RU2091389C1 - Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью - Google Patents
Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2091389C1 RU2091389C1 RU95120266/04A RU95120266A RU2091389C1 RU 2091389 C1 RU2091389 C1 RU 2091389C1 RU 95120266/04 A RU95120266/04 A RU 95120266/04A RU 95120266 A RU95120266 A RU 95120266A RU 2091389 C1 RU2091389 C1 RU 2091389C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- synthesis
- peptides
- amino acid
- added
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к новым пептидным структурам, обладающим иммуномодулирующими свойствами.
Известно применение в медицине большого количества иммуностимуляторов, таких как препараты женьшеня и лимонника, производные никотиновой кислоты, тималин и т.д. (Машковский М.Д. Лекарственные средства, т. 11, М. Медицина, 1988, с. 169).
Недостатком большинства природных препаратов является невысокая активность в связи с низким содержанием активного начала, наличие подобных эффектов.
Известно значительное количество иммуностимуляторов пептидной природы, например, тактивин (патент Франции N 2570278б, кл. A 61 K 39/41), тимозин (Goldstein A. L. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1856-1863), полученных из природного сырья. Эти препараты представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на ряд других физиологических функций организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов. Кроме того, практическое использование таких препаратов затруднено в связи со сложностью способов их извлечения из природного сырья, малым выходом, значительной вариабельностью их физико-химических свойств.
Поиск синтетических пептидов с селективной активностью на счет изменений структуры представляется более целесообразным. Синтетическими пептидными иммуностимуляторами являются пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH (патент США N 4478828, кл. A 61 K 37/00, C 07 C 103/52, 1984), аналоги тимопентина (Европейский патент, кл. C 07 K 7/64, 1985, патент США N 5013723, кл. A 61 K 37/02, 1991) и т.п.
Еще больше интерес представляет создание пептидных иммуностимуляторов на основе коротких, селективно действующих высоко активных пептидов, синтез которых является экономически выгодным.
Прототипом заявляемого изобретения являлся пептид H-α-L-Glu-L-Trp-OH, недостатком которого является менее высокая иммуномодулирующая активность.
Задачей, стоящей перед авторами при создании настоящего изобретения, являлось разработка более эффективных и безопасных иммуномодуляторов на основе коротких пептидов.
Было найдено, что данная задача решается путем использования хотя бы одного из пептидов общей формулы:
где R H, низший ацил или низший алкил,
X ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное, например эфир, амид, гидразид и т.д.
где R H, низший ацил или низший алкил,
X ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное, например эфир, амид, гидразид и т.д.
Пептиды получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе (J. M. Steward and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. San Francisco, 1969), или путем синтеза в растворе (E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965) с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта.
В качестве промежуточной защиты α-аминогруппы аминокислот при твердофазном методе синтеза используют трет-бутилоксикарбонильную группу. Для защиты боковых радикалов аминокислот используют следующие группы: для гистидина бензилоксиметильную; тирозина 2,6-дихлорбензильную; для триптофана формильную и т. д. Для конденсации используют дициклогексилкарбодиимид или дициклогексилкарбодиимид с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Деблокирование ведут 50% -ным раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, а нейтрализацию 5%-ным раствором диизопропилэтиламина в хлористом метилене.
Отщепление полученных пептидов от полимера и деблокирование боковых защитных групп ведут с помощью безводного фтористого водорода, а очистку - гель- и обращеннофазовой хроматографией.
Пример 1. Синтез пептида g-L-глутамил-L-триптофана (1)
0,6 г (0,0018 моль) a-бензилового эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты растворяют в 2,0 см3 диметилформамида, добавляют 0,2 г (0,0018 моль) N-оксисукцинимида, охлаждают до минус 5oC и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0,37 г (0,0018 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2,0 см3 диметилформамида. Смесь перемешивают при 0oC 1 ч и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, прибавляют к фильтрату 0,72 г (0,0022 моль) гидрохлорида бензилового эфира L-триптофана и 0,3 см3 (0,0023 моль) триэтиламина и перемешивают реакционную смесь 16 ч при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50,0 см3 воды и экстрагируют три раза 40 см3 этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20,0 см3 воды, два раза по 20,0 см3 2 н серной кислоты, два раза по 20,0 см3 насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием.
0,6 г (0,0018 моль) a-бензилового эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты растворяют в 2,0 см3 диметилформамида, добавляют 0,2 г (0,0018 моль) N-оксисукцинимида, охлаждают до минус 5oC и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0,37 г (0,0018 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2,0 см3 диметилформамида. Смесь перемешивают при 0oC 1 ч и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, прибавляют к фильтрату 0,72 г (0,0022 моль) гидрохлорида бензилового эфира L-триптофана и 0,3 см3 (0,0023 моль) триэтиламина и перемешивают реакционную смесь 16 ч при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50,0 см3 воды и экстрагируют три раза 40 см3 этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20,0 см3 воды, два раза по 20,0 см3 2 н серной кислоты, два раза по 20,0 см3 насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием.
Упаривают полученный органический раствор при пониженном давлении, остаток обрабатывают 16,0 см3 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 45 мин, снова упаривают при пониженном давлении и прибавляют 25,0 см3 изопропилового спирта.
К полученному раствору 0,3 г (0,00048 моль) фторацетата дибензилового эфира g-дипептида прибавляют 0,16 г (0,00096 моль) кислого углекислого натрия и 0,18 г (0,0024 моль) формиата аммония. Реакционную смесь нагревают до 50oC, прибавляют небольшими порциями 5,0 г 10% палладия на угле, суспензированного в 25,0 см3 воды, и перемешивают в течение 30 мин. Отфильтровывают катализатор, упаривают изопропиловый спирт при пониженном давлении, водный раствор лиофилизуют, прибавляют к остатку 20,0 см3 воды и снова лиофилизуют.
Полученный лиофилизат очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества по данным оптической плотности не менее 97% Структура подтверждается данными аминокислотного анализа гидролизата пептида, полученного в результате гидролиза в 3 н паратолуолсульфокислоте. Анализ выявил следующее соотношение аминокислотных остатков: Glu 1,0(1); Trp 0,9(1).
Пример 2. Синтез пептида g-L-глутамил-Nin-формил-L-триптофана (II)
Для синтеза пептида g-L-глутамил-Nin-формил-L-триптофана загружают в реакционный сосуд 0,6 г трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофил-полимера. Содержание триптофана 0,50 ммоль/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (см. табл.1).
Для синтеза пептида g-L-глутамил-Nin-формил-L-триптофана загружают в реакционный сосуд 0,6 г трет-бутилоксикарбонил-Nin-формил-L-триптофил-полимера. Содержание триптофана 0,50 ммоль/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (см. табл.1).
Если нингидриновый тест положителен, повторяют конденсацию, начиная с п. 5.
Для синтеза пептида в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют a-бензиловый эфир N-карбобензокси-L-глутаминовой кислоты.
По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 1 мл тиоанизола и 1 мл мета-крезола, охлаждают до температуры -78oC и в течение 10 мин перегоняют 10 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0oC и перемешивают в течение 60 мин, затем отгоняют фтористый водород. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.
После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 полученный лиофилизат очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифтроуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96% Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.
Пример 3. Синтез пептида g-L-глутамил-b-тиенил-D-аланил-амида (III).
Синтез, блокирование, очистка и характеристика пептида осуществляются теми же способами, что и пептида примера 2, за исключением того, что реакционный сосуд загружают 0,6 г третбутилоксикарбонил-b-тиенил-D-аланил-бензгидриламинополимера и выдерживают реакционную смесь при деблокировании в среде безводного фтористого водорода в течение 2 ч. Содержание b-тиенил-D-аланина 0,5 ммоль/г полимера.
Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97%
Пример 4. Синтез пептида N-метил-g-L-глутамил-L-триптофана (IV).
Пример 4. Синтез пептида N-метил-g-L-глутамил-L-триптофана (IV).
Синтез пептида (IV) осуществляется теми же способами, что и пептида (II) из примера 2, за исключением того, что на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют a-бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил N-метил-L-глютаминовой кислоты.
По завершении синтеза пептидил-полимер высушивают в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянной массы. 1 г пептидил-полимера переносят в реактор установки для работы с жидким фтористым водородом, добавляют 6,5 мл диметилсульфида, 0,8 мл мета-крезола и 0,4 мл этандитиола, охлаждают до температуры -78oC и в течение 10 мин перегоняют 2,5 мл безводного фтористого водорода. Реакционную смесь нагревают до 0oC и перемешивают в течение 120 мин, затем отгоняют фтористый водород и диметилсульфид. Остаток переносят на фильтр Шотта и промывают этилацетатом и эфиром. Пептид экстрагируют 50 мл 25%-ной уксусной кислоты, разбавляют водой и лиофилизируют.
После обессоливания на колонке с Sephadex G-10 полученный лиофилизат очищают обращенно-фазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифтроуксусной кислоте. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 97% Строение вещества доказывалось условиями синтеза и аминокислотным составом. Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.
Пример 5. Синтез пептида N-ацетил- g-L-глутамил-L-триптофана (V).
Синтез пептида (IV) осуществляется теми же способами, что и пептида (II) из примера 2, за исключением того, на стадии конденсации в качестве присоединяемого аминокислотного остатка используют a-бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил L-глютаминовой кислоты. Дипептидил-полимер обрабатывают 50% трифторуксусной кислотой в хлористом метилене (2 раза, 2 и 30 мин), промывают хлористым метиленом (4 раза, по 2 мин) и инкубируют в смеси, содержащей 0,11 мл триэтиламина, 0,28 мл уксусного ангидрида и 5 мл хлористого метилена.
По завершении пептидил-полимер промывают хлористым метиленом (6 раз по 2 мин), высушивают в вакууме, деблокируют и очищают, как показано в примере 4 (пептид IV). Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 96% Аминокислотный состав пептида соответствует теоретическому.
Иммуномодулирующая активность заявляемых пептидов оценивалась в тестах их влияния на уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов q-антигена и по их влиянию на индукцию синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2.
Пример 6. Влияние пептидов на дифференцировку предшественников Т-лимфоцитов костного мозга мышей.
Взвесь клеток костного мозга мышей, умерщвленных дислокацией швейных позвонков, получают путем промывания бедренных костей физиологическим раствором. Пептиды в различных концентрациях добавляют к полученным клеткам в среде Игла и инкубируют в течение часа при 37oC. Уровень экспрессии маркера дифференцировки Т-лимфоцитов q-антигена определяют методом комплементзависимого цитолиза с помощью антител к q-антигену (Terasabi P.I. et al. in Manual of Tissue Typing Techniques, Nathional Institute of Health, Bethesda, 1972, p. 50-55). Данные приведены в табл.2.
Пример 7. Влияние пептидов на продукцию интерлейкина-2 мышиными спленоцитами.
Данные по влиянию пептидов на индукцию синтеза главного ростового фактора Т-лимфоцитов-интерлейкина-2 (Gillis S. et. al. J. Immunol. 1978, v. 120, p. 2027-2032) приведены в табл. 3.
Препараты не токсичны, так как при 1000-кратном превышении терапевтической дозы (1 мг/кг) летальный исход не был обнаружен ни у одного животного.
Claims (1)
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95120266/04A RU2091389C1 (ru) | 1995-11-28 | 1995-11-28 | Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью |
US08/634,718 US5744452A (en) | 1995-11-28 | 1996-04-18 | γ-L-glutamyl containing immunomodulator compounds and methods therewith |
PCT/US1996/017913 WO1997019691A1 (en) | 1995-11-28 | 1996-11-13 | Gamma-l-glutamyl containing immunomodulator compounds and methods therewith |
US09/031,842 US5916878A (en) | 1995-11-28 | 1998-02-27 | γ-glutamyl and β-aspartyl containing immunomodulator compounds and methods therewith |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU95120266/04A RU2091389C1 (ru) | 1995-11-28 | 1995-11-28 | Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU95120266A RU95120266A (ru) | 1997-08-20 |
RU2091389C1 true RU2091389C1 (ru) | 1997-09-27 |
Family
ID=20174241
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU95120266/04A RU2091389C1 (ru) | 1995-11-28 | 1995-11-28 | Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2091389C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999001103A2 (fr) * | 1997-07-04 | 1999-01-14 | Vladimir Evgenievich Nebolsin | Derives de peptides, sels de ces derives acceptables sur le plan pharmaceutique, procede de production de ces derives, utilisation de ces derniers et composition pharmaceutique |
US8163702B2 (en) | 2006-04-20 | 2012-04-24 | Sciclone Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of melanoma |
-
1995
- 1995-11-28 RU RU95120266/04A patent/RU2091389C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1988, т.2, с.169. 2. Патент Франции N 2570278, кл. A 61 K 39/41, 1986. 3. Патент США N 4478823, кл. A 61 K 37/00, 1984. 4. Goldstein A.L. et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1972, v.69, p.1856-1863; 5. Шредер Э., Любке К. Пептиды. - М.:Мир, 1967, т.1, с.116, 398. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999001103A2 (fr) * | 1997-07-04 | 1999-01-14 | Vladimir Evgenievich Nebolsin | Derives de peptides, sels de ces derives acceptables sur le plan pharmaceutique, procede de production de ces derives, utilisation de ces derniers et composition pharmaceutique |
WO1999001103A3 (fr) * | 1997-07-04 | 1999-03-25 | Vladimir Evgenievich Nebolsin | Derives de peptides, sels de ces derives acceptables sur le plan pharmaceutique, procede de production de ces derives, utilisation de ces derniers et composition pharmaceutique |
US8163702B2 (en) | 2006-04-20 | 2012-04-24 | Sciclone Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of melanoma |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4737487A (en) | VIP type peptides | |
AU625598B2 (en) | Peptides having t cell helper activity | |
NL8020195A (nl) | Werkwijze ter bereiding van thymosine alfa1 en derivaten daarvan. | |
AU724781B2 (en) | Peptide and method of obtaining it | |
RU2107691C1 (ru) | Пептид и способ его получения | |
US4866039A (en) | Peptides containing the 18 to 23 residues of vasoactive intestinal peptide, and analogues | |
CA1267996A (en) | Peptides which are active on the central nervous system and have an action on the cholinergic system | |
CA1246055A (en) | N-.omega.-substituted hormonogens of vasopressin and its synthetic analogs | |
RU2091389C1 (ru) | Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью | |
Li et al. | The synthesis of L-histidyl-L-phenylalanyl-L-ornithyl-L-tryptophyl-glycine and L-histidyl-D-phenylalanyl-L-ornithyl-L-tryptophyl-glycine and their melanocyte-stimulating activity | |
US3749703A (en) | Asn15-bovine thyrocalcitonin | |
CA1105925A (en) | Pentapeptide compositions and methods | |
CA1250400A (en) | Peptides having influence on memory processes, processes for producing them and pharmaceutical compositions containing them | |
JPH09503200A (ja) | C反応性タンパク質断片から誘導されたオリゴペプチド | |
RU2120298C1 (ru) | Иммуностимулятор и препарат на его основе | |
US4256736A (en) | Psychopharmacological peptides | |
JPH07188285A (ja) | D−グルコピラヌロン酸及びその誘導体、該化合物の製法並びに該化合物を構成成分として含有する薬理作用を有するペプチド | |
RU2142958C1 (ru) | Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью, и препарат на его основе | |
JPH0137400B2 (ru) | ||
US4358440A (en) | Polypeptide and its production and use | |
US3847892A (en) | Octapeptide solid phase-fragment process and pentapeptide intermediates | |
US4258152A (en) | Pentapeptide modified resin | |
EP0406931B1 (en) | New analogues of all-bond retroinverted thymopentin, the method for the synthesis of the same and their employment for the preparation of pharmaceutical compositions | |
NL8301281A (nl) | Biologisch actieve peptiden. | |
US4089821A (en) | Synthesis of peptide amides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20050325 |
|
QZ4A | Changes in the licence of a patent |
Effective date: 20050325 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141129 |