CS241028B2 - Method of tripeptidamides production - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových, na centrální nervový systém působících trípeptidamidů obecného vzorce I

X-Y-W—NHz (I) ve kterém znnačí

X L-pyroglutamylovou skupinu, D pyroglutamylovou skupinu, L-2-ketOimidazolidin-4-karbonylovou skupinu, L-6-ketopipekolylovou skupinu, L-thiazolidin-4-karbonylovou skupinu, L-prolylovou skupinu nebo orotylovou skupinu,

Y L-leucylovou skupinu, L-norvalylovou skupinu nebo ' L-histidylovou skupinu a

W L-prolylovou skupinu, D-prolylovou skupinu, L-thiazolidin-4-karbonylovou skupinu, L-homoprolylovou skupinu, Ldeucylovou skupinu, L-soleucylovou skupinu, L-methionylovou skupinu, L-pipekolylovou skupinu nebo' D-pipekolylovou skupinu, přičemž dále —W—NH2 mohou také tvořit pyrrolidylovou nebo piperidylovou skupinu, ovšem když

X značí L-pyroglutamylovou skupinu a

Y značí L-histidylovou skupinu, potom

W má jiný význam než je L-prolylová skupina, a když

X značí L-prolylovou skupinu a

Y značí L-leucylovou skupinu, pak

W má jiný význam než L-prolylová skupina nebo L-thiazolidín-4-karbonylová- - skupina, jakož i terapeuticky použitelných komplexů těchto sloučenin.

Nové tripeptidové deriváty odpovídající výše definovanému obecnému vzorci I jsou analogy L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamidu (Glp-His-Pro-NHž), známého také jako „thyreotropín-releasing hormon“ (TRH), ve kterém jsou ale některé aminokyselinové skupiny nahrazeny určitými jinými, ve vzorci I definovanými aminokyselinovými skupinami, nebo - v případě —W—NH2 pyrrolidylovou nebo piperidylovou skupinou.

Existence TRH byla známa již od šedesátých let tohoto století, jeho struktura byla však objasněna teprve v letech 1989 a 1970 prakticky současně, ale navzájem nezávisle výzkumnými skupinami R. Guillemina a A. Schally [Bowers C. Y. a kol., Endocrinology 86, 1 143 (1970); R. Burgus a kol., C. R. Acad. Sci. Paris, 269, 1 870 (1970)].

Tripeptid TRH byl původně ' popsán jako regulační faktor uvolňování thyreotropního hormonu (TSH) v hypofyse savců; výzkum zabývající se tímto hormonem se však dal novým směrem, neboť se zjistilo, že biolo241028

241020 gická funkce tohoto tripeptidu není omezena na regulaci uvolňování thyreotropního hormonu, nýbrž spočívá také v působení na centrální nervový systém, [viz N. P. Plotnikoff a kol., Science 178, 417 (1972); A. J. Prange a kol., Lancet 2, 999 (1972)]. Bylo totiž zjištěno, že TRH vedle funkce hormonové způsobuje také podstatné zkrácení doby spánku způsobeného barbituráty nebo alkoholem, dále také redukuje hypothermii způsobenou různými léčivými prostředky a zvyšuje lokomotorickou aktivitu. Další důležitý faktor působení TRH na centrální nervový systém je potlačování katalepsie způsobené Haloperidoleni. Jeví se tedy jako žádoucí, vyrobit pro terapeutickou praxi takové analogy TRH, které působí na hypofysu pouze slabě a naproti tomu by mělo být působení na centrální nervový systém stejné jako u TRH nebo ještě vyšší. Za tímto účelem byly vyrobeny sloučeniny popsané v DE-OS č. 2 343 035, DE-OS č. 2 343 037, DE OS č. 2 449 167, DE-OS č. 2 514 381, DE-OS č. 2 609 154, DE-OS č. 2 639 393 a BE-PS číslo 819 198. Dosavadní výzkum, tohoto problému se týkající a jehož výsledky a postupy jsou zahrnuty v pracích A. J. Prange a kol., „The role of Hormones in Depression“, Life Sctences 20, 1 305 (1977) а А. V. Schally a kol., „Hypothalmic Regulátory Hormones“, Ann. Rev. Biochem. 47, 89 (1978), nevedl ale ke ze všech hledisek uspokojivým výsledkům, které by vedly к uspokojení potřeb terapeutické praxe.

Nyní bylo zjištěno, že se systematickou výměnou některých aminokyselin z aminokyselin, které tvoří molekulu TRH, muže dosáhnout toho, že hormonové působení tripeptidu se zcela odstraní nebo alespoň podstatně zredukuje, přičemž účinek na centrální nervový systém zůstane stejný nebo se dokonce podstatně zvýší.

Jako obzvláště výhodné se jeví takové deriváty, ve kterých je namísto histidinové skupiny v poloze 2 aminokyselinová skupina, obsahující přímý nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec. S ohledem na ještě selektivnější biologické působení se jeví jako výhodné do molekuly peptidu zabudovat namísto pyroglutamylového kruhového systému skupinu 6-ketopipekolinové kyseliny.

Způsob výroby tripeptidamidů obecného vzorce I spočívá podle vynálezu v tom, že chráněné aminokyselinové deriváty obecného vzorce II

R¹-—X—m¹ (II) a obecného vzorce III

R²—Y—M² (III) a amid nebo amin obecného vzorce IV

W—NH2 (IV) kde značí

R¹ a R² atom vodíku nebo chránící skupiny odštěpitelné acidolyticky,

M^l a M² hydroxylovou skupinu nebo aktivující skupiny a

X, Y a W mají výše uvedený význam, spolu reagují v pořadí uvedeném v obecném vzorci I. Chrániči skupiny se potom popřípadě odštěpí a získané produkty se popřípadě převedou na terapeuticky použitelné komplexy.

Tripeptidové deriváty výše definované obecným vzorcem I se dají vyrobit pomocí o sobě známých metod z chemie peptidů z odpovídajících aminokyselin, popřípadě aminokyselinových derivátů, výhodně tak, že se

a) vychází ze sloučeniny obecného vzorce IV

W-NHz (IV) ve kterém iná W výše uvedený význam, a z této sloučeniny se postupně za použití v chemii peptidů běžných kopulačních metod, výhodně za použití aktivních esteru, směsných anhydridu nebo dicyklohexylkarbodiimidu, vybuduje molekula sloučeniny obecného vzorce I nebo se

b) sloučenina obecného vzorce IV

W—NH2 (IV) ve kterém má W výše uvedený význam, acyluje azidem vyrobeným z dipeptidhydrazidu obecného vzorce

Z—X—Y—NH—NH?

ve kterém značí Z benzyloxykarbonylovou skupinu а X a Y mají výše uvedený význam a potom se ze sloučeniny obecného vzorce získané tímto způsobem

Z—X—Y—W—NH:?

ve kterém mají Z, X. Y a W výše uvedený význam, odštěpí ochranná skupina Z, výhodně katalytickou hydrogenací a získaný produkt obecného vzorce I se z reakční směsi izoluje a/nebo se popřípadě převede na terapeuticky použitelný komplex.

Při použití postupné výstavby molekuly je účelné nechat reagovat v přebytku výchozí sloučeninu obecného vzorce W—NI-I? s aktivním derivátem, obzvláště s pentafluorfenýlesterem chráněné aminokyseliny obecného vzorce

BOC—Y—OH, kde BOC značí terc.butyloxykarbonylovou ochrannou skupinu, přičemž se získají odpovídající dipeptidové deriváty vzorce

BOC—Y—W—NHí v extrémně krátké době (několik minut), · v lehce zpracovatelné formě, která většinou nevyžaduje dalšího čištění. Takovéto d^:peptidové deriváty obecného vzorce

BOC-Y—W—NHz se mohou získat pomocí jiných kopulačních metod, například za pomoci směsných anhydridů nebo volných kyselin za přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu.

Dipeptidy uvolněné ze získaných chráněných dipeptidových derivátů obecného vzor · ce

I3OCC-Y--W---NH·;

acidolysou mají obecný vzorec

Η—Y—W—NHs a výhodně se potom opět nechají reagovat s pentafluorfenylesterem chráněnou aminokyselinou obecného vzorce

Z — X · -OH.

přičemž potom se výše popsanou výhodnou cestou získají odpovídající chráněné tripeptidové deriváty obecnělm vzorce

Z—X—Y—W—NH?.

Acylace výchozí sloučeniny vzorce

W......nh.:

azidem přepravitelným z hydrazidu vzorce

Z-X-Y.....NH-N№ má tu výhodu, že uvedené hydrazidy jsou velmi dobře krystalizovatelné a z tohoto důvodu se jedná o meziprodukty, které je možno izolovat ve velmi čisté formě.

Sloučeniny obecného vzorce I, které mají substltuent X pyroglutamylovou skupinu, se mohou vyrobit také tak, že se pyroglutamylový kruh tvoří z glutaminové skupiny pouze v posledním stupni syntézy, a sice tak, že se glutamin zavádí · do molekuly jako třetí aminoskupina a tripeptid obecného vzorce

Cln—Y—W—NH?

tímto postupem získaný se několik _ minut zahřívá v kyselině octové.

Z chráněných tripeptidových derivátů obecného vzorce

Z—X—Y—W—NHž vyrobených výše popsanými metodami, se mohou žádané konečné produkty obecného vzorce I uvolnit výhodně katalytickou hydrogenací. Čistění získaného konečného produktu se může provádět jednoduchou krvstaHzací' nebo vysrážením, pokud ' to· je nutné, může se také použít chromatografie na sloupci. Konečný produkt se může popřípadě po odstranění vedlejších produktů také vypreparovat jednoduchou lyofilizací.

Tripeptidové deriváty obecného vzorce I, vyrobené podle vynálezu se zkoušejí podle dále popsaných bilogických metod · na svůj farmakologický účinek.

1. Potlačení haloperidolové katalepsie u krys (viz J- Delay a P. Deniker: Compt. Rerid. Cong. Med. Alonistes Neurologistes, 19, 497, Luxemburg 1952) mg/kg Haloperidolu, což je 4-(p-chlorfenyl )-1-(3-( p-f luorbenzoyl) propyl ] piperidin-4-ol se aplikuje zvířatům podkožně a po uplynutí 120 minut se kontroluje nástup katalepsie. Potom se krysy po skupinách vždy po 10 kusech rozdělí a intravenózně se na ně aplikuje dávka TRH, popřípadě nová analoga TRH-lripeptidů. Zvířatům kontrolní skupiny se podává fyziologický roztek chloridu sodného. V intervalu 15, 30, 90 a 120 minut po podání se zkouší úč?nek jednotlivých sloučenin, snižující katalepsii. Jako kataleptická jsou posuzována ta zvířata, která, kdví se jejich přední nohv daií na 7 centimetrů vysoký sloupek, nezmění během 30 sekund svoji pozici.

Z počtu zvířat, která nevykazují katalepsii, se zjistí pro jednotlivé účinné látky pomocí probit-analýzy odpovídající hodnoty EDóo. Uvedené pokusy se provádí se samci krys o celkové hmotnosti 160 až 180 g.

2. Stupňování lokomotorické aktivity u myší, způsobené L-Dopa. (viz The Thyroid Axis, Drugs and Behavlor, str. 116, A. J. Prage Jr., Reveň Press, Mew York, 1974)

Zvířatům se nejprve intraperitoneálně po. dá 40 mg/kg ^Ltmthyll-N-n’opalrgylben^rzylaminu (Pargylin), potom 20 mg/kg TRH, popřípadě stejná dávka zkoušených nových tripeptidů podle vynálezu a nakonec 100 mg na kg L-Dopa. Vždy po 30, 60 a 90 minutách po výše uvedeném zpracování se měří lokomotorická aktivita pokusných zvířat. Zjištěné hodnoty jsou uvedeny v následující tabulce udané v procentech, ve vztahu ke zvířatům zpracovaným TRH. K tomuto pokusu se použije vždy 15 samčích · myší o celkovém hmotnosti 18 až 22 g.

3. Účinek obracející reserpinovou hypothermii · u myší [viz Β. M. Áskew: Life Sci 2, 725—730 (1963)].

Myším samcům o hmotnosti 18 až 22 g, rozděleným do skupin po 10 zvířatech, se intraperitoneálně podá 5 mg/kg reserpinu.

Po 16 hodinách se těmto zvířatům dále podá TRH v dávce 20 mg/kg, popřípadě stejné množství zkoumaných tripeptidů.

Rektální teplota zvířat se měří před aplikací reserpinu (v následující tabulce označeno „norm.“), po 16 hodinách po aplikaci reserpinu (v následující tabulce označeno .,res.“j a po jedné, popřípadě dvou hodinách po podání zkoumaného tripeptidů (v tabulce označeno „po zpr.“). V této tabulce jsou uváděny průměrné teploty naměřené u všech deseti myší.

4. Ovlivnění doby spánku způsobeného he xobarbitalem

Samcům myší rozděleným do skupin po 10 zvířatech se intravenózně podá vždy 60 mg/kg hexobarbitalu-Na. P_o 10 minutách se myším podá dávka vždy 20 mg/kg TRH, popřípadě zkoumaných tripeptidů, intraperitoňeálne. V následující tabulce jsou uvedeny hodnoty doby spánku takto ošetřených zvířat, vztaženo na dobu spánku zvířat kontrolní skupiny (vždy průměrná hodnota 10 zvířat).

5. Ethanolová narkóza [viz J. M. Cott a kol.;

J. Pharmacol. Exp. Ther. 196, 594 (1976)].

Myším CFLP (LATI) obou pohlaví, rozděleným do skupin o dvaceti zvířatech s hmotností 13 až 22 g se intraperitoneálně podá vždy 4.5 g ethylalkoholu. Po 10 minutách se potom zvířatům podá dávka vždy 20 mg na kg intraperitoneálně zkoumaného tripeptidu. V následující tabulce jsou uvedeny doby spánku takto ošetřených zvířat, vztažené na dobu, spánku zvířat kontrolní skupiny (vždy průměrná hodnota 20 zvířat).

6. Hormonová aktivita (účinek TSH) u krys

Krysí samci o hmotnosti asi 200 g se rozdělí do skupin po 7 až 8 kusech a intravenózně se jim aplikuje vždy 20 mg/kg TRH, popřípadě zkoumaného tripeptidů; 15 minut po aplikaci TRI-I nebo TRH analogických sloučenin se zjišťuje TSH-reakce u zvířat radiomnuiologicky z plasmy. Relativní výsky účinku se vypočítají podle čtyrbodové metody za pomoci počítače, přičemž výška účinku TRH se uvažuje jako 100.

Biologické účinky důležitějších sloučenin obecného vzorce I, zjištěné výše popsanými farmakologickými metodami jsou zahrnuty v následující tabulce.

Tabulka potlačení haloperistupňování lokomotorické

X-Y-Z-NH?

TSH-

X	Y	z	dolové katalepsie	akt. L-Dopa v % po	-účinek
ED.50 (mg/kg)	doba (min)	30*	60‘	90'
Kpc	Leu	Pro	23,5	60	319	80	127	2,7 ’
Kpc	Nva	Pro	10,6	30	36	45	65	0
Glp	Leu	Tca	31,4	120	171	142	52	0
Glp	Leu	Píp	38,5	120	201	89	112	7,2
Glp	Nva	Tca	56	30	195	147	79	0
Kpc	Nva	Tca	60,3	30	103	38	70	—
Kpc	Nva	HPro	35,3	15	63	30	108
D-Glp	Leu	Pro	70	15	54	58	115	0
Kic	Leu	Pro	80	30	118	70	98	0
	TRH		80	15	100	100	100	100
				Tabulka
X-	-Y—Z—	•NH2		obrácení reserplnové		doba	doba
X	Y	Z	hypotermie rektální teplota	°C	spánku	spánku
					po zprac.	po hexo-	po etha-
			norm.	res.	1 h	2 h	barbltalu	nolu %

%

Kpc	Leu	Pro	36,3	24,5	32,0	33,9	37	79
Kpc	Nva	Pro	36,3	23,9	33,1	32,5	51	46
Glp	Leu	Tca	36,2	24,9	33,1	32,2	39	58
Glp	Leu	Píp	36,4	24,6	30,7	31,0	38	60
Glp	Nva	Tca	36,5	32,8	31,4	30,7	69	51
Kpc	Nva	Tca	36,4	23,6	30,4	29,0	61	48
Kpc	Nva	HPro	36,3	20,7	26,5	32,2	76	35
D-Glp	Leu	Pro	36,5	27,4	25,8	25,6	97	54
Kic	Leu	Pro	35,5	24,1	27,7	28,8	59	69
	TRH		36,2	25,9	35,5	30,2	56	35

ТО

Z údajů ve výše uvedené tabulce je zřejmé, že nová analoga TRH, u nichž jsou dvě nebo tři aminokyseliny molekuly- TRH nahrazeny jinými aminokyselinami, vykazují značné účinky na centrální nervový systém. Z tohoto hlediska jsou obvzláště výhodné takové deriváty, ve kterých je namísto histidinové skupiny v poloze 2 molekuly TRH alifatická aminokyselina s přímým nebo rozvětveným uhlovodíkovým - řetězcem. Z hlediska tohoto působení jsou rovněž výhodná taková analoga TRH, ve kterých je skupina Glp nahrazena kyselinou 6-ketopipekolinovou. U těchto derivátů je hormonové působení TRH buď úplně potlačeno, nebo je zredukováno na minimum, přičemž současně se zvýší podstatně účinek na centrální nervový systém, v některých případech dokonce až na osminásobek.

Nové tripeptidy, jakož i jejich farmaceuticky použitelné soli, vyrobené způsobem podle vynálezu, popřípadě jejich komplexy, se mohou používat v terapii ve formě běžných farmaceutických preparátů. Tylo preparáty obsahují účinné látky podle vynálezu spolu s anorganickými nebo organickými nosnými substancemi, vhodnými pro parenterální nebo enterální aplikaci. Farmaceutické preparáty se mohou připravit například ve formě tablet, dražé, injekčních preparátů, lyofilisátů a podobně. Výroba takovýchto léčivých přípravků se může provádět běžnými metodami používanými ve farmacii.

Praktické provedení způsobu podle vynálezu, popřípadě chemická výroba nových analog TRH podle vynálezu, je blíže objasněna v následujících příkladech provedení. V těchto příkladech používané zkratky odpovídají běžným konvenčním zkratkám používaným v chemii peptidů [viz J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)]. V následujících příkladech se ještě používají další zkratky:

HPro L-homoproiín

Kic L-2’ketonnidazolidin-4-karboxylová kyselina

Kpc kyselina

Oro kyselina ©octová

Pip kyseiina L-pipekoimová

Tca Ь-ШагоНО' kyselina

DCC dicyktohexylkalΌodiimid

DCU dicyktoheyolmozovma

PEPOH pentaflzorSenol

DMFA diz]ethyltornaamid

V příkladech uváděné teploty tání jednotlivých sloučenin, byly určovány pomocí přístroje pro měření teplot tání podle dr. Tottoliho. Hodnoty optické otáčivosti byly určovány na polarimetru. Při měření pomocí chromatografie na tenké vrstvě se používaly k pokusům destičky „silikagel G na oceli“. K vyvíjení chromatogramů se používají následující směsi rozpouštědel:

(1) chloroform : methylalkohol 9 : 1 (2) ethylacetát : (pyridin : kyselina octová : voda /20 : 6 : 11/) 95 : 5 (3) ethylacetát : (pyridin : kyselina -octová : voda /20 : 6 : 11/) 9 : 1 (4) ethylacetát : (pyridin : kyselina octová : voda /20 : 6 : 11/) - 8 : 2 (5) ethylacetát : (pyridin : kyselina octová : voda /20 : 6 : 11/) 3 : - (6) ethylacetát : (pyridin : kyselina octová : voda /20 : 6 : 11/) 2 : 3

K vyvíjení skvrn se používá roztok ninhydrinu, přičemž po postříkání se - destičky suší asi po dobu 5 minut při teplotě 105 °C. Potom se chromatogramy uloží do prostředí s obsahem chloridu a po vy větrání se vyvíjejí roztokem o-tolidin-kaliumjodidu...

Pro čištění za pomoci chromatografie na sloupci se používá silikagel G o velikosti částic 0,062 až 0,2 mm.

Pro odpařování roztoků ve vakuu se používá rotační vakuová odparka; odpařování se provádí při teplotách nepřesa-hniících 50 - C. '

Pentanaorfenylester aminokyselin, chráněných BOC se připraví pomocí metody L. Ktsfaludy a kol., Arm. 1973, 1421.

Příklad 1

Amid kyseliny L-pyroglutamyl-L-^eucyl-L-pipekzlinové

Stupeň 1

Hydrochlorid amidu kyseliny

L-kmcyl-L-pipekol lnové

1,54 g (12 molů) H-Pip-NHž se suspenzuje ve 20 ml dlmetbylformamidu a tato suspenze se za míchání smísí s 5,16 g (13 mmolů) BOC-leu OPFP a 1,68 ml (12 mmol). Reakční směs se míchá ještě dalších - 6 hodin, potom se získaný roztok ve vakuu odpaří a získaný olejovitý zbytek se rozpustí v 60 mililitrech chloroformu. Tento roztok se smísí s 0,2 ml 2-(dimethylamino)eth.ylaminu, reakční směs se nechá stát po dobu 5 minut a potom se vytřepe napřed třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku hydrogenuhličítanu sodného a nakonec jednou 20 ml vody, potom se reakční směs vysuší bezvodým síranem - - sodným a odpaří. Olejovitý zbytek se rozpustí ve 3 ml octanu ethylnatého a tento roztok se smísí s roztokem 10 ml 5 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v -octanu ethylnatém. Po jednohodinovém stání se reakční směs zředí etherem, vzniklá sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší bezvodým síranem sodným. Tímto způsobem se získá 3,12 g bl-Leu-Pip-NH2 . HC1 (94 % teoretického výtěžku vztaženo -na H-Pip-NHz).

R/⁵) = 0,46.

Stupeň 2

Amicl kyseliny benzyloxykarbonyl-L-pyrcglutamyl-L-leucyl-L-pipekolínové

3,13 g (11,2 mmolu) H-Leu-Pip-NH? . HCl a 4,94 g (11,5 mmolu) Z-Glp-OPFP se rozpustí ve 35 ml dimethylformamidu a tento roztok se smísí s 1,57 ml (11,2 mmolu) triethylaminu. Po pětiminutovém míchání se přidá dalších 1,57 ml (11,2 mmolu) triethylaminu a po dalším dvacetiminutovém míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek se rozpustí v 90 ml chloroformu a roztok se nejprve dvakrát vytřepe vždy 30 mililitry roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát 30 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného a nakonec jednou 30 ml vody. Organická fáze se potom vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Amorfní zbytek se smíchá se studeným diethyletherem, ether se oddekantuje a zbylá olejovitá kapalina se pod hexanem nechá ztuhnout. Tímto způsobem získaný amorfní surový produkt (4,7 gramu) se překrystalizuje ze směsi ethylesteru kyseliny octové a diethyletheru. Získá se 3.32 g Z-Glp-Leu-Pip-NHz (61 % teorie).

T. t. 143 až 144 °C;

R_ř ^r) — 0,51;

[ajo²⁵ -- —97,2° (с ~ 1, kyselina octová) Analýza pro CzjH.nOoNi (mol. hni.: 486,57): vypočteno

C 61,71 %, H 7,04 %, N 11,51 %, zjištěno

C 61,67 %, H 7,05 %, N 11,40 %.

Stupeň 3

Amid kyseliny L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-pipekolinové

2,1 g (4,32 mmolu) Z-Glp-Leu-Pip-NHs se rozpustí ve 40 ml methylalkoholu, к tomuto roztoku se přidá 0,2 g 10% paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do reakční směsí se zavádí vodík po dobu jedné hodiny. Po ukončení přivádění vodíku se katalyzátor odfiltruje a zbytek po odpaření se rozmíchá s diethyletherem. Tímto způsobem získaný surový produkt (1,48 g) se rozpustí ve 20 ml vody, vyčeří se aktivním uhlím a toto se odfiltruje. V čirém filtrátu se rozpustí 4 g chloridu sodného a roztok se třikrát vytřepe vždy 10 ml chloroformu. Organická fáze se vysuší bezvodým síranem sodným, odpaří se a amorfní zbytek se rozetře se směsí ethylesteru kyseliny octové a diethyletheru. Tímto způsobem se získá

R/⁵⁾ - 0,60;

[tt)n²⁵ — —86,4’ (c -=·- .1, kyselina octová).

Příklad 2

Amid kyseliny L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-thiazolidin-4-karboxylové

Stupeň 1

Hydrochlorid amidu kyseliny L-leucyl•L-thiazolidin-4-karboxylové.

1,81 g (11 mmolu) H-Tca-NHš . HC1 (viz

S. Ratner a Η. T. Clarke, J. Ain. Chem. Soc., 59, 200 [1937]) se rozmíchá ve 30 ml dimethylformamidu a tato směs se smísí se 3,97 gramu (10 mmoly) BOC-Leu-OPFP, 1,49 g (11 mmoly) a s 1,22 ml (11 mmoly) N-methylmorfolinu. Získaný roztok se nechá stát přes noc při teplotě místnosti, potom se odpaří ve vakuu a zbytek se rozpustí v 80 ml chloroformu. Tento roztok se nejdříve vytřepe třikrát vždy 20 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody. Organická fáze se potom vysuší bezvodým síranem sodným a ve vakuu se odpaří. Napěněný amorfní zbytek se rozpustí v 5 ml ethylacetátu, načež se tento roztok smísí s 10 ml 7 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové a reakční směs se nechá stát po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Potom se tato reakční směs zředí diethylelherem, vzniklá sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší bezvodým síranem sodným. Tímto způsobem se získá 1,81 g H-Leu-Tca-NH? . HC1, což je 65 % teorie, vztaženo na BOC-Leu-OPFP.

R,-^,o - - 0,25;

t. t. — 170 až 174 °C (rozklad).

Stupeň 2

Amid kyseliny benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-thiazolidin-4-karboxylové

1,69 g (6 mmolu) H-Leu-Tca-NHs . HC1 se rozmíchá ve 20 ml dimethylformamidu a tato směs se smísí s 2,7 g (6,3 mmoly) Z-Glp-OPFP a 0,84 g (6 mmoly) triethylaminu. Tato reakční směs se míchá po dobu 20 minut při teplotě místnosti a potom se ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí v 50 ml chloroformu a tento roztok se nejprve vytřepe dvakrát vždy 10 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody. Organická fáze se potom vysuší bezvodým síranem sodným, odpaří se, zbytek se rozetře s diethyletherem a surový produkt se přečistí několikanásobným přesrážením směsí ethylesteru kyseliny octové a diethyletheru. Získá se 1,64 g Z-Gip-Leu-Tca-NHí, což je 50 % teorie.

T. t. = 108 až 110 °C;

R_f,4) = 0,46;

[rab²⁵ - -Ί30,30° (c — 1, kyselina octová).

Stupeň 3

Amid kyseliny L-pyroglutamyl-L-leucyl-L-thiazoliclin-4-karboxylové

1,62 g [3,3 mmolů) Z-Glp-Leu-Tca-NH2 se rozpustí v 6 ml ledem ochlazeného 3,5 N roztoku bromovodíku v ledové kyselině octové a reakční roztok se nechá stát po dobu půl hodiny při teplotě v rozmezí 0 až 5° Celsia. Potom se reakční směs zředí diethyletherem, horní fáze se oddekantuje a zbylá olejovitá kapalina se rozpustí ve 20 mililitrech vody. Tento vodný roztok se zneutralizuje pevným hydrogenuhlíčitanem sodným a vytřepe se třikrát vždy 10 ml diethyletheru. Vodná fáze se ve vakuu odpaří, zbytek se rozpustí ve 20 ml chloroformu a roztok se potom vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Amorfní zbytek se rozetře s diethyletherem a vysuší. Získaný surový produkt (1,13 g) se rozpustí v pohyblivé fázi (4) a roztok se nanese na sloupec obsahující 20 g silikagelu. Sloupec se potom eluuje stejnou, směsí rozpouštědel [4). Z frakce obsahující čistý produkt se izoluje 0,78 g tohoto amorfního produktu. Tento se rozpustí ve 20 ml vody, roztok se vyčeří aktivním uhlím a získaný čirý vodný roztok se lyofilizuje. Popsaným způsobem se získá 0,62 g Glp-Leu-Tca-Nl-k (53 % teorie).

R/⁵) 0,53;

[ ¢-1,.25 — —145,0° (c ~ 1, kyselina octová).

Příklad 3

L-pyroglutamyl-L-leucyl-D-prolinamid

Stupeň 1

Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamy--L-leucyl-D-prolinamid

1,54 g (5,8 mmolů) H-Leu-D-Pro-NH? . . HC1 se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu a roztok se potom smísí s 0,81 ml (5,8 mmoly) triethylaminu a 2,58 g (6 mmoly (Z-Glp-OPFP. Tato reakční směs se míchá po dobu 5 minut, potom se přidá dalších 0,81 ml (5,8 mmolů) triethylaminu a po dalších deseti minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí v 60 ml chloroformu a tento roztek se nejdříve vytřepe třikrát vždy 15 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. potom rovněž třikrát vždy 15 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného a nakonec jednou 15 ml vody. Dále se tato směs vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Amorfní zbytek se rozetře s diethyletherem a získaný surový, produkt (2,1 g) se překrystalizuje z 5 ml ethylesteru kyseliny octové. Tímto způsobem se získá 1,8 g Z-Glp-Leu-D-Pro-NH? (66 % teorie).

T. t. . 153 až 157 °C;

Rf°) — 0,38;

[íJd²⁵ — —24,5° (c — 1, kyselina octová).

Stupeň 2

L-Pyroglutamyl-L-leucyl-D-prolinamid

1,5 g (3,25 mmolů) Z-Glp-Leu-D-p.ro-NH2 se rozpustí v 70 ml methylalkoholu, tento roztok se smísí s 0,3 g 10% paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do roztoku. se po dobu jedné hodiny zavádí vodík. Po ukončení přívodu vodíku se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a amorfní zbytek se rozetře s diethyletherem. Takto získaný surový produkt (0,94 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří aktivním uhlím a zfiltruje. Čirý vodný filtrát se lyofilizuje a , získá se takto 0,87 g Glp-Leu-D-Pro-NHz (79 % teorie).

R_f<⁵¹ -= 0,47;

[<aj_D ²⁵ — 4-8,4 (c = 1, kyselina octová).

Příklad 4

Amid kyseliny L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-thiazolidin-4-karboxylové

Stupeň 1

Hydrochlorid amidu kyseliny L-norvalyl-L-thiazolidin-é-karboxylové

8,0 g (20 mmolů) BOC-Nva-OH . DCHA se rozmíchá v 60 ml diethyletheru, smísí se s 20 ml 2 N roztoku kyseliny sírové a tato směs se míchá až do rozpuštění pevných součástí. Obě ' fáze se rozdělí a etherová fáze se protřepe 20 ml 2 N roztoku kyseliny sírové a 20 ml vody. Potom se , vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Olejovitý zbytek se po odpaření smísí ss 40 ml dimethylformamidu, roztok se smísí s 2,8 ml (20 mmoly) triethylaminu a reakční směs se ochladí na teplotu —15 'C. Při této teplotě a za míchání se po kapkách přidá 2,5 mililitru (20 mmolů) pivaloylcholoridu takovou rychlostí, aby teplota reakční směsi nepřekročila hodnotu --5 - C. Tímto způsobem. získaná suspenze se při stejné teplotě míchá ještě po dobu 10 minut.

Během této doby se rozmíchá 3,72 g (22 mmolů) H-Tca-NHz . HC1 ve 30 ml dimethylformamidu a tato směs se smísí s 3,1 mililitru (22 mmoly) triethylaminu. Při tom vzniklá sraženina se odfiltruje a filtrát se při teplotě —5 °C po kapkách přidá k výše uvedeným způsobem připravenému roztoku směsného anhydridu. Po ukončení přidávání se reakční směs míchá ještě po dobu 30 minut při teplotě - —10 °C a potom se nechá stát přes noc v ledničce. Příští den se zahustí ve vakuu a zbytek se rozpustí ve 100 mililitrech chloroformu. Tento roztok se nejdříve vytřepe třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou - 20 ml vody a potom se vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Olejovitý zbytek se rozpustí ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové, roztok se ochladí na teplotu nižší než 5 - C a potom se smísí s 20 ml 5 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Tato reakční směs se po dobu jedné hodiny ponechá v ledové lázni a potom se zředí diethyletherem. Vzniklá sraženina se odfiltruje a ve vakuu se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného. Tímto způsobem se získá 3,77 g H-Nva-Tca-NH; . HC1 (70 % teorie, vztaženo na BOC-Nva-Oh . DCHA).

Rf' -=- 0,20.

Stupeň 2

Amid kyseliny benzyloxykarbonybL-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-thiazolidin-4-karbo.xylové

2,8 g (10,5 mmolů) H-Nva-Tca-NHz . HC1 se rozmíchá v 50 ml dimethylformamidu a k této směsi se za míchání přidá 1,47 ml (10,5 inmolu) triethylaminu a 5,15 g (12 mmolů) Z-Glp-OPFP. Reakční směs se po pětiminutovém míchání smísí s dalšími 1,47 mililitry (10,5 mmoly) triethylaminu, dále se míchá po dobu 10 minut a potom se ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí ve 100 ml chloroformu a tento roztok se nejprve vytřepe třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec 20 ml vody. Nakonec se roztok vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Amorfní zbytek se rozetře s diethyletherem a získaný surový produkt (4,6 g) se prekrystalizuje ze směsi ethylesteru kyseliny octové a- diethyletheru. Tímto způsobem se získá 3,2 g ZtGlp-Nva-Tca-NH2 (64% teorié).

T. t. =- 116 až 118 °C;

Ri^r) 0,45;

[«]_d25 .-=.-. —129 - (c — 1, kyselina octová).

Stupeň 3

Amid kyseliny L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L^-^tiiazolidin-4-karboxylové

4,76 g (10 rnmioki] Z-Glp-Nva-Tca-NH- .se rozpustí v ledem ochlazeném 3,5 N roztoku bromovodíku v ledové kyselině octové (ve 20 ml) a tento roztok se 'nechá stát po dobu půl druhé hodiny při teplotě v rozmezí 0 až 5 °C. Potom se . reakční směs zředí diethyletherem a vyloučená olejovitá kapalina se od rozpouštědla oddělí dekaníací. Získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 50 ml vody, roztok se zneutralizuje přídavkem pevného hydrogenuhličitanu sodného a třikrát se vytřepe vždy 20 ml diethyletheru. Vodná fáze se odpaří, zbytek se rozpustí ve 100 ml chloroformu a roztok se vysuší bezvodým síranem sodným. Tento roztok se potom odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem. Získaný surový produkt (3 g) se nanese na sloupec s 80 g silikagelu a eluuje se směsí rozpouštědel. (4). Z frakce obsahující 2,18 gramu amorfního produktu se toto množství izoluje, tento se rozpustí ve 40 ml vody, roztok se vyčeří aktivním uhlím a čirý vodný - roztok se lyofilizuje. Tímto způsobem se získá 1,84 g Glp-Nva-Tca-NH; (54 % teorie).

V -·- 0,50;

(a]₀23 ~ —145,63 (_c — l; kyselina octová).

Příklad 5

L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-leucinamid

Stupeň 1 teiT.butyloxykarbony--L-norva]y--L-leucinmethylester

BOC-Nva-OH, - uvolněná ze 8,0 g DCHA-soli . (20 mmolů), získané podle - příkladu 4, stupeň 1 a 3,82 g (21 - mmolů) H-Leu-OMe . HC1 se rozpustí v 60 ml chloroformu a roztok se nejprve smísí s 2,94 - ml (21 mmoly) triethylaminu a potom za chlazení ledem a za míchání s roztokem 4,33 g DCC (21 mmolů) ve 40 ml chloroformu. Reakční směs se nechá stát přes noc při teplotě 5° Celsia, potom se vyloučený DCU odfiltruje, filtrát se nejprve protřepe třikrát vždy s 30 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy s 30 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného· a nakonem se ml vody, organická fáze se potom vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Krystalický zbytek se rozetře s n-hexanem, odfiltruje a získaný produkt surový (6,65 gramu) se překrystalizuje ze směsi 5 ml ethylesteru kyseliny octové a 20 ml petrolettheru. Tímto způsobem se získá 5,20 g BOC-Nva-Leu-OMe (75% teorie).

T. t. ( . 100 až 101 °C;

R_r.<2) = 084;

(ak)25 _:= —47,50 (c = 1, methylalkohol).

Stupeň 2 terc. butyloxyk ar bon yl-L-no rvalyl-L-leucinamid

5,0 g (14,5 mmolu) BOC-Nva-Leu-OMe se rozpustí v 50 ml methylalkoholu, roztok se ochladí ledem a do zchlazeného roztoku se po dobu 30 minut zavádí plynný amoniak. Tento roztok se potom nechá stát přes noc při teplotě místnosti, opět se ochladí a opět se sytí plynným amoniakem. Potom se nechá stát po dobu 4 hodin a nakonec se odpaří. Krystalický zbytek se prekrystalizuje ze směsi ethylesteru kyseliny octové a diethyletheru. Tímto způsobem se získá 4,37 gramu BOC-Nw-Llu-NH:, což je 91 % teorie.

T. t. = 158 až 159 °C;

R,(^?) = 0,60;

[fz]_t)25 . —48,7° (c — 1, methylalkohol).

Stupeň 3

L-norvalyl-L·--eucinarnidhydгochlořid

4,12 g (12,5 mmolu) BOC-Nva-Leu-NH: se rozmíchá s 12 inl ethylacetátu a tato směs se smíchá s 20 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Reakční směs se ponechá stát po dobu jedné hodiny, načež se zředí diethyletherem. Vyloučená sraženina se odfiltruje a surový produkt (3,64 g) se překrystalizuje z methylalkoholu. Tímto způsobem se získá 2,75 g H-Nva-Leu-NH? . ' HC1, což představuje 83 % teorie.

T. t. = 215 až 216 °C;

R/5) = 0,45;

(«1d25 = —3,47° (c — 1, methylalkohol).

Stupeň 4

Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-nořvalyl-L-^eucinamid

2,67 g (10 mmolu) H-Nva-Leu-NHi . НС 1 se rozpustí ve 30 ml dimethylformamidu. K tomuto roztoku se přidá nejdříve 1,4 ml (10 mmolu) triethylaminu a potom po odfiltrování vytvořené sraženiny se přidá 4,72 g (11 mmolů) Z-Glp-OPFP. Po uplynutí dalších 5 minut se přidá dalších 1,4 ml (10 mmolů) triethylaminu a po uplynutí 10 minut se reakční směs ve vakuu zahustí. Zbytek se ' rozetře s diethyletherem a tímto způsobem získaný surový produkt (5,5 g) se prekrystalizuje z ethylalkoholu. Takto se získá 3,84 g Z-Glp-Nva-Leu-NHs, ’ což představuje 81 % teorie.

T. t. — 241 ' až 242 °C;

f = 0,55;

[aj_D25 ~ —62,6° (c (-- ( 1, kyselina octová).

Stupeň 5

L-pyroglutamyl-L-nořvalyl·L-leucinamid

3,8 g (8 mmolů.) Z-Glp-Nva-T.eu-NH·: se rozpustí ' s 0,8 g 10% paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí a . po dobu jedné hodiny se do reakční směsi zavádí vodík. Po skončení přivádění vodíku se katalyzátor odfiltruje a gelovitý zbytek se rozetře s diethyletherem. Tímto způsobem se získá 2,7 gramu Glp-Nva-Leu-NHs, což představuje 99 procent teorie.

T. t. = 240°C (rozklad);

R₍r i 0,57;

(ajn²⁵ — —55,8° (c -=- 1, kyselina octová).

Příklad 6

L-pyroglutamyl-L-norvalyl-L-isoleucinamid

Stupeň 1 teřc.butyloxykaгbony--Ь-noι.·valy]-L-isoleucinamid

3,7 g (19 mmolu) H-Ile-NHž . HC1 se .rozpustí ve 30 ml dimethylformamidu, tento roztok se za míchání smísí s 2,7 ml (19 mmoly) BOC-Nva-OPFP a po 5 minutách se přidají k této reakční směsi další 2,4 ml (17,3 mmolu) triethylaminu. Po uplynutí dalších 10 minut se reakční směs ve vakuu odpaří, zbytek se rozpustí ve 100 ml chloroformu a tento roztok se . vytřepe nejprve dvakrát vždy 20 ml ’ 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 20 ml vody. Organická fáze se potom vysuší bezvodým síranem sod241028 ným a odpaří. Krystalický zbytek se rozetře s diethyletherem a vysuší. Tímto způsobem se získá - 4,7 g BOC-Nva-Ile-NH··, což představuje 83 % teorie.

T. t. - 192 až 144 °C;

R:- ž ' - 0,60;

[&]_и ²⁵ ž —43,7° (c -- 1, methylalkohol).

Stupeň 2

L^norv<alyl-L-is^(^l(^i^u^ii^<ami^dhydrochlorid

4,5 g (13,7 mmolů) BOC-Nva-Ile-NH· se rozmíchá ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové a tato směs se smísí s 12 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Tato reakční směs se nechá v klidu po dobu jedné hodiny, potom se zředí diethyletherem. Vzniklá sraženina se oddělí filtrací a tímto způsobem získaný surový produkt (3,6 g) se překrystalizuje ze směsi methylalkoholu a diethyletheru. Získá se 3,5 g H-Nva-Ile-NH? . HC1, což představuje 96 % teorie.

T. t. -- 254 až 255 °C;

R,''¹ = 0,45;

[α]_Ω25 ~ h - - 3,8 (_C ) i, methylalkohol).

Stupeň 3

Benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl--L·

-norvalyl-L-isoleucínamid

3,3 g (12,4 mmolů) H-Nva-Ile-NH2 . HC1 se rozpustí ve 40 ml dimethylformamidu a tento roztok se za míchání smísí s 1,74 ml (12,4 mmoly) triethylaminu a 5,85 g (13,6 mmoly) Z-Glp-OPFP. Po uplynutí 5 minut se přidá dalších 1,74 ml (12,4 mmolů) - triethylaminu. Reakční směs se po uplynutí několika sekund srazí do gelovité konzistence, načež se zředí diethyletherem a rozmíchá. Potom se tato směs ponechá po dobu 2 hodin v ledničce- stát a potom se zfiltruje. Získá se takto 5,1 g Z-Glp-Nva-Ile-NH·?, což představuje 86 % teorie.

T. t. -=- 252 až 253 °C;

R_f ^{!) -= 0,60;

[a]a²⁵ = —57,5° - (c — 1, kyselina octová).

Stupeň 4

L-pyroglutamyl-L-norvalyhL-isoleucylamid

4,75 g (10 mmolů) Z-Glp-Nva-Ile-NHa se rozpustí ve 200 ml kyseliny octové a po přídavku 1 g 10% paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí se co roztoku zavádí po dobu jedné hodiny vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odstraní filtrací, filtrát se -odstraní a zbytek se rozetře s diethyletherem. Takto se získá 3,4 g Glp-Nva-Ile-NHs, což odpovídá 98 % teorie.

T. t. - --- 267 až 270°C (rozklad);

R(^í5> -=- 0,61;

(aj - — —50,29 (c -- 1, kyselina octová).

Příklad 7

L-pyroglutamyl-L-n-orvalyl-L-methioninamid

Stupeň 1 terc.butylox.ykarbonyhL-norvaly--L-methioninmethylester

Ze 4,78 g (12 mmolů) soli DCHA se uvolní způs jbem popsaným v příkladě 4, stupeň 1 BOC-Nva-OH a společně s 2,6 g (13 mmoly) H-Met-OMe. HC1 se rozpustí ve 40 ml chloroformu. K tomuto roztoku se nejprve přidá 1,82 ml (13 mmolů) triethylaminu a potom za chlazení ledem a za míchání se přidá roztok - 2,58 g (12,5 mmolů) DCC ve 20 ml chloroformu. Reakční směs se potom nechá stát přes noc při teplotě 5 - C, potom se vyloučený DCU odfiltruje a filtrát se protřepe nejprve třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 20 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou - 20 mililitry vody. Organická -fáze se potom vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří se. Olejovitý zbytek se přídavkem petroletheru přivede ke krystalizaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (3,42 g) se překrystalizuje ze směsi ethylesteru kyseliny octové a petroletheru. Získá se 3,08 g BOC-Nva-Mílt-Oмe, což odpovídá 71 % teorie.

T. t -·- 69 až 70 °C;

R_ř ^p) - = 0,81;

[a]p25 ==; —42,7° (c -= 1, methylalkohol).

Stupeň 2 terc.butyloxykarhonyl-L-novvalyl-L-methioninamid

1,81 g (5 mmolů) BOC-Nva-Met-OMe se rozpustí ve - 20 ml methylalkoholu a za chlazení se do tohoto roztoku zavádí po dobu jedné hodiny plynný amoniak. R^eakční směs se potom nechá stát přes noc při.

teplotě místnosti a potom několik hodin v ledničce. Vyloučený krystalický produkt se odfiltruje (1.27 g), filtrát se zahustí a zbytek se krystalizuje z ethylalkoholu. Tento podíl se spojí s hlavním krystalickým podílem a získá se celkem 1,62 g BOC-Nva-Met-NH.:, což odpovídá 93 % teorie.

T. t. — 166 až 167 °C;

R;⁽ - 0,57;

[aj ---= —40,9' (c — 1, methylalkohol).

Stupen 3 • L4iorvalyl-L-rnethioninamiclhydrochlorid

4,5 g [3 3 mmolu ) BOC-Nva-Mct-NH. e e rozmíchá ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové a tato směs se smísí s 20 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Reakční směs se nechá stát po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti a potom se zředí diethyletherem. Vyloučená sraženina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu za pomocí bezvodého síranu sodného. Tímto způsobem získaný surový produkt (4 g) se překrystalizuje ze směsi methylalkoholu a diethyletheru. Takto se získá 3,28 g H-Nva-Met-NHz . HC1, což odpovídá 89 % teorie.

T. t. ·-=. 198 až 200 °C;

R ^! ) :3-) 0,40;

[«ln²⁵ - (c — 1, methylalkohol).

Stupeň 4 .

Ture, bu tyl oxy karbonyl-L-glu lamy 1-L-norvalyl-L-methioninamid

2,8-1 g (10 mmolů) H-Nva-Met-NH/ . HC1 se rozmíchá ve 40 ml dimethylformamidu a k této směsi se za míchání přidá 1,4 ml (10 mmolů) triethylaminu a 4,53 g (11 ínmolů) BOC-Gln-OPFP. Po uplynutí 5 minut se přidá dalších 1,4 ml (10 mmolů) trietbylaminu a po dalších 10 minutách míchání se získaná hustá suspenze ve vakuu odpaří. Získaný pevný odparek se rozetře s ethylalkoholem a tímto způsobem získaný surový produkt (4,82 g) se povaří s 50 ml ethylalkoholu. Po ochlazení se' získaná suspenze nechá několik hodin v ledničce a potom se odfiltruje. Tímto způsobem se získá 4,08 g BOC-Gln-Nva-Met-NHs, což odpovídá 86 % teorie.

Stupmi 5 ’

L-pyroglutamyl-L-norvalybLmettr o namlel

3,8 g (8 mmolů) BOC-Gln-Nva-Met-NIT’ se rozpustí ve 100 ml 993% kyseliny mravenčí, tento roztok se ponechá stát po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a potom se ve vakuu odpaří. Po odpaření vzniklý olejovitý zbytek se rozpustí v 50 ml kyseliny octové, roztok se po dobu 2 minut vaří a potom se ve vakuu opět odpaří. Gelovltý zbytek se potom rozetře s diethyletherem a odfiltruje. Tímto způsobem se získá 2,8 g Glp-Nva-Met-NHz, což odpovídá 98 % teorie.

T. t. - 249 až 250 °C;

R^(:‘) - · 0,58; · fv’I,p⁵ =- —48,4' (c -- 1. kyselina octová).

P ř í k 1 a d 8

N-(L- pyroglutamyl-L ·· leucy.l )pyrrolidin

Stupeň 1

N-(L--eucyl)pyrrolid)nhyd.rochlorid

3,46 g (15 mmokⁿι) BOC-Leu-OH se rozpustí v 50 ml ethylesteru kyseliny octové, tento roztok se smísí s 2,1 ml (15 mmoly) triethylaminu a tato reakční směs se potom ochladí na teplotu —15 °C. Potom se za míchání a při teplotě nižší než — 10-C přidává po kapkách 1,97 ml (16 mmolů) pivaloylchlorldu. Získaná suspenze se míchá dále po dobu 10 minut a potom se při té samé teplotě po kapkách přidá 1,37 ml (16,5 mmolů) pyrrolidinu. Reakční směs se dále míchá po dobu 30 minut při teplotě —10 C a potom se nechá stát po dobu 3 hodin při teplotě 5 °C. Získaný roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 10 ml 1 N roztoku kyseliny . chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 10 ml 1 N roztoku hydrogenuhličilanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody, potom se organická fáze vysuší bezvodým síranem sodným a ve vakuu se odpaří, Získá se olejovitý zbytek, který se rozpustí v 5 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se smísí s 10 ml 5 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Tato reakční směs se nechá stát po dobu jedné hodiny, potom se zředí diethyletherem a vytřepe se vodou. Vodná fáze se vymyje diethyletherem. zalkalizuje se uhličitanem draselným a extrahuje se chloroformem. Chloroformový roztok se oddělí, vysuší se bezvodým síranem sodným a odpaří se. Olejovitý zbytek se rozpustí v

T. t. -3-- 237 až 238 °C;

Rj ) > ^0,43;

[<Jc)2S -= —37,1' (c --- 1, kyselina octová).

24102« ml diethyletheru, hodnota pH tohoto roztoku se nastaví koncentrovaným roztokem kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové na 3 a vyloučený krystalický produkt se odfiltruje. Tímto způsobem, se získá 2,41 g H-Leu-pyrrohdinu . HC1, což odpovídá 73 % teorie.

T. t. . 170 . až 174 °C (rozklad);

R⁽d — 0,37.

Stupeň 2

N- (benzrloxykarbonrl-L-pyroglutamrl-L^lí^i^u^cyllpyinolliclin

1,7 g (7,7 mmolů) IHLeu-pyrroildin . HCL 3,0 g. (7 inmolů) ZiGlp-OPFP a 1,08 ml (7,7 mmoiu) triethylaminu se rozpustí ve 20 ml chloroformu a po uplynutí 5 minut se do reakční směsi přidá dalších 0,98 ml (7 mmolu) triethylaminu. Po uplynutí dalších 5 minut se reakční roztok zředí 30 ml chloroformu a potom se nejprve protřepe dvakrát vždy 10 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml 1 bí roztoku hydrogenuhličitauu sodného a nakonec jednou 10 ml vody. Organická' f - lze se potom vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Olejovitý zbytek se za pomoci n-hexanu přivede ke krystalizaci a tímto způsobem získaný krystalický surový produkt (2,85 g) se překrystalizuje ze směsi ethylalkoholu a diethyletheru. Získá se 2,14 g Z-Glp-Leu-pyrrolidinu. což odpovídá 71 % teorie.

T. t. - .. ( 109 až 110 . C;

R/ ' ) - - - - 0,55; , [t<a],j25 -—оЗ.З íc ( 1, kyselina octová).

Analýza pro C/sHsOrN.. (molekulová hmotnost 429,52); . .

vypočteno

C 64,32 %, H 7,27 %, N 9,78 %, zjištěno

C 61,31 %, 11 7,47 %, N 9,78 %.

Stupeň 3

N-(L-pyiOglu tamyllL-leucyllpyrrolidin

2,0 g (4,66 mmolu) Z-Glp-Leu-pyrгυlidinn se rozpustí ve 40 ml methylalkoholu, k tomuto roztoku se přidá 0,4 g paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí a po dobu jedné hodiny se do reakční směsi zavádí vodík. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a zbylá olejovitá kapalina se rozpustí v diethyletheru. Roztok se nechá stát v ledničce přes noc a vyloučené krystaly se potom oddělí filtrací. Tímto způsobem se získá 1,25 g

Gly-Leu-pyrroИdinu, což odpovídá 91 % teorie.

T. t. = 103 až 104 °C;

R,·'⁴ --· 0,65;

[a]_D25 — —3:L6^⁰ (c — 1, kyselina octová).

Analýza aminokyselin: Glu 1,00 (1,0), Leu

1,00 (1,0).

P ř í k 1 a d 9 řHL-py??oglutamyl-L-leucyl) piperidin ’

Stupeň 1

N- (L-cucy 1) piperidinhydrochlorid

3,46 g 115 minoů) ( BOC-Leu-OH se rozpustí v 50 ml ethylesteru kyseliny octové, tenlo roztok se smísí s 2,1 ml (15 mmoly) triethylaminu a ochladí se- na teplotu —15° Celsia. Při této teplotě se za míchání přidá nejprve po kapkách 1,97 ml (16 mmolů) pivaloylchíor idu a . potom po uplynutí 10 minut rovněž po kapkách 1,65 ml (16,5 mmolů) piperidinu. Po ukončení přídavku se reakční směs míchá ještě po dobu 30 minut při teplotě —10 °C a potom se nechá stát přes noc v ledničce. Vytvořená sraženina se potom odfiltruje, filtrát se vytřepe nejdříve třikrát vždy 10 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž třikrát vždy 10 ml 1 N roitoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody, dále se vysují bezvodým síranem sodným a odpaří. Zbylá olejovitá kapalina se rozpustí v 15 ml 4 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové, tento roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny, potom se zředí diethyletherem a opět se ponechá stát přes noc v ledničce. Příští den se produkt ve formě sraženiny . oddělí filtrací. Popsaným způsobem se získá 2,0 g H-Leulpiperidin- .- liCl, což odpovídá 57% výtěžku, vztaženo na BOC-Leu-OH.

T. t. - -- 123 až 125 °C;

R(^lj) 0,45.

Stupeň 2

N-- (benzyloxykarbonyl-L-pyroglutamyl-L-leucyl jpiperidin

1,81 g (7.7 mmolu) H-Leu-píperídín . HC1,

3,0 g (7 mmolů) Z-GlylOPFP a 1,08 ml (7,7 mmolů) triethylaminu se rozpustí ve 20 ml chloroformu a nechá se stát po dobu 5 minut a potom se přidá dalších 0,98 ml (7 mmolů) triethylaminu. Po dalším pětiminu241028 tovém stání se roztok zředí 30 ml chloroformu, vytřepe se nejprve dvakrát vždy 10 mililitry .1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 10 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a konečně jednou 10 ml vody, polom se vysuší bez v o dým síranem sodným a odpaří. Krystalizující olejovítá kapalina, získaná jako zbytek po odpaření se rozetře se směsí dicthyletheru a n-hexanu. Tímto způsobem získaný surový produkt (2,75 g] se překrystalizujo ze směsi ethylalkoholu a diethyletheru a získá se 2,21 g Z-Glp-Leu-piperidinu, což odpovídá 71 % teorie.

T. t. - 11.3 až 115 TJ;

Rm^! -- 0,69;

^:7--· —12,5° (c - 1, kysoluia octová).

Analýza pro C.UH33O5N3 (mol. hm. 443.55): vypočteno

C 61,99%, H 7,50%, N 9.47%, zjištěno

C 6190%, II 7,72%, N 9.53%.

S lupen 3

N-(L-pyroglutamyl-L-]ei’cyl )piperiíiin

2.0 g (4,51 mmolu) Z-OlpT-eu-piperidinu se rozpustí ve 40 ml methylalkoholu, do tohoto r ztoku se přum 0,4 g 10% paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí a do této reakční směsi se zavádí po dobu jedné hodiny vodík. Po odfiltrování katalyzátoru s'; filtrát odpaří a zbytek se pomocí dmtliyletheru přivede ke krystalizaci. Tímto způsobem se získá 1.12 g Glp-Leu-píper.idinu, což odpovídá 81 % teorie.

T. t. -- 99 až 100 °C;

R_ř ^í5) 0,71;

[α]_υ ²⁵ -j-30,4° (c ---= 1, kyselina octová).

Analýza aminokyselin; G.lu 0,95 (1,0. Leu 1,00 (1,0).

Příklad 10

L-thiazolidin-4-karbonyl-L-leucyl-L-prolinamid

Stupeň 1

L-thiazolidin-4-karbonyl-L-leucyl-L-prolinamid

5,13 g (22 mmolů) J3OC-Tca-OH a 4,05 g (22 mmolů) PFPOH se rozpustí v 60 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se za chlazení ledem a za míchbní smísí se

4.12 g (20 mmoly) DOC. Reakční směs se míchá při teplotě v rozmezí 0 až 5 T po dobu 2 hodin, filtrát se odpaří a zbytek se rozpustí v 50 ml n-hexanu. Tento roztok se vytřepe nejprve pětkrát vždy 25 ml 1 N roztoku hydrcgenuh!ičita.nu sodného a potom jednou 25 ml vody, vysuší se bezvodým síranem sodným a potom se odpaří. Tímto způsobem se získá 7,32 g olejovitého 300 -Tca-OPFP, kierý se rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu a tento roztok se přidá к suspenzi 5,23 g (20 mmolů) H-Leu-Pro-NHz . . HC1 ve 30 ml dimethylformamidu a tato směs se za ch mžení ledem a za. míchání smísí s 2.8 mi (20 mmoly) triethylaminu. Po uplynutí 5 minut se přidá dalších 2.8 mí (20 mmolů) trieihylaminu, reakční směs se míchá dalších 20 minut a potom se ve vakuu odpaří, jako zbytek získaná olejovitá kapalina se rozpustí ve 10'3 ml chloroformu, tento roztok se protřepe nejprve třikrát vždy 30 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 30 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 30 ml vody, vysuší se hezvodým síranem sodným a odpaří. Jako zbytek získám-ch 8,84 g olejovitého BOC-Tca-Lou-Pro-NH?, se rozpustí v 15 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se smísí s 15 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Reakční směs se ponechá po dobu jedné hodiny stát, potom se zředí ethylesterem kyseliny octové, vzniklá sraženina se rozetře a odfiltruje a potom se ve vakuu, vysuší pomocí bezvodého hydr .xiclu sodného. Tímto způsobem získaných 8Ό5 g tripeptidamidhydrochlondu se rozpustí v 80 ml vody, tento roztok se třikrát vytřepe vždy 20 ml diethyletheru, potom se hodnota pH vodného roztoku nastaví pomocí hydrogenuhličitanu. sodného na 8 a tento alkalický roztok se pětkrát extrahuje vždy 20 ml chloroformu. Spojené chloroformové extrakty se vysuší bézvodým síranem sodným a odpaří. Zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem a vysuší. Tímto způsobem se získá 5,20 g H-Tca-Leu-Pro-NH?, což odpovídá 76 % teorie.

T. t. 159 až 160 TJ;

Rr¹ — 0,63;

[cH;/⁵ —162,9° (c 1, kyselina octová).

Příklad 11

L-2-ketoimidazolidin-4-karbonyl-L·-prolinamid

Stupeň 1

Pentafluorfenylester kyseliny benzyloxykarbonyl-L-2-ketoimidazolidi.n-4-karboxylové

241023

10.56 g (40 mmolů) Z-Kic-OH a 9,09 g [44 mmolů) PFP-OH se rozpustí ve 100 ml směsi dimethylformamidu a dioxanu v polně ru 1:2a roztok se za chlazení ledem a za míchání smísí s 9,06 g (44 mmolů) DCC. Tato reakční směs se při teplotě v rozmezí 0 až 5 °C míchá po dobu 90 minut, potom se DCU odfiltruje, filtrát se odpaří a zbylá olejovitá kapalina se pomocí n-hexanu přivede ke krysializaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (16.46 g] se překrystalizuje z 50 ml ethylesteru kyseliny octové. Získá se 12,75 g Z-Kic-OPFP, což představuje 74 % teorie.

T. t. - 146 až 148 °C;

- 0,53;

[сф²⁵ .... —i?,Г (c ·--- 1, ethylester kyseliny octové).

Analýza pro C·nH«tO. N. Fr> (mol. hm. 430,29): vypočteno

С 50..25 H 2,58 % N 6,51 % F 22,08,

Zjištěno

C 49,88 %, H 2,35 %, N 6,66 %, F 21,81 %.

Stupeň 2

Ben:<yloxykarbonyl-L-2-ketoimi.dazolídin-4-karbonyl-L-leucyl-L-prolinamid

2.38 g (9 mmolů) H-Leu-Pro-NH-í - HC1 se rozmíchá v 39 ml dimethylformamidu a potom se smísí s 3,87 g (9 mmoly) Z-Kic-OPFP a 1,26 ml (9 mmoly) triethylaminu. Го puti minutovém míchání se přidá dalších 1,26 mililitru (9 mmolů) trlethylaminu a po dalším míchání po dobu. 20 minul se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí v 50 ml chloroformu a tento roztok se vyiřepe nejprve třikrát vždy 10 mililitry 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát 10 ml 1 N roztoku hyclvogenu.hličitanu sodného a nakonec jednou 10 ml vody, potom se vysuší hezvodým síranem sodným a odpaří. Jako zbytek získaná olejovitá kapalina se pomocí dieťnyletheru přivede ke krystalizaci a potom se odfiltruje. Tímto způsobem získaný surový produkt (3,31 g) se povaří se 30 ml ethylesteru kyseliny octové. Po ochlazení se tato reakční směs nechá stát několik hodin v ledničce a potom se sraženina odfiltruje. Takto se získá 3,0 g Z-Kic-Eeu-Pro-NH2, což představuje 70 % teorie.

T. t. =- 172 až 174 °C;

R?⁴⁾ =.· 0,18;

[a|i/²⁵ —j02,6° (c --- 1, kyselina octová).

Analýza pr₀ C^HsiOjNs (mol. hm. 473,50):

vypočteno

C 58,34 %, H 6,60 %, N 14,79 %, zjištěno

C 57,52 %, H 6,62 %, N 14,62 %.

Stupeň 3

L-2-kefoiiuidazolidin-4-karbonyl-L-leu.cyl-E-prolinamid

1.2 g (2,54 nnnolu) Z-Kic-Leu-Pro-NH·; se rozpustí ve 30 ml vody a tento roztok se smísí s 0,25 g 10% paládiového katalyzátoru na aktivním uhlí. Do této směsi se potom zavádí po dobu 4 hodin proud vodíku. Po ukončení hydrcgenace se katalyzátor odfiltruje, fUtrát se odpaří a amorfní zbytek se ve vakuu vysuší za pomoci bezvodého oxidu fosforečného. Tímto způsobem získaný surový produkt (0,75 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří aktivním uhlím a čirý roztok se lyofilizuje. Získá se takto 0,61 gramu Kic-Leu-Pro-NHz, což odpovídá 71 % teorie.

R.' -¹ 0,35;

[rzjrj²⁵ ~ -—90,42 (c 1, kyselina octová).

P г í к lad 12 [₍-6-keioplperidin-2-karbonyl-L-1 e и. с у 1 - L - p r o lina? n i d

Stupeň 1

Pentafluorfenylester kyseliny

L-6-ketopipekolmové

4.3 g (30 mmolů) kyseliny L-6-ketopipekolinové a 6,07 g (33 mmolů) PFPOH se rozpustí ve 100 mi chloroformu a roztok se za chlazení ledem a za míchání smísí s 6,8 gramu (33 mmoly) DCC. Reakční směs se potom míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 0^cC, načež se nechá stát přes noc v ledničce. Příští den se vyloučený DCU odfiltruje, filtrát se odpaří a krystalický zbytek se rozetře s n-hexanem. Tímto způsobem získaný surový produkt (9,87 g) se rozpustí ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové, roztok se nechá stát po dobu jedné hodiny v ledničce, potom se vyčeří aktivním uhlím, přefiltruje a odpaří. Po odpaření zbylá olejovitá kapalina se rozpustí ve směsi 5 ml ethylesteru kyseliny octové a 20 ml n-hexanu, tento roztok se nechá stát přes noc v ledničce a příští den se vyloučené krystaly oddělí filtrací. Získá se 6,34 g Kpc-OPFP, což odpovídá 68,5 % teorie.

T. t. — 96 až 98 °C;

[α|₍/⁵ 4-30,0' (c - :~ 1, ethylester kyseliny octové).

Analýza pro CkH.OjNFs (mol. tun. 309,20): vypočteno

C 46,62 %, II 2,61 %, N 4,53 %, F 30,72 %, zjištěno

C 46,37 %, H 2,88 %, N 4,26 %, F 30,51 %.

Stupeň 2

L-6dket<^ipendin-2-karbonyLL-leucyi-L-prolinamid

1,32 g (5 mmolů ) H-Leni-Pro-N.H - - IIC 1 se rozmíchá ve 20 mt dimethylformamidu a za chlazení ledem a za míchání se k této smísil přidá 1,61 g (5,2 mmolu) Kpc-OPFP a 0,7 ml (5 mmolu) triethylaminu. Po pětiminutovém míchání se přidá k reakční směsi dalších 0,7 ml (5 mmolu) triethylaminu a po dvaceti minutách dalšího míchání se reakční směs - ve vakuu, odpaří. Krystalický zbytek se rozetře s diethyletherem, krystaly se odfiltrují, na filtru se promyjí diethyletherein a studeným chloroformem a potom se vysuší. Tímto způsobem, se získá 1,27 g K^c-Lmu-Poo-NIT - c^c^ž odpovídá 72 % teorie.

T. t. - 214 až 216 'C;

- ' ·- 0,41;

[al;,25 - —83’’ (c -i 1, kyselina octová).

Analýza aminokyselin: kyselina alfa-amiuoadipová 0,99 (1,0), Leu 1,00 (1,0), Pro 0,98 (1,0).

Příklad 13

L-6-ketopiperiďinι2-karbrnyl-Lιllrrvalyl-L-prolinamid

2,38 g (9,5 mmolu) H-Nva-Pvo-NH’ . HC1 se rozmíchá ve 30 ml dimethylformamidu a k této směsi se za chlazení ledem a za míchání přidá 30,09 g (10 mmolů) Kpc-OPFP a 1,33 ml (9,5 mmolu) triethylaminu. Po pětiminutovém míchání se k této reakční sm^si přidá dalších - 1,33 ml (9,5 mmolu) triethylaminu a po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Krystalický zbytek se rozetře s diethyletherem, tento se odfiltruje a zbytek na filtru se ' promyje studeným methylalkoholem a vysuší. Tímto způsobem získaný surový produkt (3.66 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří aktivním uhlím, čirý vodný roztok se odpaří a krystalický zbytek se rozetře s 10 ml ethylalkoholu. Tato směs se nechá stát přes noc v ledničce a potom se přefiltruje. Takto se získá 2,10 g Kpc-Nva-Pro-NHž, což odpovídá 65 % teorie.

T. t. - - 192 až 193 °C;

R.·'·” - 0,31;

ία|;+ - --832 (c - - 1, kyselina octová).

Příklad - 14

D-pyroglutзmУlιL,ιlol’cylιL-pгolinamid

Stupeň 1

Pentafluorfenylester kyseliny benzyloxykarbonyl-D-pyrcglu tamové

4,55 g (18 mmolů) Z-DGlp-OH a 3,68 g (20 mmolů) PFPOH se rozpustí v 50 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se za chlazení ledem a za míchání smísí se

4,12 g (20 mmolů) DCC. Reakční směs se míchá dále po dobu jedné hodiny při teplotě 0 - C,- potom se DCU odfiltruje, filtrát se odpaří a olejovilý zbytek se pomocí n-hexanu přivede ke krystalizaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (7,3 g) se rozpustí ve 20 ml ethylesteru kyseliny octové, roztok se ponechá po dobu jedné hodiny stát v ledničce, potom se vyčeří pomocí aktivního uhlí a po odfiltrování se odpaří. Po odpaření zbylý olejovilý zbytek se rozpustí v 5 ml ethylesteru kyseliny octové -a přídavkem 20 ml n-hexanu se produkt vysráží. Takto se získá 6,60 g Z-Glp-OPFP, což představuje 85 % teorie. ,

T. 1. - 81 až 82 °C;

R‘” - 084;

[aji;²⁵ = 4-40,1° (c —- 1, ethylester kyseliny octové).

Analýza pro Cia^^O-No (mol. hm. 429,30): vypočteno

C - 53,16 %, II 2,82 %, N 3,26 %, F 22,13 %, zjištěno

C 532’8 %, H 3,04 %, N 3,02 %, F 21,86 %.

Stupeň 2

Benzyloχykarbony|-D·pyroglutamyi-L-leucyl-L-prolinamid

3,21 g (12,3 mmolu) H-Leu-Pro-NIT . HC1 se rozmíchá v 50 ml dimethylformamidu a .za chlazení ledem a za míchání se k -této směsi přidá 5,6 g (13 mmolů) Z-D-Glp-OPFP a 1,72 ml (12,3 mmolu) triethylaminu. - Po pětiminutovém míchání se k reakční směsi přidá dalších 1,72 ml (12,3 mmolu) triethylaminu a po dalších 20 minutách míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Zbytek po odpaření se rozpustí ve 120 ml chloro241028 forrr.b tento roztok se protřepe nejprve dvakrát vždy 30 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom třikrát vždy 30 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 30 ml vody, potom se vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Po odpaření zbylá olejovitá kapalina se přivede ke krystalizaci pomocí cliethyletheru. Tímto způsobem získaný surový produkt (5,31 g] se povaří s 30 ml ethylesteru kyseliny octové, získaná suspenze se ponechá stát рэ dobu 3 hodin v ledničce a potom se produkt ve formě sraženiny oddělí filtrací. Získá se takte 4,61 g Z-D-Glp-Leu-Pro-N1R, což odpovídá 80 % teorie.

T. t. - 189 až 194 °C;

R/'¹¹ - 0,44;

[a]o²⁵ — — 31,2’ (c — 1, kyselina octová).

Stupen 3

D-pyroglutamyl-L-leucyl-L-prulinamid

4,48 g (9,5 mmolu) Z-D-Glp-Leu-Pro-NíI. se rozpustí ve 200 ml methylalkoholu а к tomuto roztoku se přidá 0,9 g-10% palladiového katalyzátoru na aktivním uhlí. Potom se do této směsi zavádí vodík po dobu jedné hodiny. Po ukončení hydrogenace se katalyzátor odfiltruje, filtrát se odpaří a amorfní zbytek se rozetře s diethyletherem. Tímto způsobem získaný surový produkt (3,07 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří pomocí aktivního tíhli, teto se potom odfiltruje a čirý roztok se lyofilizuje. Získá se takto 2,90 g D-Glp-Leu-Pro-NI-h, což představuje 90% teorie.

Rí^(5> - 0,40;

[a]|,25 —23,6^; (c · 1, kyselina octová).

P ř í к 1 a d 15

Amid kyseliny orotýl-L-hist:din-L-pipekolinové

Stupen 1

Methylester orotyl-L-histidinu

24,2 g (100 mmolů] I-I HisOMe . 2 HCl se rozpustí ve 120 ml směsi dimethylformamidu a dioxanu v poměru 1 : 1 а к tomuto roztoku se přidá 17,41 g (100 mmolů) monohydrátu kyseliny orotové. Roztok se ochladí na teplotu 0°C a při této teplotě se postupně přidává 11,5 g (100 mmolů) N-hydroxysukcintmidu, 11,1 ml (100 mmolů] N-methylmorfolinu a konečně 20,0 g (100 mmolů] DCC. Reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě OTa potom přes noc při teplotě místnosti. Příští den se tato reakční směs uloží na dvě hodiny do ledničky, potom se odfiltruje DCU a filtrát se odpaří. Po odpaření zbylá olejovitá kapalina se přivede ke krystalizaci rozetřením s vodou, krystaly se odfiltrují a na filtru se promyjí 5% vodným roztokem kyseliny citrónové a posléze vodou. Tímto způsobem se získá 11,6 g Oro-His-OMe, což odpovídá 38 % teorie.

T. t. — 258 až 262 °C;

R/^5} — 0,40;

Analýza pro CnHísOjNs (mol. hm. 307,27): vypočteno

N 22,79 %, zjištěno

N 22,51 %.

Stupen 2

Orotyl-hlstidinhydrazid

9.21 g (30 mmolů) Oro-His-OMe se rozpustí ve 120 ml dimethylformamidu a tento roztok se smísí se 7,35 ml (150 mmolů) hydrazinhydrátu. Reakční směs se ponechá stát po dobu 2 dní při teplotě místnosti, potom se zředí 100 ml ethylesteru kyseliny octové a ponechá se přes noc v ledničce. Vyloučená sraženina se potom odfiltruje a překrystalizuje se z methylalkoholu. Tímto způsobem se získá. 8,07 g Oro-His-N:H5, což odpovídá 88 % teorie.

T. t. 250 až 260 °G;

R/ '¹ o,35;

Analýza pro CnHisOiNz (mol. hm. 307,28): vypočteno

N 31,91 %, zjištěno

N 30,75 %.

Stupeň 3

Amid kyseliny orotyl-L-histidyl-L-pipekolinové

5,0 g (16,28 mmolu) Oro-His-N₂H_:l se rozmíchá ve 135 ml dimethylformamidu a tato směs se smísí s 5,99 ml (48,84 mmolu)

8,1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Takto získaný roztok se ochladí na teplotu —15 °C a za míchání se к němu po kapkách přimísí 2,13 ml (17,9 mmolu) terc.butylnitritu. Reakční směs se potom míchá při teplotě —10 °C po dobu 20 minut a potom se к ní po kapkách přidá po sobě při teplotě —10 °C 4,56 ml (32,56 mmolu) triethylaminu, roztok 2,05 g (16,28 mmolů) H-Ptp-NHž v 10 ml dimethylformamidu a nakonec dalších 2,28 ml (16,28 mmolu) triethylaminu. Po ukončení přídavku se reakční směs míchá ještě po dobu jedné hodiny při teplotě —10 T a potom se nechá stát pres noc při teplotě 2 C. Příští den se vyloučená sraženina odfiltruje, filtrát se ve - vakuu odpaří a zbytek se rozetře s ethylesterem kyseliny octové. Tímto způsobem získaný surový produkt (4,6 gramu, 74% teorie) se oddělí a 1,3 g tohoto produktu se nanese na sloupec sestávající ze - směsi karboxymethylcelulózy-23 a karboxymethylcelulózy-52, načež se elu.uje 0,005 až 0,1 M roztokem octanu amonného (pH — 5). Frakce obsahující čistý produkt se sjednotí a lyofilizují. Získá se takto 820 miligramů amorfního Oro-His-Pip-NH·:.

R,l5) -= 0,10;

[a]u--5 = — 19,0’’ (c — 1, voda).

Analýza aminokyselin: His 1,00 (1,0), Pip 0,94 (1,0).

Příklad 16

Amid kyseliny orotyl-L-histidyl-D-pipek o línové

5,0 g (16.23 mmolu) Oro-His-N-íH·; se rozmíchá ve 135 ml dimethylformamidu a k této směsi se přidá 5,99 ml (48,84 mmolu)

8,1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Takto získaný roztok se ochladí na teplotu —15 °C a za míchání se do něj po kapkách přidá 2,1.3 ml (17,9 mmolu) terc.butylnitritu. Reakční směs se dále míchá po dobu 20 minut při teplotě .....10 Έ a potom se do ní při stejné teplotě přidá po kapkách 4,56 ml (32,56 mmolu) triethylaminu, potom roztok 2,05 g (16,28 mmolu) H-D-PipNHj a nakonec dalších 2,28 ml (16,28 mmolu) triethylaminu. Po- ukončení přídavku se reakční směs míchá ještě po dobu jedné hodiny při teplotě —10 °C a potom se nechá stát přes noc v ledničce při teplotě 2 °C. Příští den se vyloučená sraženina odfiltruje, filtrát se ve - vakuu odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s ethylesterem kyseliny octové. Tímto způsobem- se získá 4,1 g surového produktu, což představuje 66 % teorie, 1,3 g tohoto produktu se nanese na sloupec, sestávající ze směsi karboxymethylcelulózy-23 a karbox-ymethylcelulózy-52 v poměru 1:1a eluuje se 0,005 až 0,1 M roztokem octanu amonného (pH — 5). Frakce obsahující čistý - produkt se spojí a lyofilizují. Získá se 795 mg amorfního Oro-His-D-Píp-NíT.

R(l5) = 0,10;

[a]n‘^2Z‘ — +13,5° (c — 1, voda).

Analýza aminokyselin: His 1,00 (1,0), Pip 0,96 (1,0).

P ř í k 1 a d 17 .

Orotyl-L-histidyl-L-hcmoprolinarniid

5,0 g (16.28 - mmolu) Oro-His-NTl. se roznuchá - ve 135 ml dimethylformamidu a k této směsi se přidá 5,99 ml (48,84 mmolu)

8,1 N roztoku - kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Takto získaný roztok se ochladí na teplotu —15 rC a za míchání se k němu přidá po kapkách 2,13 ml (17,9 mmolu) terc.butylnitritu. Reakční směs se - potom míchá ještě po dobu 20 minut při teplotě —10 cc a potom se rovněž při teplotě —10° Celsia přidá po kapkách po sobě 4,56 ml (32,56 mmolu) triethylaminu, roztok 2,05 gramu (16,28 mmolu) H-Pro-NH v 10 ml dimethylformamidu a konečně ještě dalších

2,28 m 1 (16,28 mmolu - rriethyaamiuu - Po ukončení přídavku se reakční směs míchá ještě po dobu jedné hodiny při teplotě —10 stupňů Celsi a potom se nechá stát přes noc v ledničce při teplotě 2 °C. Příští den se vyloučená sraženina odfiltruje, filtrát se ve vakuu odpaří a zbytek po odpaření se rozetře s ethylesterem kyseliny octové. Tímto způsobem získaný surový produkt (4,2 g, což odpovídá 67% teorie) se rozdělí a 1,3 g tohoto produktu se nanese na sloupec ze směsi karboxymethylcelulózy-23 a karboxymethylcellulč^2^}-52 v poměru 1 : 1 a eluuje se 0,005 až 0,1 M roztokem octanu amonného. Frakce obsahující - čistý produkt se spojí a lyofilizují. Takto se získá 802 mg amorfního Oro-His-HPro-NH₂.

R - ‘ - 0,10;

íj·² -= -1^2.8° - (c — 1, voda);

Analýza aminokyselin: His 1,00 (1,0). HPro·

0,91 (1,0). '

Příklad 18

Amid kyseliny L-64ketopiperidi.n-2-karbonyl-L-norvalyl-L-thiazolidin^-4-karboxylové .

2,55 g (9,5 namohl) H-Nva-Tca - FICI se rozmíchá ve 30 ml dimethylformamidu a za chlazení ledem a za míchání se k této směsi přidá - 3,09 g (10 mmolů) Kpc-OPFP a 1,33 ml (9,5 mmolu) triethylaminu. Po pětiminutovém míchání se přidá do - reakční směsi dalších 1,33 ml (9,5 mmolu) triethylaminu a po 20 minutách dalšího- míchání se reakční směs ve vakuu odpaří. Po odpaření zbylá olejovitá kapalina se ponechá přes noc v ledničce - a tím ss přivede ke krystalizaci. Příští den se krystaly odfiltrují, promyjí diethyletherem a studeným e- thylalkoholem. Tímto způsobem získaný su241028

36 rový produkt (3,25 g) se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří aktivním uhlím a po přefiltrování se roztok odpaří. Krystalický zbytek se rozetře s 20 ml ethylalkoholu a přes noc se nechá stát v ledničce. Příští den se krystalický produkt odfiltruje a vysuší. Získají se 2 g Kpc-Nva-Tca-NH., což odpovídá 59 % teorie.

T. t. — 183 až 185 °C;

Rf^í5) — 0,47;

[>α]_υ ^2ύ — -136,0^ (c := 1, kyselina octová).

Příklad 19

L-6-ketopiperidln-2-karbonyl-L-norvalyl-L-homoprolinamid

Stupeň 1 terč.buíyloxy karbony 1-L-homoprolinamid

2,29 g (10 mmolů) BOC-HPro-OH se rozpustí ve 30 ml ethylesteru kyseliny octové, tento roztok se smísí s 1,4 ml (10 mmolů) triethylaminu. reakční směs se ochladí na teplotu —10 °C a potom se do ní po kapkách. přidává 1,3 ml (10 mmolů) isobutylesteru kyseliny chlormravenčí. Po patnáctiminutovém míchání směsi při teplotě —10 stupňů Celsia se do reakční směsi zavádí po dobu 30 minut plynný amoniak, potom se tato směs nechá stát po dobu 2 hodin při teplotě v rozmezí 0 až 5 °C. Vyloučená sraženina se potom odfiltruje, filtrát se odpaří a jako zbytek po odpaření získaná, olejovitá kapalina se rozpustí ve 30 ml chloroformu. Chloroformový roztok se potom protřepe nejdříve dvakrát vždy 10 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom rovněž dvakrát vždy 10 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a konečně jednou 10 ml vody, potom se vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Jako zbytek po odpaření získaná olejovitá kapalina se pomocí n-hexanu přivede ke krystalizaci. Tímto způsobem získaný surový produkt (1,95 g) se rekrystalizuje ze směsi ethylesteru kyseliny octové a diethylethe.ru a získá se 1,78 g BOC-HPro-NH₂, což je 78 % teorie.

T. t. = 138 až 140 °C;

r/2) ₌ o,43;

[aJo²⁵ = —-24,85° (c = 1, kyselina octová).

Analýza pro ΟπΗ₂₀Ο₃Ν2 (mol. lim. 228.29):

vypočteno

C 57,85 %, H 8,83%, N 12,27%, zjištěno

C 57,60 %, II 8,89%, N 12,11%.

Stupeň 2

L-hoi.noproIinamidhydrochlorid

1,6 g (7 mmolů) BOC-HPro-Nlb se za tepla rozpustí v .10 ml ethylesteru kyseliny octové, roztek se ochladí na teplotu místnosti a přidá se do něj 10 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Reakční směs se nechá stát po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, potom se zředí diethyletherem, oddělená sraženina se rozetře s diethyletherem a odfiltruje. Tímto způsobem se získá 1,05 g H-Pro-NIb . I1C.1. což představuje 91% teorie.

T. t. - 178 až 180 ^CC;

R_t ^,h) -- 4-26,2° (c -- 1, methylalkohol).

Stupeň 3

L-norvalyl-L-homoprolinamidhydrochlorid

0,99 g (6 mmolů.) H-Pro-NH₂ . HC1 se rozmíchá ve 2'0 ml dimethylformamidu a tato směs se za míchání smísí s 0,84 ml (6 mmolů) triethylaminu a 2,3 g (6 mmoly) BOC-Nva-OPFP. Po patnáctiminntovém stání se přidá dalších 0,84 ml (6 mmolů) triethvlaminu a po jedné hodině míchání reakční směsi se tato ve vakuu odpaří. Zbytek se rozpustí v 50 ml chloroformu a tento roztok se protřepe nejdříve dvakrát vždy 10 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové, potem rovněž dvakrát vždy 10 ml 1 N roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nakonec jednou 10. ml vody, potom se vysuší bezvodým síranem sodným a odpaří. Po odpaření získaná olejovitá kapalina se rozpustí v 6 ml ethylesteru kyseliny octové a tento roztok se smísí s 10 ml 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylesteru kyseliny octové. Po jedné hodině stání se reakční směs zředí diethyletherem, oddělí se vyloučená sraženina, tato se rozetře s etherem, odfiltruje a ve vakuu se vysuší pomocí bezvodého síranu sodného. Tímto způsobem se získá 1,22 g H-Nva-HPro-NH₂ . . HC1, což odpovídá 89,5 % teorie.

R_f ⁽⁵⁾ = 0,12.

Stupeň 4

L-6-ketopiperidin-2-karbonyl-L-norvalyl-L-homoprolinamid

1,22 g (5,37 mmolu) H-Nva-HPro-NH₂ .

. HC1 se rozpustí ve 20 ml dimethylform241028 amidu a tento roztok se smísí s 0,75 ml (5,37 mmolu) triethylaminu a 1,7 g (5,5 nnnolu) Kpc-OPFP. Po pětiminutovém míchání se přidá dalších 0,75 ml (5,37 mmolu) triethylaminu a po dalších 20 minutách míchání reakční směsi se tato za vakua odpaří. Zbytek po odpaření se rozetře s diethyletherem a tímto způsobem získaný amorfní surový produkt (1,8 g) se nanese na sloupec obsahující 40 g silikagelu a eluuje se směsí rozpouštědel (4). Frakce e luátu obsahující čistý produkt se spojí a odpaří. Získá se 1,1 g čistého produktu, který se rozpustí ve vodě, roztok se vyčeří aktivním uhlím a po zfiltrování se čirý vodný roztok lyofilizuje. Tímto způsobem se získá 1,0 g Kpc-Nva-HPro-NH2, což odpovídá 53 °/o teorie.

Rr^(r,) — 0,35;

[a]u²⁵ - —44,6° (c — 1, kyselina octová).

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob výroby tripeptidamidů obecného vzorce I

   X—Y_W—NH2 (I), ve kterém značí

   X L-pyroglutamylovou skupinu, D-pyroglutamylovou skupinu, L-2-ketoimidazolidin-4-karbonylovou skupinu, L-6-ketopipekolylovou skupinu, L-thiazolidin-4-karbonylovou skupinu, L-prolylovou skupinu nebo orotylovou skupinu,

   Y značí L-leucylovou skupinu, L-norvalylovou skupinu nebo L-histidylovou skupinu a

   W značí L-prolylovou skupinu, D-prolylovou skupinu, L-thiazoliditn-4-karbonylovou skupinu, L-homoprolylovou skupinu, L-leucylovou skupinu, L-isoleucylovou skupinu, L-methionylovou skupinu, L-pipekolylovou skupinu nebo D-pipekolylovou skupinu, nebo —W—NH2 značí pyrrolidylovou skupinu nebo piperidylovou skupinu, když ale

   X značí L-pyroglutamylovou skupinu a

   Y značí L-histidylovou skupinu, pak

   W má jiný význam než L-prolylová skupina, a když

   X značí L-prolylovou skupinu a

   Y značí L-histidylovou skupinu, pak

   W má jiný význam než L-prolylová skuVYNÁLEZU pina nebo L-thiazolidin-4-karbonvlová skupina, jakož i terapeuticky použitelných komplexů těchto sloučenin, vyznačený tím, že chráněné aminokyselinové deriváty obecného vzorce II

   Ri—X—M¹ (П) a obecného vzorce III

   R²—Y--M² (III) a amid nebo amin obecného vzorce IV

   W—NH2 (IV) , kde značí

   R¹ a R² atom vodíku nebo chránící skupiny odštěpitelné acidolyticky,

   M¹ a M² hydroxylovou skupinu nebo aktivující skupiny a

   X, Y a W mají výše uvedený význam, spolu reagují v pořadí uvedeném v obecném vzorci I a popřípadě se odštěpí chránící skupiny a popřípadě se získané produkty převedou na terapeuticky použitelné komplexy.