DK144563B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af do eller tritriacontapeptider eller -peptidderiveter eller syreadditionssalte eller zinkcomplexer deraf - Google Patents

Description

(19) DANMARK (fe: .

/'Τ'*.

φ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT di) 144563 Β

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2854/70 (51) Int.CI.3 C 07 C 103/52 (22) Indleveringsdag 2. jun. 1970 (24) Løbedag 2. jun. 1970 (41) Aim. tilgængelig 4. dec. 1970 (44) Fremlagt 29· mar. 1982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 5- Jun. 1969, 8405/69, CH 20. jun. 1969, 9451/69, CH

20. jun. 1969, 9452/69, CH 20. jun. 1969, 9453/69, CH m. fl.

(71) Ansøger SANDOZ A.G., CH-4002 Basel, CH.

(72) Opfinder Heinz Bossert, CH: Stephan Guttmann, CH: Rene Hu= guenin, CH: Janos Piess, CH: Edmond Sandrin, CH: m. fl.

(74) Fuldmægtig Johs. Preisz1 Efterf. Patentbureau.

(54) Analogifremgangsmåde til fremstil= ling af do- eller tritriacontapep= tider eller -peptidderivater eller syreadditionssalte eller zinkcom= plexer deraf.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til frem= stilling af do- eller tritriaeontapeptider eller ^peptidderivater med den almene formel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S-CH2-CHX-C0-l-Ser-l-Asn-l-leu-l-Ser-l-Thr-l-Cys-l-Val-l-leu-Gly= m 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 rø -1- ly s-1- leu-1- S er-1- Gin-1- Glu-1- leu-L-Hi s-L-Lys-L-Leu-L-Gln-L= S 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 - Thr-L- Tyr-l-Pro-l-Arg-L-Thr-1-Asn-L- Thr- Gly-I- Ser-Gly- L- Thr-Y, -zt hvor X betyder -H, -HH2, E-C0-KH-, hvor R betegner en 1 - 4 carbon= ^ atomer indeholdende alkylgruppe eller en eventuelt med et halogen= atom, en 1 eller 2 carbonatomer indeholdende alkoxygruppe eller en nitrogruppe substitueret phenyl- eller benzylgruppe, eller X betyder R'-O-CO-RH-, hvor R* betegner en 1 - 4 carbonatomer indeholdende alkylgruppe, en 2 - 4 carbonatomer indeholdende alkenylgruppe, en 2 144563 eventuelt med et halogenatom, en 1 eller 2 carbonatomer indeholdende alkoxygruppe eller en nitrogruppe substitueret phenylgruppe eller en eventuelt med et halogenatom, en 1 eller 2 carbonatomer indeholdende alkoxygruppe, en nitrogruppe, en phenylazo- eller en p-methoxyphenyl= azogruppe substitueret benzylgruppe, idet de sidstnævnte to grupper sidder i parastillingen, og Y betegner I-Pro-KHg eller I-Pro-I-Val-NH9, og hvor 1-Ser kan være ombyttet med I-Thr eller L-Ala, I-Asn kan være ombyttet med I-Asp, I-Gln eller Ι-Glu, I-Thr kan være ombyttet med 1-Ser eller I-Ala, L-Iys kan være ombyttet med Ke-tert.butyloxy= carbonyl-L-lys, L-Orn eller 1-Arg, I-Gln kan være ombyttet med L-G-lu, 1-Asn eller 1-Asp, Ι-Glu kan være ombyttet med tert.butyloxy-l-Glu, I-Gln, 1-Asn eller 1-Asp, 1-leu kan være ombyttet med I-Tyr, I-lyr kan være ombyttet med I-Phe, og I-Arg kan være ombyttet med I-Orn eller I-lys, syreadditionssalte deraf eller zinkcomplexer deraf.

Kår X betyder -KHg, R-CO-NH- eller R*-0-C0-KH-, foreligger aminosyren HS-CHg-CHX-COOH i I-formen.

R kan f.eks. være methyl, ethyl, propyl eller tert.butyl, men også en eventuelt med et halogenatom, en 1 - 2 carbonatomer indeholdende alkoxygruppe eller en nitrogruppe substitueret phenyl- eller benzyl= gruppe.

F.eks. kan R' betegne propyl, allyl, benzyl, p-nitrobenzyl, p-chlor-benzyl, p-brombenzyl, p-phenylazobenzyl med formlen

eller p-methoxyphenylazobenzyl med formlen CH^O

I peptidsekvenserne i den ovenfor anførte almene formel kan enkelte aminosyrer være ombyttet som angivet ovenfor med de nævnte andre, naturlige aminosyrer eller de anførte derivater.

Herefter kan i stilling 2, 5, 15 og 29 Ser være ombyttet med Thr eller Ala, i stilling 3 og 26 Asn være ombyttet med Asp, Gin eller Glu, i stilling 6, 21, 25, 27 og 31 Ihr være ombyttet med Ser eller Ala, i stilling 11 og 18 lys være ombyttet med BOC-Iys, Orn eller Arg, i stilling 14 og 20 Gin være ombyttet med Glu, Asn eller Asp, 3 144563 i stilling 15 Glu være ombyttet med OTB-Glu, Gin, Asn eller Asp, i stilling 19 Leu være ombyttet med Tyr, i stilling 22 Tyr være ombyttet med Phe, og i stilling 24 Arg være ombyttet med Orn eller Lys , idet der for alles vedkommende er tale om L-formen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man kon= denserer β-mercaptopropionsyre eller L-eystein eller cysteinderivater med den almene formel HS-CHg-CHX'-COOH, hvor X’ betegner R-CO-NH-, hvor R har den ovenfor anførte betydning, eller R'-O-CO-NH-, hvor R' har den ovenfor anførte betydning, L-Ser eller L-Thr eller i-Ala, 1-Asn eller 1-Asp eller L-Gln eller L-Glu, L-Leu eller L-Tyr, L-Ser eller L-Thr eller L-Ala, L-Thr eller L-Ser ellerL-Ala, L-Cys, L-Val, L-Leu eller L-Tyr, Gly, L-Lys eller Re-tert.butyloxycarbonyl= -L-Lys eller L-Orn eller L-Arg, L-Leu eller L-Tyr, L-Ser eller L-Thr eller L-Ala, L-Gln eller L-Glu, L-Asn eller L-Asp, L-Glu eller L-Asn eller L-Asp eller tert.butyloxy-L-Glu eller L-Gln, L-Leu eller L-Tyr, L-His, L-Lys eller ΪΓε-tert.butyloxycarbonyl-L-Lys eller L-Orn eller L-Arg, L-Leu eller L-Tyr, L-Gln eller L-Glu eller L-Asn eller L-Asp, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Tyr eller L-Rhe, L-Pro, L-Arg eller L-Orn eller L-Lys, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Asn eller L-Asp eller L-Gln eller L-Glu, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, Gly, L-Ser eller L-Thr eller L-Ala, Gly, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Pro og eventuelt L-Val i den angivne rækkefølge og/el= ler kondenserer peptidbrudstykker, som indeholder disse aminosyrer eller aminosyrederivater og eventuelt β-mercaptopropionsyre i den i den ovenfor viste formel angivne rækkefølge, hvorhos samtidig de øvrige tilstedeværende reaktive grupper beskyt= tes, og de ikke mere nødvendige beskyttelsesgrupper fraspaltes efter kondensationens afslutning, idet man på et vilkårligt tidspunkt i syntesen a) omdanner carboxylgruppen i den endestillede L-Pro- eller L-Pro= -L-Val-gruppe til en amidgruppe, b) til beskyttelse af alkoholgruppen i det i stilling 2 tilstedevæ= rende L-Ser eller peptidbrudstykker, der indeholder dette L-Ser, eventuelt kondenserer nævnte alkoholgruppe med et eventuelt aktiveret derivat af propionsyre, 4 144563 c) oxiderer mercaptogrupperne til en S-S-bro efter dannelse af delsekvens 1-7 og,om ønsket, omdanner det på denne måde vundne do- eller tritria= contapeptid eller -peptidderivat med den ovenfor viste formel til et syreadditionssalt eller et zinkcomplex deraf.

Sammenknytningen af aminosyrerne og/eller peptidenhederne sker f.eks. på den måde, at man omsætter en aminosyre eller et pep= tid med beskyttet α-aminogruppe og aktiveret terminal carboxylgruppe med en aminosyre eller et peptid med fri α-aminogruppe og fri eller beskyttet terminal carboxylgruppe, eller at man omsætter en amino= syre eller et peptid med aktiveret α-aminogruppe og beskyttet ter= minal carboxylgruppe med en aminosyre eller et peptid med fri ter= minal carboxylgruppe og beskyttet α-aminogruppe.

Oarboxylgruppen kan f.eks. aktiveres ved omdannelse til et syreazid, -anhydrid, -imidazolid eller -isoxazolid eller en aktiveret ester eller ved omsætning under anvendelse af et carbodiimid eller en JjU'-carbonyl-diimidazol. Fortrinsvis anvendes som kondensations= metode carbodiimidmetoden, azidmetoden, metoden med en aktiveret ester, anhydridmetoden eller Merrifield-metoden.

Indføringen af en eventuelt i slutproduktet ved det endestillede L-hemicystin-molekyle ønsket beskyttelsesgruppe kan ske i et vil= kårligt trin før sidste trin.

I sidste trin af kondensationen skal der imidlertid anvendes sådan= ne metoder, ved hvilke der ikke optræder racemisering, eller ved hvilke racemisering kan holdes nede på et ringe omfang, fortrinsvis ved anvendelse af aziderne eller de aktiverede estere; aktiveringen foretages fortrinsvis med ϊΓ-hydroxysuccinimid.

Frie, funktionelle grupper; som ikke tager del i reaktionen,kan ved opbygningen af de omhandlede peptider beskyttes på følgende måde:

Til blokering af guanidogruppen i argininresten i den nedenfor be= skrevne delsekvens B er der anvendt en nitrogruppe, men der kan også anvendes andre egnede beskyttelsesgrupper, f.eks. tosylgruppen, p-nitrocarbobenzoxygruppen eller 2-(isopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6= -tetrachlorbenzoylgruppen. Man kan også ved syntesen udnytte den be= skyttende effekt, som protonisering af guanidogruppen har.

5 144563

Ted opbygning af polypeptiderne eller polypeptidderivaterne har det til blokering af γ-carbonylgruppen, f'.eks. i den nedenfor beskrevne delsekvens D, vist sig hensigtsmæssigt at anvende tert.butyloxy= gruppen, men der kan også anvendes andre beskyttelsesgrupper, f.eks. en methoxy-, ethoxy-, tert.amyloxy-, amid- eller benzyloxygruppe.

lil blokering af ώ-aminogruppen i lysinresten, f.eks. i den nedenfor beskrevne delsekvens 0, kan anvendes en carbo-tert.alkoxygruppe, f.eks. carbo-tert.butoxygruppen.

Som mercaptobeskyttelsesgruppe i den nedenfor beskrevne delsekvens EF og EE3 anvendes fortrinsvis benzyl- eller tritylgruppen. Sædvan= ligvis fraspaltes de til beskyttelse af SH-grupperne anvendte benzyl-eller tritylgrupper ved slutningen af syntesen ved behandling med natrium i flydende ammoniak. Det har nu vist sig, at fraspaltningen af benzyl- eller tritylbeskyttelsesgrupperne samt dannelsen af S-S-bindingen før sidste trin fører til særlig gode udbytter af slutproduktet.

Omdannelsen af en beskyttet mercapto- eller aminogruppe til en fri gruppe samt omdannelsen af en funktionelt omdannet carboxylgruppe til en fri carboxylgruppe under fremgangsmåden til fremstilling af polypeptiderne sker efter i og for sig kendte metoder ved behand= ling med hydrolyserende eller reducerende midler.

Udgangsprodukterne til fremstilling af polypeptiderne eller polypep= tidderivaterne er kendte eller kan fremstilles efter fra peptidkemi= en kendte metoder, hvorhos aminosyrerne kan sammenknyttes enkeltvis eller efter forudgående dannelse af mindre peptidenheder.

Polypeptiderne eller polypeptidderivaterne kan også fremstilles eller anvendes i form af deres salte eller zinkcomplexer. Som salte kommer i betragtning sådanne med organiske syrer, f.eks. eddikesyre, mælke= syre, ravsyre, benzoesyre, salicylsyre, methansulfonsyre, toluen= sulfonsyre, eller polymere syrer såsom garvesyre eller carboxymethyl= cellulose, og salte med uorganiske syrer, f.eks. hydrogenhalogenid= syrer såsom saltsyre eller svovlsyre og phosphorsyre.

6 144563

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser repræsenterer et vigtigt terapeutisk princip. De sænker calciumplas= maspejlet og bevirker som antagonister til parathyreoideahormonet en positiv calciumbalance i knoglerne. De omhandlede forbindelsers biologiske virkning er prøvet på rotter, og på grundlag af sænkningen af blodcalciumniveauet bestemtes værdier på 3*000 - 5*000 MRC-enheder/ mg peptid.

Bestemmelsen af den biologiske virkning af de her omhandlede forbin= delser, f.eks. Salm-calcitonin, på rotter er udført efter standard= metoden i henhold til Kumar et al. [J. Endocrin. 33, 469 (1965)].

Her anvendes en af "Medical Research Council" (MRC) i England til rådighed stillet renset ekstrakt af svinecalcitonin som MRC-standard. Definitionsmæssigt sænker 10 millienheder af denne standard pr. rotte calciumplasmaspejlet med 1 mg$.

Som forsøgsdyr anvendes hanrottter med vægt 90 - 110 g, som i de sidste 17 - 22 timer har været holdt uden foder og har fået calci= umfri fysiologisk kogsaltopløsning. Præparaterne administreres in= travenøst, idet substansen opløses i 0,2F eddikesyre med 0,1% okse= serumålbumintilsætning. Før injektionen udtages blodprøve fra den retroorbitale veneplexus, og 60 minutter efter præparatets injek= tion udtages blodprøve fra Yena jugularis. På denne måde tjener hvert dyr som sin egen kontrol. Pr. dosis anvendes 5-8 dyr.

De på grundlag af blodprøverne ved hjælp af atomadsorptionsspektro= fotometri bestemte værdier for den med de enkelte doser opnåede sænkning af calciumplasmaspejlet optegnes i en kurve, som giver virkningssammenligningen.

I dansk patentansøgning nr. 5456/69 beskrives hypocalcæmisk virken= de polypeptider af typen I ' -1 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-Oys-Gly-I-Åsn-Tj-Leu-L-Ser-l-Thr-l-Cys-L-Met-Ii-leu-Gly-l-Thr-l= 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 -Tyr-l-Thr-I-G-ln-l-Åsp-l-Phe-L-Asn-L-Lys-I-Phe-L-His-L-Thr-L-Phe^ 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 -l-Pro-l-Gln-l-Thr-I-Ala-Ii-Ile-Gly-Ii-Val-Grly-Ii-Ala-Ii-Pro-MHg som i det følgende betegnes calcitonin M.

7 144563

De ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede polypeptider eller polypeptidderivater er forbindelser af Salm-calcitonintypen, hvor kun nogle af aminosyrerne indtager en identisk position som hos calcitonin M. Disse store strukturelle forskelle mellem de to polypeptidtyper medfører også, at deres hypocalcæmiske virkninger er forskellige. Ved sammenligningsforsøg mellem calcitonin M og den i eksempel 2 beskrevne forbindelse (Salm-calcitonin) under an= ven'delse åf den ovenfor beskrevne forsøgsmetodik opnåede s for Salm-calcitonin en værdi på 3.500 MRC-enheder/mg peptid og for calcitonin M en værdi på ca. 120 MRC-enheder/mg peptid. Salm-cal= citonin er således næsten 30 gange så kraftig virksomt som calcitonin M.

Ved den ovenfor beskrevne forsøgsmetodik bestemtes også den hypo= calcæmiske virkning af butyryl-Salm-calcitonin (forbindelsen med den ovenfor angivne almene formel, hvor X = R-CO-UH (R = butyl), Y = Pro-EHg). Der bestemtes for denne forbindelse en værdi på 3.500 MRC= -enheder/mg peptid.

De doser, der skal administreres, afhænger af den ønskede virkning samt af applikationsmåden. Almindeligvis opnås der imidlertid til= fredsstillende resultater med en daglig dosis på 1 - 10 enheder pr. kg. dyrevægt, administreret på én gang. Til større pattedyr er den daglige dosis fra ca. 70 til ca. 700 enheder, der kan ad'inistreres på én gang eller i flere portioner. Til intramuskulær applikation in= deholder en egnet administrationsform fra ca. 70 til ca. 700 enheder af det aktive stof blandet med en flydende bærer.

De omhandlede forbindelser er således indicerede ved alle tilstande, hvor der ønskes en sænkning af plasmacalciumspe;)let eller påvirkning af knoglestofskiftet, f.eks. hypercalcæmier,som skyldes mangel på det endogene thyreocalcitonin ved deficit af skjoldbruskkirtelvæv eller hyperfunktion af biskjoldbruskkirtlerne. Forbindelserne er end= videre indicerede ved alle knogleaffektioner, som beror på en forøget nedbrydning, eller ved hvilke der ønskes en calciumfiksering i knog= lerne, f.eks. osteoporose af forskellig genese (f.eks. postklimakte= risk, posttraumatisk, betinget ved corticosteroidterapi eller inaktivi= tet, osv.) frakturer, osteomalacie, rachitis og renalt betinget osteo= dystropi, samt især til kombinationsterapi med calcium eller phosphat.

8 144563

En fordel ved de omhandlede polypeptider eller polypeptidderivater med den almene formel, hvor X er R-CO-NH-, hvor R har den ovenfor anførte betydning, eller Rr-0-C0-NH-, hvor R1 har den ovenfor anførte betydning, er deres bestandighed over for aminopeptidases nedbrydende virkning.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan som lægemidler f.eks. anvendes i form af farmaceutiske præparater.

Disse indeholder de nævnte forbindelser i blanding med et til parente= ral applikation egnet organisk eller uorganisk bæremateriale. For= bindeiserne kan også administreres i form af et depotpræparat.

De i nærværende beskrivelse og krav anvendte formler for peptider er opstillet i overensstemmelse med de af IUPAC-IUB Biokemisk Nomenklaturkomité foreslåede regler, som disse fremgår af Biochim. Biophys.

Acta 121 (1966) 1-7. Endvidere anvendes følgende forkortelser: Z = carbobenzoxy (benzyloxycarbonyl)

Bzl = benzyl BOC = tert.butyloxycarbonyl

Irt = trityl = triphenylmethyl 0TB = tert.butyloxy ONP = p-nitrophenylester OOP = 2,4,5-trichlorphenoxy OMe = methoxy OEt = ethoxy ΪΓΟ2 = nitro

Piv = pival oyl MCP = β-mercaptopropionyl OSu = N-oxysuccinimid EOC = ethoxycarbonyl DOHA = dicyclohexylamin.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved følgende ek= sempler, i hvilke værdien af c i forbindelse med optisk drejning er 1. Af aminosyreanalyse, som er foretaget i forbindelse med de efterfølgende eksempler, fremgår, at de enkelte aminosyrer foreligger i de ventede forhold.

Først vises fremstillingen af de delsekvenser, der anvendes i eksemplerne.

9 U4563

Delsekvens A: HrSer-Gly-Thr-Pro-NH2 a) H-Tlxr-Pro-HHg ·HC1

Yed -5°0 opløses 134 g Z-Thr-NH-NH2 i 2 liter IN saltsyre, og til opløsningen sættes 0,55 liter IN natriumnitrit. Efter 5 minutters forløb tilsættes der kaliumcarbonat til pH-værdi 9, og det dannede azid ekstraheres med ethylacetat, og der tilsættes en opløsning af 80 g H-Pro-NHg.HCl i 100 ml vand, 500 ml dime thylformamid og 77 ml triethylamin. Ethylacetatet afdampes ved 20°0 i vakuum, og op= løsningen henstår natten over ved 25°C, hvorpå den inddampes i vakuum, og remanensen opløses i ethylacetat, hvorefter opløsningen vaskes med vand, fortyndet saltsyre og vandig calciumcarbonatopløs= ning og tørres over natriumsulfat. Derpå inddampes opløsningen i vakuum, og remanensen opløses i varmt ethylacetat og afkøles. Der fås Z-Ihr-Pro-NH2, smeltepunkt 148°C, [oc]-^0 = -72° i 95$'s eddike= syre. 90 g Z-Ihr-Pro-NH2 opløses derefter i 2 liter dioxan og 260 ml IN saltsyre og hydrogeneres ved 20°C og atmosfæretryk i nærværel= se af en palladiumkatalysator. Der filtreres, opløsningen inddam= pes i vakuum, og den krystallinske remanens vafekes med ethylacetat, hvorved der fås H-Thr-Pro-NHg.HCl, smeltepunkt 216°C;[oc]|^ = -64° i 95^'s eddikesyre.

b) Z-Ser-G-ly-NHNH2 14,5 g Z-Ser-0H opløses i 100 ml chloroform, og der tilsættes 6,1 g N-methylmorpholin. Derpå tildryppes 8,2 g chlormyresyreisobutyl= ester. Efter 10 minutters forløb tilsættes en opløsning af 6,6 g glycin-ethylester i 50 ml chloroform, og blandingen omrøres i 1 time ved stuetemperatur. Derpå vaskes blandingen med fortyndet ammoniak og derefter med saltsyreopløsning og tørres over natriumsulfat, og den organiske fase inddampes. Det vundne Z-Ser-G-ly-OEt omkrystalli= seres af ethylacetat. Smeltepunkt 103°C, = +3° i dimethylform= amid. 19,4 g Z-Ser-Gly-OEt opløses i 270 ml ethylalkohol, der til= sættes 27 ml hydrazinhydrat, og blandingen henstår i 2 dage ved stuetemperatur. Derpå frafiltreres den krystallinske masse, som vaskes med methanol og tørres. Der fås Z-Ser-G-ly-NHNH2, smeltepunkt 180°C, [a]^° = +2° i dimethylformamid.

ίο 144563 c) H-Ser-Gly-Thr-Pro-KHn

Til 200 ml dimethylformamid sættes 25 ml af en 4R opløsning af hy= drogenchlorid i ethyl ether, og i denne blanding opløses 11 g Z-Ser-Gly-NHHH2. Derpå tildryppes ved -10°C 5,4 ml tert.butylnitrit, hvorpå der til opløsningen sættes IS ml triethylamin og derefter filtreres. Samtidig opløses 12 g H-Thr-Pro-M2 .HC1 i 100 ml dime= thylformamid, der tilsættes 6,2 ml triethylamin, det udskilte tri= ethylaminhydrochlorid frafiltreres, og til filtratet sættes den på den ovenfor beskrevne måde vundne dipeptidazidopløsning. Blandingen hen= står i 2 timer ved 0°C, hvorpå den inddampes til tørhed, og rema= nensen opløses i en blanding af 500 ml methanol og 100 ml vand, hvor= på den vundne opløsning føres gennem en 100 ml's søjle af "Dowex"® -50 (H+-form). Der inddampes, og remanensen krystalliseres af me= thanol/ethylacetat. Der fås Z-Ser-Giy-2'.hr-Pro-KH2 med smeltepunkt 132°C (sønderdeling), [a]p° = -22° i dime thylformamid. 22 g Z-Ser-Gly-Thr-Pro-BHg opløses i en blanding af 440 ml methanol og 88 ml vand og hydrogeneres ved 20°0 og atmosfæretryk i nærværelse af palladium/kul. Derpå filtreres blandingen, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen vaskes med ether og tørres, hvorved der fås H-Ser-Gly-Thr-Pro-NHo med smeltepunkt 95°C (sønderdeling), [a]^ = -27° i dimethylformamid.

Delsekvens B: BQC-Arg-Ihr-Asn-lhr-Gly-EHNHg a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt 43 g Z-Thr-Gly-0Et opløses i 300 ml dimethylformamid og hydrogene= res ved atmosiæretryk og stuetemperatur i nærværelse af palladium/= kul. Der filtreres, tilsættes 60 g Z-Asn-OCP, og blandingen lades henstå i 16 timer ved 25°C, hvorpå den koncentreres til ca. 250 ml, og derpå tilsættes ethylacetat, hvorefter der vaskes med fortyndet saltsyre, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed. Rema= nensen vaskes med ethylacetat og tørres. Der fås Z-Asn-Thr-Gly-OEt, smeltepunkt 225°C [“]^° = -4° i dimethylformamid.

11 1A4563 b) Z- Thr-Asn- Thr- Gly- OEt 29 g Z-Asn-Thr-Gly-OEt opløses i 700 ml dimethylformamid, og der hydrogeneres ved atmosfæretryk og stuetemperatur i nærværelse af palladium/kul, hvorpå blandingen filtreres, og filtratet tilsættes Z-Ihr-N^, som er fremstillet ud fra 50 g Z-Thr-MML, (Dfr· delse= kvens A a)). Efter 12 timer ved 0°C inddampes til tørhed, og rema= nensen vaskes med vand, ether og ethanol. Der fås Z-Thr-Asn-Thr= -Gly-QEt, smeltepunkt 250° C, [a]·^ = -8° i dime thylf ormamid.

c) BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNI^ 22 g Z-Ihr-Asn-Thr-Gly-OEt opløses i 700 mldimethylformamid, og der hydrogeneres ved atmosfæretryk og stuetemperatur i nærværelse af palladium/kul, hvorpå der filtreres. 23 g B0C-Arg(ET02)-0H opløses i 500 ml dimethylacetamid, der tilsættes 12 ml triethylamin, afkøles til -10°C, tilsættes 9,4 ml chlormyresyreisobutylester, og blandin= gen lades reagere i 10 minutter, hvorpå den på den ovenfor beskrev= ne måde vundne tetrapeptidopløsning tilsættes. Efter 30 minutter ved 25°C tilsættes 100 ml vand, og den resulterende opløsning be= handles med "Amberlite" IRA 410 (OH-form) indtil negativ chlorreak= tion, hvorpå den filtreres, og filtratet inddampes til tørhed. Re= manensen vaskes med chloroform, ethylacetat og ether og tørres. Der fås B0C-Arg(N02)-Thr-Asn-Thr-Gly-0Et, smeltepunkt 100°C, [a]-^ = -4° i dimethylformamid.

12 g BO C-Arg(NO 2)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt opløses i en blanding af 200 ml eddikesyre og 40 ml vand, og der hydrogeneres i nærværelse af palladium/kul ved 20°C og atmosfæretryk, hvorpå der filtreres og inddampes til tørhed i vakuum ved 20°C. Remanensen opløses i di= methylformamid, og opløsningen inddampes. Denne behandling gentages, indtil der ikke længere kan påvises eddikesyre. Remanensen opløses i 120 ml dimethylformamid, og der tilsættes 6 ml hydrazinhydrat, hvorpå opløsningen henstår i 16 timer ved 25°C, hvorpå den inddam= pes. Remanensen vaskes med ether, methanol/ether (l:l) og derpå igen med ether og tørres. Der fås BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNHP, smeltepunkt 175°C (under sønderdeling), [a]^ = -42° i dimethyl= f ormamid/W HC1 (1:1).

12 144563

Delsekvens AB: H-Arg-fhr-Asn-Thr-Grly-Ser-Grly-Thr-Pro-EHg' 2 CH^COOH

13.5 g BOC-Arg-Ihr-Asn-Thr-Gly-EHEHg (del s elevens B) opløses i 270 ml dimethylformamid/vand (8:2), og opløsningen afkøles til -15°0 og tilsættes 40 ml af en 4R opløsning af saltsyre i dioxan og 2.5 ml tert.butylnitrit. Der omrøres i 10 minutter ved -15°C, til= sættes 28 ml triethylamin, frafiltreres, tilsættes 10,5 g H-Ser= -Gly-Ihr-Pro-RHg (delsekvens A) og omrøres i 16 timer ved 0°C. Der= på inddampes til tørhed, og remanensen vaskes med ether og tørres. Remanensen opløses i methanol, tilsættes et 10 gange så lille rum= fang vand og en 7 gange så stor mængde chloroform, og den resulte= rende opløsning føres gennem en søjle af 500 g silicagel. Efter eluering med en stigende mængde methanol fås efter inddampning BOC-Arg-Thr-Asn-Ihr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-KH^, som suspenderes i 200 ml af en 4R opløsning af saltsyre i dioxan, og der omrøres i 2 ti= mer ved 25°C. Der inddampes til tørhed, og remanensen opløses i 0,2R eddikesyre, der behandles med "Amberlite" IRA 410 (acetatform), og den vandige opløsning lyofiliseres. Derpå vaskes remanensen med ether, ethylacetat og ether og tørres over natriumhydroxid= spåner. Der fås H-Ar g- f hr-Asn- Thr- G-ly- S er-Grly- Ihr-Pr o-REL· · 2 CEUCOOH, smeltepunkt 195°0 (sønderdeling), [oc]^ = -64° i dimethylformamid/= IR HC1 (1:1).

Delsekvens 0: Z-His-lys(BOO)-Ieu-Grln-Thr-Tyr-Pro-OH

a) H-Thr-Tyr-Pro-OH

176 g Z-Iyr(Z)-Pro-OMe opløses i 1000 ml methanol/lR HC1, og der hydrogeneres i nærværelse af palladium/kul ved 20°C og 1 atmosfære og inddampes. Remanensen opløses i 400 ml dimethylformamid, og til opløsningen sættes ved 0°C 100 ml triethylamin, hvorpå det ud= krystalliserede triethylaminhydrochlorid frafiltreres, og filtra= tet tilsættes Z-Ihr-Rj (fremstillet ud fra 87 g Z-Thr-RHKH^, jfr. delsekvens A a)). Blandingen henstår i 16 timer ved 0°C, hvorpå den inddampes til tørhed, og remanensen opløses i ethylacetat, og ethylacetatopløsningen vaskes med fortyndet saltsyre og derefter med fortyndet ammoniak, tørres og inddampes. Remanensen p‘ulverise= res i heptan, vaskes med petroleumsether og tørres. Der fås 13 144563 Z-Thr-Tyr-Pro-OMe, smeltepunkt 80°C (sønderdeling), [a]^ = -23° i dimethylformamid.

53 g Z-Ihr-Tyr-Pro-OMe opløses i 530 ml methanol, og opløsningen tilsættes 100 ml 2H vandig natriumhydroxidopløsning, henstår i 1 time ved 25°C, tilsættes 50 ml 2H saltsyre, koncentreres til et rumfang på ca. 200 ml, tilsættes endnu 100 ml vand, indstilles på pH-værdi 10, vaskes to gange med ethylacetat og indstilles derefter på pH-værdi 1 med 4H saltsyre, hvorpå det udskilte tripeptid Z-Ihr-lyr-Pro-OH ekstraheres med ethylacetat, og ethylacetatfasen tørres og inddampes. Pen vundne remanens har smeltepunkt 80°C, [a]jj = -23° i dimethylformamid. Remanensen opløses i en blanding af 500 ml dioxan og 100 ml vand og hydrogeneres ved 20°C og atmos= færetryk i nærværelse af en palladiumkatalysator. Blandingen fil= treres og inddampes til tørhed, og remanensen vaskes med ether og tørres. Per fås H-fhr-Tyr-Pro-OH, smeltepunkt 180°C (sønderdeling), [ct].^ = -31° i 95$'s eddikesyre.

b) Z-Ieu-Gln-OMe 70 g Z-Gln-OH opløses i 1,5 liter dioxan, og der tilsættes lang= somt en sådan mængde etheropløsning af diazomethan, at opløsningen farves gul. Perefter inddampes opløsningen, og den hvide remanens forarbejdes med ether. Per fås Z-Gln-OMe, smeltepunkt 136°C, [oc]·^ = -21° i dimethylformamid. 71 g ester opløses i 1,7 liter methanol.

Perpå røres 5 g 10$'s palladium/aktivt kul op med 59 ml 4N salt= syre og sættes til opløsningen. Blandingen underkastes en 3 timers hydrogenering ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Herved forbruges ca. 83$ af den teoretiske mængde hydrogen. Katalysatoren frafiltre= res, og filtratet inddampes fuldstændigt, hvorved der fås H-Gln-OMe-HC i form af en sej olie.

64 g Z-Peu-OH opløses i 200 ml acetonitril, og til opløsningen sæt= tes 27,7 g H-hydroxysuccinimid, hvorpå den afkøles til -10°C. Her= til hældes en opløsning af 50 g dieyelohexylcarbodiimid i 100 ml acetonitril. I løbet af ca. 30 minutter frafiltreres dicyclohexyl= urinstof, hvorpå filtratet tilsættes 47,3 g H-Gln-OMe-HC1, opløst 14 144563 i dimethyIformamid, under samtidig tilsætning af 1 ækvivalent N-methylmorpholin. Opløsningen henstår i 4 timer og inddampes der= efter. Eemanensen opløses i ethylacetat og vaskes med 5$'s natri= umbicarbonatopløsning, IN saltsyre og vand. Den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Efter omkrystal= lisation af methanol og ether fås Z-Leu-Gln-OMe, smeltepunkt 179°C, [a]^ = -16° i dimethylformamid.

c) Z-Dys(B00)-Ieu-G-ln-0He 42 g Z-Leu-Gln-OMe opløses i 1500 ml methanol. Derpå røres 16 g 10$’s palladium/åkfcivt kul op med 25,8 ml 4N saltsyre og sættes til opløsningen. Blandingen underkastes 8 timers hydrogenering ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Derved forbruges 95$ af den teore= tiske mængde hydrogen. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddampes. Der fås H-Deu-Grln-OMe-HCl i form af et skum. Derpå op= løses H-leu-Gln-OMe· HC1 i 500 ml dimethylformamid, og til opløs= ningen sættes 34 g Z-Dys(B0C)-0CP og 8,4 ml triethylamin. Efter omrystning henstår reaktionsblandingen i 16 timer, hvorpå den ind= dampes i vakuum. Eemanensen behandles med vand og isoleres fra van= det ved filtrering. Derefter opløses der i en ringe mængde metha= nol og fældes med ether. Efter filtrering og tørring fås Z-Iys(B0C)= -Leu-G-ln-OMe, [oc]^ = -21° i dime thylf ormamid.

d) Z-His-Dys(BOC)-Leu-Gln-M-NH^ 38 g Z-Dys(BOC)-leu-Gln-OMe opløses i 300 ml dimethylformamid, og til opløsningen sættes 15 g 10$'s palladium/kul, hvorpå der hydro= generes ved atmosfæretryk og stuetemperatur, og katalysatoren fra= filtreres. Derpå tilsættes Z-His-N^,fremstillet ud fra 25,2 g Z-His-NHNHg, og blandingen henstår i 5 timer ved 20°0, hvorpå den inddampes, og remanensen opløses i ethylacetat, vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes, og remanensen vaskes med ether. Der fås Z-His-Lys(B0C)-Leu-Gln-0Me, smeltepunkt 120°C (søn= derdeling), [a]^® = -19° i dimethylformamid. 33 g Z-His-Lys(B0C)= -Leu-Gln-OMe opløses i 330 ml methanol, og opløsningen tilsættes 7,5 ml hydrazinhydrat, henstår to dage ved 25°C og inddampes der= efter til tørhed. Derpå opløses remanensen i dimethylformamid, og opløsningen inddampes. Denne behandling gentages, indtil der ikke 15 144563 længere kan påvises spor af hydrazin. Remanensen vaskes med ether, vand og ether og tørres, hvorved der fås Z-His-Iys(BOC)-Leu-Gln= -NH-EH^, smeltepunkt 199°C, [cc]^ = -22° i methanol.

e) Z-Hi s-Lys (BOO)-leu-Gin-Thr-Tyr-Pr o-OH

40 g Z-His-lys(BOC)-leu-Gln-HH-NH2 opløses i 400 ml dimethylform= amid, og opløsningen afkøles til -20°C, tilsættes 75 ml dioxan/= 2H HC1 og derefter 6 ml tert.butylnitrit, omrøres i 10 minutter ved -20°0, tilsættes 30 ml triethylamin og 20 g H-Thr-Tyr-Pro-OH og blandingen lades reagere i 16 timer ved 25°0. Derpå inddampes til tørhed, og remanensen vaskes med ether, fortyndet eddikesyre, ether og til sidst med varmt ethylacetat. Derpå tørres i højvakuum, hvorved der fås Z-His-Iys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH, smeltepunkt 215°C (sønderdeling), [oc]^ = -23° i dimethylformamid.

Delsekvens 01: Z-His-Iys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH

a) H-Thr-Tyr-Pro-OH Se delsekvens C a).

b) Z-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH

40,1 g Z-Gln-OHP og 38,4 g H-Thr-Tyr-Pro-OH opløses i 500 ml di= methylformamid, og til opløsningen sættes 12,2 ml N-methylmorpho= lin. Opløsningen henstår i 16 timer ved stuetemperatur, hvorpå den inddampes fuldstændigt i vakuum. Inddampningsremanensen optages i ethylacetat/n-butanol (10:1) og vaskes med 1ΜΓ svovlsyre/30^’s natriumchloridopløsning (1:1) og derefter med 15$’s natriumchlorid= opløsning. Efter tørring over natriumsulfat inddampes den organiske fase fuldstændigt i vakuum. Remanensen opløses i chloroform/metha= nol (1:1) og filtreres gennem en silicagelsøjle, der udgør en 20 gange så stor mængde som remanensen. Der fås Z-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH i form af et skum. [a]jj = -19° i dimethylf ormamid.

16 144563 c) Z-Iys(BOC)-!I!yr-OMe 143,9 g Z-Lye(BOC)-OH.DOHA opløses i 600 ml varmt dimethylformamid, og efter afkøling til 35°C tilsættes en opløsning af 65,1 g H-Iyr= -OMe ‘HC1 i 200 ml dimethylformamid, hvorved DCHA’HOl udkrystalli= serer kvantitativt. Der filtreres, og til filtratet sættes 30 g H-hydroxysuccinimid, hvorpå filtratet afkøles til -15°0 og til= sættes en opløsning af 53,6 g dicyclohexylcarbodiimid i 200 ml acetonitril. Der rystes i 15 timer ved 0°C, hvorpå dicyclohexyl= urinstof frafiltreres, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen opløses i ethylacetat, vaskes med 5$’s natriumbicarbonatopløsning, IH svovlsyre og vand, tørres over natriumsulfat og inddampes til et skum. Der fås på denne måde Z-lys(B0C)-Iyr-0Me, [a]^ = -6° i methanol.

d) Z-His-Dys(BOC)-Tyr-HHHHg 113,5 g Z-Lys(B0G)-!Tyr-0Me opløses i 2 liter methanol, og opløs= ningen tilsættes en suspension af 10 g 10$'s palladium/aktivt kul i 50 ml 4® saltsyre og hydrogeneres ved stuetemperatur og atmosfære= tryk. Efter 3 timers hydrogenering er 90$ af den teoretiske mængde hy= drogen forbrugt. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddampes fuld stændigt til tørhed i vakuum. Det resulterende skumformede H-Lys(BOC)= -lyr-OMe-HCl er i henhold til tyndtlagschromatografi ensartet og kobles med Z-His-H^ på følgende måde: 88,5 g Z-His-NHHHg opløses . i 1800 ml dimethylformamid, og der afkøles til -20°0 og tilsættes 405 ml af en 3,7H opløsning af HC1 i ether og dråbevis 36,6 ml tert.butylnitrit. Efter 10 minutters omrøring ved -20°0 tilsættes 270 ml triethylamin og en opløsning af H-lys(B0C)-Tyr-0Me· HC1 i 600 ml dimethylformamid, som allerede indeholder 27,3 ml triethyl= amin. Efter 5 timers forløb frafiltreres fra udkrystalliseret triethyl= amin.HCl. Eiltratet inddampes fuldstændigt i højvakuum. Remanensen opløses i ethylacetat/vand (2:1), og den organiske fase vaskes 4 gange med 15$'s natriumchloridopløsning, tørres over natriumsul= fat og inddampes. Efter opløsning af remanensen i chloroform/me= thanol (98:2) og filtrering over en silicagelsøjle (en 25 gange så stor mængde) fås Z-His-lys(BOC)-lyr-OMe i amorf form, [a]^® = -11° i dimethylformamid. 90,4 g Z-His-Lys(BOC)-lyr-OMe opløses i 300 ml methanol, og der tilsættes 20 ml hydrazinhydrat. Efter 2 17 144563 dages henstand udkrystalliserer det dannede hydrazid. Der t±lsæt= tes 300 ml ether, sugefiltreres, vaskes med ether og tørres i vakuum. Der fås på denne måde Z-His-Bys(BOC)-Tyr-EHNH9, smelte= 9Π punkt 187°C, [a]^ = -24° i dimethylformamid.

e) Z-His-lys (BOC)-Tyr-Gin-Thr-Tyr-Pro-OH

36,7 g Z-Gin-Thr-Tyr-Pro-OH opløses i 500 ml dimethylformamid, og der tilsættes 15 g 10$'s palladium/aktivt kul og hydrogeneres ved stuetemperatur og atmosfæretryk, hvorpå katalysatoren frafiltreres. Filtratet indeholder H-Gin-Thr-Tyr-Pro-OH, som på følgende måde kobles med Z-His-lys(BOC)-Tyr-H5: 40,4 g Z-His-Lys(B0C)-Tyr-HHra2 opløses i 400 ml dimethylformamid, og opløsningen afkøles til -20°0 og tilsættes 88 ml dioxan/2N HC1 og derefter 7,3 ml tert.butyl-nitrit. Efter 10 minutters omrøring ved -20°C tilsættes 37 ml tri= ethylamin samt dimethylformamidopløsningen indeholdende H-Gln-Thr= -Tyr-Pro-OH. Efter 5 timer ved 20°C inddampes fuldstændigt i vakuum, og remanensen opløses i ethylacetat/n-butanol (5:1), og opløsningen vaskes med fortyndet eddikesyre under tilsætning af natriumchlo= ridopløsning, hvorefter den tørres over natriumsulfat og inddampes. Den ikke helt inddampede olie tilsættes ether, gennemarbejdes godt og underkastes sugefiltrering. Efter tørring i højvakuum fås Z-His-Iys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH, smeltepunkt 193°C, [oc]^ = -33° i dimethylformamid.

Delsekvens ABC: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn=

- Thr- Gly- Ser- Gly- Thr-Pr o-NH 2 · 3 CH^OOH

10 g heptapeptid (delsekvens C) opløses i 100 ml dimethylformamid, og opløsningen inddampes, hvorefter remanensen opløses i 100 ml * dimethylformamid. Der tilsættes 15 g N-hydroxysuccinimid og afkøles til 0°C og tilsættes 5 g dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen lades reagere i 3 timer, hvorpå det udskilte dicyclohexylurinstof fra= filtreres, filtratet koncentreres til 30 ml og den dannede hepta= peptidoxysuccinimidester Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-OSu udfældes ved tilsætning af ether. Efter udvaskning med ether oplø= ses remanensen i 100 ml dimethylformamid og tilsættes 10 g nona= peptidamid (delsekvens AB), og blandingen lades reagere i 16 timer.

18 144563

Der tilsættes 500 ml ethylacetat og filtreres. Remanensen opløses i dime thylformamid, og der tilsættes 10 ml eddikesyre og fældes igen med ethylacetat. Blandingen filtreres, og filterremanensen vaskes med ethylacetat og ether og tørres. Der fås Z-His-Lys(B0C)= -leu-G-ln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-G-ly-Ser-G-ly-Thr-Pro-NHp· 2 AcOH, pn ^ [a]D = -19° i dimethylformamid, hvilket produkt direkte opløses i 805¾'s eddikesyre. Derefter tilsættes 5 g palladium/kul, og der hydrogeneres ved atmosfæretryk og stuetemperatur. Derpå filtreres, og filtratet inddampes til tørhed i højvakuum ved 20°0. Den herved vundne remanens vaskes med ether. Efter tørring over KOH-spåner 20 fås delsekvens ABC, smeltepunkt 170°C (under sønderdeling) . wr --55° i IR eddikesyre.

Delsekvens ABC1: H-Hl s-Ly s (B0C) - Tyr- G-ln- Thr- Tyr-Pr o-Arg- Thr-Asn--Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-HH2 · 3CH3COOH

Efter samme fremgangsmåde som beskrevet for fremstillingen af del= sekvens ABC fås ud fra 10 g heptapeptid (delsekvens Cl) og 10 g nonapeptid (delsekvens AB) delsekvens ABC1, smeltepunkt 166°C (sønderdeling), [α]^ - -50° i IR eddikesyre.

Delsekvens D: Trt-Gly-Lys(B0C)-Leu-Ser-G-ln-Grlu(0TB)-leu-RHRH2 a) Z-Glu( 0 TB)-leu-OMe 151 g Z-Glu(0TB)-0H og 54 g R-hydroxysuccinimid opløses i 700 ml acetonitril, og der afkøles til -20°C. Derefter tilsættes 96,5 g dicyelohexylcarbodiimid opløst i 350 ml acetonitril. Efter ca. 30 minutters henstand frafiltreres det dannede dicyclohexylurinstof.

Til filtratet sættes 71,2 g H-leu-OMe, hvorpå blandingen henstår i 4 timer og derefter inddampes i vakuum. Den faste remanens til= sættes ethylacetat/vand (2:1). Den organiske fase vaskes derefter med 5$*s natriumbicarbonatopløsning, vand og fortyndet svovlsyre (pH-værdi 3), og efter vaskning til neutral reaktion tørres den over natriumsulfat og inddampes. Remanensen opløses med chloroform, hvor= til der er sat Ifo methanol, og filtreres over en silicagelsøjle (en 10 gange så stor mængde). Der fås Z-Glu(0TB)-Leu-OMe, smeltepunkt 31°C, [a]^® = -12° i dimethylformamid.

19 144563 b) H- Grin- Giu (O TB) -Leu- OMe 118 g Z-G-lu(OTB)-Ieu-OMe opløses i 2000 ml methanol. Derefter røres 15 g 10$*s palladium/aktivt kul op i 63 ml 4H saltsyre og sættes til opløsningen. Blandingen underkastes 2 timers hydrogenering ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Herved forbruges ca. 85$ af den teoretiske mængde hydrogen. Katalysatoren frafiltreres, og filtra= tet inddampes fuldstændigt, hvorved der fås H-G-lu(0TB)-Leu-OMe·HC1 i form af et amorft skum.

91,7 g Z-Gln-OHP og 93,8 g H-Glu(0TB)-Ieu-0Me·HC1 opløses i 500 ml dimethylformamid, og der tilsættes 51 ml F-methylmorpholin. 0pløs= ningen henstår i 15 timer ved stuetemperatur, hvorpå den inddampes fuldstændigt i vakuum. Den på denne måde vundne remanens forarbejdes godt med vand og filtreres fra vandet. Derefter omkrystalliseres den af methanol, hvorved der fås Z-Gln-Glu(OTB)-Ieu-OMe, smelte= punkt 210°C (sønderdeling), [oc]jj = -40° i dimethylf ormamid.

44,4 g Z-Gfln-(xlu(0IB)-leu-0Me opløses i 1200 ml methanol/dimethyl= formamid (1:1). Derpå sættes 15 g 10$’ s palladium/aktivt kul til 50 ml vand, og denne blanding sættes til opløsningen. Efter en hydroge= neringstid på ca. 2 timer er der forbrugt næsten den kvantitative mængde hydrogen. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen opløses i ethylacetat og vaskes 3 gange med mættet natriumchloridopløsning. Den organiske fase tørres over natriumsulfat, og filtratet inddampes til ca. 1/3 af sit oprindelige rumfang. Efter tilsætning af petroleumsether kan det faste tripep= tid frafiltreres. Der fås H-(rln-Grlu(OTB)-leu-OMe, smeltepunkt 123°C, [oc]^ = -14° i dimethylf ormamid.

c) Z-Iys(BOC)-Ieu-Ser-OMe 43 g H-Ieu-Ser-OMe· HC1 og 80 g Z-Lys(B0C)-0CP opløses i 400 ml di= methylformamid, der tilsættes 22 ml triethylamin, og opløsningen henstår i 25 timer ved 25°C, hvorpå det udskilte triethylamin fra= filtreres, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen opløses i ethylacetat, vaskes med fortyndet saltsyre og fortyndet kalium= bicarbonatopløsning, tørres over natriumsulfat, filtreres og ind= dampes. Remanensen omkrystalliseres af ethylacetat/ether, hvorved 20 144563 der fås. Z-lys(BOC)-leu-Ser-OMe, smeltepunkt 110°C, [a]^ = -14° i dime thylf ormamid.

d) Trt-Gly-lys (BOG)-leu-Ser-HHWHg 158 g Trt-Gly-OH opløses i 2000 ml dichlormethan og 72 ml tri= ethylamin, hvorpå opløsningen afkøles til -5°C, tilsættes 50 ml chlormyresyreethylester ogomrøres i 10 minutter ved -5°C. Samtidig opløses 300 g Z-Iys(BOC)-leu-Ser-OMe i 3000 ml dioxan/vand (8:2), hydrogeneres i nærværelse af palladium/kul ved stuetemperatur og atmosfæretryk, filtreres og inddampes. Remanensen opløses i chloro= form og tilsættes det på den ovenfor beskrevne måde vundne blandede anhydrid. Chloroformopløsningen henstår i 1 time ved 0°C, hvorpå den vaskes med fortyndet eddikesyre og derpå med fortyndet kaliumbiear= bonatopløsning, tørres og indd.am.pes til tørhed. Remanensen opløses i 1250 ml methanol, tilsættes 175 ml hydrazinhydrat og henstår i 16 timer ved 25°C. Der koncentreres til 500 ml, tilsættes vand og fil= treres, og remanensen vaskes med vand og tørres over phosphorpent= oxid. Der fås Trt-Gly-lys (BOC)-Leu-Ser-NHNEt9, smeltepunkt 204°C, ΡΩ [a]]} = “6° i dimethylformamid.

e) Irt-Gly-Iys(B0C)-Leu-Ser-Gln-Glu(0TB)-leu-mKH2 76 g Trt-Gly-lys (B0C)-Ieu-Ser-MNH2 opløses i 300 ml dime thylf o rm= amid, og opløsningen afkøles til -20°C hvorpå der tilsættes 75 ml dioxan/4R HC1 og derefter 11,6 ml tert.butylnitrit, omrøres i 10 minutter ved -15°C, tilsættes 70 ml triethylamin og 49,5 g H-Gln= -Glu(0TB)-leu-OMe. Derpå omrøres i 16 timer ved 0°C. Det udskilte triethyl'aminhydrochlorid frafiltreres, filtratet koncentreres til ca. 100 ml,og remanensen tilsættes vand. Den udskilte remanens fra= filtreres, vaskes igennem med vand og tørres i højvakuum ved 50°C. Remanensen udkoges med ethylacetat, vaskes med ether og tørres. Den vundne heptapeptidester Trt-Gly-lys(BOC)-leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-leu-OMe (smeltepunkt 234°C, [a].^ = -20° i dimethylformamid) opløses i 200 ml dimethylformamid, tilsættes 4 ml hydrazin og henstår i 24 timer ved 25°C. Efter koncentrering til ca. 100 ml tilsættes 500 ml vand, og det udskilte materiale frafiltreres, vaskes med vand til neutral reaktion og tørres over phosphorpentoxid ved 50°C. Der fås 21 144563

Trt-Gly-Lys(BOC)-leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-iiHj[HI2, smeltepunkt 265°C, [a]^® = -18° i dimethylformamid/vand (8:2).

Delsekvens ABOD: H-Gly-I/ys(BOC)-leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-His-Iys= (BOG)-leu-Gin-Thr-Tyr-Pr o-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-S e r= -Gly-Thr-Pro-M2 3 AcOH- 3H20 3 g heptapeptidhydrazid (delsekvens D) opløses i 30 ml dimethylform= amid, og opløsningen afkøles til -20°C og tilsættes 2 ml dioxan/4N HC1 og derefter 0,3 ml tert.butylnitrit. Der omrøres i 10 minutter ved -20°C, tilsættes 2 ml triethylamin og 3 g hexadecapeptidamid (delsekvens ABC), omrøres i 16 timer ved 0°C og inddampes til tørhed. Remanensen vaskes ved 0°C med fortyndet eddikesyre og derefter med vand, og der filtreres. Remanensen opløses i methanol/vand (9:1), der filtreres over silicagel, og remanensen inddampes, vaskes med ethylacetat, opløses i 200 ml 805¾1 s eddikesyre, opløsningen henstår i 4 timer ved 25°C, hvorpå den inddampes til tørhed ved 20°C, og remanensen vaskes med ether, ethylacetat og ether, filtreres og tørres. Der fås delsekvens ABCD, smeltepunkt 240°C (sønderdeling), [a]^ = -38p i eddikesyre.

Delsekvens Dl: Trt-Gly-Lys(B0C)-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-UHKH2 a) Z-Gln-Leu-OMe 40,1 g Z-Gln-ONP og 19,1 g H-Leu-OMe·HC1 opløses i 300 ml dimethyl= formamid, og opløsningen tilsættes 34,1 ml N-methylmorpholin og henstår ved 20°C i 15 timer under periodevis omrystning. Derpå ind= dampes reaktionsopløsningen fuldstændigt i højvakuum. Remanensen forarbejdes godt med vand og isoleres ved filtrering. Efter krystal= lisation af methanol fås Z-Gln-Leu-OMe, smeltepunkt 168°C, [a]j^ = -11° i dimethylformamid.

b) H-Gin-Gin-Leu-OMe 27,8 g Z-Gln-Leu-OMe opløses i 130 ml iseddike, og til opløsningen sættes 220 ml 40$'s hydrogenbromid i iseddike. Hele blandingen hen= 22 144563 står i 1 time under periodevis omrystning. Efter fuldstændig ind= dampning i vakuum pulveriseres remanensen i vandfri ether. Efter filtrering tørres det stærkt hygroskopiske H-Gln-Leu-OMe·HBr i etherfugtig tilstand i tørreskab ved stuetemperatur.

77,5 g Z-Gln-ΟϊΠ? og 81,4 g H-Gln-Ieu-OMe -HBr opløses i 750 ml di= methylformamid, og til opløsningen sættes 66,5 ml F-methylmorpho1in. Opløsningen henstår i 15 timer ved stuetemperatur og inddampes der= på fuldstændigt i vakuum. Den på denne måde vundne remanens forar= bejdes godt med vand og skilles derefter fra vandet ved filtrering. Sugefilterremanensen forarbejdes med acetone og skilles ved hjælp af en presse fra acetonefasen. Efter tørring i vakuum fås Z-Gln= -Gln-Deu-OMe, smeltepunkt 258°0, [a]^° = -16° i dime thylf ormamid.

54,8 g Z-Gln-Gln-Ieu-OMe opløses i 1200 ml dimethylformamid. Derpå sættes til denne opløsning en suspension af 10 g 10$fs palladium/= aktivt kul i 70 ml vand. Efter ca. 1 times hydrogenering ved stuetempe= ratur og atmosfæretryk er den kvantitative mængde hydrogen forbrugt. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddampes fuldstændigt i vakuum. Remanensen omkrystalliseres af methanol/ether. Der fås H-Gln-Gln-Eeu-OMe, smeltepunkt 151°C, [a]^° = -10° i dimethylform= amid.

c) Z-Iiys(B0C)-Iieu-Ser-0Me Se delsekvens D c).

d) Trt-Gly-Lys(B0C)-Leu-Ser-EHEH2 Se delsekvens D d).

e) Trt-Gly-Iys(B0C)-leu-Ser-Gln-Gln-Deu-mm2

Ved anvendelse af samme fremgangsmåde, som er beskrevet for delse= kvens D e), idet der i stedet for H-Gln-Glu(OTB)-Leu-OMe anvendes den samme mængde H-Gln-Gln-leu-OMe, fås Trt-Gly-Lys(BOC)-leu-Ser= -Gln-Gln-ieu-KHEH2, smeltepunkt 270°C, [a]^ = -12° i dimethylform= amid/vand (8:2).

23 m 5β3

Delsekvens ABCD1: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-lys(BOC)= -Leu-Gin-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly= -Thr-Pro-KHg.3 AcOH·3 H20

Ved anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet for fremstillin= gen af delsekvens ABCD, idet der i stedet for delsekvens D .anvendes en lige så stor mængde af delsekvens Dl, fås delsekvens ABCD1, smak nr tepunkt 245°C (sønderdeling), [α]^ = -40® i iseddike.

Delsekvens AB01D: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-leu-His-Lys= (BOC)-Tyr-Gin-Thr-Tyr-Pr o-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly= -Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.3 AcOH.3 H20

Ved anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet for fremstillingen af delsekvens ABCD, idet der i stedet for delsekvens ABC anvendes en lige så stor mængde af delsekvens ABC1, fås delsekvens ABC1D, smel= tepunkt 230°C (under sønderdeling), [a]^ = -40° i eddikesyre.

Delsekvens ABC1D1: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys(BOC)= - Ty r- Gin- Thr- Ty r-P r o - Ar g- Thr-A sn- Thr- Gly- S e r= -Gly-Thr-Pro-UH2.3 AcOH.3 H20

Ved anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet for fremstillin= gen af delsekvens ABCD, idet der i stedet for delsekvens ABC anven= des en lige så stor mængde af delsekvens ABC1, og idet der i stedet for delsekvens D anvendes en lige så stor mængde af delsekvens Dl, fås delsekvens ABC1D1, smeltepunkt 255°C (sønderdeling), [α]^ = -41° i eddikesyre.

Delsekvens E: H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH

a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe.HBr 21,0 g Z-Cys(Bzl)-OCP og 12,3 g H-Val-Leu-OMe.HC1 opløses i 120 ml dimethylformamid. Derpå tilsættes 5,9 ml triethylamin, og blan= dingen henstår i 16 timer ved 25°C, hvorpå der tilsættes ethylace= tat, vaskes med fortyndet saltsyre, tørres over natriumsulfat og inddampes til tørhed, og remanensen krystalliseres af ethylacetat/= diethylether. Der fås Z-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, smeltepunkt 160°C, [ocj-p = -28° i dimethylformamid, som opløses i 210 ml af en 40^'s 24 U4563 opløsning af hydrogenbromid i iseddike. Opløsningen henstår i 1 ti= med ved 25°C, hvorpå den inddampes til tørhed, og remanensen omkry= stalliseres af isopropanol/diethylether. Der fås H-Cys(Bzl)-Yal-Deu= -OMe.HBr, smeltepunkt 168°C, [a]^ = +14° i dimethylformamid.

h) H-Ihr-Cys(Bzl)-Yal-leu-OMe.1,3HBr 20 g Z-Thr-DHNH^ opløses i 350 ml dimethylformamid, og opløsningen afkøles til -20°C og tilsættes 100 ml af en opløsning af 2Ή salt= syre i dioxan og derefter 10 ml tert.butylnitrit. Efter 10 minut= ter ved -20°C tilsættes 45 ml triethylamin og 25,5 g H-Cys(Bzl)= -Yal-Leu-OMe.HBr, og den resulterende blanding rystes i 16 timer ved 0°C. Der inddampes til tørhed, og remanensen opløses i en blan= ding af ethylacetat/vand, den organiske fase vaskes med fortyndet saltsyre, tørres over natriumsulfat og inddampes, og remanensen om= krystalliseres af ethylacetat. Der fås Z-Thr-Cys(Bzl)-Yal-Leu-OMe; smeltepunkt 208°C, [oc]^ = -27° i dimethylformamid.

20 g af det på den ovenfor beskrevne måde vundne tetrapeptid oplø= ses i 200 ml af en blanding af trifluoreddikesyre/ethylacetat (1:1), og der tilledes i 1 time ved 0°0 en strøm af gasformigt hydrogen= bromid, hvorpå der inddampes, og remanensen omkrystalliseres af methanol/diethylether. Der fås H-Thr-Cys(Bzl)-Yal-Beu-OMe.l,3 HBr, smeltepunkt 202° C, [oc]^ = -10° i dime thylf ormamid.

c) H-Thr-Cys(Bzl)-Yal-Deu-OH

372 g H-Ihr-Cys(Bzl)-Yal-Leu-OMe.1,3 HBr opløses i 1800 ml metha= nol, der tilsættes 900 ml 2M vandig natriumhydroxidopløsning, og blandingen henstår i 1 time ved 25°C, hvorpå der tilsættes 240 ml iseddike, og blandingen henstår derefter i 2 timer ved 0°C. Den udskilte krystallinske masse frafiltreres og vaskes først med IH eddikesyre og derefter med vand og tørres ved 50°0 i højvakuum.

Der fås H-Thr-Cys(Bzl)-Yal-Leu-OH, smeltepunkt 219°0, [a]j^ = -53° i IH ammoniakopløsning.

Delsekvens E: BOO-CysiBzli-Ser-Åsn-Leu-Ser-HHHHg a) H-Asn-Ieu-Ser-QMe.H01 43 g H-Ieu-Ser-OMe.HCl og 53 g BOC-Asn-OEP opløses i 400 ml di= me thylformamid, og til opløsningen sættes 22 ml triethylamin, hvor= 25 144563 efter den resulterende blanding henstår i 16 timer ved 25° C og derefter inddampes til tørhed. Remanensen omkrystalliseres af methanol. Der fås BOC-Asn-Leu-Ser-OMe, smeltepunkt 190°C, [α]·ρ = -24° i dimethylformamid, som opløses i 500 ml af en 4N opløsning af saltsyre i methanol. Blandingen henstår i 1 time ved 25°C, hvorpå den inddampes til tørhed, og remanensen opløses i methanol og fældes med diethylether. Der fås H-Asn-leu-Ser-OMe.HCl, smelte= punkt 180°C, [a]-^® = -*23° i dimethylformamid.

b) H-Ser-Asn-leu-Ser-OMe.HCl 39.5 g B0C-Ser-lENH2 opløses i 500 ml dimethylformamid, og opløs= ningen afkøles til -20°C og tilsættes 200 ml af en 2N opløsning af saltsyre i dioxan og derefter 20 ml tert.butylnitrit. Efter 10 minutter ved -20°C tilsættes 90 ml triethylamin og 38,0 g H-Asn= -leu-Ser-OMe.HCl, hvorpå der omrøres i 16 timer ved 0°C og inddam= pes til tørhed, og remanensen omkrystalliseres af chloroform/di= ethylether. Der fås BOC-Ser-Asn-Ieu-Ser-QMe, smeltepunkt 135°C, [a]p = -22° i dimethylformamid, som opløses i 420 ml 4R saltsyre= opløsning i methanol. Blandingen henstår i 1 time ved 25°C, hvorpå den inddampes til tørhed, og remanensen krystalliseres af methanol/ethylacetat. Der fås H-Ser-Asn-leu-Ser-OMe.HCl, smelte= punkt 155°C (sønderdeling), [α]^ = -15° i dimethylformamid.

c) B0C-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Ieu-Ser-BHlH2 18.5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl og 18 g B0C-Cys(Bzl)-0NP opløses i 100 ml dimethylformamid, og til opløsningen sættes 10 ml vand, 3.5 ml eddikesyre og 5,6 ml triethylamin, hvorpå den henstår i 16 timer ved 25°C og derefter inddampes til tørhed. Remanensen omkry= stalliseres af methanol. Der fås BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, smeltepunkt 182°C, [aj^ = -17° i dimethylformamid, som under let opvarmning opløses i 200 ml dimethylformamid. Der tilsættes 200 ml methanol og 20 ml hydrazinhydrat, og blandingen henstår i 16 timer ved 30°C, hvorpå der fældes med diethylether, og bundfaldet vaskes med diethylether/methanol (1:1), hvorefter man tørrer det på denne måde vundne B0C-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-EHM2, smeltepunkt 224°0, [a]^ = -13° i dime thylf ormamid.

26 144563 i l

Delsekvens EP: BOC-Cys-Ser-Asn-Ieu-Ser-Thr-Cys-Yal-Ieu-OH

18,4 g B0C-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Iieu-Ser-MlIH2 (delsekvens I*) opløses i 150 ml dimethylformamid, og opløsningen afkøles- til -20°C og tilsættes 40 ml af en 2ΪΓ opløsning af saltsyre i dioxan og 15 ml tert.dutylnitrit. Efter 10 minutter Ted -20°C tilsættes 28 ml tri= ethylamin og 16,2 g H-THr-Cys(Bzl)-Yal-leu-OH (delsekrens E), og der omrøres i 16 timer ved 25°C. Derpå filtreres blandingen, op= løsningen inddampes, og remanensen vaskes igennem med 11 eddike= syre. Der fås BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Ieu-Ser-THr-Cys(Bzl)-Val-Leu= -OH, smeltepunkt 217° C, [α]^ = -17° i dime thylf ormamid. Det vundne produkt opløses i 5000 ml tørret ammoniak, og under omrøring og kogning af ammoniakken tilsættes metallisk natrium, indtil der er fremkommet en dybblå farvning. Der tilsættes ammoniumchlorid til affarvning. Der inddampes til tøjdied, og remanensen vaskes igennem med 11 eddikesyre og acetone. Efter tørring fås BOC-Cys-Ser-Asn= -leu-Ser-Thr-Cys-Yal-leu-OH, smeltepunkt 248°C (sønderdeling), [α]β = -41° i dimetbylformamid/vand (3:l). Det på denne måde vundne nonapeptid opløses i 5000 ml 0,011 ammoniak, og der tilsættes under omrøring 11 Hydrogenperoxid indtil negativ nitroprussiatreaktion, Hvorpå der yderligere tilsættes 200 ml iseddike og filtreres og lyofiliseres. Der fås BOC-Cys-S er-Asn-Leu-Ser-THr-Cys-Yal-leu-OH, smeltepunkt 238°C (sønderdeling), [a]jj = -18° i dimetHylformamid/= vand (3:1).

Delsekvens EE1: Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-THr-Cys-Yal-Iieu-OH

BOC-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-THr-Cys-Yal-leu-OH (delsekvens EE) opløses i 300 ml trifluoreddikesyre, og opløsningen Henstår i 30 minutter ved 25°0, Hvorpå den inddampes, og remanensen vaskes med etHyl= acetat og opløses i 300 ml dimetHylformamid. Til denne opløsning sættes 30 g pivalinsyre-p-nitropHenylester - der er fremstillet som beskrevet nedenfor - samt 14 ml trietHylamin. Blandingen Hen= står i 16 timer ved 25°C, Hvorpå den inddampes, og remanensen vaskes med chloroform. Remanensen opløses i 300 ml dimetHylformamid, og der tilsættes 50 ml vand og 50 g MDowex"-50, Hvorefter der omrøres i 15 minutter og derefter filtreres, Hvorpå harpiksen vaskes med dimethylformamid, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen 27 144563 vaskes først med chloroform og derefter med ethylacetat og tørres.

Der fås Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH, smeltepunkt 243°C, [a]^° = -17° i dimethylformamid/vand (3:1).

Pivalinsyre-p-nitrophenylester 95 g pivalinsyre og 131 g p-nitrophenol opløses i 1000 ml ethyl= acetat, der tilsættes 197 g dicyclohexylcarbodiimid og omrøres i 2 timer ved 25°0, hvorpå der filtreres, filtratet inddampes, og re= manensen krystalliseres af en blanding af ethylacetat og petroleums= ether. Der fås pivalinsyre-p-nitrophenylester med smeltepunkt 104°C.

Delsekvens EE2: EOC-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH

Efter samme fremgangsmåde som beskrevet for fremstillingen af del= sekvens EE1 fremstilles ud fra delsekvens EE og carbonsyre-p-nitro= phenyl-ethylester, der fremstilles som beskrevet nedenfor, del= sekvens EE2. Smeltepunkt 263°C, [a]·^ = -21° i dimethylformamid/= vand (3:1).

Carbonsyre-p-nitrophenyl-ethylester 200 g p-nitrophenol og 113 ml pyridin opløses i 1200 ml ethylacetat, og opløsningen afkøles til 0°C og tilsættes under omrøring 156 ml chlormyresyreethylester, hvorefter der omrøres i yderligere 30 mi= nutter ved 0°C, vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og ind= dampes til tørhed. Remanensen opløses i diethylether, og carbonsyre= -p-nitrophenyl-ethylester krystalliseres ved tilsætning af petro= leumsether, smeltepunkt 65°C.

Delsekvens E3: Bzl-MCP-Ser-Asn-leu-Ser-NH-NHg a) H-Asn-Leu-Ser-OMe.HCl.

Se delsekvens E a).

28 144563 b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe.HC1 Se delsekvens E b).

c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Ieu-Ser-innJHg

Ud fra 18,5 g H-Ser-Asn-leu-Ser-OMe.HCl og 13,5 g Bzl-MCP-ONP fås efter samme fremgangsmåde som beskrevet for fremstillingen af delsekvens P c) Bzl-MCP-Ser-Asn-leu-Ser-MHIJH9, smeltepunkt 251°C, 20 ^ [a]jj = -16° i dimethylformamid.

Delsekvens EE3: MiP-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-Deu-HHMg 16,2 g Bzl-MCP-Ser-Asn-leu-Ser-MUH^ (delsekvens F3) opløses i 150 ml dime thylformamid, og opløsningen afkøles til -20°C og til= sættes 40 ml af en 2F opløsning af saltsyre i dioxan og 15 ml tert.butylnitrit. Efter 10 minutter ved -20°C tilsættes yderligere 28 ml trietbylamin og 24,8 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Iieu-OMe.l,3 HBr (delsekvens Eb)), og der omrøres i 16 timer ved 25°0. Derpå fil= treres, opløsningen inddampes, og remanensen vaskes igennem med varm methanol. Der fås Bzl-MCP-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val= -leu-OMe, smeltepunkt 244°C, [oc]^ = -22° i dimethylformamid, som ved 60°C opløses i 100 ml dimethylformamid, og til opløsningen sættes 10 ml hydrazinhydrat, hvorpå den henstår i 2 timer ved 60°C. Det dannede nonapeptidhydrazid krystalliserer ud. Der vaskes med diethylether, vand og methanol, og tørres i højvakuum over phos= phorpentoxid. Der fås nonapeptidhydrazid med smeltepunkt 265°C, [oc]^ = -35° i dimethylformamid/vand (3:1).

Det vundne produkt opløses i 5000 ml tørret ammoniak, og under om= røring og kogning af ammoniakken tilsættes metallisk natrium, ind= til der fremkommer en dybblå farvning. Til affarvning tilsættes ammoniumchlorid, hvorefter en luftstrøm ledes gennem opløsningen ind= til negativ nitroprussiatreaktion. Der inddampes til tørhed, og remanensen vaskes igennem med vand og acetone. Efter tørring fås MCfc-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-HHHHg, smeltepunkt 278°0, [a]^ = -19° i dimethylformamid/vand (3:1).

29 144563

Eksempel 1: BOC-Cys-Ser-Asn-Deu-Ser-Thr-Cys-Yal-Iieu-Gly-Iys (BOO)= -leu-Ser-G-ln-G-lu (0TB) -Leu-His-Iy s (BOC) -Leu-Gln-Thr= -Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHg. 2 CH^COgH.3 H20 1,0 g nonapeptld (delsekvens EP) opløses i 10 ml dimethylformamid, og til opløsningen sættes 1,5 g N-hydroxysuccinimid og 0,52 g dicyclohexylcarbodiimid, hvorpå der omrøres i 6 timer ved 25°C og derpå filtreres, og filtratet inddampes til tørhed. Remanensen vaskes med ethylacetat og diethylether og tørres. Der fås BOC-Cys-Ser-Asn= -leu-Ser-Thr-cVs-Val-Deu-OSu, smeltepunkt 24-2°0, som opløses i 10 ml dimethylformamid. Til denne opløsning sættes 3,1 g tricosapeptid--diacetat (delsekvens ABCD) og 1,2 g ET-hydroxysuccinimid, og der omrøres i 16 timer ved 25°C, Der inddampes til tørhed, og remanen= sen vaskes med diethylether, chloroform og acetone. På denne måde fås det rå, beskyttede dotriacontapeptid, som opløses i 50 ml af en blanding af chloroform/methanol/vand (70:30:5). Den resulterende opløsning sættes på en silicagelsøjle (5 x 100 cm), som er ækvili= breret med den ovennævnte blanding. Elueringen udføres med en sti= gende koncentration af methanol. De forenede fraktioner, der inde=; holder det rene peptid, inddampes, og remanensen vaskes med diethyl= ether og tørres i højvakuum over kaliumhydroxid. Der fås den i overskriften nævnte forbindelse, smeltepunkt 230°C (sønderdeling), [a]^ = -45° i 50/o's eddikesyre.

Eksempel 2: H-Cjrs-Ser-Asn-Ieu-Ser-Thr-Cys-Val-Ieu-Gly-lys-leu-Ser= -Gln-Glu-leu-Hi s-lys-Leu-G-ln-Thr-Tyr-Pr o-Arg-Thr-Asn= -Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-MH2.hexaacetat.decahydrat 3,3 g beskyttet dotriacontapeptid.diacetat.trihydrat (eksempel 1) opløses under nitrogenatmosfære i 100 ml trifluoreddikesyre, og opløsningen henstår i 15 minutter ved 20°C, hvorpå den inddampes til tørhed. Remanensen opløses i 300 ml 0,2ST eddikesyre, behandles med 20 ml "Amberlite" IRA 410 (acetat), lyofiliseres, vaskes med di= ethylether og. tørres over kaliumhydroxid i højvakuum. Der fås den i overskriften nævnte forbindelse, smeltepunkt 220°C, sønderdeling, [a]·^ = -46° i 50^'s eddikesyre.

30 144563

Efter samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1 eller 2 frem= stilles de nedenstående forbindelser:

Eksempel 3: Piv-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Yal-Leu-Gly-Iiys(B0C)= -1eu-Ser-Gin-Glu(OTB)-leu-His-lys(BOC)-leu-Gin-Thr= -Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHg * &i= acetat.trihydrat

Udgangsprodukt: delsekvenser EE1 og ABCD

Fremgangsmåde ifølge eksempel 1 ?f)

Smeltepunkt 220°C (sønderdeling), [a]p = -45° i 50^’s eddikesyre.

Eksempel 4: Piv-Cys-Ser-Asn-Iieu-Ser-Thr-Cys-Yal-Iieu-Gly-I/ys-Leu= -Ser-Gln-Glu-Leu-His-lys-leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr= -Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-iJHg.hexaacetat. octahydrat

Udgangsprodukt: dotriacontapeptid ifølge eksempel 3.

Fremgangsmåde ifølge eksempel 2 pn

Smeltepunkt 216°0 (sønderdeling), [ocj-p = -49° i 50^’s eddikesyre.

Eksempel 5: EOC-Gys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-'Cys-Yal-Iieu-Grly-Iiys(BOC) = -leu-Ser-Gln-Glu(0TB)-leu-His-lys(BOG)-leu-Gln-Thr-Iyr= -Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-EH^. diacetat. tri= hydrat

Udgangsprodukt: delsekvenser EE2 og ABCD

Fremgangsmåde ifølge eksempel 1

Smeltepunkt 230°G (sønderdeling^ [= -45° i 50$'s eddikesyre.

Eksempel 6: EOC-Gys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Yal-Iieu-Gly-Lys-Iieu= -Ser-Gln-Glu-leu-His-Bys-leu-Gln-Thr-Tyr-Pr o-Arg-Thr= -Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-M^.hexaacetat. octahydrat

Udgangsprodukt: dotriacontapeptid ifølge eksempel 5

Fremgangsmåde ifølge eksempel 2

Smeltepunkt 240°C (sønderdeling), [a]-^ = -52° i 50$'s eddikesyre.

31 144563

Eksempel 7: MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr^Cys-Val-Leu-Gly-Lys(BOO)-Leu= -Ser-Gin-Glu(OTB)-Leu-Hi s-Lys(BOC)-Leu-Gin-Thr-Tyr= -Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-HHg.diacetat.tri= liydrat 1,05 g octapeptid-hydrazid (delsekvens EF3) opløses i en blanding af 50 ml dimetbylformamid og 1,2 ml dioxan/2N HC1 ved -20°C. Der tilsættes 0,116 ml tert.butylnitrit, omrøres i 10 minutter ved -20°C, tilsættes 1,4 ml triethylamin og 3,1 g trieosapeptid-diacetat (del= sekvens ABCD) og 5 ml vand og omrøres i 16 timer ved 0°0. Der ind= dampes til tørhed, og remanensen vaskes med diethylether, chloro= form og acetone. Det på denne måde vundne rå peptid opløses i 100 ml 0,3U eddikesyre, behandles med 20 ml "Amberlite" IRA 410 (acetat) og tilsættes 50 ml 0,6N ammoniumhydroxid. pH-Værdien indstilles på 6,5, og den resulterende opløsning sættes på en carboxymethylcellulose= søjle (10 x 100 cm), som er ækvilibreret med en 0,15N ammoniumacetat= pufferopløsning. Elueringen udføres med en stigende koncentrations-og pH-gradient (0,15U - 0,4U; pH-værdi 6,5 - pH-værdi 7,0) af en ammoniumaoetatpuffer. De forenede fraktioner, der indeholder det rene peptid, lyofiliseres 3 gange, og remanensen vaskes med ethanol og derefter med diethylether og tørres i højvakuum over kaliumhydroxid. Der fås den i overskriften nævnte forbindelse med smeltepunkt 230°C (sønderdeling), [oc]^ = -45° i 50%'s eddikesyre.

Eksempel 8; MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser= -Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn= -Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-HH2.hexaacetat.o ctahydrat

Udgangsprodukt: dotriacontapeptid ifølge eksempel 7 Fremgangsmåde ifølge eksempel 2

Smeltepunkt 220°C (sønderdeling), [oc]·^ = -60° i 50%’s eddikesyre.

Eksempel 9: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys(BOC)-Leu= -Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Iyr-Pro-Arg= -Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-M2.2 CH3C02H.3 H20 32 144563

Udgangsprodukt: delsekvenser EF og ABCD1 Fremgangsmåde ifølge eksempel 1

PO

Smeltepunkt 235°C (sønderdeling), [a]D = -46° i 50$'s eddikesyre.

Eksempel 10: H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Iieu-Ser= -Gln-Gln-Leu-His-lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn= -Thr-Gly-Ser-Gly-Ihr-Pro-UHg·6 σΗ500£Η.10 H£0

Udgangsprodukt: dotriacontapeptid ifølge eksempel 9 Fremgangsmåde ifølge eksempel 2

OA

Smeltepunkt 230°C (sønderdeling), [a:]^ = -48° i 50$'s eddikesyre.

Eksempel 11: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-lys(BOC)= -Iieu-Ser-Gln-Glu(OTB)-leu-His-lys (BOO)-Tyr-Gln-Thr-Iyr= -Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-EB^·2 CH^C0£H.= 3 H20

Udgangsprodukt: delsekvenser EF og ABC1D Fremgangsmåde ifølge eksempel 1

Smeltepunkt 230°C (sønderdeling), [cc]^0 = -45° i 50$’s eddikesyre.

Eksempel 12: H-Cys-Ser-Asn-leu-Ser~!Ehr-Cys-Yal-Leu-Gly-Iiys-Iieu= -Ser-Gln-Glu-Iieu~His-Iys-Iyr-Gln-Ihr-I1yr-Pro-Arg= -Thr-Asn-Ihr-Gly-Ser-Gly-Ihr-Pro-EHg·hexaacetat.deca= hydrat

Udgangsprodukt: dotriacontapeptid ifølge eksempel 11 Fremgangsmåde ifølge eksempel 2

pA

Smeltepunkt 216°C (sønderdeling), [a]^ = -43° i 50$'s eddikesyre.

Eksempel 13: BOC-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cys-Val-leu-Gly-Lys(BOC) = -leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys(BOC)-Tyr-Gin-Thr-Tyr-Pro= -Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-WHg·diacetat.tri= hydrat

Claims (1)

1. 33 144563 Udgangsprodukt: delsekvenser EF og ABC1D1 Fremgangsmåde ifølge eksempel 1 O C) Smeltepunkt 235°C (sønderdeling), [a]^ = -43° i IN eddikesyre/me= thanol (2:1). Eksempel 14: H-Cys-Ser-Asn-leu-Ser-Thr-Cjfs-Val-leu-Gly-lys-leu-Ser^ - Gln-Gln-Leu-Hi s-Lys-Tyr- Gin- Thr- Tyr-Pr o-Ar g- Thr- Asn= -Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHg.hexaacetat.decahydrat Udgangsprodukt: dotriacontapeptid ifølge eksempel 13 Fremgangsmåde ifølge eksempel 2 on Smeltepunkt 216°C (sønderdeling), [a]^ = -43° i IN eddikesyre. Patentkrav. Analogifremgangsmåde til fremstilling af do- eller tritriaconta= peptider eller -peptidderivater med den almene formel 23456789 10 S-CH2~CHX-C0-L-Ser-L-Asn-L-Leu-L-Ser-L-Thr-L-Cys-L-Val-L-Leu-Gly= 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 -L-Lys-L-Leu-L-Ser-L-Gln-L-Glu-L-Leu-L-His-L-Lys-L-Leu-L-Gln-L= 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 -Thr-L-Tyr-L-Pro-L-Arg-L-Thr-L-Asn-L-Thr-Gly-L-Ser-Gly-L-Thr-Y, hvor X betyder -H, -NHg, R-CO-NH-, hvor R betegner en 1 - 4 carbon= atomer indeholdende alkylgruppe eller en eventuelt med et halogen= atom, en 1 eller 2 carbonatomer indeholdende alkoxygruppe eller en nitrogruppe substitueret phenyl- eller benzylgruppe, eller X be= tyder R'-O-CO-NH-, hvor R' betegner en 1 - 4 carbonatomer indeholden= de alkylgruppe, en 2 - 4 carbonatomer indeholdende alkenylgruppe, en eventuelt med et halogenatom, en 1 eller 2 carbonatomer indeholden= de alkoxygruppe eller en nitrogruppe substitueret phenylgruppe eller en eventuelt med et halogenatom, en 1 eller 2 carbonatomer indehol= dende alkoxygruppe, en nitrogruppe, en phenylazo- eller en p-me= 34 144563 thoxyphenylazogruppe substitueret benzylgruppe, idet de sidstnævn= te to grupper sidder i parastillingen, og Y betegner l-Pro-NHg el= ler I-Pro-l-Val-HHgj og hvor L-Ser kan være ombyttet med L-Thr el= ler L-Ala, L-Asn kan være ombyttet med L-Asp, L-Gln eller L-Glu, L-Thr kan være ombyttet med L-Ser eller 1-Ala, L-Lys kan være om= byttet med lie-tert.butyloxycarbonyl-L-Lys, 1-Orn eller I-Arg, L-Gln kan være ombyttet med L-Glu, L-Asn eller L-Asp, L-Glu kan være om= byttet med tert.butyloxy-L-Glu, L-Gln, L-Asn eller L-Asp, L-leu kan være ombyttet med L-Tyr, L-Tyr kan være ombyttet med L-Phe, og L-Arg kan være ombyttet med L-Orn eller L-Lys, syreadditionssalte deraf eller zinkcomplexer deraf, kendetegnet ved, at man kondenserer p -mercaptopropion= syre eller L-cystein eller cysteinderivater med den almene formel HS-CH^-CHX’-COOH, hvor X* betegner R-CO-NH-, hvor R har den ovenfor anførte betydning, eller R’-O-CO-HH-, hvor R* har den ovenfor anførte betydning, L-Ser eller L-Thr eller L-Ala, L-Asn eller L-Asp eller L-Gln eller L-Glu, L-Leu eller L-Tyr, L-Ser eller L-Thr eller L-Ala, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Cys, L-Val, L-Leu eller L-Tyr, Gly, L-Lys eller IP -tert.butyloxycarbonyl-L-Lys eller L-Orn eller L-Arg, L-Leu eller L-Tyr, L-Ser eller L-Thr eller L-Ala, L-Gln eller L-Glu L-Asn eller L-Asp, L-Glu eller L-Asn eller L-Asp eller tert-butyl= oxy-L-Glu eller L-Gln, L-Leu eller L-Tyr, L-His, L-Lys eller Nf-tert.= -butyloxycarbonyl-L-Lys eller L-Orn eller L-Arg, L-Leu eller L-Tyr, L-Gln eller L-Glu eller L-Asn eller L-Asp, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Tyr eller L-Phe, L-Pra, L-Arg eller L-Orn eller L-Lys, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Asn eller L-Asp eller L-Gln eller L-Glu, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, Gly, L-Ser eller L-Thr eller •L-Ala, Gly, L-Thr eller L-Ser eller L-Ala, L-Pro og eventuelt L-Val i den angivne rækkefølge og/eller kondenserer peptidbrudstykker, som indeholder disse aminosyrer eller aminosyrederivater og eventuelt p-mercaptopropionsyre i den i den ovenfor viste formel angivne række= følge, hvorhos samtidig de øvrige tilstedeværende reaktive grupper beskyttes, og de ikke mere nødvendige beskyttelsesgrupper fraspaltes efter kon= - dehsationens afslutning, idet man på et vilkårligt tidspunkt i syn= tesen a) omdanner carboxylgruppen i den endestillede L-Pro- eller L-Pro= -L-Val-gruppe til en amidgruppe,