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Publication number: DEN0009597MA
Authority: DE

Description

BUJNDESREPUBLTK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 15. Oktober 1954 Bekanntgemacht am 17. Mai 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Es sind injizierbare Insulinzubereitungen bekannt, deren protrahierte Wirkung ausschließlich oder hauptsächlich auf der Gegenwart von Insulinkristallen in wäßriger Suspension beruht. Es ist auch bekannt, daß die protahierte Wirkung solcher wäßriger Insulinkristallsuspensionen in einem gewissen Grade von der Größe der suspendierten Insulinkristalle abhängt.

Bei den bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von kristallisiertem Insulin wurden bisher keine Maßnahmen getroffen, die Größe der anfallenden Kristalle zu beeinflussen. Es erschien auch zwecklos, eine solche Beeinflussung vorzunehmen, weil bisher die Kristalle als solche nicht als Bestandteil von Insulinzubereitungen für den klinischen Gebrauch verwendet wurden. Erst nach dem Erscheinen von klinisch brauchbaren Insulinkristallsuspensionen, deren verlängerte Wirkung einigermaßen von der Größe der Insulinkristalle abhängig ist, entstand das Problem, wie Kristalle von vorzugsweise gleicher Größe zu erhalten sind oder wie der Hauptgewichtsanteil der Kristalle in bezug auf die Größe innerhalb bestimmter gewisser Grenzen zu halten ist,

Die Erfindung beschäftigt sich mit der Lösung des obenerwähnten Problems. Gegenstand der Er-

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findung ist es deshalb, Insulinkristalle von vorzugsweise gleicher Größe herzustellen. Ein weiteres . Ziel ist es, Insulirikristalle zu gewinnen, die als Keimmaterial zur Herstellung von größeren i.. 5 Kristallen von vorzugsweise gleicher Größe geeignet sind.

Der Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, daß der Kristallisationsprozeß hinsichtlich der Größe der anfallenden Kristalle und der Menge von ίο Kristallen ungefähr gleicher Größe durch die Gegenwart von gefriergetrocknetem Insulin beeinflußt wird.

Die Herstellung von kristallisiertem Insulin ist allgemein bekannt und bereits mehrfach beschrieben worden. Obgleich die Kristalli.sationsmethOden etwas voneinander'abweichen, sind sie doch auf demselben Prinzip aufgebaut, d.h., das Insulin wird aus einer wäßrigen Lösung durch Änderung des pg^Wertes des Mediums bis in die Nähe des isoelektrischen Punktes des Insulins zur Kristallisation gebracht.

Der Kristallisationsvorgang wird bekanntlich durch die Anwesenheit eines die Kristallisation fördernden Metalls, z. B. Zink, Kobalt, Nickel, _:25 Cadmium, Kupfer, Mangan oder Eisen, verbessert; am meisten wird Zink in Form eines wasserlöslichen Salzes verwendet. Wenn das Insulin selbst kein solches Metall in genügender Menge enthält, so muß zu dem wäßrigen Kristalli'sationsmedium ein entsprechender Zusatz gemacht werden-. Die erforderliche Menge des kristallisationsfördernden Metalls liegt bei etwa o,4^fl/o des Insulingewichtes. Bei der praktischen Durchführung der Kristallisation wird gewöhnlich ein zwei- bis fünfmal so hoher Betrag verwendet.

Der p_H-Wert für die Kristallisation liegt normalerweise zwischen 5,4 und 6,2. Zur Einstellung dieses Wertes werden im allgemeinen ein oder mehrere Pufferstoffe gebraucht. Beispiele derartiger Pufferstoffe sind Acetat-, Borat-, Citrat-, Phosphat-, Diäthylbarbiturät- und Maleatpuffer.

Es ist allgemein üblich, eine saure wäßrige Insulinlösung mit dem nötwendigen Metallgehalt und, falls erforderlich, mit Pufferstoffen herzustellen und diese Lösung auf den für eine Kristallisation notwendigen p_H-Wert einzustelleri: Man kann auch das Insulin amorph in einer wäßrigen Lösung ohne den notwendigen Metallgehalt ausfällen und durch Hinzufügen der notwendigen Menge an Metallen in die kristalline Form über-

.,, führen, beispielsweise in Form einer wäßrigen Metallsalzlösung. Schließlich ist es aber auch möglich, basische Insulinlösungen zu verwenden und durch Zusatz von sauren Stoffen den erforderlichen pfj-Wert zu erreichen.

Die Erfindung bezieht sich auf einVerfahren der obenerwähnten Art, wobei das charakteristische Merkmal der Erfindung darin besteht, daß die Kristallisation in Gegenwart von einem Insulin vor sich geht, das' der Gefriertrocknung unter- -.. worfen wurde. '.'-■,

Das gefriergetrocknete Insulin kann dabei dem insulinhaltigen Krfstallisationsmedium nach dessen Einstellung auf den für die Kristallisation geeigneten p_H-Wert zugesetzt werden. Die Kristallbildung darf jedoch noch nicht begonnen haben. In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird das insulinhaltige Kristallisationsmedium durch Mischen einer sauren wäßrigen Insulinlösung und einer basischen Lösung erhalten, die, wenn es erforderlich ist, kristallisationsfördernde Metalle und Pufferstoffe enthält, um den für die Kristallisation erforderlichen p_H-Wert zu stabilisieren. Das gefriergetrocknete Insulin wird der basischen Lösung vor dem Mischprozeß zugesetzt.'

Die Kristallisation erfolgt im allgemeinen bei einem p_H-Bereich von S bis 7, zweckmäßig jedoch zwischen 6,2 und 6,5. Als Ausgangsmaterial für das der Gefriertrocknung zu unterwerfende Insulin wird vorzugsweise ein kristallines Insulin oder ein Insulin von ähnlicher Reinheit verwendet. Die Gefriertrocknung wird in einer an sich bekannten Weise durchgeführt. Es kann z. B. das in einer verdünnten Säure oder in einer verdünnten Base gelöste kristalline Insulin der Gefriertrocknung unterworfen werden, wobei die Lösung einen p_H-Wert von beispielsweise 3 bzw. 7,5 hat. Es kann auch eine Insulinlösung gefriergetrocknet werden, welche derjenigen des Kristallisationsmediums entspricht, zu dem später das gefriergetrocknete Insulin hinzugefügt wird. Schließlich ist es auch möglich, eine Lösung von amorphem Insulin (frei von Metall) der Gefriertrocknung zu unterwerfen. Normalerweise werden klare Lösungen der Gefriertrocknung unterworfen, es macht aber nichts, g$ wenn ein Teil des Insulins vor der Gefriertrocknung amorph, ausgefallen ist.

Es wurde weiterhin gefunden, daß auch die Menge des gefriergetrockneten Insulins, das dem Kristallisationsmedium zugefügt wird, den Verlauf der Kristallisation beeinflußt. Es hat sich herausgestellt, daß die Kristalle unter sonst gleichen Umständen um so kleiner werden, je mehr gefriergetrocknetes Insulin zugesetzt wird. Es ist deshalb zweckmäßig, das gefriergetrocknete Insulin in einem Gewichtsbetrage zuzufügen, der einen .vorherbestimmten Teil des Gewichtsbetrages des zu kristallisierenden Insulins ausmacht.

Schließlich ist es nicht notwendig, daß die Kristallisationsflüssigkeit von vornherein Insulin enthält. Die gewünschte Insulinkonzentration in der Kristallisationsflüssigkeit kann durch das Hinzufügen von gefriergetrocknetem Insulin erreicht werden.

Effindungsgemäß werden Insulinkristalle hergestellt, denen Größe von etwa 2 bis etwa 7 μ variiert werden kann. Die Größe ist abhängig von der Höhe des Zusatzes an gefriergetrocknetem Insulin, der Zusammensetzung desselben und den Kristallisationsbedingungen.

Obwohl die nach dem beanspruchten Verfahren hergestellten Kristalle oder Kristallsuspensionen therapeutische Verwendung finden können, eignen sie sich jedoch vorzugsweise als Material zum Animpfen bei der Herstellung größerer Insulinkristalle von gleichmäßiger Größe. Hierfür sind

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sie besonders geeignet, weil die Kristallenen vollkommen voneinander getrennt sind und auf diese Weise in Form von individuellen freien Kristallkörpern erscheinen.

Beispiel ι

Soo mg kristallines Insulin mit ungefähr 0,4% Zink werden in 50 ml Wasser gelöst, das 4 ml 0,1 η-Salzsäure enthält. Die hergestellte Lösung wird der Gefriertrocknung in bekannter Weise bei einem Druck von etwa 0,05 mm Quecksilber oder niedriger unterworfen.

Wenn das gefriergetrocknete Insulin nunmehr einem wäßrigen Kristallisationsmedium, das 50 mg Zitronensäure (als Natriumeitrat) auf 100 ml, 2 mg Zink (als Zinkchlorid)' auf 100 ml, ¹Ai⁰A) Insulin und ι %o von Methyl-p-oxybenzoat enthält, in.einem Betrag von 20% der'Menge des Insulins im Kristallisationsmedium zugesetzt und auf einen p_H-Wert von 6,5 eingestellt wird, so fällt das Insulin in Form von Kristallen an, die gleichförmig in ihrer Gestalt eine Größe von etwa 5 μ auf-

weisen.

Beispiel 2

5OO mg von kristallinem Insulin gemäß Beispiel ι werden in 50 ml Wasser gelöst, das 4,3 ml 0,1 η-Salzsäure enthält. Die Lösung wird mit S'o ml einer Pufferlösung versetzt, die aus 50 mg Zitronensäure, 10 ml einer 0,1 n-Natriumhydroxydlösung, 2 mg Zink (als Zinkchlorid) und 1,6 %o Methyl-p-oxybenzoat besteht. Der p_H-Wert der Mischung wird auf 6,3 eingestellt, wobei die Lösung durch das Ausfallen von amorphem Insulin trüb wird. Die trübe Lösung wird in gleicher Weise bei dem gleichen Druck wie im Beispiel 1 gefriergetrocknet. Wenn dieses gefriergetrocknete Insulin derselben Kristallisationsflüssigkeit und in gleicher Menge wie im Beispiel 1 zugefügt wird, so kristallisiert das Insulin in einer Kristallgröße von etwa S bis 7 μ aus.

Beispiel 3

Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel 2 mit der einzigen Modifikation, daß die Insulinlösung, die gefriergetrocknet werden soll, auf einen p_H-Wert von 6,6 anstatt 6,3 eingestellt wird. Die Lösung bleibt klar, und es fällt kein amorphes Insulin aus. Die Insulinkristalle fallen in einer Größe von etwa 2 μ an.

Beispiel 4

Es wird dasselbe Verfahren wie im Beispiel 2 angewendet, nur mit dem Unterschied, daß die Insulinlösung, welche gefriergetrocknet werden soll, auf einen Wert von p_H 7 eingestellt wird. Auch in diesem Falle haben die Insulinkristalle eine Größe

von 2 μ.

Beispiel 5

Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel 2, mit dem einzigen Unterschied, daß die Insulinlösung, welche gefriergetrocknet wird, auf einen p_H-Wert von 7,5 eingestellt wird. In diesem Falle besitzen die Insulinkristalle eine Größe von 1 bis

1-5 μ- .·.■-.

Beispiel 6

500 mg eines hochgereinigten amorphen Insulins, das keine die Kristallisation fördernde Metalle enthält, werden in 50 ml Wasser gelöst; , das 4,3 ml 0,1 η-Salzsäure enthält. Die so hergestellte Lösung wird mit 50 ml einer Lösung gemischt, die aus 50 mg Zitronensäure, 10 ml 0,1 n-Natriumhydroxydlösung und 1,6 °/00 Methylp-oxybenzoat besteht. Daraufhin wird der p_H-Wert der Mischung auf 6,7 eingestellt. Die so hergestellte Mischung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gefriergetrocknet.

Wenn das genannte gefriergetrocknete Insulin derselben Kristallisationsflüssigkeit und in gleicher Menge wie im Beispiel 1 zugesetzt wird, so fallen Insulinkristalle in der Größe von 5 μ an.

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Beispiel 7

500 mg kristallines Insulin mit ungefähr 0,4% Zink werden in 50 ml Wasser gelöst, das 4,3 ml 0,1 η-Salzsäure enthält. Diese Lösung wird mit 50 ml einer Lösung gemischt, die 50 mg Zitronensäure, 2 mg Zink (als Zinkchlorid), 10 ml 0,1 n-Natriumhydroxydlösung und i,6°/oo Methylp-oxybenzoat enthält. Der p_H-Wert, auf den die Mischung eingestellt wird, liegt bei 5. Danach werden 100 mg nach Beispiel 3 gefriergetrocknetes Insulin hinzugefügt und das Gemisch umgerührt. Das Insulin kristallisiert in Form von Kristallen in der Größe von etwa 2,5 μ, welche jedoch dazu neigen, sich aneinander anzulagern, und die deshalb weniger für die Verwendung als Saatkristalle geeignet sind.

Beispiel 8

Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel 7, mit dem einzigen Unterschied, daß die Kristallisation bei einem p_H-Wert von 5,5 anstatt von 5 durchgeführt wird. Die so erhaltenen Kristalle haben eine Größe von etwa 2 μ und hängen weniger aneinander als die nach dem Beispiel 7 hergestellten.

Beispiel 9

Das Verfahren ist das gleiche wie im Beispiel 7, mit dem einzigen Unterschied, daß die Kristallisation bei einem p_H-Wert von 6 stattfindet. Bei diesem Verfahren werden Kristalle von 2 μ erhalten, welche vollkommen voneinander getrennt sind.

Beispiel 10

Das Verfahren ist das. gleiche wie im Beispiel 7, nur daß die Kristallisation bei einem p_H-Wert von 6,3 vorgenommen wird. Auf diese Weise wird das-

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selbe Resultat erhalten, wie es im Beispiel 9 angegeben ist.

Beispiel 11

Das Verfahren ist das gleiche wie im Beispiel 7, nur mit dem Unterschied, daß die Kristallisation bei einem p_H-Wert von 7 durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren Werden Insulinkristalle von einer Größe von 1 bis 2 μ erhalten. Entsprechend der relativ großen Löslichkeit des Insulins unter den genannten Kristallisationsbedingungen wird jedoch nur ein Teil desselben in Kristallform erhalten.

Beispiel 12

500 mg kristallines Insulin mit ungefähr 0,4% Zink werden in 50 ml Wasser gelöst, das 4,3 ml 0,1 η-Salzsäure enthält. Die so hergestellte Lösung wird mit 50 ml einer wäßrigen Lösung gemischt, die 178 mg von Na₂HPO₄, 2 mg Zink (als Zinkchlorid), 3,8ml 0,1 n-Salzsäurelösung und i,6°/oo Methyl-p-oxybenzoat enthält. Der p_H-Wert der Mischung wird auf 6,3 eingestellt, wonach 100 mg von gefriergetrocknetem Insulin, das entsprechend dem Beispiel 3 hergestellt wurde, zugesetzt werden. Die Mischung wird umgerührt, bis die Kristallisation beendet ist. Die Insulinkristalle haben eine Größe von etwa 2 μ.

Beispiel 13

500 mg kristallines Insulin mit ungefähr 0,4% Zink werden in 50 ml Wasser gelöst, das 4,3 ml 0,1 η-Salzsäure enthält. Diese Lösung wird mit 50 ml einer wäßrigen Lösung gemischt, welche 136 mg CH₃COONa, 3 H₂O, 2 mg Zink (als Zinkchlorid), 4,5 ml ο,ί n-Natriumhydroxydlösung und i,6°/oo Methyl-p-oxybenzoat enthält. Der p_H-Wert dieser Mischung wird auf etwa 6,3 eingestellt, wonach 100 mg gefriergetrocknetes Insulin, das entsprechend dem Beispiel 3 gewonnen wurde, zugefügt werden. Die Mischung wird umgerührt. Die Insulinkristalle, die auf diese Weise erhalten werden, haben eine Größe von etwa 2 μ.

, Beispiel 14

Zu. 50 ml einer wäßrigen Lösung, die 50 mg Zitronensäure, 4,5 mg Nickel (als Nickelchlorid), 10 ml 0,1 n-Natriumhydroxydlösung und i,6°/oo Methyl-p-oxybenzoat enthält, werden 50 ml einer Insulinlösung hinzugefügt, welche dieselbe Zusammensetzung hat wie die Insulinlösung, die entsprechend dem Beispiel 6 der Gefriertrocknung unterworfen wurde, wonach 100 mg gefriergetrocknetes Insulin nach Beispiel 3 sofort hinzugefügt werden. Der p_H-Wert der Mischung wird auf etwa 6,2 eingestellt. Bei der Kristallisation ergeben sich Insulinkristalle von 2 μ.

Beispiel 15

Zu 100 ml einer wäßrigen Lösung, die 50 mg Zitronensäure, 2 mg Zink (als Zinkchlorid) und 0,8 %o Methyl-p-oxybenzoat enthält und die auf einen p_H-Wert von 6,5 mit Hilfe von Natriumhydroxyd eingestellt ist, werden unter Rühren 600 mg gefriergetrocknetes Insulin hinzugefügt, wie es im Beispiel 3 beschrieben ist. Nachdem einige Stunden gerührt worden ist, kristallisiert das hinzugefügte Insulin in Form von Kristallen, die eine Größe von etwa 2 μ haben.

Beispiel 16

Zu 5° ^ml einer wäßrigen Lösung, die 50 mg ' Zitronensäure, 2 mg Zink (als Zinkchlorid), 10 ml 0,1 n-Natriumhydroxydlösung und i,6°/oo Methylp-Oxybenzoat enthält, werden unter Rühren 100 mg von gefriergetrocknetem Insulin, das entsprechend dem Beispiel 3 hergestellt ist, hinzugefügt; unmittelbar danach werden 500 mg kristallines, zinkhaltiges Insulin zugegeben, die in 50 ml Wasser gelöst sind, das 4,3 ml einer 0,1 η-Salzsäure enthält, wonach der p_H-Wert der Mischung auf 6 eingestellt wird. Die Kristallisation wird unter Rühren durchgeführt. Die Insulinkristalle haben eine Größe von etwa 2 μ.

Beispiel 17 ^8s

Zu 50 ml einer wäßrigen Lösung, die 50 mg Zitronensäure, 2 mg Zink (als Zinkchlorid) und etwa 9 ml ο, ι n-Natriumhydroxydlösung (bis zu einem p_H-Wert von etwa 11,8) enthält, werden go 100 mg gefriergetrocknetes Insulin, das nach dem Beispiel 3 hergestellt ist, hinzugefügt.

Das gefriergetrocknete Insulin scheint hierbei in Lösung zu gehen. Dann werden 50 ml einer Insulinlösung hinzugefügt, die 500 mg kristallines, ungefähr o,4^fl/o Zink enthaltendes Insulin, 4,3 ml 0,1 η-Salzsäure und i,6°/oo Methyl-p-oxybenzoat enthält und deren p_H-Wert auf etwa. 6,3 eingestellt ist.

Nach einigen Stunden ist die Kristallisation beendet. Die Größe der Kristalle liegt zwischen 2 und 3 μ. ^λ

Wenn die erfmdungsgemäß nach den oben angegebenen Beispielen hergestellten Insulinkristalle als Saatkristalle für die industrielle Erzeugung von injizierbaren Insulinkristallsuspensionen verwendet werden, ist es zweckmäßig, Vorkehrungen zu treffen, um Änderungen der hergestellten Keimkristalle in dem Suspensionsmedium während einer möglichen Lagerung zu verhindern. Für diesen no Zweck ist es vorteilhaft, eines der die Kristallisation beschleunigenden Metalle zu dem Suspensionsmedium der Keimkristalle hinzuzufügen, damit die Suspension bei einem p_H-Wert von etwa 7 stabil bleibt. Die Lösung wird dann mit Natronlauge auf diesen p_H-Wert eingestellt. Auf diese Weise kann jede der nach den Beispielen herge- ■ stellte Suspension von Insulinkristallen im Verhältnis ι : ι mit einer wäßrigen 50 mg Zink (als Zinkchlorid) auf 100 ml und 1 %o Methyl-p-oxybenzoat enthaltenden Lösung verdünnt werden.

Es sei jedoch bemerkt, daß bei einer industriellen Durchführung des Prozesses die Kristallisation unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muß. Die so erhaltenen sterilen Kristallsuspensionen können dann entweder für den direkten

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therapeutischen Gebrauch oder zur Herstellung von sterilen Suspensionen von größeren Insulinkristallen für den unmittelbaren therapeutischen Gebrauch benutzt werden.
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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von kristallinem Insulin aus einer wäßrigen Lösung durch

ίο Einstellen des p_H-Wertes bis in die Nähe des isoelektrischen Punktes, dadurch gekennzeichnet, daß die Kristallisation in Gegenwart von gefriergetrocknetem Insulin durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß das gefriergetrocknete Insulin einer Insulin enthaltenden Kristallisationsflüssigkeit zugefügt und vor der Bildung von Kristallen der p_H-Wert für die Kristallisation eingestellt wird.

3. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium, in dem die Insulinkristallisation stattfindet, durch Mischen einer sauren wäßrigen Insulinlösung Und einer basisehen Lösung erhalten wird, die, wenn gewünscht, kristallisationsfördernde Metalle und Pufferstoffe enthält, und daß das gefriergetrocknete Insulin der basischen Lösung vor dem Mischen zugefügt wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kristallisation bei einem p_H-Wert von 5 bis 7, vorzugsweise bei 6,2 bis 6,5 durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gefriergetrocknete Insulin aus kristallinem Insulin oder einem Insulin ähnlicher Reinheit hergestellt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Insulin der Gefriertrocknung in einem Medium von einer ähnlichen Zusammensetzung unterworfen wird, wie sie dem Kristallisationsmedium entspricht, dem das gefriergetrocknete Insulin hinzugefügt werden soll.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gefriergetrocknete Insulin in einem Gewichtsverhältnis zugesetzt wird, das einen vorher bestimmten Teil des Gewichtsbetrages von Insulin enthält, das auskristallisiert werden soll.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Insulingehalt der Kristallisationsflüssigkeit durch Hinzufügen von gefriergetrocknetem Insulin erhalten wird.