DE69730332T2 - Alkyldextran-polyalcohol Arzneimittel-Komplexe - Google Patents

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Hiroshi Edogawa-ku SUSAKI
Masahiro Edogawa-ku IKEDA
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Eiji Edogawa-ku KUMAZAWA
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Description

  • Technischer Bereich
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Wirkstoff-Komplex, welcher nützlich ist als ein Medikament. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff-Komplex, in dem ein Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohol, d. h. ein Polysaccharid-Derivat und eine Wirkstoff-Verbindung wie anti-neoplastische Mittel oder anti-inflammatorische Mittel mittels eines Spacers aneinander gebunden sind.
  • Hintergrund
  • Anti-neoplastische Mittel, die zur Behandlung von soliden Krebsarten wie Lungenkrebs oder von Karzinomen der Verdauungsorgane und Blutkrebsarten wie Leukämie verwendet werden, werden systemisch verabreicht über Verabreichungswege wie intravenöser oder oraler Verabreichung, und anschließend werden sie zu den spezifischen Tumor-Stellen verteilt und inhibieren oder unterdrücken die Proliferation von Krebszellen, um ihre therapeutische Wirksamkeit auszuüben. Systemisch verabreichte anti-neoplastische Mittel werden jedoch aus dem Blut schnell in die Leber und die reticuloendothelialen Organe befördert, oder schnell in den Harn ausgeschieden, und entsprechend können ihre Blut-Konzentrationen manchmal verringert sein, so dass die Verteilung in die Tumor-Stellen unzureichend ist. Darüber hinaus weisen herkömmliche anti-neoplastische Mittel selber eine schlechte Verteilungsselektivität gegenüber Tumor-Stellen (Tumor-Selektivität) auf, und daher sind die anti-neoplastischen Mittel einheitlich über verschiedene Gewebe und Zellen des gesamten Körpers verteilt und agieren ebenfalls als Cytotoxine gegen normale Zellen und Gewebe, was in Problemen des Auftretens von Nebenwirkungen resultiert, z. B. Erbrechen, Fieber oder Haarausfall in extrem hohem Maße. Daher war es gewünscht, ein Mittel zu entwickeln zur wirksamen und selektiven Verteilung von anti-neoplastischen Mitteln zu Tumor-Stellen.
  • Als ein solches Mittel wurde ein Verfahren vorgeschlagen, in dem ein anti neoplastisches Mittel an ein Polysaccharid-Polymer gebunden ist, um das Verschwinden des anti-neoplastischen Mittels aus dem Blut zu verzögern und die Selektivität gegenüber Tumor-Geweben zu verstärken. Z. B. offenbart die japanische Patentschrift (KOKOKU) Nr. (Hei) 7-84481/1995 einen Wirkstoff-Komplex, in dem Daunorubicin, Doxorubicin, Mitomycin C, Bleomycin oder ähnliche mittels einer Schiff-Base oder einer Säureamid-Bindung in ein carboxymethyliertes Mannoglucan-Derivat eingebracht werden. Als das Mannoglucan-Derivat in der Erfindung werden ebenfalls carboxymethylierte Mannoglucan-Polyalkohole verwendet. Mannoglucan-Derivate sind jedoch zu sehr verzweigt und besitzen komplizierte Strukturen, und entsprechend war es schwierig, ein Produkt zu erhalten mit einheitlicher Qualität, welche geeignet zur Herstellung von Medikamenten ist.
  • Darüber hinaus offenbart die internationale Veröffentlichung WO94/19376 einen Wirkstoff-Komplex, in dem eine Peptid-Kette (Anzahl der Aminosäure-Reste: 1 bis 8) an eine Carboxyl-Gruppe eines Polysaccharids, welches Carboxyl-Gruppen besitzt, gebunden ist, und Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycin C, Bleomycin oder ähnliche sind darüber hinaus mittels einer Peptid-Kette gebunden. Für das Polysaccharid, das Carboxyl-Gruppen besitzt, sind Beispiele angegeben wie Polysaccharide, die inhärent Carboxyl-Gruppen in ihren Strukturen aufweisen (z. B. Hyaluronsäure) und Polysaccharide, welche inhärent keine Carboxyl-Gruppen in ihren Strukturen aufweisen (z. B. Pullulan, Dextran, Chitin etc.), in denen ihre Hydroxyl-Gruppen mit Carbonyl-Gruppen modifiziert sind durch Einbringung von Carboxy(C1-4)alkyl-Gruppen oder Bindung mit einer polybasischen Säure wie Malonsäure oder Bernsteinsäure mittels Veresterung. Die Wirkstoff-Komplexe sind strukturell dadurch charakterisiert, dass ein Wirkstoff wie Doxorubicin und der oben genannte Polysaccharid-Anteil mittels eines Spacers aneinander gebunden sind, und die Komplexe besitzen eine höhere anti-neoplastische Aktivität verglichen mit Doxorubicin und verringerte Toxizität und Nebenwirkungen.
  • Im Hinblick auf Technologien, welche sich auf Wirkstoff-Komplexe beziehen, die polyalkoholisierte Polysaccharid-Derivate als Wirkstoff-Beförderungsträger verwenden, sind einige Berichte verfügbar, z. B. "Forschungen zu Polysaccharid-Peptid-Doxorubicin-Komplexen – Korrelationen zwischen den Stabilitäten von Polysaccharid-Trägern im Blut und ihren anti-neoplastischen Aktivitäten" (Abstracts des 10. Meeting of the Japan Society of Drug-Delivery System, 279, 1994); "Forschungen zu Polysaccharid-Peptid-Doxorubicin-Komplexen – Pharmakokinetiken und anti-neoplastische Aktivität" (Abstracts des 9. Annual Meeting of Japanese Society for the study of xenobiotics, 292, 1994); Abstracts des 19. Seminars zu Trends in Forschung und Entwicklung (gehalten durch The Organization for Drug A D R Relief R&D Promotion and Product Review), D-9, 1995; und "Forschungen zur Wirkstoff-Beförderung zu einem Tumor-Gewebe mittels Polysaccharid-Trägern" (Abstracts des 12. Colloid and Interface Technology Symposiums; The Chemical Society of Japan, 51, 1995).
  • Offenbarung der Erfindung
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Wirkstoff-Komplex bereitzustellen, welcher in der Lage ist Stellen-selektiv einen aktiven Bestandteil wie antineoplastische Mittel oder anti-inflammatorische Mittel zu Tumor-Stellen oder ähnlichem zu befördern. Genauer gesagt besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung darin, einen Wirkstoff-Komplex bereitzustellen, welcher eine Wirkstoff-Verbindung wie antineoplastische Mittel oder anti-inflammatorische Mittel als eine partielle Struktur enthält, und welcher für einen langen Zeitraum im Blut gespeichert werden kann, und welcher darüber hinaus Stellen-selektiv die Wirkstoff-Verbindung zu Tumor-Stellen oder inflammatorischen Stellen befördern kann. Darüber hinaus besteht ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Herstellung des Wirkstoff-Komplexes, welcher die zuvor genannten Merkmale besitzt, bereitzustellen.
  • Um das zuvor genannte Ziel zu erreichen, versuchten die vorliegenden Erfinder, den in der Internationalen Veröffentlichung WO94/19376 offenbarten Wirkstoff-Komplex zu verbessern. Als ein Ergebnis fanden sie heraus, dass wenn ein Dextran-Derivat, welches durch die Carboxy(C1-4)alkylierung eines polyalkoholisierten Dextrans erhalten wird, an Stelle der Polysaccharide, welche Carboxyl-Gruppen tragen, als Polysaccharid-Anteil verwendet wird, eine hohe Konzentration des Medikamentes für einen langen Zeitraum nach Verabreichung gespeichert wurde, und die Stellen-Selektivität gegenüber Tumor-Stellen oder inflammatorischen Stellen signifikant verbessert werden kann. Sie fanden ebenfalls heraus, dass in diesen Verbindungen die Hauptwirkung wie die antineoplastische Aktivität beachtlich verstärkt ist, wohingegen die Toxizität verringert ist. Die vorliegenden Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnisse erzielt.
  • Die vorliegenden Erfindung stellt daher einen Wirkstoff-Komplex bereit, welcher dadurch charakterisiert ist, dass ein Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohol und ein Rest einer Wirkstoff-Verbindung mittels eines Spacers, der eine Aminosäure umfasst, oder eines Spacers, der 2 bis 8 Peptid-gebundene Aminosäuren umfasst, aneinander gebunden sind. Gemäß weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ein Medikament bereitgestellt, welches den zuvor genannten Wirkstoff-Komplex umfasst; und eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche den zuvor genannten Wirkstoff-Komplex als einen aktiven Bestandteil umfasst, z. B. Zubereitungen zur Injektion oder Tropfinfusion in Form lyophilisierter Produkte, die in Fläschchen gefüllt sind. Darüber hinaus wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des zuvor genannten Wirkstoff-Komplexes bereitgestellt.
  • Als bevorzugte Ausführungsformen der zuvor genannten Erfindung werden bereitgestellt der oben genannte Wirkstoff-Komplex, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Dextran-Polyalkohol, der den Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol bildet, einen Dextran-Polyalkohol darstellt, welcher durch Behandlung eines Dextrans unter Bedingungen, welche im wesentlichen eine vollständige Polyalkoholisierung ermöglichen, erhalten wird; der obige Wirkstoff-Komplex, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol Carboxymethyldextran-Polyalkohol ist; der obige Wirkstoff-Komplex, wobei die Wirkstoff-Verbindung ein antineoplastisches Mittel oder ein anti-inflammatorisches Mittel darstellt; der obige Wirkstoff-Komplex, wobei die Wirkstoff-Verbindung ein antineoplastisches Mittel darstellt, welches konzentrationsabhängig antineoplastische Aktivität zeigt (ein antineoplastisches Mittel, das bei einer höheren Konzentration eine stärkere antineoplastische Aktivität zeigt: in der vorliegenden Beschreibung manchmal als antineoplastisches Mittel der konzentrationsabhängigen Art bezeichnet); der obige Wirkstoff-Komplex, wobei die Wirkstoff-Verbindung ein antineoplastisches Mittel darstellt, welches zeitabhängig antineoplastische Aktivität zeigt (ein antineoplastisches Mittel, das stärkere antineoplastische Aktivität bei längerer Wirkzeit zeigt: in der vorliegenden Be schreibung manchmal als antineoplastisches Mittel der zeitabhängigen Art bezeichnet); und der obige Wirkstoff-Komplex, wobei das antineoplastische Mittel Doxorubicin oder (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion ist.
  • Darüber hinaus werden als ebenfalls bevorzugte Ausführungsformen bereitgestellt, der oben genannte Wirkstoff-Komplex, wobei der Spacer ein Dipeptid ist, welches durch -X-Z-[das Symbol "-X-Z-" bedeutet einen Rest, welcher aus einem Dipeptid besteht, das durch Peptidbindung einer hydrophoben Aminosäure (X) und einer hydrophilen Aminosäure (Z), die sich am N-terminalen Ende beziehungsweise am C-terminalen Ende befinden, gebildet wird, und dessen eines Wasserstoffatom und dessen eine Hydroxy-Gruppe von der Amino-Gruppe am N-Terminus bzw. der Carboxyl-Gruppe am C-Terminus entfernt werden], oder worin der Spacer das Dipeptid als eine partielle Peptidsequenz enthält; der obige Wirkstoff-Komplex, wobei die hydrophobe Aminosäure Phenylalanin und die hydrophile Aminosäure Glycin ist; der obige Arzneimittel-Komplex, wobei der Spacer (N-Terminus)-Gly-Gly-Phe-Gly- ist; und der obige Wirkstoff-Komplex, wobei eine eingeführte Menge des Restes des antineoplastischen Mittels im Bereich von 1 bis 15 Gewichts%, vorzugsweise von 3 bis 10 Gewichts% und besonders bevorzugt von 5 bis 6 Gewichts% liegt.
  • Als besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt der oben genannte Wirkstoff-Komplex, wobei der N-Terminus eines durch H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-COOH dargestellten Peptides mittels einer Säureamid-Bindung an eine Carboxyl-Gruppe eines Carboxymethyldextran-Polyalkohols und der C-Terminus des Peptides mittels einer Säureamid-Bindung an die 1-Amino-Gruppe von (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-chinolin-10,13(9H,15H)-dion gebunden ist; der obige Wirkstoffkomplex, wobei die eingeführte Menge des (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-chinolin-10,13(9H,15H)-dion-Restes im Bereich von 2 bis 10 Gewichts% liegt; und der obige Wirkstoff-Komplex, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol einen Carboxymethyldextran-Polyalkohol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 500.000, vorzugsweise im Bereich von 50.000 bis 450.000, und besonders bevorzugt im Bereich von 200.000 bis 400.000 darstellt, und der Carboxymethylierungsgrad pro konstitutivem Saccharid-Rest im Bereich von 0,01 bis 2,0, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1,0, und besonders bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 0,5 liegt.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Wirkstoff-Beförderungsträger, der den Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol umfasst, bereitgestellt. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung liegt das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols im Bereich von 5000 bis 500.000, vorzugsweise im Bereich von 50.000 bis 450.000, und besonders bevorzugt im Bereich von 200.000 bis 400.000, und der Carboxymethylierungsgrad pro konstitutivem Saccharid-Rest liegt im Bereich von 0,01 bis 2,0, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1,0, besonders bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 0,5. Carboxymethyldextran-Polyalkohol wird als der am meisten bevorzugte Träger bereitgestellt. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, wird die Verwendung eines Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols zur Herstellung eines Wirkstoff-Komplexes bereitgestellt, welcher den Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol gebunden an den Rest einer Wirkstoff-Verbindung enthält.
  • Als bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt die Verwendung des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols zur Herstellung eines Wirkstoff-Komplexes, in dem der Rest einer Wirkstoff-Verbindung und der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol mittels eines Spacers aneinander gebunden sind; und die Verwendung des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols zur Herstellung eines Arzneimittel-Komplexes, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol und der Rest einer Wirkstoff-Verbindung mittels eines Spacers, welcher eine Aminosäure umfasst, oder eines Spacers, welcher 2 bis 8 Peptid-gebundene Aminosäuren umfasst, aneinander gebunden sind.
  • Kurze Erläuterung der Zeichnungen
  • 1 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 8).
  • 2 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 8).
  • 3 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 9).
  • 4 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 9).
  • 5 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 10).
  • 6 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 15).
  • 7 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 15).
  • 8 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 28).
  • 9 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 28).
  • 10 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 29).
  • 11 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 29).
  • 12 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 34).
  • 13 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 34).
  • 14 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 39).
  • 15 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 39).
  • 16 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 41).
  • 17 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 41).
  • 18 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 44).
  • 19 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 44).
  • 20 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 47).
  • 21 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 47).
  • 22 zeigt den GPC-Streifen des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 55).
  • 23 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 55).
  • 24 zeigt die Pharmakokinetiken des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (hergestellt in Beispiel 15). Jeder Wert in der Figur repräsentiert einen durchschnittlichen Wert aus drei Experimenten.
  • Beste Weise der Ausführung der Erfindung
  • Der Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol und ein Rest einer Wirkstoff-Verbindung mittels eines Spacers, der eine Aminosäure umfasst, oder eines Spacers, welcher 2 bis 8 Peptid-gebundene Aminosäuren umfasst, miteinander verbunden sind.
  • Der Rest einer Wirkstoff-Verbindung, der in dem Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung enthalten ist, ist abgeleitet von einer Wirkstoff-Verbindung, welche für eine therapeutische und/oder präventive Behandlung der Krankheiten von Säugetieren, einschließlich Menschen, als Medikament verwendet wird, z. B., ein antineoplastisches Mittel, ein anti-inflammatorisches Mittel, ein antibakterielles Mittel oder ähnliche, und der Rest ist gebildet aus einer partiellen Struktur der Wirkstoff-Verbindung. Die Wirkstoff-Verbindung, aus der der Rest abgeleitet ist, ist jedoch nicht auf die oben genannten beschränkt. Darüber. hinaus kann als die Wirkstoff-Verbindung jedwede Verbindung verwendet werden, solange sie eine oder mehrere reaktive funktionelle Gruppen aufweist, die in der Lage sind, an der Bindungsbildung mit einem Spencer teilzunehmen (z. B. eine Amino-Gruppe, eine Carboxyl-Gruppe, eine Hydroxyl-Gruppe, eine Thiol-Gruppe, eine Ester-Gruppe oder ähnliche). Der Ausdruck "Wirkstoff-Verbindung" in der vorliegenden Beschreibung schließt ebenfalls eine Vorläufer-Verbindung des Wirkstoff ein, welche als einen Bestandteil davon eine Hauptstruktur einer Wirkstoff-Verbindung enthält, welche per se pharmakologische Aktivität aufweist und die Verbindung in vivo reproduzieren kann.
  • Insbesondere bedeutet der Ausdruck "Rest der Wirkstoff-Verbindung" in der vorliegen den Beschreibung eine Teilstruktur, welche sich von der Wirkstoff-Verbindung, die in der Verbindung nach der Bindungsbildung vorliegt, ableitet, unter der Annahme, dass eine Bindung zwischen dem Spacer und dem Rest einer Wirkstoff-Verbindung mittels Reaktion einer reaktiven funktionellen Gruppe der Wirkstoff-Verbindung und einer reaktiven funktionellen Gruppen des Spacers (z. B. Dehydrierung, Kondensation etc.) ausgebildet wird. Wenn die Wirkstoff-Verbindung beispielsweise durch D-NH2, D-COOH, D-COOR, D-OH, D-SH, D-CONH2 oder D-NH-COOR (R ist eine niedere Alkyl-Gruppe oder Ähnliches) dargestellt wird, wird der Rest der Wirkstoff-Verbindung repräsentiert durch D-NH, (D-NH-CO-Q etc.), D-CO-(D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-CO-S-Q etc.), D-CO-(D-CO-NH-Q, D-CO-O-Q, D-CO-S-Q, etc.), D-O-(D-O-CO-Q, D-O-Q etc.), D-S-(D-S-CO-Q, D-S-Q etc.), D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q etc.) bzw. D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q, D-NH-CO-NH-Q etc.) (die Angaben in Klammern stellen eine Bindung zwischen dem Spencer und dem Rest der Wirkstoff-Verbindung dar, wobei Q eine verbleibende Teilstruktur des Spacers ausschließlich einer reaktiven funktionellen Gruppe darstellt). Die Art der Bindung zwischen dem Spacer und dem Rest der Wirkstoff-Verbindung ist jedoch nicht beschränkt auf die oben angegebenen. Der Rest der Wirkstoff-Verbindung kann an die N-terminale Amino-Gruppe oder die C-terminale Carboxyl-Gruppe des Spacers gebunden werden, oder kann alternativ an eine reaktive funktionelle Gruppe gebunden werden, die in einer Aminosäure vorliegt, welche den Spacer bildet.
  • Als der Rest der Wirkstoff-Verbindung können vorzugsweise z. B. Reste von antineoplastischen Mitteln wie Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycin C, Bleomycin, Cyclocytidin, Vincristin, Vinblastin, Methotrexat, Platin anti-neoplastische Mittel (Cisplatin oder dessen Derivate), Taxol oder dessen Derivate, Camptothecin oder dessen Derivate (in der japanischen ungeprüften Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 beschriebene anti-neoplastische Mittel, vorzugsweise (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano(3',4':6,7]indolizino(1,2-b]chinolin-10,13-(9H,15H)-dion, offenbart in Anspruch 2, oder ähnliche) verwendet werden. Darüber hinaus sind Reste von steroidalen anti-inflammatorischen Mitteln wie Hydrocortisonsuccinat und Prednisolonsuccinat und nicht-steroidalen antiinflammatorischen Mitteln wie Mefenamsäure, Flufenamsäure, Dicloefenac, Ibuprofen und Tinoridin ebenfalls bevorzugt.
  • Als Spacer, der an dem Rest der Wirkstoff-Verbindung bindet, kann ein Spacer verwendet werden, der eine Aminosäure umfasst, oder ein Spacer, der 2 bis 8 Aminosäuren umfasst, welche Peptid-gebunden sind. Genauer gesagt besitzt der Spacer die Form eines Restes einer Aminosäure, was bedeutet, ein Rest, welcher durch Entfernung eines Wasserstoffatoms und einer Hydroxyl-Gruppe von einer Amino-Gruppe bzw. einer Carboxyl-Gruppe der Aminosäure erhalten wird, oder ein Rest eines Oligopeptides, welches 2 bis 8 Peptid-gebundene Aminosäuren umfasst, was bedeutet, ein Rest, der durch Entfernung eines Wasserstoffatoms und einer Hydroxyl-Gruppe von der N-terminalen Amino-Gruppe bzw. der C-terminalen Carboxyl-Gruppe des Oligopeptides erhalten wird.
  • Bevorzugte Spacer stellen Reste von Oligopeptiden dar, welche 2 bis 6 Aminosäuren umfassen. Die Art der den Spacer ausbildenden Aminosäure ist nicht besonders eingeschränkt und es können z. B. L- oder D-Aminosäuren, vorzugsweise L-Aminosäuren verwendet werden, und β-Alanin, ε-Aminohexansäure, γ-Aminobuttersäure oder ähnliche können ebenso verwendet werden wie α-Aminosäuren. Diese anderen als die α-Aminosäuren sind vorzugsweise in der Nähe des Polysaccharid-Derivates lokalisiert.
  • Die Bindungsrichtung des Spacers ist nicht besonders eingeschränkt, und im allgemeinen kann der N-Terminus des Spacers an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohols mittels einer Säureamid-Bindung gebunden werden, und der C-Terminus des Spacers kann an eine Amino-Gruppe der Wirkstoff-Verbindung gebunden werden. Alternativ dürfen, z. B. wo ein Lysin-Rest als eine konstitutionelle Einheit des Peptid-Spacers eingebracht wird, die α-Amino-Gruppe und die ε-Amino-Gruppe des Lysin-Restes entsprechende Säureamid-Bindungen mit Carboxyl-Gruppen von anderen Aminosäuren ausbilden, um so N-Termini an beiden Enden des Peptid-Spacers zu bilden, was eine Bindungsbildung mit Carboxyl-Gruppen der Wirkstoff-Verbindungen ermöglicht. Darüber hinaus kann durch Einbringung von einem oder mehreren Resten von Diamin-Verbindungen oder Dicarbonsäure-Verbindungen (z. B. Reste von Diamin-Verbindungen wie Ethylendiamin oder Dicarbonsäure-Verbindungen wie Bernsteinsäure) in einen Spacer als konstitutionelle Einheiten ein Spacer mit entweder N-Termini o der C-Termini an beiden Enden verwendet werden.
  • Die Aminosäure-Sequenz des Spacers ist nicht besonders eingeschränkt. Bevorzugte verwendete Spacer schließen z. B. einen Spacer ein, der einen Rest eines Dipeptides darstellt, welches durch -X-Z- dargestellt wird, worin X einen Rest einer hydrophoben Aminosäure und Z einen Rest einer hydrophilen Aminosäure repräsentieren; und X-Z-einen Rest bedeutet, welcher aus einem Dipeptid besteht, das durch eine Peptid-Bindung zwischen einer hydrophoben Aminosäure (X) und einer hydrophilen Aminosäure (Z) an der N-terminalen Seite bzw. der C-terminalen Seite gebildet wird, und dessen eines Wasserstoffatom und eine Hydroxyl-Gruppe von der Amino-Gruppe am N-Terminus bzw. der Carboxyl-Gruppe am C-Terminus entfernt werden, und einen Spacer, der einen Rest des Dipeptides als partielle Peptid-Sequenz enthält. Als hydrophobe Aminosäure können z. B. Phenylalanin, Tyrosin, Leucin oder ähnliche verwendet werden, und als hydrophile Aminosäure können z. B. Glycin, Alanin oder ähnliche verwendet werden. Der Spacer kann eine wiederholte Sequenz des Dipeptid-Restes aufweisen (z. B. X-Z-X-Z-, -X-Z-X-Z-X-Z- etc.).
  • Bei Verwendung des Spacers, der eine derartige Peptid-Struktur enthält, kann der Spacer in den Tumor-Stellen oder den inflammatorischen Stellen, welche als reich an Peptidase angesehen wird, hydrolysiert werden, um die Wirkstoff-Verbindung in einer hohen Konzentration an diesen Stellen freizusetzen. Die Teilstruktur, welche zwischen dem Spacer, der das obige Dipeptid enthält, und der Wirkstoff-Verbindung durch Bindung aneinander ausgebildet wird, stellt eine bevorzugte Teilstruktur des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung dar. Wo ein konzentrationsabhängiges antineoplastisches Mittel (z. B. Doxorubicin) oder ähnliche als der Rest der Wirkstoff-Verbindung verwendet wird, kann z. B. ein Spacer, der aus dem obigen Dipeptid-Rest, welcher durch -X-Z- dargestellt wird, zusammengesetzt ist, oder ein Spacer, welcher den obigen Dipeptid-Rest als eine partielle Peptid-Sequenz enthält, am Bevorzugtesten eingesetzt werden.
  • Wo darüber hinaus ein anti-neoplastisches Mittel vom Zeit-abhängigen Typ als der Rest der Wirkstoff-Verbindung eingesetzt wird, welches eine gespeicherte Wirkzeit oberhalb einer bestimmten Konzentration erfordert, kann manchmal eine verstärkte antineoplastische Aktivität erhalten werden durch Verwendung des obigen Spacers. Beispiele schließen die in der japanischen ungeprüften Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarten, vorzugsweise das in Anspruch 2 offenbarte antineoplastische Mittel ein. Im allgemeinen sollte der Spacer nicht auf die oben genannten eingeschränkt sein, und es ist notwendig, einen geeigneten Spacer im Hinblick auf die Art der Wirkung des anti-neoplastischen Mittels, die pharmakokinetischen Merkmale oder das Auftreten einer Toxizität, die Freisetzung in vivo des anti-neoplastischen Mittels und ähnlichen auszuwählen. Für Karzinome, welche eine schnelle Proliferation aufweisen, ist es im allgemeinen bevorzugt, den obigen Spacer auszuwählen, der in der Lage ist, die Wirkstoff-Verbindung zu einer hohen Konzentration in einer kurzen Zeit freizusetzen.
  • Spezielle Beispiele des Spacers sind in der folgenden Tabelle gezeigt; der für die Wirkstoff-Komplexe der vorliegenden Erfindung verwendete Spacer ist jedoch nicht auf die oben genannten beschränkt, und es kann leicht verstanden werden, dass ein üblicher Fachmann einen Spacer geeignet auswählen kann, um so eine optimale Freisetzungsgeschwindigkeit einer Wirkstoff-Verbindung zu erzielen. In der Tabelle stellen die linken Enden der Peptid-Sequenzen die N-Termini dar, und die Reste der Wirkstoff-Verbindungen sind an die C-Termini gebunden. D-Phe stellt einen D-Phenylalanin-Rest dar und die anderen Aminosäuren repräsentieren L-Aminosäuren. Die Grade der Freisetzungsgeschwindigkeiten wurden beurteilt durch den Grad des Auftretens einer Wirksamkeit der Wirkstoff-Komplexe, die mit Doxorubicin gebunden sind, gegen Walker 256 Tumor-tragende Ratten, oder durch die freie Doxorubicin-Konzentration an den Tumor-Stellen von Walker 256 Tumor-tragenden Ratten. Unter diesen Spacern wird für Doxorubicin vorzugsweise ein Spacer verwendet, welcher die Wirkstoff-Verbindung zu einer hohen Konzentration in einer kurzen Zeit freisetzen kann, z. B. (N-Terminus)-Gly-Gly-Phe-Gly-.
  • Tabelle 1
    Figure 00140001
  • Οbwohl der Polyalkoholisierungsgrad des Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohols, welcher den Anteil des Polysaccharid-Derivates des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung ausbildet, nicht besonders eingeschränkt ist, ist es bevorzugt, dass der Dextranpolyalkohol, welcher den Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohol ausbildet, ein Dextranpolyalkohol ist, welcher durch Behandlung eines Dextrans unter Bedingungen, welche eine im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung ermöglichen, erhalten wird. Z. B. kann ein Dextranpolyalkohol, welcher durch Behandlung eines Dextrans nacheinander mit großen überschüssigen Mengen an Natriumperiodat und Natriumborhydrid erhalten wurde, um eine im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung zu erzielen, vorzugsweise als Ausgangsmaterial zur Herstellung des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Verfahren zur Polyalkoholisierung eines Dextrans ist jedoch nicht auf das oben genannte Verfahren beschränkt, und jedwedes Verfahren, welches dem Fachmann zugänglich ist, kann angewandt werden.
  • Die Art des Dextrans ist nicht besonders eingeschränkt, und das Dextran kann α-D-1,6-Bindungen in jeder Menge enthalten. Z. B. können Dextrane verwendet werden, die eine α-D-1,6-Bindung in einer Menge von 85% oder mehr, 90% oder mehr, und 95% oder mehr enthalten. Das Molekulargewicht des Dextrans ist nicht besonders eingeschränkt, und es können z. B. Dextrane mit einem Molekulargewicht von etwa 10.000 bis etwa 2.000.000, vorzugsweise von etwa 50.000 bis etwa 800.000 verwendet werden. Als die C1-4Alkyl-Gruppe, welche die Carboxy(C1-4)alkyl-Gruppe ausbildet, kann eine lineare oder verzweigte C1-4Alkyl-Gruppe, insbesondere eine Methyl-Gruppe, eine Ethyl-Gruppe, eine n-Propyl-Gruppe, eine Isopropyl-Gruppe, eine n-Butyl-Gruppe, eine sec-Butyl-Gruppe oder ähnliche verwendet werden, und eine Methyl-Gruppe kann bevorzugt verwendet werden. Die Carboxy(C1-4)alkylierung kann durchgeführt werden z. B. durch Reaktion einer halogenierten (C1-4)alkylcarbonsäure wie Chloressigsäure, Bromessigsäure, α-Chlorpropionsäure, α-Methyl-α-chlorpropionsäure, β-Chlorpropionsäure, α-Methyl-β-chlorpropionsäure, α-Chlorbutansäure, β-Chlorbutansäure, oder γ-Chlorbutansäure, vorzugsweise Chloressigsäure, mit Hydroxyl-Gruppen des Dextranpolyalkohols, um eine teilweise oder vollständige Carboxy(C1-4)alkylierung der Hydroxyl-Gruppen zu erhalten.
  • Der Dextranpolyalkohol wird z. B. in einem inerten Lösungsmittel gelöst, welches an den Reaktionen nicht teilnimmt (z. B. Wasser, N,N-Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid) und die Lösung wird mit einer halogenierten (C1-4)Alkylcarbonsäure oder einem Salz davon in der Gegenwart einer Base (z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid) versetzt, und anschließend wird der Mischung erlaubt, für mehrere Minuten bis zu mehreren Tagen bei einer Temperatur von unter Eiskühlung bis zu etwa 100°C zu reagieren. Der Grad an Einführung der Carboxy(C1-4)alkyl-Gruppe kann leicht kontrolliert werden, z. B. durch geeignete Auswahl der Reaktionstemperatur der Carboxy(C1-4)alkylierung oder der Menge der halogenierten (C1-4)Alkylcarbonsäure oder der Basen, welche als Reagentien verwendet werden, und diese Maßnahmen sind dem Fachmann gut bekannt. Der Grad der Carboxy(C1-4)alkylierung der Hydroxyl-Gruppen des Dextranpolyalkohols ist nicht besonders eingeschränkt, und der Grad kann beispielsweise im Bereich von 0,01 bis 2,0, vorzugsweise von 0,1 bis 1,0, und besonders bevorzugt von 0,3 bis 0,5 pro Rest des konstitutiven Saccharids liegen. Das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohols beträgt von etwa 5000 bis 500.000, vorzugsweise von etwa 50.000 bis 450.000, und besonders bevorzugt von etwa 200.000 bis 400.000, wenn mittels des Gelfiltrationsverfahrens bestimmt.
  • Der zuvor genannte Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohol ist nützlich als Wirkstoff-Beförderungsträger. Wirkstoff-Komplexe, in denen eine Wirkstoff-Verbindung und der Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohol aneinander gebunden sind, sind z. B. dadurch gekennzeichnet, dass sie eine ausgezeichnete Selektivität wie neoplastische Selektivität aufweisen, und in der Lage sind, eine hohe Blutkonzentration für einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten. Im Hinblick auf die Bindung zwischen der Wirkstoff-Verbindung und dem Carboxy(C1-4)alkyldextranpolyalkohol kann z. B. ein Verfahren, in dem beide direkt mittels einer Ester-Bindung aneinander gebunden sind, oder alternativ ein Verfahren, in dem beide mittels eines geeigneten Spacers wie die oben genannten aneinander gebunden sind, gewählt werden.
  • Im Hinblick auf den Wirkstoff-Komplex, der mittels des Spacers gebunden ist, kann der Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung durch Bindung des Spacers, der an einen Rest einer Wirkstoff-Verbindung gebunden ist, an eine Carboxyl-Gruppe des wie oben erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols hergestellt werden. Die Bindung zwischen dem Spacer und der Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols kann im Allgemeinen ausgebildet werden durch Bindung der N-terminalen Amino-Gruppe des Spacers an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols mittels einer Säureamid-Bindung. Die Bindung zwischen dem Spacer und der Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols ist jedoch nicht eingeschränkt auf die oben beschriebene, und andere chemische Bindungen und Bindungen, die einen oder mehrere Spacer nutzen, können verwendet werden. Z. B. kann ein Säureamid zwischen der C-terminalen Carboxyl-Gruppe des Spacers und einer Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols ausgebildet werden, oder durch Verwendung einer Diamin-Verbindung wie Ethylendiamin als Spacer kann jede der Carboxyl-Gruppen mittels einer Säureamid-Bindung an jede der Amino-Gruppen der Diamin-Verbindung gebunden werden.
  • Wenn die N-terminale Amino-Gruppe des Spacers mittels einer Säureamid-Bindung an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols gebunden ist, können Dehydrierungs-Kondensationsmittel, welche üblicherweise zur Synthese von Peptid-Ketten verwendet werden, z. B. N,N'-Dicycloalkylcarbodiimid wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Carbodiimid-Derivate wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAPC), Benzotriazol-Derivate wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (EEDQ) und ähnliche verwendet werden. Darüber hinaus kann die Reaktion ebenfalls mittels dem aktivierten Ester-Verfahren und dem Säurehalogenid-Verfahren durchgeführt werden.
  • Obwohl die Menge des Restes der Wirkstoff-Verbindung, die in den Carboxymethyldextranpolyalkohol eingebracht wird, nicht besonders eingeschränkt ist, sollte die Menge im Hinblick auf z. B. die physikochemischen Eigenschaften des Restes der Wirkstoff-Verbindung, und die Pharmakokinetiken, die Wirksamkeit und Toxizität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung geeignet ausgewählt werden. Im Allgemeinen kann der Bereich ungefähr von 0,1 bis 30 Gewichts%, vorzugsweise ungefähr von 1 bis 15 Gewichts%, und besonders bevorzugt ungefähr von 3 bis 10 Gewichts%, und am meisten bevorzugt ungefähr von 5 bis 6 Gewichts% ausgewählt werden. Das Verhältnis des Restes der Wirkstoff-Verbindung, die in den Carboxymethyldextranpolyalkohol eingebracht ist, kann leicht bestimmt werden, z. B. mittels absorptionsspektrometrischer Analyse.
  • Als ein Beispiel des Verfahrens zur Herstellung des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung zeigt das folgende Schema das Herstellungsverfahren zur Einführung des Restes der Wirkstoff-Verbindung, die das anti-neoplastische Mittel darstellt, das in Anspruch 2 der japanischen ungeprüften Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbart ist; die Wirkstoff-Komplexe der vorliegenden Erfindung und die Verfahren für deren Herstellung sind jedoch nicht auf diejenigen, die in dem Schema gezeigt sind, eingeschränkt. In dem unteren Schema beträgt die eingebrachte Menge des Restes der Wirkstoff-Verbindung z. B. etwa von 1 bis 15 Gewichts%, vorzugsweise von 2 bis 10 Gewichts%. Darüber hinaus ist von den konstitutionellen Einheiten der Polyalkohole in dem unteren Schema nur eine konstitutionelle Einheit, welche mit einer oder zwei Carboxymethyl-Gruppen eingebracht wird, als Beispiel angeführt. Es sollte jedoch verstanden werden, dass der Polysaccharid-Derivat-Anteil des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung nicht durch Wiederholung der zuvor genannten konstitutionellen Einheit gebildet wird.
  • Figure 00190001
  • Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung
    Figure 00200001
  • Es ist bekannt, dass das Gleichgewicht der zuvor genannten Wirkstoff-Verbindung bei der Verbindung liegt, dessen Lacton-Ring geschlossen ist (geschlossene Ring-Verbindung) in einem sauren wässrigen Medium (z. B. ungefähr bei pH 3), wohingegen in einem basischen wässrigen Medium (z. B. ungefähr bei pH 10) das Gleichgewicht bei der Verbindung liegt, dessen Lacton-Ringen geöffnet ist (geöffnete Ring-Verbindung), und der Wirkstoff-Komplex, in den der Rest eingebracht wurde, der der geöffneten oder der geschlossenen Ring-Verbindung entspricht, weist eine ähnliche anti-neoplastische Aktivität auf. Entsprechend sollte es verstanden werden, dass jede von ihnen innerhalb des Schutzumfanges der vorliegenden Erfindung fällt. Wenn ein Reaktant, dessen Lacton-Ring geöffnet ist, in dem Reaktionssystem vorliegt, wird die Kondensationsreaktion zwischen der von dem Lacton-Ring stammenden Carboxyl-Gruppe und der aus dem Spacer stammenden Amino-Gruppe ablaufen, was in einer signifikanten Abnahme der Reaktionsausbeute resultiert, und darüber hinaus kann manchmal ein gewünschter Wirkstoff-Komplex nicht einheitlich erhalten werden. Eine derartige Nebenreaktion kann vermieden werden, indem selektiv die geschlossene Ring-Verbindung als Reaktant verwendet wird.
  • Das heißt, die Nebenreaktion kann verringert werden durch Umwandlung das Natrium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols in das Triethylammonium-Salz, und an schließend Kondensieren der N-terminalen Amino-Gruppe des Spacers, welche an den Rest der oben beschriebenen Wirkstoff-Verbindung gebunden ist, mit einer Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols in einem nicht-wässrigen System (in einem organischen Lösungsmittel, welches kein Wasser enthält), was eine effiziente Herstellung des gewünschten Produkts ermöglicht. Als das Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols, der in organischen Lösungsmitteln gelöst werden kann, können z. B. Trialkylammonium-Salze wie Triethylammonium-Salz oder Trimethylammonium-Salz, oder ein Salz organischer Basen wie N-Methylpyrrolidin, N-Methylmorpholin oder Dimethylaminopyridin (DMAP) verwendet werden. Als organische Lösungsmittel können N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder ähnliche verwendet werden.
  • Der Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine spezielle gewünschte pharmakologische Aktivität an einer lokalen Stelle, wie an Tumor-Stellen oder inflammatorischen Stellen in Abhängigkeit der Art des Restes der Wirkstoff-Verbindung (z. B. der Rest der Wirkstoff-Verbindung wie anti-neoplastische Mittel oder anti-inflammatorische Mittel) aufweisen kann, und die inhärente Toxizität der Wirkstoff-Verbindung per se verringern kann. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, an irgend eine spezielle Theorie gebunden zu sein, besitzt der Polysaccharid-Derivat-Anteil des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung (z. B. Carboxymethyldextranpolyalko- hol) eine ganz ausgezeichnete Retention in Blut und erzeugt eine große Anhäufung in Tumor- oder inflammatorischen Stellen, und ist daher nützlich als ein Wirkstoff-Beförderungsträger und erlaubt, dass der Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung selektiv gegenüber einer neoplastischen Stelle und selektiv gegenüber einer inflammatorischen Stelle ist. Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass Protease (Peptidase) an Tumor-Stellen oder inflammatorischen Stellen exprimiert wird, und entsprechend wird der Spacer des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung leicht hydrolysiert, um einer freigesetzten Wirkstoff-Verbindung zu erlauben, ihre Wirksamkeit auszuüben.
  • Ein Medikament, das den Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung enthält, kann im Allgemeinen in Form eines lyophilisierten Produktes oder ähnliches in Fläschchen oder ähnliches gefüllt werden, und zur klinischen Verwendung als Zubereitungen zur parenteralen Verabreichung wie Injektionen oder Tropfinfusionen, welche bei Gebrauch gelöst werden, bereitgestellt werden. Die Form der pharmazeutischen Zubereitungen des Medikamentes der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die zuvor genannten Formen beschränkt. Für die Herstellung der obigen pharmazeutischen Zubereitungen können pharmazeutische Additive, die in dem Bereich des Standes der Technik verfügbar sind, z. B. Lösungsvermittler, pH-Modifizierer, Stabilisatoren und ähnliche verwendet werden. Obwohl die Dosis des Medikamentes der vorliegenden Erfindung nicht besonders eingeschränkt ist, sollte über sie normalerweise im Hinblick auf die Dosis der Wirkstoff-Verbindung, die den Rest der Wirkstoff-Verbindung ausbildet, die Menge des Restes der Wirkstoff-Verbindung, die in den Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung eingebracht ist, den Zustand eines Patienten, die Art der Krankheit und ähnliches entschieden werden. Wo z. B. ein Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung parenteral verabreicht wird, welcher mit etwa 6 Gewichts% des Restes des in Anspruch 2 der japanischen ungeprüften Patentschrift (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarten antineoplastischen Mittels eingebracht wird, können im allgemeinen etwa 1 bis 500 mg, vorzugsweise etwa 10 bis 100 mg pro m2 Körperoberfläche pro Tag einmal am Tag verabreicht werden, und die Verabreichung kann vorzugsweise alle drei bis vier Wochen wiederholt werden.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele spezieller erläutert werden; der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt. In den Beispielen repräsentiert "A-NH-" einen Rest einer Wirkstoff-Verbindung, wobei die Wirkstoff-Verbindung einen Lacton-Ring besitzt, wie die in Anspruch 2 der japanischen ungeprüften Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 offenbarte Wirkstoff-Verbindung (in den Beispielen manchmal als "DX-8951" bezeichnet), und die Wirkstoff-Verbindung welche einen geschlossenen Lacton-Ring aufweist, wird durch A-NH2- dargestellt. Ein Beispiel schließt die durch A-NH- in dem oben beschriebenen Schema, in dem ein Lacton-Ring gebildet wird, repräsentierte Gruppe ein. Darüber hinaus stellt A'-NH- dar, dass der Lacton-Ring des Restes einer durch A-NH- repräsentierten Wirkstoff-Verbindung entweder in der geschlossenen Ring-Form oder der offenen Ring-Form vorliegt, oder alternativ eine Mischung daraus, -DXR repräsentiert den von Doxorubicin stammenden Rest und -D51-7059 repräsentiert den von dem Taxol-Derivat, das in Beispiel 55 gezeigt ist, stammenden Rest.
  • In den Beispielen wurde, wenn nicht anders spezieller angeführt, der Carboxymethylierungsgrad im Carboxymethyldextranpolyalkohol (der Grad der Substitution mit Carboxymethyl-Gruppen pro konstitutivem Saccharid-Rest) durch Umsetzung des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols in die freie Säure-Form, Lösung der resultierenden Säure in einer wässrigen 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung und danach Titrieren unter Verwendung von 0,1 N Salzsäure bestimmt. Eine wässrige Lösung des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols wurde auf eine Bio-Rad AG50W-x2 (H+ Form)-Säule aufgegeben und das Eluat wurde lyophilisiert und anschließend als Probe verwendet. Die Probe wurde in einer vorgeschriebenen überschüssigen Menge an wässriger 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung gelöst und mit 0,1 N Salzsäure unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator titriert. Der Carboxymethylierungsgrad wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: Grad an Carboxymethylierung = 13,4(a – b)/[s·5,8(a – b)], worin "s" das Gewicht der verwendeten Probe (mg) ist; "a" die vorgeschriebene überschüssige Menge an wässriger 0,1 N Natriumhydroxid-Lösung (ml) ist, und "b" das Volumen der für die Filtration benötigten 0,1 N Salzsäure (ml) darstellt. Die Menge des eingebrachten Wirkstoffs (Gewichtsprozent) wurde mittels absorptionsspektrometrischer Analyse unter Verwendung der charakteristischen Absorption der Wirkstoff-Verbindung (ungefähr 362 nm) bestimmt. Die Gelfiltration wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Säule: TSK Gel G4000 PWXL; Eluierungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min; und Säulentemperatur: 40°C.
  • Beispiel 1: 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
    Figure 00230001
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (600 mg) und N-Hydroxysuccinimid (160 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (280 mg) versetzt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung des Methansulfonats der in Anspruch 2 der japanischen ungeprüften Patentoffenlegungsschrift (KOKAI) Nr. (Hei) 6-87746/1994 beschriebenen Wirkstoff-Verbindung (600 mg, die in Beispiel 50 der oben genannten Patentoffenlegungsschrift beschriebene Verbindung) und von Triethylamin (0,16 ml), gelöst in N,N-Dimethylformamid (30 ml) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur für 16 Stunden unter Rühren unter Licht-geschützten Bedingungen zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockne unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 10 : 1 Lösung enthaltend 0,5% Essigsäure) aufgereinigt, um die Titelverbindung (1,0 g) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.40 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.10–8.17 (m, 2H), 7.91–8.01 (m, 1H), 7.78 (d, 1H, J = 10.75 Hz), 7.32 (s, 1H), 6.94–6.96 (m, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.57 (t, 1H, J = 4.5 Hz), 5.43 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.77 (dd, 2H, J = 5.85 Hz, J = 8.80 Hz), 3.70 (d, 2H, J = 4.40 Hz), 3.65 (d, 2H, J = 5.35 Hz), 3.56 (d, 2H, J = 5.85), 3.15–3.25 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.05–2.25 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J = 7.35).
    Masse (FAB); m/e 854 (M + 1)
  • Beispiel 2: Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Phe (600 mg) und N-Hydroxysuccinimid (160 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (280 mg) versetzt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung des Methansulfonats von DX-8951 (600 mg) und Triethylamin (0,16 ml), gelöst in N,N-Dimethylformamid (30 ml), zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur für 16 Stunden unter Rühren unter Licht-geschützten Bedingungen zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockne unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dich lormethan : Methanol = 10 : 1 Lösung enthaltend 0,5% Essigsäure) aufgereinigt, um die Titelverbindung (700 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.57 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 8.19 (d, 1H), 8.05–8.07 (m, 2H), 7.79 (d, 1H, J = 11.2 Hz), 7.32 (s, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 6.93–7.03 (m, 4H), 6.51 (s, 1H), 5.52–5.55 (m, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.18 (d, 1H, J = 18.5 Hz), 4.84 (d, 1H, J = 18.5 Hz), 4.57–4.59 (m, 1H), 3.57–3.71 (m, 6H), 3.15–3.25 (m, 2H), 3.00–3.02 (m, 1H), 2.80–2.90 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.05–2.25 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.35 (s, 9H) 0.88 (t, 3H, J = 7.35 Hz).
    Masse (FAB); m/e 854 (M + 1)
  • Beispiel 3: Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Boc-Gly-Gly-Gly-Gly (120 mg) und N-Hydroxysuccinimid (39 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (70 mg) versetzt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung des Methansulfonats von DX-8951 (150 mg) und Triethylamin (0,039 ml), gelöst in N,N-Dimethylformamid (10 ml) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur für 16 Stunden unter Rühren unter Licht-geschützten Bedingungen zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockne unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 10 : 1 Lösung) aufgereinigt, um die Titelverbindung (100 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.40 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.10–8.17 (m, 2H), 7.91–8.01 (m, 1H), 7.78 (d, 1H, J = 10.75 Hz), 7.32 (s, 1H), 6.94–6.96 (m, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.57 (t, 1H, J = 4.5 Hz), 5.43 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.77 (dd, 2H, J = 5.85 Hz, J = 8.80 Hz), 3.70 (d, 2H, J = 4.40 Hz), 3.65 (d, 2H, J = 5.35 Hz), 3.56 (d, 2H, J = 5.85 Hz), 3.15–3.25 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.05–2.25 (m, 1H), 1.86 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J = 7.35 Hz).
    Masse (FAB); m/e 764 (M + 1)
  • Beispiel 4: Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoracetat
    Figure 00260001
  • 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (79 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde einer azeotropen Destillation zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) unterzogen, und anschließend wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.59–8.61 (m, 1H), 8.50 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.21–8.27 (m, 2H), 7.91–8.01 (br, 3H), 7.81 (d, 1H, J = 11.2 Hz), 7.32 (s, 1Η), 6.50–6.52 (br, 1Η), 5.57–5.59 (m, 1Η), 5.43 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.80–3.82 (m, 3H), 3.70–3.75 (m, 3H), 3.15–3.25 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.05–2.25 (m, 1Η), 1.86–1.88 (m, 2H), 0.88 (t, 3H, J = 7.35 Ηz).
  • Beispiel 5: Synthese des Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Dextran T2000 (10 g, Pharmacia, durchschnittliches Molekulargewicht: 2.000.000) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 1000 ml) gelöst und mit einer wässriger Lösung (1000 ml) von Natriumperiodat (33,0 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für 10 Tage mit Abschirmung des Lichtes, wurde die Mischung mit Ethylenglykol (7,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (14 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde anschließend bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, und für eine Stunde bei 4°C gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigen Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde einer Ultrafiltration unterworfen unter Verwendung einer Biomax-30 Membran (Millipore), um die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht zu entfernen. Die Polymerfraktion wurde lyophilisiert, um den Dextranpolyalkohol zu erhalten. Nach Behandlung dieses Dextranpolyalkohols bei pH 3,0 für eine Stunde, wurde die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht mit einer Biomax-50 Membran entfernt, und nachfolgend wurde die Polymerfraktion mit einer Biomax-100 Membran entfernt, und das Ergebnis wurde lyophilisiert, um aufgereinigten Dextranpolyalkohol (2,0 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 220 K (Gelfiltration, Dextran-Standard).
  • Dieser aufgereinigte Dextranpolyalkohol (1,8 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, welche durch Lösung von Natriumhydroxid (10,5 g) in Wasser (45 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (15 g) gegeben und unter Eiskühlung gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 20 Stunden zu reagieren. Danach wurde die Reaktionsmischung mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt, die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-10 Membran entfernt. Die Polymerefraktion wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,8 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 330 K (Gelfiltration, Dextran-Standard) und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,8.
  • Das obige Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (300 mg) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule (1,5 × 8,6 cm) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (0,5 ml) versetzt und lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (360 mg) zu ergeben. Portionen des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols (jeweils 300 mg) wurden mit der Säule wie oben beschrieben behandelt, um das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (380 mg, 400 mg) zu ergeben.
  • Beispiel 6: Synthese des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Das Natrium-Salz des in obigem Beispiel 5 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (0,15 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, die erhalten wurde durch Lösen von Natriumhydroxid (1,05 g) in Wasser (4,5 ml), und anschließend bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (1,5 g) gegeben und unter Eiskühlung gelöst, und der Mischung wurde erlaubt, für 18 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt, tropfenweise in 90 ml Methanol gegeben, und mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (0,15 ml) versetzt, und der abgeschiedene Niederschlag wurde mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Methanol gewaschen und anschließend in Wasser (5 ml) gelöst, und mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (0,15 ml) versetzt. Diese wässrige Lösung wurde durch einen Millipore Filter (0,45 μm) filtriert, und das Filtrat wurde tropfenweise zu 35 ml Ethanol gegeben und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, in Wasser gelöst, und gegen gereinigtes Wasser dialysiert unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut-off Molekulargewicht; 6000–8000). Die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (0,18 g) zu ergeben. Der Carboxymethylierungsgrad dieser Substanz pro Saccharid-Rest betrug 1,2 (Alkalimetrie).
  • Beispiel 7: Synthese des Natrium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Der in Beispiel 5 erhaltene aufgereinigte Dextranpolyalkohol (0,2 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, die erhalten wurde durch Lösen von Natriumhydroxid (0,84 g) in Wasser (6 ml), und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (1,2 g) gegeben und unter Eiskühlung gelöst, und der Mischung wurde erlaubt, für 18 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt, tropfenweise zu 120 ml Methanol gegeben, und anschließend mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (0,2 ml) versetzt, und die abgeschiede nen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Methanol gewaschen und anschließend in Wasser (5 ml) gelöst, und mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (0,2 ml) versetzt. Diese wässrige Lösung wurde durch einen Millipore-Filter (0,45 μm) filtriert, und das Filtrat wurde tropfenweise zu 35 ml Ethanol getropft und der abgeschiedene Niederschlag wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, in Wasser gelöst, und gegen gereinigtes Wasser dialysiert unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut-off Molekulargewicht; 6000–8000). Die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (0,20 g) zu ergeben. Der Carboxymethylierungsgrad dieser Substanz pro Saccharid-Rest betrug 0,4 (Alkalimetrie).
  • Beispiel 8: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 5 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (380 mg, Carboxymethylierungsgrad: 0,8) wurde in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salz (49 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml)), Triethylamin (0,017 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (380 mg) zugegeben, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit 1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt und jeweils 5 ml-Portionen der Mischung wurden tropfenweise zu 25 ml Ethanol gegeben. Diese Mischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden durch Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt.
  • Die Niederschläge wurden in Wasser gelöst und gegen gereinigtes Wasser unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut-off Molekulargewicht; 6000–8000) dialysiert, und die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore-Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert. Das resultierende Rohprodukt wurde in Wasser (30 ml) gelöst, mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und für eine Stunde bei 37°C behandelt. Diese behandelte Lösung wurde wie oben beschriebenen dialysiert, und anschließend wurde die innere Dialysat-Lösung durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um die Titelverbindung (289 mg) zu ergeben. Das nach dem Lösung dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid mittels GPC-Analyse (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,25 mg/ml) sind in 1 bzw. 2 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,3% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 9: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Die Titelverbindung (300 mg) wurde entsprechend einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 8 synthetisiert durch Einbringung des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A, welches durch Entfernung der Boc-Gruppe von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (50 mg) in einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 4 erhalten worden war, in das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (380 mg), welches in Beispiel 5 erhalten wurde. Das nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid mittels GPC-Analyse (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis, und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,19 mg/ml) sind in 3 bzw. 4 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,3% (W/W), wenn basierend auf der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 10: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Gly-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Die Titelverbindung (190 mg) wurde entsprechend einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 8 synthetisiert durch Einbringung des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A, welches durch Entfernung der Boc-Gruppe von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (41 mg) in einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 4 erhalten worden war, in das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (380 mg), welches in Beispiel 5 erhalten wurde. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,34 mg/ml) ist in 5 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,3% (W/W), wenn basierend auf der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 11: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse wurden vorbereitet (7 Mäuse pro Gruppe) durch subkutanes Transplantieren von 1 × 106 Maus Fibrosarkom Meth A-Zellen in die rechten inguinalen Regionen von männlichen BALB/c Mäusen (7 Wochen alt). An Tag 7, wurde der in destilliertem Wasser zur Injektion gelöste Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 9 in die Schwanz-Vene der Meth A Tumor-tragenden Mäuse 4 mal alle 4 Tage injiziert. An Tag 21 nach der Transplantation, wurden die Tumormassen herausgeschnitten und gewogen, um die Inhibitionsrate des Tumorwachstums gemäß der folgenden Gleichung zu berechnen: Inhibitionsrate des Tumorwachstums (%) = [1 – (durchschnittliches Tumorgewicht der Gruppe, der die Test-Probe verabreicht wurde/durchschnittliches Tumorgewicht der Kontroll-Gruppe)] × 100. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass der in Anspruch 9 erhaltene Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung eine merklich verstärkte Antitumor-Aktivität im Vergleich zu der Wirkstoff-Verbindung per se, ohne den Spacer und das Polysaccharid-Derivat, aufwies, während es keine Toxizität (Gewichtsverlust) zeigte. Das Polysaccharid-Derivat (Beispiel 5) an sich und die Wirkstoff-Verbindung, die alleine mit dem Spacer (Trifluoressigsäure-Salz von H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (A-NH2 = DX-8951), enthalten durch Entfernung der Boc-Gruppe von der Verbindung aus Beispiel 1 gemäß dem Verfahren aus Beispiel 4)) eingebracht wurde, erwiesen sich als nicht wirksam.
  • Tabelle 2
    Figure 00320001
  • Beispiel 12: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden auf eine ähnliche Weise wie der aus Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Aktivität wurde verglichen mit der, die bei einer einzigen Verabreichung der Wirkstoff-Komplexe aus den Beispielen 8 und 9 einmal an Tag 7 erhalten wurde. Als Ergebnis war der Grad der Antitumor-Aktivität wie folgt: (Polysaccharid-Derivat)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' > (Polysaccharid-Derivat)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' > Wirkstoff-Verbindung an sich. Die Verbindung, die den Rest der Wirkstoff-Verbindung umfasst, die direkt an eine Carboxyl-Gruppe des Carboxymethyldextranpolyalkohols aus Beispiel 5 ohne irgendeinen Spacer gebunden ist (Menge des eingebrachten Restes der Wirkstoff-Verbindung: 6,2 Gewichts%), erwies sich als nicht wirksam.
  • Tabelle 3
    Figure 00330001
  • Beispiel 13: Synthese das Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Dextran T500 (10 g, Pharmacia, Molekulargewicht: 500 K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 1000 ml) gelöst und mit einer wässrigen Lösung (1000 ml) von Natriumperiodat (33 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (7,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (14 g) wurde zugegeben und gelöst, und anschließend wurde die Mischung über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und für eine Stunde bei 4°C gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt, um Lösung 1 zu ergeben. Separat wurde eine Reihe von oben beschriebenen Vorgehensweisen unter Verwendung von Dextran T500 (10 g, Pharmacia, Molekulargewicht 500 K) durchgeführt, um Lösung 2 zu erhalten. Darüber hinaus wurde eine Reihe der oben beschriebenen Vorgehensweisen wiederholt unter Verwendung von Dextran T250 (jeweils 10 g, Pharmacia, Molekulargewicht 250 K) um Lösung 3 und Lösung 4 zu erhalten. Diese Lösungen 1–4 wurden vereinigt und einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran unterworfen, um die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht zu entfernen. Die Polymer-Fraktion wurde lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (25 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 163 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextranpolyalkohol (11 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (46,2 g) in Wasser (330 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (66 g) unter Eiskühlung zugegeben und gelöst, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 9 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (13 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 228 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard) und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,4.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (600 mg) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) aufgegeben und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (0,93 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (690 mg) zu ergeben.
  • Beispiel 14: Synthese des 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salzes
  • Das in Beispiel 1 erhaltene 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (79 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst, und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde einer azeotropen Destillation zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) unterworfen, und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.53 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.40–8.48 (m, 2H), 8.28 (d, 1Η, J = 8.3 Hz), 7.95–8.07 (br, 3Η), 7.81 (d, 1H, J = 10.2 Hz), 7.30–7.37 (m, 2H), 7.15–7.30 (m, 5H), 6.50–6.55 (br, 1Η), 5.50–5.57 (m, 1Η), 5.41 (d, 2Η, J = 7.82 Ηz), 5.25 (s, 2H), 4.55–4.62 (m, 1H), 3.55–3.92 (m, 6H), 3.15–3.25 (br, 2Η), 2.98–3.03 (m, 1Η), 2.73–2.82 (m, 1Η), 2.40 (s, 3Η), 2.05–2.25 (m, 1H), 1.84–1.92 (m, 2Η), 0.88 (t, 3H, J = 7.35 Hz).
  • Beispiel 15: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Natrium-Salz des in Beispiel 13 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (400 mg) wurde in das Triethylammonium-Salz (470 mg) umgewandelt und in N,N-Dimethylformamid (30 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 14 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (62 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), Triethylamin (0,02 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (470 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren und unter Abschirmung des Lichts zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Zu dieser Mischung wurde 3 M wässriges Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst, mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt und anschließend gegen gereinigtes Wasser dialysiert unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut-off Molekulargewicht; 6000–8000). Die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore Filter (0,22 um) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (600 mg) zu erhalten. Das durch GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,1 mg/ml) sind in 6 bzw. 7 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,8% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 16: Synthese das 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salzes
  • Das in Beispiel 2 erhaltene 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (79 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst, und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde einer azeotropen Destillation zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) unterworfen, und anschließend wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.62–8.66 (m, 2H), 8.23 (d, 1Η, J = 8.3 Hz), 8.18–8.20 (m, 1Η), 7.98–8.10 (br, 2H), 7.79 (d, 1H, J = 10.7 Hz), 7.32 (s, 1Η), 7.09 (d, 2H, J = 7.3 Hz), 6.93–7.03 (m, 4H), 6.50–6.60 (br, 1Η), 5.52–5.55 (m, 1Η), 5.44 (s, 2H), 5.18 (d, 1Η, J = 18.5 Hz), 4.80 (d, 1H, J = 18.5 Hz), 4.57–4.59 (m, 1Η), 3.57–3.71 (m, 6H), 3.15–3.25 (m, 2H), 3.00-3.02 (m, 1H), 2.80–2.90 (m, 1H), 2.50 (s, 3Η), 2.05–2.25 (m, 1Η), 1.86–2.00 (m, 2H), 0.88 (t, 3H, J = 7.35 Hz).
  • Beispiel 17: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NΗ-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Natrium-Salz des in Beispiel 13 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,0 g) wurde in das Triethylammonium-Salz (1,2 g) umgewandelt und in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 16 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (158 mg) in N,N-Dimethylformamid (15 ml), Triethylamin (0,05 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,2 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren und unter Abschirmung des Lichts zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Zu dieser Mischung wurde 3 M wässriges Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden anschließend mittels Zentrifugation gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst, mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt und anschließend gegen gereinigtes Wasser dialysiert unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut off Molekulargewicht; 6000–8000). Die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,4 g) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 5,2% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 18: Synthese von Boc-Gly-Phe-Leu-OH
  • H-Gly-Phe-Leu-ΟΗ (3,0 g) wurden zu 50% wässrigem Dioxan (48 ml) gegeben und eisgekühlt. Zu dieser Lösung wurden 1Η wässriges Natriumhydroxid (9,45 ml) und eine (Boc)2O (2,27 g) enthaltende Dioxan-Lösung (24 ml) zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Zu dieser Reaktionsmischung wurde 1Η Salzsäure (9,45 ml) zugegeben und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der resultierende Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 5 : 1 Lösung) aufgereinigt, um die Titelverbindung (2,5 g) zu erhalten.
  • Beispiel 19: Synthese von Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OBzl
  • Das in Beispiel 18 erhaltene Boc-Gly-Phe-Leu-OH (2,4 g) und N-Hydroxysuccinimid (656 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,17 g) versetzt und für zwei Stunden gerührt.
  • Zu dieser Lösung wurde eine N,N-Dimethylformamid-Lösung (40 ml), in der das Tosylat von H-Gly-OBzl (1,9 g) und Triethylamin (0,79 ml) gelöst worden waren, zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, unter Rühren bei Raumtemperatur für 16 Stunden zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 50 : 1 Lösung) aufgereinigt, um die Titelverbindung (2,0 g) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.20–8.30 (m, 1H), 8.12 (d, 1Η, J = 8.3 Hz), 7.83 (d, 1Η, J = 8.3 Ηz), 7.32–7.37 (m, 5Η), 6.89–6.95 (m, 1Η), 5.12 (s, 1H), 4.52–4.59 (br, 1Η), 4.34 (dd, 1Η, J = 7.3 Hz, J = 15.1 Hz), 3.93 (dd, 1H, J = 5.5 Hz, J = 17.2 Hz), 3.84 (dd, 1H, J = 5.5 Hz, J = 17.2 Hz), 3.54 (dd, 1Η, J = 5.9 Hz, J = 16.7 Hz), 3.42 (dd, J = 5.9 Hz, J = 16.7 Hz), 3.00 (dd, 1Η, J = 4.4 Hz, 13.7 Hz), 2.78 (dd, 1Η, J = 8.8 Hz, J = 13.2 Hz), 1.50–1.65 (m, 1H), 1.45 (t, 2Η, J = 7.3 Hz), 1.36 (s, 9H), 0.86 (d, 3Η, J = 6.4 Hz), 0.82 (d, 3H, J = 6.4 Hz).
  • Beispiel 20: Synthese von Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH
  • Das in Beispiel 19 erhaltene Boc-Gly-Phe-Leu-OBzl (1,7 g) wurde in einer gemischten Lösung aus Ethylacetat (30 ml) und Methanol (30 ml) gelöst und mit 5% Pd-C (1,5 g) versetzt, um eine katalytische Reduktion durchzuführen. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, und das Filtrat wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, um die Titelverbindung (1,15 g) zu ergeben
  • Beispiel 21: Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Das in Beispiel 20 erhaltene Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH (200 mg) und N-Hydroxysuccinimid (58 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (5 ml) gelöst. Nach Abkühlung auf 4°C wurde N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (104 mg) zu der Lösung zugegeben und gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine N,N-Dimethylformamid-Lösung (5 ml), in der das Methansulfonat von DX-8951 (224 mg) und Triethylamin (0,059 ml) gelöst worden waren, zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, unter Rühren bei Raumtemperatur für 16 Stunden unter Licht-abgeschirmten Bedingungen zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 10 : 1 Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure) gereinigt, um die Titelverbindung (200 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.35 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 8.08–8.18 (m, 2H), 7.75–7.85 (m, 2H), 7.32 (s, 1H), 7.10 (d, 2H, J = 6.8 Hz), 7.08–7.13 (m, 3H), 6.85–6.95 (br, 1Η), 6.40–6.65 (br, 1Η), 5.52–5.55 (m, 1Η), 5.46 (d, 1H, J = 18.5 Hz), 5.37 (d, 1Η, J = 18.5 Hz), 5.24 (s, 2H), 4.44–4.52 (m, 1Η), 4.15–4.25 (m, 1H), 3.68–3.72 (m, 2H), 3.40–3.52 (m, 2H), 3.15–3.25 (br, 2H), 2.85–2.95 (m, 1Η), 2.65–2.75 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.05–2.25 (m, 1H), 1.80–1.91 (m, 2H), 1.50–1.65 (m, 1H), 1.45 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 1.35 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J = 7.4), 0.86 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.82 (d, 3H, J = 6.4 Hz).
  • Beispiel 22: Synthese des 3'-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salzes
  • Das in Beispiel 21 erhaltene 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (97 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst, und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde einer azeotropen Destillation zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) unterworfen, und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (95 mg) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.57 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.47 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 8.32 (d, 1Η, J = 7.8 Hz), 8.17 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 7.81–7.91 (br, 3H), 7.79 (d, 1Η, J = 10.7 Hz), 7.32 (s, 1Η), 7.21–7.23 (m, 5H), 7.12–7.17 (m, 1H), 6.45–6.55 (br, 1Η), 5.57 (q, 1Η, J = 4.4 Hz), 5.43 (d, 1H, J = 16.1 Hz), 5.34 (d, 1Η, J = 16.1 Hz), 5.23 (s, 2H), 4.67 (dt, 1Η, J = 4.0 Hz, J = 9.0 Hz), 4.31 (dd, 1Η, J = 8.5 Hz, J = 15.0 Hz), 4.0–4.4 (br, 1H), 3.74–3.76 (m, 2H), 3.56 (dd, 1H, J = 6.0 Hz, J = 16.0 Hz), 3.41 (dd, 1H, J = 6.0 Hz, J = 16.0 Hz), 3.17–3.19 (br, 2H), 3.02 (dd, 1H, J = 4.0 Hz, J = 14.0 Hz), 2.70 (dd, 1Η, J = 10.0 Hz, J = 14.0 Hz), 2.40 (s, 3H), 2.05–2.15 (m, 1H), 1.85 (dt, 2H, J = 7.0 Hz, J = 14.0 Hz), 1.50–1.55 (m, 1H), 1.45 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 1.35 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J = 7.4), 0.85 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.80 (d, 3H, J = 6.4 Hz).
  • Beispiel 23: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Phe-Leu-Gly-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 13 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (690 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (50 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 22 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (95 mg) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), Triethylamin (0,03 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2- dihydroxychinolin (690 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Zu dieser Mischung wurden 3 M wässriges Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden anschließend mittels Zentrifugation gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst, mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und gegen gereinigtes Wasser dialysiert unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut-off Molekulargewicht; 6000–8000). Die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (600 mg) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 4,8% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 24: Synthese des Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Dextran T500 (10 g, Pharmacia, Molekulargewicht: 500 K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 5000 ml) gelöst und mit einer wässrigen Lösung (5000 ml) von Natriumperiodat (165,0 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (35,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (70 g) wurde zugegeben und gelöst, und anschließend wurde die Mischung über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und für eine Stunde bei 4°C gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran unterworfen, um die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht zu entfernen. Die Polymer-Fraktion wurde lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (27,1 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 140 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextranpolyalkohol (5 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (21 g) in Wasser (150 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (30 g) unter Eiskühlung zugegeben und gelöst, und der Mischung wurde anschließend erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8. eingestellt und anschließend mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (5,6 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 263 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard) und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,4.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) aufgegeben und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und lyophilisiert, um die Titelverbindung (2,2 g) zu erhalten.
  • Beispiel 25: Synthese des Trimethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Das Natrium-Salz des in Beispiel 24 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, Me3N H+ Form) Säule aufgegeben und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde lyophilisiert, um die Titelverbindung (950 mg) zu erhalten.
  • Beispiel 26: Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) hydrochlorid
  • In einer Weise ähnlich der aus Beispiel 14 wurde das von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) erhaltene 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A trifluoressigsäure-Salz (400 mg) in Wasser/MeOH (1 : 4) gelöst, auf eine Bio-Rad AG 1-X8 (200–400 mesh, Cl– Form) Säule (1,5 cm × 8,6 cm) aufgegeben und mit dem obigen Lösungsmittel eluiert. Dieses Eluat wurde konzentriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (310 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.53 (d, 1Η, J = 8.5 Ηz), 8.46–8.48 (m, 1H), 8.37–8.39 (m, 1H), 7.95 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.80 (s, 3H), 7.78 (d, 1H, J = 11.1 Hz), 7.34 (s, 1H), 7.14–7.24 (m, 5H), 6.50 (s, 1H), 5.56–5.60 (m, 1Η), 5.35–5.40 (m, 2H), 5.24 (s, 2Η), 4.51–4.56 (m, 1Η), 3.86 (dd, J = 4.8, 13.5 Hz, 1Η), 3.68–3.79 (m, 3H), 3.54 (s, 2H), 3.15–3.22 (m, 2H), 3.01 (dd, J = 5.6, 13.5 Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 9.6, 3.5 Hz, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.12–2.23 (m, 2H), 1.81–1.89 (m, 2H), 0.88 (t, 3H, J = 7.2 Hz).
    Masse (FAB); m/e 753 (M + 1)
  • Beispiel 27: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Trimethylammonium-Salz des in Beispiel 25 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (0,1 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (6 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 26 erhaltenen Hydrochlorides von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (24 mg) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), Triethylamin (5 μl) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (0,1 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Zu dieser Mischung wurden 3 M wässriges Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden anschließend mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde entsalzt mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (90 mg) zu ergeben. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 11% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 28: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Trimethylammonium-Salz des in Beispiel 25 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (0,1 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (6 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 26 erhaltenen Hydrochlorides von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (36 mg) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), Triethylamin (8 μl) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (0,1 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Zu dieser Mischung wurden 3 M wässriges Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) zugegeben, und der abgeschiedene Niederschlag wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 12 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (90 mg) zu ergeben. Das durch GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,36 μg/ml) sind in 8 bzw. 9 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 15% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 29: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Dextran T250 (20 g, EXTRASYNTHESE, durchschnittliches Molekulargewicht: 250 K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 2000 ml) gelöst und mit einer in wässrigen Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und anschließend wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und für eine Stunde bei 4°C gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht wurde aus der erhaltenen wässrigen Lösung mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran entfernt, um die zurückbehaltene Lösung 1 zu erhalten, welche nicht die Membran passierte. Separat wurde Dextran T250 (50 g, EXTRASYNTHESE, durchschnittliches Molekulargewicht: 250 K) in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 5000 ml) gelöst und mit einer wässrigen Lösung (5000 ml) von Natriumperiodat (165 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (35,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Eiskühlung mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (70 g) wurde zugegeben und gelöst, und anschließend wurde die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und für eine Stunde bei 4°C gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht wurde aus der resultierenden wässrigen Lösung mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran entfernt, um die zurückbehaltene Lösung 2 zu erhalten, welche die Membran nicht passierte. Die zurückbehaltenen Lösungen 1 und 2 wurden vereinigt und einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran unterworfen, um die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht aus der Fraktion, die die Biomax-50 Membran passiert hatte, zu entfernen und lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (25,7 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 47 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextranpolyalkohol (5 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (35 g) in Wasser (150 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (50 g) unter Eiskühlung zugegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 18 Stunden zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (7,2 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 127 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard) und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,8. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,2 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) aufgegeben und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,69 g) zu ergeben.
  • Dieses Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,67 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (200 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung, die erhalten wurde durch Lösen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A, welches durch Entfernung der Boc-Gruppe gemäß einem ähnlichen Verfahren wie dem aus Beispiel 16 von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (350 mg) erhalten worden war, welches in einer ähnlichen Weise wie das aus Beispiel 2 hergestellt wurde, und Triethylamin (0,116 ml) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), und eine Lösung, welche erhalten wurde durch Lösen von 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (2,67 g) in N,N-Dimethylformamid (10 ml), zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (100 ml) versetzt, und jeweils 8 ml-Portionen der Mischung wurden tropfenweise zu jeweils 30 ml Ethanol gegeben. Zu jeder Mischung wurden 3 M wässriges Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Aceton gewaschen und anschließend in Wasser gelöst, und mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (10 ml) versetzt, und anschließend mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt, und darauf für eine Stunde bei 37°C behandelt. Die behandelte Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-10 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μ) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (2,30 g) zu ergeben. Das durch GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,20 mg/ml) sind in 10 bzw. 11 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,8% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 30: Synthese des Triethylammonium-Salzes von Carboxymethyldextranpolyalkohol
  • Zu einer Lösung (2000 ml) von Dextran T10 (20 g, Pharmacia, durchschnittliches Molekulargewicht: 10 K) in 0,1 M Essigsäure-Puffer (pH 5,5) wurde eine wässrige Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) gegeben. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abstimmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und für eine Stunde bei 4°C gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran (Millipore) unterworfen, um die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht zu entfernen, und die verbleibende Lösung, die die Membran nicht passiert hatte, wurde durch eine Biomax-30 Membran geleitet. Das resultierende Filtrat wurde lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (8,0 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 13 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextranpolyalkohol (3,7 g) wurde zu einer wässrigen Lösung zugegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (25,9 g) in Wasser (111 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Eiskühlung Monochloressig säure (37 g) zugegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 20 Stunden zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (6,2 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 37 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard) und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,9.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (6,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule gegeben, und anschließend mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (9,3 ml) versetzt und anschließend filtriert, um die Titelverbindung (7,2 g) zu erhalten.
  • Beispiel 31: Synthese des Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Der in Beispiel 30 erhaltene Dextranpolyalkohol (3,9 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (16,3 g) in Wasser (117 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Eiskühlung Monochloressigsäure (23,4 g) gegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 18 Stunden zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (5,0 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 28 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard) und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,5. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (4,8 mg) wurde in das Triethylammonium-Salz auf eine ähnliche Weise wie der aus Beispiel 30 überführt, um die Titelverbindung (5,6 g) zu erhalten.
  • Beispiel 32: Synthese des Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Eine wässrige Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) wurde zu einer Lösung (2000 ml) von Dextran 4 (20 g, Funakoshi, durchschnittliches Molekulargewicht: 4 K–6 K) in 0,1 M Essigsäure-Puffer (pH 5,5) gegeben. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und bei 4°C für eine Stunde gerührt, und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-3 Membran (Millipore) unterworfen, um die Fraktion mit dem niedrigen Molekulargewicht zu entfernen. Das erhaltene Filtrat wurde lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (6,0 g) zu ergeben. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 9 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard). Dieser Dextranpolyalkohol (2,7 g) wurde zu einer wässrigen Lösung zugegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (18,9 g) in Wasser (81 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (27 g) unter Eiskühlung zugegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, für 20 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (4,2 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 20 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,9.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (4,0 g) wurde in das Triethylammonium-Salz in einer ähnliche Weise wie das aus Beispiel 30 umgewandelt, um die Titelverbindung (4,8 g) zu erhalten.
  • Beispiel 33: Synthese des Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Der in Beispiel 32 erhaltene Dextranpolyalkohol (2,7 g) wurde zu einer wässrigen Lösung zugegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (11,3 g) in Wasser (81 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (16,2 g) unter Eiskühlung zugegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 18 Stunden zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,7 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 16 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,5. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,7 g) wurde in das Triethylammonium-Salz auf eine ähnliche Weise wie das in Beispiel 30 umgewandelt, um die Titelverbindung (3,1 g) zu erhalten.
  • Beispiel 34: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 30 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,5 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung aus Triethylamin (0,07 ml) und des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (210 mg) in N,N-Dimethylformamid (40 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,5 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und anschließend wurden die abgeschiedenen Niederschläge mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-3 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert, und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,3 g) zu erhalten. Das nach GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 65 μg/ml) sind in 12 bzw. 13 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 6,4% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 35: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 31 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,2 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung aus Triethylamin (0,056 ml) und des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (168 mg) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,2 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-3 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert, und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,0 g) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 4,8% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 36: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 32 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,2 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde nacheinander eine Lösung aus Triethylamin (0,056 ml) und des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (168 mg) in N,N-Dimethylformamid (30 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,2 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen diese Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-3 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert, und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,0 g) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 5,9% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 37: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 33 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,5 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (90 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung aus Triethylamin (0,07 ml) und des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (210 mg) in N,N-Dimethylformamid (40 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,5 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-3 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert, und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,3 g) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 4,6% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 38: Synthese von Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (A-NH2 = DW-8286)
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (42 mg) und N-Hydroxysuccinimid (12 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (2 ml) gelöst und auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (22 mg) versetzt. Zu dieser Lösung, wurde eine N,N-Dimethylformamid-Lösung (6 ml), in der das Hydrochlorid der durch die folgende Formel dargestellten Verbindung:
  • Figure 00520001
  • [(1s,9s)-1-Amino-5-chloro-9-ethyl-2,3-dihydro-9-hydroxy-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4': 6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H]-dion: DW-8286] (50 mg) und Triethylamin (0,01 ml) gelöst worden waren, zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, unter Rüh ren und Abschirmung des Lichts bei Raumtemperatur für 16 Stunden zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 10 : 1 Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure) aufgereinigt, um die Titelverbindung (27 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (CDCl3) δ: 8.10–8.20 (br, 1H), 7.95–8.05 (br, 1Η), 7.70–7.80 (br, 2H), 7.50–7.60 (br, 1Η), 7.40–7.50 (br, 1Η), 7.10–7.25 (m, 5H), 7.05–7.15 (br, 1Η), 5.85–5.95 (br, 1Η), 5.50–5.60 (br, 1H), 5.40–5.50 (m, 1H), 5.25–5.35 (m, 1Η), 5.05–5.15 (m, 1H), 4.90–5.00 (m, 1H), 4.70–4.80 (br, 1Η), 4.10–4.25 (br, 2Η), 3.60–3.90 (m, 4H), 3.10–3.40 (m, 3Η), 2.95–3.05 (br, 1H), 2.15–2.30 (br, 1H), 1.75–1.90 (br, 2Η), 1.39 (s, 9Η), 0.80–1.00 (m, 3H).
  • Beispiel 39: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NΗ-A' (A-NH2 = DW-8286)
  • Das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (175 mg), welches in Beispiel 24 erhalten wurde, wurde in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung, des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A, (A-NH2 = DW-8286) (29 mg), welches durch Entfernung der Boc-Gruppe gemäß einem ähnlichen Verfahren wie dem aus Beispiel 4 von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (27 mg) erhalten worden war, und Triethylamin (9 μl) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (175 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Zu der Mischung wurden 3 M wässriges Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Milli pore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (135 mg) zu erhalten. Das durch GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 99 μg/ml) sind in 14 bzw. 15 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 6,1% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 40: Synthese von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DW-8089)
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly (163 mg) und N-Hydroxysuccinimid (45 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst und auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (79 mg) versetzt. Zu dieser Lösung, wurde eine N,N-Dimethylformamid-Lösung (30 ml), in der das Tosylat der durch die folgende Formel dargestellten Verbindung:
  • Figure 00540001
  • [(1s,9s)-1-Amino-9-ethyl-2,3-dihydro-9-hydroxy-1Η,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H]-dion: DW-8089] (170 mg) und Triethylamin (0,054 ml) gelöst worden waren, zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, unter Rühren und Licht-abgeschirmten Bedingungen bei Raumtemperatur über Nacht zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel : Dichlormethan : Methanol = 94 : 6 Lösung, enthaltend 0,5% Essigsäure) auf gereinigt, um die Titelverbindung (100 mg) zu erhalten.
    1Η-NMR (DMSO-d6) δ: 8.51 (d, 1Η, J = 8.5 Hz), 8.41 (t, 1Η, J = 5.6 Hz), 8.29 (s, 1Η), 8.17 (d, 1Η, J = 8.0 Ηz), 8.03 (d, 1Η, J = 8.0 Ηz), 7.90 (dd, 1Η, J = 4.8, 5.6 Ηz), 7.79 (t, 1Η, J = 5.6 Ηz), 7.53 (d, 1Η, J = 7.2 Ηz), 7.36 (s, 1Η), 7.13–7.25 (m, 5H), 6.94–6.95 (m, 1Η), 5.60–5.63 (m, 1H), 5.36–5.47 (m, 2Η), 5.21–5.30 (m, 2H), 4.42–4.47 (m, 1Η), 3.63–3.96 (m, 3Η), 3.51–3.59 (m, 3Η), 3.31–3.40 (m, 1Η), 3.09–3.21 (m, 1Η), 3.02 (dd, 1Η, J = 4.8, 13.5 Ηz), 2.76–2.81 (m, 1Η), 2.13–2.17 (m, 2H), 1.85–1.90 (m, 2Η), 1.37 (s, 9H), 0.89 (t, 3H, J = 8.0 Ηz).
    Masse (FAB); m/e 822 (M + 1)
  • Beispiel 41: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-NΗ-A' (A-NH2 = DW-8089)
  • Das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,6 g), welches in Beispiel 24 erhalten wurde, wurde in N,N-Dimethylformamid (60 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung, die durch Lösen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A, (A-NH2 = DW-8089), welches durch Entfernung der Boc-Gruppe in einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 4 von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A (200 mg), welches in Beispiel 40 hergestellt worden war, erhalten worden war, und Triethylamin (0,07 ml) in N,N-Dimethylformamid (20 ml), und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (1,6 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (25 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (2500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, anschließend in Wasser gelöst, und mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (20 ml) versetzt und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt. Diese Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-10 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (1,20 g) zu erhalten.
  • Das durch GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,26 mg/ml) sind in 16 bzw. 17 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,0% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 42: Synthese von Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OH
  • Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OBzl (670 mg), 10% Pd-C (100 mg) und Ammoniumformiat (200 mg) wurden zu DMF (5 ml) zugegeben und für drei Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, das Filtrat wurde unter verringertem Ruck bis zur Trockne verdampft und anschließend wurde der Rückstand mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 8 : 1 Lösung) gereinigt, um die Titelverbindung (300 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (CD3OD) δ: 7.16–7.45 (m, 20Η), 4.66 (dd, 1H, J = 9.8, 5.4 Ηz), 3.93 (d, 1H, J = 16.6 Ηz), 3.80 (d, 1Η, J = 17.6 Ηz), 3.78 (d, 1Η, J = 16.6 Ηz), 3.68 (d, 1H, J = 17.1 Hz), 3.23 (dd, 1H, J = 14.2, 5.4 Ηz), 2.90 (d, 1H, J = 3.7 Ηz), 2.90 (s, 1H).
  • Beispiel 43: Synthese von 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR-hydrochlorid
  • Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OH (100 mg) und N-Hydroxysuccinimid (22 mg) wurden in DMF (4 ml) gelöst, und die Mischung wurde mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (40 mg) unter Eiskühlung versetzt und für zwei Stunden bei 4°C gerührt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,019 ml) und Doxorubicin (DXR)-Hydrochlorid (92 mg), gelöst in DMF (20 mg) zugegeben, und die Mischung wurde für 16 Stunden bei 4°C gerührt. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 20 : 1 Lösung) gereinigt. Die resultierende Verbindung wurde in 75% Essigsäure (1 ml) gelöst und für 1 Stunde gerührt. Wasser (20 ml) wurde zugegeben, und die ausgefallene feste Masse wurde mittels Filtration entfernt, und anschließend wurde das Filtrat lyophilisiert und das resultierende Pulver in Wasser (5 ml) gelöst. Diese Lösung wurde durch eine AG-1X8 (Cl– Form) Säule durchgeleitet und mit Wasser eluiert, und anschließend wurde das Eluat mit Dichlormethan gewaschen, und die wässrige Schicht wurde lyophilisiert, um die Titelverbindung (40 mg) zu erhalten.
    1Η-NMR (CD3ΟD) δ: 7.95 (d, 1Η, J = 7.3 Hz), 7.82 (t, 1Η, J = 7.8 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.16–7.26 (m, 5H), 5.43 (d, 1H, J = 3.4 Hz), 5.14 (br, 1Η), 4.72 (s, 2H), 4.42 (dd, 1H, J = 8.3, 6.8 Hz), 4.30 (q, 1H, J = 6.8 Hz), 4.14–4.18 (m, 1H), 4.03 (d, 1H, J = 16.6 Hz), 4.02 (s, 3H), 3.86 (d, 1Η, J = 18.5 Hz), 3.83 (d, 1Η, J = 17.1 Hz), 3.75 (d, 1Η, J = 16.1 Hz), 3.73 (d, 1H, J = 16.1 Hz), 3.62 (br, 1Η), 3.58 (d, 1H, J = 16.6 Hz), 3.10–3.15 (m, 2H) 3.00 (d, 1Η, J = 18.6 Hz), 2.94 (dd, 1Η, J = 14.2, 8.8 Hz), 2.38 (d, 1Η, J = 14.2 Hz), 2.18 (dd, 1Η, J = 14.2, 4.4 Hz), 1.94–2.00 (m, 1H), 1.71 (dd, 1Η, J = 12.7, 4.4 Hz), 1.28 (d, 3H, J = 6.3 Hz).
  • Beispiel 44: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-DXR
  • Das Natrium-Salz des in Beispiel 24 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (1,5 g) wurde in das Trimethylammonium-Salz (1,2 g) in einer ähnlichen Weise wie in der aus Beispiel 25 überführt, und anschließend wurden 400 mg dieses Salzes in N,N-Dimethylformamid (24 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung aus 3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR-Hydrochlorid (76 mg) in N,N-Dimethylformamid (24 ml), Triethylamin (24 μl) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (400 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Die Mischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,5 ml) und Diethylether (20 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-30 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert, und anschließend lyophilisiert, und die Titelverbindung (40 mg) zu erhalten. Das durch GPC- Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl; Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 7,4, 36 μl) sind in 18 bzw. 19 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 6,0% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 480 nm in PBS (pH 7,4) bestimmt.
  • Beispiel 45: Synthese des Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Dextran T150 (20 g, Pharmacia, durchschnittliches Molekulargewicht: 150 K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 2000 ml) gelöst und mit einer wässrigen Lösung (2000 ml) von Natriumperiodat (66,0 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (14,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 7,5 eingestellt. Natriumborhydrid (28 g) wurde zugegeben und gelöst, und anschließend wurde die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt, und bei 4°C für 1 Stunde gerührt. Der pH der Mischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf 7,5 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde auf 500 ml mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran (Millipore) konzentriert, um Lösung 1 zu erhalten. Separat wurde eine Reihe von oben beschriebenen Vorgehensweisen durchgeführt unter Verwendung von Dextran T110 (20 g), um Lösung 2 zu erhalten. Lösung 1 und Lösung 2 wurden vereinigt, und die vereinigte Lösung wurde auf pH 3,0 eingestellt und bei 40°C für vier Stunden inkubiert, und anschließend auf pH 7 eingestellt, um eine Lösung zu erhalten, welche den Dextranpolyalkohol mit verringertem Molekulargewicht enthält. Die Lösung wurde durch eine Biomax-30 Membran geleitet und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran entsalzt, und anschließend lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (4,6 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 17 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieses Dextranpolyalkohol (2,5 g) wurde zu einer wässrigem Lösung zugegeben, wel che durch Lösen von Natriumhydroxid (17,5 g) in Wasser (75 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Eiskühlung Monochloressigsäure (25 g) zugegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, für 20 Stunden bei Raumtemperatur zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 9 eingestellt und anschließend mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-5 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (4,0 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 45 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,9.
  • Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (3,7 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule aufgebracht, und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (5,8 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (4,4 g) zu erhalten.
  • Beispiel 46: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A', (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (4,4 g), welcher in Beispiel 24 erhalten wurde, wurde in N,N-Dimethylformamid (300 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung von Triethylamin (0,19 ml) und des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A, (A-NH2 = DX-8951) (580 mg) in N,N-Dimethylformamid (45 ml), und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (4,4 g) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren und unter Abschirmung des Lichts zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit 1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt, und anschließend wurden jeweils 5 ml-Portionen der Mischung tropfenweise zu jeweils 25 ml Ethanol gegeben. Die Mischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in Wasser gelöst und gegen gereinigtes Wasser dialysiert unter Verwendung einer Dialyse-Membran (Spectrapore 1, Cut-Off Molekulargewicht; 6000–8000), und die innere Dialysat-Lösung wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (3,4 g) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 4,6% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 47: Synthese von α-Methylcarboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Der in Beispiel 45 erhaltene Dextranpolyalkohol (2 g) wurde zu einer wässrigen Lösung gegeben, welche durch Lösen von Natriumhydroxid (14 g) in Wasser (60 ml) erhalten wurde, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde unter Eiskühlung α-Brompropionsäure (19 ml) zugegeben und gelöst, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 18 Stunden zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextranpolyalkohols (2,95 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 45 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard). Der Grad an α-Methylcarboxymethylierung pro Saccharid-Rest wurde erhalten gemäß den Fällen des Carboxymethyldextranpolyalkohols wie folgt. Eine wässrige Lösung des Natrium-Salzes des α-Methylcarboxymethyldextranpolyalkohols wurde auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (H+ Form) Säule aufgebracht, und das Eluat wurde lyophilisiert und als eine Probe verwendet. Diese Probe wurde in einer überschüssigen, vorgeschriebenen Menge an 0,1 N wässriger Lösung von Natriumhydroxid gelöst und mit 0,1 N Salzsäure unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator titriert. Der Grad an α-Methylcarboxymethylierung wurde erhalten gemäß der Gleichung: Grad an α-Methylcarboxymethylierung = 13,4(a – b)/[s – 7,2(a – b)], worin "s" die Menge der verwendeten Probe (mg) darstellt, "a" die vorgeschriebene überschüssige Menge an 0,1 N wässriger Natriumhydroxid-Lösung (ml) ist, und "b" die Menge an 0,1Η Salzsäure, die für die die Tradition verbraucht wurde (ml), darstellt. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass der Grad an α-Methylcarboxymethylierung 0,8 beträgt.
  • Dieses Natrium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextranpolyalkohols (2,2 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, H+ Form) Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) aufgebracht, und anschließend mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextranpolyalkohols (2,69 g) zu ergeben.
  • Dieses Triethylammonium-Salz des α-Methylcarboxymethyldextranpolyalkohols (2,68 g) wurde in N,N-Dimethylformamid (60 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung, welche durch Lösen des Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (A-NH2 = DX-8951), welches in einer ähnlichen Weise wie das aus Beispiel 16 durch Entfernung der Boc-Gruppe von 3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A (350 mg), welches ähnlich wie das aus Beispiel 2 synthetisiert wurde, erhalten worden war, und Triethylamin (0,116 ml) in N,N-Dimethylformamid (10 ml) erhalten wurde, und eine Lösung, welche durch Lösen von 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (2,68 g) in N,N-Dimethylformamid (10 ml) erhalten wurde, zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (40 ml) versetzt, und jeweils 6 ml-Portionen der Mischung wurde tropfenweise zu jeweils 30 ml Ethanol gegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (1 ml) und Diethylether (5 ml) versetzt, und der abgeschiedene Niederschlag wurde mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Dieser Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen, anschließend in Wasser gelöst, mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (10 ml) versetzt, mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 9 eingestellt und für 1 Stunde bei 37°C behandelt. Diese behandelte Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-10 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (2,15 g) zu erhalten. Das mittels GPC-Analyse nach dem Lösen dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (0,1 M Tris-Puffer-Lösung, pH 9,0, 0,21 mg/ml) sind in 20 bzw. 21 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dem resultierenden Produkt betrug 5,9% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 48: Synthese des 3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salzes
  • Eine Mischung des p-Toluolsulfonsäure-Salzes von Phe-Gly-OBzl (3,06 g), Boc-Gly-OH (1,10 g), N-Hydroxysuccinimid (941 mg), N-Methylmorpholin (0,725 ml) und N,N-Dimethylformamid (40 ml) wurden auf 4°C gekühlt und mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (1,56 g) versetzt. Der Mischung wurde erlaubt, über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren zu reagieren, und anschließend wurde sie unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie gereinigt (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 98 : 2 Lösung), um Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl (1,93 g) zu ergeben.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.52 (dd, 1H, J = 5.6, 6.4 Hz), 7.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.30–7.39 (m, 5H), 7.15–7.26 (m, 5H), 6.83 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 5.14 (s, 1H), 4.52–4.57 (m, 1Η), 3.87–3.96 (m, 2H), 3.57 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.43 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.01 (dd, 1H, J = 4.8, 14.3 Hz), 2.77 (dd, 1Η, J = 5.6, 14.3 Hz), 1.37 (s, 9H).
  • Das resultierende Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl (1,78 g) wurde in Ethylacetat (60 ml) gelöst und einer katalytischen Reduktion für 24 Stunden in der Gegenwart von 5%-Pd-C (1,8 g) unterworfen. Der Katalysator wurde mittels Filtration entfernt, und das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert, um Boc-Gly-Phe-Gly-OH (1,41 g) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.35 (t, 1Η, J = 5.6 Ηz), 7.94 (d, 1H, J = 8.8 Ηz), 7.15–7.26 (m, 5H), 6.85 (dd, 1Η, J = 5.6, 6.4 Ηz), 4.52–4.58 (m, 1H), 3.76 (d, 2H, J = 5.6 Hz), 3.56 (dd, 1Η, J = 6.4, 16.7 Hz), 3.43 (dd, 1Η, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.03 (dd, 1Η, J = 5.0, 13.5 Ηz), 2.79 (dd, 1H, J = 9.5, 13.5 Hz), 1.37 (s, 9H).
  • Das oben erhaltene Boc-Gly-Phe-Gly-OH (500 mg) und N-Hydroxysuccinimid (161 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine N,N- Dimethylformamid (50 ml)-Lösung, in der das Methansulfonat von DX-8951 (530 mg) und Triethylamin (0,146 ml) gelöst waren, zugegeben. Die Mischung wurde auf 4°C gekühlt, mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (268 mg) versetzt, und ihr wurde erlaubt, über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur unter Licht-abgeschirmten Bedingungen zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 96 : 4 Lösung) gereinigt, um 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (100 mg) zu erhalten.
    1Η-NMR (DMSO-d6) δ: 8.39 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.34 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.98 (d, 1Η, J = 7.2 Hz), 7.78 (d, 1Η, J = 10.3 Hz), 7.33 (s, 1H), 7.13–7.24 (m, 5Η), 6.80 (dd, 1H, J = 5.6, 6.4 Hz), 5.55–5.61 (m, 1Η), 5.44 (d, 1H, J = 16.0 Hz), 5.41 (d, 1H, J = 16.0 Hz), 5.25 (s, 2H), 4.43–4.46 (m, 1H), 3.69–3.79 (m, 2H), 3.50 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.41 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.16–3.19 (m, 2H), 2.98 (dd, 1Η, J = 4.8, 14.3 Hz), 2.79 (dd, 1H, J = 9.5, 14.3 Hz), 2.41 (s, 3H), 2.19–2.25 (m, 1Η), 2.10–2.15 (m, 1H), 1.82–1.90 (m, 2Η), 1.35 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J = 8.0 Hz).
    Masse (FAB); m/e 797 (M + 1)
  • Das resultierende 3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (100 mg) wurde in Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst, und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde azeotropen Destillationen zweimal mit Methanol (30 ml) und zweimal mit Ethanol (30 ml) unterworfen und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (80 mg) zu erhalten.
    1Η-NMR (DMSO-d6) δ: 8.52–8.62 (m, 1H), 7.94 (s, 3H), 7.79 (t, 1H, J = 11.1 Hz), 7.34 (s, 1Η), 7.15–7.27 (m, 5H), 6.52 (s, 1H), 5.57–5.61 (m, 1H), 5.36–5.46 (m, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.66–4.70 (m, 1Η), 3.69–3.81 (m, 2H), 3.61–3.68 (m, 1H), 3.40–3.47 (m, 1Η), 3.15–3.23 (m, 1H), 3.01 (dd, 1H, J = 4.0, 13.5 Hz), 2.77 (dd, 1Η, J = 9.5, 13.5 Hz), 2.12–2.23 (m, 2H), 1.81–1.91 (m, 2H), 0.89 (t, 3H, J = 7.2 Hz).
    Masse (FAB); m/e 697 (M + 1)
  • Beispiel 49: Synthese des 3'-N-(Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salzes
  • Boc-Phe-Gly (771 mg) und N-Hydroxysuccinimid (300 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine N,N-Dimethylformamid (50 ml)-Lösung, in der das Methansulfonat von DX-8951 (1058 mg) und Triethylamin (0,293 ml) gelöst worden waren, zugegeben. Die Mischung wurde auf 4°C gekühlt, und anschließend mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (494 mg) versetzt, und ihr wurde erlaubt, unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht unter Licht-abgeschirmten Bedingungen zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 98: 2 Lösung) aufgereinigt, um 3'-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (1,20 g) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.29 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.21 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 7.76 (d, 1Η, J = 10.3 Hz), 7.32 (s, 1H), 7.13–7.25 (m, 5Η), 6.92 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 6.49 (s, 1Η), 5.56–5.61 (m, 1H), 5.44 (d, 1Η, J = 15.9 Hz), 5.38 (d, 1Η, J = 15.9 Hz), 5.25 (s, 2H), 4.08–4.12 (m, 1H), 3.78 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 3.16–3.25 (m, 2H), 2.99 (dd, 1Η, J = 4.0, 13.5 Hz), 2.72 (dd, 1Η, J = 10.3, 13.5 Hz), 2.40 (s, 3H), 2.09–2.35 (m, 2H), 1.80–1.91 (m, 2H), 1.16 (s, 9H), 0.88 (t, 3H, J = 8.0 Hz).
    Masse (FAB); m/e 741 (M + 1)
  • Das oben erhaltene 3'-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A (170 mg) wurde in Trifluoressigsäure (4 ml) gelöst, und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde azeotropen Destillationen zweimal mit Methanol (10 ml) und zweimal mit Ethanol (10 ml) unterworfen und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (100 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.88 (t, 1H, J = 4.8 Hz), 8.68 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.05–8.15 (m, 3H), 7.79 (d, 1H, J = 11.1 Hz), 7.26–7.36 (m, 5Η), 6.52 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 5.57–5.62 (m, 1H), 5.43 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 5.38 (d, 1H, J = 15.9 Ηz), 5.19–5.28 (m, 1H), 4.10–4.18 (m, 1H), 3.93 (dd, 1Η, J = 4.8, 16.7 Hz), 3.82 (dd, 1Η, J = 4.8, 16.7 Hz), 3.17–3.24 (m, 2H), 3.14 (dd, 1Η, J = 4.8, 13.5 Ηz), 2.95 (dd, 1Η, J = 8.0, 13.5 Hz), 2.42 (s, 3H), 2.14–2.25 (m, 2Η), 1.83–1.91 (m, 2H), 0.89 (t, 3H, J = 8.0 Hz).
    Masse (FAB); m/e 640 (M + 1)
  • Beispiel 50: Synthese des 3'-N-Gly-NH-A (A-NH2 = DX-8951) trifluoressigsäure-Salzes
  • Das Methansulfonat von DX-8951 (530 mg) und Triethylamin (0,28 ml) wurden in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst, auf 4°C gekühlt und mit dem N-Hydroxysuccinimidester von Boc-Gly (327 mg) versetzt. Der Mischung wurde erlaubt, unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht unter Licht-abgeschirmten Bedingungen zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und anschließend wurde der Rückstand mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 98 : 2 Lösung) aufgereinigt, um 3'-N-(Boc-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (500 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.38 (d, 1Η, J = 8.3 Ηz), 7.77 (d, 1H, J = 10.7 Hz), 7.31 (s, 1Η), 6.89–6.91 (m, 1H), 6.49 (s, 1Η), 5.55–5.59 (m, 1H), 5.45 (d, 1H, J = 16.1 Hz), 5.38 (d, 1Η, J = 16.1 Hz), 5.27 (d, 1H, J = 19.0 Ηz), 5.18 (d, 1H, J = 19.0 Hz), 3.50–3.62 (m, 2Η), 3.15–3.19 (m, 2Η), 2.41 (s, 3H), 2.18–2.24 (m, 1H), 2.08–2.12 (m, 1H), 1.81–1.91 (m, 2Η), 1.31 (s, 9H), 0.87 (t, 3H, J = 8.0 Hz).
    Masse (FAB); m/e 593 (M + 1)
  • Das oben erhaltene 3'-N-(Boc-Gly)-NH-A (100 mg) wurde in Trifluoressigsäure (2 ml) gelöst, und ihm wurde erlaubt, für eine Stunde zu stehen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde azeotropen Destillationen zweimal mit Methanol (10 ml) und zweimal mit Ethanol (10 ml) unterworfen und anschließend mit Ether gewaschen, um die Titelverbindung (70 mg) zu erhalten.
    1Η-NMR (DMSO-d6) δ: 8.88 (d, 1Η, J = 8.8 Ηz), 8.08 (s, 3H), 7.81 (d, 1Η, J = 11.2 Ηz), 7.34 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.63–5.67 (m, 1H), 5.45 (d, 1Η, J = 16.7 Hz), 5.40 (d, 1Η, J = 16.7 Hz), 5.36 (d, 1H, J = 19.1 Hz), 5.25 (d, 1Η, J = 19.1 Hz), 3.56 (s, 2Η), 3.11–3.19 (m, 2H), 2.43 (s, 3Η), 2.23–2.28 (m, 1H), 2.11–2.19 (m, 1Η), 1.81–1.91 (m, 2H), 0.88 (t, 3H, J = 8.0 Ηz).
    Masse (FAB); m/e 493 (M + 1)
  • Beispiel 51: Synthese des Trimethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols
  • Dextran T500 (50 Gramm, Pharmacia, Molekulargewicht: 500 K) wurde in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,5, 5000 ml) gelöst und mit einer wässrigen Lösung (5000 ml) von Natriumperiodat (165,0 g) versetzt. Nach Rühren bei 4°C für zehn Tage unter Abschirmung des Lichts wurde die Mischung mit Ethylenglykol (35,0 ml) versetzt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7 eingestellt. Natriumborhydrid (70 g) wurde zugegeben und gelöst, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eisgekühlt, mit Essigsäure auf pH 5,5 eingestellt und bei 4°C für eine Stunde gerührt und anschließend mit 8 M wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um Dextranpolyalkohol (20,2 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 159 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard).
  • Dieser Dextranpolyalkohol (7,5 g) wurde zu einer wässrigen Lösung zugegeben, welcher durch Lösung von Natriumhydroxid (31,5 g) in Wasser (225 ml) erhalten worden war, und bei Raumtemperatur gelöst. Zu dieser Lösung wurde Monochloressigsäure (45 g) unter Eiskühlung zugegeben und gelöst, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure auf pH 8 eingestellt und anschließend mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde lyophilisiert, um das Natrium-Salz das Carboxymethyldextranpolyalkohols (8,5 g) zu erhalten. Das Molekulargewicht dieser Substanz betrug 274 K (Gelfiltration, Pullulan-Standard), und der Carboxymethylierungsgrad betrug 0,4. Dieses Natrium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,0 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh (H+ Form) Säule (Durchmesser: 44 mm, Länge: 210 mm) aufgebracht und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde mit Triethylamin (4 ml) versetzt und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (2,2 g) zu erhalten.
  • Beispiel 52: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 51 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (200 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (7 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 48 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (41 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml), Triethylamin (0,014 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (100 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Die Mischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,0 ml) und Diethylether (25 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurde mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche nicht die Membran passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (190 mg) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 4,5% (W/W), wenn basierend auf der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 53: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Phe-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Natrium-Salz des in Beispiel 24 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,5 g) wurde in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, Et3N H+ Form) Säule aufgebracht und mit Wasser eluiert. Dieses Eluat wurde lyophilisiert, um das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (2,5 g) zu ergeben.
  • Das Triethylammonium-Salz des Carboxymethyldextranpolyalkohols (200 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (12 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 49 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-(Phe-Gly)-NH-A (A-NH2 = DX-8951) (42 mg) und Triethylamin (0,016 ml) in N,N-Dimethylformamid (5 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (200 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren und unter Abschirmung des Lichts zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mit Wasser (300 ml) versetzt und einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran 10 K (Filtron) unterworfen. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde mit 0,1 N wässrigem Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt und durch eine Filtrationsmembran (0,16 μm, Filtron) geleitet. Das Filtrat wurde unter Verwendung einer Biomax-50 Membran mittels Ultrafiltration entsalzt und anschließend durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und lyophilisiert, um die Titelverbindung (180 mg) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 6,1% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer-Lösung (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 54: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951)
  • Das Triethylammonium-Salz des in Beispiel 51 erhaltenen Carboxymethyldextranpolyalkohols (370 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (10 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 50 erhaltenen Trifluoressigsäure-Salzes von 3'-N-Gly-NH-A' (A-NH2 = DX-8951) (57 mg) in N,N-Dimethylformamid (3 ml), Triethylamin (0,027 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (185 mg) zugegeben, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 5 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol gegeben. Die Mischung wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,0 ml) und Diethylether (25 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (3500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden in 0,5 M wässrigem Natriumchlorid gelöst und mit 0,1 M wässrigem Natriumhydroxid unter Eiskühlung auf pH 9 eingestellt. Die resultierende wässrige Lösung wurden mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, welche die Membran nicht passiert hatte, wurde durch einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (290 mg) zu erhalten. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in dieser Verbindung betrug 0,5% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 362 nm in 0,1 M Tris-Puffer (pH 9,0) bestimmt.
  • Beispiel 55: Synthese von Carboxymethyldextranpolyalkohol-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059
  • Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH (200 mg) wurde in Trifluoressigsäure (4 ml) gelöst und für 1,5 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde azeotropen Destillationen zweimal mit Methanol (10 ml) und zweimal mit Ethanol (10 ml) unterworfen und mit Ether gewaschen, um das Trifluoressigsäure-Salz von Gly-Gly-Phe-Gly-OH (225 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.48 (dd, 1H, J = 5.6, 5.6 Hz), 8.59 (dd, 1H, J = 5.6, 6.4 Hz), 8.29 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 7.23–7.26 (m, 4H), 7.16–7.20 (m, 1Η), 4.58 (ddd, 1H, J = 4.8, 4.8, 10.4 Hz), 3.89 (dd, 1Η, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.76–3.79 (m, 2H), 3.67 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.56 (s, 2H).
  • Das oben erhaltene Trifluoressigsäure-Salz von Gly-Gly-Phe-Gly-OH (200 mg) wurde in Wasser gelöst (10 ml), mit Triethylamin versetzt, um den pH auf 9,0 einzustellen, anschließend mit einer Lösung aus 9-Fluorenylmethyl N-Hydroxysuccinimidylcarbonat (200 mg) in Acetonitril (5 ml) versetzt und bei Raumtemperatur für vier Stunden unter Beibehaltung des pH im Bereich von 8,0 bis 8,5 unter Verwendung von Triethylamin gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 1,5 N Salzsäure (50 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 4 : 1 Lösung) aufgereinigt, um Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH (151 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.28–8.32 (m, 1H), 8.08–8.12 (m, 1Η), 7.85–7.89 (m, 2H), 7.68–7.72 (m, 2H), 7.57–7.65 (m, 1H), 7.38–7.43 (m, 2H), 7.29–7.34 (m, 2H), 7.20–7.25 (m, 4H), 7.14–7.17 (m, 1H), 4.45–4.52 (m, 1Η), 4.26–4.30 (m, 2H), 4.19–4.24 (m, 1H), 3.77 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.58–3.69 (m, 4H), 3.42–3.52 (m, 1Η), 3.06 (dd, 1Η, J = 4.0, 13.5 Hz), 2.78 (dd, 1Η, J = 4.0, 13.5 Hz).
  • Das oben erhaltene Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH (24 mg), das durch die folgende Formel repräsentierte Taxol-Derivat:
  • Figure 00700001
  • [D51-7059: 9,10-O-(2-Aminoethyliden)-13-O-[3-(tert butoxycarbonylamino)-2-hydroxy-3-phenyl]-propanoyl-10-deacetyl-9-dihydrobaccatin III] (20 mg), und N-Hydroxysuccinimid (7 mg) wurden in N,N-Dimethylformamid (1 ml) gelöst. Diese Lösung wurde auf 4 °C gekühlt und anschließend mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (9 mg) versetzt, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde unter verringertem Druck bis zur Trockne verdampft, und der Rückstand wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 96 : 4 Lösung) aufgereinigt, um Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059 (21 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (CDCl3) δ: 8.06 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.75 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.18–7.61 (m, 23H), 7.62 (dd, 1H, J = 7.2, 8.0 Hz), 6.07 (dd, 1Η, J = 7.9, 8.8 Hz), 5.98 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 5.63 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 5.00–5.40 (m, 4H), 4.92 (s, 1Η), 4.60–4.69 (m, 2H), 4.41 (d, 2H, J = 6.4 Hz), 4.35 (d, 1Η, J = 8.0 Hz), 4.29 (d, 1Η, J = 8.0 Hz), 4.21 (t, 1H, J = 7.5 Hz), 3.96–4.07 (m, 3H), 3.73–3.86 (m, 4H), 3.37–3.41 (m, 1Η), 3.19–3.23 (m, 1H), 3.00 (dd, 1Η, J = 8.0, 13.5 Hz), 2.85–2.89 (m, 3H), 2.29 (s, 3H), 2.05–2.40 (m, 4H), 1.57 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.22 (s, 3H).
    Masse (FAB); m/e 1413 (M + Na)
  • Das oben erhaltene Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059 (21 mg) wurde in Dichlormethan (1,8 ml) gelöst und mit Piperazin (0,2 ml) versetzt, und anschließend wurde der Mischung erlaubt, bei Raumtemperatur für 1 Stunde zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde mittels Silica-Gel Säulenchromatographie (Eluierungsmittel: Dichlormethan : Methanol = 94 : 6 Lösung) aufgereinigt, um Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059 (16 mg) zu erhalten.
    1H-NMR (CDCl3) δ: 8.10 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.89–7.94 (m, 1Η), 7.62 (dd, 1H, J = 7.2, 8.0 Hz), 7.45–7.50 (m, 2H), 7.17–7.42 (m, 12H), 7.10–7.16 (m, 1Η), 6.97 (dd, 1H, J = 5.6, 6.4 Hz), 6.08 (dd, 1Η, J = 8.0, 8.7 Hz), 6.02 (d, 1Η, J = 4.8 Hz), 5.62 (d, 1H, J = 11.1 Hz), 5.23–5.30 (m, 1H), 5.23 (d, 1Η, J = 7.2 Hz), 5.10 (s, 1H), 4.98–5.00 (m, 1Η), 4.60–4.63 (m, 1Η), 4.38 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 4.33 (d, 1Η, J = 8.8 Hz), 4.13 (s, 1Η), 4.04 (dd, 1H, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.93 (dd, 1Η, J = 5.6, 16.7 Hz), 3.82 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 3.73–3.82 (m, 2H), 3.43–3.49 (m, 1H), 3.30–3.38 (m, 2H), 3.24 (dd, 1H, J = 6.4, 14.3 Hz), 3.04 (dd, 1H, J = 8.0, 14.3 Hz), 2.89–3.07 (m, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.01–2.50 (m, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.62 (s, 3H), 1.61 (s, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.26 (s, 3H).
    Masse (FAB); m/e 1169 (M + 1)
  • Das gemäß dem obigen Verfahren hergestellte Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059 (33 mg) wurde in N,N-Dimethylformamid (0,5 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden nacheinander eine Lösung des in Beispiel 24 erhaltenen Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols (180 mg) in N,N-Dimethylformamid (7 ml) und 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (180 mg) zugegeben, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Jeweils 4 ml-Portionen dieser Reaktionsmischung wurden tropfenweise zu jeweils 10 ml Ethanol zugegeben. Jede wurde mit 3 M wässrigem Natriumchlorid (2,0 ml) und Diethylether (25 ml) versetzt, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (2500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, anschließend in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, Na+ Form) Säule (Durchmesser: 15 mm, Länge: 85 mm) aufgebracht und mit Wasser eluiert, um Lösung 1 zu erhalten. Separat wurde Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059 (10 mg) in N,N-Dimethylformamid (0,5 ml) gelöst, und anschließend nacheinander mit einer Lösung des in Beispiel 24 erhaltenen Triethylammonium-Salzes des Carboxymethyldextranpolyalkohols (60 mg) in N,N-Dimethylformamid (5 ml) und einer Lösung von 1-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxychinolin (60 mg) in N,N-Dimethylformamid (0,25 ml) versetzt, und der Mischung wurde erlaubt, bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren zu reagieren. Diese Reaktionsmischung wurde tropfenweise mit 10 ml Ethanol versetzt, und anschließend wurde der resultierenden Mischung 3 M wässriges Natriumchlorid (2,0 ml) und Diethylether (25 ml) zugegeben, und die abgeschiedenen Niederschläge wurden mittels Zentrifugation (2500 rpm, 8 Minuten) gesammelt. Die Niederschläge wurden mit Ethanol gewaschen, anschließend in Wasser gelöst, auf eine Bio-Rad AG 50W-X2 (200–400 mesh, Na+ Form) Säule (Durchmesser: 15 mm, Länge: 85 mm) aufgebracht und mit Wasser eluiert, um Lösung 2 zu erhalten. Lösung 1 und Lösung 2 wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Biomax-50 Membran entsalzt. Die verbleibende Lösung, die die Membran nicht passiert hatte, wurde über einen Millipore Filter (0,22 μm) filtriert und anschließend lyophilisiert, um die Titelverbindung (208 mg) zu erhalten. Das mittels GPC-Analyse nach dem Lösung dieser Verbindung in 0,1 M wässrigem Natriumchlorid (Säule: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, Lösungsmittel: 0,1 M NaCl, Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min) erhaltene Ergebnis und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der Verbindung (Methanol : Wasser = 10 : 1 Lösung, 1,69 mg/ml) sind in 22 bzw. 23 gezeigt. Der Gehalt des Restes der Wirkstoff-Verbindung in der Verbindung betrug 5,3% (W/W), wenn auf der Basis der Absorption bei 240 nm in einer Methanol : Wasser = 10 : 1-Lösung bestimmt.
  • Beispiel 56: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung.
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden gemäß einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes aus Beispiel 15 wurde geprüft durch eine einzelne Verabreichung in einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 12. Als ein Ergebnis zeigte der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15 eine bemerkenswert verstärkte Antitumor-Aktivität und einen breiteren effektiven Dosis-Bereich im Vergleich zu der Wirkstoff-Verbindung selber aus Beispiel 12.
  • Figure 00730001
  • Beispiel 57: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • SC-6 Tumor-tragende Nacktmäuse (5 Mäuse pro Gruppe) wurden durch subkutanes Transplantieren eines Stückes eines SC-6 humanen Magentumor-Blocks in die rechten inguinalen Regionen von Nacktmäusen (BALB/c-nu/nu, männlich) vorbereitet. An Tag 27 nach der Transplantation wurde der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15, gelöst in destilliertem Wasser zur Injektion, als eine einzelne intravenöse Verabreichung gegeben, und dessen Antitumor-Aktivität wurde verglichen mit der der Wirkstoff-Verbindung an sich. Als ein Ergebnis zeigte der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15 eine höhere Antitumor-Aktivität verglichen mit der Wirkstoff-Verbindung an sich, während es keinen Tod auf Grund Toxizität gab.
  • Figure 00730002
  • Beispiel 58: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Humanen Lungenkrebs QG-90-tragende Nacktmäuse (5 Mäuse pro Gruppe) wurden gemäß einem ähnlichen Verfahren wie dem aus Beispiel 57 vorbereitet. An Tag 16 nach der Transplantation wurde der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15, gelöst in destilliertem Wasser zur Injektion, als eine einzelne intravenöse Verabreichung gegeben, und dessen Antitumor-Aktivität wurde verglichen mit der der Wirkstoff-Verbindung an sich. Als ein Ergebnis zeigte der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15 eine bemerkenswert verstärkte Antitumor-Aktivität und einen breiteren effektiven Dosis-Bereich im Vergleich mit der Wirkstoff-Verbindung an sich.
  • Figure 00740001
  • Beispiel 59: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden gemäß einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes aus Beispiel 41 wurde bestimmt in Fällen einer einzelnen Verabreichung in einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 12, und dessen Antitumor-Aktivität wurde verglichen mit der der Wirkstoff-Verbindung an sich. Als ein Ergebnis zeigte der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 41 eine bemerkenswert verstärkte Antitumor-Aktivität und einen breiteren effektiven Dosis-Bereich im Vergleich mit der Wirkstoff-Verbindung an sich.
  • Figure 00750001
  • Beispiel 60: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden gemäß einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Aktivität wurde gemäß einem ähnlichen Verfahren wie dem aus Beispiel 12 durch einzelne Verabreichung der Wirkstoff-Komplexes aus den Beispielen 29, 46 bzw. 47 geprüft. Als ein Ergebnis zeigte jeder der Wirkstoff-Komplexe eine hohe Antitumor-Aktivität und einen breiteren effektiven Dosis-Bereich.
  • Figure 00760001
  • Beispiel 61: Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse (6 Mäuse pro Gruppe) wurden auf eine ähnliche Weise wie der aus Beispiel 11 vorbereitet, und die Antitumor-Aktivität des Wirkstoff-Komplexes aus Beispiel 44 wurde gemäß einem ähnlichen Verfahren wie dem aus Beispiel 12 durch eine einzelne Verabreichung geprüft, und dessen Antitumor-Aktivität wurde verglichen mit der der Wirkstoff-Verbindung (Doxorubicin) an sich. Als ein Ergebnis zeigte der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 44 eine bemerkenswert verstärkte Antitumor-Aktivität und einen breiteren effektiven Dosis-Bereich im Vergleich zu der Wirkstoff-Verbindung an sich.
  • Figure 00770001
  • Beispiel 62: Pharmakokinetiken des Wirkstoff Komplexes der vorliegenden Erfindung
  • Meth A Tumor-tragende Mäuse wurden auf eine ähnliche Weise wie der aus Beispiel 11 vorbereitet, der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15 wurde als eine einzelne Verabreichung in einer ähnlichen Weise wie der aus Beispiel 12 gegeben (10 mg/kg: berechnet als die Wirkstoff-Verbindung), und die Änderung der Konzentration des Wirkstoff-Komplexes in verschiedene Geweben wurde bestimmt. Als ein Ergebnis wurde herausgefunden, dass der Wirkstoff-Komplex aus Beispiel 15 eine extrem lange Retention des Blut-Levels, eine hohe Verteilung in Tumorgeweben und eine hohe Tumor-Selektivität gegen Leber und Dünndarm besitzt. Die Ergebnisse sind in 24 gezeigt.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Der Wirkstoff-Komplex der vorliegenden Erfindung, der mit dem Rest einer Wirkstoff-Verbindung wie eines antineoplastischen Mittels eingebracht wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine exzellente Selektivität gegenüber Tumor-Stellen besitzt, so dass er eine hohe antineoplastische Aktivität aufweist und ebenfalls ein verringertes Auftreten von Toxizität erzielt.

Claims (26)

  1. Arzneimittel-Komplex, dadurch gekennzeichnet, daß ein Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol und ein Rest einer Arzneimittel-Verbindung mit Hilfe eines eine Aminosäure umfassenden Spacers oder eines 2 bis 8 peptidgebundene Aminosäuren umfassenden Spacers aneinander gebunden sind.
  2. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Dextran-Polyalkohol, aus dem der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol besteht, ein Dextran-Polyalkohol ist, der erhalten wird durch Behandeln eines Dextrans unter Bedingungen, die im wesentlichen vollständige Polyalkoholisierung ermöglichen.
  3. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Carboxy(C1-4)-alkyldextran-Polyalkohol Carboxymethyldextran-Polyalkohol ist.
  4. Arzneimittel-Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Arzneimittel-Verbindung ein antineoplastisches Mittel oder ein entzündungshemmendes Mittel ist.
  5. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 4, wobei die Arzneimittel-Verbindung ein antineoplastisches Mittel ist, das konzentrationsabhängig antineoplastische Wirkung aufweist.
  6. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 4, wobei die Arzneimittel-Verbindung ein antineoplastisches Mittel ist, das zeitabhängig antineoplastische Wirkung aufweist.
  7. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 4, wobei das antineoplastische Mittel Doxorubicin oder (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion ist.
  8. Arzneimittel-Komplex nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Spacer ein durch -X-Z- dargestelltes Dipeptid ist, wobei -X-Z- einen Rest darstellt, der aus einem Dipeptid besteht, das durch Peptid-Bindung einer hydrophoben Aminosäure (X) und einer hydrophilen Aminosäure (Z) gebildet wird, die sich am N-terminalen Ende bzw. am C-terminalen Ende befinden und ein Wasserstoff-Atom und eine Hydroxyl-Gruppe aus der Amino-Gruppe am N-Terminus bzw. aus der Carboxyl-Gruppe am C-Terminus derselben entfernt sind, oder wobei der Spacer das Dipeptid als partielle Peptid-Sequenz enthält.
  9. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 8, wobei die hydrophobe Aminosäure Phenylalanin ist und die hydrophile Aminosäure Glycin ist.
  10. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 9, wobei der Spacer (N-Terminus)-Gly-Gly-Phe-Gly- ist.
  11. Arzneimittel-Komplex nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die eingebrachte Menge des Rests des antineoplastischen Mittels im Bereich von 1 bis 15 Gew.-% liegt.
  12. Arzneimittel-Komplex nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die eingebrachte Menge des Rests des antineoplastischen Mittels im Bereich von 3 bis 10 Gew.-% liegt.
  13. Arzneimittel-Komplex nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die eingebrachte Menge des Rests des antineoplastischen Mittels im Bereich von 5 bis 6 Gew.-% liegt.
  14. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 1, wobei der N-Terminus eines durch H2N-Gly-Gly-Phe-Gly-COOH dargestellten Peptids durch eine Säureamid-Bindung an eine Carboxyl-Gruppe eines Carboxymethyldextran-Polyalkohols gebunden ist und der C-Terminus des Peptids durch eine Säureamid-Bindung an die 1-Amino-Gruppe von (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion gebunden ist.
  15. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 14, wobei die eingebrachte Menge des (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion-Rests im Bereich von 2 bis 10 Gew.-% liegt.
  16. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Carboxy-(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 5.000 bis 500.000 und einem Carboxymethylierungsgrad im Bereich von 0,01 bis 2,0 ist.
  17. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Carboxy-(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 50.000 bis 450.000 und einem Carboxymethylierungsgrad im Bereich von 0,1 bis 1,0 ist.
  18. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Carboxy-(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 200.000 bis 400.000 und einem Carboxymethylierungsgrad im Bereich von 0,3 bis 0,5 ist.
  19. Arzneimittel-Komplex nach Anspruch 14, wobei die eingebrachte Menge des (1S,9S)-1-Amino-9-ethyl-5-fluor-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]chinolin-10,13(9H,15H)-dion-Rests im Bereich von 5 bis 6 Gew.-% liegt, das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols etwa 228.000 ist und der Carboxymethylierungsgrad etwa 0,4 beträgt.
  20. Arzneimittelbeförderungsträger zur Bindung einer Arzneimittel-Verbindung, die einen Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol umfaßt.
  21. Arzneimittelbeförderungsträger nach Anspruch 20, wobei das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols im Bereich von 5.000 bis 500.000 liegt und der Carboxymethylierungsgrad im Bereich von 0,01 bis 2,0 liegt.
  22. Arzneimittelbeförderungsträger nach Anspruch 20, wobei das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols im Bereich von 50.000 bis 450.000 liegt und der Carboxymethylierungsgrad im Bereich von 0,1 bis 1,0 liegt.
  23. Arzneimittelbeförderungsträger nach Anspruch 20, wobei das Molekulargewicht des Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols im Bereich von 200.000 bis 400.000 liegt und der Carboxymethylierungsgrad im Bereich von 0,3 bis 0,5 liegt.
  24. Arzneimittelbeförderungsträger nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol ein Carboxymethyldextran-Polyalkohol ist.
  25. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 19, der einen an einen Rest eines Arzneimittels gebundenen Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol enthält, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohols, der an einen Rest einer Arzneimittel-Verbindung gebunden ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Carboxy(C1-4)alkyldextran-Polyalkohol mit Hilfe eines Spacers oder ohne Spacer an das Arzneimittel gebunden ist.
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