KR20100111068A - 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법 - Google Patents

이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20100111068A
KR20100111068A KR1020090029446A KR20090029446A KR20100111068A KR 20100111068 A KR20100111068 A KR 20100111068A KR 1020090029446 A KR1020090029446 A KR 1020090029446A KR 20090029446 A KR20090029446 A KR 20090029446A KR 20100111068 A KR20100111068 A KR 20100111068A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
refolding
protein
ionic liquid
methylimidazolium
ethyl
Prior art date
Application number
KR1020090029446A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101063347B1 (ko
Inventor
구윤모
하성호
장우진
배상우
Original Assignee
인하대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인하대학교 산학협력단 filed Critical 인하대학교 산학협력단
Priority to KR1020090029446A priority Critical patent/KR101063347B1/ko
Publication of KR20100111068A publication Critical patent/KR20100111068A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101063347B1 publication Critical patent/KR101063347B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법은 단백질 재접힘 버퍼에 사용되는 이온성 액체의 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종을, 음이온 부분으로 황을 포함하는 화학종을 사용하고, 재접힘 공정의 공정시간을 최적화함으로써 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 더욱 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 사용되는 이온성 액체는 세포 독성을 나타내지 않으므로, 본 발명에 따른 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재조합 방법은 이황화 결합을 포함하는 단백질을 대량으로 생산 또는 회수하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.
이온성 액체, 단백질 재접힘, 단백질 재접힘 버퍼, 이황화 결합

Description

이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법{Method for the refolding of protein containing disulfide bond using ionic liquids}
본 발명은 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술의 발달과 더불어 산업적으로 유용한 단백질을 대량으로 생산하기 위한 목적으로 미생물을 이용한 재조합 단백질 형태의 유용 유전자 산물을 대량 생산하려고 하는 시도가 많이 이루어지고 있다. 이러한 재조합 단백질을 생산하기 위해 이용되는 미생물로는 대장균이 유전적으로 가장 잘 알려져 있고, 발현 벡터가 다양하게 개발되어 있다. 이러한 대장균을 이용하여 단백질의 대량 생산을 위한 고농도의 세포 배양 기술이 개발되어 있고, 이러한 기술은 재조합 단백질 생산에 가장 많이 이용되고 있는 실정이다.
그러나, 대장균을 진핵세포(eukaryote) 유래 단백질 생산의 숙주세포로 이용 할 경우 단백질 성숙에 필요한 세포 내 요소를 갖추고 있지 않아 글리코실레이션 (glycosylation)과 같은 해독 후 수정(post-translational modification)과정이 수행되지 않는다는 단점이 있다. 또한, 외래단백질을 과량으로 발현할 경우에는 불용성 침전물인 내포체(inclusion body) 형태로 세포질 내에 축적되는 경우가 많다. 즉, 대장균에서 생산된 상당수의 재조합 단백질들이 활성이 없는 형태로 응집된 내포체(inclusion body)로 존재하는 경우가 흔히 발생한다. "내포체"란 단백질 접힘이 제대로 이루어지지 못하여 올바른 단백질 3차 구조가 형성되지 않기 때문에 생기는 균체 내의 비수용성의 침전물을 말한다. 내포체는 목적단백질의 생성 속도와 접힘 속도간의 불균형으로 인하여 목적단백질의 접힘 중간체가 외부로 노출되어 있는 소수성 부위들의 상호결합에 의해 형성된다. 이럴 경우 내포체를 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 일반적으로 단백질 분해효소에 영향을 덜 받으며, 세포내에 고농도로 축적되므로 생산성 면에서 우수하고, 목적단백질을 쉽게 분리해 낼 수 있는 장점을 지니고 있어 세포내 접힘(folding)이 용이하지 않은 단백질 생산에 이용되기도 한다. 그러나, 내포체 형태로 생산된 목적단백질은 재접힘 과정을 거쳐 생물학적 활성을 회복하여야 하는 부가적인 공정을 필요로 한다.
현재, 재조합 단백질의 생산에 있어서, 상기의 내포체 형태로 발현되는 재조합 단백질을 활성을 가진 단백질로 회수하는 재접힘(refolding) 기술이 잘 발전되어 있다. 이러한 재접힘 공정은 변성제(denaturant)를 이용한 내포체의 가용화 단계와 단백질의 올바른 접힘 유도를 위한 변성제 제거 공정으로 구성된다.
상기 내포체의 가용화 단계에서, 변성제로는 8 M 요소나 6 M guanidine-HCl(Gu-HCl) 같은 강한 chaotropes 또는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 또는 계면활성제가 사용된다. 때때로 강한 염기 환경(pH 12)에서 수행되기도 한다. 재접힘 공정은 단백질이 모두 용해된 후 첨가된 변성제를 부분적으로 제거하면서 시작된다. 상기 변성제의 제거 방법에 따라 단순 희석, 단계적 희석, 유가식 희석, 투석, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법이 사용되고 있다. 전통적인 방법인 단순희석법에 의한 단백질 재접힘 방법은 일반적으로 시료를 4 내지 100배 이상의 부피로 희석하는 과정이 필요하기 때문에, 반응을 위하여 커다란 반응기(reactor)가 필요하다는 점, 매우 저농도의 단백질 농도에서만 적용 가능하여 그 수율이 낮고, 공정에서 처리해야 하는 부피가 매우 크기 때문에 농축 공정을 요구하여 재조합 단백질 생산 및 정제비용이 높다는 점 및 무작위적인 이황화결합이 발생할 수 있다는 점 등이 단점으로 지적되고 있다.
이러한 단순희석법에 있어서의 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 크기 배제 회분식 크로마토그래피를 이용한 단백질 재접힘 방법이 개발되어 활용되고 있다. 이러한 크기 배제 회분식 크로마토그래피(size exclusion batch chromatography)를 이용한 단백질 재접힘 방법은 컬럼 크로마토그래피 방법을 사용하기 때문에 원하는 버퍼 조성으로 치환이 가능하다는 점과 재생이 불완전하게 이루어진 단백질 부분 및 재접힘 공정에 사용된 단백질 변성제(denaturant) 등의 제 거가 용이하다는 점과 같은 장점이 있다. 또한, 단순희석 방법으로는 일반적으로 10 ㎎/㎖ 이상의 농도에서는 단백질의 재접힘 공정이 어려운 것으로 알려져 있는 것에 비하여 크기 배제 회분식 크로마토그래피 방법에 의한 재접힘 공정은 80 ㎎/㎖ 이상의 단백질 농도에서도 재접힘 공정이 가능한 것으로 알려져 있다. 특히, 크기 배제 회분식 크로마토그래피 방법의 경우 단순희석 방법에 비하여 전체 공정의 자동화가 가능하여 재접힘 공정의 표준화 및 효율적인 관리가 가능하다는 장점도 있다.
상기에서 언급한 단순희석법 또는 회분식 크로마토그래피에 의한 단백질 재접힘 공정에서는 재접힘 버퍼로서 요소를 포함하는 버퍼를 사용한다. 요소는 단백질을 재접힘시키는 공정에서 중요한 역할을 한다. 앞서 언급한 바와 같이, 미생물을 이용한 재조합 단백질을 대량 생산하는 경우 미생물에서 생산된 상당수의 재조합 단백질들이 활성이 없는 형태로 응집된 내포체로 존재하는 경우가 흔히 발생하게 된다. 따라서, 단백질을 재접힘시키기 위해서는 변성제를 이용하여 재조합 대장균에 의해 생산된 단백질 내포체를 풀어주는(unfolding) 과정이 필요하게 된다. 이를 위해 요소가 주로 사용된다. 예를 들면, 재조합 대장균에 의해 생산된 내포체를 풀어주기 위해 8 M의 요소를 사용하고, 희석과정을 거쳐 2 M의 요소를 사용할 때 높은 재접힘 수율을 나타내는 것으로 알려져 있다.
한편, 소금과 같이 금속 양이온과 비금속 음이온으로 이루어진 이온성 염 또 는 염화합물이 통상 800 ℃ 이상의 고온에서 녹는 것과는 달리 100 ℃ 이하의 온도에서 융점이 형성되어 있는 염이나 염화합물을 이온성 액체라고 하며, 특히 상온에서 액체로 존재하는 이온성 액체를 상온 이온성 액체(room temperature ionic liquid)라고 한다. 이러한 이온성 액체는 유기 양이온과 음이온으로 구성되어 있으며, 양이온으로서는 디알킬이미다졸륨, 알킬피리디늄, 4급 암모늄, 4급 포스포늄 등이 있고, 음이온으로는 NO3 -, BF4 -, AlCl4 -, Al2Cl7 -, AcO-, PF6 -, TfO-(trifluoromethanesufonate, CF3SO3 -), Tf2N-(trifluoromethanesulfonylamide, (CF3SO2)2N), CH3CH(OH)CO2 -(L-lactate), SbF- 등이 있다. 이온성 액체의 특성으로는 강유전성, 비가연성에 의한 우수한 열적 안정성, 비휘발성, 무독성, 이온전도도를 가지고 있고 높은 극성을 이용하여 무기 및 유기 금속 화합물들을 쉽게 용해시킬 수 있으며 광범위한 온도 범위에서 액체로 존재할 수 있음을 들 수 있다.
현재, 이러한 특성을 갖는 이온성 액체는 촉매, 분리, 전기화학 등의 광범위한 화학분야에서 응용되고 있다. 예를 들면, 이온성 액체를 이용한 분리, 유기금속화합물을 함유한 고활성 촉매로서의 이온성 액체의 합성 및 응용에 대한 연구, 이온성 액체를 첨단 유기합성 기술인 광학활성 화합물 제조기술 개발에의 적용, 이온성 액체를 고정화 촉매로 이용하여 이차 알코올의 트랜스에스테르화(transesterification) 반응을 통한 화합물의 합성 등의 분야에서 높은 활성과 재사용성 및 친환경성 등으로 주목을 받고 있다.
이러한 이온성 액체는 균일계 촉매반응의 용매, 촉매, 분리매개체, 나노화학, 전해질, 초임계 유체-이온성 액체 등을 연계하는 방법 등에서 그 이용이 고려되고 있으나, 아직까지 생물공학에서 사용되는 예는 극히 제한적이다.
종래 보고된 연구결과에 의하면 단백질 재접힘을 위한 재접힘 버퍼로서 상기 요소가 포함된 재접힘 버퍼 중에 이온성 액체로서 0.54 M의 질산 에틸암모늄(ethylammonium nitrate)을 첨가제로 사용하여 라이소자임의 재접힘 효율을 90%까지 향상시킨 보고가 있다(Catherin A. Summers and Robert A. Flowers Ⅱ, Protein Science 9, 2001-2008, 2000년).
그러나, 단백질 재접힘 공정에 사용되는 재접힘 버퍼에 있어서 요소를 완전히 대체하여 이온성 액체를 사용할 경우에는 상온에서 이온성 액체는 기화되지 않고 100 ℃에서도 끓지 않기 때문에 물로부터 손쉽게 분리할 수 있다. 따라서 재접힘 공정 후 이온성 액체를 손쉽게 회수하여 재활용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명자들은 대한민국등록특허 제0748183호에서 단백질 재접힘 버퍼에 포함되어 재접힘 과정에 관여하는 요소를 완전히 대체할 수 있는 이온성 액체를 이용하여 단백질 재접힘 과정을 수행하고 종래의 방법에 의한 수율에 상응하는 수율을 획득하였다. 그러나 상기 특허는 단백질 재접힘 공정의 최적화 조건을 제시하지 못하였으며, 그 결과 단백질 재접힘 효율이 우수한 공정을 설계하는데 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 이온성 액체의 양이온 부분과 음이온 부분을 한정하고, 재접힘 공정의 공정시간을 최적화함으로써 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 것을 확인하고, 본 발명의 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재조합 방법이 이황화 결합을 포함하는 단백질을 대량으로 생산 또는 회수하는 공정에 유용하게 사용될 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Tris-HCl, EDTA, 환원된 글루타치온, 산화된 글루타치온을 포함하는 버퍼용액에 이온성 액체를 가하여 얻어지는 단백질 재접힘 버퍼를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법에 있어서, 상기 이온성 액체는 양이온 부분이 소수성이 작은 화학종이고, 음이온 부분이 황을 포함하는 화학종인 것을 사용하되, 재접힘 공정시간을 최적화하여 수행함으로써, 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 향상시키는 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 단백질 재접힘 버퍼에 사용되는 이온성 액체의 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종을, 음이온 부분으로 황을 포함하는 화학종을 사용하고, 재접힘 공정의 공정시간을 최적화함으로써 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 더욱 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 사용되는 이온성 액체는 세포 독성을 나타내지 않으므로, 본 발명에 따른 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재조합 방법은 이황화 결합을 포함하는 단백질을 대량으로 생산 또는 회수하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명은 Tris-HCl, EDTA, 환원된 글루타치온, 산화된 글루타치온을 포함하는 버퍼용액에 이온성 액체를 가하여 얻어지는 단백질 재접힘 버퍼를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법에 있어서, 이온성 액체의 양이온 부분의 화학종과 음이온 부분의 화학종을 적절하게 선택하고, 재접힘 공정의 공정시간을 최적화시킴으로써, 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 향상시키는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 단백질 재접힘 방법에 있어서, 상기 이황화 결합을 포함하는 단백질은 이황화 결합을 포함하는 단백질이면 특별한 제한이 없다. 이황화 결합을 포함하는 단백질로는 예를 들면, 라이소자임(lysozyme), 단사슬 Fv 절편(single-chain Fv fragment, ScFvOx), 인터페론 α-2b(interferon α-2b), 소마토스타틴(somatostatin), 알파-락트알부민(α-lactalbumin), 콜레시스토키닌 방출 펩타이드(CCK-releasing peptide), 칼시토닌(calcitonin), 코노톡신(conotoxins), 아파민(apamin), 엔도텔린(endothelin), 뇌하수체 후엽 펩타이드(posterior pituitary peptide), β-hANP(antiparallel dimer of α-ANP), μ-코노톡신(μ-Conotoxins(geographutoxins)), ω-코노톡신(ω-Conotoxin), 호박 트립신 저해제(C. maxima trypsin inhibitor), 디펜신(defensins), 카리브도톡신(charybdotoxin), 누에의 small PTTH인 bombyxins, 말미잘 신경독(sea anemone neurotoxin), 사람 인슐린(human insulin), 상피세포성장인자(epidermal growth factors), 소 췌장 트립신 저해제(bovine pancreatic trypsin inhibitor), C5a 아나필락톡신(C5a anaphylatoxin), 엔지오제닌(angiogenin), 에키스타틴(echistatin), 엘라핀(elafin), RNA 분해효소 A(ribonuclease A), 베타-1,4-엔도글루카나제(β-1,4 endoglucanase, EGPh)등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 재접힘 방법에 있어서, 상기 재접힘 버퍼에 사용되는 상기 이온성 액체는 양이온 부분이 소수성이 작은 화학종이고, 음이온 부분이 황을 포함하는 화학종인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질 재접힘 방법에 있어서, 상기 이온성 액체의 양이온 부분은 치환되는 알킬기의 탄소 수가 1 내지 4인 이미다졸륨인 것이 더욱 바람직하고, 상기 이온성 액체의 음이온 부분은 메틸설페이트([CH3SO4]), 에틸설페이트([CH3CH2SO4]), 트리플루오로메탄설포네이트([CF3SO3]), 티오시아네이트([SCN]), 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드([(CF3SO2)2N]) 등과 같은 황을 포함하는 화학 종이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 단백질 재접힘 방법에 있어서, 상기 이온성 액체는 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Bmin][CH3SO4]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 에틸설페이트([Emin][CH3CH2SO4]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 에틸설페이트([Bmin][CH3CH2SO4]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 트리플루오로메탄설포네이트([Emin][CF3SO3]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 트리플루오로메탄설포네이트([Bmin][CF3SO3]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 티오시아네이트([Emin][SCN]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드([Emin][(CF3SO2)2N]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드([Bmin][(CF3SO2)2N]) 등이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 단백질 재접힘 방법에 있어서, 상기 재접힘 공정의 공정시간은 4-16시간 동안 수행되도록 조절하는 것이 바람직하고, 6-10시간 동안 수행되도록 조절하는 것이 더욱 바람직하다. 만약, 상기 공정시간이 4시간 미만이면 재접힘 과정 중에 있는 단백질의 비율이 높으므로 재접힘 효율이 낮은 문제가 있고, 16시간을 초과하는 경우에는 단백질의 안정성이 떨어져 결과적으로 활성을 잃는 단백질의 비율이 증가하는 문제가 있다.
본 발명에 따른 단백질 재접힘 방법은 이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 단백질 재접힘 효율을 측정한 실험결과로부터 이온성 액체의 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종, 예를 들면 치환되는 알킬기의 탄소 수가 1 내지 4인 이미다졸륨을, 음이온 부분으로 황을 포함하는 화학종, 예를 들면 메틸설페이트, 트리플루오로메탄설포네트, 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드 등을 사용하고 재접힘 공정의 공정시간을 4-16시간으로 최적화함으로써 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 더욱 향상시킬 수 있음을 알 수 있다(실험예 1 및 도 1 참조).
또한, 본 발명에 사용되는 이온성 액체는 세포 독성을 나타내지 않으므로(실험예 4 및 도 4 참조), 본 발명에 따른 이온성 액체를 이용한 단백질 재조합 방법은 이황화 결합을 포함하는 단백질을 대량으로 생산 또는 회수하는 공정에 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다,
단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 1-에틸-3- 메틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Emin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
단백질 시료로는 용해 및 환원된 단백질을 사용하기 위하여, 6 M 요소, 32 mM DTT 및 1 mM EDTA를 포함하는 100 mM의 Tris-HCl(pH 8.1) 용액에 라이소자임 10 ㎎/㎖를 6시간 동안 상온에서 방치한 용액을 사용하였다. 상기 라이소자임 시료를 단백질 재접힘 버퍼로 100배 희석하여 라이소자임의 최종 농도를 0.1 ㎎/㎖으로 낮추어서 단순희석법에 의한 재접힘 실험을 수행하였다. 100 mM Tris-HCl(pH 8.1), 1 mM EDTA, 3 mM 환원된 글루타치온, 0.3 mM 산화된 글루타치온 및 1 M의 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])를 포함하는 단백질 재접힘 버퍼를 사용하여 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 실험을 수행하였다.
< 실시예 2> 1-부틸-3- 메틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Bmin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Bmin][[CH3SO4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 1> 1- 헥실 -3- 메틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Hmin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이 용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Hmin][[CH3SO4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 2> 1- 메틸 -3- 옥틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Omin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-메틸-3-옥탈이미다졸륨 메틸설페이트([Omin][[CH3SO4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 3> 1-에틸-3- 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Emin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Emin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 4> 1-부틸-3- 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Bmin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Bmin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 5> 1- 헥실 -3- 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Hmin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Hmin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 6> 1- 메틸 -3- 옥틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Omin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘
상기 실시예 1에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Omin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 7> 1- 헥실 -3- 메틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Hmin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
단백질 시료로는 용해 및 환원된 단백질을 사용하기 위하여, 8M 요소를 포함하는 100 mM의 Tris-HCl(pH 7.0) 용액에 α-아밀라아제(α-amylase) 10 ㎎/㎖를 20시간 동안 상온에서 방치한 용액을 사용하였다. 상기 α-아밀라아제(α-amylase) 시료를 단백질 재접힘 버퍼로 100배 희석하여 α-아밀라아제의 최종 농도를 0.1 ㎎/㎖으로 낮추어서 단순희석법에 의한 재접힘 실험을 수행하였다. 100 mM Tris-HCl(pH 7.0) 및 1 M의 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])를 포함하는 단백질 재접힘 버퍼를 사용하여 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘 실험을 수행하였다.
< 비교예 8> 1-부틸-3- 메틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Bmin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Bmin][[CH3SO4])를 사용한 것을 제외하고는 비교예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 9> 1- 헥실 -3- 메틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Hmin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Hmin][[CH3SO4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 10> 1- 메틸 -3- 옥틸이미다졸륨 메틸설페이트([ Omin ][[ CH 3 SO 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨 메틸설페이트([Omin][[CH3SO4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 11> 1-에틸-3- 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Emin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Emin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 12> 1-부틸-3- 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Bmin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Bmin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 13> 1- 헥실 -3- 메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([ Hmin ][ BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Hmin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 비교예 14> 1- 메틸 -3- 옥틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Omin][BF 4 ])를 이용한 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘
상기 비교예 7에서 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4])대신 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트([Omin][BF4])를 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 수행하였다.
< 실험예 1> 이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 효율
이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 효율을 알아보기 위하여 이황화 결합을 포함하는 단백질인 라이소자임을 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.
대조군으로는 100 mM Tris-HCl(pH 8.1), 1 mM EDTA, 3 mM 환원된 글루타치온, 0.3 mM 산화된 글루타치온 및 2 M 요소를 포함하는 단백질 재접힘 버퍼를 사용하고, 실험군으로는 실시예 1-2 및 비교예 1-6을 사용하였다. 라이소자임의 활성은 0.06 M 인산칼륨(pH 6.2) 버퍼에 3 ㎖의 0.25 ㎎/㎖ M. lysodeikticus 용액에 0.5 ㎖의 재접힘된 라이소자임 시료를 첨가하고, 7 분 동안 분해되는 M.lysodeikticus 의 양에 따른 흡광도의 감소를 450 ㎚의 파장에서 4시간 간격으로 총 24시간 동안 측정함으로써 결정하였고, 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 (a)에 나타난 바와 같이, 이온성 액체의 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종을, 음이온 부분으로 황을 포함하는 화학종을 사용한 실시예 1 및 실시예 2는 대조군보다 높은 단백질 재접힘 효율을 나타내었으며, 재접힘 공정시간이 8시간인 경우에 단백질 재접힘 효율이 가장 높음을 알 수 있다. 특히, 실시예 2는 단백질 재접힘 효율이 100% 이상인 것을 알 수 있다.
도 1의 (b)에 나타난 바와 같이, 양이온 부분으로 소수성이 작은 1-에틸-3- 메틸이미다졸륨([Emin])을 사용한 비교예 3은 대조군보다 높은 단백질 재접힘 효율을 나타내었으며, 재접힘 공정시간이 20시간인 경우에 단백질 재접힘 효율이 가장 높음을 알 수 있다.
또한, 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종을 사용한 실시예 1 및 실시예 2는 양이온 부분으로 소수성이 큰 화학종을 사용한 비교예 1 및 비교예 2보다 단백질 재접힘 효율이 높은 것을 알 수 있으며, 이로부터 이온성 액체의 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종을 사용할 경우에 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 효율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 나아가, 음이온 부분이 메틸설페이트([CH3SO4])인 실시예 1 및 실시예 2와 음이온 부분이 테트라플루오로보레이트([BF4])인 비교예 3-6을 비교해보면, 이온성 액체의 음이온 부분이 테트라플루오로보레이트([BF4])인 경우보다 메틸설페이트([CH3SO4])인 경우에 대체로 단백질 재접힘 효율이 높은 것을 알 수 있으며, 특히 실시예 1 및 실시예 2는 대조군보다 약 3배 정도 단백질 재접힘 효율이 높은 것을 알 수 있다.
이로부터 이온성 액체의 음이온 부분에 황을 포함하는 화학종을 사용할 경우에 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 효율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있고, 재접힘 공정시간을 4-16시간으로 수행하는 경우에 단백질 재접힘 효율이 향상되는 것을 알 수 있으며, 재접힘 공정시간을 6-8시간으로 수행하는 경우에 단백질 재접힘 효율이 가장 많이 향상되는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법에 있어 서, 이온성 액체의 양이온 부분으로 소수성이 작은 화학종을, 음이온 부분으로 황을 포함하는 화학종을 사용하고, 재접힘 공정의 공정시간을 4-16시간으로 최적화함으로써 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 더욱 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 2> 이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘 효율
이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질 재접힘 효율을 알아보기 위하여 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질인 α-아밀라아제를 이용하여 하기의 실험을 수행하였다.
대조군으로는 100 mM Tris-HCl(pH 7.0)의 단백질 재접힘 버퍼를 사용하고, 실험군으로는 비교예 7-14를 사용하였다. α-아밀라아제의 활성은 재접힘된 α-아밀라아제의 시료와 1%의 녹말을 반응시킨 후 DNS법을 이용하여 4시간 간격으로 총 24시간 동안 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였고, 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 비교예 7-14는 대부분이 대조군보다 낮은 단백질 재접힘 효율을 나타냄을 알 수 있다. 특히, 상기 실험예 1의 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘에서 높은 효율을 나타낸 이온성 액체인 [Emin][[CH3SO4]와 [Bmin][[CH3SO4]를 이용한 비교예 7은 대조군보다 낮은 단백질 재접힘 효율을 나타 내었고, 비교예 8은 대조군보다 약간 높은 단백질 재접힘 효율을 나타냄을 알 수 있다. 이로부터 비교예 7-14에서 사용한 이온성 액체들은 이황화 결합을 포함하지 않는 α-아밀라아제의 재접힘에 큰 영향을 주지 못하는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법에 있어서, 상기 이온성 액체는 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질의 재접힘에는 영향을 미치지 않으나, 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 향상시킴을 알 수 있다.
< 실험예 3> 이온성 액체가 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘에 미치는 독립적인 영향
이온성 액체가 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘에 미치는 독립적인 영향을 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
대조군으로는 실험예 1과 마찬가지로 100 mM Tris-HCl(pH 8.1), 1 mM EDTA, 3 mM 환원된 글루타치온, 0.3 mM 산화된 글루타치온 및 2 M 요소를 포함하는 단백질 재접힘 버퍼를 사용하고, 대조군"로는 환원된 글루타치온과 산화된 글루타치온을 제거하고, 100 mM Tris-HCl(pH 8.1), 1 mM EDTA 및 2 M 요소를 포함하는 단백질 재접힘 버퍼를 사용하였으며, 실험군으로는 환원된 글루타치온과 산화된 글루타치온이 제거된 실시예 1-2 및 비교예 1-6을 사용하여, 라이소자임의 활성을 0.06 M 인산칼륨(pH 6.2) 버퍼에 M. lysodeikticus를 0.25 ㎎/㎖가 되도록 용해하여 상온에서 450 ㎚ 흡광도의 감소를 4시간 간격으로 총 24시간 동안 측정함으로써 결정하였 고, 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 환원된 글루타치온과 산화된 글루타치온이 제거된 경우에는 이온성 액체의 포함 여부와 상관없이 단백질 재접힘 효율이 대체로 20% 이하인 것을 알 수 있다. 환원된 글루타치온과 산화된 글루타치온은 황을 포함하고 있으며, 상기 글루타치온은 단백질 시료내의 이황화 결합을 리커버리하는 역할을 수행한다.
따라서 이온성 액체 단독으로는 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘에 영향을 미치지 않으며, 글루타치온이 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘에 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있고, 상기 이온성 액체에 의한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘은 글루타치온과의 시너지 효과에 의한 것임을 알 수 있다.
< 실험예 4> 이온성 액체가 세포에 미치는 독성
상기 실험예 1 및 3의 라이소자임 활성은 재접힘된 라이소자임의 양에 따라 M.lysodeikticus 세포가 분해되는 정도가 다른 것을 이용하는 방법으로서, M.lysodeikticus 세포가 재접힘된 라이소자임이 아니라 이온성 액체의 독성으로 인해 분해될 경우, 정확한 단백질 재접힘 효율을 측정하기 어렵게 된다. 따라서, 이온성액체 재접힘 버퍼가 단독적으로 M. lysodeikticus 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
상기 실험예 1의 라이소자임의 활성 실험에서, 재접힘된 라이소자임 시료에 서 라이소자임만 제거하고 이온성액체가 포함된 재접힘 버퍼만을 동량 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였고, 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 이온성 액체를 M. lysodeikticus 세포와 반응시켰을 때 M. lysodeikticus 세포는 2 내지 3%의 세포 사망률을 나타냄을 확인할 수 있다.
이를 통하여 실험예 1 및 3에서 측정된 이온성 액체에 의한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 효율은 이온성 액체의 독성에서 유래된 것이 아니라 라이소자임의 재접힘으로부터 측정된 것임을 알 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실험예 1의 이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 효율을 나타낸 그래프이고;
도 2는 본 발명에 따른 실험예 2의 이온성 액체의 종류 및 재접힘 공정시간에 따른 이황화 결합을 포함하지 않는 단백질의 재접힘 효율을 나타낸 그래프이고;
도 3은 본 발명에 따른 실험예 3의 글루타치온이 제거된 단백질 재접힘 버퍼에 의한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 효율을 나타낸 그래프이고;
도 4는 본 발명에 따른 실험예 4의 이온성 액체가 세포에 미치는 독성을 나타낸 그래프이다.

Claims (6)

  1. Tris-HCl, EDTA, 환원된 글루타치온, 산화된 글루타치온을 포함하는 버퍼용액에 이온성 액체를 가하여 얻어지는 단백질 재접힘 버퍼를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법에 있어서,
    상기 단백질은 이황화 결합을 포함하고, 상기 이온성 액체는 양이온 부분이 소수성이 작은 화학종이고, 음이온 부분이 황을 포함하는 화학종인 것을 사용하되, 재접힘 공정시간을 4-16시간 동안 수행함으로써, 단백질의 재접힘 효율을 향상시키는 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이황화 결합을 포함하는 단백질은 라이소자임(lysozyme), 단사슬 Fv 절편(single-chain Fv fragment, ScFvOx), 인터페론 α-2b(interferon α-2b), 소마토스타틴(somatostatin), 알파-락트알부민(α-lactalbumin), 콜레시스토키닌 방출 펩타이드(CCK-releasing peptide), 칼시토닌(calcitonin), 코노톡신(conotoxins), 아파민(apamin), 엔도텔린(endothelin), 뇌하수체 후엽 펩타이드(posterior pituitary peptide), β-hANP(antiparallel dimer of α-ANP), μ-코노톡신(μ-Conotoxins(geographutoxins)), ω-코노톡신(ω-Conotoxin), 호박 트립신 저해제(C. maxima trypsin inhibitor), 디펜 신(defensins), 카리브도톡신(charybdotoxin), 누에의 small PTTH인 bombyxins, 말미잘 신경독(sea anemone neurotoxin), 사람 인슐린(human insulin), 상피세포성장인자(epidermal growth factors), 소 췌장 트립신 저해제(bovine pancreatic trypsin inhibitor), C5a 아나필락톡신(C5a anaphylatoxin), 엔지오제닌(angiogenin), 에키스타틴(echistatin), 엘라핀(elafin), RNA 분해효소 A(ribonuclease A) 및 베타-1,4-엔도글루카나제(β-1,4 endoglucanase, EGPh)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이온성 액체의 양이온 부분은 치환되는 알킬기의 탄소 수가 1 내지 4인 이미다졸륨인 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이온성 액체의 음이온 부분은 메틸설페이트([CH3SO4]), 에틸설페이트([CH3CH2SO4]), 트리플루오로메탄설포네이트([CF3SO3]), 티오시아네이트([SCN]) 및 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드([(CF3SO2)2N])으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 이온성 액체는 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Emin][CH3SO4]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트([Bmin][CH3SO4]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 에틸설페이트([Emin][CH3CH2SO4]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 에틸설페이트([Bmin][CH3CH2SO4]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 트리플루오로메탄설포네이트([Emin][CF3SO3]), 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 트리플루오로메탄설포네이트([Bmin][CF3SO3]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 티오시아네이트([Emin][SCN]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드([Emin][(CF3SO2)2N]) 및 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드([Bmin][(CF3SO2)2N])로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 재접힘 공정시간을 6-10시간으로 수행하는 경우 최대의 재접힘 효율이 얻어지는 것을 특징으로 하는 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질 재접힘 방법.
KR1020090029446A 2009-04-06 2009-04-06 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법 KR101063347B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090029446A KR101063347B1 (ko) 2009-04-06 2009-04-06 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090029446A KR101063347B1 (ko) 2009-04-06 2009-04-06 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100111068A true KR20100111068A (ko) 2010-10-14
KR101063347B1 KR101063347B1 (ko) 2011-09-07

Family

ID=43131443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090029446A KR101063347B1 (ko) 2009-04-06 2009-04-06 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101063347B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110981967A (zh) * 2019-11-22 2020-04-10 中国海洋大学 α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101436614B1 (ko) 2012-12-27 2014-09-11 한남대학교 산학협력단 금속 기반 이온성 액체를 이용한 금속 단백질 재접힘 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6583268B2 (en) 2000-01-25 2003-06-24 Oklahoma Medical Research Foundation Universal procedure for refolding recombinant proteins
DE10161577B4 (de) 2001-12-14 2008-01-10 Scil Proteins Gmbh Verfahren zur Renaturierung von Proteinen
KR100748183B1 (ko) 2005-05-11 2007-08-10 인하대학교 산학협력단 이온성 액체를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법
AR062069A1 (es) 2006-07-14 2008-10-15 Genentech Inc Replegado de proteinas recombinantes

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110981967A (zh) * 2019-11-22 2020-04-10 中国海洋大学 α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用
CN110981967B (zh) * 2019-11-22 2022-10-14 中国海洋大学 α-芋螺毒素Mr1.1的二聚体、合成方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR101063347B1 (ko) 2011-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Singh et al. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins
KR0126767B1 (ko) 계면활성제를 이용한 단백질 회수방법
KR101741859B1 (ko) 화학적으로 조절된 산화환원 상태를 사용한 단백질의 재폴딩
US8298789B2 (en) Orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhPTH) (1-34)
Sun et al. Tobacco etch virus protease retains its activity in various buffers and in the presence of diverse additives
Hashimoto et al. Protein refolding by reversed micelles utilizing solid‐liquid extraction technique
KR101063347B1 (ko) 이온성 액체를 이용한 이황화 결합을 포함하는 단백질의 재접힘 방법
Williamson et al. Chemically and conformationally authentic active domain of human tissue inhibitor of metalloproteinases‐2 refolded from bacterial inclusion bodies
EP0295859B1 (en) Production of proteins in active forms
US20180037604A1 (en) Process for the purification of recombinant proteins
Kee et al. Incorporation of electric fields to ionic liquids-based aqueous biphasic system for enhanced recovery of extracellular Kytococcus sedentarius TWHKC01 keratinase
Bae et al. Refolding of horseradish peroxidase is enhanced in presence of metal cofactors and ionic liquids
JP3930051B2 (ja) 正しく折畳まれた生物学的に活性の組換えタンパク質の製造方法
KR101436614B1 (ko) 금속 기반 이온성 액체를 이용한 금속 단백질 재접힘 방법
KR100748183B1 (ko) 이온성 액체를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법
IL176763A (en) Process for recovering a chemokine expressed in prokaryotic host cells
US6339061B1 (en) Process for the stabilization of proteins in complex mixtures during their storage in aqueous solvents
CN106754945B (zh) 一种毒素Tx4(6-1)无标签重组蛋白的生产方法
Bae et al. Refolding of laccase in dilution additive mode with copper-based ionic liquid
ZA200101585B (en) Process for the preparation of active somatotropin from inclusion bodies.
Ono et al. Nonaggregating refolding of ribonuclease A using reverse micellar dialysis
US20030138907A1 (en) Purification of human troponin I
AU2004324756A1 (en) A novel process for purification of human growth harmone
EP1575967B1 (en) Process for the extraction and isolation of insulin from recombinant sources
Li et al. Immobilized Triton X-100-assisted refolding of Green Fluorescent Protein-Tobacco Etch Virus protease fusion protein using β-cyclodextrin as the eluent

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140612

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150626

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160602

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee