CN115666615A - 用于治疗冠状病毒感染的化合物 - Google Patents

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P·阿维莱斯·马林
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Abstract

通式I的化合物
Figure DDA0003829598980000011
其中X、Y、n、p、q和R1‑R17具有不同的含义，用于治疗冠状病毒感染。

Description

用于治疗冠状病毒感染的化合物
技术领域
本发明涉及冠状病毒感染的治疗。
背景技术
冠状病毒(CoV)是包膜的单股正链RNA病毒，其基因组范围在26.2-31.7kb之间。这个大的、帽状的和多聚腺苷酸化的基因组包含七个常见的冠状病毒基因，其顺序如下：5'-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3'。ORF1a/b产生基因组长度mRNA(mRNA1)，其编码多蛋白1a(pp1a)和pp1ab形式的两个重叠的病毒复制酶蛋白。这些多蛋白被病毒编码的蛋白酶酶解成成熟的非结构蛋白(nsp1至nsp16)，非结构蛋白组装形成膜相关的病毒复制酶-转录酶复合物(RTC)。基因组的最后三分之一产生亚基因组(sg)mRNA，其编码四种结构蛋白，刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)，以及许多辅助蛋白。CoV属于Niodovirales目的冠状病毒科的冠状病毒亚科。该科包括α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒四个属。(SARS)严重急性呼吸综合征-CoV-2和SARS-CoV属于β-冠状病毒属，约占其基因组的80％。冠状病毒N蛋白在感染细胞内大量产生。N蛋白具有多种功能，包括与病毒RNA结合形成螺旋状核衣壳，并在冠状病毒组装中具有结构作用。N蛋白也被认为在病毒复制、转录和翻译中具有作用。
冠状病毒(CoV)感染各种人类和动物宿主，引起各种疾病，从动物胃肠道感染、脑炎和脱髓鞘，到人类大多数上呼吸道相对轻微的感染。然而，人畜共患冠状病毒、SARS-CoV、MERS-CoV和冠状病毒(2019-nCoV，最近更名为SARS-CoV-2)可导致严重疾病和死亡。由SARS-CoV-2引起的疾病称为2019冠状病毒病或COVID-19。
世卫组织宣布2019-2020冠状病毒疫情为国际公共卫生紧急事件(PHEIC)。根据世卫组织的数据，截至2021年2月12日，共有107252265例SARS-CoV-2病例，包括2355339例死亡。对于SARS-CoV感染，包括SARS-Cov(引起SARS)和SARS-CoV-2(引起COVID-19)，没有特定的治疗方法。已经开发了一些疫苗，并自2020年12月起批准用于预防COVID-19的个人免疫接种。然而，由于病毒突变、疫苗接种和/或其他因素，患有COVID-19的患者的住院率仍然很高。
因此，对于CoV感染的治疗，特别是对于COVID-19的治疗，存在紧急的未满足的医疗需求。本发明解决了这种需要。此外，还存在对不靶向病毒蛋白并因此有效对抗SARS-CoV变体的治疗的需要。本发明还解决了这种需要。
发明内容
一方面，本发明涉及通式I的化合物，或其药学上可接受的盐或立体异构体，
Figure GDA0003994401990000021
其中X选自O和NH；
Y选自CO和–COCH(CH3)CO-；
n和p各自独立地选自0和1，q选自0、1和2；
R1、R3、R5、R9、R11、以及R15各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基和取代或未取代的C2-C6炔基；
R2选自氢、CORa、COORa、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基和取代或未取代的C2-C6炔基；
R4、R8、R10、R12和R16各自独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；
R7和R13各自独立地选自氢、取代的或未取代的C1-C6烷基、取代的或未取代的C2-C6烯基和取代的或未取代的C2-C6炔基；R6和R14各自独立地选自氢、和取代的或未取代的C1-C6烷基；或者R6和R7和/或R13和R14与它们所连接的相应的N原子和C原子一起可形成取代的或未取代的杂环基；
R17选自氢、CORa、COORa、CONHRb、COSRc、(C＝NRb)ORa、(C＝NRb)NHRb、(C＝NRb)SRc、(C＝S)ORa、
(C＝S)NHRb、(C＝S)SRc、SO2Rc、SO3Rc、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，前提是当n、p、以及q为0时，R17不是氢；且
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基；
用于治疗冠状病毒(CoV)感染。
在一具体方面，通式I的化合物是PLD或其药学上可接受的盐或立体异构体。
另一方面，本发明还涉及用于治疗CoV感染的药物组合物，其包含本文定义的化合物和药学上可接受的载体。
另一方面，本发明涉及本文所定义的化合物在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及治疗受CoV感染的任一哺乳动物，优选人的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给药治疗有效量的本文所定义的化合物。
在本发明的另一个方面，提供了本文所定义的用于治疗COVID-19的化合物。特别地，本发明提供用于治疗COVID-19的PLD。COVID-19是由SARS-CoV-2感染引起的疾病。
在本发明的另一个方面，提供了本文所定义的化合物，用于治疗由COVID-19引起的肺炎。特别地，本发明提供用于治疗由COVID-19引起的肺炎的PLD。在本发明的另一个方面，提供了本文所定义的化合物，用于治疗由COVID-19引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。特别地，本发明提供用于治疗由COVID-19引起的ARDS的PLD。
在本发明的另一个方面，提供本文所定义的化合物，用于减少与CoV感染相关的并发症，包括住院、ICU和死亡。
在本发明的另一个方面，提供了本文定义的化合物，用于预防、减少或治疗持续性COVID(也称为长COVID或后COVID综合征)。
在本发明的另一个方面，提供了本文所定义的化合物，用于降低CoV患者的传染性。患者可能是无症状或症状不明显的患者。在本发明的另一个方面，提供了如本文所定义的化合物，用于减少超级传播者(具有高病毒载量(例如Tc<25)的无症状或症状不明显的患者)。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗冠状病毒(CoV)感染(包括治疗COVID-19、治疗由COVID-19引起的肺炎和本文所定义的任何用途)的如本文所定义的化合物，其中所述化合物与皮质类固醇组合给药。在一个具体实施例中，提供了用于治疗冠状病毒(CoV)感染(包括治疗COVID-19、治疗由COVID-19引起的肺炎和本文定义的任何用途)的PLD，其中所述化合物与地塞米松联合给药。所述化合物和皮质类固醇可以同时、分别或顺序给药。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗冠状病毒(CoV)感染(包括治疗COVID-19、治疗由COVID-19引起的肺炎和本文定义的任何用途)的皮质类固醇，其中所述皮质类固醇与根据本发明的化合物组合给药。
在本发明的另一个方面，提供了用于治疗冠状病毒(CoV)感染(包括治疗COVID-19、治疗由COVID-19引起的肺炎和本文所定义的任何用途)的本文所定义的化合物和皮质类固醇。
在另一个方面，提供了治疗冠状病毒(CoV)感染(包括治疗COVID-19、治疗由COVID-19引起的肺炎和本文定义的任何用途)的方法，所述方法包括给药根据本发明的化合物和皮质类固醇的组合。
在另一方面，本文公开的给药方案用于根据本发明的治疗方法中。
在另一个方面，本文公开的给药方案用于根据本发明的化合物在制备本文定义的用于治疗的药物中的用途。
在另一个方面，提供了本文所定义的化合物在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途；其中所述治疗包括给药皮质类固醇。
在另一个方面，提供了皮质类固醇在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途；其中所述治疗包括给药本文定义的化合物。
在另一方面，提供了如本文所定义的化合物和皮质类固醇在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途。
在另一个方面，提供了包含如本文所定义的化合物和皮质类固醇的药物包装，可选地，所述药物包装进一步包含说明书。
在另一个方面，提供了用于治疗CoV感染的、包含本文定义的化合物以及说明书的试剂盒。在另一个方面，提供了用于治疗CoV感染的、包含本文定义的化合物和皮质类固醇以及说明书的试剂盒。
以下实施例适用于本发明的所有方面。
R3和R4独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。R3可以是异丙基，R4可以是氢。R3和R4可以是甲基(该化合物也称为通式II的化合物)。
R11可以选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。R11可以是甲基或异丁基。R11可以是甲基并且n＝1(该化合物也称为通式III的化合物)。
R1、R5、R9和R15可以独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。R1可以选自仲丁基和异丙基，R5可以是异丁基，R9可以是对甲氧基苄基，R15可以选自甲基和苄基。
R8、R10、R12和R16可以独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。R8、R10和R12可以是甲基，R16可以是氢。
R6和R14可以独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。R6可以选自氢和甲基，并且R14可以是氢。
R7和R13可以独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。R7可以是甲基，R13可以选自氢、甲基、异丙基、异丁基和3-氨基-3-氧丙基。
R6和R7和/或R13和R14与它们所连接的相应的N原子和C原子一起可以形成取代或未取代的吡咯烷基团。
R2可以选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基和CORa，其中Ra可以是取代或未取代的C1-C6烷基。R2可以是氢。
R17可以选自氢、CORa、COORa、CONHRb、(C＝S)NHRb、以及SO2Rc，并且其中Ra、Rb和Rc可以独立地选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基。R17可选自氢、COO苄基、CO苯并[b]噻吩-2-基、SO2(对甲基苯基)、COCOCH3和COOC-(CH3)3。
X可以是NH。X可以是O。Y可以是CO。Y可以是–COCH(CH3)CO-。
所述化合物可以是PLD或其药学上可接受的盐或立体异构体。该化合物可以是PLD。
化合物可以是膜海鞘素B(didemninB)、或其药学上可接受的盐或立体异构体。该化合物可以是膜海鞘素B。
所述用途可用于治疗COVID-19和/或用于治疗由COVID-19引起的肺炎。
CoV感染可以是轻度感染、和/或中度感染、和/或重度感染。
所述CoV感染可以是急性CoV感染，优选地，其中所述CoV感染是急性COVID-19感染；和/或可以是持续有症状的CoV感染，优选地，其中所述CoV感染是持续有症状的COVID-19感染；和/或可以是后CoV综合征、持续性CoV或长CoV；优选地，其中所述CoV感染是后COVID-19综合征、持续性COVID或长COVID。后CoV综合征，持续性CoV或长CoV可包括心血管、呼吸、胃肠、神经、肌肉骨骼、代谢、肾脏、皮肤、耳鼻咽喉、血液学和自主神经系统；精神问题、全身疼痛、疲劳和/或持续发烧引起的一种或多种症状。
所述用途可以是治疗具有CoV感染(优选COVID-19)症状和体征长达4周；和/或4周至12周；和/或超过12周以上的患者。
所述用途可以是预防、减少或治疗持续性COVID、长COVID或后COVID综合征；优选的是，预防、减少或治疗可将患者遭受持续性COVID、长COVID或后COVID综合征症状的可能性降至最低；和/或降低此类症状的严重程度；进一步优选的是，治疗将CoV感染的症状降至最低。
该治疗可以降低CoV患者的传染性，包括无症状或症状不明显但具有高病毒载量的患者。
该化合物可与皮质类固醇，优选地塞米松联合给药。所述化合物和皮质类固醇可以同时、分别或顺序给药。
该化合物可以根据每日一次，给药10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天的方案给药；优选2-5天、3-5天、或3、4或5天；最优选3天或5天；最优选3天。
该化合物的给药剂量为：每天5mg或更少、每天4.5mg或更少、每天4mg或更少、每天3.5mg或更少、每天3mg或更少、每天2.5mg或更少、或每天2mg或更少；0.5mg/天、1mg/天、1.5mg/天、2mg/天、2.5mg/天、3mg/天、3.5mg/天、4mg/天、4.5mg/天、或5mg/天；优选1mg/天、1.5mg/天、2mg/天或2.5mg/天；优选1.5-2.5mg/天；进一步优选1.5mg/天、2mg/天或2.5mg/天。
该化合物的总给药剂量为：1-50mg、1-40mg、1-30mg、1-20mg、1-15mg、3-15mg、3-12mg、4-12mg、4-10mg、4.5-10mg；4.0mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg；优选4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg、或10mg；更优选4.5-7.5mg/天。总剂量可以分成1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，优选3天或5天；最优选3天。
该化合物可以以1.5-2.5mg/天的剂量每日一次给药，持续3天。剂量可以为1.5mg/天。剂量可以为2.5mg/天。
所述化合物可以是以1.5小时注射给药的PLD，每天一次，连续3天。可以1.5小时注射给药1.5mg PLD，每天一次，连续3天。可以1.5小时注射给药2mg PLD，每天一次，连续3天。可以1.5小时注射给药2.5mg PLD，每天一次，连续3天。可以1.5小时注射给药1mg PLD，每天一次，连续5天。可以1.5小时注射给药2mg PLD，每天一次，连续5天。
方案可以是单剂量(1天)。化合物可以1-10mg、4-10mg、4.5-10mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg；优选4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg或10mg；更优选5-9mg、6.5-8.5mg、7-8mg或7.5mg的单剂量给药。该化合物可以是1.5小时注射、单剂量给药的PLD。
单剂量方案可与本发明所述的所有疗法一起使用。单剂量方案可用于轻度感染病例。然而，单剂量方案可用于中度和/或重度感染病例。与皮质类固醇的组合使用(包括随后的皮质类固醇给药)可以与单剂量方案一起使用在实施例中。
多日方案可以与本发明中提出的所有疗法一起使用。多日方案可用于中度和/或重度感染病例。然而，多日方案也可用于轻度感染病例。
皮质类固醇可以在与给药根据本发明的化合物相同的天数每天给药。可在随后的一天或多天给药皮质类固醇。可以在随后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天给药皮质类固醇。当与本发明的化合物在同一天给药时，可以以较高剂量给药皮质类固醇，并且在随后的一天或多天以较低剂量给药。皮质类固醇可以是地塞米松。
本发明的化合物可以在给药方案的第1-3天以本发明的剂量给药。皮质类固醇可以在给药方案的第1-3天静脉注射给药。此后，皮质类固醇可以从第4天至第10天通过口服给药或IV给药(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。皮质类固醇可以是地塞米松。剂量可以是第1至3天6.6mg/天IV(例如8mg磷酸地塞米松)，然后从第4天到第10天口服或IV地塞米松6mg/天(例如7.2mg磷酸地塞米松或6mg地塞米松碱)。
在实施例中，地塞米松是磷酸地塞米松，并且例如在第1天至第3天以8mg/天的剂量IV给药，然后从第4天至第10天口服或IV地塞米松7.2mg/天。
根据本发明的化合物可以注射给药，优选1小时注射、1.5小时注射、2小时注射、3小时注射或更长时间，特别优选1.5小时注射。
方案可以是1.5小时注射给药1.5mg普立肽，每天一次，连续3天；或1.5小时注射给药2mg普立肽，每天一次，连续3天；或1.5小时注射给药2.5mg普立肽，每天一次，连续3天；或1.5小时注射给药1mg普立肽，每天一次，连续5天；或1.5小时注射给药2mg普立肽，每天一次，连续5天。
方案可以是在第1天作为单剂量以1.5小时注射给药7.5mg普立肽。
根据本发明的化合物可以使用负荷剂量和维持剂量给药。
根据本发明的方案可以是：
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天2mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天1.5mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天1.5mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；
第1天1.5mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天1.5mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；或
第1天1mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量。
根据本发明的化合物可以与皮质类固醇组合给药。皮质类固醇可以在与化合物给药相同的天数给药。
皮质类固醇也可以在随后的一天或更多天给药；例如其中皮质类固醇在第1-3天与化合物一起给药，皮质类固醇在第4-10天中的一天或更多天进一步给药。
皮质类固醇可以在给药化合物的天数里静脉注射给药，但在随后的天数里通过口服或IV给药。
皮质类固醇可以是地塞米松。地塞米松可以在给药化合物的天数里以6.6mg/天的剂量IV给药。
地塞米松可以在随后的天数，优选第4、5、6、7、8、9和10天中的一天或更多天，以6mg/天的剂量口服给药或IV给药。
本文定义的地塞米松剂量是指碱重量(base weight)。因此，如果以盐形式使用，可以调节剂量。例如，地塞米松可以是磷酸地塞米松，使得8mg/天磷酸地塞米松相当于6.6mg地塞米松碱，7.2mg/天磷酸地塞米松相当于6mg地塞米松碱。
根据本发明的化合物，特别是PLD，可以在第1天至第3天与IV地塞米松6.6mg/天组合静脉注射(IV)给药1.5mg/天，随后从第4天至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
根据本发明的化合物，特别是PLD，可以在第1天至第3天与IV地塞米松6.6mg/天组合静脉注射(IV)给药2.0mg/天，随后从第4天至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
根据本发明的化合物，特别是PLD，可以在第1天至第3天与IV地塞米松6.6mg/天组合静脉注射(IV)给予2.5mg/天，然后从第4天至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
皮质类固醇可在开始用本文定义的化合物治疗前20至30分钟给药。
在根据本发明的方案中，患者可另外接受以下药物，优选在开始用根据本发明的化合物治疗前20至30分钟：
昂丹司琼8mg IV(或等同药物)；
盐酸苯海拉明25mg IV(或等同药物)；以及
雷尼替丁50mg IV(或等同药物)。
在根据本发明的方案中，在第4天和第5天，患者可PO接受每天两次4mg的昂丹司琼(或等同药物)。
当以单剂量给药时，患者可在注射普立肽前20-30分钟接受以下预防性药物：
-盐酸苯海拉明25mg i.v；
-雷尼替丁50mg i.v；
-地塞米松6.6mg静脉注射；
-昂丹司琼8mg i.v，缓慢注射15分钟。
可每12小时口服昂丹司琼4mg，持续3天，以减轻药物引起的恶心和呕吐。如果在早晨给予普立肽，患者可在下午接受第一剂量的昂丹司琼。
附图说明
在以下非限制性附图中进一步描述本发明：
图1-MT-2细胞(图1A)和预先激活的PBMC(图1B)中几种浓度(μM)的化合物3的抗病毒活性(-◆-RLU)和毒性(-●-活力(Viability))的图形表示，其中MT-2细胞和预先激活的PBMC都感染了重组病毒(NL4.3 Luc)。图形表示至少是MT-2细胞的两个独立实验和PBMC的四个独立实验的平均值。
图2-MT-2细胞(图2A)和预先激活的PBMC(图2B)中几种浓度(μM)的化合物8的抗病毒活性(-◆-RLU)和毒性(-●-活力)的图形表示，其中MT-2细胞和预先激活的PBMC都感染了重组病毒(NL4.3 Luc)。图形表示至少是MT-2细胞的两个独立实验和PBMC的四个独立实验的平均值。
图3-MT-2细胞(图3A)和预先激活的PBMC(图3B)中几种浓度(μM)的化合物9的抗病毒活性(-◆-RLU)和毒性(-●-活力)的图形表示，其中MT-2细胞和预先激活的PBMC都感染了重组病毒(NL4.3 Luc)。图形表示至少是MT-2细胞的两个独立实验和PBMC的四个独立实验的平均值。
图4-MT-2细胞(图4A)和预先激活的PBMC(图4B)中几种浓度(μM)的化合物10的抗病毒活性(-◆-RLU)和毒性(-●-活力)图形表示，其中MT-2细胞和预先激活的PBMC都感染了重组病毒(NL4.3 Luc)。图形表示至少是MT-2细胞的两个独立实验和PBMC的四个独立实验的平均值。
图5-MT-2细胞(图5A)和预先激活的PBMC(图5B)中几种浓度(μM)的化合物11的抗病毒活性(-RLU)和毒性(-●-活力)的图形表示，其中MT-2细胞和预先激活的PBMC都感染了重组病毒(NL4.3 Luc)。图形表示至少是MT-2细胞的两个独立实验和PBMC的四个独立实验的平均值。
图6-10示出荧光图像，其显示a)细胞生长和b)DMSO 24hpi对HCoV-229E感染的Huh-7细胞的抗病毒活性(表1的A1、A2、A3、A4、A5)。可以看出，细胞保持存活，但没有观察到抗病毒效果。
图11-14示出荧光图像，其显示a)细胞生长和b)化合物240(膜海鞘素B)在50nM、5nM和0.5nM浓度下24hpi对HCoV-229E感染的Huh-7细胞的抗病毒活性(分别为表1中的B1、B2、B3、B4)。可以看出，细胞在包括高浓度在内的所有浓度下都保持存活；并且在所有浓度下，甚至在亚纳米摩尔浓度下，都可以看到显著的抗病毒特性。
图15-18示出荧光图像，其显示a)细胞生长和b)PLD在50nM、5nM和0.5nM浓度下24hpi对HCoV-229E感染的Huh-7细胞的抗病毒活性(分别为表1中的C1、C2、C3、C4)。同样，可以看出，细胞在所有浓度下，包括高浓度下，都保持存活；并且在所有浓度下，甚至在亚纳米摩尔浓度下，都可以看到显著的抗病毒特性。
图19-21示出荧光图像，其显示a)细胞生长和b)化合物9在50nM、5nM和0.5nM浓度下24hpi对HCoV-229E感染的Huh-7细胞的抗病毒活性(分别为表1的D1、D2、D3)。同样，可以看出，细胞在所有浓度下，包括高浓度下，都保持存活；并且在所有浓度下，甚至在亚纳米摩尔浓度下，都可以看到显著的抗病毒特性。
图22-24示出荧光图像，其显示a)细胞生长和b)化合物10在50nM、5nM和0.5nM浓度下24hpi对HCoV-229E感染的Huh-7细胞的抗病毒活性(分别为表1的E1、E2、E3)。同样，可以看出，细胞在所有浓度下，包括高浓度下，都保持存活；并且在所有浓度下，甚至在亚纳米摩尔浓度下，都可以看到显著的抗病毒特性。
图25-28示出荧光图像，其显示a)细胞生长和b)PLD在50nM、5nM和0.5nM浓度下24hpi对HCoV-229E感染的Huh-7细胞的抗病毒活性(分别为表1中的F1、F2、F3、F4)。同样，可以看出，细胞在所有浓度下，包括高浓度下，都保持存活；并且在所有浓度下，甚至在亚纳米摩尔浓度下，都可以看到显著的抗病毒特性。
图29和图30显示了根据本发明的给药方案和给药预测的总血浆浓度曲线相对时间的关系。
图31显示了根据本发明的另一给药方案和给药预测的总血浆浓度曲线相对时间的关系。
图32显示了普立肽对vero细胞中SARS-CoV-2的抗病毒作用的剂量反应曲线。
图33显示了普立肽对vero细胞中SARS-CoV-2的抗病毒作用的剂量反应曲线。
图34示出x射线，其显示了PLD给药对双侧肺炎患者的影响。
图35显示了一个单侧肺炎患者服用PLD的效果。
图36显示了用PLD治疗的患者的C反应蛋白测试。
图37显示了患者4(图37a)、患者5(图37b)、患者6(图37c)和患者7(图37d)的病毒载量记录。患者连续3天(第1-3天)每天以90分钟IV注射给药PLD，在基线、第4天、第7天、第15天和第31天通过PCR评估病毒载量。
图38显示了单剂量普立肽7.5mg和1.5、2.0和2.5mg(使用1.5小时注射)在第1天至第3天的总对血浆浓度曲线。
具体实施方式
现在将进一步描述本发明。在下面的段落中，更详细地限定本发明的不同方面。如此限定的每个方面可与任何其它一个或多个方面或一个或多个实施例组合，除非明确指示不要这样组合。特别地，指示为优选或有利的任一特征可以与指示为优选或有利的任何其它一个或多个特征组合。
在本申请中，使用了多个通用术语和短语，其应当被解释如下。
除非另有说明，本文所使用的术语“治疗”是指反转、减弱、减轻或抑制该术语所适用的疾病或病症、或该疾病或病症的一种或多种症状的进展。本文所使用的术语治疗还可包括预防性治疗，即设计为防止疾病发生或使疾病发生的可能性最小化的治疗。
病毒感染情况下的“治疗”(“treat”、“treating”、以及“treatment”)可指以下一项或多项：1)减少感染细胞的数量；2)减少血清中存在的病毒粒子数量，包括病毒滴度的降低(可通过qPCR测量)；3)抑制(即在一定程度上减缓，优选停止)病毒复制速率；4)减少病毒RNA载量；5)减少病毒感染性滴度(能够入侵宿主细胞的病毒颗粒的数量)；和6)在某种程度上缓解或减轻与病毒感染相关的一种或多种症状。这可能包括与病毒感染相关的炎症。
治疗可以是治疗CoV感染。治疗可以是治疗SARS-CoV-2感染。治疗可以是治疗COVID-19感染。治疗可以是治疗COVID-19。治疗可以是治疗由CoV感染引起的疾病。治疗可以是治疗由SARS-CoV-2感染引起的疾病。治疗可以是治疗由CoV感染引起的肺炎。治疗可以是治疗由SARS-CoV-2感染引起的肺炎。治疗可以是治疗由COVID-19感染引起的肺炎。治疗可以是治疗由COVID-19引起的肺炎。类似地，治疗可以是治疗由SARS-CoV-2或COVID-19感染引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
感染可以是中度感染。感染可以是严重感染。感染可以是轻微的感染。
治疗可以减少与CoV感染相关的并发症，包括住院、ICU和死亡。
本发明可用于治疗急性COVID-19感染(高达4周的COVID-19的体征和症状)，治疗(或最小化)正在出现症状的COVID-19(从4周到12周的COVID-19的体征和症状)，或治疗或最小化后COVID-19综合征(post-COVID-19syndrome)(在感染期间或之后出现的与COVID-19一致的症状和体征，持续超过12周，并且不能通过其他诊断来解释。它通常表现为一系列症状，通常重叠，这些症状会随着时间的推移而波动和变化，并可能影响身体的任何系统。后COVID-19综合征可在12周前考虑，同时也在评估其他潜在疾病的可能性)。本发明的化合物可以治疗具有COVID-19症状和体征长达4周的患者。本发明的化合物可治疗具有COVID-19症状和体征4周至12周的患者。本发明的化合物可以治疗具有COVID-19症状和体征超过12周的患者。
治疗可以是预防、减少或治疗持续性COVID(COVID persistent)(也称为长COVID或后COVID综合征)。根据本发明的化合物可使患者遭受持续性COVID症状的可能性最小化。或者，本发明的化合物可以降低这些症状的严重性，优选可以使CoV感染的症状最小化。
后COVID综合征可被认为是在感染期间或之后出现的与COVID-19一致的持续12周以上的症状和体征，其不能通过其他诊断来解释。这种病症通常会出现一系列症状，通常是重叠的，这些症状可能会随着时间的推移而改变，并可能影响体内的任何系统。许多患有后COVID综合征的人也会经历全身疼痛、疲劳、持续的高温和精神问题。症状包括(但不限于)心血管、呼吸系统、胃肠道、神经系统、肌肉骨骼、代谢、肾脏、皮肤病、耳鼻喉科、血液学和自主神经系统出现的症状，此外还有精神疾病、全身疼痛、疲劳和持续发烧。
治疗可以是降低CoV患者的传染性。本发明实现了病毒负荷(viral burden)的快速且显著的减少。减少病毒负荷可以降低患者的传染性。这对于无症状或症状不明显但具有高病毒载量的患者(例如，Tc<25)特别有益。这样的患者可能是超级感染者或超级传播者。在检测到感染时给药根据本发明的化合物可减少病毒负荷并因此减少患者的感染性。
所述治疗可导致病毒载量的减少。这可以表现为在给药后第6天，复制周期阈值(Ct)大于30(Ct>30)。该治疗可从基线开始减少病毒载量。这可以表现为给药后需要住院治疗的患者百分比的降低。这可以表现为在给药后需要有创机械通气和/或进入ICU的患者百分比的降低。这可以表现为出现与持续性疾病有关的后遗症的患者减少。这可以表现为被选择为不良预后标准的分析参数(包括例如淋巴细胞减少、LDH、D-二聚体或PCR)正常化的患者百分比的增加。这可以表现为临床标准正常化(包括例如：头痛、发烧、咳嗽、疲劳、呼吸困难(气短)、关节肌痛或腹泻的症状消失)的患者百分比的增加。
“患者”包括人类、非人类哺乳动物(如狗、猫、兔子、牛、马、绵羊、山羊、猪、鹿等)和非哺乳动物(如鸟类等)。患者需要住院治疗以管理感染。
普立肽(Plitidepsin)(PLD)是一种环酯肽(cyclic depsipeptide)，最初从海洋海鞘白色念珠菌(marine tunicate Aplidium albicans)中分离得到。PLD也被称为Aplidin。PLD类似物是本文定义为式I、II或III化合物的那些类似物。在优选实施例中，本发明涉及PLD的用途。
人/真核翻译延伸因子eEF1A是真核翻译延伸1复合物(eEF1)的一亚基。该复合物在蛋白质合成期间将氨基酰化的tRNA递送至伸长的核糖体。然而，eEF1A不仅是主要的翻译因子，也是最重要的多功能蛋白之一，在新合成的蛋白的质量监测、泛素依赖性降解和促进凋亡中起作用。
已经显示出CoV的N蛋白，例如SARS-CoV和TGEV(传染性胃肠炎冠状病毒)，与真核延伸因子1A(eEF1A)直接结合。此外，已显示eEF1A的敲低导致病毒数目的显著减少，证明N蛋白与eEF1A的相互作用对于病毒复制是必要的。
已显示PLD以高亲和力和低解离速率结合人翻译延伸因子eEF1A。FLIM-phasorFRET实验证明，PLD定位在肿瘤细胞中足够接近eEF1A，从而提示在活细胞中形成药物-蛋白质复合物。PLD抗性细胞系(PLD-resistant cell lines)还显示降低的eEF1A蛋白水平和这些抗性细胞中eEF1A的异位表达恢复了对PLD的敏感性，表明eEF1A直接参与了PLD的作用机制。
如上所述，CoV的N蛋白也与eEF1A结合，并且这种结合对于病毒复制是必需的。此外，N蛋白在CoV中高度保守，尤其是SARS-CoV-2与SARS-CoV中的N蛋白具有约90％的氨基酸同一性。然而，给药PLD和随后的与eEF1A的结合阻止了CoV N蛋白与eEF1A的结合。这反过来又可以防止病毒复制。因此，PLD和eEF1A之间的相互作用降低了从头合成病毒衣壳的效率，并因此导致病毒载量的降低。
除此之外，PLD与eEF1A的结合阻止了eEF1A与其通常的结合配偶体的相互作用。一种这样的结合配偶体是dsRNA激活的蛋白激酶(PKR或EIF2AK2)。PLD与eEF1A的结合利用eEF1A从复合物中释放PKR，导致PKR的激活。PKR是已知的先天免疫应答的激活剂和在抗病毒免疫应答中的关键角色。具体而言，
(i)激活的PKR磷酸化起始因子eIF2的α亚基，导致形成无活性的eiF2复合物；
(ii)激活的PKR诱导IκB降解、NF-κB核转位和NF-κB途径活化。NF-κB是调节负责先天和适应性免疫应答的基因，例如参与T细胞发育、成熟和增殖的基因的主要转录因子；
(iii)PKR的激活通过Fas聚集和NF-κB转位的机制诱导细胞凋亡，从而消除感染细胞。
值得注意的是，CoV的蛋白4a通过螯合(sequestration)dsRNA强烈抑制PKR的激活。PLD绕过这种病毒反应，通过从eEF1A复合物释放PKR导致PKR激活，如可以从在没有病毒感染的情况下PKR的激活中看到的。
最后，除上述外，PLD与eEF1A的结合也激活了ER应激诱导的未折叠蛋白反应(UPR)，这反过来又导致了许多抗病毒反应，包括eIF2α的磷酸化。
通过这些机制的结合-(i)抑制CoV N蛋白/eEF1A相互作用；(ii)激活PKR和(iii)激活UPR；PLD阻止CoV复制，并导致宿主反应的激活，从而消除CoV。两者都有助于有效的病毒疗法。靶向eEF1A的另一个优点是它是人类目标，因此不会像病毒蛋白那样突变以逃避PLD。
因此，本发明的化合物(包括PLD)可用于治疗CoV感染。
在这些化合物中，基团可根据以下指南进行选择：
烷基可以是支化的或未支化的，并且优选具有1至约12个碳原子。一类更优选的烷基具有1至约6个碳原子。甚至更优选的是具有1、2、3或4个碳原子的烷基。甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基)是本发明化合物中特别优选的烷基。除非另有说明，本文所用的术语烷基是指环状和非环状基团，尽管环状基团将包括至少三个碳环成员。
本发明化合物中优选的烯基和炔基可以是支化的或未支化的，具有一个或多个不饱和键和2至约12个碳原子。更优选的一类烯基和炔基具有2至约6个碳原子。甚至更优选的是具有2、3或4个碳原子的烯基和炔基。除非另有说明，本文所用的术语烯基和炔基是指环状和非环状基团，尽管环状基团将包括至少三个碳环成员。
本发明化合物中合适的芳基包括单环和多环化合物，包括含有分开的和/或稠合的芳基的多环化合物。典型的芳基含有1至3个分开的或稠合的环和6至约18个碳环原子。优选芳基含有6至约10个碳环原子。特别优选的芳基包括取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的联苯基、取代或未取代的菲基、以及取代或未取代的蒽基。
合适的杂环基包括含有1至3个分开的和/或稠合的环和5至约18个环原子的杂芳族和杂脂环基团。优选杂芳族和杂脂环族基团含有5至约10个环原子，最优选5、6或7个环原子。本发明化合物中合适的杂芳族基团包含一个、两个或三个选自N、O或S原子的杂芳族原子，包括例如香豆素基(包括8-香豆素基)、喹啉基(包括8-喹啉基)、异喹啉基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基(包括吡唑-3基、吡唑-4基和吡唑-5基)、嘧啶基、呋喃基(包括呋喃-2-基、呋喃-3-基、呋喃-4-基和呋喃-5-基)、吡咯基、噻吩基、噻唑基(包括噻唑-2-基、噻唑-4-基和噻唑-5-基)、异噻唑基、噻二唑基(包括噻二唑-4-基和噻二唑-5-基)、三唑基、四唑基、异恶唑基(包括异恶唑-3-基、异恶唑-4-基和异恶唑-5-基)、恶唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、恶二唑基、噻二唑基、呋咱基、哒嗪基、三嗪基、噌啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并噻吩基(包括苯并[b]噻吩-2-基和苯并[b]噻吩-3-基)、苯并噻唑基、苯并恶唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基(包括咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基和咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃吡啶基。本发明化合物中合适的杂脂环族基团包含一个、两个或三个选自N、O或S原子的杂原子，包括例如吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、哌啶基(包括哌啶-3-基、哌啶-4-基和哌啶基-5-基)、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、哌嗪基、氮杂环丁烷基(azetidinyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、硫杂环丁烷基(thietanyl)、高哌啶基(homopiperidyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂基(oxazepinyl)、二氮杂基(diazepinyl)、硫氮杂基(thiazepinyl)、1，2，3，6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吡咯基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二恶烷基、1、3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻吩基、二硫杂环戊基(dithiolanyl)、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基(imidazolidinyl)、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、3H-吲哚基和喹啉嗪基。
在上述基团中，一个或多个氢原子可以被一个或多个合适的基团取代，例如OR’，＝O，SR’，SOR’，SO2R’，NO2，NHR’，NR’R’，＝N-R’，NHCOR’，N(COR’)2，NHSO2R’，NR’C(＝NR’)NR’R’，CN，卤素，COR’，COOR’，OCOR’，OCONHR’，OCONR’R’，CONHR’，CONR’R’，取代或未取代的C1-C12烷基，取代或未取代的C1-C12烯基，取代或未取代的C1-C12炔基，未取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的杂环基，其中每个R’基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C1-C12烯基、取代或未取代的C1-C12炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可选自上述列表。当取代基以双键(例如＝O和＝N-R′)终止时，它取代相同碳原子中的2个氢原子。
本发明化合物中合适的卤素取代基包括F、Cl、Br和I。
术语“药学上可接受的盐”是指给予患者后能够(直接或间接)提供本文所述化合物的任何盐。应理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为这些盐可用于制备药学上可接受的盐。盐的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，本文提供的化合物的药学上可接受的盐是由包含碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成的。通常，这样的盐例如通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。酸加成盐的示例包括无机酸加成盐(如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐)和有机酸加成盐(如乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐)。碱加成盐的示例包括无机盐(如钠盐、钾盐、钙盐和铵盐)，以及有机碱盐(如乙二胺、乙醇胺、N，N-二烷基乙醇胺(N,N-dialkylenethanolamine)、三乙醇胺和碱性氨基酸盐)。
本发明的化合物可以是作为游离化合物或溶剂合物(例如水合物、醇化物，特别是甲醇合物)的结晶形式，这两种形式都在本发明的范围内。溶剂化方法通常是本领域已知的。本发明的化合物可以具有不同的多晶型形式，并且本发明意欲包括所有这些形式。
本文所提及的任何化合物旨在代表这样的特定化合物以及某些变体或形式。特别地，本文提及的化合物可具有不对称中心，因此以不同的对映异构体或非对映异构体形式存在。因此，本文提及的任何给定的化合物旨在代表外消旋物、一种或多种对映异构体形式、一种或多种非对映异构体形式及其混合物中的任何一种。同样，关于双键的立体异构或几何异构也是可能的，因此在某些情况下，分子可以(E)-异构体或(Z)-异构体(反式和顺式异构体)存在。如果分子含有几个双键，每个双键都会有自己的立体异构体，这可能与分子中其他双键的立体异构体相同或不同。此外，本文提及的化合物可作为阻转异构体存在。本文所提及的化合物的所有立体异构体(包括对映体、非对映体、几何异构体和阻转异构体)及其混合物都被认为在本发明的范围内。
在通式I和II的化合物中，特别优选的R1、R5、R9、R11和R15独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。更优选的R1、R5、R9、R11和R15独立地选自氢、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的乙基、取代的或未取代的正丙基、取代的或未取代的异丙基和取代的或未取代的丁基(包括取代的或未取代的正丁基、取代的或未取代的叔丁基、取代的或未取代的异丁基、和取代的或未取代的仲丁基)。所述基团的优选取代基是OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR、CONR’R’、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，其中每个R’基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可以选自前述列表。氢、甲基、正丙基、异丙基、异丁基、仲丁基、4-氨基丁基、3-氨基-3-氧丙基、苄基、对甲氧基苄基、对羟基苄基和环己基甲基是最优选的R1、R5、R9、R11、以及R15基团。具体地，特别优选的R1选自仲丁基和异丙基，最优选仲丁基。特别优选的R5选自异丁基和4-氨基丁基，最优选异丁基。特别优选的R11是甲基和异丁基。特别优选的R9选自对甲氧基苄基、对羟基苄基和环己基甲基，最优选对甲氧基苄基。特别优选的R15选自甲基、正丙基和苄基，最优选甲基和苄基。
在通式III的化合物中，特别优选的R1、R5、R9和R15独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。更优选的R1、R5、R9和R15独立地选自氢、取代或未取代的甲基、取代或未取代的乙基、取代或未取代的正丙基、取代或未取代的异丙基和取代或未取代的丁基(包括取代或未取代的正丁基、取代或未取代的叔丁基、取代或未取代的异丁基、以及取代或未取代的仲丁基)。所述基团的优选取代基是OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR’、CONR’R’、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，其中每个R'基团独立地选自以下组：氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可以选自前述列表。氢、甲基、正丙基、异丙基、异丁基、仲丁基、4-氨基丁基、3-氨基-3-氧丙基、苄基、对甲氧基苄基、对羟基苄基和环己基甲基是最优选的R1、R5、R9和R15基团。具体地，特别优选的R1选自仲丁基和异丙基，最优选仲丁基。特别优选的R5选自异丁基和4-氨基丁基，最优选异丁基。特别优选的R9选自对甲氧基苄基，对羟基苄基和环己基甲基，最优选对甲氧基苄基。特别优选的R15选自甲基，正丙基和苄基，最优选甲基和苄基。
在通式I、II和III的化合物中，特别优选的R8、R10、R12和R16独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。更优选R8、R10、R12和R16独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、异丁基和仲丁基)，甚至更优选它们独立地选自氢和甲基。具体地，特别优选的R8、R10以及R12是甲基，特别优选的R16是氢。
在通式I和III的化合物中，特别优选的R3和R4独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。更优选的R3和R4独立地选自氢、取代或未取代的甲基、取代或未取代的乙基、取代或未取代的正丙基、取代或未取代的异丙基和取代或未取代的丁基(包括取代或未取代的正丁基、取代或未取代的叔丁基、取代或未取代的异丁基和取代的仲丁基)。所述基团的优选取代基是OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR’、CONR’R’、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，其中每个R'基团独立地选自：氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可以选自前述列表。氢、甲基、异丙基和仲丁基是最优选的R3和R4基团。具体而言，特别优选的R3选自甲基和异丙基，特别优选的R4为甲基或氢。
在通式I、II和III的化合物的一个实施例中，特别优选的R6和R7独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。更优选R7选自氢、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的乙基、取代的或未取代的正丙基、取代的或未取代的异丙基和取代的或未取代的丁基(包括取代或未取代的正丁基、取代或未取代的叔丁基、取代或未取代的异丁基和取代的仲丁基)。所述基团的优选取代基是OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR’、CONR’R’、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，其中每个R'基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基以及取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可以选自前述列表。更优选的R6选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、异丁基和仲丁基)。最优选的R6选自氢和甲基，最优选的R7是甲基。
在通式I、II和III的化合物的另一个实施例中，特别优选R6和R7与它们所连接的相应的N原子和C原子一起形成取代的或未取代的杂环基。在这方面，优选的杂环基是含有一个、两个或三个选自N、O或S原子的杂原子，最优选一个N原子，并具有5至约10个环原子，最优选5、6或7个环原子的杂脂环基团(heteroalicyclic group)。吡咯烷基团是最优选的。
在通式I、II和III的化合物的一个实施例中，特别优选的R13和R14独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基。更优选R13选自氢、取代的或未取代的甲基、取代的或未取代的乙基、取代的或未取代的正丙基、取代的或未取代的异丙基和取代的或未取代的丁基(包括正丁基、叔丁基、异丁基和仲丁基)。所述基团的优选取代基是OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR’、CONR’R’、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，其中每个R'基团独立地选自以下组：氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可以选自前述列表。更优选的R14选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、异丁基和仲丁基)。最优选的R13选自氢、甲基、异丙基、异丁基和3-氨基-3-氧丙基，最优选的R14为氢。
在通式I、II和III的化合物的另一个实施例中，特别优选R13和R14与它们所连接的相应的N原子和C原子一起形成取代的或未取代的杂环基。在这方面，优选的杂环基是含有一个、两个或三个选自N、O或S原子的杂原子，最优选一个N原子，并具有5至约10个环原子，最优选5、6或7个环原子的杂脂环基团。吡咯烷基团是最优选的。
在通式I、II和III的化合物中，特别优选R2选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基和CORa，其中Ra是取代或未取代的C1-C6烷基，甚至更优选Ra是甲基、乙基、正丙基、异丙基和丁基(包括正丁基、叔丁基、仲丁基和异丁基)。更优选地，R2是氢。
在通式I、II和III的化合物中，特别优选R17选自氢、CORa、COORa、CONHRb、(C＝S)NHRb和SO2Rc，其中每个Ra、Rb和Rc优选且独立地选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂环基。所述基团的优选取代基是OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N-R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR’、CONR’R’、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，其中每个R'基团独立地选自氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基。当这些基团本身被取代时，取代基可以选自前述列表。氢、CORa、COORa和SO2Rc是最优选的R17基团，并且甚至最优选氢、COO苄基、CO苯并[b]噻吩-2-基、SO2(对甲基苯基)、COCOCH3和COOC-(CH3)3。
在通式I、II和III的化合物的另一个实施例中，特别优选Y是CO。在另一个实施例中，特别优选Y是-COCH(CH3)CO-。
在通式I、II和III的化合物的另一个实施例中，特别优选X是O。在另一个实施例中，特别优选X是NH。
在通式I和II的化合物的另一个实施例中，特别优选n、p和q为0。在另一个实施例中，特别优选n为1，p和q为0。在另一个实施例中，特别优选n和p为1，q为0。在另一个实施例中，特别优选n、p和q为1。在另一个实施例中，特别优选n和p为1，q为2。
在通式III化合物的另一个实施例中，特别优选p和q为0。在另一个实施例中，特别优选p为1和q为0。在另一个实施例中，特别优选p和q为1。在另一个实施例中，特别优选p是1和q是2。
在另外的优选实施例中，组合了上述对于不同取代基的优选项。本发明还涉及上述式I、II和III的优选取代基的这种组合。
在本发明的描述和定义中，当在本发明的化合物中存在几个基团Ra、Rb和Rc时，除非明确指出，应理解它们在给定的定义内可以各自独立地不同，即，Ra在本发明的给定的化合物中不一定同时代表相同的基团。
在通式I、II和III的化合物中，当q的值为2时，化合物中有两个基团R15和两个基团R16。由此阐明，给定的化合物中的每个R15和每个R16基团可以独立地选自上文针对这些基团描述的不同可能性。
通式I的化合物的特别优选的立体化学是
Figure GDA0003994401990000241
其中X、Y、n、p、q和R1-R17如上所定义，并且当Y是-COCH(CH3)CO-时，其具有以下立体化学：
Figure GDA0003994401990000242
通式II的化合物的特别优选的立体化学是
Figure GDA0003994401990000243
其中X、Y、n、p、q、R1、R2和R5-R17如上所定义，并且当Y是-COCH(CH3)CO-时，其具有以下立体化学：
Figure GDA0003994401990000251
通式III的化合物的特别优选的立体化学是
Figure GDA0003994401990000252
其中X、Y、p、q、R1-R10和R12-R17如上所定义，并且当Y是-COCH(CH3)CO-时，其具有以下立体化学：
Figure GDA0003994401990000253
本发明特别优选的化合物如下：
Figure GDA0003994401990000261
Figure GDA0003994401990000271
Figure GDA0003994401990000281
Figure GDA0003994401990000282
以及
Figure GDA0003994401990000283
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
通式I、II和III的化合物可以按照Vera等人.Med.Res.Rev.2002,22(2),102-145,WO 2011/020913(见示例1-5),WO 02/02596,WO 01/76616,以及WO 2004/084812(它们引入此作为参考)公开的任何合成方法制备。
优选的化合物是PLD或其药学上可接受的盐或立体异构体。最优选的是PLD。
普立肽的化学名称为(-)-(3S，6R，7S，10R，11S，15S，17S，20S，25aS)-11-羟基-3-(4-甲氧基苄基)-2,6,17-三甲基-15-(1-甲基乙基)-7-[[[(2R)-4-甲基-2-[甲基[[(2S)-1-(2-氧代丙酰基)吡咯烷-2-基]羰基]氨基]戊酰基]氨基]-10-[(1S)-1-甲基丙基]-20-(2-甲基丙基)十四氢-15H-吡咯并[2,1-f]-[1,15,4,7,10,20]二氧杂环戊环三环烷-1,4,8,13,16,18,21(17H)-庚酮((-)-(3S,6R,7S,10R,11S,15S,17S,20S,25aS)-11-hydroxy-3-(4-methoxybenzyl)-2,6,17-trimethyl-15-(1-methylethyl)-7-[[(2R)-4-methyl-2-[methyl[[(2S)-1-(2-oxopropanoyl)pyrrolidin-2-yl]carbonyl]amino]pentanoyl]amino]-10-[(1S)-1-methylpropyl]-20-(2-methylpropyl)tetradecahydro-15H-pyrrolo[2,1-f]-[1,15,4,7,10,20]dioxatetrazacyclotricosine-1,4,8,13,16,18,21(17H)-heptone)，对应分子式C57H87N7O15。它的相对分子质量为1110.34g/mol，结构如下：
Figure GDA0003994401990000291
普立肽是一种环酯肽，最初从地中海海洋海鞘白色念珠菌(marine tunicateAplidium albicans)中分离，目前通过全化学合成(full chemical synthesis)生产。它在澳大利亚被授权和销售，品牌名称为普立肽，用于治疗多发性骨髓瘤。
在真核细胞中，已证明普立肽靶向真核延伸因子(eEF1A)，真核延伸因子在调节与其它蛋白质的相互作用中具有关键作用，其中一些蛋白质被认为在病毒复制中是必需的。值得注意的是，上述蛋白之一是冠状病毒N蛋白，其在感染细胞内大量产生，并且已知与延伸因子EF1A相互作用。如上所述，普立肽与EF1A之间的相互作用可因此降低从头合成病毒衣壳的效率，并因此导致病毒载量的降低。
本发明提供本发明化合物在治疗CoV感染中的用途。特别地，本发明提供PLD在治疗CoV感染中的用途。术语“CoV”感染是指冠状病毒科和正冠状病毒亚科的病毒的任何感染。在一个实施例中，感染来自乙型冠状病毒属中的病毒，乙型冠状病毒属包括乙型冠状病毒1(Betacoronavirus 1)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1)、小鼠冠状病毒(Murine coronavirus)、蝙蝠冠状病毒HKU5(Pipistrellus bat coronavirus HKU5)、果蝠冠状病毒HKU9(Rousettus bat coronavirus HKU9)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)、扁颅蝠冠状病毒HKU4(Tylonycteris bat coronavirus HKU4)、中东呼吸综合征相关冠状病毒、人冠状病毒OC43和刺猬冠状病毒1(EriCoV)。优选地，所述病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2，最优选SARS-CoV-2。SARS-CoV-2先前称为2019-nCoV，并且这些术语在本文中可互换使用。
在具体实施例中，病毒是SARS-CoV-2和相关的COVID-19疾病。与COVID-19疾病相关的死亡率似乎与a)呼吸窘迫继发的严重呼吸衰竭和b)由细胞因子风暴引起的炎症状态有关。因此，在来自中国的最初系列患者中，需要在有或没有高流量氧气补充的情况下住院的重症疾病患者和需要机械通气支持的患者的比例估计分别接近15％和5％。然而，在欧洲，卫生当局报告的数字更高，达到30％的需要住院治疗而不需要机械通气的重症病例(在马德里市)，接近10％的患者需要机械通气。同样，中国系列患者需要机械通气的时间比马德里等城市报道的要短得多，因此，患者长时间居留改变了患者通常的流向重症监护室的情况。这给医院服务带来了巨大的负担，这使得有必要采取前所未有的特别措施。相信通过在患有早期COVID-19肺炎的患者中使用本发明可以避免或减少最初描述的并发症的程度，因为一旦发生细胞因子风暴和呼吸窘迫，抗病毒药物通常更难具有有益的治疗效果。然而，在实施例中，本发明的化合物还可用于病毒感染的后期阶段，例如在发生细胞因子风暴和呼吸窘迫的患者中。
如上所述，在真核细胞中，FLIM-FRET实验证明，普立肽位于足够接近eEF1A的位置以提示药物-蛋白质复合物的形成。用14C-普立肽和从兔肌肉纯化的eEF1A进行的单独的一组实验表明，普立肽以高亲和力和低解离速率结合eEF1A。
普立肽对SARS-CoV-2的体外作用
进行了旨在确定普立肽对SARS-CoV-2的作用的若干体外实验并在本文公开。分别使用用SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞和直接定量SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白(其明确涉及到普立肽诱导的抗病毒活性的机制)的两个研究显示，普立肽在体外是SARS-CoV-2生长的有效抑制剂，其IC50为0.7至3.0nM。在另一项研究中，将人干细胞衍生的肺细胞样细胞预防性地暴露于10nm普立肽1小时，然后用SARS-CoV-2(4×104空斑形成单位)感染。在48小时孵育期后，确定抗病毒和细胞毒性普立肽的效果。结果表明，普立肽完全消除了SARS-CoV-2的复制，对肺细胞样细胞没有明显的细胞毒性。
普立肽对体内SARS-CoV-2的影响
使用先前描述的用SARS-CoV-2感染的腺病毒介导的hACE2的小鼠模型，证明了普立肽在体内有效的抗病毒效果。使用先前描述的表达由用SARS-CoV-2感染的细胞角蛋白-18基因启动子(K18-hACE2)驱动的hACE2的转基因小鼠模型，证明了普立肽在体内也有效的抗病毒效果。
普立肽对宿主炎症反应的影响
与SARS-CoV类似，SARS-CoV-2感染也会产生多种细胞因子的高度分泌，随着疾病的发展，血浆水平也会增加，这表明细胞因子的释放与疾病严重程度之间可能存在联系。
先天免疫是抵御入侵病原体的第一道防线。在SARS-CoV-2的情况下，病毒进入宿主上皮细胞是由病毒包膜刺突(S)蛋白和细胞表面受体ACE2之间的相互作用介导的。病毒RNA，作为病原体相关的分子模式，然后被宿主模式识别受体检测，宿主模式识别受体包括toll样受体家族。然后，Toll样受体通过激活转录因子核因子κB(NF-κB)上调抗病毒和促炎介质(antiviral andproinflammatory mediator)，如白细胞介素(IL)6、IL-8和干扰素(IFN)-。在非临床物种和患者中探索SARSCoV感染的研究中，已经强调了NF-κB对促炎基因表达(特别是在肺中)的重要性。在感染SARS CoV的小鼠中，NF-κB的药理学抑制导致肺中肿瘤坏死因子α(TNF)、CCL2和CXCL2的较高的存活率和降低的表达。
早期的体外研究表明，普立肽诱导肿瘤细胞中NFκB的下调。随后，进行体外和离体研究以评估普立肽对免疫细胞的作用。
使用THP-1细胞进行体外研究，THP-1细胞是一种自发永生化的单核细胞样细胞系，来自急性单核细胞白血病儿童患者的外周血，广泛用于研究单核细胞结构和功能。结果表明，所有与病原体相关的分子模式模拟化合物(mimicking化合物)都能诱导在THP-1细胞中产生促炎细胞因子，且添加普立肽可显著减少促炎细胞因子的分泌。
离体研究评估了普立肽对小鼠肺中细胞因子IL 6、IL 10和TNFα表达的影响。结果显示，来自安慰剂治疗的小鼠的分化(CD)45+细胞群能够在LPS-B5刺激下产生IL 6、IL 10和TNFα。然而，与未刺激的对照组相比，来自用普立肽治疗的小鼠的CD45+细胞未能显示出IL 6、IL 10和TNFα的显著增加。这些结果表明，体内暴露于普立肽阻止了在从支气管肺泡灌洗液分离的CD45+细胞中增加由LPS-B5介导的促炎细胞因子的产生。
本发明的化合物可用于具有生物/药理学活性的药物组合物中，用于治疗上述感染和相关病症。这些药物组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。术语“载体(carrier)”是指与活性成分一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体(vehicle)。E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，1995，中有描述合适的药物载体。药物组合物的示例包括用于口服、局部或胃肠外给药的任何固体(片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等)或液体(溶液、混悬剂、乳剂等)组合物。含有本发明化合物的药物组合物可以通过脂质体或纳米球包封、以缓释制剂的方式或通过其它标准递送方式递送。
一种示例性组合物是用于注射的溶液的粉末形式。例如WO9942125中描述的组合物。例如包括水溶性材料，其次是混合溶剂的重构溶液的本发明化合物的冻干制剂。具体的例子是PLD和甘露醇和混合溶剂的重构溶液(例如PEG-35蓖麻油、乙醇和注射用水)的冻干制剂。每个小瓶例如可以包含2mg的PLD。重构后，每mL重构溶液可包含：0.5mg PLD、158mgPEG-35蓖麻油和0.15mL/mL乙醇。
任何特定患者的特定剂量和治疗方案可以变化，并且将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性、所使用的特定制剂、应用模式、年龄、体重、综合健康、性别、饮食、给药时间、排泄率、药物组合、反应敏感性和所治疗的特定疾病或病症的严重性。
在本发明的实施例中，本发明的化合物可以根据每日剂量的给药方案给药。
在本发明的实施例中，本发明的化合物可以根据每日一次剂量的给药方案给药。
在进一步的实施例中，本发明的化合物可以根据每日剂量给药10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天的给药方案给药。优选的方案是2-5天，或3-5天，或3、4或5天，最优选3天或5天。
剂量可为每天5mg或以下、每天4.5mg或以下、每天4mg或以下、每天3.5mg或以下、每天3mg或以下、每天2.5mg或以下或2mg或以下。
具体剂量包括0.5mg/天、1mg/天、1.5mg/天、2mg/天、2.5mg/天、3mg/天、3.5mg/天、4mg/天、4.5mg/天或5mg/天。优选的剂量为1mg/天、1.5mg/天、2mg/天和2.5mg/天。
在进一步的实施例中，本发明的化合物可以根据1-50mg、1-40mg、1-30mg、1-20mg、1-15mg、3-15mg、3-12mg、4-12mg、4-10mg或4.5-10mg的总剂量给药。总剂量可为4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg。优选的总剂量为4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg或10mg。总剂量可以分成1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，优选3天或5天。
在一个具体实施例中，本发明的化合物可根据每日一次，每天2.5mg或更少的剂量，给药5天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可根据每日一次，每天2mg或更少的剂量，给药5天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可以根据每日一次，每天1.5mg或更少的剂量，给药3天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可根据每日一次，每天2mg或更少的剂量，给药3天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可以根据每日一次，每天2.5mg或更少的剂量，给药3天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可以根据每日一次，每天1.5mg的剂量，给药3天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明化合物可以根据每日一次，每天2.0mg的剂量，给药3天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可以根据每日一次，每天2.5mg的剂量，给药3天的给药方案给药。
在另一个实施例中，本发明的化合物可以根据每日一次，每天1.5至2.5mg的剂量，给药3天的给药方案给药。
另一种方案是在第1天单剂量给药。单剂量方案可能特别适合治疗：轻度感染；减少与CoV感染相关的并发症(包括住院、ICU和死亡)；预防、减少、避免或治疗持续性COVID、长COVID、后COVID综合征；和/或降低CoV患者的传染性。单次剂量可以是1-10mg、4-10mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg；优选4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg、9mg或10mg；更优选5-9mg、6.5-8.5mg、7-8mg或7.5mg。
在另一个实施例中，本发明的化合物可根据本发明给药，其中本发明的化合物与皮质类固醇一起给药。优选地，皮质类固醇是地塞米松。
皮质类固醇可以与本发明的化合物一起每日给药。给药可以是按次序的、同时的或连续的。皮质类固醇可在给药本发明化合物后的几天内进一步给药。例如，对于3天给药方案，皮质类固醇可以在第1-3天给药，然后每天进一步给药3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天。
在一个具体实施例中，皮质类固醇可以在第1-3天以静脉注射给药，然后在第6-10天以口服给药。在另一个实施例中，皮质类固醇的剂量在与本发明化合物的共同给药阶段期间可以更高，并且在随后的天数里降低。
具体剂量时间表包括：
·在第1天至第3天静脉注射(IV)1.5mg/天的普立肽以及6.6mg/天的盐酸地塞米松，然后从第4天到第10天口服(PO)/IV6 mg/天的地塞米松直至第10天(取决于医生根据患者临床状况和病情进展的判断)。
·在第1天至第3天静脉注射(IV)2.0mg/天的普立肽并静脉注射6.6mg/天的地塞米松，然后从第4天到第10天口服(PO)/IV6 mg/天的地塞米松直至第10天(取决于医生根据患者临床状况和病情进展的判断)。
·在第1天至第3天静脉注射(IV)2.5mg/天的普立肽并静脉注射6.6mg/天的地塞米松，然后从第4天到第10天口服(PO)/IV 6mg/天的地塞米松直至第10天(取决于医生根据患者临床状况和病情进展的判断)。
在一个实施例中，为了避免与给药相关的输液反应，患者可以在开始注射根据本发明的化合物之前20至30分钟接受以下药物：
·昂丹司琼8mg IV(或等同药物)
·盐酸苯海拉明25mg IV(或等同药物)
·雷尼替丁50mg IV(或等同药物)
·地塞米松6.6mg静脉注射(包括在上述时间表中)
另外，在第4天和第5天，用本发明化合物治疗的患者可PO接受每天两次的昂丹司琼4mg。
地塞米松、昂丹司琼和雷尼替丁的剂量在此以碱形式为基础进行定义。盐酸苯海拉明的剂量以盐酸盐为基础给出。本发明化合物的剂量基于碱形式给出。
日剂量可以注射给药。注射可以是1小时注射、1.5小时注射、2小时注射、3小时注射或更长时间。优选地，注射为1.5小时。
在某些实施例中，可根据使用负荷剂量和维持剂量的方案来给药剂量。根据本发明的负荷/维持剂量包括：
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天2mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天1.5mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天1.5mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；
第1天1.5mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天1.5mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；以及
第1天1mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量。
根据另一实施例，日剂量可在方案的最后一天或多天减少。
根据另一实施方式，如果日剂量为2mg，则剂量可在第4天和第5天减少至1mg。
具体的治疗方案包括：
-1mg普立肽，注射1.5小时，每天一次，连续5天。(总剂量5mg)；
-2mg普立肽，注射1.5小时，每天一次，连续5天。根据研究人员的判断，第4天和第5天的剂量可以减少到1mg/天(总剂量8-10mg)；
-1.5mg普立肽，注射1.5小时，每天一次，连续3天。(总剂量4.5mg)；
-2mg普立肽，注射1.5小时，每天一次，连续3天。(总剂量6mg)；以及
-2.5mg普立肽，注射1.5小时，每天一次，连续3天。(总剂量7.5mg)。
单剂量方案包括：
·给药普立肽，注射1.5小时，第1天一次，剂量为1-10mg、4-10mg、4.5-10mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg，优选4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg或10mg，更优选5-9mg、6.5-8.5mg、7-8mg或最优选7.5mg。
·单剂量方案可在注射普立肽前20-30分钟进一步包括以下预防性药物：
-静脉注射盐酸苯海拉明25mg，
-静脉注射雷尼替丁50mg，
-静脉注射地塞米松6.6mg，
-静脉注射昂丹司琼8mg，缓慢注射15分钟。
·服用普立肽后，可每12小时口服昂丹司琼4mg，持续3天，以减轻药物引起的恶心和呕吐。
如果在早晨给予普立肽，患者可以在下午接受第一剂量的昂丹司琼。
根据另外的实施例，可以基于临床参数和/或患者特征选择患者用于使用普立肽的治疗。合适的参数可以是本申请中公开的测量。
上述方案和剂量适用于根据本发明的治疗方法、用途、以及本文所定义的化合物在制备本文所定义的药物中的用途。
在实施例中，本发明涉及根据本发明使用的化合物，其中所述化合物与一种或多种以下预防性药物组合给药：盐酸苯海拉明、雷尼替丁、地塞米松、昂丹司琼。特别地，静脉注射25mg的一种或多种盐酸苯海拉明或等同药物；静脉注射50mg雷尼替丁或等同药物；静脉注射8mg地塞米松；静脉注射8mg的昂丹司琼或等同药物，并缓慢注射15分钟。患者可在注入普立肽前20-30分钟接受所述预防性药物。静脉注射8mg地塞米松可以是产生6.6mg地塞米松碱的磷酸地塞米松。
为了提供更简洁的描述，本文给出的一些定量表达式没有限定术语“约”。应理解，无论是否明确使用术语“约”，本文给出的每一量均意指实际给定值，且其还意指将基于本领域技术人员合理地推断的对所述给定值的近似值，包括所述给定值的实验和/或测量条件导致的等效物和近似物。
虽然上述公开提供了对包含在本发明范围内的主题(包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式)的概述，但是提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实践本发明并提供完整的书面描述。然而，本领域技术人员将认识到，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应从本公开的权利要求及其等同药物中理解。鉴于本公开，本发明的各种进一步的方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。
示例
本发明的化合物可根据文献中所述的方法获得，例如：Vera等人.Med.Res.Rev.2002,22(2),102-145,WO 2011/020913(具体见示例1-5),WO 02/02596,WO01/76616,以及WO 2004/084812，这些内容通过引用结合于此。
在本发明的实验中使用的具体化合物是：
Figure GDA0003994401990000381
Figure GDA0003994401990000391
按照WO02/02596和说明书中描述的方法，以及在前面的实施例中进一步公开的，可得到下列化合物：
Figure GDA0003994401990000401
Figure GDA0003994401990000402
Figure GDA0003994401990000411
Figure GDA0003994401990000421
Figure GDA0003994401990000422
Figure GDA0003994401990000431
Figure GDA0003994401990000441
按照WO 02/02596和说明书中描述的方法，以及在前面的实施例中进一步公开的，可得到下列化合物：
Figure GDA0003994401990000451
Figure GDA0003994401990000452
Figure GDA0003994401990000461
Figure GDA0003994401990000462
Figure GDA0003994401990000471
Figure GDA0003994401990000481
Figure GDA0003994401990000491
另一种化合物是化合物240，称为膜海鞘素B，其结构如下所示：
Figure GDA0003994401990000492
例1
在预先用PHA+IL-2活化的MT-2细胞和PBMC中进行重组病毒检测(recombinantvirus assay)。用从293t细胞获得的上清液感染细胞，所述293t细胞用全长感染性HIV-1质粒pNL4.3-Luc(X4嗜性病毒)、pNL4.3-Renilla(X4嗜性病毒，能够进行多轮复制)、pNL4.3-Δenv-Luc加pVSV-env(用VSV的G蛋白假型化的HIV)或pJR-Renilla(R5嗜性病毒，能够进行多轮复制)转染。将来自不同感染供体的病毒的pol基因克隆到NL4.3-Renilla中获得抗性病毒。病毒9D携带以下突变：41L、67N、70R、98G、118I、184V、215F、219Q、74I，病毒4D：K65R、K70R、V75I、F77L、F116Y、Q151M、M184I、L10I。然后在96孔微板中进行检测，该微板接种100μl，每孔含有250.000(PBMC)或100.000(MT-2)细胞。将待测试化合物以50至0.0016μg/ml(100μl/孔)的浓度添加到培养物中。最后，用转染上述不同质粒获得的上清液感染细胞培养物。48小时后，除去细胞培养物上清液，并按照制造商的说明用荧光素酶(Luciferase)检测系统或海肾(Renilla)检测系统(均来自Promega)溶解细胞，在光度计(Berthold检测系统)中测量Luciferase-Renilla活性。所有实验用用载体(DMSO)处理的细胞和未处理的细胞控制。
HIV-1复制抑制通过测量光度计中萤光素酶-海肾活性或RLU(相对光单位)的降低来评估，是未处理细胞的感染的100％。
化合物3(图1A和图1B)在MT-2细胞和PBMC中都显示出抗病毒活性(IC50分别为1.39μM和0.16μM)。这种化合物在PBMC中毒性更大，如图1所示。MT-2细胞在57.3μM时未达到毒性浓度，而在PBMCS中，CC50值约为27μM。
化合物8(图2A和图2B)在MT-2细胞和PBMC中也显示出抗病毒活性。虽然浓度为50μM时是非特异性的，但在10μM时是特异性的，IC50值低100倍。
化合物9(图3A和图3B)、10(图4A和图4B)和11(图5A和图5B)是所有测试化合物中最有效的化合物。化合物9、10和11在PBMC中显示出纳摩尔范围内的IC50值(分别为0.63、0.86和69.4nM)，并且它们是文献中存在的体外抗病毒化合物中最有效的。
例2
在用HCoV-229E感染的Huh-7细胞(人肝癌细胞系)中测试本发明化合物的抗病毒活性。HCoV-229E具有与SARS-COV-2非常相似的增殖和传播机制。事实上，HCoV-229E的N蛋白与SARS-CoV-2中的同源N蛋白具有大于90％的蛋白同源性。所有冠状病毒都需要其N(核衣壳)蛋白与EF1A结合，以便有效地复制和合成病毒蛋白。减少或消除N与EF1A的结合降低了病毒传播的活力。
在下表1中列出的本发明化合物在DMSO中重构，并在-20℃下储存。
以0.01pfu的moi(感染复数)用HCoV-229E-GFP病毒感染在M96孔板中生长至融合(grown to confluence)的Huh-7细胞(人肝癌细胞系)。病毒存量为HCoV-229E-GFP(2013年1月31日起)，3x107 pfu/ml。
在8hpi(hours post infection，感染后的小时)，用具有合适的化合物稀释液(DMSO终浓度2％)的培养基替换培养基，遵循以下方案：
1 2 3 4 5
A(图6-10) 50nM 5nM 0.5nM 5nM 0.5nM
B(图11-14) 50nM 5nM 0.5nM 0.5nM
C(图15-18) 50nM 5nM 0.5nM 0.5nM
D(图19-21) 50nM 5nM 0.5nM
E(图22-24) 50nM 5nM 0.5nM
F(图25-28) 50nM 5nM 0.5nM 0.5nM
表1
A＝DMSO(对照)；B＝化合物240(膜海鞘素B)；C＝PLD；D＝化合物9；E＝化合物10；F＝PLD
24hpi观察到荧光细胞。照片是使用自动系统获得的。用4％PFA固定细胞30分钟，用PBS洗涤，用PBS中1:200的DAPI对细胞核染色20分钟RT。绿色图像显示GFP标记的小瓶颗粒。蓝色图像显示DAPI染色的细胞核。
短时间内，以0.01pfu/细胞的感染复数(MOI)，用3x107pfu/ml的病毒接种物感染Huh-7融合培养物，8小时后，加入浓度为0.5nM至50μM的普立肽。将含有普立肽的培养物温育48小时，然后通过荧光测量病毒活力。所获得的结果显示出浓度低至0.5nM(0.555μg/l)(远低于其他抗病毒药物)的普立肽诱导的抗病毒效果。
显示本发明的化合物在测试浓度范围内是有效的抗病毒剂，同时保持细胞活力。
例3
进行了一项多中心、随机、平行和概念验证研究，以评估需要住院治疗的COVID-19患者中三剂普立肽的安全性。
本研究的主要目的是确定根据提议的给药方案在COVID-19入院患者中给药的每个剂量水平下的普立肽的安全性和毒理学特性。
次要目标是通过以下指标评估以建议剂量水平对COVID-19患者使用普立肽的疗效：自基线的SARS-CoV-2病毒载量的变化；PCR阴性检测到SARS-CoV-2的时间；疾病严重程度的累积发生率(评估依据：死亡率；对有创机械通气和/或ICU入院的需要；对无创机械通气的需要；对氧气治疗的需要)和普立肽II/III期疗效研究的推荐剂量水平的选择。
研究中包括的患者以1:1:1:1的比例随机接受：
-组A)1.5mg普立肽，1.5小时注射给药，每天一次，连续3天(总剂量4.5mg)。
-组B)2.0mg普立肽，1.5小时注射给药，每天一次，连续3天(总剂量6.0mg)。
-组C)2.5mg普立肽，1.5小时注射给药，每天一次，连续3天(总剂量7.5mg)。
所有患者在注入普立肽前20-30分钟接受以下预防性药物治疗：
-静脉注射25mg盐酸苯海拉明或等同药物。
-静脉注射50mg雷尼替丁或等同药物。
-静脉注射地塞米松6.6mg。
-静脉注射8mg昂丹司琼或等同药物，缓慢注射15分钟。
包括在研究中的患者接受为期3天的治疗。
提供粉末形式的普立肽用于浓度为2mg/小瓶的用于注射的浓缩溶液。在使用前，用4ml重构溶液重构小瓶以获得无色至浅黄色的溶液，该溶液包含0.5mg/ml的普立肽、25mg/ml的甘露醇、0.15ml/ml的聚乙二醇甘油蓖麻油(macrogolglycerol ricinoleateoil)、0.15ml/ml的乙醇和0.70ml/ml的注射用水。在注射前，应在任何合适的静脉溶液中进行额外稀释。
2毫克普立肽装在一个I型透明玻璃瓶中，玻璃瓶带有一个用铝密封覆盖的溴丁基橡胶塞。每瓶含2毫克普立肽。
在I型无色玻璃小瓶中提供用于重构聚乙二醇甘油蓖麻油(聚乙二醇35蓖麻油)/无水乙醇/注射用水15％/15％/70％(v/v/v)的溶剂。安瓿的体积为4毫升。
普立肽将被标记研究方案代码、批号、内容物、有效期、储存条件、研究人员和发起人的名称。研究药物将按照《European Good Manufacturing Practices》附件13进行标记。普立肽应储存在2℃和8℃之间，小瓶应保存在外纸箱中，以保护它们免受光照。该药物在这些条件下稳定60个月。
在用4ml用于重构聚乙二醇甘油蓖麻油酸酯/乙醇/水的溶液重构2mg普立肽小瓶后，应当将重构的溶液稀释并在制备后立即使用。如果不立即使用，用户应负责储存时间和使用前的条件。重构后的药物的浓缩溶液在冷藏条件下(5℃±3℃)下物理、化学和微生物稳定24小时，在室温下在室内光照下储存在原小瓶中6小时。如果在给药前需要储存，溶液应冷藏储存，避光，并应在重构后24小时内使用。
血浆浓度
图29显示了1.0mg和2.0mg日剂量(D1-D5)后总血浆普立肽浓度曲线对时间的模拟。水平黑线表示体外相当于IC50、IC90和3xIC90的与肺中的浓度相关的总血浆浓度。对于两种剂量水平(1.0mg和2.0mg)，在整个治疗期间将获得高于IC50的血浆浓度，并且在大部分给药间隔期间将保持高于IC90。经过五次重复给药后的积累是最小的。
另一个剂量方案是每天1.5mg，持续5天。另一种方案如图30所示，其模拟了与初始固定剂量(flat dose)相关的普立肽总血浆浓度，1小时静脉注射给予1mg(第1天)，随后是0.5mg(D2-D5)的日剂量。在该剂量方案中，在整个治疗期间，普立肽血浆浓度保持在IC50以上，且在分别注射1mg和0.5mg剂量后18和14小时期间保持在IC90以上。值得注意的是，预计在反复给药后积累最少。该方案在治疗的第一天提供1mg的普立肽的负荷剂量，1小时静脉注射，随后维持剂量为0.5mg，每日一次，持续4天。
图31示出了在1.5mg、2.0mg和2.5mg的日剂量(D1-D3)之后总血浆普立肽浓度曲线相对时间的模拟。水平黑线表示体外相当于IC50、IC90和3xIC90的与肺中浓度相关的总血浆浓度。对于所有三个剂量水平(1.5mg、2.0mg和2.5mg)，在整个治疗期间将获得高于IC50的血浆浓度，并且在大部分给药间隔期间将保持高于IC90。三次重复用药后的积累很少。
中期结果
到目前为止，有9名患者的数据。在基线、第4天、第7天和第15天和第31天通过PCR评估病毒载量的情况下，PLD以90分钟静脉注射每天给药，持续3天(第1-3天)。
患者1-50岁男性，双侧肺炎。接受PLD 1.5mg x 3。PCR COVID 19检测：基线阳性，到第4天转化为阴性(无病毒载量)。急性临床好转。第7天出院。因此，PLD 1.5mg x 3在第4天去除病毒载量。PLD获得了急性临床改善，包括消除所有病毒负荷和治疗双侧肺炎，以便在第7天出院。
患者2：40岁男性，双侧肺炎。接受PLD 1.5mg x 3。到第六天，缺乏改善，并过渡到瑞德西韦(Remdesivir)+TOL+皮质固醇+阿片类药物。第15天PCR转为阴性，第19天出院。
患者3：53岁男性，双侧肺炎。接受PLD 1.5mg x 3。PLD防止了临床恶化。第10天出院，第31天PCR转为阴性。
患者4：42岁男性，双侧肺炎。接受PLD 2.0mg x 3。需要激素治疗。PCR COVID 19检测：基线时为阳性，第7天仍为阳性。到第15天，患者PCR阴性，如图37a所示。患者在第10天充分康复出院。
患者5：33岁女性，双侧肺炎。接受PLD 1.5mg x 3。PCR COVID 19检测：基线阳性，到第4天转化为阴性(无病毒载量)，如图37b所示。双侧肺炎在第6天消失(正常Rx肺)。临床有重大改善。第8天出院。X射线显示肺炎消退，如图34a-c所示。双侧肺炎如图34a所示。在用PLD治疗后，在第6天观察到改善。层状肺不张(Laminar atelectasis)如图34b所示。第15天的后续x射线显示恢复正常，图34c。PLD 1.5mg x 3在第4天去除病毒载量。PLD取得了重大的临床改善，包括消除了所有的病毒负荷，治疗了双侧肺炎，使第8天出院。
患者6：69岁女性，症状严重的COPD。登记时有单侧肺炎。接受PLD 1.5mg x 3。PCRCOVID19检测：基线阳性，到第7天转化为阴性(无病毒载量)，如图37c所示。出现重大临床改善。患者在第8天出院。X射线显示肺炎进展，如图35a-c所示。单侧肺炎在图35a中表现明显，在图35b中发展为双侧肺炎。在图35c中，可以看到改善。PLD取得了重大的临床改善，包括消除所有病毒负荷和治疗肺炎，如图35d所示，使第8天出院。
患者7：39岁女性，肺部浸润。接受PLD 2.0mg x 3。PCR COVID19检测：基线阳性，到第7天转化为阴性(无病毒载量)，如图37d所示。PLD治疗后，取得了重大的临床改善。第8天出院。
患者8：32岁男性。接受PLD 1.5mg x 3。无法评估疗效，第4天出院。
患者9：34岁男性。接受PLD 2.0mg x 3。PCR COVID 19检测：基线时为阳性，第7天仍为阳性。然而，到第8天重大临床改善并出院。
C-反应蛋白试验
也进行了PLD对患者5、7和9的炎性细胞因子的影响的测量，C反应蛋白测试的结果如图36所示。对于患者5(图36a)，在给药PLD后，在第2天出现急性下跌。患者7(图36b)和9(图36c)在服用PLD后，在第3天出现急性下跌。这些数据证明了PLD的抗炎特性。
讨论
对COVID-19患者的PLD临床试验的初步结果进一步证明了PLD在治疗SARS-CoV-2感染和COVID-19方面的显著特性。
8名可评价患者中有6名显示SARS-CoV-2PCR转化为阴性，PCR转化的中位时间为7天(4-31)。PLD对CoV感染，即SARS-CoV-2的抗病毒特性，在临床上被证明完全消除了病毒负荷。
值得注意的是，在目前测试的9名患者中，由于服用PLD，没有一名患者需要机械通气或ICU入院，研究中没有死亡。8名可评价患者中有6名PDL诱导疾病控制和重大临床改善，其中8名患者中只有2名需要后PLD特异性抗COVID 19治疗。出院的中位时间为8天(7-19天)。这些结果表明PLD对于SARS-CoV-2感染和COVID-19以及由SARS-CoV-2感染引起的肺炎是有效的疗法。
对第一组1.5mg和2mg的特别分析证实，在给药剂量下的PLD是有效的，实现了急性改善和完全的疾病控制。注意到绝大多数患者的病毒负荷都完全消除。
结果
研究完成后，45名因COVID 19住院的患者随机接受每天1.5、2.0和2.5mg的普立肽的治疗，持续3天。治疗在所有3个剂量组中的耐受性都很好。由出院率评估的治疗结果由基线时的疾病严重程度和病毒载量决定。在整个剂量组中，100％(9/9)的轻度疾病患者、82％(23/28)的中度疾病患者和57％(4/7)的重度疾病患者在第15天出院。在整个剂量组中，基线时的病毒载量中值为6.2(0至10.6)log10 copies/mL，到第7天达到病毒载量的平均减少为-3.1log10 copies/mL，到第15天达到-4.5log10 copies/mL。
这项研究是一项1期、多中心、开放标签研究，其中45名因COVID 19治疗而住院的患者被随机分为3个剂量组，包括1.5、2.0和2.5mg普立肽，每天一次1.5小时的静脉注射，连续3天。本研究的主要目的是根据(1)采用美国国家癌症研究所(NCI)《不良事件通用术语标准》(CTCAE)5.0版标准，在第3、7、15和31天出现≥3级治疗期间出现的不良事件(TEAE)的频率，(2)无法完成治疗的患者百分比和原因，(3)第3、7、15和31天出现TEAE和SAE的患者百分比，(4)第3天、第7天、第15天和第31天的血液学和非血液学参数基线变化，以及(5)第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第15天和第31天出现心电图异常的患者百分比，确定各剂量水平下的安全性和毒理学特征。第二个目标是选择关键研究的推荐剂量。
协议规定的安全性终点的结果总结如下：
·等级≥3AE：只有31％(14/45)的患者出现等级≥3AE，只有2名患者出现与治疗相关的等级≥3AE：在第一次普立肽注射过程中发生过敏反应各1例，导致停止治疗，1例腹泻，对普立肽治疗没有影响。与主要由COVID 19感染引起的等级≥3AE相一致，等级
≥3AE的患病率在很大程度上反映了每个组中严重疾病患者的百分比，其中2.5mg组的患病率最高(26.7％的严重疾病患者，40.0％的等级≥3AE)，1.5mg组的百分比较低(13.3％的严重疾病患者，33.3％的等级≥3AE)，2.0mg组的百分比最低(6.7％的严重疾病患者，
20.0％的等级≥3AE)。除1例等级≥3ALT升高外，其余均未发生特别关注事件。
●无法完成治疗的患者：只有1例患者未能完成普立肽治疗。
·严重不良事件(SAE)患者：共有10名患者经历了SAE，包括6名1.5mg剂量、1名2.0mg剂量和3名2.5mg剂量。除1例过敏反应外，其余均与COVID 19感染有关。
·不良事件(AE)患者：对于任何报告的不良事件，没有发现与剂量相关的趋势，最常报告的不良事件(不包括感染)与接受单药普立肽的晚期血液恶性肿瘤和实体肿瘤患者的安全性一致，包括胃肠道便秘疾病(癌症和COVID 19患者分别为29％比18％)、腹泻(31％比18％)、恶心(64％比42％)、呕吐(38％比18％)、乏力/疲劳的体质症状(83％比13％)和发热(28％比47％)。
●实验室参数变化：尽管大约一半的患者(51％)的血液学参数变化≥1级，大多数患者(89％)的化学参数变化≥1级，但很少有患者出现>1级变化。就血液学参数而言，6例患者的淋巴细胞减少症加重2～3级，2例中性粒细胞减少症加重2级。就化学参数而言：5例ALT升高2～3级2例，AST升高2～3级，2例GGT升高2～3级，1例CPK升高2级。
基于这些发现，结论是，普立肽治疗具有良好的耐受性，并且不可能检测到所研究的3个剂量之间的安全性差异。
COVID 19患者的疗效-
共有44名患者的疗效可评估；在1.5mg组中，有1名患者在首次注射普立肽时出现过敏反应，已停止治疗，疗效不可评估。协议规定的疗效终点的结果在3个剂量组中显示了相同的结果(表2)。治疗结果受基线疾病严重程度和病毒载量的影响。与这些发现一致，最近的一项研究表明，SARS-CoV-2病毒载量与疾病严重程度和死亡率增加有关。在整个剂量组中，100％(9/9)轻度疾病患者在第15天出院，而82％(23/28)中度疾病患者和57％(4/7)重度疾病患者出院。
Figure GDA0003994401990000571
Figure GDA0003994401990000581
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表2研究APLICOV-PC中协议规定的疗效终点汇总表
缩写：ICU＝重症监护病房
A：在第一次注射普立肽过程中出现过敏反应的患者已停止治疗，其疗效不可评价
B：根据39名患者的结果：1名患者错过了基线病毒载量评估，4名患者的基线病毒载量低于定量极限，尽管在加入前48小时内进行了阳性聚合酶链反应检测
收益-风险考虑因素
在APLICOV-PC研究中，大多数患者(84％)患有轻度至中度疾病，82％的患者在第15天出院。由于呼吸功能的进行性恶化和细胞因子释放综合征的发展通常在症状出现后平均10天发生，因此认为第15天的出院率终点反映了威胁生命的并发症的成功改善。
事后分析表明，通过出院率评估的治疗反应与基线疾病严重程度和病毒载量相关。在整个剂量组中，100％(9/9)的轻度疾病患者在第15天出院，而82％(23/28)的中度疾病患者和57％(4/7)的重度疾病患者出院。
在APLICOV-PC研究中，中值基线病毒载量为6.1log10 copies/mL，到第15天，观察到病毒载量的平均减少-4.2log10。这些结果支持这样的结论，即普立肽减少病毒复制。
考虑到与药物相关的等级≥3AE的低发生率和第15天的高出院率，以及到第15天基线病毒载量平均减少4.2-log10(中度疾病患者被报告减少-3.0-log)，证明普立肽对治疗COVID 19感染住院患者有积极的获益风险。
例4
在使用vero细胞的体外测定中进一步证实了普立肽对抗SARS-CoV-2的活性。
病毒和细胞
SARS-CoV-2获自韩国疾病控制和预防中心(KCDC)。Vero细胞从美国典型培养物保藏中心((ATCC CCL-81)获得。
通过免疫荧光法进行剂量反应曲线(DRC)分析
化合物分别用DMSO和Ampolla(聚氧乙烯蓖麻油:乙醇:水(15:15:70))在20点浓度(20-point concentrations)下用两倍连续稀释法制备。细胞接种后24小时，在细胞中以最高浓度5uM处理化合物。一小时后，将板转移到BSL-3安全设施中进行病毒感染，并以0.0125的感染复数(MOI)加入SARS-CoV-2。板在37℃下培养24小时。用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞24hpi用于透化(permeabilization)。处理抗SARS-CoV-2核衣壳(N)1抗体和488缀合的山羊抗兔IgG 2抗体到细胞，并将Hoechst 33342处理以染色细胞用于免疫荧光分析。使用内部软件分析用Operetta(Perkin Elmer)获得的图像以量化细胞数和感染率，并将抗病毒活性标准化为每个测定板中的阳性(空白对照(mock))和阴性(0.5％DMSO)对照。
DRC通过S形剂量-反应模型，利用以下方程：Y＝Bottom+(Top Bottom)/(1+(IC50/X)Hillslope)，使用XLfit 4软件或Prism7拟合。从标准化的活性数据集拟合曲线计算IC50值。所有的IC50和CC50值一式两份测量，并且每个测定的质量由Z'因子和百分比变异系数(％CV)控制。
剂量-反应曲线如图32A-C所示(三次重复)。蓝色方块表示对病毒感染的抑制(％)，红色三角形表示细胞活力(％)。由重复实验计算平均值±SD。在所有实验中未观察到药物的细胞毒效应(圆圈)的浓度下，普立肽能够抑制病毒诱导的致细胞病变效应(方块)。在本实验中，普立肽的IC50为0.0033-0.0039μM，而CC50为0.178-0.431μM，SI为49.95-129.92。
例5
在使用vero细胞的不同体外测定中进一步证实了普立肽对抗SARS-CoV-2的活性。
细胞培养
Vero E6细胞(ATCC CRL-1586)在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；Lonza)中培养，该培养基补充了5％胎牛血清(FCS；EuroClone)、100U/mL链霉素和2mM谷氨酰胺(均为ThermoFisher Scientific)。
病毒分离、滴定和测序
从鼻咽拭子中分离SARS-CoV-2病毒，该拭子从89岁男性患者收集，该患者给予知情同意，并在样品收集前用倍泰龙和羟氯喹治疗2天。将拭子收集在3mL培养基(DeltaswabVICUM)中以降低粘度，并在-80℃下储存直至使用。Vero E6细胞以1.5x106细胞在细胞培养瓶(25cm2)中过夜，然后用1mL处理样品接种，在37℃和5％CO2下培养1小时。然后，提供4mL补充了2％FCS的DMEM，并将细胞孵育48小时。收集上清液，在200x g下离心10分钟以去除细胞碎片，并在-80℃下储存。每天评估细胞病变效应，并使用SARS-CoV-2UPE、RdRp和N测定对上清进行病毒RNA提取和特异性RT-qPCR(Corman等人，2020年)。病毒繁殖两代，制备病毒原液，收集Vero E6的上清液。
使用Indimag病原体试剂盒(Indical Biosciences)直接从病毒储备中提取病毒RNA，并使用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara，使用oligo-dT和hexamer引物，根据制造商协议)将病毒RNA转录成cDNA。使用SWIFT扩增子SARS-CoV-2板(Swift Biosciences)进行DNA文库制备。测序准备好的文库，然后加载到Illumina MiSeq平台和300bp双端测序试剂盒上。对序列读数(sequence reads)进行质量过滤，并使用trimmomatic修剪衔接子引物序列。使用cutadapt去除扩增引物序列。然后使用bowtie2工具绘制序列读数相对冠状病毒参考序列(NC_045512.2)的图(Langmead,B.and Salzberg,S,2012)。使用samtools以18x1800x879平均覆盖度进行比对，得到共有基因组序列。基因组序列以登录ID EPI_ISL_510689保藏于GISAID储存库(http://gisaid.org)。
化合物
在1/5连续稀释下使用浓度范围为100μM至0.0512nM的普立肽，并在1/3稀释下测定浓度范围为100μM至0.5nM的普立肽。
抗病毒活性
向Vero E6细胞中加入浓度渐增的普立肽以及101.8TCID50/mL的SARS-CoV-2，浓度101.8TCID50/mL达到50％的细胞病变效应。未暴露的细胞用作感染的阴性对照。为了检测任何药物相关的细胞毒效应，在存在增加的药物浓度但不存在病毒的情况下，同样培养VeroE6细胞。在感染后3天使用CellTiter-Glo发光法细胞活力测定(Promega)测量病毒或药物的细胞病变或细胞毒效应。在Fluoroskan Ascent FL光度计(ThermoFisher Scientific)中测量发光。
IC50计算与统计分析
将反应曲线调整到非线性拟合回归模型，用具有可变斜率的四参数logistic曲线计算。未暴露于病毒的细胞用作感染的阴性对照并设定为100％活力，并用于标准化数据和计算细胞病变效应的百分比。使用一个样本t检验评估与100％的统计差异。所有分析和图形均使用GraphPad Prism v8.0b软件生成。
图33显示了在存在渐增浓度的普立肽的情况下，暴露于固定浓度的SARS-CoV-2的Vero E6细胞的细胞病变效应。使用浓度范围为10μmM至0.5nM的药物，稀释度为1/3。示出了来自一个具有两个重复的代表性实验的可变反应曲线的非线性拟合(方形)。该实验的具体IC50值在图中示出。还示出了在没有病毒的情况下，暴露于渐增浓度的普立肽的Vero E6细胞的细胞毒效应(圆圈)。
将恒定浓度的SARS-CoV-2与渐增浓度的普立肽混合并加入Vero E6细胞中。为了控制药物诱导的细胞毒性，还在不存在SARS-CoV-2的情况下用渐增浓度的普立肽培养VeroE6细胞。在没有观察到药物的细胞毒效应的浓度下(灰色圆圈)，普立肽能够抑制病毒诱导的细胞病变效应(红色方块)。在具有两个重复的两个实验中，普立肽的平均IC50值和标准偏差为0.06±0.02μM。
例6 3阶段，多中心、随机、对照试验，以确定需要住院以治疗中度COVID 19感染的 成人患者中两种剂量水平的普立肽相对对照组的效力和安全性
指示：中度COVID 19感染住院患者的治疗
目标：
主要目标：
●比较1.5或2.5mg普立肽相对对照组在第8天(±1)实现完全恢复的患者百分比，完全恢复定义为(i)满足在世界卫生组织(WHO)临床进展量表中的以下11类的0至2类，(ii)出院时Barthel指数>90/100，(iii)到第31天没有COVID 19感染
0：未感染，未检测到病毒RNA
1：无症状，检测到病毒RNA
2：有症状，自主的
3：有症状，需要帮助的
4：住院，无氧气治疗(如果住院仅为隔离，记录为非卧床患者状态)
5：住院，用口罩或鼻塞吸氧
6：住院，通过无创通气(NIV)或高流量供氧
7：插管和机械通气，pO2/FIO2≥150或SpO2/FIO2≥200
8：机械通气pO2/FIO2<150(SpO2/FIO2<200)或血管加压
9：机械通气pO2/FIO2<150和血管加压、透析或体外膜肺氧合(ECMO)
10：死亡
本研究的主要次要目标是在以下方面比较1.5和2.5mg普立肽与对照组：
·完成恢复的时间(以天计)，定义为第一天，从第1天到后续的第31天，患者(i)满足上述的WHO临床进展量表11类中的第0至2类，(ii)出院时Barthel指数>90/100，(iii)没有因COVID 19感染而再次入院
·第8天(±1)的临床状况(按11类WHO临床进展量表评定)
本研究的其他次要目标是：
·安全性和耐受性，基于治疗期间出现的不良事件(TEAE)、等级≥3TEAE、严重不良事件(SAE)和严重不良反应(SARs)
·在主要终点时两普立肽组明显优于对照组的情况下，比较两普立肽组(1.5mg比2.5mg)之间的疗效和安全性/耐受性
·比较在第8天(±1)天达到完全恢复的患者百分比，如上文所定义，合并的普立肽组与对照组相比
·每个研究组因COVID 19感染需要重新入院的患者百分比
·在第4天、第15天和第31天，每个研究组的临床状况(通过11类WHO临床进展量表评估)
·每个研究组的氧疗持续时间(以天计)
·在第4天、第8天、第15天和第31天每个研究组中需要高流量氧气的患者的百分比
·第4天、第8天、第15天和第31天每个研究组中需要无创机械通气的患者百分比
·第4天、第8天、第15天和第31天每个研究组中需要有创机械通气或ECMO的患者百分比
·在第4天、第8天、第15天和第31天需要重症监护病房(ICU)入院的各研究组患者的百分比
·每个研究组在ICU的住院时间
·在第4、8、15和31天接受后续抗病毒治疗或免疫调节药物的患者百分比
·各研究组医院内感染患者的百分比
·第4天、第8天、第15天和第31天每个研究组的死亡率
·从给药研究药物前第1天到第8天，每个研究组的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARSCoV2)病毒载量的变化(通过定量聚合酶链式反应(qPCR)从口鼻咽分泌物样本测量)
·每个研究组中在第8天具有不可检测的SARSCoV2病毒载量的患者的百分比(通过qPCR从口鼻咽分泌物样本测量)
从基线到第2、3、4、8、15和31天，每个研究组的炎性生物标志物(C反应蛋白[CRP]、乳酸脱氢酶[LDH]、铁蛋白、白细胞介素[IL]-6、IL-1β、IL-10和肿瘤坏死因子α[TNFα])的变化
方法/研究设计：
这是一项多中心、开放标签、对照的三阶段研究，需要住院和补充氧气以治疗中度COVID19感染的成年人将以1:1:1:1随机分为：
·1.5mg普立肽组：患者将在第1天至第3天静脉(IV)接受1.5mg/天的普立肽以及6.6mg/天的地塞米松，然后从第4天至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
·2.5mg普立肽组：患者将在第1至3天静脉接受2.5mg/天普立肽以及6.6mg/天地塞米松，然后从第4天到第10天(PO)/IV接受6mg/天的地塞米松(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
·对照组：患者将在第1至3天静脉接受地塞米松6.6mg/天，然后从第4天到第10天PO/IV接受地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。此外，根据当地治疗指南，患者可在第1天静脉接受瑞德西韦200mg，随后在第2至第5天静脉接受100mg/天。
随机化将分为两个因素：
·如果患者被随机分配到对照组(是与否)，则有意使用瑞德西韦；以及
·症严重度指标13，14(0-1vs.>1)
从第1天开始治疗起，患者将在医院被跟踪至少4天，然后到第31天或到第31天发生消除/稳定的TEAE。在第8天之前出院的患者将在第8天和第31天返回门诊诊所进行评估(附录5)。
一个独立的数据监察委员会(IDMC)将监督研究的实施(安全性和主要终点)，包括根据试验要求对汇总的安全数据进行分析。
纳入和排除的诊断和主要标准：
纳入标准如下：
1.在开始任何研究具体方法和研究治疗之前获得的签字知情同意书
2.实验室确认的SARS-CoV-2感染(由当地实验室通过定性聚合酶链式反应(PCR)从在第1天的研究治疗前不超过48小时收集的口腔/鼻咽分泌物(或其他呼吸样本)确定)
3.入院治疗中度SARS-CoV-2(COVID 19)感染，由以下标准定义：
·SARS-CoV-2PCR检测阳性
·伴有COVID 19的中度疾病症状，包括任何轻微疾病或用力呼吸急促的症状
·临床症状提示COVID 19的中度疾病，如呼吸频率每分钟≥20次但<30次，在海平面条件下吸入室内空气SpO2>93％但<95％，心率≥90但<125次/分钟，需要补充氧气
·无严重疾病的临床症状，包括休息时呼吸急促或呼吸窘迫
4.不迟于第1天开始研究治疗前6天出现COVID 19症状
5.年龄≥18岁的男性或女性
6.充足的骨髓、肝脏、肾脏和代谢功能，由当地实验室进行的以下测试确定：
·中性粒细胞绝对计数≥1000/mm3(1.0x 109/L)
·淋巴细胞计数≥500/mm3(0.5x 109/L)
·血小板计数≥10万/mm3(100x 109/L)
·血红蛋白>9.0g/dL
·丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)≤3x正常上限(ULN)
·血清胆红素≤1x ULN(≤3x ULN，如果有吉尔伯氏综合征)
·计算的肌酐清除率≥30mL/min(Cockcroft和Gault公式)
·肌酸磷酸激酶≤2.5x ULN
7.同意在第31天之前不参加另一项介入临床试验
8.具有生殖能力的女性必须在研究登记时接受当地实验室的阴性血清妊娠测试，并且必须是非哺乳期的
9.有生育潜力的伴侣的女性和男性在接受研究治疗时和最后一次服用普立肽后3个月内必须使用有效的避孕措施。
以下是排除标准：
1.由于COVID 19外的任何原因，基线前(即前一个月)全身健康状况受损、需要日常生活活动的帮助或慢性氧气治疗的受试者
2.参与另一项治疗COVID 19感染的临床试验，或先前参加临床试验并正在跟进的患者，或先前接种COVID 19疫苗的患者
3.随机化时呼吸衰竭的证据，基于至少需要以下一项的资源利用：气管插管和机械通气、高流量鼻导管输送氧气、无创正压通气、ECMO或呼吸衰竭的临床诊断(即，临床需要1种前述治疗，但在资源限制的情况下不能进行前述治疗)
4.临床上需要治疗SARS-CoV-2(COVID 19)的患者，其基线疾病严重程度被评为严重(如果通过标准RT PCR测定或同等测试呈阳性，则症状提示COVID 19严重疾病，包括任何中度疾病症状或休息时呼吸短促，或呼吸窘迫，临床症状表明患有COVID 19的严重系统性疾病，如呼吸频率≥30/分钟，心率≥125/分钟，在海平面条件下吸入室内空气SpO2≤93％，或PaO2/FiO2<300)
5.在登记前4周内接受抗病毒药物、IL 6受体抑制剂、皮质类固醇或免疫调节药物治疗COVID 19感染的患者
6.研究登记前4周内的活疫苗接种史；受试者不得在登记前4周内或研究期间的任何时间接种活疫苗、减毒流感疫苗
7.在登记前8周或研究期间接受氯喹或其衍生物治疗的患者
8.接受强细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抑制剂或诱导剂的治疗
9.需要治疗的病毒性疾病(非COVID 19)，但已经接受治疗并得到充分控制(检测不到)的人类免疫缺陷病毒感染的患者除外
10.根据筛查时的三次心电图(ECG)，使用Fridericia公式校正的QT间期延长男性>450msec，女性>470msec
11.任何类型的等级≥2的预先存在的神经病变
12.对活性成分或任何赋形剂(甘露醇、聚乙二醇甘油羟基硬脂酸酯和乙醇)过敏。
13.怀孕的女性(筛查时所有有生育潜力的女性都需要血清妊娠试验阴性)或母乳喂养
14.有生育潜力的伴侣的女性和男性(没有手术不孕或绝经12个月以上被定义为闭经的女性)，她们没有使用至少1种协议规定的避孕方法
15.研究者认为会危及患者安全或可能影响患者依从性或研究中的安全性/有效性观察结果的任何其他具有临床意义的医学状况或实验室异常。
试验产品、剂量和给药方式：
注射用普立肽装在含有2mg普立肽粉末的小瓶中。对于给药，通过添加4mL用于普立肽的溶剂来重构小瓶内容物，以获得含有0.5mg/mL普立肽与甘露醇、聚乙二醇甘油羟基硬脂酸酯和乙醇赋形剂的浅黄色溶液。将所需量的普立肽重构溶液加入到含有0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液的IV袋中，并在60分钟内以IV注射形式给药。
为了防止与普立肽相关的输液反应，所有患者必须在开始普立肽注射前20至30分钟接受以下药物：
·昂丹司琼8mg静脉注射(或等同药物；注：在QT评估[第1至3天]期间，昂丹司琼是校正QT间期[QTc]子研究中患者的禁用药物)
·盐酸苯海拉明25mg IV(或等同药物)
·雷尼替丁50mg IV(或等同药物)
·地塞米松6.6mg静脉注射
此外，在第4天和第5天，用普立肽治疗的患者必须每天两次PO接受昂丹司琼4mg。
参考治疗、剂量、剂型和给药方式：
地塞米松：普立肽和对照组的患者均在第1天至第3天IV接受6.6mg/天的地塞米松，然后从第4天至第10天PO/IV给药6mg/天的地塞米松，直至第10天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
瑞德西韦：根据当地治疗指南，随机分配到对照组的患者可在第1天静脉注射瑞德西韦200mg，然后在第2至第5天静脉注射100mg/天。
最佳支持性护理(BSC)：符合国家卫生研究所COVID 19治疗指南(www.covid19treatmentguidelines.nih.gov)或其他国家指南的BSC将提供给所有研究参与者。
实施例7.开放标签、随机II阶段研究，以评价在从急诊部出院的患有COVID-19的 成人患者中用普立肽的单线治疗(single-line treatment)的安全性和病毒载量的减少
指示：轻度COVID 19感染的治疗。
如果患者出现急性临床感染(在前5天出现症状)，患者将被纳入本研究，其中通过可以是阳性抗原测试或阳性PCR测试的诊断方法来诊断COVID-19感染。
这项研究包括两个部分：
组A)单剂量7.5mg普立肽，缓慢注射90分钟(±10分钟)，并根据参与中心的常规临床实践进行对症治疗。
组B)根据参与中心的常规临床实践进行对症治疗。
所有患者在注入普立肽前20-30分钟接受以下预防性药物：
-盐酸苯海拉明25mg i.v，
-雷尼替丁50mg i.v，
-地塞米松6.6mg静脉注射，
-昂丹司琼8mg静脉注射，缓慢注射15分钟。
昂丹司琼每12小时口服4mg，持续3天，以减轻药物引起的恶心和呕吐。如果在早晨给药普立肽，患者在下午接受第一剂量的昂丹司琼。
该研究将显示，给予患者单剂量的普立肽导致病毒载量的减少。这可以表示为在给药后第6天，复制周期阈值(Ct)大于30(Ct>30)。例如，这项研究将表明，当给药要从急诊科出院的COVID-19感染患者单剂量的普立肽时，在出院后第6天表现出病毒载量的减少，表示为复制周期阈值(Ct)值大于30(Ct>30)。这可以表示为相对于基线的SARS-CoV-2病毒载量的减少。这可以表示为给药后需要住院治疗的患者百分比的降低。这可以表示为在给药后需要有创机械通气和/或进入ICU的患者百分比的降低。这这可以表现为出现与持续性疾病有关的后遗症的患者减少。这可以表示为被选择为不良预后标准(包括例如淋巴细胞减少症、LDH、D-二聚体或PCR)的分析参数正常化的患者百分比的增加。这可以表示为临床标准正常化(包括例如：头痛、发烧、咳嗽、疲劳、呼吸困难(气短)、关节肌痛或腹泻发症状消失)的患者百分比的增加。
这项研究将表明，使用单剂量普立肽治疗可以消除患者第6天的SARS-CoV-2病毒载量，根据若干研究表明，这会导致临床改善，从而减少并发症，即减少住院、ICU和死亡。除了在短期内改善患者的预后外，病毒载量的降低被认为是其他两个目标的关键。首先，降低无症状或症状不明显的高病毒载量(TC<25)患者，即所谓的超级传染源的传染性。其次，减少病毒载量对于避免长期并发症(称为持续性COVID或长COVID)具有决定性意义。
验证的普立肽群体药代动力学模型(Nalda-Molina R等，Populationpharmacokinetics meta-analysis of plitidepsin(Aplidin)in cancersubjects.Cancer Chemother Pharmacol.2009Jun；64(1)：97-108.Doi：10.1007/s00280-008-0841-4)用于确认总血浆浓度将达到估计的肺目标浓度。图38显示了结果，并且可以看出，可以获得高于IC50和IC90的血浆浓度超过6天。
参考资料
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Claims (68)

1.用于治疗冠状病毒(CoV)感染的通式I的化合物
Figure FDA0003829598950000011
其中X选自O和NH；
Y选自CO和–COCH(CH3)CO-；
n和p各自独立地选自0和1，q选自0、1和2；
R1、R3、R5、R9、R11、以及R15各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基和取代或未取代的C2-C6炔基；
R2选自氢、CORa、COORa、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基和取代或未取代的C2-C6炔基；
R4、R8、R10、R12和R16各自独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；
R7和R13各自独立地选自氢、取代的或未取代的C1-C6烷基、取代的或未取代的C2-C6烯基和取代的或未取代的C2-C6炔基；R6和R14各自独立地选自氢、和取代的或未取代的C1-C6烷基；或者R6和R7和/或R13和R14与它们所连接的相应的N原子和C原子一起可形成取代的或未取代的杂环基；
R17选自氢、CORa、COORa、CONHRb、COSRc、(C＝NRb)ORa、(C＝NRb)NHRb、(C＝NRb)SRc、(C＝S)ORa、(C＝S)NHRb、(C＝S)SRc、SO2Rc、SO3Rc、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂环基，前提是当n、p、以及q为0时，R17不是氢；且
Ra、Rb和Rc各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C2-C12烯基、取代或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基；
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R3和R4独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R3是异丙基，R4是氢。
3.根据权利要求1或2所述的通式II的化合物，其中R3和R4是甲基。
4.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R11选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R11是甲基或异丁基。
5.根据任一前述权利要求所述的通式III的化合物，其中R11是甲基，并且n＝1。
6.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R1、R5、R9和R15独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R1选自仲丁基和异丙基，R5是异丁基，R9是对甲氧基苄基，并且R15选自甲基和苄基。
7.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R8、R10、R12和R16独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R8、R10和R12是甲基，并且R16是氢。
8.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R6和R14独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R6选自氢和甲基，并且R14是氢。
9.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R7和R13独立地选自氢和取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R7是甲基，R13选自氢、甲基、异丙基、异丁基和3-氨基-3-氧丙基。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中R6和R7和/或R13和R14与它们所连接的相应的N原子和C原子一起形成取代或未取代的吡咯烷基团。
11.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R2选自氢、取代或未取代的C1-C6烷基和CORa，并且其中Ra是取代或未取代的C1-C6烷基；优选地，其中R2是氢。
12.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中R17选自氢、CORa、COORa、CONHRb、(C＝S)NHRb、以及SO2Rc，并且其中Ra、Rb和Rc各自独立地选自取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂环基；优选地，其中R17选自氢、COO苄基、CO苯并[b]噻吩-2-基、SO2(对甲基苯基)、COCOCH3和COOC(CH3)3。
13.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中X是NH。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其中X是O。
15.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中Y是CO。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中Y是–COCH(CH3)CO-。
17.根据权利要求1所述的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003829598950000031
Figure FDA0003829598950000041
Figure FDA0003829598950000051
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
18.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是PLD或其药学上可接受的盐或立体异构体。
19.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是膜海鞘素B，或其药学上可接受的盐或立体异构体。
20.根据任一前述权利要求所述的化合物，所述化合物用于治疗CoV感染，其中所述CoV是SARS-CoV-2。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物，所述化合物用于治疗COVID-19和/或用于治疗由COVID-19引起的肺炎。
22.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中所述CoV感染是轻度感染；和/或其中所述CoV感染是中度感染；和/或其中所述CoV感染是重度感染。
23.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中所述CoV感染是急性CoV感染，优选地，其中所述CoV感染是急性COVID-19感染；和/或其中所述CoV感染是持续症状的CoV感染，优选地，其中所述CoV感染是持续症状的COVID-19感染；和/或其中所述CoV感染是后CoV综合征、持续性CoV或长CoV；优选地，其中所述CoV感染是后COVID-19综合征、持续性COVID或长COVID感染。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中后CoV综合征、持续性CoV或长CoV包括由以下引起的一种或多种症状：心血管、呼吸、胃肠、神经、肌肉骨骼、代谢、肾脏、皮肤、耳鼻咽喉、血液学和自主神经系统；精神问题、全身疼痛、疲劳和/或持续发烧。
25.根据任一前述权利要求所述的化合物，所述化合物用于治疗具有CoV感染，优选COVID-19症状和体征长达4周的患者；和/或用于治疗具有CoV感染，优选COVID-19症状和体征4周至12周的患者；和/或用于治疗具有CoV感染，优选COVID-19症状和体征超过12周的患者。
26.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物用于预防、减少或治疗持续性COVID、长COVID或后COVID综合征；优选地，所述预防、减少或治疗将患者患有持续性COVID、长COVID或后COVID综合征症状的可能性降至最低；和/或降低此类症状的严重程度；进一步优选地，所述治疗将CoV感染的症状降至最低。
27.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中所述治疗降低CoV患者的传染性；包括其中所述患者是无症状的或症状不明显的患者但具有高病毒载量。
28.根据任一前述权利要求所述用途的化合物，其中所述化合物与皮质类固醇，优选地塞米松联合给药。
29.根据权利要求28所述用途的化合物，其中所述化合物和皮质类固醇同时、分别或依次给药。
30.根据权利要求1至29中任一项所述用途的化合物，其中根据每日剂量的方案给药10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天；优选2-5天、3-5天或3、4或5天；最优选3天或5天；最优选3天。
31.根据权利要求1至30中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物以每天5mg或更少、每天4.5mg或更少、每天4mg或更少、每天3.5mg或更少、每天3mg或更少、每天2.5mg或更少、或每天2mg或更少；0.5mg/天、1mg/天、1.5mg/天、2mg/天、2.5mg/天、3mg/天、3.5mg/天、4mg/天、4.5mg/天、或5mg/天；优选1mg/天、1.5mg/天、2mg/天或2.5mg/天；更优选1.5-2.5mg/天；最优选1.5mg/天、2.0mg/天或2.5mg/天的剂量给药。
32.根据权利要求1至31中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物以1-50mg、1-40mg、1-30mg、1-20mg、1-15mg、3-15mg、3-12mg、4-12mg、4-10mg、4.5-10mg；4.0mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg或10mg；优选4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg、或10mg；更优选4.5-7.5mg/天的总剂量给药。
33.根据权利要求1至32中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物通过注射给药。
34.根据权利要求33所述用途的化合物，其中所述注射是1小时注射、1.5小时注射、2小时注射或3小时注射，优选1.5小时注射。
35.根据权利要求1至34中任一项所述用途的化合物，其中1.5mg普立肽以1.5小时注射给药，每天1次，连续3天；或其中2mg普立肽以1.5小时注射给药，每天1次，连续3天；或其中2.5mg普立肽以1.5小时注射给药，每天1次，连续3天；或其中1mg普立肽以1.5小时注射给药，每天一次，连续5天；或其中2mg普立肽以1.5小时注射给药，每天一次，连续5天。
36.根据权利要求1至35中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物使用负荷剂量和维持剂量给药。
37.根据权利要求36所述用途的化合物，其中给药方案为：
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天2mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天1.5mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天2.5mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天1.5mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天2mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；
第1天1.5mg的负荷剂量，随后几天1mg/天的维持剂量；
第1天1.5mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量；或
第1天1mg的负荷剂量，随后几天0.5mg/天的维持剂量。
38.根据权利要求1至37中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物与皮质类固醇组合给药，并且其中所述皮质类固醇在与给药根据权利要求1至19中任一项所述的化合物相同的天数给药。
39.根据权利要求38所述用途的化合物，其中也可以在随后的一天或更多天给药所述皮质类固醇；优选地，在第1-3天与化合物一起给药所述皮质类固醇，在第4-10天中的一天或更多天进一步给药所述皮质类固醇。
40.根据权利要求39所述用途的化合物，其中所述皮质类固醇在给药所述化合物的天数通过静脉注射给药，但是在随后的天数通过口服或IV给药。
41.根据权利要求38至40任一项所述用途的化合物，其中所述皮质类固醇是地塞米松；优选地，其中在给药根据本发明的化合物时以6.6mg/天的剂量IV给药地塞米松。
42.根据权利要求41所述用途的化合物，其中地塞米松在随后的天数，优选第4、5、6、7、8、9和10天中的一天或更多天，以6mg/天的剂量口服给药或IV给药。
43.根据权利要求1至42中任一项所述用途的化合物，其中在第1至3天静脉注射(IV)给药PLD 1.5mg/天，并与静脉注射地塞米松6.6mg/天组合，随后从第4天直至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)；或
其中在第1天至第3天静脉注射(IV)给药PLD 2.0mg/天，并与静脉注射地塞米松6.6mg/天组合，随后从第4天直至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)；或
其中在第1天至第3天静脉注射(IV)给药PLD 2.5mg/天，并与静脉注射地塞米松6.6mg/天组合，随后从第4天直至第10天口服(PO)/IV地塞米松6mg/天(取决于医生根据患者临床状况和进展的判断)。
44.根据权利要求38至43中任一项所述用途的化合物，其中在开始用根据权利要求1至19中任一项所述的化合物治疗之前20至30分钟给药所述皮质类固醇。
45.根据权利要求1至44中任一项所述用途的化合物，其中在开始使用根据权利要求1至19中任一项所述的化合物进行治疗之前，优选20至30分钟，患者额外接受下列药物：
昂丹司琼8mg IV(或等同药物)；
盐酸苯海拉明25mg IV(或等同药物)；以及
雷尼替丁50mg IV(或等同药物)。
46.根据权利要求1至45中任一项所述用途的化合物，其中在第4天和第5天，患者PO接受4mg的昂丹司琼(或等同药物)，每天两次。
47.根据权利要求1至34中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物以单剂量给药(第1天)。
48.根据权利要求47所述用途的化合物，其中单剂量为1-10mg、4-10mg、4.5-10mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、或10mg，优选4.5mg、5mg、6mg、7.5mg、8mg、9mg或10mg，更优选5-9mg、6.5-8.5mg、7-8mg或最优选7.5mg。
49.根据权利要求47至48中任一项所述用途的化合物，其中所述化合物以1.5小时注射给药。
50.根据权利要求47至49中任一项所述用途的化合物，其中根据权利要求38至44中任一项所述的方案给药皮质类固醇。
51.根据权利要求47至50中任一项所述用途的化合物，其中在用本发明化合物给药之前20-30分钟给药以下预防性药物：
静脉注射昂丹司琼8mg(或等同药物)，特别是以15分钟缓慢注射；
静脉注射盐酸苯海拉明25mg(或等同药物)；
静脉注射雷尼替丁50mg(或等同药物)。
52.根据权利要求47至51中任一项所述用途的化合物，其中在给药本发明化合物后每12小时口服给予昂丹司琼4mg，持续3天。
53.根据任一前述权利要求所述用途的化合物，其中地塞米松是磷酸地塞米松，如果在给药本发明化合物的天数给药，则以8mg的剂量给药(相当于6.6mg碱的剂量)，如果在给药本发明化合物的天数后给药，则以7.2mg的剂量给药(相当于6mg碱的剂量)。
54.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体，以及药学上可接受的载体；所述药物组合物用于治疗冠状病毒(CoV)感染，优选地，其中所述CoV是SARS-CoV-2。
55.权利要求1至53中任一项所定义的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途；优选地，其中CoV是SARS-CoV-2。
56.一种治疗CoV感染的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给药治疗有效量的根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体；优选地，其中所述CoV是SARS-CoV-2。
57.一种预防、减少或治疗持续性CoV、长CoV或后CoV综合征的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给药治疗有效量的根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体；优选地，其中所述CoV是SARS-CoV-2；可选地，其中所述治疗使患者遭受持续性COVID、长COVID或后COVID综合征症状的可能性最小化；和/或降低此类症状的严重程度。
58.一种降低CoV患者传染性的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给药治疗有效量的根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体；优选地，其中所述CoV是SARS-CoV-2；可选地，其中所述患者无症状或症状不明显但具有高病毒载量。
59.一种使CoV感染的症状最小化的方法，其中所述方法包括向有需要的个体给药治疗有效量的根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体；优选地，其中所述CoV是SARS-CoV-2。
60.用于治疗CoV感染的皮质类固醇，其中所述皮质类固醇与根据权利要求1至53中任一项所述的化合物组合给药。
61.用于治疗CoV感染的根据权利要求1至19中任一项所述的化合物和皮质类固醇；其中所述用途根据权利要求1至53中任一项所述。
62.一种治疗CoV感染的方法，所述方法包括将根据权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和皮质类固醇的组合疗法给药于有需要的患者，从而治疗CoV感染；其中所述方法如权利要求1至53中任一项所述。
63.根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途；其中所述治疗包括给药皮质类固醇。
64.皮质类固醇在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途；其中所述治疗包括给药根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体。
65.根据权利要求1至53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或立体异构体和皮质类固醇在制备用于治疗CoV感染的药物中的用途。
66.包含根据权利要求1至53中任一项所述的化合物和皮质类固醇的药物包装，可选地，所述药物包装进一步包含根据权利要求1至53中任一项的说明书。
67.一种用于治疗CoV感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至53中任一项所述的化合物以及说明书。
68.一种用于治疗CoV感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至53中任一项所述的化合物和皮质类固醇以及说明书。
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