DK166392B

DK166392B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af peptider og deres fysiologisk acceptable salte, samt mellemprodukt hertil

Info

Publication number: DK166392B
Application number: DK539483A
Authority: DK
Inventors: Ole Didrik Laerum
Original assignee: Nyegaard & Co As
Priority date: 1982-11-26
Filing date: 1983-11-25
Publication date: 1993-05-10
Also published as: IE832764L; FI77875B; NZ206401A; ATE50693T1; EP0112656A3; FI834320A0; AU559914B2; IE56362B1; US4499081A; DK166392C; FI77875C; DK539483D0; DK539483A; ZA838780B; EP0112656B1; NO157935B; AU2169783A; FI834320L; NO834340L; EP0112656A2

Description

DK 166392 B

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte peptider med den almene formel I

5 1 2 HN CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO (NH-R -CO) · NHCH-COX

Xj III I

(CH2}2 ?H2 CH2 (CH2}4 COX1 COOH SH NH- 10 1 hvor R1 er resten af glycin eller D-alanin og alle andre amino- 1 2 syrerester er i L-form, og hvor X og X , der er ens eller forskellige, hver betegner OH eller og n er tallet 0 eller 1, eller fysiologisk acceptable salte deraf, samt mellem-15 produkter hertil.

Disse peptider har inhiberende virkning på haemopoiese.

Mange af de mest effektive kræftbehandlingskure udnytter cytotoxiske lægemidler som angriber kræftcellerne under mitosen og i S-fasen. Normale vævsceller der er under celle-20 deling påvirkes sædvanligvis samtidig, men hovedparten af sådanne celler er i hvile og dermed ikke sårbare for angreb.

Det er imidlertid blevet iagttaget at sådanne cytotoxiske lægemidler ikke blot angriber de i formering værende vævsceller, men også har tendens til at starte en stor andel af normalt 25 hvilende hæmopoietiske stammeceller i knoglemarven til at gå igang med celledelingscyklus, hvorved de bliver følsomme for angreb.

Knoglemarvens celler stammer fra pluripotente stammeceller som modner til dannelse af en kompleks population af 30 morfologisk distinkte celler, namlig megakaryocytter, erytrocyt-ter, granulocytter og lymfocytter. Kun ca. 10% af de pluripotente stammeceller befinder sig på et givet tidspunkt i celledeling. Under en indledende fase af modningen bliver hver af de sig formerende stammeceller "bestemt" til en særlig morfo-35 logisk distinkt form der til sidst fører til en af de ovennævnte fire modne celletyper. Efterhånden som cellerne formerer sig taber de gradvist evnen til yderligere formering, og

DK 166392 B

2 de modne celler, fx erytrocytter eller granulocytter, kan ikke længere dele sig. Da de modne celler kontinuerlig dør er det derfor afgørende at den proliferative evne hos de mindre modne celler, navnlig hos de pluripotente stammeceller, oprethol-5 des.

Det har nu vist sig at visse peptider har evne til selektivt at forhindre hvilende stammeceller i at blive sat igang til celledelingscyklus. Peptiderne antages at være analoge til en naturligt forekommende granulopoiese-inhibtionsfaktor 10 som er blevet fundet i ganske små mængder i knoglemarvsekstrakter.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at beskyttelsen fjernes fra et beskyttet derivat af forbindelsen med formel I, idet 15 det beskyttede derivat har formlen II

r2N-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO(NH-R -CO) -NH-CH-COR

i i i i i 1 , (CH9), CH- CE ^CH2 4 I 3 I 4 i le

20 COR3 COR4 SRb NHR

II

1 2 6 hvor R er som defineret ved formel I, R og R er aminbe- 3 4 7 skyttende grupper eller hydrogenatomer, R , R og R hver 25 er NEL·, en beskyttet aminogruppe eller en karboxylbeskyt-^ 5 tende gruppe eller OH og R er en tiolbeskyttende gruppe, hvorpå den således dannede forbindelse med formlen I om ønsket omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt heraf.

30 Fysiologisk acceptable salte af de ifølge opfindel sen fremstillede peptider indbefatter syreadditionssalte såsom hydroklorider, hydrobromider og sulfater såvel som salte med base såsom alkalimetalsalte, fx natrium- eller kaliumsalte, jordalkalimetalsalte, fx kalciumsalte og amin-35 salte.

DK 166392B

3

Aminosyreresten i anden stilling fra den N-terminale ende synes at være kritisk "eftersom peptidet pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, der var blevet postuleret at være den naturligt forekommende granulopoiese-inhibitionsfaktor, viste sig at 5 være inaktiv. På grund af de små bitte til rådighed stående mængder af den naturlige granulopoiese-faktor er strukturen af det naturlige stof ikke blevet bestemt. Det er aldrig blevet udvundet i krystallinsk eller fuldstændig ren form og det vides ikke om en sådan udvinding kunne opnås ved hjælp af ma-10 teriale kun fra naturlige kilder. I modsætning hertil kan peptiderne med den almene formel I vindes i krystallinsk form der egner sig til farmaceutisk brug og i forholdsvis store mængder, fri for forurenende peptider og proteiner af naturlig oprindelse.

15 De foretrukne, ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er 1) L-pyroGlutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-L-ly-sin, 2) L-pyroGlutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-glycyl-20 L-lysin, 3) L-pyroGlutamyl-1-glu.taminyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-L-lysin, 4) L-pyroGlutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-D-ala-nyl-L-lysin og 25 5) L-pyroGlutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-L-lysin- amid.

Forbindelserne med den almene formel I har tendens til at udvise et komplekst aktivitetsmønster som åbenbart er dosisafhængigt. I særdeleshed udviser forbindelse nr. 1) ved injek-30 tion i mus ved forholdsvis lav dosis en selektiv inhibering af detmyelopoietiske system, nemlig inhibering af de morfologisk genkendelige celler og "formålsbestemte" stammeceller, mens andre celle-"slægter" stammende fra de pluripotente stam-meceller ikke påvirkes. Ved en koncentration på 10 Mi den 35 ekstracellulære væske er der en udtalt nedgang i antallet af perifere granulocytter, der er størst blandt de modne celler.

DK 166392B

4

Efter én injektion på 10 synes hovedvirkningen at indtræde på de "formålsbestemte" stammeceller. Ved højere doser, fx injektioner på 10 i seks på hinanden følgende dage, sker der stadig en stærk reduktion i populationen af formålsbestemte 5 stammeceller, men også de pluripotente stammeceller og produktionen af erytrocyter er nedsat. Ved 10 5M i tre uger iagttages der kraftig stimulering af hele det hæmopoietiske system, herunder produktion af lymfocytter. Lignende resultater udvises af forbindelser nr. 2)-5) omend der er svagt anderledes styrke-10 grader.

Det skal bemærkes at der ikke er nogen inhiberende virkning på cellerne i andre væv og specielt ikke på svulstceller med relation til ikke-myelopoietiske væv. Der sker således en selektiv beskyttelse af det myelopoietiske system. Imidler-15 tid udøver peptiderne en beskyttende virkning på kræftceller med relation til det myelopoietiske system, fx myeloleukæmi-celler, og disse forbindelser kan ikke bruges selektivt til behandling af sådanne kræftformer.

Peptiderne er uden signifikant toxicitet. Hidtil har 20 alle iagttagne hæmatologiske virkninger været reversible og ingen makroskopiske ændringer er blevet iagttaget i de andre organer hos dyr hvori disse peptider er blevet injiceret.

Som nævnt ovenfor har inhibering af hæmopoiese og specielt granulopoiese tendens til at forhindre hvilende celler 25 i at indtræde i celledeling og dermed blive følsomme for angreb af cytotoxiske anti-cancerlægemidier, fx cytosinarabinosid.

Det har vist sig at efter behandling med et peptid fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen såsom forbindelsen nr. 1) er den inhiberende virkning på de myelopoietiske 30 celler ikke slet og ret reversibel, men faktisk forøges produktionen af sådanne celler midlertidigt abnormt således at den normale cellepopulation meget hurtigt retableres og endda midlertidigt bliver overdreven.

Foruden den ovennævnte beskyttende funktion i terapien 35 med anvendelse af cytotoxiske lægemidler, kan de omhandlede peptider også bruges til at standse eller bremse formering af

DK 166392 B

5 kræftceller med relation til det myelopoietiske system, fx ved behandling af myeloleukæmi. Peptiderne kan bruges i en hvilken som helst klinisk situation hvor det er ønskeligt at ændre hæmopoiesen. I nogle tilfælde kan de omhandlede pepti-5 der også bruges i relative høje doser for at stimulere det myelopoietiske system hvor dette er utilstrækkelig aktivt.

Eftersom peptiderne.med formel I har vist sig at udøve en vis indflydelse på beslægtede ikke-myeloide celler såsom lymfopoiese kan de også bruges til selektiv modifikation af 10 celleformering i andre organer.

Generelt kan de omhandlede peptider, for at udøve beskyttende virkning mod cytotoxiske lægemidler, indgives til mennesker ved injektion i dosisområdet 1-10 mg, fx 4-5 mg pr.

70 kg legemsvægt om dagen. Hvis forbindelserne indgives ved 15 infusion ved lignende teknik kan dosis være i området 30-300 mg pr. 70 kg legemsvægt, fx ca. 100 mg over seks dage. I princippet er det ønskeligt at frembringe en koncentration af pep-o -9 -4 tidet pa omkring 10 M til 10 Mi patientens ekstracellulære væske.

20 I almindelighed fordrer kombineret terapi med cytotoxi ske lægemidler såsom cytosinarabinosid omhyggelig tidsberegning for at sikre at det myelopoietiske system beskyttes mens det cytotoxiske lægemiddel stadig er til stede.

Forbindelserne med den almene formel I kan indgå i far-25 maceutiske præparater der indeholder mindst én sådan forbindelse som virksom bestanddel eller et fysiologisk kompatibelt salt deraf sammen med et farmaceutisk bærestof eller excipient. Sådanne præparater kan fx oparbejdes i former egnet til oral, nasal, parenteral eller rektal indgift.

30 I nærværende beskrivelse indbefatter udtrykket "farma ceutisk” veterinære anvendelser af de omhandlede forbindelser.

Forbindelserne kan foreligge i konventionelle, farmakologiske indgiftsformer såsom tabletter, overtrukne tabletter, næsesprøjtepræparater, opløsninger, emulsioner, pulvere, kap-35 sier eller former til forsinket frigivelse. Konventionelle farmaceutiske excipienter såvel som de sædvanlige fremstillings-

DK 166392 B

6 måder kan bruges til fremstilling af disse former. Tabletter kan fx fremstilles ved sammenblanding af den eller de virksomme bestanddele med kendte excipienter, fx med fortyndinsmidler såsom kalciumkarbonat, kalciumfosfat eller laktose, desinte-5 greringsmidler såsom majsstivelse eller alginsyre, bindemidler såsom stivelse eller gelatine, smøremidler såsom magniumstearat eller talkum og/eller midler til opnåelse af forsinket frigivelse såsom karboxypolymetylen, karboxymetylcellulose, cellulose-acetatftalat eller polyvinylacetat.

10 Tabletterne kan eventuelt bestå af flere lag. Overtrukne tabletter kan fremstilles ved overtrækning af kerner, opnået på lignende måde som tabletterne, med midler der almindeligt bruges til tabletovertrækning, fx polyvinylpyrrolidon eller shellak, gummi arabikum, talkum, titandioxyd eller sukker.

15 For at opnå forsinket frigivelse eller undgå uforenelighedsproblemer kan kernen også bestå af flere lag. Tabletovertrækket kan også bestå af flere lag for at opnå forsinket frigivelse, i hvilket tilfælde der kan bruges de ovennævnte excipienter for tabletter.

20 Injektionsopløsninger kan fx fremstilles på konventionel måde, fx ved tilsætning af konserveringsmidler såsom p-hydroxy-benzoater, eller stabilisatorer såsom EDTA. Derefter indfyldes opløsningerne i injektions-hætteglas eller ampuller.

Næsesprøjtepræaprater kan oparbejdes på tilsvarende 25 måde i vandig opløsning og pakkes i sprøjtebeholdere enten med et aerosol-drivmiddel eller forsynet med midler til manuel udstødning. Kapsler indeholdende en eller flere virksomme bestanddele kan fx fremstilles ved blanding af det virksomme stof med inerte bærestoffer såsom laktose eller sorbitol og 30 indfyldning af blandingen i gelatinekapsler.

Egnede suppositorier kan fx fremstilles ved sammenblanding af det virksomme stof eller kombinationer af virksomme stof- . fer med de konventionelle bærestoffer der bruges til dette formål, fx naturlige fedtstoffer eller polyætylenglykol eller 35 derivater deraf.

DK 166392B

7

Dosisenheder indeholdende forbindelsen med den almene formel I indeholder fortrinsvis 1-10 mg, fx 4-5 mg af det omhandlede peptid.

Inhibering af hæmopoiese ved hjælp af de omhandlede 5 forbindelser sker ved at man til en person eller et dyr administrerer en effektiv mængde af et farmaceutisk præparat som beskrevet foran.

En yderligere vigtig anvendelse af disse peptider er imidlertid til fremstilling af materiale til immunologisk prø-10 veteknik. Peptidet kan herved kovalent bindes til et passende højmolekylært bærestof såsom albumin, polysin eller polyprolin med henblik på at blive injiceret i antistofdannende dyr, fx kaniner, marsvin eller geder. Antisera med høj specificitet opnås ved anvendelse af velkendt absorptionsteknik ved hjælp 15 af den højmolekylære bærer. Ved at indføre radioaktivitet (3H, ^4C, ^O, ^N) i peptidmolekylet kan der let udformes en radioimmunologisk bestemmelsesteknik, og den kan anvendes til bestemmelse af peptid i de forskellige biologiske væsker såsom serum (plasma), urin og cerebrospinalvæske.

20 De omhandlede peptider kan syntetiseres på en hvilken som helst hensigtsmæssig måde. I almindelighed vil de tilstedeværende reaktive grupper (amino, tiol og/eller karboxyl) være beskyttet under den fulde syntese, og sluttrinnet vil således være fjernelse af beskyttelsen fra et beskyttet derivat med 25 formel I. Normalt vil alle -COOH-grupper alle -Ni^-grupper, -NH-gruppen i pyroglutamylresten og -SH-gruppen i cysteinylre-sten være beskyttet.

Det beskyttede peptidderivat er ejendommeligt ved, at det har den almene formel II

30 R2N CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO(NH-R1-C0) -NH-CH-COR7 I I I I I 1 (CH2)2 ch2 ch2 <ch2)4 l-a 1 4 i 5 I 6

COR3 COR4 SR5 NHR

35 II

hvor i

DK 166392 B

8 R er som defineret ovenfor;

n C

R og R er, uafhængigt af hinanden, hydrogen eller en karbobenzoxy-, trityl-, t-butoxykarbonyl-, aretyl- eller . formylgruppe; 5 R3, R4 og R7 er, uafhængigt af hinanden, en amino-, benzoxykarbonylamino-, tritylamino-, t-butoxykarbonylamino-, acetylamino-, formylamino-, hydroxy-, benzyloxy-, p-nitro-benzyloxy- eller 1-butyloxygruppe; og R3 er en metoxybenzyl- eller sulfoætylgruppe.

Ί 0 Der kendes et stort antal beskyttelsesgrupper for amino syrer, og de er bl.a. eksemplificeret i E. Schroder og K. Liibke "The Peptides", bind 1 og 2, Academic Press, New York og London, 1965 og 1966; G.R. Pettit "Synthetic Peptides", bind 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 og 1976, Houben-15 Weyl "Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden", bind 15, Georg Thiene Verlag, Stuttgart, 1974; og "Amino Acids, Peptides and Proteins", bind 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 og 1976.

Eksempler på aminbeskyttende grupper som kan anvendes 20 er bl.a. karbobenzoxy (i det følgende også betegnet Z), trityl, t-butoxykarbonyl (i det følgende også betegnet Boc) og acyl-grupper som fx en acetylgruppe eller en formylgruppe.

Eksempler på karboxylbeskyttende grupper der kan anvendes er bl.a. let fraspaltelige estergrupper såsom benzyl (i 25 det følgende betegnet Bz), p-nitrobenzyl og t-butyl.

Eksempler på egnede tiolbeskyttende grupper er p-metoxy-benzyl og sulfoætyl.

Det vil forstås at der eksisterer et stort antal andre sådanne grupper, som fx udførligt omtalt i ovennævnte littera-30 turreferencer, og anvendelse af alle sådanne grupper i de foran beskrevne processer ligger inden for opfindelsens rammer.

Karboxylbeskyttende grupper kan indføres ved konventionelle metoder, fx ved omsætning med et passende forestringsmiddel såsom en alkohol såsom benzyl- eller p-nitrobenzylalkohol i 35 nærværelse af syre, fx p-toluensulfonsyre.

Aminbeskyttende grupper kan indføres ved konventionelle metoder, fx ved omsætning med passende syrehalogenider såsom karbobenzoxyklorid eller pivaloylklorid, eller med syreanhy-

DK 166392B

9 drider såsom eddikesyreanhydrid.

Tiolbeskyttende grupper kan indføres ved omsætning med påssende S-forætringsmidler såsom p-metoxybenzylklorid eller sulfoætylbromid.

5 Der eksisterer mange forskellige fremgangsmåder til fjernelse af amin- og karboxylbeskyttende grupper. Således kan fx en aminbeskyttende gruppe fjernes ved acidolyse, hy-drogenolyse, behandling med tyndt ammoniumhydroxyd, behandling med natrium, behandling med natriumamid, behandling med hydra-10 zin eller enzymatisk hydrolyse med fx leucinaminopeptidase. Metoder som er af interesse indbefatter også behandling med vandfrit hydrogenbromid, fx i iseddikesyre, behandling med trifluoreddikesyre, behandling, med flydende hydrogenfluorid og katalytisk hydrogenering.

15 Således kan karbobenzoxygrupper og t-butoxykarbonyl- grupper fjernes fx ved anvendelse af vandfrit hydrogenbromid, hensigtsmæssigt i nærværelse af iseddikesyre, eller ved hjælp af trifluoreddikesyre. Acylgrupper kan fx fjernes ved konventionel hydrolyse med syre eller ved enzymatisk hydrolyse som 20 beskrevet ovenfor.

Fjernelse af karboxylbeskyttende grupper kan udføres ved forsæbning, acidolyse, hydrogenolyse eller enzymatisk hydrolyse. Således kan fx forsæbning udføres med et alkalimetal-hydroxyd, hensigtsmæssigt i nærværelse af vand, en alkohol 25 og/eller acetone. Acidolyse kan fx udføres ved hjælp af vandfrit hydrogenbromid eller trifluoreddikesyre og hydrogenolyse kan fx udføres ved katalytisk hydrogenering, fx ved hjælp af palladium på kul, hensigtsmæssigt 10% palladium på trækul. Enzymatisk hydroloyse kan fx udføres ved anvendelse af leucin-30 aminopeptidase. Således kan fx benzyl- og p-nitrobenzylgrupper fjernes ved hydrogenolyse og t-butylgrupper fx ved sur.hydrolyse .

Amin-, hydroxyl- og karboxylbeskyttende grupper kan fx fjernes samtidig ved acidolyse, alkalisk hydrolyse, hydro-35 genolyse, behandling med natrium eller natriumamid eller ved enzymatisk hydrolyse. Sådanne metoder indebærer behandling med hydrogenbromid, hensigtsmæssigt i nærværelse af iseddikesyre, og behandling med alkohol, hensigtsmæsssigt indeholdende

DK 166392 B

10 tørt hydrogenklorid opløst deri.

Tiolbeskyttende grupper såsom p-metoxybenzylgrupper kan fjernes ved hjælp af hydrogenfluorid ved lav temperatur, fx 0°C, fordelagtigt i nærværelse af et rensende middel såsom 5 merkaptoætanol, cystein eller metionin. Denne metode kan fjerne amino-, karboxyl- og tiolbeskyttende grupper på en gang.

En fremgangsmåde til selektiv beskyttelsesfjernelse består fx i katalytisk hydrogenering, hensigtsmæssigt ved hjælp af palladium på fx kul som katalysator., og hensigts-10 mæssigt i nærværelse af et opløsningsmiddel såsom vand, metanol, dioxan, eddikesyre eller t-butanol. Ved denne fremgangsmåde fjernes fx karbobenzoxygruppen, mens t-butoxykarbo-nylgruppen eller en acylgruppe efterlades intakt.

Generelt kan de beskyttede derivater af forbindelser 15 med den almene formel I fremstilles ved de teknikker der egner sig til peptidsyntese. Man kan begynde ved den C-terminale ende ved omsætning af et passende beskyttet derivat af ly-sin med et passende beskyttet derivat af cystein, eller hvis n=l, forbindelsen NH^R^OOH. Lysinderivatet vil indeholde en 20 fri α-aminogruppe, mens den anden reaktant vil indeholdende enten en fri eller en aktiveret karboxylgruppe og en beskyttet aminogruppe. Efter koblingen kan mellemproduktet renses, fx ved kromatografering, hvorpå N-beskyttelsesgruppen kan fjernes for at muliggøre addition af yderligere en aminosyrerest. Den-25 ne fremgangsmåde vil fortsættes indtil hele den udkrævede ami-nosyresekvens er fuldstændiggjort. N-beskyttelsesfjernelse vil normalt blive udført ved en mild acidolyse; overskydende syre neutraliseres normalt før det næste sammenkoblingstrin, fx ved hjælp af en base såsom triætylamin.

30 Det er også muligt at begynde ved den N-terminale ende og omsætte et passende beskyttet glutaminsyrederivat eller pyroglutaminsyrederivat, fortrinsvis indeholdende en aktiveret karboxylgruppe, med et passende beskyttet derivat af glutamin-syre eller glutamin. Efter koblingen kan produktet renses, 35 fx ved kromatografering, og den terminale a-karboxylgruppe befris for beskyttelsesgruppen og aktiveres eventuelt før det næste koblingstrin. Denne trinfølge gentages indtil det ønskede · peptid er fuldstændiggjort.

DK 166392 B

11

Karboxylsyreaktiverende substituenter der fx kan anvendes indbefatter blandede anhydrider, azider og aktiverede estere som fx p-nitrofenylesteren, 2,4,5-triklorfenylesteren, N-hydro-xybenzotriazolesteren og N-hydroxysuccinimidylesteren.

5 I almindelighed er det hensigtsmæssigt at udføre kob lingsreaktionerne ved lave temperaturer, fx ved fra -20°C op til stuetemperatur, hensigtsmæssigt i et passende opløsningsmiddelsystem som fx tetrahydrofuran, dioxan, dimetylformamid, metylenklorid eller, en blanding af to eller flere af disse 10 opløsningsmidler.

Koblingen af frie amino- og karboxylgrupper kan fx udføres ved hjælp af dicyklohexylkarbodiimid (DCC). Et andet koblingsmdidel der fx kan bruges er N-ætoxykarbonyl-2-ætoxy-1,2-dihydroquinolin.

1 5 Det kan være mere hensigtsmæssigt at udføre syntesen på en fastfase-harpiksbærer. Klormetyleret polystyren (tværbundet med 1% divinylbenzen) er en nyttig type bærer; i dette tilfælde vil syntesen begynde ved C-terminalen ved kobling af N-beskyttet lysin til bæreren. Når X skal være NH2 fore- 20 trækkes det at bruge en harpiksbærer der indeholder benzhydryl-amingrupper; disse kobles først til lysinkarboxylgruppen og den endelige spaltning, fx med HF, giver det ønskede amid.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

25 Opløsningsmidler gendestilleredes fra kommercielt mate riale og oplagredes på følgende måde: dimetylformamid (DMF) over molekylsigte 4A, diklormetan (DCM) over CaC^f triætyl-amin (TEA) over Na/Pb-legering (Baker) og trifluoreddikesyre (TFA) over molekylsigte 4A.

30 / 35

DK 166392 B

12

Eksempel 1 L-Pyroglutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-L-lysin (f or-bindelse nr. 1)_ a) t-Boc-(S-p-Metoxybenzyl)-L-cysteinyl-(ε-benzyloxykarbonyl)- 5 __________________________________ 406 mg ε-benzyloxykarbonyl-lysin-benzylester-hydroklo-rid opløses i 3 ml DMF og der tilsættes TEA indtil der kan konstateres fri TEA i dampfasen med et fugtigt stykke pH-indi-katorpapir. Til denne opløsning sættes der 491 mg t-Boc-(S- 1 0 p-metoxybenzyl)-L-cystem-N-hydroxysuccinimidester opløst i 3 ml DMF. Ved passende tidsmellemrum tilsættes der portioner af TEA for at opretholde svag alkalinitet af opløsningen. Blandingen henstår natten over ved stuetemperatur og efter afprøvning for negativ ninhydrinreaktion påføres den direkte på en ^ 2,5 x 75 cm kolonne af "Sephadex" ® LH-20, ekvilibreret raed DMF og kalibreret med standardreaktanter (fx i dette eksempel t-Boc-(Y-benzyl)-L-glutaminsyre-p-nitrofenylester og p-nitro-fenol). Strømmen gennem kolonnen opretholdes som en gravitets-strøm og effluenten overvåges ved 280 nm før opsamling af frak- 2 0 tioner på hver ca. 10 ml. Produktet kan identificeres ved TLC af de enkelte fraktioner og de relevante fraktioner forenes og inddampes i vakuum. Udbytte 700 mg (100%) af et oliagtigt produkt som er homogent ved TLC (kloroform/acetone 9:1), = 0,64.

25 b) t-Boc-(B-Benzyl)-L-aspartyl-(S-p-metoxybenzyl)-L-cysteinyl- lester _(.ii).____________ 700 mg af det blokerede og beskyttede dipeptid (i), oplø-2g ses i 25 ml vandfrit DMC og der tilsættes 25 ml vandfrit TFA. Efter 30 minutter fjernes syre og opløsningsmiddel i vakuum. Remanensen opløses i DCM og inddampes på ny. Til en opløsning af remanensen i 3 ml DMF, der gøres svagt alkalisk med TEA, tilsættes der en opløsning af 488 mg t-Boc-(B-benzyl)-L-aspara-^ ginsyre-p-nitrofenylester i 3 ml DMF. Alkaliniteten bør afprøves hyppigt og opretholdes ved tilsætning af små mængder TEA. Efter af ninhydrinreaktionen er blevet negativ (efter ca. 2 13 DK Ί6639Ζ b timer) påføres reaktionsblandingen på en "Sephadex" ® LH-20 kolonne (2,5 x 75 cm) og renses som beskrevet foran. Udbytte efter inddampning i vakuum ca. 900 mg (100%) af et krystallinsk produkt, homogent ved TLC (kloroform/acetone 9:1), R^ = 0,70.

5 .c) t-Boc-(Ύ-Benzyl)-L-glutamyl-(3-benzyl)-L-asparty1-(S-p-metoxybenzyl)-L-cysteinyl-(e-benzyloxykarbonyl)-L-lysin- _______________________________________ 900 mg af det blokerede tripeptidderivat (ii) afblokeres 10 o med TFA på den ovenfor beskrevne måde, opløses i 3 ml DMF og gøres svagt alkalisk med TEA. Til denne opløsning sættes der 504 mg t-Boc-(γ-benzyl)-L-glutaminsyre-p-nitrofenylester i 3 ml DMF. Efter ca. 2,5 timer er ninhydrin-reaktionen blevet negativ og blandingen anbringes på en kolonne af "Sephadex"® 1 5 LH-20 til rensning som beskrevet ovenfor. Adskillelsen af komponenterne i denne reaktionsblanding og dens overvågning ved TLC kan udføres som beskrevet ovenfor. De relevante fraktioner (nr. 9-15 i dette tilfælde) forenes, inddampes og tørres. Udbytte *1140 mg (100%) af en lys gullig olie som er homogen on ved TLC (kloroform/acetone 9:1), = 0,53.

d) Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-(ϊ-benzyl)-L-glutamyl-(B- benzyl)-L-aspartyl-(S-p-metoxybenzyl)-L-cysteinyl-(ε-benzyl- oxykarb°nYl3-L-lysin-benzylester (iv)__________ 25

1140 mg af tetrapeptidderivatet iii afblokeres ved TFA

i DCM som beskrevet for (i) og opløses i 3 ml DMF. Opløsningen gøres svagt alkalisk med TEA og der tilsættes 423 mg benzyloxy- karbonyl-L-pyroglutaminsyre-p-nitrofenylester som en opløsning i 3 ml DMF. Reaktionsblandingens alkalinitet bør kontrolleres gentagne gange og om nødvendigt retableres ved tilsætning af TEA. Efter ca. 3 timer bliver ninhydrinprøven negativ og penta- peptidderivatet iv kan renses som beskrevet ovenfor. Udbytte «Ί230 mg (96%) lys gullig olie, homogen ved TLC (kloroform/ acetone 9:1), Rf = 0,44 (med "hale").

35 £

DK 166392B

14 e) tl?Z£29iHtå5iYi!li;l2iyt§5YiziiZ§§E§itYl-Ii3CYSteίηγΙ-L-lYsin 50 mg af det beskyttede pentapeptidderivat iv opløses i 50 ml flydende hydrogenfluorid ved 0°C under tilsætning af 500 mg metionin som rensningsmiddel, og henstår i 1 time. Hy-5 drogenfluoridet afdampes derpå til tørhed i vakuum ved 0°C og remanensen omrøres med ætylacetat. Ætylacetat-vaskevæskerne dekanteres og kasseres. Det tilbageværende materiale opløses i tynd eddikesyre og frysetørres.

Det frysetørrede materiale, 2 mg, kan renses ved revers-10 fase-HPLC under anvendelse af en C18-kolonne, 10 mm x 10 cm, med en strømningshastighed på 2,8 ml pr. minut under anvendelse af gradienteluering med opløsning A: 0,1% vandig trifluor- eddikesyre og opløsning B: 0,1% trifluoreddikesyre i acetoni-tril; der tilsættes 0,10% opløsning B i løbet af 30 minutter.

15 Opdagelse udføres ved hjælp af ultraviolet absorption ved 214 nm eller ved hjælp af pyridindisulfidreagens (for SH-grupper).

Samme fremgangsmåde kan bruges til fremstilling af ovennævnte forbindelser nr. 2 til 5. Synteserne er anført i det 20 følgende i skematisk form og produkternes karakteristika er givet i efterfølgende tabel. Der bruges følgende forkortelser: Boc = t-butoxykarbonyl Bz = benzyl Z = benzyloxykarbonyl (karbobenzoxy) 25 pMB = p-metoxybenzyl

Su = N-hydroxysuccinimyl pNP = p-nitrofenyl.

30 35

DK 166392 B

pGlu Glu Asp Cys Lys

Forbindelse 1 15

SpMB Z

Boc—^OSu H —^ OBz

SpMB Z

5 Boc — ^-S obz

OBz SpMB Z

Boc —^ OpNP OBz

OBz SpMB Z

Boc /L_^OBz

OBz OBz SpMB Z

10 Boc_^OpNP H_^_^^OBz

OBz OBz SpMB Z

Boc /OBz

OBz OBz SpMB Z

Z__OpNP _X__^OBz

OBz OBz SpMB Z

15 Z__/_Zl_^-<^OBz

H—- OH

Forbindelse 2 pGlu Glu Asp Cys Gly Lys

/Z

20 Boc--OH H--OBZ

/Z

Boc--— OBz

SpMB Z

Boc—— OSu H--=^OBz

SpMB Z

25 Boc——--— OBz

OBz SpMB Z

Boc—^OpNP H-i—--:-^OBz

OBz SpMB Z

Boc_/_/--^ OBz

OBz OBz SpMB 'Z

30 Boc-ΖθρΝΡ H_/_Z----^OBz

OBz OBz SpMB Z

Boc__r£_/_/__^OBz

OBz OBz SpMB Z

Z__OpNP K_/_Z_/__é.OBz

OBz OBz SpMB Z

35 Z__/__/_/_--ZoBz

H—i- OH

Forbindelse 3 pGlu Gin Asp Cys Lys

DK 166392 B

16

SpMB Z

Boc —-^OSu H —^ OBz

5 SpMB Z

Boc — ^OBz

OBz SpMB Z

Boc —^ OpNP H — OBz

OBz SpMB Z

Boc _/_^_^OBz

10 OBz SpMB Z

Boc__OpNP H_^-^^OBz

OBz SpMB Z

Boc__^_^OBz

OBz SpMB Z

Z__OpNP H __/_/_^OBz

15 OBz SpMB Z

Z___^-^OBz

H—- OH

Forbindelse 4 pGlu Glu Asp Cys D-Ala Lys

20 ,Z

Boc--OH H--OBZ

/Z

Boc--— OBz

SpMB Z

Boc—^OSd H--^OBz

25 SpMB Z

Boc— i---^ OBz

OBz .SpMB Z

Boc-^OpNP H-i—--^OBz

OBz SpMB Z

Boc_ /_-/--/ OBz

30 OBz OBz SpMB Z

Boc_/OpNP H--^OBz

OBz OBz SpMB Z

Boc_,/-/_-/--^OBz

OBz OBz SpMB Z

Z__OpNP H_/_/_/__/OBz

35 OBz OBz SpMB Z

Z--/-/-/--/OBz

Η—I----0H

pGlu Glu Asp Cys Lys

Forbindelse 5 17 UK IbbJaz b

SpMB Z

Boc -^OSu H-=^NH0 5 z

SpMB Z

Boc -S’NH2

OBz SpMB Z

Boc —ΟρΝΡ H_^__^ m2

OBz SpMB Z

Boc ^ • 10 Λ 2

OBz OBz SpMB Z

Boc — r^OpNP H_<£^-^-^m2

OBz OBz SpMB Z

Boc_/_^^^ Nh2

OBz OBz SpMB Z

Z ΟρΝΡ H __X__/_Znh 15 2

OBz OBz SpMB Z

Z--/-^^-^~m2 hJ- HH2

DK 166392 B

18

H H O- fu H

Η H '— — —' H ^ lo i— 1-3 ω > ^ σ o æ t1 n o o > > > wo hp o 1-3 o oo o h- ·· ·· μ Q m κ: κ: π h t n h g ··><· rø Ί3 t-1

O, co ui O Hi® ir1 cn tn ·< d ftd ro H- cn Η h d η O

π o g s · n p ·· η- ·· o ® O KO 0?> OP S ·· W U1 0 H fL H ffi cn o o o ω μη cn •·ρ-··\ρω cn Hi g τ: ·< LJPHHH-P·

3 O M 3 3 1-i \ r+PM

S (Il \ 3 (D WOiQH-

Hi 3 m ro r+ > tn

Hi o to p O O 3 ro

01-5 U1 fU > \ μ- iQ

tn cn χ m O 3 Dj CD

Hi 1< KJ \ kJ ø, h 01-5 3 tn æ HS ro ^ h ro 3 ro o ro m tn > tn •c ok: h \ i-i ro < ro \ ro \ to p < O Qj p)

o\° P

CL

o w

LJ

o 2 ft) ft) ft) ftj 1-3 Hl Hi —· o il il m i-j

Μ MOIMHI O O ^ CT

(jl ^ ^ ^ > · - O CD CO O O to

Ό 00 03 O Ό H

ft) ft) *1 ft) Hi Hi —- 0 h3 II II to bi Μ O O Η Η I O O -—O' J—» M **·*» <* ·* ** · σ\ o \o o oh* - co o oo m o ooco

-J

»id bd ft) Hi bh — o b3 II II LO bj Ο O I H H I Ο O —-O' oo > ^ ^ - ·

- CD CO 00 O OH

00 00 O -J o oo cn JJ 51 hi

ft) Hl bh ^ O

b3 II II 4^ bi ΗΟΙΗΗΗ O O — O' H - ' ' ' ' '

00 O 00 CD O O OtO

- COCOJ^OH OOCO

LJ

ft) ft) ft) h| b3 Hl Hi ·— o II II cn bi H HOIHHI O O — O- O »·,·«·» ·* *

- O 00 00 O HH

O O 00 Ό O iC* <J1

Claims

19 DK Ί66392 B

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et peptid med den almene formel HN-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO(NH-R1-CO)mNHCH-COX2

5 AJ ,1,,, l,, I,2 i,.,, i ! I I I COX COOH SH NH, hvor R1 er resten af glycin eller D-alanin og alle andre amino- 1 2 1. syrerester er i L-form, og hvor X og X , der er ens eller forskellige, hver betegner OH eller NH2 og n er tallet 0 eller 1, eller fysiologisk acceptable salte deraf, kendetegnet ved at beskyttelsen fjernes fra et beskyt- 15 tet derivat af forbindelsen med formel I, idet det beskyttede derivat har formlen II r2N-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO(NH-R^-CO) -NH-CH-COR1 I I i I I n I (^2)2 CH2 CH2 (ch2) 4 20 | 3 I 4 I 5 I 6 COR2 COR3 4 5 SRb NHR II 1 2 6 hvor R er som defineret ved formel I, R og R er aminbe- af der fremstilles L-pyroglutamyl-L-glutaminyl-L-aspartyl-L- 2 4 7 25 skyttende grupper eller hydrogenatomer, R , R og R hver 3 er NH9, en beskyttet aminogruppe eller en karboxylbeskyt-^ 5 4 tende gruppe eller OH og R er en tiolbeskyttende gruppe, hvorpå den således dannede forbindelse med formlen I om ønsket omdannes til et fysiologisk acceptabelt salt 30 heraf. 5

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved DK 166392 B 20 cysteinyl-L-lysin, L-pyroglutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cy-steinyl-glycyl-L-lysin, L-pyroglutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-L-lysin, L-pyroglutamyl-L-glutamyl-L-aspartyl-L-cysteinyl-D-alanyl-L-lysin eller L-pyroglutamyl-L-glutamyl-5 L-aspartyl-L-cysteinyl-L-lysinamid.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved at den fremstillede forbindelse foreligger i krystallinsk form.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved at beskyttelsesgrupperne fjernes ved sur hydrolyse, hy- drogenolyse, ammonolyse eller enzymatisk hydrolyse.

5. Beskyttet peptidderivat til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved at det har den almene formel II 15 -CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO (NH-R^-CO) n“NH-CH-C0R (CH2>2 ch2 CH2 4 COR3 COR4 SR5 »HR6

20 II hvor er som defineret i krav 1; 2 6 25. og R er, uafhængigt af hinanden, hydrogen eller en karbobenzoxy-, trityl-, t-butoxykarbonyl-, acetyl- eller formylgruppe; 3 4 7 R , R og R er, uafhængigt af hinanden, en amino-, benzoxykarbonylamino-, tritylamino-, t-butoxykarbonylamino-, 30 acetylamino-, formylamino-, hydroxy-, benzyloxy-, p-nitro-benzyloxy- eller 1-butyloxygruppe; og R^ er en metoxybenzyl- eller sulfoaetylgruppe.