DE102010042338A1 - Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs mit kontrollierter Freisetzung des Wirkstoffes - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, die es erlaubt den Wirkstoff in direkter Gegenwart der mit dem Wirkstoff zu behandelnden Zellen freizusetzen. Die Zusammensetzung umfasst einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms umfassend eine Disulfidgruppe, wobei sich in dem Wirkstoffträger ein Zytostatikum befindet. Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur örtlich begrenzten Freisetzung eines Zytostatikums.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, die es erlaubt, den Wirkstoff in direkter Gegenwart der mit dem Wirkstoff zu behandelnden Zellen freizusetzen. Die Zusammensetzung umfasst einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms umfassend eine Disulfidgruppe, wobei sich in dem Wirkstoffträger ein Zytostatikum befindet. Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur örtlich begrenzten Freisetzung eines Zytostatikums.
  • Trägersysteme zur Wirkstofffreisetzung basierend auf Liposomenträgern in der Größe von etwa 100 nm sind im Allgemeinen mittlerweile in der medizinischen Technik bekannt. Sie werden im Allgemeinen als vorteilhaft angesehen, wenn eine für bestimmte Organe giftige Substanz, welche aber an anderen Orten des menschlichen Körpers als medizinischer Wirkstoff eingesetzt werden kann, nur an jenen gewünschten Stellen freigesetzt werden soll.
  • Zu den vorgenannten giftigen Substanzen gehören auch sogenannte Zytostatika, die aber in korrekter Dosierung und in Anwendung auf bestimmte, insbesondere entartet erkrankte Gewebetypen auch als medizinische Therapeutika verwendet werden können.
  • Unter den vorgenannten Liposomenträgern wird im Allgemeinen eine Stoffgruppe verstanden, welche aus nicht giftigen Phospholipiden besteht. Häufig werden in solche Liposomenträger auch Polymere, wie etwa Polyethylenglykole, eingebunden, welche sich durch eine verbesserte Stabilität im Blutkreislauf von behandelten Patienten auszeichnen, da die vorgenannten Polyethylenglykole eine Form sterischen Schutzes um die eigentlichen Liposomenträger bilden. Man erhält sogenannte Lipopolymere.
  • Die vorgenannten Aussagen bezüglich Liposomenträgern werden auch durch J. Davidsen et al. in „Secreted phospholipase A2 as a new enzymatic trigger mechanism for localised liposomal drug release and absorption in diseased tissue" erschienen in Biochimica et Biophysica Acta 1609 (2003) 95–101 bestätigt. Weiter offenbaren J. Davidsen et al., dass die Eigenschaften solcher Wirkstoffträger in Form vorgenannter Liposomenträger insbesondere in Bezug auf ihr Freisetzungsverhalten von einer Vielzahl von chemischen und physikalischen Größen abhängen kann, deren Zusammenspiel noch nicht vollständig verstanden ist.
  • J. Davidsen et al. offenbaren in diesem Zusammenhang ihre Untersuchungen bezüglich einer Liposomenformulierung, bestehend aus einem 100 nm durchmessenden Liposomenträger. Der Liposomenträger kann aus 1,2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) und/oder 1,2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylen glykol)-2000] (DPPE-PEG2000) und/oder 1-O-hexadecanoyl-2-hexanodecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC) und/oder 1-O-hexadecanoyl-2-hexanodecanoyl-sn-glycero-3-phospho ethanolamin-N-[methoxy(polyethylen glykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) bestehen. Die vorgenannten Stoffe werden als Lipide bezeichnet, welche auch multilamellare Vesikel bilden können und welche zu der Stoffgruppe der Phospholipide gehören.
  • Es wird weiter offenbart, dass in der Liposomenformulierung umfassend 1-O-DPPC und 10 mol% 1-O-DPPE-PEG350, Calcein eingeschlossen werden kann. Calcein wird hierbei als Modellsubstanz für Arzneimittel bezeichnet. Eine Freisetzung des Calcein kann gemäß der Offenbarung durch J. Davidsen et al. mittels Behandlung dieser Liposomenformulierung mit Phospholipase A2 (PLA2) erzielt werden. Die Freisetzung erfolgt durch hydrolytische Spaltung von entweder DPPC oder 1-O-DPPC, oder 1-O-DPPE-PEG350, welche durch PLA2 katalysiert wird, wobei ein Lysolipid und eine Fettsäure entstehen. Die durch J. Davidsen offenbarten Liposomenformulierungen werden nur in Zusammenhang mit den vorgenannten Modellsubstanzen hinsichtlich ihrer Freisetzung beschrieben. J. Davidsen beschreiben auch eine Möglichkeit der Anwendung von Liposomenformulierungen im Allgemeinen für die Freisetzung von Doxorubicin, was ein Zytostatikum ist. Es wird allerdings keine tatsächliche Offenbarung hinsichtlich dieses Sachverhalts gegeben.
  • Damit offenbaren J. Davidsen et al. weder eine Spaltung in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil, noch dass der Liposomenträger eine Disulfidbindung umfassen kann. Insbesondere offenbaren J. Davidsen et al. nicht, dass im Zuge dessen ein Zytostatikum freigesetzt wird.
  • Durch Meng et al. wird in „Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications" erschienen in Biomaterials 30 (2009) 2180–2198 offenbart, dass bestimmte Polymere mit Disulfidbrücken entweder im polymeren Strang oder in einer dessen Seitenketten geeignet sind, Wirkstoffe einzuschließen. Zu den Wirkstoffen, die hier Einsatz finden können, zählen gemäß Meng et al. auch Krebsmedikamente. Die dort offenbarten Stoffe weisen aber stets polymeren Charakter auf, da Partikel, d. h. Feststoffe, aus diesen gebildet werden, in denen die potentiellen Wirkstoffe eingeschlossen werden sollen.
  • Es handelt sich also in keinem Fall um Stoffe mit Lipidcharakter, die zur Herstellung von Liposomen geeignet wären.
  • Die offenbarte Wirkweise der Stoffe basiert auf der Möglichkeit der Bindungsspaltung der Disulfidgruppe, wodurch entweder die Polymere aufgelöst werden oder die Polyethylenglykolseitenketten, die mit der Disulfidgruppe an die Polymere gebunden sind, abgetrennt werden und damit das Partikel nach Anwendung im Patienten durch dessen Immunsystem erkennbar und abbaubar wird. Demnach basiert die Freisetzung aus dem Wirkstoffträger gemäß der Offenbarung nach Meng et al. entweder auf einem Auflösen eines Feststoffes durch Spaltung polymerer Bindungen oder durch Degradation des Feststoffes durch das Immunsystem des Patienten, nachdem das Partikel für diese erkennbar geworden ist. In keinem Fall wird der Wirkstoff direkt freigesetzt.
  • In der WO 2000/059474 A1 werden lipide Zusammensetzungen offenbart, die aus einer hydrophoben „Schwanzgruppe” und einer hydrophilen „Kopfgruppe” bestehen, wobei die letztgenannte hydrophile „Kopfgruppe” an die hydrophobe „Schwanzgruppe” kovalent angebunden ist. Innerhalb der hydrophilen „Kopfgruppe” wird zwischen einer ersten und einer zweiten Region unterschieden, wobei diese beiden Regionen durch eine Disulfidgruppe verbunden sind, die, etwa durch Glutathion, gespalten werden kann. Die erste Region der hydrophilen „Kopfgruppe” trägt gemäß der WO 2000/059474 A1 bei physiologischem pH eine positive Ladung und die zweite Region trägt bei physiologischem pH eine negative Ladung. Die erste Region ist kovalent an die hydrophobe „Schwanzgruppe” angebunden.
  • Die gemäß der WO 2000/059474 A1 allgemein offenbarte chemische Formel der vorgenannten lipiden Zusammensetzungen ist X-Y-S-S-Z. Hierbei bildet die chemische Gruppe X die vorgenannte hydrophobe „Schwanzgruppe” und Y, sowie Z die erste bzw. zweite Region der hydrophilen Kopfgruppe.
  • Gemäß der weiteren Offenbarung der WO 2000/059474 A1 kann in der vorgenannten chemischen Formel die chemische Gruppe X als hydrophobe „Schwanzgruppe” eine Gruppe sein, die im Wesentlichen dem Glycerinrumpf eines Fettes ähnlich ist und an die die chemische Gruppe Y über eine weitere chemische Gruppe W angebunden ist.
  • Die chemische Gruppe W kann ausgewählt sein aus der Liste bestehend aus CHR3, NR3, N+(R3)2, O, S, C(O)NH, NH(CO), OC(O)NH und OP(O)(OR3)O. Die in der chemischen Gruppe W weiter enthaltene chemische Gruppe R3 kann Wasserstoff oder ein C1-C4 Alkylrest sein.
  • Die chemische Gruppe Y kann ein C1-C12 Alklrest, ein C2-C12 Alkenylrest oder ein C2-C12 Alkinylrest mit Substituenten in Form von Alkylresten, Aminoresten, Aminoalkylresten, Guanidinresten, Guadininalkylresten, Amidoresten oder Amidoalkylresten sein, wobei die vorgenannten Alkyl-, Alkenyl-, oder Alkinylreste der chemischen Gruppe Y weiter durch NR3, N+(R3)2, C(O), NHC(NH), C(NH)NH, NHC(NH)NH unterbrochen sein können. Alternativ kann die chemische Gruppe Y auch ein Aminosäurerest oder ein Peptid sein.
  • Die chemische Gruppe Z kann gemäß der Offenbarung der WO 2000/059474 A1 ein C1-C12 Alkylrest, Alkenylrest oder ein Alkinylrest sein, der wiederum mit Alkylresten, Carboxylresten, Carboxyalkylresten, Aminosäureresten, Peptiden, Oligonucleotiden oder sog. „Zielmolekülresten” substituiert sein kann.
  • Die vorgenannten chemischen Gruppen X, Y und Z müssen aber in jedem Fall so ausgestaltet sein, dass die Gruppen X und Y in ihrer Gesamtheit bei physiologischem pH eine positive Ladung aufweisen und die Gruppe Z bei physiologischem pH eine negative Ladung aufweist.
  • Demzufolge entsteht bei der Spaltung von Stoffen der Formel X-Y-S-S-Z an der Disulfidgruppe gemäß der WO 2000/059474 A1 eine Gruppe der Art X-Y-S, die positiv geladen ist und eine chemische Gruppe der Art S-Z, die negativ geladen ist.
  • In jedem Fall ist die Gruppe der Art X-Y-S dadurch, dass sie immer noch die „hydrophobe Schwanzgruppe” und eine positive Ladung umfasst, eine chemische Gruppe, die amphiphile Eigenschaften aufweist. D. h., die in einer Region hydrophob und in einer Region hydrophil ist. Die Gruppe der Art S-Z ist durch ihre negative Ladung und durch die Tatsache, dass diese einen C1-C12 Alkylrest, Alkenylrest oder ein Alkinylrest umfasst entweder ebenfalls amphiphil oder sogar – im Fall besonders kurzer Alkylreste, Alkenylreste oder Alkinylreste – nur hydrophil.
  • Die WO 2000/059474 A1 offenbart weiter, dass die vorgenannten Stoffe zur Herstellung von Liposomenträgern geeignet sind, mittels derer eine gezielte Freisetzung von Stoffen an einem Wirkort erfolgen kann. Die Freisetzung basiert auf der chemischen Spaltung der Disulfidgruppe. Die WO 2000/059474 A1 offenbart auch die Verwendung der dortigen Liposomenträger zur Freisetzung von Krebsmedikamenten im Allgemeinen.
  • Die WO 2000/059474 A1 offenbart aber nicht, dass eine Spaltung eines vorher amphiphilen Stoffes in einen hydrophilen und einen hydrophoben Anteil erzielt werden kann.
  • Eine solche Aufteilung in einen hydrophilen und einen hydrophoben Anteil würde aber eine besonders effiziente Destabilisierung und Auflösung des mit solchen Stoffen aufgebauten Liposomenträgers ermöglichen.
  • Neben den vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen ist auch allgemein bekannt, dass spezielle Enzyme im Körper eines Saugetiers spezifische Bindungen von Stoffen angreifen und diese spalten. In diesem Zusammenhang offenbaren etwa D. Mustacich et al. in Biochem. J. (2000) 346, 1–8, „Thioredoxin reductase”, dass ein solches Enzym die Thioredoxin reductase (kurz TrxRs) ist. Weiter wird offenbart, dass dieses Enzym insbesondere in Tumorgeweben mindestens zehnmal mehr vorhanden ist als in gesundem Gewebe.
  • Die bei der Behandlung von Krebserkrankungen verwendeten Zytostatika sind hinsichtlich ihrer zytostatischen Wirkung nicht selektiv. Demnach entfaltet sich diese Wirkung im Allgemeinen sowohl gegenüber gesunden Zellen, wie auch gegenüber dem erkrankten Gewebe. Die zytostatische Wirkung auf die gesunden Zellen ist eine schwerwiegende Nebenwirkung dieser Wirkstoffe.
  • Im Zuge von solchen Behandlungen wird der Patient vielfach auch mit einer größeren Dosis der Zytostatika behandelt als dies die eigentliche Tumorerkrankung erfordern würde, da sichergestellt werden muss, dass die dem Patienten verabreichte Wirkstoffmenge den Wirkort (den Tumor) noch in ausreichend großer Dosierung erreicht.
  • Hierzu wird die zytostatische Nebenwirkung auf die gesunden Zellen in der Ermittlung der notwendigen Dosierung insofern mit einberechnet, als dass davon ausgegangen wird, dass ein Teil des zytostatischen Wirkstoffs seine Wirksamkeit gegenüber gesunden Zellen entfaltet und somit für die Wirkung gegen das Tumorgewebe nicht mehr zur Verfügung steht. Demnach sind die oben genannten Nebenwirkungen in solchen Fällen intrinsischer Bestandteil der Therapie.
  • Wünschenswert wäre es aber, wenn der Wirkstoff nur am Wirkort freigesetzt würde und nur dort seine Wirkung entfalten würde. Dies würde zum einen eine Verringerung der Dosis und zum anderen eine geringere, negative Beeinträchtigung der Patienten zur Folge haben.
  • Es ist aber in vielen Fallen zugleich sicherzustellen, dass die Freisetzung des Wirkstoffs am potentiellen Wirkort sofort und möglichst quantitativ und nicht in schleichender Weise stattfindet.
  • Die vorgenannten Aufgaben werden im oben angegebenen Stand der Technik aber bis heute nicht oder nur mangelhaft gelöst.
  • Es besteht daher die Aufgabe einen Wirkstoffträger mit einem in diesem enthaltenen Zytostatikum bereitzustellen, der z. B. enzymatisch an einer Disulfidgruppe, enthalten in diesem Wirkstoffträger, gespalten werden kann, so dass eine schnelle und möglichst vollständige Freisetzung des Zytostatikums am Wirkort möglich ist.
  • Weiter besteht die Aufgabe ein Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums bereitzustellen, welches für die zielgerichtete Behandlung etwa von Tumorerkrankungen geeignet ist, indem das Zytostatikum nur in unmittelbarer Nähe zum Wirkort des menschlichen Körpers schnell und möglichst quantitativ freigesetzt wird.
  • Als ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung wurde eine Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms das ein Zytostatikum enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger mindestens einen Stoff gemäß der Formel (I)
    Figure 00050001
    umfasst, wobei der mindestens eine Stoff gemäß der Formel (I)
    • (a) in X eine chemischen Gruppe umfassend mindestens fünf Kohlenstoffatome und umfassend mindestens eine Ethergruppe und/oder Amingruppe oder Ammoniumgruppe aufweist, und wobei
    • (b) n und m unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 30 ist, wobei aber die Summe aus n und m mindestens 16 beträgt,
    gefunden.
  • Durch die Eigenschaft der Stoffe gemäß der Formel (I) in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, dass diese in den Resten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen chemische Gruppen aufweisen, die hydrophobe Eigenschaften besitzen und zugleich sterisch dazu führen, dass bei Einbringen der Stoffe gemäß der Formel (I) in ein polares Medium diese Stoffe sich selber so anordnen, dass diese hydrophoben chemischen Gruppen nach innen, weg vom polaren Lösungsmittel angeordnet sind, bilden diese gegebenenfalls mit weiteren Stoffen gleicher oder ähnlicher Eigenschaften Liposome bei Einbringen in polare Lösungsmittel, wie etwa Wasser.
  • Demnach führt das Einbringen der Stoffe gemäß der Formel (I) in ein polares Medium dazu, dass diese Stoffe sich selber so anordnen, dass es zur Ausbildung von sphärischen Strukturen in Form von Liposomen kommt.
  • Dabei entstehen üblicherweise sogenannte Lipiddoppelschichten, wobei die hydrophilen chemischen Gruppen X der Stoffe gemäß der Formel (I) sich sowohl außen als auch innen hin zum polaren Lösemittel, das sich auch im Inneren der vorgenannten sphärischen Strukturen befinden kann, orientieren, während die hydrophoben chemischen Gruppen beider Schichten ins Innere der Lipiddoppelschicht orientiert sind. Im Inneren des Liposoms befindet sich das Zytostatikum, gelöst im polaren Medium, das somit, solange die Lipiddoppelschicht stabil ist, diese nicht verlassen kann und somit auch gegenüber in der Nahe der Zusammensetzung befindlichen Zellen keine zytostatische Wirkung entfalten kann.
  • Zugleich sind die Stoffe gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung aber an der vorgesehenen Disulfidgruppe selektiv spaltbar, so dass hiernach eine hydrophile chemische Gruppe bestehend aus der chemischen Gruppe X und einem Schwefelrest, sowie eine hydrophobe chemische Gruppe umfassend die Reste mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen entstehen. Hierdurch kommt es zu einer sofortigen und vollständigen Destabilisierung des vorgenannten Liposoms und damit zu einer sofortigen Freisetzung des enthaltenen Zytostatikums.
  • Damit wird mit der neuartigen erfindungemäßen Zusammensetzung erstmals die Freisetzung eines Zytostatikums über die Spaltung einer Disulfidbindung und unter Erhalt eines hydrophilen und eines hydrophoben Rests möglich, was es erlaubt, abhängig hiervon das Zytostatikum spontan und nur am gewünschten Wirkort freizusetzen.
  • Die Reste mit n, m Kohlenstoffatomen gemäß der Formel (I) sind üblicherweise gesättigte Kohlenwasserstoffreste, wie dies auch in der Formel (I) dargestellt ist.
  • Die Reste mit n, m Kohlenstoffatomen können auch einfach oder mehrfach ungesättigte Reste sein. Es können die Reste mit n, m Kohlenstoffatomen somit auch eine oder mehrere Doppel- und/oder Dreifachbindungen aufweisen.
  • Die Formel (I) ist demnach gemäß der vorliegenden Erfindung hinsichtlich der darin dargestellten Kohlenwasserstoffreste mit n, m Kohlenstoffatomen nicht so zu verstehen, als dass diese Reste ausschließlich gesättigte Kohlenwasserstoffreste mit n, m Kohlenstoffatomen sind.
  • Die chemische Gruppe X umfasst in bevorzugten Ausführungsformen mindestens acht Kohlenstoffatome.
  • Es ist ebenfalls bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X neben der mindestens einen Ethergruppe und/oder Amingruppe oder Ammoniumgruppe auch mindestens eine Carbonsäureestergruppe umfasst.
  • Es ist besonders bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X entweder mindestens zwei Ethergruppen oder mindestens eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe und mindestens zwei Carbonsäureestergruppen umfasst.
  • Es ist ebenfalls besonders bevorzugt, wenn die mindestens eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe der chemischen Gruppe X der Stoffe gemäß der Formel (I) in den Wirkstoffträgern der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine quarternäre Ammoniumgruppe ist.
  • In solchen Ausführungsformen trägt der Stoff gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung mindestens eine positive Ladung und liegt in Kombination mit mindestens einem einfach oder mehrfach negativ geladenen Gegenion vor. Solche Gegenionen können etwa Halogenionen, wie Chlorid, Bromid und/oder Iodid, aber auch beliebige andere Gegenionen mit negativen Ladungen sein.
  • Es ist ganz besonders bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X der Stoffe gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung mindestens drei Ethergruppen umfasst. Hierbei ist es bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X über eine Carbonsäureestergruppe an eine chemische Gruppe Y gemäß der nachstehend beschriebenen weiteren bevorzugten Ausführungsform angebunden ist.
  • Innerhalb dieser ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Stoffe gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung ist die chemische Gruppe X, die dann weiter bevorzugt nur eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe enthält, ebenfalls bevorzugt über diese Amingruppe oder Ammoniumgruppe an den Rest des Stoffes gemäß der Formel (I) angebunden.
  • Diese Ausführungsform ist insbesondere vorteilhaft, weil die Amingruppe oder Ammoniumgruppe und die mindestens drei Ethergruppen in ihrer Gesamtheit eine besonders hydrophile Eigenschaft der chemischen Gruppe X zur Folge haben.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungemäßen Zusammensetzung umfassen in dieser die Stoffe gemäß der Formel (I) in der chemischen Gruppe X auch eine Phosphatgruppe.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungemäßen Zusammensetzung kann in dieser Zusammensetzung der Wirkstoffträger in Form eines Liposoms das ein Zytostatikum enthält auch mindestens einen Stoff gemäß der Formel (I*)
    Figure 00080001
    umfassen, wobei die chemische Gruppe Y eine chemische Gruppe ausgewählt aus der Liste bestehend aus Biotin, Protein, Peptid, Glykogruppe, Nucleinsäure, Nucleosid oder Nukleotid ist und wobei X, n und m die Bedeutungen, wie in Formel (I) oder in den vorstehend beschriebenen bevorzugten Varianten haben.
  • Die chemische Gruppe Y ist in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Biotin.
  • In der bevorzugten Ausführungsform, in der die chemische Gruppe Y Biotin ist, kann diese entweder durch eine Amidbindung oder über eine Carbonsäureestergruppe an die chemische Gruppe X angebunden sein.
  • In dieser bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung umfassend Wirkstoffträger mit Stoffen gemäß der Formel (I*) kann die chemische Gruppe Y an die chemische Gruppe X terminal oder als Seitengruppe angebunden vorliegen.
  • In allen Ausführungsformen der Erfindung umfassend Stoffe gemäß der Formel (I*) dient die chemische Gruppe Y der (bio-)chemischen Identifikation.
  • Indem die Gruppe Y etwa im Falle der Verwendung von Biotin gemäß der bevorzugten Ausführungsform (bio-)chemisch eindeutig durch Streptavidin erkannt wird, lässt sich hieran eine weitere chemische und/oder biologische Gruppe anbinden, die dem Stoff gemäß der Formel (I*) weitere (bio-)chemische Eigenschaften verleiht.
  • So kann etwa ein mit Streptavidin konjugierter Antikörper an das Biotin gebunden werden. Alternativ kann auch nur Streptavidin an das Biotin gebunden werden und ein wiederum mit Biotin konjugierter Antikörper wiederum an das Streptavidin gebunden werden. In beiden Fällen ermöglicht dies, dass der Wirkstoffträger sodann über die selektive Wirkung des Antikörpers bevorzugt an Zielmolekülen der zu behandelnden Zellen akkumuliert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfasst dieser Wirkstoffträger mit einem Stoff gemäß der Formel (I*) in dem Y Biotin ist, an das Streptavidin gebunden vorliegt, an das wiederum ein mit Biotin konjugierter Antikörper gebunden ist.
  • Insbesondere bevorzugte Wirkstoffträger sind solche umfassend Stoffe gemäß der Formel (Ia)
    Figure 00090001
  • Bei diesen insbesondere bevorzugten Zusammensetzungen mit Wirkstoffträgern umfassend Stoffe gemäß der Formel (Ia) ist ebenfalls bevorzugt an das Biotin des Stoffes gemäß der Formel (Ia) Streptavidin angebunden, an das wiederum ein mit Biotin konjugierter Antikörper gebunden ist.
  • Die vorgenannte, erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst in dem Wirkstoffträger üblicherweise neben den Stoffen gemäß der Formel (I), (I*) und/oder (Ia) mindestens noch einen weiteren Stoff mit mindestens einer chemischen Gruppe mit lipophilen Eigenschaften und mindestens einer chemischen Gruppe mit hydrophilen Eigenschaften. Solche weiteren Stoffe sind bevorzugt Lipide.
  • Solche Lipide sind üblicherweise jene aus der Stoffklasse der Phospholipide, insbesondere Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylethanolamin.
  • Bevorzugte Lipide sind solche ausgewählt aus der Liste bestehend aus L-α-phosphatidylcholin, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Ammonium-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-lissamin rhodamin B sulfonyl).
  • Die vorgenannten weiteren Stoffe ordnen sich bei Einbringen in ein polares Medium in gleicher Weise wie die Stoffe gemäß den Formeln (I, I* und Ia) an.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit Wirkstoffträgern, die oben genannte weitere Stoffe umfassen, enthält diese üblicherweise zu einem molaren Anteil von mindestens 50%, bevorzugt von mindestens 70%, besonders bevorzugt von 80 bis 90% bezogen auf den Wirkstoffträger.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfasst der Wirkstofftäger zwei Lipide als weitere Stoffe.
  • Innerhalb dieser bevorzugten Ausführungsform ist eines der zwei Lipide bevorzugt L-α-phosphatidylcholin. Besonders bevorzugt ist das L-α-phosphatidylcholin jenes L-α-phosphatidylcholin, welches aus Eiern von Hühnern gewonnen werden kann.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfasst der Wirkstoffträger einen molaren Anteil von L-α-phosphatidylcholin zwischen 10 und 90% und einen Anteil eines Stoffes gemäß Formel (I, I* oder Ia) bezogen auf den Wirkstoffträger.
  • In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung besteht der Wirkstoffträger aus einem molaren Anteil von L-α-phosphatidylcholin zwischen 10 und 30%, einem molaren Anteil von 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin zwischen 50 und 65% und einem verbleibenden Anteil eines Stoffes gemäß Formeln (I, I* oder Ia), so dass insgesamt 100% molarer Anteil bezogen auf den Wirkstoffträger erhalten werden.
  • Die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthaltenen Wirkstoffträger sind Liposomen, die sogenannte Lipiddoppelschichten umfassen, wobei sich die gerade beschriebenen hydrophilen chemischen Gruppen X der Stoffe gemäß der Formeln (I), (I*) (Ia), die Bestandteil dieser Wirkstoffträger sind, hin zum polaren Lösemittel orientieren, während die hydrophoben chemischen Gruppen der Stoffe gemäß der Formeln (I), (I*) bzw. der vorstehend beschriebenen Lipide beider Schichten ins Innere der Lipiddoppelschicht orientiert sind.
  • Das in der erfindungemäßen Zusammensetzung im Wirkstoffträger enthaltene Zytostatikum ist bevorzugt eines, das in Wasser oder wässrigen Medien zu einer Konzentration von bis zu 3 mmol/l löslich ist.
  • Besonders bevorzugte Zytostatika sind jene ausgewählt aus der Liste bestehend aus Doxorubicin, Pemetrexed, Melphalan, Amsacrin, Asparaginase, Bevacizumab, Bleomycin, Busulfan, Irinotecan, Carmustin, Daunorubicin, Cisplatin, Dactinomycin, Gancyclovir, Cytarabin, Dacarbazin, Cytarabin, Vindesin, Oxalipiatin, Cyclophosphamid, Cetuximab, Etoposid, Epirubicin, Fludarabin, 5-Fluorouracil, Gemcitabin, Trastuzumab, Ifosfamid, Topotecan, Cladribin, Alemtuzumab, Rituximab, Methotrexat, Mitomycin, Mitoxantron, Gemtuzumab, Carboplatin, Aldesleukin, Bendamustinhydrochlorid, Paclitaxel, Docetaxel, Thiotepa, Arsentrioxid, Vinblastin, Bortezomib, Azacitidin, Vincristin, Vinorelbin, Cidofovir und Idarubicin.
  • Ganz besonders bevorzugt ist Doxorubicin.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums aus einer Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms, dadurch gekennzeichnet, dass amphiphile Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) enthalten in dem Wirkstoffträger der Zusammensetzung an ihrer Disulfidgruppe in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil gespalten werden.
  • Die Spaltung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine enzymatisch katalysierte chemische Spaltung sein oder kann eine nicht enzymatisch katalysierte Reduktion sein, bei der die Disulfidgruppe der Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) in Folge ihrer Reduktion gespalten wird.
  • Bevorzugt ist die Spaltung eine enzymatisch katalysierte Spaltung. Das Enzym, das eine solche chemische Spaltung katalysiert, ist bevorzugt eine Thioreductase, Thiooxidase, Thiooxireductase oder Thidisulfidoxidoreductase.
  • Ebenfalls möglich ist die nicht enzymatisch katalysierte Spaltung der Disulfidgruppe durch Reduktion, wobei als Reduktionsmittel ein Stoff ausgewählt aus der Liste bestehend aus Gluthathion, Cystein, Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), Dithiothreithol (DTT) und 1,4-Dithioerythritol (DTE) eingesetzt wird. Bevorzugt ist das Reduktionsmittel Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP).
  • Die vorgenannten Reduktionsmittel sind unter Umständen vorteilhaft, weil diese üblicherweise ein Reduktionspotential aufweisen, das lediglich ausreicht mindestens eines der beiden Schwefelatome der Disulfidgruppe der Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) zu reduzieren, wodurch deren Bindung gespalten wird. Gleichzeitig reicht das Reduktionspotential der vorgenannten Reduktionsmittel aber nicht aus andere chemische Gruppen der Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) oder Gruppen der weiteren Stoffe der erfindungsgemäßen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms zu reduzieren.
  • Damit wird insbesondere sichergestellt, dass eine Spaltung der amphiphilen Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil stattfindet, wodurch die erfindungsgemäße Freisetzung besonders vorteilhaft erfolgt.
  • Gluthathion und Cystein sind Stoffe, die auch im Körper von Säugern, insbesondere Menschen, an entzündlich veränderten Stellen in besonders hoher Konzentration auftreten, wodurch insbesondere hier mit der vorliegenden Erfindung eine gezielte Freisetzung ermöglicht wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass es ausreicht, das in den Wirkstoffträgern enthaltene Zytostatikum gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) in einen hydrophilen Anteil und einen hydrophoben Anteil zu spalten, was ohne an eine Theorie gebunden zu sein dazu führt, dass das Liposom dergestalt destabilisiert wird, dass es aufbricht und den in ihm enthaltenen Wirkstoff freisetzt.
  • Ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen als Medikament. Insbesondere als Medikament zur Behandlung von Krebs.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und Abbildungen erläutert, ohne sie jedoch hierauf zu beschränken.
  • 1 zeigt eine Aufnahme der Zellen, die mittels Differentialinterferenzkontrast gewonnen wurde, gemäß dem Beispiel 3.
  • 2 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme derselben Zellen, wie sie auch in 1 dargestellt sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie hierauf zu beschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Herstellen einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger mit einem Stoff gemäß Formel (Ia)
  • Der Stoff gemäß der Formel (Ia) wurde gemäß der Beispiele 1–4 der internationalen Anmeldung PCT/EP2010/064272 hergestellt.
  • Der Stoff gemäß Formel (Ia), sowie L-α-phosphatidylcholin („eggPC”, Fa. Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin („DOPE”, Fa. Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) wurden in Chloroform/Methanol (Verhältnis 5:1) gelöst.
  • Die Anteile der vorgenannten Stoffe an dem später aus dieser Lösung erhaltenen Wirkstoffträger, bezogen auf den Wirkstoffträger sind in der Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Zusammensetzung des Wirkstoffträgers der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
    Molarer Anteil [%]
    Stoff gemäß Formel (Ia) „eggPC” „DOPE”
    20 20 60
  • Die somit erhaltene Lösung in dem vorgenannten Chlorofom/Methanol-Gemisch wurde hiernach in einem Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels behandelt, so dass sich eine Zusammensetzung gemäß Tabelle 1 als Feststoff an der Glaswand des Rotationsverdampfers trocken als Film niederschlug.
  • Anschließend wurde der niedergeschlagene Film in Cyclohexan (in Mischung mit 5 Vol.-% Ethanol) aufgenommen und die erhaltene Lösung in eine Glasröhre überführt, die bei –80°C gefroren und über Nacht lyophilisiert wurde.
  • Hiernach wurde der trockenen Zusammensetzung eine wässrige Doxorubicin-Hydrochlorid-Lösung (1 ml mit einer Konzentration von 0.5 mg/ml) zugegeben und die Mischung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt. Die so entstandene Suspension wurde fünf Einfrier- und Auftauvorgängen unterworfen, wobei das Auftauen jeweils mit einem 70°C warmen Wasserbad erfolgte. Zunächst wurden dann 0.1 ml und nach 5 Minuten weitere 0.4 ml wässrige Doxorubicin Lösung (jeweils mit einer Konzentration von 0.5 mg/ml) zu der Suspension gegeben. Somit konnte eine Endkonzentration von ~3 mmol/L Doxorubicin-Hydrochlorid erreicht werden.
  • Anschließend erfolgte ein 11-maliges Durchleiten der Suspension durch einen Polycarbonatfilter mit 100 nm Porendurchmesser.
  • Hierdurch wurde die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit Doxorubicin-Hydrochlorid als Zytostatikum mit einem Wirkstoffträger umfassend einen Stoff gemäß Formel (Ia) erhalten, wobei sich in der vorgenannten wässrigen Lösung unilamellare Vesikel (Wirkstoffträger), die mit Doxorubicin-Hydrochlorid beladen sind, bildeten.
  • Um die vorgenannte Zusammensetzung von überschüssigem, in der wässrigen Lösung befindlichen Doxorubicin Hydrochlorid, das sich nicht im Inneren der Wirkstoffträger befindet zu befreien, wurde das Permeat der vorgenannten Filtration über eine in einer Zentrifugeneinheit befindliche Gelfiltrationssäule geleitet (Säule: Sephadex G 50 (Fine, Fa. Sigma-Aldrich) in 1 ml Polypropylen Säulen, Fa. Qiagen; Zentrifugation: 3 Minuten bei 100–300 × g).
  • Beispiel 2: Funktionalisieren der Zusammensetzung mit monoclonalen Antikörpern
  • 150 μl einer wässrigen Lösung umfassend die Zusammensetzung gemäß Beispiel 1 und 25 μl einer wässrigen Streptavidin-Lösung (1 mg/ml) wurden zu einer PBS(Phosphate buffered saline)-Pufferlösung ohne Calcium- und Magnesiumionen gegeben, so dass ein Gesamtvolumen von 1 ml erreicht wurde.
  • Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen.
  • Hiernach wurden 50 μl Anti-human-p185HER2 Biotin-Konjugat (Fa. Invitrogen, Karslruhe, verwendet, wie erhalten) zugegeben und die Mischung bei 4°C für eine Stunde inkubiert.
  • Dabei wurde eine Zusammensetzung erhalten, die Wirkstoffträger zusammengesetzt gemäß Beispiel 1 enthaltend das Zytostatikum Doxorubicin-Hydrochlorid umfasst und wobei diese Wirkstoffträger an ihrer äußeren Hülle Anti-human-p185HER2 Antikörper aufweisen, die bekanntermaßen speziell an humanen p185HER2-Proteinen, befindlich auf der Oberfläche von humanen Brustkrebszellen, spezifisch anbinden.
  • Beispiel 3: Zellkulturtests mit Zusammensetzung aus Beispiel 2
  • Humane Brustkrebszellen des Typs BT-474 (DSMZ Stamm Nr. ACC 64) wurden in einer 12 ml-Zellkulturflasche als Monolayer bis zu einer Konfluenz von ca. 70% kultiviert. Als Medium wurde DMEM mit 10% FBS, 5% Penicillin-Streptomycin und 2 mM L-Glutamin verwendet.
  • Einen Tag vor der mikroskopischen Untersuchung wurden die Zellen vom Boden der Kulturflasche mit Hilfe einer 0,05%igen Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und in ein 35-mm-Glassbodengefäß überführt (DMEM, 1:4 Verdünnung).
  • Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und mit 1 ml einer PBS-Lösung, welche 25 μl der Zusammensetzung aus Beispiel 2 enthielt, behandelt.
  • Das Ergebnis dieses Expositionsversuchs wurde fluoreszenz-mikroskopisch ausgewertet (Inverted Epifluorescence Microscope, Fa. Zeiss, Typ: Axiovert 100). Vor jeder mikroskopischen Aufnahme wurden die Zellen viermal mit PBS mit Calcium und Magnesiumionen gewaschen.
  • Für jede Auswertung wurden drei mikroskopische Bilder aufgenommen und die Fluoreszenzintensität jeweils an zehn Stellen innerhalb der Zellen ermittelt und daraus die mittlere Fluoreszenz ermittelt. Analog wurde mit dreimal zehn Stellen außerhalb der Zellen verfahren, um die mittlere Hintergrundfluoreszenz zu ermitteln. Die Differenz daraus ergibt das mittlere Fluoreszenzsignal.
  • Da das Zytostatikum Doxorubicin-Hydrochlorid bekanntermaßen fluoresezenzaktiv ist, konnte somit erfasst werden, ob das Zytostatikum freigesetzt und durch die Zellen aufgenommen wurde.
  • Es zeigte sich hierbei, dass dieses mittlere Fluoreszenzsignal (Differenz aus Hintergrund und Fluoreszenz der Zellen durch den Wirkstoff) 58,94 ± 11,17 (a. u.) betrug. Dies ist ausreichend, um die Aufnahme und damit die vorhergehende Freisetzung des Zytostatikums zu belegen.
  • Die 2 zeigt hierfür noch einmal getrennt das selektive Fluoreszenzsignal in den Zellen, wobei die hellen Stellen die Fluoreszenzsignale des Doxorubicin in den Zellen (wie dargestellt in der 1 in Differentialinterferenzkontrastaufnahme) verdeutlichen. Diese wären farblich als rot-orange Lichtemission zu erkennen. Man erkennt bei jeder Zelle gemäß 1 ein entsprechendes Fluoreszenzsignal im Inneren der Zellen, so dass die Aufnahme durch die Zellen und somit die vorherige Freisetzung des Doxorubicin-Hydrochlorid nachgewiesen ist. Da der Zellkultur kein reduzierendes Agens zugesetzt wurde, erfolgte die Freisetzung aus der erfindungsgemäßen Zusammensetzung alleinig durch Anwesenheit der Zellen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 2000/059474 A1 [0012, 0012, 0013, 0014, 0017, 0019, 0021, 0021, 0022]
    • EP 2010/064272 [0087]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
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    • J. Davidsen et al. [0006]
    • J. Davidsen et al. [0007]
    • J. Davidsen et al. [0008]
    • Meng et al. wird in „Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications” erschienen in Biomaterials 30 (2009) 2180–2198 [0009]
    • Meng et al. [0011]
    • D. Mustacich et al. in Biochem. J. (2000) 346, 1–8 [0024]

Claims (10)

  1. Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms das ein Zytostatikum enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger mindestens einen Stoff gemäß der Formel (I)
    Figure 00160001
    umfasst, wobei der mindestens eine Stoff gemäß der Formel (I) (a) in X eine chemischen Gruppe umfassend mindestens fünf Kohlenstoffatome und umfassend mindestens eine Ethergruppe und/oder Amingruppe oder Ammoniumgruppe aufweist, und wobei (b) n und m unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 30 ist, wobei aber die Summe aus n und m mindestens 16 beträgt.
  2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Gruppe X mindestens acht Kohlenstoffatome umfasst.
  3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Gruppe X zusätzlich mindestens eine Carbonsäureestergruppe umfasst.
  4. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe der chemischen Gruppe X der Stoffe gemäß der Formel (I) in dem Wirkstoffträger eine quarternäre Ammoniumgruppe ist.
  5. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger einen Stoff gemäß der Formel (I*)
    Figure 00160002
    umfasst, wobei die chemische Gruppe Y eine chemische Gruppe ausgewählt aus der Liste bestehend aus Biotin, Protein, Peptid, Glykogruppe, Nucleinsäure, Nucleosid oder Nucleotid ist.
  6. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger einen Stoff gemäß der Formel (Ia)
    Figure 00170001
    umfasst.
  7. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese im Wirkstoffträger auch Phospholipide, insbesondere Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylethanolamin umfasst.
  8. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytostatikum ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus Doxorubicin, Pemetrexed, Melphalan, Amsacrin, Asparaginase, Bevacizumab, Bleomycin, Busulfan, Irinotecan, Carmustin, Daunorubicin, Cisplatin, Dactinomycin, Gancyclovir, Cytarabin, Dacarbazin, Cytarabin, Vindesin, Oxaliplatin, Cyclophosphamid, Cetuximab, Etoposid, Epirubicin, Fludarabin, 5-Fluorouracil, Gemcitabin, Trastuzumab, Ifosfamid, Topotecan, Cladribin, Alemtuzumab, Rituximab, Methotrexat, Mitomycin, Mitoxantron, Gemtuzumab, Carboplatin, Aldesleukin, Bendamustin-hydrochlorid, Paclitaxel, Docetaxel, Thiotepa, Arsentrioxid, Vinblastin, Bortezomib, Azacitidin, Vincristin, Vinorelbin, Cidofovir und Idarubicin.
  9. Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums aus einer Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass amphiphile Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) enthalten in dem Wirkstoffträger der Zusammensetzung an ihrer Disulfidgruppe, in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil gespalten werden.
  10. Verwendung der Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 als Medikament.
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