Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych trójpeptydoamidów o ogólnym wzorze X-Y-W- -NH3, w którym X oznacza grupe L-piroglutamylowa, D-piroglutamylowa, L^2-ketoimidazolidyno-4-karbony- lowa, L-6-ketopipekolilowa, L-tiazolidyno-4-karbony- lowa, L-prolilowa lub orotylowa, Y oznacza grupe L-leucylowa, L-norwalilowa lub L-histydylowa, W oznacza grupe L-prolilowa, D-prolilowa, L-tiazolidy- no-4-karbonylowa, L-homoprolilowa, L-lcucylowa, L- -izoleucylowa, L-metionylowa, L-pipekolilowa lub D- -pipekolilowa albo grupa o wzorze -W-NH2 razem oznacza gtupe pirolidylowa lub piperydylowa, przy czym jezeli X oznacza grupe L-piroglutamylowa a Y oznacza giupe L-histydylowa, wówczas W ma znacze¬ nie inne niz grupa L-prolilowa. Zwiazki te dzialaja na centralny uklad nerwowy.Nowe pochodne trójpeptydów odpowiadajace po- wyzej okreslonemu wzorowi ogólnemu stanowia zwiazki analogiczne do L-piroglutamylo-L-histydylo-L-prolina- midów (Glp-His-Pro-NH2) znanych pod nazwa an¬ gielska „thyrotropin-releasing hoimone" (TRH), lecz w których niektóre grupy aminokwasowe wymienione sa na inne gtupy aminokwasowe wyszczególnione w powyzszej definicji wzoru ogólnego lub grupa -W-NH3 na grupe pirolidylowa lub piperydylowa.Istnienie trójpeptydu TRH bylo znane juz w latach szescdziesiatych ale ich budowa zostala opisana do¬ piero w latach 1969—1970 niezaleznie przez dwie gru¬ py badawcze [Bowers, C.Y., etc. Ensocrinology 86, 30 20 25 1143 (1970); R. Burgus etc. C.R., Acad. Sci (Paris) 269, 1870 (1969)].Trójpeptyd TRH zostal dotychczas opisany jako czynnik regulujacy uwalnianie TSH (hormon pobu¬ dzajacy tarczyce) w leczeniu niskiego cisnienia u ssa¬ ków. Badania nad tymi hormonami zostaly utorowane w nowym kierunku wówczas, gdy zostal poznany fakt, ze biologiczne dzialanie tego trójpeptydu nie jest ogra¬ niczone do stymulowania uwalniania hormonu tyro- tropinowego lecz dziala on takze na centralny uklad nerowy [N.P. Plotnikoff i inni, Science 178, 417/ /1972); AJ. Prangs i inni, Lancet 2,999 (1972)].Zostalo stwierdzone nastepnie, ze TRH niezaleznie od funkcji hormonlanej takze obniza znacznie okres czasu dzialania barbiiutanów i alkoholu na sen a po¬ nadto redukuje dzialanie róznych leków wywolujacych obnizenie temperatury ciala i podwyzsza zdolnosci ruchowe.Jeszcze inna wazna funkcja TRH wplywu na cen¬ tralny uklad nerwowy jest zahamowanie katalepsji wywolywanej przez chloroperidol. Z punktu widzenia praktyki terapeutycznej pozadane jest takze wytwa¬ rzanie takiego zwiazku analogicznego do TRH, który tylko slabo dziala na niskie cisnienie krwi ale przy tym wykazuje dzialanie równe lub przewyzszajace dziala¬ nie znanych zwiazków TRH na centralny uklad ner¬ wowy. W tym celu tego typu zwiazki zostaly opisane w opisach patentowych RFN DOS nr nr 2343035, 2343037, 2449167, 2514381, 2609154, 2639393 jak równiez w opisie patentowym Belgii nr 819198. Jednak- 123 822123 822 3 ze dotychczasowe badania w tym kierunku [AJ. Prange i inni, „The Role of Hormones in Depresion" Life ^^^^y^r^^PP7) * A-w- SchaUy i inni „Hypo- | thalamic Kegulatoryf Hormones" Ann. Reg. Biochem. 147,89 (1978)], nic mogly prowadzic do zadawalaja- jcyom*dW$u»fltów^pojl I kazdym wzgledem z punktu wi- I Obecnie stwierdzono, te przez systematyczna wy¬ miane niektórych aminokwasów* które moga byc od* AwWwt z czasteczek TRH zbudowanych z 3 amino¬ kwasów, dzialanie hormonalne trójpeptydów zostaje zupelnie zlikwidowane lub co najmniej znacznie zre¬ dukowane, przy czym dzialanie na centralny uklad nerwowy zostaje zachowane lub nawet znacznie zwiek¬ szone.Szczególnie korzystne sa te pochodne trójpeptydów w których zamiast grupy histydynowej w polozeniu 2 znajduje sie alifatyczna grupa aminokwasowa o pros¬ tym lub rozgalezionym lancuchu weglowym. Dla zwiekszenia selektywnosci biologicznego dzialania oka¬ zalo sie korzystne równiez wprowadzenie do czastecz¬ ki grupy kwasu 6-ketopipekolinowego zamiast ukladu pierscieniowego piroglutamylowego.Pochodne trójpeptydów o wzorze X-Y-W-NHa» w którym X, Y i W maja powyzej podane znaczenie, wytwarza sie z odpowiednich aminokwasów albo po¬ chodnych aminokwasów metodami znanymi w chemii peptydów.Zgodnie z wynalazkiem, wychodzac ze zwiazków o ogólnym wzorze W-NHW w którym W ma wyzej podane znaczenie wytwarza sie etapami zwiazek o wzo¬ rze X-Y-W-NHjprzez zastosowanie znanych w chemii peptydów metod sprzegania, przy czym zwiazek o ogól¬ nym wzorze W-NH„ w którym W ma wyzej podane znaczenie, acyluje sie zabezpieczonym estrem piecio- fluorófenylowym aminokwasu o ogólnym wzorze BOC- -Y-OPFP, w którym BOC oznacza grupe Ill-rzed, butoksykarbonylowa, OPFP oznacza grupe piecio- fluorofenoksylowa a Y ma wyzej podane znaczenie, i z tak otrzymanego zabezpieczonego dwupeptydu o ogólnym wzorze BOC-Y-W-NHa, w którym BOC, Y 1 W maja wyzej podane znaczenie, uwalnia sie przez hydrolize kwasowa dwupeptyd o ogólnym wzorze H-Y-W-NH2w którym Y, W maja wyzej podane zna¬ czenie, i ten dwupeptyd acyluje sie zabezpieczonym estrem pieciofluorofenylowym aminokwasu o ogólnym wzorze Z-X-OPFP,w którym Z oznacza grupe benzylo- ksykarbonylówa a X i OPFP maja wyzej podane zna¬ czenie, i w otrzymanym zabezpieczonym trójpepty- coamidzie o ogólnym wzorze 2-X-Y-W-NH3Jw któ¬ rym Z, X, Y i W maja wyzej podane znaczenie, odszcze- pia sie przez katalityczne uwodornienie grupe zabez¬ pieczajaca Z.Pochodne trójpeptydów wytwarza sie równiez w ten sposób, ze zwiazek o ogólnym wzorze W-KHj, w któ¬ rym W ma wyzej podane znaczenie, acyluje sie zabez¬ pieczonym azydkiem dwupeptydu o ogólnym wzorze Z-X-Y-NMw którym Z, X i Y maja wyzej podane zna¬ czenie, i w otrzymanym zabezpieczonym trójpeptydo- amidzie o ogólnym wzorze Z-X-Y-W-NH2w którym Z, X I Y i M maja wyzej podane znaczenie, odszcze- pia sie przez katalityczne uwodornienie grupe zabez¬ pieczajaca 2.Przy zastosowaniu metody stopniowego budowania czasteczki korzystnie stosuje sie nadmiar wyjsciowego 4 zwiazku o ogólnym wzorze W-NH3 w reakcji z akty¬ wowana pochodna, zwlaszcza z pieciofluorofenylowym estrem zabezpieczonego aminokwasu o ogólnym wzorze BOC-Y-OH, w którym BOC oznacza zabezpieczajaca 5 grupe Hlrz.-butylokarbonylowa, przy czym odpowied¬ nia pochodna dwupeptydowa o ogólnym wzorze BOC- -Y-W-NH3 mozna zbudowac stosujac inne metody sprzegania, np. z mieszanymi bezwodnikami alba z wolnymi kwasami w obecnosci dwucykloheksylokar- io bodwuimidu.Pochodna dwupeptydowa o ogólnym wzorze H-Y- -W-NH2, uwolniona z otrzymanej zabezpieczonej po¬ chodnej dwupeptydowej BOC-Y-W-NH3 przez hy¬ drolize kwasowa, korzystnie poddaje sie reakcji z piecio- 25 fluorofenyloestrem zabezpieczonego aminokwasu o ogól¬ nym wzorze Z-X-OH, przy czym pózniej w opisany wyzej sposób mozna wytworzyc odpowiednia zabez¬ pieczona pochodna trójpeptydowa o ogólnym wzorze Z-X-Y-W-NH3.I0 Acylowanie wyjsciowego zwiazku W-NH2 za po¬ moca azydku otrzymywanego z hydrazydków o ogól¬ nym wzorze Z-X-Y-NH-NH3 ma te zalete, ze ten jiydrazydek daje sie latwo wykrystalizowac i w zwiaz¬ ku z tym jest produktem przejsciowym dajacym sie 25 wyodrebnic w bardzo czystej postaci.Zwiazki o ogólnym wzorze X-Y-W-NH3 zawiera¬ jace w polozeniu X grupe piroglutamylowa moga byc takze budowane w ten sposób, ze pierscien pirogluta- mylowy dopiero w ostatnim etapie syntezy tworzy sie 30 z grupy glutaminowej. Dzieje sie tak dlatego, ze glu¬ tamine wprowadza sie do czasteczki jako trzeci amino¬ kwas i w ten sposób otrzymany trójpeptyd o ogólnym wzorze Glu-Y-W-NH2ogrzewa sie kilka minut w kwa¬ sie octowym. 35 Z zabezpieczonych pochodnych trójpeptydów o ogól¬ nym wzorze Z-X-Y-W-NH3wytwarzanych za pomoca jednej z powyzej opisanych metod mozna wytwarzac pozadane koncowe produkty korzystnie przez kata¬ lityczne uwodornienie. Otrzymany produkt koncowy 40 mozna oczyszczac przez prosta krystalizacje lub wy¬ tracanie w razie potrzeby chromatograficznie. Ewen¬ tualnie produkt koncowy, po usunieciu produktów ubocznych, mozna takze przygotowac przez proste liofilizowanie. 41 Wytworzone sposobem wedlug wynalazku pochodne trójpeptydów o ogólnym wzorze X-Y-W-NH2zostaly przebadane pod wzgledem ich farmakologicznego dzialania wedlug nizej opisanych metod biologicznych. 1. Hamowanie katalepsji u szczurów wywolanej 50 Haloperidolem. 40 mg/kg Haloperidolu, to znaczy 4- (p-chlorofenylo)-l [3- (p-fluorobenzoilo)-propylo] - -piperydynohi-4 podano podskórnie zwierzetom i po 120 minutach stwierdzono wystapienie katalepsji. Nas¬ tepnie szczury podzielono w grupy po 10 sztuk i poda- 55 wano im dozyme dawki trójpeptydów analogów TRH.Zwierzeta badanej grupy potraktowano fizjologicznym roztworem soli kuchennej- Po uplywie 15,3Q» tO i 130 minut przebadano katakptyczne dzialanie poszczegól¬ nych zwiazków. Te zwierzeta uwazano za kataleptyo- 10 ne, które po ustawieniu przednimi lapami aa slupku o wysokosci 7 cnr, w ciagu 30 sekund, nie skorygowaly swej pozycji.Ze zwierzat, które nie wykazaly objawów katalepsji, zostaly wyznaczone odpowiednie wartosci ED^ dla 55 poszczególnych zwiazków za pomoca analizy przez123 8U 5 sondowanie. Próby te zastaly przeprowadzone na meskich osobnikach szczurów. Wistftf ó masie ldO-^- --¦180 g. 2. Wzmaganie aktywnosci ruchowej myszy wywo¬ lanej pfczez L-Dopa. Zwierzetom podawano doótrzew- nówb najpierw pó 40 mg/kg N-metylo-N-piopargilo- -benzytóaininy (Pargilina), nastepnie 20 mg/kg TRH, wzglednie taka sama dawke badanego nowego trój- peptydu i w koncu 100 mg/kg L-Dopa. Po 30, 60 i 90 minutach zmierzono ruchowa aktywnosc zwierzat.Uzyskanc wartosci zostaly podane w ponizszej tablicy W procentach w stosunku do zwierzat potraktowanych ttójpeptydem TRH. Do tych prób uzyto po 15 meskich Osobników myszy o masie ciala 18—22 g. 3 Dzialanie zwalczajace hypotermie u myszy wy¬ wolana Reserpinem. Osobnikom meskim podzielonym w grupach po 10 sztuk o masie ciala od 18—22 g po¬ dano dootrzewnowo 5 mg/kg Reserpinu. Po 16 go¬ dzinach zwierzetom podano dawki po 20 mg/kg TRH albo badanych trójpeptydow.Zmierzone temperature w odbycie zwierzat przed podawaniem Reserpinu (w tablicy oznaczenie jjndrm.")* po 16 godzinach po podaniu Reserpinu (w tablicy #»ret.") i po jednej ewentualnie dwóch godzinach fd podaniu badanego trójpeptydu (w tablicy ,*pti pofr.")i W tablicy podano srednie wartosci temperatury w 6d- byeie u badanych po 10 81tuk myszy* 4. Wplyw na czas trwania fenu wywolanego Hekso- 6 barbitalemi Osobnikom meskim myszy w grupach po 10 sztuk podano dozylnie pó 60 mg/kg Heksobarbitalu- -Ib (fitipan R B*yer) Po 10 minutach podano dóO- trzewnOWO Zwierzetom dawki po 20 mg/kg TRH 5 Wzglednie badanego trójpeptydu. Czas trWahia snu zostal podany W tablicy w procentach w Btosunku do grupy kontrolnej (wartosci przecietne dla 10 zwierzat). 5. Narkoza etahólówa. Myszom w grupach po 20 sztuk 0 róznej plci i masie ciala od 18 do 22 g podano lo pb 4,5 g etanolu, Po 10 minutach podano dootrzewno¬ wo zwierzetom jeszcze po 20 mg/kg badanego trójpep¬ tydu. Czas snu zostal w tablicy podany w procentach W stosunku do zwierzat z grupy kontrolnej (przeciet¬ ne Wartosci dla 20 zwierzat), i5 5* Hormonalna aktywnosc (dzialanie T8H) u szczu¬ rów. Meskim osobnikom szczurów o masie dala okolo 200 g w grupach po1 7 dó 8 zwierzat podano dozylnie dawki 20 mg/kg TS.H wzglednie badanego trójpepty¬ du. Reakcje TSH u zwierzat okreslono w 15 minut lo po podaniu TRH wzglednie zwiazków analogicznych do TRH po pobraniu osóeza krWi zwierzat przez ba¬ danie rtdl^rnmunbl^ificztte. Wzgledne wartosci okres¬ lajace dzialanie zostaly wyliczone metoda, czteropunkto- wa za pomoc* fcoinpute*a Tt^A 101$ przy czym war- $5 tosci dla TRH oznaczono )dko 100.Dane okreslajace biologiczne dzialanie najwazniej¬ szych zwiazków ó ogólnym Wzorze X-Y-W-Nlfi, które zostaly przebadane za pomoca opisanych metod farmakologicznych zostaly zebrane w" tablicy.X—Y—Z—NHi X K »¦¦ ¦¦|'ll Kpc £pe ©fc bip pip |Kpc Rpc b- -Glp |Kic Y Lett Nva Lett Leu M*a NVa NVa Lett Len z £r0 Pro Tca Pip Tca Tca HprO Pro Pro I TRH ,r-l..itst m « t.i.i-. -, , ,.i ,-....— Hamowanie katalepsji pO Halope^ rldolu mg/ m 23,5 10,6 31,4 38,5 56 60,3 35,3 ?0 80 80 »-¦--¦ ¦ • Czas min. -~— - —— -i 00 30 120 120 3o 3ó 15 15 30 15 Ta Wzmaganie aktywnosci ru¬ chowe) pó L-Dopa, % po3ó min.M tur 319 36 m 201 lfc 1Ó3 63 54 118 100 po 60 min. i ntrrn -g rr go 45 142 89 147 38 30 5& 70 100 po 90 min. 127 65 52 112 7$ 70 10S 115 100 blics Zmiana hypotermii po Resepinie, tempe* ratura w odbycie, °G norm. 36,3 36,3 36,2 36,4 36,5 36,4 36,3 36,5 35,5 36,2 re*. 24,5 23,9 24,9 24,6 32,S 23,6 20,7 2t,4 24,1 25,9 | po potr. lh 32,0 33,1 33,1 30,7 31,4 30,4 26,5 25,S 27,7 35,5 2h 33,$ 32,5 32,2 31,0 30,7 29,0 32,2 25,6 28,8 30,2 Czas shti pó Heksó* barbitolu* % do zwie¬ rzat Kon¬ trolnych 37 51 39 38 69 ' 61 76 97 59 56 G*as lnu PO etano¬ lu % dO zwierzat kóntfol* nych W 46 56 60 ii 48 35 54 69 35 Reak¬ cja ¥SH Vi 0 0 7,2 0 — — 0 0 100 Czas Sfiu po Hekeobarbitolu: Czai snu po etanolu: (x±SE)3Mit 1,36 min. (i±SE)46i9±2,17min.Z danych zawartych w tablicy widac, ze nowe zwiaz¬ ki analogiczne do TRH, w których dwa lub trzy ami¬ nokwasy w czasteczce TRH zostaly zastapione innymi aminokwasami^ wykazuja wzmocnione dzialanie na centralny uklad nerwowy, Z tego punktu widzenia szczególnie korzystne sa te pochodnej w których za¬ miast grupy His w polozeniu 2 czasteczki TRH. znaj¬ duje sie alifatyczny aminokwas o prostym lub roz¬ galezionym lancuchu weglowym^ Równiez korzystne sa z punktu widzenia takiego dzialania te analogi TRH, 60 w których grupa Glp zastapiona jest kwasem 6-Ieto- -pipekolinowym. U tego typu pochodnych dzialanie hormonalne TRH jest albo calkowicie zlikwidowane albo zmniejszone do minimum, przy czym równoczesnie dzialanie na centralny uklad nerwowy zoltaje znacznie* 6* w pewnych przypadkach nawet osmiokrotnie zwiekszone.123 822 8 Nowe trójpeptydy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku moga byc stosowane w postaci zwykle stosowanych w terapii preparatów leczniczych. Pre¬ paraty te zawieraja substancje czynna wytwarzana sposobem wedlug wynalazku w polaczeniu z nieorga¬ nicznym albo organicznym nosnikiem odpowiednim do podawania dojelitowego lub pozajelitowego. Pre¬ paraty lecznicze moga byc wytwarzane na przyklad w postaci tabletek, drazetek, preparatów do wstrzy¬ kiwania, liofilizatów itp. Preparaty lecznicze w takich postaciach wytwarza sie zwyklymi metodami farma¬ ceutycznymi.Praktycznie sposób wedlug wynalazku, to znaczy sposób wytwarzania nowych trójpeptydów analogicz¬ nych do TRH, zostal blizej opisany w ponizszych przykladach. Zastosowane w tych przypadkach skróty stanowia skróty znane w chemii peptydów wedlug J. Biol. Chem. 247, 977 (1972).Ponadto w przykladach zastosowano nastepujace dodatkowe skróty: HPro — Lrhomoprolina .Kie — kwas L-2-ketoimidazolidynokarboksylo- wy-4 Kpc — kwas L-6-ketopipekolinowy Oro — kwas orotowy Pip — kwas L-pipekolinowy Tca —kwas L-tiazolidynokarboksylowy-4 DCC — dwucykloheksylokarbodwuimid DCU — dwucykloheksylomocznik PEPOH — pieciofluorofenol DMFA — dwumetyloformamid Podane w przykladach temperatury topnienia zwiaz¬ ków okreslono za pomoca specjalnego aparatu Dr. Tot- toli Biichi, Skrecalnosc optyczna zmierzono za pomoca polarymetru typu Perkin-Elmer 141.W badaniach metoda chromatografii cienkowarstwo¬ wej albo przy rozdzielaniu stosowano plytki z zelu krzemionkowego („Kieselgel G nach Stahl — E. Merck, Darmastadt). Do rozwijania chromatografmów sto¬ sowano nastepujace mieszaniny rozpuszczalników: 1) chloroform :metanol 9:1 2) octan etylu:(pirydyna:kwas octowy:woda 20:6:11) 95:5 3) octan etylu: (pirydyna:kwas octowy:woda 20:6:11) 9:1 4) octan etylu: (pirydyna :kwas octowy :woda 20:6:11) 8:2 , 5) octan etylu: (pirydyna :kwas octowy:woda 20:6:11) 3:2 6) octan etylu: (pirydyna:kwas octowy:woda 20:6:11) 2:3 Do wywolania plamki zastosowano roztwór ninhy- dryny. Po spryskaniu plytki suszono w ciagu 5 minut w temperaturze 105°C. Potem chromatogramy umiesz¬ czono w atmosferze gazowego chloru i po przewiet¬ rzeniu wywolywano za pomoca roztworu o-tolidyny w jodku potasowym.Do oczyszczania produktu w kolumnie chroma¬ tograficznej zastosowano zel krzemionkowy „Kieselgel G" E. Mercka o rozmiarach czastek 0,062 do 0,2 mm.Do odparowywania roztworów w prózni zastosowano prózniowa wyparke Rotavapor R (Biichi), przy czym odparowywanie przeprowadzono w temperaturze nie przekraczajacej 50°C.Pieciofhiorofenylowe estry aminokwasów z grupa ochronna BOC wytwarzano metoda opisana przez L-Kisfaludy i inni Ann. 1973, 1421.Przyklad I. Wytwarzanie amidu kwasu L- -piroglutamylo-L-leucylo-L-pipekolinowego. 5 Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku amidu kwasu L-leucylo-L-pipekolinowego. 1,54 g (12 mmoli) H- -Pip-NH2 rozprowadzono w 20 ml DMFA i do otrzy¬ manej zawiesiny mieszajac dodano 5,16 g (13 moli) BOC-Leu-OPFP i 1,6 ml (12 moli) trójetyloaminy. 10 Mieszanine dalej mieszano w ciagu 6 godzin a potem otrzymany roztwór odparowywano w prózni, a otrzyr many jako pozostalosc olej rozpuszczono w 60 ml chlo¬ roformu. Do roztworu dodano 0,2 ml 2-(dwumetylo- amino)-etyloaminy, pozostawiono go w spokoju w cia- 15 gu 5 minut a nastepnie wstrzasano go kolejno trzy - krotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilos¬ ci po 20 ml i raz z 20 ml wody. Pózniej osuszono w obec¬ nosci siarczanu sodu i odparowano. Oleista pozosta¬ losc rozpuszczono w 3 ml octanu etylu i do roztworu 20 dodano 10 ml 5N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po godzinie rozcienczono mieszanine reakcyjna eterem, a otrzymany osad odsaczono i oszuszono w próz¬ ni nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten spo¬ sób otrzymano 3,12 g H-Leu-Pip-NH2 • HC1, czyli 25 94% teoretycznej wydajnosci w przeliczeniu na H-Pip* -NH2:Rf(5) = 0,46.Etap 2. Wytwarzanie amidu kwasu benzyloksykar- bonylo-L-piroglutamylo-L-leucylo-L-pipekolinowego. 3,13 g (11,2 mola) H-Leu-Pip-NH2. HC1 i 4,94 g 30 (11,5 mola) Z-Glp-OPFP rozpuszczono w 35 ml DMFA i do roztworu dodano 1,57 ml (11,2 mola) trójetyloaminy. Po 5 minutach mieszania dodano dal¬ sze 1,57 ml (11,2 mola) trójetyloaminy, a po 20 mi¬ nutach dalszego mieszania mieszanine reakcyjna od- 35 parowano w prózni. Pozostalosc rozpuszczono w chlo¬ roformie, a powstaly roztwór wstrzasano kolejno dwu-» krotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilos¬ ci po 30 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wo¬ dorotlenku sodu w ilosci po 30 ml i raz w 30 ml wody* 40 Faze organiczna osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Bezpostaciowy przesacz zmieszano z zimnym eterem, eter odlano, a pozostaly olej pcH traktowano n-heksanem dla zestalenia. Tak otrzymana bezpostaciowy surowy produkt w ilosci 4,7 g krysta-J 45 lizowano z mieszaniny octanu etylu z eterem. Otrzy-t mano 3,32 g ^-Glp-Leu-Pip-NH2 co stanowilo 61% wydajnosci teoretycznej. Mial on nastepujace wlas-: nosci: temperatura topnienia 143—144 °C, Rf(4) = = 0,51, [a] D25 =—97,2° (c = l, w kwasie octowym). 50 Analiza dla C25H3406N4: (masa czasteczkowa 486,57) obliczono C 61,71% H 7,04% N 11,51% znaleziono C 61,67% H 7,05% N 11,40% Etap 3. Wytwarzanie amidu kwasu L-pirygluta- mylo-L-leucylo-L-pipekclinowego. 2,1 g (4,32 mola) 55 Z-Glp-Leu-Pip-NH2 rozpuszczono w 40 ml metanolu, dodano 0,2 g 10% katalizatora palladowoweglowego i nastepnie do mieszaniny doprowadzono w ciagu godziny wodór. Nastepnie odsaczono katalizator, prze¬ sacz odparowano, a osad roztarto z eterem. Tak otrzy- 60 many produkt w ilosci 1,48 g rozpuszczono w wodzie, oczyszczono weglem aktywnym i odsaczono. W czys¬ tym przesaczu rozpuszczono 4 g chlorku, a roztwór' wstrzasano trzykrotnie z chloroformem w ilosci po 10 ml. Faze organiczna oszuszono bezwodnym siar-r es czanem sodu, odparowano, a bezpostaciowy osad roz*-123 822 9 tarto z mieszanina octanu etylu i eteru. W ten st otrzymano 1,33 g Glp-Leu-Pip-NH2, co stanowi 87,5% wydajnosci teoretycznej. Wlasnosci otrzymane¬ go produktu: Rf(5) ^ 0,60, [a] D25 = —86,4° (c = l, w kwasieoctowym). 5 Przyklad II. Wytwarzanie amidu kwasu L- -piroglutamylo-L-leucylo-L-tiazolidynokarboksylowe- go-4.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku amidu kwasu L-leucylo-L-tiazolidynokarboksylowego-4. 1,81 g (11 io moli) H-Tca-NH2.HC1 rozprowadzono w 30 ml DMFA i dodano do roztworu 3,97 g (10 mmoli) BOC- -Leu-OPFP, 149 g (11 mmoli) 1-hydroksy-benzotria- zolu i 1,22 ml (11 mmoli) N-metylo-morfoliny. Otrzy¬ many roztwór pozostawiono na noc w temperaturze 15 pokojowej, odparowano w prózni, a osad rozpuszczono w 80 ml chloroformu. Roztwór ten wstrzasano trzy¬ krotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilos¬ ci po 20 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wo- - doroweglanu sodu w ilosci po 20 ml oraz raz z 10 ml 20 wody, osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparo¬ wano w prózni. Wytracony bezpostaciowy osad roz¬ puszczono w 5 ml octanu etylu, dodano nas¬ tepnie 10 ml 7N roztworu kwasu solnego w octa¬ nie etylu i pozostawiono na godzine. Nastepnie mie- 25 szanine reakcyjna rozcienczono eterem, a otrzymany osad odsaczono i wysuszono w prózni nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 1,84 g H-Leu-Tca-NH2 • HG1, co stanowi 65% wydajnosci teoretycznej w przeliczeniu na BOC-Leu-OPFP. Pro- 30 dukt mial nastepujace wlasnosci: Rf(s) = 0,25, i tem¬ perature topnienia 170—175 °C.Etap 2. Wytwarzanie amidu kwasu benzyloksy- karbonylo-L-piroglutamylo-L-leucylo-tiazolidynokarbo- ksylowego-4. 1,69 g (6 mmoli) H-Leu-Tca-NH2.HC1 35 rozprowadzono w 20 ml DMFA i dodano 2,7 g (6,3 mmola) Z-Glp-OPFP oraz 0,84 ml (6 mmoli) trój- etyloaminy. Mieszanie mieszano w ciagu 20 minut w temperaturze pokojowej, a potem odparowano w prózni. Pozostaly po odparowaniu osad rozpuszczo- 40 no w 50 ml chloroformu i roztwór ten wstrzasano dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztwo¬ rem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu raz z 10 ml wody. Nastepnie faze organiczna odparo- 45 wano, pozostalosc roztarto z eterem, a otrzymany pro¬ dukt oczyszczono przez kilkakrotne wytracanie z mie¬ szaniny octanu etylu i eteru. Otrzymano 1,64 g Z- -Glp-Leu-Tca-NH256% wydajnosci teoretycznej, o nas¬ tepujacych wlasnosciach: temperatura topnienia 108— 50 —110°C, Rf(4) = 0,46, [a]D25 = 130,30° (c = 1, w kwasie octowym).Etap 3. Wytwarzanie amidu kwasu L-piroglutamylo- -L-leucylo-L-tiazolidynokaiboksylowego-4. 1,62 g (3,3 mmola) Z-Glp-Leu-Tca-NH2 rozpuszczono w 6 ml 55 3,5 N roztworu bromowodoru w lodowatym kwasie octowym, a roztwór pozostawiono na póltorej godziny w temperaturze 0—5°C. Nastepnie mieszanine reak¬ cyjna rozcienczono eterem, górna faze zlano, a pozos¬ taly olej rozpuszczono w 20 ml wody. Wodny roztwór 60 zobojetniono stalym wodoroweglanem sodu i trzy¬ krotnie wstrzasano z eterem w ilosci 10 ml. Wodna faze odparowano w prózni, pozostalosc rozpuszczo¬ no w 20 ml chloroformu, roztwór osuszono bezwod¬ nym siarczanem sodu i odparowano. Bezpostaciowa M 10 pozostalosc roztarto z eterem i wysuszono. Otrzymany produkt w ilosci 1,13 g rozpuszczono w mieszaninie rozpuszczajacej (4) i umieszczono w kolumnie chroma¬ tograficznej zawierajacej 20 g zelu krzemionkowego.Kolumne przemyto ta sama mieszanina. Z frakcji za¬ wierajacej czysty produkt wyodrebniono 0,78 bez¬ postaciowego produktu, który rozpuszczono w 20 ml wody, powstaly roztwór oczyszczono weglem aktyw¬ nym, a przezroczysty roztwór liofilizowano. W ten sposób otrzymano 0,62 g Glp-Leu-Tca-NH2, co sta¬ nowi wydajnosci teoretycznej 53% o wlasnosciach: Rf(5) = 0,53, [a] D" = —145,0° (c = l, w kwasie octowym).Przyklad III. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L- -leucylo-D-prolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-piro- glutamylo-L-leucylo-D-pirolinamidu. 1,54 g (5,8 mmo¬ la) H-Leu-D-Pro-NH2.HCl rozpuszczono w 20 ml DMFA i do roztworu tego dodano 0,81 g (5,8 mmola) trójetyloaminy i 2,58 g (6 mmoli) Z-Glp-OPFP. Mie¬ szanine mieszano w ciagu 5 minut, potem dodano jeszcze 0,81 ml 95,8 mmola trójetyloaminy i po 10 minutach dalszego mieszania mieszanine reakcyjna odparowano w prózni. Powstaly po odparowaniu osad rozpuszczono w 60 ml chloroformu, a roztwór ten przemyto trzykrotnie normalnym roztworem wodoro¬ tlenku sodu w ilosci po 15 ml oraz w koncu raz 15 ml wody, osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odpa¬ rowano. Bezpostaciowa pozostalosc roztarto z eterem.Otrzymany pólprodukt w ilosci 2,1 g wykrystalizowano z 5 ml octanu etylu. W ten sposób otrzymano 1,8 g Z-Glp-Leu-D-Pro-NH2, co stanowi 66% wydajnosci teoretycznej o wlasnosciach: temperatura topnienia 153—157°C, Rf(4) = 0,38, [a] D25 = —24,5 ° (c= l, w kwasie octowym).Etap 2. Wytwarzanie L-piroglutamylo-L-leucylo-D- -prolinamidu. 1,5 g (3,25 mmola) Z-Glp-Leu-D-Pro- -NH2 rozpuszczono w 70 ml metanolu a do otrzyma¬ nego roztworu dodano 0,3 g 10% katalizatora z palla¬ du i aktywnego wegla a nastepnie przez roztwór prze¬ puszczono w ciagu godziny wodór. Po odsaczeniu ka¬ talizatora przesacz odparowano i bezpostaciowa po¬ zostalosc roztarto z eterem. Otrzymany pólprodukt w ilosci 0,94 g rozpuszczono w wodzie, roztwór oczysz¬ czono weglem aktywnym i odsaczono. Przezroczysty przesacz liofilizowano. Otrzymano 0,87 g Glp-Leu- -D-Pro-NH2 (79% wydajnosci teoretycznej), o wlas¬ nosciach Rf(5) = 0,47, [a]D25 = +8,4° (c = l, w kwasie octowym.Przyklad IV. Wytwarzanie amidu kwasu L- -piroglutamylo-L-norwalilo-L-tiazolidynokarboksylo- wego-4.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku amidu kwasu L-norwalilo-L-tiazolidynokarboksylowego-4, 8,0 g (20 mmoli) BOC-Nva-OH.DCHA rozprowadzono w 60 ml eteru, dodano 20 ml 2N roztworu kwasu siarkowego i wstrzasano az do rozpuszczenia ciala stalego. Fazy rozdzielono. Faze eterowa wstrzasano z 20 ml 2N roz¬ tworu kwasu siarkowego oraz z 20 ml wody, osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Otrzy¬ many jako pozostalosc olej rozpuszczono w 40 ml DMFA, do roztworu dodano 2,8 ml (20 mmoli) trój¬ etyloaminy, ochlodzono do temperatury —15°C a na- tepnie mieszajac wkroplono 2,5 ml (20 mmoli) chlo¬ rku piwaloilu, utrzymujac temperature mieszaniny113822 ll 12 reakcyjnej ~"5°G, Tak otrzymana zawiesine mieszano jeszcze w ciagu 10 minut w tej parnej temperatur*?.W tym cwic rozprowadzono 3,72 g (32 mmolt) H^Tca-NtL.HCl w 30 ml PMFAi dodano 3,1 ml (23 mmole) t£$jetyloaminy. Otrzymany osad prze- aaezonp, przesacz wkfoplono do przygotowanego w PO- wyfczy sppfipb roztworu mieszanego bezwodnika w tem¬ peraturze *—§°.G Po zakonczeniu podawania miewa¬ no jaszcza mieszanino reakcyjna W ciagu 30 minut W temperaturiie "~10°C nastepnie pozostawione ja mi noc w lodówce, a nastepnego dnia odparowano W prózni. Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 100 ml chloroformu, roztwór wstrzasano trzykrotnie z normalnym roztworem kwaau solnego w ilosci po 20 ml, nastepnie równiez trzykrotnie z normalnym roz¬ tworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 20 ml • w koncu z 20 ml wody. osuszono bezwodnym siarczanem *odu i odparowano. Oleista pozostalosc rozpuszczono w 10 ml octanu etylu* roztwór oziebiono do tempera¬ tury pon**eJ $°C i dodano do niej 20 ml 3N roztworu kwa*u solnego w octanie etylu. Mieszanine rekaeyjna przetrzymywano w kapieli lodowej w ciagu godziny, a nastepnie rozcienczono ja eterem, Otrzymany o*ad osuszono w próbni nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 3,77 g H-Nva-Tca^ -NH2,HCla co sianowi 70% wydajnosci teoretycznej w przeliczeniu na EOONyarOH.DCHA; Rf(*) = = 0,20.Etap 2. Wytwarzanie amidu kwasu benzyloksykar^ bonylo-L-piroglutamylo-L-norwaUlo-l-^tiazolidynokarr boksylowego-4. 2,8 g (10,5 mmola) H-Nva-Tca-NH2, • HC1 rozprowadzono w 50 mi DMFA i mieszajac dodano 1,47 ml (10,5 mmola) trójetyloaminy ora? 5,15 g (12 mmoli) Z-Glp-OPFP. Do mieszaniny reak¬ cyjnej po 5 minutach dodadno dalsze 1,47 ml (10,5 mmola) trójetyloaminy, mieszano w ciagu dalszych 10 minut i potem odparowano w prózni, Pozostalosc rozpuszczono w 100 ml chloroformu, roztwór wstrza¬ sano trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu sol¬ nego w ilosci po 20 ml, trzykrotnie roztworem wodoro¬ weglanu sodu w ilosci po 20 ml i w koncu raz z woda w ilosci 20 ml, osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Bezpostaciowa pozostalosc roztarto z eterem, a otrzymany pólprodukt w ilosci 4,6 g prze¬ krystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru.W ten sposób otrzymano 3,2 g Z-Glp-Nva-Tca-NH3, (64% wydajnosci teoretycznej, o wlasnosciach: tern* peratura topnienia 116—U8°C, Rf(4) = 0,45, [a] D25 =—129,0°, (c = l, w kwasie octowym).Etap 3. Wytwarzanie amidu kwasu L-pirogluta- mylo-L-norwalilo-l^-tiazolidynokarboksylowego-4.4,76 g (10 mmoli) Z-Glp-Nva-Tca-NH2 rozpuszczono w 20 ml lodowatego 3,5 N roztworu kwasu octowego z bromowodorem. Otrzymany roztwór pozostawiono w ciagu póltorej godziny w temperaturze 0—5 °C.Nastepnie mieszanine reakcyjna rozcienczono eterem, a wytracony olej oddzielono od rozpuszczalnika przez dekaufacje. Otrzymany olej rozpuszczono w 50 ml wody i zobojetniono dodatkiem stalego wodoroweglanu sodu i wstrzasano trzykrotnie z eterem w ilosci po 20 ml. Wodna faze odparowano, pozostalosc rozpusz¬ czono w 100 ml chloroformu, a otrzymany roztwór osuszono bezwodnym siarczanem sodu, odparowano, a pozostalosc roztarto z eterem. Otrzymany pólpro¬ dukt w ilosci 3 % umieszczono w kolumnie chromato¬ graficznej na zelu krzemionkowym w ilosci 80 g i ehio- wano mieszanina rozpuszczalników (4)t Z rrakqi za¬ wierajacej czysty produkt wyodrebniono 2,18 g bez¬ postaciowego produktu, który rouzpuszczono w 40 ml 5 wody, otrzymany roztwór oczyszczono weglem aktyw¬ nym, a przezroczysty roztwór liofilizowano. W ten speaób otrzymano 1,84 g Glp~Nva-TcarNH2, 54% wydajnosci teoretycznej o wlasnosciach: Rf(5) =? 0,50 [o] D2* - ¦™-145,6 • (e^l, w kwasie octowym). 10 Przyklad V. Wytwarzania L-piroglutamylo-L- -norwalilo-Lrleucynamidu.Etap 1. Wytwarzanie estru metylowego ni-rz^bu- tyktoykarbonylo-L-norwalilo-L-Jeueyny. Uwolniony z 8,0 g (2Q mmoli) soli PCHA w sposób opisany w przy- *5 kladzie IV etapie 1 BOC«Nva»OH i 3,82 g (21 mmoli) H«LeupQMe.HCl rozpuszczono w 60 ml chlorofor¬ mu, a nastepnie otrzymany roztwór potraktowano najpierw 2,04 ml (21 mmoli) trójetyloaminy, potem chlodzac i mieszajac dodano do niego roztwór 4,33 g w (21 mmoli) DCC w 40 ml chloroformu. Mieszanine reakcyjna pozostawiono przez noc w temperaturze 5°C, a nastepnie wydzielony DGU odsaczono, prze¬ sacz wstrzasano trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci kazdorazowo po 30 ml, a po- ** tem trzykrotnie normalnym roztworem wodorowegla¬ nu sodu w ilosci po 30 ml* a w koncu raz z woda w ilos¬ ci 30 ml," osuszono siarczanem sodu i odparowano.Krystaliczna pozostalosc roztarto z n-heksanem, od¬ saczono a otrzymany surowy produkt w ilosci 6,65 g 3? przekrystalizowano z mieszaniny 5 ml octanu etylu i 20 ml eteru naftowego. W ten sposób otrzymano 5,20 g BOC-Nva-Leu, OMe (75% wydajnosci teo¬ retycznej), o nastepujacych wlasnosciach: temperatu¬ ra topnienia 100—101 °C, Rf(2) = 0,84, [a]D25^ 85 ^—47,5° (c = l, w metanolu).Etap 2. Wytwarzanie IIIrz.-butyloksykarbonylo-L- ^norwalilo-L-leucynamidu. 5,0 g (14,5 mmola) BOC- -Nva-Leu-OMe rozpuszczono w 50 ml metanolu, otrzymany roztwór oziebiono lodem i w ciagu pól 40 godziny doprowadzono do niego gazowy amoniak.Roztwór pozostawiono na noc w temperaturze poko-* jowej, a potem znowu ochlodzono, ponownie nasy- cono amoniakiem, pozostawiono na 4 godziny i odpa* rowano. Krystaliczna pozostalosc przekrystalizowano 45 z mieszaniny octanu etylu i eteru. W ten sposób otrzy¬ mano 4,37 g BOC-Nva-Leu-NH2 91% wydajnosci teoretycznej o wlasnosciach nastepujacych: tempera¬ tura topnienia 158—159°C, Rf(2) = 0,60, [a]D25 = =—48,7° (c = l, w metanolu). se Etap 3. Wytwarzanie chlorowodorku L-norwalilo- -L-leucynamidu. 4,12 (12,5 mmola) BOC-Nya-rLeu- -NH2 rozprowadzono w 15 ml octanu etylu i potrak¬ towano 20 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Mieszanine pozostawiono na 1 godzine a potem 55 rozcienczono eterem. Otrzymany osad odsaczono, a surowy produkt w ilosci 3,64 g przekrystalizowano z 25 ml metanolu* W ten sposób otrzymano 2,7$ g U-Nva-Leu-NH2 ' HC1 (83%wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 215—216°C, SO Rf(5)=0,45, [a]D25—-3,47° (c = l, w metanolu).Etap 4. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-piro- glutamylo-L-norwalilo-L-leucynamidu. 2,67 g (10 mmo¬ li) H-Nva-Lreu-NH2.PC1 rozpuszczono w 30 ml DMFA. Do roztworu dodano najpierw 1,4 ml (J.0 •• mmoli) trójetyloaminy, potem po odsaczeniu powsta*-1»822 13 14 lego osadu dodano 4,73 g (11 mmoli) Z-Glp-QPFP.Pe uplywie 5 minut dodano dalsze M ml (10 mmoJU) trójetyloaminy, a po uplywie dalszych 10 minut mie¬ szanine reakcyjna odparowano w prózni. Pozostalosc roztarto z eterem i tak otrzymany surowy produkt w ilosci 535 g przekrystalizowano z etanolu. Otrzy¬ mano 3*S4 g Z-QlpNva«Leu^Nli; (81% wydajnosci teoretycznej) o nastepujacych wlasnosciach: tempe¬ ratura topnienia 241^-242 °G, Rf(4)=0,55, [a]D*5 = =****62,Q9 (c^l, w kwasie octowym).Etap 5. Wytwarzanie LTpiroglutamylo-Lrporwaliloc- rl^rleucynamidu, 3,8 g (8 mmoli) Z-Glp-?Nva«-Leu»- -NH3 rozpuszczpno w 200 ml kwaau octowego, rozr twór potraktowano 10% katalizatorem z palladu i wegla aktywnego, a nastepnie przepuszczano przez niego wodór w ciagu godziny. Nastepnie katalizator odsaczono, a zelowa pozostalosc roztarto z eterem.W ten sposób otrzymano 2,7 g Glp?NyarLeu-NH2 (99% wydajnosci teoretycznej) o nastepujacych wlas? noscjachr temperatura topnienia 240°C, Rf(s)±=0,57, [a]D**=*-35,8p (c = l, w kwasie octowym).Przyklad VI. Wytwarzanie L-piroglutamylo^ -L-norwalilo-L-ize^eucynamidu.Btap 1. Wytwarzanie III. rz.~butyloksykarbonylo^L- -norwalilo-L^izoleucynamidu. 3,7 g (19 mmoli) Hr -Ile-NH3. HC1 rozpuszczono w 30 ml FMDA, a powstar ly roztwór mieszajac potraktowano 2,7 ml (19 mmoli) trójetyloaminy i 6,63 g (17,3 mmoli) BQC*Nva^QPFP a po uplywie 5 minut dodano dalsze 2,4 ml (17,3 mmo- la) trójetyloaminy. Po uplywie dalszych 10 minut mieszanine reakcyjna odparowano w prózni, a pozosta¬ losc rozpuszczono w 100 ml chloroformu. Dwukrot¬ nie roztwór wstrzasano z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 20 ml, a nastepnie trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilos¬ ci po 20 ml i w koncu raz z woda w ilosci 20 ml, osu*- szono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano.Krystaliczny osad roztarto z eterem i wysuszono. W ten sposób otrzymano 4,7 g BOC-Nva-Ile-NH3 (83% wydajnosci teotetycznej) o nastepujacych wlasnosciach: temperatura topnienia 192—194°C, Rf(2) = 0,60, [a]D35 =^43,7° (c= l, w metanolu).Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku L-nerwalilo^- -L-izoleucynamidu. 4,3 g (13,7 mmola) BOC-Nva- -Ile-NH2 rozprowadzono w 20 ml octanu etylu i po¬ traktowano 6N roztworem kwasu siarkowego w octa¬ nie etylu w ilosci 12 ml. Mieszanine reakcyjna pozosta¬ wiono na godzine, a nastepnie rozcienczono eterem.Otrzymany osad oddzielono pizez odsaczenie, a otrzy¬ many w ten sposób surowy produkt w ilosci 3,6 g przekrystalizowano z mieszaniny metanolu i eteru.Otrzymano 3,5 g H-Nva-Ile-NH2..HC1 (96% wydaja nosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatura top^ nienia 254^255 °C, Rf(*) = 0,45, [a]D25^+3,8° (c = 1, w metanolu).Etap 3. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-Lrpiro- glutamylo^L-norwalilo-L-izoleucynamidu. 3,3 g (12,4 mmola) H-Nva-Ile-NH2. HC1 rozpuszczono w 40 ml DMFA a nastepnie mieszajac do roztworu dodano 1,74 ml (12,4 mmola) trójetyloaminy i 5,85 g (13,6 mmola) Z-Glp-OPFP. Po 5 minutach dodano jeszcze 1,74 ml (12,4 mmola) trójetyloaminy. Po kilku se¬ kundach zelowa stezona mieszanine reakcyjna roz¬ cienczono eterem i wymieszano, pozostawiono na 2 godziny w lodówoe i nastepnie odsaczono. W ten spowij otrzymano 54 * Z*Gta-NYa-4k-NPa ($$% wydajnosci teprgtyeiiUM) e wtasaosfiaclM tempera* tura topnieja 292^2?9'& Rf(*)^fc6Q, [nJO«w ^^§7*5° (e = l, w kwasie octowym). 5 Etap 4. Wytwarzanie L-pirpgiutamylQ-LrnQrwalii- lo-L-izoleucynoamidu. 4,75 g (10 mmoli) ?pG!bt -Nv*-Ile-NHa rozpuszczono, w ?QQ ml kwasu octowe¬ go i po dodaniu 1 g 10% katalizator* h palladu i wegla aktywnego przez roztwór przepuszczane} w ejagu ge- M oddzielono katalizator przez odlaczenie, prpesacz o4-« parowano a pozostalosc rpztarto z eterem. Otrzymano. 3*34 g Glp-Nva-Ile-N*L (98% wydajnosci teoretycy nej) o wlasnosciach? temperatura topnienia 2*7-^279?C, ** Rf(*)^0,$l, [a]B'<^$ towyrn).Przyklad VII. Wytwarzanie L^pirogteamyJ©.-!^ -norwalUo-L-metioninaraidu.Etap h Wytwarzanie eafru metylowego IIJ,rg,*bu« «• tylokay^axbonylo-L-norwaJiU^L-mctioniny.Uwolniony z 4,78 g (12 mmoli) toli DGliA w spo£6b opisany w przykladzie IY etapie 1 BQC-Nva^QP I 2,6 g (13 mmoli) H-Met-OMe.HCl rozpuszczono w 40 ml chloroformuj a nastepnie otrzymany roztwór ts potraktowano najpierw 1*8? ml (13 mmoli) trójetyl©* aminy, potem chlodzac i mieszajac* dodano dp niego roztwór 2,58 g (12,5 mmola) PCC w 20 ml chloro- formu, Mieszanine reakcyjna pozostawiono przgz noc w temperaturze 59C* a nastepnie wybielony PCV 30 odsaczono* przesacz wstrzasano trzykrotnie, z nor¬ malnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 20 ml potem tizykrotnie z normalnym roztworem wpdoro-. weglanu sodu w ilosci po 20 ml a W koncu ra? z woda w ilosci 20 ml, osuszono siarczanem sodu i odparowa- 36 no. Oleista pozostalosc wykrystalizowano dodajac eto.-* ru naftowego, Otrzymany surowy produkt w ilosci 3,42 przekrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego. W ten sposób otrzymano 3,08 g BOC-Nva-Met-OMe (71% wydajnosci teoretycznej) 4P o nastepujacych wlasnosciach: temperatura topnienia 69—70°C, Rf(2)=0,81, [a]P2f =^42,?0 (c = l, w metanolu).Etap 2. Wytwarzanie XILrz*-butylok8ykarbonylo-L- ^norwalilo-L-metioninamidu. 1,81 g (5 mmoli) BOC- 45 -Nva-Met-OMe rozpuszczono w 20 ml metanpluj otrzymany roztwór oziebiono i w ciagu pój godziny doprowadzano do niego gazowy amoniak. Roztwór pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej a po¬ tem znowu pozostawiono na kilka godzin w lodówce. go Wydzielony krystaliczny produkt odsaczono (1,27 g)* przesacz odparowano, pozostalosc przekrystalizowano z 5 ml etanolu i polaczono z zasadnicza iloscia produktu otrzymana w wyzej opisany sposób. Ogólem otrzymano 1,62 g BOC-Nva-Met-NH2 (93% wydajnosci teore- 55 tycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 166^— -167°C, Rf(2)=o,57, [a]D25 =—40,9° (c=--l, w me¬ tanolu).Etap 3. Wytwarzanie chlorowodorku L-norwalilo-» -L-metioninamidu. 4,5 g (13 mmoli) JJOC-Nya,- go -Met-NH2 rozprowadzono w 20 ml octanu etylu i do¬ dano do niego 20 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Mieszanine reakcyjna pozostawiono W ciagu godziny w temperaturze pokojowej* potem roz¬ cienczono eterem* otrzymany osad odsaczono i 04u« •5 szono nad bezwodnym wodorotlenkiem sodu. Qtrpp-123 822 15 many w ten sposób surowy produkt w ilosci 4 g prze- krystalizowano z mieszaniny metanolu i eteru. Otrzy¬ mano 3,28 g H-Nva-Met-NH3.HC1 (89% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 198—200 °C, Rf(*)=0,40, [a] D2S=+ 10,2° (c= l, w metanolu).Etap 4. Wytwarzanie III.rz.-butyloksykarbonylo-L- -gmtaminylo-L-norwalilo-L-metioninamidu. 2,84 g (10 mmoli) H-Nva-Met-NH2. HC1 rozprowadzono w 40 ml DMFA i mieszajac dodano jeszcze 1,4 ml (10 mmoli) trójmetyloaminy i 4,53 g (11 mmoli) BOC-Gln-OPFP.Po uplywie 5 minut dodano jeszcze 1,4 ml (10 mmoli) trójetyloaminy a po mieszaniu w ciagu dalszych 10 minut otrzymana gesta zawiesine odparowano w próz¬ ni. Stala pozostalosc po odparowaniu roztarto etano¬ lem i tak otrzymany surowy produkt w ilosci 4,82 g doprowadzono do stanu wrzenia z 50 ml etanolu. Po ochlodzeniu zawiesine przetrzymano w lodówce w cia¬ gu kilku godzin a nastepnie przesaczono. Otrzymano w ten sposób 4^08 g BOC-Gln-Nva-Met-NH2 (86% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatu¬ ra topnienia 237—238 °C, Rf(4) = 0,43, [a]D25 = =—37,1°, (c = l, w kwasie octowym).Etap 5. Wytwarzanie L-piroghttamylo-L-norwalild- -L-metionamidu. 3,8 g (8 mmoli) BOC-Gln-Nva- -Met-NH2 rozpuszczono w 100 ml 98% kwasu mrów¬ kowego, roztwór przechowywano w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej a nastepnie odparowano w prózni. Otrzymany jako pozostalosc olej rozpuszczo¬ no w 50 ml kwasu octowego i roztwór doprowadzono do stanu wrzenia w ciagu 2 minut a nastepnie znowu odparowano w prózni. Zelowy osad roztarto z eterem i przesaczono. W ten sposób otrzymano 8,8 g Glp- -Nva-Met-NH2 (98% wydajnosci teoretycznej) o wlas¬ nosciach: temperatura topnienia 249—250 °C, Rf(5) = =0,58, [a]D25=—48,4° (c = l, w kwasie octowym).Przyklad VIII. Wytwarzanie N- (L-pirogluta- mylo-L-leucylo)-pirolidyny.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku N-(L-leucylo)- -pirolidyny. 3,46 g (15 mmoli) BOC-Leu-OH roz¬ puszczono w 50 ml octanu etylu, do roztworu tego do¬ dano 2,1 ml (15 mmoli) trójetyloaminy i ochlodzono do temperatury —15 °C. Nastepnie mieszajac w tem¬ peraturze ponizej —10°C wkroplono 1,97 ml (16 mmoli) chlorku piwaloilu. Otrzymana zawiesine mie¬ szano dalej w ciagu 10 minut, a potem wkroplono do niej w tej samej temperaturze 1,37 ml (16,5 mmola) piro- lidyny i mieszanine mieszano jeszcze pól godziny w temperaturze —10°C i w koncu pozostawiono ja na 3 godziny w temperaturze 5°C. Otrzymany roztwór wstrzasano trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wodorotlenku sodu po 10 ml i w koncu raz z woda w ilosci 10 ml, osuszono siarczanem sodu i odparowano w prózni. Otrzymany jako pozostalosc olej rozpuszczono w 5 ml octanu etylu i dodano do nieg3 10 ml 5N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Mieszanine pozostawiono na godzine, potem rozcienczono eterem i wstrzasano z woda. Faze wodna przemyto eterem, alkalizowano weglanem potasu i ekstrahowano chloroformem. Roztwór chloroformu oddzielono, osuszono siarczanem sodu i odparowano.Oleisty osad rozpuszczono w 10 ml eteru, doprowadzono wartosc pH roztworu za pomoca stezonego roztworu kwasu solnego w octanie etylu do 3 i wydzielony kry- 16 staliczny produkt odsaczono. W ten sposób otrzymano 2,41 g H-Leu-pirolidyny.HCl (73% wydajnosci teo¬ retycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 170— - 174 °C,Rf(5) = 0,37. 5 Etap 2. Wytwarzanie N-(benzyloksykarbonylo-L- -piroglutamylo-L-leucylo)-pirolidyny. 1,7 g (7,7 mmo¬ la) H-Leu-pirolidyny.HCl 3,0 g (7 mmoli) Z-Gl- -OPFP i 1,08 ml (7,7 mmola) trójetyloaminy rozpusz¬ czono w 20 ml chloroformu a po uplywie 5 minut 10 dodano jeszcze 0,98 ml (7 mmoli) trójetyloaminy.Po dalszych 5 minutach roztwór rozcienczono 30 ml chloroformu i wstrzasano go dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzy¬ krotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu 15 w ilosci po 10 ml i w koncu z woda w ilosci 10 ml, osu¬ szono siarczanem sodu i odparowano. Oleisty osad doprowadzono do krystalizacji za pomoca n-heksanu i otrzymany w ten sposób surowy produkt w ilosci 2,85 g przekrystalizowano z mieszaniny etanolu i ete- 20 ru. Otrzymano 2,14 g Z-Gp-Leu-pirolidyny (71% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatu¬ ra topnienia 109—110 °G, Rf(4) = 0,55, [a]D25 = =—53,3° (c = l, w kwasie octowym).Analiza dla C23H3105N3 (masa czasteczkowa 429,52) 25 obliczono: C 64,32% H 7,27% N 9,78% znaleziono: C 64,31% H 7,47% N 9,78% Etap 3. Wytwarzanie N-(L-piroglutanylo-L-leucylo)- -pirolidyny. 2,0 g (4,66 mmola) Z-Gp-Leu-pirolidyny rozproszono w 40 ml metanolu, do roztworu dodano 30 0,4 g katalizatora z palladu i wegla aktywnego oraz w ciagu godziny przepuszczono przez roztwór gazowy wodór. Po odsaczeniu katalizatora przesacz odparo¬ wano otrzymany jako pozostalosc olej rozpuszczono w eterze, roztwór pozostawiono na noc w lodówce, 35 potem wydzielona faze krystaliczna oddzielono przez odsaczenie. W ten sposób otrzymano 1,25 g Glp-Leu- -pirolidyny (91% wydajnosci teoretycznej) o wlas¬ nosciach: temperatura topnienia 103—104°C, Rf(s) = = 0,65, [a]D25 = —31,6° (c = l, w kwasie octowym). 40 Analiza aminokwasów: Glu 1,00 (1,0), Leu 1,00 (1,0) Przyklad IX. Wytwarzanie N- (L-pirogluta- mylo-L-leucylo)-piperydyny.Etap 1. Wytwarzanie chlorowodorku N-(L-leucylo)- 45 -piperydyny. 3,46 g (15 mmoli) BOC-Leu-OH roz¬ puszczono w 50 ml octanu etylu, do roztworu dodano 2,1 ml (15 mmoli) trójetyloaminy i oziebiono go do temperatury —15 °C. Mieszajac w tej temperaturze wkroplono do roztworu najpierw 1,97 ml (16 mmoli) 50 chlorku piwawolilu a potem po 10 minutach 1,65 ml (16,5 mmola) piperydyny. Po zakonczeniu tego wkra- plania mieszanine reakcyjna mieszano jeszcze pól go¬ dziny w temperaturze —10 °C a potem pozostawiono ja na noc w lodówce. Osad potem odsaczono a prze- 55 sacz wJtrzasano trzykrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, równiez trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu raz z woda w ilosci 10 ml, wysu¬ szono w obecnosci siarczanu sodu i odparowano. Jako 60 pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 15 ml 4N roztworu kwasu solnego, roztwór pozostawiono na 1 godzine, potem rozcienczono go eterem i pozosta¬ wiono na noc w lodówce. Nastepnego dnia oddzielo¬ no przez odsaczenie otrzymany produkt w postaci 65 osadu. W ten sposób otrzymano 2,0 g H-Leu-pipe-123 822 17 rydyny.HCl (57% wydajnosci teoretycznej) o wlas¬ nosciach: temperatura topnienia 123—125 °C, Rf(5) = = 0,45.Etap 2. Wytwarzanie N-(benzyloksykarbonylo-L- -piroglutamylo-L-leucylo)-piperydyny. 1,81 g (7,7 mmo- la) H-Leu-piperydyny.HCl 3,0 g (7 mmoli) Z-Glp- -OPFP i 1,08 ml (7,7 mmola) trójetyloaminy rozpusz¬ czono w 20 ml chloroformu i po 5 minutach dodano jeszcze 0,98 ml (7 mmoli) trójetyloaminy. Po dal¬ szych 5 minutach roztwór rozcienczono 30 ml chloro¬ formu, nastepnie wstrzasano dwukrotnie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, trzykrot¬ nie normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu raz woda w ilosci 10 ml, osu¬ szono siarczanem sodu i odparowano. Otrzymany jako pozostalosc krystalizujacy olej roztarto z mieszanina eteru i n-heksanu. W ten sposób otrzymany surowy produkt w ilosci 2,75 g przekrystalizowano z miesza¬ niny etanolu i eteru. Otrzymano 2,21 g Z-Glp-Leu- -piperydyny (71% wydajnosci teoretycznej) o wlas¬ nosciach: temperatura topnienia 113—115°C, Rf(4) = =0,69, [a]D25=—42j5° (c = l, w kwasie octowym).Analiza dla C24H33,,5N3: (masa czasteczkowa 443,55) obliczono: C 64,99% H 7,50% N 9,47% znaleziono: C 64,90% H 7,72% N 9,53% Etap 3. Wytwarzanie N-(L-piroglutamylo-)-pipe- rydyny. 2,0 g (4,51 mmola) Z-Glp-Leu-piperyny rozpuszczono w 40 ml metanolu, dodano do niej 0,4 g 10% katalizatora pallad-wegiel aktywny w ciagu go¬ dziny doprowadzono do roztworu gazowy wodór.Po odfiltrowaniu katalizatora przesacz odparowano, a pozostalosc doprowadzono do krystalizacji za po¬ moca eteru. W ten sposób otrzymano 1,12 g Glp-Leu- -piperydyny (81% wydajnosci teoretycznej) o wlas¬ nosciach: temperatura topnienia 99—100 °C, Rf(5) = =0,71, [a] D25=+30,4° (c = l, w kwasie octowym).Analiza aminokwasów: Gin 0,95 (1,0), Leu 1,00 (1,0) Przyklad X. Wytwarzanie L-tiazolidyno-4-kar- bonylo-L-leucylo-L-prolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie L-tiazolidyno-4-karbonylo-L- -leucylo-prolinamidu. 5,13 g (22 mmola) BOG-Tca-OH i 4,05 g (22 mmole) POPOH rozpuszczono w 60 ml octanu etylu i do tego roztworu mieszajac i chlodzac, dodano 4,12 g (20 mmoli) DCC. Mieszanine reakcyj¬ na mieszano w ciagu 2 godzin w temperaturze od 0 do 5°C, nastepnie DGU odfiltrowano, przesacz od¬ parowano a osad rozpuszczono w 50 mln-heksanu.Roztwór wstrzasano pieciokrotnie z normalnym roz¬ tworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 25 ml, póz¬ niej raz z woda w ilosci 25 ml, wystudzono w obecnosci siarczanu sodu i odparowano. Otrzymano w ten sposób 7,32 g oleistej BOC-Tca-OPFP, która rozpuszczono w 20 ml DMFA. Roztwór ten dodano do zawiesiny 5,23 g (20 mmoli) H-Leu-Pro-NH2. HC1 w 30 ml DMFA. Potem do mieszaniny tej chlodzac i mieszajac dodano 2,8 ml (20 mmoli) trójetyloaminy. Po 5 mi¬ nutach dodano jeszcze 2;8 ml (20 mmoli) trójetylo¬ aminy i mieszanine mieszano dalej 20 minut po czym odparowano w prózni. Otrzymany olej rozpuszczono w 100 ml chloroformu. Roztwór wstrzasano trzykrot¬ nie z normalnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 30 ml, trzykrotnie z normalnym roztworem wodo¬ roweglanu sodu iw koncu z woda w ilosci 30 ml osu¬ szono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. 18 Jako pozostalosc otrzymano 8,84 g oleistego BOC- -Tca-Leu-Pro-NH2*który rozpuszczono w 15 ml octa¬ nu etylu i do roztworu dodano 15 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Mieszanine reakcyjna 5 pozostawiono na godzine, nastepnie rozcienczono octa¬ nem etylu, powstaly osad roztarto i odsaczono a po¬ tem w prózni wysuszono nad bezwodnym wodorotlen¬ kiem sodu. Otrzymany w ten sposób chlorowodorek trójpeptydoamidu w ilosci 8,05 g rozpuszczono w 80 10 ml wody. Roztwór wstrzasano trzykrotnie eterem w ilosci po 20 ml, potem za pomcoa wodoroweglanu sodu doprowadzono do pH =8. Alkaliczny roztwór ekstra¬ howano pieciokrotnie chloroformem w ilosci po 20 ml.Polaczone ekstrakty chloroformu wysuszono w obec- 15 nosci bezwodnego siarczanu sodu oraz odparowano* Pozostalosc po odparowaniu roztarto z eterem i wysu¬ szono. W ten sposób otrzymano 5,20 g H-Tca-Leu- -NHj (76% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 159—160°C, Rf(5)=0,63, 20 [a]2$ = —162,9 ° (c= 1, w kwasie octowym).Przyklad XI. Wytwarzanie l*-2-ketoimidozo- lidino-4-karbonylo-L-leucylo-L-prolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie pieciofluorofenylowego estru kwasu benzyloksykarbonylo-L-2-ketoimidazolidinokar- 25 boksylowego-4. 1056 g (40 mmoli) Z-Kic-OH i 9,09 g (44 mmoli) PEP-OH rozpuszczono w 100 ml mie:-, szaniny DMFA i dioksanu w proporcji 1:2 a nastep¬ nie do roztworu, chlodzac i mieszajac dodano 9,06 g (44 mmole) DCC. Mieszanine reakcyjna mieszano 30 w ciagu póltorej godziny w temperaturze od 0 do 5°C, potem DCU odsaczono, przesacz odparowano a jako pozostalosc otrzymany olej potraktowano n-heksanem w celu wykrystalizowania. Otrzymany w ten sposób surowy produkt w ilosci 16,46 g przekrystalizowano 35 z 50 ml octanu etylu. Otrzymano 12,75 g Kic-Z-OPFP (74% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: tem¬ peratura topnienia 146—148°C, Rf(*)=0,53, [a]D25 = =—42,1° (c = l, w octanie etylu).Analiza dla CisHu^NzFj: (masa czasteczkowa 40 430,29) obliczono: C 50,25% H 2,58% N 6,51% F 22,08% znaleziono: C 49,88% H 2,35% N 6,66% F 21,81% , Etap 2. Wytwarzanie benzyloksykarbonylo-L-2-ke- toimidazolidyno-4-karbonylo-L-leucyloTL-prolinaniidu. 45 2,38 g (9 mmoli) H-Leu-Pro-NH2. HC1 rozprowa¬ dzono w 30 ml DMFA i dodano do niego 3,87 g (9 mmo¬ li) Z-Kic-OPFP oraz 1,26 ml (9 mmoli) trójetyloaminy.Po 5 minutach mieszania dodano jeszcze 1,26 ml (9 mmoli) trójetyloaminy i po 20 minutach dalszego mie- 50 szania mieszanine reakcyjna odparowano w prózni.Pozostalosc po odparowaniu rozpuszczono w 50 ml chloroformu, roztwór wstrzasano dwukrotnie z nor¬ malnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml i raz z woda w ilosci 10 ml, osuszono bezwodnym siar* 55 czanem sodu i odparowano. Jako pozostalosc otrzy¬ many olej potraktowano eterem w celu jego wykrysta¬ lizowania i odsaczono. W ten sposób otrzymany su¬ rowy produkt w ilosci 3,31 g doprowadzono do wrze¬ nia z 30 ml octanu etylu. Po ochlodzeniu zawiesine 60 pozostawiono na kilka godzin w lodówce i potem od¬ saczono. Otrzymano 3,0 g Z-Kic-Leu-Pro-NH2 (70% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: tempera¬ tura topnienia 172—174°C, Rf(4) = 0,18, [a]D25 = =—102,6° (c = l, w kwasie octowym). 65 Analiza dla C23H3206N5: (masa czasteczkowa 473,50):123 822 19 20 oMfczono: Ci8,34% H 6)60% N l4)?9% znaleziono: G 57,52% H 6,68% N 14)62% Etap 3. Wytwafzarile L-2-k*t»lmidazolidmo-4^kar- ft©&ylo-L-l-L-^roliMUiidU. 1$2 g (2,54 mmoltt) Z-Rlc^-LWi-^r^NHi rozpuszczono w 30 ml wody, 5 dd rOztWOru dodano 0*25 g 10% katalizatora pallad* figiel dkty#ny i przez mieSzanm* przepuszczano # clajU 4 g&dzili gazowy wódótf. Nastepnie odsaczono katalizatot przeSasa OdparóWanO a btapostftciowa po- 26sfa*0Sc wysuszona w prózni nad bezwodnym pifciO*- 10 tlenkiem fesf&ru* Otrzymany W ten sposób pólprodukt W Hosci 0,^5 f ftzpuizczódo W wodzie, roztwór oczysa- ezirad w^glein aktywn?m a przezroczysty roztwór Ho- fillzdwa&o. OfrtfyffiafaO 0,61 g Kic-Leu-PttHNHs (71% Wydajndsci teoretycznej) © WlaShosetachr tempera* ii tdra tdpfli^ls,RfC) = 0,35i [tt]D"=^90,4° (c = l, W kwasie oeiowym).Przyklad XII. Wytwarzanie L-6-kótotipery- dyno-S-kafbonylo-L-leilcylo-L^prolinftttlidu.Etap 1. WytWarfeante pieriofluorbfeitflOWego estni *§ kwlau i^ketopipel^iBaWegO. 4si g (JO mmoli) kwasu L-64tet0pipe*0lineWegó i ó,0t g (33 mmoli} PSPOH r^zid*zO«onb w 100 ml chloroformu i do fÓitw§ru dódftftd mieszajac 1 chlodzac 8)fe g (33 mzaote) ©Gfc. Mieszanin* mieifclhó w ciagu godziny w tenl* if pfcritutffce 0°C5 p*f#m pozostawiono j* na fiOO W lo^ d«wee\ Nastepnego dnia wydzielony lCtt odsaczono* frrzesacz ódpafoWano a krystalldza* pozostalosc ton- falf© fc fl-he*sahem. Otrgyman? w ten fcpósob BttroWy prbdutt w ilosci 9,87 g fozpttsz&bnO W 20 rnl Octanu M etylU, reitwbf petottawiOfiO W lodWo tUtu* potem O«fydz*aeuo w*gleMI aktywnym* odia* iSbtttii i odparowano. Jako póloltetOSC Otrzymany tle) Wfcpttiiczone- W mtetianiltle 5 ml octanu etyl* i 36 Ali h-lleklahu, róztwóf ten pOiditawiono na nftc M W lodoWOe i nastepnego dnia Wydzielona Substancje kfystallWna oddzielono priez odlaczenie. Otrzymano 6,34 g Kpc-OPFP t6fc5H Wydajnosci teoretycznej) o wlaSnoteiafehi temperatur* topnienia 96^*98 *C, [a]D25=+30,0° (c = l, w octanie etylu). *• Analiza dla Ci2tls9(3Kf^; (masa czasteczkowa 309,20) obliczono: 6 46,02% H 2,61% N 4,51% F 30)72% zftalwieno: ifeaf 2. Wytwarzanie Io-ketopipcrydyno-2-karbo- nyl6*L-leUcyfe-L-prblbia»ld*4 i£& g (5 mhioli) H- 41 -Leu-Pro-NKi.HCl rozprowadzono W 20 ml DMFA i dodano dÓ niego mieszajac i chlodzac 1)01 g (5,2 mmola) Jtpc-OPFP i 0)7 ml 0 mmol!) trójetyloaminy* Pb 3 minutach miisialiia dodano jcszcjt« 0,7 ml (5 rnrnd- li) tfejet?lbafiiifiy 1 P© 20 minutach dals*ego mieszt- 50 nii ntieszanlnf fói&yjiia odparowano w ptóani. Krys- talfeena pozOltslO§c roztarto z ^tettm, substancja k^staliczna odfeaczoóo, pweffiyto na filtrze eterem i ziffinySi tóhlofoformeni oraz Wysuszono. Otrzymano W ten sposób 1)87 g Kpc-Lett-PfO-NH2 (72% wydaj- 59 nOsei teóletyczne) ó tolasnO&iatth t temperatura top¬ nienia al4^2l6°C R|(5) = 0)4l, [a] DM=^83% (c^ = 15 W kwasie btlbwym).Analiza anlittbkwasów: kwas -aminóadypinowy 0,99 (1)9) Led 1,00 (1,0), PfO a,98 (1,0). e0 Przyklad Xlii. Wytwarzanie L-6-ketópipetydy- n^-2-ksrbonylo^L-nbrwalilo-L-prOlinarnidu. 2,3S g (9,5 mmbia) H-NVa^ro-^fl2.rtCl rozprowadzono w 30 ml DMFA i dodano cfilodzac i mieszajac 3D,09 g (10 rnlnoii) Kpe-OPFP i 1,33 nil (#35 rnmola) trojtttylo- 61 aminy. Po 5 minutach mieszania dodano jeSzcze 1,33 ml (9,5 mmdla) trójetyloaminy a jeszcze po 20 minutach mieszania mieszanine reakcyjna odparowano w prózni.Krystaliczna pozostalosc roztarto z eterem, odsaczono przemyto na filtrze zimnym etanolem i wysuszono.Otrzyhiany w ted spOsdb surowy produkt W ilosci 3)66 g rozpuszczono w wodzie, roztwór oCzyizczOno wegleni aktywnym) przezroczysty roztwór Odparowano a krystaliczna pozostalosc roztarto z 10 ml etanolu.Mieszanine pozostawiono w lodówce a potem Odsa¬ czono. Otrzymano 2,10 g Kpc-Nra-Pro-NH2 (65% Wydajnosci teoretycznej o wlasnosciach: temperatura topnienia 192—193°C* Rf(5)=0,31) [o] Da5=—83)8° (c=*l) w kwasie octowym).Przyklad XIV. Wytwarzanie D-piroglutamylo- "L-deucylo-L-prólinamidu.Etap li Wytwarzanie pieciofluorofenylowegó estru kwasu b*nzyloksykarbonylo*D-pifóglutaminowegO. 4)55 g (IB mmdli) Z-D-Glp-OH i 3,68 (20 mmoli) PEPOH rozpuszczono w 50 ml ostanu etylu & do roztworu mieszajac i chlbdzac dodano 4,12 g (20 mmoli) DCC.Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu godziny W tem¬ peraturze 0°C, patem odsaczono DCU* przesacz od¬ parowano i Oleista pózOstialosc potraktowano n-hek- sanem dla WykrYstalizOWinii. Otrzymalry w teh spo* sób surowy produkt w ilosci 7,3 g roipussezono w 20 ml octanu etyhi, rOztWór pozostawiono na godzine w lo¬ dówce, potem oczyszczono weglom aktywnym i odpa- rowanOi Jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczo¬ no w 5 ml octtnu etylu i wytracono produkt dodajac 20 ml n-heksanu. Otrzymano 6,60 g Z-D-Olp-OPFP (85% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: tem¬ peratura topnienia 81"-82°C, RfC)=0,84, [a]D"<* -*+40)l% (c**h w octanie etylu).Analiza dli GuHl404NF4: (mnsa czastecikowa 459,30) Obliczono: C 53)16% H 2,82% N 3)26% F 22,13% znaleziono: C 53,28% H 3,04% N 3,02% F 21,86% Btap 2< Wytwarzanie benzylbk3ykarbonylo~D-pijro- glutamylo-L-leucylo-L-prólinamidu* 3,24 g (12,3 mmo* la) H*Leu-Pro-NH*.HGl rozprowadzono w 50 ml DMFA a nastepnie mieszajac cblodiae dodano 5)6 g (13 Mmoli) Z-D-Qlp-OPFP otai 1,72 ml (12)3 mmola) trójetyloaminy. Po 5 minutach mieszania dodano jesz- eze 1)72 ml (12,3 mmola) trójetyloaminy a po dalszych 20 minutach mieszania mieszanine reakcyjna odparo* wano w prOzni. Pozostalosc rozpuszczono w 120 ml chloroformu) roztwór wstrzasano dwukrotnie z nor¬ malnym roztworem kwasu Solnego w ilosci po 30 ml) trzykrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 30 ml i W koncu raz z Woda w ilosci 30 ml) osuszono benzWódnym siarczanem sodu i od* parowano. Oleista pozostalosc po Odparowaniu do*- prowadzono do krystalizacji za pomoca eteru* Otrzy¬ many w teA sposób surOwy produkt w ilosci 5,31 g doprowadzono do wrzenia z 50 ml octanu etylu, ótrzy* mina zawiesine pozostawiono ha 3 godziny W lodówce i potem Uzyskany produkt W postaci osadu Oddzielo¬ no przez Odsaczanie. Otrzymano 4)61 g Z-Glp-Leu- -Pro-NHi (80% wydajnosci teoretycznej o wlasnos¬ ciach: temperatura topnienia 189—194°C, Rf(4) = =* Etap 3. Wytwarzanie D»piroglutamylo-L-leucylO-L- -prolinamidu 4,48 g (9,5 mmola) Z-Glp-D-Leu- -Pro^NHi rozpuszczono w 200 ml metanolu i do rox~123 822 21 tworu dodano 0,9 g 10% katalizatora pallad-wegiel aktywny a nastepnie przepuszczono przez niego w cia¬ gu godziny gazowy wodór. Wówczas odsaczono kata¬ lizator a przesacz odparowano i bezpostaciowa po¬ zostalosc po odparowaniu roztarto z eterem. Otrzy- 5 many w ten sposób surowy produkt w ilosci 3,07 g rozpuszczono w wodzie, roztwór oczyszczono weglem aktywnym a przezroczysty roztwór liofilizowano. O- trzymano 2,90 g D-Glp-Leu-Pro-NH2 (90,5% wy¬ dajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: [a]D25= —23,6° 10 (c =l, w kwasie octowym), Rf(5) = 0,40.Przyklad XV. Wytwarzanie amidu kwasu orotylo-L-histydylo-L-pipekolinowego.Etap 1. Wytwarzanie metylowego estru orotylo-L- -histydyny. 24,2 g (100 mmoli) H-His-OMe.2HCl 15 rozpuszczono w mieszaninie 120 ml DMFA i dioksanu w proporcji 1:1. Do roztworu tego dodano 17,41 g (100 mmoli) jednowodzianu kwasu orotowego. Roz¬ twór oziebiono do temperatury 0 °C i w tej marnej tem¬ peraturze dodano 11,5 g (100 mmoli) N-hydroksy- 20 -sukcynimidu, 11,1 ml (100 mmoli) N-metylo-mor- foliny i w koncu 20,6 g (100 mmoli) DCC. Miesza¬ nine reakcyjna mieszano w ciagu godziny w tempera¬ turze 0CC a pózniej przez noc w temperaturze poko¬ jowej. Nastepnego dnia mieszanine trzymano 2 go- 25 dziny w lodówce a potem odsaczono DCU i przesacz odparowano. Jako pozostalosc otrzymany olej przez roztarcie z woda doprowadzono do krystalizacji, krysz¬ taly odsaczono i przemyto na filtrze 5% wodnym roz¬ tworem kwasu cytrynowego i woda. W ten sposób ao otrzymano 11,6 g Oro-His-OMe (38% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 258—262 °C,Rf(5)=0,40.Analiza dla C12H1305N5: (masa czasteczkowa 307,27) obliczono: N22,79% 35 znaleziono: N 22,51% Etap 2. Wytwarzanie hydrazydu orotylo-histydyny. 9,21 g (30 mmoli) Oro-His-OMe rozpuszczono w 120 ml DMFA i do roztworu dodano 7,35 (150 mmoli) wodzianu hydrazyny. Mieszanine reakcyjna pozosta- 40 wiono na 2 dni w temperaturze pokojowej, potem roz¬ cienczono 100 ml octanu etylu i na noc wstawiono do lodówki. Wydzielony osad odfiltrowano i przekrysta- lizowano z metanolu . W ten sposób otrzymano 8,07 g Oro-His-N2H3 (88% wydajnosci teoretycznej) o wlas- 45 nosciach: temperatura topnienia 250—260 CC, Rf(5) = = 0,35, Analiza dla C11H1304N7: (masa czasteczkowa 308,28) obliczono: N 31,91% znaleziono: N30,75% 50 Etap 3. Wytwarzanie amidu kwasu orotylo-L-histy- dyno-L-pipekolinowego. 5,0 g (16,28 mmola) Oro- -His-N2H3 rozprowadzono w 135 ml DMFA i do roz¬ tworu dodano 5,99 ml (48,84 mmola) 8,1 N roztworu kwasu solnego w dioksanie. Otrzymany roztwór ochlo- 55 dzono do temperatury —15 CC i mieszajac wkroplono do niego 2,13 ml (17,9 mmola) azotynu-III.rz.butylu.Mieszano mieszanine reakcyjna w ciagu 20 minut w temperaturze —10°C, w której nastepnie dodano 4,56 ml (32,56 mmola) trójetyloaminy. Do miesza- 60 niny dodano roztwór 2,05 g (16,28 mmola) H-Pip-NH2 w 10 ml DMFA i w koncu wkroplono 2,28 ml (16,28 mmola) trójetyloaminy. Po zakonczeniu tego doda¬ wania mieszanine reakcyjna mieszano jeszcze godzine w temperaturze —10 °C a nastepnie pozostawiono na « 22 noc w temperaturze 2°C. Nastepnego dnia wydzielony osad odsaczono, przesacz odparowano w prózni a po¬ zo:talosc roztarto z octanem etylu. Otrzymany w ten sposób surowy produkt w ilosci 4,6 g, co stanowilo 74% wydajnosci teoretycznej, oddzielono i 1,3 g tego produv.tu umieszczono w kolumnie chromatograficz¬ nej na mieszaninie fcarboksymetylocehllozy-23 i kar- boksymetylocelulozy-52 w proporqi 1:1 a nastepnie eluowano 0,005—0,1 molarnym roztworem octanu amonu o wartosci pH=5. Czysty produkt zebrano i liofilizowano. Otrzymano 820 mg bezpostaciowego Oro-His-Pip-NH2 o wlasnosciach: Rf(5)=0,10, [a]D«=^19,0° (c = l, w wodzie).Analiza aminokwasów: His 1,00 (1,0), Pip 0,94 (1,0).Przyklad XVI. Wytwarzanie amidu kwasu orotylo-L-histydylo-D-pipekolinowego. 5,0 g (16,28 mmola) Oro-His-N2H3 rozprowadzono w 135 ml DMFA i dodano 5,99 ml (48,84 mmola) 8,1 N roz¬ tworu kwasu solnego w dioksanie. Otrzymany roztwór ochlodzono do temperatury —15°C i mieszajac wkro¬ plono do niego 2,13 ml (17,9 mmola) azotynu-III.rz.- -butylu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 20 minut w temperaturze —10 °C, potem w tej samej temperaturze wkroplono 4,56 ml (32,56 mmola) trój* etyloaminy, dodano do mieszaniny roztwór 2,05 g (16,28 mmola) H-D-Pip-NH2 i w koncu 2,28 ml (16,28 mmola) trójetyloaminy. Po zakonczeniu doda¬ wania mieszanine reakcyjna mieszano jeszcze godzine w temperaturze —10 °C, potem pozostawiono ja na noc w lodówce w temperaturze 2°. Nastepnego dnia wydzielony osad odsaczono przesacz odparowano w prózni a pozostalosc po odparowaniu roztarto z octa¬ nem etylu. Otrzymano w ten sposób 4,1 g surowego produktu, co stanowilo 66% wydajnosci teoretycznej. 1,3 g tego pólproduktu umieszczono w kolumnie chro¬ matograficznej na mieszaninie karboksymetylocelulo- zy-23 i karboksymetylocelulozy-52 w proporcji 1:1 oraz eluowano 0,005—0,1 molarnym roztworu octanu amonu o wartosci pH = 5. Frakcje zawierajace czysty produkt polaczono i liofilizowano. Otrzymano 795 mg bezpostaciowego Oro-His-D-Pip-NH2 o wlasnosciach: Rf(5)=0,lÓ, [a]D24=+13,5c (c = l, w wodzie).Analiza aminokwasów: His 1,00 (1,0), Pip 0,96 (1,0) Przyklad XVII. Wytwarzanie orotylo-L-histy- dylo-L-homoprolinamidu. 5,0 g (16,28 mmola) Oro- -His-N2H3 rozprowadzono w 135 ml DMFA i dodano 5,99 ml (48,84 mmola) 8,1-normalnego roztworu kwasu solnego w dwuóksanie. Otrzymany roztwór ochlodzono do temperatury —15°C mieszajac wkro¬ plono do niego 2,13 ml (17,9 mmola) azotynu-III-rz.- butylu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 20 minut w temperaturze —10°C, potem w tej same; temperaturze wkroplono kolejno 4,56 ml (32,56 mmola) trójetyloaminy, roztwór 2,05 g (16,28 mmola) H-Pro- -NH2 w 10 ml DMFA i w koncu jeszcze 2,28 ml (16,28 mmola) trójetyloaminy. Po zakonczeniu tego dodawa¬ nia mieszanine reakcyjna mieszano jeszcze w czasie godziny w temperaturze —10°C a potem pozostawio¬ no na noc w lodówce w temperaturze 2°C. Nastepne¬ go dnia osad odsaczono, przesacz odparowano w próz¬ ni a pozostalosc roztarto z octanem etylu. Otrzymano w ten sposób surowy produkt w ilosci 4,2 g (67% wy¬ dajnosci teoretycznej). 1,3 g tego pólproduktu umiesz¬ czono w kolumnie chromatograficznej na mieszane123 23 karboksymetylocelulozy-23 i karboksymetylocelutozy-52 w proporcji 1:1 oraz eluowano 0,005—0,1, molarnym roztworem octanu amonu. Frakcje zawierajace czysty produkt polaczono i liofilizowano. Otrzymano 802 mg bezpostaciowego Oro-His-HPro-NH2 o wlasnosciach: Rf(5)=0,10, [a]D" =—12,8 *(c = l, w wodzie).Analiza aminokwas ów: His 1,00 (1,0), HPro 0,91 (1,0).Przyklad XVIII. Wytwarzanie amidu kwasu L-6-ketopiperydyno-2-karbonylo-L-norwalilo-L-tiazoli- dyno-karboksyIowego-4. 2,55 g (9,5 mmola) H-Nva-rca- -NH2.HC1 rozprowadzono w 30 ml DMFA i miesza¬ jac i chlodzac dodano 3,09 g (10 mmoli) Kpc-OPFP i 1,33 ml/ (9,5 mmola) trójetyloaminy. Po 5 minutach mieszania dodano jeszcze 1,33 ml (9,5 mmola) tiój- etyloaminy i po dalszych 20 minutach mieszania mie¬ szanine reakcyjna odparowano w prózni. Jako pozos¬ talosc otrzymany olej pozostawiono na noc w lodówce i przez to doprowadzono do jego krystalizacji. Nastep¬ nego dnia krysztaly odsaczono oraz przemyto eterem i zimnym etanolem. Otrzymany w ten sposób surowy produkt w ilosci 3,25 g rozpuszczono w wodzie, roz¬ twór oczyszczono weglem aktywnym, przezroczysty roztwór odparowano, krystaliczna pozostalosc roztarto z 20 ml etanolu i pozostawiono na noc w lodówce.Nastepnego dnia otrzymany produkt odsaczono i wy¬ suszono. Otrzymano 2,0 g Kpc-Nva-Tca-NH2 (59% wy¬ dajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 183—185°C, Rf(5) = 0,47, [a] D" =—136,0°C (c = 1, w kwasie octowym).Przyklad XIX. Wytwarzanie L-6-ketopipery- dyno-2-karbonylo-L-norwalilo-L-homoprolinamidu.Etap 1. Wytwarzanie III.rz.-butyloksykarbonylo-L- -homoprolinamidu. 2,29 g (10 mmoli) BOC-HPro- -OH rozpuszczono w 30 ml octanu etylu, do roztworu 35 dodano 1,4 ml (10 mmoli) trójetyloaminy, potem mie¬ szanine ochlodzono do temperatury —10°C i wkro- plono do niej 1,3 ml (10 mmoli) estru i izobutylowego kwasu chloroweglowego. Po 15 minutach mieszania do roztworu doprowadzono w ciagu pól godziny amoniak 40 gazowy w temperaturze —10°C. Nastepnie miesza¬ nine pozostawiono na 2 godzi ly w temperaturze od 0—5°C. Osad odsaczono, przesacz odparowano a jako pozostalosc otrzymany olej rozpuszczono w 30 ml chloroformu. Roztwór wstrzasano dwukrotnie z nor- 4) malnym roztworem kwasu solnego w ilosci po 10 ml, równiez dwukrotnie z normalnym roztworem wodoro¬ weglanu sodu w ilosci po 10 ml i w koncu z woda w ilosci 10 ml, wysuszono bezwodnym siarczanem sodu, odparowano a jako pozostalosc otrzymany olej dopro- 50 wadzono do krystalizacji za pomoca n-heksanu. Otrzy¬ many w ten sposób surowy produkt w ilosci 1,95 prze- krystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru.W koncu otrzymano 1,78 g BOC-HPro-NH2 (78% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach: tempera- 55 tura topnienia 138—140°C Rf(2) = 0,43, [a]D?5= =—24,85° (c = l, w kwasie octowym).Analiza dla C^H^OaNj: (masa czasteczkowa 228,29) obliczono: C 57,87% H 8,83% N 12,27% znaleziono: C 57,65% H 8,89% N 12,11% «° Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku L-homopro- linamidu, 1,6 g (7 mmoli) BOC-HPro-NH2 rozpusz¬ czono w 10 ml cieplego octanu etylu, roztwór ochlo¬ dzono do temperatury pokojowej i dodano do niego 10 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu, m 822 24 Mieszanine reakcyjna pozostawiono na godzine w tem¬ peraturze pokojowej, rozcienczono eterem, osad roz¬ tarto z eterem i odsaczono. W ten sposób otrzymano 1,05 g H-HPro-NH2.HCl (91% wydajnosci teore¬ tycznej) o wlasnosciach: temperatura topnienia 178— —180°C, Rf(6)=0,32, [a]D25=+26,2° (c = l, w me¬ tanolu).Etap 3. Wytwarzanie chlorowodorku L-norwalilo-L- -homoprolinamidu. 0,99 g (6 mmoli) H-Pro-NH2.HCl rozprowadzono w 20 ml DMFA i mieszajac dodano 0,84 ml (6 mmoli) trójetyloaminy oraz 2,3 g (6 mmoli) BOC*Nva-OPFP. Po uplywie 15 minut dodano jesz¬ cze 0,84 g (6 mmoli) trójetyloaminy i po godzinnym mieszaniu mieszanine odparowano w prózni. Pozosta¬ losc rozpuszczono w 50 ml chloroformu, roztwór wstrzasano dwukrotnie z normalnym kwasem solnym w ilosci po 10 ml, równiez dwukrotnie z normalnym roztworem wodoroweglanu sodu w ilosci po 10 ml, osuszono bezwodnym siarczanem sodu i odparowano.Otrzynuny jako pozostalosc olej rozpuszczono w 6 ml octanu etylu, do roztworu dodano 10 ml 6N roztworu kwasu solnego w octanie etylu. Po godzinie mieszani¬ ne reakcyjna rozcienczono eterem, bezpostaciowy osad roztarto, odsaczono i wysuszono w prózni nad bezwod¬ nym wodorotlenkiem sodu. W ten sposób otrzymano 1,22 g H-Nva-HPro-NH2.HCl (89,5% wydajnosci teoretycznej) o wlasnosciach Rf(5) =0,12.Etap 4. Wytwarzanie L-6-ketopiperydyno-2-karbo- nylo-L-norwalilo-L-homoprolinamidu. 1,22 g (5,37 mmoli) H-Nva-HPro-NH2•HC1 rozpuszczono w 20 ml DMFA i do roztworu dodano 0,75 ml (5,37 mmola) trójetyloaminy oraz 1,7 g (5,5 mmola) Kpc-OPFP.Po 5 minutach mieszania dodano dodatkowo 0,75 ml (5,37 mmola). trójetyloaminy i po uplywie dalszych 20 minut, w czasie których mieszanine mieszano, odparowano ja w prózni. Pozostalosc roztarto z ete¬ rem i w ten sposób otrzymany bezpostaciowy surowy produkt w ilosci 1,8 g umieszczono w kolumnie chro¬ matograficznej na zelu krzemionkowym w ilosci 40 g a nastepnie eluowano mieszanine rozpuszczalników (4).Francje eluatu zawierajace czysty produkt polaczono i odparowano. Otrzymano 1,11 g czystego produktu, który rozpuszczono w wodzie, oczyszczono weglem aktywnym a przezroczysty roztwór liofilizowano. W ten sposób otrzymano 1,0 g Kcp-Nva-HPRo-NH2 (53% wydajnosci teoretycznej) o nastepujacych wlas¬ nosciach: Rf(5) = 0,35, [a]D35 =—44,6° (c = l, w kwasie octowym).Zastrzezenia patentowe 1 Sposób wytwarzania nowych trójpeptydoamidów o ogólnym wzorze X-Y-W-NH2,w którym X oznacza grupe L-piroglutamylowa, D-piroglutamylowa, L-2- -ketoimidazolidyno- 4-karbonylowa, L-6-ketopipekolilo- wa, L-tiazolidyno-4-karbonylowa, L-prolilowa lub oro- tylowa, Y oznacza grupe L-leucylowa, L-norwalilowa lub L-histydylowa, W oznacza grupe L-prolilowa, D-prolilowa, L-tiazolidyno-4-karbonylowa, L-homo- prolilowa, L-leucylowa, L-izoleucylowa, L-metiony- lowa, L-pipekolilowa lub D-pipekolilowa albo grupa o wzorze -W-NH2 razem oznacza grupe pirolidylowa lub piperydylowa, przy czym jezeli X oznacza grupe L-piroglutamylowa a Y oznacza grupe L-histydylowa, wówczas W ma znaczenie inne niz grupa L-prolilowa, znamienny tym, ze wychodzac ze zwiazków o ogól-123 822 25 nym wzorze W-NH2,w którym W ma wyzej podane znaczenie wytwarza sie etapami zwiazek o wzorze X-Y-W-NH2 przez zastosowanie znanych w chemii peptydów metod sprzegania, przy czym zwiazek o ogól¬ nym wzorze W-NH2, w którym W ma wyzej podane znaczenie acyluje sie zabezpieczonym estrem piecio- fluorofenylowym aminokwasu o ogólnym wzorze BOC- -Y-OPFP, U którym BOC oznacza grupe III-rzed. butoksykarbonylowa, OPFP oznacza grupe piecio- fluorofenoksylowa, a Y ma wyzej podane znaczenie, i z tak otrzymanego zabezpieczonego dwupeptydu o ogólnym wzorze BOC-Y-W-NH2, w którym BOC, Y i W maja wyzej podane znaczenie, uwalnia sie przez hydrolize kwasowa dwupeptyd o ogólnym wzorze H-Y-W-NH2,w którym Y i W maja wyzej podane zna¬ czenie i ten dwupeptyd acyluje sie zabezpieczonym ' estrem pieciofluorofenylowym aminokwasu o ogól¬ nym wzorze Z-X-OPFP, w którym Z oznacza grupe benzyloksykarbonylowa, a X i OPFP maja wyzej po¬ dane znaczenie, o w otrzymanym zabezpieczonym trójpeptydoamidzie o ogólnym wzorze Z-X-Y-W-NH2, w którym Z, X, Y i W maja wyzej podane znaczenie, odszczepia sie przez katalityczne uwodornienie grupa zabezpieczajaca Z. 26 2. Sposób wytwarzania nowych trójpeptydoamidów o ogólnym wzorze X-Y-W-NH2,w którym X oznacza grupe L-piroglutamylowa, D-piroglutamylowa, L-2- -ketoimidazolidyno-4-karbonylowa, L-6-ketopipekolilo- 5 wa, L-tiazolidyno-4-karbonylowa, L-prolilowa lub oro- tylowa, Y oznacza grupe L-leucylowa, L-norwalilowa lub L-histydylowa, W oznacza grupe L-prolilowa, D-prolilowa, L-tiazolidyno-4-karbonylowa, L-homo- prolilowa, L-leucylowa, L-izoleucylowa, L-metiony- lowa, L-pipekolilowa lub D-pipekolilowa albo grupa o wzorze -W-NH2 razem oznacza fcrujpe pirolidylowa lub piperydylowa, przy czym jezeli X oznacza grupe L-piroglutamylowa a Y oznacza grupe L-histydylowa, wówczas W ma znaczenie inne niz grupa L-prolilowa, znamienny tym, ze zwiazek o ogólnym wzorze W-NH2, w którym W ma wyzej podane znaczenie, acyluje sie zabezpieczonym azydkiem dwupeptydu o ogólnym wzorze Z-X-Y-N3,w którym Z, X, i Y maja wyzej po¬ dane znaczenie, i w otrzymanym zabezpieczonym trój¬ peptydoamidzie o ogólnym wzorze Z-X-Y-W-NH2 w którym Z, X, Y i W maja wyzej podane znaczenie, odszczepia sie przez katalityczne uwodornienie grupa zabezpieczajaca Z. PL PL PL