ES2229354T3 - Complejos medicamentosos polialcohol-alquildextrano. - Google Patents
Complejos medicamentosos polialcohol-alquildextrano.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN COMPLEJO MEDICINAL QUE SE CARACTERIZA EN QUE UN RESIDUO DE UN COMPUESTO MEDICINAL TAL COMO LOS AGENTES ANTINEOPLASICOS Y UN POLIALCOHOL DE CARBOXI(C 14 )ALQUILDEX TRANO OBTENIDO MEDIANTE EL TRATAMIENTO DE UN DEXTRANO BAJO CONDICIONES QUE HACEN POSIBLE UNA POLIALCOHOLIZACION BASICAMENTE COMPLETA SE UNEN ENTRE SI POR MEDIO DE UN SEPARADOR QUE COMPRENDE UN AMINOACIDO O POR MEDIO DE UN SEPARADOR QUE COMPRENDE ENTRE 2 Y 8 AMINOACIDOS UNIDOS A UN PEPTIDO. EL COMPLEJO SE CARACTERIZA EN QUE TIENE UNA EXCELENTE SELECTIVIDAD PARA ZONAS TUMORALES DE FORMA QUE EXHIBE UNA ALTA ACTIVIDAD ANTINEOPLASICA Y TAMBIEN CONSIGUE UNA APARICION REDUCIDA DE TOXICIDAD.
Description
Complejos medicamentosos
polialcohol-alquildextrano.
La presente invención se refiere a un complejo
medicamentoso que es útil como medicamento. Más específicamente, la
presente invención se refiere a un complejo medicamentoso en el cual
un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano que
es un derivado de polisacárido y un compuesto medicamentoso tal
como un agente antineoplásico o anti-inflamatorio
están ligados entre sí por medio de un espaciador.
Los agentes antineoplásicos, utilizados para el
tratamiento de cánceres sólidos tales como cáncer de pulmón o
carcinomas de órganos digestivos, y cánceres de sangre tal como
leucemia, se administran sistémicamente a través de rutas de tales
como la administración intravenosa u oral y luego se distribuyen
hasta localizaciones tumorales específicas, e inhiben o suprimen la
proliferación de células cancerosas para mostrar su eficacia
terapéutica. Sin embargo, los agentes neoplásicos sistémicamente
administrados son rápidamente asimilados por el hígado y órganos
reticuloendoteliales desde la sangre, o rápidamente excretados en
la orina y, por tanto, su concentración en sangre puede reducirse en
ocasiones hasta ser insuficiente para su distribución en áreas
tumorales. Además, los agentes neoplásicos comunes presentan escasa
capacidad de distribución hacia áreas tumorales (selectividad
tumoral) y, por tanto, los agentes neoplásicos se distribuyen
uniformemente en diversos tejidos y células de todo el cuerpo y
actúan como citotoxinas también contra células y tejidos normales,
lo cual se traduce en problemas de aparición de efectos adversos,
por ejemplo emesis, pirexia o alopecia, en una proporción muy alta.
Por tanto, era deseable desarrollar un medio de distribución
eficiente y selectiva de agentes neoplásicos hacia áreas
tumorales.
Como uno de tales medios, se ha propuesto un
procedimiento en el cual un agente antineoplásico está ligado a un
polímero polisacárido para retrasar la desaparición del agente
antineoplásico de la sangre y mejorar la selectividad hacia tejidos
tumorales. Por ejemplo, la publicación de la patente japonesa
(KOKOKU) n° (Hei) 7-84481/1995 describe un complejo
medicamentoso en el cual daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina
C, bleomicina o similar se introduce en un derivado de manoglucano
carboximetilado por medio de una base Schiff o un enlace
ácido-amida. Como derivado de manoglucano, también
se utilizan en la invención polialcoholes manoglucanos
carboximetilados. Sin embargo, los derivados de manoglucano están
demasiado ramificados y presentan estructuras complicadas y, por
tanto, ha sido difícil obtener un producto con calidad uniforme
adecuado para fabricar medicamentos.
Además, la publicación de la patente
internacional WO94/19376 describe un complejo medicamentoso en el
cual una cadena peptídica (número de residuos aminoácidos: 1 a 8)
está ligada a un grupo carboxilo de un polisacárido que presenta
grupos carboxilo, y adicionalmente están ligados doxorrubicina,
daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina o similar por medio de la
cadena peptídica. Como polisacárido que presenta grupos carboxilo,
se ofrecen ejemplos tales como polisacáridos que presentan
inherentemente grupos carboxilo en sus estructuras (p. ej. ácido
hialurónico), y polisacáridos que no presentan inherentemente
grupos carboxilo en sus estructuras (p. ej. pululano, dextrano,
quitina, etc.) en los cuales sus grupos hidroxilo son modificados
con grupos carbonilo mediante introducción con grupos
carboxi(C_{1-4})alquilo o enlazando
con un ácido polibásico tal como ácido malónico o ácido succínico
mediante esterificación. Los complejos medicamentosos se
caracterizan estructuralmente porque un medicamento, tal como
doxorrubicina, y la fracción de polisacárido antes mencionada están
ligados por medio de un espaciador, y los complejos poseen mayor
actividad antineoplásica en comparación con la doxorrubicina y
toxicidad y efectos adversos reducidos.
En cuanto a las tecnologías relativas a complejos
medicamentosos utilizando derivados polisacáridos polialcoholizados
como transportadores-suministradores del
medicamento, están disponibles algunos informes, por ejemplo,
"Researches on
polysaccharide-peptide-doxorubicin
complexes-Correlations between stabilities of
polysaccharide carriers in blood and their
anti-neoplastic activities" (Abstracts of 10th
Meeting of the Japan Society of Drug Delivery System, 279, 1994);
"Researches on
polysaccharide-peptide-doxorubicin
complexes - Pharmacokinetics and anti-neoplastic
activity" (Abstracts of 9th Annual Meeting of Japanese Society
for the study of xenobiotics, 292, 1994); Abstracts of 19th Seminar
of Trends in Research and Development (organizada por The
Organization for Drug A D R Relief. R&D Promotion and Product
Review), D-9, 1995; y "Researches on drug
delivery to a tumor tissue by polysaccharide carriers" (Abstracts
of 12th Colloid and Interface Technology Symposium, The Chemical
Society of Japan, 51, 1995).
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un complejo medicamentoso capaz de hacer llegar con
selectividad de localización un ingrediente activo, tal como agentes
antitumorales o agentes anti-inflamatorios hacia
áreas tumorales o similares. Más específicamente, el objetivo de la
presente invención es proporcionar un complejo medicamentoso que
contiene un compuesto medicamentoso, tal como un agente neoplásico
o anti-inflamatorio, como una estructura parcial y
que puede ser retenido en la sangre durante un largo periodo de
tiempo, y adicionalmente, puede con selectividad de localización
hacer llegar el compuesto medicamentoso hacia áreas tumorales o
zonas inflamatorias. Además, otro objetivo de la presente invención
es proporcionar un procedimiento para la fabricación de complejos
medicamentosos que presentan las antes mencionadas
características.
Para lograr el objetivo anterior, los inventores
de la presente intentaron mejorar el complejo medicamentoso
descrito en la publicación de la patente internacional WO94/19376.
Como resultado, hallaron que cuando un derivado de dextrano
obtenido por
carboxi(C_{1-4})alquilación de un
dextrano polialcoholizado se utiliza como una fracción de
polisacárido en lugar de los polisacáridos que presentan grupos
carboxilo, se retiene una alta concentración del medicamento durante
un largo periodo de tiempo después de administración, y la
selectividad de localización hacia áreas tumorales o zonas
inflamatorias puede ser apreciablemente mejorada. También hallaron
que en estos compuestos su principal eficacia, tal como la
actividad antineoplásica, estaba notablemente mejorada, mientras que
la toxicidad se reduce. La presente invención se logró con base en
estos hallazgos.
La presente invención proporciona así un complejo
medicamentoso caracterizado porque un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano y un
residuo de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí por
medio de un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador
que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente. De
acuerdo con otras realizaciones de la presente invención, se
proporciona un medicamento que comprende el complejo medicamentoso
antes mencionado; y una composición farmacéutica que comprende el
complejo medicamentoso antes mencionado como un ingrediente activo,
por ejemplo preparaciones para inyectar o infusiones por goteo en
forma de productos liofilizados envasados en viales.
Adicionalmente, según otra realización de la presente invención, se
proporciona un procedimiento para la fabricación del complejo
medicamentoso antes mencionado.
Como realizaciones preferibles de la invención
antes mencionada, se proporciona el anterior complejo medicamentoso
caracterizado porque el polialcohol dextrano que constituye el
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol dextrano que se obtiene mediante tratamiento de un
dextrano bajo condiciones que permiten una polialcoholización
sustancialmente completa; el anterior complejo medicamentoso en el
cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano; el anterior complejo
medicamentoso en el cual el compuesto medicamentoso es un agente
antineoplásico o un agente anti-inflamatorio; el
anterior complejo medicamentoso en el cual el compuesto
medicamentoso es un agente antineoplásico que dependiendo de la
concentración posee actividad antineoplásica (un agente
antineoplásico que presenta más potente actividad antineoplásica
con una mayor concentración: en ocasiones denominado en la presente
descripción agente antineoplásico del tipo dependiente de la
concentración); el anterior complejo medicamentoso en el cual el
compuesto medicamentoso es un agente antineoplásico que posee
actividad antineoplásica en función del tiempo (un agente
antineoplásico que presenta más potente actividad antineoplásica con
tiempos de operación más largos: en ocasiones denominado en la
presente descripción agente antineoplásico del tipo dependiente del
tiempo); y el anterior complejo medicamentoso en el cual el agente
antineoplásico es doxorrubicina o
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1
H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona.
Además, como realizaciones también preferibles,
se proporcionan el anterior complejo medicamentoso en el cual el
espaciador es un dipéptido representado por -X-Z-[el
símbolo "-X-Z-" significa un residuo que
consta de un dipéptido que está formado mediante enlace peptídico de
un aminoácido hidrofóbico (X) y un aminoácido hidrofílico (Z)
situados en el extremo N-terminal y el extremo
C-terminal, respectivamente, y cuyo átomo de
hidrógeno y grupo hidroxilo son eliminados del grupo amino en la
N-terminación y el grupo carboxilo en la
C-terminación, respectivamente], o en el cual el
espaciador contiene el dipéptido como una secuencia peptídica
parcial; el anterior complejo medicamentoso en el cual el
aminoácido hidrofóbico es fenilalanina y el aminoácido hidrofílico
es glicina; el anterior complejo medicamentoso en el cual el
espaciador es
(N-terminación)-Gly-Gly-Phe-Gly-;
y el anterior complejo medicamentoso en el cual una cantidad
introducida del residuo del agente antineoplásico está en el
intervalo de 1 a 15% en peso, preferiblemente desde 3 a 10% en peso,
y más preferiblemente desde 5 a 6% en peso.
Como realizaciones particularmente preferibles de
la presente invención, se proporcionan el anterior complejo
medicamentoso en el cual la N-terminación de un
péptido representado por
H_{2}N-Gly-Gly-Phe-Gly-COOH
está ligada a un grupo carboxilo de polialcohol carboximetildextrano
por medio de un enlace ácido-amida y la
C-terminación del péptido está ligada al grupo
1-amino de
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona
por medio de un enlace ácido-amida; el anterior
complejo medicamentoso en el cual la cantidad introducida del
residuo
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona
está en el intervalo de 2 a 10% en peso; y el anterior complejo
medicamentoso en el cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano que presenta un peso molecular en
el intervalo de 5.000 a 500.000, preferiblemente en el intervalo de
50.000 a 450.000, y más preferiblemente en el intervalo de 200.000
a 400.000, y el grado de carboximetilación por cada residuo sacárido
constitutivo está en el intervalo de 0,01 a 2,0, preferiblemente en
el intervalo de 0,1 a 1,0, y más preferiblemente en el intervalo de
0,3 a 0,5.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, está previsto un
transportador-suministrador del medicamento que
comprende el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano.
Según realizaciones preferibles de este aspecto de la invención, el
peso molecular del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano está
en el intervalo de 5.000 a 500.000, preferiblemente en el intervalo
de 50.000 a 450.000, y más preferiblemente en el intervalo de
200.000 a 400.000, y el grado de carboximetilación por cada residuo
sacárido constitutivo está en el intervalo de 0,01 a 2,0,
preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 1,0, y más preferiblemente
en el intervalo de 0,3 a 0,5. El polialcohol carboximetildextrano
está previsto como el transportador-suministrador
más preferible. Desde otro aspecto de la invención, está previsto
el uso de un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano para
la fabricación de un complejo medicamentoso que contiene el
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano
ligado al residuo de un compuesto medicamentoso.
Como realizaciones preferibles de la presente
invención, se proporcionan el uso del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquil-
dextrano para la fabricación de un complejo medicamentoso en el cual el residuo de un compuesto medicamentoso y el polialcohol carboxi(C_{1-4}alquildextrano están ligados entre sí por medio de un espaciador; y el uso del polialcohol carboxi(C_{1-4})alquildextrano para la fabricación de un complejo medicamentoso caracterizado porque el polialcohol carboxi(C_{1-4})alquildextrano y el residuo de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí por medio de un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente.
dextrano para la fabricación de un complejo medicamentoso en el cual el residuo de un compuesto medicamentoso y el polialcohol carboxi(C_{1-4}alquildextrano están ligados entre sí por medio de un espaciador; y el uso del polialcohol carboxi(C_{1-4})alquildextrano para la fabricación de un complejo medicamentoso caracterizado porque el polialcohol carboxi(C_{1-4})alquildextrano y el residuo de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí por medio de un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente.
La Figura 1 representa el diagrama GPC
(cromatografía de permeación de gel) del complejo medicamentoso de
la presente invención (preparado en el Ejemplo 8).
La Figura 2 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 8).
La Figura 3 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 9).
La Figura 4 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 9).
La Figura 5 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 10).
La Figura 6 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 15).
La Figura 7 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 15).
La Figura 8 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 28).
La Figura 9 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 28).
La Figura 10 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 29).
La Figura 11 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 29).
La Figura 12 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 34).
La Figura 13 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 34).
La Figura 14 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 39).
La Figura 15 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 39).
La Figura 16 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 41).
La Figura 17 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 41).
La Figura 18 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 44).
La Figura 19 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 44).
La Figura 20 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 47).
La Figura 21 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 47).
La Figura 22 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 55).
La Figura 23 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso de la presente invención
(preparado en el Ejemplo 55).
La Figura 24 representa la farmacocinética del
complejo medicamentoso de la presente invención (preparado en el
Ejemplo 15). Cada punto en la figura representa un valor promedio de
tres experimentos.
El complejo medicamentoso de la presente
invención se caracteriza porque un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano y un
residuo de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí por
medio de un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador
que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente.
El residuo de un compuesto medicamentoso
contenido en el complejo medicamentoso de la presente invención se
deriva de un compuesto medicamentoso utilizado como un medicamento
para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de enfermedades de
mamíferos incluyendo el humano. Por ejemplo, un agente
antineoplásico, un agente anti-inflamatorio, un
agente antibacteriano, o similares, y el residuo está compuesto de
una estructura parcial del compuesto medicamentoso. Sin embargo, el
compuesto medicamentoso del cual se deriva el residuo no se limita a
los mencionados anteriormente. Además, como compuesto
medicamentoso, pueden ser utilizados cualesquiera compuestos siempre
que posean uno o más grupos funcionales reactivos capaces de
participar en la formación de enlace con un espaciador (por
ejemplo, grupo amino, grupo carboxilo, grupo hidroxilo, grupo tiol,
grupo éster o similares). El término "compuesto medicamentoso"
en la presente descripción también incluye un profármaco que
contiene, como parte de él, una estructura principal de un compuesto
medicamentoso que posee actividad farmacológica, por sí mismo, y
puede reproducir el compuesto in vivo.
Más específicamente, en la presente descripción
el término "residuo del compuesto medicamentoso" significa una
estructura parcial derivada del compuesto medicamentoso existente en
el compuesto después de la formación de enlace, presumiendo que un
enlace entre el espaciador y el residuo de un compuesto
medicamentoso se ha formado a través de una reacción de un grupo
funcional reactivo del compuesto medicamentoso y un grupo funcional
reactivo del espaciador (p. ej. condensación por deshidratación
etc.). Por ejemplo, cuando el compuesto medicamentoso se representa
por D-NH_{2}, D-COOH,
D-COOR, D-OH, D-SH,
D-CONH_{2}, o
D-NH-COOR (R es un grupo alquilo
inferior o similar), el residuo del compuesto medicamentoso se
representa por D-NH-
(D-NH-CO-Q etc.),
D-CO-
(D-CO-NH-Q,
D-CO-O-Q,
D-CO-S-Q, etc.),
D-CO-
(D-CO-NH-Q,
D-CO-O-Q,
D-CO-S-Q, etc.),
D-O-
(D-O-CO-Q,
D-O-Q, etc.), D-S-
(D-S-CO-Q,
D-S-Q, etc.),
D-CONH-
(D-CO-NH-CO-Q
etc.), y D-NH-CO-
(D-NH-CO-O-Q,
D-NH-CO-NH-Q,
etc.), respectivamente (el paréntesis representa un enlace entre el
espaciador y el residuo del compuesto medicamentoso, en el cual Q
representa una estructura parcial remanente del espaciador
excluyendo un grupo funcional reactivo). Sin embargo, el tipo de
enlace entre el espaciador y el residuo del compuesto medicamentoso
no se limita a los mencionados anteriormente. El residuo del
compuesto medicamentoso puede estar ligado al grupo amino
N-terminal o al grupo carboxilo
C-terminal del espaciador, o alternativamente,
puede estar ligado a un grupo funcional reactivo existente en un
aminoácido que constituye el espaciador.
Como residuo del compuesto medicamentoso, pueden
utilizarse preferiblemente, por ejemplo, residuos de agentes
neoplásicos tales como doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C,
bleomicina, ciclocitidína, vincristina, vinblastina, metotrexato,
agentes neoplásicos platinados (cisplatino o sus derivados), taxol
o sus derivados, camptotecina o sus derivados (agentes neoplásicos
descritos en la publicación de la patente japonesa sin examinar
(KOKAI) n° (Hei) 6-87746/1994, preferiblemente
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-(9H,15H)-diona
descrito en la reivindicación 2, o similares). Además, son también
preferibles residuos de agentes anti-inflamatorios
esteroides, tales como succinato de hidrocortisona y succinato de
prednisolona y agentes anti-inflamatorios no
esteroides, tales como ácido mefenámico, ácido flufenámico,
diclofenac, ibuprofeno y tinoridina.
Como espaciador que enlaza con el residuo del
compuesto medicamentoso, puede utilizarse un espaciador que
comprende un aminoácido o un espaciador que comprende 2 a 8
aminoácidos que están enlazados peptídicamente. Más
específicamente, el espaciador adopta una forma de residuo de un
aminoácido, lo cual significa un residuo obtenido mediante
eliminación de un átomo de hidrógeno y un grupo hidroxilo de un
grupo amino y un grupo carboxilo del aminoácido, respectivamente, o
un residuo de un oligopéptido que comprende 2 a 8 aminoácidos
enlazados peptídicamente, lo que significa un residuo obtenido
mediante eliminación de un átomo de hidrógeno y un grupo hidroxilo
del grupo amino N-terminal y el grupo carboxilo
C-terminal del oligopéptido, respectivamente.
Espaciadores preferibles son los residuos de
oligopéptidos que comprenden 2 a 6 aminoácidos. El tipo del
aminoácido que constituye el espaciador no está particularmente
limitado y, por ejemplo, pueden ser utilizados L- o
D-aminoácidos, preferiblemente
L-aminoácidos, y también pueden ser utilizados
\beta-alanina, ácido
\varepsilon-aminocapróico, ácido
\gamma-aminobutírico o similares, así como
\alpha-aminoácidos. Estos aminoácidos, distintos
de los \alpha-aminoácidos, están situados
preferiblemente próximos al derivado de polisacárido.
La dirección de enlace del espaciador no está
particularmente limitada, y generalmente, la
N-terminación del espaciador puede estar ligada a un
grupo carboxilo del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano por
medio de un enlace ácido-amida, y la
C-terminación del espaciador puede estar ligada a un
grupo amino del compuesto medicamentoso. Alternativamente, por
ejemplo, cuando un residuo lisina se incorpora como una unidad
constitutiva del espaciador peptídico, se permite al grupo
\alpha-amino y al grupo
\varepsilon-amino del residuo lisina formar
respectivos enlaces ácido-amida con grupos carboxilo
de otros aminoácidos para formar N-terminaciones en
ambos extremos del espaciador peptídico, lo cual posibilita la
formación de enlaces con grupos carboxilo de los compuestos
medicamentosos. Además, incorporando en un espaciador uno o más
residuos de compuestos diamina o compuestos de ácido dicarboxílico
(residuos de compuestos diamina tales como etilenodiamina o
compuestos de ácido dicarboxílico tal como ácido succínico) como
unidades constitutivas, puede ser utilizado un espaciador que posee
tanto N-terminaciones como
C-terminaciones en ambos extremos.
La secuencia aminoácida del espaciador no está
particularmente limitada. Los espaciadores preferiblemente
utilizados incluyen, por ejemplo, un espaciador que es un residuo de
un dipéptido representado por -X-Z-, en el cual X
representa un residuo de un aminoácido hidrofóbico y Z representa
un residuo de un aminoácido hidrofílico; y
X-Z- significa un residuo que consta de un dipéptido que está formado por un enlace peptídico entre un aminoácido hidrofóbico (X) y un aminoácido hidrofílico (Z) en el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, respectivamente, y cuyo átomo de hidrógeno y grupo hidroxilo son eliminados del grupo amino en la N-terminación y el grupo carboxilo en la C-terminación, respectivamente, y un espaciador que contiene un residuo del dipéptido como una secuencia peptídica parcial. Por ejemplo, como aminoácido hidrofóbico pueden utilizarse fenilalanina, tirosina, leucina o similares, y como aminoácido hidrofílico pueden ser utilizados, por ejemplo, glicina, alanina o similares. El espaciador puede presentar una secuencia repetida del residuo dipeptídico (por ejemplo, X-Z-X-Z-, -X-Z-X-Z-X-Z-, etc.).
X-Z- significa un residuo que consta de un dipéptido que está formado por un enlace peptídico entre un aminoácido hidrofóbico (X) y un aminoácido hidrofílico (Z) en el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, respectivamente, y cuyo átomo de hidrógeno y grupo hidroxilo son eliminados del grupo amino en la N-terminación y el grupo carboxilo en la C-terminación, respectivamente, y un espaciador que contiene un residuo del dipéptido como una secuencia peptídica parcial. Por ejemplo, como aminoácido hidrofóbico pueden utilizarse fenilalanina, tirosina, leucina o similares, y como aminoácido hidrofílico pueden ser utilizados, por ejemplo, glicina, alanina o similares. El espaciador puede presentar una secuencia repetida del residuo dipeptídico (por ejemplo, X-Z-X-Z-, -X-Z-X-Z-X-Z-, etc.).
Utilizando el espaciador que contiene tal
estructura dipeptídica, el espaciador puede ser hidrolizado en
áreas tumorales o zonas inflamatorias, que se consideran abundantes
en peptidasa, para liberar el compuesto medicamentoso con alta
concentración en dichos lugares. La estructura parcial formada
mediante enlace entre el espaciador que contiene el anterior
dipéptido y el compuesto medicamentoso es una estructura parcial
preferible del complejo medicamentoso de la presente invención.
Cuando se utiliza un agente antineoplásico dependiente de la
concentración (p. ej. doxorrubicina) o similar como el residuo del
compuesto medicamentoso, pueden utilizarse preferiblemente, por
ejemplo, un espaciador compuesto del anterior residuo dipeptídico
representado por -X-Z- o un espaciador que contiene
el anterior residuo dipeptídico como una secuencia peptídica
parcial.
Además, cuando se utiliza como residuo del
compuesto medicamentoso un tipo de agente antineoplásico
dependiente del espacio de tiempo, el cual requiere un tiempo de
actividad sostenida bajo determinada concentración, puede obtenerse
algunas veces una actividad antineoplásica mejorada utilizando el
espaciador anterior. Los ejemplos incluyen los agentes neoplásicos
descritos en la publicación de la patente japonesa sin examinar
(KOKAI) n° (Hei)
6-87746/1994, preferiblemente el agente antineoplásico descrito en la reivindicación 2. Generalmente, el espaciador no se limita a los mencionados anteriormente y es necesario elegir un espaciador apropiado desde los puntos de vista del modo de actuación del agente antineoplásico, características farmacocinéticas o aparición de toxicidad, liberación in vivo del agente antineoplásico y otros. Para carcinomas que presentan rápida proliferación, es generalmente preferible elegir el espaciador anterior capaz de liberar el compuesto medicamentoso con alta concentración en un corto intervalo.
6-87746/1994, preferiblemente el agente antineoplásico descrito en la reivindicación 2. Generalmente, el espaciador no se limita a los mencionados anteriormente y es necesario elegir un espaciador apropiado desde los puntos de vista del modo de actuación del agente antineoplásico, características farmacocinéticas o aparición de toxicidad, liberación in vivo del agente antineoplásico y otros. Para carcinomas que presentan rápida proliferación, es generalmente preferible elegir el espaciador anterior capaz de liberar el compuesto medicamentoso con alta concentración en un corto intervalo.
En la siguiente tabla se representan ejemplos
específicos del espaciador. Sin embargo, el espaciador utilizado en
el procedimiento para la fabricación de los complejos medicamentosos
de la presente invención no se limita a los mencionados más
adelante, y se comprende que un experto medio en la materia puede
seleccionar apropiadamente un espaciador para lograr un índice
óptimo de liberación de un compuesto medicamentoso. En la tabla,
los extremos izquierdos de las secuencias peptídicas son
N-terminaciones y los residuos de compuestos
medicamentosos están ligados a C-terminaciones.
D-Phe representa un residuo
D-fenilalanina y los otros aminoácidos representan
L-aminoácidos. Los grados del índice de liberación
fueron estimados a partir del grado de aparición de eficacia de los
complejos medicamentosos ligados con doxorrubicina experimentados en
ratas Portadoras de tumores Walker 256, o a partir de la
concentración de doxorrubicina libre en áreas tumorales de ratas
Portadoras de tumores Walker 256. Entre estos espaciadores, es
preferiblemente utilizado para doxorrubicina un espaciador que
puede liberar el compuesto medicamentoso con alta concentración en
un corto intervalo, por ejemplo
(N-terminación)-Gly-Gly-Phe-Gly-.
| (a) Espaciadores que presentan alto índice de liberación | |
| -Leu-Gly- | |
| -Tyr-Gly- | |
| -Phe-Gly- | |
| -Gly-Phe-Gly- | |
| -Gly-Gly-Phe-Gly- | |
| -Gly-Phe-Gly-Gly- | |
| -Phe-Gly-Gly-Gly- | |
| -Phe-Phe-Gly-Gly- | |
| -Gly-Gly-Gly-Phe-Gly- | |
| (b) Espaciadores que presentan índices de liberación relativamente altos | |
| -Gly-Gly-Phe-Phe- | |
| -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly- | |
| (c) Espaciadores que presentan índices de liberación relativamente bajos | |
| -Phe-Phe- | |
| -Ala-Gly- | |
| -Pro-Gly- | |
| -Gly-Gly-Gly-Phe- | |
| (d) Espaciadores que presentan bajo índice de liberación | |
| -Gly- | |
| -D-Phe-Gly- | |
| -Gly-Phe- | |
| -Ser-Gly- | |
| -Gly-Gly- | |
| -Gly-Gly-Gly- | |
| -Gly-Gly-Gly-Gly- |
Aunque el grado de polialcoholización del
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano, que
constituye la fracción del derivado polisacárido del complejo
medicamentoso de la presente invención, no está particularmente
limitado, es preferible que el polialcohol dextrano que constituye
el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano sea
un polialcohol dextrano obtenido mediante tratamiento de un dextrano
bajo condiciones que posibiliten una polialcoholización
sustancialmente completa. Por ejemplo, un polialcohol dextrano
obtenido mediante tratamiento sucesivo de un dextrano con un gran
exceso de periodato sódico y borohidruro sódico para alcanzar una
polialcoholización sustancialmente completa puede utilizarse
preferiblemente como material de partida para fabricar el complejo
medicamentoso de la presente invención. Sin embargo, el
procedimiento para la polialcoholización de un dextrano no está
limitado al procedimiento mencionado anteriormente, y puede ser
adoptado cualquier procedimiento utilizable por los expertos en la
materia.
El tipo de dextrano no está particularmente
limitado, y el dextrano puede contener
\alpha-D-1,6-enlaces
en cualquier cantidad. Por ejemplo, pueden ser utilizados los
dextranos que contienen
\alpha-D-1,6-enlaces
en una tasa del 85% o más, 90% o más, y 95% o más. El peso molecular
del dextrano no está particularmente limitado y, por ejemplo, pueden
ser utilizados los dextranos que presentan un peso 5 molecular desde
aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 2.000.000,
preferiblemente desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente
800.000. Como grupo C_{1-4}alquilo que constituye
el grupo carboxi(C_{1-4})alquilo,
pueden ser utilizados un grupo C_{1-4}alquilo
linear o ramificado, específicamente, grupo metilo, grupo etilo,
grupo n-propilo, grupo isopropilo, grupo
n-butilo, grupo sec-butilo o
similares, y puede utilizarse preferiblemente un grupo metilo. La
carboxi(C_{1-4})alquilación puede
ser realizada, por ejemplo, haciendo reaccionar un ácido
(C_{1-4})alquilcarboxílico halogenado tal
como ácido cloroacético, ácido bromoacético, ácido
\alpha-cloropropiónico, ácido
\alpha-metil-\alpha-cloropropiónico,
ácido \beta-cloropropiónico, ácido
\alpha-metil-\beta-cloropropiónico,
ácido \alpha-clorobutírico, ácido
\beta-clorobutírico o ácido
\gamma-clorobutírico, preferiblemente ácido
cloroacético, con grupos hidroxilo del polialcohol dextrano para
alcanzar una
carboxi(C_{1-4})alquilación parcial
o completa de los grupos hidroxilo.
Por ejemplo, el polialcohol dextrano se disuelve
en un disolvente inerte que no participa en las reacciones (p. ej.
agua, N,N-dimetilformamida, o dimetil sulfóxido) y
la solución se añade con un ácido
(C_{1-4})alquilcarboxílico halogenado o una
sal de éste en presencia de una base (p.ej. hidróxido sódico o
hidróxido potásico), y entonces se deja reaccionar la mezcla desde
varios minutos hasta varios días a una temperatura desde
enfriamiento con hielo hasta aproximadamente 100°C. El grado de
introducción del grupo
carboxi(C_{1-4})alquilo puede ser
fácilmente controlado, por ejemplo mediante adecuada elección de la
temperatura de reacción de la
carboxi(C_{1-4})alquilación o la
cantidad de ácido
(C_{1-4})alquilcarboxílico halogenado o
las bases utilizadas como reactivos, y estos medios son bien
conocidos para los expertos en la materia. El grado de
carboxi(C_{1-4})alquilación para los
grupos hidroxilo del polialcohol dextrano no está particularmente
limitado y, por ejemplo, el grado puede estar en el intervalo de
0,01 a 2,0, preferiblemente de 0,1 a 1,0, y más preferiblemente de
0,3 a 0,5 por cada residuo del sacárido constitutivo. El peso
molecular del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es
desde aproximadamente 5.000 a 500.000, preferiblemente desde
aproximadamente 50.000 a 450.000, y más preferiblemente desde
aproximadamente 200.000 a 400.000, cuando se determina por el método
de filtración de gel.
El polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano antes
mencionado es útil como transportador-suministrador
del medicamento. Los complejos medicamentosos en los que están
ligados un compuesto medicamentoso y el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano se
caracterizan, por ejemplo, porque poseen una excelente
selectividad, tal como selectividad neoplásica, y son capaces de
mantener una alta concentración en sangre durante un largo periodo
de tiempo. En cuanto al enlace entre el compuesto medicamentoso y el
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano,
puede ser adoptado, por ejemplo, un procedimiento en el cual ambos
están ligados directamente por medio de un enlace éster, o
alternativamente, un procedimiento en el cual ambos están ligados
por medio de un espaciador apropiado, tal como los anteriormente
mencionados.
En cuanto al complejo medicamentoso ligado por
medio del espaciador, el complejo medicamentoso de la presente
invención puede ser preparado enlazando el espaciador, que está
ligado a un residuo de un compuesto medicamentoso, a un grupo
carboxilo del polialcohol carboximetildextrano obtenido según lo
anterior. El enlace entre el espaciador y el grupo carboxilo del
polialcohol carboximetildextrano puede estar formado generalmente
por enlace del grupo amino N-terminal del
espaciador a un grupo carboxilo del polialcohol carboximetildextrano
por medio de un enlace ácido- amida. Sin embargo, el enlace entre el
compuesto medicamentoso o el espaciador y el grupo carboxilo del
polialcohol carboximetildextrano no está limitado al enlace antes
descrito, y pueden ser utilizados otros enlaces químicos y enlaces
utilizando uno o más espaciadores. Por ejemplo, puede estar formado
un anhídrido ácido entre el grupo carboxilo
C-terminal del espaciador o un grupo carboxilo del compuesto medicamentoso y un grupo carboxilo del polialcohol carboximetildextrano, o utilizando un compuesto diamina, tal como etilenodiamina, como un espaciador. Cada uno de los grupos carboxilo puede estar ligado por medio de un enlace ácido-amida a cada uno de los grupos amino del compuesto diamina.
C-terminal del espaciador o un grupo carboxilo del compuesto medicamentoso y un grupo carboxilo del polialcohol carboximetildextrano, o utilizando un compuesto diamina, tal como etilenodiamina, como un espaciador. Cada uno de los grupos carboxilo puede estar ligado por medio de un enlace ácido-amida a cada uno de los grupos amino del compuesto diamina.
Cuando el grupo amino N-terminal
del espaciador está ligado a un grupo carboxilo del polialcohol
carboximetildextrano por medio de un enlace
ácido-amida, pueden ser utilizados agentes de
condensación por deshidratación ordinariamente utilizados para
síntesis de cadenas peptídicas, por ejemplo,
N,N'-dicicloalquilcarbodiimidas, tal como
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), derivados de
carbodiimida, tal como
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAPC), derivados de benzotriazol, tal como
1-hidroxibenzotriazol (HOBT),
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(EEDQ) y similares. Además, la reacción también puede ser realizada
mediante el procedimiento de éster activado o el procedimiento de
ácido haluro.
Aunque la cantidad del residuo del compuesto
medicamentoso introducido en el polialcohol carboximetildextrano no
está particularmente limitada, dicha cantidad debe ser adecuadamente
seleccionada desde los puntos de vista de las propiedades
físico-químicas del residuo del compuesto
medicamentoso, farmacocinética, eficacia y toxicidad del complejo
medicamentoso de la presente invención. Generalmente, puede ser
elegido el intervalo desde 0,1 a 30% en peso aproximadamente,
preferiblemente desde 1 a 15% en peso aproximadamente, más
preferiblemente desde 3 a 10% en peso aproximadamente, y todavía
más preferiblemente desde 5 a 6% en peso aproximadamente. La
proporción del residuo del compuesto medicamentoso introducido en el
polialcohol carboximetildextrano puede ser fácilmente determinada,
por ejemplo, mediante análisis espectrométrico de absorción.
Como un ejemplo del procedimiento para fabricar
el complejo medicamentoso de la presente invención, el siguiente
esquema representa el procedimiento de preparación para introducir
el residuo del compuesto medicamentoso, que es el agente
antineoplásico descrito en la reivindicación 2 de la publicación de
la patente japonesa sin examinar (KOKAI) n° (Hei)
6-87746/1994. Sin embargo, los complejos
medicamentosos de la presente invención y los procedimientos para su
fabricación no se limitan a los representados en el esquema. En el
esquema siguiente, la cantidad introducida del residuo del
compuesto medicamentoso es, por ejemplo, desde aproximadamente 1 a
15% en peso, preferiblemente desde 2 a 10% en peso aproximadamente.
Además, entre las unidades constitutivas de los polialcoholes,
solamente una unidad constitutiva, que se introduce con uno o dos
grupos carboximetilo, se representa como ejemplo en el esquema
siguiente. Sin embargo, debe entenderse que la fracción derivado de
polisacárido del complejo medicamentoso de la presente invención no
está formada por la repetición de la unidad constitutiva antes
mencionada.
Es conocido que el equilibrio del compuesto
medicamentoso en el esquema anterior se sitúa en el compuesto cuyo
anillo lactona está cerrado (el compuesto de anillo cerrado) en un
medio acuoso ácido (por ejemplo, a pH 3 aproximadamente), mientras
que el equilibrio se sitúa en el compuesto cuyo anillo lactona está
abierto (el compuesto de anillo abierto) en un medio acuoso básico
(por ejemplo, a pH 10 aproximadamente), y el complejo medicamentoso
introducido con el residuo correspondiente al compuesto de anillo
cerrado o de anillo abierto posee similar actividad antineoplásica.
Por tanto, debe entenderse que cualquiera de ellos está comprendido
dentro del objeto de la presente invención. Cuando un reactante,
cuyo anillo lactona está abierto, está presente en el sistema de
reacción, la reacción de condensación progresará entre el grupo
carboxilo derivado del anillo lactona y el grupo amino derivado del
espaciador, lo cual resulta en un apreciable descenso del
rendimiento de la reacción y, además, algunas veces no puede
obtenerse uniformemente un complejo medicamentoso deseable. Dicha
reacción colateral puede ser evitada utilizando el compuesto de
anillo cerrado como reactante.
Esto es, la reacción colateral puede ser reducida
mediante conversión de la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano en la sal trietilamónica, y luego condensando
el grupo amino N-terminal del espaciador, el cual
está ligado al residuo del compuesto medicamentoso descrito
anteriormente, con un grupo carboxilo del polialcohol
carboximetildextrano en un sistema no acuoso (en un disolvente
orgánico no que contenga agua), lo cual posibilita una fabricación
eficiente del producto deseado. Como sal del polialcohol
carboximetildextrano que puede disolverse en disolventes orgánicos,
pueden ser utilizadas, por ejemplo, sales trialquilamónicas, tal
como sal trietilamónica o sal trimetilamónica, o sales de bases
orgánicas tales como N-metilpirrolidina,
N-metilmorfolina, o dimetilaminopiridina (DMAP).
Como disolventes orgánicos, pueden ser utilizados
N,N-dimetilformamida, dimetil sulfóxido o
similares.
El complejo medicamentoso de la presente
invención se caracteriza porque puede presentar una actividad
farmacológica específicamente deseada en una localización definida,
tal como áreas tumorales o zonas inflamatorias, dependiendo del
tipo de residuo del compuesto medicamentoso (p. ej. el residuo del
compuesto medicamentoso como agente antineoplásico o
anti-inflamatorio), y puede reducir la toxicidad
inherente al compuesto medicamentoso aislado. Aunque no se pretende
una vinculación con una teoría específica, la fracción derivado de
polisacárido del complejo medicamentoso de la presente invención
(p. ej. polialcohol carboximetildextrano) presenta una excelente
retención en sangre y alcanza una elevada acumulación en zonas
tumorales o inflamatorias, y por ello es útil como
transportador-suministrador del medicamento y
permite al complejo medicamentoso de la presente invención poseer
selectividad de localización neoplásica y selectividad de
localización inflamatoria. Adicionalmente, se considera que la
proteasa (peptidasa) se expresa en áreas tumorales o zonas
inflamatorias y, por tanto, el espaciador del complejo
medicamentoso de la presente invención es fácilmente hidrolizado
para permitir mostrar su eficacia al compuesto medicamentoso
liberado.
Un medicamento que contiene el complejo
medicamentoso de la presente invención puede generalmente envasarse
en viales o similares en forma de un producto liofilizado u otro, y
estar previsto para uso clínico como preparaciones para
administración parenteral, tales como inyecciones o infusiones por
goteo que se disuelven al tiempo de utilizarse. Sin embargo, la
forma de las preparaciones farmacéuticas del medicamento no está
limitada a las formas antes mencionadas. Para la fabricación de las
anteriores preparaciones farmacéuticas, pueden ser utilizados
aditivos farmacéuticos disponibles en el estado de la técnica, por
ejemplo, solubilizantes, modificadores de pH, estabilizadores y
similares. Aunque la dosis del medicamento de la presente invención
no está particularmente limitada, deberá decidirse normalmente en
función de la dosis del compuesto medicamentoso que constituye el
residuo del compuesto medicamentoso, la cantidad del residuo del
compuesto medicamentoso introducida en el complejo medicamentoso,
la condición del paciente, el tipo de enfermedad y similares. Por
ejemplo, cuando se administra parenteralmente un complejo
medicamentoso de la presente invención que se introduce con
aproximadamente 6% en peso del residuo del agente antineoplásico
descrito en la reivindicación 2 de la publicación de la patente
japonesa sin examinar (KOKAI) n° (Hei) 6-87746/1994,
aproximadamente 1 a 500 mg, preferiblemente 10 a 100 mg
aproximadamente por cada m^{2} de superficie corporal por día,
puede administrarse generalmente una vez al día, y la administración
puede repetirse preferiblemente cada 3 a 4 semanas.
La presente invención se describirá más
específicamente mediante ejemplos; sin embargo, el objetivo de la
presente invención no se limita a los ejemplos siguientes. En los
ejemplos, "A-NH-" representa un residuo de un
compuesto medicamentoso en el cual el compuesto medicamentoso
presenta un anillo lactona, tal como el compuesto medicamentoso
descrito en la reivindicación 2 de la publicación de la patente
japonesa sin examinar (KOKAI) n° (Hei)
6-87746/1994 (en ocasiones designado como "DX-8951" en los ejemplos), y el compuesto medicamentoso que posee un anillo lactona cerrado se representa por A-NH_{2}. Un ejemplo incluye el grupo representado por A-NH- en el esquema antes descrito, en el cual está formado un anillo lactona. Además, A'-NH- representa que el anillo lactona del residuo de un compuesto medicamentoso representado por A-NH- está en forma de anillo cerrado o de anillo abierto o, alternativamente, una mezcla de ambos, -DXR representa el residuo derivado de doxorrubicina, y
-D51-7059 representa el residuo procedente del derivado de taxol representado en el Ejemplo 55.
6-87746/1994 (en ocasiones designado como "DX-8951" en los ejemplos), y el compuesto medicamentoso que posee un anillo lactona cerrado se representa por A-NH_{2}. Un ejemplo incluye el grupo representado por A-NH- en el esquema antes descrito, en el cual está formado un anillo lactona. Además, A'-NH- representa que el anillo lactona del residuo de un compuesto medicamentoso representado por A-NH- está en forma de anillo cerrado o de anillo abierto o, alternativamente, una mezcla de ambos, -DXR representa el residuo derivado de doxorrubicina, y
-D51-7059 representa el residuo procedente del derivado de taxol representado en el Ejemplo 55.
En los ejemplos, a no ser que se mencione
específicamente, el grado de carboximetilación en polialcohol
carboximetildextrano (el grado de sustitución con grupo
carboximetilo por cada residuo sacárido constitutivo) se determinó
mediante conversión de la sal sódica del polialcohol
carboximetildextrano en forma de ácido libre, disolviendo el ácido
resultante en una solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N, y
luego valorando (neutralizando) con ácido clorhídrico 0,1 N. Una
solución acuosa de la sal sódica del polialcohol
carboximetildextrano se aplicó a una columna Bio-Rad
AG 50W-X2 (tipo H^{+}) y el efluente fue
liofilizado y luego utilizado como muestra. La muestra se disolvió
en un exceso determinado de solución acuosa de hidróxido sódico 0,1
N y fue neutralizada con ácido clorhídrico 0,1 N utilizando
fenolftaleína como un indicador. El grado de carboximetilación se
calculó utilizando la siguiente ecuación: Grado de
carboximetilación =
13,4(a-b)/[s-5,8(a-b)]
en la cual "s" es el peso de la muestra aplicada (mg),
"a" es el exceso determinado de solución acuosa de hidróxido
sódico 0,1 N (ml), y "b" es el volumen de ácido clorhídrico
0,1 N consumido para la valoración (ml). La cantidad de medicamento
introducida (porcentaje en peso) se determinó mediante análisis
espectroscópico de absorción utilizando absorciones características
del compuesto medicamentoso (aproximadamente 362 nm). La filtración
de gel se realizó bajo las siguientes condiciones: columna: TSK Gel
G4000 PW_{XL} ; eluyente: NaCl 0,1 M; índice de flujo: 0,8
ml/min; y temperatura de columna: 40°C.
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly
(600 mg) y N-hidroxisuccinimida (160 mg) en
N,N-dimetilformamida (20 ml), se enfrió a 4°C, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(280 mg). A esta solución, se añadió una solución de metanosulfonato
del compuesto medicamentoso descrito en la reivindicación 2 de la
publicación de la patente japonesa sin examinar (KOKAI) n° (Hei)
6-87746/1994 (600 mg, del compuesto descrito en el
Ejemplo 50 de la publicación de patente antes mencionada) y
trietilamina (0,16 ml) disueltos en
N,N-dimetilformamida (30 ml), y se dejó reaccionar
la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas con agitación
bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo ácido
acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (1,0 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,40 (d,1H,J=8,3 Hz),
8,10-8,17 (m,2H), 7,91-8,01 (m,1H),
7,78 (d,1H,J=10,75 Hz), 7,32 (s,1H), 6,94-6,96
(m,1H), 6,50 (s,1H), 5,57 (t,1H,J=4,5 Hz), 5,43 (s,2H), 5,23 (s,2H),
3,77 (dd,2H,J=5,85 Hz,J=8,80 Hz), 3,70 (d,2H,J=4,40 Hz), 3,65
(d,2H,J=5,35 Hz), 3,56 (d,2H,J=5,85), 3,15-3,25
(m,2H), 2,40 (s,3H), 2,05-2,25 (m,1H), 1,86 (m,2H),
1,35 (s,9H), 0,88 (t,3H,J=7,35).
Masa (FAB); m/e 854 (M+1).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Gly-Phe
(600 mg) y N-hidroxisuccinimida (160 mg) en
N,N-dimetilformamida (20 ml) y se enfrió a 4°C,
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(280 mg). A esta solución, se añadió una solución de metanosulfonato
de DX-8951 (600 mg) y trietilamina (0,16 ml)
disueltos en N,N-dimetilformamida (30 ml) y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas con
agitación bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de
reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (eluyente: diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo
ácido acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (700
mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,57 (d,1H,J=7,8 Hz), 8,19
(d,1H), 8,05-8,07 (m,2H), 7,79 (d,1H,J=11,2 Hz),
7,32 (s,1H), 7,10 (d,2H,J=7,8 Hz), 6,93-7,03
(m,4H), 6,51 (s,1H), 5,52-5,55 (m,1H), 5,44 (s,2H),
5,18 (d,1H,J=18,5 Hz), 4,84 (d,1H,J=18,5 Hz),
4,57-4,59 (m,1H), 3,57-3,71 (m,6H),
3,15-3,25 (m,2H), 3,00-3,02 (m,1H),
2,80-2,90 (m,1H), 2,40 (s,3H),
2,05-2,25 (m,1H), 1,86 (m,2H), 1,35 (s,9H), 0,88
(t,3H,J=7,35 Hz).
Masa (FAB); m/e 854 (M+1).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Gly-Gly
(120 mg) y N-hidroxisuccinimida (39 mg) en
N,N-dimetilformamida (20 ml), se enfrió a 4°C, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(70 mg). A esta solución, se añadió una solución de metanosulfonato
de DX-8951 (150 mg) y trietilamina (0,039 ml)
disueltos en N,N-dimetilformamida (10 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas con
agitación bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de
reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 10:1) para
obtener el compuesto del enunciado (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,40 (d,1H,J=8,3 Hz),
8,10-8,17 (m,2H), 7,91-8,01 (m,1H),
7,78 (d,1H,J=10,75 Hz), 7,32 (s,1H), 6,94-6,96
(m,1H), 6,50 (s,1H), 5,57 (t,1 H,J=4,5 Hz), 5,43 (s,2H), 5,23
(s,2H), 3,77 (dd,2H,J=5,85 Hz,J=8,80 Hz), 3,70 (d,2H,J=4,40 Hz),
3,65 (d,2H,J=5,35 Hz), 3,56 (d,2H,J=5,85 Hz),
3,15-3,25 (m,2H), 2,40 (s,3H),
2,05-2,25 (m,1H), 1,86 (m,2H),1,35(s,9H),
0,88 (t,3H,J=7,35 Hz).
Masa (FAB); m/e 764 (M+1).
Se disolvió
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (79 mg) en
ácido trifluoroacético (3 ml) y se dejó reposar durante una hora.
Se evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones
azeotrópicas dos veces con metanol (30 ml) y dos veces con etanol
(30 ml), y entonces el residuo fue lavado con éter para obtener el
compuesto del enunciado (80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,59-8,61
(m,1H), 8,50 (d,1H,J=8,3 Hz), 8,21-8,27 (m,2H),
7,91-8,01 (br,3H), 7,81 (d,1H,J=11,2 Hz), 7,32
(s,1H), 6,50-6,52 (br,1H), 5,57-5,59
(m,1H), 5,43 (s,2H), 5,23 (s,2H), 3,80-3,82 (m,3H),
3,70-3,75 (m,3H), 3,15-3,25 (m,2H),
2,41 (s,3H), 2,05-2,25 (m,1H),
1,86-1,88 (m,2H), 0,88 (t,3H,J=7,35 Hz).
Se disolvió Dextran T2000 (10 g, Pharmacia, peso
molecular medio: 2.000.000) en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 1.000
ml) y se añadió con una solución acuosa (1000 ml) de periodato
sódico (33,0 g). Después de agitar a 4ºC durante 10 días con
protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (7,0 ml)
y fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH
7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. Se
añadió y disolvió borohidruro sódico (14 g), y la mezcla fue
entonces agitada a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla
de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético, y agitada a 4°C durante una flora, y entonces ajustada a
pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo.
La solución acuosa resultante se sometió a ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-30 (Millipore) para
eliminar la fracción de bajo peso molecular. La fracción polimérica
fue liofilizada para obtener polialcohol dextrano. Después de
tratar este polialcohol dextrano a pH 3,0 durante una hora, la
fracción de bajo peso molecular fue eliminada con una membrana
Biomax-50, y seguidamente, la fracción polimérica
fue eliminada con una membrana Biomax-100, y el
resultado fue liofilizado para obtener polialcohol dextrano
purificado (2,0 g). El peso molecular de esta sustancia fue 220K
(filtración de gel, estándar dextrano).
Este polialcohol dextrano purificado (1,8 g) se
añadió a una solución acuosa obtenida mediante disolución de
hidróxido sódico (10,5 g) en agua (45 ml) y se disolvió a
temperatura ambiente. A esta solución, se añadió ácido
monocloroacético (15 g) y se disolvió bajo enfriamiento con hielo, y
luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante
20 horas. Después de ajustar esta mezcla de reacción a pH 8 con
ácido acético, la fracción de bajo peso molecular fue eliminada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-10. La fracción polimérica fue liofilizada
para obtener la sal sódica de polialcohol carboximetildextrano (1,8
g). El peso molecular de esta sustancia fue 330K (filtración de
gel, estándar dextrano) y el grado de carboximetilación fue 0,8.
Se disolvió en agua la anterior la sal sódica de
polialcohol carboximetildextrano (300 mg), se aplicó a una columna
Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (1,5x8,6 cm) y fue eluida con
agua. Este efluente se añadió con trietilamina (0,5 ml) y fue
liofilizado para obtener sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (380 mg). Fueron tratadas porciones de la sal
sódica de polialcohol carboximetildextrano (300 mg cada una) con la
columna, según se describió anteriormente, para obtener sal
trietilamónica de polialcohol carboximetildextrano (380 mg, 400
mg).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
(0,15 g) obtenida en el Ejemplo 5 anterior se añadió a una solución
acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico (1,05 g) en
agua (4,5 ml) y luego se disolvió a temperatura ambiente. A esta
solución, se añadió y disolvió ácido monocloroacético (1,5 g) bajo
enfriamiento con hielo, y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético, se añadió por goteo en 90 ml de metanol, y se
añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (0,15 ml), y los precipitados
depositados se recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8
minutos). Los precipitados fueron lavados con metanol y luego
disueltos en agua (5 ml), y se añadieron con cloruro sódico acuoso 3
M (0,15 ml). Esta solución acuosa se filtró a través de un filtro
Millipore (0,45 \mum), y el filtrado se añadió por goteo a 35 ml
de etanol y los precipitados depositados se recogieron mediante
centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron
lavados con etanol, disueltos en agua, y dializados con agua
purificada utilizando una membrana de diálisis (Spectrapore 1, peso
molecular de corte; 6.000-8.000). La solución
dializada interna se filtró a través de un filtro Millipore (0,22
\mum) y fue liofilizada para obtener sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (0,18 g). El grado de carboximetilación de esta
sustancia fue 1,2 por cada residuo sacárido (alcalimetría).
El polialcohol dextrano purificado (0,2 g)
obtenido en el Ejemplo 5 se añadió a una solución acuosa obtenida
mediante disolución de hidróxido sódico (0,84 g) en agua (6 ml) y se
disolvió a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió y
disolvió ácido monocloroacético (1,2 g) bajo enfriamiento con
hielo, y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante
18 horas. La mezcla de reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético,
se añadió por goteo a 120 ml de metanos, y luego se adicionó con
cloruro sódico acuoso 3 M (0,2 ml), y los precipitados depositados
se recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados fueron lavados con metano) y luego disueltos en agua
(5 ml), y se añadieron con cloruro sódico acuoso 3 M (0,2 ml). Esta
solución acuosa se filtró a través de un filtro Millipore (0,45
\mum), y el filtrado se añadió por goteo a 35 ml de etanol y los
precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación (3500
rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron lavados con etanol,
disueltos en agua, y dializados con agua purificada utilizando una
membrana de diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000). La solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue
liofilizada para obtener sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (0,20 g). El grado de carboximetilación de esta
sustancia fue 0,4 por cada residuo sacárido (alcalimetría).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 5 (380 mg, grado de
carboximetilación: 0,8) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (30 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (49 mg) en
N,N-dimetilformamida (5 ml), trietilamina (0,017 ml)
y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(380 mg), y entonces se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante la noche con agitación. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 10 con hidróxido sódico acuoso 1 M y cada una de las
porciones de 5 ml de la mezcla se añadió por goteo a 25 ml de
etanol. Esta mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml)
y éter dietilo (5 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos).
Los precipitados fueron disueltos en agua y
dializados con agua purificada utilizando una membrana de diálisis
(Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000), y la solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue
liofilizada. El producto crudo resultante se disolvió en agua (30
ml), se ajustó a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M, y tratado a
37°C durante una hora. Esta solución tratada se dializó como se ha
descrito anteriormente, y entonces la solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (289 mg). El
resultado obtenido mediante análisis GPC (cromatografía de
permeación de gel) después de disolver este compuesto en cloruro
sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min), y el espectro de absorción ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,25 mg/ml) se representan en las Figuras 1 y 2, respectivamente. El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,3% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min), y el espectro de absorción ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,25 mg/ml) se representan en las Figuras 1 y 2, respectivamente. El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,3% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El compuesto del enunciado (300 mg) fue
sintetizado de acuerdo con una forma similar a la del Ejemplo 8
mediante introducción de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A,
la cual se había obtenido mediante eliminación del grupo Boc del
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (50 mg) de una
manera similar a la del Ejemplo 4, en la sal trietilamónica de
polialcohol carboximetildextrano (380 mg) obtenida en el Ejemplo 5.
El resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver
este compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min), y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,19 mg/mi) se
representan en las Figuras 3 y 4, respectivamente. El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,3% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución
tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El compuesto del enunciado (190 mg) fue
sintetizado según una forma similar a la del Ejemplo 8 mediante
introducción de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A,
la cual se había obtenido a través de eliminación del grupo Boc del
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (41 mg) de una
manera similar a la del Ejemplo 4, en la sal trietilamónica de
polialcohol carboximetildextrano (380 mg) obtenida en el Ejemplo 5.
El espectro de absorción ultravioleta de este compuesto (solución
tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,34 mg/ml) se representa en la Figura 5.
El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el
compuesto fue 5,3% (w/w) cuando se determinó con base en la
absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(7 ratones por grupo) mediante trasplante subcutáneo de 1x10^{6}
células de fibrosarcoma Meth A de ratón en las regiones inguinales
derechas de ratones macho BALB/c (de 7 semanas). El 7° día, el
complejo medicamentoso del Ejemplo 9 disuelto en agua destilada
para inyecciones, se inyectó en la vena de cola de los ratones
portadores de tumor Meth A 4 veces cada 4 días. El 21° día después
del trasplante, se extirparon y pesaron masas tumorales para
calcular la tasa de inhibición de crecimiento tumoral, de acuerdo
con la siguiente ecuación: tasa de inhibición de crecimiento
tumoral (%) = [1-(peso tumoral medio del grupo administrado con la
muestra de prueba/peso tumoral medio del grupo de control)] x 100.
Como resultado, se halló que el complejo medicamentoso de la
presente invención obtenido en el Ejemplo 9 presentaba una actividad
antitumoral considerablemente mejorada en comparación con el
compuesto medicamentoso aislado, sin el espaciador y el derivado
polisacárido, mientras que no mostraba toxicidad (pérdida de peso).
El derivado polisacárido aislado (Ejemplo 5), y el compuesto
medicamentoso introducido con el espaciador solamente (sal de ácido
trifluoroacético de
H_{2}N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) obtenida
mediante eliminación del grupo Boc del compuesto del Ejemplo 1 según
el procedimiento del Ejemplo 4) no mostraron efectividad.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y la actividad antitumoral fue comparada con la obtenida
por administración simple, una vez el 7° día, de los complejos
medicamentosos de los Ejemplos 8 y 9. Como resultado, el grado de
actividad antitumoral fue el siguiente: (Derivado
polisacárido)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A'
> (Derivado
polisacárido)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A'
> el compuesto medicamentoso aislado. No mostró efectividad el
compuesto que comprende el residuo del compuesto medicamentoso
directamente enlazado a un grupo carboxilo del polialcohol
carboximetildextrano del Ejemplo 5 sin espaciador (cantidad de
residuo del compuesto medicamentoso introducida: 6,2% en peso).
Se disolvió en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 1000
ml) Dextran T500 (10 g, Pharmacia, peso molecular: 500K) y se
añadió con una solución acuosa (1000 ml) de periodato sódico (33 g).
Después de agitar a 4ºC durante diez días con protección de luz, la
mezcla se añadió con glicol etileno (7,0 ml) y fue agitada durante
la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5 con hidróxido
sódico acuoso 8 M. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (14 g),
y luego la mezcla fue agitada durante la noche. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido acético
y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5 con
hidróxido sódico acuoso 8 M para obtener la Solución 1.
Separadamente, se realizaron una serie de procesos descritos
anteriormente utilizando Dextran T500 (10 g, Pharmacia, peso
molecular 500K) para obtener la Solución 2. Adicionalmente, se
repitió una serie de procesos descritos anteriormente utilizando
Dextran T250 (10 g cada vez, Pharmacia, peso molecular 250K) para
obtener las Soluciones 3 y 4. Estas Soluciones 1-4
fueron combinadas y sometidas a ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-50 para eliminar la fracción de bajo
peso molecular. La fracción polimérica fue liofilizada para obtener
polialcohol dextrano (25 g). El peso molecular de esta sustancia fue
163K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (11 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(46,2 g) en agua (330 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió bajo enfriamiento con hielo ácido
monocloroacético (66 g), se disolvió y se dejó reaccionar la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 9 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-30.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (13 g). El peso molecular de esta sustancia fue
228K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,4.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (600 mg) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este afluente se añadió con
trietilamina (0,93 ml) y luego liofilizado para obtener el compuesto
del enunciado (690 mg).
El
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (79 mg)
obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en ácido trifluoroacético (3
ml) y se dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y
el residuo fue sometido a destilación azeotrópica dos veces con
metanol (30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con
éter para obtener el compuesto del enunciado (80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,53 (d, 1H, J=8,3 Hz),
8,40-8,48 (m, 2H), 8,28 (d, 1H, J=8,3 Hz),
7,95-8,07 (br, 3H), 7,81 (d, 1H, J=10,2 Hz),
7,30-7,37 (m, 2H), 7,15-7,30 (m,
5H), 6,50-6,55 (br, 1H), 5,50-5,57
(m, 1H), 5,41 (d, 2H, J=7,82 Hz), 5,25 (s, 2H),
4,55-4,62 (m, 1H), 3,55-3,92 (m,
6H), 3,15-3,25 (br, 2H), 2,98-3,03
(m, 1H), 2,73-2,82 (m, 1H), 2,40 (s, 3H),
2,05-2,25 (m, 1H), 1,84-1,92 (m,
2H), 0,88 (t, 3H, J=7,35 Hz).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
obtenida en el Ejemplo 13 (400 mg) se convirtió en la sal
trietilamónica (470 mg) y se disolvió en
N,N-dimetilformamida (30 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) obtenida en el
Ejemplo 14 (62 mg) en N,N-dimetilformamida (5 ml),
trietilamina (0,02 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(470 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Cada una de las
porciones de 5 ml de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a
lotes de 10 ml de etanol. Se añadieron a la mezcla cloruro sódico
acuoso 3 M (2,5 ml) y éter dietilo (20 ml), y se recogieron los
precipitados depositados mediante centrifugación. Los precipitados
se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M, se ajustaron a pH 9
con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo y
luego fueron dializados con agua purificada utilizando una membrana
de diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000). La solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (600 mg). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver este
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh; disolvente: NaCl 0,1 M; índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,1 mg/ml) se
representan en las Figuras 6 y 7, respectivamente. El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,8% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución
tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (79 mg)
obtenido en el Ejemplo 2 se disolvió en ácido trifluoroacético (3
ml) y se dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y
el residuo fue sometido a destilación azeotrópica dos veces con
metanol (30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y entonces el
residuo fue lavado con éter para obtener el compuesto del enunciado
(80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,62-8,66
(m, 2H), 8,23 (d, 1H, J=8,3 Hz), 8,18-8,20 (m, 1H),
7,98-8,10 (br, 2H), 7,79 (d, 1H, J=10,7 Hz), 7,32
(s, 1H), 7,09 (d, 2H, J=7,3 Hz), 6,93-7,03 (m, 4H),
6,50-6,60 (br,1H), 5,52- 5,55 (m, 1H), 5,44 (s, 2H),
5,18 (d, 1H, J=18,5 Hz), 4,80 (d, 1H, J=18,5 Hz),
4,57-4,59 (m, 1H), 3,57-3,71 (m,
6H), 3,15-3,25 (m, 2H), 3,00-3,02
(m, 1H), 2,80-2,90 (m, 1H), 2,50 (s, 3H),
2,05-2,25 (m, 1H), 1,86- 2,00 (m, 2H), 0,88 (t, 3H),
J=7,35 Hz).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
obtenida en el Ejemplo 13 (1,0 g) se convirtió en la sal
trietilamónica (1,2 g) y se disolvió en
N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) obtenida en el
Ejemplo 16 (158 mg) en N,N-dimetilformamida (15 ml),
trietilamina (0,05 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,2 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Cada una de las
porciones de 5 ml de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a
lotes de 10 ml de etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico
acuoso 3 M (2,5 ml) y éter dietilo (20 ml), y luego los precipitados
depositados se recogieron mediante centrifugación. Los precipitados
se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M, se ajustaron a pH 9
con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo y
fueron dializados con agua purificada utilizando una membrana de
diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000). La solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,4 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 5,2% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm
en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se añadió
H-Gly-Phe-Leu-OH
(3,0 g) a dioxano acuoso 50% (48 ml) y se enfrió con hielo. A esta
solución, se añadieron hidróxido sódico acuoso 1 N (9,45 ml) y una
solución de dioxano (24 ml) conteniendo (Boc)_{2}O (2,27
g), y la mezcla fue agitada durante la noche. Se añadió ácido
clorhídrico 1 N (9,45 ml) a la mezcla de reacción y se evaporó el
disolvente. El residuo resultante se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución
diclorometano:metanol = 5:1) para obtener el compuesto del
enunciado (2,5 g).
El
Boc-Gly-Phe-Leu-OH
obtenido en el Ejemplo 18 (2,4 g) y
N-hidroxisuccinimida (656 mg) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (50 ml), se enfrió a 4ºC, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(1,17 g), y se agitó durante 2 horas. A esta solución, se añadió una
solución de N,N-dimetilformamida (40 ml) en la cual
se habían disuelto tosilato de
H-Gly-OBzl (1,9 g) y trietilamina
(0,79 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con agitación a
temperatura ambiente durante 16 horas. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: solución diclorometano:metanol = 50:1) para obtener el
compuesto del enunciado (2,0 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,20-8,30
(m, 1H), 8,12 (d, 1H, J=8,3 Hz), 7,83 (d, 1H, J=8,3 Hz),
7,32-7,37 (m, 5H), 6,89-6,95 (m,
1H), 5,12 (s, 1H), 4,52-4,59 (br, 1H), 4,34 (dd, H,
J=7,3 Hz, J=15,1 Hz), 3,93 (dd, 1H, J=5,5 Hz, J=17,2 Hz), 3,84 (dd,
1H, J=5,5 Hz, J=17,2 Hz), 3,54 (dd, 1H, J=5,9 Hz, J=16,7 Hz), 3,42
(dd, J=5,9 Hz, J=16,7 Hz), 3,00 (dd, 1H, J=4,4 Hz, 13,7 Hz), 2,78
(dd, 1H, J=8,8 Hz, J=13,2 Hz), 1,50-1,65 (m, 1H),
1,45 (t, 2H, J=7,3 Hz), 1,36 (s, 9H), 0,86 (d, 3H, J=6,4 Hz), 0,82
(d, 3H, J=6,4 Hz).
El
Boc-Gly-Phe-Leu-OBzl
(1,7 g) obtenido en el Ejemplo 19 se disolvió en una solución mixta
de acetato de etilo (30 ml) y metanol (30 ml), y se añadió con 5%
Pd-C (1,5 g) para realizar reducción catalítica. La
mezcla de reacción se filtró y el filtrado fue evaporado hasta
sequedad bajo presión reducida para obtener el compuesto del
enunciado (1,15 g).
El
Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH
obtenido en el Ejemplo 20 (200 mg) y
N-hidroxisuccinimida (58 mg) se disolvieron en
N,N-dimetilformamida (5 ml). Después de enfriar a
4°C, se añadió N,N'-diciclohexilcarbodiimida (104
mg) a la solución y se disolvió. A esta solución, se añadió una
solución de N,N-dimetilformamida (5 ml) en la cual
se habían disuelto metanosulfonato de DX-951 (224
mg) y trietilamina (0,059 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con
agitación a temperatura ambiente durante 16 horas bajo condiciones
protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta
sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:
diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo ácido acético
0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (200 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d;) \delta: 8,35 (d, 1H, J=7,8 Hz),
8,08-8,18 (m, 2H), 7,75-7,85 (m,
2H), 7,32 (s, 1H), 7,10 (d, 2H, J=6,8 Hz),
7,08-7,13 (m, 3H), 6,85-6,95 (br,
1H), 6,40-6,65 (br, 1H), 5,52-5,55
(m, 1H), 5,46 (d, 1H, J=18,5 Hz), 5,37 (d, 1H, J=18,5 Hz), 5,24
(s,2H), 4,44-4,52 (m, 1H), 4,15-4,25
(m, 1H), 3,68-3,72 (m, 2H),
3,40-3,52 (m, 2H), 3,15-3,25 (br,
2H), 2,85-2,95 (m, 1H), 2,65-2,75
(m, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,05-2,25 (m, 1H),
1,80-1,91 (m, 2H), 1,50-1,65 (m,
1H), 1,45 (t, 2H, J=7,3 Hz), 1,35 (s, 9H),.0,88 (t, 3H, J=7,4),0,86
(d, 3H, J=6,4 Hz), 0,82 (d, 3H, J=6,4 Hz).
Se disolvió el
3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (97 mg)
obtenido en el Ejemplo 21 en ácido trifluoroacético (3 ml) y se
dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y el
residuo fue sometido a destilación azeotrópica dos veces con metano)
(30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con éter
para obtener el compuesto del enunciado (95 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,57 (d, 1H, J=8,3 Hz),
8,47 (d, 1H, J=8,3 Hz), 8,32 (d, 1H, J=7,8 Hz), 8,17 (t, 1H, J=5,5
Hz), 7,81-7,91 (br, 3H), 7,79 (d, 1H, J=10,7 Hz),
7,32 (s, 1H), 7,21-7,23 (m, 5H),
7,12-7,17 (m, 1H), 6,45-6,55 (br,
1H), 5,57 (q, 1H, J=4,4 Hz), 5,43 (d, 1H, J=16,1 Hz), 5,34 (d, 1H,
J=16,1 Hz), 5,23 (s, 2H), 4,67 (dt, 1H, J=4,0 Hz, J=9,0 Hz), 4,31
(dd, 1H, J=8,5 Hz, J=15,0 Hz), 4,0-4,4 (br, 1H),
3,74-3,76 (m, 2H), 3,56 (dd, 1H, J=6,0 Hz, J=16,0
Hz), 3,41 (dd, 1H, J=6,0 Hz, J=16,0 Hz), 3,17-3,19
(br, 2H), 3,02 (dd, 1H, J=4,0 Hz, J=14,0 Hz), 2,70 (dd, 1H, J=10,0
Hz, J=14,0 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,05-2,15 (m, 1H),
1,85 (dt, 2H, J=7,0 Hz, J=14,0 Hz), 1,50-1,55 (m,
1H), 1,45 (t, 2H, J=6,0 Hz), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J=7,4), 0,85
(d, 3H, J=6,4 Hz), 0,80 (d, 3H, J=6,4 Hz).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 13 (690 mg) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (50 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (95 mg)
obtenida en el Ejemplo 22 en N,N-dimetilformamida
(10 ml), trietilamina (0,03 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(690 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml) y
éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación. Los precipitados se disolvieron en cloruro
sódico acuoso 0,5 M, se ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso
0,1 M, y fueron dializados con agua purificada utilizando una
membrana de diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte; 6.000-
8.000). La solución dializada interna se filtró a través de un
filtro Millipore (0,22 \mum), y entonces el filtrado fue
liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (600 mg). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 4,8% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvió en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 5000
ml) Dextran T500 (50 g, Pharmacia, peso molecular: 500K), y se
añadió una solución acuosa (5000 ml) de periodato sódico (165,0 g).
Después de agitar a 4ºC durante diez días con protección de luz, la
mezcla se añadió con glicol etileno (35,0 ml) y fue agitada durante
la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5 con hidróxido
sódico acuoso 8 M. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (70 g),
y luego la mezcla fue agitada durante la noche. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido acético
y agitada a 4°C durante una hora, y entonces ajustada a pH 7,5 con
hidróxido sódico acuoso 8 M. La solución resultante se sometió a
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50
para eliminar la fracción de bajo peso molecular. La fracción
polimérica fue liofilizada para obtener polialcohol dextrano (27,1
g). El peso molecular de esta sustancia fue 140K (filtración de
gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(21 g) en agua (150 ml), y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió bajo enfriamiento con hielo y se disolvió
ácido monocloroacético (30 g), y luego se dejó reaccionar la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 8 con ácido acético y entonces fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana fue
liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (5,6 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 263K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,4.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,0 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (4 ml) y fue liofilizado para obtener el compuesto del
enunciado (2,2 g).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
(1,0 g) obtenida en el Ejemplo 24 se disolvió en agua, se aplicó a
una columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo Me_{3}N H^{+}) y fue eluida con
agua. Este efluente fue liofilizado para obtener el compuesto del
enunciado (950 mg).
De una manera similar a la del Ejemplo 14, sal de
ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
obtenida desde
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-(NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (400 mg) se
disolvió en agua/MeOH (1:4), se aplicó a una columna
Bio-Rad AG 1-X8 (trama
200-400, tipo Cl^{-}) (1,5 cm x 8,6 cm) y fue
eluida con el anterior disolvente. Este efluente fue concentrado y
luego liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (310
mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,53 (d, 1H, J=8,5 Hz),
8,46-8,48 (m, 1H), 8,37-8,39 (m,
1H), 7,95 (d, 1H, J=8,0 Hz), 7,80 (s, 3H), 7,78 (d, 1H, J=11,1 Hz),
7,34 (s, 1H), 7,14-7,24 (m, 5H), 6,50(s, 1H),
5,56-5,60 (m, 1H), 5,35-5,40 (m,
2H), 5,24 (s, 2H), 4,51-4,56 (m, 1H), 3,86 (dd,
J=4,8, 13,5 Hz, 1H), 3,68-3,79 (m, 3H), 3,54 (s,
2H), 3,15-3,22 (m, 2H), 3,01 (dd, J=5,6, 13,5 Hz,
1H), 2,78 (dd, J=9,6, 3,5 Hz, 1H), 2,41 (s, 3H),
2,12-2,23 (m, 2H), 1,81-1,89 (m,
2H), 0,88 (t, 3H, J=7,2 Hz).
Masa (FAB); m/e 753 (M+1).
La sal trimetilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 25 (0,1 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (6 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución del hidrocloruro de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (24 mg)
obtenido en el Ejemplo 26 en N,N-dimetilformamida
(10 ml), trietilamina (5 pl), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(0,1 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento
con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-30.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (90 mg). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 11% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm
en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal trimetilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 25 (0,1 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (6 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución del hidrocloruro de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (36 mg)
obtenido en el Ejemplo 26 en N,N-dimetilformamida
(10 ml), trietilamina (8 \mul), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(0,1 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 12 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-30. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (80 mg). El resultado obtenido mediante análisis GPC
después de disolver este compuesto en cloruro sódico acuoso 1,0 M
(columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl
0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min), y el espectro de absorción
ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 36
\mug/ml) se representan en las Figuras 8 y 9, respectivamente. El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto
fue 15% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm
en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvió Dextran T250 (20 g, EXTRASYNTHESE,
peso molecular medio: 250K) en tampón ácido acético 0,1 M (pH 5,5,
2000 ml) y se añadió con una solución acuosa (2000 ml) de periodato
sódico (66,0 g). Después de agitar a 4°C durante diez días con
protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (14,0 ml)
y fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH
7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. Se
añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y entonces la mezcla
fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético y agitada a 4°C durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. La
fracción de bajo peso molecular se eliminó en la solución acuosa
resultante mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-30 para obtener la Solución Retenida 1 que no
pasó a través de la membrana. Separadamente, se disolvió Dextran
T250 (50 g, EXTRASYNTHESE, peso molecular medio: 250K) en tampón
acetato 0,1 M (pH 5,5, 5000 ml) y se añadió con una solución acuosa
(5000 ml) de periodato sádico (165 g). Después de agitar a 4°C
durante diez días con protección de luz, la mezcla se añadió con
glicol etileno (35,0 ml) y fue agitada durante la noche. La mezcla
de reacción se ajustó a pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo
enfriamiento con hielo. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (70
g), y entonces la mezcla fue agitada durante la noche a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a
pH 5,5 con ácido acético y agitada a 4°C durante una hora, y luego
ajustada a pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento
con hielo. La fracción de bajo peso molecular se eliminó en la
solución acuosa resultante mediante ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-30 para obtener la Solución
Retenida 2 que no pasó a través de la membrana. Las Soluciones
Retenidas 1 y 2 fueron combinadas, sometidas a ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-30 para eliminar la
fracción de bajo peso molecular de la fracción que había pasado a
través de membrana Biomax-50, y fueron liofilizadas
para obtener polialcohol dextrano (25,7 g). El peso molecular de
esta sustancia fue 47K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(35 g) en agua (150 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A esta
solución, se añadió ácido monocloroacético (50 g) bajo enfriamiento
con hielo y se disolvió, y entonces se dejó reaccionar la mezcla a
temperatura ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 8 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (7,2 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 127K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,8. Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,2 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (4 ml) y luego fue liofilizado para obtener sal
trietilamónica de polialcohol carboximetildextrano (2,69 g).
Esta sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (2,67 g) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (200 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución obtenida mediante disolución
de la sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A,
la cual había sido obtenida mediante eliminación del grupo Boc,
según el procedimiento similar al del Ejemplo 16 de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (350 mg)
preparada de una manera similar a la del Ejemplo 2, y trietilamina
(0,116 ml) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y una
solución obtenida mediante disolución de
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(2,67 g) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche con
agitación. Esta mezcla de reacción se añadió con cloruro sódico
acuoso 3 M (100 ml) y cada una de las porciones de 8 ml de la mezcla
se añadió por goteo a lotes de 30 ml de etanol. A cada mezcla, se
añadieron cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml) y éter dietilo (5 ml), y
los precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron lavados con acetona
y luego disueltos en agua, y se añadieron con cloruro sódico acuoso
3 M (10 ml), y luego se ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso
0,1 M, y seguidamente tratados a 37ºC durante 1 hora. La solución
tratada fue desalada mediante ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-10. La solución restante que no
había pasado a través de la membrana se filtró a través de un
filtro Millipore (0,22 \mum) y fue luego liofilizada para obtener
el compuesto del enunciado (2,30 g). El resultado obtenido mediante
análisis GPC después de disolver este compuesto en cloruro sódico
acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh,
disolvente: NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro
de absorción ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1
M, pH 9,0, 0,20 mg/mi) se representan en las Figuras 10 y 11,
respectivamente. El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en el compuesto fue 5,8% (w/w) cuando se determinó
con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH
9,0).
A una solución (2000 ml) de Dextran T10 (20 g,
Pharmacia, peso molecular medio: 10K) en tampón ácido acético 0,1 M
(pH 5,5) se añadió una solución acuosa (2000 ml) de periodato sódico
(66,0 g). Después de agitar a 4°C durante diez días con protección
de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (14,0 ml) y fue
agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. Se
añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y la mezcla fue
agitada durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético y agitada a 4°C durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante se sometió a ultrafiltración utilizando
una membrana Biomax-5 (Millipore) para eliminar la
fracción de bajo peso molecular, y la solución restante que no había
atravesado la membrana fue pasada a través de una membrana
Biomax-30. El filtrado resultante fue liofilizado
para obtener polialcohol dextrano (8,0 g). El peso molecular de
esta sustancia fue 13K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (3,7 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(25,9 g) en agua (111 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (37 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y entonces se dejó reaccionar
la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-5. La
solución restante que no había pasado a través de la membrana fue
liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (6,2 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 37K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,9.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (6,0 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}), y luego fue eluida con agua.
Este efluente se añadió con trietilamina (9,3 ml) y entonces
liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (7,2 g).
El polialcohol dextrano (3,9 g) obtenido en el
Ejemplo 30 se añadió a una solución acuosa obtenida mediante
disolución de hidróxido sódico (16,3 g) en agua (117 ml) y se
disolvió a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió ácido
monocloroacético (23,4 g) bajo enfriamiento con hielo y se
disolvió, y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético y fue desalada mediante ultrafiltración utilizando
una membrana Biomax-5. La solución restante que no
había pasado a través de la membrana fue liofilizada para obtener
la sal sódica de polialcohol carboximetildextrano (5,0 g). El peso
molecular de esta sustancia fue 28K (filtración de gel, estándar
pululano) y el grado de carboximetilación fue 0,5. Esta sal sódica
de polialcohol carboximetildextrano (4,8 g) se convirtió en la sal
trietilamónica de una manera similar a la del Ejemplo 30 para
obtener el compuesto del enunciado (5,6 g).
Una solución acuosa (2000 ml) de periodato sódico
(66,0 g) se añadió a una solución (2000 ml) de Dextran 4 (20 g,
Funakoshi, peso molecular medio: 4K-6K) en tampón
ácido acético 0,1 M (pH 5,5). Después de agitar a 4ºC durante diez
días con protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno
(14,0 ml) y fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se
ajustó a pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento
con hielo. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y la
mezcla fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. La
mezcla de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con
ácido acético y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a
pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo.
La solución acuosa resultante se sometió a ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-3 (Millipore) para
eliminar la fracción de bajo peso molecular. El filtrado obtenido
fue liofilizado para obtener polialcohol dextrano (6,0 g). El peso
molecular de esta sustancia fue 9K (filtración de gel, estándar
pululano). Este polialcohol dextrano (2,7 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(18,9 g) en agua (81 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (27 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y entonces se dejó reaccionar
la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-5.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (4,2 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 20K (filtración de gel, estándar pululano), y el grado de
carboximetilación fue 0,9.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (4,0 g) se convirtió en la sal trietilamónica
de una manera similar a la del Ejemplo 30 para obtener el compuesto
del enunciado (4,8 g).
El polialcohol dextrano (2,7 g) obtenido en el
Ejemplo 32 se añadió a una solución acuosa obtenida mediante
disolución de hidróxido sódico (11,3 g) en agua (81 ml) y se
disolvió a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió ácido
monocloroacético (16,2 g) bajo enfriamiento con hielo y se
disolvió, y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético y fue desalada mediante ultrafiltración utilizando
una membrana Biomax-5. La solución restante que no
había pasado a través de la membrana fue liofilizada para obtener
la sal sódica de polialcohol carboximetildextrano (2,7 g). El peso
molecular de esta sustancia fue 16K (filtración de gel, estándar
pululano) y el grado de carboximetilación fue 0,5. Esta sal sódica
de polialcohol carboximetildextrano (2,7 g) se convirtió en la sal
trietilamónica de una manera similar a la del Ejemplo 30 para
obtener el compuesto del enunciado (3,1 g).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 30 (1,5 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,07 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (210 mg) en
N,N-dimetilformamida (40 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,5 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y entonces los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-3. La solución restante que no había pasado a
través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (1,3 g). El resultado obtenido mediante análisis GPC
después de disolver este compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M
(columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl
0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción
ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 65
\mug/ml) se representan en las Figuras 12 y 13, respectivamente.
El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el
compuesto fue 6,4% (w/w) cuando se determinó con base en la
absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 31(1,2 g) se
disolvió en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta
solución, se añadieron sucesivamente una solución de trietilamina
(0,056 ml) y sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (168 mg) en
N,N-dimetilformamida (30 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,2 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento
con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-3.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,0 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 4,8% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 32 (1,2 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,056 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (168 mg) en
N,N-dimetilformamida (30 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,2 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento
con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-3.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,0 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 5,9% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 33 (1,5 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,07 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (210 mg) en
N,N-dimetilformamida (40 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,5 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento
con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-3.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,3 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 4,6% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly
(42 mg) y N-hidroxisuccinimida (12 mg) en
N,N-dimetilformamida (2 ml), se enfrió a 4°C, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(22 mg). A esta solución, se añadió una solución de
N,N-dimetilformamida (6 ml), en la cual se
disolvieron el hidrocloruro del compuesto representado por la
siguiente fórmula:
[(1S,9S)-1-amino-5-cloro-9-etil-2,3-dihidro-9-hidroxi-1
H,12H-benzo[de]pirano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H]-diona:
DW-82861 (50 mg) y trietilamina (0,01 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla con agitación y protección de luz a
temperatura ambiente durante 16 horas. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo ácido
acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (27
mg).
^{1}H-NMR (CDCl_{3})
\delta: 8,10-8,20 (br, 1H),
7,95-8,05 (br, 1H), 7,70-7,80 (br,
2H), 7,50-7,60 (br, 1H), 7,40- 7,50 (br, 1H),
7,10-7,25 (m, 5H), 7,05-7,15 (br,
1H), 5,85-5,95(br, 1H),
5,50-5,60 (br, 1H), 5,40-5,50 (m,
1H), 5,25-5,3 5 (m, 1H), 5,05-5,15
(m, 1H), 4,90-5,00 (m, 1H),
4,70-4,80 (br, 1H), 4,10-4,25 (br,
2H), 3,60-3,90 (m, 4H), 3,10-3,40
(m, 3H), 2,95-3,05 (br, 1H),
2,15-2,30 (br, 1H), 1,75-1,90 (br,
2H), 1,39 (s, 9H), 0,80-1,00 (m, 3H).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (175 mg) obtenida en el Ejemplo 24 se disolvió
en N,N-dimetilformamida (20 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DW-8286) (29 mg), la
cual había sido obtenida de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(27 mg) preparado en el Ejemplo 38 eliminando el grupo Boc de una
manera similar a la del Ejemplo 4, y trietilamina (9 \mul ) en
N,N-dimetilformamida (5 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(175 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-30. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana se filtró a
través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue liofilizada
para obtener el compuesto del enunciado (135 mg). El resultado
obtenido mediante análisis GPC después de disolver este compuesto
en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 99 \mug/ml) se
representan en las Figuras 14 y 15, respectivamente. El contenido
del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 6,1%
(w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en
solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly
(163 mg) y N-hidroxisuccinimida (45 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml), se enfrió a 4°C, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(79 mg). A esta solución, se añadió una solución de
N,N-dimetilformamida (30 ml), en la cual se
disolvieron tosilato del compuesto representado por la siguiente
fórmula:
[(1S,9S)-1-amino-9-etil-2,3-dihidro-9-hidroxi-1
H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13
(9H,15H)-diona: DW-8089] (170 mg) y trietilamina (0,054 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano:metanol = 94:6 solución conteniendo ácido acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (100 mg).
(9H,15H)-diona: DW-8089] (170 mg) y trietilamina (0,054 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano:metanol = 94:6 solución conteniendo ácido acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,51 (d, 1H, J=8,5 Hz),
8,41 (t, 1H, J=5,6 Hz), 8,29 (s, 1H), 8,17 (d, 1H, J=8,0 Hz), 8,03
(d, 1H, J=8,0 Hz), 7,90 (dd, 1H, J=4,8, 5,6 Hz), 7,79 (t, 1H, J=5,6
Hz), 7,53 (d, 1H, J=7,2 Hz), 7,36 (s, 1H),
7,13-7,25 (m, 5H), 6,94-6,95 (m,
1H), 5,60-5,63 (m, 1H), 5,36-5,47
(m, 2H), 5,21-5,30 (m, 2H),
4,42-4,47 (m, 1H), 3,63-3,96 (m,
3H), 3,51-3,59 (m, 3H), 3,31-3,40
(m, 1H), 3,09-3,21 (m, 1H), 3,02 (dd, 1H, J=4,8,
13,5 Hz), 2,76-2,81 (m, 1H),
2,13-2,17 (m, 2H), 1,85-1,90 (m,
2H), 1,37 (s, 9H), 0,89 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 822 (M+1).
Se disolvió la sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (1,6 g) obtenida en el Ejemplo 24 en
N,N-dimetilformamida (60 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución obtenida mediante disolución
de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DW-8089), la cual había
sido obtenida de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(200 mg) preparado en el Ejemplo 40 eliminando el grupo Boc de una
manera similar a la del Ejemplo 4, y trietilamina (0,07 ml) en N,N-
dimetilformamida (20 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,6 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml) y
éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (2500 rpm, 8 minutos). Los precipitados
fueron lavados con etanol, luego disueltos en agua, se añadieron
con cloruro sódico acuoso 3 M (20 ml), y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M. Esta solución fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-10.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,20 g). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver el
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,26 mg/ml) se
representan en las Figuras 16 y 17, respectivamente. El contenido
del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,0%
(w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en
solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se añadieron
Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OBzl
(670 mg), Pd-C 10% (100 mg) y formato amónico (200
mg) a DMF (dimetilformamida) (5 ml) y se agitó durante tres horas.
La mezcla de reacción se filtró, el filtrado fue evaporado hasta
sequedad bajo presión reducida, y entonces el residuo se purificó
mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:
solución diclorometano:metanol = 8:1) para obtener el compuesto del
enunciado (300 mg).
^{1}H-NMR (CD_{3}OD)
\delta: 7,16-7,45 (m, 20H), 4,66 (dd, 1H,
J=9,8,5,4 Hz), 3,93 (d, 1H, J=16,6 Hz), 3,80 (d, 1H, J=17,6 Hz),
3,78 (d, 1H, J=16,6 Hz), 3,68 (d, 1H, J=17,1 Hz), 3,23 (dd, 1H,
J=14,2,5,4 Hz), 2,90 (d, 1H, J=13,7 Hz), 2,90 (s, 1H).
Se disolvieron
Trt-Gly-Gly-Phe-Gly-OH
(100 mg) y N-hidroxisuccinimida (22 mg) en DMF (4
ml), y la mezcla se añadió con
N,N'-diciclohexiicarbodiimida (40 mg) bajo
enfriamiento con hielo y fue agitada a 4°C durante 2 horas. A esta
solución, se añadió una solución de N-metilmorfolina
(0,019 ml) e hidrocloruro de doxorrubicina (DXR) (92 mg) disueltos
en DMF (20 ml), y la mezcla fue agitada a 4°C durante 16 horas.
Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión
reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol
= 20:1). El compuesto resultante se disolvió en ácido acético 75% (1
ml) y se agitó durante 1 hora. Se añadió agua (20 ml), la masa
sólida precipitada fue eliminada mediante filtración, luego el
filtrado fue liofilizado y el polvo resultante se disolvió en agua
(5 ml). Esta solución fue pasada a través de una columna
Bio-Rad AG 1-X8 (tipo Cl^{-}) y
fue eluida con agua, y luego el efluente fue lavado con
diclorometano, y la capa acuosa fue liofilizada para obtener el
compuesto del enunciado (40 mg).
^{1}H-NMR (CD_{3}OD
\delta:7,95 (d, 1H, J=7,3 Hz), 7,82 (t, 1H, J=7,8 Hz), 7,54 (d,
1H, J=8,3 Hz), 7,16-7,26 (m, 5H), 5,43 (d, 1H,
J=3,4 Hz), 5,14 (br, 1H), 4,72 (s, 2H), 4,42 (dd, 1H, J=8,3,6,8 Hz),
4,30 (q, 1H, J=6,8 Hz), 4,14-4,18 (m, 1H), 4,03 (d,
1H, J=16,6 Hz), 4,02 (s, 3H), 3,86 (d, 1H, J=18,5 Hz), 3,83 (d, 1H,
J=17,1 Hz), 3,75 (d, 1H, J=16,1 Hz), 3,73 (d, 1H, J=16,1 Hz), 3,62
(br, 1H), 3,58 (d, 1H, J=16,6 Hz), 3,10-3,15 (m,
2H) 3,00 (d, 1H, J=18,6 Hz), 2,94 (dd, 1H, J=14,2, 8,8 Hz), 2,38 (d,
1H, J=14,2 Hz), 2,18 (dd, 1H, J=14,2,4,4 Hz),
1,94-2,00 (m, 1H), 1,71 (dd, 1H, J=12,7,4,4 Hz),
1,28 (d, 3H, J=6,3 Hz).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
(1,5 g) obtenida en el Ejemplo 24 se convirtió en la sal
trimetilamónica (1,2 g) de una manera similar a la del Ejemplo 25, y
luego 400 mg de esta sal se disolvieron en
N,N-dimetilformamida (24 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de hidrocloruro de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-DXR
(76 mg) en N,N-dimetilformamida (24 ml),
trietilamina (24 pl) y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(400 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3,500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y fueron desalados
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-30. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (40 mg). El resultado obtenido mediante análisis GPC
después de disolver este compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M
(columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, disolvente:
NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción
ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 7,4, 36
\mul) se representan en las Figuras 18 y 19, respectivamente. El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto
fue 6,0% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 480
nm en PBS (pH 7,4).
Se disolvió Dextran T150 (20 g, Pharmacia, peso
molecular medio: 150K) en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 2000 ml) y
se añadió con una solución acuosa (2000 ml) de periodato sódico
(66,0 g). Después de agitar a 4°C durante diez días con protección
de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (14,0 ml) y fue
agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. Se
añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y entonces la mezcla
fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético, y agitada a 4°C durante 1 hora. El pH de la mezcla se
ajustó a 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con
hielo. La solución acuosa resultante fue concentrada hasta 500 ml
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-5 (Millipore) para obtener la Solución 1.
Separadamente, se realizaron una serie de procesos descritos
anteriormente utilizando Dextran T110 (20 g) para obtener la
Solución 2. Las Soluciones 1 y 2 fueron combinadas, y la solución
combinada se ajustó a pH 3,0 y fue incubada a 40°C durante 4 horas,
y luego ajustada a pH 7 para obtener una solución conteniendo el
polialcohol dextrano con peso molecular rebajado. La solución fue
pasada a través de una membrana Biomax-30 y fue
desalada mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-5, y luego fue liofilizada para obtener
polialcohol dextrano (4,6 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 17K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (2,5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(17,5 g) en agua (75 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (25 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y luego se dejó reaccionar la
mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 9 con ácido acético y luego fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-5. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana fue liofilizada para obtener la sal sódica
de polialcohol carboximetildextrano (4,0 g). El peso molecular de
esta sustancia fue 45K (filtración de gel, estándar pululano), y el
grado de carboximetilación fue 0,9.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (3,7 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) y fue eluida con agua. Este
eluyente se añadió con trietilamina (5,8 ml) y luego fue
liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (4,4 g).
Se disolvió la sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 45 (4,4 g) en
N,N-dimetilformamida (300 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,19 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (580 mg) en
N,N-dimetilformamida (45 ml) y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(4,4 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 10 con hidróxido sódico acuoso 1 M, y
entonces cada una de las porciones de 5 ml de la mezcla se añadió
por goteo a lotes de 25 ml de etanol. La mezcla se añadió con
cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml) y éter dietilo (5 ml), y los
precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron disueltos en agua y
dializados con agua purificada utilizando una membrana de diálisis
(Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000), y la solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Miliipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (3,4 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 4,6% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El polialcohol dextrano (2 g) obtenido en el
Ejemplo 45 se añadió a una solución acuosa obtenida mediante
disolución de hidróxido sódico (14 g) en agua (60 ml) y se disolvió
a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió y disolvió ácido
\alpha-bromopropiónico (19 ml) bajo enfriamiento
con hielo, y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético y fue desalada mediante ultrafiltración utilizando
una membrana Biomax-50. La solución restante que no
había pasado a través de la membrana fue liofilizada para obtener la
sal sódica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,95 g). El peso
molecular de esta sustancia fue 45K (filtración de gel, estándar
pululano). El grado de
\alpha-metilcarboximetilación por cada residuo
sacárido se obtuvo de acuerdo con los casos de polialcohol
carboximetildextrano que siguen. Una solución acuosa de la sal
sódica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (tipo
H^{+}), y el efluente fue liofilizado y utilizado como muestra.
Esta muestra se disolvió en un exceso determinado de solución
acuosa de hidróxido sódico 0,1 N y fue neutralizada con ácido
clorhídrico 0,1 N utilizando fenolftaleína como un indicador. El
grado de \alpha-metilcarboximetilación se obtuvo
según la ecuación: grado de
\alpha-metilcarboximetilación =
13,4(a-b)/[s-7,2(a-b)]
en la cual "s" es la cantidad de muestra utilizada (mg),
"a" es el exceso determinado de solución acuosa de hidróxido
sódico 0,1 N (ml), y "b" es la cantidad de ácido clorhídrico
0,1 N consumida para la valoración (ml). Como resultado, el grado
de \alpha-metilcarboximetilación se determinó en
0,8.
Esta sal sódica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,2 g) se
disolvió en agua, se aplicó a una columna Bio-Rad
AG 50W-X2 (trama 200-400, tipo
H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud: 210 mm), y luego fue eluida
con agua. Este efluente se añadió con trietilamina (4 ml) y luego
fue liofilizado para obtener sal trietilamónica de
polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,69 g).
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,69 g).
Esta sal trietilamónica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,68 g) se
disolvió en N,N-dimetilformamida (60 ml). A esta
solución, se añadieron sucesivamente una solución obtenida mediante
disolución de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951), la cual había
sido obtenida de una manera similar a la del Ejemplo 16 eliminando
el grupo Boc de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(350 mg) sintetizado similarmente al del Ejemplo 2, y trietilamina
(0,116 ml) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y una
solución obtenida mediante disolución de
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(2,68 g) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche con
agitación. Esta mezcla de reacción se añadió con cloruro sódico
acuoso 3 M (40 ml), y cada una de las porciones de 6 ml de la
mezcla se añadió por goteo a lotes de 30 ml de etanol. Cada lote se
añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml) y éter dietilo (5 ml), y
el precipitado depositado fue recogido mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Este precipitado fue lavado con acetona,
luego disuelto en agua, añadido con cloruro sódico acuoso 3 M (10
ml), ajustado a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M, y tratado a
37ºC durante 1 hora. Esta solución tratada fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-10.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (2,15 g). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver este
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,21 mg/ml) se representan en las Figuras 18 y 19, respectivamente. El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el producto resultante fue 5,9% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,21 mg/ml) se representan en las Figuras 18 y 19, respectivamente. El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el producto resultante fue 5,9% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Una mezcla de sal de ácido
p-toluenosulfónico de
Phe-Gly-OBzl (3,06 g),
Boc-Gly-OH (1,10 g),
N-hidroxisuccinimida (941 mg),
N-metilmorfolina (0,725 ml), y
N,N-dimetilformamida (40 ml) se enfrió a 4ºC, y se
añadió con
N,N'-diciclohexil-carbodiimida (1,56
g). Se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a temperatura
ambiente con agitación, y entonces fue evaporada hasta sequedad bajo
presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en
columna de gel de sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol
= 98:2) para obtener
Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl
(1,93 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,52 (dd, 1H, J=5,6, 6,4
Hz), 7,97 (d, 1H, J=8,8 Hz), 7,30-7,39 (m, 5H),
7,15-7,26 (m, 5H), 6,83 (t, 1H, J=5,6 Hz), 5,14 (s,
1H), 4,52-4,57 (m, 1H), 3,87-3,96
(m, 2H), 3,57 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz), 3,43 (dd, 1H, J=5,6, 16,7
Hz), 3,01 (dd, 1H, J=4,8, 14,3 Hz), 2,77 (dd, 1H, J=5,6, 14,3 Hz),
1,37 (s, 9H).
El
Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl
resultante (1,78 g) se disolvió en acetato de etilo (60 ml) y fue
sometido a reducción catalítica durante 24 horas en presencia de
5%-Pd-C (1,8 g). El catalizador se eliminó mediante
filtración y el filtrado fue concentrado bajo presión reducida para
obtener
Boc-Gly-Phe-Gly-OH
(1,41 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,35 (t, 1H, J=5,6 Hz),
7,94 (d, 1H, J=8,8 Hz), 7,15-7,26 (m, 5H), 6,85 (dd,
1H, J=5,6, 6,4 Hz), 4,52-4,58 (m, 1H), 3,76 (d, 2H,
J=5,6 Hz), 3,56 (dd, 1H, J=6,4, 16,7 Hz), 3,43 (dd, 1H, J=5,6, 16,7
Hz), 3,03 (dd, 1H, J=5,0, 13,5 Hz), 2,79 (dd, 1H, J=9,5, 13,5 Hz),
1,37 (s, 9H).
Se disolvieron el
Boc-Gly-Phe-Gly-OH
(500 mg) obtenido anteriormente y
N-hidroxisuccinimida (161 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml). A esta solución, se
añadió una solución de N,N-dimetilformamida (50 ml),
en la cual se disolvieron metanosulfonato de DX-8951
(530 mg) y trietilamina (0,146 ml). La mezcla se enfrió a 4°C, se
añadió con N,N'-diciclohexilcarbodiimida (268 mg), y
se dejó reaccionar durante la noche con agitación a temperatura
ambiente bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de
reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida y el
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 96:4) para
obtener
3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,39 (d, 1H, J=8,0 Hz),
8,34 (t, 1H, J=5,6 Hz), 7,98 (d, 1H, J=7,2 Hz), 7,78 (d, 1H, J=10,3
Hz), 7,33 (s, 1H), 7,13-7,24 (m, 5H), 6,80 (dd, 1H,
J=5,6, 6,4 Hz), 5,55-5,61 (m, 1H), 5,44 (d, 1H,
J=16,0 Hz), 5,41 (d, 1H, J=16,0 Hz), 5,25 (s, 2H),
4,43-4,46 (m, 1H), 3,69-3,79 (m,
2H), 3,50 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz), 3,41 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz),
3,16-3,19 (m, 2H), 2,98 (dd, 1H, J=4,8, 14,3 Hz),
2,79 (dd, 1H, J=9,5, 14,3 Hz) 2,41 (s, 3H),
2,19-2,25 (m, 1H), 2,10-2,15 (m,
1H), 1,82-1,90 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H,
J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 797 (M+1).
El
3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) resultante (100
mg) se disolvió en ácido trifluoroacético
(3 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones azeotrópicas dos veces con metano, (30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con éter para obtener el compuesto del enunciado (80 mg).
(3 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones azeotrópicas dos veces con metano, (30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con éter para obtener el compuesto del enunciado (80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,52-8,62
(m, 1H), 7,94 (s, 3H), 7,79 (t, 1H, J=11,1 Hz), 7,34 (s, 1H),
7,15-7,27 (m, 5H), 6,52 (s, 1H),
5,57-5,61 (m, 1H), 5,36-5,46 (m,
2H), 4,66-4,70 (m, 1H), 3,69-3,81
(m, 2H), 3,61- 3,68 (m, 1H), 3,40-3,47 (m, 1H),
3,15-3,23 (m, 1H), 3,01 (dd, 1H, J=4,0, 13,5 Hz),
2,77 (dd, 1H, J=9,5, 13,5 Hz), 2,12-2,23 (m, 2H),
1,81-1,91 (m, 2H), 0,89 (t, 3H, J=7,2 Hz). Masa
(FAB); m/e 697 (M+1).
Se disolvieron
Boc-Phe-Gly (771 mg) y
N-hidroxisuccinimida (300 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml). A esta solución, se
añadió una solución de N,N-dimetilformamida (50 ml),
en la cual se disolvieron metanosulfonato de
DX-8951 (1058 mg) y trietilamina (0,293 ml). La mezcla se enfrió a 4ºC, y luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida (494 mg), y se dejó reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 98:2) para obtener 3'-N-(Boc-Phe- Gly)-NH-A (A-NH_{2}=DX-8951) (1,20 g).
DX-8951 (1058 mg) y trietilamina (0,293 ml). La mezcla se enfrió a 4ºC, y luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida (494 mg), y se dejó reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 98:2) para obtener 3'-N-(Boc-Phe- Gly)-NH-A (A-NH_{2}=DX-8951) (1,20 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,29 (d, 1H, J=8,0 Hz),
8,21 (t, 1H, J=4,8 Hz), 7,76 (d, 1H, J=10,3 Hz), 7,32 (s, 1H),
7,13-7,25 (m, 5H), 6,92 (d, 1H, J=7,2 Hz), 6,49 (s,
1H), 5,56-5,61 (m, 1H), 5,44 (d, 1H, J=15,9 Hz),
5,38 (d, 1H, J=15,9 Hz), 5,25 (s, 2H), 4,08-4,12 (m,
1H), 3,78 (d, 1H, J=4,8 Hz), 3,16-3,25 (m, 2H), 2,99
(dd, 1H, J=4,0, 13,5 Hz), 2,72 (dd, 1H, J=10,3, 13,5 Hz), 2,40 (s,
3H), 2,09-2,35 (m, 2H), 1,80-1,91
(m, 2H), 1,16 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 741 (M+1).
El
3'-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A
(170 mg) obtenido anteriormente se disolvió en ácido
trifluoroacético (4 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se
evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones
azeotrópicas dos veces con metanol (10 ml) y dos veces con etanol
(10 ml), y luego lavado con éter para obtener el compuesto del
enunciado (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,88 (t, 1H, J=4,8 Hz),
8,68 (d, 1H, J=8,7 Hz), 8,05-8,15 (m, 3H), 7,79 (d,
1H, J=11,1 Hz), 7,26-7,36 (m, 5H), 6,52 (d, 1H,
J=7,2 Hz), 5,57-5,62 (m, 1H), 5,43 (d, 1H, J=15,9
Hz), 5,38 (d, 1H, J=15,9 Hz), 5,19-5,28 (m, 1H),
4,10-4,18 (m, 1H), 3,93 (dd, 1H, J=4,8, 16,7 Hz),
3,82 (dd, 1H, J=4,8, 16,7 Hz), 3,17-3,24 (m, 2H),
3,14 (dd, 1H, J=4,8, 13,5 Hz), 2,95 (dd, 1H, J=8,0, 13,5 Hz), 2,42
(s, 3H), 2,14-2,25 (m, 2H),
1,83-1,91 (m, 2H), 0,89 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 640 (M+1).
Se disolvieron metanosuifonato de
DX-8951 (530 mg) y trietilamina (0,28 ml) en
N,N-dimetilformamida (10 ml), se enfrió a 4°C, y se
añadió con éster N-hidroxisuccinimida de
Boc-Gly (327 mg). Se dejó reaccionar la mezcla con
agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones
protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta
sequedad bajo presión reducida, y entonces el residuo se purificó
mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:
solución diclorometano:metanol = 98:2) para obtener
3'-N-(Boc-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (500 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,38 (d, 1H, J=8,3 Hz),
7,77 (d, 1H, J=10,7 Hz), 7,31 (s, 1H), 6,89-6,91 (m,
1H), 6,49 (s, 1H), 5,55-5,59 (m, 1H), 5,45 (d, 1H,
J=16,1 Hz), 5,38 (d, 1H, J=16,1 Hz), 5,27 (d, 1H, J=19,0 Hz), 5,18
(d, 1H, J=19,0 Hz), 3,50-3,62 (m, 2H),
3,15-3,19 (m, 2H), 2,41 (s, 3H),
2,18-2,24 (m, 1H), 2,08-2,12 (m,
1H), 1,81-1,91 (m, 2H), 1,31 (s, 9H), 0,87 (t, 3H,
J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 593 (M+1).
El
3'-N-(Boc-Gly)-NH-A
(100 mg) obtenido anteriormente se disolvió en ácido
trifluoroacético (2 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se
evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones
azeotrópicas dos veces con metanol (10 ml) y dos veces con etanol
(10 ml), y luego lavado con éter para obtener el compuesto del
enunciado (70 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,88 (d, 1H, J=8,8 Hz),
8,08 (s, 3H), 7,81 (d, 1H, J=11,2 Hz), 7,34 (s, 1H), 6,52 (s, 1H),
5,63-5,67 (m, 1H), 5,45 (d, 1H, J=16,7 Hz), 5,40 (d,
1H, J=16,7 Hz), 5,36 (d, 1H, J=19,1 Hz), 5,25 (d, 1H, J=19,1 Hz),
3,56 (s, 2H), 3,11-3,19 (m, 2H), 2,43 (s, 3H),
2,23-2,28 (m, 1H), 2,11-2,19 (m,
1H), 1,81- 1,91 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 493 (M+1).
Se disolvió Dextran T500 (50 g, Pharmacia, peso
molecular: 500K) en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 5000 ml) y se
añadió con una solución acuosa (5000 ml) de periodato sódico (165,0
g). Después de agitar a 4°C durante diez días con protección de
luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (35,0 ml) y fue agitada
durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7 con
hidróxido sódico acuoso 8 M. Se añadió y disolvió borohidruro
sódico (70 g), y la mezcla fue agitada durante la noche. La mezcla
de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético y agitada a 4°C durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M. La solución acuosa resultante fue
desalada mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-50. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana fue liofilizada para obtener polialcohol
dextrano (20,2 g). El peso molecular de esta sustancia fue 159K
(filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (7,5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(31,5 g) en agua (225 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (45 g) bajo
enfriamiento con hielo, se disolvió, y se dejó reaccionar la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 8 con ácido acético y luego fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (8,5 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 274K (filtración de gel, estándar pululano), y el grado de
carboximetilación fue 0,4. Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,0 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (4 ml) y luego fue liofilizado para obtener el
compuesto del enunciado (2,2 g).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 51 (200 mg) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (7 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) obtenida en el
Ejemplo 48 (41 mg) en N,N-dimetilformamida (5 ml),
trietilamina (0,014 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(100 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,0 ml) y
éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-50. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana se filtró a
través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue liofilizada
para obtener el compuesto del enunciado (190 mg). El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto fue 4,5% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en tampón
Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
obtenida en el Ejemplo 24 (2,5 g) se disolvió en agua, se aplicó a
una columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo Et_{3}N H^{+}) y fue eluida con
agua. Este efluente fue liofilizado para obtener sal trietilamónica
de polialcohol carboximetildextrano (2,5 g).
Esta sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (200 mg) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (12 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (42 mg)
obtenida en el Ejemplo 49 y trietilamina (0,016 ml) en
N,N-dimetilformamida (5 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(200 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Esta mezcla de
reacción se añadió con agua (300 ml) y fue sometida a
ultrafiltración utilizando una membrana de ultrafiltración 10K
(Filtron). La solución restante que no había pasado a través de la
membrana se ajustó a pH 10 con hidróxido sódico acuoso 0,1 N, y se
pasó a través de una membrana de filtración (0,16 \mum, Filtron).
El filtrado fue desalado mediante ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-50, y entonces se filtró a través de
un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue liofilizado para obtener el
compuesto del enunciado (180 mg). El contenido del residuo del
compuesto medicamentoso en este compuesto fue 6,1% (w/w) cuando se
determinó con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris
0,1 M (pH 9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 51 (370 mg) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (10 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-Gly-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) obtenida en el
Ejemplo 50 (57 mg) en N,N-dimetilformamida (3 ml),
trietilamina (0,027 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(185 mg), y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante la noche con agitación. Cada una de las porciones
de 5 ml de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10
ml de etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M
(2,0 ml) y éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-50. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (290 mg). El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en este compuesto fue 0,5% (w/w) cuando se determinó
con base en la absorción a 362 nm en tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvió
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH
(200 mg) en ácido trifluoroacético (4 ml) y se agitó durante 1,5
horas. Se evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a
destilaciones azeotrópicas dos veces con metanol (10 ml) y dos
veces con etanol (10 ml), y fue lavado con éter para obtener sal de
ácido trifluoroacético de
Gly-Gly-Phe-Gly-OH
(225 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,48 (dd, 1H, J=5,6, 5,6
Hz), 8,59 (dd, 1H, J=5,6, 6,4 Hz), 8,29 (d, 1H, J=4,8 Hz),
7,23-7,26 (m, 4H), 7,16-7,20 (m,
1H), 4,58 (ddd, 1H, J=4,8, 4,8, 10,4 Hz), 3,89 (dd, 1H, J=5,6, 16,7
Hz), 3,76-3,79 (m, 2H), 3,67 (dd, 1H, J=5,6, 16,7
Hz), 3,56 (s, 2H).
La sal de ácido trifluoroacético de
Gly-Gly-Phe-Gly-OH
(200 mg) obtenida anteriormente se disolvió en agua (10 ml), se
añadió con trietilamina para ajustar el pH a 9,0, luego se adicionó
con una solución de 9-fluorenilmetil
N-hidroxisuccinimidilcarbonato (200 mg) en acetonitrilo (5 ml), y se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas mientras se mantenía el pH en el intervalo de 8,0 hasta.8,5 utilizando trietilamina. La mezcla de reacción se añadió con ácido clorhídrico 1,5 N (50 ml), y los precipitados depositados se recogieron mediante filtración, se lavaron con agua y se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 4:1) para obtener Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH (151 mg).
N-hidroxisuccinimidilcarbonato (200 mg) en acetonitrilo (5 ml), y se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas mientras se mantenía el pH en el intervalo de 8,0 hasta.8,5 utilizando trietilamina. La mezcla de reacción se añadió con ácido clorhídrico 1,5 N (50 ml), y los precipitados depositados se recogieron mediante filtración, se lavaron con agua y se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 4:1) para obtener Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH (151 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,28-8,32
(m, 1H), 8,08-8,12 (m, 1H),
7,85-7,89 (m, 2H), 7,68-7,72 (m,
2H), 7,57- 7,65 (m, 1H), 7,38-7,43 (m, 2H),
7,29-7,34 (m, 2H), 7,20-7,25 (m,
4H), 7,14-7,17 (m, 1H), 4,45-4,52
(m, 1H), 4,26-4,30 (m, 2H),
4,19-4,24 (m, 1H), 3,77 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz),
3,58-3,69 (m, 4H), 3,42-3,52 (m,
1H), 3,06 (dd, 1H, J=4,0, 13,5 Hz), 2,78 (dd, 1H, J=4,0, 13,5
Hz).
Se disolvieron el
Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-OH
obtenido anteriormente (24 mg), el derivado de taxol representado
por la fórmula siguiente:
[D51-7059:
9,10-O-(2-aminoetilideno)-13-O-[3-(tert-butoxicarbonilamino)-2-hidroxi-3-fenil]-propanoil-10-deacetil-9-dihidrobaccatina
III] (20 mg), y N-hidroxisuccinimida (7 mg) en
N,N-dimetilformamida (1 ml). Esta solución se
enfrió a 4ºC y luego se adicionó con
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (9 mg), y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche con
agitación. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad
bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución
diclorometano:metanol = 96:4) para obtener
Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059
(21
mg).
^{1}H-NMR (CDCl_{3})
\delta: 8,06 (d, 2H, J=8,1 Hz), 7,75 (d, 2H, J=8,1 Hz),
7,18-7,61 (m, 23H), 7,62 (dd, 1H, J=7,2, 8,0 Hz),
6,07 (dd, 1H, J=7,9, 8,8 Hz), 5,98 (d, 1H, J=4,8 Hz), 5,63 (d, 1H,
J=8,8 Hz), 5,00-5,40 (m, 4H), 4,92 (s, 1H),
4,60-4,69 (m, 2H), 4,41 (d, 2H, J=6,4 Hz), 4,35 (d,
I H, J=8,0 Hz), 4,29 (d, 1H, J=8,0 Hz), 4,21 (t, 1H, J=7,5 Hz),
3,96-4,07 (m, 3H), 3,73-3,86 (m,
4H), 3,37-3,41 (m, 1H), 3,19-3,23
(m, 1H), 3,00 (dd, 1H, J=8,0, 13,5 Hz), 2,85-2,89
(m, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,05-2,40 (m, 4H), 1,57 (s,
3H), 1,56 (s, 3H), 1,53 (s, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,22 (s, 3H).
Masa (FAB); m/e 1413 (M+Na).
Se disolvió el
Fmoc-Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059
obtenido anteriormente (21 mg) en diclorometano (1,8 ml) y se
añadió con piperazina (0,2 ml), y entonces se dejó reaccionar la
mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora. Esta mezcla de
reacción se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 94:6) para
obtener
Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059
(16 mg).
^{1}H-NMR (CDCl_{3})
\delta: 8,10 (d, 2H, J=8,1 Hz), 7,89-7,94 (m, 1H),
7,62 (dd, 1H, J=7,2, 8,0 Hz), 7,45-7,50 (m, 2H),
7,17-7,42 (m, 12H), 7,10-7,16 (m,
1H), 6,97 (dd, 1H, J=5,6, 6,4 Hz), 6,08 (dd, 1H, J=8,0, 8,7 Hz),
6,02 (d, 1H, J=4,8 Hz), 5,62 (d, 1H, J=11,1 Hz),
5,23-5,30 (m, 1H), 5,23 (d, 1H, J=7,2 Hz), 5,10 (s,
1H), 4,98-5,00 (m, 1H), 4,60-4,63
(m, 1H), 4,38 (d, 1H, J=8,8 Hz), 4,33 (d, 1H, J=8,8 Hz), 4,13 (s,
1H), 4,04 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz), 3,93 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz),
3,82 (d, 1H, J=7,2 Hz), 3,73-3,82 (m, 2H),
3,43-3,49 (m, 1H), 3,30-3,38 (m,
2H), 3,24 (dd, 1H, J=6,4, 14,3 Hz), 3,04 (dd, 1H, J=8,0, 14,3 Hz),
2,89-3,07 (m, 3H), 2,30 (s, 3H),
2,01-2,50 (m, 4H), 1,70 (s, 3H), 1,62 (s, 3H, 1,61
(s,3H), 1,40 (s, 9H), 1,26 (s, 3H).
Masa (FAB); m/e 1169 (M+1).
Se disolvió el
Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059
sintetizado de acuerdo con el procedimiento anterior (33 mg) en
N,N-dimetilformamida (0,5 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal trietilamónica de
polialcohol carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 24 (180 mg)
en N,N-dimetilformamida (7 ml) y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(180 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 4 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,0 ml)
y éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (2500 rpm, 8 minutos). Los precipitados
fueron lavados con etanol, luego se disolvieron en agua, se
aplicaron a una columna Bio-Rad AG
50W-X2 (trama 200-400, tipo
Na^{+}) (diámetro: 15 mm, longitud: 85 mm) y fueron eluidos con
agua para obtener la Solución 1. Separadamente, se disolvió
Gly-Gly-Phe-Gly-D51-7059
(10 mg) en N,N-dimetilformamida (0,5 ml), y luego se
adicionó sucesivamente con una solución de la sal trietilamónica de
polialcohol carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 24 (60 mg)
en N,N-dimetilformamida (5 ml) y una solución de
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(60 mg) en N,N-dimetilformamida (0,25 ml), y se
dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche
con agitación. Esta mezcla de reacción se añadió por goteo a 10 ml
de etanol, y luego la mezcla resultante se añadió con cloruro
sódico acuoso 3 M (2,0 ml) y éter dietilo (25 ml), y los
precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación (2500
rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron lavados con etanol, luego
se disolvieron en agua, se aplicaron a una columna
Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo Na^{+}) (diámetro: 15 mm, longitud:
85 mm) y fueron eluidos con agua para obtener la Solución 2. Las
Soluciones 1 y 2 fueron combinadas y luego desaladas mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (208 mg). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver este
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución metanol:agua = 10:1, 1,69 mg/ml) se representan
en las Figuras 22 y 23, respectivamente. El contenido del residuo
del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,3% (w/w) cuando se
determinó con base en la absorción a 240 nm en una solución
metanol:agua = 10:1.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11 y se examinó la actividad antitumoral del complejo
medicamentoso del Ejemplo 15 mediante administración simple, de una
manera similar a la del Ejemplo 12. Como resultado, el complejo
medicamentoso del Ejemplo 15 presentaba una actividad antitumoral
considerablemente mejorada y campo de dosificación efectiva más
amplio en comparación con el compuesto medicamentoso del Ejemplo 12
aislado.
Se prepararon ratones rasurados portadores de
tumor SC-6 (5 ratones por grupo) mediante
trasplante subcutáneo de una porción de bloque de tumor gástrico
humano SC-6 en las regiones inguinales derechas de
ratones rasurados (BALB/c-nu/nu, machos). El 27° día
después del trasplante, el complejo medicamentoso del Ejemplo 15
disuelto en agua destilada para inyecciones, se inyectó como una
administración intravenosa simple y su actividad antitumoral fue
comparada con la del compuesto medicamentoso aislado. Como
resultado, el complejo medicamentoso del Ejemplo 15 presentó mayor
actividad antitumoral en comparación con el compuesto medicamentoso
aislado, mientras que no hubo muertes debidas a toxicidad.
Se prepararon ratones rasurados portadores de
cáncer de pulmón humano QG-90 (5 ratones por grupo)
según una forma similar a la del Ejemplo 57. El 16° día después del
trasplante, el complejo medicamentoso del Ejemplo 15 disuelto en
agua destilada para inyecciones, se inyectó como una administración
intravenosa simple y su actividad antitumoral fue comparada con la
del compuesto medicamentoso por sí mismo. Como resultado, el
complejo medicamentoso del Ejemplo 15 presentó una actividad
antitumoral considerablemente mejorada y un campo de dosificación
efectiva más amplio en comparación con el compuesto medicamentoso
aislado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ratones podadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y se examinó la actividad antitumoral del complejo
medicamentoso del Ejemplo 41 en los casos de administración simple
de una manera similar a la del Ejemplo 12, y su actividad
antitumoral fue comparada con la del compuesto medicamentoso
aislado. Como resultado, el complejo medicamentoso del Ejemplo 41
presentó una actividad antitumoral considerablemente mejorada y un
campo de dosificación efectiva más amplio en comparación con el
compuesto medicamentoso aislado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y se examinó la actividad antitumoral de acuerdo con un
procedimiento similar al del Ejemplo 12 mediante administración
simple de los complejos medicamentosos de los Ejemplos 29, 46 y 47,
respectivamente. Como resultado, todos los complejos medicamentosos
presentaron mayor actividad antitumoral y campo de dosificación
efectiva más amplio.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y se examinó la actividad antitumoral del complejo
medicamentoso del Ejemplo 44 según un procedimiento similar al del
Ejemplo 12 mediante administración simple, y su actividad
antitumoral fue comparada con la del compuesto medicamentoso
(Doxorrubicina) aislado. Como resultado, el complejo medicamentoso
del Ejemplo 44 presentaba una actividad antitumoral
considerablemente mejorada y campo de dosificación efectiva más
amplio en comparación con el compuesto medicamentoso aislado.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
según una forma similar a la del Ejemplo 11. Se inyectó el complejo
medicamentoso del Ejemplo 15 como administración simple de una
manera similar a la del Ejemplo 12 (10 mg/kg: calculado como el
compuesto medicamentoso), y se determinó el cambio de concentración
del complejo medicamentoso en diversos tejidos. Como resultado, el
complejo medicamentoso del Ejemplo 15 se mostró poseedor de un
nivel de retención en sangre considerablemente más largo, mayor
distribución en tejidos tumorales, y más alta selectividad tumoral
en hígado e intestino delgado. Los resultados se representan en la
Figura 24.
El complejo medicamentoso de la presente
invención, que se introduce con un residuo de un compuesto
medicamentoso, tal como un agente antineoplásico, se caracteriza
porque posee excelente selectividad hacia áreas tumorales de forma
que presenta elevada actividad antineoplásica y también proporciona
una reducida aparición de toxicidad.
Claims (26)
1. Un complejo medicamentoso caracterizado
porque un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano y un
residuo de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí
mediante un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador
que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente.
2. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 1, caracterizado porque el polialcohol
dextrano que constituye el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol dextrano obtenido mediante tratamiento de un dextrano
bajo condiciones que permitan una polialcoholización sustancialmente
completa.
3. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 1 ó 2, en el cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es
polialcohol carboximetildextrano.
4. El complejo medicamentoso según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual el compuesto
medicamentoso es un agente antineoplásico o un agente
anti-inflamatorio.
5. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 4, en el cual el compuesto medicamentoso es un
agente antineoplásico que posee actividad antineoplásica dependiente
de su concentración.
6. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 4, en el cual el compuesto medicamentoso es un
agente antineoplásico que posee actividad antineoplásica dependiente
de su tiempo de actuación.
7. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 4, en el cual el agente antineoplásico es
doxorrubicina o
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona.
8. El complejo medicamentoso según una cualquiera
de las reivindicaciones 5 a 7, en el cual el espaciador es un
dipéptido representado por -X-Z-, en el cual
"-X-Z-" representa un residuo que consta de un
dipéptido que está formado por el enlace peptídico de un aminoácido
hidrofóbico (X) y un aminoácido hidrofílico (Z) situados en el
extremo N-terminal y el extremo
C-terminal, respectivamente, y cuyo átomo de
hidrógeno y grupo hidroxilo son eliminados, respectivamente, del
grupo amino en la N-terminación y del grupo
carboxilo en la C-terminación, o en el cual el
espaciador contiene el dipéptido como una secuencia peptídica
parcial.
9. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 8, en el cual el aminoácido hidrofóbico es
fenilalanina y el aminoácido hidrofílico es glicina.
10. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 9, en el cual el espaciador es
(N-terminación)-Gly-Gly-Phe-Gly-.
11. El complejo medicamentoso según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el cual la cantidad
introducida del residuo del agente antineoplásico se encuentra en el
intervalo de 1 a 15% en peso.
12. El complejo medicamentoso según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el cual la cantidad
introducida del residuo del agente antineoplásico se encuentra en el
intervalo de 3 a 10% en peso.
13. El complejo medicamentoso según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el cual la cantidad
introducida del residuo del agente antineoplásico se encuentra en el
intervalo de 5 a 6% en peso.
14. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 1, en el cual la N-terminación de un
péptido representado por
H_{2}N-Gly-Gly-Phe-Gly-COOH
está ligada a un grupo carboxilo de un polialcohol
carboximetildextrano mediante un enlace ácido-amida
y la C-terminación del péptido está ligada al grupo
1-amino de
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15)-diona
mediante un enlace ácido-amida.
15. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 14, en el cual la cantidad introducida de residuo de
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]
quinolina-10,13(9H,15H)-diona se encuentra en el intervalo de 2 a 10% en peso.
quinolina-10,13(9H,15H)-diona se encuentra en el intervalo de 2 a 10% en peso.
16. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 14 ó 15, en el cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano que presenta un peso molecular en
el intervalo de 5.000 a 500.000 y el grado de carboximetilación se
encuentra en el intervalo de 0,01 a 2,0.
17. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 14 ó 15, en el cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano que presenta un peso molecular en
el intervalo de 50.000 a 450.000 y el grado de carboximetilación se
encuentra en el intervalo de 0,1 a 1,0.
18. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 14 ó 15, en el cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano que presenta un peso molecular en
el intervalo de 200.000 a 400.000 y el grado de carboximetilación se
encuentra en el intervalo de 0,3 a 0,5.
19. El complejo medicamentoso según la
reivindicación 14, en el cual la cantidad introducida de residuo de
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]
quinolina-10,13(9H,15H)-diona se encuentra en el intervalo de 5 a 6% en peso, el peso molecular del polialcohol carboxi(C_{1-4})alquildextrano es 228.000 aproximadamente y el grado de carboximetilación es 0,4 aproximadamente.
quinolina-10,13(9H,15H)-diona se encuentra en el intervalo de 5 a 6% en peso, el peso molecular del polialcohol carboxi(C_{1-4})alquildextrano es 228.000 aproximadamente y el grado de carboximetilación es 0,4 aproximadamente.
20. Un medio
transportador-suministrador de medicamento destinado
a enlazar un compuesto medicamentoso, que comprende un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano.
21. El medio
transportador-suministrador de medicamento según la
reivindicación 20, en el cual el peso molecular del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano se
encuentra en el intervalo de 5.000 a 500.000 y el grado de
carboximetilación se encuentra en el intervalo de 0,01 a 2,0.
22. El medio
transportador-suministrador de medicamento según la
reivindicación 20, en el cual el peso molecular del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano se
encuentra en el intervalo de 50.000 a 450.000 y el grado de
carboximetilación se encuentra en el intervalo de 0,1 a 1,0.
23. El medio
transportador-suministrador de medicamento según la
reivindicación 20, en el cual el peso molecular del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano se
encuentra en el intervalo de 200.000 a 400.000, y el grado de
carboximetilación se encuentra en el intervalo de 0,3 a 0,5.
24. El medio
transportador-suministrador de medicamento según una
cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el cual el
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano.
25. Un procedimiento para fabricar un complejo
medicamentoso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19,
que contiene un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano
ligado a un residuo de un medicamento, caracterizado porque
utiliza un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano que
está enlazado a un residuo de un compuesto medicamentoso.
26. El procedimiento según la reivindicación 25,
en el que el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano está
enlazado al medicamento por medio de un espaciador, o sin
espaciador.
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