NO317256B1 - <Gamma>-glutamyl og <beta>-aspartyl inneholdende immunmodulator-forbindelser og fremgangsmater derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører gamma-glutamyl og beta-aspartyl inneholdende immunmodulator-forbindelser og farmasøytisk sammensetning derav. Den vedrører følgelig immunstimulerende forbindelser som stimulerer modning og differensiering av visse klasser av hvite blodceller i kroppen. Denne selektive stimuleringen av hvit.blod-celledifferensiering og proliferasjon forsterker kroppens motstand overfor sykdoms-forårsakende organismer og modulerer og lindrer også selv-inflammatoriske tilstander.

Immunsystemet er et nettverk av celler tilpasset for å beskytte organismen mot patogener og celler som ikke blir gjenkjent som "selv". Når immunsystemet er aktivert, deltar en mengde celler og molekyler for å fremskaffe en effektorfunksjon konstruert for å eliminere "ikke-selv" enheter i kroppen. Lymfocytter er celler i immunsystemet som har evne til spesifikt å gjenkjenne og selektivt eliminere fremmede bestanddeler. I kontrast til andre celler i immunsystemet, så som neutrofiler som er betraktet som uspesifikke i deres reaksjoner overfor invaderende midler, utviser karaktertrekkene til lymfocyttenes spesifisitet, diversitet, hukommelse og selv/ikke-selv gjenkjenning overfor immunresponsen.

Det er to vesentlige populasjoner av lymfocytter: B lymfocytter og T lymfocytter.

B lymfocytter oppstår og modnes innenfor benmargen og er ansvarlig for dannelsen av antistoffmolekyler. T lymfocytter oppstår også ut fra benmargen, men modnes i tymus.

Det er to hovedsubpopulasjoner av T-celler: T hjelpeceller og T cytotoksiske celler. De

to typene av T-cellene kan bli skjelnet ved tilstedeværelse av en av to membranclyko-proteiner, enten CD4 eller CD8. T-hjelpeceller (som uttrykker CD4) når aktivert av antigen-komplekser (fremmede molekyler koblet til spesialproteiner) reagerer ved

utskilling av forskjellige vekstfaktorer kjent kollektivt som cytokiner. Disse cytokinene er signaler som aktiverer andre celler i immunsystemet, inkludert T-cytotoksiske celler. T-cytotoksiske celler (som uttrykker CD8) når aktivert, prolifererer og differensierer til cytoksiske T lymfocytter (CTL) som har evne til å registrere og eliminere fra kroppen patogene celler, fremmede celler, virus-infiserte celler og tumorceller.

Normal utvikling, modning og differensiering av T lymfocytter er regulert av peptidhormoner som blir utskilt av tymiske celler. Slikt homon er 49-aminosyreresidie-peptidet tymopoietin. Residiene 32-36 av tymopoietin, Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, beholder de biologiske aktivitetene til tymopoietin, og utgjør grunnlaget for et immunmodulatorisk medikament betegnet tymopentin. Terapeutiske anvendelser av tymopentin innbefatter anvendelse for leddgikt, dermatologiske tilstander, infeksjoner med bakterier, virus og sopp, reversering av irnmundepresjon forårsaket av kirurgi eller cancerterapi, potensiering av respons overfor hepatitt B virusvaksinering og behandling av ervervet immunsvikt-syndrom (AIDS), en tilstand hvor T-hjelper (CD4) celler blir spesifikt angrepet av virus (Christian, J.S., "A Review of the Pharmacology, Clinical Applications, and Toxicology og Thymopentin," Transgenica: The Journal or Clinical Biotechnology, 1, s. 23-34,1994).

En annen forbindelse med lignende egenskaper som tymopentin er dipeptidet

-Glu-Trp- betegnet tymogen. Sekvensen -Glu-Trp- oppstår også i molekylet som er for-løperen for syntese av tymopoeitin, men -Glu-Trp- er ikke del av 49-aminosyrehormonet, og dette dipeptidet blir ikke gjenkjent som en bidragsyter til den biologiske aktiviteten av tymopoietiner. Tymogen ble oppdaget og ble anvendt primært i Russland for profylakse og behandling av infeksjoner. Tymogen ble anvendt for forsterking av irnmunfunksjonen etter skading av lymfocytter ved eksponering for bestrålning ved uhell som et resultat av Chernobyl-hendelsen. (Khavinson et al., WO 92/17191 og WO 93/08815, "Pharmaceutical Dipeptide Compositions and Methods of Use Thereof'). y-L-glutamyl avledete peptider oppstår naturlig i kroppen, og det mest velkjente eksemplet er tripeptider glutation. Syntetiske y-L-glutamyl-molekyler er også blitt anvendt som kandidatmedikamenter. Disse kandidatene er betegnet "promedikamenter" på grunn av at y-L-glutamyl-gruppen blir anvendt som en bærer for den aktive delen av molekylet. For eksempel demonstrerer y-L-glutaminyl-4-hydroksy-3-jodbenzen anti-tumor aktivitet i mennesker og i musemelanomcellelinjer. Det antas at anti-tumoraktivitetene til denne forbindelsen er forårsaket av enzymatisk frigjøring av 4-hydroksy-3-jodbenzen nære ved tumorcellen (Prezioso et al., "y-Glutamyltranspeptidase Expression Regulates the Growth Inhibitory Activity of the Anti-tumor Prodrug y-glutaminyl-4-hydroxy-3-iodobenzene," International Journal of Cancer, 56, s. 874-879, 1994). y-L-glutamyl-dipamin og y-L-glutamyl-5-hydroksy-tryotofan er videre blitt beskrevet som promedikamenter som kan bære og tilføre dopamin og 5-hydroksytrypofan til hjerneneuroner (Likamwa et al., "The Antinatriuretic Action of y-L-glutamyl-hydroxy-L-tryptophan is Dependent on its Decarboxylation to 5-hydroxytroptamine in Normal Brain," British Journal of Clinical ' Pharmacology, 387:265-260,1994). PCT dokument WO 96/40740, publisert 19. desember 1996, oppfinneren Deigin og Korotkov beskriver peptider ifølge formel X-A-D-Trp-Y (I), hvor: A = D-Glu eller D-isoglutaminsyre (D-iGlu); X = H, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosmørsyre eller 8-amino-kapronsyre; Y = Gly, Ala, Leu, Ile, Val, Nva, Pro, Try, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-Nva, D-Pro, D-Try, D-Phe, D-Trp, y-aminosmørsyre eller e-aminokapron-syre, OH eller 1-3C substituert amino. Forbindelsene (I) angis å ha immunundertrykkende aktivitet (f.eks. inhibering av proliferasjon av miltceller) og være nyttige innen human og veterinær-medisin og eksperimentell biokjemi.

"Bestim," et agronym på angivelsen "best inrniunmodulator," er navnet gitt til en utførelsesform av en ny klasse forbindelser hvortil oppfinnelsen vedrører og som har immunmodulatoriske egenskaper. Opphavssøknaden serie nr. 08 / 634, 718 som er en CIP, beskriver og krever flere forbindelser i den nye klassen av forbindelsene, og krever en immunmodulatorisk terapeutisk metode ved anvendelse av disse forbindelsene. Selve bestimforbindelsen har den kjemiske strukturen til y-L-glutamy 1-L-tryptofan.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig forbindelse, kjennetegnet ved at den har minst to aminosyreresidier og har strukturen ifølge formel 1:

hvor n er 1 eller 2, R er hydrogen, en acyl med 2 til 10 karbonatomer eller en alkyl med fra 1 til 6 karboner, og X er L-tryptofan, D-tryptofan, p-L-aspartan eller P-D-aspartan, og hvori a karbon merket med en stjerne i formel 1 har en stereokonfigurasjon, når h er 2, som er forskjellig fra stereokonfigurasjonen til X.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre forbindelse ifølge krav 1, kjennetegnet ved at X er L-tryptofan og D-tryptofan.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre forbindelse, kjennetegnet ved at den er y-D-glutamyl-L-tryptofan, P-L-aspartan eller P-D-aspartan.

Peptider ifølge formel 1 kan danne farmasøytisk akseptable salter med en hvilken som helst ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Salter av karboksylgrupper innbefatter ikke-toksiske karboksylsyresalter dannet med en hvilken som helst egnet uorganisk eller organisk base.

Formen Bestim har en potent immunstimulatorisk aktivitet når testet i forskjellige eksperimentelle analysesystemer in vitro og in vivo. Mekanismen for dets biologiske virkning er relatert til induksjon av differensiering av benmarg T-lymfocyttforløper, stimulering av lymfocyttprofilerasjon og økning i produksjonen av forskjellige cytokiner, inkludert interleukin-2. Nettoresultat av Bestin<V>s farmakologiske effekt er en selektiv økning i antall T-hjelper lymfocytter, dvs, celler som inneholder CD4 markøren.

Prekliniske studier av Bestim demonstrerer den immunstimulatorisk aktiviteten ved sub-nanomolare konsentrasjoner. In vivo virker den ved doser på 10 ng til 1 ug pr. kg kroppsvekt og har ingen observerbar toksisitet ved dosene 500 til over 1 million ganger høyere enn den immunstimulatoriske dosen. I dyrestudier er den aktiv etter oral administrering.

I premilinære studier i mennesker øker Bestim immunfunksjonen målt ved laboratorieforandringer av lymfocytrfunksjonen. Disse laboratorieforandringene ble ledsaget av positive indikatorer på fordelen i klinisk resultat.

En av de nye analogene, y-D-glutamyl-L-tryptofan er blitt funnet å ha en høyere biologisk aktivitet sammenlignet med den til Bestim og med IL-2 induksjonen observert i et videre doseringsområde.

Et medikament betegnet som et "immunmodulatorisk medikament" har veldefinerte virkningssett. Bestim og analoger derav er effektive som et medikament for immunoterapi av infektiøse sykdommer og for gjenopprettelse av immunaktiviteten som tidligere er blitt redusert ved eksponering for bestrålning eller andre stressfaktorer så som cancer

kjemoterapi eller kirurgi.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse med immunmodulatorisk aktivitet blir hensiktsmessig administrert til pasienter for å modifisere immunsvikt forårsaket av naturlige eller medikamentinduserte tilstander, administrert til pasienter for å lindre og redusere risiko for infeksjoner fra mikroorganismer, spesielt administrert til sykehus-pasienter, til individer utsatt for brannsår, pasienter som gjennomgår kirurgi, pasienter som gjennomgår cancerkjemoterapi, på grunn av at slike individer er spesielt mottakelige for infeksjoner. Immunmodulatoriske forbindelser med formel 1 kan videre bli administrert til pasienter med symptomatiske eller asymptomatiske viralinfeksjoner for å lette viral eliminering og forsterke immuneovervåkningen av patogenorganismer og følgelig redusere sannsynligheten for tilbakevending av sykdom, for eksempel, i individer som er syke av eller som er bærere at herpesviruser, varicellaviruser, heptatittviruser og HIV, administrert til pasienter med sykdommer som endrer naturlige celler slik at de blir gjenkjent som "fremmede" av kroppen, for eksempel, i tilstander så som cancer, og administrering til pasienter med celleinflammatoriske (autoimmune) sykdommer så som leddgikt, multiple sklerose, skleroderma - for å justere immunsystemet til likevekt.

I tillegg til disse anvendelsene med pasienter som har høy risiko for sykdom eller som uttrykker symptomer på sykdom, kan formel I immunmodulatoriske forbindelser med formel 1 bli administrert til den friste populasjonen med hensyn å epidemiske infeksjoner for eksempler sammen med influensavaksineringer eller for å aktivere immunrespons overfor patogener i sammenheng med vaksineringer, for eksempel for vaksinering mot hepatitt, og den tekniske angivelsen for dette er anvendelse av oppfinnelsen som en "adjuvant" ved vaksinering.

Disse anvendelsene kan bli administrert ved doseringer i området på omtrent 1 ng til omtrent 1000 u,g pr. kg kroppsvekt, gitt som enkeltdose eller innimellom på opptil en måned eller mer, og leveringsveiene er fortrinnsvis ved parenteral injeksjon, ved oral eller nasal innhalering eller ved oralt inntak.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen er unike kjemiske forbindelser som modulerer populasjonen av T-hjelperceller til optimale nivåer i verten. For eksempel vil modulering av immunsystemet for å øke antall T-hjelperceller øke organismens evne til å ta med infeksjoner fra bakterier og vimser. Modulering for å øke T-hjelperceller hjelper også kroppen til å bekjempe cancerceller som er blitt fremmede for verten. Alternativt muliggjør disse forbindelsene også at verten kan tilpasse seg sykdommer som oppstår fra endringer av cellegjerkjenningsprosesser hvor det er omfattende angrep av vert T-celler mot endogene vev. I slike tilfeller modulerer de oppfinneriske forbindelsene T-hjelper-populasjon slik at tegn og symptomer på selv-rettete inflammatoriske (autoimmune) sykdommer så som leddgikt og multipel sklerose blir lindret.

"Bestim," et agronym på angivelsen "best immunmodulator," er navnet gitt til en form av en ny klasse av forbindelser hvortil oppfinnelsen tilhører og som har immunmodulatoriske egenskaper. Det har ingen observerbar toksisitet ved doser 500 til 500,000 ganger høyere enn den immunstimulatoriske dosen.

I formel 1 hvor n er R og X som angitt ovenfor. Hensiktsmessige acyl eller alkylgrupper for "R" er: forgrenete eller lineære alkylgrupper med 1 til 6 karboner, acylgrupper fra 2 til 10 karbonatomer, og blokkeringsgrupper så som karbobenzyloksy og t-butyloksy-karbonyl.

Peptider ifølge formel 1 kan danne farmasøytisk akseptable salter med en hvilken som helst ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Illustrerende organiske syrer som danner egnete salter, innbefatter saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og fosforsyre og syre-metallsalter så som natrium monohydrogenortofosfat og kalium hydrogensulfat. Illustrerende organiske syrer som danner egnete salter, innbefatter mono-, di- og trikarboksylsyrer. Eksempler på slike syrer er for eksempel eddiksyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, malonsyre, ravsyre, glutarsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, askorbinsyre, benzosyre, hydroksygenzosyre, fenyleddiksyre, kanelsyre, salisylsyre, 2fenoksybenzosyre og sulfonsyre som metansulfonsyre og 2-hydroksyetansulfonsyre. Salter av karboksylsyre-grupper innbefatter ikke-toksiske karboksylsyresalter dannet med en hvilken som helst uorganisk eller organisk base. Som illustrasjon innbefatter disse saltene disse fra alkali-metaller, som for eksempel natrium og kalium, jordalkaliske metaller, så som kalsium og magnesium, lette metaller fra gruppen IIIA som innbefatter aluminium og organiske primære, sekundære og tertiære aminer, som for eksempel trialkylaminer, inkludert trietyl-amin, prokain, dibenylamin, 1-etenamin, N,N-dibenzyletylendiamin, dihydroabietylamin, (N-(lavere)alkyl-piperidin og et hvilket som helst annet egnet amin.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har vært antatt å tilveiebringe to viktige egenskaper: motstand mot degradering av aminopeptidaser og øket potens.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter forbindelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 5, 6 eller 7 blandet sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Toksisitet

Akutte og subakutte toksisitetsstudier ble utført i dyr med Bestim ifølge betingelser for god laboratoirepraksis. Bestim, preparert som et sterilt lyofilisert pulver i ampuller, ble løst opp i steril 0,9% NaCl løsning og injisert intramuskulært i alle eksperimentene.

Akutt toksisitet: Gnagere (mus og rotter) og huder ble tilfeldig inndelt i grupper med likt antall han- og hunkjønn. Dyrene ble inspisert daglig i 14 dager etter en enkelt dose Bestim (intramuskulært):

Kroppsvekt, totalt utseende og adferd ble vurdert hver dag, og etter to uker ble det utført mikroskopiske og histopatologiske undersøkelser av indre organer (hjerte, lunger, pleurale og periotoneale hulrom, muskler, mave, tynntarm og tarm, lever, milt, bukspytt-kjertel, nyrer, blære, tyroid, hjerne, hud og testikler/ovarier) av alle dyrene.

Ingen dødsfall ble observert i noen av de testete dyrene, og registrerte parametere på generelt utseende, adferd, kroppsvekt, hematologi, biokjemiske og fysiologiske tegn, og makroskopiske og histopatologiske undersøkelser av indre organer var alle innenfor normalgrensene.

Subakutte toksisitetsstudier:

I et andre sett av eksperimenter ble Bestim administrert i lengre varigheter, som følger: rotter: 1 mg/kg og 100 mg/kg, administrert intramuskulært daglig i 3 måneder og i

6 måneder

hunder: 1 mg/kg, 10 mg/kg og 100 mg/kg administrert intramuskulært daglig i 1 måned og i 3 måneder.

Gjentatt injeksjon av Bestim i rotter forårsaket ikke dødsfall i noen dyr, eller produserte forandringer i adferd, eller i hematologiske, biokjemiske eller fysiologiske parametere. Morfologisk utseende av alle organer på makroskopiske og histologiske nivåer var normale. Begge dosene i rotter induserte en viss økning i kroppsvekt i de eksperimentelle dyrene.

Gjentatt injeksjon av Bestim i hunder forårsaket ikke død av noe dyr, eller dannet heller ikke forandringer i adferd, kroppsvekt, hematologiske, biokjemiske eller fysiologiske parametere. Makroskopisk og histologisk undersøkelse av alle undersøkte organer viste ingen signifikante forandringer. Det var ingen lokale inflammatoriske reaksjoner ved injeksjons setet.

Det kan derfor konkluderes med at disse toksiske testene viste at Bestim er fri for akutte eller subakutte toksiske egenskaper i gnagere og hunder. Testete doser i forhold til ventete doser for terapeutiske forsøk var i størrelsesorden 5,000,000 ganger for enkelt-administrering og 100 ganger for gjentatt administrering.

Toksisiteten til fire peptider in vitro ble også vurdert ved anvendelse av murin tymocytter. Tymocytter ble vasket to ganger, resuspendert i RPMI 1640 medium, inneholdende 2% fetalt kalveserum. Cellesuspensjonen ble plassert i 96-brønn skål (1 x IO<6 >celler pr. brønn). Deretter ble peptidene (eller bærer for kontrollbrønnene) tilsatt i brønnene ved ønskete konsentrasjoner. Cellene ble inkubert med peptider eller bærere i løpet av 4 timer ved 37°C i CO2 inkubator. Etter inkubasjonen ble cellelevedyktigheten beregnet mikroskopisk ved anvendelse av eosin B farving. Resultatene er vist i tabell A.

Det sammenlignbare peptidet, y-D-glutamyl-D-tryptopan, ble derimot runnet å redusere cellelevedyktigen (Tabell A) og følgelig å være cytotoksisk ved en dose på 0,1 mg/ml.

Goldstein og Audhya ("Thymopoietin to Thymopentin; Experimental Studies" in Thymopentin in Experimental and Clinical Medicine, Surv. Immunol. Res., 4, s. 1-10, 1985) innførte konseptet som omfatter av immunmodulatoriske medikamenter virker slik at de gjenoppretter irnmunubalansene, enten ubalansene er i hyperresponsiv eller hyperresponsiv tilstand. Bi-rettet aktivitet til disse medikamentene oppstår på grunn av naturen til bioreguleringen hvor ubalansene blir gjenopprettet til et likevekts-innstillingspunkt. Når det gjelder hyporesponsitiviteten, hører administrering av hormonene som regulerer T-lymfocyttene, til å optimalisere og oppregulere funksjonen av selvforsvarssystemet slik at ikke-selv organismer lettere blir avstøtt. Når det gjelder hyperresponsiviteten, fører administrering av immunmodulatoriske medikamenter til å redusere immunprosessene hvor det gale angrepet av nyttige "selv" deler nå blir redusert. Kategorien for kliniske anvendelser av Bestim i hyperresponsive og hyperresponsive immuntilstander er diskutert og eksempler oppført.

Hyperres<p>onsivitet eller immunsviktsbetin<g>elser

Immunsviktstilstander faller inn i tre generelle etiologiske kategorier. For det første er det immunsuppresjon som oppstår som en konsekvens av sykdomsprosessene. For det andre er det immunsvikt som oppstår på grunn av terapi mot andre sykdommer, såkalte iatrogen immunsvikt. For det tredje kan immunsvikt være et resultat av direkte angrep av T-lymfocyttene av human immunsviktvirus (HIV) som forårsaker ervervet immunsvikt-syndrom (AIDS).

Vanlige sykdomsprosesser som fører til immunsvikt, er feilernæring, neoplasi, aldring og infeksjoner. Feilernærte mennesker, pasienter med omfattende cancerformer og mennesker med svekkende sykdommer blir syke og dør oftere på grunn av reduserte celle-medierte, og humorale immune responser øker mottakeligheten for infeksjoner i forskjellige organismer. En tilstand med generalisert svikt i immunresponser er betegnet anergi. Forskjellige typer av infeksjoner, spesielt virale infeksjoner, fører til immunsuppresjon. Et medikament så som Bestim som har evne til å gjøre T-hjelper lymfocytt-komponentene til immunsystemet mer robuste, vil være et viktig terapeutisk middel for å øke motstanden til pasienten overfor infeksjoner. For eksempel kan Bestim eller analoger derav bli: administrert til pasienter, spesielt eldre pasienter, før eller like etter innleggelse i sykehus for å redusere risikoen for nosokomial (sykehusinduserte) infeksjoner, et vanlig og alvorlig klinisk problem

administrert til individer med brannsår, på grunn av at slike individer er spesielt

mottakelige for infeksjoner

administrert til pasienter i sammenheng med epidemiske infeksjoner, for eksempel i sammenheng med influensavaksineringer eller hepatittvaksineringer, for å styrke immunresponsen overfor patogenene

administrert til pasienter med asymptomatiske virale infeksjoner, for å forsterke immunovervåkningen av patogene organismer og redusere sannsynligheten for tilbakevending av sykdom, for eksempel for individer som er bærere av herpesviruser, varicellaviruser, hepatittviruser og HIV.

Iatrogen irnmunsuppresjon er ofte forårsaket av medikamentterapier som enten dreper eller funksjonelt inaktiverer lymfocytter. Forskjellige kjemoterapeutiske medikamenter blir administrert til cancerpasienter, og disse medikamentene er vanligvis cytotoksiske overfor både modne og utviklende lymfocytter samt granulocytt og monocytt forløpere. Cancerkjemoterapi blir derfor som oftest ledsaget av en periode med irnmunsuppresjon og øket risiko for infeksjoner. Bestrålningsbehandling av cancer innbefatter de samme risikoene. Medisineringer (granulocytt-koloni stimulerende faktor) eksisterer for økende neutrofiler i blodet for å bekjempe infeksjoner som oppstår etter cancer kjemoterapi, men ingen medisineringer blir for tiden anvendt for gjenopprettelse av lymfocytt-funksjonene. Store kirurgiske inngrep, for eksempel reparering av aneurismer eller bypass-operasjoner, reduserer også immunfunksjonen i menneskene. Grunner for reduksjon i blodlymfocytter som oppstår på grunn av store inngrep, er ikke klarlagt, men et middel som forhøyer lymfocytrfunksjonene i slike pasienter, har terapeutisk verdi ved reduksjon av sannsynlighet for infeksjoner.

En siste form for ervervet irnmunsuppresjon som bør bli nevnt, er et resultat av fravær av en milt, forårsaket ved kirurgisk fjerning av organet etter traumer eller for behandling av visse hematologiske sykdommer eller som et resultat av infarkt i sviktcelle-sykdom. Pasienter er uten milt er mer mottakelige for infeksjoner med noen organismer, spesielt innkapslete bakterier så som streptococus pneumoniae. Milten er sannsynligvis nødvendig for injeksjon av beskyttende humoral immunrespons overfor slike organismer. Bestim vil hjelpe individer uten en milt eller uten en tymus med motstand mot infeksjon med mikroorganismer.

Data vedrørende peptidene, samt flere syntesemetoder, vil nå bli illustrert i følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av forbindelsene og deres farmasøytiske sammensetninger Materialer og utstyr

Reagens. N-benzyloksykarbonyl-D-glutaminsyre a-benzylester og N-benzyloksykarbonyl-L-glutaminsyre a-benzylester ble fremstilt som beskrevet i Moore et al., J. Chem. Soc, 2349 (1966), og L-tryptofanbenzylester p-toluensulfonat ble fremstilt som beskrevet i Aria et al.,./. Org. Chem., 48, 121 (1983). D-tryptofan, N-metylmorfolin, isobutylklorformat, palladium-trekullkatalysator (10%), N-hydroksysuksinimid, dicykloheksylkarbodiimid, N,N-dimetylformamid, tetrahydrofuran, acetonitril ble oppnådd fra Fluka, og trifluoreddiksyre ble oppnådd fra Merck.

T<y>nnsjiktskormato<g>rafi ( TLC ).

Stigende TLC ble utført på forbelagte skåler Kieselgel 60 F254 (Merck) ved anvendelse av følgende løsningsmiddelsystemer (i volum): A, kloroform/metanol/eddiksyre 0:8:2;

B, 2-propanol/25% N^OH/vann 50:5:15;

C, butanol/eddiksyre/vann 3:1:1.

Peptider ble lokalisert med UV lys, ninhydrin og h-

Høv ytelse væskekromatoerafi CHPLC )

For alle HPLC separeringene ble det samme løsningsmiddelsystemet anvendt: løsnings-middel A - 0,1% trifluoreddiksyre i vann og løsningsmiddel B - acetonitril.

Analytiske kjøringer ble utført på en Gilson kromatograf bestående av to pumper (Model 302), autosampler (Model 402), spektrofotometer (Model 116), Data Master (Model 621), og analytisk kolonne Zorbax ODS 4,6 x 150 mm, 5u,. Strømingsrate - 1 ml/min. Peptidet ble kontrollert ved 230 nm. Elueringsmiddel - lineær gradient på 10-40% B eller 10-90% over 20 min,

Preparativ rensing ble utført på en Gilson kromatografi beståene av to pumper (Model 303), dynamometrisk blander (Model 811), samlingsfraksjoner (Model 202), spektrofotometer (Holochrome) og preparativ kolonne Zorbax ODS 21,2 x 250 mm, 8 u.. Strømingsrate -10 ml/min. Peptidet ble kontrollert ved 230 nm. Elueringsmiddel - lineær gradient på 0-40% B over 80 min.

Nukleær magnetisk resonans

Alle spektere ble registrert med et Brucker CPX-300.spektrometer utstyrt med en Aspect 2000 datamaskin, drevet i Fourier transform metode med kvadraturdeteksjon ved 300 MHz for protoner. 50 mg peptid ble løst opp i 0,5 ml CD3OD hvori 'H gjenværende signal ble satt til referanse ved 3,35 ppm. Dersom ikke annet er angitt, var typiske ervervete parametere: temperatur - omgivende, spektralvidde - 4500 Hz, pulsvidde -1 u.s (6°), og 8192 datapunkter i tidsdomenen. Prosessering ble utført med 16384 punkter. Relaksforsinkelse - 2s.

Eksempel IA

y-D-glutamyl-L-tryptofan

N- benzvloksvkarbonyl- y- D- glutamyl- L- tryptofan dibenzvlester

En løsning av N-benzyloksykarbonyl-D-glutaminsyre a-benzylester (0,74 g,

2 mmol) og N-metylmorfolin (0,22 ml, 2 mmol) i tørr tetrahydrofuran blir avkjølt til -15°C. Isobutylklorformat (0,28 ml, 2 mmol) blir tilsatt og blandingen latt stå ved -10°C i 3 minutter for dannelsen av blandet anhydrid. Ved det tidspunktet blir en løsning av L-tryptofanbenzylester p-toluensulfonat (0,93 g, 2 mmol) og N-metylmorfolin (0,22 ml, 2 mmol) i tørr tetrahydrofuran (15 ml) avkjølt til -5°C, tilsatt, og reaksjonsblandingen satt til side i en kjøler ved omtrent 5°C. Neste dag blir løsningen filtrert fra saltet, vasket med tørr tetrahydrofuran (20 ml) og avdampet * vakuum. Resten blir løst opp i etylacetat (50 ml), vasket med like volum vann, 2N H2SO4 løsning, vann, 5% NaHCOs løsning, og vann på ny. Det blir tørket over vannfri Na2S04, filtrert fra tørkemidlet og konsentrert 1 vakuum til omtrent 10 ml. Ved fortynning med heksan (50 ml) separeres produktet. Utbytte 820 mg (62%).Rf(A)-0,75,

y- D- glutamyl- L- tryptofan

En løsning av N-benzyloksykarbonyl-Y-D-glutamyl-L-tryptofandibenzylester (0,6 g, 0,9 mmol) i metanol blir hydrogenert over Pd/C (10%, 200 mg) i løpet av 5 timer. Katalysatoren blir fjernet ved filtrering over trekull og filtratet avdampet til tørrhet. Utbytte 260 mg.

Oppnådd peptid bir renset ved hjelpe av preparativ HPLC og lyofilisert. Utbytte 190 mg. RF (B) - 0,5, RF (C) - 0,45. Som tidligere angitt, blir denne spesielt foretrukne utførelsesformen noen ganger referert til som "SCV-07."

Eksempel IB

y-L-glutamyl-L-tryptofan

N- benzyloksykarbonyl- y- L- glutamyl- L- trvptofan a- benzylester

En løsning av N-benzyloksykarbonyl-L-glutaminsyre a-benzylester (0,99 g,

2,6 mmol) og N-hydroksysuksinimid (0,3 g, 2,6 mmol) i N,N-diemtylformamid 96 ml) blir avkjølt i et is-vannbad og en løsning av dicykloheksylkarbodiimid (0,56 g, 2,7 mmol) i N,N-dimetylformaid (3 ml) blir tilsatt med omrøring. Blandingen blir omrørt i 1 time ved 0°C og over natt ved romtemperatur. Separert N,N-dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering og D-tryptofan (0,64 g, 3,1 mmol) og strietylamin (0,46 ml, 3,3 mmol) blir tilsatt til filtratet. Blandingen blir omrørt i løpet av 16 timer ved romtemperatur og fortynnet med

vann (SO ml). Separert olje blir ekstrahert med etylacetat (3 x 20 ml) og kombinerte organiske lag blir vasket med 2 NH2SO4 løsning (2 x 20 ml) og vann (4 x 30 ml), tørket over Na2SC>4, filtrert fra tørkemidlet og konsentrert /' vakuum til omtrent 10 ml. Ved fortynning med heksan (30 ml) separeres produktet. Utbytte 1,2 g (81%). Rf (A) - 0,7.

Y- L- elutamvl- D- tryptofan

En løsning av N-benzyloksykarbonyl-y-L-glutamyl-D-tryptofan a-benzylester (0,6 g, 0,9 mmol) i metanol (30 ml) blir hydrogenen over Pd/C (10%, 200 mg) i løpet av 2 timer (TLC kontroll). Katalysatoren blir fjernet ved filtrering over trekull, og filtratet avdampet til tørrhet. Utbytte 285 mg.

Oppnådd peptid blir renset ved hjelp av preparativ HPLC og lyofilisert. Utbytte 180 mg. Rf (B)-0,5, Rf(c) - 0,45.

y-L-glutamyl-D-tryptofan har samme <l>H NMR og <13>C NMR spektere som y-D-glutamyl- L-tryptofan.

Eksempel 1C

Fast fasesyntese av p-L-aspartyl-L-tryptofan

Ønsket molekyl blir syntetisert ved anvendelse av 1% divinylbenzen kryssbundet polystyren som fast bærer. 0,1 g Na-tert-Boc-Ninformyl-L tryptofan- Merrifield harpiks (innhold av trp 0,7 mmol/g harpiks) blir plassert i reaksjonsbeholderen. Programmet for automatisert syntese er som følger.

Peptidet ble avbeskyttét og spaltet fra polymeren med flytende hydrogenfluorid (HF) inneholdende 10% anisol og 10% m-kresol ved 0°C i 60 minutter. HF ble fjernet i vakuum ved 0°C, peptidet ble ekstrahert med 30% vandig eddiksyre, vasket med etyleter, lyofilisert og etter deformulering med 0,2 N natriumhydroksid renset ved preparativ høy-ytelse væske kromatografi (HPLC).

Alle Bestim analogene kan bli syntetisert ifølge samme skjema som i tabell 3 ovenfor med anvendelse av forskjellige Boc-derivater, idet trinn 5 er den eneste forskjellen.

Verifisering av syntese

Bestim ble for eksempel karakterisert ved:

1. Høy-ytelse væskekromatografi (HPLC), ved anvendelse av en kromatograf Gilson (France, elueringsmiddel 0,1% TFA/acetonitril, gradient 10-40%, 14 min. kjøring, kolonne Delta-Pack C-18, 300Å, 5 um, 3,9 x 150 nm. Retensjonstiden til produktet var 8,1 min. og renheten, målt som integrert areal under HPLC toppen var 99,7%. 2. Aminosyreanalyse: ved anvendelse av en LKB aminosyreanalysator Alpha Plus 4151 ble produktet hydrolysert i 4 N metansulfonsyre, inneholdende 0,2% tryptamin i vakuum, ved 115°C, 24 timer. Peptidinnholdet av glutaminsyre 1,0,

tryptofan 0,94, bekrefter tilstedeværelse av ønskete rester.

3. Tynnsjiktskromatografi (TLC): system I - n-butanol: etylacetat:eddiksyre:vann = 1:1:1:1, Rf = 0,72; system 2 - sec-butanol:eddiksyre:toluen:vann = 6:1:2:1, Rf=

0,4.

4. Nukleær magnetisk resonansspektrometri (NMR): NMR spektrometer Bruker GXP-300 utstyrt med Aspect 100 datamaskin. I karbon NMR spekteret av peptidet (0,001 M/l løsning) ble detektert: for Glu - ved 30,0; 31,0; 57,2; 176,6; 178,3 ppm; for TRP-ved 35,7; 58,3; 113,1; 116,6; 123,4; 124,3; 126,6; 129,0; 131,0; 140,3; 179,4 ppm. 5. Hurtig atbmbombardementmassespektrometri (FAB-MS), molekylært ion: beregnet 334,13 Da; funnet 333,73.

Preparering av forbindelsene i en farmasøytisk akseptabel saltform er illustrert i eksempel ID nedenfor etterfulgt av formulering av tablettene som beskrevet i eksempel 1E.

Eksempel ID

Preparering av H-y-D-glu-L-trp natriumsalt

N-benzyloksykarbonyl-y-D-glu-L-trp-a-benzylester (5 g, 0,087 M) ble løst opp i metanol (40 ml) og NaHCC-3 (0,73 g, 0,087 M) ble tilsatt. Luft ble erstattet av en sakte strøm av nitrogen og 10% palladium-på-trekullkatalysator (2,5 g i 30 ml vann) ble tilsatt. På ny ble en sakte nitrogenstrøm ført gjennom flasken, og deretter ble innføring av sakte strøm hydrogen påbegynt. Katalysatoren ble oppbevart i suspensjon ved omfattende omrøring. I løpet av 4 timer ble katalysatoren fjernet ved filtrering og vasket med metanol

(10 ml). Filtratet ble avdampet i vakuum og resten triturert med acetonitril. Fast produkt ble samlet på et filter, vasket med acetonitril og tørket i vakuum.

Utbytte: 2,14 g (70%).

Eksempel 1E

Formulerin<g> av tabletter

Eksempel IA oppfinnerisk peptid (y-D-glutamyl-L-tryptofan) ble formulert til

tabletter med enten 98,9% glycin, 1% magnesiumstearat og 0,1% innfinnerisk peptid, eller 94,9% glycin, 5% stivelse og 0,1% innfinnerisk peptid. Hver 100 mg tablett inneholdt 100 u,g oppfinnerisk analog.

Eksempel 2

Bestim og Bestim analogstudier in vivo innvirkning på interleukin 2 (IL-2) produksjon

Soecies: Mus (DBA stamme).

Analyse: Peptidene y-L-glu-L-trp (Bestim) og y-D-glu-L-trp (Bestim analog) ble administrert i mus pr. os i en form for vannløsning ved forskjellige doser indikert i tabellen en gang pr. dag i 5 påfølgende dager. Fem dyr ble anvendt for hver peptiddose. 48 timer senere ble miltene fjernet, og miltcellene ble dyrket i ytterligere 24 timer in vitro i nærvær av IL-2 produksjonsinduseren ConA (5 u.g/ml) i RPMI medium supplementert med 10% føtalt kalveserum i 96-brønn flatbunnete kulturskåler. IL-2- nivåene i supematantene ble målt i bioanalysen ved anvendelse av murin IL-2-avhengig cellelinje CTLL-2 (Gillis et al., 1978).

Konklusjon: Peptidet y-D-glu-L-trp (oppfinnerisk Bestim analog) hadde en høyere biologisk aktivitet sammenlignet med den til Bestim. IL-2 induksjonen ble observert i et mye større doseringsområde, og ved høyere doser ga denne analogen ingen økning i IL-2-induksjonen.

Eksempel 3

Innvirkning på ty-1- antigenekspresjon til murin benmarg T-celleforløpere

Protokoll: Benmargcellene ble oppnådd fra lårben fra CBA mus, og inkubert med peptider in vitro i mikrotitrerings (Terasaki) skåler i Eagle's medium i en time ved 37°C. Ty-1 antigenekspresjon ble bestemt i komplement-avhengig cytotoksistetsanalyse ved anvendelse av anti ty-1- antistoff.

Signifikant forskjell med kontroll, p<0,05, ble observert.

Konklusjon: Oppfinnerisk peptid y-D-glu-L-trp hade høyest aktivitet sammenlignet med aktiviteten til Bestim og analogen y-L-glu-D-trp.

Eksempel 4

In vitro Bestim analogenes biologiske aktivitet

Peptider: Bestim og flere oppfinneriske analoger ble preparert i Iyofilisert form. Like før eksperimentet ble alle peptidene oppløst i vann for å danne løsninger med forskjellige substanskonsentrasj oner.

Innvirkning på IL- 2 produksjon i kultur

Protokoll: Milter fra DBA mus ble fjernet, splenocytter isolert og dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% fetalt kalveserum i 96-brønn flat-bundete kulturskåler.

IL-2 produksjonen ble indusert med 5 ug/ml Con A i 24 timer kultur. Peptider med ønskete konsentrasjoner ble tilsatt til cellekulturene ved "0" tid. IL-2- nivående i kultursuperna-tantene ble bestemt ved anvendelse av IL-2 avhengig CTLL-2 cellelinje (Gillis et al., 1978),

Eksempel 5

Forandringer i immunsystemet til pasienter etter peroral applikasjon

En hvilken som helst av de to tablettformuleringene beskrevet i eksempel 1E ble gitt til to pasienter med cancer en måned etter kirurgisk operasjon.

Studie av første tilfelle

Pasient: "Eg"

Diagnose: Koloncancer

Tidligere terapi: Kirurgi

SCV-07 terapi: 5 daglige perorale tablettapplikasjoner (0,1 mg pr. dag).

Andre studie

Pasient: "Ar"

Diagnose: Kolon cancer

Tidligere terapi: Kirurgi

SCV-07 terapi: 5 daglige perorale tablettapplikasjoner (0,1 mg pr. dag)

Irmvirkning av oppfinnerisk av peptid y-D-glutamyl-L-tryptofan på human neutrofil leukocytttunksjonell aktivitet ble bestemt ifølge forandringene i nivå av fri oksygen radikal produksjon ved anvendelse av spontant luminol-avhengig kjemiluminiscensanalyse (Muto et al., 1986). Prøver av donorens fullblod ble applisert i arbeidskuvetter av 1251 lumino-meter (LKB) sammen med peptider fortynnet i saltvann i en konsentrasjon som angitt i tabellen. Luminol ble tilsatt til hver kuvette og kuvertene ble inkubert i 10 min. Etter at disse kuvertene ble inkubert i luminometerbrønnene i 40 min. ved 37°C og konstant omrøring. Mengde av utviklete superoksidradikaler ble beregnet ved anvendelse av "Lumina" dataprogram og uttrykt som lyssyn i 40 min. (mV/min.). Hver prøie ble studert i triplikat.

Studier av innvirkning av peptidene på human leukocvtkiemotaksis

Kjemotaktisk analyse ble utført ved anvendelse av agarosemigreringsteknikken beskrevet av Nelson et al. (1972). Agarose ble løst opp i 199 kulturmedium supplementert med 10% fetalt kalveserum til en sluttkonsentrasjon på 1%. Denne blandingen ble overført til en vevskulturskål og latt blir til gel. Serier av brønner med 2 mm i diameter og med avstand 3 mm fra hverandre ble spaltet i gelen. 10 ul neutrofiler (2,5 x 106 brønner pr. ml) ble tilsatt til sentralbrønnen. Andre brønner ble fylt på en side med medium for å måle tilfeldig migrering, mens de på den andre siden ble fylt med kjemotaktisk faktor FMLP med 10-7 M, for å måle stimulert migrering. Skålene ble inkubert i en CO2 inkubator i 120 min. Peptider ble ønskete konsentrasjoner ble tilsatt til brønnene ved "0" tid. Celle-migreringen ble avlest under mikroskopet med en mikroskala og uttrykt som kjemotaksisk indeks: stimulerte migrering/tilfeldig migrering.

Studier av innvirkning av peptidene på human leukocytt fagocvtose

Humane neutrofile leukocytter oppnådd fra giverens blod ved Ficoll-Pack separering ble overført til silikon-behandlete rør ved en konsentrasjon 2 x 106 celler pr. ml i Eagle's kulturmedium supplementert med 10% fetalt kalveserum. Gjærceller oppsonisert med humant sera ble anvendt som et objekt for fagocytosen. Gjærcellene ble tilsatt i rør (10 gjærceller pr. 1 neutrofil) og cellesuspensjonen ble inkubert i en CO2 inkubator i 40 min. Etter disse cellene ble vasket ved sentrifugering, ble celleutstryk på objektglass dannet og farvet med Giemsa farve. Fagocytiske celler ble beregnet under mikroskop.

Innvirknine av peptidene på rotteWmocvttproliferasjon in vitro

Triplikatkulturer av innavlete hvite rottetymocytter med 5 x IO<6> ble dyrket med peptider i 72 timer i CO2 inkubator i flatbundete 96-brønn kulturskåler i RPMI-1640 medium supplementert med 1% varme-inaktivert fetalt bovinserum, 2 nM L-glutamin, 80 (ig/ml gentamycin, 5 u,g/ml polymiksin B og 0,5 u.g/ml Concanavalin A. Seksten timer før kulturperiode ble cellene pulsmerket med <3>H tymidin. Cellene ble høstet på glassfiberfiltere med Titertek cellehøster og opptelt i betavæske scintillasjonsteller. Proliferasjonsraten ble uttrykt som tellinger pr. min.

Det kan konkluderes med at peptidene ifølge oppfinnelsen har immunstimulatoriske egenskaper og kan stimulere IL-2 produksjonen til miltlymfocytter, indusere forløper T-lymfocyttmodning og stimulere T-celleproliferasjon. Foretrukket oppfinnerisk peptid y-D-glu-L-trp (SCV-07) er vist å øke immunfunksjonen gjennom stimulering av human neutrofil leukocyttfunksjonell aktivitet, spesielt fagocytose og oksygenradikal produksjon. De oppfinneriske peptidene, spesielt SCV-07, er vist å øke det totale T-lymfocytt og T-hjelper lymfocyttantallet og CD4/CD8 forholdet i perifert blod. De oppfinneriske peptidene, spesielt SCV-07 har også vist å stimulere human neutrofil leukocyttmigrering og bakteriesidal aktivitet.

Claims (8)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har minst to aminosyreresidier og har strukturen ifølge formel 1: hvor n er 1 eller 2, R er hydrogen, en acyl med 2 til 10 karbonatomer eller en alkyl med fra 1 til 6 karboner, og X er L-tryptofan, D-tryptofan, p-L-aspartan eller P-D-aspartan, og hvori a karbon merket med en stjerne i formel 1 har en stereokonfigurasjon, når n er 2, som er forskjellig fra stereokonfigurasjonen til X.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at X er L-tryptofan.

3. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at X er D-tryptofan.

4. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at den er i en farmasøytisk akseptabel saltform.

5. Forbindelse, karakterisert ved at den er y-D-glutamyl-L-tryptofan.

6. Forbindelse, karakterisert ved at den er P-L-aspartan.

7. Forbindelse, karakterisert ved at den er P-D-aspartan.

8. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter forbindelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 5, 6 eller 7 blandet sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.