uma proteína do plasma sanguíneo utilizada para expandir o volume plasmático. São também conhecidos polissacáridos, geralmente caracterizados como polímeros de glucano que são utilizados como extensores do plasma sanguíneo. Em geral, é preferível que o polissacárido não seja antigénico.

Hetastarch (McGaw, Inc.) é um colóide artificial derivado de um amido ceroso composto quase exclusivamente por amilopectina com grupos de éter hidroxietílico introduzidos nas unidades de glucose ligadas em alfa(1—4). As propriedades coloidais de uma solução a 6% (p/p) de Hetastarch aproximam-se às da albumina de soro humano. Outros derivados polissacarídeos podem ser adequados como agentes oncóticos nas soluções de acordo com o invento incluindo polímeros de alfa (1—4) ou (1—6) hidroximetilo. As ciclodextrinas são agentes oncóticos adequados.

Podem ser utilizados polímeros de D-glucose. Por exemplo, o dextrano, que é D-glucose predominantemente ligada por ligação alfa (1—6), pode ser utilizado como o agente oncótico na solução do invento. São preferidos polissacáridos tais como dextrano numa gama de pesos moleculares de 30000 a 50000 daltons (D). O Dextrano 40 é o mais preferido, possuindo um peso molecular de cerca de 40000 D.

Polissacáridos de elevado peso molecular, tais como o Dextrano 70, possuindo um peso molecular de cerca de 70000 D, são geralmente menos preferidos porque aumentam a viscosidade da solução coloidal, impedindo assim elevados caudais. No entanto, para algumas utilizações, são preferidas soluções 12 12

86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ de dextrano de elevado peso molecular por serem mais eficazes na prevenção de inchaço de tecidos devido aos seus baixos caudais de fuga dos capilares. Assim, tais soluções de dextrano de elevado peso molecular são particularmente úteis no tratamento de isquemia cerebral a tensões de oxigénio hiperbáricas s nc gestão efiud^ cio edema cerebral. Em tais circunstâncias, pode ser desejável utilizar um polissacárido de peso molecular mais elevado tal como um dextrano na gama de pesos moleculares de 50000 a 70000 D.

Quando é utilizado Dextrano 40 nas soluções de acordo com o presente invento, são utilizados cerca de 8% de Dextrano 40 (p/p) ou cerca de 80 gramas (g) por litro (I) de água. A molaridade do substituto do sangue de acordo com o invento estará na gama de cerca de 290 a 330 miliMolar, sendo preferível uma molaridade de cerca de 300. É mais preferida uma molaridade final de cerca de 298 mM. A concentração do polissacárido é suficiente para alcançar (quando tomada em conjunto com sais cloreto de sódio, cálcio e magnésio, ião orgânico do sal orgânico de sódio e açúcar hexose discutidos acima) uma pressão osmótica coloidal que se aproxima da do soro humano normal, cerca de 28 mm de Hg. A solução pode ser utilizada como uma solução em circulação, em conjunto com oxigénio ou oxigénio hiperbárico, a temperaturas corporais normais, ou com ou sem oxigénio hiperbárico em sujeitos durante procedimentos. A solução pode também ser utilizada como uma solução em circulação em sujeitos durante procedimentos onde a temperatura corporal do sujeito é significativamente reduzida abaixo da temperatura normal do sujeito. Quando sujeitos de sangue quente são expostos a condições de baixa temperatura durante procedimentos cirúrgicos e em doação de órgãos de cadáveres a baixa temperatura, é geralmente desejável substituir o sangue do sujeito pela solução de circulação fria do invento, ou circular a solução durante um tempo, que foi concebida para perfundir e manter o sujeito e os seus órgãos intactos durante o procedimento. A solução do presente invento pode ser administrada intravenosamente ou intra-arterialmente a um sujeito eutérmico que é colocado numa atmosfera pressurizada de concentração de oxigénio aumentada até 100% de oxigénio ou 13 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ a um sujeito alvo de um procedimento durante o qual a temperatura corporal do sujeito é significativamente reduzida abaixo da temperatura normal do sujeito quer seja utilizado ou não oxigénio hiperbárico. Enquanto a solução está a ser administrada e feita circular através do sujeito, podem ser administrados vários agcr.tss taiõ comu agentes cardioplégicos, ou directamente no sistema circulatório do sujeito, administrados directamente ao miocárdio do sujeito, ou adicionados à solução em circulação do presente invento. Estes componentes são adicionados para se alcançar efeitos fisiológicos desejados tais como manutenção de actividade contráctil cardíaca regular, paragem de fibrilhação cardíaca ou inibição completa da actividade contráctil do miocárdio ou músculo cardíaco.

Os agentes cardioplégicos são materiais que causam paragem da contracção do miocárdio e incluem anestésicos tais como lidocaína, procaína e novocaína, e catiões monovalentes tais como ião potássio em concentrações suficientes para alcançar inibição contráctil do miocárdio. As concentrações de ião potássio suficientes para alcançar este efeito são geralmente superiores a 1 5 mM.

Durante a reanimação de um sujeito (após um período de temperatura subnormal ou manutenção criogénica utilizando a solução de acordo com o invento para manter o sujeito) o sujeito pode ser reinfundido com uma mistura da solução de acordo com o invento em conjunto com sangue retirado do sujeito ou obtido de dadores de sangue. À medida que o sujeito é aquecido, é infundido sangue completo até o sujeito alcançar um hematócrito aceitável, geralmente hematócritos superiores a cerca de 30%. Quando é alcançado um hematócrito aceitável, a perfusão é interrompida e o sujeito é reanimado após a sutura de feridas cirúrgicas utilizando procedimentos convencionais.

Em geral, a solução de acordo com o invento é administrada utilizando uma linha intravenosa (quando o sujeito está à temperatura normal) ou a um sujeito arrefecido utilizando um aparelho de circulação bombeada tal como uma bomba centrífuga, uma bomba rolante, uma bomba peristáltica ou outra bomba de circulação conhecida e disponível. 0 aparelho de circulação é ligado ao sujeito através de uma cânula inserida cirurgicamente em veias e artérias apropriadas. Quando a solução é administrada a um sujeito arrefecido, esta é 14 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ sujeito geralmente administrada através de uma cânula arterial e removida do através de uma cânula venosa, e descartada ou armazenada. A solução pode ser utilizada numa variedade de cenários e procedimentos cirúrgicos. Fouc ser úiii em neurocirurgia delicada onde campos cirúrgicos claros são imperativos e uma actividade reduzida do sistema nervoso central pode ser desejável e alcançada efectuando o procedimento num doente cuja temperatura central e/ou temperatura cerebral tenha sido substancialmente reduzida. A solução pode ser utilizada para manter um sujeito (o qual perdeu uma quantidade significativa de sangue, p. ex. 20% a 98% do seu sangue) a temperaturas corporais normais num ambiente pressurizado a uma concentração de oxigénio aumentada acima da tensão atmosférica de oxigénio, até 100% de oxigénio. O sujeito é mantido numa concentração de oxigénio elevada até que suficientes componentes do sangue possam ser sintetizados pelo sujeito para suportar a vida à pressão e concentração de oxigénio atmosféricas. A solução de acordo com o invento pode ser utilizada para manter um sujeito a temperaturas abaixo da temperatura corporal normal e a uma taxa de metabolismo reduzida após um ferimento traumático que põe em perigo a vida, até que possam ser efectuados os procedimentos cirúrgicos de suporte ou correctivos apropriados. Adicionalmente, a solução pode ser utilizada para manter um doente possuindo um tipo raro de sangue ou tecido até que possa ser encontrado um dador compatível apropriado e possam ser obtidas unidades de sangue ou outro órgão de substituição.

Surpreendentemente, verificou-se que é possível substituir substancialmente todo o sangue em circulação de um sujeito mamífero pela solução de acordo com o invento e manter o sujeito vivo sem reinfundir sangue no sujeito. Considera-se que substancialmente todo o sangue em circulação de um sujeito mamífero é substituído quando o hematócrito do sujeito desce abaixo dos 10%. O hematócrito pode ser inferior a 10% se for proporcionado ao sujeito 02 ou substancialmente inferior a 10% numa câmara de 02 hiperbárica. A solução de acordo com o invento pode evidentemente ser utilizada para manter um sujeito possuindo um hematócrito superior a 10%. 15 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ Ο procedimento para substituição de substancialmente todo o sangue em circulação de um sujeito mamífero pode ser efectuado com a temperatura corporal do sujeito mamífero sendo mantida à sua temperatura substancialmente normal. Adicionalmente, o procedimento pode ser efectuado com arrefecimento do sujeito e redução da temperatura corporal do sujeito mamífero abaixo da sua temperatura normal. O arrefecimento pode ser alcançado arrefecendo o sujeito num banho de gelo, numa lama de gelo-sal ou com um cobertor de arrefecimento. 0 sujeito pode ainda ser arrefecido arrefecendo a solução de acordo com o presente invento antes da perfusão do sujeito com a solução.

No procedimento de acordo com o presente invento para substituição de substancialmente todo o sangue em circulação de um sujeito mamífero, é preferido que o sujeito seja arrefecido e perfundido com a solução, utilizando um cateter arterial para distribuir a solução pelo sistema circulatório do sujeito e um cateter venoso para remover sangue e o perfundido do sujeito. Substancialmente todo o sangue em circulação do sujeito é removido desta forma tal como determinado através da medição do hematócrito do efluente do cateter venoso. Quando substancialmente todo o sangue em circulação do sujeito foi removido, a perfusão é parada.

Adicionalmente, o procedimento para substituição de substancialmente todo o sangue do sujeito pode ser efectuado com a ajuda de 02 hiperbárico. 0 sujeito é colocado numa câmara hiperbárica pressurizada com oxigénio a concentrações superiores a 20%, de preferência 100% de oxigénio. A pressão na câmara hiperbárica é mantida durante quase todo o procedimento na gama entre 0,5 libras por polegada quadrada acima da pressão atmosférica até cerca de duas vezes a pressão atmosférica. Numa concretização, o procedimento é efectuado com o sujeito numa câmara hiperbárica a pressões hiperbáricas de cerca de 0,07 a cerca de 2 atmosferas acima da pressão ambiente (0,5-30 libras por polegada quadrada [psi]) com 100% de oxigénio. Se necessário, a pressão da câmara hiperbárica pode ser reduzida para a pressão atmosférica durante a sutura da ferida. O sujeito é subsequentemente mantido a pressão hiperbárica a uma concentração elevada de oxigénio. A pressão é gradualmente reduzida para uma pressão menor mas ainda hiperbárica. De preferência, a pressão é mantida abaixo de 10 psi até cerca de 5 psi durante de várias horas a vários dias. Subsequentemente, a pressão é novamente diminuída gradualmente 16 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ esta pressão abaixo de 1 psi e de preferência até cerca de 0,5 psi e é mantida durante um período de tempo adicional de até um dia ou mais. A solução pode também ser utilizada para manter a integridade fisiológica de um sujeite dador de óiyãus imediatamente após a ocorrência de morte cerebral. O sujeito pode ser arrefecido, o sangue do sujeito removido e substituído por uma solução de circulação mantida abaixo de 37°C ou circulando ao mesmo tempo a solução fria de acordo com o presente invento. Através desta utilização da solução pode ser minimizada a isquemia dos órgãos vitais. Fazendo circular a solução fria de acordo com o invento através do sistema circulatório do sujeito a baixa temperatura colocando ou não o sujeito numa câmara de oxigénio hiperbárica, os órgãos vitais podem ser mantidos durante períodos de tempo mais longos, maximizando assim o número de órgãos de um dador que podem ser eficazmente utilizados para potenciais receptores de transplantes.

Noutro aspecto do invento, verificou-se que utilizando certos aductos, particularmente propanodiol e elevada concentração de glucose para aumentar a solução, pode ser possível reduzir a temperatura de órgãos de dadores e em particular corações de dadores, abaixo do ponto de congelação da água (0°C) e recuperá-los da congelação num estado útil, i.e. num estado capaz de manter contracção cardíaca coordenada. Para além disso, utilizando a solução de acordo com o invento com tais aductos, foi possível reduzir a temperatura de sujeitos dadores mamíferos intactos abaixo do ponto de congelação da água (0°C) e recuperá-los da congelação num estado capaz de manter contracção cardíaca coordenada. Acredita-se também que outros sistemas de órgãos sejam mantidos com um elevado grau de integridade biológica, i.e. num estado fisiológico capaz de manter a vida.

Os aductos à solução incluem poliálcoois alifáticos de baixo peso molecular. São preferidos dióis, exemplificados por etilenodiol, propanodiol e butanodiol. Destes dióis é particularmente preferido o propanodiol. Outros poliálcoois que podem ser adequados como aductos para baixa temperatura, preservação a sub-zero °C de órgãos e sujeitos dadores de órgãos são polietilenoglicóis de baixo peso molecular. É preferido neste aspecto do invento que o aducto seja adicionado à solução a uma concentração final na gama entre cerca de 0,2 Molar e 1 Molar. No que respeita ao propanodiol, é preferida em 17 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ particular uma gama de 0,2 M a 0,6 M. É preferível uma concentração dre ftrca de 0,4 M de propanodiol. É preferido o 1,2-propanodiol como aducto para a solução utilizada para preservação de órgãos e dadores a baixas temperaturas de acordo com o invento, embora possa ser utilizado o 1,3-propanodiol. A concentração de glucose na solução útil para preservação a sub-zero °C de órgãos e sujeitos dadores de órgãos varia entre cerca de 0,6 M e cerca de 1,4 M. É preferida uma concentração de cerca de 1 M de glucose.

Outro aducto que é útil na solução para preservação a baixas temperaturas e sub-zero °C de órgãos e tecidos de dadores de órgãos é o óxido de trimetilamina (TMAO). Pode ser adicionado TMAO à solução descrita imediatamente acima até uma concentração final na gama entre 0,2 M e 7 Μ. A solução incluindo TMAO quando perfundida num sujeito conduz a uma integridade biológica melhorada dos tecidos do sujeito tal como evidenciado através da superior preservação anatómica dos tecidos.

Pretende-se que os Exemplos seguintes ilustrem o invento e a sua utilização e os inventores não pretendem que sejam limitantes do presente invento.

EXEMPLOS O exemplo seguinte é apresentado de forma a proporcionar aos vulgares peritos na arte uma divulgação e descrição completas de como efectuar a síntese do invento e não se pretende que limite o âmbito do que os inventores consideram como o seu invento. Foram feitos esforços para assegurar exactidão no que diz respeito aos números utilizados (p. ex., quantidades, temperatura, etc.), mas deve ser tido em conta algum erro e desvio experimental. A menos que indicado em contrário, partes são partes por peso, peso molecular é peso molecular médio ponderado, temperatura é em graus Centígrados e pressão é ou está perto da pressão atmosférica.

Exemplo 1. Preparação de Soluções.

Preparação de 10 I de Solução A. Num recipiente apropriado, adicionar 80 g/l (ou 800 g para 10 litros) de Dextrano 40 isento de pirogénios 18 18

86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ (Pharmachem ou Pharmacia). Adicionar água desionizada, levando o volume até 6-9 litros. Dissolver completamente o Dextrano 40 por agitação. Os seguintes componentes podem ser adicionados em qualquer ordem, dissolvendo completamente cada um antes da adição do seguinte. Os seguintes reagentes podem ser cbtidcs a partir ue casas fornecedoras de produtos químicos; neste exemplo os reagentes listados foram obtidos de Sigma: NaCI (5,2 g/l), CaCI2 (0,29 g/l), MgCI2 (0,40 g/l), glucose (0,9 g/l), Tris (3,03 g/l) e gluconato de sódio (6,54 g/l). A seguir, a solução é levada a pH 7,80 à temperatura ambiente através da adição gota a gota de HCI 0,25 M ao mesmo tempo que se agita e monitoriza com um medidor de pH. A solução é então levada ao seu volume final desejado (i.e. 10 litros) através da adição de mais água desionizada.

Finalmente, a solução é bombeada através de um filtro de 0,2 μ (podem ser utilizadas unidades de filtro Gelman, Whatman ou idealmente Pall) para recipientes ou sacos estéreis. A solução engarrafada e tapada é armazenada em gelo até ser utilizada. , A solução pode então ser preparada como um pó seco estéril em recipientes adequados para preparação de soluções IV estéreis após criodessecação sob condições apropriadas.

Preparação de Solução HL. Para preparar 50 litros de solução HL (BioTime Hextend™-lactato), são adicionados 3,0 kg de Hetastarch (HES) de elevado peso molecular a 25 litros de água. É adicionado suficiente NaCI para levar a concentração final de NaCI a 6,72 g/l. A solução é agitada até ambos HES e NaCI estarem dissolvidos. A solução pode ser aquecida a 50°C se necessário. O volume total é levado a 45 litros e os seguintes componentes são adicionados e misturados até estarem completamente dissolvidos: CaCI2.2H20 18,5 g; MgCI2.6H20 4,5 g; KCI 11,0 g; glucose 45,0 g; e lactato de sódio 4,03 ml de uma solução a 60% (p/p). A solução é levada a um volume de 50 litros. A solução é filtrada para remover material não dissolvido e colocada em recipientes autoclaváveis e aquecida numa autoclave a uma temperatura de 120°C durante 15 minutos.

86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ 19

Solução HLB. A cada litro esterilizado pelo calor ou solução HL são adicionados 5 ml de uma solução 1 M estéril de NaHC03, grau médico, formando a solução HLB (BioTime Hextend™-lactato-bicarbonato).

Suiucão L. A soiuçáo l é preparada tal como descrito para a solução HL acima sem a adição de Hetastarch (HES).

Exemplo 2. Hamster reanimado após 1 hora de substituição gelada do sangue.

Um hamster (Mesocricetus auratus) fêmea de 41 g, com aproximadamente 1 mês de idade, foi injectado i.m. com 0,04 ml de Vetalar, uma solução 100 mg/ml do anestésico cetamina. O animal foi empacotado em gelo triturado e arrefecido até a sua temperatura rectal ser 10°C. O animal foi removido do gelo triturado e colocado com o lado ventral para cima num estrado concebido à medida posicionado de forma a que porções específicas do animal possam ser observadas através de um estereo-microscópio durante a cirurgia. Os seus membros foram presos e o animal foi instrumentado com cabos de EKG e uma sonda rectal de teletermómetro.

Foi feita uma incisão na região da virilha direita, e a veia femural direita, e depois a artéria femural direita, foram canuladas utilizando microcânulas especialmente concebidas cheias com solução A. Após a canulação, foram injectados no animal 0,02 ml de heparina (1000 U/ml) em solução A através da cânula venosa, a qual foi então tapada.

Após a canulação arterial femural direita, a cânula foi ligada a um segmento com ponta "luer" de tubagem de plástico estéril o qual foi ligado a uma torneira de passagem montada no estrado cirúrgico. A torneira de passagem foi ligada a outro segmento de tubagem o qual foi por sua vez ligado a um segmento de tubagem mais largo, grosso e mais complacente, que passa através da cabeça de uma bomba rolante. A extremidade deste segmento de tubagem mais largo continha um tubo para retirar fluido de um reservatório. Este tubo para retirar fluido de um reservatório aqui designado um "pick-up" foi concebido a partir da extremidade "luer" de uma agulha hipodérmica de calibre 18. Este "pick-up" foi coberto com material de filtragem de sangue o qual foi preso por um pequeno anel "O" de borracha. O "pick-up" foi inserido num reservatório de solução A compreendido por um tubo de centrífuga imerso em

86 322 ÍLà

EP 0 701 455/PT 7Z 20 . sr gelo triturado. Foram adicionados 0,06 ml de KCI 1 M à solução (15 ml), produzindo uma concentração molar de cerca de 4 mM de KCI. A linha foi fechada utilizando a torneira de passagem para evitar retorno do sangue para a cânula arterial. 0 hamster foi rodeado com gelo triturado e arrefecido a 4°C. Depois foram injectados 0,2 ml de KCI 1 M na torneira de passagem, a qual foi aberta para permitir que a solução injectada fluísse para a linha que liga à cânula arterial e a partir daí para a artéria femural do animal. O coração do hamster parou. Permitiu-se que o animal arrefecesse mais e foi perfundido através da cânula arterial com 8 ml de solução A KCI 4 mM. O efluente, contendo a maior parte do sangue do hamster, foi recolhido a partir da cânula venosa. Após o hematócrito ter descido abaixo de 5, a bomba rolante foi desligada durante 67 minutos. 0 hamster foi então perfundido através da cânula arterial com 8 ml de solução A sem KCI, seguido por 8 ml de sangue heparinizado retirado de outros hamsters por punção cardíaca. Foi recolhida uma quantidade igual de efluente da cânula venosa. Após o hematócrito ter excedido os 40%, a perfusão com sangue completo foi terminada e as cânulas removidas. 0 hamster foi aquecido com uma lâmpada de secretária até ficar reactivo a estímulos. As cânulas foram removidas, os vasos sanguíneos abertos ligados e as incisões fechadas. Foi continuado o reaquecimento. O animal recuperou totalmente e continuou a viver durante semanas após a experiência.

Exemplo 3. Preservação Cardíaca Após Armazenamento a Sub-zero.

Um hamster fêmea em jejum (de um dia para o outro), de 40 gramas, foi injectado, i.m., com 0,02 ml de anestésico Cetamina (100 mg/ml). O hamster foi imerso em gelo triturado até a sua temperatura corporal baixar para +14°C. Foi então colocado num estrado cirúrgico e instrumentado com cabos de EKG e uma sonda rectal de temperatura. A artéria carótida e veia jugular foram expostas cirurgicamente enquanto a temperatura corporal do animal era mantida entre 10-14°C e foram inseridas cânulas na artéria e na veia. A cânula arterial foi ligada a tubagem ligada a uma bomba peristáltica. A tubagem foi cheia com solução A, contendo em adição KCI 20 mM. A cânula venosa foi tapada até a

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86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ temperatura corporal do animal baixar para 5°C utilizando gelo triturado e um estrado com controlo de temperatura ajustado para -1,0°C. O animal parou de respirar por si quando a sua temperatura corporal caiu abaixe dos 1G"C. Foi iniciada respiração com 100% de 02. A 5°C, a tampa da cânula venosa foi removida e foram bombeados 3,5 ml de solução A para a artéria a um caudal de cerca de 0,3 ml/minuto. Após isto, foram infundidos 4,5 ml de uma solução crioprotectora composta por solução A e em adição KCI 4 mM, glucose 1,0 M, propanodioi a 4% (i.e. 1,8 g de glucose + 0,4 g de propanodiol por 10 ml de solução). Durante a perfusão, o efluente venoso foi recolhido. A temperatura do animal foi baixada gradualmente para 0°C durante a perfusão. A respiração foi interrompida 5 minutos após o início da perfusão. Neste momento, mais de 30% do volume de sangue do sujeito tinha sido removido. O coração continuou a bater até que eventualmente parou. Após a perfusão com a solução crioprotectora descrita no parágrafo anterior, o animal foi colocado numa solução pastosa de NaCI a sub-0°C (0,6 M) a qual foi colocada num congelador de um dia para o outro. A temperatura do congelador foi mantida a uma média de -5°C. Quinze minutos após o animal ter sido colocado no congelador, a sua temperatura rectal baixou de 0 para -1,0°C. A temperatura rectal do animal 12 horas mais tarde era -2,5°C. O animal foi então aquecido para uma temperatura de cerca de 2,5°C num forno de microondas de cozinha comercial Quasar utilizando pulsos de 7 segundos com regulação em morno. Os pulsos foram gerados com afastamento de 1 minuto. Foram necessários dezoito pulsos para descongelar o animal. O animal foi colocado novamente no estrado cirúrgico e instrumentado com cabos de EKG e uma sonda rectal de teletermómetro. Foram perfundidos três ml e meio de solução A para a artéria carótida a um caudal de aproximadamente 0,2 ml/min. A temperatura corporal do animal foi mantida abaixo de 5°C. O hamster foi então perfundido com sangue completo e gradualmente aquecido.

Após 2 ml de sangue terem sido infundidos e a temperatura do animal ter subido para 1 3°C, foram detectados sinais de EKG rítmicos. Com a continuação da perfusão e do aquecimento, a amplitude dos sinais tornou-se maior e estes

22 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ aumentaram de frequência. Após 5,5 ml de sangue terem sido infundidos e a temperatura do animal ter alcançado os 25°C, o peito do animal foi aberto e observou-se que o seu coração batia continuamente.

Exemplo Ί. Solução Sintética Gubalilui Sangue Numa Uamara Hiperbárica.

Um hamster de 40 g, previamente posto em jejum de um dia para o outro, foi injectado com 0,03 ml de Cetamina (100 mg/ml) i.m.. O hamster foi colocado em gelo triturado até a sua temperatura corporal baixar abaixo dos 15°C. O hamster foi removido do gelo triturado e colocado com o lado ventral para cima num estrado com controlo de temperatura posicionado para microcirurgia debaixo de um estereo-microscópio. A temperatura do hamster foi mantida entre 12-15°C.

Após uma incisão na área da virilha direita, a veia e a artéria femurais direitas foram expostas. A veia femural foi canulada, foram injectados 0,1 ml de heparina (1000 U/ml) e a cânula foi tapada para impedir hemorragia. A artéria femural direita foi então canulada e a cânula foi brevemente ligada a uma tubagem cheia com solução A. A tubagem foi enrolada através da cabeça de uma bomba peristáltica. Foi infundido um pequeno volume da solução (aproximadamente 0,3 ml) para manter a cânula arterial sem sangue. Ambas as cânulas venosa e arterial foram presas ao animal com sutura cirúrgica. A cânula arterial foi tapada e o animal foi movido para o estrado numa câmara de oxigénio hiperbárica (OHB). Foi inserida uma sonda de temperatura no recto. A cânula arterial foi ligada a uma tubagem que passava através de uma bomba peristáltica e para um reservatório. A tubagem e o reservatório foram cheios com solução A contendo KCI 4 mM. A tampa foi removida da cânula venosa e a câmara de OHB foi fechada e pressurizada. A bomba peristáltica foi ligada e o animal foi perfundido com solução, a qual substituiu a maior parte do seu sangue. Permitiu-se que este sangue drenasse do animal como um efluente venoso. A pressão final da 23 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ câmara era 1,5 atm acima da pressão ambiente, a qual foi mantida constante. 0 caudal da solução para o animal era cerca de 0,3 ml/min. 0 hamster foi mantido entre 14-16°C utilizando o estrado com controlo de temperatura no qual o hamster foi colocado na câmara de OHB. A actividade cardíaca e a respiração foram mantidas ao longo deste período durante a perfusão. Após terem sido perfundidos no hamster 15 ml de solução A contendo em adição KCI 4 mM substituindo o sangue, a câmara foi gradualmente despressurizada. A câmara foi então aberta e foi retirada uma amostra de hematócrito. O hematócrito era de 5%. As cânulas venosa e arterial foram tapadas e a câmara fechada e pressurizada para 1,5 atm acima da pressão ambiente. 0 animal continuou a respirar por si na câmara durante 4 horas após a remoção do seu sangue. Após este tempo, a câmara foi gradualmente despressurizada. Concomitantemente, o animal foi arrefecido para 12°C. A câmara foi aberta e o animal foi movido para outro estrado cirúrgico. Foi colocado gelo no animal e foi perfundido sangue completo no animal a um caudal de 0,2 ml/min, à medida que se permitia que a solução drenasse como efluente venoso.

Após ter sido infundido 1 ml de sangue, o gelo foi removido. A temperatura corporal do hamster estava nos 4°C. Permitiu-se então que o animal aquecesse gradualmente à medida que o hematócrito aumentava através de infusão contínua de sangue. A respiração artificial foi iniciada após ter sido reposto 1 ml de sangue. 0 coração do animal nunca parou de bater ritmicamente. Aos 21 °C o animal estava a respirar estavelmente por si. A respiração artificial foi interrompida e o aquecimento e a infusão de sangue continuaram até a temperatura do animal alcançar os 25°C. O hematócrito foi medido como sendo 40%. A perfusão foi interrompida, as cânulas removidas, os vasos sanguíneos ligados e as incisões cirúrgicas fechadas.

Uma hora após o procedimento, o animal estava muito activo e alerta. Quatro horas após a experiência, o animal comia e bebia. Vinte e quatro horas 24 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ depois do termo do procedimento acima descrito, parecia completamente normal no que diz respeito a postura e comportamento e continuou a viver durante semanas após a experiência.

Eaciiιμίυ 5. Substituição Geiaaa de Sangue de um Hamster.

Um hamster de 46 g, com aprox. 1 mês de idade, foi injectado i.m. com 0,02 ml de Vetalar, uma solução 100 mg/ml de cetamina. O animal foi rodeado de gelo triturado até a sua temperatura rectal ser cerca de 12°C. O animal foi então removido do gelo triturado e colocado com o lado ventral para cima num estrado operacional concebido para manter o animal frio, o qual está por baixo de um estereo-microscópio. Os seus membros foram presos e o animal instrumentado com cabos de EKG e uma sonda rectal de teletermómetro.

Foi feita uma incisão na região da virilha direita. Foi colocada uma cânula na veia femural direita e foram injectados no animal 0,02 ml de solução de heparina (250 U/ml) através da cânula que foi então tapada. Depois a artéria femural direita foi canulada. A cânula foi ligada a um segmento com ponta "luer" de tubagem de plástico e a tubagem foi passada através de uma bomba peristáltica rolante e para um reservatório contendo solução A contendo glucose 0,05 M. Na extremidade da tubagem foi inserida uma agulha hipodérmica 18G à qual foi presa uma malha de material de filtragem de sangue no eixo central através de um anel "O" de borracha. A bomba foi ligada e o fluido no reservatório foi bombeado através da tubagem para a artéria femural do animal. Quando a temperatura do animal caiu abaixo dos 9°C, foi iniciada a ventilação (a 20 respirações/minuto) utilizando 100% de oxigénio. O animal foi adicionalmente arrefecido para uma temperatura rectal de 4°C e foram injectados 0,1 ml de KCI 0,2 M para o angiocateter 24G que foi inserido na veia femural. Esta injecção parou o coração e os sinais de EKG pararam. A bomba foi ligada e a solução A foi perfundida para a artéria a aproximadamente 0,2 ml/min enquanto o efluente venoso era recolhido. Durante a perfusão a temperatura do animal desceu para perto de 1°C. Após terem sido perfundidos 4 ml de solução para o animal, a bomba foi desligada e o animal foi mantido rodeado de gelo triturado em paragem circulatória durante 2 horas. Depois o animal foi perfundido com aproximadamente 7 ml de sangue completo (que foi recolhido de outros hamsters dadores de sangue) enquanto o animal era gradualmente aquecido utilizando uma lâmpada de secretária. Durante a 25 86 322 EPO 701 455/PT perfusão foi recolhido o efluente venoso. O mesmo volume bombeado para a artéria é recolhido como efluente venoso. Aos 10°C, após o animal ter permanecido em paragem cardíaca durante 3 horas e 11 minutos, foram primeiramente observados batimentos cardíacos após monitorização dos sinais de CKG. A veiúiiação (õ respiraçoes/minuto) do animal foi então iniciada utilizando 100% de oxigénio. À medida que o animal era mais aquecido e os batimentos cardíacos se tornavam mais fortes e rápidos, esta taxa foi aumentada para cerca de 15 respirações/minuto. Quando a temperatura do animal estava acima de 28°C o animal começou a respirar por si e tornou-se responsivo. A perfusão foi interrompida (o hematócrito lia 44%) e as cânulas foram removidas e as feridas cirúrgicas foram fechadas. Este hamster permaneceu vivo aparentemente de saúde normal durante muitas semanas após a experiência.

Exemplo 6. Recuperação do Batimento Cardíaco num Hamster Gelado.

Um hamster fêmea mantido em jejum (de um dia para o outro), de 45 gramas, foi injectado i.m. com 0,03 ml de anestésico cetamina (100 mg/ml). O hamster foi imerso em gelo triturado até a sua temperatura corporal baixar para cerca de 14°C. O animal foi então colocado numa plataforma cirúrgica e instrumentado com cabos de EKG e uma sonda rectal de temperatura. A artéria carótida e a veia jugular foram expostas cirurgicamente utilizando um estereo-microscópio. A temperatura corporal do animal foi mantida entre 10-14°C. Foram inseridas cânulas na artéria carótida e na veia jugular. A cânula arterial foi ligada a uma tubagem que passava através de uma bomba peristáltica para um reservatório contendo solução crioprotectora composta por solução A contendo, em adição, KCI 11 mM, glucose 1,0 M e 4% de propanodiol. A cânula venosa foi inicialmente tapada até a temperatura corporal do animal ser baixada para 5°C utilizando gelo triturado e uma plataforma com regulação de temperatura regulada para perto de -1,0°C. O animal parou de respirar por si quando a temperatura corporal caiu abaixo dos 10°C. Neste momento o animal foi ventilado a cerca de 15 respirações por minuto com 100% de oxigénio. Quando a temperatura do animal caiu para 5°C, a tampa venosa foi removida e a bomba foi ligada a um caudal de cerca de 0,20 ml/minuto. O coração do animal parou de bater 21 minutos mais tarde e a ventilação foi interrompido 5 minutos após o início da 26 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ perfusão. Durante a perfusão o sangue foi recolhido como efluente venoso. Aproximadamente 4 ml da solução A crioprotectora foram infundidos no animal. Depois o animal foi rodeado por uma lama de sal-gelo cuja temperatura era de -2,0°C. 0 recipiente que continha a lama e o animal foi colocado dentro de um banho de temperatura reyuiauo para -ò,U°C. A temperatura rectal do animal baixou gradualmente para -3,4°C de manhã (18 horas após o animal ser colocado no banho de arrefecimento). O recipiente foi removido do banho de arrefecimento. A lama estava congelada e sólida. Foi derretida utilizando água gelada. Após remoção da "lama" o animal parecia congelado. O animal foi então colocado num forno de microondas de cozinha. O forno foi regulado em morno durante 7 segundos. O animal foi exposto a cerca de 20 ciclos de aquecimento de 7 segundos durante um período de 20 minutos. Isto descongelou o animal e aumentou a sua temperatura rectal para cerca de 2°C. 0 animal foi novamente colocado na plataforma cirúrgica e foi infundido na artéria carótida com solução A. A solução crioprotectora foi recolhida como efluente venoso. Cerca de 3 ml de solução A foram perfundidos no animal a um caudal de 0,15 ml/minuto. O sangue que foi recolhido de hamsters dadores de sangue foi então perfundido ao mesmo caudal. Após 2 ml de sangue terem sido perfundidos para a artéria do hamster, o hamster foi aquecido lentamente utilizando uma lâmpada de secretária. À medida que a perfusão e o aquecimento continuavam, a temperatura do animal subiu acima dos 1 5°C e foram registados fortes sinais de EKG rítmicos. Após toractomia cirúrgica puderam realmente ser observados batimentos cardíacos.

Exemplo 7. Soluções Sintéticas como Substituto de Sangue numa Câmara de Oxigénio Hiperbárica.

Um hamster fêmea de 43 gramas (em jejum de um dia para o outro) foi injectado, i.m., com 0,02 ml de cetamina (100 mg/ml). 0 hamster foi colocado em gelo triturado até a sua temperatura corporal baixar para cerca de 14°C. O hamster foi então colocado com o lado ventral para cima num estrado com controlo de temperatura posicionado para microcirurgia debaixo de um estereo-microscópio. A temperatura do hamster foi mantida entre 12-15°C. Após uma incisão na área da virilha direita, a veia e a artéria femurais direitas foram expostas. A veia femural foi canulada, foram injectados 0,1 ml de heparina (250 U/ml) e a cânula foi tapada para impedir hemorragia. A artéria 27 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ femural direita foi então canulada e a cânula foi ligada a uma tubagem que passava através de uma bomba peristáltica e para um reservatório cheio com solução A. Um pequeno volume da solução [i.e. 0,2 ml) foi infundido para manter a linha arterial sem sangue. Ambas as cânulas venosa e arterial são presas ao animal. A cânula arterial foi tapada e o animal foi transferido para o estrado com regulação de temperatura de uma câmara de oxigénio hiperbárica (OHB). A temperatura do animal medida rectalmente foi mantida entre 13-18°C. O objectivo de manter o hamster nessa gama de temperatura era o de manter a actividade do animal baixa enquanto se assegurava que o animal respirava por si e se mantinha reflexivamente responsivo a estímulos. A cânula arterial foi ligada a uma tubagem que passava fora da câmara através de uma bomba peristáltica e para um reservatório (dentro da câmara) que continha solução A e KCl 2,5 mM. A tampa foi removida da cânula venosa e a bomba foi ligada a um caudal de cerca de 0,2 ml/min. A solução foi perfundida para o animal, e foi recolhido o efluente venoso (sangue). A câmara foi rapidamente fechada e gradualmente pressurizada para 20-24 psi (100% de oxigénio). Após cerca de 1 hora de perfusão sob pressão, a câmara foi gradualmente despressurizada durante um período de cerca de 1 hora. Depois a perfusão foi interrompida. Um total de cerca de 13 ml de solução foram perfundidos no animal. As cânulas foram tapadas depois de uma amostra de efluente venoso ser retirada para determinar o hematócrito. 0 animal foi novamente colocado numa plataforma cirúrgica e as cânulas foram puxadas para fora e as feridas foram atadas. O animal mostrou alguma actividade reflexa muito mínima durante este tempo embora tivesse pouco sangue e estivesse a respirar ar ambiente. O animal foi rapidamente colocado numa caixa dentro da câmara que foi gradualmente pressurizada para cerca de 20 psi. Na câmara foram colocados comida e água para o hamster. Foi utilizada uma lâmpada de aquecimento para aquecer a câmara e o animal. A pressão na câmara foi gradualmente reduzida (durante um período de 1 hora) para 5 psi. A actividade do animal aumentou durante o período de uma hora até este se tornar bastante activo. 0 animai foi mantido na câmara durante cerca de 16 horas a 5 psi. A pressão foi então graduelmente reduzida para 0,5 psi (100% de oxigénio) e mantida a essa pressão durante 24 horas. Depois o animal foi retirado da câmara e colocado numa jaula normal. O animal continuou a parecer completamente normal durante muitas semanas após a experiência. 28 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ

Exemplo 8.

Utilização de Solução A Acrescentada com Cloreto de para Substituir Sangue em Primatas.

Potássio

Neste exemplo um babuíno macho jovem de 8 kg da espécie Papio anubis toi injectado i.m. com 60 mg de cetamina. Um cateter de calibre 22 x 1-1/4 pol. foi inserido na veia cefálica direita e foram injectados i.v. 3 ml de pentotal a 2,5%. Ao animal foi então aplicado um tubo endotraqueal, foi colocado numa mesa cirúrgica e ventilado com uma mistura de Flether a 0,7-2,5% em 100% de oxigénio, titulada para a actividade do animal. Os olhos foram revestidos com "lacrylube" para protecção. O ventilador foi regulado para 18 respirações por minuto (rpm), o seu volume de êmbolo era de 240 ml, e a razão inspiração/expiração era de 37%. A pressão do ar de ventilação foi mantida a aproximadamente 10 mm de Hg e o volume distribuído em cada respiração foi verificado examinando o traçado da pressão do ar de ventilação num gravador CRT ou de banda. A pressão do ar de ventilação foi monitorizada em linha por computador. 0 animal foi rapado e foi iniciada a aplicação em gotas i.v. de lactato de Ringer a um caudal de 1-3 ml/minuto com o caudal titulado para a pressão de sangue arterial do animal. Foi administrada terramicina. O circuito extracorpóreo consistia num oxigenador de sangue, um reservatório de sangue e uma bomba e foi construído com um permutador de calor secundário em linha adicionado tão perto do animal quanto possível. Estava ainda equipado com um reservatório de água gelada externo. O reservatório de água gelada tinha uma bomba para fornecer o permutador de calor interno do oxigenador bem como o permutador de calor secundário com água gelada de circulação. Todas as tubagens em contacto com o sangue ou com o substituto do sangue eram estéreis. O reservatório do oxigenador e o circuito foram cheios com 2 litros de solução A.

Foi adicionado KCI (4 ml de 2,0 M) aos 2 litros de solução A num reservatório de oxigenador e circuito de derivação, produzindo uma concentração de KCI de 4 mM. Foi introduzido na artéria braquial esquerda um cateter 5F NIH para monitorização da pressão arterial. A este foi ligada uma torneira de passagem de 3 vias (para permitir amostragem de sangue arterial 29 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ cada 10-60 minutos ao longo de todo o procedimento). Os gases sanguíneos, o pH, o K+ e o hematócrito foram medidos em cada amostra e, nalguns casos, também os electrólitos e as enzimas. O cateter foi ligado a um transdutor de pressão. O transdutor foi ligado a um computador para monitorizar a pressão aríeriai centrai (PÀC). Outros parâmetros de temperatura e pressão foram também medidos em linha pelo mesmo computador.

Um cateter 6F NIH foi inserido num ramo distai da veia braquial esquerda para permitir a monitorização computadorizada da pressão venosa central (PVC). Foi efectuada uma toractomia e foi inserido um cateter coronário 6F na aurícula esquerda para monitorizar a pressão auricular esquerda.

Foi colocada uma cânula arterial 10F na artéria femural esquerda e foi colocada uma cânula venosa 16F na veia femural esquerda. Foi introduzida i.v. metil-prednisolona (80 mg). Foi introduzido um tubo esofágico e foram administrados 3 ml de Maalox. 0 tubo esofágico foi equipado com uma sonda térmica para registo da temperatura esofágica profunda.

Devido aos extensos procedimentos cirúrgicos, o babuíno passou cerca de cinco horas sob anestesia. Após os cabos de EKG estarem colocados, o animal foi colocado numa funda de rede e baixado para dentro de uma arca gelada isolada. Foi depois imerso em gelo triturado. Após 1 hora e 6 minutos de arrefecimento em gelo triturado, a temperatura corporal desceu para 23°C. Começou-se uma infusão de niprida (25 mg de nitroprussida de sódio em 500 ml de dextrose aquosa a 5%) a um caudal de 6 ml/h. O animal foi colocado em derivação 17 minutos mais tarde, quando a temperatura tinha descido para 21°C.

Nessa altura, 200 ml de sangue completo foram removidos do babuíno como efluente venoso. Os grampos que isolavam a circulação do macaco do circuito de derivação foram libertados e permitiu-se que 2 litros de solução A, à qual foram adicionados 2 ml de KCI 2 M (concentração final de KCI 2 mM), substituíssem o sangue do animal. A seguir a isto, o seu coração foi parado através da administração i.v. de 1 5 ml de KCI 2 M.

Uma mistura de sangue-substituto de sangue foi continuamente removida como um efluente venoso até 4 litros de solução A (à qual tinham sido 30 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ adicionados 22 ml de KCI 2 M) terem substituído a solução em circulação. Após 50 minutos de substituição fria do sangue, a temperatura do primata tinha descido para 3°C. O fluxo através do animal parecia bom e havia pouca tendência para que a pressão na cunha arterial pulmonar se elevasse com a pcrfuccc da artéria íemuiai. A causa deste fluxo aumentado e passo relativamente rápido de declínio da temperatura pode estar relacionada com a utilização de nitroprussida e também com a utilização relativamente escassa de anestésicos durante o arrefecimento, o que resultou no animal estar de alguma forma mais activo à medida que ia sendo arrefecido. A seguir à substituição do sangue, o animal foi colocado em paragem circulatória durante uma hora e 40 minutos. No final do período de paragem, foram adicionados ao circuito 2 litros de solução A gelada, substituindo 2 litros removidos como efluente venoso. A temperatura corporal mínima registada foi de 2,8°C. Foi então começado o reaquecimento. Após 13 minutos de aquecimento, a temperatura corporal do animal alcançou os 10°C e foram adicionados ao circuito 800 ml de uma mistura 1:3 de sangue e substituto de sangue, seguida de 450 ml de uma mistura 1:1 e finalmente aproximadamente 1 litro de sangue completo, substituindo a solução A.

Imediatamente após o sangue ter sido introduzido no animal, foi detectado batimento cardíaco. Durante a hora e 22 minutos seguintes foram introduzidos i.v. 40 ml de NaHC03. Começou-se a ventilação mecânica e foi administrada gota a gota dopamina (200 mg em 250 ml) a 30 ml/h. Foi também injectado i.v. CaCI2 (50 mg). Aproximadamente uma hora mais tarde, quando a temperatura corporal subiu para quase normal, o animal foi retirado da derivação e colocado sob administração gota a gota de sangue completo. Os gases sanguíneos do animal e pressões sanguíneas estabilizaram na gama normal.

Uma hora mais tarde as cânulas foram removidas. Como o animal tinha sido cateterizado a seguir a uma toractomia, decidiu-se que não seria tentada a gestão pós-cirúrgica a longo prazo do animal, devido aos problemas de comportamento ao reprimir um babuíno selvagem ao mesmo tempo que tratando potenciais infecções do peito. Quando a ventilação foi interrompida após mais uma hora, o animal apresentava movimentos agonais e sofreu paragem cardíaca. Como as pressões sanguíneas e os gases sanguíneos do 31 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ macaco tinham estabilizado, é claro que o animal tinha o potencial para sobreviver após ter tido o sangue substituído abaixo dos 10°C (temperatura esofágica profunda) durante 2 horas e 30 minutos.

Eaciiψίυ 3. Utilização de Soiucao A bem Ser Acrescentada em Substituição de Sangue de Primatas.

Neste exemplo um babuíno macho jovem de 8 kg da espécie Papio anubis foi arrefecido e o seu sangue foi substituído abaixo de 10°C durante 1 hora e 22 minutos. Antes do arrefecimento e da substituição do sangue, um cateter cuneiforme em flecha Swan-Ganz 4F de 60 cm foi colocado na artéria pulmonar através da veia femural direita. Isto permitiu a medição da pressão na cunha arterial pulmonar sem efectuar uma toractomia. A manutenção do animal ligeiramente anestesiado e a utilização de nitroprussida quando a temperatura caiu para 28°C melhoraram o fluxo através do circuito de derivação. Embora todo o procedimento tenho corrido bem, uma injecção i.v. de 50 mg de cloreto de cálcio após o sangue citrado ter sido introduzido durante o aquecimento causou uma formação massiva de coágulos e o fim da experiência. Nessa altura não havia heparina no sistema cardiovascular.

Procedimento. O babuíno foi injectado i.m. com 70 mg de cetamina. Um cateter de calibre 22 χ 1-1/4 pol. foi inserido na veia cefálica esquerda e 3 ml de pentotal a 2,5% foram injectados i.v.. Ao macaco foi então aplicado um tubo endotraqueal e foi movido para a sala de raios X. Foi colocado numa mesa de raios X e ventilado com uma mistura a 1 % de isofluorano (Flether) em 100% de oxigénio, e foi-lhe implantado um cateter cuneiforme em flecha 4F de 60 cm na artéria pulmonar através da veia femural direita. O ventilador foi regulado para 20 rpm, o seu volume de êmbolo era de 200 ml e a razão inspiração/expiração era de 37%. A pressão do ar de ventilação foi mantida a aproximadamente 10 mm de Hg e o volume distribuído em cada respiração foi verificado examinando o traçado da pressão do ar de ventilação num gravador CRT ou de banda. A pressão do ar de ventilação foi monitorizada em linha por computador. 32 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ Ο animal foi rapado e foi iniciada uma administração i.v. gota a çffJtã^de lactato de Ringer a 1-3 ml/minuto, com o seu caudal titulado para a pressão sanguínea arterial do animal. G oiiuuilu exiracorpóreo foi tal como descrito no Exemplo anterior. O reservatório e o circuito do oxigenador foram cheios com 2 litros de solução A.

Um cateter hidrómero de calibre 20 foi colocado na veia femural direita para permitir a monitorização computadorizada da pressão venosa central (PVC). Uma torneira de passagem de 3 vias foi colocada em linha para permitir amostragem. Um cateter hidrómero de calibre 20 para monitorização da pressão arterial foi introduzido na artéria braquial direita. A este foi ligada uma torneira de passagem de 3 vias (para permitir amostragem de sangue arterial cada 10-60 minutos ao longo de todo o procedimento). Os gases sanguíneos, o pH, o K + e o hematócrito foram medidos em cada amostra e, nalguns casos, também os electrólitos e as enzimas. 0 cateter foi ligado a um transdutor de pressão. O transdutor foi ligado a um computador para monitorizar a pressão arterial central (PAC). Outros parâmetros de temperatura e pressão foram também medidos em linha pelo mesmo computador.

Uma cânula venosa 14F foi colocada na veia femural esquerda e uma cânula arterial 10F foi colocada na artéria femural esquerda. Após a cânula venosa ter sido implantada, foram injectados i.v. 2,6 ml de heparina. Foi inserido um tubo esofágico e foram administrados 3 ml de Maalox. O tubo esofágico foi equipado com uma sonda térmica para registo da temperatura esofágica profunda. Foi introduzida i.v. metil-prednisolona (80 mg). Os olhos foram revestidos com lacry/ube para protecção. Como o animal estava ligeiramente anestesiado, foi administrado i.v. 1 ml de pentotal.

Os cabos de EKG estavam no lugar, o animal foi colocado numa funda de rede e baixado para dentro de uma arca gelada isolada. Foi então imerso em gelo triturado. Após 29 minutos de arrefecimento em gelo triturado, a temperatura corporal desceu para 28°C. 0 animal foi mantido ligeiramente anestesiado, sendo desligado a Flether quando a temperatura caiu abaixo dos 30°C. Começou-se uma infusão de niprida (nitroprussida de sódio - 25 mg em 500 ml de dextrose aquosa a 5%) a um caudal de 20 ml/h e depois aumentado para 40 ml/h. Durante os 20 minutos seguintes a administração gota a gota de 33 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ niprida foi ligada e desligada esporadicamente, à medida que a pressão sanguínea e a temperatura desciam. Foi finalmente desligada quando o animal foi colocado em derivação 27 minutos mais tarde e a temperatura tinha descido para 23°C. Nessa altura, os grampos que isolavam a circulação do macaco do uiiOuilu cie derivação foram libertados, permitiu-se que 2 litros de solução A substituíssem o sangue do animal, e sangue completo e diluído foram removidos como efluente venoso e guardados para a reanimação. Depois disto, o seu coração foi parado através da administração i.v. de 10 ml de KCI 2 M.

Uma mistura de sangue-substituto de sangue foi continuamente removida como um efluente venoso até 4 litros de solução A terem substituído a solução em circulação. Após 39 minutos de substituição fria de sangue, a temperatura do primata tinha descido abaixo dos 4°C. 0 fluxo através do animal era rápido. A pressão na circulação pulmonar, que foi prontamente medida, indicava que a circulação era boa e que o cateter cuneiforme de pressão estava bem colocado.

Após 50 minutos de substituição do sangue abaixo dos 10°C, a temperatura corporal mínima registada era de 2,9°C. Começou-se então o reaquecimento e após 28 minutos de aquecimento a temperatura corporal do animal atingiu os 10°C e foram adicionados ao circuito 750 ml de sangue completo, substituindo a solução A.

Foi detectado batimento cardíaco 8 minutos após o sangue ter sido reinfundido no animal. Durante os 30 minutos seguintes, enquanto o animal aquecia, foram introduzidos i.v. 1 0 ml de NaHC03 e foi também injectado i.v. CaCI2 (50 mg), tal como o foram 80 mg de metil-prednisolona. Poucos minutos depois da adição de CaCI2, era evidente uma formação massiva de coágulos. Pensou-se que o sangue, que estava anti-coagulado com citrato, coagulava como resultado da adição de CaCI2. A experiência foi então interrompida.

Nesta experiência, o caudal do substituto do sangue através do animal e do circuito de derivação parecia elevado, enquanto a pressão auricular esquerda permanecia aceitavelmente baixa. Os factores que se pensou contribuírem para este resultado foram a utilização de nitroprussida e a manutenção de um estado de ligeira anestesia durante o processo de arrefecimento. Serão adicionados ao sangue 1-2 ml de heparina antes da sua reintrodução no animal. Acredita-se 34 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ que a heparinização do sangue reintroduzido eliminará a coagulação mafteiva que causou um final inesperado a esta experiência.

Exemplo 10. Substituição Gelada de Sangue de um Cão com Solução HLB.

Colocar um cão de 25-30 kg em derivação cardio-pulmonar parcial. Arrefecer o cão à superfície e interiormente, perto do ponto de congelação (1-3°C). Substituir o sangue do cão pelo substituto de sangue hipotérmico, solução HLB, descrito no Exemplo 1. Guardar o sangue para transfusão durante o reaquecimento. Reduzir a temperatura corporal do animal para perto do ponto de congelação (abaixo de 4°C) e depois reaquecer. Substituir o substituto do sangue por sangue com aquecimento e reanimar o animal.

Preparação. Cateterizar o cão através da veia radial direita, injectado i.v. com pentotal e depois aplicar-lhe um tubo endotraqueal e ventilar com isofluorano (ou Flether) em 100% de 02. Iniciar uma administração gota a gota de lactato de Ringer a um caudal titulado para a pressão sanguínea arterial do cão (aprox. 40 ml/h i.v.). Colocar o cão num cobertor de arrefecimento arrefecido com água gelada em recirculação. Cateterizar a artéria carótida direita para permitir a monitorização da pressão sanguínea (PAC) e adicionar uma torneira de passagem de 3 vias em linha para permitir amostragem de sangue arterial cada 10-60 min. ao longo de todo o procedimento. Inserir um cateter "foley" para recolha de urina e medir o volume de urina ao longo do procedimento. Implantar um cateter cuneiforme Swan Ganz 7F de 2 lúmens através da veia jugular direita ou da veia femural direita, o qual é alimentado através do coração direito para a artéria pulmonar. Utilizar a abertura distai para medir a pressão na cunha pulmonar (PCP), a abertura proximal é utilizada para a pressão venosa central (PVC). (Se necessário a PVC pode ser medida com um cateter inserido numa das veias braquiais). Isolar a artéria e a veia femurais esquerdas e preparar para canulação. Heparinizar o animal (aprox. 5000 U). Inserir uma cânula de retorno venoso Biomedicus (15-19F) na veia femural e uma cânula arterial Biomedicus (12-15F) na artéria femural. Medir o tempo de coagulação activada (TCA) cada 45 min (até à substituição do sangue) e ajustar a heparina de forma a que permaneça superior a 400 s. Ligar um termopar a aprox. meio caminho, a um tubo esofágico e inserir a unidade de forma que o tubo entre no estômago. Um segundo termopar é colocado rectalmente. Ligar cabos de ECG. Adicionar Solu-Delta-Cortef (Upjohn, Na-succinato de 35 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ prednisolona veterinário), 80 mg por injecção i.v.. Revestir os olhos com Terrimicina (ou Lacrylube) e adicionar DiGel (ou Maalox, 20 ml) através do tubo esofágico.

Mcdicõas. Medir us yases sanguíneos arteriais, o pH e o hematócrito em cada amostra de sangue e, nalguns casos, os electrólitos, as enzimas e outras químicas. Monitorizar as temperaturas esofágica e rectal bem como as temperaturas do sangue de influxo arterial e retorno venoso. Monitorizar a PAC, PCAP, PVC, ECG e pressão do ar de ventilação. As temperaturas devem ser apresentadas digitalmente e armazenadas em função do tempo num sistema de aquisição de dados computadorizado. As pressões e o ECG devem ser apresentados em formas de ondas em tempo real ou em dados numéricos e armazenados pelo computador.

Componentes do Circuito de Derivação. O circuito apresenta uma bomba sanguínea centrífuga Biomedicus e um medidor de caudal, um oxigenador de membrana de fibras ocas Terumo com permutador de calor interno, reservatório venoso de revestimento duro Shi/ey com filtro e um permutador de calor secundário com ratoeira para bolhas integral (Electromedics) localizado o mais próximo possível do animal. Um segmento de drenagem localiza-se perto da entrada do reservatório venoso e termina com uma válvula de verificação. Isto permite trocas de sangue/substituto de sangue rápidas e eficazes. Existe um segmento de desvio A-V que permite a circulação quando não em derivação. O reservatório venoso pode ser cheio a partir do funil separador de 1 litro através da abertura "principal" ou a partir de sacos de infusão dupla através de uma das aberturas de cardiotomia. A linha arterial do oxigenador para a cânula arterial e o desvio A-V são construídos a partir de tubagem de 1/4"; as linhas de retorno venoso, de drenagem e de cabeça da bomba são de 3/8". Nos segmentos em que podem ocorrer dobras graves, é utilizada tubagem de parede pesada ou o tubo é revestido com "revestimento espiral". O circuito do doente é duplamente revestido e todo o circuito (excepto o reservatório, o permutador de calor secundário e o oxigenador esterilizados de fábrica) são esterilizados com gás de óxido de ètileno na forma de seis secções básicas (cabeça da bomba, secção medidora de caudal, circuito central de derivação, funil, linha de infusão e linha gasosa de filtro). 36 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ

Suporte do Circuito de Derivação. Água gelada, bombeada de um de dois reservatórios isolados de 10 gal., é utilizada para arrefecer o oxigenador e os permutadores de calor secundários. O outro reservatório fornece o cobertor de arrefecimento. Mu inídu da cirurgia, é feita circular água gelada através do cobertor de arrefecimento. No início da derivação, é feita circular água à temperatura ambiente através do circuito dos permutadores de calor. A temperatura é lentamente reduzida adicionando gelo ao reservatório, em quantidades suficientes para manter uma diferença de 7-10°C entre as temperaturas esofágica e da corrente sanguínea. Após a substituição do sangue (i.e. até um hematócrito de menos de cerca de 4%) é iniciado um fluxo completo de água gelada.

Após reaquecimento, o gelo é removido do reservatório e o aquecedor é activado. A temperatura da corrente de aquecimento é limitada a um máximo de 10°C superior à temperatura de retorno venoso através de ajuste manual do termostato do aquecedor. O oxigenador é fornecido com 100% de 02 estéril e filtrado.

Substituição do Sangue. O circuito é iniciado com 2 litros de solução L (Exemplo 1) e recirculado através do desvio A-V para assegurar o equilíbrio temperatura-gás. As cânulas são ligadas às linhas arterial e venosa do circuito de derivação e as linhas permanecem grampeadas. O cobertor de arrefecimento é embrulhado à volta do doente o qual é arrefecido à superfície até se atingir uma temperatura esofágica profunda de 35°C.

Os grampos são removidos e é começada a derivação com a corrente de sangue diluído com solução L à temperatura ambiente (aprox. 25°C). No início do arrefecimento é interrompida a anestesia gasosa e o cão é gerido com pentotal a 2,5%. A corrente sanguínea é gradualmente arrefecida até o animal ter uma temperatura esofágica de 20°C, à qual o sangue é removido tapando o retorno venoso na entrada do reservatório e drenando do segmento de drenagem ao mesmo tempo que é infundida solução L. Durante esta troca, mais 2 litros de 37 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ solução L são adicionados ao reservatório venoso e quando o nível de solução L desce para 250 ml, são adicionados aproximadamente 6 litros de HLB em passos até todo o sangue ter sido removido (HCT menos de 2%, observação visual). Aproximadamente 4 litros de misturas sangue/substituto de sangue são recolhidos em garrafas estéreis e guardados para reinfusão. A mistura de sangue muito diluído (cerca de 5½ litros) é descartada.

Após terem sido trocados 4 litros (i.e. após a dição de 2 litros de solução L e 2 litros de solução HLB), serão injectados 20 meq de KCI através de uma torneira de passagem no permutador de calor secundário, para parar o coração. Durante a troca, o influxo é ajustado de tal forma que a PCAP seja mantida abaixo de 5 mm de Hg e a taxa de efluxo seja igual à taxa de influxo, i.e. o mais perto possível de isovolemia. No final da troca o nível final do reservatório será de cerca de 500 ml, a PCAP abaixo de 5 mm de Hg e a PVC menos de 5 mm de Hg. 0 fluxo será ajustado de tal forma que será mantida a isovolemia (nível constante do reservatório e os níveis de pressão de cima, i.e. PCAP <5 mm de Hg e PVC <5 mm de Hg).

Quando quase todo o sangue foi removido (HCT menos de 4%, observação visual), a corrente de arrefecimento pode ser reduzida para temperatura de água gelada (enchendo o reservatório com gelo) e o cão arrefeceu rapidamente para a sua temperatura mínima. Se for observado que o HCT aumenta a qualquer momento durante a perfusão a frio, a mistura de sangue pode ser removida trocando-a por 2 a 4 litros de solução HLB pelo método acima descrito.

Durante todo o processo, foram retiradas amostras de sangue arterial e monitorizados os gases sanguíneos, o pH, o HCT e, nalguns casos, os electrólitos e outras químicas do sangue.

Após cerca de 1-2 horas de arrefecimento com substituição do sangue, a temperatura do cão será cerca de 1-4°C e começará o reaquecimento. O cão será reaquecido removendo o gelo do reservatório de fornecimento e aquecendo os seus conteúdos com um aquecedor que por sua vez aquecem os cobertores. Quando a temp. esofágica atinge os 1 5°C, serão trocados 4 litros de solução L com 25 g de manitol pela solução HLB, seguidos pelos 4 litros da mistura sanguínea recolhida. O efluente será descartado. 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ 38

Ο animal será suavemente aquecido, sendo o diferencial de temperatura da corrente sanguínea menor que 10°C e nunca superior a 40°C. 0 coração começará espontaneamente a bater. Quando as temperaturas do animal (esofágica e rectai) atingirem cerca de 35°C, os parâmetros fisiológicos são estabilizados e este pode suportar-se sozinho, pode ser separado do circuito extracorpóreo.

Exemplo 11. Reanimação de um Cão Após Substituição Gelada do Sangue.

Um cão macho de 26,8 kg foi anestesiado com nembutal e intubado. Foi movido para a sala de operações, ventilado e cateterizado com cateteres venoso, "Foley", arterial e Swan Ganz e após heparina i.v. as suas artéria e veia femurais direitas foram canuladas. Foi inserido um tubo esofágico e administrado antácido. Foram colocados sensores de temperatura no esófago e no recto. Foi injectada i.v. metil-prednisolona. O animal foi embrulhado num cobertor de arrefecimento e foi iniciado o arrefecimento superficial. As cânulas do animal foram ligadas a um circuito de derivação que consistia numa bomba sanguínea de vórtex, um oxigenador com um permutador de calor interno, um permutador de calor secundário em linha e um funil para a administração rápida de sangue e substituto de sangue. Foi removido sangue completo (225 ml) do cão e guardado para o reaquecimento. 0 volume de sangue foi rapidamente substituído por solução HLB. 0 circuito de derivação contendo 1,05 litros de solução HLB foi aberto para o animal e começou o arrefecimento interno.

Foram trocados trinta e três litros de substituto de sangue. Na altura em que se alcançou o ponto de congelação, o hematócrito estava muito abaixo de 1%. A temperatura esofágica profunda do animal esteve abaixo dos 10°C durante 4 horas e 5 minutos, com uma temperatura mínima registada de 0,7°C (Tabela 2).

Após o período hipotérmico, o animal foi aquecido. Quando a temperatura corporal subiu acima dos 10°C, o efluente venoso e o sangue completo previamente recolhidos, bem como sangue de dadores, foram devolvidos ao circuito; o hematócrito aumentou com o aumento da

86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ 39 temperatura. Foram administrados lidocaína e bicarbonato, o coração foi desfribrilhado e começou-se a ventilação. Quando a pressão sanguínea e temperaturas corporais se aproximaram do normal, o animal foi separado da derivação e foram injectados protamina e Lasix. Várias horas após o aquecimento o animal estava consciente e responsivo. 0 animal permaneceu vivo e bem após o procedimento.

Exemplo 12. Reanimação de um Babuíno Após Substituição gelada do Sangue.

Um babuíno macho de 24 kg da espécie Papio anubis foi anestesiado primeiro com cetamina e acepromazina i.m., depois com pentotal i.v.. Foi então imobilizado com brometo de pancurónio. Foi intubado, ventilado e cateterizado com cateteres venoso, "Foley" e arterial. 0 animal foi embrulhado num cobertor de arrefecimento e foi iniciado o arrefecimento superficial. Após ter sido administrada heparina i.v., a artéria femural direita e as veias femurais bilaterais foram canuladas. Foram colocados sensores de temperatura no esófago, no recto e no cérebro. O animal foi instrumentado para EKG, potenciais provocados somatossensoriais (PPSS) e EEG. Foi injectada i.v. dexametazona.

As cânulas do animal foram ligadas a um circuito de derivação que consistia numa bomba sanguínea de vórtex, um oxigenador com um permutador de calor interno e um funil para a administração rápida de sangue e substituto de sangue. Foi removido sangue completo (300 ml) do babuíno e guardado para o reaquecimento. 0 volume foi rapidamente substituído por 300 ml de solução salina fisiológica. O circuito de derivação, contendo 2 litros de Plasmalyte (solução de electrólito comercialmente disponível) foi aberto para o animal e começou o arrefecimento interno.

Após a temperatura esofágica profunda ter descido abaixo dos 13°C, outros 2 litros de Plasmalyte contendo 12,5 g de manitol foram adicionados ao circuito, substituindo a mistura de sangue e Plasmalyte que enchia anteriormente o circuito. Este sangue diluído foi guardado para utilização durante o aquecimento. Imediatamente depois, foram adicionados 10 litros de solução HLB, substituindo o Plasmalyte. Quando se alcançou o ponto de congelação, o hematócrito estava muito abaixo de 1%. Quando o animal atingiu uma temperatura cerebral de 3,4°C e uma temperatura esofágica profunda de 2,8°C, a bomba sanguínea foi parada e o animal foi mantido sob uma condição 40 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ de paragem circulatória (estacionada) durante 45 minutos circulação foi restabelecida.

Após este período a

Após o período hipotérmico, foram adicionados 4,2 litros de solução HLB ao circuito de derivevãu e υ animai íoi aquecido. Quando a temperatura corporal atingiu o 15°C, foram adicionados 2 litros de Plasmalyte ao circuito para substituir a solução HLB. Foi adicionado manitol (6,25 g/l) ao Plasmalyte no circuito. Adicionalmente, o efluente venoso e o sangue completo previamente recolhidos, bem como células sanguíneas e plasma fresco congelado de dadores, foram devolvidos ao circuito; o hematócrito do animal aumentou com o aumento da temperatura corporal. Outros 12,5 g de manitol foram adicionados ao circuito. Quando as temperaturas esofágica e rectal se aproximaram do normal, o coração fibrilhou durante o aquecimento e começou a bater. Começou-se a ventilação. Quando a pressão sanguínea e as temperaturas corporais se aproximaram do normal, o animal foi injectado com protamina i.v., foi separado da derivação, as suas cânulas e cateteres foram removidos e as suas incisões fechadas. A temperatura esofágica profunda do animal tinha estado abaixo dos 15°C durante 3 horas e abaixo dos 10°C durante 2 horas e 17 minutos, com uma temperatura mínima registada de 2,8°C (Tabela 3). Na manhã seguinte o animal era capaz de se sentar erecto na sua jaula e apanhar e comer bocados de banana, bem como beber sumo de maçã. Permaneceu vivo e bem até ser sacrificado mais de uma semana mais tarde para avaliação histológica. 86 322

EP 0 701 455/PT TABELA 2. REANIMAÇÃO DE UM CÃO APÓS SUBSTITUIÇÃO GELADA DO SANGUE.

Hct 34 37 24 o o o Λ t 2,7 3,1 2,6 2,5 3,6 4,2 in eN 151 143 155 165 159 151 CS O Q- 403 581 719 812 999 + + 666 + 666 I (N O (J 0- 25,1 34,7 37,1 9,2 8,8 co 13,7 -1 I CL 7,52 7,41 7,36 00 K 7,50 7,50 7,50 Fluxo l/min r- 00 6'0 o LO i _ in τ— i I LC 91 T” PVC mmHg 00 co ΙΩ 00 00 CN i í í PCAP mmHg CM CN CN o oo Γ'·» i i I 1 - FC bpm 133 141 132 128 122 LL PAM mmHg 129 134 141 115 105 99 <33 00 CN 37 37 37 LZ 36 35 36 CC o I— O 36,1 35,2 34,8 32,9 _ 31,5 29,7 24,8 20,1 18,8 16,9 CN cd 15,3 12,3 10,4 00 ω' <33' u o LU I— 32,6 32,2 03 CN 26,7 21,9 18,5 14,9 ó 9,9 8,6 5,7 3,7 3,3 2,9 SOLUÇÃO 225 ml de HLB para dentro & 225 ml de sangue para fora @ 12:19 @ 13:36 em derivação c/ 1,05 I de HLB 5 I de HLB 4I de HLB 4I de HLB 4I de HLB 2I de HLB TEMPO 1 1:57 12:21 12:39 12:40 12:52 13:35 _I 13:40 13:43 13:46 13:50 13:58 o o 14:02 14:04 14:05 00 o 14:14 co 14:20 14:22 14:25 14:27 42 42 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ Hct O 20 26 27 26 27 4,6 5,4 5,7 CD 5,0 3,2 2,9 Γ" CN Na 09 L CJ LO 150 151 154 158 LO 150 | CM O CL + 666 + co co (D 999 + 902 716 670 587 496 CN O U Q_ co 9,6 11,0 28,0 27,2 38,9 28,9 27,3 X Q. 7,54 7,63 7,48 O co d 7,28 7,34 7,37 7,33 Fluxo l/min 1,4 co 1,3 1,3 CO O 0,4 0,3 0,4 0,4 o r— r— 0Ί - cq PVC mmHg r» - - CN - CN O PCAP mmHg co 00 co r- 00 CD ID oo FC bpm 00 24 143 161 PAM mmHg 37 36 37 37 CN CN CN 20 00 <T> 27 27 ! 30 co ! 30 38 09 132 E ° VL 00 co 4,2 3,4 2,3 CN cq 00 2,8 cq co' 4,2 5,3 6,7 10,7 00 32,2 TE °C r“ CN 't 1,2 CN 1,1 co o - oo d 00 d cq 4,7 6,6 r^. co' 9,9 10,7 13,8 20,2 29,2 32,8 SOLUÇÃO 2I de HLB 2I de HLB 3I de HLB 2I de HLB 3I de HLB 2I de HLB 2 I de meio-sangue 1 I de sangue O CL Έ LU l·- 14:33 14:44 14:47 14:50 14:52 14:59 15:55 o o CQ 16:22 o o 17:30 17:50 17:56 18:04 18:06 18:08 i 18:09 18:11 18:12 18:15 18:25 18:34 18:39 18:42 18:48 18:57 19:00 <ο +-< k_ < 0 _c c 3 υ U “3 '0 .2 ’ L_ 0 Ο 10 V) 0 < CL Ο 0 CC 0 3 0 α ε 0 η Pulmonar; PVC: Pressão Venosa Central tu

C Ο

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Ο ίΛ LU 0 k_ 3 -*-* 0 ν_ 0 Ο. ε 0

86 322

EP O 701 455/PT 43 TABELA 3. REANIMAÇÃO DE UM BABUÍNO APÓS SUBSTITUIÇÃO GELADA DO SANGUE.

Hct 0 Sangue (um derivação) Plasmalyte' 1,6 I + 1 2,5 g de manitol 0,3 I I Γ0 HLB CM CO CM O 0- I 530 ! 578,6 CN 00 CM O O CL 27 1 17,1 21,2 X α 7,40 "d- CO r>·' 7,37 Fluxo l/min 2,2 r— CN CM CN' cm' 2,2 2,0 2,0 2,0 2,1 CN 1,0 1,3 co co co co co CM CM r— O 0 Tmm í 0' L 0 PIC mmHg cd CD 00 cd (D 00 o 00 LO T*— CD CD - t—* O O CD O r* 00 00 co FC bpm 83 67 45 27 1 24 23 I 25 22Π PAM mmHg 09 09 50 50 1 50 09 09 50 O LD 09 50 40 _ 40. 50 50 50 50 50 55 50 50 09 55 50 u o H ° 33,2 32,5 30,9 o co CM 26,5 25,6 I 24,3 23,1 22,3 18,2 16,1 15,1 14,1 13,3 11,9 11,0 9,9 cd 00' rq co' 6,3 4,6 3,8 3,6 3,5 3,4 O o QC I- 32,8 31,1 29,0 26,6 25,5 24,7 23,7 22,8 22,2 19,3 q 00' T“* I 17,5 16,9 16,2 15,0 14,3 13,4 11,7 10,4 9,8 cq co' co r*»' cq r-' 7,4 7,3 CJ o LU I- 31,3 28,5 23,4 19,3 O co' co r·»' 16,8 00' 18,0 12,2 iq 12,7 1 1,3 SOL 9,6 8,8 7,9 co' cq 10' 5,4 3,9 3,2 3,0 2,9 cq cm' TEMPO 13:23 13:27 13:30 13:32 13:35 13:37 13:38 13:40 13:44 13:46 13:50 13:55 CM q 14:05 14:10 14:14 14:21 in CM 0 q ^J· 14:40 14:49 14:54 15:18 15:29 15:32 15:35 15:37 44 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ

Hct 0 CN CN Sangue 0,3 1 de 1/10 de sangue 2 I de 1/4 sangue/0,3 I de p asma + 1 2 5 g de maiitol 0,3 1 de pia >ma 0,4 1 de sangue + 12,5 g de manitol • <U 4-» > CS — ε CN <Λ (U CQ — _| CN X CN 00 CM CN co Ό CO CN cn CL p* CN 10 CN Ο CN co ο CN 10' 0. CN l'' CO O X co CO co Q. - r'- §| r-' O O 0 O O O 0 cn CO 0 0 3 c r— r- r- t— 0 0 CN CN 1 CN LU — cn y i co 00 00 O co 0 cn CO CN co CN 0. c E o | O 4-» O 4—· J2 -Ω XI c jd c 0) *4— U- __ D5 Ξ X LO LO 0 LO LO 0 O LO O LO LO 0 LO LO < ε ^1· LO co CO co co co r-. 00 00 co cn LO ^ ε o O 00 co LO 0 co CN <n LO co cn <- 10 CN r> 1— o co' θ'·' C0 cn cn cn 00' Tf 10' co' to' cb CN CN CN O o CN LO co co cn cn co CN co CN co 0 cn cc o O 0 0 0 0 O O t— t— CN CN to 10 0 0' CN h- ' ' ' r” CN CN CN u o r-N 00 to 00 0 cn 0 CN r- CO _o CO 0 r» LU co' co 00' cn' cn' cn 0 T- CO cb 'b 10 cb 1- ' CN CN CN o CN r» CN co 00 cn LO co LO cn LO CO 0 LO CD r·» Q_ CN CN CN 00 00 00 00 00 IO LO LO LO 0 0 t— CN CN CN co co 2 co CO CO CO co co co co co co CO co co cb Γ'' 1^ Γ"’ 1- 4586 322ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ

g '0 < CL Π3 *-> Ο 0 QC ν *σ) '0 ο C0 LU 0 k_ Ο 0 α Ε 0 « y I- 0- CD Ο ν<5 'ό k_ 0ο 0 *ϋ C <0 Õ* 0)u. LL Ò .2 0 4—·< Ο ICO </) C0 0 u.ο. CO ι_ JD 0 k_ 0ο C0 να 4-> ca ι_ 0αΕ α) Ι ο Cο u. D ^—· 0 0αΕ 0 · 0c 0’c 0ο I 0 ο 10 (Λ </> 0 Α Β**-'1 -ί' ^·\ '' '

46 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ Ο invento acima descrito e aqui adiante reivindicado engloba novas soluções que podem ser úteis em vários procedimentos. Os vulgares peritos na arte podem ser capazes, à luz dos ensinamentos do fascículo e reivindicações, de íezsr ccrtcs adições úu modificações ao presente invento sem se afastarem da essência do invento divulgado.

Lisboa, U M 2001

Por BIOTIME, INC.

Claims (10)

1. 86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES

   1. Solução de substituição de sangue de e aquosa compreendendo um agente oncótico, Na+ e um ácido carboxílico orgânico, sal ou éster deste, e 0 a 5 iinvl ue mas não inciui um tampão biológico convencional.
2. 2. Solução adequada para utilização como substituto de sangue, compreendendo: 0 a 5 mM de K+; concentrações de Na^, Mg + + , Ca"" e Cl que são concentrações fisiológicas ou subfisiológícas; um agente oncótico macromolecular; um ácido carboxílico orgânico, sal ou éster deste; e um açúcar; com a condição de que a solução não inclua um tampão biológico convencional.
3. 3. Solução de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que K+ está presente na gama de concentrações 2 a 3 mM.
4. 4. Solução de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que Na+ está presente numa concentração de 130 a 150 mM, Mg"+ está presente numa concentração de 0,20 a 0,45 mM, Ca^+ está presente numa concentração de 2,0 a 2,5 mM e o açúcar é um simples açúcar hexose que é glucose, frutose ou galactose, ou uma mistura destes.
5. 5. Solução de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o ácido carboxílico orgânico, sal ou éster deste é representado pela fórmula: RCOOX em que R é um grupo alquilo, alcenilo ou arilo possuindo uma cadeia ramificada ou linear, contendo 1 a 30 carbonos que podem ser substituídos; e X é um hidrogénio ou sódio ou outro substituinte iónico biologicamente compatível que se possa ligar à posição do oxigénio, ou é um grupo alquilo C14 de cadeia linear ou ramificada.

   86 322 ΕΡ Ο 701 455/ΡΤ 2/2
6. 6. Solução de acordo com a reivindicação 5 em que o ácido carboxílico orgânico é lactato, acetato, piruvato ou citrato.
7. 7. Solução de acordo com a reivindicação 3 compreendendo ainda NaHUU3.
8. 8. Método para proporcionar um substituto de sangue esterilizado pelo calor, compreendendo o método: colocar a solução constituída por K+ 0 a 5 mM, concentrações de Na + , Mg”, Ca” e Cl' a níveis fisiológicos ou subfisiológicos, um agente oncótico macromolecular, um ácido carboxílico orgânico, um sal ou éster deste, e um açúcar, num recipiente esterilizável pelo calor; e subir a temperatura da solução sob pressão e durante um período de tempo suficiente para matar todas ou substancialmente todas as bactérias e inactivar todos ou substancialmente todos os vírus na solução.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8 em que a solução é adequada para infusão num sujeito como substituto de sangue ou extensor do plasma.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 8 com a condição da solução não incluir um tampão biológico convencional. Lisboa, )2. 3; ?001 Por BIOTIME, INC.

    Έή^Γ^ΝΤόΝΙΟ JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA