BRPI0711567A2 - uso de um composto imunomodulador para tratamento de melanoma - Google Patents

Abstract

USO DE UM COMPOSTO IMUNOMODULADOR PARA TRATAMENTO DE MELANOMA. Um composto imunomodulador é administrado para tratar, prevenir, inibir, ou reduzir melanoma em um indivíduo.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

Pedido de Patente de Invenção para: "USO DE UM COMPOSTO IMUNOMODULADOR PARA TRATAMENTO DE MELANOMA" .

Fundamentos da invenção Referência cruzada a pedidos relacionados

O presente pedido reivindica o beneficio relativamente ao Pedido Provisional dos E.U.A. n° 60/793,243 depositado em 20 de abril de 2006. Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao campo do tratamento de melanoma.

Descrição da arte anterior

Melanoma é um tumor maligno de melanócitos. Primariamente, ele é um tumor de pele, mas também é observado, embora menos freqüentemente, nos melanócitos do olho (melanoma uveal). Embora representando uma das formas mais raras de câncer de pele, o melanoma permanece subjacente à maior parte das mortes relacionadas com câncer de pele. Apesar de muitos anos de pesquisa intensa em laboratórios e clinicas, a única cura efetiva corrente é a ressecção cirúrgica do tumor primário antes que este atinja uma espessura superior a 1 mm.

O melanoma de pele é responsável por 160.000 casos novos em todo o mundo, a cada ano, e é mais freqüente em homens brancos. Ele é particularmente comum em populações brancas que vivem em climas Saúde], cerca de 48.000 mortes em todo o mundo devidas a melanoma maligno são registradas anualmente.

O diagnóstico do melanoma requer experiência, porque estágios precoces podem parecer idênticos a nevos inofensivos ou não apresentam qualquer cor. Nevos pigmentados ou de formas irregulares indicam suspeita de um melanoma maligno ou de uma lesão pré- maligna.

Os tratamentos correntes incluem remoção cirúrgica do tumor com tratamento adjuvante; quimioterapia e/ou immunoterapia, e/ou terapia de radiação.

De uma maneira geral, o risco de um indivíduo desenvolver melanoma depende de dois grupos de fatores: intrínseco e ambiental. Fatores "intrínsecos" são, de uma maneira geral, a história familiar de um indivíduo e o genótipo herdado, embora o fator ambiental mais relevante seja a exposição ao sol.

Estudos epidemiológicos sugerem que a exposição à radiação ultravioleta (UVA e UVB) é um dos contribuidores principais para o desenvolvimento de melanoma. Radiação UV causa dano ao DNA das células, que, quando não-reparado, pode criar mutações nos genes das células. Quando a célula se divide, estas mutações são propagadas para novas gerações de células. Se as mutações ocorrerem em oncogenes ou genes supressores de tumor, a taxa de mitose nas células portadoras de mutação pode tornar-se descontrolada, levando à formação de um tumor. Exposição extrema ocasional ao sol (resultando em "queimadura solar") está relacionada causalmente com o melanoma. Outros fatores são mutações na perda, ou na perda total de genes supressores de tumor. 0 uso de camas de bronzeamento (com raios UVA de penetração profunda) esteve ligado ao desenvolvimento de cânceres de pele, incluindo melanoma.

Possíveis elementos significativos na determinação do risco incluem a intensidade e a duração da exposição ao sol, a idade em que ocorre a exposição ao sol, e o grau de pigmentação da pele. A exposição durante a infância é um fator de risco mais importante do que a exposição na fase adulta. Isto é observado em estudos de migração na Austrália, onde pessoas tendem a conservar o perfil de risco de seu país de nascimento se migrarem para a Austrália como adultos. Indivíduos apresentando queimaduras solares que formam bolhas ou que descascam (particularmente nos primeiros vinte anos de vida) apresentam um risco significativamente maior de melanoma.

Pessoas louras e ruivas, pessoas com nevos atípicos múltiplos ou nevos displásticos e pessoas nascidas com nevos melanocíticos congênitos gigantes encontram-se em risco maior.

A história familiar do melanoma aumenta muito o risco de uma pessoa devido a mutações de CDKN2A, CDK4 e diversos outros genes foram encontrados em famílias propensas a melanoma. Pacientes com histórico de um melanoma encontram-se em risco maior de desenvolver um segundo tumor primário. A incidência de melanoma aumentou nos anos mais recentes, mas não está claro o envolvimento da extensão em alterações no comportamento, ambiente, ou detecção precoce.

Melanoma familiar é geneticamente heterogêneo, e identificou- se o loci para melanoma familiar nos braços de cromossomos 1p, 9p e 12q. Reportou-se eventos genéticos múltiplos na patogênese do melanoma. O gene supressor de tumores múltiplos 1 (CDKN2A/MTS1) codifica pl6INK4a - um inibidor de proteína com baixo peso molecular de proteínas quinases dependentes de ciclina (CDKs, cyclin-dependent protein kinases) - que foram localizadas na região p21 do cromossomo humano 9.

Permanece na arte uma necessidade de métodos de tratamento para tratar, prevenir, inibir ou reduzir melanoma.

Sumário da invenção

De acordo com a presente invenção, um método de tratamento para tratar, prevenir, inibir ou reduzir melanoma ou uma metástase do mesmo, ou para tratar, prevenir, inibir ou reduzir o crescimento de células de melanoma ou de metástases das mesmas, em um sujeito, compreende administrar ao sujeito uma quantidade efetiva para o tratamento de melanoma, de um composto imunomodulador de fórmula A

<formula>formula see original document page 5</formula> sendo que, η é 1 ou 2, Ré hidrogênio, acila, alquila ou um fragmento de peptidio, e X é um aminoácido aromático ou heterociclico ou um derivado do mesmo, de forma a tratar, prevenir, inibir ou reduzir referido melanoma ou metástase do mesmo no sujeito, ou tratar, prevenir, inibir ou reduzir o crescimento de referidas células de melanoma ou de metástases das mesmas no suj eito.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 ilustra graficamante o crescimento do tumor em um estudo de uma modalidade em dosagens diferentes.

A Figura 2 ilustra graficamente o peso do tumor no estudo de uma modalidade em dosagens diferentes. Descrição das modalidades preferidas

De acordo com uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método de tratamento para tratar, prevenir, inibir, ou reduzir melanoma por meio da administração de um composto imunomodulador a um sujeito mamífero, de preferência, um sujeito humano.

Em uma modalidade, a doença é melanoma ou uma metástase da mesma. A invenção pode ser usada para tratar, prevenir, inibir ou reduzir o crescimento de células de melanoma ou de metástases das mesmas em um sujeito. De preferência, o melanoma primário é removido por cirurgia antes, durante ou após o tratamento com um composto da invenção. Compostos imunomoduladores de acordo com a presente invenção compreendem immunomoduladores de Fórmula A:

<formula>formula see original document page 7</formula>

Na Fórmula A, n é 1 ou 2, Ré hidrogênio, acila, alquila ou um fragmento de peptidio, e X é um aminoácido aromático ou heterociclico ou um derivado do mesmo. De preferência, X é L- triptofano ou D-triptofano, da forma mais preferível, L-triptofano.

Derivados apropriados dos aminoácidos aromáticos ou heterocíclicos para "X" são: amidas, amidas substituídas por mono- ou di-(C1-C6) alquila, arilamidas, e (C1-C6) alquila ou ésteres de arila. Porções de alquila ou acila apropriados para "R" são: grupos alquila ramificados ou não-ramifiçados com de 1 a cerca de 6 carbonos, grupos acila com de 2 a cerca de 10 átomos de carbono, e grupos bloqueadores, como carbobenzilóxi e t-butiloxicarbonila. De preferência, o carbono do grupo CH mostrado na Fórmula A apresenta uma estéreo-configuração, quando n é 2, que é diferente da estéreo- configuração de X.

Modalidades preferidas usam compostos, como γ-D-glutamil-L- triptofano, γ-L-glutamil-L-triptofano, γ-L-glutami I-Nin-formi I-L- triptofano, N-metil-Y-L-glutamil-L-triptofano, N-acetil-Y-L- glutamil-L-triptofano, γ-L-glutamiI-D-triptofano, β-L-aspartil-L- triptofano, e β-D-aspartil-L-triptofano. Modalidades particularmente preferidas usam γ-D-glutamil-L-triptofano, algumas vezes referido como SCV-07. Estes compostos, métodos para preparar estes compostos, sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos e formulações farmacêuticas dos mesmos são divulgadas na Patente dos Estados Unidos n° 5.916.878, incorporada aqui por referência.

SCV-07, γ-D-glutamil-L-triptofano, é um membro da classe de drogas imunomoduladoras que apresentam porções γ-glutamila ou β- aspartila, que foi descoberto por cientistas russos e está sendo examinado quanto à eficácia em diversas indicações nos E.U.A. pela SciClone Pharmaceuticals, Inc. SCV-07 apresenta uma quantidade de atividades imunomoduladoras in vivo e in vitro. SCV-07 aumenta a proliferação de linfócitos e timócitos induzida com Con-A, aumenta a produção de interleucina-2 (IL-2) induzida com Con-A e a expressão do receptor de IL-2 por linfócitos do baço, e estimula a expressão de Thy-1.2 em células da medula óssea. In vivo, SCV-07 exerce um forte efeito imunoestimulador em animais imunossuprimidos com 5-FU e em um modelo de imunização com células sangüíneas vermelhas de ovelha.

Os compostos de Fórmula A podem ser administrados em qualquer dosagem efetiva, p. ex., em dosagens na faixa de cerca de 0,001 a 1000 mg, de preferência, de cerca de 0,1 a 100 mg e, da forma mais preferível, de cerca de 10 mg. As dosagens podem ser administradas um ou mais vezes por semana, p. ex., numa base diária, com dosagens administradas uma ou mais vezes ao dia. A administração pode ser por meio de qualquer método vantajoso, incluindo oralmente, por via nasal, transdermicamente, por via sublingual, por injeção, infusão periódica, infusão continua, e análogos. As dosagens podem ser administradas por meio de injeção intramuscular, embora seja possível usar outras formas de injeção e infusão, e outras formas de administração, como inalação oral ou nasal ou ingestão oral. É possível usar aerossóis, soluções, suspensões, dispersões, tabletes, cápsulas, xaropes, etc..

Dosagens também podem ser medidas em miligramas por quilograma, com dosagens na faixa de cerca de 0,00001-100 mg/kg, mais preferivelmente na faixa de cerca de 0,01 a 10 mg/kg.

Incluiu-se análogos biologicamente ativos apresentando porções substituídas, deletadas, alongadas, substituídas, ou, de outra forma, modificadas que apresentam atividade substancialmente similar àquela do SCV-07, p. ex., um peptídio derivado de SCV-07 apresentando suficiente homologia com SVC-07 de tal forma que funciona substancialmente da mesma maneira com substancialmente a mesma atividade que SCV-07.

De acordo com uma modalidade, um composto de Fórmula A pode ser administrado a um sujeito para manter, de forma substancialmente contínua, uma quantidade efetiva do composto de Fórmula A no sistema circulatório do sujeito durante um período de tratamento ou de prevenção. Embora, de acordo com a invenção, se considere períodos de tratamento muito mais longos, modalidades da invenção incluem manter de forma substancialmente contínua uma quantidade efetiva do composto de Fórmula A no sistema circulatório do paciente durante períodos de tratamento de pelo menos cerca de 6, 10, 12 horas, ou mais longos. Em outras modalidades, períodos de tratamento são de pelo menos cerca de um dia, e mesmo de uma pluralidade de dias, por exemplo, uma semana ou mais. No entanto, considera-se que tratamentos, como definidos acima, em que quantidades efetivas do composto de Fórmula A são mantidas de forma substancialmente contínua no sistema circulatório do sujeito, podem ser separados por períodos de não-tratamento de durações similares ou diferentes.

De acordo com uma modalidade, o composto de Fórmula Ά é infundido continuamente em um sujeito, por exemplo, por meio de infusão intravenosa, durante o período de tratamento, de forma a manter de forma substancialmente contínua uma quantidade efetiva do composto de Fórmula A no sistema circulatório do sujeito. A infusão pode ser realizada por meio de qualquer meio vantajoso, como por meio de minibomba. Alternativamente, um regime de injeção do composto de Fórmula A pode ser mantido de forma a manter de forma substancialmente contínua uma quantidade efetiva do composto de Fórmula A no sistema circulatório do sujeito. Regimes de injeção vantajosos podem incluir uma injeção a cada 1, 2, 4, 6, etc. horas, de modo a manter de forma substancialmente contínua a quantidade efetiva do peptidio de composto imunomodulador no sistema circulatório do sujeito durante o período de tratamento.

Embora se considere que durante a infusão continua do composto de Fórmula A, a administração será durante um período substancialmente mais longo, de acordo com uma modalidade a infusão contínua do composto de Fórmula A se dá durante um período de tratamento de pelo menos cerca de 1 hora. Mais preferivelmente, a infusão contínua é realizada durante períodos mais longos, como durante períodos de pelo menos cerca de 6, 8, 10, 12 horas, ou mais longos. Em outras modalidades, a infusão contínua é durante pelo menos cerca de um dia, e até mesmo durante uma pluralidade de dias, como durante uma semana ou mais.

Em algumas modalidades, o composto de Fórmula A está presente em um veículo líquido farmaceuticamente aceitável, como água para injeção, solução salina fisiológica, ou similar, a concentrações numa faixa de cerca de 0,001 a 1000 μg/ml, mais preferivelmente de cerca de 0,1 a 100 ug/ml.

Quantidades efetivas de composto de Fórmula A podem ser determinadas por meio de experimentos rotineiros de dose-titulação. O composto de Fórmula A também pode ser administrado com outros agentes. Por exemplo, no caso de tratamentos de câncer referidos agentes incluem agentes quimioterápicos e/ou radiação.

Exemplo 1

Introdução SCV-07 (γ-D-glutamil-l-triptofano) é um dipeptidio sintético que demonstrou atividade imunomoduladora por meio do aumento da diferenciação e função de células T, processos biológicos que são necessários para controlar crescimento de tumor in vivo.

Um dos avanços notáveis na última década é que a polarização de uma resposta imune de TH (células T CD4 + ) do tipo 1 (THl) no sentido do fenótipo de tipo 2 (TH2) contribui para uma imunidade celular diminuída contra o câncer, e que citocinas desempenham um papel central no desenvolvimento de tumores por meio de regulação da expansão de células THl e TH2.

Estudos precedentes com SCV-07 mostram que este composto imunomodulador estimula um desvio de células auxiliares T no sentido de uma resposta imune similar a THl, e que a produção de IFN-γ tanto por células tímicas como também por células de baço, bem como seu nível circulatório no soro, é incrementada por meio de tratamento com SCV-07.

Melanoma é o protótipo de um tumor imunogênico, no qual se aplicou vários tipos de imunoterapia. No presente estudo nós investigamos a atividade biológica in vitro e in vivo de SCV-07 usando um modelo de melanoma murino Bl6. Métodos

Induziu-se tumores por meio de injeção de 1 χ 10"6 células de melanoma Bl6 subcutaneamente na pata traseira de camundongos C57/B16 singênicos. Camundongos foram randomizados em 5 grupos de 10 animais e tratados com SCV-07 em doses de 0,001, 0,01, ou 0,10 mg/kg administrados diariamente i.p. durante 3 dias consecutivos durante 2 semanas, iniciando 3 dias após a implantação do tumor. Grupos de controle foram tratados com solução salina ou dacarbazina (DTIC) a uma dose de 50 mg/kg i.p. durante 3 dias. 0 crescimento do tumor foi avaliado a cada 3 dias com um paquimetro e o peso do tumor foi medido após a morte.

Realizou-se estudos de sensibilidade de células in vitro em uma linhagem de células B16. Células de melanoma confluentes foram colhidas, suspensas em meio completo e semeadas em placas de 24 poços (10"5 células em um volume final de 2 ml/poço) . As células foram tratadas em poços em triplicata durante 24, 48 ou 72 horas de cultura com concentrações escalonadas de SCV-07 compreendendo de 0,1 a 100 yg/ml. A proliferação e a viabilidade de células foram determinadas pelo método de exclusão de corante azul de tripano por meio de contagem manual das células com um hemocitômetro.

A apoptose foi avaliada por meio de análise citométrica de fluxo de DNA. A cada concentração de SCV-07, células aderentes foram separadas das placas por meio de tripsinização, combinadas com as células flotantes e fixadas com 50 % de acetona:metanol a 1:4 em PBS. As células foram suspensas (1 x 106/ml) em PBS contendo 50 μg/ml de iodeto de propidio (PI) e 100 KU/ml de RNase e incubadas no escuro, à temperatura ambiente, durante 30 min. O teor de DNA por célula foi avaliado por meio de f luorescência de PI medida numa escala linear usando-se um citômetro de fluxo FACScan (Becton & Dickinson, San Jose, CA). Células apoptóticas apresentam um manchamento menor, no canal de fluorescência do vermelho, abaixo da população de G0/G1 de células diplóides normais, e são representadas por um largo pico hipodiplóide devido à fragmentação do DNA após eventos apoptóticos. Isto é facilmente distinguivel de um pico estreito de células com teor de DNA diplóide. Assim, a fração de células apoptóticas foi calculada integrando-se o pico pré-Gl.

Resultados

in vivo

Camundongos receberam injeções com células de melanoma B16 e divididos em 5 grupos de 10 camundongos cada. Camundongos de controle receberam injeções de solução salina ou dacarbazina (DTIC). Os efeitos de diferentes doses de SCV-07 foram examinados com relação à taxa de crescimento do tumor e ao tempo de sobrevida.

Os resultados mostram que SCV-07 inibiu o crescimento do tumor de uma maneira dependente da dose, como ilustrado na Tabela A. Após 24 dias, a inibição do crescimento do tumor foi de 6 %, 22,6 %, e 42,7 % para os tratamentos com 0,001,0,01 e 0,1 mg/kg, respectivamente, versus o controle (tratamento com DTIC levou a uma inibição de 19,0%).

Tabela A <table>table see original document page 15</column></row><table>

O peso médio do tumor foi 35 % menor em animais tratados com a maior dose de SCV-07, em comparação com 20 % para as doses menores e 15 % para DTIC.

O tempo de sobrevida de camundongos nos diferentes grupos de tratamento foi monitorado até 30 dias após a injeção de tumor. Após 26 dias, 21 % dos animais tratados com SCV-07 na dose mais alta sobreviveram em boa condição, embora com tumores. Não houve animais sobreviventes nos grupos tratados com doses menores ou com DTIC. in vitro A atividade antiproliferativa de SCV-07 foi avaliada no crescimento de melanoma B16 por meio de contagem direta de células após 2 4 e 48 horas de cultura. Os resultados de um experimento representativo mostram que SCV-07 induziu um efeito inibidor dependente da dose sobre o crescimento de célula em B16. A baixa concentração, o efeito de SCV foi substancialmente citostático, enquanto que a concentração maior (100 pg/ml), SCV-07 apresentou efeitos tóxicos com uma diminuição drástica no número de células viáveis. No entanto, análise citométrica de fluxo com iodeto de propidio não pôde evidenciar qualquer efeito significativo de SCV- 07 sobre o percentual de morte celular apoptótica.

Conclusão

Os resultados mostraram inibição do crescimento de células de melanoma, tanto in vitro como in vivo, e mostram que o tratamento com SCV-07 pode ser uma estratégia terapêutica potencial como conseqüência da modulação da resposta antitumor do hospedeiro, e eliminação direta de células de tumor.

Exemplo 2

Efeito antitumor de SCV-07 em modelo de melanoma B16 murino

Abreviaturas

DTIC Dacarbazina

F Fêmea

g Grama

IR Taxa de inibição <table>table see original document page 17</column></row><table>

Resumo

Avaliou-se neste estudo o efeito antitumor de SCV-07 no modelo de melanoma B16 murino. Um total de 60 camundongos C57/BL6, 30 machos e 30 fêmeas, receberam implantes subcutâneos com células de melanoma B16 murino, seguido de tratamento durante 14 dias consecutivos. SCV-07 foi administrado por meio de injeção subcutânea a 5 grupos de camundongos C57/BL6 respectivamente nas dosagens de 0 (Grupo 1: grupo de controle com veiculo), 0,01 (Grupo 3), 0,1 (Grupo 4), 1,0 (Grupo 5) e 5,0 mg/kg/dia (Grupo 6), durante 14 dias consecutivos (do dia 1 ao dia 14). Dacabazina (DTIC), 50 mg/kg/dia, foi administrada subcutaneamente ao Grupo 2 (grupo de controle positivo) do dia 1 ao dia 14. Os pesos dos tumores foram obtidos no dia 17 após a eutanásia.

Não se verificou mortes em qualquer um dos grupos de doses durante o estudo. Os resultados estatísticos dos pesos corporais mostraram que não há diferença significativa entre grupos tratados com SCV-07 e grupo de controle com veículo, indicando que SCV-07 não tem efeito sobre o ganho de peso corporal. No entanto, os resultados mostraram uma inibição significativa de ganho de peso corporal (P <0,01) no grupo de tratamento com DTIC, que é provavelmente o resultado da toxicidade de DTIC.

No dia 3 e no dia 6, os tamanhos dos tumores de todos os grupos não foram mensuráveis. Os tamanhos médios dos tumores dos grupos de tratamento com SCV-07 no dia 9 não apresentaram diferenças estatísticas quando comparados com o grupo de controle com veículo. No dia 12, os tamanhos médios dos tumores do Grupo 3, Grupo 5 e Grupo 6 foram significativamente menores do que o Grupo 1. Embora o tamanho médio dos tumorse do Grupo 4 no dia 12 fosse menor do que no Grupo 1, os resultados não mostraram significância estatística. No dia 15, os tamanhos médios dos tumores do Grupo 3, Grupo 4, Grupo 5 e Grupo 6 foram menores do que no Grupo 1, mas apenas os resultados do Grupo 5 e Grupo 6 apresentaram significância estatística. A taxa de inibição do crescimento de tumor de SCV-07 do Grupo 6 (maior nível de dose) no dia 15 foi de 30,2 %, indicando uma inibição significativa (p=0,01) do crescimento de tumor em comparação com o grupo de controle com veículo. Grupo 5 (nível de dose de 1,0 mg/kg SCV-07) também apresentou significativa inibição de crescimento do tumor (16,5 %) ao término do tratamento no dia 15. As curvas de crescimento de tumor também mostraram que os tumores cresceram mais lentamente nos animais tratados com SCV-07 em comparação com o grupo de controle com veiculo. Animais no grupo de controle positivo apresentam uma diminuição significativa dos tamanhos médios dos tumores. Suas taxas de inibição do crescimento de tumor foram de 96,9 %, 98,8 % e 95,1 % no dia 9, dia 12 e dia 15, respectivamente. Isto prova que o modelo de tumor usado neste estudo é válido.

No dia 17, os pesos médios de tumores de todos os grupos de tratamento com SCV-07 foram menores do que o grupo de controle com veiculo. No entanto, apenas os resultados do Grupo 3, Grupo 5 e Grupo 6 apresentaram significância estatística. A taxa de inibição do crescimento de tumor do Grupo 6 foi de 30,8 % (p=0,015) quando comparada com o Grupo 1. Grupo 3 e Grupo 5 também mostraram significativa inibição do crescimento de tumor da ordem de 27,5 % e 23,5 %, respectivamente. Animais no grupo de controle positivo apresentam diminuição significativa dos pesos médios dos tumores. Sua taxa de inibição do peso do tumor foi de 85,0 % no dia 17.

Concluindo, o modelo de tumor usado neste estudo é válido. A administração de SCV-07 uma vez ao dia durante 14 dias consecutivos pela via subcutânea é efetiva contra crescimento de tumor de melanoma Bl6 murino. Os pesos dos tumores em três grupos tratados com o artigo de teste foram reduzidos significativamente em comparação com aqueles do grupo de controle com veículo. Os pesos corporais médios dos animais de todos os grupos de tratamento com SCV-07 não foram significativamente diferentes daqueles do grupo de controle com veículo após tratamento com SCV-07, corroborando a falta de toxicidade do artigo de teste. No entanto, embora o tratamento com o controle de quimioterapia positivo, DTIC, tenha diminuído significativamente os tamanhos dos tumores e os pesos dos tumores em comparação com o grupo de controle com veiculo, ele levou a uma inibição significativa do ganho do peso corporal. Os dados deste estudo indicam que SCV-07 em níveis de dosagem de 0,01, 1,0 e 5,0 mg/kg/dia durante 14 dias reduziu significativamente o crescimento de tumor de melanoma B16 sem efeito tóxico sobre o ganho do peso corporal.

Introdução

Este estudo foi iniciado usando o modelo de melanoma B16 murino transplantável para avaliar a efetividade de SCV-07 como um agente antitumor potencial.

Objetivo

0 objetivo deste estudo consiste em avaliar o efeito antitumor potencial de SCV-07 em um modelo de melanoma Bl 6 murino quando administrado subcutaneamente em níveis de dosagem de 0, 0,01, 0,1, 1,0 e 5,0 mg/kg, respectivamente, durante 14 dias consecutivos.

Materiais e métodos

Artigos de teste e de controle

Formulação do artigo de teste

O artigo de teste SCV-07 foi obtido de Sponsor, dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS, NaCl:137 mM, KCI:2,7 mM; K2HPO4:1,4 mM; Na2HPO4:10,1 mM, pH 7,0) para se obter os níveis de dosagem apropriados como indicado na tabela do projeto do estudo. A formulação foi mantida sobre gelo, protegida da luz, e usada dentro de uma semana. Este estudo de duas semanas exigiu duas preparações frescas.

Artigo de controle positivo

Usou-se dacarbazina (DTIC) como o artigo de controle positivo. Ela foi adquirida da Sigma-Aldrich (número de código: D2359) e aliquotada em 10 mg/frasco. Antes do uso, um frasco foi dissolvido em PBS para se obter o nivel de dosagem apropriado como indicado na tabela de projeto do estudo. A formulação foi mantida sobre gelo, protegida da luz, e usada dentro de uma semana. Este estudo de duas semanas exigiu duas preparações frescas.

Sistema de teste e criação animal

Células de melanoma

Células de melanoma B16 murinas foram obtidas do Centro de Cultura de Células da Academia Chinesa de Ciências Médicas [Cell Culture Center of Chinese Academy of Medicai Sciences] (CAMS; Beijing, R.P. da China).

Sistema de teste

Trinta camundongos machos e trinta fêmeas C57BL/6 saudáveis, não tratados, foram recebidos do Instituto de Ciência de Animais de Laboratório [Institute of Laboratory Animal Science], CAMS, Beijing, R.P. da China. Os animais tinham seis semanas de vida e pesavam entre 18 e 22 gramas no inicio do estudo. Cuidados com os animais

Animais foram alojados de forma grupada em compartimentos de caixa de sapato autoclavados com cavacos de madeira autoclavados como o material de cama. A temperatura do recinto dos animais foi mantido a de 22 a 25°C, e a umidade relativa foi mantida a de 40 a 60 %. Manteve-se um ciclo de luz de 12 horas/escuridão de 12 horas, exceto quando interrompido por eventos relacionados com o estudo. Animais foram alimentados à vontade com água estéril e dieta para roedores Science Australia Unites Efforts Rodent Diet. Todos os animais foram aclimatados durante 3 dias antes da inoculação de tumor.

Procedimentos experimentais

Preparação de células de tumor

Como nos procedimentos de cultura de tecidos asséptica, um frasco de células de melanoma B16 (fornecido pelo Centro de Cultura de Células do CAMS) foi descongelado e centrifugado a 1000 rpm, de. 20 a 25°C durante 5 minutos. Os pellets de células foram suspensos em de 0,1 a 0,5 ml de solução salina normal (NS, normal saline) e injetados subcutaneamente na axila direita de cada camundongo (aproximadamente 1x106 células/camundongo). Quando o diâmetro do tumor foi de aproximadamente 1 cm (medido com paquimetro), os animais foram eutanizados com asfixia de CO2 e o tumor foi excisado. Células de tumor foram suspensas em solução salina normal como descrito previamente, e o ciclo de adaptação de células foi repetido uma vez.

Inoculaçâo de células de tumor

No dia O, 1x10"6 células B16 em um volume de 0,1 ml de solução salina normal foram injetadas subcutaneamente na área axilar direita do camundongo. 0 dia de inoculaçâo do tumor foi definido como dia 0.

Projeto do estudo e regime de tratamento No dia 1, os animais foram randomizados em grupos diferentes com base nos seus pesos corporais de tal forma que os pesos corporais médios não foram estatisticamente significantes entre os grupos. A dosagem foi iniciada no dia 1. 0 artigo de teste foi administrado uma vez ao dia durante 14 dias consecutivos via administração subcutânea (sc) com um volume de dose de 0,1 ml/20 g de peso corporal. 0 veiculo também foi dosado diariamente durante 14 dias consecutivos via administração s.c. com o mesmo volume de dose. 0 controle positivo, DTIC, foi administrado diariamente via administração i.p. com o mesmo volume de dose.

Cada grupo de terapia recebeu diferentes regimes de tratamento como delineado na tabela a seguir. Tabela 1: Projeto do estudo

<table>table see original document page 24</column></row><table> Avaliação do efeito antitumor

Durante o período de observação, os tamanhos dos tumores e os pesos corporais foram medidos uma vez a cada 3 dias durante o estudo: o tamanho do tumor por meio de paquímetro, e o peso corporal por meio de balança de laboratório. Observações foram registradas diariamente quanto à mortalidade e morbidez. Os animais foram eutanizados por meio de asfixia com CO2 no dia 17. Os tumores foram excisados, separados, e pesados.

Volume do tumor foi calculado usando a fórmula a seguir: Volume do tumor = Comprimento x largura x largura/2

Taxa de inibição (IR, inhibition rate) do volume de tumor foi calculada de acordo com a fórmula:

IR(TV)= (TV veículo TV tratado com droga) / TV veículo X 100 %

TV é o volume do tumor no dia da medição.

O efeito antitumor do artigo de teste também foi avaliado de acordo com o peso do tumor. 0 peso do tumor de cada camundongo foi registrado após a eutanásia, e calculou-se a taxa de inibição do peso do tumor de acordo com a fórmula: IR(TW)= (peso do tumor veículo - peso do tumor tratado com droga) / peso do tumor veículo x 100 %

Desvios médio e padrão foram calculados usando Excel, e usou- se o teste t de Student para cálculos estatísticos.

Análise estatística Para cada grupo (SCV-07 em cada dose, controle de veiculo e controle de DTIC), comparação inter-grupos foi realizada com relação a volume do tumor, peso do tumor e peso corporal, usando-se um teste t de Student. Valores P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Arquivo e armazenamento de registros

Todos os dados gerados no estudo foram coletados e registrados.

Área de armazenamento: Instituto de Ciências Médicas Básicas, PUMC & CAMS

Resultados e discussão Mortalidade

Não foram verificadas mortes em qualquer dos grupos de doses durante o estudo. Tamanho do tumor

Os resultados estatísticos dos tamanhos de tumor encontram-se listados nas tabelas. As curvas de crescimento de tumor são apresentadas na Figura 1.

Como mostrado na Tabela 2 até a Tabela 6, no dia 3 e dia 6, os tamanhos dos tumores de todos os grupos não foram mensuráveis. Os tamanhos médios dos tumores dos grupos de tratamento com SCV-07 no dia 9 não apresentaram diferenças estatísticas quando comparados com o grupo de controle com veículo. No dia 12, os tamanhos médios de tumores do Grupo 3, Grupo 5 e Grupo 6 foram significativamente menores do que no Grupo 1. Embora o tamanho médio dos tumores do Grupo 4 no dia 12 fosse menor do que no Grupo 1, os resultados não apresentaram significância estatística. No dia 15, os tamanhos médios dos tumores do Grupo 3, Grupo 4, Grupo 5 e Grupo 6 foram menores do que no Grupo 1, mas somente os resultados do Grupo 5 e Grupo 6 mostraram significância estatística. A taxa de inibição do crescimento de tumor de SCV-07 do Grupo 6 (maior nível de dose) no dia 15 foi de 30,2 %, indicando uma inibição significativa (p=0,01) do crescimento do tumor quando comparado com o grupo de controle com veículo. Grupo 5 (nível de dose de 1,0 mg/kg SCV-07) também apresentou significativa inibição do crescimento do tumor (16,5 %) ao final do tratamento no dia 15. As curvas de crescimento de tumor também mostraram que os tumores se desenvolveram mais devagar nos animais tratados com SCV-07 quando comparado com o grupo de controle com veículo. Animais no grupo de controle positivo apresentam diminuição significa dos tamanhos médios de tumor. Suas taxas de inibição de crescimento de tumor foram de 96,9 %, 98,8 % e 95,1 % no dia 9, dia 12 e dia 15, respectivamente. Isto prova que o modelo de tumor usado neste estudo é válido.

A Figura 1 demonstra a diminuição do crescimento dos tamanhos de tumor durante o tempo do estudo nos grupos tratados com SCV-07 quando comparado com o grupo de controle com veículo.

Peso corporal Os resultados estatísticos dos pesos corporais encontram-se listados na Tabela 8 até a Tabela 14. Como mostrado nas tabelas, não há diferenças significativas entre grupos tratados com SCV-07 e grupo de controle com veículo. No entanto, os resultados mostraram uma diminuição significativa do peso corporal (P<0,01) no grupo de tratamento com DTIC, que é provavelmente o resultado de toxicidade de DTICs.

Peso do tumor

Como mostrado na Tabela 7, no dia 17, os pesos médios dos tumores de todos os grupos de tratamento com SCV-07 foram menores do que no grupo de controle com veículo. No entanto, apenas os resultados do Grupo 3, Grupo 5 e Grupo 6 apresentaram significância estatística. A taxa de inibição do crescimento de tumor do Grupo 6 foi de 30,8 % (p=0,015) quando comparado com o Grupo 1. Grupo 3 e Grupo 5 também apresentaram significativa inibição do crescimento do tumor, de 27,5 % e 23,5 %, respectivamente. Animais no grupo de controle positivo apresentaram uma diminuição significativa dos pesos médios dos tumores, de 85,0 %.

A Figura 2 demonstra a diminuição do peso de tumor no término do estudo (dia 17).

Conclusão

Concluindo, o modelo de tumor usado neste estudo é válido. A administração de SCV-07 uma vez ao dia durante 14 dias consecutivos pela via subcutânea é efetiva contra crescimento de tumor de melanoma Β16 murino. Pesos de tumores nos três grupos tratados com artigo de teste foram reduzidos significativamente em comparação com aqueles do grupo de controle com veiculo. Os pesos corporais médios dos animais de todos os grupos de tratamento com SCV-07 não foram significativamente diferentes daqueles do grupo de controle com veiculo após tratamento com SCV-07, corroborando a falta de toxicidade do artigo de teste. No entanto, embora o tratamento com o controle de quimioterapia positivo, DTIC, tenha diminuído os tamanhos dos tumores e os pesos dos tumores significativamente quando comparado com o grupo de controle com veículo, ele levou a uma inibição significativa do ganho do peso corporal. Os dados deste estudo indicam que SCV-07 em níveis de dosagem de 0,01, 1,0 e 5,0 mg/kg/dia durante 14 dias reduziu significativamente o crescimento de tumor de melanoma B16 sem efeito tóxico sobre o ganho do peso corporal.

Tabela 2: Resultados estatísticos dos tamanhos dos tumores no dia 3

<table>table see original document page 29</column></row><table> a: o tamanho do tumor não foi mensurável e foi definido como 0.

Tabela 3: Resultados estatísticos dos tamanhos dos tumores no dia 6

<table>table see original document page 30</column></row><table>

a: o tamanho do tumor não foi mensurável e foi definido como 0.

Tabela 4: Resultados estatísticos dos tamanhos dos tumores no dia 9

<table>table see original document page 30</column></row><table> Tabela 5: Resultados estatísticos dos tamanhos dos tumores no dia 12

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Tabela 6: Resultados estatísticos dos tamanhos dos tumores no dia 15

<table>table see original document page 31</column></row><table> Tabela 7: Resultados estatísticos dos tamanhos dos tumores no dia 17

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Tabela 8: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 0

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Tabela 9: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 3

<table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table>

Tabela 10: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 6

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Tabela 11: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 9

<table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table>

Tabela 12: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 12

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Tabela 13: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 15

<table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table>

Tabela 14: Resultados estatísticos dos pesos corporais no dia 17

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Apêndices

Apêndice 1: Medições dos tumores (cm) no dia 3

<table>table see original document page 35</column></row><table> - Não mensurável

Apêndice 2: Volumes dos tumores* (cm3) no dia 3

<table>table see original document page 36</column></row><table>

*Volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula "Volume do tumor=ComprimentoxLarguraxLargura/2" com base nos dados listados no Apêndice 1.

- Não aplicável Apêndice 3: Medições dos tumores (cm) no dia 6

<table>table see original document page 36</column></row><table>

- Não mensurável Apêndice 4: Volumes dos tumores* (cm3) no dia 6

<table>table see original document page 37</column></row><table>

* Volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula "Volume do tumor=ComprimentoxLarguraxLargura/2" com base nos dados listados no Apêndice 3.

- Não aplicável Apendice 5: Medicoes dos tumores (cm) no dia 9

<table>table see original document page 38</column></row><table>

- Nao mensuravel Apêndice 6: Volumes dos tumores* (cm3) no dia 9

<table>table see original document page 39</column></row><table>

* Volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula "Volume do tumor=ComprimentoxLarguraxLargura/2" com base nos dados listados no Apêndice 5.

- Não aplicável Apendice 7: Medicoes dos tumores(cm) no dia 12

<table>table see original document page 40</column></row><table> Apêndice 8: Volumes dos tumores* (cm ) no dia 12

<table>table see original document page 41</column></row><table>

* Volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula "Volume do tumor=ComprimentoxLarguraxLargura/2" com base nos dados listados no Apêndice 7,

- Não aplicável Apendice 9: Medicacoesdos tumores(cm)no dia 15

<table>table see original document page 42</column></row><table> Apêndice 10: Volumes dos tumores* (cm ) no dia 15

<table>table see original document page 43</column></row><table>

* Volumes dos tumores foram calculados usando a fórmula "Volume do tumor=ComprimentoxLarguraxLargura/2" com base nos dados listados no Apêndice 9.

- Não aplicável Apêndice 11: Pesos dos tumores (g) no dia 17

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Apêndice 12: Pesos corporais (g) no dia 0

<table>table see original document page 44</column></row><table> Apêndice 13: Pesos corporais (g) no dia 3

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Apêndice 14: Pesos corporais (g) no dia 6

<table>table see original document page 45</column></row><table> Apêndice 15: Pesos corporais (g) no dia 9

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Apêndice 16: Pesos corporais (g) no dia 12

<table>table see original document page 46</column></row><table> Apêndice 17: Pesos corporais (g) no dia 15

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Apêndice 18: Pesos corporais (g) no dia 17

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Claims (21)

1. Uso de um composto imunomodulador de fórmula (A) <formula>formula see original document page 48</formula> No qual η é 1 ou 2, Ré hidrogênio, acila, alquila ou um peptídio do mesmo, e X é um aminoácido aromático ou heterocíclico ou um derivado do mesmo caracterizado por ser na preparação de um medicamento para tratar, prevenir, inibir ou reduzir melanoma ou uma metástase do mesmo, ou o crescimento de células de melanoma ou metástase do mesmo, em um indivíduo, tratamento este que consiste na administração de uma quantidade eficaz do referido composto imunomodulador de fórmula (A) em um indivíduo.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X ser L-triptofano ou D-triptofano.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser SCV-07.

4. Uso de acordo, com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,001 a 1000 mg.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,01 a 100 mg.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizaido por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,00001 a 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser SCV-07, e por ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,001 a 1000 mg.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido composto ser SCV-07, e por ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,00001 a 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

10. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido tratamento ser para melanoma primário.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,001 a 1000 mg.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,1 a 100 mg.

13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0, 00001 a 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

14. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

15. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido tratamento ser para uma metástase de melanoma.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,001 a 1000 mg.

17. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,1 a 100 mg.

18. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,00001 a 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

19. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o referido composto ser administrado em uma dosagem numa faixa de cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo.

20. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida dosagem ser de cerca de 10 mg.

21. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida dosagem ser de cerca de 10 mg.