DE69837807T2 - Kationische lipidzusammenstellung zur markierung von angiogenischen endothelzellen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung kann zur Behandlung einer Vielzahl verschiedener Erkrankungen und Abnormalitäten angewendet werden. Im Allgemeinen wird Krebs gegenwärtig direkt mit Hilfe physikalischer Mittel behandelt wie beispielsweise durch das operative Entfernen kanzerogenen Gewebes. Desweiteren kann er mit Hilfe von chemischen Mitteln behandelt werden wie z. B. einer Chemotherapie. Diese und verwandte Behandlungen sind im Allgemeinen darauf gerichtet das kanzerogene Gewebe direkt zu behandeln. Um verständlich zu machen, inwiefern sich die vorliegende Erfindung von konventionellen Behandlungsmethoden unterscheidet, wird eine kurze allgemeine Beschreibung gegenwärtiger Behandlungstechnologien auf diesen Gebieten bereitgestellt.
  • BEHANDLUNG VON KREBSERKRANKUNGEN
  • Die Bezeichnung „Krebs" umfasst ein Spektrum von Erkrankungen, das hinsichtlich Behandlung, Prognose und Heilungschancen variiert. Der Ansatz zur Diagnose und Behandlung hängt von der Tumorurspungsstelle, dem Ausmaß der Ausbreitung, den betroffenen Stellen, dem physiologischen Zustand des Patienten und der Prognose ab. Sobald der Tumor diagnostiziert ist, wird er üblicherweise „eingestuft", ein Vorgang, der den Einsatz von Techniken der Chirurgie, der physikalischen Untersuchung, Histopathologie, Bildaufzeichnung und Laborbewertung einschließt, um das Ausmaß der Erkrankung zu bestimmen und um die Population der Krebspatienten in Gruppen, in Reihenfolge der abnehmenden Heilungswahrscheinlichkeit, einzuteilen. Solche Systeme werden sowohl dazu verwendet, die Behandlung zu planen, als auch um die Prognose für den Patienten zu erstellen (Stockdale, F., 1996, „Prinziples of Cancer Patient Managment", in: Scientific American Medicine, Band 3, Dale, D.C., und Federman, D.D. (Hrsg.), Scientific American Press, New York). Die Art oder das Stadium des Krebses kann bestimmen, welche der drei allgemeinen Behandlungsarten verwendet werden wird: Operation, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie. Ein aggressiver Behandlungsplan einer kombinierten Modalität kann ebenfalls gewählt werden. Zu diesem Zweck kann eine Operation dazu eingesetzt werden, den Primärtumor zu entfernen, und die verbleibenden Zellen werden durch eine Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie behandelt (Rosenberg, S.A., 1985, „Combined-modality therapy of cancer: what is it and when does it work?" New Engl. J. Med. 312: 1512–14).
  • Eine Operation spielt die zentrale Rolle bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Im Allgemeinen ist ein operativer Eingriff für eine Biopsie erforderlich, und eine Operation kann für die meisten Krebspatienten die endgültige Behandlung darstellen. Eine Operation wird ebenfalls dazu verwendet, die Tumormasse zu reduzieren, Metastasen herauszuschneiden, medizinische Notfälle zu bewältigen, palliative Maßnahmen zu ergreifen und zu rehabilitieren. Obwohl die primäre chirurgische Technik zur Behandlung von Krebs die Entwicklung eines Anwendungsbereiches beteiligt hat, in dem Tumore unter direkter Visualisierung entfernt werden, ermöglichen die heutigen Techniken, dass manche Resektionen mit Hilfe endoskopischer Mittel durchgeführt werden. Ein Hauptanliegen bei der Behandlung von Krebs ist die Berücksichtigung des Operationsrisikos (Stockdale, F., supra).
  • Die Bestrahlungstherapie spielt sowohl bei der primären, als auch bei der palliativen Krebsbehandlung eine wichtige Rolle. Sowohl Teletherapie (Megavolt-Bestrahlungstherapie), als auch Brachytherapie (interstitielle und intracavitäre Bestrahlung) sind gängige Praxis. Die elektromagnetische Bestrahlung in Form von Röntgenstrahlen wird am häufigsten in der Teletherapie zur Behandlung allgemeiner maligner Tumore verwendet, wohingegen Gammastrahlen, eine Form elektromagnetischer Strahlung ähnlich der Röntgenstrahlen, die von radioaktiven Isotopen von Radium, Kobalt und anderen Elementen emittiert wird, ebenfalls verwendet wird. Durch eine Bestrahlungstherapie wird Energie zu Geweben als einzelne Energiepakete, genannt Photonen, transportiert, die sowohl malignes, als auch normales Gewebe schädigt, indem eine Ionisierung in den Zellen erzeugt wird. Das Ziel für die Ionen ist meistens die DNA: Eine Bestrahlungstherapie nutzt die Tatsache aus, dass Strahlenschäden nicht gleichmäßig über malignes und normales Gewebe verteilt sind – sich schnell teilende Zellen sind empfindlicher gegenüber einer DNA Schädigung als ruhende Zellen (Pass, H.I., 1993, „Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use", J. Natl. Cancer Instit. 85: 443–56). Eine Bestrahlungstherapie ist mit einzigartigen Vorteilen sowie mit wichtigen Toxizitäten verbunden. Bestrahlung wird in bestimmten anatomischen Bereichen (z. B. dem Mediastinum) bevorzugt, wo Bestrahlung das einzige mögliche lokale Behandlungsverfahren darstellen kann, und Bestrahlung auch die einzige mögliche lokale Behandlungsmodalität sein kann, wenn der vom Tumor betroffene Bereich ausgedehnt ist. Bestrahlung kann auch eingesetzt werden, wenn der Patient einen chirurgischen Eingriff als nicht akzeptabel empfindet, oder wenn der medizinische Zustand des Patienten einen chirurgischen Eingriff verbietet. Eine Bestrahlungsbehandlung bringt eine Schädigung des Gewebes mit sich, welche zu frühen oder späten Strahlenschäden führen kann. Die frühen Effekte (akute Toxizität der Bestrahlungstherapie) umfassen Erythemen der Haut, Desquamation, Ösophagitis, Übelkeit, Alopezie und Mylosuppression, während die späten Effekte Gewebenekrose und Fibrose einschließen und üblicherweise die Grenztoxizität der Bestrahlungstherapie bestimmen (Stockdale, F., supra).
  • Nahezu alle chemotherapeutischen Agentien, die derzeit verwendet werden, greifen in die DNA-Synthese, die Bereitstellung von Vorläufern der DNA- und RNA-Synthese oder in die Mitose ein und zielen somit auf proliferierende Zellen ab (Stockdale, F., „Cancer growth and chemotherapy", supra). Tumoruntersuchungen bei Tieren und klinische Studien an Menschen haben gezeigt, dass Wirkstoffkombination höhere objektive Antwortraten und ein längeres Überleben erzielen als einzelne Agentien (Frei, E. III, 1972, „Combination cancer therapy: presidential address", Cancer Res. 32: 2593–2607). Eine kombinierte Wirkstofftherapie macht sich die unterschiedlichen Wirkmechanismen und zytotoxischen Potentiale mehrerer Wirkstoffe, einschließlich alkylierender Agentien, Antimetabolite und Antibiotika zunutze (Devita, V.T., et al., 1975, „Combination versus single agent chemotherapy: a review of the basis for selection of drug treatment of cancer", Cancer 35: 98–110). Der physiologische Zustand des Patienten, die Wachstumsmerkmale des Tumors, die Heterogenität der Tumorzellpopulation und der Resistenzstatus des Tumors gegenüber mehreren Wirkstoffen beeinflussen die Wirksamkeit der Chemotherapie. Im Allgemeinen ist Chemotherapie nicht zielgerichtet (obwohl diese Techniken entwickelt werden, z. B. Pastan, I., et al., 1986, „Immunotoxins", Cell 47: 641–648), und Nebenwirkungen wie Knochenmarksdepression, Gastroenteristis, Übelkeit, Alopezie, Leber- oder Lungenschäden oder Sterilität auftreten können.
  • GEGENWÄRTIGE BEHANDLUNGEN – IMMUNOLOGIE
  • Die oben beschriebenen Behandlungsformen hatten unterschiedliche Erfolgsquoten. Da die Erfolgsquote in vielen Fällen nicht annähernd perfekt ist, fährt die Forschung fort, verbesserte Behandlungen zu entwickeln. Ein viel versprechendes Gebiet der Forschung betrifft die Beeinflussung des Immunsystems. Durch Verwendung von Genmanipulation und/oder chemischer Stimulation ist es möglich, Immunantworten zu modifizieren und/oder zu stimulieren, so dass das körpereigene Immunsystem die Erkrankung behandelt, z. B. dass Antikörper Tumorzellen zerstören. Diese Art der Behandlung unterscheidet sich von den oben beschriebenen Behandlungen insofern, als ein biologischer Vorgang ausgenutzt wird, um eine Erkrankung zu bekämpfen. Bei der Behandlung handelt es sich jedoch noch immer um eine direkte Behandlung, was bedeutet, dass die erzeugten Antikörper direkt Tumorzellen angreifen.
  • Die vorliegende Erfindung kann zu Behandlungen eingesetzt werden, die eine radikale Abkehr von normalen Behandlungen darstellen, indem die vorliegende Erfindung keine direkte Beeinflussung der kanzerogenen, beschädigten oder entzündeten Zellen beinhaltet.
  • Es wurde zumindest theoretisch erkannt, dass es möglich ist, Krebs oder Entzündungen, die mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, durch eine Hemmung der Angiogenese zu behandeln. Ein typisches Beispiel für die derzeitige Denkweise in diesem Zusammenhang wird in der PCT-Veröffentlichung WO 95/25543 diskutiert, die am 28. September 1995 veröffentlicht wurde. Diese veröffentlichte Anmeldung beschreibt die Hemmung der Angiogenese durch Verabreichung eines Antikörpers, der an ein Antigen bindet, von dem man annimmt, dass es auf der Oberfläche von angiogenen Endothelzellen vorhanden ist. Insbesondere beschreibt die Anmeldung die Verabreichung eines Antikörpers, der an αγβ3 bindet, welches ein Membranrezeptor ist, von dem man annimmt, dass er Zell-Zell und Zell-extrazelluläre-Matrix Wechselwirkungen, die im Allgemeinen auch als Zelladhäsionsereignisse bekannt sind, vermittelt. Durch Blockierung dieses Rezeptors hofft die Behandlung Angiogenese zu hemmen und somit Krebs und Entzündungen zu behandeln.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Offenbart ist ein kationisches Liposom, das mindestens ein kationisches Lipid in einer Menge von mindestens 5 Mol% und gegebenenfalls neutrale Lipide und eine toxische Verbindung, die eine angiogene Endothelzelle eines Tumors zerstört, umfasst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Zetapotential besitzt, das größer als 0 mV ist, wenn es sich in physiologischem pH befindet, sowie die Verwendung des erfindungsgemäßen Liposoms zur selektiven Verabreichung der toxischen Verbindung an angiogene Endothelzellen eines Tumors. Die Verwendung beinhaltet die Injektion, vorzugsweise in das Blutgefäßsystem und weiter bevorzugt intraarteriell, von kationischen Liposomen, die kationische Lipide und eine toxische Verbindung umfassen, die eine angiogene Endothelzelle eines Tumors zerstört. Nach der Verabreichung assoziieren die kationischen Liposomen selektiv mit angiogenen Endothelzellen, was bedeutet, dass sie mit angiogenen Endothelzellen zu einem fünffach höheren Maß (bevorzugt zehnfach oder mehr) assoziieren als mit korrespondierenden ruhenden Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen. Sobald die Liposomen mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, werden sie von den Endothelzellen aufgenommen und zeigen ihre erwünschte Wirkung. Der Wirkstoff kann Endothelzellen zerstören. Die Erfindung schließt eine Zusammensetzung zur selektiven Beeinflussung angiogener Endothelzellen ein, welche kationische Lipide und eine toxische Verbindung umfassen, wobei die Zusammensetzung im Blut eine höhere Affinität zu angiogenen Endothelzellen besitzt, verglichen mit korrespondierenden normalen Endothelzellen, wobei die Zusammensetzung selektiv mit angiogenen Endothelzellen eines angiogenen Blutgefäßes für so lange und in einer Weise assoziiert, dass die Zusammensetzung in die angiogenen Endothelzellen gelangt. Diese Zusammensetzung ist vorzugsweise zur Verabreichung durch Injektion in das Blutgefäßsystem eines Säugers formuliert. Die Zusammensetzung hat vorzugsweise im Blut eine fünffache oder höhere und weiter bevorzugt zehnfach oder höhere Affinität zu angiogenen Endothelzellen verglichen mit korrespondierenden normalen Endothelzellen. Die Zusammensetzung umfaßt vorzugsweise eine Menge von 5 Mol% oder mehr kationische Lipide.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Zerstörung eines ungewollten Tumors durch die Verabreichung einer toxischen Verbindung an angiogenen Endothelzellen des Tumors, wobei diese Verbindung die angiogenen Endothelzellen und anschließend die Tumorzellen zerstört.
  • Ein Merkmal der Erfindung ist, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen selektiv mit einer viel höheren Präferenz (fünffach oder mehr und bevorzugt zehnfach oder mehr) mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, als sie mit korrespondierenden Endothelzellen assoziieren, die nicht an Angiogenese beteiligt sind.
  • Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen verwendet werden können, um präzise kleine Mengen toxischer Verbindungen an Endothelzellen zu verabreichen, wobei die Zellen in einer Weise beeinflusst (z. B. getötet) werden, so dass das Blutgefäß zerstört oder in seiner Funktion ausgeschaltet wird, wie beispielsweise durch ein einen Blutklumpen und die Nährstoffversorgung an das umgebende Gewebe (wie Tumorzellen) abgeschnitten und das Gewebe dadurch zerstört wird (z. B. Zerstörung eines soliden Tumors).
  • Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen dazu verwendet werden können, Angiogenese zu hemmen, die mit malignen oder gutartigen Tumoren in Verbindung stehen, die mit fortgesetzter Angiogenese verbunden sind.
  • Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist, dass verschiedene Klassen von Erkrankungen und/oder Abnormalitäten behandelt werden, ohne direkt das mit der Abnormalität verbundene Gewebe zu behandeln, z. B. wird durch eine Hemmung der Angiogenese die Blutzufuhr zu einem Tumor abgeschnitten und der Tumor wird getötet, ohne dass die Tumorzellen in irgendeiner Weise direkt behandelt werden.
  • Diese und andere Gegenstände, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden einem Fachmann durch Lesen der bereitgestellten Offenbarung in Verbindung mit den beigefügten Abbildungen ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Die 1–10 sind hier sowohl in einer farbigen Version, als auch in einer schwarz-weiß Version eingereicht. Da die Erfindung am besten durch farbige Fotos verstanden wird, welche unter gängiger PCT-Anmeldungspraxis nicht akzeptiert werden könnten, wurden diese hier mit eingereicht. Farbige Fotos der 1–10 gibt es in der U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 08/820,337, die am 12. März 1997 eingereicht wurde. Weiterhin werden farbige Fotos, die klar die höhere Affinität der markierten Komplexe der Erfindung zu angiogenen Endothelzellen im Vergleich zu korrespondierenden normalen Endothelzellen zeigen, in Thurston et al., „Cationic Liposomes Target Angiogenic Endothelial Cells in Tumors and Inflammtion in Mice", J. Clin. Invest, 1. April, 1998, gezeigt.
  • 1 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme, die die Aufnahme rot fluoreszierender CM-Dil-markierter DDAB:Cholesterin-DNA-Komplexe in angiogenen Blutgefäßen eines Follikels in einem normalen Mauseierstock zeigt (Skalaleiste: 60 μm).
  • 2 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme, die die Aufnahme rot fluoreszierender CM-Dil-markierter DDAB:Cholesterin-DNA-Komplexe in angiogenen Blutgefäßen in einem Abschnitt eines Pankreastumors in einer RIP1-Tag 5-Maus zeigt – die Gefäße sind grün mit einem fluoreszierenden Lektin angefärbt (Skalaleiste: 40 μm).
  • 3 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit geringer Vergrößerung, die eine geringe bzw. keine Aufnahme Texas Red-markierter DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexe (gelb-orange) in Blutgefäße einer normalen Maus-Pankreasinsel zeigt (Skalaleiste: 150 μm).
  • 4 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme mit geringer Vergrößerung, die die Aufnahme Texas Red-markierter DOTAP:Cholesterin-DNA- Komplexe (gelb-orange) in Blutgefäße eines Pankreastumors in einer RIP1-Tag2-Maus zeigt (Skalaleiste: 150 μm).
  • 5 ist eine konfokalmikroskopische Aufnahme, die eine geringe bzw. keine Aufname Texas-Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einer normalen Pankreasinsel zeigt, in der die Gefäße (grün) mit fluoreszierendem Lektin angefärbt wurden (Skalaleiste: 50 μm).
  • 6 zeigt eine konfokalmikroskopische Aufnahme der Aufname Texas-Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einen Pankreastumor einer RIP1-Tag2-Maus. Die Gefäße wurden mittels Perfusion eines fluoreszierenden Lycopersicon esculentum Lektins (grün) angefärbt, nachdem die Liposomen intravenös injiziert wurden (Skalaleiste: 50 μm).
  • 7 zeigt eine konfokalmikroskopische Aufnahme der Aufnahme Texas-Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einen Pankreastumor einer RIP1-Tag2-Maus. Die Gefäße wurden mittels Perfusion eines fluoreszierenden Lycopersicon esculentum Lektins (grün) angefärbt, nachdem die Liposomen intravenös injiziert wurden (Skalaleiste: 50 μm).
  • 8 zeigt eine konfokalmikroskopische Aufnahme der Aufnahme Texas-Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einen Pankreastumor einer RIP1-Tag2-Maus. Die Gefäße wurden mittels Perfusion eines fluoreszierenden Lycopersicon esculentum Lektins (grün) angefärbt, nachdem die Liposomen intravenös injiziert wurden. Mögliche Stellen eines Gefäßwachstums zeigen eine starke Aufnahme (Skalaleiste: 50 μm).
  • 9 ist eine konfokalmikroskopische Aufnahme, die eine geringe Aufnahme Texas Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in normalen Blutgefäßen in der Luftröhre einer pathogenfreien Maus zeigt. Die Gefäße sind mit einem fluoreszierenden Lektin grün angefärbt (Skalaleiste: 50 μm).
  • 10 zeigt eine konfokalmikroskopische Aufnahme der Aufnahme Texas Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in angiogenen Blutgefäßen in der Luftröhre einer Maus mit einer Mycoplasma pulmonis Infektion (Skalaleiste: 50 μm).
  • 11 ist ein Diagramm, das die Aufnahmemenge Texas Red-markierter DOTAP:Cholesterin-Liposomen durch Blutgefäße pathogenfreier (normaler) und Mycoplasma pulmonis infizierter Mausluftröhren zeigt, die durch Messung der Intensität der Liposomenfluoreszenz 4 Stunden nach intravenöser Injektion gemessen wurde. Die Messungen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 410 Mikroskop durchgeführt. Die infizierten Mäuse wurden intranasal mit M. pulmonis Organismen beimpft und nach 4 Wochen untersucht. Das Sternchen zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied (P < 0.05, Mittel +/– SE, n = 4 Mäuse pro Gruppe).
  • 12 ist eine transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme, die DOTAP:Cholesterin Liposomen zeigt, die mit einer Endothelzelle in der Luftröhre einer M. pulmonis-infizierten Maus assoziiert ist (Skalaleiste: 50 μm) und
  • 13 ist eine transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme, die DOTAP:Cholesterin Liposomen zeigt, die von einer Endothelzelle in der Luftröhre einer M. pulmonis-infizierten Maus aufgenommen wurden (Skalaleiste: 80 μm).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Bevor das vorliegende Verfahren der selektiven Beeinflussung angiogener Endothelzellen und Liposomen, die im Verfahren verwendet werden, beschrieben werden, sollte verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf die bestimmten Liposomen oder Verfahren, die beschrieben sind, als solche beschränkt ist, sondern selbstverständlich variieren jönnte. Es sollte außerdem verstanden werden, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient.
  • Es ist anzumerken, dass die wie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendeten Singluarformen „ein", „und" und „der", „die", „das", auch die entsprechenden Pluralformen einschließen, sofern sich aus dem Zusammenhang nicht deutlich etwas anderes ergibt. So schließt die Bezugnahme auf „ein Liposom" beispielsweise Mischungen und eine große Anzahl solcher Liposomen ein, die Bezugnahme auf „ein Agens" eine große Anzahl von Agentien und deren Mischungen und die Bezugnahme auf „das Verfahren" ein oder mehrere Verfahren oder Schritte des Typs, der hierin beschrieben ist.
  • Die hierin diskutierten Veröffentlichungen sind ausschließlich aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Erfindung angegeben. Es soll jedoch nichts hierin so gedeutet werden, dass die vorliegende Erfindung nicht dazu berechtigt ist, aufgrund ihres früheren Erfindungszeitpunkts diesen Publikationen vorauszugehen.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein von einem Fachmann im Bereich dieser Erfindung verstanden werden.
  • DEFINITIONEN
  • Die Begriffe „Behandlung", „Behandeln" und „behandeln" und dergleichen werden hierin mit der Bedeutung verwendet, dass eine gewünschte pharmakologische und/oder physiologische Wirkung erzielt wird. Die Wirkung kann prophylaktisch sein, im Sinne einer vollständigen oder teilweisen Vorbeugung einer Krankheit oder eines ihrer Symptome und/oder kann therapeutisch sein, im Sinne einer teilweisen oder vollständigen Stabilisierung oder Heilung einer Krankheit und/oder von Nebenwirkungen, die mit der Krankheit zusammen hängen. Wie hierin verwendet schließt „Behandlung" jede Behandlung einer Krankheit bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen ein und umfasst:
    • (a) Vorbeugen gegen das Auftreten der Krankheit oder des Symptoms bei einem Lebewesen, das für diese Krankheit oder dieses Symptom prädisponiert sein könnte, welches mit dieser Krankheit oder diesem Symptom bisher aber noch nicht diagnostiziert wurde,
    • (b) Hemmen des Krankheitssymptoms, d.h. Anhalten seiner Entwicklung und
    • (c) Lindern des Krankheitssymptoms, d.h. Bewirken des Rückgangs der Krankheit oder des Symptoms.
  • Der Begriff „Angiogenese" bezieht sich auf einen Vorgang der Gewebevaskularisierung, der die Entwicklung neuer Blutgefäße einschließt.
  • Angiogenese erfolgt durch einen von drei Mechanismen: (1) Neovaskularisierung, bei der Endothelzellen aus zuvor vorhandenen Blutgefäßen wandern und beginnen, neue Blutgefäße zu bilden, (2) Vaskulogenese, bei der die Blutgefäße aus Vorläuferzellen neu entstehen oder (3) vaskuläre Expansion, bei der sich vorhandene kleine Blutgefäße in ihrem Durchmesser vergrößern, um größere Blutgefäße zu bilden (Blood, C.H. und Zetter, B.R., 1990, Biochem. Biophys. Acta 1032: 89–118).
  • Angiogenese ist ein wichtiger Vorgang in normalen neonatalen Wachstumsvorgängen und im weiblichen Reproduktionssystem während des Gelbkörper-Wachstumszyklus (siehe Moses, M.A., et al., 1990, Science 248: 1408–10). Unter normalen Bedingungen sind alle Prozesse, die die Neubildung oder Umbildung vorhandener oder neuer Blutgefäße einschließen, selbstlimitierende Vorgänge, und die Expansion spezifischer Zelltypen ist reguliert und aufeinander abgestimmt.
  • Angiogenese ist auch an der Wundheilung und an der Pathogenese einer großen Anzahl klinischer Erkrankungen, einschließlich Gewebeentzündung, Arthritis, Asthma, Tumorwachstum, diabetische Retinopathie und anderer Zustände beteiligt. Klinische Erscheinungsformen, die mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, werden als angiogene Erkrankungen bezeichnet (Folkman, J. und Klagsbrun, M., 1987, Science 235: 442–7).
  • Viele Versuche haben vermuten lassen, dass Gewebe angiogene Faktoren produzieren können, die die Angiogenese unter den Bedingungen einer geringen Blutzufuhr, sowohl unter normalen, als auch unter pathologischen Bedingungen, fördern. Diese Faktoren und Verbindungen unterscheiden sich in ihrer Zellspezifität und im Mechanismus, durch den sie das Wachstum neuer Blutzellen hervorrufen. Diese Faktoren wirken durch eine Vielzahl von Mechanismen. Beispielswiese können sie die Wanderung und Proliferation von Endothelzellen hervorrufen oder die Produktion von Kollagenase stimulieren (siehe Klagsbrun, M. und D'Amore, P.A., 1991, „Regulators of angiogenesis", Ann. Rev. Physiol. 53: 217–39). Es gibt eine Reihe von Bioassays, die die direkte Bestimmung angiogener Aktivitäten erlauben (Wilting, J., et al., 1991, „A modified chorioallantoic membrane (CAM) assay for qualitative and quantitative study of growth factors. Studies on the effects of carriers, PBS, angiogenin, and bFGF", Anat. Embryol. (Berl) 183: 259–71).
  • Es wurde vorgeschlagen, dass angiogene Inhibitoren bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich sein könnten. Zum Beispiel kann das Eingreifen in die Angiogenese Tumorwachstum einschränken. Verschiedene Mittel zur Hemmung von Angiogenese wurden vorgeschlagen, einschließlich: (1) Hemmung der Ausschüttung angiogener Faktoren, (2) Neutralisierung angiogener Faktoren durch die Verwendung solcher Mittel wie monoklonalen Antikörpern und (3) Hemmung endothelialer Zellantworten (Folkman, J., et al., 1992, Seminars in Cancer Biology 3: 89–96) durch die Verwendung anti-angiogener Faktoren, also Molekülen, die bekanntermaßen Angiogenese hemmen. Verschiedene solcher Endothelzell-Inhibitoren wurden beschrieben, wie zum Beispiel der Kollagenase-Inhibitor, Basalmembranumsatz-Inhibitoren, angiostatische Steroide, Inhibitoren aus Pilzen, Platelet Factor 4, Thrombospondin, Arthritisarzneimittel wie z. B. Penicillamin und alpha-Interferon und anderen (siehe Folkman, J., et al., 1992, Seminars in Cancer Biology 3: 89–96, für Beispiele siehe Stepien, H., et al., 1996, „Inhibitory effects of fumagillin and its analogue TNP-470 on the function, morphology, and angiogenesis of an oestrogen-induced prolactinoma in Fischer 344 rats", J. Endocrinol. 150: 99–106, Maione, T.E., et al., 1990, „Inhibition of angiogenesis by recombinant human platelet factor-4 and related peptides", Science 247: 77–9).
  • Der Begriff „Endothelzellen" bezeichnet solche Zellen, die das Endothel bilden, die Einzelschicht einfacher Squamosazellen, welche die innere Oberfläche des Blutkreislaufsystems auskleiden. Diese Zellen behalten die Fähigkeit zur Zellteilung bei, obwohl sie unter normalen Bedingungen sehr langsam proliferieren, und vielleicht nur einmal im Jahr eine Zellteilung durchlaufen. Die Proliferation von Endothelzellen kann durch die Verwendung von [3H]Thymidin zur Markierung von Zellen in der S-Phase gezeigt werden. In normalen Gefäßen ist der Anteil an Endothelzellen, die markiert werden, besonders hoch an Verzweigungspunkten in Arterien, wo Turbulenz und Abnutzung die Zellerneuerung anzuregen scheinen (Goss, R.J., 1978, The Physiology of Growth, Academic Press, New York, Seiten 120–137). Normale Endothelzellen sind ruhend, d.h. sie teilen sich nicht und sind daher von angiogenen Endothelzellen unterscheidbar, wie weiter unten diskutiert wird.
  • Endothelzellen besitzen auch die Fähigkeit zu wandern, ein Vorgang der bei der Angiogenese wichtig ist. Endothelzellen bilden neue Kapillaren in vivo, wenn sie benötigt werden, wie zum Beispiel während der Wundheilung, oder wenn eine erkennbare Notwendigkeit für sie besteht, wie bei der Tumorbildung. Die Bildung neuer Blutgefäße wird als Angiogenese bezeichnet und beteiligt Moleküle (angiogene Faktoren), die mitogen oder chemo-anziehend für Endothelzellen sein können (Klagsbrun, supra). Während der Angiogenese können Endothelzellen aus einem vorhandenen Kapillargefäß wandern, um die Bildung eines neuen Blutgefäßes zu beginnen, d.h. die Zellen eines Gefäßes wandern in einer Art, die die Extension dieses Blutgefäßes erlaubt (Speidel, C.C., Am J. Anat. 52: 1–79). In vitro-Studien haben sowohl die Proliferation, als auch die Migration von Endothelzellen dokumentiert. Endothelzellen, die in Kultur gehalten werden, können proliferieren und spontan kapillare Röhren bilden (Folkman, J. und Haudenschild, C., 1980, Nature 288: 551–56).
  • Die Begriffe „angiogene Endothelzellen" und „Endothelzellen, die Angiogenese durchlaufen" und dergleichen werden hierin austauschbar verwendet um Endothelzellen (wie oben definiert) zu bezeichnen, die Angiogenese durchlaufen (wie oben definiert). Angiogene Endothelzellen sind daher Endothelzellen, die mit einer Geschwindigkeit proliferieren, die weit oberhalb der normalen Bedingung einer Zellteilung von etwa einmal pro Jahr liegt. Der Unterschied zu einer normalen Proliferationsrate von Endothelzellen kann das 2-, 5- oder 10-fache oder mehr einer normalen Proliferationsrate betragen und stark variieren, abhängig von Faktoren wie zum Beispiel dem Alter und Zustand des Patienten, der Art des beteiligten Tumors, der Art der Wunde etc. Vorausgesetzt, dass der Unterschied im Proliferationsausmaß zwischen normalen Endothelzellen und angiogenen Endothelzellen messbar ist und als biologisch signifikant erachtet wird, dann sind die beiden Zelltypen mit Hilfe der vorliegenden Erfindung unterscheidbar, d.h. angiogene Endothelzellen sind von korresponierenden normalen ruhenden Endothelzellen hinsichtlich der bevorzugten Bindung kationischer Liposomen unterscheidbar.
  • Der Begriff „korrespondierende Endothelzellen", „normale oder ruhende Endothelzellen" und dergleichen wird so verwendet, dass er sich auf normale, ruhende Endothelzellen innerhalb desselben Gewebetyps (unter normalen Bedingungen) bezieht, wenn einige der Endothelzellen Angiogenese durchlaufen und einige der Endothelzellen ruhend sind. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt angiogene Endothelzellen angesteuert, und sie werden mit einer Präferenz angesteuert, die fünffach, bevorzugt zehnfach größer ist als bei korrespondierenden ruhenden Endothelzellen.
  • Der Begriff „Lipid" wird in seiner herkömmlichen Bedeutung als generischer Ausdruck verwendet, der Fette, Lipide und die Alkohol-Ether löslichen Bestandteile des Protoplasmas, das in Wasser unlöslich ist, umfasst. Lipide setzen Fette, fettige Öle, essentielle Öle, Wachse, Steroide, Sterole, Phospholipide, Glycolipide, Sulfolipide, Aminolipide, Chromolipide (Lipochrome) und Fettsäuren zusammen. Der Begriff umfasst sowohl natürlich auftretende, als auch synthetisch hergestellte Lipide. Bevorzugte Lipide in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Phospholipide, einschließlich Phosphatidylcholine und Phosphatidylethanolamine, sowie Sphingomyeline. Sofern es sich um Fettsäuren handelt, können dies 12–24 Kohlenstoffatome lang sein, bis zu 6 ungesättigte Reste (Doppelbindungen) enthalten und mit dem Grundgerüst über Acyl- oder Etherbindungen verbunden sein. Sofern mehr als eine Fettsäure mit dem Grundgerüst verbunden ist, können die Fettsäuren unterschiedlich (asymmetrisch) sein, oder es könnte nur eine Fettsäurekette vorhanden sein, z. B. Lysolezithine. Gemischte Formulierungen sind ebenfalls möglich, insbesondere wenn die nicht kationischen Lipide aus natürlichen Quellen stammen, wie z. B. Lezithine (Phosphatidylcholine), die aus Eigelb, Schweineherz, Hirn, Leber oder Sojabohnen gereinigt wurden. Steroide und Sterole, insbesondere Cholesterin und Sterole, die an der 3β-Position substituiert sind.
  • Der Begriff „kationisches Lipid" wird hierin so verwendet, dass jedes Lipid der Erfindung (wie oben definiert), das kationisch ist, umfasst ist. Das Lipid wird als kationisch bezeichnet, wenn das Lipid (in physiologischem pH-Wert) eine positive Ladung trägt, die durch die zum Zeitpunkt der Messung verwendeten Instrumente messbar ist. Wenn an dem kationischen Lipid Fettsäuren vorhanden sind, so können sie 12–24 Kohlenstoffatome lang sei, bis zu 6 ungesättigte Reste (Doppelbindungen) enthalten und mit dem Grundgerüst über Acyl- oder Etherbindungen verbunden sein. Es könnte auch nur eine Fettsäurekette mit dem Grundgerüst verbunden sein. Wo mehr als eine Fettsäure mit dem Grundgerüst verbunden ist, können die Fettsäuren unterschiedlich (asymmetrisch) sein. Gemischte Formulierungen sind ebenfalls möglich.
  • Der Begriff „Liposom" umfasst jedes Kompartiment, das durch eine Lipid-Doppelschicht umschlossen ist. Liposomen werden auch als Lipid-Vesikel bezeichnet. Um ein Liposom zu bilden, umfassen die Lipidmoleküle elongierte, nicht-polare (hydrophobe) und polare (hydrophile) Anteile. Die hydrophoben und hydrophilen Anteile des Moleküls befinden sich bevorzugt an zwei Enden einer elongierten Molekülstruktur. Wenn solche Lipide in Wasser dispergiert werden, so bilden sie spontan doppelschichtige Membranen, die als Lamellen bezeichnet werden. Die Lamellen sind aus zwei einzelschichtigen Lagen von Lipidmolekülen zusammengesetzt, die sich mit ihren nicht-polaren (hydrophoben) Oberflächen gegenüber stehen und mit ihren polaren (hydrophilen) Oberflächen zum wässrigen Medium weisen. Die Membranen, die aus den Lipiden gebildet werden, umschließen einen Teil der wässrigen Phase auf eine ähnliche Weise wie eine Zellmembran, die die Inhalte einer Zelle umschließt. Die Doppelschicht eines Liposoms hat daher Ähnlichkeiten mit einer Zellmembran, ohne die Proteinkomponenten, die in einer Zellmembran vorhanden sind. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff Liposom so verwendet, dass multilamellare Liposomen mit umfasst sind, die allgemein einen Durchmesser im Bereich von 1 bis 10 Mikrometern aufweisen und aus zwischen zwei und hundert konzentrischen Lipid-Doppelschichten, die sich mit Schichten einer wässrigen Phase abwechseln, zusammengesetzt sind. Ebenfalls umfasst sind unilamellare Vesikel, die aus einer einzigen Lipidschicht zusammengesetzt sind und im Allgemeinen einen Durchmesser von 20 bis 100 Nanometern besitzen, wobei die Vesikel hergestellt werden können, indem multilamellare Liposomen mit Ultraschall behandelt werden.
  • Bevorzugte Liposomen können kleine unilamellare Vesikel (SUV's) sein, die eine einzige Lipidschicht besitzen und einen Durchmesser im Bereich von 25–200 nm aufweisen.
  • Kationische Liposomen können funktionell so definiert werden, dass sie ein Zetapotential von größer als 0 mV besitzen.
  • Der Begriff „kationisches Liposom" soll wie hierin verwendet, jedes Liposom wie oben definiert, umfassen, das kationisch ist. Das Liposom wird als kationisch bezeichnet, wenn es in physiologischem pH vorliegt. Es sollte angemerkt werden, dass das Liposom selbst die Einheit darstellt, die als kationisch bezeichnet wird, was bedeutet, dass das Liposom, das in seinem physiologischen pH-Wert eine messbare positive Ladung besitzt, in einem In vivo-Umfeld an andere Substanzen gebunden werden könnte. Diese anderen Substanzen könnten negativ geladen sein und daher zu der Bildung einer Struktur führen, die keine positive Ladung hat. Die Ladung und/oder Struktur eines Liposoms der vorliegenden Erfindung, das in einem In vivo-Umfeld vorliegt, wurde nicht präzise bestimmt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein erfindungsgemäßes kationisches Liposom jedoch unter Verwendung wenigstens einiger Lipide hergestellt, die selbst kationisch sind. Das Liposom muss nicht vollständig aus kationischen Lipiden bestehen, es muss aber eine ausreichende Menge kationischer Lipide umfassen, so dass es, wenn das Liposom gebildet wird und in ein In vivo-Umfeld mit physiolgischem pH-Wert eingebracht wird, anfangs eine positive Ladung aufweist.
  • Der Begriff „assoziiert mit" bezieht sich auf die Aktivität erfindungsgemäßer kationischer Liposomen, die in ausreichender Nähe für eine ausreichend lange Zeit an angiogenen Endothelzellen verweilen, so dass das Liposom und/oder sein Inhalt in die Endothelzelle eintritt. Die erfindungsgemäßen Liposomen können unter einer Vielzahl von Umständen mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, am meisten bevorzugt assoziieren sie aber mit angiogenen Endothelzellen unter In vivo-Bedingungen. Das Liposom könnte daher durch die Anhaftung, Bindung oder Assoziation anderer Moleküle oder Materialien, die in der Blutbahn vorhanden sind, modifiziert werden, bevor es mit der angiogenen Endothelzelle assoziiert. Eine Vielzahl von Kräften könnte für die Assoziation von Liposomen mit angiogenen Endothelzellen verantwortlich sein, wie z. B. die unspezifischen Wechselwirkungen, die zwischen irgendwelchen zwei Molekülen auftreten, die nicht miteinander in Verbindung stehen, d.h. anderen Makromolekülen, wie zum Beispiel menschliches Serumalbumin und menschliches Transferrin. Diese intermolekularen Kräfte können in vier allgemeine Bereiche eingeteilt werden, nämlich (1) Elektrostatik, (2) Wasserstoffbindung, (3) hydrophobe und (4) Van der Waals-Kräfte. Elektrostatische Kräfte entstehen durch die Anziehung gegensätzlich geladener ionischer Gruppen, wie z. B. zwischen entgegengesetzt geladenen Gruppen auf einem kationischen Liposom und Gruppen, die auf oder in der angiogenen Endothelzelle vorliegen. Die Anziehungskraft (F) ist invers proportional zum Quadrat des Abstands (d) zwischen den Ladungen. Wasserstoffbindungskräfte werden durch die Bildung reversibler Wasserstoffbrücken zwischen hydrophilen Gruppen bereitgestellt. Erfindungsgemäße Liposomen können hydrophile Gruppen beinhalten, wie zum Beispiel -COOH, und ähnliche Gruppen können an der Oberfläche von Endothelzellen vorhanden sein, wie zum Beispiel die Gruppen -ON, NH2. Diese Kräfte sind weitgehend von der engen Positionierung zweier Moleküle abhängig, die diese Gruppen tragen. Hydrophobe Kräfte wirken auf dieselbe Weise wie Öltröpfchen, die in Wasser unter Bildung eines einzelnen, großen Tropfens verschmelzen. Entsprechend neigen unpolare hydrophobe Gruppen, wie sie auf den erfindungsgemäßen Liposomen vorliegen, in wässrigem Medium dazu, zu assoziieren und sie können dazu neigen, mit hydrophoben Gruppen, die auf der Oberfläche von Endothelzellen vorhanden sind, zu assoziieren. Van der Waals-Kräfte schließlich entstehen zwischen Molekülen und beruhen auf den Wechselwirkungen zwischen den äußeren Elektronenwolken.
  • Der Begriff „assoziiert selektiv" und „ steuert selektiv an" und dergleichen wird hierin verwendet, um eine Eigenschaft der erfindungsgemäßen kationischen Liposomen zu beschreiben, durch die die kationischen Liposomen zu einem höheren Ausmaß mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, als kationische Liposomen mit korrespondierenden normalen Endothelzellen, die nicht an Angiogenese beteiligt sind. In Verbindung mit der Erfindung bedeutet selektive oder bevorzugte Assoziation, dass das Liposom zu einem fünffachen oder höheren Maß mit den Endothelzellen, die Angiogenese durchlaufen, assoziiert im Vergleich zu den korrespondierenden normalen Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen. Weiter bevorzugt weist die bevorzugte oder selektive Assoziation eine zehnfache oder höhere Selektivität zwischen angiogenen Endothelzellen verglichen mit korrespondierenden normalen Endothelzellen auf.
  • Der Begriff „Krebs" bezieht sich auf eine Erkrankung mit unangemessener Zellproliferation. Diese Störung wird klinisch am meisten augenscheinlich, wenn das Tumorgewebeknäuel die Funktion lebensnotwendiger Organe beeinflusst. Konzepte, die normales Gewebewachstum beschreiben, sind auf malignes Gewebe anwendbar, weil normales und malignes Gewebe ähnliche Wachstumscharakteristika teilen können, sowohl auf der Ebene einer einzelnen Zelle, als auch auf der Ebene des Gewebes. Krebs ist ebenso eine Erkrankung einer ungeordneten Regulierung des Gewebewachstums, wie auch einer ungeordneten Regulierung des Zellwachstums. Die Verdopplungszeit bezieht sich auf die Zeit, die benötigt wird, damit sich ein Gewebe oder ein Tumor in seiner Größe oder Zellzahl verdoppelt. Die Verdopplungszeit eines klinisch sichtbaren Tumors ist üblicherweise beträchtlich länger als ein Zellzyklus der Zellen, aus denen sich der Tumor zusammensetzt. Im Gegensatz zu einem Tumor haben eine normale Leber, Herz oder Lungen bei einem Erwachsenen jedoch keine Verdopplungsrate, da sich die Organe in einem Gleichgewichtszustand befinden, so dass die Geschwindigkeiten von Zellproduktion und Zelltod gleich sind (Stockdale, F., 1996, „Cancer growth and chemotherapy", in: Scientific American Medicine, Band 3, Scientific American Press, New York, Seiten 12–18). Die Wachstumscharakteristika von Tumoren sind derart, dass die Produktion neuer Zellen den Zelltod übersteigt. Ein neoplastisches Ereignis tendiert dazu, eine Zunahme in dem Anteil der Stammzellen, die eine Selbsterneuerung durchlaufen, hervorzurufen und eine korrespondierende Abnahme des Anteils der Stammzellen, die zur Reifung fortschreiten (McCulloch, E.A., et al., 1982, „The contribution of blast cell properties to outcome variation in acute myeloblastic leukemia (AML), Blood 59: 601–608). Für jede Tumorpopulation besteht eine Verdopplungszeit, und eine spezifische Wachstumskurve kann festgelegt werden (Stockdale, F., supra). Das Wachstumsmuster in Tumoren kann durch eine Gomperzianische Kurve beschrieben werden (Steel, G.G., 1977, Growth kinetics of tumors, Oxford University Press, Inc., New York, Seite 40), die anzeigt, dass die Wachstumsgeschwindigkeit während der Entwicklung eines Tumors anfangs sehr schnell ist und dann progressiv mit zunehmender Größe abnimmt.
  • ALLGEMEINE ASPEKTE DER ERFINDUNG
  • Die beigefügten Abbildungen ermöglichen eine deutliche visuelle Darstellung der hohen Selektivität, mit der die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen angiogene Endothelzellen ansteuern. Eine grundlegende Ausführungsform der Erfindung schließt ein Verfahren zur selektiven Beeinflussung von Endothelzellen ein, bei dem eine Formulierung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und kationische Liposomen, die einen toxischen Wirkstoff enthalten, umfasst, verabreicht wird (bevorzugt durch intravaskuläre Injektion, weiter bevorzugt durch intraarterielle Injektion). Die kationischen Liposomen in der injizierten Formulierung können dann (durch Endozytose) in die angiogenen Endothelzellen, die die Wände der der angiogenen Blutgefäße auskleiden, eintreten. Die kationischen Liposomen assoziieren mit den angiogenen Endothelzellen ausreichend lange und in einer Weise, dass die Liposomen selbst und/oder ihr Inhalt in die angiogene Endothelzelle eintreten. Anschließend kann der Wirkstoff, der in die Zelle eintritt, Angiogenese hemmen oder fördern oder auch nur eine Markierung bereitstellen, die den Nachweis einer Angiogenesestelle ermöglicht. Die Selektivität der Zielsteuerung auf angiogene Endothelzellen kann mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen besser verstanden werden.
  • 1 zeigt einen Teil eines Mauseierstocks, in dem ein großes, rundes Follikel (gelb) positioniert ist. Da in einem normalen Mauseierstock Angiogenese stattfindet, assoziieren kationische Liposomen, die eine nachweisbare Markierung enthalten, mit angiogenen Endothelzellen der wachsenden Blutgefäße des Follikels (rot-orange). In 1 kann jedoch nicht klar unterschieden werden, ob die Markierung nur mit den angiogenen Endothelzellen assoziiert ist, oder ob sie mit dem gesamten Gewebe innerhalb des Eierstocks und des Follikels assoziiert ist.
  • 2 ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme, die einen Abschnitt eines Pankreastumors einer Maus zeigt, die intravenös mit den kationischen Liposomen der Erfindung (rot-orange), die eine nachweisbare Markierung enthalten, injiziert wurde. Angiogenese tritt innerhalb von Tumoren leicht auf. Dieses Foto liefert daher einen gewissen Hinweis darauf, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen (rot-orange) spezifisch mit angiogenen Endothelzellen (grün) assoziieren. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität der Erfindung jedoch nicht definitiv.
  • Ein Vergleich der 3 und 4 zeigt die Kapazität der Erfindung, eine Angiogenesestelle zu lokalisieren. 3 ist ein Foto, das Blutgefäße in einem normalen Pankreasgewebe einer Maus zeigt. Dort sind viel weniger normale Endothelzellen markiert als korrespondierende angiogene Endothelzellen. Dieses wird deutlich durch den Vergleich von 3 mit 4 gezeigt, die ein Foto eines Pankreastumors bei einer Maus dargestellt. 4 zeigt deutlich im Bereich des Tumors ein hohes Maß an Akkumulierung der Markierung (gelb-orange), die in den kationischen Liposomen enthalten ist. Der drastische Unterschied zwischen 3 und 4 zeigt die Zweckmäßigkeit der vorliegenden Erfindung, eine Tumorstelle deutlich und präzise zu markieren. Da jedoch ein so großer Teil der Markierung in 4 mit den angiogenen Blutgefäßen assoziiert ist, kann die Spezifität der kationischen Liposomen, bevorzugt angiogene Endothelzellen anzusteuern, möglicherweise nicht vollständig gewürdigt werden.
  • 5 ist ein Foto von Blutgefäßen (grün) in einer normalen Mauspankreasinsel. Die kleine Menge an rot-oranger Färbung zeigt die eingeschränkte Assoziation kationischer Liposomen mit normalen Endothelzellen an, die die Blutgefäße des Pankreasgewebes auskleiden.
  • Die Spezifität kationischer Liposomen, die eine nachweisbare Markierung enthalten, wird noch deutlicher durch den Vergleich von 5 mit 6 gezeigt. 6 zeigt deutlich ein viel höheres Maß an Akkumulierung der Markierung in den Endothelzellen der angiogenen Blutgefäße des Tumors in der Pankreas einer Maus.
  • Die präzise Fähigkeit der kationischen Liposomen, angiogene Endothelzellen anzusteuern, wird in den 7 und 8 deutlich gezeigt. 7 zeigt deutlich, dass die fluoreszierende Markierung nur mit den Blutgefäßen im Zusammenhang steht, d.h. die Markierung leckt nicht und wandert nicht in das umgebende Gewebe aus. Die Spezifität wird am deutlichsten in 8 gezeigt, die klar auf markierte kationische Liposomen fokussiert ist, die in angiogenen Endothelzellen nachgewiesen werden, was zeigt, dass die Markierung spezifisch für diese Zellen ist und nicht leckt oder in das umgebende Gewebe auswandert.
  • Die 9 und 10 zeigen den gleichen Effekt, der oben bereits beschrieben wurde, mit einem anderen Angiogenesemodell. Die 1 bis 8 sind alle entweder auf normales Gewebe oder auf Krebsgewebe gerichtet. Die 9 bzw. 10 zeigen normales und entzündetes Gewebe der Luftröhre einer Maus. Insbesondere zeigt die 9 normale Blutgefäße einer Luftröhre, d.h. eine pathogenfreie Mausluftröhre. 10 zeigt die Blutgefäße einer Luftröhre mit dem Auftreten einer durch Infektion hervorgerufenen Angiogenese. Die höhere Konzentration der nachweisbaren Markierung in 10 ist offensichtlich und zeigt an, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen selektiv mit angiogenen Endothelzellen assoziieren – insbesondere assoziieren sie spezifisch mit Endothelzellen der Luftröhre, in der Angiogenese durch eine Infektion hervorgerufen wurde.
  • 11 zeigt ein Diagramm, das den Unterschied in der Spezifität der kationischen Liposomen darstellt, mit angiogenen Endothelzellen und korrespondierenden normalen Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen, zu assoziieren. Wie in 11 dargestellt wird, zeigen die kationischen Liposomen der Erfindung (in diesem Versuch) eine etwa 10× größere Affinität zu angiogenen Endothelzellen verglichen mit korrespondierenden Endothelzellen auf, die keine Angiogenese durchlaufen.
  • Die 12 und 13 schließlich zeigen, wie die kationischen Liposomen der Erfindung in die angiogenen Endothelzellen eintreten. In 12 sind kationische Liposomen mit der Oberfläche der angiogenen Endothelzelle in Kontakt getreten. In 13 sind die kationischen Liposomen durch Endozytose in die angiogene Endothelzelle eingetreten und befinden sich innerhalb der Zelle.
  • Nachdem die Spezifität der erfindungsgemäßen kationischen Liposomen mit Worten beschrieben und mit Hilfe der Figuren gezeigt wurde, kann ein Fachmann eine Vielzahl unterschiedlicher kationischer Liposomen herstellen, die eine Vielzahl unterschiedlicher toxischer Substanzen enthalten, um die Erfindung zu verwenden. Zur Vervollständigung werden allerdings im Folgenden kationische Liposomen und ihre Herstellungsverfahren beschrieben, und anschließend werden Substanzen beschrieben, die Angiogenese entweder hemmen oder fördern.
  • LIPOSOMEN
  • Liposomen können leicht gebildet werden, indem Lipide (wie oben definiert), die kationische Lipide (wie oben definiert) einschließen, in eine wässrige Lösung gegeben werden und die Lösung für einen Zeitraum von einigen Sekunden bis zu Stunden bewegt wird. Diese einfache Vorgehensweise erzeugt spontan große multilamellare Liposomen oder Vesikel mit Durchmessern im Bereich von etwa 1 bis 10 Mikrometer. Diese Liposomen sind aus zwei bis mehreren hundert konzentrischen Lipid-Doppelschichten zusammengesetzt, die mit Schichten einer wässrigen Phase abwechseln können, in der die Lipide vorhanden waren. Eine Substanz, wie zum Beispiel eine Verbindung die Angiogenese hemmt, fördert oder eine nachweisbare Markierung bereitstellt, kann in der wässigen Phase vorhanden sein. Die Substanz ist bevorzugt wasserlöslich oder kann zumindest leicht in Wasser dispergiert werden.
  • Die Dicke der wässrigen Schicht und damit die Gesamtmenge der wässrigen Phase innerhalb des Liposoms, hängt von dem Gleichgewicht der elektrostatischen Abstoßungskräfte zwischen geladenen Lipiden und der Van der Waals-Anziehungskräfte zwischen den Doppelschichten als Ganzes ab. Der wässrige Abstand (und damit das Volumen des eingeschlossenen wässrigen Materials) nimmt daher mit zunehmendem Anteil geladener Lipide in der Membran und mit abnehmenden Elektrolyt-Konzentrationen (geladenen Ionen) in der wässrigen Phase ab. Die kleinen Liposomen oder Vesikel, die gebildet werden, sind unilamellar und haben eine Größe im Bereich von etwa 20 bis 100 Nanometer und können hergestellt werden, indem multilamellare Vesikel mit Ultraschall behandelt werden. Größere unilamellare Liposomen mit einer Größe im Bereich von etwa 0,1 bis 1 μm im Durchmesser können erhalten werden, indem das Lipid in einem organischen Lösungsmittel oder einem Detergens solubilisiert und das Solubilisierungsmittel durch Evaporation bzw. Dialyse entfernt wird. Die Fusion kleinerer unilamellarer Liposomen durch Verfahren, die bestimmte Lipide oder stringente Dehydrierungs-Hydrierungs-Bedingungen erfordern, kann zu unilamellaren Gefäßen so groß wie oder größer als Zellen führen.
  • Um die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen zu bilden, ist es notwendig, dass die Liposomen unter Verwendung mindestens einiger kationischer Lipide hergestellt werden. Die kationischen Liposomen der Erfindung müssen allerdings nicht ausschließlich aus kationischen Lipiden bestehen. Die Verwendung neutraler Lipide in einer Menge von ca. 45 % und kationischer Lipide in einer Menge von ca. 55 % führt beispielsweise zu kationischen Liposomen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und die bevorzugt angiogene Endothelzellen ansteuern.
  • Die Verbindung kationischer Liposomen mit einer Substanz, die Angiogenese beeinflußt und/oder einer Markierung schließt eine Liposomenpräparation ein, in der Liposomen nach Standardverfahren hergestellt werden. Hierbei werden zum Beispiel Lösungen von 1-[2-(9(Z)-Octadecenoyloxy)ethyl]-2-(8(Z)-heptadecenyl)3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DOTAP), Cholesterin und Texas Red DHPE miteinander gemischt, bis zur Trockenheit evaporiert und der Lipidfilm anschließend in 5 % Dextrose rehydriert, um multilamellare Liposomen zu erhalten. Diese Vesikel werden durch Polycarbonatmembranfilter extrudiert um unilamellare Vesikel zu erhalten. Liposomen und die zu verbindende Substanz, zum Beispiel Plasmid-DNA, werden miteinander in spezifischen Verhältnissen in einer 5%igen Dextroselösung oder einem anderen physiologisch annehmbaren Hilfsstoff vermischt. Zweckmäßige kationische Lipide umfassen: DDAB, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (erhältlich von Avanti Polar Lipids und Sigma Chemical Company), 1,2-Diacyl-3-trimethylammoniumpropane (einschließlich nicht aber beschränkt auf Dioleyl (DOTAP), Dimyristoyl, Dipalmitoyl, Distearoyl) [diese sind alle von Avanti Polar Lipids zu beziehen], 1,2-Diacyl-3-dimethylammoniumpropane (einschließlich nicht aber beschränkt auf Dioleyl, Dimyristoyl, Dipalmitoyl, Distearoyl) [diese sind alle von Avanti Polar Lipids zu beziehen], DOTMA, N-[1-[2,3-bis(oleoyloxy)]propyl]-N,N,N,-trimethylammoniumchlorid, DOGS, Dioctadecylamidoglycylspermin (erhältlich von Promega Corporation), DC-Cholesterin, 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin, DOSPA, 2,3-Dioleoyloxy-N-(2(spermincarboxamido)ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoroacetat, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (einschließlich, nicht aber beschränkt auf Dioleoyl (DOEPC), Dilauroyl, Dimyristoyl, Diplamitoyl, Distearoyl, Palmitoyl-oleoyl) [diese sind alle von Avanti Polar Lipids erhältlich], β-Alanylcholesterin, CTAB, Cetyltrimethylammoniumbromid, diC14-Amidin, N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin, 14Dea2, O,O'-Ditetradecanolyl-N-(trimethylammonioacetyl)diethanolaminchlorid, (N,N,N',N'-tetramethyl-N,N'-bis(2- hydroxylethyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butandiammoniumiodid [erhältlich von Promega Corporation], 1-(2-Acyloxy)ethyl]2-alkyl(alkenyl)-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid-Derivative wie zum Beispiel 1-[2-(9(Z)-Octadecenoyloxy)ethyl]-2-(8(Z)-heptadecenyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DOTIM), 1-[2-(Hexadecanoyloxy)ethyl]-2-pentadecyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DPTIM), 1-[2-Tetradecanoyloxy)ethyl]-2-tridecyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchloird (DMTIM) – diese 3 Lipide werden in Solodin et al., 1995, Biochem. 43, 13537–13544, beschrieben. Dieses ist aus dem Labor von Tim Heath in Wisconsin. Megabios haben die Patent für einige dieser Lipid-Erfindungen bezogen.
  • 2,3-Dialkyloxypropyl-quaternäre Ammoniumverbindungs-Derivate, die einen Hydroxyalkylrest am quaternären Amin enthalten wie zum Beispiel 1,2-Dioleoyl-3-dimethyl-hydroxyethlyammoniumbromid (DORI), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxypropylammoniumbromid (DORIE-HP),), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxybutylammoniumbromid (DORIE-HB), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxypentylammoniumbromid (DORIE-HPe), 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), 1,2-Dipalmityloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid (DPRIE), 1,2-Disteryloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid (DSRIE) – diese Lipide wurden von Vical, Felgner et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550–2561, entwickelt.
  • Kationische Liposomen werden aus kationischen Lipiden selbst hergestellt oder in Beimischung mit anderen Lipiden, insbesondere neutralen Lipiden wie zum Beispiel Cholesterin, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (einschließlich nicht aber beschränkt auf Dioleoyl (DOPE); eine große Familie von Derivaten ist von Avanti Polar Lipids erhältlich), 1-2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine (eine große Familie von Derivaten ist von Avanti Polar Lipids erhältlich).
  • Nebenbemerkung: Man könnte asymmetische Fettsäuren, sowohl synthetische, als auch natürliche und gemischte Formulierungen der obigen Diacylderivate mit einschließen.
  • Liposomen der oben beschriebenen Art und anderer Arten, die einem Fachmann geläufig sind, können in der vorliegenden Erfindung mit den Liposomen, die eine Substanz, die Angiogenese entweder fördert oder hemmt und/oder eine nachweisbare Markierung beinhaltet, verwendet werden. Ein Beispiel erfindungsgemäßer Liposomen sind kationische Liposomen, die eine lipidlösliche oder wasserlösliche Substanz, die Angiogenese hemmt, enthalten. Lipidlösliche Verbindungen können allerdings in der Lipid-Doppelschicht vorhanden sein. Nachfolgend wird eine Beschreibung von Angiogenese-Inhibitoren bereitgestellt. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass weitere Inhibitoren einem Fachmann bekannt sind und/oder nach der vorliegenden Erfindung entwickelt werden, und dass solche Angiogenese-Inhibitoren leicht im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten.
  • DOSIERUNG
  • Die Menge eines Angiogenese-Inhibitors oder -Förderers, die einem Patienten (der jedes Tier mit einem Blutkreislaufsystem mit Endothelzellen sein kann, welche Angiogenese durchlaufen) verabreicht wird, wird in Abhängigkeit zahlreicher Faktoren variieren. Zum Beispiel wäre es notwendig, Menschen eine wesentlich höhere Dosis bereitzustellen als kleineren Tieren. Die Menge eines Angiogenese-Inhibitors oder -Fördererswird von der Größe, dem Alter, Geschlecht, Gewicht und dem Zustand des Patienten, sowie von der Wirksamkeit der verabreichten Substanz abhängen. Nachdem angemerkt wurde, dass bezüglich der Dosierung eine beträchtliche Variationsbreite besteht, wird angenommen, dass ein Fachmann mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung leicht die geeignete Dosierung bestimmen kann, indem zunächst eine extrem kleine Menge verabreicht wird und die Dosis zunehmend erhöht wird, bis das gewünschte Ergebnis erhalten wird. Obwohl die Dosismenge auf Grundlage der oben beschriebenen Faktoren stark variieren wird, ermöglicht es die vorliegende Erfindung im Allgemeinen, wesentlich geringere Mengen einer jeglichen Substanz zu verabreichen, im Vergleich zu Verabreichungssystemen, die das umgebende Gewebe, wie z. B. die Tumorzellen selbst, ansteuern.
  • EXPERIMENTELLE ANGIOGENESEMODELLE
  • Die vorliegende Erfindung wurde durch die Verwendung von Nagermodellen für Angiogenese ermöglicht. Chronische Entzündungserkrankungen wie Asthma und Bronchitis verursachen eine Gewebe- und Blutgefäßumbildung in der Atemwegsmukosa. Um über die Pathogenese einer chronischen Atemwegsentzündung zu lernen, wurde ein Modell verwendet, in dem eine chronische Entzündung und Gewebeumbildung in Luftröhren von Ratten und Mäusen auftritt. Angiogenese entwickelt sich in der Atemwegsmukosa als Folge einer Mycoplasma pulmonis-Infektion. In diesem Modell verursachen Mycoplasma pulmonis-Organismen eine persistierende Infektion im Luftröhren- und Bronchialepithel. Die Atemwegsmukosa von Ratten, die mit M. pulmonis infiziert sind, weist verschiedene deutliche Abnormalitäten auf: 1) die Verdickung des Epithels und der Lamina propria, 2) Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung des Epithels, 3) Angiogenese, 4) erhöhte Empfindlichkeit der angiogenen Blutgefäße für die Entzündungsmediatorsubstanz P hinsichtlich des Austretens von Plasma, 5) das Substanz P induzierte Auslaufen aus Kapillargefäßen sowie aus Venen und 6) die erhöhte Anzahl von Rezeptoren für die Substanz P (NK1-Rezeptoren) auf kapillaren Endothelzellen. In diesem Modell wird Angiogenese durch eine chronische Entzündung verursacht, und die Blutgefäße sind empfänglicher für Enzündungsmediatoren.
  • Studien, in welchen die luminale Endothelzelloberfläche durch die Perfundierung von Lektinen angefärbt wurde, zeigten das Angiogeneseausmaß in Ratten nach einer M. pulmonis-Infektion. In der Luftröhrenmukosa infizierter Ratten sind zahlreiche kapillarähnliche Gefäße vorhanden, und diese Gefäße lecken in Folge einer intravenösen Injektion der Enzündungsmediatorsubstanz P aus.
  • In Mäusen verursacht M. pulmonis eine akute Lungenentzündung, die ihren Höhepunkt nach 6–9 Tagen nach Inokulation hat, gefolgt von einer persistierenden Atemwegsinfektion. In Mäusen ist die Antwort auf eine Infektion mit M. pulmonis stark vom Stamm abhängig: zum Beispiel zeigen Mäuse des C3H-Stamms eine höhere Mortalität und eine größere Reduktion des Cytokin-Tumornekrosefaktors α als C57BL-Stämme. Einige Aspekte der mukosalen Umbildung, wie Epithelhyperplasie, wurden von den Luftwegen von Mäusen beschrieben, die mit M. pulmonis infiziert sind. In C57BU6-Mäusen, die durch nasale Inokulation von M. pulmonis infiziert wurden, steigt die Anzahl der Luftröhrenblutgefäße drastisch an, offensichtlich durch das Wachstum neuer Kapillaren. In diesem Stamm ist das Luftröhrenmukosa-Blutgefäßsystem nicht länger eben und kleine Gefäße wachsen senkrecht zur Mukosaebene. Zahlreiche sichtbare Gefäßsprossen werden in Bereichen erhöhter Vaskularität gefunden. Die Infektion von C57BL/6-Mäusen mit M. pulmonis erzeugt daher eine chronische Atemwegsentzündung mit Endothelproliferation, Gefäßumbildung und Angiogenese. Im Gegensatz dazu nimmt in C3H/HeN-Mäusen, die durch nasale Inokulation mit M. pulmonis infiziert wurden, die Anzahl vaskulärer Endothelzellen in der Luftröhrenmukosa zu, die Anzahl von Gefäßen jedoch nicht. Die erhöhte Vaskularität ist nicht die Folge einer Zunahme an Länge oder der Anzahl von Gefäßen, sondern einer Vergrößerung des Gefäßdurchmessers, wobei diese Zunahme der Gefäßgröße die Folge einer Verdoppelung der Endothelzellzahl ist. Die Größe individueller Endothelzellen in infizierten Luftröhren nimmt nicht signifikant zu. Die Mengen an zirkulierenden Antikörpern gegen M. pulmonis ist in den zwei Mausstämmen ähnlich. Eine Infektion von C3H/HeNCr-Mäusen mit M. pulmonis erzeugt daher eine chronische Atemwegsinfektion mit vaskulärer Umbildung und Endothelproliferation, aber keine signifikante Zunahme der Anzahl der Gefäße, wo hingegen dieses in C57BL/6-Mäusen Endothelproliferation und neue Gefäße hervorruft.
  • In einem zweiten Modell tritt Angiogenese in Tumoren auf, die aus einer transgenen Expression des viralen SV40 Onkogens resultieren. Das „RIP-Tag" transgene Mausmodell bietet die Möglichkeit, die phänotypischen Veränderungen in angiogenen Endothelzellen in einer gut charakterisierten Progression von normalem Gewebe zu Tumoren zu untersuchen. Im „RIP-Tag" transgenen Mausmodell wird das Onkogen des SV-40 Virus, das große T-Antigen (Tag) durch eine Region des Ratteninsulinpromotors (RIP) reguliert. Wenn dieses Konstrukt in das murine Genom eingeführt wird, induziert es die Tag-Expression besonders in Pankreasinsel-β-Zellen, die in etwa 400 Inseln verstreut über die Pankreas lokalisiert sind. Alle Pankreasinseln in diesen Mäusen exprimieren Tag, die Inseln entwickeln sich jedoch bis zu einem Alter von etwa 6 Wochen normal. Danach werden etwa 50 % der Inseln hyperplastisch. Ein kleiner Anteil dieser hyperplastischen Inseln (< 5 %) entwickelt sich jedoch in etwa 10 Wochen zu Tumoren. Es scheint, dass dieser Engpass der Tumorgenese überwunden wird, wenn eine Insel die Fähigkeit erwirbt, Angiogenese zu induzieren: diese Tumorgenesephase wurde daher als „der angiogene Schalter" bezeichnet. Ein ähnlicher Angiogeneseschalter scheint auch in anderen Modellen muriner Tumorgenese, sowie in verschiedenen menschlichen Tumoren zu existieren. Das „RIP-Tag"-Modell liefert daher ein gut charakterisiertes Gerüst für die Untersuchung der Angiogeneseprogression in Tumoren.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele dienen dazu, Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung bereitzustellen, wie kationische Liposomen hergestellt werden und wie die Methodik zur Verwendung solcher Liposomen angewendet wird. Es wurden Anstrengungen unternommen, die Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlenangaben (z. B. Mengen, Temperatur usw.) abzusichern, gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen sollten aber berücksichtigt werden. Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei Anteilen um Gewichtsanteile, beim Molekulargewicht um die mittlere Molmasse, die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben, und der Druck liegt bei oder nahe dem atmosphärischen Druck. Es sollte beachtet werden, dass jedes der nachfolgenden Beispiele mehrere Versuche, die mit Hilfe der Verfahren durchgeführt wurden, wiedergibt und die Ergebnisse zusammengefasst wurden. Fachleute werden erkennen, dass nicht jeder Versuch positive Ergebnisse liefert. Es wird jedoch angenommen, dass das Nachfolgende einen genauen Überblick über die erzielten Resultate liefert.
  • BEISPIEL 1
  • Verteilung kationischer Lipide in normalen Mäusen
  • Liposomen und/oder die Plasmid-DNA wurden markiert und die zelluläre Verteilung der markierten Komplexe wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach intravenöser Injektion bestimmt. Die Versuche wurden in pathogenfreien Mäusen (20–25 g Körpergewicht) beiderlei Geschlechts durchgeführt.
  • Kationische kleine unilamellare Vesikelliposomen wurden aus dem kationischen Lipid DDAB oder DOTAP und dem neutralen Lipid DOPE oder Cholesterin hergestellt, mit Texas Red oder dem roten Fluoreszenzcarbocyanin-Farbstoff Dil oder CM-Dil markiert, und in einigen Fällen mit Plasmid-DNA, die ein Reportergen, wie zum Beispiel Luciferase oder β-Galaktosidase enthält, komplexiert. Endothelzellen wurden mit dem fluoreszierenden Pflanzenlektin Fluorescein-Lycopersicon esculentum markiert. Monozyten/Makrophagen wurden mit fluoreszierenden Perlen (Duke, 500 nm) markiert. Zellkerne wurden mit DAPI, YO-PRO oder dem Hoechst-Farbstoff 33342 markiert.
  • Fluoreszierende Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe, die 10–60 μg DNA in bis zu 300 μl enthielten, wurden in nicht narkotisierte Mäuse über die Schwanzvene injiziert. In einigen Versuchen wurden im Anschluss an die Komplexe 500 nm große fluoreszierende Perlen injiziert. 5 Minuten bis 24 Stunden danach wurden die Tiere mit Natriumpentobarbital narkotisiert und dann durch das linke Ventrikel mit Fixierlösung (1 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung) perfundiert, gefolgt von dem fluoreszierenden Lektin, um die Endotheloberfläche des Blutgefäßsystems zu markieren. Nach der Perfusion wurden die Gewebe entfernt und entweder als Ganzes präpariert oder mit Hilfe eines Vibratom- oder Gewebeschneiders in Teile geschnitten. Zusätzlich wurden einige Proben für die Elektronenmikroskopie vorbereitet. Die Gewebe wurden mittels Epifluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie untersucht. Zusätzlich wurden einige Proben durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.
  • Egebnisse: In Mäusen, die 5 Minuten bis 24 Stunden nach der Injektion untersucht wurden, waren CM-Dil- oder Dil-markierte Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe in den Lungen am reichlichsten vorhanden. Ferner waren sie in Endothelzeller der alveolaren Kapillaren am zahlreichsten. Die Fluoreszenz in den alveolaren Kapillaren war gleichförmig über alle Lappen beider Lungen verteilt. Zusätzlich trat in intravakulären Monocyten/Makrophagen etwas CM-Dil- oder Dil-Fluoreszenz auf.
  • Neben der Lunge wiesen die Leber und die Milz die größte Menge an markierten Liposomen oder Komplexen auf. In diesen Organen war die CM-Dil- oder Dil-Fluoreszenz mit den fluoreszierenden Perlen co-lokalisiert. In der Leber waren die CM-Dil- oder Dil-Fluoreszenz und Perlen in den Kupffer-Zellen zu finden. In der Milz lagen sie in den Makrophagen vor.
  • Die Eierstöcke wiesen ebenfalls Blutgefäße auf, die stark mit CM-Dil- oder Dil-markierten Liposomen oder Komplexen markiert waren. Insbesondere wurde beobachtet, dass die Endothelzellen in angiogenen Blutgefäßen großer Follikel und Gelbkörperchen des Mauseierstocks nach intravenöser Injektion CM-Diö- oder Dil-markierte DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe reichlich aufgenommen hatten. Diese Beobachtungen wurden fotographisch dokumentiert (1). Andere Eierstockblutgefäße enthielten relativ wenig markierte Komplexe. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass angiogene Endothelzellen bevorzugt Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe aufnehmen, d.h. dass die kationischen Liposomen, die in den Versuchen verwendet wurden, eher mit Endothelzellen, die Angiogenese durchlaufen, assoziieren, als mit korrespondierenden Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen.
  • Markierte Liposomen oder Komplexe waren außerdem in Endothelzellen hoher endothelialer Venen (HEV) von Lymphknoten und Peyerschen Drüsen des Dünndarms sehr zahlreich vorhanden, wohingegen sie in Endothelzellen der Kapillaren dieser lymphoiden Organe sehr selten waren. Markierte Liposomen oder Komplexe waren auch in kapillaren Endothelzellen der vorderen Hypophyse, des Myokards, Diaphragmas, Nierencortex und Fettgewebes zahlreich.
  • Markierte Liposomen oder Komplexe lagen in Monocyten/Makrophagen, die an Venen der Blase des Urintrakts, der Gebärmutter und des Eierstocks gebunden waren, zahlreich vor. Einige Venen enthielten eine große Anzahl markierter Monocyten/Makrophagen. Außerdem war ein kleiner Anteil der Endothelzellen von Arteriolen, Kapillaren und Venen in diesen Organen markiert.
  • Relativ wenige markierte Liposomen oder Komplexe waren mit kapillaren Endothelzellen der hinteren Hypophyse, renalen Medulla, Darmzotten (Ileum), Pankreas und Nierenmedulla assoziiert. Nahezu keine markierten Liposomen oder Komplexe wurden in Endothelzellen im Gehirn, in der Schilddrüse, dem renalen Cortex, den Pankreasinseln, der Luftröhre oder den Bronchien gefunden, mit Ausnahme gelegentlicher Monocyten/Makrophagen.
  • Schlussfolgerungen: Die in diesen Studien verwendeten Formulierungen von CM-Dil- oder Dil-markierten DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen, steuerten hauptsächlich drei Zelltypen an: Endothelzellen, Makrophagen und Monocyten. Die Aufnahme von Liposomen oder Komplexen war organ- und gefäßspezifisch. Die meisten wurden von kapillaren Endothelzellen der Lunge und von Makrophagen der Leber und Milz aufgenommen. Kapillare Endothelzellen des Eierstocks, der vorderen Hypophyse, des Herzens, Diaphragmas, Nierencortex und Fettgewebes wurden ebenfalls angesteuert. Bei den Blutgefäßen, die im Eierstock Liposomen oder Komplexe aufnahmen, handelte es sich um Angiogenesestellen. Außerdem wurden HEV der Lymphknoten und Darm-Peyer-Drüsen angesteuert. Endothelzellen oder Makrophagen anderer Organe wurden weniger häufig und variabler angesteuert. Blutgefäße des Gehirns, der Schilddrüse, des renalen Cortex, der Luftröhre und der Bronchien wurden nicht angesteuert.
  • Zusätzlich dokumentieren die Versuche, dass die Liposomen oder Komplexe in den meisten Organen nicht aus den Blutgefäßen leckten. Obwohl sie in extravaskulären Zellen der Milz gefunden wurden, die Blutgefäße mit einem diskontinuierlichen Endothel aufweisen, wanderten sie nicht in andere Organe ein.
  • Die starke Aufnahme kationischer Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe durch Blutgefäße der großen Eierstockfollikel und Gelbkörperchen weist schließlich darauf hin, dass es sich bei den Endothelzellen angiogener Blutgefäße um bevorzugte Aufnahmeorte handelt.
  • BEISPIEL 2
  • Aufnahme von DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen in RIP-Tag5-Mäusen
  • Die Ergebnisse der Versuche in Beispiel 1 zeigten, dass angiogene Blutgefäße in Eierstockfollikeln und Gelbkörperchen kationische Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe stark aufnahmen. Entsprechend wurde ein Versuch durchgeführt, um zu bestimmen, ob Endothelzellen angiogener Blutgefäße von Tumoren kationische Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe stark aufnehmen.
  • Verwendet wurde das transgene RIP-Tag5-Modell für Tumore, wie es unter dem experimentellen Maus Modell Abschnitt, Hanahan, D., 1985, Heritable formation of pancreatic beta-cell tumors in tansgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes, Nature 315: 115–22 und Hanahan, D. und Folkman, J., 1996, Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigeneseis, Cell 86: 353–64 beschrieben ist. In diesem Modell, das als RIP-Tag bezeichnet wird, wird das Onkogen des SV-40 Virus, das große T-Antigen (Tag) durch eine Region des Ratten-Insulinpromotors (RIP) reguliert. Sobald dieses Konstrukt in das murine Genom eingefügt wird, so induziert es die Expression des T-Antigens spezifisch in β-Zellen der Pankreasinseln.
  • Eine wichtige Eigenschaft dieses Modells ist, dass verschiedene Stadien der Tumorentwicklung und daher verschiedene Angiogenesestadien gleichzeitig in jeder RIP-Tag5-Maus vorhanden sind. Obwohl alle der 300–400 Inseln das T-Antigen exprimieren, entwickeln sich die Inseln anfangs normal. Im Alter von 6 Wochen ist jedoch etwa die Hälfte hyperplastisch und von diesen entwickelt sich ein kleiner Anteil nach 10 Wochen zu Tumoren. Die Tumorgenese scheint mit dem Beginn der Angiogenese zusammenzufallen. Diese Konversion wurde als „der angiogene Schalter" bezeichnet (Folkman, J., Watson, K., Ingber, D. und Hanahan, D., 1989, Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia, Nature 339: 58–61 und Hanahan, D. und Folkman, J., 1996, Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell 86: 353–64). Ein ähnlicher angiogener Schalter scheint in anderen murinen Tumorgenesemodellen, sowie in verschiedenen menschlichen Tumoren zu existieren (Hanahan, D. und Folkman, J., 1996, Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell 86: 353–64).
  • Verwendet wurden Methoden und Materialien wie in Beispiel 1. Insbesondere wurden CM-Dil- oder Dil-markierte DDAB:Cholesterin-Liposomen intravenös in eine RIP-Tag5-Maus, die einen Tumor barg, und CM-Dil- oder Dil-markierte DDAB:Cholesterin-DNA Komplexe in eine andere RIP-Tag5-Maus intravenös injiziert. Die Verteilung der Liposomen oder Komplexe in angiogenen Blutgefäßen der Pankreasinselzelltumore wurde 24 Stunden nach der Injektion untersucht und mit derjenigen in Blutgefäßen von Pankreasinseln normaler Mäuse verglichen.
  • Ergebnisse: Zwei neue Beobachtungen wurden gemacht: (1) die Liposomen oder Komplexe wurden von Endothelzellen angiogener Blutgefäße aufgenommen ohne über das Endothel hinaus zu lecken und (2) die endosomale Aufnahme der Liposomen oder Komplexe war in Endothelzellen angiogener Blutgefäße größer als in Endothelzellen normaler Blutgefäße von Pankreasinseln (2 stammt von einer Gewebeprobe).
  • Schlussfolgerungen: Dieser Versuch lieferte Ergebnisse, die mit der bevorzugten Aufnahme von DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen durch angiogene Tumorblutgefäße konsistent ist. Bevor der Versuch wiederholt wurde, wurde (1) die Intensität der Fluoreszenz der Liposomen-DNA-Komplexe erhöht, (2) die Methoden zur Lokalisierung der Aufnahmestellen kationischer Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe in Tumoren der RIP-Tag5-Mäuse verbessert und (3) eine bessere Kenntnis der Struktur und Funktion angiogener Blutgefäße in Pankreasinselzelltumoren in RIP-Tag5-Mäusen gewonnen.
  • BEISPIEL 3 (Vergleichsbeispiel)
  • Aufnahme von DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexen in RIP-Tag2 Mäusen
  • Ziel: Die Fluoreszenzintensität der Liposomen-DNA-Komplexe wurde durch die Verwendung von Texas Red-DHPE anstelle von Dil erhöht. Die Methode zur Präparation der Pankreas von RIP-Tag2-Mäusen zur Lokalisierung von Aufnahmestellen der fluoreszierenden kationischen Liposomen-DNA-Komplexe wurde verbessert und die Struktur und Funktion der angiogenen Blutgefäße in Pankreasinselzelltumoren in RIP-Tag2-Mäusen wurde untersucht. Mit diesen Verbesserungen wurden Versuche, wie sie in Beispiel 2 beschreiben wurden, durchgeführt, um zu bestimmen, wie kationische Liposomen und Lipid-DNA-Komplexe aufgenommen wurden.
  • Methoden: Kleine, unilamellare, kationische DOTAP:Cholesterin-Vesikelliposomen, die mit Texas Red-DHPE markiert sind, wurden hergestellt. Liposomen-DNA-Komplexe wurden in einem Lipid:DNA-Gesamtverhältnis von 24:1 (nmol/μg) in 5 Glucose hergestellt, wobei 60 μg Plasmid-DNA in 300 μl verwendet wurden. Die Komplexe (300 μl) wurden in die Schwanzvenen nicht narkotisierter transgener RIP- Tag2-C57BL/6-Mäuse und in die nicht narkotisierter normaler RIP-Tag2-C57BL/6-Mäuse injiziert.
  • Vier Stunden nach der Injektion von Komplexen wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Nembutal narkotisiert. Das Gefäßsystem wurde durch die Perfusion von 1 % Paraformaldehyd durch die aufsteigende Aorta fixiert und die luminale Oberfläche des Gefäßsystems durch Perfusion von grün fluoreszierendem Lektin angefärbt (Thurston, G., Baluk, P., Hirata, A. und McDonald, D.M., 1996, Permeability-unrelated changes revealed at endothelial cell borders in inflamed venules by lectin binding, Am. J. Physiol. 271: H2547–2562). Ganze Gewebehäufchen oder Vibratomschnitte wurden in Vectashield eingebettet, und die Gefäße mit Hilfe eines Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskops oder eines konfokalen Zeiss LSM 410 Mikroskops, das mit einem Krypton-Argon-Laser ausgestattet und mit Fotoverdopplerröhren optimiert war, untersucht. Die Bilder wurden auf Kodak Ektachrom Filmen (ASA 400) oder als digitale konfokale Bildaufzeichnungen aufgenommen.
  • Ergebnisse: Der Versuch zeigte klar die starke Aufnahme der Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexe durch angiogene Endothelzellen in Pankreastumoren der RIP-Tag2-Mäuse. Die Aufnahme durch Tumorgefäße überstieg bei Weitem die Aufnahme dieser Komplexe durch die korrespondierenden Endothelzellen normaler Pankreasinseln (vergleiche die 3 und 4).
  • Die Tumore konnten aufgrund der starken Markierung ihrer Blutgefäße mit den rot fluoreszierenden Liposomenkomplexen leicht von benachbarten Geweben unterschieden werden. Die Geometrie des Gefäßsystems der Tumore war variabel und reichte vom Muster typischer normaler Inseln bis zu einem dichten gewundenen anastomosierenden Netzwerk sinusförmiger Gefäße, die auffallend größer und dichter gepackt waren als in normalen Inseln. In letzterem Fall erinnerte das Gefäßsystem an das von Gelbkörperchen. Die Markierungsintensität von Tumorgefäßen stand annähernd im Verhältnis zu der Größe des Tumors. Die größten Tumore wiesen die meiste Markierung auf.
  • Einige Blutgefäße in kleinen bis mittelgroßen Tumoren hatten stummelartige, fokale Aneurysma-ähnliche Protrusionen. Diese Stellen waren besonders auffällig, da ungewöhnlich zahlreiche Texas Red-markierte Punkte vorhanden waren, von denen angenommen wurde, dass es sich um Endosomen handelt. Die Texas Red-Markierung dieser Stellen war stärker als die benachbarten Gefäße. Es schien, dass es sich bei diesen Strukturen um kapillare Auswachsungen handeln könnte. Die Strukturen wurden in großen Tumoren, die ein dichtes komplexes Gefäßsystem aufwiesen, nicht gefunden wo die Gefäße gleichmäßig stark markiert waren.
  • Es gab keine Anzeichen einer Extravasation Texas Red-markierter Komplexe in Tumore. In den Anhäufungen extravaskulärer Erythrozyten in den Tumoren wurden ebenfalls keine Texas Red-markierten Komplexe gefunden. Die starke Markierung des Tumorgefäßsystems erinnerte an das von ovarialen Gelbkörperchen während der frühen Phase ihrer Entwicklung.
  • BEISPIEL 4
  • Aufnahme kationischer Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe durch angiogene Blutgefäße in Tumoren und bei chronischer Entzündung
  • Ziel: Versuche wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden durchgeführt, um die Beobachtungen auf andere Angiogenesemodelle auszuweiten. Diese Versuche beschäftigten sich auch mit der Frage, ob DNA vorhanden sein muss, damit kationische Liposomen angiogene Blutgefäße ansteuern. Vier Angiogenese-Tiermodelle wurden daraufhin untersucht, ob eine bevorzugte Aufnahme von DOTAP:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen durch angiogene Blutgefäße erfolgt.
  • Modelle: RIP1-Tag2-Tumormodell. Transgene C57BL/6-Mäuse wurden gezüchtet und bei ihrer Geburt durch PCR-Analyse phänotypisiert. Das Mausmodell ist weiter oben beschrieben.
  • HPV-Tumormodell. Transgene HPV(Menschliche Papilloma Virus)-Mäuse wurden gezüchtet und bei Geburt durch PCR-Analyse phänotypisiert. Nicht transgene Tiere des gleichen Wurfs wurden als Kontrollen verwendet. In diesem Modell wird das Onkogen des menschlichen Papilloma-Virus durch eine Region des Keratin 14- Promotors reguliert. Wenn dieses Konstrukt in das murine Genom eingebaut wird, induziert es insbesondere in epidermalen Zellen eine HPV-Expression. Alle transgenen Mäuse entwickeln Dysplasien, die von Angiogenese in der Haut der oberen Brust und der Ohren begleitet wird, und ein kleiner Teil entwickelt Tumore.
  • Mycoplasma pulmonis-Infektionsmodell in Mäusen: Diese Infektion führt zu einer chronischen Atemwegsentzündung verbunden mit Angiogenese in der Atemwegsmukosa. Nach ihrem Narkotisieren (87 mg/kg Ketamin und 13 mg/kg Xylazin, intraperitoneal injiziert) wurden pathogenfreie, 8 Wochen alte, männliche und weiblich C3H/HeNCr oder C57BL/6 Mäuse (beide von Charles River) intranasal mit 3 × 104 Kolonie-bildenden Einheiten Mycoplasma pulmonis (Stamm 5782C-UAB CT7) in einem Volumen von 50 μl inokuliert. Pathogenfreie Mäuse dienten als Kontrolle und wurden mit steriler Nährlösung inokuliert. Infizierte Mäuse und Kontrollmäuse wurden getrennt voneinander unter Barrierebedingungen in Käfigen gehalten. Die Serumwerte von Antikörpern gegen M. pulmonis wurden am Ende des Versuches gemessen (Microbiological Associates, Bethesda MD). Die Mäuse wurden 1 bis 8 Wochen nach der Infektion untersucht.
  • Mycoplasma pulmonis-Infektionsmodell in Ratten. Ebenso wie bei Mäusen verursacht diese Infektion eine chronische Atemwegserkrankung, wobei ein Merkmal dieser Erkrankung Angiogenese in der Atemwegsmukosa ist. Nach dem Narkotisieren (40 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin, intraperitoneal injiziert), wurden pathogenfreie 8 Wochen alte männliche Wistar-Ratten (von Charles River) täglich an drei aufeinander folgenden Tagen intranasal mit Mycoplasma pulmonis des 578C4-Stamms in einem Volumen von 200 μl inokuliert. Pathogenfreie Ratten, die mit Nährlösung inokuliert wurden, dienten als Kontrollen. Infizierte Ratten und Kontrollratten wurden getrennt voneinander unter Barrierebedingungen in Käfigen gehalten. Die Serumwerte von Antikörpern gegen M. pulmonis und andere Pathogene wurden am Ende des Versuchs gemessen (Microbiological Associates, Bethesda MD).
  • Methoden: Kationische DOTAP:Cholesterin-Liposomen, die mit Texas Red-DHPE markiert waren, wurden hergestellt wie unter Beispiel 3 beschrieben. Die Liposomen wurden in eine Schwanzvene der Mäuse injiziert, in einer Dosierung von 360 nmol Gesamtlipid in einem Volumen von 100 μl in 5 % Glucose. Ratten wurden über die Oberschenkelvene injiziert. Liposomen-DNA-Komplexe wurden zu einem Gesamtverhältnis von Lipid:DNA von 24:1 in 5 % Glucose hergestellt, wobei 60 μg Plasmid-DNA in 200–300 μl verwendet wurden. Liposomen oder Komplexe (200–300 μl) wurden in eine Schwanzvene nicht narkotisierter RIP-Tag2-, HPV- oder M. pulmonis-infizierter Mäuse injiziert. Nicht transgene, pathogenfreie Tiere wurden entsprechend als Kontrollen verwendet.
  • Nach 20 Minuten oder 4 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse oder Ratten durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Nembutal narkotisiert. Das Gefäßsystem wurde durch Perfusion von 1 % Paraformaldehyd durch die aufsteigende Aorta fixiert und die luminale Oberfläche des Gefäßsystems wurde durch Perfusion mit grün fluoreszierendem Lektin angefärbt (Thurston G., Baluk, P., Hirata, A. und McDonald D.M., 1996, Permeability-related changes revealed at endothelial cell borders in inflamed venules by lectin binding, Am. J. Physiol. 271: H2547–2562). Ganze Gewebehäufchen oder Vibratomschnitte wurden in Vectashield eingebettet, und die Gefäße mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop untersucht.
  • Die aufgenommene Menge an fluoreszierenden Liposomen oder Komplexen wurde durch konfokale Mikroskopie quantifiziert. Kurz gefasst wurde eine Serie von 12 konfokalen Bildern, die einen Abstand von 2,5 μm in der Fokalachse (z) aufweisen, im rostralen Bereich der Luftröhre in den Fluorescein- und Texas Red-Kanälen gesammelt, wobei eine 20 × NA 0,6 Linse (Zeiss) und Standardeinstellungen für die konfokale Lochblende (confocal pinhole size), den Photomultiplizierröhrenwert (photomultiplier tube gain) und die Laserenergie verwendet wurden. Von den Bildserien wurden Projektionen erstellt, die die Gefäße (Fluorescein-L. esculentum) und Liposomen (Texas Red) getrennt zeigen. Unter Verwendung der konfokalen Software wurden Bereiche mit einer Fläche von etwa 200 μm2 auf den Bildern der Gefäße bestimmt und anschließend wurde die durchschnittliche Fluoreszenz der korrespondierenden Bereiche der Bilder der Liposomen gemessen. Die Hintergrundintensität wurde bestimmt, indem die Fluoreszenz in ausgewählten Regionen, die benachbart zu den Gefäßen liegen, gemessen wurde. Die Messungen wurden an 25 Gefäßen pro Luftröhre und 4 Luftröhren pro Gruppe (n = 4) durchgeführt. Die Signifikanz der Unterschiede wurde durch den Student's t-Test bestimmt.
  • Die Gewebe, die für die Transmissionselektronenmikroskopie präpariert wurden, wurden wie zuvor beschrieben verarbeitet (McDonald, D.M., 1994, Endothelial gaps and permeability of venules of rat tracheas exposed to inflammatory stimuli, Am. J. Physiol. 266: L61–L83). Kurz gefasst erfolgte zunächst eine Perfusion der ersten Fixierlösung (3 % Glutaraldehyd in 75 mM Cacodylatpuffer, pH 7,1 mit 1 Saccharose, 4 % PVP, 0,05 % CaCl2 und 0,075 % H2O2) für 5 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend eine Perfusion der sekundären Fixierlösung (3 Glutaraldehyd in 75 mM Cacodylatpuffer, pH 7,1 mit 0,05 % CaCl2, 1 % Saccharose und 4 % PVP) für 5 Minuten. Die Gewebe wurden für die Fixierung in situ für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen, dann entnommen und über Nacht bei 4°C in sekundärer Fixierlösung belassen. Die Gewebe wurden mit einer Rasierklinge zurecht geschnitten oder mit einem Gewebeschneider in Scheiben geschnitten, in Osmium postfixiert (2 % OsO4 in 100 mM Cacodylatpuffer, pH 7,4 für 18 Stunden bei 4°C), in H2O gewaschen (18 Stunden bei 4°C) und en bloc mit Uranylacetat (wässrig, 37°C für 48 Stunden) angefärbt. Das Gewebe wurde anschließend mit Aceton dehydriert, infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. Ultradünnschnitte wurden mit einem Ultramicrotom geschnitten, auf Einzelschlitzprobengitter eingebettet und mit einem Zeiss EM-10 Elektronenmikroskop untersucht.
  • Ergebnisse: Die Versuche zeigten, dass Texas Red-markierte DOTAP:Cholesterin-Liposomen in der Abwesenheit von DNA selektiv angiogene Endothelzellen von Tumoren in RIP1-Tag2-Mäusen ansteuerten, ähnlich wie vorhergehende Befunde mit Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexen und Dil-markierten DDAB:Cholesterin-DNA-Komplexen. Dieses und nachfolgende Versuche mit transgenen RIP1-Tag2-Mäusen bestätigten, dass die Aufnahme kationischer Liposomen durch angiogene Blutgefäße hyperplastischer Inseln und Tumoren die Aufnahme durch korrespondierende normale Gefäße weit überstieg (5, 6, 7 und 8). In einigen Gefäßen hyperplastischer Inseln und kleiner Tumore wurden Liposomen nur in fokalen Bereichen durch Endothelzellen aufgenommen (8), wohingegen in größeren Tumoren die Aufnahme allgemeiner war (6).
  • Fokale Aufnahmebereiche wurden als mögliche Stellen eines neuen Gefäßwachstums vermutet (8).
  • Da diese Eigenschaft kationischer Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe den potenziellen praktischen Nutzen einer selektiven Verabreichung von Substanzen an angiogene Endothelzellen aufwies, schien es erstrebenswert zu bestimmen, ob Endothelzellen anderer Stellen pathologischer Angiogenese diese Eigenschaft angiogener Endothelzellen in Tumoren teilen. Auf diese Frage wurden Versuche gerichtet, bei denen die Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen durch angiogene Endothelzellen untersucht wurde, in der Luftröhre von Mäusen mit einer Mycoplasma pulmonis Infektion, die eine chronische Atemwegsentzündung, die das Merkmal Angiogenese aufweist, hervorruft (vergleiche 9 und 10). Es wurde gefunden, dass angiogene Endothelzellen in Bereichen einer chronischen Entzündung Orte einer ungewöhnlich hohen Aufnahme kationischer Liposomen waren (10). Insbesondere Gefäße in den Luftröhren von Mäusen, die mit M. pulmonis infiziert waren, zeigten eine ungewöhnlich hohe Aufnahmemenge. Konfokalmikroskopische Messungen angiogener Blutgefäße zeigten, dass die infizierten Mäuse eine 20–30fach höhere Aufnahme zeigten als Kontrollen (11). Einige angiogene Gefäße zeigten eine 100fach höhere Aufnahme. Konfokalmikroskopische Untersuchungen und elektronenmikroskopische Untersuchungen angiogener Endothelzellen in Mäusen, die mit M. pulmonis infiziert waren, legten nahe, dass kationische Liposomen zuerst mit Endosomen assoziierten (12) und dann von diesen internalisiert wurden (13).
  • Ähnlich wurden kationische Liposomen stark durch angiogene Blutgefäße in ovarialen Follikeln und Gelbkörperchen in Mäusen, durch dysplastische Haut transgener HPV-Mäuse und Luftröhren von Ratten mit Angiogenese aufgrund einer M. pulmonis-Infektion aufgenommen.
  • Schlussfolgerungen: Diese Versuche bestätigten, dass kationische Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe bevorzugt angiogene Endothelzellen von Tumoren und chronische Entzündungsstellen ansteuern.

Claims (8)

  1. Kationisches Liposom, umfassend: mindestens ein kationisches Lipid in einer Menge von mindestens 5 Mol% und gegebenenfalls neutrale Lipide, sowie eine toxische Verbindung, welche eine angiogene Endothelzelle eines Tumors zerstört, dadurch gekennzeichnet, dass es bei physiologischem pH-Wert ein Zetapotential von größer als 0 mV besitzt.
  2. Liposom nach Anspruch 1, wobei das kationische Lipid ein Grundgerüst und mehr als eine Fettsäure umfasst, welche eine Länge von 12 bis 24 Kohlenstoffen besitzt und bis zu sechs ungesättigte Reste enthält, die mit dem Grundgerüst entweder über Acyl- oder über Etherbindungen verbunden sind.
  3. Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Liposom eine mindestens fünffach höhere Selektivität für angiogene Endothelzellen als für entsprechende normale Endothelzellen besitzt.
  4. Verwendung eines kationischen Liposoms, umfassend mindestens ein kationisches Lipid in einer Menge von mindestens 5 Mol% und gegebenenfalls wenigstens ein neutrales Lipid, sowie eine Substanz, die eine angiogene Endothelzelle beeinflußt und aus einer toxischen Verbindung, welche eine angiogene Endothelzelle eines Tumors zerstört, ausgewählt wird, wobei das Liposom bei physiologischem pH-Wert ein Zetapotential von größer als 0 mV besitzt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das kationische Lipid ein Grundgerüst und mehr als eine Fettsäure umfasst, welche eine Länge von 12 bis 24 Kohlenstoffen besitzt und bis zu sechs ungesättigte Reste enthält, die mit dem Grundgerüst entweder über Acyl- oder über Etherbindungen verbunden sind.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 5, wobei das Liposom mittels intravaskulärer Injektion verabreicht wird.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Liposom eine mindestens fünffach höhere Selektivität für angiogene Endothelzellen als für entsprechende normale Endothelzellen besitzt.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Patient ein Säuger, insbesondere ein Mensch, ist.
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