KR20060105757A - 브래디키닌 ｂ1 수용체의 길항제 - Google Patents

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콜린 브이. 게그
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토마스 스톨즈
유에리에 루
데린 씨. 다미코
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Abstract

본 발명은 감염인자로서 B1과 관련된 질병 또는 상태에 대한 치료법 또는 예방법으로 사용될 수 있는 특정한 생물학적으로 활성인 펩티드들 및 복합 펩티드들에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 생물학적으로 활성인 PEG-결합 펩티드들이 제공된다. 본 발명의 하나의 측면에서, 본 발명의 약제학적으로 활성인 PEG-결합 펩티드들은 감염이나 통증을 치료하는데 유용하다.

Description

브래디키닌 Ｂ1 수용체의 길항제{Antagonists of the Bradykinin B1 Receptor}
본 출원은 2003년 10월 22일자로 출원된 미국 가출원 제60/513,913호 및 2004년 1월 24일자로 출원된 미국 가출원 제60/538,929호의 이익을 주장하며, 이들은 본원에 참고문헌으로 통합되어 있다.
발명의 배경
미국내에서만 200만명 이상의 사람들은 언제부터인가 만성 통증에 무기력해져 있다(T. M. Jessell & D. D. Kelly, Pain and Analgesia in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, third edition (E. R. Kandel, J. H. Schwartz, T. M. Jessell, ed., (1991)).
불행하게도, 현재 통증을 위한 치료는 부분적으로만 효과적이며, 또한, 많은 치료법들이 생활-방식 변화, 쇠약, 및/또는 위험한 부작용을 일으킨다. 예를 들면, 아스피린, 이부프로펜 및 인도메타신과 같은 비-스테로이드 항-염증성 의약들("NSAIDs")은 염증성 통증에 대하여 적당히 효과적이나, 이들은 또한 신장 중독을 일으키고, 높은 용량은 위장자극, 궤양, 출혈, 심혈관 위험 증가, 및 정신착란을 일으키는 경향이 있다. 마취제로 치료받은 환자들은 종종 정신착란 및 변비를 경험하고, 장기간의 마취제의 사용은 내성 및 의존성과 관련된다. 리도카인 및 미셀리틴과 같은 국부 마취제들은 통증을 억제함과 동시에 정상적인 감각의 손실을 일으킨다. 게다가, 국부 마취제가 전신적으로 사용될 경우에는 심혈관에 대한 역효과와 관련된다. 이와 같이, 만성 통증에 대한 치료의 요구는 지금도 계속되고 있다.
통증은, 신경계에 의해 외부로부터 수용되고, 전달되어, 인지되는 신호에 기반을 둔 지각작용이다(리뷰를 위해, Millan, M.J., The induction of pain: an integrative review. Prog Neurobiol 57:1-164 (1999) 참고). 열 및 접촉과 같은 해로운 자극은 피부내의 특별한 감각 수용체로 하여금 중추 신경계("CNS")로 신호를 전달하게 한다. 상기 과정은 통각이라 칭하고, 그것을 매개하는 말초 감각 신경은 침해수용체(nociceptor)이다. 침해수용체(들)로부터의 신호의 세기와 CNS에 의한 상기 신호의 제거 및 동화에 따라, 사람은 통증인 해로운 자극을 경험할 수도 있고 하지 않을 수도 있다. 통증의 지각이 자극의 강도에 적합하게 대응할 때, 통증은 그것이 의도하는 보호 기능을 나타낸다. 그러나 조직 손상의 어떤 타입은 사람의 통증 한계치를 낮추기 때문에 해가 없는 통증이 강한 통증인 것처럼 지각되는 통각 과민증 또는 프로-침해수용(pronociception)으로 알려져 있는 현상을 야기시킨다. 염증 및 신경 손상은 모두 통각 과민증을 유도할 수 있다. 따라서, 햇볕화상(sunburn), 골관절염, 대장염, 심장염, 피부염, 근염, 신경염, 염증성 장질환, 교원 혈관성 질환(류머티즘성 관절염 및 루푸스를 포함함)과 같은 염증으로 고생하는 사람들은 종종 강화된 지각 통증을 경험한다. 이와 유사하게, 외상, 수술, 절 단, 농양, 작열통, 교원 혈관성 질환, 탈수초성 질환, 3차 신경 신경통, 암, 만성 알코올 중독, 뇌졸증, 시상통증증후군, 당뇨, 헤르페스 감염, 후천성면역결핍증("AIDS"), 독성물질 및 화학요법은 엄청난 고통을 초래하는 신경 손상들을 야기시킨다.
정상 및 알레르기성 조건하에서 외부 신호를 변환시키는 침해수용체에 의한 메카니즘이 보다 잘 이해되게 되었기 때문에, 통각 과민증과 연관된 과정들은 통증 한계치를 낮추는 것을 억제하고, 이로써 느껴지는 통증이 감소되도록 조절될 수 있다.
브래디키닌(BK) 및 이와 연관된 펩티드인 칼리딘(Lys-BK)(표 3 참고)은 심혈관 및 신장 시스템에 관한 키닌의 생리적 활성을 조절한다. 그러나, 활성 펩티드인 BK 및 칼리딘은 플라즈마 및 그 밖의 생체액내의 펩티다제 및 다양한 세포(cell)로부터 방출된 펩티다제에 의해 빠르게 분해되어서, 플라즈마내의 BK의 반감기는 약 17초인 것으로 보고되어 있다(1). BK 및 칼리딘은 des-Arg BK 또는 des-Arg 칼리딘을 생성하기 위해 카르복시말단의 아르기닌 잔기를 제거하는 카르복시펩티다제 N에 의해 생체내에서 빠르게 물질대사된다. des-Arg-칼리딘은 생체내의 주된 키닌중에 하나이며, 키닌의 병리학적 활성을 매개한다. 게다가 매우 강력한 전염증성(proinflammatory) 펩티드인 des-Arg-BK 또는 des-Arg-칼리딘은 혈관확장, 관다발 침투성 및 기관지수축을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다(리뷰를 위해, Regoli and Barabe, Pharmacology of Bradykinin and Related Kinins, Pharmacological Reviews, 32(1):1-46 (1980) 참고). 또한, des-Arg-BK 및 des-Arg-칼리딘은 염증 및 염증성 통증의 유지에 밀접한 관련이 있을 뿐만 아니라 매우 중요한 염증 및 염증성 통증의 매개체인 것으로 여겨진다. 또한, 폐혈증 쇼크, 관절염, 급성 통증 및 편두통과 같은, 통증이 주요 특징인 상태들에 있어서 des-Arg-칼라딘의 과잉생산을 포함하는 중요한 생체의 징후가 있다.
키닌의 다면 발현성 활성을 매개하는 멤브레인 수용체는 B1 및 B2라 명명된 두개의 다른 종류가 있다. 두 종류의 수용체는 사람을 포함한 다양한 종으로부터 복제되고 서열화되어 왔다(Menke, et al, Expression cloning of a human b1 Bradykinin receptor. J. Biol. Chem. 269:21583-21586 (1994); Hess et al, Cloning and pharmacological characterization of a human Bradykinin (BK-2) receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 184, 260-268 (1992)). 그것들은 7개의 추정 멤브레인 스패닝 영역을 갖는 수용체가 커플링된 일반적인 G 단백질이다. 다양한 조직에서, BK 수용체는 알려진 모든 2차 전달체에 커플링된다. BK에 대해 보다 높은 친화성을 갖는 B2 수용체는 브래디키닌 수용체의 가장 주된 형태인 것으로 여겨진다. 본질적으로 브래디키닌에 대한 모든 정상적 생리반응 및 대부분의 병리학적 반응들은 B2 수용체에 의해 매개된다.
다른 한편으로, B1 수용체는 BK와 비교되는 des-Arg-BK(표 3 참고)에 대해 보다 높은 친화성을 갖는 반면에, B2 수용체에서 des-Arg-BK는 비활성이다. 게다가, B1 수용체는 대부분의 조직에서 정상적으로는 발현되지 않는다. 그것들의 발현은 만성 염증 또는 전신성 상해의 어떤 종류에서 뿐만 아니라 상처 또는 조직 손상으로 인해 야기된다(Marceau, F., 등, Kinin B1 receptors: a review. Immunpharmacology, 30:1-26 (1995)). 더욱이 B1 수용체에 의해 매개된 반응들은 토끼, 쥐 및 돼지(Marceau 등, (1998))에서 박테리아 리포다당류(LPS) 또는 염증성 사이토킨의 투여에 따라 제로 레벨로부터 상향-조정된다.
B1 수용체의 유도발현과 연관된 키닌의 통증-유도 특성은, 정상 조직내에서 최소 활성으로 손상된 조직에서 특이적으로 유도될 수 있는 항염증제, 항자극제, 항알레르기제 및 진통제의 개발에 있어서 B1 수용체를 흥미있는 타겟으로 만든다. B1 수용체를 타겟으로 하는 다양한 종류의 펩티드 길항제가 확인된 반면에, 치료 진통제로서의 그것들의 개발은 조직 및 혈청 펩티다아제에 의한 매우 빠른 분해에 기인한 효율 낮은 반감기 및 그로 인한 신장으로부터의 제거(clearance)에 의해 방해받고 있다. 더욱 최근에는, 합성 아미노산 치환기를 갖는 펩티드 유사체는 시험관내에서의 안정성 분석에서 펩티다아제에 대해 저항성이 있는 것을 보여준다(리뷰를 위해, Regoli et al, receptors and their antagonists. European Journal of Pharmacology, 348:1-10 (1998); Stewart, J.M., et al, Bradykinin antagonists: present progress and future prospects. Immunopharmacology, 43:155-161 (1999); and Stewart, J.M., 등, Metabolism-Resistant Bradykinin Antagonists: Development and Applications. Biol. Chem., 382:37-41 (2001) 참고).
폴리에틸렌글리콜(PEG)과 단백질의 공유결합은 생체내에서 치료 단백질의 순환 반감기를 상당히 연장시키기 위한 접근법으로 널리 인식되어 왔다. PEG 결합(PEGylation: PEG화)은, PEG 부분이 단백질에 상당한 유체운동적 반경을 추가하기때문에, 주로 신장으로부터의 제거를 지연시키므로써 이러한 목적을 이룬 다(Zalipsky, S., 등, Use of functionalized poly ( ethylene glycol )s for modification of polypeptides ., in Poly ( ethylene glycol ) chemistry : Biotechnical and biomedical applications ., J.M. Harris, Editor. (1992), Plenum Press: New York. p. 347-370.). 단백질의 PEG 결합에 의해 부여되는 부가적인 이익은 용해도의 증가, 단백질가수분해에 대한 저항성, 및 치료 폴리펩티드의 감소된 면역원성을 포함한다. 단백질 PEG 결합의 이점은, 임상실험에 사용되는 많은 PEG-결합 단백질뿐만 아니라 PEG-아데노신 디아미나아제(AdagenTM/Enzon Corp.), PEG-L-아스파라기나아제(OncasparTM/Enzon Corp.), PEG-인터페론 α-2b(PEG-인트론TM/Schering/Enzon), PEG-인터페론 α-2a (PEGASYSTM/Roche) 및 PEG-G-CSF (NeulastaTM/Amgen)를 포함하는 여러 PEG 결합 단백질의 상업화에 의해 입증된다. 다른 한편으로, 작은 사이즈의 치료 펩티드의 PEG 결합은 상당한 도전의 기회를 제공하고, 폭넓게 응용되지는 않는다. 펩티드 PEG 결합에 대한 가장 큰 장해중의 하나는 최종 결합체에서 생리적 활성의 유지가 필수적으로 요구된다는 점이다. 종종 활성을 위해 요구되는 최소의 서열을 포함하는 치료 펩티드는 매우 작기때문에, 이들 펩티드는 치환에 대해 허용적이지 않다. PEG 부분은 펩티드 자체보다 불균형적으로 커서, 활성을 위해 요구되는 특이적 펩티드와 수용체간의 결합 상호작용이 입체적으로 방해를 받는 경향이 있다. 따라서, 유용한 치료제가 되기 위한 충분한 특이적 활성을 여전히 유지하면서, PEG 결합을 허용하는 펩티드의 성능은 상당히 예 상하기 힘들고 경험상으로 결정되어야만 한다(Morpurogo, 등, Selective Alkylation and Acylation of α and ε Amino Groups with PEG in a Somatostatin Analogue: Tailored Chemistry for Optimized Bioconjugates. Bioconjugate Chem. 13:1238-1243 (2002)).
명백하게, 염증 및 통증을 위한 새롭고, 안전하며 효과적인 치료제에 대한 요구가 있다. 순환 라이프(지연된 제거), 용해도, 안정성을 향상시키고, 그리고/또는 분자의 면역원성을 감소시키므로써, 치료하는 동안에 조직의 노출을 보다 더 허용할 수 있는 B1 특이적 펩티드 길항제를 갖는 것은 유리할 것이다. 증가된 순환 라이프는 식이요법의 투여횟수의 감소 및 투여 스케쥴의 감소를 초래하고, 이는 의사 및 환자에게 더 편리할 것이고, 특히 자가-투여를 하는 환자들에게 도움이 될 것이다. 투여횟수 감소의 이점은 환자에게 투여되는 약의 양이 감소하는 것 및 증가된 적응성을 포함한다.
본 발명의 요약
따라서, 본 발명은 염증, 통증, 및 천식 및 알레르기성 비염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 그 밖의 B1 매개된 상태들을 치료 또는 예방하는데에 치료적으로 유용할 정도로 충분히 B1 수용체 활성에 대해 길항적이면서 공지의 펩티드 B1 길항제와 비교하여 생체내에서 현저하게 뛰어난 약물 동력학적 특성을 갖는 B1 수용체의 새로운 결합제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 의해 이러한 결합제는 B1 수용체의 새로운 펩티드 길항제 및 결합된 펩티드 길항제의 형태로 제공된다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 새로운 B1 수용체 펩티드 길항제는 서열번호 15~54중의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 몇 가지 구체예에 따르면, 유전적으로 암호화된 20개의 L-아미노산 또는 입체이성체 D-아미노산의 어느 것으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상, 및 바람직하게는 1~9개의 아미노산 잔기는 서열번호 15~54로 표시되는 펩티드 서열의 한쪽 말단 또는 양말단에 커플링될 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한 치료적으로 사용될 수 있을 정도로 충분히 B1 수용체와 결합하여 B1 수용체의 활성에 길항적이면서, 공지의 펩티드 B1 길항제와 비교하여 생체내에서 현저하게 우수한 약물 동력학적 특성을 갖는 결합된 펩티드를 제공한다.
본 발명의 하나의 측면은 화학식 I의 결합 펩티드(conjugated peptide)를 포함한다:
F-[(X1)-(Y1)n] I
여기에서,
F는 X1 또는 Y1에 공유결합된 비히클이다(바람직하게 F는 PEG 부분 또는 그것의 유도체이다);
X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
L1 및 L2는 각각 독립하여 링커(linkers)들이고;
n은 0~3이고; 그리고
P1 및 P2는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다. 바람직하게는, P1 및 P2는 서열번호 5~26, 43~60중의 하나로 표시되는 아미노산 서열 및 그것의 유도체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 결합 펩티드가 분산된 부형제 캐리어 물질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 부형제 및 적어도 하나의 본 발명의 펩티드 및/또는 결합 펩티드를 포함하는 약제학적으로 유효량의 조성물을 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 펩티드 및/또는 결합 펩티드는 B1 활성에 의해 매개된 질병의 치료를 위해 치료적 가치가 있고, 상기 질병으로는 염증성 및 신경병리학적 원인에 의한 염증 및 만성 통증 상태, 폐혈증 쇼크, 관절염, 골관절염, 안기나, 천식, 알레르기 비염 및 편두통이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 펩티드 및/또는 결합 펩티드는 적당한 약제학적 캐리어 물질과 함께 제제화되어, 인간(또는 다른 포유류)과 같은 환자에게 유효량을 투여하므로써 치료 목적 또는 예방 목적을 위해 사용되어질 수 있다.
본 명세서에서 개시된 펩티드 및/또는 비히클-결합(vehicle-conjugated) 펩티드의 아미노산 서열의 보존적 변형에 의해 추가의 유용한 펩티드 및/또는 결합 펩티드를 얻을 수 있다. 보존적 변형은 그러한 변형의 기원이 되는 펩티드 및/또는 결합 펩티드와 유사한 기능적, 물리적 및 화학적 특성을 갖는 펩티드 및/또는 결합 펩티드를 생성할 것이다. 여기에 개시된 펩티드 및/또는 결합 펩티드의 이러한 보존적 변형 형태는, 또한 본 발명의 구체예로서 고려된다.
본 발명의 다른 측면은, 다음의 단계를 포함하는, 본 명세서에 개시된 결합 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
하기 화학식을 갖는 화합물을,
(X1)-(Y1)n
(여기에서,
X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
L1 및 L2는 각각 독립하여 링커들이고;
n은 0~3이고; 그리고
P1 및 P2는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다)
비히클(F)와 반응시켜, 화학식 F-[(X1)], F-[(X1)]-F, F-[(X1)-(Y1)n], F-(X1)-(Y1)n, 또는 F-(X1)-(Y1)n-F의 결합 펩티드를 생성한다. 바람직하게, F는 PEG 부분 또는 그의 유도체이다. 더욱 바람직하게는, P1 및 P2는 각각 독립하여 서열번호 5~60으로 표시되는 펩티드 서열의 적어도 하나를 포함하는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다. 더욱 바람직하게는, X1은 서열번호 27~41로 표시되는 펩티드이다. 본 발명의 추가의 측면 및 이점은 다음의 본 발명의 상세한 설명을 고려하면 분명해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 일반적으로 치환에 대해 상당히 비-허용적인 것으로 여겨지던 펩티드의 어느 종류가 같은 종류의 공지된 펩티드와 비교하여 극적으로 지속된 효능 프로파일을 갖는 치료적으로 유용한 펩티드 및/또는 펩티드 결합체(conjugate)를 제공하기 위해 N-말단에서 아미노산으로 치환되고, 그리고/또는 N-말단에서 여러가지 비히클이 결합될 수 있으며, 이로 인해 그들은 염증 및 통증을 조절하는데 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 근거한 것이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 및/또는 펩티드 결합체는 공지된 B1 펩티드 길항제에 비해 상당히 치료적 이점을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명자들은 치료적 용도에 관한 공지의 B1 펩티드 길항제의 상기한 단점들은 N-말단에서 아미노산을 치환하고, 그리고/또는 생체내에서 유효 반감기를 연장시키면서 길항제 활성 및 특이성의 보존을 극대화시키는 일정 크기와 조성을 갖는 펩티드 링커 또는 비펩티드 링커를 사용하여, 제한되지는 않으나, PEG 분자와 같은 비히클에 펩티드 길항제를 결합시키므로써 극복될 수 있다는 것을 밝혀 내었다. 부가적으로(또는 선택적으로), 시험관내에서 거대 PEG 폴리머에 결합된 B1 펩티드 길항제의 활성이 다소 감소되었음에도 불구하고, 보다 작은 PEG 폴리머에 결합된 펩티드 결합체와 비교할때, 거대 PEG-결합체의 연장된 순환 반감기는 생체내에서 현저히 긴 노출시간과 장기간 지속되는 효과를 제공한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명자들은 B1 수용체의 펩티드 길항제에 부착된 PEG 분자의 크기가 생체내에서의 고유의 길항제 활성 및 유효 반감기를 최적화하는 중요한 변수라는 것을 발견하였다. 예를 들면, 아세틸화 펩티드 B1 길항제는 생체내 통증 모델에서 복수회 투여후에 최대 4시간의 효능을 나타내었다. 놀랍게도, 여기에서 개시된 방법으로 5kD 및 20kD의 PEG 분자에 결합된 동일한 펩티드는, 알약 하나를 투입후에, 각각 최대 2일 동안 및 적어도 4일 동안 효능을 나타내었다.
본 발명의 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 및 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드 길항제 및 그것의 제조방법 및 사용 방법을 개시하기 전에, 본 발명에 의해 고려된 펩티드 및/또는 결합 펩티드 길항제 및 방법들은 다소 변경될 수 있기 때문에 본 발명은 개시된 특정의 펩티드 및/또는 결합 펩티드 길항제에 제한되는 것은 아니라는 것을 이해하여야만 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 여기에 사용된 용어는 특정의 구체예들만을 개시하기 위한 목적을 위한 것이며, 제한의 의도로 사용된 것은 아니다.
여기에 개시된 목적을 위하여 여기에 개시된 방법에 따라 비히클에 결합될 것으로 고려되는 브래디키닌 B1 수용체 펩티드는, 다음의 간행물 중의 하나에 개시된 어떤 펩티드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌, 당분야에 공지된 B1 결합 펩티드 길항제 뿐만 아니라 여기에 개시된 새로운 B1 결합 펩티드 길항제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: Regoli 등, Bradykinin receptors and their antagonists. Eur. J. of Pharma., 348:1-10 (1998); Neugebauer, W., 등, Kinin B1 receptor antagonists with multi-enzymatic resistance properties. Can. J. Physiol. Pharmacol., 80:287-292 (2002); Stewart, J.M., et al, Bradykinin antagonists: present progress and future prospects. Immunopharmacology, 43:155-161 (1999); Stewart, J.M., 등, Metabolism-Resistant Bradykinin Antagonists: Development and Applications. Biol. Chem., 382:37-41 (2001); PCT Publication WO 98/07746; and U.S. Patent Nos: 4,693,993, 4,801,613, 4,923,963, 5,648,336, 5,834,431, 5,849,863, 5,935,932, 5,648,333, 5,385,889, 5,444,048, 및 5,541,286.
본 명세서에 사용된 용어들은 특별한 경우에 제한되지 않는 한 다음과 같이 정의된다.
천연 아미노산 잔기는 세가지 방식으로 논의된다: 아미노산의 완전 명칭, 표준 3-문자 코드 또는 하기에 나타낸 표에 따른 표준 1-문자 코드.
Figure 112006035208390-PCT00001
하기에서 명확하게 지정하지 않는 한, 여기에서 천연 또는 비-천연 아미노산의 명칭은 아미노산의 D- 및 L-이성질체를 포함하는 것이다. 여기에서 비-천연 아미노산을 위해 사용된 약어는 본원에 참고문헌으로 통합되어 있는 미국특허 제5,834,431호, PCT 공보 WO 98/07746, 및 Neugebauer 등(2002)에서 개시된 바와 같다. 추가적으로, 약어인 "Dab" 및 "D-Dab"는 각각 비-천연 아미노산인 D-2-아미노부티르산의 L- 및 D-이성질체를 의미한다. 약어인 "3'PaI"및 "D-3'PaI"는 각각 비-천연 아미노산인 3'-피리딜알라닌의 L- 및 D- 이성질체를 의미한다. 또한, 약어 "Igl"는 "Igla" 및 "Iglb"(각각 α-(1-인다닐)글리신 및 a-(2-인다닐)글리신)를 포함하는 것이다. 이와 유사하게, "DIgl"은 "D-Igla" 및 "D-Iglb"(각각 α-(1-인다닐)글리신 및 α-(2-인다닐)글리신의 D-이성질체)를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 여기에서 사용된 Igl은 Iglb이고, D-Igl은 D-Iglb이다.
"비히클-결합 펩티드" 또는 "결합 펩티드"는 생활성을 가지며, 포유류에게 투여했을때 치료효과를 제공하는 화합물을 의미한다. 이는 (1) 적어도 하나의 B1 펩티드 길항제, 및 (2) 펩티드 자체의 잔기에 공유결합되거나, 또는 펩티드 잔기에 공유결합된 펩티드 링커 또는 비-펩티드 링커(방향족 링커를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)에 공유결합된, 하기에 나타낸 바와 같은 적어도 하나의 비히클을 포함한다.
"PEG-결합 펩티드" 또는 "PEG화(PEGylated) 펩티드"는 생활성을 갖고, 포유류에 투여시 치료적 효과를 제공하는 2성분 화합물을 의미한다. 상기 2 성분은 (1) 적어도 하나의 B1 펩티드 길항제, 및 (2) 펩티드 자체의 잔기에 공유결합되거나, 또는 펩티드 잔기에 공유결합된 펩티드 링커 또는 비-펩티드 링커(방향족 링커들을 포함하나, 이에 제한되지는 않음)에 공유결합된, 하기에 나타낸 바와 같은, 적어도 하나의 PEG 부분(moiety)을 포함한다.
"폴리에틸렌글리콜" 또는 "PEG"는 커플링제를 갖거나 갖지 않거나 또는 커플링 부분 또는 활성화 부분(예를 들면, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지르딘, 옥시란, 오르토피리딜디설피드, 비닐술폰, 요오도아세트아미드 또는 말레이미드 부분)으로 유도체화 된 폴리알킬렌글리콜 화합물 또는 그것의 유도체를 의미한다.
PEG는 상업적으로 입수 가능하거나 또는 당분야에서 공지된 방법에 따라 에틸렌글리콜을 개환 중합시켜서 제조할 수 있는 수용성 폴리머로 잘 알려져 있다(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161). 본 명세서에서 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG의 말단에서의 변형에 관계없이, 단작용성- 부터 다작용성까지의 형태로, 어느 폴리에틸렌글리콜 분자든지 모두 포함하는 의미로 사용되며, 다음의 화학식으로 나타낼 수 있다:
X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH Ⅱ
여기에서, n은 20~2300 및 X는 H 또는 말단 변형기, 예를 들면, C1 -4 알킬이다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용된 PEG는 히드록시 또는 메톡시를 한쪽 말단으로 하고, 예를 들면, X는 H 또는 CH3("메톡시 PEG")이다. X=CH3일 경우, PEG의 다른 한쪽 말단은, 말단이 OH인 화학식 Ⅱ에서 나타낸 바와 같이, 에테르 산소 결합을 통해 활성화 부분에 공유결합된다. X=H일 경우, PEG의 양쪽 말단은 에테르 결합을 통하여 활성화 부분에 결합되어, 선형 비스-작용기성 PEGs를 형성한다. 화학구조에서 사용될 경우, 용어 "PEG"는, 히드록실기의 수소가 없이, 에테르 결합을 형성하기 위해 링커의 유리 탄소원자와 반응할 수 있는 산소가 남겨진 상기 화학식 Ⅱ를 포함한다. 더욱 상세하게는, 펩티드에 PEG를 결합하기 위해, PEG는 "활성화된" 형태로 있어야 한다. 활성화된 PEG는 화학식 Ⅲ으로 나타낼 수 있다:
(PEG)-(A) Ⅲ
여기에서, PEG(상기에서 정의된)는 에테르 결합을 형성하기 위해 활성화 부분(A)의 탄소 원자에 공유결합되고, (A)는 펩티드의 아미노산 잔기상에 아미노, 이미노, 또는 티올기와 반응할 수 있는 반응성기 또는 펩티드에 공유결합된 링커 부분을 포함한다.
활성화된 PEG를 제조하기 위한 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 미국특허번호 제5,643,575호, 제5,919,455호, 제5,932,462호 및 PCT 공보 WO 95/06058 참고(각각은 그 내용 전체가 참고문헌으로 본원에 통합되어 있다). 적합한 활성화된 PEG는 수 많은 종래 반응들에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, Buckmann과 Merr, Makromol. Chem., 182:1379-1384 (1981)에 따라 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)를 N-히드록시숙신이미드(NHS)와 반응시킴으로써, PEG-모노에틸에테르(Union Carbide로부터 상업적으로 입수 가능)로부터 PEG의 N-히드록시숙신이미드에스테르(M-NHS-PEG)가 제조될 수 있다. PEG-알데히드와 같은 다른 활성화된 PEG는 상업적 공급원, 예를 들면, Nektar Therapeutics(Huntsville, Al) 또는 Enzon, Inc. (Piscataway, N.J.)으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 바람직한 활성화된 PEG의 예들은 Nektar Therapeutics(Huntsville, Al)로부터 상업적으로 입수가능한 PEG-프로피온알데히드 및 PEG-부티르알데히드이다. PEG-프로피온알데히드는 화학식 PEG-CH2CH2CHO로 나타내어지고, 본원에 참고문헌으로 통합된 미국특허번호 제5,252,714호에 기재되어 있다. 또한, 이작용성의 PEG-알데히드는 이량체 결합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 바람직한 아민 반응성 PEG는; Nektar Therapeutics(Huntsville, Al), Enzon, Inc.(Piscataway, N.J.), 또는 NOF Corporation(Tokyo, Japan)으로부터 다양한 분자량으로 입수가능한 메톡시-PEG 숙신이미딜프로피오네이트(mPEG-SPA) 및 메톡시-PEG 숙신이미도부타노에이트(mPEG-SBA), mPEG-벤조트리아졸카르보네이트 또는 mPEG-p-니트로페닐카르보네이트를 포함한다. 또한, 바람직한 활성화된 PEG 부분들은 티올 반응성 작용기를 포함하고, 하기에 나타낸 화학식 PEG-CH2CH2SO2-CH=CH2로 표시되는 PEG 비닐술폰, mPEG-요오도아세테이트 및 mPEG-티오에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
Figure 112006035208390-PCT00002
본 발명의 PEG-결합 펩티드를 생성하기 위한 다른 바람직한 활성화된 PEG는 PEG-말레이미드이다. 말레이미도 모노메톡시 PEG와 같은 화합물은 특히 본 발명의 PEG-결합 펩티드를 생성하는데에 유용하다.
본 발명의 PEG-결합 펩티드를 생성하기 위한 더욱 바람직한 활성화된 PEG는 한 개 이상의 활성화된 잔기를 갖는 다원자가의 PEG이다. 바람직한 다원자가의 PEG 부분은 하기에 나타낸 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure 112006035208390-PCT00003
예를 들어, 약 1,000~100,000Da(n은 20~2300이다)의 어떤 분자량의 PEG도 실제적으로 바람직하게 사용될 수 있다. PEG에서 반복단위수인 "n"은 돌턴으로 표시되는 분자량과 유사하다. 활성 링커에 결합된 PEG의 총 분자량은 약제학적 용도에 적합한 것이 바람직하다. 따라서, PEG의 총 분자량은 100,000Da을 초과해서는 안된다.
바람직하게는, 본 발명의 PEG-결합 펩티드에서 사용된 PEG의 전체 또는 총 분자량은 약 3,000~60,000Da이고(총 n은 70~1,400이다), 더욱 바람직하게는 약 8,800~36,000Da(총 n은 약 200~약 820이다)이다. 가장 바람직하게는, PEG의 총 분자량은 약 20,000~24,000Da이다(총 n은 약 450~약 540이다).
폴리프로필렌글리콜과 같은 다른 폴리알킬렌글리콜 화합물이 본 발명에서 사용될 수 있다. 다른 적당한 폴리알킬렌글리콜 화합물은 다음과 같은 종류의 하전된 또는 중성의 폴리머들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 덱스트란, 콜로민산 또는 다른 카보하이드레이트계 폴리머, 아미노산의 폴리머, 및 비오틴 유도체들.
용어 "포함"은 펩티드 또는 결합 펩티드가 주어진 서열의 N- 또는 C- 말단 또는 양말단에 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 추가의 분자 성분을 포함할 수 있음을 의미한다. 물론, 이들 추가된 분자 성분들은 펩티드 또는 결합 펩티드의 활성에 중대한 방해가 되어서는 안된다.
여기에서 사용된 바와 같은, 용어 "천연 펩티드"는 여기에서 개시되었거나 또는 당분야에서 공지된 비결합 B1 펩티드 길항제를 나타낸다.
용어 "유도체화" 및 "유도체" 또는 "유도체화된"은 각각 그러한 과정 및 결과의 펩티드 또는 결합 펩티드를 포함하며, 유도체에 있어서 (1) 펩티드 또는 결합 펩티드는 시클릭 부분을 갖는다; 예를 들면, 결합 펩티드내의 시스테닐 잔기들 사이의 가교결합; (2) 펩티드 또는 결합 펩티드는 가교결합되거나, 또는 가교결합 부위를 갖는다; 예를 들면, 펩티드 또는 결합 펩티드는 시스테닐 잔기를 가지고 있으므로 배양 또는 생체내에서 가교결합된 이량체를 형성한다; (3) -NH2 말단기를 갖는 결합 펩티드의 N-말단은 -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, 숙신이미드기, 또는 치환 또는 비치환 벤질옥시카르보닐-NH-로 치환되고, 여기에서 R 및 R1 및 고리 치환기는 이하에서 정의된 바와 같다; (5) C-말단은 -C(O)R2 또는 -NR3R4로 치환되고, 여기에서 R2, R3 및 R4는 이하에서 정의된 바와 같다; 및 (6) 결합 펩티드내의 각각의 아미노산 부분은 선택된 곁사슬 또는 말단 잔기와 반응 가능한 시약으로 처리하여 변형된다. 유도체에 대하여는 이하에 더 설명된다.
용어 "B1"은 브래디키닌 B1 수용체를 의미한다(Judith M Hall, A review of BK receptors. Pharmac. Ther. 56:131-190 (1992) 참고). 특별히 지정하지 않는한, B1 또는 브래디키닌 B1 수용체는 인간 브래디키닌 B1 수용체(hB1)를 의미한다. 바람직하게는, hB1은 야생형 수용체이다. 더욱 바람직하게는, hB1은 GenBank Accession no. AJ238044로 개시된 브래디키닌 수용체이다.
여기에서 일반적으로 사용된 용어 "펩티드"는 4~40개의 아미노산, 바람직하게는 10~20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 15~18개의 아미노산으로 된 분자를 의미한다. 여기에서 사용된 용어 "디-펩티드"는 두개의 아미노산으로 된 분자를 의미한다. 여기에서 사용된 용어 "트리-펩티드"는 세개의 아미노산으로 된 분자를 의미한다.
또한, 단백질-단백질 상호작용의 구조적 분석은 거대 단백질 리간드의 결합활성과 유사한 활성을 나타내는 펩티드를 의미하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분석에서, 결정 구조는 유사 펩티드가 디자인될 수 있는 단백질 리간드의 중요한 잔기의 동일성 및 상대적 배열을 나타낼 수 있다. 예를 들면, Takasaki 등, Nature Biotech., Volume 15, 1266-1270페이지 (1997) 참고. 또한, 이러한 분석방법은 수용체 단백질과 본 발명의 펩티드, 비히클-결합 펩티드, 또는 PEG-결합 펩티드 사이의 상호작용을 연구하는데 사용되어질 수 있으며, 이는 결합 친화력을 증가시키기 위하여 펩티드 또는 펩티드 결합체의 추가의 변형을 제안할 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같은, 펩티드, 비히클-결합 펩티드 또는 PEG-결합 펩티드 B1 길항제와 연관되어 사용되는 용어 "유효량" 및 "치료 유효량"은 바람직한 결과를 생성하기 위한(즉, 본 발명의 펩티드, 비히클-결합 펩티드, 및/또는 PEG-결합 펩티드 B1 길항제로 치료하기 위한) 충분한 양 또는 투여량을 의미한다. 본 발명의 설명에서, 바람직한 결과는 염증 및/또는 통증이 바람직하게 감소하는 것이고, 예를 들면, B1의 하나 이상의 생물학적 활성의 수준의 관찰가능한 감소를 일으키는 것이다. 더욱 상세하게는, 치료 유효량은 문제되는 상태, 예를 들면, 약제로 생체내 처리된 환자에서의 염증 또는 통증과 관련된 하나 이상의 임상적으로 정의된 병리학적 과정들을 어느 기간 동안 억제하기에 충분한 펩티드 및/또는 결합 펩티드의 양이다. 유효량은 선택된 특이적 펩티드 및/또는 결합 펩티드 B1 길항제에 따라 다양할 수 있고, 또한 치료될 환자와 관련된 다양한 요소들과 상태들 및 기능장애의 심각도에 따라 다르다. 예를 들면, 펩티드 및/또는 결합 펩티드 B1 길항제가 생체내에 투여되면, 예비 임상적 동물 실험에서 얻어진 투여량 반응 곡선 및 독성 데이터 뿐만 아니라 환자의 나이, 몸무게 및 건강과 같은 요소들도 고려되어질 것이다. 약제가 생체내에서 세포와 접촉된다면, 흡수, 반감기, 투여량, 독성 등과 같은 파라미터를 평가하기 위한 예비 임상적 시험관내 연구를 다양하게 설계할 수 있다. 주어진 시약에 대한 유효량 또는 치료 유효량의 결정은 당업자의 능력내에서 가능하다.
용어 "약물학적 활성"은 해당물질이 의학적 파라미터 또는 질병 상태(예를 들면, 통증)에 영향을 미치는 활성을 가지는 것으로 결정된 것을 의미한다. 본 발명의 설명에서, 상기 용어는 통상적으로 B1-유도된 또는 B1-매개된 질병 또는 비정상적인 의학적 상태 또는 장애에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 염증 또는 통증의 길항작용에 관한 것이다.
용어 "길항제", "억제제" 및 "역작용제"(예를 들어, Rianne A. F. de Ligt, 등, British Journal of Pharmacology 2000, 130, 131 참고)는 관련 단백질의 생물학적 활성을 차단, 방해, 감소, 완화 또는 여러가지 방법으로 간섭하는 분자를 의미한다. 본 발명의 바람직한 "길항제" 또는 "억제제"는 B1 활성의 시험관내 분석에서 500nM 이하의 IC50에서 B1에 결합하여 B1을 억제하는 분자이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 "길항제" 또는 "억제제"는 B1 활성의 시험관내 분석에서 100nM 이하의 IC50에서 B1에 결합하여 B1을 억제하는 분자이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 "길항제" 또는 "억제제"는 B1 활성의 시험관내 분석에서 50nM 이하의 IC50에서 B1에 결합하여 B1을 억제하고, 통증에 대한 일반적으로 인정되는 적어도 하나의 생체내 동물모델에서 측정되는 통증을 예방, 완화 또는 해소시키며, 그리고/또는 부종, 염증 또는 통증에 대한 생체내 동물모델에서 생화학적 공격을 억제하는 분자이다.
또한, 본 발명의 펩티드 또는 결합 펩티드의 생리학적으로 허용가능한 염도 본 발명에 포함된다. 본원에서 교환가능하게 사용된 용어 "생리학적으로 허용가능한 염" 및 "약제학적으로 허용가능한 염"은 약제학적으로 허용가능한(즉, 온혈동물의 치료에 유용한) 것으로 공지된 또는 추후에 밝혀질 모든 염을 포함한다. 몇가지 특정한 예들은, 아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 염산염 및 브롬화수소산염과 같은 히드로할라이드; 설페이트; 시트레이트; 타르트레이트; 글리콜레이트; 옥살레이트; 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 말산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 시트르산, 젖산, 푸마르산, 숙신산, 말레산, 살리실산, 벤조산, 페닐아세트산, 만델산 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 무기산 염 및 유기산 염들이다.
본 발명의 화합물이 카르복실기와 같은 산성 작용기를 포함하는 경우, 상기 카르복실기에 대해 약제학적으로 허용가능한 적당한 양이온쌍은 당업자에게 공지되어 있고, 알칼리 양이온, 알칼리 토류 양이온, 암모늄 양이온, 4차 암모늄 양이온 등을 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 염"의 추가의 예들을 위해 하기의 내용 및 Berge 등, J. Pharm. Sci. 66:1 (1977) 참고.
일반적으로 "보호기(protecting groups)"는 카르복시, 아미노, 히드록시, 멜캅토 등과 같은 선택된 반응성기가 친핵성, 친전자성 산화, 환원 등과 같은 원치 않는 반응을 일으키지 않도록 막기 위해서 사용되는, 당분야에서 공지된 기를 의미한다. 바람직한 보호기는, 적절한 경우, 본 명세서에서 지정된다. 아미노 보호기의 예들은 아랄킬, 치환 아랄킬, 시클로알케닐알킬 및 치환 시클로알케닐알킬, 알릴, 치환 알릴, 아실, 알콕시카르보닐, 아랄콕시카르보닐, 실릴 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아랄킬의 예들은 할로겐, 알킬, 알콕시, 히드록시, 니트로, 아실아미노, 아실 등에 의해, 선택적으로 치환될 수 있는 벤질, 오르토-메틸벤질, 트리틸 및 벤즈하이드릴 및 포스포늄 및 암모늄 염과 같은 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아릴기의 예들은 페닐, 나프틸, 인다닐, 안트라세닐, 9-(9-페닐플루오레닐), 페난트레닐, 두레닐 등을 포함한다. 시클로알케닐알킬 또는 치환 시클로알킬레닐알킬 라디칼의 예들은 바람직하게는 6~10개의 탄소원자를 가지고, 시클로헥세닐메틸 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 아실, 알콕시카르보닐 및 아랄콕시카르보닐기는 벤질록시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 이소-부톡시카르보닐, 벤조일, 치환 벤조일, 부티릴, 아세틸, 트리-플루오로아세틸, 트리-클로로아세틸, 프탈로일 등을 포함한다. 보호기들의 혼합물이 아랄킬기 및 아랄콕시카르보닐기 모두에 의해 보호될 수 있는 1차 아미노기와 같은, 동일한 아미노기를 보호하는데 사용될 수 있다. 또한, 아미노 보호기는 이들이 부착되는 질소를 갖는 헤테로시클릭고리, 예를 들면, 1,2-비스(메틸렌)벤젠, 프탈이미딜, 숙신이미딜, 말레이미딜 등을 형성할 수 있고, 이러한 헤테로시클릭기는 인접한 아릴 및 시클로알킬 고리를 더 포함할 수 있다. 또한, 헤테로시클릭기는, 니트로프탈이미딜과 같은, 모노-, 디- 또는 트리-치환된 것일 수 있다. 아미노기는 염산염, 톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 등과 같은 부가염의 형성을 통해, 산화반응과 같은 원치않는 반응에 대하여 보호될 수 있다. 많은 아미노 보호기는 또한 카르복시기, 히드록시기 및 멜캅토기를 보호하는데 적합하다. 예를 들면, 아랄킬기가 있다. 또한 터셔리-부틸과 같은 알킬기는 히드록시기 및 멜캅토기를 보호하는데 적합하다.
실릴 보호기는 하나 이상의 알킬, 아릴 및 아랄킬기에 의해 선택적으로 치환된 실리콘원자들이다. 적합한 실릴 보호기는 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, 트리-이소프로필실릴, 터셔리-부틸디메틸실릴, 디메틸페닐실릴, 1,2-비스(디메틸실릴)벤젠, 1,2-비스(디메틸실릴)에탄 및 디페닐메틸실릴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아미노기의 실릴화 반응은 모노- 또는 디-실릴아미노기를 제공한다. 아미노알코올 화합물의 실릴화 반응은 N,N,O-트리-실릴 유도체를 생성할 수 있다. 실릴에테르기로부터 실릴기의 제거는, 개별 반응 단계로서 또는 알코올기와 반응하는 동안에 인-시튜(in-situ)로, 예를 들면, 금속수산화물 또는 암모늄플루오라이드 시약으로 처리하므로써 쉽게 수행되어진다. 적합한 실릴화제로는, 예를 들면, 트리메틸실릴클로라이드, 터셔리-부틸-디메틸실릴클로라이드, 페닐디메틸실릴클로라이드, 디페닐메틸실릴클로라이드, 또는 이미다졸 또는 DMF와의 이들의 조합 생성물이다. 아민의 실릴화를 위한 방법 및 실릴 보호기의 제거는 당업자들에게 공지되어 있다. 또한, 상응하는 아미노산, 아미노산 아미드 또는 아미노산 에스테르로부터 이들 아민 유도체를 제조하기 위한 방법은 아미노산/아미노산 에스테르 또는 아미노알코올 화학을 포함하는 유기화학의 당업자들에게 공지되어 있다.
보호기는 분자의 나머지 부분에 영향을 미치지 않는 조건하에서 제거된다. 이러한 방법은 당분야에서 공지되어 있으며, 가수분해, 수소첨가분해 등을 포함한다. 바람직한 방법은, 알코올, 아세트산 등 또는 그들의 혼합물과 같은 적합한 용매 시스템에서 탄소상 팔라듐을 사용한 수소첨가분해에 의한 벤질옥시카르보닐기의 제거와 같은, 보호기의 제거를 포함한다. t-부톡시-카르보닐 보호기는 다이옥산 또는 염화메틸렌과 같은 적절한 용매 시스템에서 염산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 무기산 또는 유기산을 사용하여 제거될 수 있다. 결과의 아미노염은 쉽게 중화되어 유리 아민을 생성할 수 있다. 메틸, 에틸, 벤질, 터셔리-부틸, 4-메톡시페닐메틸 등과 같은 카르복시 보호기는 당업자들에게 공지되어 있는 가수분해 및 수소첨가분해 조건하에서 제거될 수 있다.
본 발명의 화합물들은, 다음의 예들로 예시된 시클릭 아미딘 및 비시클릭 아미딘기 및 구아니딘기, 및 헤테로원자 치환 헤테로아릴기(Y' = O, S, NR) 등과 같은 토토머 형태(tautomeric form)로 존재할 수 있는 기들을 포함할 수 있고:
Figure 112006035208390-PCT00004
비록 하나의 형태가 명명되고, 설명되고, 표시되고 그리고/또는 청구될지라도, 모든 토토머 형태는 본질적으로 그러한 명명, 설명, 표시 및/또는 청구내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 화합물의 프로드러그(prodrugs) 또한 본 발명에 의해 고려된다. 프로드러그는 환자에게 프로드러그가 투여된 후에 가수분해, 물질대사 등과 같은 생체내 생리학적 작용을 통하여 본 발명의 화합물로 화학적으로 변형되는 활성 또는 비활성 화합물이다. 프로드러그를 제조하고 사용하는 것과 관련 있는 적응성 및 기술은 당업자들에게 공지되어 있다. 에스테르를 포함하는 프로드러그에 관한 일반적 논의를 위해 Svensson and Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) 및 Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier(1985)를 참고. 은폐된(masked) 카르복실레이트 음이온의 예들은 알킬(예를 들면, 메틸, 에틸), 시클로알킬(예를 들면, 시클로헥실), 아랄킬(예를 들면, 벤질, p-메톡시벤질), 및 알킬카르보닐옥시알킬(예를 들면, 피발로일옥시메틸)과 같은 다양한 에스테르를 포함한다. 아민은 생체내 에스테라제에 의해 분해되어 유리(free) 드러그 및 포름알데히드를 방출하는 아릴카르보닐옥시메틸 치환 유도체로 은폐된다(Bundgaard J. Med. Chem. 2503 (1989)). 또한 이미다졸, 이미드, 인돌 등과 같은 산성 NH기를 포함하는 드러그는 N-아실옥시메틸기로 은폐된다(Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)). 히드록시기는 에스테르 및 에테르로 은폐된다. EP 039,051(Sloan과 Little, 4/11/81)은 만니히 염기 히드록사민산 프로드러그, 그들의 제조 및 사용을 개시한다.
결합 펩티드들의 구조
일반적 사항 . 본 발명의 비히클-결합 펩티드는 다음의 화학식에 의해 표시될 수 있다:
F-[(X1)-(Y1)n] (IV)
여기에서:
X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
F는 X1 or Y1에 공유결합된 비히클이고;
L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
n은 0~3이고; 그리고
P1 및 P2(존재할 경우)는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다.
화학식 Ⅳ의 비히클-결합 펩티드는, P1 및 P2(존재할 경우)가 각각 독립하여 서열번호 5~60중의 하나로 표시되는 펩티드 서열 및 그것의 유도체를 갖는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제인 바람직한 구체예들을 포함할 것이다.
본 발명의 비히클-결합 펩티드의 더욱 바람직한 구체예들은, P1 및 P2(존재할 경우)가 하기 화학식에 의해 정의되는 화학식 Ⅳ의 비히클-결합 펩티드들을 포함할 것이다:
NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
여기에서,
a0는 염기성 또는 중성의 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산, 염기성 곁사슬을 갖는 하나 또는 두개의 잔기를 포함하는 디-펩티드 또는 트리-펩티드이거나 또는 존재하지 않고;
a1, a2, a3 및 a4는 각각 독립하여 염기성 또는 중성의 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고;
a6는 Ser이고;
a5, a7, 및 a8은 각각 독립하여 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고, 다만 적어도 하나의 a5, a7, 및 a8은 D- 또는 L- 서열의 Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga 및 Nigb로부터 선택되고; 그리고
a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
더욱 바람직하게는, P1 및 P2(존재할 경우)는 다음의 화학식으로 정의된다:
NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
여기에서,
a0는 염기성 아미노산, 염기성 곁사슬을 갖는 하나 또는 두개의 잔기를 포함하는 디-펩티드이고;
a1은 염기성 아미노산이고;
a2는 Pro이고;
a3는 Hyp이고;
a4는 Gly이고;
a5 및 a8은 인다닐 아미노산이고;
a6는 Ser이고;
a7는 D-인다닐 아미노산이고;
a8는 Cpg이고; 그리고
a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
보다 바람직하게는, P1 및 P2(존재할 경우)는 다음의 화학식으로 정의된다:
NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
여기에서,
a0는 염기성 아미노산, 하나 또는 두개의 염기성 곁사슬을 포함하는 디-펩티드이거나 또는 존재하지 않고;
a1은 염기성 아미노산이고;
a2은 Pro이고;
a3는 Hyp이고;
a4는 Gly이고;
a5는 Cpg이고;
a6는 Ser이고;
a7는 DTic이고;
a8은 Cpg이고; 그리고
a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 비히클-결합 펩티드는, n=0이고, X1은 서열번호 27~41로 표시되는 펩티드 및 그들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드인 화학식 Ⅳ의 비히클-결합 펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명은, 브래디키닌 B1 수용체들(B1)에 결합하여 그것의 활성에 길항작용을 하며, 비결합 펩티드 B1 길항제와 비교하여 생체내에서 극히 우수한 약물 동력학적 특성을 갖는 PEG-결합 펩티드를 제공한다. 본 발명의 PEG-결합 펩티드들은 다음의 화학식(V)에 의해 표시될 수 있다:
F-[(X1)-(Y1)n] V
여기에서,
X1 및 Y1 는 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
F는 X1 또는 Y1에 공유결합된 PEG 부분이고;
L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
n은 0~3이고; 그리고
P1 및 P2(존재할 경우)는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다.
화학식 V의 PEG-결합 펩티드는, P1 및 P2(존재할 경우)가 각각 독립하여 서열번호 5~60의 하나로 표시되는 펩티드 서열 및 그것의 유도체들을 갖는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들인 바람직한 구체예들을 포함할 것이다.
PEG-결합 펩티드들의 추가의 바람직한 구체예들은 P1 및 P2(존재할 경우)가 다음의 화학식에 의해 정의되는 화학식 V의 PEG-결합체를 포함할 것이다:
NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
여기에서,
a0는 염기성 또는 중성의 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산, 염기성 디-펩티드 또는 트리-펩티드이거나 또는 존재하지 않고;
a1, a2, a3 및 a4는 각각 독립하여 염기성 또는 중성의 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고;
a6는 Ser이고;
a5, a7, 및 a8은 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고, 다만 적어도 하나의 a5, a7, 및 a8은 D- 또는 L- 서열의 Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga 및 Nigb로부터 선택되고; 그리고
a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
더욱 바람직하게는, P1 및 P2(존재할 경우)는 다음의 화학식으로 정의된다:
NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
여기에서,
a0는 염기성 아미노산, 염기성 디-펩티드이거나 또는 존재하지 않고;
a1은 염기성 아미노산이고;
a2은 Pro이고;
a3는 Hyp이고;
a4는 Gly이고;
a5 및 a8은 인다닐 아미노산이고;
a6는 Ser이고;
a7은 D-인다닐 아미노산이고;
a8은 Cpg이고; 그리고
a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
보다 바람직하게는, P1 및 P2(존재할 경우)는 다음의 화학식으로 정의된다:
NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
여기에서,
a0는 염기성 아미노산, 염기성 디-펩티드이거나 또는 존재하지 않고;
a1은 염기성 아미노산이고;
a2은 Pro이고;
a3는 Hyp이고;
a4는 Gly이고;
a5는 Cpg이고;
a6는 Ser이고;
a7는 DTic이고;
a8은 Cpg이고; 그리고
a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
본 발명의 보다 더욱 바람직한 PEG-결합 펩티드는, n=0이고, X1은 서열번호 27~41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드들 및 그들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드인 화학식 V의 PEG-결합 펩티드를 포함한다. 본 발명의 보다 더욱 바람직한 PEG-결합 펩티드는, n=0이고, X1은 서열번호 27~41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드들 및 그들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드인 것을 포함한다.
보다 더욱 바람직하게, 본 발명의 PEG-결합 펩티드는 다음의 화학식 또는 그것들의 생리학적으로 허용가능한 염으로 표시될 수 있다:
F'-Rz ,VI
여기에서,
F'는 다원자가 비히클이고;
R은 각각 독립하여 -(X1)-(Y1)n이고, 여기에서 R은 F'에 공유결합되고;
X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
n은 0~3이고;
Z은 2~8이고; 그리고
P1 및 P2는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다.
본 발명의 더욱 바람직한 PEG-결합 펩티드는, n이 0이고, Z는 4~8이고, X1은 서열번호 27~41로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드들 및 그들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드인 화학식 Ⅵ의 PEG-결합 펩티드를 포함한다.
또한, 상기에서 정의된 P1 및 P2(존재할 경우)의 단편(즉, "서브 서열), 유사체, 및 유도체인 펩티드 서열을 갖는 펩티드 결합체들도 본 발명의 일부이고, 그러한 결합 펩티드는 본원에서 특정적으로 개시된 펩티드 결합체와 시험관내 및/또는 생체내에서의 항-B1 활성이 실질적으로 같다.
용어 "유사체"는 펩티드들, 결합-펩티드들(비결합 P1 및 P2(존재할 경우)), 및/또는 각각 화학식(Ⅳ) 및 (V)에 의해 제공된 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드들의 펩티드 링커(L)의 아미노산들의 선형 서열로부터 유도된 하나 이상의 아미노산의 치환, 결 및/또는 부가를 나타내는 평균분자를 의미하고, 이는 본원에서 특정적으로 개시된 동종의 비결합 펩티드 또는 결합 펩티드와 비교했을 때 시험관내 및/또는 생체내에서의 항-B1 활성이 실질적으로 동일한 분자를 초래한다.
본 발명에 따른 결합 펩티드 유사체들은 전형적으로 (P)(P1 및/또는 P2(존재할 경우)) 또는 (L)(L1 및/또는 L2(존재할 경우))의 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 보존적 아미노산의 변화는 폴리펩티드의 구조 및/또는 기능을 방해하지 않을 것이고, 통상적으로 하나의 아미노산을 구조 및/또는 기능이 유사한 다른 아미노산(예를 들면, 크기, 전하 및/또는 형태가 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산)으로 치환한 것을 포함한다는 것이 일반적으로 인식되어 있다. 이러한 치환체들의 성질은 당업자들에게 공지되어 있고, 예시적인 아미노산 치환체들은 표 1 및 2에 요약되어 있다.
표 1 아미노산 치환체들
Figure 112006035208390-PCT00005
표 2 아미노산 치환체들
Figure 112006035208390-PCT00006
새로운 시스테인이 유리된 티올로서 유지된, A, F, H, I, L, M, P, V, W 또는 Y에서 C로의 변화가 더욱 바람직하다.
바람직 아미노산 치환(보존적 또는 비보존적)은 그러한 치환이 필요할 때에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 치환은 펩티드 서열의 중요한 잔기들을 일치시키기 위하여, 또는 본원에서 개시된 비결합 및/또는 결합 펩티드 분자의 친화성을 증가 또는 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서는, 보존적 아미노산 치환들은 또한 화학적 펩티드 합성에 의해 일반적으로 통합된 비-천연 유래의 아미노산 잔기를 포함하기도 한다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 천연으로 존재하는 잔기들은 서열의 변형에 유용할 수 있는 공통적인 곁사슬 특성을 근거로 하여 분류될 수 있다. 예를 들면, 비-보존적 치환은 어느 종류에 속하는 하나의 멤버를 다른 종류의 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 치환된 잔기들은 비-인간 상동단백질(ortholog)에 상동성인 펩티드의 영역내로, 또는 분자의 비-상동성 영역내로 도입될 수 있다. 또한, 체인 배열에 영향을 주도록 하기 위해 P 또는 G를 사용하여 변형을 만들 수 있다.
이러한 변형을 주는데 있어서, 아미노산의 수치료법 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각 아미노산은 그들의 소수성 및 전하 특성을 근거로 하여 수치료법 지수가 지정되어졌고, 이것들은, 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5)이다.
단백질에 대한 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 아미노산의 수치료법 지수의 중요성은 당분야에 공지되어 있다. Kyte 등, J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982) 참고. 어떤 아미노산은 유사한 수치료법 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 유사한 생물학적 활성을 여전히 유지할 수 있다는 것은 알려져 있다. 수치료법 지수를 기초로하여 변화를 주는데에 있어서, 수치료법 지수들이 ±2 이내인 아미노산들의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 더욱 바람직하며, ±0.5 이내인 것이 특히 바람직하다.
유사 아미노산들의 치환이 소수성을 기초로 하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것은 당분야에 또한 공지되어 있다. 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 최대 국부적 평균 친수성은 단백질의 면역성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 관계가 있다.
다음의 친수성값들이 아미노산 잔기들에 지정되어 있다:
아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성값을 근거로 하여 변화를 주는데 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 더욱 바람직하며, ±0.5 이내인 것이 특히 바람직하다. 또한, 친수성을 근거로 하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프(epitope)를 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"으로도 언급된다.
당업자는 공지된 기술을 이용하여 본 명세서에 개시된 비결합 및/또는 결합 펩티드들의 적절한 유사체를 결정할 수 있을 것이다. 활성을 유지하면서(보존 아미노산 잔기 치환) 천연 펩티드내에 존재하는 잔기들에 대해 유사한 아미노산들을 화학적으로 치환할 수 있다는 것을 당업자는 또한 알고 있을 것이다. 따라서, 생물학적 활성 또는 구조에 대하여 중요할 수 있는 영역 조차도 생물학적 활성이 파괴되지 않거나, 또는 비결합 펩티드 또는 결합 펩티드 구조에 불리하게 작용하지 않는 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
또한, 당업자는 활성 또는 구조에 있어서 중요한, 비결합 및/또는 결합 펩티드 서열내의 잔기를 확인하는 구조-기능 연구들을 검토할 수 있다. 그러한 비교를 고려하여, 당업자는 펩티드 서열에서 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는, 본 발명의 비결합 및/또는 결합 펩티드의 예측되는 중요한 아미노산 잔기들에 대해서 화학적으로 유사한 아미노산 치환체로 치환하는 것을 선택할 수 있다.
여러 과학 간행물들은 2차 구조를 예측하는데 노력해 왔다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou 등, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou 등, Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou 등, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou 등, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 및 Chou 등, Biophys. J., 26:367-384 (1979) 참고. 또한, 최근에는 2차 구조를 예상하는데 컴퓨터 프로그램을 사용할 수 있다.
2차 구조를 예측하는데 사용하는 다른 방법들은 "스레딩(threading)" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl 등, Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "프로파일 분석"(Bowie 등, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov 등, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov 등, Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-8 (1987)), 및 "evolutionary linkage"(Home, 상게서, 및 Brenner, 상게서 참고).
본 발명에 따른 펩티드 및/또는 결합 펩티드 유사체 및 유도체는, 특히 여기에서 개시된 유사 펩티드 및/또는 결합 펩티드와 같은 목적(즉, 시험관내 및/또는 생체내에서의 B1 활성의 길항제)을 위해서 유용할 것이다.
펩티드. 본 발명의 펩티드는 서열번호 15~35 및 39~54로 표시되는 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 본 발명의 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드내의 펩티드 서열 P1 및 P2(P)(존재할 경우)는, 상기에서 언급한 바와 같이, B1에 결합하여, B1의 활성에 길항 작용을 하는 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드는 서열번호 5~60 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 펩티드 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드는 서열번호 27~41 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 펩티드 서열을 포함한다.
표 3 브래디키닌 펩티드
Figure 112006035208390-PCT00007
비히클 . 여기에서 사용된 용어 "비히클"은 분해를 방지하고, 그리고/또는 반감기를 연장하거나, 독성을 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 또는 치료 펩티드 또는 단백질의 생물학적 활성을 증가시키는 분자를 의미한다. 본 발명에서 유용한 비히클들은 당분야에서 공지되어 있고(예를 들면, PCT 공보 WO 98/07746 참고, 이는 본원에 전체가 참고문헌으로 통합되어 있음), 모두 당업자들이 쉽게 입수할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 비히클은 폴리메틸에틸렌글리콜, 폴리히드록시프로필렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 및 옥사이드, 폴리메틸프로필렌글리콜, 폴리히드록시프로필렌옥사이드, 직쇄 및 분지쇄 폴리프로필렌글리콜 및 그의 유도체, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리프로필렌글리콜 및 모노메틸에테르, 모노세틸에테르, 모노-n-부틸에테르, 모노-t-부틸에테르 및 그의 모노올레일에테르, 폴리알킬렌글리콜의 카르복실산에스테르 및 폴리알킬렌글리콜과 아민의 탈수축합반응 생성물, 다른 폴리알킬렌옥사이드 및 글리콜 및 그들의 유도체, 폴리(비닐피롤리돈), 폴리비닐알코올, 폴리(비닐아세테이트), 폴리(비닐아세테이트-코-비닐알코올)공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈, 폴리(비닐메틸옥사졸리돈), 및 폴리(비닐메틸에테르), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리(아크릴아미드), 및 폴리(메타크릴아미드) 및 그것들의 다른 아미드, 폴리(N,N-디메틸아크릴아미드), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(N-아세트아미도아크릴아미드) 및 폴리(N-아세트아미도메타크릴아미드), 및 다른 아미드의 N-치환 유도체들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한 측면은 비-펩티드 링커 부분 또는 펩티드 B1 길항제에 공유결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기에 결합된 적어도 하나의 비히클(F)의 존재를 요구한다. 본 발명에서, 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 바람직한 비히클은 PEG분자로 구성된다. 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 더욱 바람직한 비히클은 다원자가의 PEG 분자로 구성된다.
본 명세서에서 특정적으로 개시되거나 또는 언급된 비히클- 또는 PEG-결합 분자는, B1의 길항작용이 실질적으로 유지되는 한, 본 발명에 따른 유사체를 형성하기 위해 (X1)-(Y1)n(상기에서 정의된 바와 같음)로 표시된 영역내에서 약간 변형될 수 있다.
본 발명의 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드와 그의 유사체는, (P)영역에서 세개 이하의 비-말단 잔기가 다른 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 의해 고려된 유사체는 본 발명의 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드의 (P)영역의 특정의 비-말단 부위에서 둘 이하의 아미노산의 치환, 삽입, 또는 결실이 이루어진 분자를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드와 그것의 유사체간의, 특히 특정 (P)영역에 있어서의 서열 차이는 하나 이상의 "보존적 변형"의 형태이다.
링커들. 여기에서 사용된 용어 "링커"는, 화학식 Ⅳ 또는 V(상기함)에서 표시된 바와 같이, L1 및 L2 (존재할 경우)를 의미하고, (L)로 약칭된다. 바람직하게는, (L)은 천연 펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산들로 이루어짐)이고, 1~9개의 아미노산으로 이루어진다. 더욱 바람직하게는, (L)은 1~9개의 아미노산으로 이루어지고, 여기에서 아미노산은 천연적으로 존재하는 20개의 아미노산으로부터 선택된다. 보다 더욱 바람직한 구체예에서는, 펩티드 링커의 1~9개의 아미노산은 시스테인, 글리신, 알라닌, 프롤린, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된다. 보다 더욱 바람직하게, 펩티드 링커는 펩티드 결합으로 연결된 글리신 및 알라닌과 같은 입체적으로 방해받지 않은 복수의 아미노산으로 구성된다. 따라서, 바람직한 펩티드 링커들은 폴리(Gly-Ala)2-4 및 폴리(Ala)1 -8뿐만 아니라 폴리(Gly)1-8, 특히 (Gly)3(서열번호 100), (Gly)5(서열번호 101) 및 (Gly)7(서열번호 102)이다. 펩티드 링커의 다른 특정한 예들은 (Gly)5Lys(서열번호 103) 및 (Gly)5LysArg(서열번호 104)이다. Gly과 Ala의 다른 조합 또한 바람직하다. 상기 명명법을 설명하기 위하여, 예를 들면, (Gly)5Lys는 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys를 의미한다. 펩티드 링커는 비히클과 함께 결합하기 위한 N-말단 시스테인, 다른 티올, 또는 친핵체를 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 링커는 작용성 비히클인 말레이미드, 요오도아세트아미드 또는 티오에스테르와 결합하기 위한 N-말단 시스테인 또는 호모시스테인 잔기, 또는 다른 2-아미노-에탄티올 또는 3-아미노프로판티올 부분을 포함한다. 말레이미드로 활성화된 PEG와 펩티드의 반응에 의해 생성된 초기의 3-설파닐숙신이미드 부가 생성물(1c)을 과량의 염기로 처리하므로써, 덜 안정한 숙신이미드 부가생성물을 가수분해에 대해 안정한 6-메틸카르바모일-5-옥소-티오몰포린-3-카르복스아미드 형태(1d, 반응도 1)로 전환시킨다. 또는, 상업적으로 입수가능한 티오에스테르 또는 요오도아세트아미도 PEG(Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)는, 반응도 2 및 반응도 3에서 나타낸 바와 같이, 화학선택적 결합에 사용될 수 있다.
반응도 1
Figure 112006035208390-PCT00008
반응도 2
Figure 112006035208390-PCT00009
반응도 3
Figure 112006035208390-PCT00010
다른 바람직한 링커는, 대략 1k PEG 분자의 크기로 측정된 랜덤 Gly/Ser/Thr 서열(GSGSATGGSGSTASSGSGSATH; 서열번호 105)을 포함하는 유연하고 큰 링커이다. 또한, 펩티드 링커는, 화학식 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-(단단한 링커: -AEAAAKEAAAKEAAAKAGG-)의 6개의 탄소로 이루어진 지방족 분자와 같은 비-펩티드 절편을 포함할 수 있다.
또는, 반응성 친핵체를 포함하는 비-펩티드 링커가 X1 및 Y1(존재할 경우)내에 존재할 수 있다. 예를 들면, -NH-(CH2)s-C(O)-와 같은 알킬 링커들, 여기에서 s = 2~20일 수 있다. 이러한 알킬 링커들은 저급 알킬(예를 들면, C1-C6), 저급 아실, 할로겐(예를 들면, Cl, Br), CN, NH2, 페닐 등과 같은 모든 비-입체적으로 방해된 기에 의해 더 치환될 수 있다. 예시적인 비-펩티드 링커들은 PEG 링커들이다(하기에 나타냄):
Figure 112006035208390-PCT00011
여기에서, n은 링커들의 분자량이 100~500킬로돌턴(kD), 바람직하게는 100~500kD이 되게 하는 수이며, m은 1~3이다. 바람직하게는, 비-펩티드 링커는 방향족이다. 링커들은 여기에서 개시된 것과 같은 방법으로 유도체를 형성하기 위해 변형될 수 있다.
또한, PEG 부분들은 PEG 알데히드를 이용하는 환원적 알킬화 반응 또는 PEG의 히드록시숙신이미도 또는 카보네이트에스테르를 이용하는 아실화 반응에 의해 N-말단 아민 또는 선택된 곁사슬 아민에 결합될 수 있다. 상기에 개시된 링커들은 상기 방법에서 사용될 수 있다. 또는, 적합하게 작용화된 PEG는, 서열번호 5~26 또는 서열번호 43~60으로 표시되는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제 또는 서열번호 5~26 또는 43~60으로 표시되는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제에 공유결합된 펩티드 링커의 아미노산 잔기에 직접 결합될 수 있다.
비히클 및/또는 타겟(target) 펩티드는 다원자가일 수 있으므로, 본 발명의 공정은 다양한 비히클:펩티드 구조를 생성할 수 있다. 일례로서, 1가 비히클 및 1가 펩티드는 1:1 결합체를 생성할 것이고; 2가 펩티드 및 1가 비히클은 2개의 비히클 부분을 가지는 결합체를 형성할 수 있는 반면에 2가 비히클 및 1가 펩티드는 두개의 펩티드 부분이 하나의 비히클 부분에 연결된 종류를 생성할 수 있고; 높은 원자가의 비히클의 사용은 1개의 비히클 부분에 결합된 펩티드 군(cluster)을 형성할 수 있는 반면에 높은 원자가의 펩티드는 다수의 비히클 부분으로 덮여질 수 있다. 펩티드 부분은 활성화된 비히클과 반응할 하나 이상의 반응성 기를 가질 수 있고, 복합구조체가 형성될 가능성을 항상 고려하여야 하고; 비히클 및 펩티드의 1:1 부가생성물과 같은 간단한 구조를 형성하거나, 또는 펩티드:비히클:펩티드 부가생성물을 형성하기 위해 2가 비히클을 사용하기를 원할 경우, 활성화된 비히클 및 펩티드 물질의 미리 결정된 비율 및 그들의 미리 결정된 농도를 사용하여, 일정 비율의 개시된 생성물을 형성하기 위하여 미리 결정된 조건들(기간, 온도, pH 등)하에서 반응을 수행하고, 그런 다음 다른 반응 생성물로부터 개시된 생성물을 분리하는 것이 유리할 것이다. 반응 조건들인 시약의 비율 및 농도는 필요에 따라 적당하게 비율을 조정하여 당업자들의 능력내에서 비교적 간단한 시행착오 실험에 의해 얻을 수 있다. 상기 생성물의 정제 및 분리는 당분야에서 당업자들에게 공지되어 있는 종래의 기술과 유사하게 이루어진다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문장에서 명확하게 지시하지 않는 한, 단수 형태는 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "비히클-결합 펩티드 길항제" 또는 "PEG-결합 펩티드 길항제"는 이러한 결합체 혼합물을 포함하고, "치료 방법"은 당분야에서 당업자들에게 공지되어 있거나 본 명세서 등을 통해 알게 될 형태의 하나 이상의 치료 방법을 포함한다.
시스테인 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 및 폴리펩티드의 티올기와 PEG-말레이미드의 결합을 통해 이루어진 통상의 PEG 결합은 유기 용매를 사용하거나 또는 사용하지 않고서 인산염 완충용액에서 수행되어진다. PEG 결합된 펩티드 및 폴리펩티드의 높은 용해도 및 물중에서의 피롤리딘-2,5-디온 고리의 잠재적 불안정성은 PEG 결합된 펩티드 및 단백질을 대용량으로 생산하고, 정제하는 본 방법을 적용할 때 방해가 된다. 그러므로, 본 발명자들은, 시스테인 잔기를 갖는 펩티드 및 폴리펩티드의 티올기와 mPEG-말레이미드를 결합시키기 위해 새로운 비수용성 조건을 개시한다. 새로운 공정은 PEG 결합된 펩티드 및 폴리펩티드의 높은 수율을 조절하고, 마이클 추가 반응 및 가아민분해반응이 함께 일어나게 하는(one-pot) 결과(반응도 4)를 나타낸다. 두 조건들에 의해, 침전을 통해 PEG 결합된 펩티드 및 폴리펩티드가 직접 분리되는 결과가 얻어진다.
반응도 4
Figure 112006035208390-PCT00012
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 메탄올(MeOH)은 하나 이상의 다음의 용매들을 포함하는 용매로 대체될 수 있다: 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, n-프로판올, n-부탄올, 디클로로메탄(DCM), 아세토니트릴(AcN), 테트라히드로퓨란(THF), 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMAc), 및 N-메틸피롤리돈(NMP).
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, TBME는 하나 이상의 다음의 용매들을 포함하는 용매로 대체될 수 있다: 디에틸에테르, 메틸이소프로필에테르, 및 디이소프로필에테르.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 반응도 4에서 도시된 반응 1)은 약 20~약 60℃의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 반응 1)은 약 30~약 50℃의 온도에서 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 반응 1)은 약 35~약 45℃의 온도에서 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 반응 1)은 실온에서 수행될 수 있다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 반응도 4에서 도시된 반응 2)는 약 20~약 60℃의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 반응 2)는 약 30~약 50℃의 온도에서 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 반응 2)는 약 35~약 45℃의 온도에서 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 반응 2)는 실온에서 수행될 수 있다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 반응도 4에서 도시된 침전반응은 적어도 10분 동안 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 침전반응은 적어도 60분 동안 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응도 4에서 도시된 침전반응은 약 60분 동안 수행되어 진다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 침전, 여과, 및/또는 정제 반응은 한번 이상 수행될 수 있다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 4에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 침전 및/또는 정제 반응은 한번 이상 수행될 수 있다.
부분적으로 보호된 펩티드들은 이것들이 폴리작용성(polyfunctional) 펩티드의 특정 위치에서의 선택적인 변형이 가능하도록 하는 방법을 위해 특히 유용한 시약들이다. 펩티드 합성분야의 당업자들에게 공지된, 확립된 탈보호 방법을 사용하여 PEG 결합체로부터 보호기를 제거한다. 본 출원을 위해 적합한 부분적으로 보호된 펩티드는 펩티드 합성분야의 당업자들에게 공지된 직교 보호 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 브래디키닌 B1 수용체의 부분적으로 보호된 펩티드 길항제의 합성 및 결합체 형성의 예시는 반응도 5에 도시되어 있다. 곁사슬 아민이 결합부위로서 작용하는 유사체들은 쉽게 입수가능한 직교 보호된 염기성 아미노산으로부터 제조될 수 있다.
반응도 5
Figure 112006035208390-PCT00013
표 3(서열번호 5~60)에 기재된 것들과 같은 B1 길항제 펩티드의 부분적으로 보호된 형태는 유사 방법을 사용하여 PEG 부분에 결합될 수 있다.
반응도 5에서 도시된 과정의 한 구체예에 있어서, 부분적으로 보호된 펩티드 (5c)의 아민 곁사슬들은 터셔리-부틸카르바모일(Boc) 부분에 의해 은폐되고, 결과의 펩티드는 1,2-디클로로에탄(DCE), N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 이들의 혼합물과 같은 유기 용매내에서 앞에서 개시된 PEG 알데히드와 반응을 한다. 이민 중간체의 형성은 분말화된 4°A 건조제와 같은 탈수제의 첨가에 의해 촉진될 수 있다. 실온에서 1~24시간 동안 교반한 후에, 결과의 이민은 1~4당량의 소듐트리아세톡시보로히드라이드 또는 소듐시아노보로히드라이드의 첨가에 의해 환원된다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 5에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 반응은 약 20~약 60℃의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 바와 같이, 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 반응은 약 20~약 50℃의 온도에서 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 바와 같이, 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 반응은 약 35~약 45℃의 온도에서 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 바와 같이, 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 대부분의 반응은 실온에서 수행될 수 있다.
반응도 5에서 도시된 과정의 다른 구체예에서는, 부분적으로 보호된 펩티드(5c)의 아민 곁사슬이 터셔리-부틸카르바모일(Boc) 부분에 의해 은폐되고, 결과의 펩티드는 1,2-디클로로에탄(DCE), N, N'-디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄, N-메틸피롤리딘(NMP) 또는 이들의 혼합물과 같은 유기 용매들내에서 앞에 기술된 PEG N-히드록시숙신이미드 또는 p-니트로페닐에스테르 PEG 시약과 반응을 한다. 활성화된 PEG에스테르들은 Nektar 또는 NOF와 같은 공급자들로부터 상업적으로 입수가능한 단작용성 또는 선형 이작용성을 갖는 종류일 수 있다. 또한, 3~6 히드록시숙신이미드 또는 p-니트로페닐에스테르 부분을 포함하는 분지된 폴리작용성 PEG 활성화된 에스테르는 본 발명의 결합체를 제조하는데 특히 유용하다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 5에 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 반응은 약 20~약 60℃의 온도에서 약 4시간~약 10일 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 반응은 약 20~50℃의 온도에서 약 12시간~약 5일 동안 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 반응은 약 35~약 45℃의 온도에서 약 1일~약 5일 동안 수행될 수 있다. 반응도 5에서 기술된 5c와 같은 부분적으로 보호된 펩티드와의 대부분의 반응은 약 1일~약 4일 동안 실온에서 수행될 수 있다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 5에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 반응도 5에서 도시된 곁사슬의 보호기의 제거는 약 -20~약 60℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 반응은 약 5~50부피%의 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 디클로로메탄과 같은 적합한 용매내에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 산-매개된 보호기의 제거는 TFA를 약 10~약 25부피% 사용하여 약 0~약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 산-매개된 보호기의 제거는 디클로로메탄내에서 TFA를 약 10~약 20부피% 사용하여, 약 0~약 25℃의 온도에서 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응도 5에서 도시된 산-매개된 보호기의 제거는 디클로로메탄내에서 TFA를 약 20부피% 사용하여 실온에서 수행될 수 있다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 5에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 반응도 4에서 도시된 생성물(5d)은 역상 HPLC, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 멤브레인 투석법으로 정제될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기에서 언급된 정제 기술의 둘 또는 그 이상을 조합한 정제 기술은 본 발명의 결합체를 정제하기 위하여 조합적으로 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
상기 또는 하기의 구체예와 관련하여, 반응도 5에서 도시된 과정의 다른 구체예에 있어서, 정제 방법은 1회 이상 수행될 수 있다.
유도체들.
본 발명의 펩티드 및/또는 결합 펩티드의 유도체 또한 여기에서 고찰된다. 그러한 유도체들은 본 명세서에서 개시된 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드의 용해도, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 더욱 향상시킬 수 있다. 부가된 부분들은 본 명세서에서 개시된 펩티드 및/또는 결합 펩티드의 원치 않는 어떤 특성들을 선택적으로 제거 또는 감쇠시킬 수 있다. 예시적인 유도체는, 하기와 같은 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드를 포함한다:
1. 펩티드 및/또는 결합 펩티드 또는 그들의 어떤 부분은 시클릭이다. 예를 들면, 펩티드 및/또는 결합 펩티드의 펩티드 부분은 디설피드 결합 형성에 의해 고리화할 수 있는, 둘 이상의 시스테인 잔기들(예를 들면, 펩티드 링커내에)을 포함하도록 변형될 수 있다. 고리화 유도체의 제조에 관한 참고문헌으로서 인용한 WO 00/24782를 참고.
2. 펩티드 및/또는 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드는 가교결합되거나 또는 분자들 사이에서 가교결합이 가능하게 된다. 예를 들면, 결합 펩티드의 펩티드 부분은 하나의 Cys 잔기를 포함하도록 변형될 수 있고, 이로써 유사한 분자와 함께 분자간 디설피드 결합이 형성될 수 있다.
3. 하나 이상의 펩티딜 [-C(O)NR-] 결합(펩티드 결합)은 비-펩티딜 결합에 의해 치환된다. 예시적인 비-펩티딜 결합은 -CH2-카바메이트[-CH2-OC(O)NR-], 포스포네이트, -CH2-술폰아미드[-CH2-S(O)2NR-], 우레아[-NHC(O)NH-], -CH2-2차 아민, 및 알킬화된 펩티드[-C(O)NR6-, 여기에서 R6은 저급 알킬이다]이다.
4. X1에서 결합 펩티드의 N-말단 시스테인 잔기는 N-말단 유도체 기로 치환될 수 있다. 예시적인 N-말단 유도체 기는 -NHR1을 포함하고, 여기에서 R1은 모노알킬이다.
이작용성 물질에 의한 유도체화 반응은 불수용성 지지 매트릭스 또는 다른 거대분자 비히클에 비히클-결합 펩티드 또는 그들의 기능성 유도체를 가교결합 시키는데에 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는, 예를 들면 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜에스테르를 포함하는 호모이작용성 이미도에스테르 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이작용성 말레이미드를 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]-프로피오이미데이트]와 같은 유도체화제들은 빛의 존재하에서 가교결합을 형성할 수 있는 광학활성 중간체를 생산한다. 또는, 미국특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 개시된 시아노겐브로마이드-활성화된 카보하이드레이트와 같은 반응성의 불수용성 매트릭스들 및 반응성 기질들이 단백질 고정화에 적용된다.
카보하이드레이트(올리고당)기들은 단백질내에 글리코실화 위치로 알려진 위치에 공유결합될 수 있다. 일반적으로, O-연결된 올리고당은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기에 결합되고, 반면에 N-연결된 올리고당은, Asn-Aaa-Ser/Thr 서열의 일부일 경우(여기서 Aaa는 프롤린을 제외한 아미노산일 수 있다.), 아스파라긴(Asn) 잔기에 결합된다. Aaa가 프롤린외의 19개의 천연 아미노산의 하나인 것이 바람직하다. N-연결된 및 O-연결된 올리고당 및 각각의 타입에서의 당 잔기의 구조는 차이가 있다. 상기 두 타입에서 공통적으로 발견되는 하나의 당 타입은 N-아세틸뉴라민산(살리실산으로 지칭됨)이다. 일반적으로, 살리실산은 N-연결된 및 O-연결된 올리고당의 말단 잔기이고, 그것의 마이너스 전하에 의해 글리코실화 결합 펩티드에 산성의 특성을 줄 수 있다. 이러한 부위(들)은 본 발명의 비히클-결합 펩티드의 링커내에 통합될 수 있다. 이러한 부위들은 당분야에서 공지된 합성 또는 반합성과정에 의해 더 글리코실화될 수 있다.
다른 가능한 변형은 프롤린 및 리신의 히드록실화 반응, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 포스포릴화 반응, 시스테인내의 황원자의 산화, 리신, 아르기닌, 및/또는 히스티딘 곁사슬의 알파-아미노기들의 메틸화반응을 포함한다(Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pages 79-86 (1983)).
본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 적합한 아미노산 유도체의 제조를 포함하는, 여기에서 개시된 펩티드 및/또는 결합 펩티드의 합성, 펩티드를 합성하기 위한 그들의 활성화 및 커플링, 및 그들의 순도의 측정은, 용액상 중합에 대해 Houben-Weyl "Methoden der Organischen Chemie" Vol. 16, parts I & Ⅱ에서 일반적으로 개시된 바와 같이, 일반적인 펩티드 화학의 지식에 포함되는 것이다. 고체상 방법에 의한 합성을 위해, 적합한 기술은 또한 당분야에 공지되어 있고, Merrifield, Chem. Polypeptides, 페이지 335-361 (Katsoyannis and Panayotis editors) (1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Volume 85, 페이지 2149 (1963); Davis 등, Biochem. Intl., Volume 10, 페이지 394-414 (1985); Stewart와 Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); 미국특허 제3,941,763호; Finn 등, The Proteins (3d edition), Volume 2, 페이지 105-253 (1976); 및 Erickson 등, The Proteins (Third Edition), Volume 2, 페이지 257-527 (1976)에 개시된 것들을 포함한다. 펩티드 합성의 당분야에서 숙련된 화학자는 표준 용액 방법, 또는 수동적 또는 자동적인 고체상 방법에 의해, 개시된 펩티드를 합성할 수 있다. 비용상의 효율성으로 인하여 고체상 합성은 각각의 펩티드를 제조하기 위한 바람직한 기술이다.
약제학적 조성물
일반. 본 발명은 또한 예컨대, 염증 및 통증(염증성 통증 및 관련 통각 과민증 및 이질통증을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다)의 예방 또는 치료에 있어서 본 발명의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들의 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들은, 제한되지는 않지만, 시신경 통증 증후군, 당뇨병, 독소 및 화학요법, 패혈성 쇼크, 관절염, 혼합-혈관상 및 비-혈관상 증후군들, 일반적인 염증, 류머티즘 질병, 루프스, 골관절염, 염증성 장질환, 염증성 안질환, 염증성 또는 불안정성 방광 질환, 건선, 염증성 성분으로 인한 피부병, 햇볕화상, 심장염, 염증성 장 질병, 피부염, 근육염, 신경염, 콜라겐 관상 질병, 만성 염증성 상태, 상피 조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 당뇨병성 신경장애 통증, 후-포진성 신경통, 작열통, 교감 지속 통증, 구심로차단 증후군, 긴장성 두통, 급성 통증, 편두통, 외과적 통증, 호흡기, 비뇨생식기, 위장 또는 관상 부위에서의 내장 운동성 장애, 상처, 화상, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 피부 반응, 가려움증, 백반, 일반적인 위장 질환, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 또는 혈관 운동성 또는 알레르기성 비염을 포함하는 B1 활성과 관련되거나 또는 B1 활성에 의해 매개되는 다른 통증 상태의 예방 또는 치료에 대한 치료적 유용성을 갖는다.
본 발명은 또한 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 절단 또는 종기로 인한 통증, 작열통, 중추신경계 탈수초증 질병, 3차 신경의 신경통, 암, 만성 알코올중독, 뇌졸증, 시신경 통증 증후군, 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군 ("AIDS"), 독소 및 화학요법, 일반적인 두통, 편두통, 군발 두통, 혼합-혈관상 및 비-혈관상 증후군, 긴장성 두통, 일반적인 염증, 관절염, 류머티즘 질병, 루프스, 골관절염, 염증성 장질환, 염증성 안질환, 염증성 또는 불안정성 방광 질환, 건선, 염증성 성분으로 인한 피부병, 햇볕화상, 심장염, 피부염, 근육염, 신경염, 콜라겐 관상 질병, 만성 염증성 상태, 염증성 통증 및 관련 통각 과민증 및 이질통증, 신경병적 통증 및 관련 통각 과민증 및 이질통증, 당뇨병성 신경장애 통증, 작열통, 교감 지속 통증, 구심로차단 증후군, 천식, 알레르기성 비염, 상피 조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 후-포진성 신경통, 호흡기, 비뇨생식기, 위장 또는 관상 부위에서 내장 운동성 장애, 상처, 화상, 알레르기성 피부 반응, 가려움증, 백반, 일반적인 위장 질환, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 및 기관지 질환의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 절단 또는 종기로 인한 통증, 작열통, 중추신경계 탈수초증 질병, 3차 신경의 신경통, 암, 만성 알코올중독, 뇌졸증, 시신경 통증 증후군, 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군("AIDS"), 독소 및 화학요법, 일반적인 두통, 편두통, 군발 두통, 혼합-혈관상 및 비-혈관상 증후군, 긴장성 두통, 일반적인 염증, 관절염, 류머티즘 질병, 루프스, 골관절염, 염증성 장질환, 염증성 안질환, 염증성 또는 불안정성 방광 질환, 건선, 염증성 성분으로 인한 피부병, 햇볕화상, 심장염, 피부염, 근육염, 신경염, 콜라겐 관상 질병, 만성 염증성 상태, 염증성 통증 및 관련 통각 과민증 및 이질통증, 신경병적 통증 및 관련 통각 과민증 및 이질통증, 당뇨병성 신경장애 통증, 작열통, 교감 지속 통증, 구심로차단 증후군, 천식, 알레르기성 비염, 상피 조직 손상 또는 기능장애, 단순포진, 후-포진성 신경통, 호흡기, 비뇨생식기, 위장 또는 관상 부위에서의 내장 운동성 장애, 상처, 화상, 알레르기성 피부 반응, 가려움증, 백반, 일반적인 위장 질환, 대장염, 위궤양, 십이지장궤양, 및 기관지 질환과 같은 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 하나 이상의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들의 사용에 관한 것이다.
여기에서 사용된, "치료" 또는 "치료하는 것"은 유용한 또는 바람직한 임상 결과들을 얻기 위한 접근방법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유용한 또는 바람직한 임상 결과들은 하나 이상의 다음과 같은 것들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다:급성, 만성, 염증성, 신경병적, 또는 외과술후 통증을 포함하는 통증 및/또는 염증의 측면에서의 개선 또는 완화. 본 발명의 목적을 위하여, 유용한 또는 바람직한 임상 결과들은 하나 이상의 다음과 같은 것들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다: (통증 및/또는 염증의 기간 단축 및/또는 통증 민감도 또는 통증 지각의 감소와 같은) 통증 및/또는 염증의 어떤 측면을 포함하는 통증 및/또는 염증과 관련된 하나 이상의 증상들의 완화, 경감.
그러한 약제학적 조성물들 또는 약제들은 주사에 의해, 또는 경구투여, 폐투여, 비강투여, 경피투여 또는 다른 투여의 형태로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제, 방부제, 용해제, 유화제, 보조제 및/또는 담체들과 함께 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 및/또는 적어도 하나의 비히클-결합 펩티드를(여기에서 제공된 통증 또는 어떤 다른 의학 상태를 예방, 완화, 또는 해소하는데 유효한 양으로) 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 그러한 조성물들은 다양한 완충 성분(예컨대, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온강도의 희석제들; 세제 및 가용제(예컨대, Tween 80, Polysorbate 80), 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 방부제(예컨대, Thimerosol, 벤질 알코올) 및 벌킹 물질(예컨대, 락토오스, 만니톨)과 같은 첨가제; 폴리젖산, 폴리글리콜산 등과 같은, 폴리머성 비히클-결합 펩티드들의 미립자 제제내로의, 또는 리포솜내로의 물질의 통합을 위한 첨가제를 포함한다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 이는 순환에 있어서 지속 시간을 촉진시키는 효과를 가질 수 있다. 그러한 조성물들은 또한 본 발명의 비히클-결합 펩티드들의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출율, 및 생체내 제거율에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어 여기에 참고문헌으로 통합된, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18번째 발행본., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1435~1712페이지(1990)를 참고하라. 조성물들은 액상 형태, 또는 건조 분말(냉동건조 형태와 같은)로서 제조될 수 있다. 주입할 수 있는 지속 방출 제제들도 또한 고려되며, 이는 경피 제제들이다.
경구 투여 형태. 경구 고형 투여 형태의 사용이 고려되고, 이는 여기에 참고문헌으로 통합된 Remington's Pharmaceutical Sciences의 Chapter 89에 일반적으로 기술되어 있다. 고형 투여 형태는 정제, 캡슐, 알약, 트로키 또는 로진즈(lozenge), 오블라토 또는 펠릿을 포함한다. 또한, 리포솜의 캡슐화 또는 유단백질 캡슐화는 본 발명의 조성물(예컨대, 미국특허 제4,925,673호에 보고된 유단백질 마이크로스피어와 같은)의 제제화에 사용될 수 있다. 리포솜 캡슐화가 사용될 수 있고, 리포솜들은 여러가지 폴리머들로 유도화될 수 있다(예컨대, 미국특허 제5,013,556호 참조). 가능한 고형 투여 형태는, 여기에 참고문헌으로 통합된, G. S. Banker 및 C. T. Rhodes에 의해 편집된, Marshall, K., Modern Pharmaceutics의 Chapter 10에 기술되어 있다. 일반적으로, 제제는 위장 환경에 대한 보호를 가능하게 할 뿐만 아니라 장 전체에서 비히클-결합 펩티드의 방출을 가능하도록 하는 불활성 성분 뿐만 아니라, 본 발명의 비히클-결합 펩티드를 포함할 것이다.
또한 본 발명의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들 그 자체들의 경구 투여 형태가 특별하게 고려된다. 이것과 관련하여, 필요하다면, 경구 투여가 효과적이 되도록 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들은 화학적으로 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 비히클-결합 펩티드들의 흡수를 강화하기 위한 담체로서, 소듐 N-(8-[2-하이드록시벤조일]아미노)카프릴레이트(SNAC)와 같은 변형된 지방족 아미노산의 염을 사용하는 것이 가능하다. "경구 약제 운반 조성물 및 방법들"이라는 제목의 미국특허 제5,792,451호 참고.
본 발명의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들은 약 1밀리미터의 입자 사이즈의 과립 또는 펠릿의 형태로 미세한 다수-미립자로서 제제내에 포함될 수 있다. 또한, 캡슐 투여를 위한 제제는 분말, 또는 약간 압축된 플러그 또는 정제의 형태일 수 있다.
착색제 및 향료도 모두 포함될 수 있다. 예컨대, 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드 또는 그것의 유도체들이 제제화될 수 있고(리포솜 캡슐화 또는 마이크로스피어 캡슐화에 의한 것과 같이), 그 후에 착색제 및 향료를 포함하는 냉장 음료와 같은 식용 제품 내에 더 포함될 수 있다.
불활성 물질로 본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드를 희석시키거나 또는 부피를 증가시킬 수 있다. 이들 희석제들은 탄수화물, 특히, 만니톨, α-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로오스, 슈크로오스, 변형 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 칼슘 트리포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및 소듐 클로라이드를 포함하는 무기염들은 충전제로서 사용될 수 있다. 몇몇의 상업용 희석제들은 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이다.
붕괴제는 고형 투여 형태의 치료용 제제내에 포함될 수 있다. 붕괴제로서 사용되는 물질들은 전분계 상업용 붕괴제인 익스플로탭(Explotab)을 포함하여, 전분을 포함하지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 소듐 전분 글리콜레이트, 암베르라이트(Amberlite), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 울트라밀로펙틴, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산 카르복시메틸 셀룰로오스, 천연 해면 및 벤토나이트 또한 사용될 수 있다. 붕괴제의 다른 형태는 불용성 양이온 교환수지이다. 분말 검들은 붕괴제로서 그리고 바인더로서 사용될 수 있고, 이들은 한천, 카라야(Karaya) 또는 트래거캔스(tragacanth)와 같은 분말 검을 포함할 수 있다. 아르긴산 및 그것의 소듐염 또한 붕괴제로서 유용하다.
바인더들은 약제학적 조성물의 성분들과 함께 유지되어 단단한 정제를 형성하는데 사용될 수 있고, 그들은 아카시아, 트래거캔스, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 생성물들로부터의 물질들을 포함한다. 다른 것들은 메틸셀룰로오스(MC), 에틸셀룰로오스(EC) 및 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(HPMC) 모두 치료제를 과립화하기 위해서 알코올 용액으로 사용될 수 있다.
항-마찰제는 제제화 공정 동안에 끈적끈적함을 예방하기 위해서 제제에 포함될 수 있다. 윤활제는 치료제 및 다이 월(die wall) 사이의 층으로서 사용될 수 있고, 이들은 다음을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다: 스테아르산(이것의 마그네슘염 및 칼슘염을 포함), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액상 파라핀, 식물성 유지 및 왁스. 또한 가용성 윤활제로는 다양한 분자량의 소듐 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, Carbowax 4000 및 6000과 같은 것이 사용될 수 있다.
제제화하는 동안 비히클-결합 펩티드의 유동성을 개선할 수 있고, 압축과정 동안의 재배열을 돕기 위해 활제가 첨가될 수 있다. 그러한 활제들은 전분, 탈크, 피로제닉 실리카 및 수화 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드의 수성 매체에의 용해를 돕기 위해서, 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 그러한 계면활성제들은 소듐 라우릴 설페이트, 디옥틸 소듐 설포숙시네이트 및 디옥틸 소듐 설포네이트와 같은 음이온 세제를 포함할 수 있다. 양이온 세제가 사용될 수 있고, 이는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제제에 포함될 수 있는 가능한 비이온 세제의 목록은 라우로매크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터 오일 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 슈크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스이다. 이들 계면활성제는 단독으로 제제에 존재할 수 있거나 또는 다양한 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.
또한 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드의 흡수를 강화하기 위해서 첨가제가 제제에 포함될 수 있다. 잠재적으로 이러한 특징을 갖는 첨가제들은 예컨대 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산과 같은 다양한 지방산들을 포함한다.
방출 조절 제제가 바람직할 수 있다. 본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드는 예컨대, 검과 같은 확산 또는 침출 메커니즘에 의한 방출을 가능하게 하는 불활성 매트릭스내에 통합될 수 있다. 예컨대, 알기네이트 또는 폴리사카라이드와 같은 서서히 분해되는 매트릭스들 또한 제제내에 통합될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드의 조절된 방출의 다른 형태는 오로스(Oros) 치료 시스템(Alza Corp.)에 기초한 방법에 의한 것으로, 상기 방법에서 의약은 삼투효과에 기인하여 단일한 작은 입구를 통하여 물이 흡수됨과 동시에 의약을 밀어내는 반투과막내에 둘러싸인다. 몇몇 장용 코팅들 또한 지연된 방출 효과를 갖는다.
폐 전달 형태. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 폐 전달 또한 고려된다. 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드(또는 그것의 유도체들)는 흡입에 의해 포유류의 폐로 전달되어, 폐의 상피 라이닝을 통과하여 혈류로 전달된다. 이와 관련하여, Adjei 등, Pharma. Res., Volume 7, 565~569페이지(1990); Adjei 등, Internatl. J. Pharmaceutics, 63권, 135~144페이지(1990)(leuprolide acetate; Braquet 등, J. Cardiovasc. Pharmacol., 13권(suppl.5), s.143~146(1989)(endothelin-1); Hubbard 등, Annals Int. Med., 3권, 206~12페이지(1989)(α1-antitrypsin); Smith 등, J. Clin. Invest., 84권, 1145~1146페이지(1989)(α1-proteinase); Oswein 등, "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado(1990)(recombinant human growth hormone); Debs 등, J. Immunol., 140권, 3482~3488페이지(1988)(interferon-γ 및 tumor necrosis factor α); 및 미국특허 제5,284,656호(granulocyte colony stimulating factor)를 포함하는 거대분자의 폐를 통한 전달에 대한 보고서들이 도움이 될 수 있다.
치료제 생성물의 폐 전달을 위해 디자인된 여러 기계적 장치들이 본 발명의 실시에 사용되기 위해 고려되는데, 여기에는 호흡보조기, 투여량 계량 흡입기, 및 분말 흡입기가 포함되지만, 이에 제한되지 않으며, 이들 모두는 당업자들에게 공지되어 있다. 본 발명의 실시에 적합한 상업적으로 구입가능한 장치들의 몇가지 특정 예들은 미조리주의 세인트루이스 소재의 Mallinckrodt, Inc.에 의해 제조된 Ultravent 호흡 보조기; 콜로라도주의 이글우드 소재의 Marquest Medical Products에 의해 제조된 Acorn II 호흡 보조기; 북부 캘리포니아주 소재의 Research Triangle Park의 Glaxo Inc.에 의해 제조된 Ventolin 투여량 계량 흡입기; 및 메사추세츠주의 베드포드 소재의 Fisons Corp.에 의해 제조된 Spinhaler 분말 흡입기이다.
그러한 모든 장치들은 여기에 기술된 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들 및/또는 그것의 유도체들의 투여를 위해 적합한 제제들의 사용을 필요로 한다. 일반적으로, 각각의 제제는 적용되는 장치의 타입에 한정되고, 치료에 유용한 희석제, 부형제, 보조제 및/또는 담체에 추가하여 적당한 추진제 물질의 사용을 포함할 수 있다.
이들 폐 투여 조성물들을 위한 약제학적으로 허용가능한 담체들은 트레할로스, 만니톨, 크실리톨, 슈크로오스, 락토오스 및 소르비톨과 같은 탄수화물을 포함한다. 제제에 사용되기 위한 다른 성분들은 DPPC, DOPE, DSPC 및 DOPC를 포함할 수 있다. 천연 계면활성제 또는 합성 계면활성제가 사용될 수 있다. (펩티드를 유도체화하는데 사용되는 것과 별도로) PEG가 사용될 수 있다. 시클로덱스트란과 같은 덱스트란, 담즙염, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체들 또한 사용될 수 있다. 완충 제제에서와 같이, 아미노산이 사용될 수 있다.
또한, 리포솜, 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어 함유 복합체들, 또는 다른 타입의 담체들의 사용이 고려된다.
제트 타입 또는 초음파 타입의 호흡보조기의 사용에 적합한 제제들은, 전형적으로 용액의 밀리미터(ml)당 생물학적 활성제 약 0.1~25미리그램(mg)의 농도로 물에 용해된 본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드를 포함할 것이다. 상기 제제는 또한 (예컨대, 삼투압에 대한 펩티드의 안정화 및 조절을 위한) 완충제 및 단당을 포함할 수 있다. 호흡 보조기 제제는 또한, 에어로솔을 형성하는데 있어서 용액의 미립자화에 의해 야기된 단백질의 표면에서 유도된 응집을 감소시키거나 또는 방지하기 위해서 계면활성제를 포함할 수 있다.
투여량 계량 흡입기 장치의 사용을 위한 제제들은 일반적으로 계면활성제의 도움으로 추진제 내에 현탁된, 상기 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드를 포함하는 미세하게 분쇄된 분말을 포함할 것이다. 추진제는 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 , 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 또는 이들의 조합물을 포함하는 하이드로카본과 같은, 이러한 목적을 위해 사용되는 통상의 물질일 수 있다. 적합한 계면활성제들은 소르비탄 트리올리에이트 및 대두 레시틴을 포함한다, 올레산은 또한 계면활성제로서 유용하다.
분말 흡입기 장치로부터 투여될 수 있는 제제들은 상기한 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들을 포함하는 미세하게 분쇄된 건조 분말을 포함할 것이며, 또한 상기 장치로부터 상기 분말의 분산을 용이하게 할 수 있는 양, 예컨대 제제의 50~90중량%의 락토오스, 소르비톨, 슈크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 크실리톨과 같은 벌킹제를 포함할 수 있다.
비강 전달 형태. 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드들의 비강 전달 또한 고려된다. 비강 전달은, 코에 치료제 생성물을 투여한 후에, 폐에서의 상기 생성물의 침착 없이 본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드들의 혈류로의 직접 이동을 가능하게 한다. 비강 전달을 위한 제제들은 덱스트란 또는 시클로덱스트란을 갖는 것들이다. 다른 점막을 통과하는 이동을 통한 전달 또한 고려된다.
펌프 전달. 본 발명의 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 국부적 전달이 B1에 의해 매개되는 질병을 치료 또는 예방하기 위해서 고려된다. 본 발명에 의해 고려되는 국부적 전달의 한가지 방법은 약제가 작용하는 국소 부위에 약제를 주입하는 것이다.
국부적 전달을 위한 다른 방법은 원하는 신체부위에 약물(들)을 투여하기 위한 카테테르를 삽입하고, 카테테르를 통해서 약물(들)을 밀어넣는 펌프를 사용하는 것을 포함한다. 내부적으로 이식된 카테테르와 함께 사용되는 외부적으로 착용되는 약물 펌프들이 당업자들에게 공지되어 있다.
국부적 전달을 위한 또 다른 방법들은 이식가능한 약물 전달 장치들을 포함한다. 이식가능한 펌프들은 당업자들에게 잘 알려진 외부 펌프와 카테테르 시스템들을 사용하는 기술들의 불리한 점들을 검토하기 위해서 개발되었다. 이식가능한 약물 전달 펌프들은 종종 약물을 저장하기 위한 저장소, 저장소로부터 규칙적인 간격으로 오래된 약물을 제거할 뿐만 아니라 새로운 약물 제조물을 투여할 수 있는 주입 포트, 및 선택적으로 원하는 부위에 약물을 운반할 수 있는 카테테르를 포함한다. 바람직한 이식가능한 장치들은 Duros implant(Alza Corporation, Mountain View, CA), SynchroMed I 또는 II Infusion System(Medtronic, Inc., Minneapolis) 등을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
추가적으로 (또는 선택적으로), 본 발명은 상기에서 이미 언급된, 및/또는 당업자들에게 공지된 다양한 서방성 제제들 또는 지속된 방출 제제들 또는 미립자 제제들중의 어느 것에 사용되기 위한 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들을 제공한다.
투여량. 투여되어질 본 발명의 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 유효 투여량은 생물학적 반감기, 생체이용도, 및 독성과 같은 파라미터를 검토하는, 당업자들에게 공지된 방법을 통해서 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 유효 투여량 범위는 당업자들에게 공지된 통상적인 시험관내 및 생체내 연구로부터의 데이터를 사용하여 당업자들에 의해 결정된다. 예컨대, 하기 실시예 6에 기술된 예시적인 분석과 같은, 시험관내 세포 배지 분석은 데이터를 제공할 것이고, 이 데이터로부터 당업자들은 약간의 B1 유도된 활성을 방지하기 위해서 필요한 펩티드 또는 결합 펩티드의 평균 억제농도(IC) 또는 평균 유효농도(EC)(예컨대, 50%, IC50; 또는 90%, IC90)를 쉽게 결정할 수 있다. 그런 다음, 하기 실시예 9에 기술된 예시적인 약물 동력학적 데이터와 같은, 하나 이상의 전형적인 동물 모델로부터의 약물 동력학적 데이터를 사용하여, 결정된 IC값과 같거나 그 이상인 펩티드의 최소 혈장 농도(Cmin)가 얻어지도록 하는 적합한 투여량이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 관련된 질병 또는 질환을 치료하기 위한 방법에 관련된 투여량 처방 계획은 나이, 상태, 체중, 성별 및 환자의 식이요법, 치료되는 상태의 심각도, 투여시간, 및 다른 임상적 요소들과 같은 치료제의 작용을 변화시키는 다양한 요소들을 고려하여, 주치의에 의해서 결정될 것이다. 일반적으로, 일일 처방 계획은 체중의 킬로그램(kg)당 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드 1.0~10000마이크로그램(μg), 바람직하게는 체중의 킬로그램당 1.0~1000μg, 가장 바람직하게는 체중의 킬로그램당 1.0~150μg의 범위이어야 한다.
복합 치료. 다른 측면에 있어서, 본 발명은 일정량의 본 발명의 펩티드 및/또는 비히클-결합 펩티드 및 일정량의 NSAID를 투여하는 것을 포함하는, 통증 및/또는 감염, 또는 B1 활성과 관련된 어떤 상태 또는 질환을 치료하는 방법(또는 다른 구체예들에서는, 예방하는 방법)을 포함한다. 용어 "NSAID"는 비-스테로이드 항-염증성 화합물을 언급한다. 펩티드 길항제 및/또는 결합 펩티드 길항제 및 NSAID의 상대적인 양과 비는 다양할 수 있다. 어떤 구체예에서, 동등한 정도의 통증 또는 염증의 완화를 가져오는 효과를 나타내기 위해서 필요한 NSAID의 정상적인 투여량을 감소시키기 위해서, 충분한 양의 펩티드(들) 및/또는 결합 펩티드(들)이 투여될 것이다. 어떤 구체예에서, 동등한 정도의 통증 또는 염증의 완화를 가져오는 효과를 나타내기 위해서 필요한 NSAID의 정상적인 복용량을 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 그 이상을 감소시키기 위해서, 충분한 양의 본 발명의 펩티드(들) 및/또는 결합 펩티드(들)이 투여될 것이다. 이러한 감소는 주어진 투여당 투여량 및/또는 주어진 시간 동안의 투여량(감소된 빈도)으로 나타내어질 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 및/또는 적어도 하나의 결합 펩티드와 조합하여 유효량의 NSAID를 투여하는 것을 포함하는 NSAID 통증 또는 감염 치료를 강화시키기 위한 방법을 제공한다. 여기에서 사용된, "조합 투여"는 또한 NSAID 및 본 발명의 펩티드 및/또는 결합 펩티드가 개인에게 유효량으로 투여되는 어떠한 상황을 포함하는 것을 의미한다. 여기에서 사용된 "조합 투여"는 동시 투여 및/또는 다른 시간들에 투여하는 것을 포함한다. 조합 투여는 또한 공동-제제로서의 투여(즉, 본 발명의 펩티드 및/또는 결합 펩티드 및 NSAID는 동일 조성물내에 존재한다(조합된다)) 및/또는 별도의 조성물로서의 투여를 포함한다. 본 발명의 펩티드(들) 및/또는 결합 펩티드(들) 및 적어도 하나의 NSAID는 다른 투여 횟수 및/또는 간격으로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 결합 펩티드는 일주일마다 투여될 수 있고, 반면에 NSAID는 좀더 자주 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드(들) 및/또는 결합 펩티드(들) 및 NSAID는 동일 루트의 투여 또는 다른 루트의 투여를 사용하여 투여될 수 있고, 그러한 다른 투여 계획은 투여(들)의 경로에 따라 달라질 수 있다. 통증 또는 염증의 시작 전에 투여가 이루어질 수도 있다. 따라서, 다른 측면에 있어서, 본 발명은 개인의 통증 및/또는 염증의 전개 또는 진행을 치료, 발생빈도 감소, 완화 및/또는 지연시키는 방법을 제공하고, 상기 방법들은 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 및/또는 적어도 하나의 결합 펩티드와 유효량의 적어도 하나의 NSAID를 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 그러한 방법들은 NSAID의 사용이 일반적으로 처방되는 통증 및/또는 염증을 포함하는 어떤 병인학의 통증 및/또는 염증을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다. 그러한 방법들은 또한 B1 활성에 의해 매개되거나 또는 B1 활성과 관련되어 있는 것으로 상기에서 미리 언급했거나, 또는 이하에서 언급되는 상태 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해서 적합하다. 어떤 구체예에서, 통증 및/또는 염증은 외과술후 통증이다. 어떤 구체예에서, 통증 및/또는 염증은 화상 또는 상처와 관련되어 있다. 다른 구체예들에 있어서, 통증 및/또는 염증은 류머티스성 관절염과 관련되어 있다. 다른 구체예들에 있어서, 통증 및/또는 염증은 골관절염과 관련되어 있다. 다른 구체예들에 있어서, 통증 및/또는 염증은 후-포진성 신경통과 관련되어 있다. 어떤 구체예들에 있어서, NSAID는 아스피린, 아세토미노펜, 이부프로펜, 인도메타신, 나프록센, 나프로신, 디클로페나크, 케토프로펜, 톨메틴, 슬린다크, 메페남산, 메클로페남산, 디플루니살, 루페니살, 피록심, 수독시캄, 이속시캄, 셀레콕시브, 로페콕시브, DUP-697, 플로술리드, 멜록시캄, 6메톡시-2 나프틸아세트산, MK-966, 나부메톤, 니메술리드, NS-398, SC-5766, SC58215, T-614 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예들
다음의 실시예들은 예시적인 목적만을 나타낼 뿐, 어떤 방법으로 본 발명을 제한하려는 의도는 아니라고 이해되어야만 한다. 당업자들은 여기에 개시된 화합물들의 변형과 변경이 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 화합물들은 다음 방법들의 하나 이상에 따라 합성될 수 있다. 일반적인 과정들은 특정되지 않은 입체화학을 갖는 화합물들의 제조에 관련되어 있는 것으로 나타나 있음을 주목해야 한다. 그러나, 그러한 과정들은 일반적으로 특정 입체화학의 화합물들에 적용가능하고, 예컨대, 여기에서 기(group)에 관한 입체화학구조는 (S) 또는 (R)이다. 또한, 하나의 입체화학구조(예컨대, (R))를 갖는 화합물들은 공지된 방법들을 사용하여, 예컨대, 역전환(inversion)에 의해 반대 입체화학구조(즉, (S))를 갖는 화합물들을 제조하기 위해 종종 사용될 수 있다.
실시예 1: B1 수용체 펩티드 길항제 및 PEG -결합 B1 수용체 펩티드 길항제의 합성 및 정제
본 발명의 다양한 펩티드들이 당업계에 공지된 합성 기술들을 사용하여 합성되었다. 본 발명의 다양한 펩티드들을 합성하는 바람직한 방법은 하기에 기술된 바와 같이 카르보디이미드 활성화를 포함하는 FMOC 방법을 사용한다.
단계 1: 카르보디이미드 화학물질을 사용하여 수지에 Fmoc -아미노산을 용해.
Fmoc-아미노산(3~4당량)은 무수 DCM/NMP 혼합물(NMP 또는 DMF는 완전한 용해를 돕기 위해 사용되었다)에 용해되었다. NMP 중의 N-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 아미노산과 동일한 당량) 용액이 아미노산 용액에 첨가되었다. DCM 중의 N,N'-디시클로헥실-카르보디이미드(DCC, 아미노산과 동일한 당량) 용액이 아미노산 용액에 첨가되었다. 용액을 대략 20분 동안 혼합하였다. 그 후에 활성화된 산 용액을 수지에 첨가하였다(필요하다면, 첨가하기 전에 침전물을 제거하였다). 수지가 닌히드린 테스트에서 음성으로 될때까지 반응물을 교반하였다. 커플링반응이 완료되었을때, 수지를 모으고, DMF로 수회 세척하였다.
단계 2: 펩티드-수지로부터 N-말단 Fmoc 의 제거.
Fmoc-보호된 펩티드 수지를 3분 동안 피페리딘/DMF(2/8)로 처리하였다. 수지로부터 물을 제거하고, 처리를 15분 동안 반복하였다. 수지를 DMF로 세척하고나서 DCM으로 수회 세척하였다. 다음 단계가 하기 단계 3에 기술된 바와 같이 수지로부터 펩티드의 분리를 포함하는 경우에는, 수지를 공기-건조시켰다.
단계 3: TFA 분리 및 탈보호 .
단계 2로부터의 건조 수지를 플라스크에 넣고, 수지 lg당 10~25ml의 분리 칵테일(95% TFA, 2.5% 물, 1.5% 트리이소프로필실란 및 1% 에탄디티올)을 첨가하였다. 3~4시간 동안 반응물을 교반한 후에, 수지를 감압하에서 여과에 의해서 제거하고, TFA로 2회 세척하였다. 모아진 여과액을 감압하에서 회전식 증발접시에 의해서 ~20%까지 농축시켰다. 액체를 -50℃까지 냉각시키고, 10배 부피의 냉각 건조 에테르로 침전시켰다. 침전물을 수집하였다. 그 후에 펩티드를 0.5% TFA를 포함하는 물/아세토니트릴 혼합물 중에 용해시키고, 냉동건조시켰다. 그 후에 조생성물을 물중의 10% 아세토니트릴/0.1% TFA로부터 물중의 50% 아세토니트릴/0.1% TFA까지의 구배로, C18 HPCL를 사용하여 정제하였다. 조생성물 1g에 대해서, 215nm 및 254nm에서의 이중 파장 검출을 하는 Agilent prep HPLC상에서 250 x 50mm C18 컬럼이 90mL/min의 유속으로 사용되었다. 주입물은 분획화되었고, 각각의 분획물은 질량 분석법에 의해 분석되었다. 튜브들은 질량 분석법에 기초하여 풀(pool)로 되었고, 감압하에서 농축시켜 아세토니트릴을 제거하고, 냉동건조시켜 흰색 분말인 펩티드 B1 길항제를 얻었다. 특성 분석은 HPLC-MS 및 Maldi-TOF 질량 결정에 의해 이루어졌다.
본 발명의 여러가지 PEG-결합 펩티드들이 다음과 같이 제조되었다.
서열번호 5~60으로 이루어진 군으로부터 선택된, 다양한 활성 브래디키닌 B1 수용체 펩티드 길항제는 상기한 방법들을 사용하여 N-말단에 다른 펩티드 링커들을 갖는 것으로 합성되었고, 각각은 끝에서 두번째 시스테인을 포함한다(예컨대, 서열번호 27~41). 이들 펩티드 유사체들은, 예컨대 하기 기술된 방법 A 또는 방법 B를 사용하여, 펩티드 유사체들의 N-말단 시스테인 티올에 대한 멜라민 활성 폴리머의 부위-특이적 커플링을 통해서 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)의 다양한 크기와 배열을 갖는 유도체로 되었다. 생성된 PEG-펩티드 결합체들은 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 정제되었고, 냉동건조 또는 투석여과에 의해서 농축되었고, 시험관내 및 생체내 생물학적 분석 전에 완충 용액으로 투석되었다.
방법 A:
PEG-결합 펩티드들은 펩티드 ml당 2.5~5mg의 50mM NaHPO4, 5mM EDTA(pH6.5) 중에서 시스테인 함유 펩티드와 PEG-말레이미드를, 말레이미드:티올이 1.2배 몰과량인 화학양론적인 반응으로 반응시킴으로써 제조되었다. 반응물을 1~1.5시간 동안 실온(20~25℃)에서 교반하였다. 일단 완료되면, 반응물을 β-메르캅토에탄올(β-ME):말레이미드의 10배 몰과량으로 퀀칭하고, 실온에서 추가로 30~60분 동안 교반하도록 했다.
반응물 5㎕를 4.6 x 250mm, 5미크론 C4 컬럼(Grace Vydac, Columbia, MD; cat. no.: #214TP54)에 주입하여 역상 HPLC(RP-HPLC)를 사용하여 반응 과정을 관찰하였다. 반응되지 않은 펩티드 및 PEG-펩티드 결합체가 0.1% 트리플루오로아세트산 중의 5~90% 아세토니트릴의 선형 구배로 용리되었다. 일반적으로 >90%의 펩티드 유사체가 반응에서 소모되었다.
선형 말레이미드 활성화 PEG 폴리머들(MW = 5kD 또는 20kD, PD=1.01~1.02)은 Shearwater Corp. 또는 NOF Corp.(Toyko, Japan) 제품이다.
정제:
PEG-결합 펩티드들은 10mM NaOAc, 20% EtOH(pH4)를 이용하여 미리-평형을 이룬 SP Sepharose HP 컬럼들(Amersham Biosciences)을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 충전 전에, 반응 혼합물을 10배의 20% EtOH로 희석시키고, pH를 결정 아세트산으로 3.5로 조절하였다. 희석된 반응 혼합물들을 2.5mg/ml의 펩티드:수지 비율을 초과하지 않도록 적당한 크기의 컬럼에 충전하였다.
그 후에 컬럼을 10mM NaOAc, 20% EtOH, pH 4의 2컬럼 부피(CVs)로 세척하였고, 10~20CV에 대해 10mM NaOAc, 20% EtOH, pH 4 중의 0~200mM NaCl 선형 구배로 용리하였다. 변형되지 않은 펩티드 및 PEG-펩티드 결합체들은 254nm 또는 220nm에서의 흡광도를 관찰하므로써 검출되었다. 이러한 조건하에서, 과량의 PEG 및 β-ME를 세척하여 미결합 흐름 분획으로 제거하였고, 넓은 피크가 시작하는 ~50mM NaCl내에 결합체가 용리되었고, 유리 펩티드는 ~200mM NaCl에서 용리되면서 잘 용해되었다.
용리된 피크 분획물들은 RP-HPLC에 의해 평가되었고, PEG-펩티드 결합체와 일치하는 동질성과 체류시간을 기초로 하여 풀(pool)로 되었다. 풀로 된 결합체 피크는 건조에 의해서 농축되었고, 그 후에 물에서 재구성되었고, 완충제를 이용하여 투석되었다. 또는 투석여과는 농축을 위해서, 그리고 결합체를 완충액 교환하기 위해서 사용될 수 있다.
PEG-펩티드 결합체들의 최종 풀들은 RP-HPLC에 의해 분석되었고, 일반적으로 ~98% 결합체였다. 결합체 조성 및 농도는 아미노산 분석, 펩티드 서열분석 및 흡광 분광분석의 조합에 의해 결정되었다.
반응도 1 중의 1c에 의해 표시된 화합물들의 용액 안정도는 상기 기술된 CEX방법(도 1(A))을 사용하여, 시간 경과에 따라 pH=7.2인 포스페이트 완충 식염수 중에서 주위온도에서 관찰되었다. 화합물 1c는 숙신이미드 부분의 가수분해로부터 생성되는 두개의 생성물 뿐만 아니라 1d로 빠르게 전환되는 것을 나타내었다(IR, MS/MS 및 NMR 실험의 조합에 의해 결정된 구조들).
방법 B:
mPEG-말레이미드(1.0당량)는 기계적 교반기, 온도 탐침기 및 N2 입구가 부착된 3구 둥근 바닥 플라스크에 들어 있는 무수 MeOH 중에 30℃에서 용해되었다. mPEG-말레이미드가 완전히 용해되었을때, N-말단 시스테인 잔기(1.3당량)를 포함하는 펩티드를 투명용액에 첨가하였고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 역상 HPLC는 mPEG-말레이미드의 소멸과 초기의 3-설파닐-숙신이미드 부가물의 새로운 피크를 나타낸다. 다음에, 10당량의 디이소프로필-에틸아민(MO주의 세인트 루이스 소재의 Sigma-Aldrich Corp.)을 용액에 첨가하고, 적어도 24시간 동안 25℃에서 교반하였다. 반응물을 고정상으로서 TOSOHAAS SP-5PW(20㎛)를 사용하는 이온교환 크로마토그래피에 의해서 관찰하였다. CEX 분석은 잔류 3-설파닐-숙신이미드 부가물이 1.5% 미만으로, 90% 이상의 전환율을 나타내었다. 터셔리부틸메틸 에테르(TBME)를 첨가하였고(반응에 사용된 메탄올 부피의 2배), 생성된 탁한 용액을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 흰색 침전물을 여과하고, 밤새도록 실온에서 진공 건조시켜, 6-메틸-카르바모일-5-옥소-티오몰포린-3-카르복스아미드가 결합된 조생성물(1d)을 얻었다.
정제:
상기 조생성물을 MeOH-H2O-AcOH 시스템(고정상으로서 c18 YMC ODS NQ)을 사용하는 RP-HPLC에 의해 정제시켜, 분석적 역상 크로마토그래피에 의해 측정된 순도 >98%의 6-메틸-카르바모일-5-옥소-티오몰포린-3-카르복스아미드가 결합된 생성물을 얻었다. 순수 분획물을 모아서 진공하에서 농축건조시키고, 생성된 흰색 잔류물을 최소량의 따뜻한 MeOH(~30oC)에 충분히 용해시켜 투명 용액을 얻고, TBME(사용된 MeOH의 부피의 2배)로 처리하였다. 생성된 탁한 용액을 1시간 동안 실온에서 교반하였고, 침전물을 여과하고, 적어도 16시간 동안 실온에서 진공 건조시켰다. 순수 생성물(1d)은 >98%의 CEX 및 RPC 순도를 가지며, 총수율 74%로 회백색으로 얻어졌다. 결합체 조성 및 펩티드 함량은 아미노산 분석, 펩티드 서열분석, 다핵 NMR 방법 및 흡광 분광분석에 의해 결정되었다. 화합물 1d의 용액 안정도는 pH=7인 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에서 주위온도에서 상기 기술된 CEX 방법을 사용하여 시간에 따라 관찰되었다. 이러한 화합물은 6일 동안 중요한 변화가 없어, 상당히 안정하다는 것이 증명되었다.
분석적 역상(RP) 및 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피는 다이오드 어레이(array) 또는 가변성 파장 검출기 및 온도조절장치가 장착된 오토샘플러를 갖는 Agilent 1100 HPLC 시스템상에서 수행되었다. 표준 크로마토그래피 조건들은 하기에 기술되어 있다.
1. RP - HPLC 방법의 조건들
컬럼: YMC ODS-AQ, 3μm, 120Å, 4.6 x 100mm
컬럼 온도. 40oC
이동상: A) 물 중의 0.1% TFA
B) MeOH 중의 0.1% TFA
유동속도: 1.1mL/min
구배: 시간 %B
0 5
10 40
30 95
35 95
35.1 5
40 5
검출: 220nm에서의 UV
주입부피: 샘플 농도에 따라 20μL 또는 50μL
샘플 농도: 2.5~10mg/mL
샘플 희석제: Dulbecco의 PBS 및 안정화 연구에 사용된 다른 완충액들
2. 일반적인 분석적 양이온 교환 크로마토그래피 방법
컬럼: TOSOH, TSK-GEL, SP-5PW, 10μm, 7.5 x 75mm
컬럼 온도. 25oC
이동상: A) 물/EtOH(8:2) 중의 20mM NaH2PO4, pH3.5
B) 물/EtOH(8:2) 중의 20mM NaH2PO4 및 0.5M NaCl, pH3.5
유동속도: 1.0mL/분
구배: 시간 B%
0 0
3 0
25 45
40 100
45 100
45.1 0
50 0
검출: 220nm에서의 UV
주입부피: 샘플 농도에 따라 10~50μL
샘플 농도: 2.5~10mg/mL
샘플 희석제: Dulbecco의 PBS 및 안정화 연구에서 사용된 다른 완충액들
실시예 2: PEG 티오에스테르를 사용하는 PEG -결합 B1 수용체 펩티드 길항제의 합성 및 정제.
PEG-결합 펩티드들은 펩티드 ml당 2.5~5mg의 50mM NaHPO4, 5mM EDTA(pH 7) 중에서, 시스테인 함유 펩티드와 PEG-말레이미드를, 말레이미드:티올이 1.2배의 몰과량인 화학양론적인 반응으로 반응시키므로써 제조되었다. 반응물을 18~26시간 동안 실온(20~25℃)에서 교반하였다. 일단 완료되면, 반응물은 10배 몰과량의 β-메르캅토에탄올(β-ME):말레이미드로 퀀칭하고, 실온에서 30~60분 동안 추가로 더 교반하였다. 반응물을 상기 실시예 1의 방법 A에 기술된 바와 같이 정제하였다.
실시예 3: PEG 티오에스테르 또는 PEG 요오도아세테이트를 사용하는 PEG -결합 B1 수용체 펩티드 길항제의 합성 및 정제.
PEG-결합 펩티드들은 펩티드 ml당 2.5~5mg의 50mM NaHPO4, 5mM EDTA(pH 7) 중에서 N-말단 시스테인 잔기 함유 펩티드와 PEG-OPTE(오르토-피리딜 티오 에스테르)를, 활성화 PEG:펩티드가 1.2배 몰과량인 화학양론적인 반응으로 반응시키므로써 제조되었다. 반응물을 18~26시간 동안 실온(20~25℃)에서 교반하였다. 일단 완료되면, 반응물을 10배 몰과량의 시스테인:과량의 PEG 시약으로 퀀칭하고, 실온에서 추가로 30~60분 동안 교반하였다. 반응물을 상기 실시예 1의 방법 A에 기술된 바와 같이 정제하였다.
선택적으로, PEG-요오도아세트아미드를 상기 기술된 바와 같이 사용하여, PEG 부분이 티오에테르 결합을 통해서 부착된 결합체를 형성할 수 있다(반응도 3). 이 경우에 있어서, 활성화 PEG 반응물의 1.5몰당량이 사용되고, 반응시간은 24시간까지 증가하고, 반응물은 상기 실시예들에서 기술된 바와 같이 정제된 10몰당량의 β-메르캅토에탄올로 퀀칭된다.
실시예 4: PEG 프로피온알데히드를 사용하는 PEG -결합 B1 수용체 펩티드 길항제의 합성 및 정제.
서열번호 5~60 및 27~41 중 어느 하나와 같은 B1 수용체 펩티드 길항제들은 미국 특허 제5,824,784호(전체가 참고문헌으로 여기에 통합됨)에 기술된 방법을 사용하여 PEG로 선택적으로 N-말단이 변형될 수 있다. 예컨대 서열번호 6으로 나타난 바와 같은 펩티드(245mg, 0.14mmol)는 100mM NaH2PO4 및 60mM NaCNBH3를 포함하는 10mL 용액에 용해되었다. 혼합물을 교반하면서 4℃까지 냉각시키고, 20K mPEG 포르피온알데히드(Nektar Therapuetics, Huntsville, AL) 2.35g으로 처리하였다. 혼합물을 3일 동안 교반한 후 실시예 1의 방법 B에 기술된 RP 및 CEX 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
또는, 아민 반응성 작용기를 포함하는 PEG를 반응도 5에 예시된 방법에 따라 부분적으로 보호된 B1 펩티드 길항제와 반응시킬 수 있다. 결합 반응 후에, 곁사슬 보호기들은, 고상 및 용액상 펩티드 합성의 분야에서 당업자들에게 공지된 방법을 사용하여 분리되고, 생성된 PEG-펩티드 구조체들은 상기 기술된 바와 같이 정제되었다. 또한 다작용성 PEG 알데히드들(3~6개의 반응기들)을 몰과량의 보호된 펩티드들과 반응시켜, 다수의 펩티드들이 위치화학적으로 그리고 화학양론적으로 정의된 방식으로 부착된 다가의 PEG 구조체를 얻을 수 있다.
실시예 5: PEG N 히드록시- 숙신이미드를 사용하는 PEG -결합 B1 수용체 펩티드 길항제의 합성 및 정제.
서열번호 5~60의 어느 하나와 같은 B1 수용체 펩티드 길항제는 반응도 5에 예시된 방법에 따라 부분적으로 보호된 B1 펩티드 길항제를 사용하여 특정의 N 터미널 또는 곁사슬 질소원자상에 선택적으로 PEG 결합될 수 있다. 예컨대, 2.5ml의 무수 DMF 중의 데카펩티드(1.43g, 1.025mmol) 용액은 25mL 디클로로메탄 중의 Sunbright PTE-200GS(20kD 4-arm 숙신이미딜글루테레이트, NOF, Tokyo, Japan) 및 1.0mL의 디이소프로필에틸 아민과 혼합되었다. 생성된 무색의 용액을 2일 동안 실온에서 교반한 후, 감압하에서 증발시켰다. 생성된 잔류물을 25mL의 탈이온수에 용해시키고, 10,000MW 컷오프 투석막(Pierce, Rockford Il, USA)에 놓았다. 상기 화합물을 24시간 동안 물로 투석하고(3회 완충액 교환) 나서, 냉동건조시켜 보호된 4가의 PEG 생성물을 얻었다. 생성된 흰색 고체를 60mL 디클로로메탄에 용해시키고, 20mL의 무수 TFA로 처리하였다. 2일 동안 실온에서 교반한 후에, 반응 혼합물을 감압하에서 증발시키고 나서, 상기한 바와 같이 용해시켜 투석시켰다. 투석된 물질을 냉동건조시키고 나서, 상기에 기술한 바와 같이 이온교환 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 흰색 고체인 4가의 생성물을 얻었다. 유사한 방법으로 1~6의 숙신이미딜글루테레이트 부분을 포함하는 PEG가 단작용성 또는 다작용성 펩티드 구조체를 제조하는데 사용될 수 있다.
표 4a: X 1 펩티드들
Figure 112006035208390-PCT00014
표 4b: Y 1 펩티드들
Figure 112006035208390-PCT00015
실시예 6: B1 활성에 대한 펩티드 길항제 및 PEG -결합 펩티드 길항제의 시험관내 B1-억제 활성
B2 활성과 비교되는 B1 활성을 선택적으로 억제할 수 있는 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들이 하기 A, B, 및 C에 기술된 바와 같은 분석을 사용하여 확인되었다.
A. 칼슘 플럭스(flux)를 사용하는 인간 B1 수용체 기능의 시험관내 분석:
Gq가 연결된 B1 수용체의 활성화로 인하여 세포내의 칼슘이 증가한다. 그러므로, 칼슘 민감성 광단백질인 에쿼린(aequorin)이 B1 수용체 활성의 지표로서 사용될 수 있다. 에쿼린은 발색단 공동인자인 코엘렌테라진(coelenterazine)과 연결될 경우, 생물발광 복합체를 형성하는 21-kDa의 광단백질이다. 이 복합체에 칼슘이 결합된 후에, 코엘렌테라진의 산화반응으로 인하여 아포에쿼린, 코엘렌테르아미드, CO2 및 통상의 발광기로 검출할 수 있는 빛이 생성된다.
안정한 CHO D-/인간 B1 수용체(GenBank Accession no. AJ238044)/에쿼린 세포주가 확립되고, 상기 세포들은 1:1 비율의 DMEM 및 HAM F12(Gibco 11765-047), 고(high) 글루코오스(Gibco 11965-084), 10% 열-불활성화 투석 혈청(Gibco 26300-061), 1X 비-필수 아미노산들(Gibco 11140-050), 1X 글루타민-펜-스트렙(Gibco 10378-016), 및 하이그로마이신, 300μg/ml (Roche 843555)를 포함하는 스피너병에 든 현탁액중에서 유지되었다. 발광기 분석의 15~24시간 전에, 25,000세포들/웰((2.5E6 세포들/10ml/플레이트)을 96-웰의 블랙편(black-sided) 투명바닥 분석 플레이트((Costar #3904)에서 평판 배양했다.
배지를 웰로부터 제거하고, 30mM HEPES(pH 7.5)가 함유된 혈청이 제거된 HAM's F12 60㎕와 15μM의 코엘렌테라진(Coelenterazine h Luciferin #90608; Assay Designs(Ann Arbor, MI))으로 치환한다. 그리고 나서 플레이트를 1.5~2시간 동안 배양한다. 길항제 화합물들의 1:3 또는 1:5 희석물을 포함하는 10점 IC50 화합물 플레이트들 및 작용제 활성화제 플레이트(20nM des-Arg10-Kallidin 최종 농도, EC80)가 pH 7.5의, 30mM HEPES가 함유된 Ham's F12를 사용하여 제조된다. 코엘렌테라진 배양 후에, 자동화 플래쉬-발광기 플랫폼이 세포 플레이트로 B1 길항제 화합물들을 분배하기 위해서 사용되었고, 세포 플레이트의 아래에 위치한 CCD 카메라는 화합물들에 길항제 활성이 있는지 여부를 결정하기 위해서 5초 간격으로 세포 플레이트의 12개 이미지를 찍었다. 그 후에 hB1 작용제, des-Arg10-Kallidin이 세포 플레이트에 첨가되고, 길항제(들)의 IC50을 결정하기 위해서 다른 12개의 이미지들이 기록된다.
B. 칼슘 플럭스를 사용하는 hB2 수용체의 시험관내 분석:
hB2 수용체 활성화에 의해서 유도된 세포내 칼슘 플럭스는 형광계 이미징 플레이트 리더(fluorometric imaging plate reader ; FLIPR)상에서 PerkinElmer (Wellesley, MA;catalog no.: RBHB2C000EA)로부터 구입한 hB2 재조합 세포주(CHO-K1)를 사용하여 분석된다. 세포들은 Ham's F12 Nutrient Mixture(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA; catalog no.: 11765-047), 10% Fetal Clone II 소혈청(HyClone, Logan, UT;catalog no.: SH3006603), 1mM 소듐 피루베이트(100mM 저장액, Invitrogen Corp., catalog no.: 12454-013), 및 0.4mg/ml Geneticin(G418; 50mg/ml 활성 geneticin, Invitrogen, catalog no.: 10131-207)을 포함하는 T225 플라스크에서 배양된다. 배양 배지를 하루 걸러 바꿔준다. FLIPR 분석 24시간 전에, hB2/CHO 세포들을 PBS(Invitrogen)로 1회 세척하고, 10ml의 Versene(1:5000, Invitrogen, catalog no.: 15040-066)을 각각의 플라스크에 첨가한다. 37℃에서 5분 배양한 후에, Versene은 제거되고, 세포들을 플라스크에서 분리시켜 배양 배지에 재현탁시킨다. 세포들의 수를 세고, 25,000세포들/웰을 96-웰 블랙편 투명바닥 분석 플레이트들(Costar, Acton, MA; catalog no.:3904)에서 평판 배양시킨다. 세포들을 37℃의 CO2 배양기에서 밤새 배양시킨다.
배지를 세포들로부터 흡입제거하고, 65μl의 염료-충전 완충액으로 치환한다. 충전 완충액은 10%[w/v] 플루론산을 포함하는 DMSO 중에 용해된 0.5mM의 Fluo-4 AM (Molecular Probes, Eugene, OR)의 저장 용액을, 0.1% BSA, 20mM HEPES, 및 2.5mM 프로베네시드(프로베네시드는 음이온 이동 단백질의 활성을 억제하여, 세포들 내에서 염료 충전을 향상시킨다)를 포함하는 Clear Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 1μM 농도로 희석시키므로써 제조된다. 세포들은 실온에서 1시간 동안 염료로 충전된다. 과량의 염료는 분석 완충액으로 2회 세포를 세척하므로써 제거된다. 분석 완충액은 20mM HEPES, 0.1% BSA, 및 2.5mM 프로베네시드를 포함하는 행크스 균형 염용액(HBSS)으로 이루어진다. 세척 싸이클 후에, 각각의 웰에는 100μL 부피가 남아 있고, 플레이트는 FLIPR 시스템에서 쉽게 분석된다. 1점(최종 농도가 10μM) POC 길항제 화합물 플레이트 또는 길항제 화합물들의 1:3 또는 1:5 희석물이 포함되어 있는 10점 IC50 화합물 플레이트들 및 작용제 활성화제 플레이트(0.3nM 브래디키닌 최종 농도, EC80)가 분석 완충액을 사용하여 제조된다. 세포 플레이트 및 화합물 플레이트들이 FLIPR상에 놓여지고, 분석하는 동안 세포 플레이트의 모든 96웰들로부터 형광 판독이 동시에 수행된다. 10개의 1초 판독들이 얻어져서 각각의 웰에 대해서 안정한 베이스라인을 확립하고, 그 후에, B1 길항제 플라이트로부터 25μL가 빠르게(50μL/초) 첨가된다. 형광 신호는 전체 3분 동안 1초(1분) 다음에 6초(2분) 간격으로 측정되어, 어떤 화합물이 작용제 활성을 갖는지 여부를 결정한다. 그 후에 B2 작용제인 브래디키닌이 세포 플레이트에 첨가되고, 추가의 3분이 10μM(POC 플레이트들)에서의 억제 퍼센트 또는 길항제의 IC50를 결정하기 위해서 기록된다.
hB1 에쿼린 분석에서 테스트된 비히클- 또는 PEG-결합 펩티드들에 대한 IC50 값은 평균하여 큰 PEG 폴리머들에 결합된 펩티드의 약간 감소된 시험관내 활성을 나타낸다. 예컨대, 서열번호 36으로 표시된 펩티드 및 서열번호 37로 표시된 그것의 아세틸화 형태는 hB1 수용체에서 각각 3.0nM (+/- 5nM, n=8) 및 3.2nM (+/- 3.2nM, n=9)의 IC50값을 갖는다. 그러나 여기에 기술된 PEG에 결합된 동일한 펩티드는 IC50에 있어서 대략 10배 증가되었다는 것이 증명되었다. 펩티드의 고유의 형태, 아세틸화 형태 및 PEG-결합 형태는 hB2 FLIPR 분석에 있어서 10μM까지 불활성이었다. hB1 또는 hB2 수용체에 대해 작용제 활성을 나타낸 화합물은 없었다.
C. hB1 수용체 결합 펩티드들의 조직에 기초한 시험관내 분석들:
본 발명의 펩티드들 및/또는 비히클-결합 펩티드들의 브래디키닌 B1 수용체에 대한 길항제 활성 및 선택성은 하기 기술된 시험관내 인간 배꼽 정맥(HUV)의 수축성 분석으로 결정되었다.
내피-박탈 혈관들을 mM로 NaCl 118.0, KCl 4.7, MgSO4 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25.0 및 글루코오스 11.0(pH 7.4)의 조성을 갖고, 산소처리되고(95% O2 및 5% CO2) 예열된(37℃) 표준 생리 식염수를 포함하는 20-ml의 기관(organ) 용액에 현탁하였다. K+ 농도가 높은 용액들(80mM KCl)은 NaCl과 KCl를 등가 치환하므로써 제조되었다. 또한 Hoe 140(lμM), mergetpa(1μM) 및 captopril(10 μM)을 각각 B2 수용체들을 차단하기 위해서, 그리고 펩티드 분해를 방지하기 위해서 실험 내내 존재시켰다.
조직들을 등척성 긴장 기록을 위해 응력 변환기에 연결된 후에, 최적의 휴식 긴장하에서 충분한 시간동안 평형화시켰다. 실험들은 8개의 기관 용액을 포함하는 반자동화 분리 기관 시스템들을 사용하여 수행되어, 다중채널 데이터를 획득하였다. 처음에 조직들을 K+ 농도가 높은 용액(80mM KCl)에 노출시켜 대조구 수축을 얻었다. 세척 및 그 후의 60분의 평형기간이 지나서, Lys-desArg9-BK에 노출되기 15분 전에 첨가된 테스트 화합물들 또는 참고 길항제 Lys-desArg9[Leu8]-BK(테스트 조제물들)의 부재(대조군 조성물들) 또는 다양한 농도의 존재하에서, 조직들을 점차 증가하는 누적 농도의 참고 작용제 Lys-desArg9-BK에 노출시켜, 농도-반응 커브를 얻었다. Lys-desArg9-BK에 대한 농도-반응 커브는 각각의 조제물에서 얻어졌다.
측정된 파라미터는 각각의 작용제의 농도에 의해서 유도된 긴장의 최대 변화이고, 결과들은 KCl에 대한 대조군 반응들의 퍼센트로서 표시되었다. 작용제의 EC50 값(최대 반응의 1/2을 일으키는 농도)은 그것의 농도-반응 커브의 선형 회귀 분석에 의해 계산되었다. 테스트 화합물들 및 Lys-desArg9[Leu8]-BK의 길항제 효과는 pA2 값(작용제 농도-반응 커브의 두배의 오른쪽 이동을 일으키는 -log 농도)과 관련되어 평가되었고, pA2값은 Van Rossum(Van Rossum, J.M., 누적 투여량-반응 커브들. II. 분리된 기관들의 투여량-반응 커브 작성 및 의약 파라미터들의 평가 기술. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 143:299-330 (1963))에 따라 계산되었다. pA2 값은 작용제 농도-반응 커브의 상당한 오른쪽 이동을 야기시킨 길항제 농도만을 사용하여 계산되었다. pA2 값은 3개의 결정값들의 평균 ±s.e.m.으로서 주어진다. 통계상 중요한 차이들은 Student's 테스트를 사용하여 결정되었고, p 값 < 0.05은 통계학적으로 중요하게 고려되었다.
D. 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 시험관내 B1-억제 활성
B1 활성의 억제제로서 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 유효성(즉, B1 "중화")은 B1 자극된 CGRP 및 물질 P방출 및 척수신경절(Dorsal Root Ganglion;DRG) 뉴런 배지에 있어서의 칼슘 신호를 막을 수 있는 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 능력을 측정하므로써 평가될 수 있다.
척수신경절 뉴런 배지. 시기를 조정하여 임신된 후, 마취시킨 스프래그-돌리 쥐(Sprague-Dawley rats)의 자궁으로부터 외과적으로 제거된, 태내에서 19일 된(E19) 쥐들의 모든 척수 체절로부터 척수신경절을 무균상태에서 하나씩 절단한다(Charles River, Wilmington, MA). DRG는 5%의 열-비활성화된 말 혈청(GibcoBRL)을 포함하는 빙냉된 L-15 배지(GibcoBRL, Grand Island, NY)내에 수집되고, 느슨한 연결 조직 및 혈관이 제거된다. DRG를 pH가 7.4인 Ca2 + 및 mg2 +가 없는 Dulbecco 포스페이트 완충식염수(DPBS)(GibcoBRL)로 2회 헹군다. 그 후에 DRG를 파파인 해리 시스템(papain dissociation system)(Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)을 사용하여 단일 세포 현탁액내로 해리시킨다. 요약하면, DRG는 15분 동안 37℃에서 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)중의 파파인 20U/ml를 포함하는 소화용액중에서 배양된다. 세포들은 MEM/Ham's F12, 1:1, 1mg/ml 오보뮤코이드(ovomucoid) 억제제 및 1mg/ml 오브알부민, 및 0.005% 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase)를 포함하는 해리배지에서 불다듬질된 파스퇴르 피펫(fire-polished Pasteur pipettes)을 통한 분쇄에 의해 해리된다. 해리된 세포들은 5분 동안 200 x g에서 펠릿화되고, 1mg/ml 오보뮤코이드 억제제, 1mg/ml 오브알부민 및 0.005% DNase를 포함하는 EBSS에 재-현탁된다. 세포 현탁액을 6분 동안 200 x g에서 10mg/ml 오보뮤코이드 억제제, 10mg/ml 오브알부민을 포함하는 구배용액을 통하여 원심분리하여, 세포 파편을 제거하고, 그 다음에 88-μm 나일론 메쉬(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)를 통해 여과하여 세균 덩어리를 제거한다. 세포 수는 혈구 계산기에 의해서 결정되고, 세포들은 완전 배지에서 10 x 103세포들/웰의 비율로 폴리-오르니틴 100㎍/ml(Sigma, St. Louis, MO) 및 마우스 라미닌 1㎍/ml(GibcoBRL)으로 코팅된 96-웰 플레이트에 시드(seed)된다. 완전 배지는 최소 필수 배지(MEM) 및 Ham's F12, 1:1, 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100㎍/ml), 및 10% 열-비활성화된 말 혈청(GibcoBRL)으로 이루어진다. 배양물은 37℃에서, 5% CO2 및 100% 습도에서 유지한다. 비-뉴런 세포들의 성장을 조절하기 위해서, 5-플루오로-2'-디옥시우리딘(75μM) 및 우리딘(180μM)이 배지에 포함된다.
B1 및 항-B1 펩티드들 및/또는 항-B1 결합 펩티드들에 의한 처리.
평판배양 2시간 후에, 세포들을 10ng/ml(0.38nM) 농도에서 재조합 인간 β-B1 또는 재조합 쥐 β-B1로 처리한다. 일련의-희석된 항-B1 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 포함하는 양성 대조군들은 각각의 배양 플레이트에 도포된다. 테스트 펩티드들 또는 테스트 결합 펩티드들(예컨대, 실시예 1로부터)은 3.16배의 일련의 희석액을 사용하여 10가지의 농도로 첨가된다. 모든 샘플들을 배양물에 첨가하기 전에 완전 배지에 희석시킨다. 배양시간은 일반적으로 VR1 발현의 측정 전 대략 40시간이다.
DRG 뉴론에서 VR1 발현의 측정.
배양물을 15분 동안 행크스 균형 염 용액 중의 4% 파라포름알데히드로 고정하고, Superblock(Pierce, Rockford, IL)으로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 Tris.HCl (시그마)-완충 식염수(TBS) 중의0.25% Nonidet P-40(Sigma)로 투과시킨다. 배양물을 0.1% Tween 20(Sigma)을 포함하는 TBS로 1회 헹구고, 실온에서 1시간 30분 동안 토끼 항-VR1 IgG(Amgen에서 제조됨)로 배양하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 Eu-라벨 항-토끼 제2 항체(Wallac Oy, Turku, Finland)로 배양된다. 각각의 항체 배양 후에, TBS로 세척(천천히 흔들면서 5분씩 3회)을 행한다. 강화 용액(150ml/웰, Wallac Oy)을 배양물에 첨가한다. 그 후에 시간-결정 형광계(Wallac Oy)로 형광 신호를 측정한다. 비히클-결합 펩티드들로 처리된 샘플들 중에서의 VR1 발현은 0~1000ng/ml로부터의 B1 적정의 표준 커브와 비교하므로써 결정된다. DRG 뉴론에서의 VR1 발현에 대한 B1 효과의 퍼센트 억제(최대 가능한 억제와 비교된)는 B1 처리되지 않은 대조군과 비교하므로써 결정된다.
PEG-결합 펩티드 B1 길항제의 각각에 대해 불충분한 수용체 결합 및 기능 활성은 첨가된 PEG 그룹의 사이즈와 직접 연관되어 있고, 그 범위는 효능에 있어서 5~200배의 감소에 이른다. ~5~7개의 잔기들을 갖는 폴리글리신 링커들은 기능성을 잘 유지하는 반면, 좀더 긴 링커들은 개선을 거의 나타내지 않거나("유연한 링커"), 또는 활성에 치명적인 것으로 판명된다("단단한 링커"). 최종적으로, 표 8은 본 발명에 사용되는 다양한 다른 PEG-결합 펩티드 B1 길항제를 예시한다.
표 8: 펩티드 및 PEG화된 펩티드 길항제에 대한 인간 B1 수용체 ( hB1 )에서의 결합 친화성( Ki ) 및 기능적 효능( IC 50 )
Figure 112006035208390-PCT00016
a: 반응도 4에 기술된 1점 공정에 의해 생성;
b: N-말단 잔기에 있는 환원 아민화, 엡실론 아민;
c: N-말단 잔기에서 아실화, 엡실론 아민;
d: N-말단 잔기에서 아실화, 알파 아민
실시예 7: 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 안정성 결정
A. 쥐의 신장 브러시 보더 미세융모 분석
신장 막 조직은 Booth 등(Biochemical Journal, 142:575 (1974))에 의해 개시된 방법에 따라 제조된다. 단백질 농도는 Bradford의 방법(Anal. Biochemistry., 72:248~254 (1976))에 의해 결정된다.
B. 쥐 또는 인간 폐 S9 균질물 분석
쥐 또는 인간 폐는 Skidgel 등(Biochemical Pharmacology 33: 3471 (1984))에 의해 기술된 바와 같이 제조된다.
테스트 화합물들은 PBS 용액(pH=7.1) 중의 1mM 농도로 제조된다. 테스트 화합물들을 공정 A 또는 B로부터의 조직 조제물(최종 단백질 농도는 2mg/ml)에 첨가하고, 37℃에서 배양한다. 다양한 시간 지점에서, 단백질은 아세토니트릴, 아세토니트릴 중의 0.1M HCl 또는 물중의 10% TFA로 침전된다. 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 여과물을 0.1μM 막을 통해서 더 여과한다. 침전물을 질량 분광 검출과 함께 역상 HPLC(4.6 x 300mm Novapak HR C18(Waters Corporation, Milford, MA) 유속 = 1mL/분, 10% ACN(0.1% 포름산)-90% 물(0.1% 포름산) 으로부터 50% ACN(0.1% 포름산)-50% water (20분에 걸친 0.1% 포름산)까지의 선형구배)에 의해 분석한다. 내부 표준에 대한 시간 T에서의 테스트 화합물의 농도는 일차 손실 함수(first order loss function)로 고정된다([화합물]t = [화합물]0 (1 - e(- kt )); "[화합물]0" 및 "[화합물]t"는 각각 시간 0에서의 테스트 화합물의 농도 및 샘플을 회수한 시간에서의 테스트 화합물의 농도이고; 변수 "t"는 분석을 위해서 샘플을 회수한 시간이고; 그리고 k는 테스트 화합물 농도 변화의 속도이다). 변수 "k"는 JMP 통계 소프트웨어 패키지에 의해 공급된 비선형 회귀 접근법을 사용하므로써 결정된다. 테스트 화합물 농도가 시간이 지남에 따라 감소하면, "k" 값은 마이너스이다. 반감기는 다음의 식: T1/2= (Ln2)/k를 사용하는 "k"의 모델 유도값으로부터 계산된다.
실시예 8: 쥐 및 원숭이 통증 모델들에 있어서 항-B1 펩티드들 및 비히클-결합 항-B1 펩티드들의 생체내 항-침해수용 활성
A. 쥐 신경병적 통증 모델.
수컷 스프래그-돌리 쥐들(200g)을 이소플루란 흡입 마취로 마취시키고, Kim 및 Chung(쥐에 있어서 단편 척수 신경 결찰에 의해 생성된 주변 신경장애를 위한 실험 모델. Pain 50:355-363, (1992))에 의해 처음으로 기술된 바와 같이, L5 및 L6 수준의 왼쪽 요추 척수 신경을 좌골 신경으로 들어가기 전의 척수근신경절 말단에 단단하게 결찰시킨다(4-0 견사 봉합사). 절개부를 봉합하고, 쥐를 회복시킨다. 이러한 과정은, (신경 손상 부위에 대해 동측인) 영향받은 발이 와이어-메쉬 관찰 케이지를 통해 발의 발바닥 표면(풋패드(footpad) 사이)에 대해서 수직으로 적용된 점진적인 자극(4.0~148.1mN 범위의 von Frey 필라멘트)에 반응하여 움츠러드는 압력을 기록하므로써 분석되는 바와 같이, 왼쪽 뒷발에서의 기계적인(촉각할 수 있는) 이질통증을 초래한다.
발이 움츠러드는 한계점(PWT)은 자극 강도를 연속적으로 증가 및 감소시키고, Chaplan, S.R., 등(쥐의 발에 있어서의 촉각할 수 있는 이질통증의 정량 평가. J. Neurosci. Meth, 53:55~63 (1994))에 기술된 바와 같이, 딕슨 비-파라미터 테스트를 사용하여 움츠림 데이터를 분석하므로써 결정되었다.
정상적인 쥐들과 위조 수술 쥐들(신경이 분리되었지만 결찰되지는 않음)은 적어도 148.1mN(15g과 동등)의 압력에서 반응 없이 견딘다. 척수 신경이 결찰된 쥐들은 영향을 받은 발에 대한 4.0mN(0.41g과 동등)만큼의 약간의 압력에 반응한다. 쥐들이 운동근육 기능장애(예컨대, 발을 질질 끌고 절뚝거리는)를 나타내지 않고, 그들의 PWT가 39.2mN(4.0g과 동등) 이하인 경우에만 연구에 포함된다. 수술후 적어도 7일 후에, 피하주사를 사용하여 테스트 펩티드들 또는 테스트 비히클-결합 펩티드들(일반적으로 각각 약 1mg/kg 및 약 60mg/kg의 스크리닝 투여량) 또는 대조 희석제(PBS)로 쥐들을 처리하고, 그 이후 PWT는 7일 동안 매일 결정되었다.
B. 쥐의 CFA 염증성 통증 모델.
수컷 스프래그-돌리 쥐들(200g)을 이소플루란 흡입 마취로 약하게 마취시키고, 왼쪽 뒷발에 완전한 프룬드 보조제(CFA) 0.15ml를 주입한다. 이러한 과정은, 영향을 받은 발이 와이어-메쉬 관찰 케이지를 통해 발의 발바닥 표면(풋패드 사이)에 대해서 수직으로 적용된 점진적인 자극(4.0~148.1mN 범위의 von Frey 필라멘트)에 반응하여 움츠러드는 압력을 기록하므로써 왼쪽 뒷발에서의 기계적인(촉각할 수 있는) 이질통증을 초래한다. PWT는 자극 강도를 연속적으로 증가 및 감소시키고, Chaplan 등(1994)에 기술된 바와 같이, 딕슨 비-파라미터 테스트를 사용하여 움추림 데이터를 분석하므로써 결정되었다. 쥐들은 운동근육 기능장애(예컨대, 발을 질질 끌거나 절뚝거리는) 또는 피부 찢어짐을 나타내지 않고, 그들의 PWT가 39.2mN(4.0g과 동등) 이하인 경우에만 연구에 포함된다. CFA 주사 이후 적어도 7일이 지난 다음, 피하주사를 사용하여 테스트 펩티드들 및/또는 테스트 비히클-결합 펩티드들(일반적으로 60mg/kg의 스크리닝 투여량) 또는 대조 용액(PBS)으로 처리하고, 그 이후 PWT는 7일 동안 매일 결정된다. 평균 PWT는 다음의 식을 사용하여 최대 가능 효과의 퍼센트(%MPE)로 전환되었다:%MPE = 100 × (처리된 쥐들의 PWT - 대조군 쥐들의 PWT)/(15 - 대조군 쥐들의 PWT). 따라서, 15g의 컷오프 값(148.1mN)은 MPE의 100%와 동등하고, 대조군 반응은 0% MPE와 동등하다.
본 발명의 바람직한 펩티드들 및 비히클-결합 펩티드들은 각각 약 1mg/kg 및 약 60mg/kg의 스크리닝 투여량에서 PD 관계로 인해서 침해수용 방지(항-침해수용)효과를 나타낼 것이 기대된다.
B. 사바나 원숭이 LPS 염증 모델.
B1 활성의 억제제로서의 펩티드들 및/또는 결합 펩티드들의 유효성은, 본원에 참고문헌으로 통합된 deBlois 및 Horlick (British Journal of Pharmacology. 132:327~335 (2002))에 기술된 바와 같이, 필수적으로 B1 작용제로 부분적으로 처리된 수컷 사바나 원숭이들(Cercopithaecus aethiops St Kitts)에서 평가될 수 있다.
본 발명의 PEG-결합 펩티드 길항제들이 B1에 의해 유도된 부종을 억제하는지 여부를 결정하기 위해서, 하기 기술된 연구들이 Caribbean Primates Ltd. 실험 농장(St Kitts, West Indies)에서 수컷 사바나 원숭이들(Cercopithaecus aethiops St Kitts)에 대해 수행되었다. 방법들은 CR-CHUM 및 Caribbean Primates Ltd.(St Kitts, West Indies)의 Animal Care Committees(Montreal, Canada)에 의해 검토되고 수용되었다. 6.0±0.5kg(n=67) 무게의 동물들을 마취시키고(50mg 케타민 kg-1), 복재정맥을 통해서 LPS(90㎍kg-1) 또는 식염수(1ml)의 1회 정맥내 주사로 사전처리하였다.
1. 염증 연구
키닌-유도 부종은 복부 피부 주름 분석(Sciberras 등, 1987)에 의해 평가되었다. 즉, 마취된 원숭이들에게는 캡토프릴(captopril)(분석하기 30분 전에 1mg kg-1 )을 주사하였다. dKD, BK 또는 비히클(Ringer's 락테이트 100㎕중 2mM 아마스타틴)의 1회 피하주사를 배 부분에 주사하고, 측정 캘리퍼를 사용하여 피부 주름의 두께증가를 30~45분 동안 모니터하였다. 결과를 피하주사 전과 후의 피부 주름 두께 사이의 차이로 나타냈다. 캡토프릴과 아마스타틴은 각각 카르복실-말단 및 아미노-말단에서의 키닌의 분해를 감소시키기 위해서 사용되었다.
길항제 실드(SCHILD) 분석
dKD(1~100nmol)-유도 부종에 대한 투여량-반응 관계는 다양한 농도의 PEG-펩티드 길항제의 부재 또는 존재하에서 24시간 후-LPS로 결정되었다. BK(30nmol)는 양성 대조군으로서 사용되었다.
길항제 시간 경과
길항제에 의한 억제의 시간 경과는 큰 알약 투여후 4시간, 24시간, 48시간, 72시간 및/또는 96시간 후에 결정되었다. BK(30nmol)는 양성 대조군으로서 사용되었다.
약물
케타민 하이드로클로라이드, LPS, 아마스타틴 및 캡토프릴은 Sigma(MO, U.S.A.) 제품이었다. 모든 펩티드들은 Phoenix Pharmaceuticals(CA, U.S.A.) 제품이었다.
통계
값들은 평균(s.e. 평균)의 ± 표준 오차의 평균으로서 표시된다. 부종의 연구에 있어서, 피부 주름의 주사 전 두께는 피하 주사 후의 값으로부터 뺀 것이었다. 곡선 맞춤 및 EC50 계산값은 Apple Computers의 Delta Graph 4.0 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 변수의 2방식 분석에 의해 비교되었고, 이어서 Bonferroni 보정이 적용되는, 짝을 이루지 않은, one tail Student's t-테스트에 의해 비교되었다. p<0.05는 통계학상으로 유의한 것으로 간주되었다.
사바나 원숭이에 대한 LPS 투여는 부종 형성 분석에 있어서 그들의 민감성을 0 수준으로부터 B1 수용체 작용제까지 증가시켰다. 대비적으로, B2 수용체 작용제 BK에 대한 반응은 영향을 받지 않았다.
놀랍게도, 동일한 펩티드 유사체인 대표적인 5kD PEG-결합 펩티드와 20kD PEG-결합 펩티드의 10mg/kg의 1회 피하 투여량은 이미-생성된 B1 작용제에 의해 유도된 염증성 반응을 경감시키고, 각각 3일 및 4일 동안의 연속적인 매일의 작용제 공격을 억제하는데 충분하였다. 96시간까지 B1 공격으로 인한 속성 내성은 관찰되지 않았다. 또한 효과는 B2보다 B1에 대해 선택적인 것으로 결정되었다. 게다가, 빠른 개시와 효능이 1.25시간까지 두 분자들에 있어서 대등하였으나, 5K PEG-결합체는 결합되지 않은 펩티드(즉, 천연 펩티드)보다 dKD 공격에 대한 반응에서 더 오래 부종을 억제했다.
실시예 9: 쥐의 약물 동력학 연구들
여러가지 펩티드들 또는 결합 펩티드들(수성 배지에 있는)이 정맥내(iv) 또는 피하(sc) 경로를 통해서 스프래그-돌리 쥐들에게 큰 알약으로서 투여되었다. 혈액 샘플들은 헤파린화 튜브들내로 여러 시점(예컨대, 주사 후 0분, 15분, 30분 및/또는 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 120시간, 240시간, 및/또는 320시간)에서 수집되었다. 혈장은 원심분리에 의해서 펠릿화된 세포들로부터 제거되어, 동결되거나 또는 즉시 가공처리되었다. 상기 혈장 중의 목적 화합물은 분석-특이적 LC-MS/MS 또는 ELISA 방법에 의해서 정량되었다. 정화값(CL), 외관 정화값(CL/F), 분배의 부피(Vss), 평균 체류시간(MRT), 커브 아래의 면적(AUC), 및 말단 반감기(t1 /2)와 같은 여러가지 표준 약물 동력학적 파라미터들이 비-구획(non-compartmental) 방법에 의해 계산되었다(예컨대, 표 9 참고).
표 9. 쥐에서의 펩티드 및 PEG화된 펩티드 B1 길항제들의 약물 동력학 연구
Figure 112006035208390-PCT00017
a: 반응도 4에 기술된 1점 과정에 의해 생성;
b: N-말단 잔기에서의 환원 아민화, 엡실론 아민;
c: 1 mpk sc;
d: N-말단 잔기에서의 아실화, 엡실론 아민;
e: 0.5 mpk sc;
f: N-말단 잔기에서의 아실화, 알파 아민;
g: 30 mpk sc; h: 1 mpk iv; 및 i: 3 mpk iv
상기 기술한 바와 같이, 본 발명에 있어서 여러가지 변형들이 이루어질 수 있다는 것은 분명할 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 다음의 청구범위에서 규정된다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Inc. <120> ANTAGONISTS OF THE BRADYKININ B1 RECEPTOR <130> A-836B <140> PCT/US2004/034976 <141> 2004-10-22 <150> 60/538,929 <151> ZOO4-01-24 <150> 10/972,236 <151> 2004-10-21 <150> 60/513,913 <151> ZOO3-10-2Z <160> 60 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <Z11> 9 <212> PRT <Z13> Human <400> 1 Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> HUMAN <400> 2 Lys Arg Pro Pro Gly Phe ser Pro Phe Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400> 3 Met Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> HUMAN <400> 4 Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400> 5 Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400> 6 Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DArg <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Thi <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as DTic <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Oic <400> 7 Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <21Z> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DArg <220> <221> misc_feature <22Z> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <22O> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Thi <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as DTic <220> <2Z1> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Oic <400> 8 Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFIcIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <22Z> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DArg <220> <2Z1> misc_feature <22Z> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <2Z1> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Thi <2ZO> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as DHpe <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Oic <400> 9 Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <Z20> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <22Z> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as MePhe <220> <2Z1> mis_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as D-Beta-NaI <400> 10 Leu Leu Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <2ZO> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DArg <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <221> mis_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Igl <220> <221> mis(＝_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as DIgl <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Oic <400> 11 Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <2Z3> Xaa at position 7 is defined as Igl <2ZO> <221> misc_feature <222> (g)..(g) <223> Xaa at position 9 is defined as DIgl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Oic <400> 12 Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <22O> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 13 Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DArg <22O> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Igl <220> <221> misc_feature <22Z> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as Df5f <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <ZZ3> Xaa at position 9 is defined as Igl <400> 14 Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <21Z> PRT <213> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <2Z3> ARTIFICIAL <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <2ZZ> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <22O> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <22O> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 15 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Thz <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 16 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as 3Pal <22O> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined ascP9 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position lO is defined as Cpg <400> 17 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <Z12> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as 4Pal <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <Z23> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 18 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFIcIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as Cha <220> <221> misc_feature <222> (4>..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Cpg <400> 19 xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as 2Nal <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <Z23> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <Z23> Xaa at position 8 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Cpg <400>20 Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <2ZO> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <22O> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as Dtic <220> <Z21> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Cpg <400> 21 Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> mis_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as DLys <220> <221> misc_feature <Z2Z> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222>〔7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <22O> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 22 Xaa Leu Arg Pro Xaa GIy Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 23 <210> 10 <212> PRT <Z13> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <22O> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> mlsc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <Z23> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 23 Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is defined as Cha <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (I0)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 24 Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is defined as Abu <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <2Z3> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <2Z3> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 25 Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <2Z3> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 1 is defined as 2Nal <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <2Z1> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400>26 Leu Xaa Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400> 27 Cys Gly Gly Gly Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <223> ARTIFICIAL <400> 28 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <223> ARTIFIcIAL <400> 29 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 15 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400>30 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro 1 5 10 15 Leu <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> ARTIFIcIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 <400> 31 Cys Gly Xaa Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <22O> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is defined as MePhe <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is defined as D-Beta-NaI <400> 32 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Leu Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa at position ll is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is defined as CPg <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is defined as CPg <400> 33 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <22O> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 34 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <22O> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22O> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 is defined as Hyp <22O> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <22O> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is defined as Dtic <22O> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is defined as Cpg <400> 35 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 36 <211> 10 <ZIZ> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as CPg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as CPg <400> 36 Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is defined as Cpg <400> 37 Lys Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400> 38 Cys Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa at position ll is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is defined as CPg <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is defined as CPg <400> 39 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa at position ll is defined as Thz <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is defined as CPg <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is defined as Dtic <22O> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is defined as CPg <400> 40 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa at position ll is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 14 is defined as CPg <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is defined as CPg <400> 41 Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <400> 42 Gly Gly Gly Gly Gly Lys Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as D-Dab <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as CPg <400> 43 Xaa Lys Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as D-Dab <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at positiong is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 44 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at positon 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as CPg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(g) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at positon 10 is defined as Cpg <400> 45 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as Dorn <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 46 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as D-3'Pa1 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 47 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <21Z> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as D-3'Pa1 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 48 Xaa Leu Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as D-Lys <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is defined as D-2-Na1 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 49 Xaa Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTID <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is defined as D-2-Na1 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is defined as Hyp <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Cpg <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as Dtic <22O> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is defined as Cpg <400> 50 Leu Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa 1 5 10 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as DOrn <22O> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as Oic <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 51 Xaa Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as Oic <22O> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Me-Phe <22O> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 52 Xaa Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as 0ic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as D-Beta-NaI <400> 53 Xaa Leu Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position l is defined as DOrn <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is defined as Oic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 9 is defined as D-Beta-NaI <400> 54 Xaa Leu Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 10 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as Me-Phe <400> 55 Leu Arg Pro Pro Gly Phe Ser Xaa Ile 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 56 Leu Arg Pro Pro Gly Phe Ser Xaa Ile 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as Orn <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as Oic <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 57 Xaa Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <22O> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is defined as Orn <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as Oic <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 58 Xaa Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as Oic <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 59 Leu Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5 <210> 60 <211> 9 <21Z> PRT <213> ARTIFICIAL <22O> <223> ARTIFICIAL PEPTIDE <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is defined as Oic <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is defined as Me-Phe <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is defined as D-Beta-NaI <400> 60 Leu Arg Xaa Pro Gly Xaa Ser Xaa Ile 1 5

Claims (49)

  1. 화학식 F-[(X1)-(Y1)n]의 조성물, 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염:
    상기에서,
    X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
    F는 X1 또는 Y1에 공유결합된 비히클이고;
    L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
    n은 0~3이고; 그리고
    P1 및 P2는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다.
  2. 화학식 F'-Rz의 조성물 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염:
    상기에서,
    F'는 다원자가의 비히클;
    R은 각각 독립하여 -(X1)-(Y1)n 이고, 여기에서 R은 F'에 공유결합되며;
    X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
    L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
    n은 0~3이고;
    Z는 2~8이고; 그리고
    P1 및 P2는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제이다.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 P1 및 P2는 각각 독립하여 서열번호5~26, 43~60으로 표시되는 펩티드들 및 그것의 유도체들로 이루어진 펩티드들의 군으로부터 선택된 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 X1은 서열번호 27~41로 표시되는 펩티드들 및 그것의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 n은 1이고, P2는 서열번호 42로 표시되는 서열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 n은 0인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 P1 및 P2는 각각 독립하여 다음의 화학식으로 정의된 펩티드들로 이루어진 펩티드들의 군으로부터 선택되는 펩티드 길항제인 것을 특징으로 하는 조성물:
    NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
    여기에서,
    a0은 염기성 또는 중성 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산, 염기성 디-펩티드이거나, 또는 존재하지 않고;
    a1, a2, a3 및 a4는 각각 독립하여 염기성 또는 중성 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고;
    a6은 Ser이고;
    a5, a7, 및 a8는 각각 독립하여 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고, 다만 적어도 하나의 a5, a7 및 a8은 D- 또는 L-배열의 Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga 및 Nigb로부터 선택되고 ; 그리고
    a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존 재하지 않는다.
  8. 제 7항에 있어서, 상기
    a0은 염기성 아미노산 또는 염기성 디-펩티드이거나 또는 존재하지 않고;
    a1은 염기성 아미노산 또는 염기성 디-펩티드이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5 및 a8는 각각 독립하여 인다닐 아미노산들이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 D-인다닐 아미노산이고;
    a8은 Cpg이고; 그리고
    a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기
    a0은 Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, DLys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이거나, 또는 Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys 또는 DLys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 두개의 아미노산들로 이루어진 디-펩티드이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Cpg이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 DTic이고; 그리고
    a8은 Cpg인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 상기
    a0은 Lys-Lys이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Iglb이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 DIglb이고; 그리고
    a8은 Oic인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 상기
    a0은 DArg이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Igl이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 DIgl이고; 그리고
    a8은 Oic인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 P1 및 P2는 각각 독립하여 다음의 화학식으로 정의된 펩티드들로 이루어진 펩티드들의 군으로부터 선택된 펩티드 길항제인 것을 특징으로 하는 조성물:
    NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
    여기에서,
    a0은 존재하지 않거나 또는 염기성 아미노산 또는 염기성 디-펩티드이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Pro이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Me-Phe이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 D-β-NaI이고; 그리고
    a8은 Ile이다.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 L1은 서열번호 100~서열번호 105로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 3항에 있어서, 상기 L1은 서열번호 100~서열번호 105로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 치료적 유효량의 제 1항 또는 제 2항에 따른 조성물을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, B1 활성과 관련되거나 B1 활성에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 방법.
  16. 치료적 유효량의 제 3항에 따른 조성물을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, B1 활성과 관련되거나 B1 활성에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 또는 제 2항에 따른 조성물과 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 화학식 F-[(X1)-(Y1)n]의 조성물 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염:
    상기에서,
    X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
    F는 X1 또는 Y1에 공유결합된 PEG이고;
    L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
    n은 0~3이고; 그리고
    P1 및 P2는 각각 독립하여 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제들이다.
  21. 제 2항에 있어서, 상기 F'는 다원자가의 PEG인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상기 P1 및 P2는 각각 독립하여 서열번호 5~60으로 표시되는 펩티드들 및 그것의 유도체들로 이루어지는 펩티드들의 군으로부터 선택된 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제 21항에 있어서, X1은 서열번호 27~41로 표시되는 펩티드들 및 그것의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제 21항에 있어서, n은 0이고, Z는 2~8인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 Z는 4인 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 화학식 F-[(X1)-(Y1)n]의 조성물 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염:
    상기에서,
    X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
    F는 X1 또는 Y1에 공유결합된 비히클이고;
    L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
    n은 0~3이고; 그리고
    P1 및 P2는 각각 독립하여 다음의 화학식으로 정의된 펩티드들로 이루어진 펩티드들의 군으로부터 선택된 펩티드 길항제이고,
    NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
    여기에서,
    a0은 염기성 또는 중성 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산, 염기성 디-펩티드이거나, 또는 존재하지 않고;
    a1, a2, a3 및 a4는 각각 독립하여 염기성 또는 중성 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고;
    a6은 Ser이고;
    a5, a7, 및 a8는 각각 독립하여 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고, 다만, 적어도 하나의 a5, a7, 및 a8는 D- 또는 L- 배열의 Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga 및 Nigb로부터 선택되고; 그리고
    a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14 는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
  27. 화학식 F'-Rz의 조성물 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염:
    상기에서,
    F'는 다원자가의 비히클이고;
    R은 각각 독립하여 -(X1)-(Y1)n이고,
    여기에서 R 은 F'에 공유결합되어 있고;
    X1 및 Y1은 각각 독립하여 화학식 -L1-P1 및 -L2-P2의 펩티드들이고;
    L1 및 L2는 각각 독립하여 존재하지 않거나 또는 0~9개의 아미노산 잔기들을 갖는 링커들이고;
    n은 0~3이고;
    Z는 2~8이고; 그리고
    P1 및 P2는 각각 독립하여 다음의 화학식으로 정의된 펩티드들로 이루어진 펩티드들의 군으로부터 선택된 펩티드 길항제들이고,
    NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
    여기에서,
    a0은 염기성 또는 중성 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산, 염기성 디-펩티드이거나, 또는 존재하지 않고;
    a1, a2, a3 및 a4는 각각 독립하여 염기성 또는 중성 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고;
    a6은 Ser이고;
    a5, a7, 및 a8은 각각 독립하여 방향족, 지방족, 헤테로환족, 또는 지환족 아미노산들이고, 다만 적어도 하나의 a5, a7, 및 a8는 D- 또는 L- 배열의 Chg, Cpg, Igla, Iglb, Niga 및 Nigb로부터 선택되고; 그리고
    a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 천연 아미노산이거나 또는 존재하지 않는다.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
    a0은 염기성 아미노산, 염기성 디-펩티드이거나, 또는 존재하지 않고;
    a1은 염기성 아미노산이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5 및 a8은 각각 독립하여 인다닐 아미노산들이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 D-인다닐 아미노산이고;
    a8은 Cpg이고; 그리고
    a9, a10, a11, a12, a13, 및 a14는 각각 독립하여 아미노산이거나 또는 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
    a0은 Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, DLys로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys 또는 DLys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 두개의 아미노산들로 이루어진 디-펩티드이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Cpg이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 DTic이고; 그리고
    a8은 Cpg인 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
    a0은 D-Arg, 또는 Lys-Lys, DLys-Lys 및 DOrn-Lys로 이루어진 군으로부터 선택된 디펩티드이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Iglb이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 DIglb이고; 그리고
    a8은 Oic인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제 26항 또는 제 27항에 있어서,
    a0은 DArg 또는 Lys-Lys 디-펩티드이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Hyp이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Igl이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 DIgl이고; 그리고
    a8은 Oic인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    P1 및 P2는 각각 독립하여 다음의 화학식으로 정의된 펩티드들로 이루어진 펩티드들의 군으로부터 선택된 펩티드 길항제들이고,
    NH2-a0a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12a13a14-COOH
    여기에서,
    a0은 Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys, DLys로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이거나, 또는 Arg, D-Arg, Orn, D-Orn, Lys 또는 DLys로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 두개의 아미노산들로 이루어진 디펩티드이고;
    a1은 Arg이고;
    a2는 Pro이고;
    a3은 Pro이고;
    a4는 Gly이고;
    a5는 Me-Phe이고;
    a6은 Ser이고;
    a7은 D-β-NaI이고; 그리고
    a8은 Ile인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 L1은 서열번호 100~서열번호 105로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 링커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물:
    i. 5,000돌턴;
    ii. 20,000돌턴;
    iii. 24,000돌턴;
    iv. 30,000돌턴;
    v. 40,000돌턴; 및
    vi. 60,000돌턴.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 조성물은 시험관내에서 B1 수용체 활성에 대해 길항할 수 있고, 포유류의 생체내에서 치료적으로 허용가능한 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 치료적 유효량의 제 34항에 따른 조성물을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, B1 활성과 관련된 또는 B1 활성에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료, 예방, 또는 개선하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 34항에 따른 조성물 및 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  39. 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 제 34항에 따른 조성물의 사용.
  40. 서열번호 15~35, 39~54로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제, 그것의 유도체들, 및 그것의 생리학적으로 허용가능한 염.
  41. 서열번호 15~35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제, 또는 그것의 생리학적으로 허용가능한 염.
  42. 제 41항에 있어서, 서열번호 15~26으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  43. 제 40항에 있어서, N-말단 아미노산은 D-아미노산인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 N-말단 아미노산은 D-Dab, DLys, DArg, 및 DOrn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  45. 서열번호 15~35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제 및 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  46. 서열번호 15~35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 브래디키닌 B1 수용체의 펩티드 길항제 및 적어도 하나의 약제학적으로-허용가능한 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, B1 활성과 관련되거나 또는 B1 활성에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료, 예방, 또는 개선하는 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 제 19항에 따른 약제학적 조성물의 사용.
  49. 염증, 염증성 통증, 급성 통증, 치통, 등의 통증, 하부 등의 통증, 외상으로 인한 통증, 외과적 통증, 염증성 장질환, 천식, 및 알레르기성 비염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병 또는 상태의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 제 45항에 따른 약제학적 조성물의 사용.
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