DE60222843T2

DE60222843T2 - Hydrophobe Iodverbindung enthaltendes Liposom und dieses enthaltendes Röntgenkontrastmittel

Info

Publication number: DE60222843T2
Application number: DE60222843T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Minami-ashigara-shi KITAGUCHI; Kazuhiro Minami-ashigara-shi AIKAWA
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2022-08-21
Also published as: EP1287833A2; ATE375173T1; EP1287833A3; EP1287833B1; US7008614B2; US20030086875A1; DE60222843D1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Liposom. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Liposom, das eine besondere Klasse einer hydrophoben Iodverbindung enthält und das für ein Verfahren zur bildlichen Wiedergabe einer Schädigung im Gegensatz zu einer nichtpathologischen Stelle durch selektive Anreicherung der hydrophoben Iodverbindung an der Schädigung (Läsion) verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Röntgenkontrastmedium, das sich selektiv in einem Gewebe oder einer Läsion anreichert, in dem sich Makrophagen lokalisieren, und das die bildliche Wiedergabe davon im Kontrast zu den anderen Stellen ermöglicht.
Stand der Technik
In der modernen Gesellschaft, insbesondere in den Gesellschaften der entwickelten Länder, gibt es immer mehr Gelegenheiten zur Aufnahme von Nahrung mit hohen Kalorie- und Fettgehalten. Aus diesem Grunde erhöhen sich auch die Todesraten infolge ischämischer Erkrankungen, die aus einer Arteriosklerose resultieren (Herzerkrankungen wie Herzinfarkt und Angina pectoris, zerebrovaskuläre Erkrankungen wie Hirninfarkt und zerebrale schwere Blutungen). Es ist daher wünschenswert, derartige Zustände in einem frühen Stadium zu diagnostizieren und eine entsprechende Behandlung anzuschließen. Allerdings ist keine zufrieden stellende Methode für den Diagnosefortschritt von Arteriosklerose in einem frühen Stadium vor Beginn der zuvor genannten Erkrankungen verfügbar.
Verfahren zur Diagnose von Arteriosklerose werden grundsätzlich in nicht-invasive Methoden und invasive Methoden eingeteilt, bei denen ein Katheter oder ähnliches in eine Arterie eingeführt wird. Zu typischen nicht-invasiven Methoden gehören die Röntgenangiographie und die Ultrasonographie. Es ist allerdings mittels dieser Methoden nahezu unmöglich, die Arteriosklerose in einem frühen Stadium zu bestimmen, insbesondere die Verengung der Koronararterie in einem frühen Stadium vor Beginn dieser Erkrankungen, was dann zu einem Herzinfarkt oder Angina pectoris führt.
CT, MRI und ähnliche können manchmal als eine andere Klasse nicht-invasiver Methoden angewandt werden. Allerdings sind diese Methoden in der Hauptsache für die Bestimmung von Tumoren entwickelt worden, und dem entsprechend gibt es bei ihnen Probleme mit der niedrigen Auflösung von arteriosklerotischen Schädigungen. Zusätzlich erfordern diese Methoden teure und große Geräte, die die heranzuziehenden Krankenhäuser und die generelle Anwendbarkeit beschränken.
Als invasive Methoden sind intravaskuläres Echo, vaskuläres Endoskop und ähnliche eingesetzt worden. Es ist anerkannt, dass eine arteriosklerotische Schädigung mit einer Dicke von nur 0,1 mm mittels dieser Methoden gemessen werden kann. Für den Einsatz dieser Methoden ist es allerdings erforderlich, einen Ultraschall-Oszillator oder ein Endoskop am Ende eines Katheters einzuführen, was zu einem beträchtlichen physischen Stress und Schwierigkeiten sowie zu einem Risiko für den Patienten führen kann. Obgleich daher diese Verfahren therapeutisch für Patienten nach dem Auftreten eines Herzinfarkts und ähnlichem oder als sekundäre Prophylaxe verwendet worden sind, können sie nicht für diagnostische Aufgaben eingesetzt werden, um Erkenntnisse über das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines graduellen Fortschritts von Arteriosklerose in einem Patienten vor deren Auftreten eingesetzt werden.
Unter den zuvor genannten Methoden ist die Methode, die am meisten für die Identifizierung einer Schädigung einer arteriellen Gefäßeinengung verwendet wurde, die Röntgenangiographie. Diese Methode umfasst die Stufe der Verabreichung eines wasserlöslichen Iod-Kontrastmediums, um den vaskulären Fluss zu visualisieren und die Feststellung einer Schädigung, durch die der Fluss blockiert wird. Die meisten Röntgenkontrastmedien, die in der praktischen Anwendung sind, sind Verbindungen mit einer Triiodphenylgruppe, die wasserlöslich gemacht wurden. Diese Mittel werden für die Diagnose von Zellräumen, das Vorhandensein von Verengungen und ähnlichem verwendet durch Verabreichung in Zellräume, wie Blutgefäße, den Urinaltrakt und den Ovartrakt. Allerdings werden diese Verbindungen sehr schnell aus solchen Zellräumen ausgeschieden ohne Wechselwirkung mit einem Gewebe oder einer Schädigung, und daher sind sie für die Diagnose eines Gewebes oder einer Schädigung im Detail nicht besonders nützlich. Darüber hinaus kann mit diesen Methoden nur eine Schädigung festgestellt werden, wo der Verengungsfortschritt 50% oder mehr beträgt, und sie versagt bei der Bestimmung einer Schädigung vor dem Auftreten einer Attacke einer ischämischen Erkrankung. Daher ist ein Röntgenkontrastmedien würtschenswert, das sich selektiv in einem Zielgewebe oder einer Schädigung anreichert, um zu einem Bild zu führen mit klaren Kontrast gegenüber den anderen Stellen.
Zum Beispiel offenbaren J. Pharm. Sci., 72(8), 898 (1983); Invest. Radiol., 18 (3), 275 (1983); Steroids, 44 (1), 85 (1984); J. Med. Chem., 24 (1), 5 (1981); J. Med. Chem., 25 (6), 618 (1982); J. Med. Chem., 25 (12), 1500 (1983); Steroids, 49 (6), 531 (1987); Invest. Radiol., 35 (3), 158 (2000); J. Pharm. Sci., 85 (9), 908 (1996); Pharm. Res., 13 (6), 875 (1996); J. Med. Chem., 38 (4), 636 (1995); Invest. Radiol., 29 (suppl. 2), S284 (1994); J. Med. Chem., 29 (12), 2457 (1986), WO 98/46275 , WO 95/31181 , WO 94/19025 , U.S. Patente 4873075 , 4567034 , WO 96/28414 , WO 96/00089 und ähnliche Verfahren der Suspendierung oder Öl-Emulgierung einer hydrophoben Iodverbindung in Wasser in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels und/oder eines Öls und Fettes für den Kontrast eines Tumors, der Leber, der Milz, der Nebennierenrinde, einer arteriosklerotischen Schädigung, eines Gefäßraumes, des lymphatischen Systems und ähnlichem. Allerdings sind diese Methoden zur Formulierung nicht ausreichend in Bezug auf die Effektivität und Selektivität zum Zwecke einer selektiven Röntgenographie eines Gewebes oder einer Schädigung.
Es ist auch über einige Versuche berichtet worden, bei denen ein hydrophobes Iod-Kontrastmittel oder ein hydrophiles Kontrastmittel zur selektiven Anreicherung in einer Zielläsion formuliert wird ( WO 95/19186 , WO 95/21631 , WO 89/00812 , GB 867650 , WO 96/00089 , WO 94/19025 , WO 96/40615 , WO 95/2295 , WO 98/41239 , WO 98/23297 , WO 99/02193 , WO 97/06132 , U.S. Patente 4192859 , 4567034 , 4925649 , Pharm. Res., 16 (3), 420 (1999), J. Pharm. Sci., 72 (8), 898 (1983), Invest. Radiol., 18 (3), 275 (1983)).
Zum Beispiel offenbart Pharm. Res., 16 (3), 420 (1999), dass sich durch Injektion einer Ölpartikeldispersion von Cholesteryl-Iopanoat als hydrophobe Verbindung die Iodverbindung in arteriosklerotischen Schädigungen von Versuchstieren anreichert. J. Pharm. Sci. 72 (8), 898 (1983) offenbart Beispiele der Röntgen-Hepatographie und Splenographie durch Injektion einer Ölpartikeldispersion von Cholesteryliopanoat. Die US-A-4567034 beschreibt ein Verfahren zur selektiven Hepatographie oder Splenographie unter Verwendung von Liposomen, die einen Ester von Diatrizoesäure einkapseln. Die WO 96/28414 und WO 96/00089 offenbaren Kontrastmedien zur bildlichen Wiedergabe von Gefäßpools oder lymphatischen Systemen. Die Methoden unter Verwendung dieser Formulierungen sind allerdings nicht zufrieden stellend in Hinblick auf Effektivität und Selektivität für den Zweck eines selektiven Kontrastes von Gefäßerkrankungen, und es wird über kein Beispiel berichtet, in dem Gefäßerkrankungen unter Verwendung von Röntgenbestrahlung bildlich wiedergegeben werden.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln für eine im hohen Maße selektive Anreicherung einer Iodverbindung in einem besonderen Gewebe oder einer Läsion. Spezieller ist es das Ziel, Mittel bereitzustellen für die selektive Anreicherung einer Iodverbindung in einer Läsion durch Gefäßerkrankung, hervorgerufen durch anormale Vermehrung von glatten Gefäßmuskelzellen, wie Arteriosklerose und Restenose nach PTCA. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln zur bildlichen Wiedergabe eines biologischen Umfeldes einer Gefäßerkrankung oder ähnlichem durch Röntgenographie unter Verwendung der zuvor genannten Mittel.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Röntgenkontrastmediums, das eine scharfe bildliche Wiedergabe eines biologischen Umfeldes eines Gewebes oder einer Läsion ermöglicht, in dem sich Makrophagen lokalisieren, wie in der Leber, Milz, Luftvesikel, Lymphknoten, Lymphgefäße, Nierenepithel oder ähnlichen. Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Kontrastmediums, das die Identifizierung einer Stelle ermöglicht, an der ein Tumor, eine Entzündung oder Infektion fortschreitet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben verschiedene Studien durchgeführt, um die zuvor genannten Ziele zu erreichen, und als Ergebnis wurde gefunden, dass Liposomen, die eine hydrophobe Iodverbindung als eine der Membrankomponenten sich in glatten Gefäßmuskelzellen und Schaummakrophagen anreichern, die die Hauptkomponenten der arteriosklerotischen Läsion sind. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch gefunden, dass Liposomen, die eine hydrophobe Iodverbindung, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin als Membrankomponenten enthalten, sich in einem Gewebe oder einer Läsion anreichern, in der Makrophagen lokalisiert sind, und das derartige Gewebe oder Läsionen, in denen sich Makrophagen lokalisieren, eine scharfe bildliche Wiedergabe durch Röntgenographie unter Verwendung eines Kontrastmediums mit derartigen Liposomen ergeben. Die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieser Erkenntnisse gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Liposom zur Verfügung, das eine hydrophobe Iodverbindung enthält, repräsentiert durch die folgende allgemeine Formel (I) als Membrankomponente: R¹-CO₂-R² (wobei in der Formel R¹ eine substituierte oder unsubstituierte 2,3,5-Triiodphenylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte 3,4,5-Triiodphenylgruppe ist; und R² ist eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen).
Als bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das zuvor genannte Liposom bereitgestellt, das ein Phospholipid enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin, vorzugsweise einer Kombination von Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin, als Membrankomponente(n); das zuvor genannte Liposom, enthaltend einen Phosphorsäuredialkylester, der ein Diester eines Alkyls mit 6 oder mehr Kohlenstoffatomen ist als Membrankomponente; und das zuvor genannte Liposom, worin die Kohlenwasserstoffgruppe, die 10 oder mehr Kohlenstoffatome hat, ein Rest eines Cholesterinderivats ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Röntgenkontrastmedium, das das zuvor genannte Liposom umfasst. Als bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden bereitgestellt das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, das für die Röntgenographie einer Gefäßerkrankung verwendet wird; und das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, das zur Röntgenographie von glatten Gefäßmuskelzellen verwendet wird, die eine anormale Vermehrung unter Einfluß von Schaummakrophagen zeigen, zum Beispiel für die Radiographie einer arteriosklerotischen Läsion oder Restenose nach PTCA.
Nach einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Röntgenkontrastmedium für die Röntgenographie eines Gewebes oder einer Läsion bereit, in der sich Makrophagen lokalisieren, das ein Liposom umfasst, enthaltend eine hydrophobe Iodverbindung, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin als Membrankomponenten.
Als bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden bereitgestellt das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, worin die hydrophobe Iodverbindung ein Triiodbenzolderivat ist, das wenigstens einen Substituenten mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen hat; das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, worin das Liposom einen Phosphorsäuredialkylester enthält, der ein Diester eines Alkyls mit 6 oder mehr Kohlenstoffatomen ist als eine Membrankomponente; das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, worin die Kohlenwasserstoffgruppe, die 10 oder mehr Kohlenstoffatome hat, ein Rest eines Cholesterinderivats ist; das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, worin das Gewerbe, in dem sich Makrophagen lokalisieren, aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den Geweben von Leber, Milz, Luftvesikeln, Lymphknoten, Lymphgefäßen und Nierenepithel Epithel; und das zuvor genannte Röntgenkontrastmedium, worin die Läsion, in der sich Makrophagen lokalisieren, aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Tumorstelle, einer Entzündungsstelle und einer Infektionsstelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Röntgenographie eines Gewebes oder einer Läsion, in der sich Makrophagen lokalisieren, die eine Stufe der Durchführung einer Röntgenographie nach Verabreichung eines Röntgenkontrastmediums umfasst, umfassend ein Liposom, das eine hydrophobe Iodverbindung, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin als Membrankomponenten enthält, bei einem Säugetier, einschließlich des Menschen.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse der Auslösung von Vermehrung der glatten Gefäßmuskelzellen bei der Maus in Gegenwart von Schaummakrophagen der Maus.
2 zeigt eine Vermehrungskurve von glatten Gefäßmuskelzellen der Maus, erhalten ohne Zugabe von Schaummakrophagen der Maus.
3 zeigt die Aufnahme von Liposomen durch glatte Gefäßmuskelzellen der Maus. In der Figur zeigt (1) Ergebnisse, erhalten durch Zugabe einer Liposompräparation am dritten Tag des Kultursystems von 2 ohne Zugabe von Schaummakrophagen und anschließende Fortsetzung der Kultur für 1 Tag, (2) zeigt Ergebnisse, erhalten durch Zugabe eines Liposompräparation am fünften Tag des Kultursystems von 1, das mit Schaummakrophagen zugegeben wurde und anschließende Fortsetzung der Kultur für 1 Tag, und (3) zeigt Ergebnisse, erhalten durch Zugabe einer Liposompräparation am siebten Tag des Kultursystems von 1, das mit Schaummakrophagen zugegeben wurde, und anschließende Fortsetzung der Kultur für 1 Tag (3).
4 zeigt die Ergebnisse, erhalten unter Verwendung einer Ölpartikeldispersion anstelle der Liposomen der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die Iodverbindung, repräsentiert durch die allgemeine Formel (1), ist eine Esterverbindung, gebildet aus einer substituierten oder unsubstituierten 2,3,5-Triiodbenzoesäure oder einer substituierten oder unsubstituierten 3,4,5- Triiodbenzoesäure und einem Alkohol, der eine Kohlenwasserstoffgruppe hat, die mehr als 10 Kohlenstoffatome enthält. Der Alkohol, der eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen hat, ist vorzugsweise ein Alkohol, der eine hydrophobe Wasserstoffgruppe für die stabile Lokalisierung des Triiodbenzoesäurerestes aufweist, um als Iodkontrastkomponente in einer Bilayer des Liposoms zu dienen. Zum Beispiel ist ein Alkohol bevorzugt mit einer Kohlenwasserstoffgruppe, die von 18 bis 40 Kohlenstoffatome enthält (numerische Bereiche definiert mit „von-bis" in der Beschreibung beziehen die Werte der oberen und unteren Grenzen mit ein). Weiterhin kann die Kohlenwasserstoffgruppe ein oder mehrere Heteroatome enthalten, wie ein Sauerstoffatom, Stickstoffatom oder Schwefelatom. Die Gesamtzahl an Sauerstoffatomen und Stickstoffatomen, die in der Kohlenwasserstoffgruppe enthalten sein können, beträgt vorzugsweise allgemein 10 oder weniger. Die Heteroatome können das Gerüst einer Kohlenwasserstoffgruppe bilden und/oder können in einer Seitenkette enthalten sein.
Die Kohlenwasserstoffgruppe hat bevorzugter eine Struktur, ähnlich der von Lipidkomponenten, die biologische Membranen bilden. Bevorzugte Beispiele für die hydrophoben Iodverbindungen der allgemeinen Formel (I), die derartige Erfordernisse erfüllen, schließen zum Beispiel Esterverbindungen ein, gebildet durch Cholesterinderivate, beschrieben in J. Med. Chem., 25 (6), 618 (1982); J. Med. Chem., 24 (1), 5 (1981); Appl. Radial. Isot., 37 (8), 907 (1986); Steroids, 44 (1), 85 (1984); Steroids, 14 (5), 575 (1969) und ähnliche sowie die 2,3,5-Triiodbenzoesäure oder 3,4,5-Triiodbenzoesäure. Die in den zuvor genannten Literaturstellen beschriebenen Cholesterinderivate sind bevorzugt, und Cholesterin ist besonders bevorzugt. Verbindungen, in denen Cholesterin an die 3-Hydroxygruppe einer 2,3,5-Triiodbenzoesäure oder 3,4,5-Triiodbenzoesäure gebunden ist, um eine Esterbindung zu bilden, sind bevorzugt.
In der allgemeinen Formel (I) kann die 2,3,5-Triiodphenylgruppe oder 3,4,5-Triiodphenylgruppe einen oder mehrere Substituenten am Ring tragen. Die Art, die Substituierungsposition und die Anzahl der Substituenten sind nicht besonders eingeschränkt. Zu Beispielen der Substituenten am Ring gehören beispielsweise eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Acylaminogruppe, eine Hydroxygruppe, eine Carboxygruppe und ähnliche. Bevorzugte Substituenten sind eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe und eine substituierte oder unsubstituierte Acylaminogruppe. Zu Beispielen der Aminogruppe mit einem Stubstituenten gehören eine Monoalkylaminogruppe, eine Dialkylaminogruppe und ähnliche, und zu Beispielen der Acylaminogruppe mit einem Substituenten gehören die Trifluoracetylaminogruppe, p-Chlorbenzoylaminogruppe und ähnliche.
Zu bevorzugten Beispielen der Verbindung, repräsentiert durch die allgemeine Formel (I), gehören Verbindung 12 bis Verbindung 15 unter den speziellen Verbindungen, die unten aufgeführt sind. Allerdings sind die Liposome der vorliegenden Erfindung nicht auf solche beschränkt, die diese Verbindungen enthalten.
Die hydrophobe Iodverbindung, repräsentiert durch die zuvor genannte allgemeine Formel (I), ist in einer Komponente einer Membran des Liposoms enthalten, und der Gehalt der Verbindung in dem Liposom beträgt etwa von 10 bis 90 Masse-%, bevorzugt von 10 bis 80 Masse-%, weiter bevorzugt von 20 bis 80 Masse-% der gesamten Membrankomponenten des Liposoms. Eine Art der hydrophoben Iodverbindung kann als Membrankomponente verwendet werden, oder es können zwei oder mehrere Arten an hydrophober Iodverbindung in Kombination eingesetzt werden.
Als andere Komponenten, die die Liposommembran bilden, kann eine beliebige Lipidverbindung, die üblicherweise für die Herstellung von Liposomen verwendet wird, eingesetzt werden.
Zum Beispiel sind solche Verbindungen beschrieben in Biochim. Biophys. Acta, 150 (4), 44 (1982); Adv. in Lipid. Res., 16 (1) 1 (1978); „RESEARCH IN LIPOSOMES", P. Machy, L. Leserman, John Libbey EUROTEXT Co.); "Liposome" (Hrsg., Nojima, Sunamoto und Inoue, Nankodo) und ähnliche. Als Lipidverbindungen sind Phospholipide bevorzugt, und Phosphatidylcholine (PC) sind besonders bevorzugt. Zu bevorzugten Beispielen von Phosphatidylcholinen gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ei-PC, Dimyristoyl-PC (DMPC), Dipalmitoyl-PC (DPPC), Distearoyl-PC (DSPC), Dioleyl-PC (DOPC) und ähnliche.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Liposoms der vorliegenden Erfindung kann ein Phospholipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylcholinen und Phosphatidylserinen (PS) als Membrankomponente des Liposoms verwendet werden, und nach einer bevorzugteren Ausführungsform können beide in Kombination verwendet werden. Zu Beispielen von Phosphatidylserinen gehören solche, die Lipidkomponenten haben, ähnlich denen der Phospholipide, die als bevorzugte Beispiele der Phosphatidylcholine genannt worden sind. Wenn ein Phosphatidylcholin und ein Phosphatidylserin in Kombination verwendet werden, liegt das molare Verhältnis von PC und PS (PC:PS) vorzugsweise im Bereich von 90:10 bis 10:90, weiter bevorzugt von 30:70 bis 70:30.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Liposoms der vorliegenden Erfindung ist ein Liposom, das Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin sowie weiterhin einen Phosphorsäuredialkylester als Membrankomponenten enthält. Die beiden Alkylgruppen, die den Dialkylester der Phosphorsäure bilden, sind vorzugsweise von gleicher Art, und jede Gruppe kann 6 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten, vorzugsweise 10 oder mehr Kohlenstoffatome, bevorzugter 12 oder mehr Kohlenstoffatome. Eine obere Grenze der Kohlenstoffanzahl der Alkylgruppen ist nicht genau anzugeben. Die Grenze beträgt allgemein 24 oder weniger. Zu bevorzugten Beispielen der Phosphorsäuredialkylester gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Dilaurylphosphat, Dimyristylphosphat, Dicetylphosphat und ähnliche. In dieser Ausführungsform beträgt die Menge des Phosphorsäuredialkylesters von 1 bis 50 Masse-%, bevorzugt von 1 bis 30 Masse-%, weiter bevorzugt von 1 bis 20 Masse-%, bezogen auf die Gesamtmasse an Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin.
In dem Liposom, enthaltend Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphorsäuredialkylester und eine hydrophobe Iodverbindung, repräsentiert durch die zuvor genannte allgemeine Formel (I) als Membrankomponenten, kann ein bevorzugtes Verhältnis von PC, PS, Phosphorsäuredialkylester und hydrophober Iodverbindung, repräsentiert durch die allgemeine Formel (I), von 5 bis 40 Masse-%:von 5 bis 40 Masse-%:von 1 bis 10 Masse-%:15 bis 80 Masse-% gewählt werden.
Die Komponenten des Liposoms der vorliegenden Erfindung sind nicht auf die zuvor genannten vier Arten an Verbindungen eingeschränkt, deshalb können andere Komponenten hinzugegeben werden. Zu Beispielen solcher Komponenten gehören Cholesterin, Cholesterinester, Sphingomyelin, Monosial-Gangliosid GM1-Derivate beschrieben in FEBS Lett., 223, 42 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 6949 (1988) etc., Glucuronsäurederivate beschrieben in Chem. Lett., 2145 (1989); Biochim. Biophys. Acta, 1148, 77 (1992) etc., Polyethylenglycolderivate beschrieben in Biochim. Biophys. Acta, 1029, 91 (1990); FEBS Lett., 268, 235 (1990) und ähnliche. Allerdings sind die Komponenten nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Das Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung nach dem ersten Aspekt ist gekennzeichnet dadurch, dass es die Liposomen umfasst, die die Verbindung enthalten, die durch die zuvor genannte Formel (I) repräsentiert wird. Die Liposomen können nach beliebigen bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt werden. Beispiele von Herstellungsverfahren sind beschrieben in solchen Literaturstellen, wie allgemeinen Überblicken von oben genannten Liposomen sowie in Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980), „Liopsomes" (Hrsg. M. J. Ostro, MARCELL DEKKER, INC.) und ähnliche. Zu speziellen Beispielen dafür gehören das Ultraschallverfahren, Ethanolinjektionsverfahren, French-press-Verfahren, Etherinjektionsverfahren, Cholsäuremethode, Calciumfusionsmethode, Gefrier- und Auftaumethode, Umkehrphasenverdampfung und ähnliche. Die Herstellungsverfahren sind jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die Größe der Liposomen kann eine beliebige von denen sein, die durch die zuvor genannten Verfahren herstellbar ist. Im allgemeinen kann die Größe 400 nm oder weniger sein, vorzugsweise 200 nm oder weniger. Die Strukturen der Liposome sind nicht besonders eingeschränkt, es können unilamellare oder multilamellare Strukturen sein. Es ist auch möglich, eine oder mehrere Arten von entsprechenden Medikamenten oder anderen Kontrastmedien in den Liposomen zu formulieren.
Das nach dem ersten Aspekt bereitgestellt Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung kann für die Röntgenographie als Iodenthaltendes Kontrastmedium verwendet werden. Das Kontrastmedium kann vorzugsweise parenteral verabreicht werden bevorzugter wird es intravenös verabreicht. Zum Beispiel können Präparationen in Form einer Injektion oder einer Tropfinfusion als pulverförmige Zusammensetzungen in lyophilisierter Form vorgesehen sein, und sie können durch Lösung oder Resuspensierung unmittelbar vor der Verwendung in Wasser oder in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. physiologischer Kochsalzlösung, Glucoseinfusion, Pufferlösung und ähnlichen verwendet werden. Wenn die Liposome der vorliegenden Erfindung als Iod-enthaltendes Kontrastmedium verwendet werden, kann die Dosis in geeigneter Weise so festgelegt werden, dass ein Iodgehalt in den Liposomen in ähnlicher Höhe erreicht wird wie der bei konventionellen Iod-enthaltenden Kontrastmedien.
Obgleich es nicht beabsichtigt ist, sich an eine spezielle Theorie gebunden zu fühlen, ist es bekannt, dass es bei Gefäßerkrankungen wie Arteriosklerose oder Restenose nach PTCA die glatten Gefäßmuskelzellen abnorm wachsen und in das Endosporium wandern, um gleichzeitig den Blutdurchfluß einzuengen. Faktoren, die das anormale Wachstum von normalen glatten Gefäßmuskelzellen auslösen, sind bisher noch nicht vollständig geklärt worden, es ist allerdings bekannt, dass die Wanderung von Makrophagen in das Endosporium und das Schäumen wichtige Faktoren sind. Es ist darüber berichtet worden, dass glatte Gefäßmuskelzellen anschließend eine Phänotypumwandlung hervorrufen (vom eingeschnürten zum Komposittyp).
Wenn die Liposomen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann die hydrophobe Iodverbindung, repräsentiert durch die allgemeine Formel (I), selektiv in die glatten Gefäßmuskelzellen aufgenommen werden, die unter dem Einfluß von Schaummakrophagen anormal gewachsen sind. Es ergibt sich unter Verwendung der Liposomen der vorliegenden Erfindung eine Röntgenographie mit starkem Kontrast zwischen einer Läsion und glatten Gefäßmuskelzellen an nichtpathologischen Stellen. Daher kann das Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung, das nach dem ersten Aspekt bereitgestellt wird, in geeigneter Weise insbesondere für die Röntgenographie von Gefäßerkrankungen verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Röntgenographie von einer arteriosklerotischen Läsion oder Restenose nach PTCA durchgeführt werden. Die Methode zur Bildgebung ist nicht besonders eingeschränkt. Die Bildgebung kann mittels eines üblichen Verfahrens unter Verwendung von Röntgenstrahlung durchgeführt werden.
Weiterhin ist es bekannt, wie in J. Biol. Chem., 265, 5226 (1990) zum Beispiel beschrieben, dass Phospholipide enthaltende Liposome, insbesondere unter Verwendung von PC und PS gebildete Liposome, sich mit Hilfe von Radikalfängerrezeptoren zur Anreicherung an Makrophagen eignen. Daher kann unter Verwendung der Liposome der vorliegenden Erfindung die hydrophobe Iodverbindung, repräsentiert durch die allgemeine Formel (I), in einem Gewebe oder einer Läsion angereichert werden, in der sich Makrophagen lokalisieren. Wenn die Liposome der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist es möglich, eine größere Menge der Iodverbindung in Makrophagen anzureichern im Vergleich mit einem Kontrastmedium, das eine Suspension oder eine Ölemulsion verwendet, wie bei der üblichen Technik.
Zu Beispielen von Gewebearten, in denen die Lokalisierung von Makrophagen beobachtet wird, die in geeigneter Weise nach dem erfindungsgemäßen Verfahren röntgenografisch erfasst werden können, gehören Blutgefäße, Leber, Milz, Luftvesikel, Lymphknoten, Lymphgefäße und Nierenepithel. Weiterhin ist es bekannt, dass sich Makrophagen in Läsionen bestimmter Arten von Krankheiten anreichern. Zu Beispielen von solchen Krankheiten gehören Tumor, Arteriosklerose, Entzündung, Infektion und ähnliche. Daher können Läsionen durch solche Erkrankungen unter Verwendung der Liposome der vorliegenden Erfindung identifiziert werden. Insbesondere ist es bekannt, dass sich Schaummakrophagen, die eine große Menge an denaturiertem LDL mit Hilfe von Radikalfängerrezeptoren aufnehmen, sich in arteriosklerotischen Läsionen in einem frühen Stadium anreichern. (Am. J. Pathol., 103, 181 (1981); Annu. Rev. Biochem., 52, 223 (1983)). Daher ist es mit Durchführung der Radiographie nach Anreicherung der Liposome der vorliegenden Erfindung in den Makrophagen möglich, Orte von arteriosklerotischen Läsionen in einem frühen Stadium zu identifizieren, was mit Hilfe von anderen Mitteln schwerlich erreichbar ist.
Das zweite Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung, das nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt wird, ist ein Röntgenkontrastmedium für die Röntgenographie eines Gewebes oder einer Läsion, in der sich Makrophagen lokalisieren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es Liposome umfasst, die eine hydrophobe Iodverbindung, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin als Membrankomponenten enthalten.
Die Art der hydrophoben Iodverbindungen ist nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel sind Iodbenzolderivate bevorzugt, und Triiodbenzolderivate mit wenigstens einem Substituenten, der 10 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, sind bevorzugter. Die Substitutionspositionen der drei Iod-Atome der Triiodbenzolderivate sind nicht besonders eingeschränkt. Zu bevorzugten Beispielen der Triiodbenzolderivate gehören 1,3,5-Triiodbenzolderivate, 1,2,4-Triiodbenzolderivate, 1,2,3-Triiodbenzolderivate und ähnliche. Weiterhin sind auch die hydrophoben Iodverbindungen, die durch die zuvor genannte Formel (I) repräsentiert werden, bevorzugt.
Der Substituent, der 10 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, ist vorzugsweise eine hydrophobe Gruppe für die stabile Lokalisierung des Triiodbenzolrestes, der eine Kontrastkomponente ist. Zum Beispiel sind Substituenten bevorzugter, die 18 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten, in denen die Gesamtzahl der Sauerstoffatome und Stickstoffatome 10 oder weniger beträgt. Eine Obergrenze der Kohlenstoffanzahl der Substituenten, die 10 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten ist nicht besonders gegeben. Im allgemeinen liegt die Grenze bei 40 oder weniger. Der hydrophobe Substituent hat bevorzugter eine Struktur ähnlich der einer biologischen Membran, die Lipidkomponenten enthält. Zu bevorzugten Beispielen der hydrophoben Iodverbindungen, die derartige Bedingungen erfüllen, gehören zum Beispiel 1,3,5-Triiodbenzolderivate mit einem Substituenten eines Restes eines Cholesterinderivates, offenbart in J. Med. Chem., 25 (12), 1500 (1982); Steroids, 49 (6), 531 (1987); Pharm. Res., 6 (12), 1011 (1989); WO 95/19186 , WO 96/28414 und ähnlichen.
Zu anderen bevorzugten Beispielen der hydrophoben Iod-Verbindung gehören zum Beispiel 1,2,4- oder 1,2,3-Triiodbenzolderivate, die als Substituenten einen Rest eines beliebigen Cholesterinderivates aufweisen, beschrieben in J. Med. Chem., 25 (6), 618 (1982); J. Med. Chem., 24 (1), 5 (1981); Appl. Radial. Isot., 37 (8), 907 (1986); Steroids, 44 (1), 85 (1984); Steroids, 14 (5), 575 (1969) und ähnlichen.
Die Cholesterinderivate, die in der zuvor beschriebenen Literaturstelle genannt sind, sind bevorzugt, und insbesondere bevorzugt ist Cholesterin. Es sind Verbindungen bevorzugt, in denen Cholesterin an der 3-Hydroxygruppe an die hydrophobe Iod-Verbindung gebunden ist, zum Beispiel an eine Triiodphenylgruppe. Als Mittel für die Bindung der Hydroxygruppe des Cholesterins an die hydrophobe Iod-Verbindung, wie eine Triiodphenylgruppe, kann eine Esterbindung, Etherbindung, Urethanbindung, Carbonatbindung und so weiter eingesetzt werden. Eine Esterbindung ist bevorzugt. Cholesterin und die hydrophobe Iodverbindung, wie eine Triiodphenylgruppe, können direkt über eine beliebige der oben genannten Bindungen gebunden werden, oder sie können mittels einer geeigneten Brückengruppe gebunden werden. Zu Beispielen einer geeigneten Brückengruppe gehören eine lineare oder verzweigte Alkylengruppe mit 5 oder weniger Kohlenstoffatomen.
Die hydrophobe Iod-Verbindung, vorzugsweise eine Triiodbenzolverbindung, kann einen oder mehrere Substituenten tragen, anders als der zuvor genannte Substituent mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen. Die Art, die Substituierungsposition und die Anzahl der Substituenten sind nicht besonders eingeschränkt. Zum Beispiel können eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Acylaminogruppe, eine Hydroxygruppe, eine Carboxygruppe und ähnliche an einem Benzolring der hydrophoben Iod-Verbindung substituiert sein. Zu bevorzugten Substituenten gehören eine substituierte oder unsubstituierte Aminogruppe und eine substituierte oder unsubstituierte Acylaminogruppe. Zu Beispielen der Aminogruppe mit einem Substituenten gehören eine Monoalkylaminogruppe, eine Dialkylaminogruppe und ähnliche, und zu Beispielen der Acylaminogruppe mit einem Substituenten gehören die Trifluoracetylaminogruppe, die p-Chlorbenzoylaminogruppe und ähnliche.
Bevorzugte Beispiele der hydrophoben Iod-Verbindung sind unten aufgeführt. Das Liposom der vorliegenden Erfindung ist allerdings nicht auf die eingeschränkt, die diese Verbindungen enthalten.
Die hydrophobe Iod-Verbindung ist in einer Membrankomponente des Liposoms enthalten, und der Gehalt der Verbindung in dem Liposom beträgt etwa 10 bis 90 Masse-%, vorzugsweise von 10 bis 80 Masse-%, weiter bevorzugt von 20 bis 80 Masse-% der Gesamtmembrankomponenten des Liposoms. Eine Art der hydrophoben Iod-Verbindung kann als Membrankomponente verwendet werden, oder es können 2 oder mehrere Arten der hydrophoben Iod-Verbindungen in Kombination eingesetzt werden.
Die in dem Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung enthaltenen Liposome, die nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt werden, sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die hydrophobe Iod-Verbindung, Phosphatidylcholin (PC) und Phospharidylserin (PS) in Kombination als Membrankomponenten enthalten. Zu bevorzugten Beispielen der Phosphatidylcholine gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Ei-PC, Dimyristoyl-PC (DMPC), Dipalmitoyl-PC (DPPC), Distearoyl-PC (DSPC), Dioleyl-PC (DOPC) und ähnliche. Zu bevorzugten Beispielen von Phosphatidylserin gehören solche, die Lipideinheiten haben, ähnlich denen der Phospholipide, die als bevorzugte Beispiele für die Phosphatidylcholine genannt wurden. Bevorzugte molare Verhältnisse des verwendeten PC und PS liegen im Bereich von 90:10 bis 10:90, bevorzugter von 30:70 bis 70:30.
Ein Beispiel einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Liposoms, das in dem Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung enthalten ist, und nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt wird, ist ein Liposom, das die hydrophobe Iod-Verbindung, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin und weiterhin einen Phosphorsäuredialkylester als Membrankomponenten enthalten. Die beiden Alkylgruppen, die den Dialkylester der Phosphorsäure bilden, sind vorzugsweise die gleichen, wobei jede 6 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten kann, vorzugsweise 10 oder mehr Kohlenstoffatome, bevorzugter 12 oder mehr Kohlenstoffatome. Eine obere Grenze der Kohlenstoffatomanzahl der Alkylgruppen ist nicht speziell festgelegt. Im allgemeinen liegt die Grenze bei 24 oder weniger. Zu bevorzugten Beispielen des Phosphorsäuredialkylesters gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Dilaurylphosphat, Dimyristylphosphat, Dicetylphosphat und ähnliche. Nach dieser besonderen Ausführungsform liegen die bevorzugten Mengen an Phosphorsäuredialkylester von 1 bis 50 Masse-%, bevorzugt 1 bis 30 Masse-%, weiter bevorzugt 1 bis 20 Masse-%, bezogen auf die Gesamtmasse an Phosphatidylcholin und Phospharidylserin.
In dem Liposom, das Phosphatidylcholin, Phospharidylserin, Phosphorsäuredialkylester und die hydrophobe Iodverbindung als Membrankomponenten enthält, können die bevorzugten Masseverhältnisse von PC, PS, Phosphorsäuredialkylester und der hydrophoben Iod-Verbindung gewählt werden von 5 bis 40 Masse-%:von 5 bis 40 Masse-%:von 1 bis 10 Masse-%:von 15 bis 80 Masse-%.
Die Komponenten des Liposoms der vorliegenden Erfindung, die nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt werden, sind nicht auf die zuvor genannten vier Arten von Verbindungen beschränkt, es können weitere Komponenten zugegeben werden. Zu Beispielen von derartigen Komponenten gehören Cholesterin, Cholesterinester, Sphingomyelin, Monosial Ganglioside GM1-Derivat beschrieben in FEBS Lett., 223, 42 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 6949 (1988) etc., Glucuronsäurederivate beschrieben in Chem. Lett., 2145 (1989); Biochim, Biophys. Acta, 1148, 77 (1992) etc., Polyethylenglycolderivate beschrieben in Biochim. Biophys. Acta, 1029, 91 (1990); FEBS Lett., 268, 235 (1990) und ähnliche. Allerdings sind die Komponenten nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Die in dem Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung enthaltenen Liposome, die nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt werden, können nach beliebigen bekannten Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden. Beispiele der Herstellungsverfahren sind in den oben genannten Literaturstellen zu Übersichtsartikeln über Liposome beschrieben sowie in Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980), „Liopsomes" (Hrsg. M. J. Ostro, MARCELL DEKKER, INC.) und ähnliche. Zu speziellen Beispielen gehören die Ultraschallmethode, Ethanolinjektionsmethode, French-press-Verfahren (Extruder), Etherinjektionsverfahren, Cholinsäureverfahren, Calciumfusionsverfahren, Gefrier- und Auftauverfahren, Umkehrphasenverdampfung und ähnliche. Die Herstellungsverfahren sind allerdings nicht auf diese Beispiele beschränkt. Die Größe der Liposome kann eine beliebige Größe sein, die nach den zuvor genannten Verfahren erhältlich ist. Die Größe beträgt im Durchschnitt 400 nm oder weniger, vorzugsweise 200 nm oder weniger. Die Strukturen der Liposome sind nicht besonders eingeschränkt, es kann sich um unilamellare oder multilamellare Strukturen handeln. Es ist auch möglich, eine oder mehrere Arten von entsprechenden Medikamenten oder andere Kontrastmedien in den Liposomen zu formulieren.
Das Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung, das nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt wird, kann für die Röntgenografie als Iod-haltiges Kontrastmedium verwendet werden. Dieses Kontrastmedium kann vorzugsweise parenteral verabreicht werden, bevorzugter intravenös verabreicht werden. Zum Beispiel können Präparationen in Form einer Injektion oder einer Tropfinfusion vorgesehen sein sowie Pulverzusammensetzung in lyophilisierter Form, und sie können gelöst oder resuspensiert unmittelbar vor der Verwendung in Wasser oder einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. physiologische Kochsalzlösung, Glucoseinfusion, Puffer und ähnliche) sein. Wenn die Liposome der vorliegenden Erfindung als Iod enthaltendes Kontrastmittel verwendet werden, kann in geeigneter Weise eine Dosis festgelegt werden, so dass ein Iodgehalt in den Liposomen ähnlich gegeben ist wie der in einem konventionellen Iod enthaltenden Kontrastmedium.
Wie in J. Biol. Chem., 265, 5226 (1990) beschrieben ist es zum Beispiel bekannt, dass Phospolipide enthaltende Liposome, insbesondere Liposome, die aus PC und PS gebildet sind, sich wahrscheinlich in Makrophagen mit Hilfe von Radikalfängerrezeptoren anreichern. Daher kann unter Verwendung der Liposome der vorliegenden Erfindung, die nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt werden, die hydrophobe Iod- Verbindung in einem Gewebe oder eine Läsion angereichert werden, in der sich Makrophagen lokalisieren. Wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben, kann ein Verfahren unter Verwendung des Kontrastmediums der vorliegenden Erfindung einen größeren Betrag an Anreicherung der Iodverbindung in Makrophagen erreichen, im Vergleich mit einem Verfahren, das mit einer Suspension oder einer Ölemulsion als konventionelle Technik arbeitet.
Zu Beispielen von Geweben, in denen sich Makrophagen lokalisieren, die in geeigneter Weise mittels des Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung röntgenografiert werden können, gehören Leber, Luftvesikel, Lymphknoten, Lymphgefäße und Nierenepithel, Es ist weiterhin bekannt, dass sich Makrophagen in Läsionen bestimmter Arten von Krankheiten anreichern. Zu Beispielen dieser Krankheiten gehören Tumor, Entzündung, Infektion und ähnliche. Daher können Läsionen von solchen Erkrankungen unter Verwendung der Liposome der vorliegenden Erfindung, die nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt werden, identifiziert werden.
Beispiele
Die Erfindung wird spezieller unter Bezug auf Beispiele erläutert. Allerdings ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt. Die in den Beispielen verwendeten Verbindungsnummern entsprechen den Nummern der Verbindungen, die oben als bevorzugte Verbindungen genannt wurden.
Beispiel 1: Herstellung eines Kultursystems von glatten Gefäßmuskelzellen, bei denen Wachstum durch Schaummakrophagen aktiviert wird.
Glatte Gefäßmuskelzellen wurden aus dem Maus-Aortaendothel isoliert („Tissue Culture Method", 10. Aufl. Hrsg. Japanese Tissue Culture Association, publiziert von Kodansha, 1998). Die isolierten vaskulären Glattmuskelzellen wurden suspendiert in 10% FBS Eagle's MEM (GIBCO, Nr. 11095-080) und inokuliert in Löchern einer 12-Loch-Mikroplatte (FALCON, Nr. 3503). Die Anzahl der Zellen in jedem Loch wurde auf 10000 Zellen eingestellt. Die Zellen wurden für 3 Tage bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.
Anschließend wurden die geschäumten peritonealen Mausmakrophagen hergestellt nach der Methode, die in Biochimica, Biophysica Acta, 1213, 127 (1994) beschrieben ist. 200000 der Schaummakrophagen wurden abgetrennt und auf eine Insertzelle geimpft (FALCON, Nr. 3180), die sich auf jedem Loch der Mikroplatte befand, wo die glatten Gefäßmuskelzellen auf der Behälteroberfläche kultiviert wurden. Die Zellen wurden für 5 Tage bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Die Anzahl der Zellen an glatten Gefäßmuskelzellen in dem obigen Experiment sind in 1 gezeigt. Obgleich die glatten Gefäßmuskelzellen in einem frühen Stadium nach Beginn der Kultur nur mäßig wuchsen, wuchsen sie aktiv nach Zugabe der Schaummakrophagen am dritten Tag und in der nachfolgenden Induktionsperiode für etwa einen Tag. Eine Wachstumskurve der glatten Gefäßmuskelzellen, die nicht mit den Makrophagen versetzt worden waren, ist in 2 gezeigt. Der Vergleich der Ergebnisse, die in 1 und 2 aufgeführt sind, zeigt klar die Aktivierungswirkung der Schaummakrophagen auf das Wachstum.
Beispiel 2: Verifizierung der Expression von Radikalfängerrezeptoren auf glatten Gefäßmuskelzellen
Es ist bekannt, dass glatte Gefäßmuskelzellen in einer arteriosklerotischen Läsion Radikalfängerrezeptoren auf ihren Oberflächen exprimieren, um oxidiertes LDL (Biochem. Phamacol., 15:57 (4), 383 (1999); Exp. Mol. Pathol., 64 (3), 127–45, 1997) aufzunehmen. Die glatten Gefäßmuskelzellen des Kultursystems von 1 wurden unter Verwendung von Radikalfängerrezeptoren-Antikörpern der Maus immungefärbt. Obgleich die Expression bei den glatten Gefäßmuskelzellen am dritten Tag der Beimpfung nicht beobachtet wurde, wurde als Ergebnis eine klare Färbung am sechsten Tag nach der Beimpfung beobachtet. Wenn die Schaummakrophagen auf dem Zellfilter in ähnlicher Weise immungefärbt wurden, wurde ebenfalls eine klare Färbung beobachtet.
Beispiel 3: Aufnahme von oxidiertem LDL durch glatte Gefäßmuskelzellen
In dem Kultursystem von 1 wurde ¹²⁵I-markiertes oxidiertes LDL dem Medium für die glatten Gefäßmuskelzellen am dritten Tag und am sechsten Tag nach der Beimpfung zugegeben. In die Zellen aufgenommenes ¹²⁵I wurde 24 Stunden nach jeder Zugabe gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Eine klare Differenz bei der Aufnahmemenge wurde beobachtet zwischen dem Ergebnissen am dritten Tag und am sechsten Tag. Tabelle 1

Tage Aufnahme von ¹²⁵I-oxLDL (× 1000 cpm)

3 Tage nach Beimpfung 0,52 ± 0,11

6 Tage nach Beimpfung 2,2 ± 0,4
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die glatten Gefäßmuskelzellen, die in dem zuvor genannten Zellkultursystem kultiviert worden waren, Eigenschaften hatten, ähnlich denen von Glattmuskelzellen in einer Läsion von Arteriosklerose, Restenose oder ähnlichen. Da die glatten Gefäßmuskelzellen, die in dem Kultursystem von 1 kultiviert worden waren, Eigenschaften von gesunden Blutgefäßen bis zum dritten Tag nach Beimpfung hatten und Eigenschaften von glatten Gefäßmuskelzellen in einer arteriosklerotischen Läsion an oder nach dem siebten Tag nach der Beimpfung hatten, kann ein Screening eines Medikaments selektiv zur Läsion durchgeführt werden durch Vergleich von Wirkungen des Medikaments bei jeder der oben genannten Zellen. Insbesondere kann das System zur Suche nach einem für die Läsion selektiven Arzneimittel-Zuführungssystem, zur Suche nach einem für die Zellen in einer Läsion selektiv toxischen Medikament, zur Suche nach einem Medikament, das selektiv den Zellzyklus von Zellen in einer Läsion beendet und ähnliches verwendet werden.
Beispiel 4: Herstellung von Liposomen
Ei-PC (Funakoshi, Nr. 1201-41-0214), Ei-PS (Funakoshi, Nr. 1201-42-0226), Dicetylphosphat (DCP, Funakoshi, Nr. 1354-14-8165) und Verbindung 12 als hydrophobe Iod-Verbindung, synthetisiert nach dem Verfahren von J. Med. Chem., 24 (1) 5 (1981), in den oben beschriebenen Verhältnissen, wurden in Methylenchlorid gelöst, das in einem auberginenförmigen Kolben enthalten war, um eine gleichmäßige Lösung zu bilden.
Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft, um eine dünne Membran auf dem Boden des Kolben zu bilden. Die dünne Membran wurde im Vakuum getrocknet, anschließend wurden 1,5 ml einer 0,9%igen physiologischen Kochsalzlösung (Hikari Pharmaceutical, Nr. 512) versetzt und mit Ultraschall behandelt (Sondentyp Oszillator, Branson, Nr. 3542, 0,1 mW) für 5 Minuten unter Eiskühlung, um eine gleichmäßige Liposomdispersion zu erhalten. Die Größe der in der erhaltenen Dispersion enthaltenen Teilchen wurde unter Verwendung eines WBC-Analysators (Nihon Kohden, A-1042) gemessen. Die Teilchengröße betrug 40 bis 65 nm. Tabelle 2

Liposom PC PS Verbindung 12

Präparation 1 50 nmol 50 nmol 40 nmol

Präparation 2 50 nmol 50 nmol 75 nmol

Präparation 3 50 nmol 50 nmol 150 nmol
Beispiel 5: Selektive Aufnahme von Liposompräparationen durch glatte Gefäßmuskelzellen
Die drei Arten von im Beispiel 4 hergestellten Liposomen wurden zu dem glatten Gefäßmuskelzell-Kultursystem von 1 oder 2 in Beispiel 1 nach den folgenden Protokollen (1), (2) und (3) gegeben. Anschließend wurde die Kultur fortgeführt.

(1) Eine Liposompräparation wurde am dritten Tag zu dem Kultursystem von 2 zugegeben, nicht mit den Schaummakrophagen versetzt, und die Kultur wurde für einen Tag fortgesetzt.
(2) Eine Liposompräparation wurde am fünften Tag zu dem Kultursystem von 1 zugegeben, mit den Schaummakrophargen versetzt, und die Kultur wurde für 1 Tag fortgeführt.
(3) Eine Liposompräparation wurde am siebenten Tag zu dem Kultursystem von 1 zugegeben, mit den Schaummakrophargen versetzt, und die Kultur wurde für 1 Tag fortgeführt.

Nachdem die Zugabe der Liposomen und die Nachkultur entsprechend jedem der Protokolle (1) bis (3) beendet war, wurde das Überstehende entfernt, und der Rückstand wurde dreimal mit Hank's Puffer gewaschen (Nissui Pharmaceutical, Code 05906, pH 7,2), mit einer 1,5% SDS-Lösung versetzt (Vako Pure Chemical Industries, 199-07141) und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um die Zellen aufzulösen. Die Menge an Verbindung 12, die in den Zellen aufgenommen wurden, wurde mittels HPLC gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 aufgeführt. Es wurden klare Unterschiede bei den Mengen der hydrophoben Iod-Verbindung, die in den glatten Gefäßmuskelzellen mittels der Liposome der vorliegenden Erfindung aufgenommen worden waren, beobachtet, bevor und nachdem das Wachstum unter dem Einfluß der Schaummakrophagen initiiert worden war.
Beispiel 6: Vergleichsbeispiel
Eine Ölpartikelsuspension der Verbindung 12 wurde nach dem Verfahren hergestellt, das in Pharm. Res. 6(12) 1011 (1989) beschreiben wurde. Die Suspension wurde dem Zellkultursystem unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 5 (Protokolle (1), (2) und (3) in einer solchen Menge zugegeben, das die Menge von Verbindung 12 die gleiche wurde wie die in Beispiel 5. Die Menge an Verbindung 12, die in die glatten Gefäßmuskelzellen aufgenommen wurde, wurde mittels HPLC gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 aufgeführt. Aus dem Vergleich der Ergebnisse, die in 3 und 4 aufgeführt sind, wird deutlich, dass durch Verwendung der Liposome der vorliegenden Erfindung das Iod enthaltende Kontrastmedium effizienter und selektiver in den glatten Gefäßmuskelzellen angereichert werden kann, die unter Einfluß von Schaummakrophagen anormal wachsen, im Vergleich mit der bekannten Ölteilchensuspension.
Beispiel 7: Herstellung von Liposomen
Gleichmäßige Liposomdispersionen wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 4 erhalten. Die Größen der Teilchen, die in der erhaltenen Dispersion enthalten waren, wurden mittels WBC-Analysator (Nihon Kohden A-1042) gemessen. Die Teilchengrößen betrugen 40 bis 65 nm. Tabelle 3

Liposom PC PS DCP Verbindung 1

Präparation 4 50 nmol 50 nmol 10 nmol 40 nmol

Präparation 5 50 nmol 50 nmol 10 nmol 75 nmol

Präparation 6 50 nmol 50 nmol 10 nmol 150 nmol
Beispiel 8: Selektive Aufnahme der Liposompräparation durch Makrophagen

Geschäumte peritoneale Mausmakrophagen wurden hergestellt nach der Verfahrensweise von Biochimica Biophysica Acta, 1213, 127–134 (1994). 200000 Zellen der Schaummakrophagen wurden separiert, suspendiert in 10% FBS Eagle's MEM (GIBCO, Nr. 11095-080), geimpft in jedes Loch einer 12-Loch-Mikroplatte (FALCON, Nr. 3503) und für 5 Tage bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Anschließend wurde jede der im Beispiel 4 erhaltenen Präparationen 1 bis 3 und im Beispiel 7 erhaltenen Präparationen 4 bis 6 in die Löcher gegeben, und die Kultur wurde für 1 Tag fortgeführt. Danach wurde das Überstehende entfernt, und der Rückstand wurde dreimal mit Hank's Puffer (Nissui Pharmaceutical, Code 05906, pH 7,2) gewaschen, mit 1,5 % SDS-Lösung (Vako Pure Chemical Industries 199-07141) versetzt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um die Zellen aufzulösen. Die intrazellular aufgenommenen Mengen von Verbindung 1 oder Verbindung 12 wurden mittels HPLC gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4: Aufnahme der Liosompräparation durch Makrophagen

	aufgenommene Menge Iod-Verbindung
Präparation 1 (Verbindung 12)	19
Präparation 2 (Verbindung 12)	21
Präparation 3 (Verbindung 12)	24
Präparation 4 (Verbindung 1)	35
Präparation 5 (Verbindung 1)	34
Präparation 6 (Verbindung 1)	38

Einheit: (nmol/μ g Protein) × 10^–3

Beispiel 9: Vergleichsbeispiel

Es wurden Ölteilchensuspensionen von Verbindung 1 oder Verbindung 12 nach der Methode hergestellt, die in Pharm. Res. 6, (12) 10011 (1989) beschrieben wurde. Jede der Suspensionen wurde dem Zellkultursystem unter den gleichen Bedingungen zugesetzt, wie sie in Beispiel 8 beschrieben wurden, und zwar in einer Menge, dass die Menge der Verbindung 1 oder der Verbindung 12 die gleiche war wie jede der im Beispiel 8 verwendeten. Die in den Makrophagen aufgenommenen Mengen von Verbindung 1 oder Verbindung 12 wurden mittels HPLC gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 aufgeführt. Aus dem Vergleich der Ergebnisse der 4 und 5 ist klar, dass durch Einsatz des Kontrastmediums mit dem Liposomen der vorliegenden Erfindung die Iod-Verbindungen effektiver und selektiver in den Makrophagen angereichert werden im Vergleich mit der bekannten Ölteilchensuspension. Tabelle 5

	aufgenommene Menge Iod-Verbindung
Zugegeben in gleicher Menge wie Präparation 1 (Verbindung 12)	1,5
Zugegeben in gleicher Menge wie Präparation 2 (Verbindung 12)	2,3
Zugegeben in gleicher Menge wie Präparation 3 (Verbindung 12)	1,9
Zugegeben in gleicher Menge wie Präparation 4 (Verbindung 1)	4,8
Zugegeben in gleicher Menge wie Präparation 5 (Verbindung 1)	5,3
Zugegeben in gleicher Menge wie Präparation 6 (Verbindung 1)	5,9

Einheit: (nmol/μg Protein) × 10^–3

Die Liposome der vorliegenden Erfindung können eine Anreicherung der hydrophoben Iod-Verbindungen, repräsentiert durch die allgemeine Formel (I), in glatten Gefäßmuskelzellen erreichen, die anormal unter dem Einfluss von Schaummakrophagen wachsen. Sie sind nützlich als Röntgenkontrastmedium für die Röntgenographie einer Läsion einer Gefäßerkrankung, hervorgerufen durch anormales Wachstum von glatten Gefäßmuskelzellen. Weiterhin kann das Kontrastmedium der vorliegenden Erfindung, das nach dem zweiten Aspekt bereitgestellt wird, eine Anreicherung von Iod-Verbindungen in Makrophagen erreichen und ist daher als Kontrastmedium für die Röntgenographie eines Gewebes oder einer Läsion nützlich, in der sich Makrophagen lokalisieren.

Claims

Liposom, das eine hydrophobe Iodverbindung, die durch die folgende allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird, als eine Membrankomponente enthält: R¹-CO₂-R² (I)worin R¹ eine substituierte oder unsubstituierte 2,3,5-Triiodphenylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte 3,4,5-Triiodphenylgruppe bezeichnet; und R² einen Rest eines Cholesterolderivats bezeichnet.
Liposom gemäß Anspruch 1, das eine Kombination von Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin als Membrankomponenten enthält.
Liposom gemäß Anspruch 1 oder 2, das einen Phosphorsäuredialkylester, der ein Diester eines Alkyls, das 6 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, ist, als eine Membrankomponente enthält.
Röntgenkontrastmedium, das ein Liposom gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
Röntgenkontrastmedium gemäß Anspruch 4, das für die Radiographie einer Gefäßerkrankung verwendet wird.
Röntgenkontrastmedium gemäß Anspruch 4, das für die Radiographie glatter Gefäßmuskelzellen verwendet wird, die unter dem Einfluß von Schaummakrophagen abnormal proliferiert sind.
Verwendung eines Liposoms gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Röntgenkontrastmediums für die Radiographie eines Gewebes oder einer Läsion, in dem/der sich Makrophagen lokalisieren.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Gewebe, in dem sich Makrophagen lokalisieren, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Geweben der Leber, Milz, Luftvesikel, Lymphknoten, Lymphgefäß und Nierenepithel.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei die Läsion, in der sich Makrophagen lokalisieren, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tumorort, Entzündungsort und Infektionsort.