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Verfahren zur Herstellung von kristallisierten Präparaten aus dem
blutzuckersenkenden Hormon der Bauchspeicheldrüse In der deutschen Patentschrift
727 888 ist ein Verfahren zur Herstellung von protrahiert wirkenden Präparaten aus
dem blutzuckersenkenden Hormon der Bauchspeicheldrüse beschrieben, das darin besteht,
daß man das Hormon mit solchen Verbindungen der Chinolin- und Acridinreihe umsetzt,
deren Basen bei einem zwischen 6,5 und 9 liegenden PH-Wert in Wasser entweder unlöslich
oder nur kolloidallöslich sind, und gegebenenfalls die Lösung auf ein pn von 6,5
bis 7 einstellt.
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Beim Arbeiten nach dieser Patentschrift erhält man beim Einstellen
auf LH 6,5 bis 7 eine feinverteilte amorphe Suspension, die ,unter Umständen beim
Lagern zum Zusammenballen neigt und sich dann nur schwer durch Schütteln wieder
gleichmäßig verteilen läßt. Durch Einstellen auf einen pH-Wert von etwa 3,5 kann
man klare Lösungen erhalten, die ebenfalls eine protrahierte Wirkung zeigen und
die sich in der Zwischenzeit klinisch außerordentlich bewährt haben.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung
von Präparaten aus dem blutzuckersenkenden Hormon der Bauchspeicheldrüse durch Umsetzung
dieses Hormons mit solchen Verbindungen der Acridin- und Chinolinreihe, deren Basen
bei einem zwischen 6,5 und 9 liegenden pH-Wert entweder unlöslich oder nur kolloidal
löslich sind, wobei man die Umsetzungsprodukte in der für das reine Inselhormon
üblichen Weise zur Kristallisat4on bringt.
Es sind mehrere Methoden
zur Herstellung von kristallisiertem reinem Inselhormon bekannt (vgl. B om s k o
v, Methodik der Hormonforschung, Bd. i i19371, S. 676 ff.). Insbesondere wird auf
die Methode von Scott und Gerlough-Bates hingewiesen, wobei kristallisiertes Inselhormon
mit Hilfe von Aceton oder Propylälkohol unter Zusatz von Phosphatpuffer und in Gegenwart
von kleinen Mengen Zink, Kobalt, Nickel oder Cadmium gewonnen werden kann, Es ist
außerordentlich überraschend, daß es gelingt, die Umsetzungsprodukte aus Inselhormon
und den in Frage stehenden Verbindungen der Acridin- und Chinolinreihe in gleicher
Weise in Kristallform überzuführen, wie das reine Inselhormon selbst. Man kann beispielsweise
so vorgehen, daß man eine saure Hormonlösung mit geeigneten Puffersubstanzen, wie
Phosphaten oder Acetaten, versetzt, geringe Mengen von Zink-, Cadmium-, Kobalt-
oder Nickelsalzen sowie organische wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole oder
Ketone, zusetzt und dann nach Zugabe der Lösungen der Acridin- oder Chinolinverbindungen
auf einen pH-Wert zwischen etwa 5 und 6,5, vorzugsweise etwa pH 6, einstellt. Beim
Stehen, besser und gleichmäßiger unter Rühren, verwandelt sich die anfangs amorphe
Fällung allmählich in wohlausgebildete Kristalle, die durch fraktionierte Sedimentation
von geringen amorphen Anteilen befreit und isoliert werden können. Durch Variieren
der Menge des zugesetzten Metallsalzes und der Chinolin-oder Acridinverbindungen
hat man es in der Hand, den Gehalt der Kristalle an diesen Substanzen in verhältnismäßig
weiten Grenzen zu beeinflussen.
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Die neuen kristallisierten Präparate* haben bereits mit niedrigem
Gehalt an Acridin- oder Chinolinverbindungen eine hervorragende protrahierte Wirkung
und können gegebenenfalls in wäßriger Suspension zur Anwendung gebracht werden.
Beispiel i 8oo mg reines Inselhormon werden in Wasser durch Zusatz von wenig Salzsäure
in Lösung gebracht und auf 200 ccm aufgefüllt. Man gibt eine Lösung von 36 mg Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamidchlorhydrat
in 20 ccm Wasser und 2 ccm o,50/0ige Chlorzinklösung zu und fällt dann den Inselhormonkomplex
aus, indem man eine mit Natronlauge auf pH 6,5 eingestellte und auf 220
CCM verdünnte Lösung von 2,7 g primärem Kaliumphosphat in Wasser zusetzt.
Man gibt sofort noch 5o ccm Isopropylalkohol zu und bringt mit 2n-Salzsäure auf
pH 6 bis 6,1. Dann läßt man bei Zimmertemperatur langsam rühren bis die Fällung
fast ganz durchkristallisiert ist. Die Kristalle werden ausgeschleudert, auf der
Zentrifuge durch fraktionierte Sedimentation von geringen amor-K hen Beimengungen
befreit und mit Aceton und ther getrocknet.
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Man erhält etwa 700 mg einheitliche Kristalle, die einen Gehalt
an Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamid -von 2,50/, zeigen. Setzt man an Stelle
von 36 mg Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamidchlorhydrat 72 mg dieser Verbindung
zu, so erhält man Kristalle mit einem Gehalt an Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamid
von 4,5 0/0. Beispiel 2 5 g' Inselhormon werden mit Salzsäure zu 95o ccm Wasser
gelöst und die Lösung von i5o mg Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamidchlorhydrat
in 50 ccm Wasser zugesetzt. Nunmehr gibt man 1 1 Phbsphatpuffer (enthaltend
16,8 g sekundäres Natriumphosphat und 2,8 g primäres Kaliumphosphat), der vorher
mit 8o ccm n-Salzsäure angesäuert wurde, 20 ccm o,50/0ige Chlorzinklösung und 200
ccm Aceton zu und stellt mit Ammoniak auf etwa PH 5,8. Beim Stehen geht die anfangs
amorphe Fällung in Kristalle über, die wie im Beispiel i aufgearbeit°t werden.
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Man erhält ein Produkt mit einem Gehalt an Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamid
von 1,5 0/0. Verwendet man 300 mg Bis-2-methyl-4-aminochinclyl-6-carbamidchlorhydrat,
so erhält man ein kristallisiertes Endprodukt mit einem Gehalt an Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamid
von etwa 30/0. Beispiel 3 io g Inselhormon werden in Wasser mit Hilfe von Salzsäure
zu 1,11 gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 1,21 Phosphatpuffer, der vorher
mit 96 ccm n-Salzsäure angesäuert wurde, 24 ccm o,50/0ige Chlorzinklösung und 240
ccm Aceton sowie eine Lösung von 86o mg Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamidchlorhydrat
in ioo ccm Wasser. Dann wird mit Ammoniak auf pH 6,3 gestellt und weiter wie im
Beispiel i aufgearbeitet.
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Man erhält 8,5 g Kristalle mit einem Gehalt an Bis-2-methyl-4-aminochinolyl-6-carbamid
von etwa 3%. Beispiel 4 I,25 g reines Insulin wird in Wasser unter Zusatz von 2,5
ccm n-Salzsäure zu 125 ccm gelöst. Man gibt eine Mischung von 150 ccm Phosphatpuffer,
12 ccm n-Salzsäure, 3 ccm o,50/0ige Chlorzinklösung und 30 ccm Aceton zu,
außerdem 54 mg 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactat, gelöst in 15 ccm Wasser. Die
klare Lösung wird mit Ammoniak auf pH -..6,g gestellt und 3o Minuten stehengelassen.
Dann wird mit n-Salzsäure auf pH-6,i zurückgestellt und bei Zimmertemperatur langsam
gerührt, bis die Fällung fast vollständig in kleine abgerundete Kristalle umgewandelt
ist. Nun wird ausgeschleudert und wie, im Beispiel i weiter aufgearbeitet. Man erhält
i g intensiv zitronengelb gefärbte Kristalle, die, in wäßriger Suspension gespritzt,
eine gegenüber normalem Kristallinsulin erheblich verlängerte Wirkung zeigen. Beispiel
5 1,25 g kristallisiertes Insulin wird wie im Beispiel 4 gelöst und mit denselben
Zusätzen versetzt. Statt des 2-Äthoxy-6, 9-diaminoacridinlactats wird eine Lösung
von 95 mg 3, 6-Diamino-io-methylacridiniumchlorid in 15 ccm Wasser zugesetzt, dann
wird auf pH-6,9 gestellt, etwa 15 Minuten stehengelassen und mit Salzsäure auf pH--6,2
zurückgestellt. Die weitere Verarbeitung erfolgt wie im Beispiel 4. Man erhält 1,23
g kleine, aber wohl ausgebildete Kristalle von leuchtend goldgelber Farbe.
Beispiel
6 1,25 g kristallisiertes Insulin wird wie im Beispiel 4 gelöst und mit den
zur Kristallisation üblichen Zusätzen versetzt. Man gibt noch 12o mg 2-P)-Diäthylaminoäthoxy-6-acetamido-9-aminoacridinacetat,
in wenig Wasser gelöst, zu und stellt mit Ammoniak auf pH-6,3 ein. Die gebildeten
Kristalle werden wie üblich aufgearbeitet. Man erhält o,8 g nadelförmige Kristalle
von zitronengelber Farbe, die sich durch besonders starke protrahierte Wirkung auszeichnen.
Beispiel 7 I,25 g kristallisiertes Insulin werden wie im Beispiel 4 gelöst und unter
Zusatz von io8 mg N, N'-Di-(2-methyl) - 4 -aminochinolyl- 6 -adipinsäurediamidchlorhydrat,
in wenig Wasser gelöst, zur Kristallisation angesetzt. Man erhält 1,21 g abgerundete
Würfel, die 3()/', der Base enthalten. Beispiel 8 I,25 g kristallisiertes Insulin
werden wie im Beispiel 7, aber unter Zusatz von Zoo mg :N', N'-Di-(2-methyl) - 4
- aminochinolyl- 6 -cyanursäurediamiddichlorhydrat, umkristallisiert. Man erhält
Z,Z5 g abgerundete Würfel, die 2,6 °/a der Base enthalten und eine deutlich erhöhte
protrahierte Wirkung zeigen.