KR20010114247A - 리포좀에 사용하기 위한 절단가능 결합을 갖는 콘쥬게이트 - Google Patents

리포좀에 사용하기 위한 절단가능 결합을 갖는 콘쥬게이트 Download PDF

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KR20010114247A
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자리프스키사무엘
가비존앨버토에이
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스톤 스티븐 에프.
알자 코포레이션
라파엘 호프스튜
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Abstract

절단가능 디티오벤질 결합을 통해 치료제에 결합된 소수성 부분, 예컨대 지질의 콘쥬게이트가 기재된다. 디티오벤질 결합은 약한 가황분해에 의한 절단에 민감해서, 그 원래 형태의 치료제를 방출한다. 결합은 비환원 조건 하에서는 안정하다. 콘쥬게이트는 생체 내 투여용 리포좀 내에 삽입되어, 내인성 생체 내 환원 조건에 반응하거나 외인성 환원제 투여에 반응하여 치료제를 방출시킬 수 있다.

Description

리포좀에 사용하기 위한 절단가능 결합을 갖는 콘쥬게이트 {CONJUGATE HAVING A CLEAVABLE LINKAGE FOR USE IN A LIPOSOME}
리포좀은 다양한 치료 목적을 위해, 특히 리포좀을 전신 투여하여 치료제를 표적 위치 또는 세포에 전달하기 위해 사용되는 폐쇄 지질 소포이다. 수용성, 생체적합성 중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜의 사슬이 그라프트된 표면을 갖는 리포좀은 중요한 약물 전달체가 되고 있다. 이러한 리포좀은 중합체를 코팅하지 않은 리포좀에 비해 연장된 혈액 순환수명을 제공한다. 그라프트된 중합체 사슬은 리포좀을 보호하거나 차폐하여, 혈장 단백질과의 비특이적 상호작용을 최소화한다. 이는 다시, 리포좀이 세망내피계에서 대식세포 또는 기타 세포에 의해 인지되지 않고 순환하므로, 리포좀이 생체 내에서 제거되거나 삭제되는 속도를 완화시킨다. 나아가, 소위 향상된 투과성 및 보유 효과로 인해, 리포좀은 혈관계가 손상되거나 늘어난 위치, 예컨대, 암, 염증 위치에 축적되는 경향이 있다.
종종, 전신 투여되는 리포좀이 표적 위치, 세포 또는 부위에 도달케 하기 위해서는 연장된 혈액 순환수명이 요청된다. 예를 들어, 종양 위치로의 리포좀 요법을 위해서는, 리포좀이 전신에 분포된 후 종양 위치로 침투해야 하므로, 약 12 시간 초과의 혈액 순환수명이 바람직하다.
리포좀 기재 요법과 관련된 하나의 문제는 전신 분포에 충분한 시간 동안 리포좀 내에 약물이 보유되게 하는 것이다. 이러한 문제는 오래 순환하는 리포좀, 즉 중합체 사슬이 그라프트된 리포좀을 투여하는 경우 특히 중요하다. 비교적 소수의 약물만이 효율적으로 로딩되고, 오랜 기간 보유되어 방출될 수 있다.
약물 보유를 개선하기 위한 하나의 접근법은 이중막이 트랩핑된 약물에 투과성이 적도록 하는 지질 이중막 성분을 선택하는 것이다. 그러나, 지질 이중막은 목적한 시간, 예컨대 표적 부위에 편재되거나 충분히 생체분포된 후에, 예를 들어 지질 이중막을 통과하는 수송 또는 지질 소포의 분열에 의해, 약물이 방출될 정도로 충분히 유동적이어야 한다.
약물 보유를 개선하기 위한 또다른 접근법은 약물을 리포좀 지질 이중막 내 지질에 공유 부착하는 것이다 (Waalkes 등, Selective Cancer Therap., 6:15-22 (1990); Asai 등, Biol. Pharm. Bull., 21:766-771 (1998)).
긴 혈액 순환수명을 갖고 목적한 시간 동안 트랩핑된 약물을 보유할 수 있으면서도 필요 시에 약물을 방출할 수 있는 리포좀 조성물을 제형화하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 특징을 달성하기 위해 당분야에 기재된 하나의 접근법은 비소포형성 지질, 예컨대 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 및 지질 이중막 안정화 지질, 예컨대 메톡시-폴리에틸렌 글리콜-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (mPEG-DSPE) 으로 리포좀을 제형화하는 것이다 (Kirpotin, D 등, FEBS Lett. 388:115-118 (1996)). 상기 접근법에서, mPEG 는 절단가능 결합을 통해 DSPE 에 부착된다. 결합의 절단은 리포좀 함유물을 신속히 방출하도록 리포좀을 불안정화시킨다.
PEG 중합체 사슬을 리포좀에 결합시키기 위한 불안정 결합이 기재되어 있다 (미국 특허 제 5,013,556 호, 제 5,891,468 호; WO 98/16201). 이러한 리포좀 조성물 중의 불안정 결합은 예를 들어, 표면에 부착된 타겟팅 리간드를 노출시키거나 리포좀과 표적 세포의 융합을 유도하기 위해, 리포좀에서 PEG 중합체 사슬을 방출시킨다.
그러나, 현재까지, 생체 내 사용하기 적합한 조건 하에서, 리포좀으로부터 중합체 사슬을 방출시킬 수단을 얻지 못해왔다. 예를 들어, 일부 방출가능 결합은 중합체 사슬을 방출하기 위해 강력한 가황분해제, 예컨대 1,4-디티오트레이톨을 필요로 한다. 상기 환원제는 생체 내 사용하기에 허용가능하지 않다. PEG 를 리포좀 지질에 연결시키는 공지된 방출가능 결합의 또다른 문제점은 방출가능 결합의 절단이 비천연의 바람직하지 않은 변형 지질을 생성한다는 것이다. 따라서, 생체 내 사용에 적합하고, 절단 후 천연의 변형되지 않은 형태의 약물 또는 치료제를 제공하는 절단가능 결합이 당분야에 여전히 필요하다.
EP 0317957 에서, Senter 는 항체가 디술피드 벤질 카르바메이트 또는 카르보네이트 링커를 이용해 약물에 결합되고, 디술피드 결합의 환원으로 약물이 방출되는, 약물-항체 전구약물을 기재하고 있다. Senter 의 교시는 환원제, 예컨대 1,4-디티오트레이톨, 글루타티온, NADH 및 NADPH 의 작용 하, 약물-리간드 전구약물 분자의 절단에 특이적이다. 혈류를 통해 순환하는 리포좀 내로 삽입되는 경우, 상기 링커의 행동은 Senter 의 개시를 기초로 예측할 수 없다. 예를 들어, 리포좀 내에서, 중합체 및 지질 사이의 링커는 PEG 코팅 중에 묻히거나 차폐될 것이다. Senter 에서와 같이, 단일 약물-리간드 전구약물의 방출을 예상하는 것은 비교적 용이하다; 그러나, 중합체 사슬의 리포좀 표면 코팅에서와 같이 일부 빽빽히 뭉쳐진 장벽에서의 링커의 방출은 예측하기가 더 어렵다.
상기 명시된 바와 같이, 연장된 혈액 순환수명이 PEG-코팅된 리포좀의 바람직한 특징이며, 암 위치로의 리포좀 요법을 위해서는 약 12 시간 초과의 혈액 순환수명이 바람직하다. Senter 의 개시는 내인성 환원 조건 하, 예컨대 리포좀의 혈액 순환 중에, 리포좀 내에 삽입된 콘쥬게이트의 방출 역학에 대한 지시를 제공하지 않는다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목적은 약물이 리포좀에서 방출되기 위해 필요한 시기 동안 보유되는 리포좀 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 리포좀에 사용하기 위한 콘쥬게이트를 제공하는 것으로, 상기 콘쥬게이트는 지질 이중막 내에 고정하기 위한 소수성 부분, 약한 가황분해적 조건에 반응하는 절단가능 결합 및 치료제를 함유한다.
하나의 요지에서, 본 발명은 리포좀 약물 전달 매개체에 사용하기 위한 콘쥬게이트를 포함하며, 콘쥬게이트는 하기 화학식을 갖는다:
(식 중, L 은 리포좀 지질 이중막 내로 삽입하기에 적합한 소수성 부분이며, R1은 디티오벤질 부분에 공유 부착된 치료 약물을 나타내고, CH2R1기의 방향은 오르토 위치 및 파라 위치에서 선택된다).
하나의 구현예에서, 치료 약물은 우레탄, 아민, 아미드, 카르보네이트, 티오-카르보네이트, 에테르 및 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 결합에 의해 공유 부착된다.
또다른 구현예에서, L 은 콜레스테롤, 디아실글리세롤, 인지질 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, L 은 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 제공하는 디아실글리세롤 유도체이다:
(식 중, R2및 R3은 약 탄소수 8 내지 약 24, 또는 또다른 구현예에서, 탄소수 약12 내지 약 22 의 탄화수소이다). 또다른 구현예에서, R2및 R3은 동일한 길이의 탄화수소 사슬이다.
또다른 구현예에서, 약물은 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 아트로핀, 클로람부실, 메토트렉세이트, 미톡산트론 및 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 치료 약물은 디티오벤질 부분에 공유 결합되어 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 형성한다:
(식 중, R4는 치료 약물의 잔기를 나타낸다).
하나의 구현예에서, R4는 일차 또는 이차 아민 부분를 함유하는 치료 약물의 잔기로서, 디티오벤질 및 치료 약물 간 우레탄 결합을 형성한다. 상기 구현예에서, 치료 약물은, 예를 들어 미토마이신 A, 미토마이신 C, 블레오마이신 또는 폴리펩티드일 수 있다.
또다른 구현예에서, R4는 디티오벤질 및 치료 약물 간 에스테르 결합을 형성하는, 카르복실-함유 치료 약물의 잔기이다. 상기 구현예에서 약물의 예에는 클로람부실 또는 메토트렉세이트가 포함된다.
또다른 구현예에서, R4는 히드록실 부분을 함유하여 디티오벤질 및 치료 약물 간 카르보네이트 결합을 형성하는 치료 약물 잔기이다. 상기 구현예에서 약물의 예에는 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 미톡산트론 및 아트로핀이 포함된다.
또다른 구현예에서, 본 발명에는 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 상기 기재된 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 함유하는 소포형성 지질로 구성된 리포좀을 함유하는 리포좀 조성물이 포함된다. 치료 약물은 생리적 조건 또는 인공적으로 유도된 조건에 반응하여 생체 내에서 콘쥬게이트로부터 방출된다.
또다른 요지에서, 본 발명에는 소포형성 지질 및 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 상기 기재된 콘쥬게이트로 구성되는 리포좀을 제조하는 것을 포함하는, 리포좀 내 약물을 보유하는 방법이 포함된다. 리포좀은 생리적 조건 또는 인공적으로 유도된 조건에 반응하여 콘쥬게이트로부터 방출되기 전까지, 약물을 리포좀 내에 효과적으로 보유한다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은, 동반되는 도면과 함께 하기 본 발명의 상세한 설명을 독서하여 보다 자세히 이해될 것이다.
본 발명은 소수성 부분, 절단가능 결합, 및 치료제를 함유하는 콘쥬게이트에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 리포좀 제형물에 삽입되는, 지질, 절단가능 결합 및 약물을 함유하는 콘쥬게이트에 관한 것이다. 콘쥬게이트는 변형되지 않은 상태의 약물을 방출하기 위해, 생체 내의 약한 가황분해적 조건 하에서 절단될 수 있다.
도 1 은 아민-, 히드록시- 또는 카르복실-함유 약물과 더 반응시키기 위한파라-디아실디글리세롤-디티오벤질알콜의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다;
도 2A 는 아미노-함유 약물을 반응성 디아실디글리세롤-디티오벤질카르보네이트에 부착시키기 위한 일반 반응식을 나타낸다;
도 2B 는 도 2A 의 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 후 산물을 나타낸다;
도 3A 는 디아실디글리세롤-디티오벤질-5-플루오로우라실 콘쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다;
도 3B 는 도 3A 의 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 후 생성물을 나타낸다;
도 4 는 디아실디글리세롤-디티오벤질-5-플루오로우라실 콘쥬게이트의 제조를 위한 대안적 합성 반응식 및 상기 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 후 산물을 나타낸다;
도 5 는 디아실디글리세롤-디티오벤질-클로람부실 콘쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응식 및 상기 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 후 산물을 나타낸다;
도 6A 는 디아실디글리세롤-디티오벤질-미토마이신-C 콘쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다;
도 6B 는 도 6A 의 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 후 산물을 나타낸다;
도 7 은 콜레스테롤-디티오벤질-미토마이신-C 콘쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다;
도 8 은 콜레스테롤-디티오벤질-미토마이신-C 콘쥬게이트의 제조를 위한 또다른 합성 반응식을 나타낸다;
도 9A-9C 는 세 가지 지질-디티오벤질-미토마이신-C 콘쥬게이트인, 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신-C (도 9A), 파라-디팔미토일-DTB-미토마이신-C (도 9B) 및 오르토-디팔미토일-DTB-미토마이신 C (도 9C) 의 구조를 나타낸다;
도 10A-10B 는 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 10A) 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 10B) 로 구성되는 리포좀의 HPLC 크로마토그램이며, 각 도는 시스테인의 존재 하에서 리포좀을 인큐베이션한 시간의 함수로서의 따른 일련의 크로마토그램을 나타낸다;
도 11 은 시스테인의 존재 하에서 인큐베이션한 시간의 함수로서, HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (검은 다이아몬드) 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (검은 원) 로 구성되는 리포좀에서 방출되는 미토마이신 C 의 퍼센트를 나타내는 그래프이다;
도 12A-12B 는 150 μM (검은 기호) 및 1.5 mM (흰 기호) 농도의 시스테인 존재 하에서 인큐베이션한 시간의 함수로서, HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 12A) 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C (도 12B) 로 구성되는 리포좀에서 방출되는 미토마이신 C 의 퍼센트를 나타내는 그래프이다;
도 13 은 유리 미토마이신 c (흰 삼각형), HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 를 함유하는 리포좀 (검은 사각형), 및 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 를 함유하는 리포좀 (흰 원) 에 대해, 미토마이신 C 의 양 (nM) 의 함수로서, 약물 및 시스테인 부재 하 M109 세포의 성장 기준 퍼센트로 표현되는 M109 세포의 성장률 그래프이다;
도 14A 는 미토마이신 C 의 농도 (nM) 의 함수로서, 약물 또는 시스테인 부재 하 M109 세포의 성장 기준 퍼센트로 표현되는, M109 세포의 성장률 그래프이다. 유리 형태의 미토마이신 C (흰 삼각형) 및 유리 형태의 미토마이신 C 에 더해 1000 μM 시스테인 (검은 삼각형) 으로 처리한 세포를 나타낸다. 또한, HSPC/PEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 로 구성되는 리포좀 제형물 (흰 원), 및 150 μM (흰 다이아몬드), 500 μM (검은 원) 및 1000 μM (흰 사각형) 농도로 부가적 시스테인이 첨가된 리포좀 제형물로 처리한 세포를 나타낸다;
도 14B 는 미토마이신 C 의 농도 (nM) 의 함수로서, 약물 또는 시스테인 부재 하 M109 세포의 성장 기준 퍼센트로 표현되는, M109 세포의 성장률 그래프이다. 유리 형태의 미토마이신 C (흰 삼각형) 및 유리 형태의 미토마이신 C 에 더해 1000 μM 시스테인 (검은 삼각형) 으로 처리한 세포를 나타낸다. 또한, HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 를 함유하는 리포좀 제형물 (흰 원) 및 150 μM (흰 다이아몬드), 500 μM (검은 원) 및 1000 μM (흰 사각형) 농도로 부가적 시스테인이 첨가된 리포좀 제형물로 처리한 세포를 나타낸다;
도 15 는 다양한 농도의 시스테인에서 시험관 내 M109 세포에 대한, 유리 미토마이신 C (검은 사각형), HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 으로 구성되는 리포좀 (검은 원), 및 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 로 구성되는 리포좀 (흰 삼각형) 과 연합된 미토마이신 C 의 세포독성 ((IC50시스테인 없을 때/IC50시스테인 있을 때)x100 으로 측정) 증가 퍼센트를 나타내는 그래프이다;
도 16A 는 유리 미토마이신 C (흰 사각형),HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 로 구성되는 리포좀 (검은 다이아몬드), 및 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 로 구성되는 리포좀 (검은 원) 의 정맥 주사 후 시간 (시간) 의 함수로서 래트의 혈중 미토마이신 C 농도를 나타내는 그래프이다;
도 16B 는 유리 미토마이신 C (흰 사각형), HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 를 함유하는 리포좀 (검은 다이아몬드), 및 HSPC/mPEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C 를 함유하는 리포좀 (검은 원) 의 정맥 주사 후 시간 (시간) 의 함수로서 래트의 혈중 잔여 주사 용량 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
"리포좀 지질 이중막 내로 삽입하기 적당한 소수성 부분" 라는 어구는 리포좀 지질 이중막의 소수성 이중막 영역에 도입될 수 있는 소수성 부분을 포함하는 임의 물질을 의미하는 것이다. 상기 소수성 부분은 전형적으로 소수성 지질 꼬리 및 친수성 극성 머리를 갖는 양쪽성 지질, 예컨대 인지질 및 디아실글리세롤을 포함하는 지질이다. 트리글리세라이드, 스테롤, 인지질 유도체, 디아실글리세롤, 스테롤 및 트리글리세라이드 및 천연원에서 유래되거나 합성적으로 제조된 기타 지질을 또한 나타낸다.
"치료 약물 잔기" 에서와 같은 "잔기" 라는 용어는 약물 분자의 하나 이상의 원자가 치환되었거나 제거되어 결합을 형성하는, 결합을 형성하도록 또다른 분자와반응한 약물 분자를 의미하는 것이다.
본원에서 사용되는 "폴리펩티드" 는 아미노산 중합체를 말하며, 특정 길이의 아미노산 중합체를 말하는 것은 아니다. 따라서, 예를 들어, 용어 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 및 효소가 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어에는 또한, 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어 당화, 아세틸화, 인산화 등이 포함된다.
본원에서는 하기 약어들이 사용된다: PEG, 폴리(에틸렌 글리콜); mPEG, 메톡시-PEG; DTB, 디티오벤질; DSPE, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민; HSPC, 수소화 콩 포스파티딜콜린; MMC, 미토마이신 C.
II. 콘쥬게이트 조성 및 제조 방법
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 콘쥬게이트를 포함한다:
(식 중, L 은 리포좀 지질 이중막 내로 삽입하기 적합한 소수성 부분이며, R1은 디티오벤질 부분에 공유 부착된 치료 약물 잔기를 나타내고, CH2R1기의 방향은 오르토 위치 및 파라 위치에서 선택된다). 소수성 부분, L 은 전형적으로 지질, 예컨대 디아실글리세롤, 스테롤, 인지질, 이러한 지질의 유도체, 기타 천연 생성 지질 및 그의 합성 유사체이다.
콘쥬게이트에서, 치료 약물은 공유 결합에 의해 디티오벤질 부분에 부착되어, 화학식에서 R1으로 나타내는 약물 잔기를 형성한다. 당업자가 이해할 것과 같이, 결합은 약물 및 반응 화학에 따라 다양할 것이다. 바람직한 구현예에서, 치료 약물은 우레탄, 아민, 아미드, 카르보네이트, 티오-카르보네이트, 에테르 및 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 결합에 의해 디티오벤질 부분에 공유 부착된다.
우레탄 결합은 O(C=O)NH-R4또는 O(C=O)N=R4의 형태를 취하며, 여기서 R4는 치료 약물 잔기를 나타낸다. 예를 들어, 일차 또는 이차 아민을 함유하는 약물, 예컨대 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신 및 치료용 폴리펩티드와 같이 소수 명명되는 것들이 반응하여 약물 내 아민 부분과 우레탄 결합을 형성한다.
카르보네이트 결합은 O(C=O)O-R4의 형태를 취하며, 여기서 R4는 약물 잔기를 나타내고, 카르보네이트 결합은 약물 중의 페놀 또는 알콜 또는 히드록실 부분에서 유도된다. 티오-카르보네이트는 O(C=O)S-R4의 형태를 취하며, 여기서 R4는 약물 잔기를 나타내고, 결합은 약물 중의 부분에서 유도된다. 디티오벤질 알콜과 반응하여 카르보네이트 결합을 형성하는 상기 부분을 갖는 약물의 예에는 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 미톡산트론 및 아트로핀이 포함된다.
에스테르 결합은 O(C=O)-R4의 형태를 취하며, 여기서 R4는 약물 잔기를 나타낸다. 결합은 치료 약물 중 카르복실산 부분과의 반응에서 유도되며, 클로람부실 및 디티오벤질 간 에스테르 결합을 갖는 콘쥬게이트의 예가 하기에 기재된다.메토트렉세이트는 콘쥬게이트의 디티오벤질 부분과 에스테르 결합을 형성할 수 있는 약물의 또다른 예이다.
디티오벤질 부분에 약물을 부착시키는 우레탄, 카르보네이트 또는 에스테르 결합을 갖는 콘쥬게이트는 일반적으로 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
(식 중, R4는 치료 약물의 잔기를 나타낸다).
또다른 구현예에서, 콘쥬게이트에는 O-R4의 형태를 취하는 에테르 결합이 포함되며, 여기서 R4는 치료 약물 잔기를 나타낸다. 결합은 전형적으로 약물 상 알콜 작용기와의 반응에서 유도된다.
아미드 결합은 N=R4의 형태이며, 여기서 R4는 약물 잔기를 나타내고, 결합은 약물 중 N 과 디티오벤질의 CH2부분에 직접 부착된다. 아민 결합이 형성된, 약물 5-플루오로우라실과의 콘쥬게이트가 하기 기재될 것이다. 아미드 결합 또한 치료제로서의 펩티드와 형성될 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산의 유리 카르복실이 디티오벤질아민과 축합된다.
아미드 결합은 NH(C=O)-R4의 형태를 취하며, 여기서 R4는 약물 잔기를 나타낸다.
도 1 은 본 발명에 따른 예시적 콘쥬게이트의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다. 상기 구현예에서, 중간체 화합물인 파라-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜 (화합물 IV) 의 합성은 선택된 치료 약물과의 후속 반응을 위해 준비된다. 화합물 IV 는 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 3-메르캅토-1,2-프로판디올 (화합물 I) 을 과산화수소와 반응시켜 rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디올) (화합물 II) 을 형성함으로써 제조된다. Rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디올) 은 소수성 부분 R 로 아실화된다. 예를 들어, R 은 탄소수 약 8 내지 약 24 의 지방산일 수 있다. 실시예 1 은 R 이 스테아르산인 반응 절차를 상술한다. 또다른 구현예에서, R 은 탄소수 약 12 내지 약 22 의 지방산이다. 화합물 II 의 아실화로 Rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디스테아로일) (화합물 III) 이 얻어지며, 이를 염화술푸릴 및 4-메르캅토벤즈알콜과 반응시켜 목적한 중간체 산물인 파라-디아실디글리세롤-디티오벤즈알콜 (화합물 IV) 을 형성한다. 화합물 IV 는 반응성 카르복실 부분 (R'CO2H) 를 갖는 약물과 쉽게 반응하여, 에스테르 결합을 통해 약물이 DTB 에 연결된 지질-디티오벤질 (DTB)-약물 콘쥬게이트 (화합물 V) 를 형성한다. 또한, 화합물 IV 는 반응성 아민 부분 (R'-NH2) 을 갖는 약물과 쉽게 반응하여, 우레탄 결합을 통해 약물이 DTB 에 연결된 지질-DTB-약물 콘쥬게이트 (화합물 VI) 를 형성한다. 또한, 화합물 IV 는 반응성 히드록실 부분 (R'OH) 을 갖는 약물과 쉽게 반응하여, 카르보네이트 결합을 통해 약물이 DTB 에 연결된 지질-DTB-약물 콘쥬게이트 (화합물 VII) 를 형성한다.
각종 약물을 본 발명의 콘쥬게이트에 사용하기 위해 나타낸다. 특히, 본 발명은 반응에 적합한 아민 (NH 또는 NH2), 카르복실, 술프히드릭 또는 히드록실 부분을 갖는 약물을 나타낸다. 본원에서 사용되는 "반응에 적합한" 이란, 예를 들어 디티오벤질 알콜의 형태인, 디티오벤질 부분과 반응할 수 있는 하나의 언급된 부분을 약물이 가짐을 의미한다. 약물의 예에는 반응에 적합한 NH 기를 갖는 5-플루오로우라실, 반응성 카르복실을 갖는 클로람부실 및 반응성 아민 (아지리딘기) 을 갖는 미토마이신 C 가 포함된다. 이러한 약물을 사용하여, 본 발명의 예시적 합성 구현예를 예시하고, 도 3-9 에 대해 설명한다. 사용하려는 기타 약물이 예에는 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 아트로핀, 클로람부실, 메토트렉세이트, 미톡산트론 및 5-플루오로우라실이 포함된다. 폴리펩티드, 아미노글리코시드, 알칼로이드 모두가 또한 본 발명에 사용하기 적합함이 이해될 것이다.
실시예 1 은 또한, 콘쥬게이트를 형성하기 위한 중간체 화합물로 작용할 수 있는, 오르토-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜의 제조 반응 조건에 대해 상술한다.
도 2A-2B 는 지질-DTB-약물 콘쥬게이트의 제조 (도 2A) 및 환원제의 존재 하 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 (도 2B) 을 나타낸다. 도 2A 에 나타낸 바와 같이, 소수성 부분 R 이 지방산 R"(CO)OH, 예컨대 스테아르산 (CH3(CH2)16CO2H) 에서 유도된 도 1 의 화합물 VII 를 포스포겐 (COCl2) 의 존재 하에서, 아민 함유 약물인H2N-약물과 반응시킨다. 상기 반응으로 도 2A 에 예시된 지질-DTB-약물 콘쥬게이트가 얻어진다. 환원 조건, 즉, 환원제, 예컨대 시스테인 또는 글루타티온에 노출 시, 콘쥬게이트는 분해되어 도 2B 에 나타낸 산물을 제공한다. 나타낸 바와 같이, 콘쥬게이트의 가황분해적 절단은 변형되지 않은, 천연 상태의 약물을 재생시킨다. 하기에 나타낼 것처럼, 콘쥬게이트 중 약물이 대상으로의 생체 내 투여를 위해 리포좀에 쉽게 삽입될 수 있으므로, 상기는 바람직한 특징이다. 나아가, 하기에 나타낼 것과 같이, 콘쥬게이트 형태의 약물은 독성이 없다. 투여 후 및 내인성 환원제에의 노출 또는 외인성 환원제에의 노출 시, 콘쥬게이트는 분해되어 자연 상태의, 생물학적 활성을 갖는 약물을 제공한다.
도 3A 에서는, 5-플루오로우라실의 콘쥬게이트 제조를 위한 합성 반응식이 예시된다. 화합물 IV 인 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜을 염화파라-톨루엔술포닐과 반응시켜, 중간체 화합물 IX 를 형성한다. 5-플루오로우라실 음이온 또는 소듐 염 (화합물 X) 과의 반응으로 목적한 지질-DTB-5-플루오로우라실 콘쥬게이트 (화합물 XI) 가 얻어진다. 환원제인 R'-SH 에 노출 시 지질-DTB-5-플루오로우라실 콘쥬게이트 (화합물 XI) 의 분해를 도 3B 에 나타낸다. 콘쥬게이트의 가황분해적 절단으로 변형되지 않은 형태의 5-플루오로우라실이 재생된다.
도 4 는 디아실디글리세롤-DTB-5-플루오로우라실 콘쥬게이트의 제조를 위한 대안적 합성 반응식을 나타낸다. 도 4 에서, 1-클로로에틸 클로로포르메이트 (화합물 XII) 를 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜 (화합물 IV) 과 반응시켜,반응성 클로로에틸 카르보네이트-DTB-디아실디글리세롤 중간체 (화합물 XII) 를 형성한다. 이어서 중간체를 트리에탄올아민 (TEA) 의 존재 하에서, 5-플루오로우라실과 반응시켜 지질-DTB-5-플루오로우라실 콘쥬게이트 (화합물 XIV) 를 생성한다. 콘쥬게이트의 가황분해적 절단 및 5-플루오로우라실의 재생을 또한 도 4 에 나타낸다.
콘쥬게이트의 또다른 구현예를 도 5 에 나타낸다. 상기 구현예에서, 반응성 카르복실 부분을 함유하는 약물인 클로람부실 (화합물 XV) 을 1,3-디시클로헥시카르보디이미드 (DCC) 및 디메틸아미노피리딘 (DMAP) 의 존재 하에서 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜 (화합물 IV) 과 반응시켜, 지질-DTB-클로람부실 콘쥬게이트 (화합물 XVI) 를 형성한다. 환원제에 노출 시, 콘쥬게이트는 나타낸 산물로 가황분해된다. 이어서 변형되지 않은 형태의 클로람부실이 재생된다.
도 6A 는 본 발명의 또다른 구현예에 따른 콘쥬게이트의 합성을 나타낸다. 나타낸 반응식에서, 반응성 아민 부분을 함유하는 약물인 미토마이신 C (화합물 XVII, 도 6B) 를 포스포겐의 존재 하에서 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜 (화합물 IV) 과 반응시켜 디아실디글리세롤-디티오벤질-미토마이신 C 콘쥬게이트 (화합물 XVIII) 를 형성한다. 합성의 자세한 사항은 실시예 2 에 제시된다.
도 6B 는 디아실디글리세롤-DTB-미토마이신-C 콘쥬게이트의 가황분해를 나타낸다. 환원제의 존재 하에서, 콘쥬게이트는 분해되어 나타낸 미토마이신 C (화합물 XVII) 및 기타 산물을 재생한다.
상기 명시한 바와 같이, 콘쥬게이트 중의 소수성 부분은 임의 수의 소수성부분, 예컨대 지질로부터 선택될 수 있다. 상기 실시예에서, 디아실디글리세롤 지질을 사용하여 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 형성하였다:
(식 중, R2및 R3은 탄소수 약 8 내지 약 24 의 탄화수소이다).
소수성 부분으로서, 디아실글리세롤에 덧붙여, 기타 지질이 예상된다. 도 7 은 콘쥬게이트 중 소수성 부분으로서 콜레스테롤이 사용되는 또다른 구현예를 나타낸다. 콜레스테롤 (화합물 XIV) 을 트리에틸아민 (TEA) 의 존재 하에서, 디클로로메탄 중 염화메탄술포닐과 반응시킨다. 이어서, 생성된 중간체를 티올 유도체, 궁극적으로 주요 디티오벤질 알콜로 전환시켜, 디아실글리세롤에 대해 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 미토마이신 C 를 결합시키는데 사용한다.
콜레스테롤-DTB-미토마이신-C 콘쥬게이트를 제조하기 위한 대안적 반응식을 도 8 에 나타낸다. 메톡시카르보닐디티오에틸 아민을 콜레스테롤 클로로포르메이트와 직접 반응시켜, 우레탄 결합을 형성한다. 이어서, 메르캅토벤질알콜을 사용하여, DTB-콜레스테롤 화합물을 수득한다. 미토마이신 C 를 상기 및 실시예 2 에 기재된 바와 같이 결합시킨다.
당업자는 상기 기재된 다양한 콘쥬게이트가 단지 예라는 것을 이해할 것이다. 매우 다양한 기타 소수성 부분 및 기타 약물, 예컨대 독소루비신 및 다우노루비신을 예상할 수 있고, 본 발명에 사용하기 적합하다. 하기 기재되는, 본 발명을 지지하기 위해 수행된 부가 시험에서, 도 6A 에 기재된 바와 같이 제조된 콘쥬게이트로 화합물 XVII 인 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C 를 사용하였다. 참고의 편리를 위해, 상기 콘쥬게이트를 도 9A 에 나타낸다. 기타 디아실 지질, 예컨대 디팔미토일 지질을 사용할 수 있음이 이해되며, 도 9B 는 파라-디팔미토일-DTB-미토마이신 C 콘쥬게이트를 나타낸다. 또한, 콘쥬게이트가 이성질체 결합도 또한 가질 수 있음을 이해할 것이다. 이는, 도 9C 에 나타낸 바와 같은 오르토-디팔미토일-DTB-미토마이신 C 콘쥬게이트에서 자명하다.
III. 콘쥬게이트 함유 리포좀의 제조
또다른 측면에서, 본 발명에는 소포형성 지질 및 상기 기재된 콘쥬게이트를 함유하는 리포좀 조성물이 포함된다. 리포좀은 다양한 치료 목적, 특히 리포좀의 전신 투여에 의해 치료제를 표적 위치 또는 세포에 전달하기 위해 사용되는 폐 지질 소포이다. 특히, 친수성 중합체 사슬, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 표면에 코팅된 리포좀은, 이러한 리포좀이 중합체가 코팅되지 않은 리포좀에 비해 연장된 혈액 순환수명을 제공하므로, 약물 전달체로서 바람직하다. 중합체는 혈액 단백질에 대한 장벽으로 작용하므로, 단백질의 결합 및 세망내피계의 기타 세포 및 대식세포에 의한 흡수 및 제거를 위한 리포좀 인지를 방지한다.
본 발명에 따른 리포좀에는, 하나의 구현예에서 소포형성 지질인 지질, 및 임의로 기타 이중막 성분과 배합된 콘쥬게이트가 포함된다. "소포형성 지질" 이란수 중에서 자발적으로 이중막 소포를 형성하는 지질이다. 소포형성 지질은 바람직하게는 두 개의 탄화수소 사슬, 전형적으로 아실 사슬, 및 극성 머리기를 갖는다. 당분야에는 다양한 합성 소포형성 지질 및 천연 생성 소포형성 지질이 공지되어 있으며, 두 개의 탄화수소 사슬은 전형적으로 탄소수 약 12 내지 약 24 의 길이이고, 다양한 불포화도를 갖는다. 예에는 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티드산 (PA), 포스파티딜이노시톨 (PI), 및 스핑고미엘린 (SM) 이 포함된다. 본 발명에 사용하기 바람직한 지질은 수소화 콩 포스파티딜콜린 (HSPC) 이다. 또다른 바람직한 지질군은 디아실글리세롤이다. 이러한 지질은 시판되거나, 공개된 방법에 따라 제조될 수 있다.
소포형성 지질은 일정도의 유동성 또는 강성을 얻기 위해, 혈청 중 리포좀의 안정성을 조절하기 위해, 그리고 리포좀 중 트랩핑된 약제의 방출율을 조절하기 위해 선택될 수 있다. 보다 단단한 지질 이중막, 또는 액체 결정성 이중막을 갖는 리포좀은 비교적 단단한 지질, 예컨대 비교적 높은 상전이 온도, 예컨대 약 80℃ 이하를 갖는 지질을 삽입하여 제조할 수 있다. 강성의, 즉 포화된 지질은 지질 이중막의 보다 큰 막 강성에 기여한다. 기타 지질 성분, 에컨대 콜레스테롤도 또한 지질 이중막 구조 내 막 강성에 기여하는 것으로 공지되어 있다.
액체 유동성은 비교적 유동적인 지질, 전형적으로 비교적 낮은 액체에서 액체-결정상으로의 전이 온도, 예컨대 실온 이하 (약 20-25℃) 를 갖는 지질 상을 갖는 것들을 삽입하여 얻어진다.
또한, 리포좀은 지질 이중막 내로 삽입될 수 있는 기타 성분, 예컨대 스테롤을 함유할 수 있다. 이러한 기타 성분은 전형적으로 이중막 내부의 소수성 영역과 접촉하는 소수성 부분, 및 막 외부의 극성 표면쪽으로 배열된 극성 머리기 부분을 갖는다.
본 발명의 리포좀 중 또다른 지질 성분은, 친수성 중합체로 유도체화된 소포형성 지질이다. 상기 지질 성분에서, 유도체화 지질은 지질 이중막 표면의 내부 및 외부 모두에 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 형성시킨다. 전형적으로, 약 1-20 몰 퍼센트의 유도체화 지질이 지질 조성물 중에 함유된다.
소포형성 지질의 유도체화에 적합한 친수성 중합체에는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필옥사졸린, 폴리히드록시프로필메트아크릴아미드, 폴리메트아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리히드록시프로필메트아크릴레이트, 폴리히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리아스파르트아미드가 포함된다. 중합체는 동종중합체 또는 블록 또는 랜덤 공중합체로서 사용될 수 있다.
바람직한 친수성 중합체 사슬은, 바람직하게는, 약 500 내지 약 10,000 달톤, 바람직하게는 약 1,000 내지 약 5,000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 사슬인, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이다. PEG 의 메톡시- 또는 에톡시-캡핑된 유사체도 또한 바람직한 친수성 중합체이다. 이러한 중합체는 다양한 중합체 크기, 예컨대 약 12 내지 약 220,000 달톤으로 시판되고 있다.
본 발명의 리포좀에는 전형적으로 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트, 바람직하게는약 5 내지 약 30 몰 퍼센트, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 20 몰 퍼센트의 지질-DTB-약물 콘쥬게이트가 포함된다. 본 발명을 지지하기 위해 수행된 연구에서, 소포형성 지질 수소화 콩 포스파티딜콜린 (HSPC), 메톡시-폴리에틸렌 글리콜로 유도체화된 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (mPEG-DSPE), 및 도 9A 에 나타낸 콘쥬게이트인 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (화합물 XVIII) 를 함유하는 리포좀을 실시예 4A-4B 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 한 리포좀 제형물은 지질 HSCP/콜레스테롤/mPEG-DSPE/파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (화합물 XVIII) 가 60/30/5/5 의 몰비로 존재하며, 콜레스테롤을 함유하였다 (실시예 4A). 콜레스테롤을 함유하지 않는 두 번째 제형물을 제조하고 분석하였다 (실시예 4B). 상기 제형물에서, 지질 HSCP/mPEG-DSPE/파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C (화합물 XVII) 는 90/5/5 의 몰 비로 존재하였다.
IV. 콘쥬게이트 함유 리포좀의 시험관 내 특징분석
A. 시험관 내 약물 방출
리포좀을 실시예 4A-4B 에 기재된 바와 같이 제조하고 시험관 내 특징분석하여, 환원제에의 노출에 따른 미토마이신 C 의 방출율을 측정하였다. 시험관 내 연구를 위해, 시험 매질에, 전형적으로 약 150 μM 농도의 시스테인을 첨가하여 환원 조건을 유도하였다. 생체 내, 내인성 환원 조건이 약물 방출을 위한 지질-DTB-약물 콘쥬게이트의 가황분해에 영향을 미치기에 충분할 수 있음이 이해될 것이다. 생체 내 환원 조건을 적합한 환원제, 예컨대 시스테인 또는 글루타티온의 투여에 의해 인공적으로 유도할 수 있음도 더 예상된다.
리포좀 제형물, 예컨대 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/콘쥬게이트인 화합물 XVIII (이하, "콜레스테롤 있는 제형물") 및 HSCP/mPEG-DSPE/콘쥬게이트인 화합물 XVIII (이하, "콜레스테롤 없는 리포좀 제형물") 을 24 시간 동안, 150 μM 시스테인의 존재 하 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 시료를 선택한 시점마다 채취하고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 분석하여, 콘쥬게이트 및 유리 미토마이신 C 의 양을 정량하였다. HPLC 조건을 실시예 5 에 기재하였다.
도 10A-10B 는 두 개 리포좀 제형물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 도 10A 에서는, 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물의 결과를 나타낸다. 시점 0 에서는, 측정가능한 유리 미토마이신 C 가 없고, 측정가능한 모든 약물은 리포좀에 결합한 지질-DTB-약물 콘쥬게이트의 형태이다. 인큐베이션 시간이 증가할수록, 콘쥬게이트 결합 미토마이신 C 의 존재에서 상응하는 감소와 함께 리포좀에서 방출되어 유리 형태로 측정가능한 미토마이신 C 의 양이 증가한다.
도 10B 는 콜레스테롤 있는 리포좀 제형물의 결과를 나타낸다. 시점 0 에서 채취한 첫번째 시료에는, 측정가능한 유리 미토마이신 C 가 없었다. 150 μM 시스테인의 존재 하에서 1 시간 인큐베이션한 후, 리포좀 결합 지질-DTB-미토마이신 콘쥬게이트의 분해를 시사하는 소량의 유리 약물이 검출되었다. 도 10A 와 대조하여, 콜레스테롤 있는 리포좀은 보다 느린 콘쥬게이트 분해율을, 따라서 보다 느린 약물의 방출을 나타낸다.
도 11 은 도 10A-10B 의 크로마토그램에서 측정된 바와 같은, 두 개의 리포좀 제형물에서 방출된 미토마이신 C 의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 콜레스테롤 없는 리포좀 (검은 다이아몬드) 이 콜레스테롤 있는 리포좀 (검은 원) 보다 높은 방출율을 가졌다. 콜레스테롤 없는 제형물에서는, 2 시간 후 미토마이신 C 의 50% 초과가 리포좀 결합 콘쥬게이트로부터 방출되었다. 두 가지 제형물에 대해, 24 시간 인큐베이션 기간의 말기에는 약물의 80% 초과가 방출되었다.
또다른 연구에서는, 두 가지 리포좀 제형물을 1.5 mM 시스테인 중에 인큐베이션하였다. 실시예 5 에 기재된 바와 같이 분석을 수행하여, 결과를 도 12A-12B 에 나타낸다. 도 12A 는 콜레스테롤 없는 리포좀 내에 삽입된 지질-DTB-약물 콘쥬게이트 (HSPC/PEG-DSPE/지질-DTB-미토마이신 C) 로부터 방출된 미토마이신 C 의 퍼센트를 나타낸다. 대조를 위해, 150 μM 과의 인큐베이션 중 방출 퍼센트 (검은 다이아몬드) 를 또한 나타낸다. 보이는 바와 같이, 더 높은 농도의 환원제 (1.5 mM, 흰 다이아몬드) 와 인큐베이션하여, 콘쥬게이트 분해율 및 약물 방츌율이 증가한다.
도 12B 는 콜레스테롤 있는 리포좀 제형물의 결과를 나타낸다. 1.5 mM 에서 인큐베이션한 리포좀 (흰 원) 은 150 μM 시스테인에서 인큐베이션한 동일 리포좀 (검은 원) 보다 상당히 높은 분해율을 나타낸다.
B. 시험관 내 세포독성
지질-DTB-미토마이신 C 콘쥬게이트 (화합물 XVIII) 함유 리포좀의 시험관 내 세포독성을 마우스 폐 육종주인 M-109 세포를 이용하여 평가하였다. 실시예 6 에 기재된 바와 같이, M109 세포를 유리 미토마이신 C 또는 디스테아로일-DTB-미토마이신 C 콘쥬게이트 함유 리포좀의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 실시예 6A 에명시된 몰 비로 실시예 4A-4B 에 기재된 바와 같이 제조된 리포좀을 시험하였다. 150 μM, 500 μM 및 1000 μM 농도의 시스테인을 일부 시험 세포에 첨가하여 콘쥬게이트의 가황분해 및 미토마이신 C 의 방출을 일으켰다.
실시예 6 에 기재된 바와 같이, IC50 값을 대조군 성장율을 50% 억제시키는 약물 농도 (IC50) 로 취하였다. 결과를 표 1 에 나타낸다.
제형물에 계속 노출시키면서 72 시간 배양한 후 M109 종양 세포의 IC50 값
제형물 시스테인 농도
0 150 μM 500 μM 1000 μM
유리 MMC1 285 ±92 n.d.4 n.d. 300 ±71
콜레스테롤 있는 리포좀2 1750 ±356 1140 ±368 650 ±42 510 ±113
콜레스테롤 없는 리포좀3 5400 ±1414 4550 ±1484 3600 ±1272 2550 ±778
1MMM = 미토마이신 C2HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/디스테아로일-DTB-MMC (90/45/5/5)3HSPC/mPEG-DSPE/디스테아로일-DTB-MMC (90/5/5)4n.d. = 수행하지 않음
세포독성 연구에서 결정된 M109 마우스 육종 세포의 성장율 퍼센트를 도 13 에 나타낸다. 성장율 퍼센트는 미토마이신 C 및 시스테인의 부재 하 M109 세포의 성장율을 기준으로 한 퍼센트로 표현되며, 미토마이신 C 농도 (nM) 의 함수로 나타낸다. 세포의 성장율은 실시예 6 에 기재된 바와 같이 결정하였다. 보이는 바와 같이, 콜레스테롤 있는 리포좀 (흰 원) 및 콜레스테롤 없는 리포좀 제형 (검은 사각형) 둘 다에서 시스테인의 농도가 증가함에 따라 세포 성장율 퍼센트는 감소한다. 또한, 시스테인은 유리 미토마이신의 활성에 영향을 미치지 않으며, 미토마이신 C 는 콘쥬게이트에서 방출되어 세포 성장을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
유리 형태의 미토마이신 C 또는 리포좀 결합 지질-DTB-약물 콘쥬게이트의 형태인 미토마이신 C 로 처리한 M109 마우스 육종 세포의 시험관 내 성장율을 도 14A-14B 에 나타낸다. 도 14A 에서는, 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물의 결과를 나타낸다. 그래프에서, M109 세포의 성장율은 약물 및 시스테인의 부재 하 M109 세포의 성장을 기준으로 한 퍼센트로 표현되며, 미토마이신 C 농도 (nM) 의 함수로 나타낸다. 유리 형태의 미토마이신 C (흰 삼각형) 및 유리 형태의 미토마이신 C 에 더해 1000 μM 의 시스테인 (검은 삼각형) 을 처리한 세포는 유리 형태 약물의 독성으로 인해 성장율 감소를 나타낸다. HSPC/PEG-DSPE/DSPE-DTB-미토마이신 C 로 구성되는 리포좀 제형물 (흰 원), 및 150 μM (흰 다이아몬드), 500 μM (검은 원) 및 1000 μM (흰 사각형) 농도로 부가적 시스테인이 첨가된 리포좀 제형물로 처리한 세포는 시스테인 용량 의존적 방식으로 세포의 세포독성을 나타낸다.
도 14B 는 콜레스테롤 있는 리포좀 제형물에 대한 유사 그래프이다. 콜레스테롤에 더해 150 μM (흰 다이아몬드), 500 μM (검은 원) 및 1000 μM (흰 사각형) 농도의 부가적 시스테인을 함유하는 리포좀 조성물로 처리한 세포에서 동일한 양식이 관찰되었다. 즉, 시스테인 농도가 증가함에 따라, 세포 성장율이 감소하였다. 이는 시스테인이 유도한 미토마이신 C 의 방출이 시스테인 농도와 직접적인 상관관계에 있음을 시사한다. 리포좀 제형물과는 대조적으로, 유리 형태의 미토마이신 C (흰 삼각형) 로 처리한 세포의 시험관 내 성장율은 유리 형태의 미토마이신 C 에 더해 1000 μM 시스테인 (검은 삼각형) 을 처리한 세포의 성장율과 동일하였다.
도 15 는 유리 미토마이신 C 및 리포좀 제형물의, 시스테인 농도 (μM) 의함수로서의 세포독성의 증가 퍼센트를 나타낸다. 세포독성의 증가는 IC50 의 감소 퍼센트, 예컨대 시스테인의 부재 하 IC50 에 대한 시스테인의 존재 하 IC50 곱하기 100 ((IC50시스테인 없는 경우/IC50시스테인 있는 경우)x100) 으로 측정되었다. 보이는 바와 같이, 세포독성 퍼센트는, 콜레스테롤 있는 리포좀 (흰 삼각형) 및 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물 (검은 원) 둘 다에서, 시스테인의 농도가 증가함에 따라 현저히 증가한다. 유리 미토마이신 C (검은 사각형) 의 세포독성은 시스테인의 존재에 영향받지 않는다.
세포독성 데이타는 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물이 시스테인에 의해 보다 많이 영향받음을 나타낸다. 특정 시스테인 농도에서의 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물의 IC50 는 단독 유리 약물보다 단지 2 배 더 낮다. 콜레스테롤 있는 리포좀 제형물은 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물보다 세포독성이 적다. 또한 데이타는, 시스테인이 종양 세포에 세포독성 효과를 갖지 않으며, 유리 미토마이신 C 의 세포독성에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 또한, 데이타로부터, 시스테인이 리포좀 결합 미토마이신 C 의 세포독성을 용량 의존적 방식으로 증가시킴이 현저하다. 따라서, 리포좀 제형물에서 관찰되는 세포독성 효과는 지질-DTB-약물 콘쥬게이트로부터 시스테인이 매개한 미토마이신 C 의 방출에 의해 대부분 설명된다.
C. 생체 내 약동역학
콜레스테롤 있는 리포좀 및 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물의 생체 내 약동역학을 래트에서 측정하였다. 실시예 7 에 기재된 바와 같이, 동물들에 유리 형태의 미토마이신 C 또는 본 발명에 따른 지질-DTB-미토마이신 C 콘쥬게이트 형태의 리포좀에 삽입된 미토마이신 C 약 0.1 mg/mL 를 단회 볼루스 정맥주사하였다. 주사 후, 혈액 시료를 채취하여, 미토마이신 C 의 양을 분석하였다. 결과를 도 16A-16B 에 나타낸다.
도 16A 는 정맥 주사 후, 시간의 함수로서 래트의 혈액 중 미토마이신 C 의 농도 (㎍/mL) 를 나타낸다. 보이는 바와 같이, 유리 형태로 정맥 투여한 유리 미토마이신 C (흰 사각형) 는 혈액으로부터 신속히 제거된다. 리포좀 결합 지질-DTB-약물 콘쥬게이트의 형태인 미토마이신 C 는 상당히 더 긴 시기동안 순환하며 남아 있다. 콜레스테롤 있는 리포좀 (검은 다이아몬드) 및 콜레스테롤 없는 리포좀 (검은 원) 과 연합된 미토마이신 C 는 혈액 중에서 20-25 시간 동안 10 ㎍/mL 초과로 검출되었다.
도 16B 는 시험 제형물의 정맥 주사 후, 시간의 함수로서 혈액 중 잔여 주사 용량의 퍼센트를 나타낸다. 실제로 유리 미토마이신 C (흰 사각형) 의 용량은 약 5 분 초과 시점에서 혈액 중에 남아 있지 않았다. 그러나, 리포좀 제형물의 주사 20 시간 후, 미토마이신 C 용량의 약 15-18 퍼센트가 순환하며 남아 있었다. 이는 순환 중인 리포좀 내에서 미토마이신 C-DTB-지질 콘쥬게이트가 안정하게 남아있고, 혈장 중에서 최소한의 가황분해적 절단이 일어남을 시사한다. 따라서, 상기 시스템이 연장된 혈액 순환수명 및 종양 내 증가된 축적을 나타내는 장기 순환 리포좀 (스텔스리포좀) 과 상용성인 것으로 나타났다.
V. 실시예
하기 실시예는 본원에 기재된 본 발명을 보다 예시하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
재료
모든 재료는 상업적 공급자, 예컨대 Aldrich Corporation 에서 구매하였다.
실시예 1
파라-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜 (화합물 IV) 및 오르토-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜의 합성
A. 파라-디아실디글리세롤디티오벤즈알콜
본 반응은 도 1 에 예시되어 있다. Snyder, W.R. (Journal of Lipid Research, 28:949 (1987)) 의 방법에 따라 화합물 II 및 III 을 제조하였다.
물 5 ml 중 3-메르캅토-1,2-프로판디올 (화합물 I, 1 g, 9.26 mmol) 을 함유하는 100 ml 둥근바닥 플라스크를 얼음조에 위치시켰다. 상기 신속 교반 플라스크에, 온도를 30-40℃ 로 유지하면서 과산화수소 (정확히 0.5 몰 당량, 525 ㎕, 4.63 mmol) 을 적가하였다. 발열 단계의 말기에, 반응물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 아세토니트릴을 20 ml 양씩 연속 첨가하여, 회전 증발로 물을 공비반응시켰다. 아세토니트릴 첨가 공정을 3-4 회 또는 물이 모두 제거될 때까지 반복하여, 깨끗한 오일을 얻었다. 금속 스파툴라로 플라스크를 긁어내고 -20℃ 에서 하룻밤동안 냉각시킨 후, 오일성 산물을 고형화하였다 (화합물 II, rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디올)). 백악질의 고체를 P2O5상에서 진공 건조하였다.
화합물 (980 mg, 4.6 mmol) 을 오븐 건조된 100 mL 둥근바닥 플라스크에 첨가하고 건조 염화메틸렌 (40 mL) 중에 용해시켜, rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디올) 산물 (화합물 II) 을 아실화시켰다. 상기물에, 스테아르산 (4.92 g, 17.1 mmol) 및 4-디메틸아미노)피리디늄 4-톨루엔술포네이트 (1.38 g, 4.6 mmol) 를 촉매로서 첨가하여 실온 (25℃) 에서 20 분 동안 교반하였다. 이어서, 디이소프로필카르보디이미드 (3.1 mL, 20 mmol) 을 피펫팅하여 실온에서 하룻밤동안 반응시켰다. GF (헥산 중 10% 에틸아세테이트) 상 TLC 실릭은 디올기의 완전 반응을 나타내었다. (rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디올) Rf=0.60; rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디스테아로일) Rf=0.35). 약염기성 이온교환 수지인 AmberlystA-21 (~3 g) 및 강산성 이온교환 수지인 Amberlyst15 (~ 3 g) 를 반응 혼합물에 첨가하였다. 30 분 동안 교반한 후, 수지를 여과하고 여과액을 건조시켰다. 잔류물을 이소프로판올로부터 3 회 (100 mL 씩) 재결정화시켰다. 고체 산물, rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디스테아로일) (화합물 III) 을 수합하여 P2O5상에서 건조하였다.
다음 단계에서, rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디스테아로일) (화합물 III) (2.97 g, 2.33 mmol) 의 용액을 톨루엔 (30 mL) 중에 용해시켜 얼음 조에 위치시켰다. 염화술푸릴 (1.9 mL, 23.2 mmol) 을 플라스크 내로 피펫팅하고 혼합물을 차가운 얼음조 온도에서 30 분 동안 교반하였다. 이어서, 플라스크를 실온에 위치시키고 다시 30 분 동안 교반하였다. 과량의 염화술푸릴을 회전 증발기로 제거하였다. 신선한 톨루엔 일정량 (20 mL) 을 반응 플라스크에 첨가하여 얼음조에 위치시켰다. 상기물에, 톨루엔 중 4-메르캅토벤즈알콜 (780 mg, 5.6 mmol) 용액을 느린 속도로 첨가하였다. 5 시간의 반응 시간 후, 모든 용매를 회전 증발로 증발시켜 건조하였다. 따뜻한 에틸 아세테이트 (10 mL) 를 반응 플라스크에 첨가하여 고체를 용해시키고 불용성 물질을 여과하였다. 에틸 아세테이트 용액에, 에테르 50 mL 을 첨가하여 침전시키고, 고체 산물 (파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜, 화합물 IV) 을 여과로 수합하였다. 상기 공정을 2 회 반복하였다. 수율: 75%.
산물 (파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜, 화합물 IV) 을 정제하기 위해, 클로로포름 중 실리카 겔 칼럼 (20 x 2.5 cm) 을 제조하였다. 시료를 최소량의 클로로포름 중에 용해시키고, 두 개의 상이한 이동상을 첨가하여 크로마토그래피하였다. 일차로, 100% CHCl3(100 ml) 를 용출하였다. 상기 분획에는 불순물인 디티오벤질 알콜이 함유된다.1HNMR 로 확인하였다. 이어서, 이동상을 클로로포름 중 15% 메탄올로 변화시켜, 순수한 산물을 플래시 크로마토그래피로 수합하였다. CH3OH:CHCl3(15:85) 500 ml 로 용출하여, 순수한 DGTBA (TLC 상에 한 점임) 를 수합하였다. 용매를 증발시킨 후, 고체를 t-BuOH 로부터 동결건조하여 P2O5상에서 진공 건조하였다. 최종 정제로 수율이 40%, 1.4 g 으로 감소하였다.
시료 5 mg 을 원소 분석 실험실 (Midwest Micro Lab) 에 제출하였다.
분석 이론치 실측치
탄소 70.93 % 70.67 %
수소 10.50 % 10.41 %
황 8.25 % 8.31 %
B. 오르토-디글리세롤디티오벤즈알콜
rac-3,3'-디티오비스(1,2-프로판디스테아로일) (화합물 III) (200 mg, 0.156 mmol) 용액을 톨루엔 (30 mL) 중에 용해시키고, 얼음조에 위치시켰다. 염화술푸릴 (39 ㎕, 0.47 mmol) 을 플라스크 내로 피펫팅하고, 혼합물을 차가운 얼음조 온도에서 30 분 동안 교반하였다. 이어서, 플라스크를 실온에 위치시키고, 다시 30 분 동안 교반하였다. 과량의 염화술푸릴을 회전 증발기로 제거하였다. 신선한 톨루엔의 일정량 (20 mL) 을 반응 플라스크에 첨가하여 얼음조에 위치시켰다. 상기물에, 톨루엔 중 2-메르캅토벤즈알콜 (48 mg, 35 mmol) 용액을 느린 속도로 첨가하였다. 반응 시간 5 시간 후, 모든 용매를 회전 증발로 증발시켜 건조하였다. 따뜻한 에틸 아세테이트 (10 mL) 를 반응 플라스크에 첨가하여 고체를 용해시키고 불용성 물질을 여과하였다. 에틸 아세테이트 용액에, 에테르 50 mL 을 첨가하여 침전시키고, 고체 산물 (오르토-디아실-디글리세롤-디티오벤잘알콜) 을 여과로 수합하였다. 상기 공정을 2 회 반복하였다. 고체를 P2O5상에서 진공 건조하였다.
실시예 2
파라-디아실디글리세롤디티오벤잘-미토마이신 C (화합물 XVIII) 의 합성
본 반응을 도 6A 에 예시한다.
50 mL 둥근바닥 플라스크를 포스겐 (3.1 mmol) 및 톨루엔 (5 mL) 으로 충진하고 용액을 0℃ 로 냉각하였다. 톨루엔 (2.5 mL) 중 파라-디아실-디글리세롤-디티오벤잘-알콜 (화합물 IV, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조함, 0.31 mmol) 의 용액을 제조하였다. 이어서, 알콜 용액을 포스겐 용액에 적가하였다. 혼합물을 하룻밤동안 실온으로 가온시켰다. 18 시간 후, 용액을 진공 농축하여 과량의 포스겐을 제거하였다. 조 염화아실를 톨루엔 (5 mL) 중에 재용해시켰다.
미토마이신 C (0.31 mmol), 디메틸아미노피리딘 (0.031 mmol) 및 DMF (1 mL) 의 용액을 제조하였다. 미토마이신 C 용액을 염화아실 용액에 적가하였다. 1 시간 후, 톨루엔을 증발제거하고 조 산물을 실리카 상에서 크로마토그래피하였다 (1:1 헥산: 에틸 아세테이트). 이어서, 정제 산물을 t-BuOH (50 mL) 에 취하여 동결건조하였다. 산물은 자주색 고체였다 (183 mg, 53%). Rf= 0.38 (50% 헥산:에틸아세테이트);
실시예 4
리포좀 제조
A. 콜레스테롤 있는 리포좀
1. 리포좀 제조
HSPC 59 mg, 콜레스테롤 14.4 mg, mPEG-DSPE 17.4 mg 및 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C 7.4 mg (몰 비 60/30/5/5) 를 60-65℃ 에서 탈수 에탄올 1 mL 에 첨가하고 용해될 때까지, 약 10 분 동안 혼합하였다.
증류수 중 10 mM 히스티딘 및 150 mM NaCl 로 구성된 수화 배지를 70℃ 로 가온시켰다.
따뜻한 지질 용액을 혼합하면서, 따뜻한 (63-67℃) 수화 매질에 신속히 첨가하여, 불균질한 크기를 갖는 리포좀 현탁액을 형성하였다. 현탁액을 63-67℃ 에서 1 시간 동안 혼합하였다.
2. 압출
테플론을 붙인 스테인레스 스틸 용기 내에 장착된 폴리카르보네이트 필터 카트리지를 통해 조절 압출시켜, 리포좀을 원하는 평균 입자 지름으로 크기를 맞추었다. 6-8 시간의 기간인 압출 공정 동안, 리포좀 현탁액을 63-65℃ 에서 유지하였다.
3. 투석여과
투석여과에 의해, 에탄올을 리포좀 현탁액으로부터 제거하였다. 무균수에 히스티딘 (10 mM) 및 염화나트륨 (150 mM) 을 용해시켜, 히스티딘/염화나트륨 용액을 제조하였다. 용액의 pH 를 약 7 로 조절하였다. 용액을 0.22 ㎛ Durapore 필터를 통해 여과하였다. 리포좀 현탁액을 히스티딘/염화나트륨 용액으로 약 1:1 (v/v) 비로 희석하여, 폴리술폰 중공-섬유 울트라필터를 통해 투석여과하였다. 히스티딘/염화나트륨 용액에 대해 8 배 부피의 교환을 수행하여 에탄올을 제거하였다. 공정 유동 온도를 약 20-30℃ 로 유지하였다. 총 투석여과 시간은 약 4.5 시간이었다.
4. 무균 여과
리포좀 현탁액을 33-38℃ 로 가열하고, 0.2 ㎛ Gelman Supor 폴리에테르술폰 필터를 통해 여과하였다. 총 여과 시간은 약 10 분이었다.
각 공정 단계 (수화, 압출, 투석 및 여과) 후, 지질 농도 및 콘쥬게이트/약물 농도를 HPLC 로 측정하였다. 리포좀 입자 크기는 다이나믹 광산란으로 측정하였고, 외부 현탁액 매질 중 "유리", 비결합 미토마이신 C 의 양은 HPLC 로 측정하였다.
지질-DTB-MMC1,2콘쥬게이트 (㎍/mL) 지질(mg/mL) 콘쥬게이트/지질 비 리포좀 크기 (nm) 유리 MMC2(%)
90° 30°
수화 후 699 12.50 56 -- -- 2
압출 후 369 8.49 43 105 186 4
투석 후 311 7.78 40 -- -- 0
여과 후 315 7.22 44 103 120 0
1콘쥬게이트=화합물 XVIII, 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C2MMC=미토마이신 C
B. 콜레스테롤 없는 리포좀 제형물
상기 기재된 바와 같이, 리포좀을 90/5/5 의 몰비의 HSPC, mPEG-DSPE 및 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C 지질 조성으로 제조하였다. 구체적으로, HSPC 88.5 mg, mPEG-DSPE (PEG MW 2000 달톤) 17.9 mg 및 콘쥬게이트 7.3 mg 을 에탄올 1 mL 에 용해시켰다. 리포좀 크기, 지질 및 약물 농도, 및 외부 현탁액 매질 중 유리 미토마이신 C 농도를 각 공정 단계 후에 측정하였다.
지질-DTB-MMC1,2콘쥬게이트 (㎍/mL) 지질(mg/mL) 콘쥬게이트/지질 비 리포좀 크기 (nm) 유리 MMC2(%)
90° 30°
수화 후 525 10.94 48 -- -- 3
압출 후 466 9.95 47 85 110 6
투석 후 404 8.35 48 -- -- 0
여과 후 378 7.92 48 82 93 0
1콘쥬게이트=화합물 XVIII, 파라-디스테아로일-DTB-미토마이신 C2MMC=미토마이신 C
실시예 5
시험관 내 특징분석을 위한 HPLC 조건
실시예 4A-4B 에 기재된 바와 같이 제조된 리포좀을 0.6 M 옥타일글루코피라노시드에 희석하였다. 리포좀을 37℃ 에서, 150 mM 시스테인의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 시점 0, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 24 시간에 시료를 채취하였다. 20 ㎕ 부피를 Water Symmetry C8 3.5 x 5 cm 칼럼을 이용한 HPLC 로 분석하였다. 유속은 1 mL/분이었고, 이동상 농도구배는 하기와 같았다:
개시 10 % MEOH 90 % 10 mM NaPO4, pH = 7
5 분 25 % MEOH 75 % 10 mM NaPO4, pH = 7
10 분 25 % MEOH 75 % 10 mM NaPO4, pH = 7
15 분 100 % MEOH --
25 분 100 % MEOH --
30 분 10 % 90 % 10 mM NaPO4, pH = 7
35 분 10 % MEOH 90 % 10 mM NaPO4, pH = 7
실시예 6
세포독성 연구
A. 리포좀 제조
실시예 4A-4B 에 기재된 바와 같이 제조된 리포좀은 HSPC/mPEG-DSPE/디스테아로일-DTB-미토마이신 C (90/5/5) 또는 HSPC/콜레스테롤/mPEG-DSPE/디스테아로일-DTB-미토마이신 C (90/45/5/5) 로 구성되었다. 리포좀 제제를 0.45 ㎛ 셀룰로오스 막을 통해 무균 여과하고, 압출을 통해 크기를 줄이지 않았다. 리포좀을 제형화한 후, 미토마이신 C 농도를 이소프로판올에 10-20 배 희석시켜 가용화된 리포좀 중 360 nm 에서의 흡광도로 측정하고, 인지질 농도를 무기 포스페이트 분석으로 측정하였다.
콜레스테롤 있는 리포좀은 275 ±90 nm 의 평균 지름을 가졌다. 콜레스테롤 없는 리포좀은 150 ±50 nm 의 평균 지름을 가졌다. 두 가지 리포좀 제형물에서 인지질 농도는 10 μM/mL 이었고, 두 가지 제형물에서 미토마이신 C 의 농도는 120 ㎍/mL 이었다.
B. 화학민감성 분석 및 성장율 측정
유리 미토마이신 C 또는 리포좀 내에 삽입된 디스테아로일-DTB-미토마이신 C 콘쥬게이트 형태인 미토마이신 C 의 세포독성 효과를 이전 (Horowitz, A.T. 등, Biochem. Biophys. Acta, 1109:203-209 (1992)) 에 기재된 메틸렌 블루 염색 방법을 약간 변형한 발색측정으로 분석하였다. 분석 종료 시, 세포를 고정하고, 메틸렌 블루 염색 분석을 이용하여 평가하였다.
분석에서, 200 ㎕ 량의 배양액 (RPMI-1640 배지 + 10% 우 태아 혈청) 에서 지수적으로 성장하는 1500 개의 M109 마우스 육종 세포를 96 웰 평편바닥 마이크로타이터 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포가 부착하여 성장을 개시하는 동안인 배양 20 시간 후, 시험 제형물 (유리 미토마이신 C 또는 리포좀 제형물) 20 ㎕ 를 각 웰에 첨가하였다. 약물 농도가 10 배씩 증가할 때마다, 4 가지 약물 농도점을 시험하였다. 각 시험을 세 개 웰씩, 두 개의 평행 플레이트 상에서 수행하였다. 세포를 72 시간 동안 연속 처리하였다.
72 시간 처리 기간 후, 각 웰에 2.5% 글루타르알데히드 50 ㎕ 를 10 분 동안 첨가하여 배양물을 고정시켰다. 탈이온수로 3 회, 0.1 M 보레이트 완충액 (pH 8.5) 으로 1 회 플레이트를 세척한 후, 실온 (20-25℃) 에서 메틸렌 블루 (pH 8.5, 0.1 M 완충 보레이트 중의 1 %) 100 ㎕ 로 60 분 동안 염색하였다. 플레이트를 탈이온수의 5 개 조에서 헹구어, 세포에 결합하지 않은 염료를 제거한 후 건조하였다. 37℃ 에서, 0.1 N HCl 200㎕ 로 60 분 동안 염료를 추출하고, 마이크로플레이트 분광계를 이용하여 광학 밀도를 측정하였다.
세포 수는 분광계의 흡광도와 잘 연관되는 혈구계로 세포를 계수하여 측정하였다. 초기 세포 플레이팅 밀도는 연구 말기의 세포 수 및 흡광도 간 선형비례 관계가 확실시 되도록 선택하였다. 각 연구에서, 약물을 첨가하기 전에 6 개 웰을 고정시켜, 초기 평균 흡광도를 결정하였다. 상기 값을 사용하여, 하기 공식을 이용한 대조군 및 약물 처리 세포의 성장율 (GR) 및 배가 시간 (DT) 를 계산하였다: DT = ln2/ln[(ODt/ODc)/h]; 여기서, DT = 배가 시간 (시간); ODt= 연구 말기의 시험 웰의 광학 밀도; ODc= 연구 개시의 대조군 웰의 광학 밀도; h = 인큐베이션 기간 (시간) 이다.
성장율은 GR = (ln2/DT) 로 계산하였다. 성장 억제 퍼센트 또는 성장율 조절 퍼센트는, 약물 처리 세포의 성장율을 비처리한 대조군 세포의 성장율로 나누어 얻었다. 대조군 성장율의 50% 억제를 일으키는 약물 농도 (IC50) 는, 성장 억제 곡선의 가장 가까운 두 값을 내삽하여 계산하였다.
10-8- 10-5M 범위의 미토마이신 C 를 분석하였다. 10-8- 3 x 10-5M 범위의 콘쥬게이트 결합 리포좀 제형물을 분석하였다. 상호작용 연구를 위해, 시스테인 (SIGMA, St. Louis, MO) 을 미토마이신 C 또는 리포좀 제형물과 함께, 150, 500, 또는 1000 μM 의 최종 농도로 첨가하였다.
결과를 표 1 및 도 13, 14 및 15A-15B 에 나타낸다.
실시예 7
생체 내 약동역학 연구
A. 리포좀 제형물
콜레스테롤 있는 리포좀 및 콜레스테롤 없는 리포좀을 실시예 5A 및 5B 에 기재된 바와 같이 제조하였다.
에탄올 119 ㎕ 에 미토마이신 C 11.9 mg 을 용해시켜 유리 형태의 미토마이신 C 용액을 제조하였다. 용해 후, 10 mM 히스티딘/150 mM 식염수 용액 약 11.8 ㎕ 을 첨가하였다. 사용 전에, 미토마이신 C 용액을 히스티딘/식염수 용액 100 ㎍/mL 로 희석하여 여과하였다.
B. 동물
8 마리의 래트를 무작위로 하기와 같은 처리군으로 사용하였다:
래트 번호 체중 (mg) 제형물 MMC 농도 (mg/mL) 용량(mL) 용량(mg/kg)
1 262.9 콜레스테롤 있는 리포좀 0.088 1.5 0.50
2 268.2 콜레스테롤 있는 리포좀 0.088 1.5 0.49
3 264.0 콜레스테롤 없는 리포좀 0.106 1.5 0.53
4 238.1 콜레스테롤 없는 리포좀 0.106 1.5 0.67
5 226.0 유리 MMC 0.1 2.26 0.66
6 232.0 유리 MMC 0.1 2.32 0.88
7 250.0 유리 MMC 0.1 2.60 0.80
8 263.0 유리 MMC 0.1 2.63 0.59
시험 제형물의 단일 정맥 주사를 볼루스 용량으로 투여하였다. 혈액 시료를 주사 후 하기 시간에 각 동물로부터 채취하였다: 30 초, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간. 혈액 중 미토마이신 C 의 양을 하기 주어진 HPLC 절차에 의해 측정하였다. 7.5% EDTA 5.1 ml 중에 요오도아세트아미드 199.3 mg 을 넣어 200 mM 요오도아세트아민 용액을 제조하였다. 200 mM 요오도아세트아미드 용액 15 ㎕ 를 각 혈액 시료 1 ㎕ 에 넣었다.
C. 혈장 중 미토마이신 C 를 측정하기 위한 HPLC 방법
1. 용액 제조
탈이온수로 채운 1 L 부피측정 플라스크 내에 인산암모늄 1.321 g 을 넣어 pH=7, 10 mM 인산암모늄을 함유하는 수성 완충액을 제조하였다. 혼합물을 교반하고, o-인산으로 pH 를 7 로 조절하였다. 완충액을 사용 전에 0.45 ㎛ 나일론 필터를 통해 여과하였다.
메탄올 이동상 및 수성 완충액을 Waters Alliance 이중 펌프를 이용한 농도구배 프로그램을 통해 혼합하였다.
2. 표준 용액 및 품질 조절 시료의 제조
2 개 개별 중량의 미토마이신 C 및 미토마이신 C 콘쥬게이트를 표준 및 품질 조절 시료로서 제조하였다. 미토마이신 C 및 미토마이신 C 콘쥬게이트 1 mg 을 계량하여 개별적으로 희석제 (20% 클로로포름 및 80% 메탄올 혼합물) 1 mL 에 용해시켰다. 두 화합물의 스톡 용액 농도는 1 mg/mL 이었다. 희석제 중에 여러 희석물을 제조하여, 표준 및 품질 조절 시료용으로 5 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL 농도를 얻었다.
래트 혈장 0.1 mL 량에 적절한 부피 (10 ㎕-50 ㎕) 의 미토마이신 C 및 미토마이신 C 콘쥬게이트 표준 용액을 넣었다. 미토마이신 C 및 미토마이신 C 콘쥬게이트에 대한 농도 범위는 각각 0.05-5.0 ㎍/mL 및 0.1-5 ㎍/mL 이었다. 메탄올로 최종 부피를 1 mL 로 조절하였다. 유사한 절차를 따라, 품질 조절 시료를 제조하였다. 래트 혈장 중, 품질 조절 시료의 농도는 미토마이신 C 가 0.1, 0.5 및 5 ㎍/mL 및 미토마이신 C 콘쥬게이트가 0.1, 1 및 5 ㎍/mL 이었다. 시료를 실온에서 10 분 동안 3,000 rpm 에서 회전침전시켰다. 상청액 300 ㎕ 를 주사용 삽입물 300㎕ 가 들어있는 HPLC 바이알에 옮겼다.
3. 시료 제조
혈장 시료 100 ㎕ 를 메탄올 900 ㎕ 로 변성시킨 후, 3,000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상청액 300 ㎕ 양을 주사용 삽입물 300 ㎕ 가 들어있는 HPLC 바이알에 옮겼다.
4. 크로마토그래피 조건
SupelcoC-8, 5 μ, 4.6 mm x 5 cm 칼럼을 사용하였다. 이동상 A 는 pH 7, 10 mM 인산암모늄이었다. 이동상 B 는 메탄올이었다. 유속은 1 mL/분이었고, 360 nm 에서 UV 로 검출하였다. 주사액 부피는 40 ㎕ 이었고, 통상 수행 시간은 15 분이었다. 농도구배 프로그램은 하기와 같았다:
시간 (분) 이동상 A 의 양 (%) 이동상 B 의 양 (%)
0 90 10
4 70 30
8 0 100
12 90 10
15 90 10
5. 분석 및 계산
저농도에서 고농도로 제조된 직선상 표준물 (6 개 농도 레벨) 을 주사하였다. 이어서, 품질 조절 및 혈장 시료를 분석을 위해 주사하였다.
PE-Nelson Turbochrom (4.1 버전) 시스템으로, 피크 넓이 및 정체 시간을 측정하였다. 직선 회귀 프로그램을 이용하여 미토마이신 C 및 미토마이신 C 콘쥬게이트 의 농도를 계산하였다. 6 개 농도 레벨로부터의 표준 반응으로 직선화 방법을 평가하였다. 데이타는 1/x2의 중량 인자로, 직선 회귀 공식 y=B*x + A 로 맞춰졌다. 품질 조절 시료뿐만 아니라 표준물의 농도를 역계산하여, 상기 방법의 정확도 및 신뢰도를 평가하였다.
결과를 도 16A-16B 에 나타낸다.
본 발명을 특정 구현예에 대해 기재하였으나, 당업자에게는 본 발명에서 벗어나지 않는 다양한 변화 및 변형이 만들어질 수 있음이 자명할 것이다.

Claims (42)

  1. 하기 화학식을 갖는, 리포좀 약물 전달 매개체로 사용하기 위한 콘쥬게이트:
    (식 중, L 은 리포좀 지질 이중막 내로 삽입하기 적합한 소수성 부분이며, R1은 디티오벤질 부분에 공유 부착된 치료 약물을 나타내고, CH2R1기의 방향은 오르토 위치 및 파라 위치에서 선택된다).
  2. 제 1 항에 있어서, 치료 약물이 우레탄, 아민, 아미드, 카르보네이트, 티오-카르보네이트, 에테르 및 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 결합으로 공유 부착된 콘쥬게이트.
  3. 제 1 항에 있어서, L 이 콜레스테롤, 디아실글리세롤, 인지질 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  4. 제 1 항에 있어서, L 이 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 생성하는 디아실글리세롤 유도체인 콘쥬게이트:
    (식 중, R2및 R3은 탄소수 약 8 내지 약 24 의 탄화수소이다).
  5. 제 4 항에 있어서, R2및 R3이 탄소수 약 12 내지 약 22 의 탄화수소인 콘쥬게이트.
  6. 제 4 항에 있어서, R2및 R3이 동일한 길이의 탄화수소 사슬인 콘쥬게이트.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 약물이 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 아트로핀, 클로람부실, 메토트렉세이트, 미톡산트론 및 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  8. 제 1 항에 있어서, 치료 약물이 디티오벤질 부분에 공유 부착되어 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 형성하는 콘쥬게이트:
    (식 중, R4는 치료 약물의 잔기를 나타낸다).
  9. 제 8 항에 있어서, R4가 일차 또는 이차 아민 부분을 함유하는 치료 약물 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 우레탄 결합을 형성하는 콘쥬게이트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 치료 약물이 미토마이신 A, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  11. 제 8 항에 있어서, R4가 카르복실 함유 치료 약물의 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 에스테르 결합을 형성하는 콘쥬게이트.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 약물이 클로람부실 또는 메토트렉세이트인 콘쥬게이트.
  13. 제 8 항에 있어서, R4가 히드록실 부분을 함유하는 치료 약물 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 카르보네이트 결합을 형성하는 콘쥬게이트.
  14. 제 13 항에 있어서, 치료 약물이 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 미톡산트론 및 아트로핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  15. 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 함유하는 소포형성 지질로 구성되는 리포좀을 함유하는 리포좀 조성물로:
    (식 중, L 은 리포좀 지질 이중막 내로 삽입하기 적합한 소수성 부분이며, R1은 디티오벤질 부분에 공유 부착된 치료 약물을 나타내고, CH2R1기의 방향은 오르토 위치 및 파라 위치에서 선택된다),
    상기 치료 약물이 생리적 조건 또는 인공적으로 유도된 조건에 반응하여 생체 내에서 콘쥬게이트로부터 방출되는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 치료 약물이 우레탄, 아민, 아미드, 카르보네이트, 티오-카르보네이트, 에테르 및 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 결합으로디티오벤질 부분에 공유 부착되는 콘쥬게이트.
  17. 제 15 항에 있어서, L 이 콜레스테롤, 디아실글리세롤, 인지질 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  18. 제 15 항에 있어서, L 이 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 생성하는 디아실글리세롤인 콘쥬게이트:
    (식 중, R2및 R3은 탄소수 약 8 내지 약 24 의 탄화수소이다).
  19. 제 18 항에 있어서, R2및 R3이 탄소수 약 12 내지 약 22 의 탄화수소인 콘쥬게이트.
  20. 제 18 항에 있어서, R2및 R3이 동일한 길이의 탄화수소 사슬인 콘쥬게이트.
  21. 제 15 항에 있어서, 상기 약물이 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 아트로핀, 클로람부실, 메토트렉세이트, 미톡산트론 및 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  22. 제 15 항에 있어서, 치료 약물이 디티오벤질 부분에 공유 결합되어 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트를 형성하는 콘쥬게이트:
    (식 중, R4는 치료 약물의 잔기를 나타낸다).
  23. 제 22 항에 있어서, R4가 일차 또는 이차 아민 부분을 함유하는 치료 약물 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 우레탄 결합을 형성하는 콘쥬게이트.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 치료 약물이 미토마이신 A, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트
  25. 제 22 항에 있어서, R4가 카르복실 함유 치료 약물의 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 에스테르 결합을 형성하는 콘쥬게이트.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 약물이 클로람부실 또는 메토트렉세이트인 콘쥬게이트.
  27. 제 22 항에 있어서, R4가 히드록실 부분을 함유하는 치료 약물 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 카르보네이트 결합을 형성하는 콘쥬게이트.
  28. 제 27 항에 있어서, 치료 약물이 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 미톡산트론 및 아트로핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트.
  29. 소포형성 지질 및 약 1 내지 약 30 몰 퍼센트의 하기 화학식을 갖는 콘쥬게이트로 구성되는 리포좀을 제조하는 것을 포함하는, 리포좀 중 약물 보유 방법으로:
    (식 중, L 은 리포좀 지질 이중막 내로 삽입하기 적합한 소수성 부분이며, R1은 디티오벤질 부분에 공유 부착된 치료 약물을 나타내고, CH2R1기의 방향은 오르토 위치 및 파라 위치에서 선택된다),
    상기 제조가 생리적 조건 또는 인공적으로 유도된 조건에 반응하여 콘쥬게이트로부터 방출될 때까지 약물을 리포좀 중에 보유하는 데 효과적인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 제조가 우레탄, 아민, 아미드, 카르보네이트, 티오-카르보네이트, 에테르 및 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 결합으로 치료 약물이 공유 부착된 콘쥬게이트의 제조를 포함하는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 제조가 L 이 콜레스테롤, 디아실글리세롤, 인지질 및 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 콘쥬게이트의 제조를 포함하는 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 상기 제조가 L 이 하기 화학식의 콘쥬게이트를 생성하는 디아실글리세롤인 콘쥬게이트의 제조를 포함하는 방법:
    (식 중, R2및 R3은 탄소수 약 8 내지 약 24 의 탄화수소이다).
  33. 제 18 항에 있어서, R2및 R3이 탄소수 약 12 내지 약 22 의 탄화수소인 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, R2및 R3이 동일한 길이의 탄화수소 사슬인 콘쥬게이트.
  35. 제 29 항에 있어서, 상기 제조가 미토마이신 C, 미토마이신 A, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노루비신, 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴, 퀴니딘, 아트로핀, 클로람부실, 메토트렉세이트, 미톡산트론 및 5-플루오로우라실로 구성된 군으로부터 선택되는 약물을 함유하는 콘쥬게이트의 제조를 포함하는 방법.
  36. 제 29 항에 있어서, 상기 제조가 디티오벤질 부분에 공유 결합되어 하기 화학식의 콘쥬게이트를 형성하는 치료 약물을 함유하는 콘쥬게이트의 제조를 포함하는 방법:
    (식 중, R4는 치료 약물의 잔기를 나타낸다).
  37. 제 36 항에 있어서, R4가 일차 또는 이차 아민 부분을 함유하는 치료 약물 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 우레탄 결합을 형성하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 치료 약물이 미토마이신 A, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서, R4가 카르복실 함유 치료 약물의 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 에스테르 결합을 형성하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 약물이 클로람부실 또는 메토트렉세이트인 방법.
  41. 제 36 항에 있어서, R4가 히드록실 부분을 함유하는 치료 약물 잔기여서 디티오벤질 및 치료 약물 간 카르보네이트 결합을 형성하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 치료 약물이 플루오로데옥시유리딘, 요오도데옥시유리딘, 에토포시드, AZT, 아시클로비어, 비다라빈, 아라비노실 시토신, 펜토스타틴,퀴니딘, 미톡산트론 및 아트로핀으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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Families Citing this family (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7422902B1 (en) * 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP1027033B1 (en) 1997-05-14 2009-07-22 The University Of British Columbia High efficiency encapsulation of nucleic acids in lipid vesicles
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
DK1173222T3 (da) * 1999-04-23 2007-01-29 Alza Corp Konjugat med en spaltelig binding til brug i et liposom
US7112337B2 (en) * 1999-04-23 2006-09-26 Alza Corporation Liposome composition for delivery of nucleic acid
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
US7094423B1 (en) * 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
HUP0303616A3 (en) 2001-03-26 2006-07-28 Alza Corp Mountain View Liposome composition for improved intracellular delivery of a therapeutic agent
DE60231868D1 (de) 2001-04-24 2009-05-20 Purdue Research Foundation Folat-mimetika und deren folatrezeptorbindende konjugate
JP2005516897A (ja) * 2001-11-07 2005-06-09 イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション 改善された粘膜のワクチン及びその使用方法
US7842498B2 (en) * 2001-11-08 2010-11-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Hydrophobic surface chip
US7211440B2 (en) 2002-03-08 2007-05-01 Wallac Oy Dissociative fluorescence enhancement assay
US6737524B2 (en) * 2002-03-25 2004-05-18 Paul K. Smith Activated polyethylene glycol compounds
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
EP3100719A3 (en) 2002-05-15 2017-02-22 California Pacific Medical Center Delivery of nucleic acid-like compounds
JP4814520B2 (ja) * 2002-05-15 2011-11-16 エンドサイト，インコーポレイテッド ビタミン−マイトマイシン結合体
WO2004050062A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute Artificial low-density lipoprotein carriers for transport of substances across the blood-brain barrier
PT1592457E (pt) 2003-01-27 2012-11-02 Endocyte Inc Conjugados de entrega farmacológica de ligação a recetores de vitaminas
CA2542099A1 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
CA2553426A1 (en) * 2004-01-15 2005-08-04 Alza Corporation Liposome composition for delivery of therapeutic agents
US7282590B2 (en) * 2004-02-12 2007-10-16 The Research Foundation Of State University Of New York Drug conjugates
US7931693B2 (en) * 2004-02-26 2011-04-26 Endosphere, Inc. Method and apparatus for reducing obesity
EP1734991A4 (en) * 2004-04-14 2012-10-24 Avirid Inc COMPOSITIONS COMPRISING MODIFIED NUCLEASES DIRECTED AGAINST VIRAL NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF USE FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF VIRAL DISEASES
ZA200609638B (en) * 2004-04-21 2008-02-27 Alza Corp Polymer conjugate releasable under mild thiolytic conditions
JP2007533750A (ja) * 2004-04-21 2007-11-22 アルザ コーポレイション 緩和なチオール分解条件下で遊離可能なポリマー結合体
US8288557B2 (en) * 2004-07-23 2012-10-16 Endocyte, Inc. Bivalent linkers and conjugates thereof
US20060058236A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-16 Hutchins Maria U Endogenously-formed conjugate of albumin
TW200612993A (en) * 2004-10-08 2006-05-01 Alza Corp Lipopolymer conjugates
US20060110441A1 (en) * 2004-10-28 2006-05-25 Harry Wong Lyophilized liposome formulations and method
JP5289935B2 (ja) * 2005-03-16 2013-09-11 エンドサイト，インコーポレイテッド プテロイン酸およびその結合体の合成と精製
KR20130113543A (ko) * 2005-08-19 2013-10-15 엔도사이트, 인코포레이티드 복수-약제 리간드 공액체
JP2009504783A (ja) * 2005-08-19 2009-02-05 エンドサイト，インコーポレイテッド ビンカアルカロイド、類似体および誘導体のリガンド結合体
AU2007275660B2 (en) * 2006-07-19 2012-08-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Preparations of phospholipids and pharmaceuticals containing 5-amino salicylic acid for the treatment of inflammatory bowel disease
US20100329664A1 (en) * 2007-01-23 2010-12-30 Lim Dae-Soon Shutter device for camera
WO2008101231A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Endocyte, Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease
JP5829793B2 (ja) * 2007-03-14 2015-12-09 エンドサイト・インコーポレイテッドＥｎｄｏｃｙｔｅ， Ｉｎｃ． 結合性リガンドが結合したツブリシンの薬剤送達結合体
ITRM20070327A1 (it) * 2007-06-11 2008-12-12 Univ Palermo Vettori colloidali a struttura poliamminoacidica per il rilascio orale di peptidi e proteine e relativo metodo di produzione.
WO2009002993A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
US9877965B2 (en) 2007-06-25 2018-01-30 Endocyte, Inc. Vitamin receptor drug delivery conjugates for treating inflammation
US20100210575A1 (en) * 2007-06-29 2010-08-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Structuring effect of cholesterol in peg-phospholipid micelles, drug delivery of amphotericin b, and combination antifungals
EP2180881A2 (en) * 2007-07-20 2010-05-05 Basf Se Vesicles comprising a transmembrane transport trigger system
MX2010004400A (es) 2007-10-23 2010-05-20 Nektar Therapeutics Polimeros de multiples brazos dirigidos a la hidroxiapatita y conjugados de estos.
US9187521B2 (en) 2007-10-25 2015-11-17 Endocyte, Inc. Tubulysins and processes for preparing
US9259398B1 (en) * 2007-11-26 2016-02-16 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Bioactive agent-loaded targeting micelles
ES2694481T3 (es) * 2008-05-23 2018-12-21 The University Of British Columbia Fármacos modificados para su uso en nanopartículas liposomales
US9393227B2 (en) * 2009-02-04 2016-07-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoscale platinum compounds and methods of use thereof
EA022699B1 (ru) 2009-05-27 2016-02-29 Селекта Байосайенсиз, Инк. НАЦЕЛЕННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ НАНОНОСИТЕЛИ С pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СРЕДСТВ
EA201592264A1 (ru) * 2009-08-26 2016-08-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Композиции, которые индуцируют хелперное действие т-клеток
EP2496262A2 (en) * 2009-11-02 2012-09-12 Université de Genève Stabilized protein formulations and use thereof
ME03091B (me) 2009-12-01 2019-01-20 Translate Bio Inc Isporuka irnk za povećanje ekspresije proteina i enzima u humanim genetskim oboljenjima
US20110237686A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Cerulean Pharma Inc Formulations and methods of use
DE102010042338A1 (de) * 2010-10-12 2012-04-12 Bayer Technology Services Gmbh Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs mit kontrollierter Freisetzung des Wirkstoffes
US9994443B2 (en) 2010-11-05 2018-06-12 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
US20120301498A1 (en) 2011-04-29 2012-11-29 Selecta Biosciences, Inc. Controlled release of immunosuppressants from synthetic nanocarriers
EP3354644A1 (en) 2011-06-08 2018-08-01 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
EP2717893B1 (en) 2011-06-08 2019-05-08 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mrna delivery
EP2606884A1 (en) 2011-12-21 2013-06-26 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Inhibitors of notch signaling pathway and use thereof in treatment of cancers
US10080805B2 (en) 2012-02-24 2018-09-25 Purdue Research Foundation Cholecystokinin B receptor targeting for imaging and therapy
US20140080175A1 (en) 2012-03-29 2014-03-20 Endocyte, Inc. Processes for preparing tubulysin derivatives and conjugates thereof
ES2858523T3 (es) 2012-03-29 2021-09-30 Translate Bio Inc Nanopartículas neutras derivadas de lípidos
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
CA2887727A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Endocyte, Inc. Drug delivery conjugates containing unnatural amino acids and methods for using
WO2014152966A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger rna
CN105142676B (zh) 2013-03-14 2022-06-28 夏尔人类遗传性治疗公司 Cftr mrna组合物以及相关方法和用途
US9827552B2 (en) 2013-07-17 2017-11-28 Clemson University Functionalized lipid modification of solid phase surfaces for use in chromatography
KR101988552B1 (ko) 2013-10-22 2019-09-25 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 전달을 위한 지질 제형
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
MX2016005239A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Tratamiento con acido ribonucleico mensajero para la fenilcetonuria.
EA201691696A1 (ru) 2014-04-25 2017-03-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы очистки матричной рнк
ES2750686T3 (es) 2014-05-30 2020-03-26 Translate Bio Inc Lípidos biodegradables para la administración de ácidos nucleicos
WO2015191563A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Lipomedix Pharmaceuticals Ltd. Combination chemotherapy comprising a liposomal prodrug of mitomycin c
ES2964588T3 (es) 2014-06-24 2024-04-08 Translate Bio Inc Composiciones enriquecidas estereoquímicamente para la administración de ácidos nucleicos
AU2016233143B2 (en) 2015-03-17 2021-03-25 Alberto Gabizon Methods for the treatment of bladder cancer
CN106519221B (zh) * 2015-09-10 2019-04-26 中国科学院高能物理研究所 一种聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物、其制备方法及包含该共聚物的两亲性siRNA载体
CN106519211B (zh) * 2015-09-10 2018-10-09 中国科学院高能物理研究所 一种两亲性聚合物以及由其形成的磁性胶束纳米载体和其用途
CN105866311B (zh) * 2016-05-25 2017-05-31 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 测定鸡肉中抗病毒药物残留的uplc‑ms/ms方法
GB2552301A (en) * 2016-07-11 2018-01-24 Evox Therapeutics Ltd Metabolic drug loading of EVs
WO2018089481A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Mallinckrodt Llc Mitomycin c prodrug liposome formulations and uses thereof
MA47603A (fr) 2017-02-27 2020-01-01 Translate Bio Inc Nouvel arnm cftr à codons optimisés
US11173190B2 (en) 2017-05-16 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mRNA encoding CFTR
WO2019016208A1 (en) * 2017-07-17 2019-01-24 Technische Universiteit Eindhoven APPLICABLE CHEMICAL COMPOSITION COMPRISING AN AGENT CONJUGATED TO A HYDROPHOBIC PART AND A SUPPORT
EP4257198A3 (en) 2017-08-22 2023-10-18 Dynavax Technologies Corporation Alkyl chain modified imidazoquinoline derivatives as tlr7/8 agonists and uses thereof
JP2021503005A (ja) 2017-11-14 2021-02-04 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション Ｔｌｒ７／８アゴニスト化合物の切断可能なコンジュゲート、その調製方法および使用
US11174500B2 (en) 2018-08-24 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
CN113453668A (zh) * 2019-01-11 2021-09-28 利普麦迪克斯制药有限公司 包含丝裂霉素c的脂质体前药的脂质体组合物及其制备方法
EA202192394A1 (ru) 2019-04-10 2022-01-24 Селлестия Биотек Аг Ингибиторы пути передачи сигнала notch и их применение для лечения рака
EP4255409A1 (en) 2020-12-07 2023-10-11 Cellestia Biotech AG Pharmaceutical combinations for treating cancer
EP4008324A1 (en) 2020-12-07 2022-06-08 Cellestia Biotech AG Combinations comprising an inhibitor of an anti-apoptotic protein, such as bcl-2, bcl-xl, bclw or mcl-1, and a notch signaling pathway inhibitor for treating cancer
WO2022253794A2 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Cellestia Biotech Ag Method for treating an autoimmune and inflammatory disease
WO2023079132A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Cellestia Biotech Ag Pharmaceutical combinations for treating cancer
EP4223292A1 (en) 2022-02-07 2023-08-09 Cellestia Biotech AG Pharmaceutical combinations for treating cancer

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5240B2 (ko) * 1973-12-17 1977-01-05
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5059421A (en) 1985-07-26 1991-10-22 The Liposome Company, Inc. Preparation of targeted liposome systems of a defined size distribution
JPH0615532B2 (ja) * 1986-02-03 1994-03-02 テルモ株式会社 ５−フルオロウラシル誘導体およびこれを含有する医薬製剤
US4766105A (en) * 1986-10-31 1988-08-23 Shell Oil Company Ethylene oxide catalyst and process for preparing the catalyst
JPH01113391A (ja) * 1987-10-24 1989-05-02 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd マイトマイシン誘導体
US4952394A (en) * 1987-11-23 1990-08-28 Bristol-Myers Company Drug-monoclonal antibody conjugates
ZA886812B (en) * 1987-11-23 1989-07-26 Bristol Myers Co Anti-tumor prodrugs
US5103556A (en) 1988-05-05 1992-04-14 Circon Corporation Method of manufacturing an electrohydraulic probe
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
TW211015B (ko) * 1990-01-11 1993-08-11 Nippon Shinyaku Co Ltd
US5169934A (en) * 1990-05-14 1992-12-08 Anergen, Inc. Intracellularly cleavable compounds
WO1993018751A1 (en) 1992-03-23 1993-09-30 Georgetown University Liposome encapsulated taxol and a method of using the same
JP2813511B2 (ja) * 1992-06-10 1998-10-22 大日本スクリーン製造株式会社 ロールコータによる基板表面への塗液塗布方法
AU5092893A (en) 1992-09-02 1994-03-29 Georgetown University Method of encapsulating anthracycline glycosides in liposomes
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5820873A (en) * 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
CA2210500A1 (en) * 1995-01-16 1996-07-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Therapeutic compound - fatty acid conjugates
WO1996022302A1 (en) 1995-01-20 1996-07-25 Florida State University Sex-specific dna probe for parrots, methods and kits
JPH09268190A (ja) * 1996-04-02 1997-10-14 Sagami Chem Res Center マイトマイシンｃ誘導体及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤
TW520297B (en) * 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
EP0932390A1 (en) * 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
JPH1160499A (ja) 1997-08-22 1999-03-02 Hiroshi Maeda 抗腫瘍剤
SE513149C2 (sv) * 1997-12-05 2000-07-17 Katarina Edwards Läkemedelsdistributionssystem med tvåstegsmålsökning, till specifika celler eller vävnad och till dess cellkärna
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
ATE365563T1 (de) * 1998-04-28 2007-07-15 Applied Research Systems Verfahren zur schrittweise bindung von polyethylenglykol (peg) an polypeptide
DK1173222T3 (da) * 1999-04-23 2007-01-29 Alza Corp Konjugat med en spaltelig binding til brug i et liposom
US7238368B2 (en) 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US7112337B2 (en) 1999-04-23 2006-09-26 Alza Corporation Liposome composition for delivery of nucleic acid
EP1173221A2 (en) 1999-04-23 2002-01-23 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US7303760B2 (en) 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
WO2001026625A2 (en) 1999-10-08 2001-04-19 Alza Corp Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery
WO2002026265A2 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US7260330B2 (en) * 2002-11-04 2007-08-21 The Boeing Company Optical communication system using correlation receiver

Also Published As

Publication number Publication date
US20020128195A1 (en) 2002-09-12
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US6984396B2 (en) 2006-01-10
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CN1399561A (zh) 2003-02-26
JP4558952B2 (ja) 2010-10-06
EP1880736A1 (en) 2008-01-23
KR100669053B1 (ko) 2007-01-15
ZA200108726B (en) 2003-03-05
US6342244B1 (en) 2002-01-29
ATE340592T1 (de) 2006-10-15
AU4657700A (en) 2000-11-10
WO2000064484A2 (en) 2000-11-02
AU769425B2 (en) 2004-01-29
EP1173222A2 (en) 2002-01-23
US7608687B2 (en) 2009-10-27

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