ES2302391T3 - Procedimiento de administracion de un compuesto a celulas resistentes a multi-farmacos. - Google Patents

Abstract

El uso de una composición constituida por: un vehículo de liposoma compuesto de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol, y diastearoil fosfatidil etanolamina-polietileno glicol-folato (DSPE-PEG-folato) y doxorubicina ocluida en el vehículo de liposoma, en el que la relación de doxorubicina a fosfolípido está entre 110-150 µg/µmol, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer resistente a multi-fármacos.

Description

Procedimiento de administración de un compuesto a células resistentes a multi-fármacos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la administración de un compuesto terapéutico a células de cáncer resistentes a multi-fármacos.

Antecedentes de la invención

Después de las enfermedades del corazón, el cáncer es la causa principal de muerte en los Estados Unidos de América. Con los presentes procedimientos de tratamiento, aproximadamente un tercio de los pacientes se curan con medidas locales, cirugía o terapia de radiación, las cuales son generalmente eficaces cuando el tumor no ha sido metastasizado durante el período de tratamiento. En los casos restantes, la micrometástasis precoz es un aspecto característico del neoplasma, que indica que se requiere una vía sistémica, tal como quimioterapia, frecuentemente conjuntamente con cirugía o radiación.

Un problema con la quimioterapia del cáncer es la resistencia a fármacos. Algunos tipos de tumores, por ejemplo, cáncer de pulmón de célula no pequeña y cáncer de colon, muestran resistencia primaria, es decir, ausencia de respuesta en la primera exposición a agentes quimioterapéuticos convencionales, actualmente disponibles. Otros tipos de tumores muestran resistencia adquirida, la cual se desarrolla en un cierto número de tipos de tumores sensibles a fármacos. Las células de cáncer resistentes a fármacos demuestran dos tipos de resistencia adquirida a los fármacos; células que muestran resistencia a un único agente o resistencia a clases únicas de fármacos anti-cáncer con el mismo mecanismo de acción. El segundo tipo implica células ampliamente resistentes a algunos o muchos fármacos anti-cáncer químicamente diversos con diferentes mecanismos de acción. Este segundo tipo de resistencia adquirida se conoce como resistencia a multi-fármacos.

La resistencia a multi-fármacos se ha encontrado igualmente en algunos tipos de células de tumor, tales como tumores renales y de colon, que muestran resistencia primaria. Es decir, al contrario a una resistencia adquirida a multi-fármacos, ciertos tipos de tumores no responden al tratamiento inicial con muchos agentes quimioterapéuticos.

La resistencia a multi-fármacos se la asocia frecuentemente con la expresión incrementada de un gen normal, el gen MDR1, para una glucoproteína de superficie celular, P-glucoproteína, implicada en el eflujo del fármaco. La expresión de la P-glucoproteína se relaciona con una disminución en la acumulación intracelular de fármaco; es decir, la P-glucoproteína actúa como una bomba dependiente de la energía o como molécula de transporte que elimina fármacos de la célula, evitando que el fármaco se acumule en la célula.

La P-glucoproteína se expresa normalmente de manera fundamental en las superficies epitelial y endotelial y parece jugar un papel en la absorción y/o secreción. Es un transportador activo que bombea fármacos hidrófobos fuera de las células, reduciendo su concentración citoplásmica y, en consecuencia, la toxicidad. En células normales, la P-glucoproteína funciona para eliminar metabolitos tóxicos o compuestos xenobroncos del cuerpo (Endicott, J. y Ling, V., Annu. Rev. Biochem., vol. 57, págs. 137-171, (1989)).

Los cánceres que expresan P-glucoproteína incluyen cánceres obtenidos de tejidos que normalmente expresan el gen MDR1, fundamentalmente cánceres de hígado, colon, riñón, páncreas y adrenal. La expresión del gen se observa igualmente durante el curso de la termoterapia con fármacos resistentes a multifármacos en leucemias, linfomas, cáncer de pecho y ovarios, y muchos otros cánceres. Estos cánceres inicialmente responden a la quimioterapia, pero cuando el cáncer recae, las células del cáncer frecuentemente expresan más P-gluco-proteína. Existen cánceres obtenidos de tejidos que normalmente no expresan P-glucoproteína pero en los cuales se incrementa la expresión de P-glucoproteína durante el desarrollo del cáncer. Un ejemplo es la leucemia mielógena crónica, la cual, cuando entra en crisis de blasto, expresa más P-glucoproteína independientemente de la historia del tratamiento previo (Gorresman, M.M., Cancer Research, vol. 53, págs. 747-754, (1993)).

La bomba de P-glucoproteína codificada para MDR1 reconoce y transporta muchas substancias diferentes, incluyendo los fármacos anti-cáncer de productos los más naturales tales como doxorubicina, daunorubicina, vinblastina, vincristina, actinomicina D pacimaxel, y exopósido (Gorresman, M. y otros, Current Opinion in Genetics and Development, vol. 6, págs. 610-617, (1996)). Más generalmente, los fármacos frecuentemente implicados en resistencia a multi-fármacos son alcaloides tales como antibióticos de plantas o de origen fúngico, e incluyen los vinca alcaloides, antraciclinas epipodofilotoxinas y dactinomicina. Ocasionalmente se ha observado resistencia cruzada a agentes de alquilación tales como melfalan, mostaza nitrogenada, y mitomicina C (Endicott, J. y Ling. V., Annu. Rev. Biochem., vol. 58, págs. 137-171, (1989)).

A.T. Horowitz y otros (Chemistry and Biology of Pteridines and Folates, 11^{th} Symposium 1997, Berchtesgadenn, eds. W. Pfleiderer and H. Rokos, Blackwell Wissenschaftsverlag GmbH, Berlin, págs. 353-356), se refieren a la citotoxicidad y unión de liposomas dirigidos a ácido fólico con doxorubicina ocluida en células susceptibles y resistentes al fármaco. Los autores informan que los liposomas con ligandos dirigidos a ácido fólico no se unen a receptores folato asociados a la membrana, sino a un ligador de receptor de folato no identificado presente en la matriz extracelular.

D. Goren y otros (Proceedings of the Internacional Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials, vol. 24, págs. 865-866, (1997)) se refieren a la identificación de liposomas que portan fármacos contra el receptor de folato de células de tumores mediante un ligando de identificación de ácido fólico. Los autores informan que un ligando de folato acoplado a liposomas mejora la unión de los liposomas a células de tumores, potenciando, de esta forma, la citotoxicidad.

R.J. Lee y otros (Biochemica et Biophysica Acta, vol. 1233, págs. 134-144, (1995)) se refieren a la identificación de un fármaco, doxorubicina, contra células de cáncer mediante la oclusión de doxorubicina en liposoma dirigido a folato. La patente WO-98/16202, se refiere al suministro de un compuesto ocluido en liposoma al citoplasma de una célula mediante la fusión de la bicapa lípida del liposoma con la membrana celular. En una realización, se une un ligando folato al liposoma para identificar el liposoma contra los receptores folato sobre células epiteliales.

La patente WO-98/13072, está relacionada con oligonucleótidos antisentido que evitan la expresión del gen MDR1 con el fin de eliminar resistencia a multi-fármacos. En una realización, el oligonucleótido antisentido se conjuga a una molécula identificada, tal como folato, para lograr el suministro celular del oligonucleótido a través de la endocitosis del receptor de folato.

K.A. Mislick y otros (Bioconjugate Chemistry, vol. 6, no. 5, págs. 512-515, (1995)) se refieren al suministro intracelular de ADN a través de la endocitosis del receptor de folato.

Claramente, la resistencia a multi-fármacos en células de cáncer limita el éxito de la quimioterapia y sugiere un descenso de la prognosis del paciente. Se ha descrito una vía para superar la resistencia a multi-fármacos que incluye la co-administración de bloqueadores del canal de calcio, tal como verapamil, el cual inhibe la acción del transporte del fármaco de P-glucoproteína con el agente quimioterapéutico. Esta vía no ha sido probada aún en humanos, siendo necesarias otras estrategias para superar la resistencia a multi-fármacos.

Sumario de la invención

El objeto de la invención es proporcionar una composición para la administración de un agente terapéutico anti-cáncer a células resistentes a multi-fármacos de acuerdo con la reivindicación 1.

Estos y otros objetos y características de la invención se apreciarán de manera más completa al leer la descripción detallada siguiente de la invención conjuntamente con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema de reacción de la síntesis para la preparación de un conjugado de ácido fólico-PEG-DSPE, que muestra la estructura del conjugado ligado a \gamma-carboxilo;

la Figura 2 muestra el resultado de un estudio de unión de competencia para determinar la unión de ácido fólico radiomarcado a una concentración de 0,1 \mum al receptor de folato celular en célula de pulmón de murino con una alta densidad de receptor de folato (M109R-HiFR) en la presencia de los competidores siguientes: folato libre (círculos en blanco), PEG_{2000} libre (cuadrados en negro) o un conjugado PEG-folato (triángulos en negro) a concentraciones variables;

las Figuras 3A-3F son ilustraciones esquemáticas de composiciones de liposomas preparadas como soporte de la presente invención;

las Figuras 4A-4B muestran la unión de diversos liposomas que portan ácido fólico y liposomas de control (sin ligando de ácido fólido) a células de carcinoma de pulmón de murino con alta (M109-HiFR) y baja (M109-LoFR) densidad de receptor de folato (Figura 4A) y a células de carcinoma epidérmico humano que tienen una alta densidad de receptor de folato (KB-HiFR) y una baja densidad de receptor de folato (KB-LoFR) (Figura 4B);

las Figuras 5A-5D son imágenes al microscopio confocal de células M109-HiFR incubadas con liposomas dirigidos a folato, marcado con rodamina (Figuras 5A-5B) y con liposomas dirigidos a folato, marcado con rodamina que tienen cadenas de PEG adicionales (Figuras 5C-5D);

las Figuras 6A-6B son imágenes al microscopio confocal de células M109-HiFR incubadas con liposomas con rodamina-ácido fólico-PEG_{2000} (HSPC/Col/DSPE-PEG-folato/DPPE-rodamina (98,9:70:1,0:0,1)) durante 30 minutos (Figura 6A) y durante 50 minutos (Figura 6B);

las Figuras 7A-7B son imágenes al microscopio confocal de células M109-HiFR incubadas con liposomas con rodamina-ácido fólico-PEG_{2000} y con folato libre 2 mM incubado durante 4 horas (Figura 7A) y durante 19 horas (Figura 7B);

las Figuras 8A-8B son imágenes al microscopio confocal de células M109-HiFR (Figura 8A) y células M109-HiFR tratadas con fosfatidilinositol fosfolipasa C (Figura 8B) e incubadas con liposomas con rodamina-ácido fólico-PEG_{2000} durante 1 hora;

las Figuras 9A-9F son imágenes de células M109R-HiFR (una sublinea de células M109 seleccionadas por su resistencia a multi-fármacos) incubadas con doxorubicina libre durante 7 minutos (Figura 9A) y durante 30 minutos (Figura 9B); con liposomas dirigidos a folato, cargados con doxorubicina, durante 20 minutos (Figura 9C), 60 minutos (Figura 9D) y durante 90 minutos (Figura 9E); y con liposomas no dirigidos a folato recubiertos con mPEG-DSPE (conocido comercialmente como DOXIL) durante 4 horas (Figura 9F);

las Figuras 10A-10D son imágenes de células M109R-HiFR incubadas durante 1 hora con doxorubicina libre (Figura 10A) o con liposomas dirigidos a folato conteniendo doxorubicina (Figura 10B) y durante 24 horas en medio libre de fármaco después de 1 hora de incubación con doxorubicina libre (Figura 10C) o con liposomas dirigidos a folato conteniendo doxorubicina (Figura 10D);

las Figuras 11A-11B son resultados del ensayo de citometría de flujo para células M109R-HiFR expuestas a doxorubicina libre (Figura 11A) y a liposomas dirigidos a folato que portan doxorubicina (Figura 11B) en la presencia o ausencia de verapamil, un bloqueador de P-glucoproteína;

la Figura 12 es una gráfica que muestra la cinética de la fijación de doxorubicina por células M109R-HiFR expuestas a doxorubicina ocluida en liposomas dirigidos a folato a una relaciones de fármaco a lípido de 137,6 \mug/\mumol (círculos en negro) y 11,3 \mug/\mumol (círculos en blanco);

la Figura 13 es una gráfica de barras que muestra la acumulación de doxorubicina en células M109R-HiFR después de exposición a doxorubicina libre y doxorubicina ocluida en liposomas dirigidos a folato durante 1 hora y durante 4 horas, en donde la acumulación se determinó para los núcleos de las células y el citosol;

las Figuras 14A-14B muestran resultados de citotoxicidad para células M109-HiRF (Figura 14A) y M109R-HiFR (Figura 14B) cuando se expusieron a doxorubicina en forma libre (círculos en negro) o en forma ocluida en liposomas dirigidos a folato (triángulos en negro) o en forma ocluida en liposomas no dirigidos a folato (cuadrados en negro);

la Figura 15A muestra el espesor medio de la planta de la pata en el trascurso del tiempo, en mm, después de la inyección de células de tumor dentro de la planta de la pata de ratones, en los que las células de tumor fueron tratados in vitro antes de la inyección con doxorubicina libre (círculos en negro), doxorubicina ocluida en liposomas (cuadrados en blanco) o con liposomas dirigidos a folato (triángulos en negro). Los ratones de control recibieron células de tumor sin tratar (círculos en blanco);

la Figura 15B muestra el peso medio del tumor de la planta de la pata, en gramos, el día 34 de los animales de ensayo de la Figura 15A, en la que el peso del tumor de la planta de la pata se tomó como el peso de la planta de la pata el día 34 menos el peso promedio de la pata de la planta de un ratón sano; y

la Figura 16 es una gráfica que muestra el número de tumores palpables después de la inyección subcutánea de células de tumor no tratadas (control, círculos en blanco) o tratadas in vitro con doxorubicina libre (círculos en negro), doxorubicina ocluida en liposomas no dirigidos (cuadrados en blanco) y doxirubicina ocluida en liposomas dirigidos a folato (triángulos en negro).

Descripción de tallada de la invención

En un aspecto, la invención está dirigida a una composición para administración de un agente terapéutico a una célula resistente a multi-fármacos. En la práctica, la composición proporciona la administración de un agente terapéutico a una persona que sufre de cáncer, y en particular de un cáncer que exprese P-glucoproteína sobre las superficies celulares del cáncer. Tal como se ha indicado anteriormente, ciertos cánceres, tales como el cáncer renal y el cáncer de colon muestran resistencia primaria, en contraposición a las resistencias secundaria o refractaria, a muchos agentes quimioterapéuticos. La composición y procedimiento de la invención proporciona el tratamiento de estos cánceres, así como aquellos cánceres que son refractarios, por ejemplo, tales como aquellos cánceres que desarrollan resistencia a multi-fármacos en donde el cáncer inicialmente responde a un agente terapéutico o grupo de agentes, pero progresan hasta un estado en que ya no responde más o no es tratable con éxito por el agente o agentes.

En un aspecto, la invención incluye una composición compuesta de un vehículo, un ligando de identificación de folato, y el fármaco a administrar. El ligando de folato está covalentemente unido al vehículo, y el fármaco está asociado con el vehículo. Por asociado, se entiende que el fármaco está unido covalentemente o electrostáticamente, o está ocluido o encapsulado con el vehículo. Tal como se describirá más adelante, la composición es eficaz para lograr la acumulación del fármaco en células resistentes a multi-fármacos, es decir, células que expresan la P-glicoproteína la cual actúa como una bomba de eflujo para evitar la acumulación de fármaco en la célula, en una cantidad suficiente como para ser citotóxica para la célula. Por "citotóxica" se entiende que la cantidad de fármaco acumulado en las células es
suficiente como para evitar el normal funcionamiento de la célula y, preferiblemente, causar la muerte de la célula.

Unido al vehículo, bien al final o conjuntamente con el propio vehículo o unido a la superficie de una microsfera preparada a partir del vehículo, existe un ligando de folato, el cual se describirá más adelante. El fármaco a administrar está igualmente unido al vehículo o está asociado de alguna forma con el vehículo de manera tal que se mueve con el vehículo y el ligando de identificación de folato. Tal como se describirá más adelante, el folato identifica de manera eficaz el conjugado a una célula resistente a multi-fármacos para el suministro y acumulación del fármaco en la célula.

El vehículo es un liposoma. En estudios realizados para apoyar la invención, se prepararon liposomas dirigidos a folato y el concepto general se demostró usando los liposomas vehículos. No obstante, debe resaltarse que la enseñanza útil sacada a partir de los estudios de liposomas es aplicable a un cierto número de vehículos, tal como resultará evidente a partir de los estudios descritos más adelante.

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I. Preparación de liposomas dirigidos al receptor de folato A. Síntesis y caracterización de mPEG-ácido fólico y ácido fólico-PEG-DSPE

Se prepararon conjugados compuestos de folato, polietileno glicol (PEG) y diestearoil fosfatidil etanolamina (DSPE) (ácido fólico-PEG-DSPE) tal como se muestra en la Figura 1, a través de un acoplamiento mediado por diciclohexilcarbodiimida de ácido fólico a H_{2}N-PEG-DSPE. Tal como se describe en el Ejemplo 1A, los lípidos amino-PEG de partida se sintetizaron a partir de PEG conteniendo pesos moleculares de 2000 Daltons y 3350 Daltons, de acuerdo con procedimientos previamente descritos (Zalipsky, S. y otros, FEBS Lett., vol. 353, págs. 71-74, (1994)). Los conjugados de ácido fólico y metoxi-PEG, por ejemplo, conjugados sin el resto fosfolípido, se prepararon usando el mismo procedimiento de acoplamiento. Las estructuras de los conjugados purificados se corroboraron mediante RMN-^{1}H, MALDI-TOFMS y espectroscopia UV, tal como se establece en los Ejemplos 1B-1C. El ácido fólico activado con carbodiimida puede acoplarse con H_{2}N-PEG-DSPE a través de o bien grupos \alpha-carboxilo o bien \gamma-carboxilo de su resto glutamato. El \gamma-conjugado se une al receptor de folato, en tanto que el \alpha-conjugado no lo hace, determinándose, de esta forma, las cantidades relativas de cada conjugado mediante un procedimiento que usa carboxipeptidasa G (CPG). Tal como se describe en el Ejemplo 1E, se usó un procedimiento que usa carboxipeptidasa G (CPG), puesto que es sabido que los \alpha-conjugados son inertes a la enzima, en tanto que los \gamma-conjugados están sometidos a escisión pteroateglutamato a una velocidad apreciable (Wang, S. y otros, Bioconjugate Chem., vol. 7, págs. 56-62, (1996)); Fan, J. y otros, Biochemistry, vol. 30, págs. 4573-4589, (1991)); Levy, C. y Goldman, P., Biol. Chem., vol. 242, págs. 2933-2938, (1967)). La escisión enzimática fue seguida por la desaparición del pico del conjugado mediante HPLC. Esta reacción se desarrolló hasta un 80% de conversión a pesar de los prolongados tiempos de incubación y de múltiples adiciones de la enzima, lo que indica que el ácido fólico-PEG-DSPE contenía 80% de \gamma-carboxi ligado y el 20% restante fueron conjugados \alpha-ligados. Se usó la misma vía para determinar que el 90% de mPEG-ácido fólico estaba ligado a través del grupo \gamma-carboxilo.

Los conjugados se caracterizaron mediante estudios de unión, tal como se describirá a continuación. Tal como se establece en el Ejemplo 2, tres de las líneas de células usadas, el carcinoma de pulmón de murino (M109), una sublínea resistente a multi-fármacos de M109 (M109R) y carcinoma epidérmico nasofaríngeo humano (KB), se indujeron para sobreregular sus receptores de ácido fólico mediante pasadas consecutivas en medio agotado de ácido fólico (ácido fólico 3 nM). Esto dio como resultado tres sublíneas de células denominadas como "receptor alto en folato" (HiFR) con un incremento de 20-80 veces en la capacidad de unión de folato sobre las líneas de células progenitoras, las cuales se denominan aquí como "receptor bajo en folato" (LoFR).

Estas líneas de células y su capacidad para unir ácido fólico se determinaron tal como se establece en el Ejemplo 2B, mediante incubación de las células durante 30 minutos con ácido fólico a 37ºC. Dos de las líneas de células, las células M109-LoFR y KB-LoFR, se ensayaron igualmente para determinar la unión de ácido fólico después de 24 horas de incubación en medio agotado de ácido fólico. Igualmente, se determinaron la unión de folato a fibroblastos humanos normales en pase precoz y a una línea de melanoma humano A375, para obtener un espectro de líneas de células diferentes con un amplio intervalo de niveles de expresión del receptor. Los resultados se resumen en la
Tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Cuando la línea con la cantidad más baja (M109-LoFR) y más alta M109-HiFR) de receptores se compararon, se observaron diferencias en la capacidad de unión de ácido fólico de hasta 485 veces. Igualmente, tal como se observa en la Tabla 1, para las líneas de células incubadas durante 24 horas en medio agotado de ácido fólico, la M109-LoFR no sobrereguló la cantidad de unión de ácido fólico. Por el contrario, la KB-LoFR mostró un incremento de 15 veces en la unión de ácido fólico, lo que indicó la rápida sobre-expresión de la expresión del receptor.

En estudios adicionales para caracterizar la unión de ácido fólico con la línea de células M109-HiFR que sobre-expresa el receptor de folato, se hicieron las siguientes observaciones:

i) la unión es directamente proporcional al número de células dentro del intervalo de 10^{3} a 1,5X10^{6} células por placa;

ii) los cultivos monocapa de células M109R-HiFR tratadas previamente con fosfatidilinositol-fosfolipasa C (PI-PLC) (véase Ejemplo 2B) pierden 99% de sus receptores de ácido fólico, tal como se muestra mediante el ensayo de unión con ácido fólico, lo que indica que el receptor de folato sobre-expresado está unido a la membrana celular mediante un anclaje glucofosfolípido. Por el contrario, el tratamiento con tripsina no daña el receptor de folato, tal como se indica por (a) el ácido fólico radiomarcado se une en una amplitud similar a las células cultivadas en placa y a las células en suspensión después de tripsinización, y (b) el ácido fólico radiomarcado se recupera casi completamente (91\pm1%) después de tripsinización; y

iii) únicamente el 2\pm1% del ácido fólico permanece unido a monocapas de células M109R-HiFR después del lavado ácido (pH 3), lo que indica que la unión del ácido fólico a los receptores sobre-expresados es sensible al pH. Para evitar la introducción, el ensayo de unión de ácido fólico se llevó a cabo a 1ºC durante 30 minutos. Cuando las células M109R-HiFR se incubaron durante 4 horas a 37ºC con ácido fólico radiomarcado y, a continuación, se sometieron a lavado ácido, el 30 al 40% del ligando fue retenido por las células. Esta es, lo más posiblemente, la fracción de ligando de ácido fólico que es introducida por las células, evitándose, de esta forma, la disociación inducida por el pH del receptor.

Tal como se describe en el Ejemplo 2B, se llevó a cabo un estudio de unión de competencia con ácido fólico, mPEG-ácido fólico, y PEG libre. En este estudio, las células M109R-HiFR se expusieron a una cantidad constante de ácido fólico radiomarcado a una concentración de 0,1 \muM. Se agregaron ácido fólico, mPEG-ácido fólico, y PEG libre "frío" a las células M109R-HiFR a concentraciones que variaron desde 0,1 hasta 100 \muM. El PEG_{2000} y el conjugado mPEG_{2000}-ácido fólico fueron compuestos, no ligados a lípidos, completamente solubles en agua. El último compuesto derivado puede considerarse como una versión monovalente de liposoma de ácido fólico-PEG_{2000}, tal como se expondrá más adelante.

Los resultados del ensayo de unión de competencia se muestran en la Figura 2 como porcentaje de unión frente a la concentración en \mum de cada uno de los competidores, ácido fólico libre (círculos en blanco), PEG-ácido fólico (triángulos en negro) y PEG (cuadrados en negro). Tal como se observa, el mPEG-ácido fólico fue menos eficaz que el ácido fólico libre en competencia con ácido fólico radiomarcado por la unión a los receptores de folato, lo que sugiere que la unión de PEG a la molécula de vitamina disminuye en 5 a 10 veces la capacidad del ácido fólico para unirse al receptor. El PEG libre no mostró unión de célula, lo que demuestra la no competencia con la unión de ácido fólico.

B. Preparación de liposoma

Se prepararon seis formulaciones de liposomas de acuerdo con el procedimiento establecido en el Ejemplo 3. Las seis composiciones liposómicas se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

2

Tal como puede observarse en la Tabla 2, todas las formulaciones contenían HSPC, Col, y DSPE, y, por ello, se hace referencia a ellas aquí de acuerdo con el contenido en ácido fólico-PEG/mPEG, tal como se indica en la columna de la derecha de la tabla. Las Figuras 3A-3F ilustran esquemáticamente las formulaciones liposómicas. Se prepararon cuatro formulaciones de liposomas dirigidos a folato (Figuras 3B, 3C, 3E, 3F); dos formulaciones incluyeron un conjugado de ácido fólico-PEG preparado con PEG de peso molecular distinto de 2000 Daltons (Figura 3B; ácido fólico-PEG_{2000} para 3350 Daltons (Figura 3C; ácido fólico-PEG_{3350}) y dos formulaciones que incluyeron el conjugado de ácido fólico-PEG además de un conjugado de mPEG-DSPE preparado con mPEG de peso molecular de 2000 Daltons (Figura 3E; ácido fólico-PEG_{2000}/mPEG y Figura 3F, ácido fólico-PEG_{3350}/mPEG). En todas las cuatro formulaciones, el conjugado de ácido fólico-PEG obtenido de PEG de peso molecular de 2000 ó 3350 Daltons, se incluyeron a una fracción molar del 0,5% del fosfolípido liposómico total. Las dos formulaciones de control no contenían folato (Figuras 3A y 3D) y se diferenciaron en la fracción molar del mPEG_{2000}-DSPE incluido (0,5% y 7,5%, respectivamente.

En los estudios en apoyo de la invención, expuestos más adelante, se encontró que la formulación de liposoma de control, es decir, las formulaciones de mPEG alto y mPEG bajo no dirigidas, se comportaron de manera similar in vitro, por lo que los datos se han presentado solamente para los liposomas de mPEG alto.

C. Estudios de unión in vitro

La unión de liposomas dirigidos a ácido fólico radiomarcado y los liposomas no dirigidas, de control, se ensayaron sobre cultivos monocapa o sobre líneas de células resistentes a multi-fármacos tanto con nivel de receptores de folato alto como bajo, las células M109R-HiFR y M109F-LoFR, a 37ºC, durante 24 horas, tal como se describe en el Ejemplo 2B. Los resultados se muestran en la Figura 4A, en la cual se muestra la cantidad de liposomas unidos a célula liberada de tripsina, expresada como picomoles de fosfolípido por millón de células, para cada una de las formulaciones de liposomas. Tal como se observa en la figura, la unión de los liposomas de mPEG convencional, no dirigidos, a las células resistentes a multi-fármacos fue muy baja tanto a niveles de receptor de ácido fólico bajo como alto. La formulación dirigida con la eficacia de unión la más alta fue con liposomas que tienen el conjugado de ácido fólico-PEG_{3350}, el cual logró un incremento de 26 veces en la unión sobre los liposomas no dirigidos. De acuerdo con ello, en una realización de la invención, la composición incluye un vehículo liposómico que tiene cadenas de polímero de PEG con un peso molecular de al menos aproximadamente 3.500 Daltons, con un intervalo preferido entre 2.500-10.000 Daltons y un intervalo más preferido entre 3.500-10.000 Daltons. En la realización, la composición es eficaz para lograr al menos un incremento de 10 veces, más preferiblemente uno de 20 veces, y los más preferiblemente uno de 25 veces en la unión, comparada con una composición que tiene cadenas de PEG con un peso molecular menor de aproximadamente 2.500 Daltons, y específicamente un peso molecular de 2.000 Daltons.

Continuando con la referencia a la Figura 4A, la adición de mPEG a la formulación o el acortamiento del PEG algo desde 3350 hasta 2000 redujo substancialmente la unión. La unión fue superior para las células M109R-HiFR que para las células M109F-LoFR para todas las formulaciones de liposomas. De manera interesante, la formulación de liposoma de afinidad la más alta, por ejemplo, liposomas que contienen áido fólico-PEG_{3350}, mostraron el incremento relativo el más bajo de unión (-30%) cuando se compararon las células LoFR y HiFR.

La Figura 4B es una gráfica similar a la Figura 4A, excepto que el estudio se llevó a cabo con la línea de células KB. Tal como se observa en las figuras, la adición de mPEG a los liposomas redujo la eficacia de la unión. En la ausencia de mPEG, un espaciador de PEG más largo (3350 Daltons), incrementó solamente de manera ligera la eficacia de la unión a las células KB. Las diferencias entre KB-HiFR y KB-LoFR fueron para algunas de las composiciones de liposomas más pequeñas que las observadas para las células M109R. Esto puede estar relacionado con la rápida sobre-regulación de los receptores de folato en células KB durante el período de incubación de 24 horas, tal como se ha expuesto anteriormente con referencia a la Tabla 1.

Con el fin de estudiar si los liposomas asociados a las células estaban unidos a la superficie celular o introducidos dentro de las células, se llevó a cabo un lavado ácido con solución salina, pH 3, al final del ensayo de unión. Los resultados, los cuales se muestran en la última columna de la Tabla 3, indican que aproximadamente el 22% de liposomas de ácido fólico-PEG_{3350} y 32% de ácido fólico-PEG_{3350}/mPEG fueron eliminadas por el lavado ácido, lo cual indica que más de 2/3 de los liposomas asociados a las células habían sido introducidos por las células M109R-HiFR. Igualmente, en la Tabla 3 se muestran estudios de competencia con ácido fólico 1 mM (700 veces en exceso sobre la concentración de ácido fólico unido al liposoma) agregado a la mezcla liposoma/célula, bien al comienzo o bien al final de la incubación los liposomas con las células. Tal como se observa en la tabla, el ácido fólico agregado al comienzo del período de incubación de los liposomas FA-PEG_{3350} dirigidos con las células M109F-HiFR, inhibe solamente de manera parcial (46%) la unión del liposoma. La adición del ácido fólico al final de las 24 horas de incubación del liposoma/célula, da como resultado un desplazamiento no significativo de los liposomas que portan ácido fólico de las células, a pesar del hecho de que, de acuerdo con los experimentos de lavado ácido, aproximadamente el 20-30% de los liposomas estaban aún unidos a la superficie celular. Estos estudios demuestran la mayor avidez por la unión de liposomas de ácido fólico-PEG sobre el ácido fólico libre por el receptor de folato celular, lo cual contrasta con las 5-10 veces menos eficaz unión del análogo monovalente, mPEG-ácido fólico (Tabla 1). La unión más fuerte de liposomas dirigidos a ácido fólico está relacionada con la presentación multivalente de restos de ácido fólico sobre la plataforma liposómica.

TABLA 3

3

Tal como se ha indicado anteriormente, estos estudios sugieren que las formulaciones de liposomas que incluyen mPEG-DSPE además de las cadenas de PEG que tienen el ligando de folato unido, por ejemplo, las formulaciones de ácido fólico-PEG_{2000}/mPEG y ácido fólico-PEG_{3350}/mPEG, interfieren con la unión a las células diana. Esta sugerencia se examinó adicionalmente mediante la exposición de las células a liposomas marcados con rodamina, preparados tal como se describe en el Ejemplo 4, y observación de las células mediante microscopia confocal. Las células M109-HiFR se incubaron con liposomas de rodamina-ácido fólico-PEG_{2000} (HSPC/Col/DSPE-PEG-folato/DPPE-rodamina (98,9:70:1,0:0,1)) o con liposomas de rodamina-ácido fólico-PEG_{2000}/mPEG_{2000} (HSPC/Col/mPEG-DSPE/DSPE-PEG-folato/DPPE-rodamina (91,9:70:7:1,0:0,1)) durante 7 horas y se examinaron mediante microscopia confocal. Los resultados se muestran en las Figuras 5A-5B y las Figuras 5C-5D para los liposomas de rodamina-ácido fólico-PEG_{2000} y los de rodamina-ácido fólico-PEG_{2000}/mPEG_{2000}, respectivamente. Tal como se observa en las Figuras 5A-5B, el citoplasma de las células M109-HiFR expuesto a liposomas dirigidos a folato con cadenas de PEG no adicionales se cargaron con liposomas marcados con rodamina. Por el contrario, tal como se observa en las Figuras 5C-5D, los liposomas con el mPEG adicional tienen pobre unión a las células, tal como se puso en evidencia mediante la débil señal de rodamina asociada con la superficie celular y el fallo de los liposomas para introducirse dentro de las células. Estos resultados confirman que el ligando de folato es capaz de mediar en la unión e introducción de liposomas dirigidos a folato a células con receptores de folato sobre-expresados y que las cadenas de PEG adicionales parecen interferir con estos procedimientos.

En otro estudio llevado a cabo para apoyar la invención, las células M109-HiFR se incubaron con liposomas de rodamina-ácido fólico-PEG_{2000} (HSPC/Col/DSPE-PEG-folato/DPPE-rodamina (98,9:70:1,0:0,1)) en medio libre de folato. Después de 30 minutos y después de 50 minutos de incubación, las células se visualizaron con microscopia confocal y las imágenes se muestran en las Figuras 6A-6B. Tal como se observa en la Figura 6A, después de 30 minutos de incubación, los liposomas dirigidos a folato se asociaron con las células M109-HiFR, y después de 50 minutos, tal como se observa en la Figura 6B, algunos liposomas se introdujeron y acumularon en el citosol de la célula. En el mismo estudio, algunas células estuvieron expuestas igualmente a ácido fólico a una concentración de 2 mM, lo cual fue equivalente a aproximadamente 1000 veces la concentración de folato unido al liposoma. Este estudio de unión de competencia se realizó con el fin de verificar la interacción entre el ligando de folato y el receptor de folato. Después de 30 minutos y 50 minutos de incubación, las células se visualizaron y no se observó unión de liposoma (Figura 6), lo que sugiere que el folato libre fue capaz de bloquear de forma competitiva la unión de los liposomas dirigidos a folato al receptor de folato celular. Después de tiempos de exposición más largos de 4 horas y 19 horas, la unión del liposoma dirigido a folato a las células M109-HiFR no fue ya bloqueada por el folato soluble, libre, y el citoplasma celular se tiñó con rodamina fluorescente, tal como se observa en las Figuras 7A-7B.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los resultados del estudio de unión de competencia pueden ser debidos al hecho de que la afinidad de la unión es mayor para el folato liposómico que para el folato libre, a la vista de la multivalencia de los liposomas. Sin embargo, el equilibrio por los liposomas con folato se alcanza después de un período más largo de tiempo, particularmente en vista del gran exceso (1000 veces) de folato libre y la más rápida movilidad de las moléculas pequeñas en comparación con las nanopartículas (liposomas).

La evidencia adicional de la implicación del receptor de folato con los liposomas dirigidos a folato con células M109-HiFR está proporcionada por los estudios llevados a cabo con células previamente tratadas con fosfatidilinositol-fosfolipasa C (PI-PLC) (Ejemplo 2B) para destruir el receptor de folato. La exposición de células M109-HiFR previamente tratadas con PI-PLC a liposomas dirigidos a folato, marcados con rodamina, durante 1 hora a 4ºC, dio como resultado una unión no detectable tal como se observa en la imagen de la Figura 8A. Sin embargo, los mismos liposomas se unieron mediante células no tratadas con PI-PLC, tal como se observa en la imagen de la Figura 8B. A 4ºC tiene lugar la unión al receptor pero no se produce la introducción y reciclado del receptor a la superficie celular (Kamen, B.A. y Capdevila, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, págs. 5983-5987, (1986)). La incapacidad de los liposomas dirigidos a folato para asociarse con las células M109-HiFR tratadas con enzima proporciona la evidencia de que el receptor de folato anclado a glucofosfolípido está implicado en la asociación liposoma-célula.

1. Estudios de unión in vitro usando liposomas cargados con doxorubicina

Tal como se ha descrito en el Ejemplo 5, se prepararon liposomas dirigidos a folato que contenían doxorubicina y se incubaron con células M109R-HiFR. Con fines comparativos, se incubaron igualmente células M109-HiFR con doxirubicina libre o con liposomas que contenían doxorubicina pero sin ligando dirigido a folato. El movimiento de la molécula de doxirubicina se rastreó usando fluorescencia y los resultados se muestran en las Figuras 9A-9F.

Las Figuras 9A-9B son imágenes para células expuestas a doxorubicina libre durante 7 minutos (Figura 9A) y durante 30 minutos (Figura 9B). El influjo de la doxorubicina libre a través de las membranas celulares fue muy rápido tal como se indicó mediante el teñido citoplásmico brillante en la Figura 9A. Tal como puede observarse en la Figura 9B, el fármaco libre fue ya localizado en el núcleo den-tro de los 30 minutos.

Las cinéticas de la interacción de la célula con liposomas dirigidos a folato, cargados con doxorubicina, fueron considerablemente diferentes de las de con doxorubicina libre. Tal como se observa en las Figuras 9C-9E, la unión del liposoma a la membrana celular se observó dentro de aproximadamente los 20 minutos (Figura 9C). A los 60 minutos, se produjo la introducción y la doxorubicina liposómica se detectó en el citosol y, en una pocas células, el fármaco empezó a aparecer en el núcleo (Figura 9D). Después de 90 minutos, la doxorubicina liberada de los liposomas dirigidos a folato había alcanzado el núcleo en la mayoría de las células, mientras que la fluorescencia del fármaco citoplásmico había desaparecido (Figura 9E). Al contrario de los liposomas dirigidos a folato, una formulación de liposomas no dirigidos recubiertos con mPEG-DSPE (comercialmente conocido como DOXIL) no mostró asociación con las células M109R-HiFR, tal como se observa en la Figura 9F, incluso después de 4 horas de incubación. Este estudio se repitió con células nuevas y fijadas con resultados esencialmente similares.

En otro estudio, se examinó la capacidad de las células M109R-HiFR para retener doxorubicina después de tratamiento durante 1 hora tanto con doxorubicina libre como con liposomas dirigidos a folato cargados con doxorubicina, seguido de incubación en medio libre de fármaco durante 24 horas. Tal como se observa en las Figuras 10A-10D, los núcleos de las células se tiñeron mediante doxorubicina fluorescente después de 1 hora de incubación tanto con el fármaco libre (Figura 10A) como con el fármaco ocluido en liposoma (Figura 10B). Sin embargo, después de 24 horas la fluorescencia había casi completamente decaído en las células tratadas con el fármaco libre, tal como se observa en la Figura 10C. La fluorescencia en las células tratadas con los liposomas es aún claramente detectable, tal como se observa en la Figura 10D. Estos resultados muestran que el fármaco liposómico es retenido en las células resistentes al fármaco mejor que el fármaco libre.

2. Evidencia adicional de la acumulación de fármaco en células MDR

Tal como se describe en el Ejemplo 6, se llevaron a cabo estudios para mostrar que el suministro intracelular de doxorubicina mediante la vía del receptor de folato en la forma de liposomas que portan doxorubicina dirigida a folato supera a la bomba de eflujo de P-glucoproteína. En un estudio, se examinó la actividad de la bomba de P-glucoproteína en células M109R-HiFR mediante citometría de flujo usando un ensayo de eflujo de rodamina, encontrándose que era sensible al blocaje de verapamil (datos no mostrados). Usando esta técnica, se examinó el eflujo de doxorubicina suministrada intracelularmente en forma libre y en forma ocluida en liposoma dirigido a folato. Se expusieron monocapas de células M109R-HiFR a doxorubicina en forma libre o en forma ocluida en liposoma durante 1 hora en la presencia de verapamil. Las células se aclararon e incubaron nuevamente en verapamil 10 \mumol durante 2 horas. A continuación, las células se analizaron para determinar el contenido de doxorubicina celular usando fluorescencia y citometría de flujo.

Los resultados de la citometría de flujo se muestran en las Figuras 11A-11B para las células tratadas con doxorubicina libre (Figura 11A) y con doxorubicina ocluida en liposoma (Figura 11B). Tal como se observa en la Figura 11A, el desplazamiento de la curva indica un claro incremento de fluorescencia de la célula en células M109R-HiFR después de exposición a doxorubicina libre en presencia de verapamil. Por el contrario, el nivel celular de fluorescencia en células M109R-HiFR tras exposición al fármaco de liposoma dirigido a folato aparece sin cambiar en la presencia o ausencia de verapamil (Figura 11B). Estas observaciones se confirmaron mediante fluorometría cuantitativa de doxorubicina procedente de extractos de células tal como se resume en la Tabla 4.

TABLA 4

4

Tal como se observa en la tabla, la presencia de verapamil no tuvo efecto sobre la cantidad de acumulación de fármaco en las células resistentes al fármaco cuando se suministró a través de liposomas dirigidos a folato. Por el contrario, la retención de célula de doxorubicina administrada en forma libre fue -4,5 veces mayor en la presencia de verapamil. La retención de fármaco es aproximadamente 4-6 veces mayor cuando se administró a partir de liposomas dirigidos a folato. Estos resultados indican que la difusión de doxorubicina libre dentro de las células fue bombeada fuera por la acción de la bomba de P-glucoproteína, en tanto que la entrada de doxorubicina a través de la vía del receptor de folato evita el mecanismo de eflujo de la P-glucoproteína.

En un estudio adicional para confirmar la potenciación del suministro de fármaco a células mediante liposomas dirigidos a folato, se expusieron células resistentes a fármacos (M109R) y células sensibles a fármacos (M109) a doxorubicina 0,2x10^{-5} M y 0,5x10^{-6} M, respectivamente. La doxorubicina se administró a las células en forma libre y ocluida en liposomas dirigidos a folato. El fármaco asociado a la célula se midió después de 1 hora y 4 horas de exposición a doxorubicina. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5

5

Los datos en la Tabla 5 muestran que las células resistentes a fármacos expuestas a doxorubicina libre bombean fuera el fármaco, incluso en la presencia de exceso de fármaco en el medio extracelular que baña al fármaco. Por el contrario, las células resistentes a fármacos expuestas a doxorubicina en la forma de liposomas dirigidos a folato acumulan doxorubicina en las células. Tal como se esperaba, las células sensibles a fármacos son capaces de acumular doxorubicina tanto en forma libre como en forma ocluida en liposoma. Estos datos muestran que mientras las células resistentes a fármacos expuestas a doxorubicina libre bombean fuera de manera eficaz el fármaco, se produce suministro y acumulación de fármaco en las células de manera eficaz cuando se suministra a través de la vía folato.

La dependencia de la fijación y acumulación de fármaco en células resistentes a fármacos sobre la vía folato está apoyada además por el estudio presentado en la Figura 12. En este estudio, se prepararon dos formulaciones de liposomas dirigidos a folato que tienen doxorubicina ocluida. Una formulación tenía una relación de fármaco a lípido de 137,6 \mug/\mumol (círculos en negro en la Figura 12) y la otra tenía una relación de fármaco a lípido de 11,3 \mug/\mumol (círculos en blanco). Las células M109R-HiFR se incubaron con las formulaciones de liposomas y la fijación del fármaco dentro de la célula se controló como una función del tiempo. Tal como se observa en la Figura 12, la acumulación celular de doxorubicina fue constantemente superior por un factor de -10 para los liposomas que tienen la relación de fármaco a lípido 10 veces superior. La acumulación permanente de fármaco liposómico dirigido por células de tumor durante el período de incubación de 24 horas, sin evidencia de eflujo y sin nivel de meseta, resulta igualmente obvio a partir de las curvas en la Figura 12.

En otro estudio, se determinó la cantidad cuantitativa de doxorubicina acumulada en el núcleo de la célula y el citosol de la célula mediante fraccionamiento de la célula. Las células M109R-HiFR se incubaron con doxorubicina libre o con doxorubicina ocluida en liposomas dirigidos a folato durante 1 hora y 4 horas. La acumulación de doxorubicina en los núcleos de las células y el citosol se midió fluorométricamente después de la separación de los núcleos de las células del citosol, tal como se establece en el Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Figura 13, en donde puede observarse, después de 1 hora de incubación, que la mayoría del fármaco se encuentra en la fracción nuclear tanto con doxorubicina (DOX) libre como doxorubicina liposómica dirigido. Después de 4 horas de incubación, la concentración de fármaco nuclear obtenido con doxorubicina liposómica dirigido sobrepasa claramente la concentración obtenida con doxorubicina libre. El análisis mediante HPLC de fármaco acumulado en células expuestas a liposomas dirigidos a folato muestra que el fármaco acumulado es fármaco intacto (datos no mostrados), lo que indica que esta vía de suministro no conduce a la degradación del fármaco. Igualmente, no se detectaron cantidades significativas de metabolitos después de 1 a 4 horas de exposición de células de tumor tanto a doxorubicina libre como a doxorubicina liposómica dirigido a folato.

3. Citotoxicidad

La citotoxicidad de la doxorubicina suministrada a células M109-HiFR en forma libre y en forma ocluida en liposoma dirigido a folato, se comparó tal como se describe en el Ejemplo 8. En resumen, las células M109-HiFR se expusieron a doxorubicina libre o liposómica durante 1 hora y, a continuación, se lavaron y se incubaron adicionalmente durante 5 días (120 horas) en medio reciente. Tal como se observa en la Figura 14A, la curva de inhibición del desarrollo de doxorubicina en liposomas dirigidos a folato (triángulos en negro) es similar a la de doxorubicina administrada en forma libre (círculos en negro), y considerablemente superior a la de doxorubicina cuando se administró en la forma de liposomas no dirigidos convencionales (cuadrados en negro).

Se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad similar usando la sublínea resistente a multi-fármacos, M109R-HiFR y los resultados se muestran en la Figura 14B. Se obtuvo una potenciación clara de la citotoxicidad cuando el fármaco se administró a las células mediante liposomas dirigidos a folato (triángulos en negro) comparado con el fármaco administrado a partir de liposomas no dirigidos, convencionales (cuadrados en negro).

II. Caracterización in vivo de la composición

Con el fin de examinar la actividad biológica del fármaco suministrado mediante la vía folato a partir de liposomas dirigidos a folato en otro modelo, se expusieron células M109R-HiFR in vitro a un fármaco de ensayo. Estas células se inocularon dentro de la planta de la pata de ratones. De esta forma, se rastreó el desarrollo de las células durante un intervalo de tiempo mucho mayor que en los experimentos in vitro, y se puso en juego factores micro-ambientales in vivo. Sin embargo, a diferencia de los experimentos terapéuticos, este tipo de ensayo adoptivo in vivo no está afectado por factores farmacocinéticos y de biodistribución que complican la interpretación de los resultados.

De acuerdo con ello, se incubaron células de tumor in vitro con doxorubicina libre o con doxorubicina no dirigida a folato (DOXIL®), ocluida en liposoma o con doxorubicina ocluida en liposoma dirigido a folato de acuerdo con la invención. Tal como se describe en el Ejemplo 9, las células de tumor se incubaron en la presencia de la formulación seleccionada durante 1 hora y, a continuación, se inyectaron 1x10^{6} células dentro de la planta de la pata de un ratón, inyectándose cada formulación de tratamiento dentro de 8 ratones. Se midió el espesor de la planta de la pata de cada ratón de cada uno de los grupos de tratamiento, y los resultados se muestran en la Figura 15A.

Tal como se observa en la figura, los ratones de control (círculos en blanco), es decir los ratones inyectados con células de tumor no tratados con doxorubicina, tenían un incremento continuado en el espesor de la planta de la pata después de la inyección de las células del tumor. Los ratones que recibieron células tratadas con doxorubicina libre (círculos en negro) y los ratones que recibieron células de tumor tratadas con doxorubicina ocluida en liposoma (cuadrados en blanco), experimentaron igualmente un incremento en el espesor de la planta de la pata. Unicamente los ratones inyectados con los liposomas dirigidos a folato (triángulos en negro) no tuvieron incremento en el espesor de la planta de la pata.

Al final del estudio, el día 34 después de inyección de las células de tumor tratadas, se determinó el peso de cada planta de pata de ratón que portaba el tumor y se restó del peso promedio de una planta de pata de ratón para determinar el peso del tumor en cada planta de pata de ratón. La Figura 15B muestra el peso del tumor de la planta de la pata en gramos para cada uno de los regímenes de tratamiento. Tal como se observa, los tumores en los ratones que recibieron las células tratadas con los liposomas ocluidos con doxorubicina dirigidos a folato (triángulos en negro) tenían el peso de tumor promedio más pequeño.

La Tabla 5 resume la incidencia del tumor y el peso del tumor medio para cada uno de los grupos de tratamiento.

TABLA 5

6

Los resultados en la Tabla 6 señalan una disminución significativa estadísticamente del número de apariciones de tumor en ratones inyectados con células de tumor expuestas a doxorubicina liposómica dirigido a folato, comparado con doxorubicina libre, DOXIL, y control, después de seguimiento durante 5 semanas. Los pesos de los tumores fueron igualmente más pequeños para el grupo liposómico dirigido a folato.

En un estudio similar, se inyectaron subcutáneamente células de tumor tratadas con cada una de las formulaciones dentro de ratones y se determinaron el número de tumores palpables como una función del tiempo después de la inyección. Los resultados se muestran en la Figura 16, y los ratones de control (círculos en blanco) tenían el número de tumores más alto. Los ratones que recibieron las células tratadas con doxorubicina libre (círculos en negro), después de una fase de desarrollo del tumor inicial lenta, tenían igualmente un número significativo de tumores después de aproximadamente el día 20. Los ratones que recibieron las formulaciones de liposoma (cuadrados en blanco para los liposomas no dirigidos y triángulos en negro para los liposomas dirigidos a folato) tenían el menor número de tumores, siendo el número más pequeño de tumores el liposoma dirigido a folato con doxorubicina.

III. Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran procedimientos de preparación y caracterización de la composición de liposoma de la invención sin estar destinados de ninguna manera a ser limitativos de ella.

Ejemplo 1 Preparación y caracterización de conjugados de ácido fólico-PEG-DSPE A. Síntesis del conjugado

Se disolvió ácido fólico (Fluka, 100 mg, 0,244 mmol) en DMSO (4 ml). Se agregaron amino-PEG_{2000}-DSPE (preparado tal como se establece por Zalipsky, S. y otros, en FEBS Lett., vol. 353, págs. 71-74, (1994)) (400 mg, 0,14 mmol) y piridina (2 ml) a la solución de ácido fólico-DMSO, seguido de diciclohexilcarbodiimida (130 mg, 0,63 mmol). La reacción se continuó a temperatura ambiente durante 4 horas. La TLC sobre gel de sílice (cloroformo/metanol/agua, 75:36:6) mostró una mancha nueva (R_{1} = 0,57) debida a la formación del producto. La desaparición de la amino-PEG-DSPE (R_{1} = 0,76) de la mezcla de reacción se confirmó mediante pulverización de ninhidrina. La piridina se eliminó mediante evaporación rotatoria. Se agregó agua (50 ml) a la mezcla de reacción. La solución se centrifugó para eliminar las trazas de compuestos insolubles. El sobrenadante se dializó mediante intubación (MWCO 300.000) en Spectra/Por CE (Spectrum, Houston, TX) contra solución salina (50 mM, 2 x 2000 ml) y agua (3 x 2000 ml). La solución resultante, que contenía únicamente el producto (una única mancha mediante TLC) se liofilizó y el residuo se secó en vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 400 mg, 90%. En la Figura 1 se ilustra la síntesis.

Se usó el mismo protocolo para preparar ácido fólico-PEG-DSPE a partir de H_{2}N-PEG_{3350}-DSPE. En un procedimiento similar, se unió el ácido fólico a mPEG_{2000}-NH_{2} (Zalipsky, S. y otros, Eur. Polym. J., vol. 19, págs. 1177-1183, (1983)). El producto, mPEG-ácido fólico, se purificó sobre una columna de gel de sílice (malla 70-200, 60 \ring{A}) usando un gradiente escalonado de metanol (10 - 80%) en cloroformo y, a continuación, cloroformo/metanol/agua (65:30:5) para la elusión del producto puro.

B. Caracterización del conjugado mediante análisis UV

El valor del contenido en folato se determinó mediante espectrofotometría UV cuantitativa de los conjugados en metanol (0,05 mg/ml) usando el coeficiente de extinción del ácido fólico \varepsilon = 27.500 M^{-1}.cm^{-1} a \lambda_{max} = 285 nm. Se calcularon los valores del contenido en ácido fólico siguientes: 0,29 mmol/g (94% del valor teórico, 0,31 mmol/g) para ácido fólico-PEG_{2000}-DSPE; 0,21 mmol/g (97% del valor teórico, 0,22 mmol/g) para ácido fólico-PEG_{3350}-DSPE, y 0,40 mmol/g (98% del valor teórico, 0,41 mmol/g) para mPEG_{2000}-ácido fólico.

C. Caracterización del conjugado mediante RMN-^{1}H (360 MHz, DMSO-D6 / CF_{3}CO_{2}D \sim10/1 v/v)

Para ácido fólico-PEG-DSPE: \delta 0,84 (t, CH_{3}, 6H); 1,22 (s, CH_{2}, 56H); 1,49 (m, CH_{2}CO, 4H); 2,1-2,3 (solapamiento 2 x \tau, CH_{2}CH_{2}CO y m CH_{2} de Glu, 8H); 3,2 (m, CH_{2}CH_{2}N, 4H); 3,50 (s, PEG, \sim180H y \sim300H para derivados de PEG2000 y -33500 respectivamente); 4,02 (t, CH_{2}OCON, 2H); 4,1 (dd, trans-PO_{4}CH_{2}CH, 1H); 4,3 (dd, cis-PO_{4}CH_{2}CH, 1H); 4,37 (m, \alpha-CH, 1H); 4,60 (d, 9-CH_{2}-N, 2H); 5,15 (m, PO_{4}CH_{2}CH, 1H); 6,65 (d, 3',5'-H, 2H); 7,65 (d, 2',6'-H); 8,77 (s, C7-H, 1H); ppm. Para mPEG-ácido fólico: \delta 1,85-2,1 (m, \beta-CH_{2} de Glu, 2H); 2,3 (m, \gamma-CH_{2} de Glu, 2H);3,11 (m, CH_{2}CH_{2}N, 4H); 3,50 (s, PEG, \sim180H); 4,3 y 4,37 (menor y mayor \alpha-CH_{2} de Glu, 1H); 4,60 (9-CH_{2}-N, 2H); 6,65 (d, 3',5'-H, 2H); 7,66 (d, 2',6'-H, 2H); 8,77 (s, C7-H, 1H) ppm.

D. Caracterización del conjugado mediante espectro de masa (MALDI-TOFMS)

Los espectros se obtuvieron de Charles Evans & Associates (Redwood City, CA) con analizador electrostático triple PHI-EVANS MALDI de duración de la trayectoria del espectrómetro de masa (láser de desorción: 337 nm, 600 pseg amplitud de impulso), usando ácido gentrínseco como un material de matriz. Los espectros mostraban unas distribuciones en forma de campana de líneas espaciadas 44 DA centradas a 3284 para el ácido fólico-PEG2000-DSPE (peso molecular calculado 3200 Da); a 4501 para ácido fólico-PEG3350-DSPE (peso molecular calculado 4540 Da); y a 2400 para mPEG-ácido fólico (peso molecular calculado 2423 Da).

E. Control mediante HPLC de la escisión mediada por carboxipeptidasa G

Se usó un sistema de HPLC, Shimadzu 10 A, equipado con Phenomenex Prodigy C8 (4.6.50 mm) a 1 ml/min, mientras se controlaba a \lambda = 285 nm. Para el análisis del ácido fólico-PEG-DSPE el sistema se usó en modo isocrático, metanol/fosfato sódico 10 mM; pH 7,0 (92:8, v/v). El conjugado se eluyó en forma de un único pico con un tiempo de retención de 5,7 minutos. El análisis del mPEG-ácido fólico se llevó a cabo mediante un modo de gradiente, usando fosfato sódico 10 mM, pH 7,0 con metanol (0-35% en 25 minutos).El conjugado eluyó en forma de un único pico con tiempo de retención de 19,6 minutos. En ambos casos, fue posible seguir la escisión enzimática del pteroato a partir del resto de ácido fólico de los conjugados mediante la disminución en el área de pico conjugado total. Se preparó una solución de ácido fólico-PEG-DSPE (0,1 mg/ml) en tampón Tris 150 mM, pH 7,3. Una parte alícuota (10 \mul) de esta solución se inyectó dentro de HPLC para obtener la integración del pico de tiempo cero. La enzima carboxipeptidasa G (CPG, Sigma, una unidad) se agregó a la solución de ácido fólico-PEG-DSPE. La solución resultante se incubó en baño de agua a 30ºC y se inyectaron partes alícuotas (10 \mul) dentro de HPLC a diferentes intervalos de tiempo. La velocidad de hidrólisis enzimática fue inicialmente rápida relantizándose después de 4 horas de tiempo de incubación. Se agregaron partes alícuotas de una unidad adicional de CPG a la mezcla de reacción a las 4 horas y a las 20 horas. Los datos se recogieron hasta las 27 horas. A pesar de los prolongados tiempos de incubación y de las múltiples adiciones de la enzima, la desaparición del pico del conjugado no excedió del 20% del valor de integración inicial, lo que indica que el 80% del ácido fólico-PEG-DSPE estaba \gamma-carboxilo ligado. El experimento llevado a cabo con mPEG-ácido fólico como un substrato, mostró que este conjugado contenía \sim90% de restos de ácido fólico \gamma-carboxilo ligados.

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Ejemplo 2 Cultivo de células y estudios de unión A. Cultivo de células

Se cultivaron células en medio normal o en RPMI libre de ácido fólico, con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina 50 u/ml, y estreptomicina 50 \mug/ml. La concentración de ácido fólico en medio libre de ácido fólico que contiene suero es únicamente 3 nM, en oposición a los 2,26 \muM (1 mg/ml) bajo condiciones de cultivo normales. Las células se trataron de manera rutinaria con solución de tripsina (0,05%) - EDTA (0,02%) en Industries (Beyt Haemek, Israel), y el suero bovino fetal procedía de GIBCO (Grand Island, NY).

(i) Líneas de células: En la mayoría de los estudios, se usaron M109, una línea de carcinoma de pulmón de murino de ratones BALB/c (Marks, T.A. y otros, Cancer Treat. Rep., vol. 61, págs. 1459-1470, (1997)), y una sublínea de estas células, M109R que muestra resistencia a multi-fármacos (aproximadamente 100 veces resistencia incrementada a doxorubicina). Ambas líneas de células expresan in vitro cantidades bajas de receptores de ácido fólico y, en consecuencia, se denominan como M109-LoFR y M109R-LoFR. Mediante el cultivo de estas células en medio libre de ácido fólico durante varias pasadas, se obtuvieron dos sublíneas que expresan una alta cantidad de receptores de ácido fólico. Estas sublíneas se adaptaron para ser desarrolladas en condiciones de bajo contenido en ácido fólico con generación de tiempos de doblado similar a los de las líneas de origen. Estas sublíneas se denominan como M109-HiFR y M109R-HiFR, para enfatizar la sobre-expresión de receptores de ácido fólico.

Igualmente, se desarrollaron células KB, un carcinoma epidérmico nasofaríngeo humano (Saikawa, Y., Biochemistry, vol. 34, págs. 9951-9961, (1995)), en medio bajo en ácido fólico para obtener células que sobre-expresan receptores de ácido fólico, células KB-HiFR. Otras líneas células usadas en este estudio fueron la A375, una línea de melanoma humano, y fibroblastos humanos que fueron amablemente proporcionados por el Genetics Department of Hadassah Hebrew University Hospital.

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B. Unión de céulas de conjugados y liposmas de folato libre, ácido fólico-PEG

La unión se ensayó mediante la medición de ^{3}H-ácido fólico o ^{3}H-Col liposómico asociado a células. 48 horas antes de un ensayo, se sembraron 5x10^{5} células en una placa de 35 mm, para obtener aproximadamente 10^{6} células/placa. Las placas se incubaron previamente con medio y suero durante 2 días, sin células, las cuales se usaron como controles. Para los ensayos, las placas se lavaron dos veces con medio RPMI llibre de ácido fólico, y se incubaron a 37ºC con 1 ml de medio RPMI libre de ácido fólico que contenía ácido fólico radiomarcado 0,1 \muM o liposomas en cantidades de 30-300 nmoles de fosfolípido. Después de la incubación, las placas se lavaron 3 veces con 2 ml de PBS enfriado en hielo, y los radiomarcadores se extrajeron con 1 ml de NaOH 0,5 N durante una noche, seguido de neutralización con 1 ml de HCl 0,5 N. Para analizar la radiactividad asociada con las células, las células se liberaron de las placas mediante tratamiento con tripsina-EDTA, se lavaron 3 veces con PBS y, a continuación, se extrajeron siguiendo el mismo procedimiento. La radiactividad se determinó mediante recuento por centelleo líquido. En base a la relación específica de cpm/fosfolípido para cada formulación de liposoma, los resultados se tradujeron en picomoles de fosfolípido por millón de células.

Para el tratamiento de lavado ácido después de la unión, cada placa se lavó dos veces con solución salina acidificada (pH = 3), seguido de lavado con PBS y, a continuación, se extrajo tal como se ha descrito anteriormente.

Para el tratamiento de células con fosfatidilinositol-fosfolipasa C (PI-PLC), las células M109-HiFR se aclararon dos veces con medio RPMI libre de folato y se expusieron a 0,1 u/m de fosfoinositol fosfolipasa-C (PI-PLC) (Boehringer, Mannheim) en medio RPMI libre de folato durante 60 minutos a 37ºC. Posteriormente, las células se aclararon nuevamente dos veces con medio RPMI libre de folato y se expusieron a liposomas dirigidos a folato durante 1 hora a 4ºC. El examen microscópico se llevó a cabo con muestras de células fijadas.

En estudios realizados con células en suspensión, las células procedentes de monocapas se liberaron mediante tratamiento con tripsina-EDTA, seguido de tres lavados (7 minutos, centrifugación a 500g) en medio RPMI libre de ácido fólico. Las células suspendidas (1-10x10^{6} células/ml) se incubaron con ácido libre radiomarcado o liposomas (con la concentración indicada para cada estudio) durante 30 minutos en tubos de plástico de 5 ml. El material no unido se eliminó mediante cuatro lavados con PBS.

Ejemplo 3 Preparación de lipsoma

Se prepararon liposomas compuestos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL), colesterol (Col) (Sigma, St. Louis, MO) y metoxiPEG_{2000}-DSPE (mPEG-DSPE) tal como se ha descrito previamente (Zalipsky, S., y otros, Bioconjugate Chem., vol. 4, págs. 296-299, (1993)). Las composiciones de liposomas se han establecido anteriormente en la Tabla 2, y, tal como se ha expuesto, dado que todas las formulaciones contenían HSPC, Col, y DSPE, de acuerdo con ello, se hace referencia a ellas aquí de acuerdo con el contenido en ácido fólico-PEG/mPEG. La Figura 3 ilustra esquemáticamente las formulaciones.

Todas las preparaciones de liposomas se inocularon con una cantidad traza de ^{3}H-colhexadecil éter (NEN, Boston, MA). Los liposomas se formaron mediante hidratación a 55-60ºC de o bien una película de lípido seca fina obtenida mediante evaporación rotatoria de una solución de lípido en cloroformo:metanol (1:1) o bien de una "torta" de lípido criodesecada obtenida mediante liofilización de una solución de lípido en terc-butanol. El tampón usado fue dextrosa al 5%/Hepes 15 mM, pH 7,4 a una concentración de 50-100 \mumoles de fosfolípido/ml. La hidratación fue seguida por extrusión a alta presión a través de membranas de policarbonato de doble apilamiento con tamaños de poro de desde 1,0 hasta 0,05 \mum usando un dispositivo de acero inoxidable de Lípex Biomembranes (Vancouver, BC). Los liposomas se esterilizaron mediante filtración a través de membranas de celulosa de 0,22 \mum. La caracterización del liposoma incluyó: concentración de fosfolípido en base al contenido en fósforo, concentración de ácido fólico en base a la absorbancia UV de ácido fólico a 285 nm después de la rotura del liposoma en solución de dodecil sulfato sódico (10%), tamaño de la vesícula determinado mediante difusión por láser dinámico, y, en algunas preparaciones, el contenido en ácido graso libre para comprobar la hidrólisis fosfolípida. Todas las preparaciones de liposomas tenían un tamaño de vesícula medio de entre 70-90 nm con una desviación estándar <25% y una distribución de tamaño unimodal. La hidrólisis fosfolípida no se detectó en las preparaciones ensayas aquí.

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Ejemplo 4 Unión e introducción de liposomas dirigidos a folato a células M109-HiFR A. Preparación del liposoma

Se prepararon liposomas de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 3 para incluir DPPE-rodamina (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) tal como sigue:

7

B. Microscopía confocal

Las células M109-HiFR se cultivaron, 24 horas antes de cada estudio, sobre portaobjetos de 24 mm insertados en placas de cultivo de 35 mm. Los tiempos de exposición de las células a la composición de liposoma o a la doxorubicina libre se indican para cada estudio. Las células se fijaron con la solución de PBS, tamponada, que contenía formalina al 4%/metanol al 1,5% (Bio-Labs, Israel) a 4ºC durante 15 minutos y, a continuación, se lavaron 4 veces con PBS (Gibco, Grand Island, NY). A continuación, los portaobjetos se colocaron sobre portas recubiertos con medio de montaje tamponado que consistía en glicerol al 90%/PBS al 10%/NaN_{3} al 0,1% y DABCO al 3% (Sigma) como agente anti-decoloración.

La visualización microscópica de células de hígado (no fijadas) se llevó a cabo en PBS que contenía MgSO_{4} 2 mM/HEPES 1 mM (Sigma), pH 7,5.

El examen de las células se llevó a cabo con microscopio de barrido de láser confocal Zeiss (LSM410) (Carl Zeiss, Jena, Alemania). La excitación máxima se realizó mediante la línea de 543 nm del láser de He-neón interno; la emisión de fluorescencia se observó por encima de 570 nm con filtro barrera de gran paso LP-570 para rodamina. Para la doxorubicina, la excitación máxima se realizó mediante la línea de 488 nm del láser de argón interno: la emisión de fluorescencia se observó por encima de 515 nm con filtro barrera de gran paso LP-515. Se usó un objetivo de inmersión en agua C-Apochromat 63x1,2W corr. (Zeiss). Las imágenes se convirtieron el formato de archivo TIF, y el nivel de contraste y brillo de las imágenes se ajustaron usando el programa Zeiss LSM410. Las imágenes se imprimieron a partir de una impresora QMS magicolor 2 a 1200 dpi.

Ejemplo 5 Preparación de liposomas de doxorubicina y unión in vitro A. Preparación del liposoma

La preparación de los liposomas se llevó a cabo tal como ha sido descrito por Gabizon (J. Drug Targeting, vol. 3, págs. 391-398, (1996)), y estaban compuestos de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC, Avanti Polar Lipids, Birmingham-LA, USA), colesterol (Sigma), DSPE-PEG-folato. La relación de doxorubicina a fosfolípido estaba entre 110-150 \mug/\mumol. Los liposomas cargados de doxorubicina que carecen del ligando dirigido a folato, pero que tienen un recubrimiento superficial de PEG, fueron tal como han sido descritos por Cabanes, A., y otros, Clinical Cancer Res., vol. 4, págs. 499-505, (1998)), y comercializados como bajo el nombre comercial de DOXIL (Sequus Pharmaceuticals, Inc.).

B. Unión in Vitro

Las células M109R-HiFR se incubaron con doxorubicina libre o con doxorubicina ocluida en liposomas dirigidos a folato a una concentración de doxorubicina de 4x10^{-5} M. La molécula de doxorubicina se rastreó usando fluorescencia.

Ejemplo 6 Bloqueo con verapamil de la bomba de eflujo y suministro de doxorubicina

Las monocapas de células M109R-HiFR en placas de cultivo de 35 mm se expusieron a doxorubina 0,5x10^{-5} M en forma de fármaco libre o en liposomas dirigidos a folato durante 1 hora a 37ºC, en la presencia o la ausencia de verapamil 10 \mumol (Teva, Israel), seguido de lavado con PBS (7 minutos, centrifugación a 500g). A continuación, las células lavadas se aclararon y se volvieron a incubar con verapamil durante 2 horas. Las células se liberaron de la monocapa con tripsina al 0,05%/EDTA al 0,02% (Gibco, Grand Island, NY) y se separaron en dos fracciones, una fracción para la determinación de doxorubicina celular usando fluorescencia y la otra fracción para el ensayo de citometría de flujo. La determinación de doxorubicina celular se llevó a cabo mediante extracción de la doxorubicina con HCl 0,075 N/alcohol isopropílico al 90% a 4ºC durante una noche, centrifugación y determinación de la fracción sobrenadante para determinación de la doxorubicina mediante fluorescencia usando un fluorímetro (Kontron, Lumitron, Israel) a una excitación de 470 nm y una emisión de 590 nm.

El ensayo de citometría de flujo se llevó a cabo de la forma siguiente. Las células M109R-HiFR suspendidas tal como se ha descrito anteriormente, se analizaron mediante citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACS-Star Plus (Becton-Dickinson, Immunofluorometry System, Mountanin View, CA). Las células se pasaron a una velocidad de aproximadamente 1000 células/imagen a través de un orificio de 70 \mum, usando solución salina como el fluido de recubrimiento. Un haz de láser de argón de 488 nm a 250 mW sirvió como fuente luminosa para la excitación. La fluorescencia roja (obtenida de doxorubicina) se midió usando un filtro de paso de banda DF 26 de 575 nm.

Los resultados se muestran en las Figuras 11A-11B y en la Tabla 4.

Ejemplo 7 Cuantificación de la doxorubicina celular y nuclear

Las células M109-HiFR y M109R-HiFR se expusieron a doxorubicina libre y a doxorubicina ocluida en liposomas dirigidos a folato durante 1 hora y 4 horas. La cuantificación del fármaco que se acumula en las células se realizó fluorométricamente sobre células tripsinizadas tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6. Las células M109R-HiFR expuestas a doxorubicina tripsinizadas y lavadas con PBS se suspendieron durante 10 minutos a 4ºC, en la solución siguiente: NaCl 100 mM/EDTA 1 mM/Triton X-100 al 1% (Sigma)/Tris 10 mM (Sigma), pH 7,4 y, a continuación, se centrifugaron (15 minutos, 800g). El precipitado de núcleos de células se separó del citosol celular y la doxorubicina se extrajo a partir de ambas fracciones tal como se ha descrito en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Figura 13.

Ejemplo 8 Estudios de citotoxicidad

Las células M109-HiFR y M109R-HiFR en medio RPMI libre de folato sembradas en placas de 96 pocillos (6 muestras replicadas) a una densidad de 10^{3} células/pocillo, se expusieron durante 1 hora a doxorubicina en forma libre, en forma ocluida en liposoma no dirigido y en forma ocluida en liposoma dirigido a folato. Después de exposición, las células se aclararon dos veces y se incubaron otra vez durante 120 horas en el medio anterior. El ensayo de desarrollo de las células se realizó usando glutaraldehído al 2,5% (Merck) como fijador, seguido de teñido con azul de metileno (Merck), y mediciones de absorbancia a 620 nm sobre un lector de placa automatizado. Los resultados se muestran en las Figuras 14A-14B.

Ejemplo 9 Ensayo de desarroollo de tumor adoptivo in vivo

Se mantuvieron ratones BALB/c hembra de 10 semanas de edad en un dispositivo libre de patógenos específico. Las células M109R-HiFR en suspensión in vitro (10^{7} células/ml) se expusieron a doxorubicina 10^{-5} M tanto como fármaco libre, como ocluido en liposoma (Doxil®), o como ocluido en liposoma dirigido a folato durante 2 horas, se lavaron con PBS y, a continuación, se resuspendieron a una concentración de 2x10^{7} células. Los ratones BALB/c singénicos, sanos, fueron inyectados en la planta de la pata posterior derecha con 50 \mul (10^{6} células). El espesor de la planta de la pata se midió con calibres una a dos veces a la semana durante 5 semanas. Después de 35 días, los ratones fueron sacrificados, se registraron el número de tumores, y las plantas de las patas de control e inoculadas con tumor se seccionaron a nivel del tobillo y se pesaron. El peso del tumor se estimó como la diferencia entre el peso de la planta de la pata normal y la que porta el tumor. La importancia estadística de las diferencias en la incidencia final de los tumores por grupo se analizó mediante tablas de contingencia y el ensayo exacto de Fisher. Los resultados se muestran en las Figuras 15A-15B y la Figura 16 y en la Tabla 5.

Aunque la invención se ha descrito con respecto a realizaciones particulares, resultará evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse diversos cambios y modificaciones sin apartarse de la invención.

Claims (1)

1. El uso de una composición constituida por:

un vehículo de liposoma compuesto de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), colesterol, y diastearoil fosfatidil etanolamina-polietileno glicol-folato (DSPE-PEG-folato) y

doxorubicina ocluida en el vehículo de liposoma, en el que la relación de doxorubicina a fosfolípido está entre 110-150 \mug/\mumol,

en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer resistente a multi-fármacos.