ES2272280T3 - Conjugado que presenta un enlace escindible para uso en un lipososma. - Google Patents

Conjugado que presenta un enlace escindible para uso en un lipososma. Download PDF

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Abstract

Conjugado para uso en un vehículo para suministro de fármaco liposómico, presentando el conjugado la fórmula estructural general: en la que L es un resto de diasteroilglicerol adecuado para la incorporación en una bicapa lipídica liposómica, R1 representa un resto de mitomicina A o mitomicina C unido covalentemente al resto de ditiobencilo mediante un grupo uretánico, y en la que la orientación del grupo CH2R1 se selecciona a partir de la posición orto y de la posición para.

Description

Conjugado que presenta un enlace escindible para uso en un liposoma.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un conjugado que comprende un resto hidrófobo, un enlace escindible, y un agente terapéutico. Más particularmente, la presente invención se refiere a conjugados que comprenden un lípido, un enlace escindible y un fármaco incorporado en una formulación liposómica. Los conjugados son escindibles en condiciones tiolíticas suaves in vivo para la liberación del fármaco en un estado no modificado.
Antecedentes de la invención
Los liposomas son vesículas lipídicas cerradas usadas para una variedad de fines terapéuticos, y en particular para portar agentes terapéuticos hasta una región diana o a una célula mediante administración sistémica de liposomas. Los liposomas que tienen una superficie injertada con cadenas de polímero soluble en agua, biocompatible, en particular polietilenglicol, se han convertido en portadores farmacéuticos importantes. Estos liposomas ofrecen un tiempo de vida prolongado de circulación en la sangre, con respecto a liposomas que carecen del revestimiento polimérico. Las cadenas poliméricas injertadas protegen o enmascaran al liposoma, minimizando así la interacción no específica mediante proteínas plasmáticas. Esto, a su vez, ralentiza la velocidad a la que se aclaran o eliminan in vivo los liposomas, puesto que el liposoma circula sin ser reconocido por macrófagos y otras células del sistema reticuloendotelial. Además, debido al denominado efecto de retención y permeabilidad potenciado, los liposomas tienden a acumularse en sitios de la vasculatura dañada o expandida, por ejemplo, tumores, sitios de inflamación.
A menudo se desea un tiempo prolongado de circulación en sangre para permitir que los liposomas administrados sistémicamente alcancen una región, célula o sitio diana. Por ejemplo, se prefiere un tiempo de vida de circulación en sangre mayor que aproximadamente 12 horas para liposomaterapia en una región tumoral, ya que los liposomas se deben de distribuir sistémicamente y se deben entonces extravasar a la región tumoral.
Un problema asociado con la terapia a base de liposomas es la retención del fármaco dentro del liposoma durante un tiempo suficiente para la distribución sistémica. Este problema es de particular importancia cuando se administran liposomas de larga circulación, es decir, liposomas con cadenas poliméricas injertadas. Relativamente pocos fármacos se pueden cargar y retener eficazmente durante una duración prolongada, y luego ser liberados.
Un enfoque para mejorar la retención del fármaco es seleccionar componentes de bicapas lipídicas que hacen a la bicapa menos permeable al fármaco atrapado. Sin embargo, la bicapa lipídica debe de ser suficientemente fluida de forma que se libere el fármaco, por ejemplo mediante transporte a través de la bicapa lipídica, o mediante ruptura de la vesícula lipídica, en el momento deseado, por ejemplo, tras la localización en un sitio diana o una biodistribución suficiente.
Otro enfoque para mejorar la retención del fármaco es unir covalentemente el fármaco a un lípido en la bicapa lipídica liposómica (Waalkes, et al., Selective Cancer Therap., 6:15-22 (1990); Asai, et al., Biol. Pharm. Bull., 21:766-771 (1998)).
Sería deseable formular una composición liposómica que tenga un tiempo de vida de circulación en sangre prolongado, y que sea capaz de retener un fármaco atrapado durante un tiempo deseado, pero que aún sea capaz de liberar el fármaco cuando se necesite. Un enfoque descrito en la técnica para lograr estas características ha sido formular un liposoma a partir de un lípido no formador de vesículas, tal como dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), y un lípido estabilizador de la bicapa lipídica, tal como metoxi-polietilenglicol-diestearoilfosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE) (Kirpotin, D., et al., FEBS Lett. 388:115-118 (1996)). En este enfoque, el mPEG se une a la DSPE vía un enlace escindible. La escisión del enlace desestabiliza el liposoma para una liberación rápida de los contenidos del liposoma.
Se han descrito enlaces lábiles para enlazar cadenas poliméricas de PEG a liposomas (patentes U.S. nº 5.013.556, nº 5.891.468; documento WO 98/16201). El enlace lábil en estas composiciones liposómicas libera las cadenas poliméricas de PEG de los liposomas, por ejemplo, para exponer un ligando seleccionador de dianas, unido a la superficie, o para accionar la fusión del liposoma con una célula diana.
Sin embargo, hasta la fecha, no se ha logrado un medio para liberar cadenas poliméricas a partir de liposomas en condiciones adecuadas para su uso in vivo. Por ejemplo, algunos enlaces liberables requieren un potente agente tiolítico, tal como 1,4-ditiotreitol, para lograr la liberación de las cadenas poliméricas. Este agente reductor es inaceptable para uso in vivo. Otro problema con los enlaces liberables conocidos que unen PEG a un lípido liposómico es que la escisión del enlace liberable genera un lípido modificado no natural e indeseable. En consecuencia, existe la necesidad en la técnica de un enlace escindible que sea adecuado para uso in vivo, y que, después de la escisión, produzca el fármaco o el agente terapéutico en su forma natural, no modificada.
En el documento EP 0317957, Senter describe un profármaco de fármaco-anticuerpo, en el que el anticuerpo está enlazado a un fármaco usando un ligador de carbonato o carbamato de bencilo disulfurado, y la reducción del enlace de disulfuro efectúa la liberación del fármaco. La enseñanza de Senter es específica para la escisión de una molécula de profármaco de complejo de fármaco-ligando, bajo la acción de agentes reductores tales como 1,4-ditiotreitol, glutationa, NADH y NADPH. El comportamiento de tal ligador, cuando se incorpora en un liposoma que circula a través del torrente sanguíneo, no se puede predecir basándose en la descripción de Senter. Por ejemplo, en los liposomas, el ligador entre el polímero y el lípido estaría enterrado o enmascarado en el revestimiento de PEG. Es relativamente fácil prever la liberación de un profármaco de complejo de fármaco-ligando individual como en Senter; sin embargo, la liberación del ligador es menos predecible cuando forma parte de una barrera densamente empaquetada como en un revestimiento de la superficie del liposoma con cadenas poliméricas.
Como se ha señalado anteriormente, un tiempo prolongado de circulación en la sangre es una característica deseable de los liposomas revestidos con PEG, prefiriéndose tiempos de vida de circulación en sangre mayores que aproximadamente 12 horas para la terapia liposómica en una región tumoral. La descripción de Senter no proporciona ninguna guía con respecto a la cinética de liberación de un conjugado incorporado en un liposoma bajo condiciones de reducción endógenas, tales como durante la circulación sanguínea del liposoma.
El documento WO 97/36904A describe un derivado de mitomicina C para inhibir tirosina quinasas no receptoras, que comprende mitomicina C derivatizado con un grupo docosahexanoilo.
El documento EP 0510197A describe una emulsión grasa que comprende mitomicina C derivatizada con un grupo hidrocarbonado de C_{3-25}, mediante un grupo enlazante que contiene un carbonilo.
El documento JP 01 113391 describe conjugados de mitomicina C y un ácido graso.
El documento FR 2254336A describe un derivado de mitomicina C que comprende mitomicina C derivatizada con un grupo hidrocarbonato de C_{9-29}, que puede estar sustituido con hidroxilo, mediante un grupo enlazante que contiene carbonilo.
Sumario de la invención
En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar una composición liposómica en la que el fármaco es retenido durante un período de tiempo deseado para la liberación a partir del liposoma.
Es el objeto de la invención proporcionar un conjugado para uso en un liposoma, en el que el conjugado comprende un resto hidrófobo para anclarse en la bicapa lipídica, un enlace escindible en respuesta a las condiciones tiolíticas suaves, y un agente terapéutico.
La invención se refiere a un conjugado para uso en un vehículo de suministro liposómico de fármacos, presentando el conjugado la fórmula estructural general:
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en la que L es un resto de diasteroilglicerol, adecuado para la incorporación en una bicapa lipídica liposómica, R^{1} representa un resto de mitomicina A o mitomicina C unido covalentemente al resto de ditiobencilo mediante un grupo uretano, y en la que la orientación del grupo CH_{2}R^{1} se selecciona a partir de la posición orto y de la posición para.
La mitomicina A y la mitomicina C contienen un resto de amina primara o secundaria, formando de ese modo un enlace uretánico entre el ditiobencilo y el fármaco terapéutico.
En otro aspecto, la invención incluye una composición liposómica, que comprende liposomas compuestos de lípidos formadores de vesículas que incluyen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30 por ciento en moles de un conjugado que tiene la estructura general descrita anteriormente. El fármaco terapéutico se libera del conjugado in vivo en respuesta a un estado fisiológico o a un estado inducido artificialmente.
En aún otro aspecto, la invención incluye un método para retener un fármaco en un liposoma, que comprende preparar liposomas que comprenden un lípido formador de vesículas y entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 por ciento en moles de un conjugado descrito anteriormente. Los liposomas retienen eficazmente el fármaco en los liposomas hasta su liberación a partir del conjugado, en respuesta a un estado fisiológico o a un estado inducido artificialmente.
Estos y otros objetos y características de la invención se apreciarán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada de la invención, en conjunción con los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un esquema de reacción sintética para la preparación del alcohol para-diacildiglicerolditiobencí-
lico para la reacción posterior con fármacos que contienen grupos amina, hidroxi o carboxilo;
la Fig. 2A muestra un esquema de reacción general para la unión de un fármaco que contiene un grupo amino a un carbonato de diacildiglicerolditiobencilo;
la Fig. 2B muestra los productos después de la escisión tiolítica del conjugado en la Fig. 2A;
la Fig. 6A muestra un esquema de reacción sintética para la preparación del conjugado de diacildiglicerol-ditiobencil-mitomicina C;
la Fig. 6B muestra los productos después de la escisión tiolítica del conjugado en la Fig. 6A;
las Figs. 9A-9C muestran la estructura de tres conjugados de lípido-ditiobencil-mitomicina C, para-diestearoil-DTB-mitomicina B (Fig. 9A), para-dipalmitoil-DTB-mitomicina C (Fig. 9B) y orto-dipalmitoil-DTB-mitomicina C (Fig. 9C);
las Figs. 10A-10B son cromatogramas de HPLC para liposomas que comprenden HSPC/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (Fig. 10A) y HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (Fig. 10B), en las que cada figura muestra una serie de cromatogramas como función del tiempo de incubación de los liposomas en presencia de cisteína;
la Fig. 11 es una gráfica que muestra el porcentaje de mitomicina C liberada a partir de liposomas que comprenden HSPC/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (diamantes en negro) y HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en negro), como función del tiempo de incubación en presencia de cisteína;
las Figs. 12A-12B son gráficas que muestran el porcentaje de mitomicina C liberada a partir de liposomas que comprenden HSPC/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (Fig. 12A) y HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (Fig. 12B) como función del tiempo de incubación en presencia de cisteína, a concentraciones de 150 \muM (símbolos en negro) y a 1,5 mM (símbolos en blanco);
la Fig. 13 es una gráfica de velocidad de crecimiento de células M109, expresada como un porcentaje basado en el crecimiento de células M109 en ausencia de fármaco y cisteína, como función de la cantidad de mitomicina C, en nM, para mitomicina C libre (triángulos en blanco), liposomas que comprenden HSPC/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (cuadrados en negro), y liposomas que comprenden HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en blanco);
la Fig. 14A es una gráfica de la velocidad de crecimiento de células M109, expresada como un porcentaje basado en el crecimiento de células M109 en ausencia de fármaco o cisteína, como función de la concentración de mitomicina C en nM. Se muestran las células tratadas con mitomicina C en forma libre (triángulos en blanco), y con mitomicina en forma libre más 1000 \muM de cisteína (triángulos en negro). También se muestran las células tratadas con la formulación liposómica que comprende HSPC/PEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en blanco), y con la formulación liposómica con cisteína adicional añadida a concentraciones de 150 \muM (diamantes en blanco), 500 \muM (círculos en negro) y 1000 \muM (cuadrados en blanco);
la Fig. 14B es una gráfica de la velocidad de crecimiento de células M109, expresada como un porcentaje basado en el crecimiento de células M109 en ausencia de fármaco o de cisteína, como función de la concentración de mitomicina C en nM. Se muestran las células tratadas con mitomicina C en forma libre (triángulos en blanco), y con mitomicina C en forma libre más 1000 \muM de cisteína (triángulos en negro). También se muestran las células tratadas con la formulación liposómica que comprende HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en blanco), y con la formulación liposómica con cisteína adicional añadida a concentraciones de 150 \muM (diamantes en blanco), 500 \muM (círculos en negro) y 1000 \muM (cuadrados en blanco);
la Fig. 15 es una gráfica que muestra el incremento en porcentaje de la citotoxicidad (según se determina mediante IC50_{sin \ ciste\text{í}na}/IC50_{ciste\text{í}na)} x 100)) de mitomicina C libre (cuadrados en negro), mitomicina C asociada con liposomas que comprenden HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en negro), y liposomas que comprenden HSPC/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (triángulos en blanco), de células M109 in vitro a diversas concentraciones de cisteína;
la Fig. 16A es una gráfica que muestra la concentración de mitomicina C en la sangre de ratas como función del tiempo, en horas, tras la inyección intravenosa de mitomicina C libre (cuadrados en blanco), liposomas que comprenden HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (diamantes en negro), y liposomas que comprenden HSPC/ mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en negro); y
la Fig. 16B es una gráfica que muestra el porcentaje de dosis inyectada que queda en la sangre de ratas como función del tiempo, en horas, tras la inyección intravenosa de mitomicina C libre (cuadrados en blanco), liposomas que comprenden HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (diamantes en negro), y liposomas que comprenden HSPC/mPEG-DSPE/lípido-DTB-mitomicina C (círculos en negro).
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
En la presente memoria se usan las siguientes abreviaturas: PEG, poli(etilenglicol); mPEG, metoxi-PEG; DTB, ditiobencilo; DSPE, diestearoilfosfatidiletanolamina; HSPC, fosfatidilcolina de soja hidrogenada; MMC, mitomicina C.
II. Composición del conjugado y método de preparación
En un aspecto, la invención incluye un conjugado en la forma:
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en la que L es un resto diasteroilglicerol, adecuado para la incorporación en una bicapa lipídica liposómica, R^{1} representa un resto de mitomicina A o de mitomicina C unido covalentemente al resto de ditiobencilo, y en el que la orientación del grupo CH_{2}R^{1} se selecciona a partir de la posición orto y de la posición para. El resto hidrófobo, L, es un diacilglicerol.
En el conjugado, se une un fármaco terapéutico al resto de ditiobencilo mediante un enlace covalente, formando de ese modo un resto farmacéutico, representado por R^{1} en la estructura.
El fármaco terapéutico está unido covalentemente al resto de ditiobencilo mediante un enlace uretánico.
El enlace uretánico tiene la forma O(C=O)NH-R^{4} o O(C=O)N=R^{4}, en la que R^{4} representa el resto de fármaco terapéutico. De este modo, la mitomicina C o la mitomicina A se hace reaccionar para formar un enlace uretánico con el resto amínico en el fármaco.
Los conjugados se pueden representar generalmente mediante la siguiente estructura:
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en la que R^{4} representa un resto del fármaco terapéutico.
La Fig. 1 muestra un esquema de reacción sintética para la preparación de conjugados ejemplares según la invención. En esta realización, la síntesis de un compuesto intermedio, el para-diacildiglicerolditiobenzalcohol (Compuesto IV), se prepara para la reacción posterior con un fármaco terapéutico seleccionado. El Compuesto IV se prepara, como se describe en el Ejemplo 1, haciendo reaccionar 3-mercapto-1,2-propanodiol (Compuesto I) con peróxido de hidrógeno para formar rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiol) (Compuesto II). El rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiol) se acila con un resto hidrófobo R.
El Ejemplo 1 detalla el procedimiento de reacción en el que R es ácido esteárico.
La acilación del Compuesto II produce rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiestearoilo) (Compuesto III), que se hace reaccionar con cloruro de sulfurilo y 4-mercaptobenzalcohol para formar el producto intermedio deseado, el para-diacildiglicerol-ditiobenzalcohol (Compuesto IV).
El Compuesto IV se hace reaccionar fácilmente con un fármaco que contiene un resto de amina reactivo (R'-NH_{2}) para producir un conjugado de lípido-DTB-fármaco, en el que el fármaco se une al DTB mediante un enlace uretánico (Compuesto VI).
La invención usa fármacos que tienen un resto amina (NH o NH_{2}) adecuado para la reacción. Como se utiliza en la presente memoria, "adecuado para la reacción" implica que el fármaco tiene un resto amínico capaz de reaccionar con el resto de ditiobencilo, en forma de, por ejemplo, alcohol ditiobencílico. El fármaco puede ser mitomicina C, que tiene una amina reactiva (grupo aziridina). El otro fármaco ejemplar es mitomicina A.
El Ejemplo 1 también detalla las condiciones de reacción para la preparación del orto-diacildiglicerolditiobenzal-
cohol, que puede servir como un compuesto intermedio para formar el conjugado.
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Las Figs. 2A-2B muestran la preparación de un conjugado de lípido-DTB-fármaco (Fig. 2A), y la escisión tiolítica del conjugado en presencia de un agente reductor (Fig. 2B). Como se muestra en la Fig. 2A, el Compuesto VII de la Fig. 1, en el que el resto hidrófobo R deriva de un ácido graso R''(CO)OH, tal como ácido esteárico (CH_{3}(CH_{2})_{16}
CO_{2}H), se hace reaccionar con un fármaco que contiene una amina, H_{2}N-fármaco, en presencia de fosgeno (COCl_{2}). Esta reacción produce el conjugado de lípido-DTB-fármaco ilustrado en la Fig. 2A. El conjugado, al exponerlo a condiciones reductoras, es decir, a un agente reductor tal como cisteína o glutationa, se descompone para producir los productos mostrados en la Fig. 2B. Como se muestra, la escisión tiolítica del conjugado da como resultado la regeneración del fármaco en un estado no modificado, natural. Esto es una característica deseable, puesto que, como se mostrará más abajo, el fármaco en el conjugado se puede incorporar fácilmente en liposomas para la administración in vivo a un sujeto. Además, el fármaco en forma de conjugado no es tóxico, como se mostrará también más abajo. Tras la administración, y con la exposición a agentes reductores endógenos, o con la exposición a un agente reductor exógeno, el conjugado se descompone para producir el fármaco en su estado natural, y con actividad biológica.
La Fig. 6A muestra la síntesis de un conjugado según una realización de la invención. En el esquema de reacción mostrado, la mitomicina C (Compuesto XVII, Fig. 6B), un fármaco que contiene un resto amínico reactivo, se hace reaccionar con para-diacil-diglicerol-ditiobenzalcohol (Compuesto IV) en presencia de fosgeno, para formar un conjugado de diacildiglicerol-ditiobencil-mitomicina C (Compuesto XVIII). En el Ejemplo 2 se proporcionan los detalles de la síntesis.
La Fig. 6B muestra la descomposición tiolítica de un conjugado de diacildiglicerol-DTB-mitomicina C. En presencia de un agente reductor, el conjugado se descompone para regenerar mitomicina C (Compuesto XVII) y los otros productos mostrados.
Como se ha señalado anteriormente, el resto hidrófobo en el conjugado es un lípido de diacildiglicerol que tiene la estructura
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en la que R^{2} y R^{3} son hidrocarburos que tienen 17 átomos de carbono.
En estudios adicionales realizados para apoyar la invención, descritos más abajo, se usó el conjugado preparado como se describe en la Fig. 6A, Compuesto XVII, para-diestearoil-DTB-mitomicina C. Para una facilidad de referencia, este conjugado se muestra en la Fig. 9A.
La Fig. 9B muestra un conjugado de para-dipalmitoil-DTB-mitomicina C.
En la Fig. 9C se muestra el conjugado de orto-dipalmitoil-DTB-mitomicina C.
III. Preparación de liposomas que comprenden el conjugado
En otro aspecto, la invención incluye una composición liposómica compuesta de un lípido formador de vesículas y un conjugado como se describe anteriormente. Los liposomas son vesículas lipídicas cerradas usadas para una variedad de fines terapéuticos, y en particular, para portar agentes terapéuticos hasta una región o célula diana mediante administración sistémica de liposomas. En particular, son deseables los liposomas que tienen un revestimiento superficial de cadenas poliméricas hidrófilas, tales como polietilenglicol (PEG), como portadores farmacéuticos ya que estos liposomas ofrecen un tiempo de vida prolongado de la circulación en sangre con respecto a liposomas que carecen del revestimiento polimérico. El polímero actúa como una barrera para las proteínas de la sangre, evitando de ese modo la unión de la proteína y el reconocimiento de los liposomas para su captación y eliminación por macrófagos y otras células del sistema reticuloendotelial.
Los liposomas, según la invención, incluyen un conjugado en combinación con un lípido, que, en una realización, es un lípido formador de vesículas, y, opcionalmente, otros componentes de la bicapa. Los "lípidos formadores de vesículas" son lípidos que espontáneamente forman vesículas de bicapas en agua. Los lípidos formadores de vesículas tienen preferiblemente dos cadenas de hidrocarburos, típicamente cadenas acílicas, y un grupo de cabeza polar. Existe una variedad de lípidos sintéticos formadores de vesículas, y lípidos de origen natural formadores de vesículas conocidos en la técnica, en los que las dos cadenas hidrocarbonadas tienen típicamente desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono de longitud, y tienen varios grados de insaturación. Los ejemplos incluyen los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI), y esfingomielina (SM). Un lípido preferido para uso en la presente invención es fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC). Otra familia preferida de lípidos son los diacilgliceroles. Estos lípidos se pueden obtener comercialmente, o se preparan según métodos publicados.
El lípido formador de vesículas se puede seleccionar para lograr un grado de fluidez o de rigidez, para controlar la estabilidad del liposoma en el suero, y para controlar la velocidad de liberación de un agente atrapado en el liposoma. Los liposomas que tienen una bicapa lipídica más rígida, o una bicapa cristalina líquida, se pueden generar mediante incorporación de un lípido relativamente rígido, por ejemplo, un lípido que tiene una temperatura de transición de fases relativamente elevada, por ejemplo hasta aproximadamente 80ºC. Los lípidos rígidos, es decir, los saturados, contribuyen a una mayor rigidez de la membrana en la bicapa lipídica. También se sabe que otros componentes lipídicos, tal como colesterol, contribuyen a la rigidez de la membrana en las estructuras de bicapas lipídicas.
La fluidez del lípido se logra mediante incorporación de un lípido relativamente fluido, típicamente aquel que tiene una fase lipídica con una temperatura de transición de fases líquida a líquida-cristalina relativamente baja, por ejemplo, a la temperatura ambiente o por debajo de ella (aproximadamente 20-25ºC).
El liposoma también puede incluir otros componentes que se pueden incorporar en las bicapas lipídicas, tales como esteroles. Estos otros componentes tienen típicamente un resto hidrófobo en contacto con la región hidrófoba interior de la membrana bicapa, y tienen un resto de un grupo de cabeza polar orientado hacia la superficie polar exterior de la membrana.
Otro componente lipídico en los liposomas de la presente invención es un lípido formador de vesículas derivatizado con un polímero hidrófilo. En este componente lipídico, un lípido derivatizado da como resultado la formación de un revestimiento superficial de cadenas poliméricas hidrófilas tanto en las superficies de la bicapa lipídica interna como externa. Típicamente, en la composición lipídica, se incluye entre aproximadamente 1-20 por ciento en moles del lípido derivatizado.
Los polímeros hidrófilos adecuados para la derivatización con un lípido formador de vesículas incluyen polivinilpirrolidona, polivinilmetiléter, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, poli(metacrilato de hidroxipropilo), poli(acrilato de hidroxietilo), hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, y poliaspartamida. Los polímeros se pueden emplear como homopolímeros o como copolímeros de bloques o al azar.
Una cadena polimérica hidrófila preferida es polietilenglicol (PEG), preferiblemente como una cadena de PEG que tiene un peso molecular entre aproximadamente 500 hasta aproximadamente 10.000 Daltons, preferiblemente entre aproximadamente 1.000 hasta aproximadamente 5.000 Daltons. También se prefieren como polímeros hidrófilos los análogos terminados en metoxi o en etoxi de PEG. Estos polímeros están comercialmente disponibles en una variedad de tamaños poliméricos, por ejemplo desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 220.000 Daltons.
Los liposomas de la presente invención incluyen típicamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 por ciento en moles del conjugado de lípido-DTB-fármaco, preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 30 por ciento en moles, más preferiblemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 por ciento en moles. En estudios realizados para apoyar la invención, los liposomas, que comprenden el lípido formador de vesículas de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), diestearoilfosfatidiletanolamina derivatizada con metoxi-polietilenglicol (mPEG-DSPE), y el conjugado mostrado en la Fig. 9A, para-diestearoil-DTB-mitomicina C (Compuesto XVIII), se prepararon como se describió en los Ejemplos 4A-4B. Una de las formulaciones liposómicas incluyó colesterol (Ejemplo 4A), con los lípidos HSCP/colesterol/mPEG-DSPE/para-diestearoil-DTB-mitomicina C (Compuesto XVIII) presente en una relación molar de 60/30/5/5. Se preparó y se caracterizó (Ejemplo 4B) una segunda formulación, que no contenía colesterol. En esta formulación, los lípidos HSCP/mPEG-DSPE/para-diestearoil-DTB-mitomicina C (Compuesto XVII) estaban presentes en una relación molar de 90/5/5.
IV. Caracterización in vitro de liposomas que contienen un conjugado A. Liberación del fármaco in vitro
Los liposomas se prepararon como se describió en los Ejemplos 4A-4B, y se caracterizaron in vitro para determinar la velocidad de liberación de mitomicina C tras la exposición al agente reductor. Para los estudios in vitro, se indujeron condiciones reductoras mediante adición de cisteína, típicamente a una concentraciones de aproximadamente 150 \muM, al medio de ensayo. Se apreciará que las condiciones reductoras endógenas, in vivo, pueden ser suficientes para efectuar la descomposición tiolítica del conjugado de lípido-DTB-fármaco, para la liberación del fármaco. Se contempla además que las condiciones reductoras in vivo se pueden reducir artificialmente mediante administración de un agente reductor adecuado, tal como cisteína o glutationa.
Las formulaciones liposómicas, por ejemplo, HSPC/colesterol/mPEG-DSPE/conjugado Compuesto XVIII (en lo sucesivo la "formulación que contiene colesterol"), y HSPC/mPEG-DSPE/conjugado Compuesto XVIII (en lo sucesivo la "formulación liposómica libre de colesterol"), se incubaron a 37ºC en presencia de 150 \muM de cisteína durante 24 horas. Las muestras se extrajeron en puntos de tiempo seleccionados, y se analizaron mediante cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC), para cuantificar la cantidad de conjugado y de mitomicina C libre. Las condiciones de HPLC se describieron en el Ejemplo 5.
Las Figs. 10A-10B muestran cromatogramas de HPLC para dos formulaciones liposómicas. En la Fig. 10A, se muestran los resultados para la formulación liposómica libre de colesterol. En el tiempo cero, no existe mitomicina C libre detectable, y todo el fármaco medible está en forma del conjugado de lípido-DTB-fármaco que está unido a liposoma. A medida que aumenta el tiempo de incubación, la cantidad de mitomicina C liberada de los liposomas, y detectable en forma libre, aumenta, con una disminución correspondiente de la presencia de mitomicina C unida a conjugado.
La Fig. 10B muestra los resultados para la formulación liposómica que contiene colesterol. En la primera muestra tomada en el tiempo cero, no hay mitomicina C libre detectable. Después de 1 hora de incubación en 150 \muM de cisteína, se detectó una pequeña cantidad de fármaco libre, indicando la descomposición del conjugado de lípido-DTB-mitomicina, unido a liposoma. En comparación con la Fig. 10A, los liposomas que contienen colesterol produjeron una velocidad más lenta de la descomposición del conjugado y, en consecuencia, una liberación más lenta del fármaco.
La Fig. 11 es una gráfica que muestra el porcentaje de mitomicina C liberada a partir de las dos formulaciones liposómicas, según se determina a partir de los cromatogramas en las Figs. 10A-10B. Los liposomas exentos de colesterol (diamantes en negro) tuvieron una velocidad de liberación mayor que los liposomas que contenían colesterol (círculos en negro). Se liberó, a partir del conjugado unido a liposoma, más del 50% de la mitomicina tras 2 horas para la formulación libre de colesterol. Para ambas formulaciones, al finas del período de incubación de 24 horas, se liberó más del 80% del fármaco.
En otro estudio, las dos formulaciones liposómicas se incubaron en 1,5 mM de cisteína. El análisis se realizó como se describe en el Ejemplo 5, y los resultados se muestran en las Figs. 12A-12B. La Fig. 12A muestra el porcentaje de mitomicina C liberada a partir del conjugado de lípido-DTB-fármaco incorporado en los liposomas libres de colesterol (HSPC/PEG-DSPE/lípido/DTB-mitomicina C). También se muestra como comparación (diamantes en negro) el porcentaje de liberación durante la incubación con 150 \muM. Como se ve, la incubación a una concentración más elevada de agente reductor (1,5 mM, diamantes en blanco) provoca un incremento en la velocidad de descomposición del conjugado, y en la velocidad de liberación del fármaco.
La Fig. 12B muestra los resultados para la formulación liposómica que contiene colesterol. Los liposomas incubados en 1,5 mM (círculos en blanco) tienen una velocidad de descomposición significativamente mayor que los mismos liposomas incubados en 150 \muM de cisteína (círculos en negro).
B. Citotoxicidad in vitro
La citotoxicidad in vitro de los liposomas que contienen el conjugado de lípido-DTB-mitomicina C (Compuesto XVIII) se evaluó usando células M-109, una estirpe de carcinoma pulmonar de ratón. Como se describe en el Ejemplo 6, las células M109 se incubaron en presencia de mitomicina C libre, o en presencia de liposomas que contienen el conjugado de diestearoil-DTB-mitomicina C. Se estudiaron los liposomas preparados como se describe en los Ejemplos 4A-4B, con las relaciones molares especificadas en el Ejemplo 6A. Se añadió cisteína a concentraciones de 150 \muM, 500 \muM y 1000 \muM, a algunas de las células de ensayo, para efectuar la descomposición tiolítica del conjugado, y la liberación de mitomicina C.
Los valores de IC50 se tomaron como la concentración del fármaco que provocó una inhibición del 50% de la ve-
locidad de crecimiento de control (IC_{50}), como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
5
En la Fig. 13 se muestra el porcentaje de la velocidad de crecimiento de células de carcinoma de ratón M109 determinado a partir de estudios de citotoxicidad. El porcentaje de la velocidad de crecimiento se expresa como un porcentaje basado en la velocidad de crecimiento de células M109 en ausencia de mitomicina C y de cisteína, y se muestra como una función de la concentración de mitomicina C, en nM. La velocidad de crecimiento de las células se determinó como se describe en el Ejemplo 6. Como se puede ver, el porcentaje de la velocidad de crecimiento de las células disminuye a medida que aumenta la concentración de cisteína tanto para los liposomas que contienen colesterol (círculos en blanco) como para la formulación liposómica libre de colesterol (cuadrados en negro). También se puede observar que la cisteína no tiene ningún efecto sobre la actividad de mitomicina C libre, y que la mitomicina C se libera del conjugado para inhibir eficazmente el crecimiento celular.
La velocidad de crecimiento in vitro de células de carcinoma de ratón M109 tratadas con mitomicina C en forma libre, o con mitomicina C en forma de conjugado de lípido-DTB-fármaco unido a liposoma, se muestra en las Figs. 14A-14B. En la Fig. 14A, se muestran los resultados para la formulación liposómica que no contiene colesterol. En la gráfica, la velocidad de crecimiento de las células M109 se expresa como un porcentaje basado en el crecimiento de células M109 en ausencia de fármaco y de cisteína, y se muestra como una función de la concentración de mitomicina C, en nM. Las células tratadas con mitomicina C en forma libre (triángulos en blanco), y con mitomicina C en forma libre más 1000 \muM de cisteína (triángulos en negro), muestran una disminución de la velocidad de crecimiento debido a la toxicidad del fármaco en forma libre. Las células tratadas con la formulación liposómica que comprende HSPC/PEG-DSPE/DSPE-DTB-mitomicina C (círculos en blanco), y con la formulación liposómica con cisteína adicional, añadida a concentraciones de 150 \muM (diamantes en blanco), 500 \muM (círculos en negro) y 1000 \muM (cuadrados en blanco), mostraron una citotoxicidad celular de una manera dependiente de la dosis de cisteína.
La Fig. 14B es una gráfica similar para la formulación liposómica que contiene colesterol. Se observó el mismo patrón para células tratadas con la composición liposómica que contiene colesterol más cisteína adicional, a concentraciones de 150 \muM (diamantes en blanco), 500 \muM (círculos en negro) y 1000 \muM (cuadrados en blanco). Esto es, a medida que aumenta la concentración de cisteína, disminuye la velocidad de crecimiento celular. Esto indica una liberación, inducida por cisteína, de mitomicina C en correlación directa con la concentración de cisteína. En contraste con las formulaciones liposómicas, la velocidad de crecimiento in vitro de células tratadas con mitomicina C en forma libre (triángulos en blanco) fue la misma que la velocidad de crecimiento de células tratadas con mitomicina C en forma libre más 1000 \muM de cisteína (triángulos en negro).
La Fig. 15 muestra el porcentaje de incremento de la citotoxicidad como función de la concentración de cisteína, en \muM, de mitomicina C libre y de las formulaciones liposómicas. El incremento de la toxicidad se determinó mediante el porcentaje de caída de IC50, por ejemplo, IC50 en presencia de cisteína con relación a IC50 en ausencia de cisteína a tiempo 100 ((IC50_{sin \ ciste\text{í}na}/IC50_{ciste\text{í}na}) x 100)). Como se puede ver, el porcentaje de citotoxicidad aumenta significativamente a medida que aumenta la concentración de cisteína tanto para los liposomas que contienen colesterol (triángulos en blanco) como para la formulación liposómica libre de colesterol (círculos en negro). La citotoxicidad de mitomicina C libre (cuadrados en negro) no se ve afectada por la presencia de cisteína.
Los datos de citotoxicidad muestran que la formulación liposómica libre de colesterol se ve más afectada por la cisteína. La IC50 de la formulación liposómica libre de colesterol, a ciertas concentraciones de cisteína, es sólo unas 2 veces menor que la del fármaco libre solo. La formulación liposómica que contiene colesterol es menos citotóxica que la formulación liposómica libre de colesterol. Los datos también muestran que la cisteína no tiene ningún efecto citotóxico de las células tumorales, y no tienen ningún efecto sobre la citotoxicidad de la mitomicina C libre. También es manifiesto, a partir de los datos, que la cisteína aumenta, de manera dependiente de la dosis, la citotoxicidad de la mitomicina C unida a liposomas. De este modo, los efectos citotóxicos observados para las formulaciones liposómicas dan cuenta mayoritariamente de la liberación, mediada por cisteína, de mitomicina C a partir del conjugado de lípido-DTB-fármaco.
C. Farmacocinética in vivo
Se determinó en ratas la farmacocinética in vivo de los liposomas que contienen colesterol y de la formulación liposómica libre de colesterol. Como se describe en el Ejemplo 7, los animales se trataron con una única inyección de bolo intravenoso de aproximadamente 0,1 mg/ml de mitomicina C en forma libre, o se incorporó en liposomas en forma de conjugado de lípido-DTB-mitomicina C según la invención. Después de la inyección, se tomaron muestras de sangre y se analizaron para determinar la cantidad de mitomicina C. Los resultados se muestran en las Figs. 16A-16B.
La Fig. 16A muestra la concentración (\mug/ml) de mitomicina C en la sangre de ratas, como una función del tiempo, en horas, tras la inyección intravenosa. Como se puede ver, la mitomicina C libre (cuadrados en blanco), administrada intravenosamente en forma libre, se aclara rápidamente de la sangre. La mitomicina C en forma de un conjugado de lípido-DTB-fármaco unido a liposoma, permanece en circulación durante un período de tiempo sustancialmente más prolongado. La mitomicina C asociada con liposomas que contienen colesterol (diamantes en negro), y con liposomas libres de colesterol (círculos en negro), se detectó en la sangre a una concentración mayor que 10 \mug/ml durante 20-25 horas.
La Fig. 16B muestra el porcentaje de dosis inyectada que queda en la sangre como función del tiempo, en horas, tras la inyección intravenosa de las formulaciones de ensayo. Virtualmente, ninguna de las dosis de mitomicina C libre (cuadrados en blanco) queda en la sangre en los puntos de tiempo mayores que aproximadamente 5 minutos. Sin embargo, a las 20 horas después de la inyección de las formulaciones liposómicas, aproximadamente 15-18 por ciento de la dosis de mitomicina C queda en circulación. Esto indica que el conjugado de mitomicina C-DTB-lípido permanece estable en el liposoma mientras está en circulación, y que se produce en el plasma una escisión tiolítica mínima. Por lo tanto, este sistema parece ser compatible con liposomas de larga circulación (liposomas Stealth®), los cuales tienen un tiempo de vida de circulación en sangre prolongado, y una acumulación potenciada en tumores.
V. Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención descrita en la presente memoria
Materiales
Todos los materiales se obtuvieron de proveedores comercialmente adecuados, tales como Aldrich Corporation.
Ejemplo 1 Síntesis de para-diacildiglicerolditiobenzalcohol (Compuesto IV) y orto-diacildiglicerolditiobenzalcohol A.para-diacildiglicerolditiobenzalcohol
Esta reacción se ilustra en la Fig. 1. Se siguió el procedimiento de Snyder, W.R. (Journal of Lipid Research, 28:949 (1987)) para preparar los Compuestos II y III.
En un baño de hielo se colocó un matraz de fondo redondo de 100 ml que contiene 3-mercapto-1,2-propanodiol (Compuesto I, 1 g, 9,26 mmoles) en 5 ml de agua. A este matraz que se agita rápidamente se le añadió gota a gota peróxido de hidrógeno (exactamente 0,5 equivalentes molares, 525 \mul, 4,63 mmoles) mientras se mantiene la temperatura entre 30-40ºC. Al final del proceso exotérmico, la reacción se dejó agitar toda la noche a temperatura ambiente. El agua se destiló azeotrópicamente con evaporación giratoria mediante adición sucesiva de acetonitrilo en alícuotas de 20 ml. El proceso de adición de acetonitrilo se repitió 3-4 veces o hasta que se eliminó todo el agua, produciendo un aceite claro. Después de raspar el matraz con una espátula de metal, y de enfriar toda la noche a -20ºC, solidificó el producto oleoso (Compuesto II, rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiol)). El sólido calcáreo se secó a vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 630 mg, 63%. RMN^{1}H (CD_{3}OD, 360 MHz) \delta 2,77, 2,95 (2xd, CH_{2}OH, 2H), 3,59 (M, SCH_{2}, 2H), 3,87 (m, CH, 1H) ppm.
El producto de rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiol) (Compuesto II) se aciló añadiendo el compuesto (980 mg, 4,6 mmoles) a un matraz de fondo redondo de 100 ml, secado en el horno, y disolviéndolo en cloruro de metileno seco (40 ml). A esto, se añadió ácido esteárico (4,92 g, 17,1 mmoles) y 4-toluenosulfonato de 4-(dimetilamino)piridinio (1,38 g, 4,6 mmoles) como el catalizador, y se agitó a temperatura ambiente (25ºC) durante 20 minutos. Después, se pipeteó diisopropilcarbodiimida (3,1 ml, 20 mmoles), y se hizo reaccionar toda la noche a temperatura ambiente. La TLC silícica en GF (10% de acetato de etilo en hexano) mostró la reacción completa del grupo diol. (rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiol) R_{f} = 0,60: rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiestearoilo) R_{f} = 0,35). Se añadieron una resina de intercambio iónico ligeramente básica Amberlyst® A-21 (\sim 3 g) y una resina de intercambio iónico fuertemente ácida Amberlyst 15 (\sim 3 g) a la mezcla de reacción. Después de agitar 30 minutos, las resinas se filtraron, y el filtrado se llevó hasta sequedad. El residuo se recristalizó en isopropanol tres veces (100 ml cada vez). El producto sólido, rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiestearoilo) (Compuesto III), se recogió y se secó sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 70%, 4,1 g. Punto de fusión 54-55ºC. RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 360 MHz) \delta 0,86, (t, CH_{3}, 6H), 1,22 (s, lípido, 56H), 1,48 (m, CH_{2}CH_{2}(CO)O, 4H), 2,26 (2xt, CH_{2}(CO)O, 4H), 2,87 (d, CH_{2}S, 2H), 4,03 & 4,22 (2xd, CH_{2}CH de lípido, 2H), 4,97 (m, CHCH_{2} de
lípido) ppm.
En la siguiente etapa, se disolvió una disolución de rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiestearoilo) (Compuesto III), (2,97 g, 2,33 mmoles) en tolueno (30 ml), y se colocó en un baño de hielo. Se pipeteó cloruro de sulfurilo (1,9 ml, 23,2 mmoles) en el matraz, y la mezcla se agitó a la temperatura del baño de hielo frío durante 30 minutos. El matraz se colocó entonces a temperatura ambiente, y se agitó durante otros 30 minutos. El exceso de cloruro de sulfurilo se eliminó con un evaporador giratorio. Se añadió al matraz de reacción una alícuota reciente (20 ml) de tolueno, y se colocó en un baño de hielo. A esto, se añadió, con velocidad lenta, una disolución de 4-mercaptobenzalcohol (780 mg, 5,6 mmoles) en tolueno. Después de 5 horas de tiempo de reacción, todos los disolventes se evaporaron con evaporación giratoria hasta sequedad. Se añadió acetato de etilo tibio (10 ml) al matraz de reacción, para disolver el sólido, y la materia insoluble se filtró. A la disolución de acetato de etilo, se añadieron 50 ml de éter para precipitar, y el producto sólido (para-diacil-diglicerol-ditiobenzalcohol, Compuesto IV) se recogió por filtración. Este proceso se repitió dos veces. Rendimiento: 75%.
Para purificar el producto (para-diacil-diglicerol-ditiobenzalcohol, Compuesto IV), se preparó una columna de gel de sílice (20 x 2,5 cm) en cloroformo. La muestra se disolvió en una cantidad mínima de cloroformo, y se cromatografió con adición de dos fases móviles diferentes. En primer lugar, eluyó CHCl_{3} al 100% (100 ml). Esta fracción contenía la impureza de alcohol ditiobencílico. La confirmación se realizó mediante RMN ^{1}H. Después, al cambiar la fase móvil a 15% de metanol en cloroformo, el producto puro se recogió mediante cromatografía ultrarrápida. Eluyendo con 500 ml de CH_{3}OH:CHCl_{3} (15:85), se recogió DGTBA puro (una mancha mediante TLC). Después de la evaporación de los disolventes, el sólido se liofilizó a partir de t-BuOH, y se secó a vacío sobre P_{2}O_{5}. La purificación final redujo el rendimiento hasta 40%, 1,4 g. RMN ^{1}H: (CDCl_{3}, 360 MHz) \delta 0,86 (t, CH_{3}, 6H), 1,22 (s, lípido, 56H), 1,48 (m, CH_{2}CH_{2}(CO)O, 4H), 2,26 (2xt, CH_{2}(CO)O, 4H), 2,87 (d, CH_{2}S, 2H), 4,03 & 4,22 (2xd, CH_{2}CH de lípido, 2H), 4,69 (s, CH_{2}, bz, 2H), 4.97 (m, CHCH_{2} de lípido), 7,36 & 7,56 (d, CH_{2}, aromático, 4H) ppm.
5 mg de la muestra se sometió a un análisis elemental de laboratorio (Midwest Micro Lab).
Análisis Teórico Medido
Carbono 70,93% 70,67%
Hidrógeno 10,50% 10,41%
Azufre 8,25% 8,31% 
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B.orto-diglicerolditiobenzalcohol
Una disolución de rac-3,3'-ditiobis(1,2-propanodiestearoilo (Compuesto III) (200 mg, 0,156 mmoles) se disolvió en tolueno (30 ml), y se colocó en un baño de hielo. Se pipeteó cloruro de sulfurilo (39 \mul, 0,47 mmoles) en el matraz, y la mezcla se agitó a la temperatura del baño de hielo frío durante 30 minutos. El matraz se colocó entonces a temperatura ambiente, y se agitó durante otros 30 minutos. El exceso de cloruro de sulfurilo se eliminó con un evaporador giratorio. Se añadió al matraz de reacción una alícuota reciente (20 ml) de tolueno, y se colocó en un baño de hielo. A esto, se añadió, con velocidad lenta, una disolución de 2-mercaptobenzalcohol (48 mg, 35 mmoles) en tolueno. Después de 5 horas de tiempo de reacción, todos los disolventes se evaporaron con evaporación giratoria hasta sequedad. Se añadió acetato de etilo tibio (10 ml) al matraz de reacción, para disolver el sólido, y se filtró la materia insoluble. A la disolución de acetato de etilo, se añadieron 50 ml de éter para precipitar, y el producto sólido (orto-diacil-diglicerol-ditiobenzalcohol) se recogió por filtración. Este proceso se repitió dos veces. El sólido se secó a vacío sobre P_{2}O_{5}. Rendimiento: 75%. RMN ^{1}H: (CDCl_{3}, 360 MHz) \delta 0,86 (t, CH_{3}, 6H), 1,25 (s, lípido, 56H), 1,58 (m, CH_{2}CH_{2}(CO)O, 4H), 2,28 (2xt, CH_{2}(CO)O, 4H), 2,91 (d, CH_{2}S, 2H), 4,14 & 4,35 (2xd, CH_{2}CH de lípido, 2H), 4,86 (s, CH_{2}, bz, 2H), 5,26 (m, CHCH_{2} de lípido), 7,31 (m, aromático, 2H), 7,48 & 7,75 (d, aromático, 2H)
ppm.
Ejemplo 2 Síntesis de para-diacildiglicerolditiobenzal-mitomicina C (Compuesto XVIII)
Esta reacción se ilustra en la Fig. 6A.
Un matraz de fondo redondo de 50 ml se cargó con fosgeno (3,1 mmoles) y con tolueno (5 ml), y la disolución se enfrió hasta 0ºC. Se preparó una disolución de para-diacil-diglicerol-ditiobenzalcohol (Compuesto IV, preparado como se describe en el Ejemplo 1, 0,31 mmoles) en tolueno (2,5 ml). La disolución alcohólica se añadió entonces gota a gota a la disolución de fosgeno. La mezcla se dejó calentar hasta la temperatura ambiente toda la noche. Después de 18 horas, la disolución se concentró a vacío para eliminar el exceso de fosgeno. El cloruro de acilo bruto se redisolvió en tolueno (5 ml).
Se preparó una disolución de mitomicina C (0,31 mmoles), dimetilaminopiridina (0,031 mmoles) y DMF (1 ml). La disolución de mitomicina C se añadió gota a gota a la disolución de cloruro de acilo. Después de 1 hora, el tolueno se separó por evaporación, y el producto bruto se cromatografió (1:1, hexano:acetato de etilo) sobre sílice. El producto purificado se recogió entonces en t-BuOH (50 ml), y se liofilizó. El producto fue un sólido púrpura (183 mg, 53%). R_{f} = 0,38 (50% de hexano:acetato de etilo); RMN ^{1}H (360 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,88 (t, J = 6,8 Hz, 6H), 1,26 (s, 58H), 1,58 - 1,63 (m, 4H), 1,76 (s, 3H), 2,29 (t, J = 7,6 Hz, 4H), 2,93 - 2,96 (m, 2H), 3,19 (s, 3H), 3,29 (dd, J = 4,7 y 2,9 Hz, 1H), 3,41 (dd, J = 5,0 y 2,2 Hz, 1H), 3,48 (dd, J = 13,7 y 2,5 Hz, 1H), 3,67 (dd, J = 11,5 y 4,7 Hz, 1H), (ddd, J = 12,2 y 5,8 y 2,5 Hz, 1H), 4,27-4,36 (m, 2H), 4,43 (d, J = 13,3 Hz, 1H), 4,61 (s, 2H), 4,90 (ddd, J = 10,4 y 5,0 y 2,2 Hz, 1H), 5,00 - 5,12 (m, 3H), 5,26 - 5,30 (m, 1H), 7,32 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,50 (d, J = 7,9 Hz, 2H); MALDI MS calc. para C_{62}H_{99}N_{4}O_{11}S_{2}Na: 1164, encontrado m/z 1164 (M + Na).
\newpage
Ejemplo 4 Preparación de liposomas A. Liposomas que contienen colesterol 1. Preparación de liposomas
Se añadieron 59 mg de HSPC, 14,4 mg de colesterol, 17,4 mg de mPEG-DSPE, y 7,4 mg de para-diestearoil-DTB-mitomicina C (relación molar de 60/30/5/5) a 1 ml de etanol deshidratado, a 60-65ºC, y se mezcló hasta disolución, aproximadamente 10 minutos.
Se calentó hasta 70ºC un medio de hidratación compuesto de 10 mM de histidina y 150 mM de NaCl en agua destilada.
La disolución lipídica tibia se añadió rápidamente al medio de hidratación tibio (63-67ºC), con mezclamiento, para formar una suspensión de liposomas que tienen tamaños heterogéneos. La suspensión se mezcló durante 1 hora a 63-67ºC.
2. Extrusión
A los liposomas se les dio el diámetro medio de partículas deseado mediante extrusión controlada a través de cartuchos de filtros de policarbonato alojados en vasijas de acero inoxidable forradas con teflón. La suspensión liposómica se mantuvo a 63-65ºC durante el proceso de extrusión, durante un período de 6-8 horas.
3. Diafiltración
El etanol se eliminó de la suspensión liposómica mediante diafiltración. Se preparó una disolución de histidina/cloruro sódico disolviendo histidina (10 mM) y cloruro sódico (150 mM) en agua estéril. El pH de la disolución se ajustó hasta aproximadamente 7. La disolución se filtró a través de un filtro Durapore de 0,22 \mum. La suspensión liposómica se diluyó en una relación aproximadamente 1:1 (v/v) con la disolución de histidina/cloruro sódico, y se diafiltró a través de un ultrafiltro de fibra hueca de polisulfona. Se realizaron ocho intercambios de volumen frente a la disolución de histidina/cloruro sódico, para eliminar el etanol. La temperatura del fluido del proceso se mantuvo a aproximadamente 20-30ºC. El tiempo total de diafiltración fue aproximadamente 4,5 horas.
4. Filtración estéril
La suspensión liposómica se calentó hasta 33-38ºC, y se filtró a través de un filtro de polietersulfona de 0,2 \mum de Gelman Supor. El tiempo total de filtración fue aproximadamente 10 minutos.
Después de cada etapa de tratamiento (hidratación, extrusión, diálisis y filtración), la concentración del lípido y la concentración del conjugado/fármaco se determinaron mediante HPLC. El tamaño de partículas liposómicas se midió mediante dispersión dinámica de la luz, y la cantidad de mitomicina C no unida, "libre", en el medio de suspensión externa, se midió mediante HPLC.
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B. Formulación liposómica libre de colesterol
Se prepararon liposomas como se describe anteriormente con una composición lipídica de HSPC, mPEG-DSPE y para-diestearoil-DTB-mitomicina C, en una relación molar de 90/5/5. Específicamente, se disolvieron 88,5 mg de HPSC, 17,9 mg de mPEG-DSPE (PEG MW 2000 Daltons) y 7,3 mg del conjugado en 1 ml de etanol. El tamaño de los liposomas, la concentración de lípido y de fármaco, y la concentración de mitomicina C libre en el medio de suspensión externa, se determinó después de cada etapa de tratamiento.
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Ejemplo 5 Condiciones de HPLC para la caracterización in vitro
Los liposomas preparados como se describe en los Ejemplos 4A-4B se diluyeron en octailglucopiranósido 0,6 M. Los liposomas se incubaron en presencia de 150 mM de cisteína, a 37ºC. Las muestras se extrajeron a tiempo cero, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas y 24 horas. Se analizó un volumen de 20 \mul mediante HPLC, usando una columna Water Symmetry C8 3,5 x 5 cm. El caudal fue 1 ml/min., y el gradiente de la fase móvil fue el siguiente:
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Ejemplo 6 Estudios de citotoxicidad A. Preparación de liposomas
Los liposomas, preparados como se describe en el Ejemplo 4A-4B, comprendían HSPC/mPEG-DSPE/diestearoil-DTB-mitomicina C (90/5/5) o HSPC/colesterol(mPEG-DSPE/diestearoil-DTB-mitomicina C (90/45/5/5). Las preparaciones liposómicas se filtraron de forma estéril a través de membranas de celulosa de 0,45 \mum, y no se redujeron en tamaño mediante extrusión. Después de la formación de los liposomas, se determinó la concentración de mitomicina C mediante absorbancia a 360 nm en liposomas solubilizados mediante dilución de 10-20 veces en isopropanol, y la concentración de fosfolípidos se determinó mediante ensayo de fosfato inorgánico.
Los liposomas que contienen colesterol tuvieron un diámetro medio de 275 \pm 90 nm. Los liposomas libres de colesterol tuvieron un diámetro medio de 150 \pm 50 nm. La concentración de fosfolípido en ambas formulaciones liposómicas fue 10 \muM/ml, y la concentración de mitomicina C en ambas formulaciones fue 120 \mug/ml.
B. Ensayo de quimiosensibilidad y determinación de la velocidad de crecimiento
El efecto citotóxico de mitomicina C libre, o de mitomicina C en forma de un conjugado de diestearoil-DTB-mitomicina C incorporado en liposomas, se evaluó colorimétricamente mediante un método de tinción con azul de metileno, descrito previamente (Horowitz, A.T. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1109:203-209 (1992)), con ligeras modificaciones. Al terminar el ensayo, las células se fijaron y se evaluaron usando el ensayo de tinción con azul de metileno.
En el ensayo, se cultivaron en placas, sobre placas de microtitulación de fondo plano, de 96 pocillos, 1500 células de carcinoma de ratón M109 procedentes de cultivos que crecen exponencialmente, en alícuotas de 200 \mul (medio RPMI-1640 + 10% de suero fetal bovino). Después de 20 horas en cultivo, durante las cuales las células se adhirieron y continuaron el crecimiento, se añadieron a cada pocillo 20 \mul de las formulaciones de ensayo (mitomicina C libre, o formulaciones liposómicas). Por cada incremento de 10 veces de la concentración de fármaco, se ensayaron cuatro puntos de concentración del fármaco. Cada ensayo se realizó en pocillos triplicados, y en dos placas paralelas. Las células se trataron continuamente durante 72 horas.
Después del período de tratamiento de 72 horas, los cultivos se fijaron mediante adición de 50 \mul de glutaraldehído al 2,5% a cada pocillo, durante 10 minutos. Las placas se lavaron tres veces con agua desionizada, una vez con tampón de borato 0,1 M (pH 8,5), y después se tiñeron durante 60 minutos con 100 \mul de azul de metileno (1% en tampón de borato 0,1 M, pH 8,5), a temperatura ambiente (20-25ºC). Las placas se aclararon en cinco baños de agua desionizada, para eliminar el colorante no unido a las células, y después se secaron. El colorante se extrajo con 200 \mul de HCl 0,1 N durante 60 minutos a 37ºC, y la densidad óptica se determinó usando un espectrofotómetro de microplacas.
El número de células determinado mediante recuento de células con un hemocitómetro se correlacionó bien con la absorbancia espectrofotométrica. La densidad inicial de células en placas se escogió para asegurar una relación lineal entre el número de células y la absorbancia al final del estudio. En cada estudio, se fijaron seis pocillos antes de que se añadiese el fármaco, para determinar la absorbancia media inicial. Este valor se usó para calcular la velocidad de crecimiento (GR) y el doble de tiempo (DT) de las células tratadas con el control y con fármaco usando la siguiente ecuación: DT = ln 2/ln[(OD_{t}/OD_{c}7h]; en la que DT = doble de tiempo en horas; OD_{t} = densidad óptica del pocillo de ensayo al final del estudio; OD_{c} = densidad óptica del pocillo de control al comienzo del estudio; h = duración de la incubación, en horas.
La velocidad de crecimiento se calculó según GR = (ln 2/DT). El porcentaje de inhibición del crecimiento, o el porcentaje de la velocidad de crecimiento del control, se obtuvo dividiendo la velocidad de crecimiento de células tratadas con el fármaco entre la velocidad de crecimiento de células del control, no tratadas. La concentración del fármaco que provocó una inhibición del 50% de la velocidad de crecimiento del control (IC_{50}) se calculó mediante interpolación de los dos valores más próximos de la curva de inhibición del crecimiento.
La mitomicina C se ensayó en el intervalo de 10^{-8}-10^{-5} M. Las formulaciones liposómicas unidas a conjugado se ensayaron en el intervalo 10^{-8}-3 x 10^{-5} M. Para estudios de interacción, se añadió cisteína (SIGMA, St. Louis, MO) junto con la mitomicina C o con formulaciones liposómicas, hasta una concentración final de 150, 500, ó 1000 \muM.
Los resultados se muestran en la Tabla 1, y en las Figs. 13, 14 y 15A-15B.
Ejemplo 7 Estudio farmacocinético in vivo A. Formulaciones liposómicas
Los liposomas que contienen colesterol, y los liposomas libres de colesterol, se prepararon como se describe en el Ejemplo 5A y 5B.
Se preparó una disolución de mitomicina C en forma libre disolviendo 11,9 mg de mitomicina C en 119 \mul de etanol. Después de la disolución, se añadieron aproximadamente 11,81 \mul de una disolución de 10 mM de histidina/150 mM de disolución salina. Antes del uso, la disolución de mitomicina C se diluyó hasta 100 \mug/ml con la disolución de histidina/disolución salina, y se filtró.
B. Animales
Se distribuyeron al azar ocho ratas en grupos de tratamiento, según lo siguiente:
9 
\newpage
Se administró una única inyección intravenosa de la formulación de ensayo como una dosis de bolo. Se tomaron muestras de sangre procedentes de cada animal en los siguientes tiempos tras la inyección: 30 segundos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas. La cantidad de mitomicina C en las muestras de sangre se determinó mediante el procedimiento de HPLC dado más abajo. Se preparó una disolución de yodoacetamida 200 mM colocando 199,3 mg de yodoacetamida en 5,1 ml de EDTA al 7,5%. Se colocaron 15 \mul de la disolución de yodoacetamida 200 mM en cada 1 \mul de muestra de sangre.
C. Método de HPLC para medir la mitomicina C en plasma 1. Preparación de la disolución
Se preparó un tampón acuoso, que contiene 10 mM de fosfato de amonio, pH = 7, colocando 1,321 g de fosfato de amonio en un matraz volumétrico de 1 l lleno de agua desionizada. La mezcla se agitó, y el pH se ajustó hasta 7,0 con ácido o-fosfórico. El tampón se filtró a través de un filtro de nailon de 0,45 \mum antes del uso.
La fase móvil de metanol y el tampón acuoso se mezclaron mediante un programa de gradiente usando una bomba binaria Waters Alliance.
2. Preparación de una disolución estándar y muestras de control de calidad
Se prepararon como patrones y como muestras de control de calidad dos pesos separados de mitomicina C y de conjugado de mitomicina C. Se pesó un mg de mitomicina C y de conjugado de mitomicina C, y se disolvió en 1 ml de diluyente (mezcla de 20% de cloroformo y 80% de metanol), separadamente. La concentración de la disolución madre para ambos compuestos fue 1 mg/ml. Se realizaron diversas diluciones en diluyente para obtener concentraciones de 5 \mug/ml hasta 100 \mug/ml para las muestras de control de calidad y para las muestras patrón.
A una alícuota de 0,1 ml de plasma de rata se le añadieron volúmenes apropiados (10 \mul-50 \mul) de disoluciones patrón de mitomicina C y de conjugado de mitomicina C. Los intervalos de concentración fueron 0,05-5,0 \mug/ml y 0,1-5 \mug/ml para mitomicina C y para conjugado de mitomicina C, respectivamente. El volumen final se ajustó hasta 1 ml con metanol. Se siguió un procedimiento similar para preparar muestras de control de calidad. Las concentraciones de las muestras de control de calidad fueron 0,1, 0,5 y 5 \mug/ml para mitomicina C, y 0,1, 1 y 5 \mug/ml para conjugado de mitomicina C, en plasma de rata. Las muestras se hicieron girar a 3.000 rpm durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Se transfirieron 300 \mul de sobrenadante a viales de HPLC que contienen 300 \mul de inserto para
inyección.
3. Preparación de las muestras
Se desnaturalizaron 100 \mul de muestra de plasma con 900 \mul de metanol, seguido de la centrifugación, durante 10 minutos, a 3.000 rpm. Se transfirió una alícuota de 300 \mul de sobrenadante a un vial de HPLC que contiene 300 \mul de inserto para inyección.
4. Condiciones cromatográficas
Se usó una columna Supelco® C-8, 5 \mu, 4,6 mm x 5 cm. La fase móvil A fue fosfato de amonio 10 mM, pH 7. La fase móvil B fue metanol. El caudal fue 1 ml/min., y la detección se realizó mediante UV a 360 nm. El volumen de inyección fue 40 \mul, y el tiempo típico de paso a través de la columna fue de 15 minutos. El programa de gradiente fue el siguiente:
Tiempo (minutos) Cantidad de fase móvil A (%) Cantidad de fase móvil B (%)
0 90 10
4 70 30
8 0 100
12 90 10
15 90 10
5. Ensayo y cálculos
Se inyectaron los patrones de linealidad preparados (seis niveles de concentración), desde la concentración baja hasta la concentración elevada. Después se inyectaron para análisis las muestras de control de calidad y de
plasma.
El área del pico y los tiempos de retención se determinaron mediante el sistema PE-Nelson Turbochrom (Versión 4.1). Las concentraciones de mitomicina C y de conjugado de mitomicina C se calcularon usando un programa de regresión lineal. La linealidad del método se evaluó usando respuestas estándar a partir de seis niveles de concentración. Los datos se fijaron a la ecuación de regresión lineal y = B*x + A, con un factor de peso de 1/x^{2}. La precisión y la exactitud del método se evaluaron a partir de las concentraciones nuevamente calculadas de los patrones, así como también a partir de las muestras de control de calidad.
Los resultados se muestran en las Figs. 16A-16B.

Claims (3)

1. Conjugado para uso en un vehículo para suministro de fármaco liposómico, presentando el conjugado la fórmula estructural general:
10
en la que L es un resto de diasteroilglicerol adecuado para la incorporación en una bicapa lipídica liposómica, R^{1} representa un resto de mitomicina A o mitomicina C unido covalentemente al resto de ditiobencilo mediante un grupo uretánico, y en la que la orientación del grupo CH_{2}R^{1} se selecciona a partir de la posición orto y de la posición para.
2. Composición liposómica, que comprende liposomas compuestos de lípidos formadores de vesículas que incluyen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 por ciento en moles de un conjugado según la reivindi-
cación 1.
3. Método para retener un fármaco en un liposoma, que comprende preparar liposomas según la reivindicación 2, siendo dicha preparación eficaz para retener el fármaco en los liposomas hasta la liberación a partir del conjugado en respuesta a una condición fisiológica o a una condición inducida artificialmente.
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