JPH0364514B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は造血に対して抑制作用を有する新規な
ペプチドおよびそれらの製造に関する。 最も効果的な癌治療法の多くは細胞毒薬物を使
用しており、これは有糸分裂期間中およびｓ−期
において癌細胞を攻撃する。細胞分裂を受ける正
常な組織細胞は通常同時に影響を受けるがしかし
かかる細胞の大部分は休止しており従つて攻撃を
受け易いわけではない。しかしながら、かかる細
胞毒薬物は増殖中の組織細胞を攻撃するのみなら
ず、骨髄中の大部分の通常は休止した造血幹細胞
が細胞分裂周期（サイクル）に入る引金を引き、
従つてそれらを攻撃に感じ易くする傾向がある。 骨髄細胞は多能性幹細胞に由来しこれは成熟し
て形態学的に区別される細胞、すなわち巨大球、
赤血球、類粒球およびリンパ球の複合祖集団を形
成する。多能性幹細胞の約10％のみが常時細胞分
裂中である。成熟の初期相においては増殖中の幹
細胞のそれぞれは個々の形態学的に異なる形態に
「連合」し、結果として前記４種の成熟した細胞
型の１種となる。細胞が増殖するとそれらはそれ
以上の増殖の力を徐々に喪失しそして成熟した細
胞例えば赤血球または顆粒球はもはや分裂し得な
い。その結果として、成熟した細胞は連続的に死
んでいるので、まだ成熟してない細胞そして特に
多能性幹細胞の増殖能力が維持されることが必須
要件である。 今や、休止幹細胞が分裂周期に入るを選択的に
阻止しうるある種のペプチドを見出した。これら
ペプチドは骨髄抽出物中に微量に見出される天然
に存在する顆粒球形成抑制因子と類似であると信
じられる。 それゆえ、本発明によれば、一般式 （式中、R¹はグリシンまたはＤ−アラニンの残
基であり、そして他のすべてのアミノ酸残基はＬ
−形であり、X¹およびX²は同一または相異なり
てOHまたはNH₂でありそしてｎは０または１で
ある）を有する化合物およびその生理学的に受容
しうる塩が提供される。 本発明のペプチドの生理学的に受容しうる塩に
は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩等のような酸付
加塩ならびにアルカリ金属塩例えばナトリウムま
たはカリウム塩、アルカリ土類金属塩例えばカル
シウム塩、またはアミン塩のような塩基との塩が
包含される。 Ｎ−末端から第２番目の位置にあるアミノ酸残
基が臨界的であると思われる。何故ならば天然に
存在する顆粒球形成抑制因子とみなされてきたペ
プチドすなわちピロGlu−Asp−Asp−Cys−
LysOHが不活性であることが判明したからであ
る。入手しうる天然の顆粒球形成因子の量が微量
なので、その天然物質の構造は決定されていな
い。これは結晶形態または完全に純粋な形態では
まだ得られておらずそしてこのことが天然源から
得られる物質のみを用いて達成されうるか否かは
判つていない。対照的に、本発明のペプチドは薬
学的用途に適する結晶形でそして天然起原の夾雑
性ペプチドおよび蛋白質を伴うことなく比較的大
量に得られうる。 本発明の好ましい化合物をあげれば次のとおり
である。 (1) Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジ
ン、 (2) Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−システイニル−グリシル−
Ｌ−リジン、 (3) Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジ
ン、 (4) Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｄ−アラニ
ル−Ｌ−リジンおよび (5) Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジン
アミド。 上式の化合物は明らかに薬量依存性である複雑
な活性の型を示す傾向がある。特に、化合物(1)は
比較的低い薬量レベルでマウスに注射された場合
骨髄造血系の選択的抑制、すなわち形態学的に識
別しうる細胞および、連合した幹細胞の抑制を示
すが、多能性幹細胞に由来する他の細胞直系は影
響を受けない。細胞外液体中10^-7M濃度では成熟
細胞中最大である末梢顆粒球の著明な減少があ
る。10^-5M1回の注射後、主要効果は連合した幹
細胞に現われると思われる。より多量例えば
10^-5Mを連続６日間注射後では、連合した幹細胞
の祖集団がまだ強く減少されるがしかしまた多能
性幹細胞および赤血球産性も減少される。10^-5M
で３週間では、リンパ球の産生を含む全造血系の
強い刺激が観察される。わずかに効力のレベルは
相異するが、化合物(2)〜(5)によつても同様の結果
が示される。 他の組織の細胞そして特に非骨髄造血組織に関
連する腫瘍細胞には何ら抑制効果がないことに留
意するべきである。従つてこれらは骨髄造血系を
選択的に保護する。しかしながら、これらペプチ
ドは骨髄造血系に関連する癌細胞、例えば骨髄性
白血病細胞に保護作用を及ぼし、そしてかかる癌
の治療には選択的に使用できない。 これらのペプチドは有意な毒性をもたない。そ
の上、観察されたすべての血液学的作用は可逆的
でありそしてそのペプチドを注射された動物の他
の器官においては何ら肉眼的変化は観察されなか
つた。 前記のように、造血そして特に顆粒球形成の抑
制は休止細胞が細胞分裂に入りそして細胞毒抗癌
薬物例えばチトシンアラビノシドによる攻撃を受
け易くなるのを阻止する傾向がある。 化合物(1)のような本発明のペプチドで処置後に
は、骨髄造血細胞への抑制効果は単に可逆的であ
るのみならず、実際かかる細胞の産性が一時的に
異常に増大し、従つて正常細胞祖集団が非常に速
かに修復され、そして事実、一時的に過度になる
ことに注目した。 細胞毒薬物を使用する治療法における前記保護
機能に加え、本発明によるペプチドは例えば骨髄
白血病における骨髄造血系に関連した癌細胞の増
殖を停止させるのにも使用されうる。これらペプ
チドは造血を変更するのが望ましいあらゆる臨床
的症状に使用されうる。ある場合には、本発明に
よるペプチドはまた骨髄造血系が活性不充分であ
る場合にこれを刺激するために比較的多量に使用
することもできる。 これらペプチドはリンパ造成のような関連する
非骨髄性細胞にもある種の影響を及ぼすことが判
明したので、これらは他の器官における細胞増殖
の選択的修正にも使用されうる。 一般に、細胞毒薬物に対して保護作用を働かせ
るために、本発明のペプチドは人患者に１日につ
いて体重70Kg当り１〜10mg例えば４〜５mgの範囲
で注射により投与されうる。注入または同様の手
段により投与される場合、薬量は体重70Kgにつき
６日以上にわたり30〜300mg、例えば約100mgであ
りうる。原則的には患者の細胞外液体中にペプチ
ド濃度約10^-9M〜10^-4Mを生ずるのが望ましい。 一般に、チトシンアラビノシドのような細胞毒
薬物との組み合せ療法では細胞毒薬物がなお存在
する一方で骨髄造血系が保護されることを確保す
るためには注意深いタイミングを必要とする。 本発明のさらにもう一つの特徴によれば、薬学
的担体または付形剤と一緒の前記定義された式
（）の化合物またはその生理学的に相容性であ
る塩の少くとも１種を活性成分として包含する薬
学的組成物が提供される。本発明による組成物
は、例えば経口、鼻内、非経口または直腸からの
投与に適する形態で提供されうる。 ここで使用される「薬学的」なる用語には本発
明の獣医学的適用も包含される。 本発明による化合物は錠剤、被覆錠、鼻スプレ
ー、溶液、乳剤、紛剤、カプセルまたは徐放性形
態物のような慣用の薬理学的投与形態で提供され
うる。これら形態の調製には慣用の薬学的付形剤
ならびに通常の製造法が用いられうる。錠剤は、
例えば１種またはそれ以上の活性成分を既知の付
形剤例えば炭酸カルシウム、燐酸カルシウムまた
は乳糖のような希釈剤、コーンスターチまたはア
ルギニン酸のような崩壊剤、殿粉またはゼラチン
のような結合剤、ステアリン酸マグネシウムまた
はタルクのような潤滑剤および／またはカルボキ
シポリメチレン、カルボキシメチルセルロース、
酢酸フタル酸セルロースまたはポリ酢酸ビニルの
ような抑制された放出のための薬剤と混合するこ
とにより製造されうる。 錠剤の所望の場合は数層からなることもでき
る。被覆された錠剤は錠剤と同様の方法で得られ
た芯（コア）を錠剤の被覆に通常使用される薬剤
例えばポリビニルピロリドンまたはセラツク、ア
ラビアゴム、タルク、二酸化チタンまたは糖で被
覆することにより製造されうる。徐放性となすか
または禁忌を回避するために、芯も数層から構成
してもよい。錠剤被覆はまた徐放性となすために
数層からなることができ、その場合錠剤用の前記
付形剤が使用されうる。 注射溶液は例えば防腐剤例えばｐ−ヒドロキシ
ベンゾエートまたは安定剤例えばEDTAの添加
によるような慣用の方法により製造されうる。次
にこの溶液を注射用バイアルまたはアンプル中に
充填する。 鼻スプレーも同様に水溶液中で製剤化されそし
てエーロゾル推進薬と共にまたは手動による圧縮
手段を備えたスプレー容器中に包装されうる。１
種または数種の活性成分を含有するカプセルは、
例えば活性成分を乳糖またはソルビトールのよう
な不活性担体と混合しそしてこの混合物をゼラチ
ンカプセル中に充填することにより製造されう
る。 適当な坐薬は、例えば活性成分または活性成分
の組合せ物を天然脂肪またはポリエチレングリコ
ールまたはそれらの誘導体のようなこの目的に期
待された慣用の担体と混合することにより製造さ
れうる。 本発明の化合物を含有する薬量単位は式（）
のペプチドを１〜10mg例えば４〜５mgの量で含有
するのが好ましい。 本発明のさらにもう一つの特徴によれば前記に
定義された薬学的組成物の有効量を患者に投与す
ることからなる造血の抑制法が提供される。 しかしながらこの新規ペプチドのもう一つの主
要な用途は免疫学的検定技術のための物質の製造
にある。ペプチドは抗体産生性動物（例えばウサ
ギ、モルモツトまたはヤギ）に注射するためにア
ルブミン、ポリシン（polysine）またはポリプロ
リンのような適当な高分子担体に共有結合されう
る。この高分子担体を使用する周知の吸収技術を
用いることにより高特異性抗血清が得られる。ペ
プチド分子中に放射能（3H、¹⁴C、¹⁸O、¹⁵N）を導
入することにより放射線免疫検定が容易に企画で
き、そして血清（血漿）、尿および脳背髄液のよ
うな異なる生物学的液体中のペプチドの測定に使
用されうる。 本発明のペプチドは任意の好都合な方法で合成
されうる。一般に、存在する反応性の基（アミ
ノ、チオールおよび／またはカルボキシル）は全
合成期間中にわたつて保護され、そして従つて最
終工程は式（）の保護された誘導体の保護基除
去であろう。通常、すべての−COOH基、すべ
ての−NH₂基、ピログルタミル残基の−NH基お
よびシステイニル残基の−SH基が保護されよう。 従つて保護された化合物は式 （式中、R²およびR⁶はアミン保護基または水素
原子であり、R³、R⁴およびR⁷はNH₂、保護され
たアミンまたはカルボキシル保護基またはOHで
ありそしてR⁵はチオール保護基である）を有し
うる。 アミノ酸の保護基については広い選択が知られ
ておりそしてE.SchroederおよびK.Luebke両氏
らの「The Peptides」第１および２巻（アカデ
ミツクプレス1965および1966年発行）、G.R.
Pettit氏の「Synthetic Peptides」第１〜４巻
（Van Nostrand 1970、1971、1975および1976年
発行）、Houben−Weyl氏の「Methodender
Organischen Chemie、Synthese von Pepti−
den」第15巻（ゲオルグ・チーメ1974年発行）お
よび「Amino Acids、Peptides and Proteins」
第４〜８巻（英国化学会1972、1974、1975および
1976年発行）に例示される。 従つて、例えば使用されうるアミン保護基には
カルボベンゾキシ（以下「ｚ」としても表示され
る）、トリチル、第３ブトキシカルボニル（以下
「Boc」としても表示される）およびアシル基例
えばアセチル基またはホルミル基が包含される。 例えば使用されうるカルボキシル保護基にはベ
ンジル（以下「Bz）としても表示される）、ｐ−
ニトロベンジルまたは第３ブチル基のような容易
に解裂されるエステル基が包含される。 チオール保護基にはｐ−メトキシベンジルおよ
びスルホエチル基が包含される。 例えば前記参考文献中に詳説されるように広範
囲の他のかかる基が存在し、そして前記方法にお
けるすべてのかかる基の使用は本発明の範囲内に
該当することは認識されよう。 カルボキシル保護基は常法例えば適当なエステ
ル化試薬例えばベンジルまたはｐ−ニトロベンジ
ルアルコールのようなアルコールと酸例えばｐ−
トルエンスルホン酸の存在下に反応させることに
より導入されうる。 アミン保護基は常法例えばカルボベンゾキシク
ロライドまたはピバロイルクロライドのような適
当な酸ハライド、または無水酢酸のような酸無水
物と反応させることにより導入されうる。 チオール保護基はｐ−メトキシベンジルクロラ
イドまたはスルホエチルブロマイドのような適当
なｓ−エーテル化剤との反応により導入されう
る。 アミンまたはカルボキシル保護基の除去には広
範囲の操作がある。従つて例えばアミン保護基は
アシドリシス、水素添加分解、希水酸化アンモニ
ウムでの処理、ナトリウムでの処理、ナトリウム
アミドでの処理、ヒドラジンでの処理、または例
えばロイシンアミノペプチダーゼを用いる酵素的
加水分解により除去されうる。興味ある方法には
また例えば氷酢酸中における無水臭化水素での処
理、トリフルオロ酢酸での処理、液体弗化水素で
の処理および接触水素添加も包含される。 従つてカルボベンゾキシおよび第３ブトキシカ
ルボニル基は、例えば好都合には氷酢酸の存在下
に無水臭化水素を使用してか、またはトリフルオ
ロ酢酸を使用して除去されうる。アシル基は例え
ば酸による慣用の加水分解または前記した酵素的
加水分解により除去されうる。 カルボキシル保護基の除去は、例えばけん化、
アシドリシス、水素添加分解または酵素的加水分
解により遂行されうる。従つて、例えばけん化は
好都合には水、アルコールおよび／またはアセト
ンの存在下にアルカリ金属水酸化物を用いて遂行
されうる。アシドリシスは例えば無水臭化水素ま
たはトリフルオロ酢酸を使用することにより遂行
できそして水素添加分解は例えば接触水素添加例
えば炭素上のパラジウム好都合には木炭上の10％
パラジウムを使用することにより遂行されうる。
酵素的加水分解は例えばロイシンアミノペプチダ
ーゼを使用することにより遂行されうる。従つて
例えばベンジルおよびｐ−ニトロベンジル基は水
素添加分解により除去できそして第３ブチル基は
例えば酸分解により除去できる。 アミン、ヒドロキシルおよびカルボキシル保護
基は例えばアシドリシス、アルカリ加水分解、水
素添加分解、ナトリウムまたはナトリウムアミド
での処理、または酵素的加水分解により同時に除
去されうる。かかる方法には好都合には氷酢酸の
存在下における臭化水素処理および好都合には溶
解乾燥塩化水素を含有するアルコールでの処理が
包含される。 ｐ−メトキシベンジル基のようなチオール保護
基は好都合にはメルカプトエタノール、システイ
ンまたはメチオニンのような捕集剤の存在下に低
温例えば０℃で弗化水素を用いて除去されうる。
この方法はアミノ、カルボキシルおよびチオール
保護基を同時に除去しうる。 選択的脱保護（保護基除去）の方法の一つは、
例えば好都合には触媒として例えば炭素上のパラ
ジウムを使用しそして好都合には溶媒例えば水、
メタノール、ジオキサン、酢酸または第３ブタノ
ールの存在下における接触水素添加である。この
方法は例えばカルボベンゾキシ基を除去するが、
しかし第３ブトキシカルボニルまたはアシル基を
元のままに残す。 一般に、式（）の化合物の保護された誘導体
はペプチド合成に適する技術により製造されう
る。適当に保護されたリジン誘導体を適当に保護
されたシステイン誘導体、またはｎ＝１である場
合は化合物NH₂R¹COOHと反応させることによ
りＣ−末端で出発しうる。リジン誘導体は遊離の
α−アミノ基を有し、そして一方他の反応体は遊
離であるかまたは活性化されたカルボキシル基の
いずれかおよび保護されたアミノ基を有しよう。
カツプリングした後、中間体を例えばクロマトグ
ラフイーにより精製し、そして次に選択的にＮ−
保護基除去してさらに他のアミノ酸残基の付加を
許容せしめる。必要なアミノ酸順列が完成される
までこの操作を継続する。Ｎ−保護基除去は通常
穏和なアシドリシスにより遂行されよう。過剰の
酸は通常例えばトリエチルアミンのような塩基を
使用することにより次のカツプリング工程前に中
和される。 あるいはまた、Ｎ−末端で出発しそして好まし
くは活性化されたカルボキシル基を有する適当に
保護されたグルタミン酸またはピログルタミン酸
誘導体をグルタミン酸またはグルタミンの適当に
保護された誘導体と反応させることも可能であ
る。カツプリングさせた後、生成物を例えばクロ
マトグラフイーにより精製し、そして末端α−カ
ルボキシル基を保護基除去（脱保護）しそして所
望の場合は次のカツプリング工程に先立ち活性化
させうる。この工程順序を所望のペプチドが完成
するまで反復する。 例えば使用されうるカルボン酸活性化物質には
混合無水物、アミドまたは活性化エステル例えば
ｐ−ニトロフエニルエステル、２，４，５−トリ
クロロフエニルエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールエステルまたはＮ−ヒドロキシスク
シンイミジルエステルが包含される。 一般に好都合には適当な溶媒系例えばテトラヒ
ドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミ
ド、メチレンクロライドまたはこれら溶媒の混合
物中低温例えば−20℃ないし周囲温度でカツプリ
ング反応を遂行するのが好都合である。 遊離のアミノ基およびカルボキシル基のカツプ
リングは、例えばジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（DCC）を使用して遂行されうる。例えば使
用されうる他のカツプリング剤はＮ−エトキシカ
ルボニル−２−ニトキシ−１，２−ジヒドロキノ
リンである。 合成を固相樹脂支持体上で実施するのがより好
都合でありうる。クロロメチル化されたポリスチ
レン（１％ジビニルベンゼンと交さ結合）が支持
体の一つの有用なタイプである。この場合合成は
Ｎ−保護されたリジンを支持体に結合させること
によりｃ−末端で出発しよう。X²がNH₂である
場合ベンズヒドリルアミン基を担持する樹脂支持
体を使用するのが好ましい。これらをはじめにリ
ジンカルボキシル基に結合させそして例えばHF
を用いて最後に解裂させると所望のアミドが生ず
る。 以下に説明のために例を掲げる。溶媒は商業上
の物質を再蒸留しそして下記方法すなわちジメチ
ルホルムアミド（DMF）はモレキユラーシーブ
4A上、ジクロロメタン（DCM）はCaCl₂上、ト
リエチルアミン（TEA）はNa／Pb合金
（Baker）上そしてトリフルオロ酢酸（TFA）は
モレキユラーシーブ4A上で保存する。 例 １ Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジン 〔化合物(1)〕 (a) ｔ−Boc（ｓ−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−
システイニル−（ε−ベンジルオキシカルボニ
ル）−Ｌ−リジンベンジルエステル（） ε−ベンジルオキシカルボニル−リジンベン
ジルエステル塩酸基（406mg）をDMF3ml中に
溶解させそして遊離のTEAがPH指示紙の湿つ
た紙片で蒸気相中に検出されうるまでTEAを
添加する。この溶液中にDMF3ml中に溶解した
ｔ−Boc（ｓ−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−シ
ステインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（419mg）を添加する。溶液をわずかにアル
カリ性に保持するために適当な間隔でTEAを
少しずつ添加する。この混合物を室温で一夜放
置しそしてニンヒドリン反応が陰性であるか検
査したのち、DMFで平衡化されそして標準反
応体〔例えば例においてはｔ−Boc−（γ−ベ
ンジル）−Ｌ−グルタミン酸−ｐ−ニトロフエ
ニルエステルおよびｐ−ニトロフエノール〕で
検定されたセフアデツクス（Sephadex）LH
−20の2.5×75cmカラムに直接適用する。カラ
ム流れは重力による流れにより保持しそして流
出液は約10mlのフラクシヨンに集める前に
280nｍで監視する。各フラクシヨンのtlcによ
り生成物を同定し、代表的フラクシヨンを集め
そして真空下に蒸発させる。油状生成物の収量
〜700mg（100％）、tlc（クロロホルム／アセト
ン（９：１））中同質、Rf＝0.64。 (b) ｔ−Boc−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパルチ
ル−（ｓ−ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−システ
イニル−（ε−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ
−リジンベンジルエステル（） 保護されたジペプチド（）700mgを無水
DCM25ml中に溶解させそして無水TFA25mlを
添加する。30分後、酸および溶媒を真空下に除
去する。残留物をDCM中に溶解させそして再
び蒸発させる。TEAでわずかにアルカリ性と
なしたDMF（３ml）中の残留物の溶液にDMF3
ml中のｔ−Boc−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパ
ラギン酸ｐ−ニトロフエニルエステル（488mg）
の溶液を加える。アルカリ度を頻繁に検査しそ
して少量のTEAの添加により保持する。ニン
ヒドリン反応が陰性（約２時間後）になつた後
反応混合物をセフアデツクスLH−20カラム
（2.5×75cm）に適用しそして前記のようにして
精製する。真空下に蒸発させた後の結晶性生成
物の収量〜900mg（100％）、tlc（クロロホル
ム／アセトン（９：１））上同質、Rf＝0.70。 (c) ｔ−Boc−（γ−ベンジル）−Ｌ−グルタミル
−（β−ベンジル）−Ｌ−アスパルチル−（ｓ−
ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−システイニル−
（ε−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン
ベンジルエステル（） 保護されたトリペプチド誘導体900mgを前
記のようにしてTFAで保護基除去し、DMF3
ml中に溶解しそしてTEAを用いて弱アルカリ
性となす。この溶液中にｔ−Boc−（γ−ベン
ジル）−Ｌ−グルタミン酸ｐ−ニトロフエニル
エステル（DMF3ml中）504mgを加える。約２
時間半後にニンヒドリン反応が陰性となりそし
てこの混合物をセフアデツクスLH−20のカラ
ムに適用して前記のように精製する。反応混合
物中の成分の分離およびtlcによるその監視は
前記と同様にして実施されうる。適切なフラク
シヨン（この場合No.９〜15）を集め、蒸発させ
そして乾燥する。淡帯黄色油状物の収量〜1140
mg（100％）、tlc（クロロホルム／アセトン
（９：１））上同質、Rf＝0.53。 (d) ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログルタ
ミル−（γ−ベンジル）−Ｌ−グルタミル−（β
−ベンジル）−Ｌ−アスパルチル−（ｓ−ｐ−メ
トキシベンジル）−Ｌ−システイニル−（ε−ベ
ンジル−オキシカルボニル）−Ｌ−リジンベン
ジルエステル（） テトラペプチド誘導体1140mgをについて
前記したと同様にしてDCM中TFAを用いて保
護基除去しそしてDMF3ml中に溶解させる。こ
の溶液をTEAで弱アルカリ性となしそしてベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−ピログルタミン
酸ｐ−ニトロフエニルエステル423mgをDMF3
ml中の溶液として加える。反応混合物のアルカ
リ度を反復して検査して必要ならばTEAの添
加により元に戻しておかねばならない。約３時
間後ニンヒドリン試験が陰性となりそしてペン
タペプチド誘導体を前記と同様にして精製し
うる。淡帯黄色油状物の収量〜1230mg、tlc（ク
ロロホルム／アセトン（９：１））上同質、Rf
＝0.44（テイリング）。 (e) Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジン 保護されたペンタペプチド誘導体50mgを捕
集剤としてメチオニン500mgを添加して０℃で
液体弗化水素50ml中に溶解させそして１時間放
置する。次に弗化水素を真空下に０℃で蒸発乾
燥させそして残留物を酢酸エチルと撹拌する。
酢酸エチル洗液を傾瀉しそして捨てる。残留す
る物質を希酢酸中に溶解させそして凍結乾燥す
る。 凍結乾燥した物質（２mg）をC18−カラム（10
mm×10cm）を用い、溶液Ａ（0.1％水性トリフルオ
ロ酢酸）および溶液Ｂ（アセトニトリル中の0.1％
トリフルオロ酢酸）を使用し溶液Ｂの0.10％を30
分間にわたつて添加する匂配溶離法を用いて毎分
2.8mlの流量で逆相HPLCすることにより精製し
うる。214nｍでの紫外線吸収またはピリジンジ
スルフイツド試薬（SH基に対する）を用いて検
出を遂行する。 同じ操作が前記化合物(2)〜(5)の調製に用いられ
うる。これらの合成法はスキームの形態で以下に
掲げそして生成物の特性を第表に示す。下記略
語が用いられる。 Boc＝第３ブトキシカルボニル Bz＝ベンジル Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル（カルボベンゾキ
シ） pMB＝ｐ−メトキシベンジル Su＝Ｎ−ヒドロキシスクシニミル pNP＝ｐ−ニトロフエニル

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 毒物学的試験 本発明の物質の毒性作用について (1) 骨髄細胞の懸濁培養物として24時間まで、そ
して (2) 寒天培養物による幹細胞毒性につき７日間試
験した。 化合物１は動物１匹当り9.1mgまでの薬量でマ
ウスへの１回注射および複数回注射ならびに連続
注入によつても試験した。観察時間は19日間まで
で全部で動物273匹を使用した。全器官の顕微鏡
検査により剖検を行つた。 これら薬理学的研究に使用された方法はO.D.
LaerumおよびダブリユーPaukovits両氏により
「Exp.Hematol.」第12巻（1984年）に詳細に記載
されている。 10^-3Mまでのどの薬量でも毒性または動物の死
亡の何の徴候も観察されなかつた。多量では白血
球増加症を誘発する。白血球減少症は薬量の多い
動物のいずれにおいても観察されなかつた。 生物学的試験 LaerumおよびPaukovitsの「Exp.Hematol.」
第12巻第７〜第17頁（1984年）に記載の方法を用
いて寒天コロニー形成法（CFU−Ｃ）および生
体内試験を行なつた。 （寒天コロニー形成法） 雌のマウスの骨髄細胞を使用し、本発明の化合
物を生体外で10^-9M、10^-7M、10^-5Mの各種の濃
度で加え、そしてインキユベーシヨンした。形成
したコロニーの数を計数して対照（未処置の細
胞）に対する割合（％）を求めることにより、本
発明の化合物の造血コロニー形成における抑制効
果を評価した。結果を下記の第表に示す。第
表を見てわかるように本発明の化合物は生体外試
験において優れた造血抑制効果を示した。 （生体内試験） 本発明の化合物１をマウスに注射し、その造血
コロニー形成における抑制効果を試験した。その
結果、この化合物は可逆的な造血抑制作用を示し
た。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中、R¹はグリシンまたはＤ−アラニンの残
   基であり、そして他のすべてのアミノ酸残基はＬ
   −形であり、X¹およびX²は同一または相異なり
   てOHまたはNH₂でありそしてｎは０または１で
   ある）を有する化合物およびその生理学的に受容
   しうる塩。 ２ Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ
   −アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リジ
   ン、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−
   アスパルチル−Ｌ−システイニル−グリシル−Ｌ
   −リジン、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル
   −Ｌ−アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｌ−リ
   ジン、Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−グルタミル−Ｌ
   −アスパルチル−Ｌ−システイニル−Ｄ−アラニ
   ル−Ｌ−リジンおよびＬ−ピログルタミル−Ｌ−
   グルタミル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−システイニ
   ル−Ｌ−リジンアミドから選ばれたものである前
   記特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ 結晶形をした前記特許請求の範囲いずれかの
   項に記載の化合物。 ４ 式 （式中、R¹はグルシンまたはＤ−アラニンの残
   基であり、R²およびR⁶はアミン保護基または水
   素原子であり、R³、R⁴およびR⁷はNH₂、保護さ
   れたアミノまたはカルボキシル保護基またはOH
   でありそしてR⁵はチオール保護基である）を有
   する化合物を脱保護することからなる一般式 （式中、R¹は前述の定義を有し、そして他のす
   べてのアミノ酸残基はＬ−形であり、X¹および
   X²は同一または相異なりてOHまたはNH₂であり
   そしてｎは０または１である）を有する化合物の
   製造方法。 ５ 前記保護基が酸加水分解、水素添加分解、ア
   ンモノリンスまたは酵素的加水分解により除去さ
   れることからなる前記特許請求の範囲第４項記載
   の方法。 ６ 薬学的担体または付形剤と共に一般式 （式中、R¹はグリシンまたはＤ−アラニンの残
   基であり、そして他のすべてのアミノ酸残基はＬ
   −形であり、X¹およびX²は同一または相異なり
   てOHまたはNH₂でありそしてｎは０または１で
   ある）を有する化合物およびその生理学的に受容
   しうる塩を有効成分とする骨髄造血系抑制剤。