JP2919965B2

JP2919965B2 - デヒドロジデムニンｂ

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Publication number: JP2919965B2
Application number: JP2513643A
Authority: JP
Inventors: リネハート，ケネス，ロイド; ― バーテロニ，アンナ，マチルドリスゴウ
Original assignee: FUARUMA MARU SA; RATSUFURUZU GUREIAMU KEISU
Current assignee: FUARUMA MARU SA; RATSUFURUZU GUREIAMU KEISU
Priority date: 1989-09-29
Filing date: 1990-10-01
Publication date: 1999-07-19
Anticipated expiration: 2014-07-19
Also published as: US6710029B1; AU642169B2; DE69024965D1; DK0493480T3; USRE39887E1; ES2082003T3; AU6441290A; US6153731A; EP0493480A1; EP0493480B1; DE69024965T2; GB8922026D0; US5834586A; ATE133181T1; JPH05502441A; WO1991004985A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、デヒドロジデムニンＢ、特にアシディアセ
ア（Ascidiacea）網の被嚢動物からの環状デプシペプチ
ドであるデヒドロジデムニンＢの単離に関する。この新
規化合物は、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用および細胞毒
性作用を有することが示されている。

ジデムニンは、様々な種類のトリジデムナム（Tridid
emnum）属から単離された環状デプシペプチドのクラス
を形成する。それらは、ウイルスおよび腫瘍細胞に対し
て強力な作用を有することが示されている（ラインハー
ト、ジュニア、ケイ・エル（Rinehart,Jr.K.L.）ら、J.
Am.Chem.Soc.,（1981）,103,1857-59）。このクラスの
内で現在までのところ最も活性の大きい化合物であるジ
デムニンＢは、強力な免疫抑制作用を有し（モントゴメ
リー、ティー、ダブリュ（Montgomery,D.W.）、ツコス
キイ、シー・エフ（Zukoski,C.F.）、Transplantation
（1985）,40,49-56）およびヒトリンパ球へのプロラク
チンの結合を他のジデムニン化合物よりも強力に抑制す
る（モントゴメリー、ティー、ダブリュ（Montgomery,
D.W.）ら、Fed.Prac,（1987）,44,634）ことが示されて
いる。

本発明は、このクラスの新規且つ更に且つの強い化合
物、すなわち、式（式中、Ｒ＝Ｈ）を有する、地中海の被嚢動物である
アルピディウム・アルビカンス（Alpidium albicans）
から予想外に単離されたデヒドロジデムニンＢ（DBB）
および同じ種類の生物活性を有するその可能な誘導体
（但し、Ｒはアシル、アルキルまたはアリールであるこ
とができる）を提供する。

この化合物は、溶液中で少なくとも２種類のコンフォ
ーマーが可能であることを考慮すれば、下記の特性を有
することを特徴とする： TLC R_f＝0.4;0.35（シリカゲル、2:3,CH₂Cl₂/EtOA
c）;0.5;0.44（シリカゲル;9:1,CHCl₃/MeOH）。

RP-HPLC t_R＝10.7;11.7分（スフェリソルブ（Spheris
orb）C₁₈カラム、250mm×10mm、10μｍ粒度、9:1,MeOH/
H₂O;2ml/分）。

［α］D25°＝−86°（ε1,MeOH） HR FABMS（Ｍ＋Ｈ）C₅₇H₈₈N₇O₁₅m/z計算値1110.636
6）；（Ｍ−側鎖＋Ｈ）：C₄₂H₆₆N₅O₁₁m/z計算値816.478
1（実測値816.4755）；（Ｍ−側鎖）：C₁₅H₂₃N₂O₄m/z計
算値295.1657（実測値295.1657）。

IR（CHCl₃）ν_maxcm^-1:3680,3600,2970,2940,2880,17
40,1650,1605,1540,1510。

¹H NMR（CDCl₃，δ,ppm）:7.83（d,J＝9 Hz,IH）;7.7
9（d,J＝9 Hz,IH）;7.62（d,J＝6 Hz,1H）;7.21（d,J＝
9 Hz,1H）;7.19（d,J＝9 Hz,1H）;7.08（d,J＝8.5 Hz,2
H）;6.85（d,J＝8.5 Hz,2H）;3.77.（s,3H）;3.13（s,3
H）;3.08（s,3H）;2.54（s,3H）;2.50（s,3H）;2.1（s,
3H）;2.02（s,3H）;0.82-0.88（重なり合ったｄおよび
t,30H） ¹³C MMR（CDCl₃，δ,ppm）:204.93（ｓ）;204.77;
（ｓ）;201.23（ｓ）;197.55（ｓ）;173.05（ｓ）;172.
36（ｓ）;171.84（ｓ）;171.21（ｓ）;171.16（ｓ）;17
0.59（ｓ）;169.58（ｓ）;169.51（ｓ）;169.35（ｓ）;
168.36;（ｓ）;168.28（ｓ）;161.31（ｓ）;161.06
（ｓ）;158.64（ｓ）;158.62（ｓ）;130.31（ｄ）;114.
12（ｄ）;114.01（ｄ）;81.47（ｄ）;81.43（ｄ）;70.6
8（ｄ）;70.33（ｄ）;67.97（ｄ）;67.76（ｄ）;66.38
（ｄ）;66.22（ｄ）;60.39（ｔ）;50.88（ｄ）;57.80
（ｄ）;57.45（ｄ）;57.26（ｄ）;57.18（ｄ）;57.12
（ｄ）;55.61（ｄ）;55.57（ｄ）;55.26（ｑ）;54.65
（ｄ）;49.55（ｄ）;49.49（ｄ）;48.85（ｔ）;48.41
（ｔ）;46.98（ｔ）;41.29（ｔ）;41.24（ｔ）;38.78
（ｑ）;38.74（ｑ）;38.68（ｑ）;36.42（ｔ）;36.22
（ｔ）;34.06（ｄ）;33.99（ｄ）;33.96（ｔ）;31.57
（ｄ）;31.38（ｑ）;31.34（ｑ）;31.30（ｑ）;30.69
（ｄ）;29.68（ｔ）;29.64（ｄ）;27.98（ｔ）;27.94
（ｔ）;27.30（ｔ）;27.17（ｔ）;27.08（ｔ）;25.91
（ｔ）;25.87（ｔ）;25.73（ｄ）;25.68（ｄ）;25.63
（ｄ）;25.52（ｄ）;25.48（ｄ）;24.80（ｑ）;24.70
（ｑ）;24.44（ｑ）;24.31（ｑ）;22.21（ｑ）;22.12
（ｑ）;21.92（ｑ）;21.79（ｑ）;21.76（ｑ）;19.46
（ｑ）;17.76（ｑ）;17.72（ｑ）;17.18（ｑ）;16.87
（ｑ）;16.08（ｑ）;15.62（ｑ）;15.48（ｑ）;15.05
（ｑ）;12.55（ｑ）;12.50（ｑ）． DDBの構造決定は、マススペクトル分析法［低および
高分解能FABMS（ラインハート、ジュニア、ケイ、エル
（Rinehart,Jr.K.L.）ら、Pure and Appl.Chem.（198
2）,54,2409-2424）］およびNMRデーターを他のジデム
ニンのデーターと比較することによって行い、天然のジ
デムニンＡと的と適当な側鎖とのカップリングを含むDD
Bの合成によって確認した。低分解能FABマススペクトル
は、m/z 1110（Ｍ＋Ｈ）、816（Ｍ＋2H−側鎖）および2
95（側鎖）にピークを示した。環についての同じm/z量
に加えて、分子イオンおよび側鎖ピークにおける２つの
質量単位が欠如していることから、デヒドロジデムニン
ＢおよびジデムニンＢの間の差異は、側鎖における不飽
和度が１つ多いことによって表わされることを示した。
高分解能FABMSから導かれる分子式は、C₅₇H₈₈N₇O₁₅（Ｍ
＋H,2.8mmu）であり、環および側鎖に対応するフラグメ
ントイオンは、それぞれC₄₂H₆₆N₅O₁₁（0.4mmu）およびC
₁₅H₂₃N₂O₄（2.6mmu）であった。これらのピークについ
てのタンデムマススペクトル分析法では、ジデムニンの
典型的な開裂パターンを示した。

NMRデーターから、ペプチド結合の存在は、δ8ppm付
近のピークおよびアミノ酸残基に対応するメチルシグナ
ルによって示された。これらのピークの幾つかは、少な
くとも室温において溶液では２個の主要なコンフォーマ
ーが存在するために二重または三重になっているが、こ
れらのピークはジデムニンのピークに極めて類似してい
る。DDBとジデムニンＢとの間にみられる主な差異は、
メチルケトンに指定することができる2.04ppmにおける
メチル一重線ピークおよび4.3ppmのラクチル残基におけ
るヒドロキシル基のα−プロトンに対応するシグナルの
不在である。

本発明の化合物は、インビトロではL1210およびＰ−3
88マウス白血病細胞、Ｌ−929、マウス疎性結合性およ
び脂肪組織、Ｂ−16、マウス黒色腫細胞;A−549、ヒト
肺癌細胞;HeLa、ヒト子宮頸部上皮癌細胞、およびKB、
ヒト口腔表皮癌細胞を、インビボでは、Ｐ−338、マウ
ス白血病細胞、ルイス肺癌細胞およびＢ−16黒色腫細胞
を抑制することが示されている。したがって、DDBは抗
腫瘍剤として有用であり、それ故これらの腫瘍細胞を示
す哺乳類の腫瘍細胞の成長を阻害するのに有用である。

下記の表に、インビトロでのそれぞれのラインの細胞
に対するIC₅₀値を纏める。

第１表ライン細胞 IC₅₀（ng/ml）Ｌ−1210 0.3 Ｐ−388 0.175 Ｌ−929 1.9 Ｂ−16 0.225 Ａ−549 0.5 HeLa 0.5 KB 5.6 下記の表に、DDBを投与した後のインビボにおける％T
/Cを示す。

デヒドロジデムニンＢは、ジデムニンＢ（モントゴメ
リー、ディー・ダブリュ（Montgomery,D.W.）、ツコス
キイ、シー・エフ（Zukoski,C.F.）、Transplantation
（1985）,40,49-56）と同様に、強力な免疫モジュレー
ターである。

デヒドロジデムニンＢは、CV−１細胞（サル腎臓細
胞）における単純ヘルペルウイルス、１型に対しても活
性を示したので、これは抗ウイルス剤としても有用であ
る。測定したIC₅₀は、それぞれ60ng/ml（例えば、Ｌ−1
210細胞に対するより10倍大きい）および１μg/mlであ
った。

本発明の化合物は、好ましくは薬学上好適なキャリヤ
ー中に活性成分を適量で含む単位投与形態でヒトおよび
動物に投与する目的で提供される。

実例としては、投与される活性成分の投与水準は、静
脈内では0.05〜約50mg/Kg動物（体）重、腹腔内、皮下
および筋肉内では１〜100mg/Kg、経口では１〜150mg/Kg
とすることができる。

DDBの投与は、新生物形成疾患、例えば急性骨髄球性
白血病、急性リンパ球性白血病、悪性黒色腫、肺の腺
癌、肺の小細胞癌などを有する動物またはヒトにおける
癌細胞の成長を抑制するのに有用である。

このような化合物は、下記の図に記載されている脊索
動物亜門、アシディアセア（Ascidiacea）網の被嚢動物
から単離することができる（単離工程図）。

特に、この化合物は、アプリディウム（Aplidiumu）
属の被嚢動物、更に具体的にはアプリディウム・アルビ
カンス (Aplidiumu albicans)種から単離することができる。
この種は、イペリア半島の地中海沿岸並びにバレアレス
諸島に見出されている。この種は、大ブリテン島、イギ
リス海峡並びにアフリカ海岸およびポルトガルにも見出
されている。これは、有機堆積物のサンゴ礁形成性およ
びシアフィラエ・アルガエ（scilafilae algae）の群落
を好むものと考えられる。これらの群落は、一層好光性
の環境に見出すこともできる。

この被嚢動物のコロニーは、一般的には平坦で且つロ
ーブがある（直径2.5cm）。これら、ゼリー様であり、
コロニーに砂の色を与えている砂で全体に外殻が形成さ
れている。個虫は長さが10mmの白っぽい色をしており、
口の水管には６個のローブがあり、総排泄腔の舌様体
（cloacal languet）は三裂になっており、これは種に
特徴的なものである。一般的には、10〜11列の気門があ
る。胃には、６個の顕著なひだがある。生殖腺はファミ
リー・タイプ（family type）のものであり、消化管の
下方に１または数個のオボサイト（ovocites）および後
腹部において１または２列を形成する多数の睾丸状小胞
（testicular follicles）を有している。幼虫を、アー
トリアルキャヴィティー（artrial cavity）中で１〜９
の数でインキュベーションする。それら３つの吸角ガラ
ス（cupping-glasses）と数個の小胞形成体を全部に有
している。

したがって、本発明による典型的な処理法では、単離
法はホモゲナイズした被嚢類をアルコールで抽出し、所
望なDDBを選択的に精製することから成っている。

第１図に示した例示用の工程図では、被嚢類をMeOHで
抽出し、濾過して、MeOH:トルエン3:1に溶解し、10％Na
NO₃で分配させた。水性層を、CH₂Cl₂、EtOAcおよびｎ−
BuOHで連続して抽出した。有機画分を、CHCl₃:MeOH 9:1
で展開した通常相TLCによって観察した後に纏めると、
2:1（容積／容積）を与え、活性をメタノール性層中で
濃縮した。この極性画分を、シリカゲル中を通過させ、
ステップグラディエントクロマトグラフィを行う。最後
のフラクションを2ml/minの流速で逆相HPLCでさらに精
製する。２つの中位のピークを集めて、容易にＩとIIと
の混合物に相互変換させ、約1:1の比率とした。

DDBは、全合成または天然のジデムニンＡからの半合
成の後に、いずれの場合にもペプチド化学における保護
および活性化の標準的処理法を行うことによって製造す
ることもできる。

ピルビン酸＋Ｌ−Proは、側鎖を生じ、側鎖＋ジデム
ニンＡは、ジヒドロジデムニンＢを生じる。

したがって、例えば、Pro-OBzlをDMFに溶解したもの
をピルビン酸およびHOBtと混合し、DDCをCH₂Cl₂に溶解
したものを加える。反応生成物は精製することができ、
ピルビル−Pro-OBzlに対応する化学的および物理的特性
を示す。

この最後の生成物をCH₂Cl₂に溶解したものにEDCを加
え、次いでジデムニンＡを加えた。蒸発残渣を精製する
と、天然のデヒドロジデムニンＢによる化学的、物理
的、分光学的および生物学的特性を有するDDBを生じ
る。

DDB自体は別として、本発明は、DDBのアシル化、アル
キル化またはアリール化誘導体［但し、Ｒは基COR′で
あることができ、Ｒ′が下記の置換基：CH₃、CH₂R₁、CH
₂R₁、CHR₁R₂R₃またはC₆H₅を表わし、但し、R₁、R₂およびR₃はＲ′によって記載された置換
基を有するまたは持たないアルキル（線形または分枝し
たもの）、アリールまたはアルキルアリールであること
ができる］を含んで成るDDBの誘導体をも包含する。残
基R₁、R₂およびR₃は同一であるかまたはことなるもので
あることもできる。

通常は、この種のDDBからのかかる誘導体はDDB自体と
同様な生物活性、例えば具体的には抗腫瘍、抗ウイル
ス、細胞毒性および免疫抑制活性を示す。

これらの誘導体は、更に好ましくはアルキル、アリー
ルまたはアシル誘導体（但し、Ｒ′は脂肪族または芳香
族基であり、更に好ましくは１〜６の炭素原子を有する
残基）であることができる。

アシル誘導体は、ピリジンまたは他の窒素化した有機
塩基の存在下にて対応する無水カルボン酸で親化合物を
処理することによって、DDBをそれぞれの塩化アシルと
反応させることによって、またはDCCを用いてDDBおよび
対応するカルボン酸から脱水することによって得ること
ができる。

アルキルまたはアリール誘導体（Ｒ＝Ｒ′）の場合に
は、それらは、アルカリ性の有機弱塩基の存在下にてDD
Bを対応するハロゲン化物と反応させることによって、
またはDDBとアルキルまたはアリールヒドロキシ誘導体
との間で有機脱水剤によって脱水することによって得る
ことができる。

機器、材料および方法 NMRスペクトルは、イリノイ大学におけるゼネラル・
エレクトリック（General Electric）QE-300（300MHz,¹
J）ニコレット（Nicolet）NT-360（360MHz,¹H）または
ゼネラル・エレクトリック（General Electric）GN500
（500MHz,¹H）、またはファルマ・マル、エス・エイ（P
harama Mar,S.A.）（マドリッド、スペイン）における
バリアン・ユニティー300（300MHz,¹Hおよび75MHz,
¹³C）で得た。化学シフトは、¹Hについてはδ7.26ppmの
クロロホルムピークに関してppmで表わしている。FABMS
は、イリノイ大学のマススペクトロメトリー・ラボラト
リーにおけるブイジー・アナリティカル・ゼットエイビ
ー（VG Analytical ZAB）で測定した。GC分析は、アル
テック・アソシエーツ・インコーポレーテド（Alltech
Asoociates,Inc.）製チラシルーバル（Chirasil-Var）I
Iキャピラリーカラム（25m x 0.32mm）を備えたバリア
ン（Varian）GC（3700型）を用いて、流速が1.2ml/分の
ヘリウムガスで、昇温オーブン温度（90℃、４℃／分、
180℃）で行った。逆相HPLCはアルテックス（Altex）ポ
ンプ（110A型）およびウォーターズ・アソシエーツ（Wa
ters Associates）製示差屈折計（Ｒ−401型）およびア
ルテック・スフェリソルブ（Alltech Spherisorb）C18
カラム（25cm x 1cm、粒度10μｍ）を備えた装置で、Me
OH:H₂O 9:1を溶媒系として用いて行った。

下記の例によって、本発明を説明する。

例１ 1. 構造決定 DDBの構造は、物理的および分光学的方法によって決
定した。

1.1 分光学的データー TLC R_f＝0.4;0.35（シリカゲル、2:3,CH₂Cl₂/EtOA
c）;0.5;0.44（シリカゲル、9:1,CHCl₃/MeOH）。

RP-HPLC ^tR＝10.7;11.9分（スフェリソルブC₁₈カラ
ム、250mm x 10mm、10μｍ粒度、9:1,MeOH/H₂O、2ml/
分）［α］D25＝−86°（ε1,MeOH） HR FABMS（Ｍ＋Ｈ）C₅₇H₈₈N₇O₁₅m/z計算値1110.6382
（実測値1110.6366）；（Ｍ−側鎖＋Ｈ）：C₄₂H₆₆N₅O₁₁
m/z計算値816.4781（実測値816.4755）；（Ｍ−側
鎖）：C₁₅H₂₃N₂O₄m/z計算値295.1657（実測値295.165
7）。

¹H NMR（CDCl₃，δ,ppm）:7.82（d,J＝9 Hz,1H）;7.7
9（d,J＝9 Hz,1H）;7.62（d,J＝6 Hz,1H）;7.21（d,J＝
9 Hz,1H）;7.19（d,J＝9 Hz,1H）;7.08（d,J＝8.5 Hz,2
H）;6.85（d,J＝8.5 Hz,2H）;3.77.（s,3H）;3.13（s,3
H）;3.08（s,3H）;2.54（s,3H）;2.52（s,3H）;2.50
（s,3H）;2.1（s,3H）;2.02（s,3H）;0.82-0.88（重な
り合ったｄおよびt,30H） ¹³C MMR（CDCl₃，δ,ppm）:204.93（ｓ）;204.77;
（ｓ）;201.23（ｓ）;197.55（ｓ）;173.05（ｓ）;172.
36（ｓ）;171.16（ｓ）;170.59（ｓ）;169.58（ｓ）;16
9.35（ｓ）;168.36;（ｓ）;168.28（ｓ）;161.31
（ｓ）;161.06（ｓ）;158.64（ｓ）;158.62（ｓ）;130.
31（ｄ）;114.12（ｄ）;114.10（ｄ）;81.47（ｄ）;81.
43（ｄ）;70.68（ｄ）;70.33（ｄ）;67.97（ｄ）;67.76
（ｄ）;66.38（ｄ）;66.22（ｄ）;60.39（ｔ）;50.88
（ｄ）;57.80（ｄ）;57.45（ｄ）;57.26（ｄ）;57.18
（ｄ）;57.12（ｄ）;55.61（ｄ）;55.57（ｄ）;55.26
（ｑ）;54.65（ｄ）;49.55（ｄ）;49.49（ｄ）;48.85
（ｔ）;48.41（ｔ）;46.98（ｔ）;41.29（ｔ）;41.24
（ｔ）;38.78（ｑ）;38.74（ｑ）;38.68（ｑ）;36.42
（ｔ）;36.22（ｔ）;34.06（ｄ）;33.99（ｔ）;31.57
（ｄ）;31.38（ｑ）;31.34（ｑ）;31.30（ｑ）;30.69
（ｄ）;29.68（ｔ）;29.64（ｄ）;27.98（ｔ）;27.94
（ｔ）;27.30（ｔ）;27.17（ｔ）;27.08（ｔ）;25.91
（ｔ）;25.87（ｔ）;25.87（ｔ）;25.73（ｄ）;25.68
（ｄ）;25.63（ｄ）;25.52（ｄ）;25.48（ｄ）;24.80
（ｑ）;24.70（ｑ）;24.44（ｑ）;24.44（ｑ）;24.31
（ｑ）;22.21（ｑ）;22.12（ｑ）;21.92（ｑ）;21.79
（ｑ）;21.76（ｑ）;19.46（ｑ）;17.76（ｑ）;17.72
（ｑ）;17.18（ｑ）;16.87（ｑ）;16.08（ｑ）;15.62
（ｑ）;15.48（ｑ）;15.05（ｑ）;12.55（ｑ）;12.50
（ｑ）． 1.2 DDBのアセチル化デヒドロジデムニンＢの構造は、アセチル化生成物を
ジデムニンＢのアセチル誘導体と比較することによって
確認することもできる。

DDBの無水酢酸およびピリジンを用いたアセチル化に
よって、モノアセチル誘導体が得られた。

低分解能マススペクトルは、m/z1153.5（Ｍ＋Ｈ）、8
59.0（Ｍ＋2H−側鎖）及び295.4（側鎖）にピークを示
し、ジデムニンＢに関してアセチル化の２つの可能な部
位の一方が失われ、且つ喪失部位は側鎖におけるラクチ
ル残基のヒドロキシル基であることを示していた。

1.3 アミノ酸残基のＮ−トリフルオロアセチルメチル
エステル DDBの構造は、個々のサブユニットの全加水分解によ
る同定およびアミノ酸のＮ−トリフルオロアセチルメチ
ルエステルへの転換およびGCによる分析によって決定す
ることもできる。

アミノ酸は、それらの保持時間と、ジデムニンＢのア
ミノ酸のＮ−トリフルオロアセチルメチルエステルへの
転換から得られる基準試料の比較とによって同定した。

^tR（分）:L−スレオニン（1.23）;D−Ｎ−Me−ロイシ
ン（1.70）;L−ロイシン（2.05）;L−プロリン（2.3
8）；（3S,4S,5S）−イソスタチン（3.15,4.13,4.77）;
L−N,O−Me₂−チロシン（6.75）。

DDBとガラス蒸留したHClとの混合物を、密封したテフ
ロンをライニングしたねじ蓋付きバイアル瓶中で18時間
中に110℃に加熱した。溶媒をN₂ガスの気流中で除去し
た。

加水分解物を、MeOH/塩化アセチルで、110℃で１時間
処理した。溶液を室温に冷却し、溶媒をN₂ガスの気流中
で除去した。固形物を、TFAA/TFAの混合物で、110℃で1
5分間処理した。溶液を冷却して、溶媒を留去した。残
渣を２−プロパノールに溶解して、GC分析を行った。

例２生物活性のアッセイ 2.1 Ｌ−1210細胞（DBA/2マウス由来のアスセィク（As
cetic）流体）に対するアッセイＬ−1210細胞を、16mmウェルに、指示された濃度の薬
剤を含むMEN 10Cの1ml中にウェル当たり１×10⁴個の細
胞を接種した。総ての計測は３回行った。毎日３種の薬
剤を計数した後、細胞数を計数して、観察期間中には細
胞は指数成長していることを確かめた。

DDBによるL-1210細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 2.9×10⁵ 0 0.05 2.7×10⁵ 7 0.1 2.7×10⁵ 7 0.2 2.1×10⁵ 28 0.5 1.0×10⁵ 66 1 2.5×10⁴ 91 2 6.3×10³ 98 2.2 Ｐ−388細胞（DBA/2マウス由来のリンパ球様新生
物）に対するアッセイＰ−388細胞を、16mmウェルに、指示された濃度の薬
剤を含むMEM 10Cの1ml中にウェル当たり１×10⁴個の細
胞を接種した。総ての計測は３回行った。３日間インキ
ュベーションした後、細胞数を計数した。薬剤を含まな
い別の組の培養物を毎日計数して、細胞が観察の期間中
に指数成長していることを確かめた。

DDBによるP-388細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 5.63×10⁵ 0 0.12 3.97×10⁵ 29 0.25 1.26×10⁵ 77 0.5 4.47×10⁴ 92 2.3 Ｌ−929細胞（マウス疎性結合および脂肪組織に対
するアッセイＬ−929細胞を、16mmウェルにMEM 10Cの1ml中にウェ
ル当たり１×10⁴個の細胞を接種した。次の日に培地をM
EM10C 0.5mlに代えた。次の日に、培地を指示された濃
度の薬剤を含むMEM 10C 0.5mlに代えた。総ての計測
は、３回行った。薬剤を含まない別の組の培養物を毎日
計数して、観察の期間中には、細胞が指数成長している
ことを確かめた。細胞をトリプシン処理して、接種から
４日後に計数した。

DDBによるP-929細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 3.17×10⁵ 0 1 2.31×10⁵ 27 2.5 1.13×10⁵ 64 5 5 ×10⁴ 84 10 3.45×10⁴ 89 2.4 Ｂ−16細胞（マウス黒色腫）に対するアッセイＢ−16細胞を、16mmウェルに、指示された濃度の薬剤
を含むMEM 10Cの1ml中にウェル当たり１×10⁴個の細胞
を接種した。総ての計測は３回行った。薬剤を含まない
別の組の培養物を毎日計数して、観察の期間中には、細
胞が指数成長していることを確かめた。細胞をトリプシ
ン処理して、接種から４日後に計数した。

DDBによるB-16細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 1.71×10⁵ 0 0.16 1.71×10⁵ 0 0.12 1.27×10⁵ 25 0.25 8.25×10⁴ 52 0.5 4.50×10⁴ 74 1.0 2.88×10⁴ 83 2.5 Ａ−549細胞（ヒト肺癌）に対するアッセイＡ−549細胞を、16mmウェルにMEM 10Cの1mlに中にウ
ェル当たり１×10⁴個の細胞を接種した。次の日に培地
を指示された濃度の薬剤を含むMEM 10C 0.5mlに代え
た。総ての計測は、３回行った。薬剤を含まない別の組
の培養物を毎日計数して、観察の期間中には、細胞が指
数成長していることを確かめた。細胞をトリプシン処理
して、接種から４日後に計数した。

DDBによるA-549細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 8.16×10⁴ 0 0.25 4.80×10⁴ 41 0.50 4.00×10⁴ 50 1.0 2.60×10⁴ 68 2.5 1.30×10⁴ 84 2.6 HeLa細胞（ヒト子宮頸部上皮癌）に対するアッセ
イ HeLa細胞を、16mmウェルに、MEM 10Cの1mlに中にウェ
ル当たり１×10⁴個の細胞を接種した。次の日に、培地
を指示された濃度の薬剤を含むMEM 10C 0.5mlに代え
た。総ての計測は、３回行った。薬剤を含まない別の組
の培養物を毎日計数して、観察の期間中には、細胞が指
数成長していることを確かめた。細胞をトリプシン処理
して、接種から４日後に計数した。

DDBによるHeLa細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 6.25×10⁴ 0 0.25 5.46×10⁴ 12 0.50 3.01×10⁴ 52 1.0 1.90×10⁴ 70 2.7 KB細胞（ヒト口腔類表皮癌）に対するアッセイ KB細胞を、16mmウェルにMEM 10Cの1mlに中にウェル当
たり１×10⁴個の細胞を接種した。次の日に、培地を指
示された濃度の薬剤を含むMEM 10C 0.5mlに代えた。総
ての計測は、３回行った。薬剤を含まない別の組の培養
物を毎日計数して、観察の期間中には、細胞が指数成長
していることを確かめた。細胞をトリプシン処理して、
接種から４日後に計数した。

DDBによるKB細胞の成長抑制 DDB（ng/ml）細胞数の真の増加抑制率（％） 0 4.50×10⁴ 0 2.5 4.57×10⁴ 0 5 2.40×10⁴ 46 10 1.02×10⁴ 77 2.8 HSV−１（単純ヘルペスウイルス１型）に対するア
ッセイ 16mmの直径のウェルに、それぞれMEM10Cの1mlに中に
２×10⁵個のCV−１細胞を接種した。４日後に、細胞
に、ウェル当たり10C PFUのHSV−１を感染させた。1.5
時間吸着させた後、ウェルの対における接種原を指示さ
れた濃度の薬剤を含むMEM 5C 0.5mlに代えた。薬剤を含
まない２個のウェルからの細胞を培地に塗布して、感染
の後４時間凍結し、真のウイルス産生を計算するための
ベースラインを提供した。これらの試料の平均は、1ml
当たり2.5×10⁵〜1.2×10⁶個のPFUであった。残りの試
料を、感染から24時間後に集めた。

2.9 免疫抑制作用デヒドロジデムニンＢは、免疫抑制剤として活性であ
る。混合リンパ球反応において、これはネズミ細胞の免
疫反応を抑制する。これは、ネズミＴ−細胞およびＢ−
細胞の成長も抑制する。

例３抽出および単離白色の単生の被嚢動物をバレアレス諸島（スペイン）
のイビザ付近で採取し、バルセロナ大学、バルセロナ
（スペイン）のドクター・キサベル・ツーロン（Dr Xav
er Turon）によってアプリジウム・アルビカンス（Apli
cium albicans）と同定された。一つの試料は、セント
レ・ドゥ・エチューデス・アバンカッツ、ブランズ（Ce
nter d′ Etudes Avancats,Blanes）（ヘローナ、スペ
イン）に保存されている。船上での予備試験では、VSV
−１（水泡性口内炎ウイルス）に対する抗ウイルス活性
を示した。実験室で更に研究を行ったところ、サル腎臓
細胞（CV−１）における単純ヘルペスウイルス１型（HS
V−１）に対する抗ウイルス活性が確かめられ、インビ
トロでのマウスリンパ球様白血病（L1210株細胞）に対
する細胞毒性を示した。

凍結した被嚢動物をメタノールで抽出した。残渣を溶
媒分配したところ、３種類の活性画分を生じ、これらを
TLC（薄層クロマトグラフィ）における類似性にしたが
って纏めた。粗製の活性画分を分配し、活性をメタノー
ル層中で濃縮した。メタノール層をシリカゲル重力カラ
ム（クロロホルムおよびクロロホルム−メタノール混合
物）によってクロマトグラフィ処理を行ったところ、一
つの活性画分を生じ、これを更に逆相高性能液体クロマ
トグラフィ（RPC₁₈HPLC）によって精製したところ、２
つのピーク（ＩおよびII）を得た。TLCによって分析し
たところ、それぞれのHPLC画分において２つの同じスポ
ットが現れた。それぞれの個々の画分を再注入したとこ
ろ、ＩおよびIIと同じ保持時間を有する２つのピークを
得た。ＩおよびIIを同時に注入したところ、それぞれの
画分における２つの同一のピーク（可能なコンフォーマ
ー）の存在が確認され、ＩからIIおよびその逆の速やか
な相互変換が示唆された。

例４ジデムニンＡからDDBの半合成デヒドロジデムニンＢも得ることができ、その構造
を、適当な側鎖を天然のジデムニンＡにカップリングさ
せることによって製造した半合成試料と比較することに
よって確かめた。半合成試料について得たデーターは、
天然のDDBについてのデーターと完全に一致した。

4.1 ピルビル−Pro-OBzlの合成 Pro-OBzlの塩酸塩（10.2g,42ミリモル）を無水DMF（3
0ml）に溶解し、NMM（Ｎ−メチルモルホリン,4.7ml,42
ミリモル）により０℃で中和し、溶液をピルビン酸（8.
8g,100ミリモル）およびHOBt（１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール,16.8g,100ミリモル）をCH₂Cl₂‐DMF（80ml,
8:1）に溶解したものと混合した。DDC（ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド,22.6g,110ミリモル）をCH₂Cl₂（35m
l）に溶解したものを、前記の混合物に０℃で撹拌しな
がら加えた。反応混合物を０℃で２時間撹拌し、室温で
一晩放置した。DCClを濾別し、CH₂Cl₂（20ml）で洗浄し
た。濾液を蒸発乾固し、残渣をEtOAcに吸収させ、５％
クエン酸、水、５％NaHCO₃で連続的に洗浄し、最後に水
でpHが中性になるまで洗浄した。有機層を乾燥し（Na₂S
O₄）、濃縮した。残渣をSiO₂上でヘキサン−EtOAc（2:
1）でクロマトグラフィ処理し、表記の化合物（11g,95
％）を得た。

［α］D²⁵＝−78.57（ε0.14,CHCl₃） R_f＝0.63（19:1,CHCl₃/MeOH）分析 C₁₅H₁₈NO₄（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値:276.1235、実測
値:276.1235（Ｍ＋H,HRFABMS）。

4.2 ピルビル−プロリンの合成前記の合成から得た保護基を有するジペプチドをEtOA
c（75ml）に溶解し、水素雰囲気下にてPd/C上で２時間
撹拌した。対で、触媒を濾別し、濾液を蒸発乾固した。
残渣をEtOAc−ヘキサンから結晶させ、保護基を外した
ペプチド（6.9g,93％）を得た。

［α］D²⁵＝−103.99（ε0.12,CHCl₃） R_f＝0.41（19:1:0.5,CHCl₃/MeOH/AcOH）分析 C₈H₁₂NO₄（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値:186.0766、実測
値:186.0765（Ｍ＋H,HRFABMS）。

4.3 デヒドロジデムニンＢの合成 EDC（１−エチル−３−（３−ジメチルアミドプロピ
ル）カルボジイミド、4.27g、22.3ミリモル）を、Pyruv
-Pro（8.2g、44.5ミリモル）を無水CH₂Cl₂（40ml）に溶
解したものに10℃で撹拌しながら加えた。混合物を10℃
で２時間撹拌した後、０℃に冷却した。ジデムニンＡ
（1.4g、1.48ミリモル）をCH₂Cl₂‐DMF（10ml、4:1）を
加え、透明な溶液を０℃で２時間撹拌した後、冷蔵庫中
で一晩放置した。

DMAP（４−（ジメチルアミノ）ピリジン、25mg）を反
応混合物に加え、これを再度冷蔵庫中に48時間放置し
た。溶媒を蒸発乾固させ、残渣をEtOAcに吸収させ、５
％NaHCO₃および水でpHが中性になるまで洗浄した。有機
層を乾燥し（Na₂SO₄）、濃縮した。このようにして得ら
れた残渣を、シリカゲル上でCHCl₃‐MeOH（19:1）を用
いてクロマトグラフィ処理を行い、デヒドロジデムニン
Ｂ（1.4g,84％,TLC上で２スポット）を得た。

［α］D²⁵＝−95.384（ε0.06,MeOH） R_f＝0.51および0.44（19:1,CHCl₃/MeOH）分析 C₅₅H₈₈N₇O₁₅（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値:1110.6338、
実測値:1110.6355（Ｍ＋H,HRFABMS）。

同じ一連の反応を若干の変更を行って行うことがで
き、特にEDCをDDCに代えて、若干低い収率にすることが
できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 1/10 Ｃ０７Ｋ 1/14 1/14 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者リネハート，ケネス，ロイドアメリカ合衆国61801 イリノイ州アーバナ，ウエストカリフォルニアストリート 1209，ロジャーアダムスラボラトリー 454，ユニバーシティーオブイリノイ気付 (72)発明者リスゴウ ― バーテロニ，アンナ，マチルドアメリカ合衆国61801 イリノイ州アーバナ，ウエストカリフォルニアストリート 1209，ロジャーアダムスラボラトリー 454，ユニバーシティーオブイリノイ気付 (56)参考文献特開平３−135999（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 5/08,1/10,1/14 A61K 38/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式を有するデヒドロジデムニンＢ。
【請求項２】式（式中、Ｒは−COR′基又は−Ｒ′基であり、Ｒ′は炭
素原子数１〜６の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、
又はフェニル基である）を有するデヒドロジデムニンＢ
誘導体。
【請求項３】デヒドロジデムニンＢまたは請求項２に記
載のその誘導体を薬学上許容可能なキャリヤーと共に含
んで成る、抗ウイルス作用を有する薬学組成物。
【請求項４】デヒドロジデムニンＢまたは請求項２に記
載のその誘導体を薬学上許容可能なキャリヤーと共に含
んで成る、抗腫瘍作用を有する薬学組成物。
【請求項５】デヒドロジデムニンＢまたは請求項２に記
載のその誘導体を薬学上許容可能なキャリヤーと共に含
んで成る、細胞毒性作用を有する薬学組成物。
【請求項６】ピルビル−プロリンをジデムニンＡにカッ
プリングさせることから成る、デヒドロジデムニンＢの
製造法。
【請求項７】デヒドロジデムニンＢを含有する被嚢動物
から抽出することから成る、デヒドロジデムニンＢの単
離法。