NL8003766A

NL8003766A - Op het centrale zenuwstelsel werkende tripeptiden en werkwijze voor de bereiding daarvan.

Info

Publication number: NL8003766A
Application number: NL8003766A
Authority: NL
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1979-06-28
Filing date: 1980-06-27
Publication date: 1980-12-30
Also published as: BE884015A; AU5972080A; DD151745A5; GB2058079A; JPS568354A; DE3024256A1; IL60406A; NL192575B; FI73224C; CA1188296A; SE8004745L; BG60739B2; DK149610B; IT1174678B; SU1085505A3; JPH0159278B2; NL192575C; FR2460291A1; SE447389B; IL60406A0

Description

N/29.792-Kp/vdM i - 1 -

Op het centrale zenuwstelsel werkende tripeptiden en werkwijze voor de bereiding daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op de bereiding van nieuwe op het centrale zenuwstelsel werkende tripeptideamiden met de algemene formule 1 X - Y W - nh2 , 5 waarin: X een L-pyroglutamyl-, D-pyroglutamyl-, L-2-keto-imidazolidin- 4-carbonyl-', L-6-keto-pipecolyl-, L-thiazolidin-4-carbonyl-, L-prolyl- of orotylgroep, Y een L-leucyl-, L-norvalyl- of L-histidylgroep, 10 W een L-prolyl-, D-prolyl-, L-thiazolidin-4-carbonyl-, L-homoprolyl-, L-leucyl-, L-isoleucyl-, L-methionyl-, L-pipecolyl- of D-pipecolylgroep is, terwijl verder -W-NH2 te samen ook een pyrrolidyl- of piperidylgroep betekent, terwijl echter wanneer X L-pyroglutaminyl- en 15 Y L-histidylgroep betekenen, W een van de L-prolylgroep verschillende betekenis heeft, alsmede van therapeutisch toepasbare complexen van deze verbindingen.

De nieuwe tripeptidederivaten, die overeenkomen met de boven gedefiniëerde algemene formule 1, zijn analogen van 20 het ook als "thyrotropine-vrijmakend hormoon" (TRH) bekende L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamide (Glp-His-Pro-NH2), waarin echter enige aminozuurgroepen op een bepaalde andere, in de boven gegeven definitie van de algemene formule 1 aangegeven, aminozuurgroepen, resp. -W-NH2, eventueel tegen een 25 pyrrolidyl- of piperidylgroep zijn uitgewisseld.

Het bestaan van TRH was reeds in de zestiger jaren bekend, maar zijn structuur werd eerst in de jaren 1969, resp. 1970 opgeklaard door de onderzoekgroepen van R. Guillemin, resp. A. Schally en wel bijna gelijktijdig, doch onafhankelijk 30 van elkaar, verg. Bowers, C.Y., enz., Endocrinology 86_, 1143 (1970); en R. Burgus en medew., C.R. Acad. Sci. (Parijs) 269, 1870 (1969).

Het tripeptide TRH werd oorspronkelijk beschreven als een factor, die het vrijmaken van TSH (thyreotroop hormoon) 35 in de hypofyse van zoogdieren reguleerde; het onderzoek, dat 800 3 7 66 % - 2 - zich bezig hield met dit hormoon werd echter in een nieuwe richting gevoerd toen bekend werd dat de biologische functie van dit tripeptide niet beperkt is tot de regulering van de vrijmaking van het thyreotrope hormoon, doch dat het ook een 5 werking bezit op het centrale zenuwstelsel (verg. N.P.

Plotnikoff en medew., Science 178, 417 (1972) en A.J. Prange en medew., Lancet _2, 999 (1972)). Er werd dan vastgesteld, dat het TRH naast de genoemde hormoonfunctie ook de tijdsduur van de door barbituraten of alcohol veroorzaakte slaap aan-10 zienlijk verlaagt, verder ook de door verschillende geneesmiddelen veroorzaakte hypothermie vermindert en de locomotorische activiteit vergroot. Een verdere belangrijke factor van de op het centrale zenuwstelsel uitgeoefende werking van TRH is de remming van de door Haloperidol veroorzaakte catalepsie. Het 15 scheen derhalve ook gewenst voor de therapeutische praktijk dergelijke TRH-analogen te maken, die op de hypofyse slechts zwak werken, doch daarentegen de werking van TRH bereikende of zelfs overtreffende werkingen vertonen op het centrale zenuwstelsel. Voor dit doel werden de in de Duitse octrooischrif-20 ten 2.343.035, 2.343.037, 2.449.167, 2.514.381, 2.609.154 en 2.639.393 alsmede de in het Belgische octrooischrift 819.198 beschreven dergelijke verbindingen vervaardigd. De tot nog toe hierop betrekking hebbende onderzoekingen, waarvan de resultaten en ervaringen van A.J. Prange en medew. /"The Role of 25 Hormones in Depression", Life Sciences 20_, 1305 (1977/7 en A.V. Schally en medew., /"Hypothalamic Regulatory Hormones", Ann, Rev. Biochem. £7, 89 (1978/7 werden samengevat, konden echter niet voeren tot resultaten, die in elk opzicht bevredigend waren voor de eisen van de therapeutische praktijk.

30 Er werd thans gevonden, dat men door systematische uitwisseling van enkele aminozuren van het uit drie aminozuren opgebouwde TRH-molecuul kan bereiken dat de hormoonwerking van het tripeptide geheel wordt opgeheven, of tenminste aanzienlijk kan worden gereduceerd, terwijl echter de op het centrale 35 zenuwstelsel uitgeoefende werking kan worden behouden of zelfs belangrijk kan worden verhoogd. Als bijzonder voordelig hebben zich daarbij die derivaten getoond, waarin op de plaats van de histidinegroep op de 2-plaats een alifatische aminozuurgroep 8003766 Λ.

I · - 3 - staat, die een rechte of vertakte koolstofketen bevat. In het belang van een nog meer selectieve biologische werking bleek het eveneens voordelig te zijn een 6-keto-pipecolinezuurgroep in het molecuul in te bouwen in de plaats van het pyrogluta-5 myl-ringsysteem.

De tripeptidederivaten, die overeenkomen met de boven gedefinieerde algemene formule 1, worden volgens de uitvinding volgens op zichzelf bekende peptide-chemische methoden uit de overeenkomstige aminozuren, resp. aminozuurderivaten, 10 bij voorkeur zodanig bereid, dat men a) uit verbindingen met de algemene formule 2 W - nh2 waarin W de boven aangegeven betekenis heeft, uitgaande van het molecuul met de algemene formule 1, stapsgewijze, door 15 toepassing van de in de peptide-chemie gebruikelijke koppe-lingsmethode, met voordeel onder toepassing van actieve esters, gemengde anhydriden of dicyclohexylcarbodiimide opbouwt, of b) de verbindingen met de algemene formule 2, W - nh2 20 waarin W de boven aangegeven betekenis heeft, acyleert met aziden, die bereid zijn uit dipeptidehydraziden met de algemene formule 3, z - x - y - nh-nh2 waarin Z een benzyloxycarbonylgroep betekent en X en Y de 25 boven aangegeven betekenissen hebben, en dan de beschermende groep Z bij voorkeur door katalytische hydrering afsplitst uit de volgens ëën van de boven genoemde methoden verkregen verbindingen met de algemene formule 4 Z-X-Y-W- NH2 30 waarin Z, X, Y en W de boven aangegeven betekenissen hebben, en het verkregen produkt met de algemene formule 1 isoleert uit het reactiemengsel en/of eventueel omzet in een therapeutisch toepasbaar complex.

Bij de toepassing van de methode van de stapsgewij-35 ze molecuulopbouw wordt de doelmatig in overmaat aanwezige uitgangsverbinding met de algemene formule W-NH2 omgezet met een geactiveerd derivaat, in het bijzonder met de pentafluor-fenylester van een beschermd aminozuur met de algemene for- 8003766 - 4 - mule BOC-Y-OH, waarin BOC de tert-butyloxycarbonyl-bescher-mende groep betekent, waarbij de overeenkomstige dipeptidederi-vaten BOC-Y-W-NI^ in een uiterst korte reactietijd van enige minuten worden verkregen in een gemakkelijk opwerkbare vorm, 5 die meestal geen verdere reiniging nodig heeft. Deze zelfde dipeptidederivaten met de algemene formule BOC-Y-W-NH2 kunnen echter ook onder toepassing van andere koppelingsmethoden, bijv. met gemengde anhydriden, of met vrije zuren in aanwezigheid van dicyclohexyl-carbodiimide worden opgebouwd.

10 De door acidolyse uit het verkregen beschermde di- peptidederivaat BOC-Y-W-NH2 in vrijheid gestelde dipeptide met de algemene formule H-Y-W-NH2 wordt dan met voordeel weer omgezet met de pentafluorfenylester van een beschermd aminozuur met de algemene formule Z-X-OH, waarbij dan op de boven be-15 schreven voordelige manier de overeenkomstige beschermde tri-peptidederivaten met de algemene formule Z-X-Y-W-NH2 worden verkregen.

De acylering van de uitgangsverbinding W-NI^, met een azide, dat te bereiden is uit de hydraziden met de algeme-20 ne formule Z-X-Y-NH-NEL,, heeft het voordeel, dat de genoemde hydraziden zeer goed kristalliseerbare en dienovereenkomstig in zeer zuivere vorm isoleerbare tussenprodukten zijn.

De op de plaats van X een pyroglutamylgroep bevattende verbindingen met de algemene formule 1 kunnen ook zoda-25 nig worden opgebouwd, dat men de pyroglutamylring slechts vormt in de laatste stap van de synthese uit een glutamine-groep en wel zo, dat men glutaminezuur als derde aminozuur in het molecuul invoert en het op deze wijze verkregen tripeptide met de algemene formule Gln-Y-W-NI^ enige minuten verwarmt in 30 azijnzuur.

Uit de beschermde tripeptidederivaten met de algemene formule Z-X-Y-W-NH2, die vervaardigd zijn volgens één van de boven beschreven methoden, kunnen de gewenste eindprodukten met de algemene formule 1 met voordeel in vrijheid worden ge-35 steld door katalytische hydrering. De zuivering van de verkregen eindprodukten kan plaatsvinden door eenvoudig kristalliseren of door herhaald neerslaan, indien nodig echter ook door zuilenchromatografie. Eventueel kan het eindprodukt na 8003766 - 5 - het verwijderen van de nevenprodukten ook uitgeprepareerd worden door eenvoudige lyofilisering.

De volgens de uitvinding bereide tripeptidederiva-ten met de algemene formule 1 werden volgens de hieronder be-5 schreven biologische methoden beproefd op hun farmacologische werkingen.

1. Remming van de Haloperidol-catalepsie bij ratten. (Verg.: J. Delay en P. Deniker: Compt. Rend. Cong. Med. Alenistes Neurologistes, JL9, 487 Luxemburg 1952).

10 De dieren kregen subcutaan 40 mg/kg Haloperidol, d.w.z. 4-(p-chloorfenyl)-1-/2-(p-fluorbenzoyl)-propyl7-pipe~ ridin-4-ol en na 120 minuten werd het intreden van catalepsie gecontroleerd; aansluitend werden de ratten ingedeeld in groepen van elk 10 dieren en behandeld met intraveneus toege-15 diende doseringen van TRH, resp. van de nieuwe TRH-analogen tripeptiden. De dieren van de controlegroepen werden behandeld met fysiologische zoutoplossing. De catalepsie-opheffende werking van de afzonderlijke verbindingen werd onderzocht 15, 30, 90 en 120 minuten na de behandeling. Die dieren werden als 20 cataleptisch beschouwd, die wanneer ze met hun voorpoten werden gezet op een 7 cm hoge zuil, hun plaats niet hadden gecorrigeerd binnen 30 seconden.

Uit het aantal van de geen catalepsie vertonende dieren werden door probiet-analyse de overeenkomstige ED^-g-25 waarden bepaald voor de afzonderlijke grondstoffen.

Deze proeven werden uitgevoerd met mannelijke Wistar-ratten met een afzonderlijk gewicht van 160-180 g.

2. Potentiëring van de door L-Dopa veroorzaakte locomotorische activiteit bij muizen.

30 (Verg.: The Thyroid Axis, Drugs and Behavior, blz. 116, A.J. Prage Jr., Raven Press, New York, 1974).

Aan de dieren werd eerst 40 mg/kg N-methyl-N-propargyl-benzylamine (Pargyline) gegeven, dan 20 mg/kg TRH, resp. dezelfde dosering van de te onderzoeken nieuwe tripep-35 tiden en tenslotte 100 mg/kg L-Dopa, steeds intraperitoneaal.

Na 30, 60 en 90 minuten na de boven genoemde behandeling werd de locomotorische activiteit van de dieren gemeten; de bepaalde waarden worden aangegeven in de onderstaande tabel in 8003766 - 6 - procenten, betrokken op de met TRH behandelde dieren verkregen waarden. Voor deze proeven werden steeds 15 mannelijke muizen gebruikt met 18-22 g afzonderlijk gewicht.

3. Reserpinehypothermie-omkerende werking bij 5 muizen.

Verg.: B.M. Askew: Life Sci. 2, 725-730 (1963).

Aan de in groepen van 10 dieren ingedeelde mannelijke muizen met 18-22 g afzonderlijk gewicht, werd 5 mg/kg Reserpine intraperitoneaal toegediend; na 16 uur werden de 10 dieren behandeld met doseringen van elk 20 mg/kg TRH, resp. van het te onderzoeken tripeptide.

De rectale temperatuur van de dieren werd gemeten voor de behandeling met Reserpine (in de onderstaande tabel: "norm."), 16 uur na de behandeling met Reserpine (in de tabel: 15 "res.") en ëën, resp. twee uur na de toediening van de te onderzoeken tripeptiden (in de tabel: "na behandel."). In de tabel zijn doorsneewaarden gegeven van de steeds bij 10 muizen gemeten rectale temperaturen.

4. Beïnvloeding van de duur van de door Hexobarbi-20 tal veroorzaakte slaap.

Aan de in groepen van elk 10 dieren ingedeelde mannelijke muizen werd steeds 60 mg/kg Hexobarbital-Na (Evipan , Bayer) intraveneus toegediend; na 10 min. werden de dieren dan behandeld met doseringen van elk 20 mg/kg TRH, 25 resp. van het te onderzoeken tripeptide, langs intraperitonea-le weg. De slaaptijden werden gemeten en in de onderstaande tabel aangegeven in procenten van de doorsneewaarden, betrokken op de bij de dieren van de controlegroep gemeten waarden.

5. Ethanolnarcose.

30 Verg.: J.M. Cott en medew.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 196, 594 (1976).

Aan de in groepen van steeds 20 dieren ingedeelde CFLP (LATI) muizen van gemengd geslacht met 18-22 g afzonderlijk gewicht, werd steeds 4,5 g ethanol intraperitoneaal toe-35 gediend; na 10 min. werden de dieren dan intraperitoneaal behandeld met doseringen van steeds 20 mg/kg van het te onderzoeken tripeptide. De slaaptijden werden in de onderstaande tabel aangegeven in procenten, betrokken op de doorsneewaarden 8003766 ' t · - 7 - van 20 dieren, van bij de dieren van de controlegroep gemeten waarden.

6. Hormoonactiviteit (TSH-werking) aan ratten.

Mannelijke Wistar-ratten met ca. 200 g afzonderlijk 5 gewicht werden ingedeeld in groepen van 7 en intraveneus behandeld met doseringen van 20 mg/kg TRH, resp. van het te onderzoeken tripeptide. De TSH-reactie van de dieren werd 15 min. na de behandeling met TRH, resp. met de TRH-analoge verbindingen bepaald uit het plasma van de dieren door radio-immune 10 onderzoeking. De relatieve werkingshoogten werden berekend volgens de vierpuntsmethode met behulp van een TPA 101 computer, waarbij de werkingshoogte van TRH als 100 werd beschouwd.

De volgens de boven geschilderde farmacologische methoden verkregen gegevens van de biologische werkingen van 15 de belangrijkste verbindingen met de algemene formule 1 worden samengevat in de onderstaande tabel.

20 8003766 - 8 - I Di ffl £ w ·η t~~ cm

Ei M - -

p CMOOt^OIIOOO

φ O

£

<D

P

0) Φ

Ό -P

'D Ό i-i-iCd) m'flcooHcoui'foi in Η-ΗΛ3Η i-'MPwramMpramra ra 0 +> > o £ ft p (Ö (Ö <K> +> ,£ <Ö £

+> H O

φ co o £ 1 Φ

H P

(Ö Φ +J (U -H „ •p Φ Ό Ό ρ-'-ισίοοσ^ι-ιΐΟΓ'σι ra h-n α) ramrarararaO'Dim ld

P -P £ H

iö +) iö O

A ft > P

0 (Ö -U

<Ö dP £

Φ H O

M m u

• ΟιιΟίΝΟΓ-ΟίΜνΟΟΟ CM

j **%*·***·*»»*· *k 1 ΟΦΛ raCMCM-HODiramCO o O) o OcMrararararacMracMCM ra

£ S

•Η - IÖ

Dj Μ Λ

p £<D ο-ΐ'-'Γ-ΜΡΜΡίηΟΟΓ'· LH

φ φ £ Λ ,£ --------- -

ω +J ^HCMtnrOO'-'O'OLnr' LD

(Dgfljnj rarararararacMCMCM ra OS P P £ , 0) Φ 1-3 £ Λ ft H iö +) g · mDlDiraCOrat^'Ö'·'-1 Dl ra > O Φ to --------- - ri Öj +) φ MpraMP^pcMraor-MP m

&I>1 P CMCMCMCMCOCNCMCMCM CM

^ £ Λ Φ p “iö £ £ Φ +) g nntN^ui^ciiiiin cm -p -p

y CJM - SS

g ΦΟ rawrarararararaw ra O M£ rarararararararacM ra ra o- m *-i

. r-i CM

C p -r^mcMCMOiooomrao ..

(öo OCMvOLDTHC^r^O'i-'D o +1+1 J>JJ D*·* T-4t-4 T-i 0 <x> mp σi

Di S - CO- rara •Pü+iiö-oincMDir-raorao o ra mp PO-pfioraMPMProMPraraint·- o !φ η φ ra *-l ^ •i-l +>

+) <Ö -P D D

C ft > Η H

φ O ·Ρ WW

jjp+j - cjira^»-iinrarnMpro o . .

oio O'-irar-ocnoraini-i o +1+1 ft D (ö rara ^jcm^-itj *-< *« |χΐ|><< 1 Ό CH ·Γΐ£οοοοοοιηιηο ra ·· iU0D-H-3raracMCMrara>H^jra «η Ό > Ό ·Ρ +> S th^h -ra

H 10 -H

Dl P ft % H ft H Dl 2 Ό f0 m ooiraraMpra rara iöi-i

H+)LO\---- -- rP -P

φ iö iöq Dirao^raraoraoo o m+> PM uw gcM-Hraramrarar-co ra ift ______________ ____^__________—_____ H IÖ 0 <ö <ö

OOnjftiöiöPOO -P H

N P P O -P O ü ft, PP -PtD

ftftEiftEiIHMftft A I

cm b H

a iö o

2 CiÖ3£(ÖiÖiö££ AG

I >ΐφ>ΦΦ>>>ΦΦ 0Φ

N DSDPiaSSPIDM

I OS Φ -P

>4 Ei Μ Φ I ft Λ r-1 ^üüftOïftüüüü Οι04γΗγ-ΙΗ Oj Q| I ·Η _IggQOO^US QNSl m o m o 8003766 - 9 -

Uit de gegevens in de bovenstaande tabel blijkt dat de nieuwe TRH-analogen, waarbij twee of drie aminozuren van het THR-molecuul zijn vervangen door andere aminozuren, aanzienlijke werkingen vertonen op het centrale zenuwstelsel.

5 Uit dit gezichtspunt zijn vooral die derivaten voordelig, waarin op de plaats van de His-groep op de 2-plaats van het TRH-molecuul, een alifatisch aminozuur staat met een rechte of vertakte koolstofketen. Eveneens voordelig zijn uit het gezichtspunt van deze werking die TRH-analogen, waarin de Glp-10 groep is vervangen door 6-keto-pipecolinezuur. Bij deze derivaten is de hormoonwerking van TRH ofwel volledig opgeheven, ofwel gereduceerd tot op een minimum, waarbij gelijktijdig de werking die op het centrale zenuwstelsel wordt uitgeoefend, zeer belangrijk, in enkele gevallen zelfs tot op het achtvou-15 dige, gestegen is.

De volgens de uitvinding te vervaardigen nieuwe tripeptiden, alsmede hun farmaceutisch toepasbare zouten, resp. complexen, kunnen in de therapie worden gebruikt in de vorm van de gebruikelijke geneesmiddelpreparaten. Deze genees-20 middelpreparaten bevatten de grondstoffen volgens de uitvinding onder begeleiding van anorganische of organische drager-stoffen, die geschikt zijn voor de enterale of parenterale toediening. De geneesmiddelpreparaten kunnen bijv. worden gemaakt in de vorm van tabletten, dragees, injectiepreparaten, 25 lyofilisaten, enz. De vervaardigingen van deze geneesmiddel-vormen kan geschieden volgens de gebruikelijke farmaceutische methoden.

De praktische uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding, resp. de chemische bereiding van de nieuwe TRH-30 analogen volgens de uitvinding, worden nader toegelicht door de onderstaande voorbeelden. De in deze voorbeelden gebruikte afkortingen komen overeen met de in de peptidechemie gebruikelijke conventionele afkortingen, verg.: J. Biol. Chem. 247, 977 (1972). Er worden voorts de volgende verdere afkortingen 35 gebruikt in de onderstaande voorbeelden: HPro L-homoproline

Kic L-2-ketoimidazolidine-4-carbonzuur

Kpc L-6-ketopipecolinezuur 8003766 - 10 -

Oro orootzuur Pip L-pipecolinezuur Tea L-thiazolidine-4-carbonzuur DCC dicyclohexyl-carbodiimide 5 DCU dicyclohexyl-ureum PFPOH pentafluorfenol DMFA dimethylformamide.

De in de voorbeelden aangegeven smeltpunten van de verbindingen werden bepaald door middel van een smeltpuntmeet-10 apparaat volgens Dr. Tottoli (Büchi). De optische rotatiewaar-den werden gemeten met behulp van een polarimeter van het type Perkin-Elmer 141.

Voor de dunne-laagchromatografische onderzoekingen resp. scheidingen, werden silicagelplaten gebruikt "Kieselgel 15 G volgens Stahl" (E. Merck, Darmstadt). Voor de ontwikkeling van de chromatogrammen werden de volgende oplosmiddelmengsels toegepast: (1) chloroform - methanol 9 : 1 (2) ethylacetaat : (pyridine : azijnzuur:water 20 20 : 6 : 11) 95 : 5 (3) ethylacetaat : (pyridine:azijnzuur:water 20 : 6 : 11) 9 : 1 25 (4) ethylacetaat : (pyridine:azijnzuur:water 20 : 6 : 11) S : 2 (5) ethylacetaat : (pyridine:azijnzuur:water 20 : 6 : 11) 30 3 :2 (6) ethylacetaat : (pyridine:azijnzuur:water 20 : 6 : 11) 2 : 3.

Voor de ontwikkeling van de vlekken werd een nin-35 hydrineoplossing gebruikt; na de bespuiting werden de platen ongeveer 5 min. lang gedroogd bij 105°C. Dan werden de chromatogrammen gelegd in chloorgas en na beluchting ontwikkeld met o-tolidine-kaliumjodide-oplossing.

Voor de zuilchromatografische zuivering van de 40 produkten werd "Kieselgel G" (E. Merck) silicagel gebruikt met 800 37 66 - 11 - een deeltjesgrootte van 0,062-0,2 mm.

Voor het indampen van de oplossingen in vacuum werd een "Rotavapor R" (Büchi) vacuum-indamper toegepast; het indampen werd uitgevoerd bij temperaturen die de 50°C niet 5 overschreden.

De pentafluorfenylester van de met BOC beschermde aminozuren werd vervaardigd volgens de methode van L. Kisfalu-dy en medew., Ann. 1973, 1421.

VOORBEELD I

10 L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-pipecolinezuuramide.

Stap 1: L-leucyl-L-pipecolinezuuramide-hydrochloride.

In 20 ml DMFA werd 1,54 g (12 mmol.) H-Pip-N^ gesuspendeerd en aan de suspensie werd 5,16 g (13 mmol.) BOC-15 Leu-OPFP en 1,68 ml (12 mmol.) triethylamine onder roeren toegevoegd. Het mengsel werd 6 uur lang verder geroerd, dan werd de verkregen oplossing in vacuum ingedampt en de als residu verkregen olie opgelost in 60 ml chloroform. Aan de oplossing werd 0,2 ml 2-(dimethylamino)-ethylamine toegevoegd, 20 men liet dit 5 min. staan en dan werd met steeds 20 ml N zout-zuuroplossing driemaal uitgeschud, met elk 20 ml N-natrium-waterstofcarbonaatoplossing driemaal en met 20 ml water eenmaal in de aangegeven volgorde uitgeschud, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en ingedampt. De olie-achtige rest 25 werd in 3 ml ethylacetaat opgelost en aan de oplossing werd 10 ml 5 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat toegevoegd. Na een uur staan werd het reactiemengsel met ether verdund, het ontstane neerslag werd afgefiltreerd en in vacuum gedroogd boven watervrij natriumhydroxide. Er werd op deze wijze 3,12 g H-30 Leu-Pip-NH9.HC1 verkregen (94 % van de op H-Pip-NH0 berekende Δ (5) Δ theoretische opbrengst); R^ = 0,46.

Stap 2:

Benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-pipecolinezuuramide In 35 ml DMFA werd 3,13 g (11,2 mmol.) H-Leu-Pip-35 N^.HCl en 4,94 g (11,5 mmol.) Z-Glp-OPFP opgelost en aan de oplossing werd 1,57 ml (11,2 mmol.) triethylamine toegevoegd.

Na 5 min, roeren werd nog eens 1,57 ml (11,2 mmol.) triethylamine toegevoegd en na 20 min. verder roeren werd het reactie- 8003766 - 12 - mengsel in vacuum ingedampt. Het residu werd opgelost in 90 ml chloroform en de oplossing werd uitgeschud achtereenvolgens met steeds 30 ml N zoutzuuroplossing tweemaal, met steeds 30 ml N natriumhydroxide-oplossing driemaal en met 30 ml water een-5 maal, in de aangegeven volgorde. De organische fase wordt dan gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. Het amorfe residu wordt omgeroerd met koude ether, de ether wordt gedecanteerd en de achterblijvende olie wordt onder n-hexaan tot stollen gebracht. Het op deze wijze verkregen amorfe ruwe pro-10 dukt (4,7 g) wordt gekristalliseerd uit ethylacetaat/ether.

Er wordt 3,32 g Z-Glp-Leu-Pip-NH2 verkregen (61 % van de theorie); smp. 143-144°C; = 0,51; [_ a/^5 = -97,2° (c = 1, in azijnzuur).

Analyse voor C25H34°6N4 (mol.gew. 486,57): 15 berekend: C 61,71 %, H 7,04 %, N 11,51 %; gevonden: C 61,67 %, H 7,05 %, N 11,40 %.

Stap 3: L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-pipecolinezuuramide.

In 40 ml methanol werd 2,1 g (4,32 mmol.) Z-Glp-20 Leu-Pip-NH2 opgelost, daaraan werd 0,2 g 10 % palladium op actieve kool als katalysator toegevoegd en werd een uur lang waterstofgas in het mengsel geleid. Dan werd de katalysator afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en het residu verwreven met ether. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (1,48 g) 25 werd opgelost in 20 ml water, geklaard met actieve kool en afgefiltreerd. In het heldere filtraat werd 4 g natriumchlori-de opgelost en de oplossing werd driemaal uitgeschud met steeds 10 ml chloroform. De organische fase werd gedroogd met watervrij natriumsulfaat, ingedampt en het amorfe restant 30 werd verwreven met een mengsel van ethylacetaat en ether. Op deze wijze werd 1,33 g Glp-Leu-Pip-NH2 verkregen (87,5 % van de theorie); = 0,60; L _ -86,4° (c = 1, in azijn zuur) .

VOORBEELD II

35 L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-thiazolidine-4-carbon- zuuramide.

Stap 1: L-leucyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide-hydrochloride.

8003766 - 13 -

In 30 ml DMFA werd 1,81 g (11 mmol.) H-Tca-NH2.

HC1 (verg. S. Ratner en H.T. Clarke, J. Am. Chem. Soc. 59, 200 (1937)) opgeslibd en hieraan wordt 3,97 g (10 mmol.) BOC-Leu-OPFP, 1,49 g (11 mmol.) 1-hydroxybenztriazol en 1,22 ml 5 (11 mmol.) N-methylmorfoline toegevoegd. De verkregen oplossing liet men gedurende de nacht bij kamertemperatuur staan en deze werd dan in vacuum ingedampt en het residu werd opgelost in 80 ml chloroform. De oplossing werd achtereenvolgens uitgeschud met 20 ml N zoutzuuroplossing driemaal, driemaal met 10 steeds 20 ml N natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water; werd met watervrij natriumsulfaat gedroogd en in vacuum ingedampt. Het opschuimende amorfe restant wordt opgelost in 5 ml ethylacetaat, waaraan 10 ml 7 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat wordt toegevoegd, welk 15 mengsel men een uur laat staan. Dan wordt het reactiemengsel met ether verdund, het verkregen neerslag wordt afgefiltreerd en in vacuum gedroogd boven watervrij natriumhydroxide. Op deze wijze wordt 1,84 g H-Leu-Tca-NH9.HC1 verkregen (65 % van ^ (5) de op BOC-Leu-OPFP berekende theoretische opbrengst); — 20 0,25; smp. = 170-174°C (ontleding).

Stap 2: benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-Ii-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

In 20 ml DMFA werd 1,69 g (6 mmol.) H-Leu-Tca-25 NH2.HC1 opgeslibd en hieraan werd 2,7 g (6,3 mmol.) Z-Glp-OPFP en 0,84 ml (6 mmol.) triethylamine toegevoegd. Het mengsel werd 20 min. bij kamertemperatuur geroerd en dan in vacuum ingedampt. De verdampingsrest werd opgelost in 50 ml chloroform en uitgeschud met tweemaal 10 ml N-zoutzuuroplos-30 sing, driemaal met 10 ml N natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water. De organische fase werd dan ingedampt, het residu werd met ether verwreven en het verkregen ruwe produkt werd gereinigd door meerdere malen neerslaan uit ethylacetaat/ether. Er wordt op deze wijze 1,64 g 35 Z-Glp-Leu-Tca-NH2 verkregen (56 % van de theorie); smp. = 108-110°C; R^4) = 0,46; = -130,30° (c = 1, in azijn zuur) .

Stap 3: 8003766 - 14 - L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

In 6 ml ijskoude 3/5 N broomwaterstofoplossing in ijsazijn werd 1,62 g (3,3 mmol.) Z-Glp-Leu-Tca-NH2 opgelost en men liet de oplossing 1,5 uur staan bij 0-5°C. Dan werd het 5 reactiemengsel met ether verdund, de bovenfase werd gedecanteerd en de achtergebleven olie werd opgelost in 20 ml water.

De waterige oplossing werd geneutraliseerd met vast natriumwa-terstofcarbonaat en driemaal uitgeschud met 10 ml ether. De waterige fase werd ingedampt in vacuum, het residu opgelost in 10 20 ml chloroform, de oplossing gedroogd met watervrij natrium-sulfaat en ingedampt. Het amorfe residu werd verwreven met ether en gedroogd. Het verkregen ruwe produkt (1,13 g) werd in het loopmiddelmengsel (4) opgelost en gebracht op een zuil, die 20 g silicagel bevatte. De zuil werd geëlueerd met hetzelf-15 de oplossingsmiddelmengsel. Uit het zuivere produkt bevattende fracties werd 0,78 g amorf produkt geïsoleerd. Dit produkt werd in 20 ml water opgelost, de oplossing geklaard met actieve kool en de verkregen waterheldere oplossing gelyofiliseerd. Op deze wijze werd 0,62 g Glp-Leu-Tca-NH2 verkregen (53 % van 20 de theorie); = 0,53; [ = -145,0° (c = 1, in azijn zuur) .

VOORBEELD III

L-pyroglutamyl-L-leucyl-D-prolinamide.

Stap 1: 25 benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-D-prolinamide.

In 20 ml DMFA werd 1,54 g (5,8 mmol.) H-Leu-D-Pro-NH2.HCl opgelost en aan de oplossing werd 0,81 ml (5,8 mmol.) triethylamine en 2,58 g (6 mmol.) Z-Glp-OPFP toegevoegd. Het mengsel werd 5 min. geroerd en dan werd nog een 30 verdere 0,81 ml (5,8 mmol.) triethylamine toegevoegd en na 10 min. verder roeren werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. Het verdampingsresidu werd opgelost in 60 ml chloroform, de oplossing werd gewassen met achtereenvolgens driemaal 15 ml N zoutzuuroplossing, driemaal 15 ml N natriumhydroxide-35 oplossing en eenmaal 15 ml water, dan met watervrij natrium-sulfaat gedroogd en ingedampt. Het amorfe residu werd met ether verwreven. Het verkregen ruwe produkt (2,1 g) werd her-kristalliseerd uit 5 ml ethylacetaat; op deze wijze werd 1,8 g 8003766 -15- Z-Glp-Leu-D-Pro-NH2 verkregen (66 % van de theorie); smp. = 153-157°C; R^ = 0,38; = -24,5° (c = 1, in azijnzuur).

Stap 2: L-pyroglutamyl-L-leucyl-D-prolinamide.

5 In 70 ml methanol werd 1,5 g (3,25 mmol.) Z-Glp-

Leu-D-Pro-NH2 opgelost, aan de oplossing werd 0,3 g 10 % palladium op actieve kool als katalysator toegevoegd en een uur lang werd waterstof door de oplossing geleid. Na het affiltreren van de katalysator werd het filtraat ingedampt en 10 het amorfe residu verwreven met ether. Het verkregen ruwe pro-dukt (0,94 g) werd in water opgelost, de oplossing werd met actieve kool geklaard en afgefiltreerd. Het waterheldere filtraat werd gelyofiliseerd; er werd op deze wijze 0,87 g Glp- (5)

Leu-D-Pro-NH~ verkregen (79 % van de theorie); R' = 0,47; ” *"25 o 15 (_ o_7q = +8,4° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD IV

L-pyr°glutamyl-L-norvalyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

Stap 1; 20 L-norvalyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide-hydrochloride.

In 60 ml ether werd 8,0 g (20 mmol.) BOC-Nva-OH-DCHA opgeslibd, hieraan werd 20 ml 2 N zwavelzuuroplossing toegevoegd en geschud tot oplossing van de vaste stof. De fasen werden gescheiden, de etherfase uitgeschud met 20 ml 25 2 N zwavelzuuroplossing en met 20 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. De als residu verkregen olie werd opgelost in 40 ml DMFA, aan de oplossing werd 2,8 ml (20 mmol.) triethylamine toegevoegd, afgekoeld op -15°C en onder roeren werd druppelsgewijs 2,5 ml (20 mmol.) pivaloyl-30 chloride toegevoegd in een zodanig tempo, dat daarbij de temperatuur van het reactiemengsel beneden -15°C bleef. De op deze wijze verkregen suspensie werd bij dezelfde temperatuur nog 10 min. geroerd.

Gedurende deze tijd werd in 30 ml DMFA 3,72 g 35 (22 mmol.) H-Tca-NH2.HC1 opgeslibd, hieraan werd 3,1 ml (22 mmol.) triethylamine toegevoegd, het ontstane neerslag werd afgefiltreerd en het filtraat van de op deze wijze voorbereide oplossing van het gemengde anhydride werd bij -5°C druppelsge- 8003766 - 16 - wijs toegevoegd. Na de beëindiging van de toevoeging werd het reactiemengsel nog 30 min. bij -10°C geroerd, waarna men het gedurende de nacht in de koelkast liet staan en op de volgende dag het in vacuum indampte. Het verdampintsrestant werd in 100 5 ml chloroform opgelost, de oplossing werd uitgeschud driemaal met 20 ml N zoutzuuroplossing, aansluitend driemaal met 20 ml N natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 20 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. Het olie-achtige residu werd opgelost in 20 ml ethylacetaat, de 10 oplossing werd tot beneden 5°C afgekoeld en er werd 20 ml 5 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat aan toegevoegd. Het reactiemengsel werd een uur lang in een ijsbad gehouden en dan met ether verdund. Het ontstane neerslag, werd afgefiltreerd en in vacuum boven watervrij natriumhydroxide gedroogd. Op deze wij-15 ze werd 3,77 g·H-Nva-Tca-NH9.HC1 verkregen (70 % van de op Δ (5) BOC-Nva-OH.DCHA berekende theoretische opbrengst); R^ = 0,20. Stap 2: benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

20 In 50 ml DMFA werd 2,8 g (10,5 mmol.) H-Nva-Tca- N^.HCl opgeslibd en hieraan werd onder roeren 1,47 ml (10,5 mmol.) triethylamine en 5,15 g (12 mmol.) Z-Glp-OPFP toegevoegd. Het reactiemengsel werd na 5 min. vermengd met nog eens 1,47 ml (10,5 mmol.) triethylamine, er werd nog 10 min. verder 25 geroerd en dan in vacuum ingedampt. Het restant werd opgelost in 100 ml chloroform, de oplossing werd uitgeschud driemaal met 20 ml N zoutzuuroplossing, driemaal met 20 ml natriumwa-terstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 20 ml water, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en ingedampt. Het amorfe 30 restant werd verwreven met ether en het verkregen ruwe produkt (4,6 g) herkristalliseerd uit een mengsel van ethylacetaat en ether. Op deze wijze werd 3,2 g Z-Glp-Nva-Tca-NH9 verkregen n Mi ^ - -26 (64 % van de theorie); smp. = 116-118 C; = 0,45; (_ o_/D = -129,0° (c = 1, in azijnzuur).

35 Stap 3: L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

In 20 ml ijskoude 3,5 N broomwaterstof-ijsazijnop-lossing werd 4,76 g (10 mmol.) Z-Glp-Nva-Tca-NH2 opgelost en 8003766 - 17 - de oplossing liet men 1,5 uur staan bij 0-5°C. Dan werd het reactiemengsel met ether verdund en de afgescheiden olie van het oplosmiddel door decanteren gescheiden. De verkregen olie werd opgelost in 50 ml water, de oplossing werd geneutraliseerd 5 door toevoeging van vast natriumwaterstofcarbonaat en driemaal uitgeschud met 20 ml ether. De waterige fase werd ingedampt, het restant werd opgelost in 100 ml chloroform, de oplossing werd met watervrij natriumsulfaat gedroogd, ingedampt en het restant werd met ether verwreven. Het verkregen ruwe produkt 10 (3 g) werd op een uit 80 g silicagel vervaardigde zuil gebracht en geëlueerd met het oplosmiddelmengsel (4). Uit de fracties, die het zuivere produkt bevatten, werd 2,18 g amorf produkt geïsoleerd, dit werd in 40 ml water opgelost, de oplossing werd met actieve kool geklaard en de waterheldere oplos-15 sing werd gelyofiliseerd. Er werd op deze wijze 1,84 g Glp-

Nva-Tca-NH9 verkregen (54 % van de theorie); R.i^ = 0,50; - -25 Δ o r / q_/D = -145,6 (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD V

L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-leucinamide.

20 Stap 1: tert-butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-leucine-methylester.

Het uit 8,0 g (20 mmol.) DCHA-zout op de in voorbeeld IV, stap 1, beschreven wijze in vrijheid gestelde BOC-Nva-OH en 3,82 g (21 mmol.) H-Leu-OMe.HC1 werden in 60 ml 25 chloroform opgelost en aan de oplossing werd eerst 2,94 ml (21 mmol.) triethylamine en dan onder ijskoeling en roeren de oplossing van 4,33 g (21 mmol.) DCC in 40 ml chloroform toegevoegd. Het reactiemengsel liet men gedurende de nacht bij 5°C staan, dan werd het afgescheiden DCU afgefiltreerd, het 30 filtraat driemaal met steeds 30 ml N zoutzuuroplossing uitgeschud, dan driemaal met 30 ml N natriumwaterstofcarbonaatop-lossing en tenslotte eenmaal met 30 ml water, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en ingedampt. Het kristallijne residu werd verwreven met n-hexaan, af gefiltreerd en het verkregen· . 35 ruwe produkt (6,65 g) herkristalliseerd uit een mengsel van 5 ml ethylacetaat en 20 ml petroleumether. Er werd op deze wijze 5,20 g BOC-Nva-Leu-OMe verkregen (75 % van de theorie); smp. - 100-101°C; R^2) = 0,84; Z\7p5 = -47,5° (o = 1, in 80Θ3766 - 18 - methanol).

Stap 2: tert-butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-leucinamide.

In 50 ml methanol werd 5,0 g (14,5 mmol.) BOC-5 Nva-Leu-OMe opgelost, de oplossing werd met ijs gekoeld en in de gekoelde oplossing werd een half uur lang ammoniakgas geleid. Men liet de oplossing dan gedurende de nacht bij kamertemperatuur staan, dan werd opnieuw afgekoeld, weer met ammoniakgas verzadigd, men liet 4 uur lang staan en dan werd de 10 oplossing ingedampt. Het kristallijne residu werd herkristal-liseerd uit een mengsel van ethylacetaat en ether. Op deze wijze werd 4,37 g BOC-Nva-Leu-NH2 verkregen (91 % van de theorie); smp. = 158-159°C; R^2)= 0,60; ί\7^ = -48,7° (c = 1, in methanol).

15 Stap 3: L-novalyl-L-leucinamide-hydrochloride.

In 15 ml ethylacetaat werd 4,12 g (12,5 mmol.) BOC-Nva-Leu-NH2 opgeslibd en aan de suspensie werd 20 ml 6 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat toegevoegd. Het mengsel 20 liet men een uur lang staan, dan werd het met ether verdund; het verkregen neerslag werd afgefiltreerd en het ruwe produkt (3,64 g) werd herkristalliseerd uit 25 ml methanol. Op deze wijze werd 2,75 g H-Nva-Leu-NH2·HC1 verkregen (83 % van de theorie); Smp. = 215-216°C; = 0,45; l\7^5 = -3,47° (c = 25 1, in methanol).

Stap 4: benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-leucinamide.

In 30 ml DMFA werd 2,67 g (10 mmol.) H-Nva-Leu-NH2.HC1 opgelost. Aan de oplossing werd eerst 1,4 ml (10 mmol.) 30 triethylamine toegevoegd en dan na het affiltreren van het ontstane neerslag 4,72 g (11 mmol.) Z-Glp-OPFP. Na 15 min. werd nog eens 1,4 ml (10 mmol.) triethylamine toegevoegd en na nog eens 10 min. werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. Het residu werd met ether verwreven en het op deze wijze verkregen 35 ruwe produkt (5,5 g) uit ethanol herkristalliseerd. Er werd zo 3,84 g Z-Glp-Nva-Leu-NH2 verkregen (81 % van de theorie); smp. = 24l-242°C; R^4) = 0,55; Z\7q5 = -62,6° (c = 1, in azijnzuur).

8003766 - 19 -

Stap 5: L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-leucinamide.

In 200 ml azijnzuur werd 3,8 g (8 mmol.) Z-Glp-Nva-Leu-NH2 opgelost, aan de oplossing werd 0,8 g 10 % palla-5 dium op actieve kool als katalysator toegevoegd en een uur lang werd door het mengsel waterstofgas geleid. Dan werd de katalysator afgefiltreerd en het gelachtige residu met ether verwreven. Op deze wijze werd 2,7 g Glp-Nva-Leu-NH2 verkregen (99 % van de theorie); smp. = 240°C (ontleding); rI^ = 0,57; mm Λ p _ “ 10 L “7q = "55,8° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD VI

L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-isoleucinamide.

Stap 1: tert-butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-isoleucinamide.

15 In 30 ml DMFA werd 3,7 g (19 mmol.) H-Ile-NH2.HCl opgelost, aan de oplossing werd onder roeren 2,7 ml (19 mmol.) triethylamine en 6,63 g (18,3 mmol.) BOC-Nva-OPFP toegevoegd en na 5 min. werd nog eens 2,4 ml (17,3 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na nog eens 10 min. werd het reactiemengsel in 20 vacuum ingedampt, het restant opgelost in 100 ml chloroform, de oplossing tweemaal met steeds 20 ml N zoutzuuroplossing, dan driemaal met steeds 20 ml N natriumwaterstofcarbonaatop-lossing en tenslotte eenmaal met 20 ml water uitgeschud, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en ingedampt. Het kristal-25 lijne residu werd met ether verwreven en gedroogd. Op deze wijze werd 4,7 g BOC-Nva-Ile-NH2 verkregen (83 % van de theorie); smp. = 192-194°C; R^2' = 0,60; = -43,7° (c = 1, in methanol).

Stap 2: 30 L-norvalyl-L-isoleucinamide-hydrochloride.

In 20 ml ethylacetaat werd 4,5 g (13,7 mmol.) BOC-Nva-Ile-NH2 opgeslibd en aan de suspensie werd 12 ml 6 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat toegevoegd. Het reactiemengsel liet men een uur lang staan en dan werd het met ether ver-35 dund. Het ontstane neerslag werd door filtreren afgescheiden en het op deze wijze verkregen ruwe produkt (3,6 g) werd her-kristalliseerd uit een mengsel van methanol en ether. Op deze wijze werd 3,5 g H-Nva-Ile-NH2.HCl verkregen (96 % van de 8003766 - 20 - theorie) ? srap. = 254-255°C; = 0,45; [ aj^ = +3,8° (c = 1, in methanol) .

Stap 3: benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-isoleucinamide.

5 In 40 ml DMFA werd 3,3 g (12,4 mmol.) H-Nva-Ile- NH2·HC1 opgelost en aan de oplossing werd onder roeren 1,74 ml (12,4 mmol) triethylamine en 5,85 g (13,6 mmol.) Z-Glp-OPFP toegevoegd. Na 5 min. werd nog eens 1,74 ml (12,4 mmol.) triethylamine toegevoegd. Het na enige seconden gelachtig stol-10 lende reactiemengsel werd met ether verdund en verroerd, 2 uur lang in de koelkast gezet en dan afgefiltreerd. Op deze wijze verkreeg men 5,1 g Z-Glp-Nva-Ile-NH2 (86 % van de theorie); smp. = 252-253°C; R^4) = 0,60; L\7^ = -57,5° (c = 1, in azijnzuur).

15 Stap 4: L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-isoleucylamide.

In 200 ml azijnzuur werd 4,75 g (10 mmol.) Z-Glp-Nva-Ile-NH2 opgelost en na toevoeging van 1 g 10 % palladium op actieve kool als katalysator werd een uur lang waterstofgas 20 door de oplossing geleid. Na de beëindiging van de hydrering werd de katalysator door filtreren afgescheiden, het filtraat werd ingedampt en het restant werd met ether verwreven. Er werd op deze wijze 3,34 g Glp-Nva-Ile-NH2 verkregen (98 % van de theorie); smp. = 267-270°C (ontleding); R^^ = 0,61; 25 ^ °l7q^ = “50,2° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD VII

L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-methionineamide.

Stap 1: tert-butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-methionine-methylester.

30 Uit 4,78 g (12 mmol.) DCHA-zout werd het BOC-Nva- OH in vrijheid gesteld op de in voorbeeld IV, stap 1, beschreven wijze en met 2,6 g (13 mmol.) H-Met-OMe.HC1 in 40 ml chloroform opgelost. Aan de oplossing werd eerst 1,82 ml (13 mmol.) triethylamine en dan onder ijskoeling en roeren de op-35 lossing van 2,58 g (12,5 mmol.) DCC in 20 ml chloroform toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende de nacht bij 5°C bewaard, dan werd het afgescheiden DCÜ afgefiltreerd, het filtraat uitgeschud, driemaal met steeds 20 ml N zoutzuuroplos- 8003766 - 21 - sing, driemaal met steeds 20 ml N natriumwaterstofcarbonaatop-lossing en tenslotte eenmaal met 20 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. Het olie-achtige residu werd door toevoeging van petroleumether tot kristalliseren 5 gebracht. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (3,42 g) werd uit een mengsel van ethylacetaat en petroleumether her-kristalliseerd. Er werd op deze wijze 3,08 g BOC-Nva-Met-OMe verkregen (71 % van de theorie); smp. = 69-70°C; rI2^ = 0,81; - -25 o 1 [_ a_/D = -42,7 (c = 1, in methanol).

10 Stap 2: tert-butyloxycarbonyl-L-norvalyl-L-methioninamide.

In 20 ml methanol werd 1,81 g (5 mmol.) BOC-Nva-Met-OMe opgelost en onder koeling werd een half uur lang ammoniakgas in de oplossing geleid. Het reactiemengsel liet 15 men gedurende de nacht bij kamertemperatuur staan en dan werd het enige uren in de koelkast gehouden. Het afgescheiden kris-tallijne produkt werd afgefiltreerd (1,27 g) ; het filtraat werd ingedampt, het restant werd herkristalliseerd uit 5 ml ethanol en verenigd met de op de boven aangegeven wijze verkre-20 gen hoofdmassa van het produkt. Er werd zo in totaal 1,62 g „ BOC-Nva-Met-N^ verkregen (93 % van de theorie); smp. = 166-167°C; R^2) = 0,57; L~<Ü^ = -40,9° (c = 1, in methanol).

Stap 3: L-norvalyl-L-methioninamide-hydrochloride.

25 In 20 ml ethylacetaat werd 4,5 g (13 mmol.) BOC-

Nva-Met-lSffi^ opgeslibd en hieraan werd 20 ml 6 N zoutzuuroplos-sing in ethylacetaat toegevoegd. Het reactiemengsel liet men een uur lang bij kamertemperatuur staan, dan werd het verdund met ether, het verkregen neerslag werd afgefiltreerd en in 30 vacuum gedroogd boven watervrij natriumhydroxide. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (4 g) werd herkristalliseerd uit een mengsel van methanol en ether. Op deze wijze werd 3,28 g H-Nva-Met-NH2.HC1 verkregen (89 % van de theorie); smp. = 198-200°C; r|5) = 0,40; £\7*5 = +10,2° (c = 1, in methanol).

35 Stap 4; tert-butyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-norvalyl-L-methionine- amide.

In 40 ml DMFA werd 2,84 g (10 mmol.) H-Nva-Met-NH2.HCI opgeslibd en hieraan werd onder roeren 1,4 ml (10 fl A A 3 7 6 6 - 22 - mmol.) triethylamine en 4,53 g (11 mmol.) BOC-Gln-OPFP toege-voegd. Na 5 min. werd nog eens 1,4 ml (10 mmol.) triethylamine toegevoegd en na nog eens 10 min. roeren werd de verkregen dikke suspensie in vacuum ingedampt. Het vaste verdampingsre-5 sidu werd verwreven met ethanol en het op deze wijze verkregen ruwe produkt (4,82 g) opgekookt met 50 ml ethanol. Na het afkoelen werd de suspensie enkele uren in de koelkast bewaard en dan afgefiltreerd. Op deze wijze werd 4,08 g BOC-Gln-Nva-Met-NH£ verkregen (86 % van de theorie); smp. = 237-238°C; 10 = 0,43; / a?^ = -37,1° (c = 1, in azijnzuur).

Stap 5: L-pyroglutamyl-L-norvaly1-L-methioninamide.

In 100 ml 98 % mierezuur werd 3,8 g (8 mmol.) BOC-Gln-Nva-Met-NH2 opgelost, de oplossing liet men 2 uur bij 15 kamertemperatuur staan en dan werd in vacuum ingedampt. De als residu verkregen olie werd opgelost in 50 ml azijnzuur, deze oplossing werd 2 min. gekookt en dan in vacuum opnieuw ingedampt. Het gelachtige residu werd met ether verwreven en afgefiltreerd. Op deze wijze werd 2,8 g Glp-Nva-Met-NH2 verkregen 20 (98 % van de theorie); smp. = 249-250°C (ontleding); r1^ = 0,58? ta-/-Q = “48,4° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD VIII

N-(L-pyroglutamyl-L-leucyl)-pyrrolidine.

Stap 1: 2 5 N-(L-leucy1)-pyrrolidine-hydrochloride.

In 50 ml ethylacetaat werd 3,46 g (15 mmol.) BOC-Leu-OH opgelost en aan de oplossing werd 2,1 ml (15 mmol.) triethylamine toegevoegd en afgekoeld tot -15°C. Dan werd onder roeren bij beneden -10°C 1,97 ml (16 mmol.) pivaloyl-30 chloride druppelsgewijs toegevoegd. De verkregen suspensie werd nog 10 min. verder geroerd en dan werd bij dezelfde temperatuur 1,37 ml (16,5 mmol.) pyrrolidine druppelsgewijs toegevoegd en het mengsel nog een half uur geroerd bij -10°C en aansluitend liet men het drie uur staan bij 5°C. De verkregen 35 oplossing werd driemaal met steeds 10 ml N zoutzuuroplossing, aansluitend driemaal met steeds 10 ml N natriumwaterstofcarbo-naatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water uitgeschud, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en in vacuum ingedampt.

800 3 7 66 - 23 -

De als residu verkregen olie werd opgelost in 5 ml ethylace-taat en er werd 10 ml 5 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat aan toegevoegd. Het mengsel liet men een uur lang staan, dan werd het met ether verdund en met water uitgeschud. De wateri-5 ge fase werd met etner gewassen, met kaliumcarbonaat alkalisch gemaakt en met chloroform geëxtraheerd. De chloroformoplossing werd afgescheiden, met watervrij natriumsulfaat gedroogd en ingedampt. Het olie-achtige residu werd in 10 ml ether opgelost, de pH-waarde van de oplossing werd met geconcentreerde 10 zoutzuuroplossing in ethylacetaat ingesteld op 3 en het afgescheiden kristallijne produkt werd afgefiltreerd. Op deze wijze werd 2,41 g H-Leu-pyrrolidine.HC1 verkregen (73 % van de theorie); smp. = 170-174°C (ontleding); R^^ = 0,37.

Stap 2; 15 N-(benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl)-pyrrolidine.

In 20 ml chloroform werden 1,7 g (7,7 mmol.) H-leu-pyrrolidine.HCl, 3,0 g (7 mmol.) Z-Glp-OPFP en 1,08 ml (7,7 mmol.) triethylamine opgelost en na 5 min. werd nog eens 0,98 ml (7 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na nog verdere 5 20 min. werd de oplossing verdund met 30 ml chloroform, uitgeschud tweemaal met telkens 10 ml N zoutzuuroplossing, dan driemaal met telkens 10 ml N natriumwaterstofcarbonaatoplos-sing en tenslotte eenmaal met 10 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. Het olie-achtige residu 25 werd met n-hexaan tot kristalliseren gebracht en het op deze wijze verkregen ruwe produkt (2,85 g) werd herkristalliseerd uit een mengsel van ethanol en ether. Op deze wijze werd 2,14 g Z-Glp-Leu-pyrrolidine verkregen (71 % van de theorie); smp.= 109-110°C; = 0,55; {_ = ”53,3° (c = 1, in azijnzuur).

30 Analyse voor C23H3i°5N3 (mol.gew. 429,52): berekend: C 64,32 %, H 7,27 %, N 9,78 %; gevonden: C 64,31 %, H 7,47 %, N 9,78 %.

Stap 3: N-(1-pyroglutamyl-L-leucyl)-pyrrolidine.

35 In 40 ml methanol werd 2,0 g (4,66 mmol.) Z-Glp-

Leu-pyrrolidine opgelost, aan de oplossing werd 0,4 g palla-dium-actieve-kool-katalysator toegevoegd en een uur lang werd waterstofgas door de oplossing geleid. Na het affiltreren van flflfl 3 7 66 - 24 - de katalysator werd het filtraat ingedampt, de als residu verkregen olie opgelost in ether, de oplossing gedurende de nacht in de koelkast gezet, dan werden de afgescheiden kristallen door filtreren afgescheiden. Er werd op deze wijze 1,25 g 5 Glp-Leu-pyrrolidine verkregen (91 % van de theorie); smp. = 103-104°C; = 0,65; [_ α_7^5 = “31,6° (c = 1, in azijnzuur).

Aminozuuranalyse: Glu 1,00 (1,0), Leu 1,00 (1,0).

VOORBEELD IX

N-(L-pyroglutamyl-L-leucyl)-piperidine.

10 Stap 1: N-(L-leucyl)-piperidine-hydrochloride.

In 50 ml ethylacetaat werd 3,46 g (15 mmol.) BOC-. Leu-OH opgelost, aan de oplossing werd 2,1 ml (15 mmol.) triethylamine toegevoegd en deze werd afgekoeld tot -15°C. Bij 15 deze temperatuur werd onder roeren eerst 1,97 ml (16 mmol.) pivaloylchloride en dan na 10 min. 1,65 ml (16,5 mmol.) piperidine druppelsgewijs toegevoegd. Na het beëindigen van de toevoeging werd het reactiemengsel nog een half uur geroerd bij -10°C en dan gedurende de nacht in de koelkast bewaard.

20 Het neerslag werd dan afgefiltreerd, het filtraat driemaal uitgeschud met 10 ml N zoutzuuroplossing, eveneens driemaal met 10 ml N natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water, dan gedroogd met watervrij natrium-sulfaat en ingedampt; De als residu verkregen olie werd in 15 25 ml 4 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat opgelost, de oplossing liet men een uur staan en dan werd met ether verdund en liet men deze gedurende de nacht in de koelkast staan. De volgende dag werd het als neerslag verkregen produkt door filtreren afgescheiden. Op deze wijze werd 2,0 g H-Leu-piperidine.

30 HC1 verkregen (57 % van de op BOC-Leu-OH berekende theoretische opbrengst); smp. = 123-125°C; R^^ = 0,45.

Stap 2: N-(benzyloxycarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl)-piperidine.

In 20 ml chloroform werd 1,81 g (7,7 mmol.) H-Leu-35 piperidine.HC1, 3,0 g (7 mmol.) Z-Glp-OPFP en 1,08 ml (7,7 mmol.) triethylamine opgelost en na 5 min. staan werd nog eens 0,98 ml (7 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na een verdere 5 min. werd de oplossing verdund met 30 ml chloroform, tweemaal 8003766 - 25 - uitgeschud met steeds 10 ml N zoutzuuroplossing, driemaal met _ steeds 10 ml N natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water, dan gedroogd met watervrij natrium-sulfaat en ingedampt. De als residu verkregen kristalliserende 5 olie werd verwreven met een mengsel van ether en n-hexaan. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (2,75 g) werd herkristal-liseerd uit een mengsel van ethanol en ether; er werd 2,21 g Z-Glp-Leu-piperidine verkregen (71 % van de theorie); smp. = 113-115°C; R^4) = 0,69; faj^5 = “42,5° (c = 1, in azijnzuur).

10 Analyse voor C24H33°5N3 (mol*9ew* 443,55): berekend: C 64,99 %, H 7,50 %, N 9,47 %; gevonden: C 64,90 %, H 7,72 %, N 9,53 %.

Stap 3: N-(L-pyroglutamyl-L-leucyl)-piperidine.

15 In 40 ml methanol werd 2,0 g (4,51 mmol.) Z-Glp-

Leu-piperidine opgelost, dan werd 0,4 g 10 % palladium op actieve kool als katalysator toegevoegd en werd een uur lang waterstofgas door de oplossing geleid. Na het affiltreren van de katalysator werd het filtraat ingedampt en het residu met 20 ether tot kristalliseren gebracht. Op deze wijze werd 1,12 g Glp-Leu-piperidine verkregen (81 % van de theorie); smp. = 99-l00°C; R^5) = 0,71; faJ^5 = +30,4° (c = 1, in azijnzuur).

Aminozuuranalyse: Glu 0,95 (1,0), Leu 1,00 (1,0). VOORBEELD X

25 L-thiazolidine-4-carbonyl-L-leucyl-L-prolinamide.

Stap 1: L-thiazolidine-4-carbonyl-L-leucyl-l-prolinamide.

In 60 ml ethylacetaat werd 5,13 g (22 mmol.) BOC-Tcal-OH en 4,05 g (22 mmol.) PFPOH opgelost en aan de oplos-30 sing werd onder ijskoeling en roeren 4,12 g (20 mmol.) DCC toegevoegd. Het reactiemengsel werd 2 uur lang bij 0-5°C geroerd, dan werd het DCU afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en het residu opgelost in 50 ml n-hexaan. De oplossing werd 5 maal uitgeschud met steeds 25 ml N natriumwaterstofcarbo-35 naatoplossing en aansluitend eenmaal met 25 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. De op deze wijze verkregen 7,32 g olie-achtige BOC-Tca-OPFP werd in 20 ml DMFA opgelost en aan de oplossing werd de suspensie van 5,23 g 800 37 66 - 26 - (20 mmol.) H-Leu-Pro-NH2.HC1 in 30 ml DMFA toegevoegd, dan werd aan dit mengsel onder ijskoeling en roeren nog 2,8 ml (20 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na 5 min. werd nog eens 2,8 ml (20 mmol.) triethylamine toegevoegd, waarna het mengsel 5 20 min. nog verder werd geroerd en dan in vacuum ingedampt.

De als residu verkregen olie werd in 100 ml chloroform opgelost, de oplossing werd driemaal uitgeschud met steeds 30 ml N zoutzuur, driemaal met steeds 30 ml N natriumwaterstofcarbo-naatoplossing en tenslotte eenmaal met 30 ml water, gedroogd 10 met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. De als residu verkregen 8,84 g olie-achtige BOC-Tca-Leu-Pro-NH2 werd in 15 ml ethylacetaat opgelost en aan de oplossing werd 15 ml 6 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat toegevoegd. Het reactiemeng-sel liet men een uur lang staan, dan werd het met ethylacetaat 15 verdund, het ontstane neerslag werd verwreven en afgefiltreerd en dan in vacuum gedroogd boven watervrij natriumhydroxide.

De op deze wijze verkregen 8,05 g tripeptideamide-hydrochlori-de werd in 80 ml water opgelost, de oplossing werd driemaal uitgeschud met steeds 20 ml ether, dan werd de pH-waarde van 20 de waterige oplossing op 8 ingesteld met natriumwaterstofcar-bonaat en werd de alkalisch gemaakte oplossing 5 maal geëxtraheerd met steeds 20 ml chloroform. De verenigde chloroform-extracten werden met watervrij natriumsulfaat gedroogd en ingedampt. De verdampingsrest werd met ether verwreven en ge-25 droogd. Er werd op deze wijze 5,20 g H-Tca-Leu-Pro-NH2 verkregen (76 % van de theorie); smp. = 159-160°C; r!^ = 0,63; l_ a_7p = -162,9° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD XI

L-2-ketoimidazolidine-4-carbonyl-L-prolinamide.

30 Stap 1: benzyloxycarbonyl-L-2-ketoimidazolidine-4-carbonzuur-penta-fluorfenylester.

In 100 ml van een 1 ; 2 mengsel van DMFA en dio-xaan werd 10,56 g (40 mmol.) Z-Kic-OH en 9,09 g (44 mmol.) 35 PFP-OH opgelost en de oplossing werd onder ijskoeling en roeren verenigd met 9,06 g (44 mmol.) DCC. Het reactiemengsel werd bij 0-5°C 1,5 uur lang geroerd, dan werd het DCU afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en de als residu verkregen 800 3766 - 27 - olie met n~hexaan tot kristalliseren gebracht. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (16,46 g) werd nerkristalliseerd uit 50 ml ethylacetaat. Er werd 12,75 g Z-Kic-OPFP verkregen (74 % van de theorie); smp. = 146-148°C; R.i^ = 0,53; - -25 o r 5 £ a_/D = -42,1 (c = 1, in ethylacetaat).

Analyse voor cigHll05N2F5 (m°l*9ew· 430,29): berekend: C 50,25 %, H 2,58 %, N 6,51 %, F 22,08 % gevonden: C 49,88 %, H 2,35 %, N 6,66 %, F 21,81 %.

Stap 2: 10 benzyloxycarbonyl-L-2-ketoimidazolidine-4-carbonyl-L-leucyl-L-prolinamide.

In 30 ml DMFA werd 2,38 g (9 mmol.) H-Leu-Pro-NH2.HC1 opgeslibd en hieraan werd 3,87 g (9 mmol.) Z-Kic-OPFP en 1,26 ml (9 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na 5 min. roe-15 ren werd nog eens 1,26 ml (9 mmol.) triethylamine toegevoegd en na 20 min. verder roeren werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. De verdampingsrest werd opgelost in 50 ml chloroform, de oplossing werd uitgeschud tweemaal met steeds 10 ml N zoutzuur, driemaal met steeds 10 ml N natriumwaterstofcar-20 bonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water, dan gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. De als residu verkregen olie werd met ether tot kristalliseren gebracht en afgefiltreerd. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (3,31 g) werd opgekookt met 30 ml ethylacetaat; na het 25 afkoelen werd de opslibbing enkele uren lang in de koelkast gezet en dan afgefiltreerd. Er werd 3,0 g Z-Kic-Leu-Pro-NH2 verkregen (70 % van de theorie); smp. = 172-174°C; =

O C

0,18; / a_/D = -102,6° (c = 1, in azijnzuur).

Analyse voor C23H3i0gN5 (mol.gew. 473,50): 30 berekend: C 58,34 %, H 6,60 %, N 14,79 %; gevonden: C 57,52 %, H 6,62 %, N 14,62 %.

Stap 3: L-2-ketoimidazolidine-4-carbonyl-L-leucyl-L-prolinamide.

In 30 ml water werd 1,2 g (2,54 mmol.) Z-Kic-Leu-35 Pro-NH2 opgelost, aan de oplossing werd 0,25 g 10 % palladium op actieve kool als katalysator toegevoegd en 4 uur lang werd waterstofgas door het mengsel geleid. Dan werd de katalysator afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en het amorfe residu in 800 37 66 - 28 - vacuum gedroogd boven watervrij fosforpentoxide. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (0,75 g) werd opgelost in water, de oplossing werd geklaard met actieve kool en de waterheldere oplossing werd gelyofiliseerd. Er werd 0,61 g Kic-Leu-Pro-5 NH2 verkregen (71 % van de theorie); = 0,35; j_ a.7^ = -90,4° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD XII

L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-leucyl-L-prolin- amide.

10 Stap 1: L-6-ketopipecolinezuur-pentafluorfenylester.

In 100 ml chloroform werd 4,3 g (30 mmol.) L-6-ketopipecolinezuur en 6,07 g (33 mmol.) PFPOH opgelost en aan de oplossing werd onder ijskoeling en roeren 6,8 g (33 mmol.) 15 DCC toegevoegd. Het mengsel werd een uur lang bij 0°C geroerd, dan gedurende de nacht in de koelkast gelaten. De volgende dag werd het afgescheiden DCü afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en het kristallijne residu verwreven met n-hexaan. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (9,87 g) werd in 20 ml 20 ethylacetaat opgelost, de oplossing werd een uur lang in de koelkast bewaard, dan met actieve kool geklaard, afgefiltreerd en ingedampt. De als residu verkregen olie werd opgelost in een mengsel van 5 ml ethylacetaat en 20 ml n-hexaan, de oplossing werd gedurende de nacht in de koelkast gelaten en de 25 volgende dag werden de afgescheiden kristallen door filtreren afgescheiden. Er werd op deze wijze 6,34 g Kpc-OPFP verkregen (68,5 % van de theorie); smp. = 96-98°C; / ~ +30,0° (c = 1, in ethylacetaat).

Analyse voor C^HgOgNFj. (mol.gew. 309,20); 30 berekend; C 46,62 %, H 2,61 %, N 4,53 %, F 30,72 % gevonden: C 46,37 %, H 2,88 %, N 4,26 %, F 30,51 %. Stap 2: L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-leucyl-L-prolinamide.

In 20 ml DMFA werd 1,32 g (5 mmol.) H-Leu-Pro-N^. 35 HCl opgeslibd en daaraan werd onder ijskoeling en roeren 1,61 g (5,2 mmol.) Kpc-OPFP en 0,7 ml (5 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na 5 min. roeren werd nog eens 0,7 ml (5 mmol.) triethylamine toegevoegd en na 20 min. verder roeren werd het 800 3)66 - 29 - reactiemengsel in vacuum ingedampt. Het kristallijne residu werd met ether verwreven, de kristallen werden afgefiltreerd, op het filter met ether en met koude chloroform gewassen en gedroogd. Er werd op deze wijze 1,27 g Kpc-Leu-Pro-NH., ver- 5 kregen (72 % van de theorie); smp. = 214-216 C; Ri = 0,41; - -25 o r (_ α_/β = -83 (c = 1, in azijnzuur).

Aminozuuranalyse: a-amino-adipinezuur 0,99 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 0,98 (1,0).

VOORBEELD XIII

10 L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L- prolinamide.

In 30 ml DMFA werd 2,38 g (9,5 mmol.) H-Nva-Pro-NH2.HC1 opgeslibd en daaraan werd onder ijskoeling en roeren 30,09 g (10 mmol.) Kpc-OPFP en 1,33 ml (9,5 mmol.) triethyl-15 amine toegevoegd. Na 5 min. roeren werd nog eens 1,33 ml (9,5 mmol.) triethylamine toegevoegd en na 20 min. verder roeren werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. Het kristallijne residu werd met ether verwreven, afgefiltreerd, op het filter gewassen met koude ethanol en gedroogd. Het op deze 20 wijze verkregen ruwe produkt (3,66 g) werd in water opgelost, de oplossing werd met actieve kool geklaard, de waterheldere oplossing ingedampt en het kristallijne residu verwreven met 10 ml ethanol. Het mengsel werd in de koelkast gelaten en dan afgefiltreerd. Er werd 2,10 g Kpc-Nva-Pro-NH2 verkregen (65 % 25 van de theorie); smp. = 192-193°C; R^^ = 0,31; / q_7^= -83,2° (c = 1, in azijnzuur).

VOORBEELD XIV

D-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolinamide.

Stap 1: 30 benzyloxycarbonyl-D-pyroglutaminezuur-pentafluorfenylester.

In 50 ml ethylacetaat werd 4,55 g (18 mmol.) Z-D-Glp-OH en 3,68 g (20 mmol.) PFPOH opgelost en aan de oplossing werd onder ijskoeling en roeren 4,12 g (20 mmol.) DCC toegevoegd. Het reactiemengsel werd een uur lang bij 0°C ge-35 roerd, dan werd het DCU afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en het olie-achtige residu met n-hexaan tot kristalliseren gebracht. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (7,3 g) werd in 20 ml ethylacetaat opgelost, de oplossing een uur lang in de 8003766 - 30 - koelkast gelaten, dan met actieve kool geklaard en ingedampt. De als residu verkregen olie werd opgelost in 5 ml ethylace-taat en door toevoeging van 20 ml n-hexaan werd het produkt neergeslagen. Er werd 6,60 g Z-D-Glp-OPFP verkregen (85 % van 5 de theorie); smp. = 8l-82°C; = 0,84; [_ a_7^ = +40,1° (c = 1, in ethylacetaat).

Analyse voor Ci9H12°5NF5 (m°l*9ew* 429,30): berekend: C 53,16 %, H 2,82 %, N 3,26 %, F 22,13 % gevonden: C 53,28 %, H 3,04 %, N 3,02 %, F 21,86 %. 10 Stap 2: benzyloxycarbonyl-D-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolinamide.

In 50 ml DMFA werd 3,24 g (12,3 mmol.) H-Leu-Pro-NH2.HCI opgeslibd en onder ijskoeling en roeren verenigd met 5,6 g (13 mmol.) Z-D-Glp-OPFP en 1,72 ml (12,3 mmol.) triethyl-15 amine. Na 5 min. roeren werd nog eens 1,72 ml (12,3 mmol.) triethylamine toegevoegd en na nog eens 20 min. roeren werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. Het residu werd opgelost in 120 ml chloroform, de oplossing werd uitgeschud tweemaal met steeds 30 ml N zoutzuur, driemaal met steeds 30 ml 20 N natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 30 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. Het olie-achtige verdampingsresidu werd met ether tot kristalliseren gebracht. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (5,31 g) werd met 50 ml ethylacetaat opgekookt, de 25 verkregen suspensie werd drie uur lang in de koelkast bewaard en dan werd het als neerslag verkregen produkt door filtreren afgescheiden. Er werd 4,61 g Z-D-Glp-Leu-Pro-N^ verkregen (80 % van de theorie); smp. = 189-194°C; r14^ = 0,44; - -25 o r /α/D = -31,2 (c = 1, in azijnzuur).

30 Stap 3: D-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolinamide.

In 200 ml methanol werd 4,48 g (9,5 mmol.) Z-D-

Glp-Leu-pro-NH2 opgelost en aan de oplossing werd 0,9 g 10 % palladium op actieve kool als katalysator toegevoegd, waarna 35 gedurende een uur waterstofgas door het mengsel werd geleid.

Dan werd de katalysator afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en het amorfe verdampingsresidu met ether verwreven. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (3,07 g) werd in water opge- 800 37 66 - 31 - lost, de oplossing werd met actieve kool geklaard en de waterheldere oplossing gelyofiliseerd. Er werd op deze wijze 2,90 g (5) D-Glp-Leu-Pro-NH9 verkregen (90,5 % van de theorie); R' = 0,40; ^ q_7D = -23,6° (c = 1, in azijnzuur).

5 VOORBEELD XV

orotyl-L-histidyl-L-pipecolinezuuramide.

Stap 1: orotyl-L-histidine-methylester.

In 120 ml van een 1 : 1 mengsel van DMFA en dioxaan 10 werd 24,2 g (100 mmol.) H-His-OMe.2HCl opgelost en aan de oplossing werd 17,41 g (100 mmol.) orootzuur-monohydraat toegevoegd. De oplossing werd afgekoeld op 0°C en bij deze temperatuur werd er 11,5 g (100 mmol.) N-hydroxysuccinimide, 11,1 ml (100 mmol.) N-methylmorfoline en tenslotte 20,6 g (100 15 mmol.) DCC aan toegevoegd. Het reactiemengsel werd een uur lang bij 0°C en aansluitend gedurende de nacht bij kamertemperatuur geroerd. De volgende dag werd het reactiemengsel gedurende 2 uur in de koelkast gehouden, dan werd het DCÜ afgefiltreerd en het filtraat ingedampt. De als residu verkregen olie 20 werd door verwrijven met water tot kristalliseren gebracht, de kristallen werden afgefiltreerd en op het filter gewassen met 5 % waterige citroenzuuroplossing en met water. Op deze wijze werd 11,6 g Oro-His-OMe verkregen (38 % van de theorie); smp. = 258-262°C; R^5) = 0,40.

25 Analyse voor ci2Hi3°5N5 (m°l*9ew· 307,27): berekend: N 22,79 %; gevonden: N 22,51 %.

Stap 2: ofotyl-histidine-hydrazide.

30 In 120 ml DMFA werd 9,21 g (30 mmol.) Oro-His-OMe opgelost en aan de oplossing werd 7,35 ml (150 mmol.) hydra-zinehydraat toegevoegd. Het reactiemengsel liet men gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur staan, dan werd het verdund met 100 ml ethylacetaat en werd het gedurende de nacht in de koel-35 kast bewaard. Het afgescheiden neerslag werd dan afgefiltreerd en herkristalliseerd uit methanol. Op deze wijze werd 8,07 g Oro-His-N_H^ verkregen (88 % van de theorie); smp. = 250-260°C; *<5> = o,35: 8003766 - 32 -

Analyse voor C^H O^N^ (mol.gew. 307,28) : berekend: N 31,91 %; gevonden: N 30,75 %.

Stap 3: 5 orotyl-L-histidyl-L-pipecolinezuuramide.

In 135 ml DMFA werd 5,0 g (16,28 mmol.) Oro-His-opgeslibd en hieraan werd 5,99 ml (48,84 mmol.) 8,1 N zoutzuuroplossing in dioxaan toegevoegd. De verkregen oplossing werd afgekoeld tot -15°C en onder roeren werd hieraan 10 2,13 ml (17,9 mmol.) tert-butylnitriet druppelsgewijs toegevoegd. Het reactiemengsel werd dan bij -10°C gedurende 20 min. geroerd, waarop aansluitend bij -10°C 4,56 ml (32,56 mmol.) triethylamine, vervolgens een oplossing van 2,05 g (16,28 mmol.) H-Pip-NH2 in 10 ml DMFA en tenslotte nog eens 2,28 ml 15 (16,28 mmol.) triethylamine druppelsgewijs werden toegevoegd. Na de beëindiging van de toevoeging werd het reactiemengsel nog een uur lang bij -10°C geroerd, en dan liet men het gedurende de nacht bij 2°C staan. De volgende dag werd het afgescheiden neerslag afgefiltreerd, het filtraat in vacuum inge-20 dampt en het restant met ethylacetaat verwreven. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (4,6 g, 74 % van de theorie), werd afgescheiden en 1,3 g van dit produkt werd op een zuil gebracht, die vervaardigd was uit een 1 : 1 mengsel van car-boxymethylcellulose-23 en carboxymethylcellulose-52 en werd 25 geëlueerd met 0,005-0,1 M ammoniumacetaatoplossing (pH = 5).

De fracties die het zuivere produkt bevatten, werden verenigd en gelyofiliseerd. Er werd 820 mg amorf Oro-His-Pip-NH2 verkregen; = 0,10; l a_7^ = -19,0° (c = 1, in water).

Aminozuuranalyse: His 1,00 (1,0), Pip 0,94 (1,0). 30 VOORBEELD XVI

orotyl-L-histidyl-D-pipecolinezuuramide.

In 135 ml DMFA werd 5,0 g (16,28 mmol.) Oro-His-N2H3 opgeslibd en hieraan werd 5,99 ml (48,84 mmol.) 8,1 N zoutzuuroplossing in dioxaan toegevoegd. De verkregen oplos-35 sing werd afgekoeld tot -15°C en onder roeren werd druppelsgewijs 2,13 ml (17,9 mmol.) tert-butylnitriet toegevoegd. Het reactiemengsel werd bij -10°C 20 min.lang geroerd en dan werd bij dezelfde temperatuur druppelsgewijs 4,56 ml (32,56 mmol.) 8003766 - 33- trie thy 1 amine , aansluitend een oplossing van 2,05 g (16,28 mmol.) H-D-Pip-NH2 en tenslotte nog eens 2,28 ml (16,28 mmol.) triethylamine toegevoegd. Na beëindiging van de toevoeging werd het reactiemengsel nog een uur lang bij -10°C geroerd, 5 waarna men het gedurende de nacht bij 2°C in de koelkast liet staan. De volgende dag werd het ontstane neerslag afgefiltreerd, het filtraat in vacuum ingedampt en de verdampingsrest verwreven met ethylacetaat. Op deze wijze werd 4,1 g ruw produkt verkregen (66 % van de theorie); 1,3 g van dit produkt 10 werd op een zuil gebracht, die was vervaardigd uit een 1 : 1 mengsel van carboxymethylcellulose-23 en carboxymethylcellulo-se-52, en geëlueerd met 0,005-0,1 M ammoniumacetaatoplossing (pH = 5). De fracties die het zuivere produkt bevatten, werden verenigd en gelyofiliseerd. Er werd 795 mg amorf Oro-His-D-15 Pip-NH2 verkregen? R^5) = 0,10; = +13,5° (c = 1, in water).

Aminozuuranalyse: His 1,00 (1,0), Pip 0,96 (1,0).

VOORBEELD XVII

orotyl-L-histidyl-L-homoprolinamide.

20 In 135 ml DMFA werd 5,0 g (16,28 mmol.) Oro-His- N2H2 opgeslibd en hieraan werd 5,99 ml (48,84 mmol.) 8,1 N zoutzuuroplossing in dioxaan toegevoegd. De verkregen oplossing werd afgekoeld tot -15°G en hieraan werd onder roeren druppelsgewijs 2,13 ml (17,9 mmol.) tert-butylnitriet toege-25 voegd. Het reactiemengsel werd dan 20 min. bij -10°C geroerd, vervolgens werd bij -10°C na elkaar 4,56 ml (32,56 mmol.) triethylamine, de oplossing van 2,05 g (16,28 mmol.) H-Pro-NH2 in 10 ml DMFA en tenslotte nog 2,28 ml (16,28 mmol.) triethylamine druppelsgewijs toegevoegd. Na de beëindiging van de 30 toevoeging werd het reactiemengsel nog een uur lang bij -10°C geroerd en dan gedurende de nacht in de koelkast gelaten bij 2°C. De volgende dag werd het neerslag afgefiltreerd, het filtraat in vacuum ingedampt en het residu met ethylacetaat verwreven. Van het op deze wijze verkregen ruwe produkt (4,2 g, 35 67 % van de theorie) werd 1,3 g gebracht op een zuil, die was samengesteld uit een 1 : 1 mengsel van carboxymethylcellulose-23 en carboxymethylcellulose-52 en geëlueerd met 0,005-0,1 M ammoniumacetaatoplossing. De fracties die het zuivere produkt 8003766 - 34 - bevatten werden verenigd en gelyofiliseerd. Er werd 802 mg amorf Oro-His-HPro-NH2 verkregen; R^ = 0,10; (_ a_7^ = -12,8° (c = 1, in water).

Aminozuuranalyse: His 1,00 (1,0), HPro 0,91 (1,0).

5 VOORBEELD XVIII

L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

In 30 ml DMFA werd 2,55 g (9,5 mmol.) H-Nva-Tca-NH2.HCI opgeslibd en hieraan werd onder ijskoeling en roeren 10 3,09 g (10 mmol.) Kpc-OPFP en 1,33 ml (9,5 mmol.) triethyl-amine toegevoegd. Na 5 min. roeren werd nog eens 1,33 ml (9,5 mmol.) triethylamine toegevoegd en na een verdere 20 min. roeren werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. De als residu verkregen olie werd gedurende de nacht in de koelkast gehouden 15 en daardoor tot kristalliseren gebracht. De volgende dag wer- den de kristallen afgefiltreerd, en met ether en met koude ethanol gewassen. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (3,25 g) werd opgelost in water, de oplossing werd geklaard met actieve kool, de waterheldere oplossing werd ingedampt, 20 het kristallijne residu werd met 20 ml ethanol verwreven en gedurende de nacht in de koelkast gelaten. De volgende dag werd het verkregen produkt afgefiltreerd en gedroogd. Er werd 2,0 g Kpc-Nva-Tca-NH2 verkregen (59 % van de theorie); smp. = 183-185°C; R^5^ = 0,47; ~ -136,0° (c = 1, in azijnzuur).

25 VOORBEELD XIX

L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L-homoprolinamide.

Stap 1: tert-butyloxycarbonyl-L-homoprolinamide.

30 In 30 ml ethylacetaat werd 2,29 g (10 mmol.) BOC- HPro-OH opgelost en aan de oplossing werd 1,4 ml (10 mmol.) triethylamine toegevoegd, waarna het mengsel op -10°C werd afgekoeld en druppelsgewijs werd 1,3 ml (10 mmol.) chloorkool-zure isobutylester toegevoegd. Na 15 min. roeren werd bij 35 -10°C een half uur lang ammoniakgas door het mengsel geleid, dan werd het mengsel gedurende 2 uur bij 0-5°C met rust gelaten. Het neerslag werd dan afgefiltreerd, het filtraat ingedampt en de als residu verkregen olie opgelost in 30 ml chlo- 800 3766 - 35 - roform. De oplossing werd uitgeschud tweemaal met steeds 10 ml N zoutzuur, eveneens tweemaal met steeds 10 ml N natriumwater-stofcarbonaatoplossing en tenslotte eenmaal met 10 ml water, gedroogd met watervrij natriumsulfaat, ingedampt en de als 5 residu verkregen olie met n-hexaan tot kristalliseren gebracht. Het op deze wijze verkregen ruwe produkt (1,95 g) werd herkristalliseerd uit een mengsel van ethylacetaat en ether; er werd 1,78 g B0C-HPro-NH2 verkregen (78 % van de theorie); smp. = 138-140°C; R^2) = 0,43; l\7^5 = -24,85° (c = 1, in 10 azijnzuur).

Analyse voor ciiH20O3N2 (m°l*9ew· 228,29): berekend: C 57,87 %, H 8,83 %, N 12,27 %; gevonden: C 57,60 %, H 8,89 %, N 12,11 %.

Stap 2: 15 L-homoprolinamide-hydrochloride.

In 10 ml warme ethylacetaat werd 1,6 g (7 mmol.) BOC-HPro-NH2 opgelost, de oplossing werd op kamertemperatuur afgekoeld en er werd 10 ml 6 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat aan toegevoegd. Het reactiemengsel werd een uur lang bij 20 kamertemperatuur met rust gelaten, dan met ether verdund, het neerslag werd met ether verwreven en afgefiltreerd. Er werd op deze wijze 1,05 g H-HPro-NH2.HC1 verkregen (91 % van de theorie); smp. = 178-180°C; = 0,32; ~ +26,2° (c = 1, in methanol).

25 Stap 3: L-norvalyl-L-homoprolinamide-hydrochloride.

In 20 ml DMFA werd 0,99 g (6 mmol.) H-Pro-NH2.HCl opgeslibd en onder roeren werd hieraan 0,84 ml (6 mmol.) tri-ethylamine en 2,3 g (6 mmol.) BOC-Nva-OPFP toegevoegd. Na 15 30 min. laten staan werd nog eens 0,84 ml (6 mmol.) triethylamine aan het reactiemengsel toegevoegd en na een uur roeren werd het mengsel in vacuum ingedampt. Het residu werd opgelost in 50 ml chloroform, de oplossing werd uitgeschud tweemaal met steeds 10 ml N zoutzuur, eveneens tweemaal met steeds 10 ml N 35 -natriumwaterstofcarbonaatoplossing, gedroogd met watervrij natriumsulfaat en ingedampt. De als residu verkregen olie werd opgelost in 6 ml ethylacetaat en aan de oplossing werd 10 ml 6 N zoutzuuroplossing in ethylacetaat toegevoegd. Na 1 uur 800 3 7 66 - 36 - staan werd het reactiemengsel met ether verdund, het amorfe neerslag verwreven, afgefiltreerd en in vacuum boven watervrij natriumhydroxide gedroogd. Op deze wijze werd 1,22 g H-Nva-HPro-Ni^ECl verkregen (89,5 % van de theorie); R.^ = 0,12.

5 Stap 4: L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L-homoprolinamide.

In 20 ml DMFA werd 1,22 g (5,37 mmol.) H-Nva-HPro-NH2.HC1 opgelost en aan de oplossing werd 0,75 ml (5,37 mmol.) triethylamine en 1,7 g (5,5 mmol.) Kpc-OPFP toegevoegd. Na 5 10 min. roeren werd nog eens 0,75 ml (5,37 mmol.) triethylamine toegevoegd en na verdere 20 min. roeren werd het reactiemengsel in vacuum ingedampt. Het residu werd met ether verwreven en het op deze wijze verkregen amorfe ruwe produkt (1,8 g) werd gebracht op een uit 40 g silicagel vervaardigde zuil en 15 geëlueerd met het oplossingsmiddelmengsel (4). De fracties van het eluaat, die het zuivere produkt bevatten, werden verenigd en ingedampt. Er werd 1,11 g zuiver produkt verkregen, die werd in water opgelost, met actieve kool geklaard en de waterheldere oplossing werd gelyofiliseerd. Op deze wijze werd 1,0 (5) 20 g Kpc-Nva-HPro-NH., verkregen (53 % van de theorie); Rl = - -25 ^ o r 0,35? ^ α_/ΰ = -44,6 (c = 1, in azijnzuur).

25 800 3766

Claims

1. Peptiden met de algemene formule 1, X - Y - W - nh2, waarin 5. een L-pyroglutamyl-, D-pyroglutamyl-, L-2-keto- imidazolidine-4-carbonyl-, L-6-ketopipecolyl-, L-thiazolidine- 4-carbonyl-, L-prolyl- of orotylgroep is, Y een L-leucyl-, L-norvalyl- of L-histidylgroep isf W een L-prolyl-, D-prolyl-, L-thiazolidine-4-10 carbonyl-, L-homoprolyl-, L-leucyl-, L-isoleucyl-, L-methio-nyl-, L-pipecolyl- of D-pipecolylgroep is, of -W-NH2 te samen een pyrrolidylgroep of een piperidylgroep betekent, terwijl echter wanneer X L-pyroglutamyl is en Y L-histidyl is, W een van L-prolyl verschillende betekenis heeft, alsmede therapeu-15 tisch toepasbare complexen van deze verbindingen.

2. L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-pipecolinezuuramide.

3. L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide.

4. L-pyroglutamyl-Irnorvalyl-L-thiazolidine-4- 20 carbonzuuramide.

5. L-2-ketoimidazolidine-4-carbonyl-L-leucyl-L- prolinamide.

6. L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-leucyl-L- prolinamide. 25

7. L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L- prolinamide.

8. D-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prolinamide.

9. L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L-thiazolidine-4-carbonzuuramide. 30

10. L-6-ketopiperidine-2-carbonyl-L-norvalyl-L- homoprolinamide.

11. Werkwijze voor de bereiding van peptiden met de algemene formule 1 X - Y - W - nh2, 35 waarin X een L-pyroglutamyl-, D-pyroglutamyl-, L-2-keto-imidazolidine-4-carbonyl-, L-6-ketopipecolyl-, L-thiazolidine- 4-carbonyl-, L-prolyl- of orotylgroep is. 800 3766 - 38 - Y een L-leucyl-, L-norvalyl- of L-histidylgroep is, W een L-prolyl-, D-prolyl-, L-thiazolidine-4-caroonyl-, L-homoprolyl-, L-leucyl-, L-isoleucyl-, L-methio-nyl-, L-pipecolyl- of D-pipecolylgroep is, of -W-NH2 te samen 5 een pyrrolidyl- of piperidylgroep betekent, wanneer echter X L-pyroglutaminyl en Y L-histidyl betekent, W een van de L-prolylgroep verschillende betekenis heeft, alsmede van therapeutische toepasbare complexen van deze verbindingen, met het kenmerk, dat men tripep- 10 tidederivaten met de algemene formule 1, waarin X, Y en W de boven aangegeven betekenissen hebben, uit de overeenkomstige aminozuren of aminozuurderivaten opbouwt volgens op zichzelf bekende peptide-chemiscne methoden en desgewenst het verkregen produkt overvoert in een therapeutisch toepasbaar complex.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk , dat men a) uit verbindingen met de algemene formule 2, W - nh2, waarin W de in conclusie 11 aangegeven betekenis heeft, uit- 20 gaande van het molecuul met de algemene formule 1, stapsgewijze door toepassing van de in de peptidechemie gebruikelijke koppelingsmethoden, met voordeel onder toepassing van actieve • esters, gemengde anhydriden of cyclohexyl-carbodiimide, opbouwt, of 25 b) de verbindingen met de algemene formule 2 W - nh2 waarin W de boven aangegeven betekenis heeft, met aziden acy-leert, die vervaardigd zijn uit dipeptidehydraziden met de algemene formule 3,

30 Z - X - Y - NH-NH2, waarin Z de benzyloxycarbonylgroep betekent, X en Y de in conclusie 11 aangegeven betekenissen hebben, en dan uit de verkregen beschermde verbindingen met de algemene formule 4 Z-X-Y-W- nh2, 35 waarin Z, X, Y en W de boven aangegeven betekenissen hebben, de beschermde groep Z afsplitst en het verkregen produkt met de algemene formule 1 isoleert uit het reactiemengsel en/of eventueel overvoert in een therapeutisch toepasbaar complex. 800 37 66 -*.· :T - 39 -

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk , dat men uit de beschermde verbinding met de algemene formule 4 de beschermende groep Z afsplitst door katalytische hydrering.

14. Werkwijze volgens conclusie 11, ter bereiding van de in de plaats van X een pyroglutamylgroep bevattende verbindingen met de algemene formule 1, waarin Y en W de in conclusie 11 aangegeven betekenissen hebben, met het kenmerk , dat men in de plaats van de pyroglutamylgroep 10 een glutaminerest als N-terminaal aminozuur in het molecuul invoert en het op deze wijze verkregen tripeptide met de algemene formule Gln-Y-W-NH2 door warmtebehandeling overvoert in de overeenkomstige, op de plaats van X een pyroglutamylgroep bevattende, verbinding met de algemene formule 1.

15 800 37 66