DE60027730T2

DE60027730T2 - Verabreichung von taxanen an angiogene blutgefässe mittels kationischer liposomen

Info

Publication number: DE60027730T2
Application number: DE60027730T
Authority: DE
Inventors: M. Donald San Francisco MCDONALD; W. John Redwood City MCLEAN; Gavin O. San Francisco THURSTON
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2020-09-09
Also published as: EP1210065A1; CA2383412A1; US20100226970A1; JP4848113B2; EE200200127A; EP1210065A4; JP2003514768A; PL203128B1; MXPA02002579A; CA2383412C; KR100591767B1; DE60027730D1; CN1235567C; CN1378443A; ES2258471T3; ZA200201555B; IL148372A0; HUP0202669A3; BR0013866A; IL148372A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Verabreichung durch Liposomen und insbesondere die Verabreichung von Taxanen an Blutgefäße mittels kationischer Liposomen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann auf die Behandlung und Diagnose einer Vielfalt von unterschiedlichen Erkrankungen und Abnormalitäten angewendet werden. Obwohl die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist, kann sie bei der Behandlung von Krebs und einer Vielfalt von chronischen Entzündungserkrankungen angewendet werden. Im Allgemeinen werden diese Erkrankungen gegenwärtig jeweils direkt durch physikalische Mittel behandelt, wie beispielsweise durch chirurgische Entfernung von kanzerogenem Gewebe, Nähen von Wunden und chirurgische Entfernung entzündeter Gelenke. Außerdem können sie jeweils auf chemische Weise behandelt werden.
Chemotherapie wird bei Krebs eingesetzt und anti-inflammatorische Wirkstoffe werden angewendet, um chronische Entzündungszustände zu behandeln. Diese und verwandte Behandlungen sind im Allgemeinen auf die direkte Behandlung von kanzerogenem oder entzündetem Gewebe gerichtet. Um ein Verständnis dafür zu ermöglichen, inwiefern sich die vorliegende Erfindung von herkömmlichen Behandlungsmodalitäten unterscheidet, wird eine kurze allgemeine Beschreibung der Behandlungstechnologien auf diesen Gebieten bereitgestellt.
Krebsbehandlungen
Die Bezeichnung „Krebs" umfasst ein Spektrum von Erkrankungen, die sich in der Behandlung, Prognose und Heilbarkeit unterscheiden. Der Ansatz zur Diagnose und Behandlung hängt von der Tumorursprungsstelle, dem Ausmaß der Ausbreitung, den betroffenen Stellen, dem physiologischen Zustand des Patienten und der Prognose ab. Nach der Diagnose wird der Tumor üblicherweise „eingestuft", ein Vorgang der den Einsatz von Techniken der Chirurgie, der physikalischen Untersuchung, Histopathologie, Bildaufzeichnung und Laborbewertung einschließt, um das Ausmaß der Erkrankung zu bestimmen und die Population der Krebspatienten in Gruppen, in Reihenfolge der abnehmenden Heilungswahrscheinlichkeit, einzuteilen. Solche Systeme werden verwendet, um die Behandlung zu planen und um die Prognose für den Patienten zu erstellen (Stockdale (1996) „Principles of Cancer Patient Management", in: Scientific American Medicine, Band 3, Dale, D. C., und Federman, D. D. (Hrsg.), Scientific American Press, New York). Die Art oder das Stadium des Krebses kann dafür entscheidend sein, welche der drei allgemeinen Behandlungsarten verwendet wird: Chirurgie, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie. Ein aggressiver Behandlungsplan mit kombinierter Modalität kann ebenfalls gewählt werden. Zu diesem Zweck kann Chirurgie eingesetzt werden, um den primären Tumor zu entfernen, und die verbleibenden Zellen werden mittels Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie behandelt. Rosenberg (1985) New Engl. J. Med. 312: 1512–14.
Chirurgie spielt eine zentrale Rolle bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Im Allgemeinen ist ein chirurgischer Eingriff für die Biopsie erforderlich und Chirurgie kann für die meisten Krebspatienten auch die endgültige Behandlung darstellen. Chirurgie wird außerdem eingesetzt, um die Größe des Tumors zu verringern, um Metastasen herauszuschneiden, um medizinische Notfälle zu bewältigen, um Linderung und Wiederherstellung zu erreichen. Obwohl sich in der primären chirurgischen Technik zur Krebsbehandlung ein Anwendungsbereich entwickelt hat, bei dem Tumore unter direkter Visualisierung herausgeschnitten werden, ermöglichen die heutigen Techniken bei manchen Resektionen eine Durchführung auf endoskopischem Weg. Ein Hauptanliegen bei der Behandlung von Krebs ist die Berücksichtigung des Operationsrisikos (Stockdale, F., supra).
Bestrahlungstherapie spielt sowohl bei der primären als auch der palliativen (lindernden) Behandlung von Krebs eine wichtige Rolle. Sowohl Teletherapie (Megavolt-Bestrahlungstherapie) als auch Brachytherapie (interstitielle und intrakavitäre Bestrahlung) sind gängige Praxis. Die elektromagnetische Bestrahlung in Form von Röntgenstrahlen wird in der Teletherapie am häufigsten verwendet, um gemeine maligne Tumore zu behandeln, wobei Gammastrahlen, eine den Röntgenstrahlen ähnliche Form von elektromagnetischer Strahlung, die jedoch von radioaktiven Isotopen von Radium, Cobalt und anderen Elementen emittiert wird, ebenfalls eingesetzt werden. Durch die Bestrahlungstherapie wird Energie als einzelne Energiepakete, so genannte Photonen, zu dem Gewebe transportiert, wobei die Photonen sowohl malignes als auch normales Gewebe beschädigen, indem in den Zellen eine Ionisierung bewirkt wird. Das Ziel für die Ionen ist meistens die DNA; bei der Bestrahlungstherapie wird die Tatsache ausgenutzt, dass Strahlenschäden nicht gleichmäßig auf malignes und normales Gewebe verteilt sind – schnell teilende Zellen sind empfindlicher gegenüber einer Beschädigung der DNA als ruhende Zellen (Pass (1993) J. Natl. Cancer Inst. 85: 443–56). Bestrahlungstherapie ist mit einzigartigen Vorteilen aber auch wichtigen Toxizitäten verbunden. In bestimmten anatomischen Bereichen (z.B. dem Mediastinum) ist die Bestrahlungstherapie bevorzugt, wobei hier Bestrahlungstherapie das einzige mögliche lokale Behandlungsverfahren sein kann, und Bestrahlungstherapie auch dann die einzige mögliche lokale Behandlungsmodalität sein kann, wenn der vom Tumor betroffene Bereich ausgedehnt ist. Bestrahlungstherapie kann auch eingesetzt werden, wenn der Patient einen chirurgischen Eingriff als nicht akzeptabel empfindet oder wenn der medizinische Zustand des Patienten keinen chirurgischen Eingriff erlaubt. Bestrahlungstherapie bringt eine Schädigung des Gewebes mit sich, die zu frühen und späten Strahlungsschäden führen kann. Die Frühschäden (akute Toxizität der Bestrahlungstherapie) schließen Erythema der Haut, Desquamation, Ösophagitis, Nausea, Alopezie und Myelosuppression ein, während die Spätfolgen Gewebenekrose und Fibrose einschließen und üblicherweise die Grenztoxizität der Bestrahlungstherapie bestimmen (Stockdale, F., supra).
Nahezu alle chemotherapeutischen Mittel, die derzeit verwendet werden, beeinflussen die DNA-Synthese, die Bereitstellung von Vorläufern der DNA- und RNA-Synthese, oder die Mitose, und zielen somit auf proliferierende Zellen (Stockdale, F., „Cancer growth and chemotherapy", supra). Tumoruntersuchungen bei Tieren und klinische Versuche an Menschen haben gezeigt, dass Wirkstoffkombinationen zu höheren objektiven Antwortraten und zu einem längeren Überleben führen, als einzelne Mittel (Frei (1972) Cancer Res. 32: 2593–2607). Bei einer kombinierten Wirkstofftherapie werden die unterschiedlichen Wirkungsmechanismen und zytotoxischen Potentiale mehrerer Wirkstoffe, Antimetaboliten und Antibiotika ausgenutzt (Devita et al. (1975) Cancer 35: 98–110). Der physiologische Zustand des Patienten, die Wachstumsmerkmale des Tumors, die Heterogenität der Tumorzellpopulation und der Resistenzstatus des Tumors gegenüber mehreren Wirkstoffen beeinflussen die Wirksamkeit der Chemotherapie. Im Allgemeinen ist Chemotherapie nicht zielgerichtet (obwohl diese Techniken entwickelt werden, z.B. Pastan (1986) Cell 47: 641–648), und es können Nebenwirkungen wie Knochenmarkdepression, Gastroenteritis, Nausea, Alopezie, Leber- oder Lungenschäden oder Sterilität auftreten.
Chronische Entzündung
Natürliche, humorale und zelluläre Immunmechanismen wurden jeweils mit der Pathogenese chronischer Entzündungserkrankungen in Zusammenhang gebracht (Seymour, et al. (1979) J. Oral Pathol. 8: 249–65). Autoimmunerkrankungen sind auf Abweichungen in der Lymphozytenfunktion zurückzuführen. Abweichungen in der T-Zell-Funktion können für eine Erkrankung durch Zell-vermittelte Immunität verantwortlich sein, und die Wirkung von T-Helferzellen bei der Produktion von Antikörpern kann zu einer Bildung von Auto-Antikörpern führen. Die zentrale Rolle von T-Helferzellen bei Autoimmunerkrankungen wird dadurch unterstützt, dass viele dieser Erkrankungen mit bestimmten HLA-Molekülen im Zusammenhang stehen. Das Versagen eines oder mehrerer Schritte bei der Aufrechterhaltung der Toleranz könnte zu Autoimmunität führen (Robinson (1996) „Immunologic Tolerance and Autoimmunity", in: Scientific American Medicine, Band 2, Abschnitt VI, Scientific American Press, New York, S. 1–11).
Bei Autoimmunerkrankungen werden verschiedene Arten der Behandlung eingesetzt, die alle auf eine Verringerung der Immunantwort in dem betroffenen Gewebe abzielen. Beispielsweise können bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis, einer Autoimmunerkrankung, antientzündliche Mittel wie nichtsteroidale antientzündliche Mittel (NSAIDs) oder Glucocorticosteroide, Remission-hervorrufende Mittel wie Goldsalze und/oder immunosuppressive Wirkstoffe wie Cyclophosphamid eingesetzt werden. Orthopädische Chirurgie kann auch eingesetzt werden, um während des Entzündungsvorgangs beschädigte Gelenke zu ersetzen (siehe Gilliland, B. C., und Mannik, M., 1983, „Rheumatoid Arthritis" in: Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, S. 1977–1984). In einer aktuellen Arbeit wurden die Möglichkeiten neuer Behandlungen, die auch auf das betroffene Gewebe gerichtet sind, wie beispielsweise die Verwendung von TNFα bei der Behandlung rheumatoider Arthritis, vorgeschlagen (Brannan et al. (1995), Br. Med. Bull. 51: 368–384).
Allergie bezeichnet einen Zustand, bei dem eine Immunantwort auf Antigene der Umgebung zu einer Gewebeentzündung und Organfunktionsstörung führt. Ebenso wie bei Autoimmunerkrankungen deuten die Daten auch bei allergischen Erkrankungen auf eine Wechselwirkung verschiedener Komponenten des Immunsystems hin. Die Vielfältigkeit der Ausprägungen allergischer Erkrankungen ist auf unterschiedliche immunologische Effektor-Mechanismen zurückzuführen, die spezielle Gewebeverletzungsmuster hervorrufen (Beer et al. (1996) „Allergy", in: Scientific American Medicine, Band 2, Abschnitt VII, Scientific American Press, New York, S. 1–29). Die klinischen Merkmale jeder allergischen Erkrankung spiegeln die immunologisch vermittelte Entzündungsantwort in den betroffenen Organen oder Geweben wider (z.B. spiegelt Asthma eine Entzündungsantwort in den Atemwegen wider).
Verschiedene Behandlungsstrategien wurden eingesetzt, um immunvermittelte allergische Erkrankungen zu behandeln, die jeweils auf eine Verringerung der Immunantwort in dem entzündeten Gewebe gerichtet sind. Beispielsweise kann die Therapie zur Behandlung von Asthma eine Kontrolle der Umgebung, Pharmacotherapie und Allergen-Immunotherapie einschließen (Beer et al. (1996) „Allergy" in: Scientific American Medicine, Band 2, Abschnitt VII, Scientific American Press, New York, S. 1–29). Bei der Behandlung von Asthma ist die Eliminierung der ursächlichen Substanz der erfolgreichste Weg um der Entzündung vorzubeugen. Dies ist jedoch häufig nicht möglich und es sind verschiedene Klassen von Wirkstoffen eingesetzt worden. Diese beinhalten Methylxanthine (zur Bronchodilation), adrenerge Stimulantien (Stimulation α-adrenerger Rezeptoren, Bronchodilatoren), Glucocorticoide (Verringerung der Entzündung in der Lunge), Chromogene (Herunterregulierung von Mastzellen, Verringerung der Entzündung in der Lunge) und Anti-Cholinergica (Bronchodilatoren) (McFadden, et al., „Lung disease caused by immunologic and environmental injury", in: Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, S. 1512–1519). Desensibilisierung oder Immunotherapie mit Extrakten der mutmaßlichen Allergene wurde ebenfalls vorgeschlagen, um die Entzündung bei Asthma zu vermindern (McFadden und Austen, o. zit.; Jacquemin und Saint-Remy (1995) Ther. Immunol. 2: 41–52).
Atherosklerotische Plaques
Atherosklerose ist die progressive Verengung des Lumens (inneren Durchgangs) der arteriellen Blutgefäße durch Plaqueschichten (Fettgewebe und fibrinogenes Gewebe). Die vorrangigen Komplikationen der Atherosklerose, einschließlich ischämischer Herzerkrankung, myokardialem Infarkt, Schlaganfall und Gangrän der Akren, machen mehr als die Hälfte der jährlichen Todesfälle in den Vereinigten Staaten aus.
Arterien sind aus drei Schichten aufgebaut: aus der Intima, die Endothel und Bindegewebe der inneren elastischen Lamina umfasst; der Media, die glatte Muskelzellen und in den elastischen Arterien elastische Fasern und in großen Gefäßen die Vasa Vasorum umfasst; und aus der Adventitia, welche die äußere Schicht der Gefäßwand bildet und einen Bindegewebsmantel umfasst, der aus Fibroblasten, kleinen Gefäßen und Nerven aufgebaut ist. Atherosklerose kann in allen Arterien auftreten. In Koronararterien kann sie zu Herzinfarkt führen; in Großhirnarterien kann sie zu Schlaganfällen führen; und in peripheren Arterien kann sie zu Gangrän der Akren führen. Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang und es ist nicht bekannt, wie er genau beginnt und was ihn auslöst. Es wird jedoch angenommen, dass Endothelschädigung ein anfänglicher Schritt der Bildung von atherosklerotischen Läsionen ist, und durch hämodynamische Zerrung, Hypercholesterinämie, Hochdruck oder Immunkomplex-Erkrankung verursacht werden kann. Endothelschädigung führt zu einer Akkumulation von Cholesterin und Lipid, einer Verdickung der Intima, Proliferation der glatten Muskelzellen und Bildung von Bindegewebsfasern. Der Aufbau von Fettablagerungen und die Proliferation von glatten Muskelzellen führen allmählich zur Bildung von Plaques, die die Arterien möglicherweise verengen und blockieren.
Neovaskularisierung in der Intima humaner atherosklerotischer Läsionen wurde beschrieben, ihre Rolle bei der Progression der Atherosklerose ist jedoch unklar. Moulton, et al. (1999) Circulation 99: 1726–1732; Isner (1999) Circulation 99: 1653–1655; Depre, et al. (1996) Catheterization and Cardiovascular Diagnosis 39: 215–220.
Die Sterblichkeitsrate aufgrund von Atherosklerose und verwandten Pathologien macht deutlich, dass die gegenwärtigen Behandlungen unzulänglich sind. Der wichtigste Faktor bei der Verursachung von atherosklerotischen Ereignissen ist eine hohe Blutplasma-Cholesterinkonzentration in Form von Lipoproteinen mit geringer Dichte. Derzeitige Behandlungsmethoden schließen Wirkstoffe ein, die das Leberenzymsystem für die Cholesterinsynthese hemmen.
Gegenwärtige Behandlungen – Immunologie
Die oben beschriebenen Behandlungsformen haben zu unterschiedlichen Erfolgen geführt. Da die Erfolgsquote in vielen Fällen nicht annähernd perfekt ist, müssen in der Forschung weiterhin verbesserte Behandlungen entwickelt werden. Ein viel versprechendes Gebiet der Forschung betrifft die Beeinflussung des Immunsystems. Durch Verwendung von Genmanipulation und/oder chemischer Stimulierung ist es möglich, die Immunantworten zu modifizieren und/oder zu stimulieren, sodass das körpereigene Immunsystem die Erkrankung behandelt, z.B. dass Antikörper die Tumorzellen zerstören. Diese Art der Behandlung unterscheidet sich von den oben beschriebenen Behandlungen insofern, als ein biologischer Vorgang ausgenutzt wird, um die Erkrankung zu bekämpfen. Bei der Behandlung handelt es sich jedoch noch immer um eine direkte Behandlung, was bedeutet, dass die erzeugten Antikörper direkt die Tumorzellen angreifen.
Die vorliegende Erfindung kann für Behandlungen eingesetzt werden, die insofern eine radikale Abkehr von normalen Behandlungen darstellen, als die vorliegende Erfindung keine direkte Beeinflussung der krebsartigen, beschädigten oder entzündeten Zellen beinhaltet.
Es wurde, zumindest theoretisch, erkannt, dass es möglich ist, Krebs oder Entzündungen, die mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, über eine Hemmung der Angiogenese zu behandeln. Ein typisches Beispiel für die derzeitige Denkweise in diesem Zusammenhang wird in der PCT-Veröffentlichung WO 95/25543 diskutiert, die am 28. September 1995 veröffentlicht wurde. Diese veröffentlichte Anmeldung beschreibt die Hemmung der Angiogenese durch Verabreichung eines Antikörpers, der an ein Antigen bindet, von man annimmt, dass es auf der Oberfläche von angiogenen Endothelzellen vorhanden ist. Insbesondere beschreibt die Anmeldung die Verabreichung eines Antikörpers, der an α_vβ₃ bindet, wobei es sich bei α_vβ₃ μm einen Membranrezeptor handelt, von dem man annimmt, dass er Zell-Zell und Zell-extrazelluläre-Matrix Wechselwirkungen, die im Allgemeinen auch als Zelladhäsionsereignisse bekannt, vermittelt. Durch Blockierung dieses Rezeptors verspricht die Behandlung die Angiogenese zu hemmen und somit Krebs und Entzündungen zu behandeln.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Verfahren zur selektiven Verabreichung eines Taxans an angiogene Endothelzellen beschrieben. Das Verfahren umfasst die Injektion, vorzugsweise Injektion in die Blutbahn, noch weiter bevorzugt intraarterielle Injektion, von kationischen Liposomen, die kationische Lipide und ein Taxan, das die Angiogenese hemmt, umfassen. Nach der Verabreichung assoziieren die kationischen Liposomen selektiv mit angiogenen Endothelzellen, d.h. sie assoziieren in einem zwei- oder mehrfach größeren Verhältnis (bevorzugt zehnfach oder mehr) mit angiogenen Endothelzellen als mit korrespondierenden ruhenden endothelialen Zellen, die keine Angiogenese durchlaufen. Wenn die Liposomen mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, werden sie von der Endothelzelle aufgenommen und üben ihre gewünschte Wirkung aus. Das Taxan kann die Endothelzelle zerstören und die Blutgerinnung fördern.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, zur selektiven Einwirkung auf angiogene Endothelzellen, wodurch die Angiogenese gehemmt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Diagnose einer Angiogenesestelle durch die Verabreichung kationischer Liposomen, die ein Taxan und eine nachweisbare Markierung umfassen, wobei die Liposomen so konzipiert sind, dass sie selektiv mit angiogenen Endothelzellen assoziieren und nicht mit korrespondierenden Endothelzellen assoziieren, die keine Angiogenese durchlaufen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung kationischer Liposomen, wobei die Liposomen aus kationischen Lipiden und einem Taxan aufgebaut sind, die speziell für die Hemmung der Angiogenese vorgesehen und konzipiert sind, wobei das Taxan wasserlöslich oder in Wasser leicht dispergierbar oder Lipid-verträglich und in die Lipidschichten eingebaut sein kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung kationischer Zusammensetzungen, die kationische Lipide und ein Taxan umfassen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, um angiogene Endothelzellen mit einem Taxan, das mit einem kationischen Lipid assoziiert ist, anzusteuern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, zur selektiven Einwirkung auf angiogene Endothelzellen, in einer Art und Weise, die zur lokalen intravaskulären Blutgerinnung führt, durch die die Durchblutung in einem Blutgefäß behindert oder vollständig blockiert wird.
Ein weiterer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Analyse angiogener Endothelzellen durch Markierung von Zellen mit einer nachweisbaren Markierung, wobei dieses Verfahren es ermöglicht, die angiogenen Endothelzellen für eine anschließende Kultivierung und/oder Analyse von den benachbarten Zellen zu separieren.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Zerstörung eines ungewollten Tumors durch die Verabreichung eines Taxans an die angiogenen Endothelzellen des Tumors, wobei diese Verbindung die angiogenen Endothelzellen zerstört und anschließend die Tumorzellen zerstört.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verringerung der Bildung von atherosklerotischer Plaque in einem Blutgefäß durch Verabreichung eines kationischen Lipid-Komplexes, der eine Substanz enthält, die Angiogenese verringert, wodurch die Bildung von Plaque gehemmt wird.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen selektiv mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, mit einer viel höheren Affinität (zweifach oder mehr und bevorzugt zehnfach oder mehr) als sie mit korrespondierenden Endothelzellen, die nicht an der Angiogense beteiligt sind, assoziieren.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen verwendet werden können, um kleine Mengen eines Taxans zielgerichtet an Endothelzellen zu verabreichen, wobei die Zellen in einer Art und Weise beeinflusst werden (z.B. getötet werden), dass das Blutgefäß zerstört wird oder in seiner Funktion ausgeschaltet wird, wie zum Beispiel durch Blutgerinnung, und somit die Zufuhr an Nährstoffen zu dem benachbarten Gewebe (z.B. Tumorzellen) abgeschnitten wird und dadurch das Gewebe zerstört wird (z.B. Zerstörung eines soliden Tumors).
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen verwendet werden können, um Angiogenese, die mit malignen oder gutartigen Tumoren im Zusammenhang steht, zu hemmen.
Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist, dass verschiedene Klassen von Erkrankungen und/oder Abnormalitäten behandelt werden können, ohne direkt das mit der Abnormalität verbundene Gewebe zu behandeln, z.B. wird durch eine Hemmung der Angiogenese die Blutzufuhr zu einem Tumor abgeschnitten und der Tumor wird getötet, ohne dass die Tumorzelle in irgendeiner Weise direkt behandelt wird.
Diese und andere Gegenstände, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden einem Fachmann durch Lesen der folgenden Offenbarung in Verbindung mit den beigefügten Figuren ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme, die die Aufnahme von rot fluoreszierenden CM-Dil-markierten DDAB:Cholesterin-DNA-Komplexen in angiogenen Blutgefäßen eines Follikels in einem normalen Mäuseeierstock zeigt (Skalaleiste: 60 μm);
2 ist eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme, die die Aufnahmen von rot fluoreszierenden CM-Dil-markierten DDAB:Cholesterin-DNA-Komplexen in angiogenen Blutgefäßen in einer Sektion eines Pankreastumors in einer RIP1-Tag 5-Maus zeigt – die Gefäße sind grün gefärbt mit einem fluoreszierenden Lectin (Skalaleiste: 40 μm).
3 ist eine mikroskopische Fluoreszenzaufnahme mit geringer Vergrößerung, die eine geringe bzw. keine Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexen (gelb-orange) in Blutgefäßen einer normalen Maus-Pankreasinsel zeigt (Skalaleiste: 150 μm;
4 zeigt eine mikroskopischen Fluoreszenzaufnahme mit geringer Vergrößerung, die die Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexen (gelb-orange) in Blutgefäßen eines Pankreastumors in einer RIP1-Tag 2-Maus zeigt (Skalaleiste: 150 μm);
5 zeigt eine konfokale mikroskopische Aufnahme, die eine geringe bzw. keine Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einer normalen Pankreasinsel zeigt, die Gefäße wurden angefärbt (grün) mit fluoreszierendem Lectin (Skalaleiste 50 μm);
6 zeigt eine konfokale mikroskopische Aufnahme der Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einem Pankreastumor einer RIP1-Tag 2-Maus. Die Gefäße wurden mittels Perfusion eines fluoreszierenden Lycopersicon esculentum Lectins (grün) angefärbt, nachdem die Liposomen intravenös injiziert wurden (Skalaleiste: 50 μm);
7 zeigt eine konfokale mikroskopische Aufnahme der Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in einem Pankreastumor einer RIP1-Tag 2-Maus. Die Gefäße wurden mittels Perfusion eines fluoreszierenden Lycopersicon esculentum Lectins (grün) gefärbt, nachdem die Liposomen intravenös injiziert wurden (Skalaleiste: 50 μm);
8 zeigt eine konfokale mikroskopische Aufnahme einer Aufnahme von Texas rot-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-organge) in einem pankreatischen Tumor einer RIP1-Tag 2-Maus. Die Gefäße wurden mittels Perfusion eines fluoreszierenden Lycopersicon esculentum Lectins (grün) angefärbt, nachdem die Liposomen intravenös injiziert wurden. Mögliche Stellen eines Gefäßwachstums zeigen eine starke Aufnahme (Skalaleiste: 50 μm);
9 zeigt eine konfokale mikroskopische Aufnahme einer geringen Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in normalen Blutgefäßen in der Luftröhre einer pathogenfreien Maus. Die Gefäße sind grün angefärbt mit einem fluoreszierenden Lectin (Skalaleiste: 50 μm);
10 zeigt eine konfokale mikroskopische Aufnahme der Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen (rot-orange) in angiogenen Blutgefäßen in der Luftröhre einer Maus mit Mycoplasma pulmonis Infektion (Skalaleiste: 50 μm);
11 zeigt ein Diagramm, das die Aufnahmemenge von Texas Red-DOTAP:Cholesterin-Liposomen durch Blutgefäße einer pathogenfreien (normalen) und einer Mycoplasma pulmonis infizierten Mäuseluftröhre zeigt, die durch Messung der Intensität der Liposomenfluoreszenz 4 Stunden nach intravenöser Injektion gemessen wurde. Die Messungen wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 410 Mikroskop durchgeführt. Die infizierten Mäuse wurden intranasal mit M. pulmonis Organismen beimpft und nach 4 Wochen untersucht. Das Sternchen bedeutet einen statistisch signifikanten Unterschied (P < 0,05, mittel ''. SE, n = 4 Mäuse pro Gruppe);
12 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahme, die die Assoziierung der DOTAP:Cholesterin-Liposomen mit einer Endothelzelle in der Luftröhre einer M. pulmonis infizierten Maus zeigt (Skalaleiste: 50 μm);
13 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahme, die die Aufnahme von DOTAP:Cholesterin-Liposomen durch eine Endothelzelle in der Luftröhre einer M. pulmonis infizierten Maus zeigt (Skalaleiste: 80 μm);
14 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahme, der Assoziierung von kationischen Paclitaxel-Liposomen mit der Endothelzellauskleidung der Luftröhre einer pathogenfreien Maus (Tafel A) und der Luftröhre einer Maus, die mit M. pulmonis infiziert ist (Tafel B).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Bevor das vorliegende Verfahren der selektiven Beeinflussung/Markierung von angiogenen Endothelzellen und Liposomen, die in dem Verfahren verwendet werden, beschrieben wird, sollte angemerkt werden, dass diese Erfindung nicht auf die bestimmten beschriebenen Liposomen, Verfahren oder Taxane als aktive Substanzen beschränkt ist, da diese selbstverständlich variieren können. Es sollte außerdem angemerkt werden, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht beschränkend sein soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung ausschließlich durch die beigefügten Ansprüche begrenzt wird.
Es ist anzumerken, dass die in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendeten Singularformen „ein", „und" und „der", „die", „das", auch die entsprechenden Pluralformen umfassen, sofern sich aus dem Zusammenhang nicht deutlich etwas anderes ergibt. So umfasst die Bezugnahme auf „ein Liposom" beispielsweise Mischungen und eine große Anzahl solcher Liposomen, die Bezugnahme auf „ein Taxan" umfasst eine große Anzahl von Taxanen und deren Mischungen und die Bezugnahme auf „das Verfahren" umfasst ein oder mehrere Verfahren oder Schritte, die hierin beschrieben sind.
Die hierin diskutierten Veröffentlichungen sind ausschließlich aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Anmeldetag der vorliegenden Erfindung angegeben. Es soll jedoch nichts hierin so gedeutet werden, dass die vorliegende Erfindung nicht dazu berechtigt ist, aufgrund ihres früheren Erfindungszeitpunkts diesen Publikationen vorauszugehen.
Sofern nicht anders definiert haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie allgemein von einem Fachmann im Bereich dieser Erfindung verstanden werden. Obwohl alle Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig zu denjenigen sind, die hierin beschrieben sind, zur Durchführung oder Überprüfung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden hierin bevorzugte Verfahren und Materialien beschrieben. Alle hierin zitierten Veröffentlichungen sind hierin als Referenz inbegriffen, um spezielle Gegenstände der Erfindung, zu denen die jeweilige Veröffentlichung zitiert ist, zu offenbaren und zu beschreiben.
Definitionen
Die Begriffe „Behandlung", „Behandeln" und „behandeln" und dergleichen werden hierin mit der Bedeutung verwendet, dass eine gewünschte pharmakologische und/oder physiologische Wirkung erhalten wird. Die Wirkung kann prophylaktisch, im Sinne einer vollständigen oder teilweisen Vorbeugung einer Krankheit oder eines ihrer Symptome, und/oder kann therapeutisch, im Sinne einer teilweisen oder vollständigen Stabilisierung oder Heilung einer Krankheit und/oder nachteiliger Wirkungen, die mit der Krankheit zusammen hängen, sein. Wie hierin verwendet schließt „Behandlung" jede Behandlung einer Krankheit bei einem Säuger, insbesondere einem Menschen, ein und umfasst:

(a) Vorbeugen der Krankheit oder des Symptoms vor dem Auftreten bei einem Lebewesen, das für diese Krankheit oder dieses Symptom prädisponiert sein kann, bei dem diese Krankheit oder dieses Symptom aber bisher noch nicht diagnostiziert wurde,
(b) Hemmen des Krankheitssymptoms, d.h. Hemmen seiner Entwicklung, oder
(c) Lindern des Krankheitssymptoms, d.h. Bewirken des Rückgangs der Krankheit oder des Symptoms.

Wie hierin verwendet bezieht sich „pharmazeutisch verträgliches Salz" auf ein Salz, das die gewünschte biologische Aktivität der Stammverbindung beibehält und keinerlei unerwünschte toxikologischen Wirkungen hervorruft. Beispiele solcher Salze beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: (a) Säureadditions-Salze, die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und dergleichen gebildet werden, und Salze, die mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Citronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Pamoinsäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalenschwefelsäure, Naphthalendischwefelsäure, Polygalacturonsäure gebildet werden, (b) Salze mit polyvalenten Metallkationen, wie zum Beispiel Zink, Kalzium, Bismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium und dergleichen und (c) Salze, die mit einem organischen Kation gebildet werden, das aus N,N'-Dibenzylethylendiamin oder Ethylendiamin gebildet wird und (d) Kombinationen aus (a) und (b) oder (c), wie z.B. ein Zinktannatsalz und dergleichen.
Der Begriff „Angiogenese" bezieht sich auf einen Vorgang der Gewebevaskularisierung, der die Entwicklung neuer Blutgefäße einschließt. Angiogenese erfolgt über einen von drei Mechanismen: (1) Neovaskularisierung, bei der Endothelzellen aus zuvor vorhandenen Blutgefäßen wandern und beginnen, neue Blutgefäße zu bilden, (2) Vaskulogenese, bei der die Blutgefäße aus Vorläuferzellen neu entstehen oder (3) vaskuläre Expansion, bei der sich vorhandene kleine Blutgefäße in ihrem Durchmesser vergrößern, um größere Blutgefäße zu bilden (Blood et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta. 1032: 89–118).
Angiogenese ist ein wichtiger Vorgang in normalen neonatalen Wachstumsvorgängen und im weiblichen Reproduktionssystem während des Gelbkörper-Wachstumszyklus (siehe Moses et al. (1990) Science 248: 1408–10). Unter normalen Bedingungen sind alle Prozesse, die die Neubildung oder Umbildung vorhandener oder neuer Blutgefässe einschließen, selbstlimitierende Vorgänge, und die Expansion spezifischer Zelltypen ist reguliert und aufeinander abgestimmt.
Angiogenese ist auch an der Wundheilung und an der Pathogenese einer großen Anzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich Gewebeentzündung, Arthritis, Asthma, Tumorwachstum, diabetische Retinopathie und anderen Zuständen beteiligt. Klinische Erscheinungsformen, die mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, werden als angiogene Erkrankungen bezeichnet (Folkman et al. (1987) Science 235: 442–7).
Viele Experimente haben vermuten lassen, dass Gewebe angiogene Faktoren produzieren können, die die Angiogenese unter den Bedingungen einer geringen Blutzufuhr, sowohl unter normalen, als auch unter pathologischen Bedingungen, fördern. Diese Faktoren und Verbindungen unterscheiden sich in der Zellspezifität und im Mechanismus, durch den sie das Wachstum neuer Blutzellen hervorrufen. Diese Faktoren wirken über eine Vielzahl von Mechanismen. Beispielsweise können sie die Wanderung und Proliferation von Endothelzellen hervorrufen oder die Produktion von Kollagenase stimulieren (siehe Klagsbrun et al. (1991) Ann. Rev. Physiol. 53: 217–39). Es gibt mehrere Bioassays, die die direkte Bestimmung angiogener Aktivitäten erlauben (Wilting et al. (1991) Anat. Embrol. (Berl) 183: 259–71).
Es wurde vorgeschlagen, dass angiogene Inhibitoren bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich sein könnten. Zum Beispiel kann das Eingreifen in die Angiogenese das Tumorwachstum einschränken. Verschiedene Mittel zur Hemmung der Angiogenese wurden vorgeschlagen, einschließlich: (1) Hemmung der Ausschüttung angiogener Faktoren, (2) Neutralisierung angiogener Faktoren durch die Verwendung von Mitteln wie monoklonalen Antikörpern und (3) Hemmung endothelialer Zellantworten (Folkman et al. (1992) Seminars in Cancer Biology 3: 89–96), durch die Verwendung von anti-angiogenen Faktoren, also von Molekülen, die bekanntermaßen Angiogenese hemmen. Verschiedene solcher Endothelzell-Inhibitoren wurden beschrieben, wie zum Beispiel unter anderem Kollagenase-Inhibitor, Basalmembranumsatz-Inhibitoren, angiostatische Steroide, Inhibitoren aus Pilzen, Plättchen Faktor 4, Thrombospondin, Arthritisarzneimittel, wie zum Beispiel Penicillamin, und Alpha-Interferon (siehe Folkman et al. (1992) Seminars in Cancer Biology 3: 89–96, für Beispiele siehe Stepien et al. (1996) J. Endocrinol. 150: 99–106, Maione et al. (1990) Science 247: 77–9).
Der Begriff „Endothelzellen" bezeichnet solche Zellen, die das Endothel bilden, Monoschichten einfacher Squamosazellen, welche die innere Oberfläche des Blutkreislaufsystems auskleiden. Diese Zellen behalten die Fähigkeit zur Zellteilung bei, obwohl sie unter normalen Bedingungen sehr langsam proliferieren, und vielleicht nur einmal im Jahr eine Zellteilung durchlaufen. Die Proliferation von Endothelzellen kann durch die Verwendung von [³H]Thymidin zur Markierung der Zellen in der S-Phase gezeigt werden. In normalen Gefäßen ist der Anteil der Endothelzellen, die markiert werden, an Verzweigungspunkten in Arterien besonders hoch, wo die Turbulenz und die Abnutzung die Zellerneuerung anzuregen scheinen (Goss, (1978) The Physiology of Growth, Academic Press, New York, Seiten 120–137). Normale Endothelzellen sind ruhend, d.h. sie teilen sich nicht und sind daher von angiogenen Endothelzellen unterscheidbar, wie weiter unten diskutiert wird.
Endothelzellen besitzen auch die Fähigkeit zu wandern, ein Vorgang, der bei der Angiogenese wichtig ist. Endothelzellen bilden dann neue Kapillaren in vivo, wenn sie benötigt werden, wie zum Beispiel während der Wundheilung, oder wenn eine erkennbare Notwendigkeit für sie besteht, wie zum Beispiel bei der Tumorbildung. Die Bildung neuer Blutgefäße wird als Angiogenese bezeichnet und beteiligt Moleküle (angiogene Faktoren), die mitogen oder chemo-anziehend für Endothelzellen sein können (Klagsbrun, supra). Während der Angiogenese können Endothelzellen aus einem vorhandenen Kapillargefäß heraus wandern, um die Bildung eines neuen Blutgefäßes zu beginnen, d.h. die Zellen aus einem Gefäß wandern so, dass die Extension dieses Blutgefäßes ermöglicht wird (Speidel, Am J. Anat. 52: 1–79). In vitro-Studien haben sowohl die Proliferation, als auch die Migration von Endothelzellen dokumentiert. Endothelzellen, die in Kultur gehalten werden, können proliferieren und spontan kapillare Röhren bilden (Folkman et al. (1980) Nature 288: 551–56).
Die Begriffe „angiogene Endothelzellen" und „Endothelzellen, die Angiogenese durchlaufen" und dergleichen werden hierin austauschbar verwendet und bezeichnen Endothelzellen (wie oben definiert), die Angiogenese durchlaufen (wie oben definiert). Angiogene Endothelzellen sind daher solche Endothelzellen, die mit einer Geschwindigkeit proliferieren, die weit oberhalb normaler Bedingungen einer Zellteilung von etwa einmal pro Jahr liegt. Der Unterschied zu einer normalen Proliferation von Endothelzellen kann das 2-, 5- oder 10-fache oder mehr einer normalen Proliferation betragen und kann stark variieren, abhängig von Faktoren wie zum Beispiel dem Alter und Zustand des Patienten, der Art des beteiligten Tumors, der Art der Wunde etc. Wenn der Unterschied in dem Ausmaß der Proliferation normaler Endothelzellen und angiogener Endothelzellen messbar ist und als biologisch signifikant angesehen wird, dann sind die beiden Zelltypen durch die vorliegende Erfindung unterscheidbar, d.h. angiogene Endothelzellen sind von korrespondierenden normalen, ruhenden Endothelzellen durch die bevorzugte Bindung kationischer Liposomen unterscheidbar.
Der Begriff „korrespondierende Endothelzellen" „normale oder ruhende Endothelzellen" und dergleichen wird so verwendet, dass er sich auf normale, ruhende Endothelzellen innerhalb desselben Gewebetyps (unter normalen Bedingungen), wenn einige der Endothelzellen Angiogenese durchlaufen und einige der Endothelzellen ruhend sind, bezieht. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt angiogene Endothelzellen angesteuert, und sie werden mit einer Präferenz, die fünffach, bevorzugt zehnfach größer ist als bei korrespondierenden ruhenden Endothelzellen, angesteuert.
Der Begriff „Lipid" wird in seiner herkömmlichen Bedeutung als generischer Ausdruck verwendet, der Fette, Lipide und die Alkohol-Ether löslichen Bestandteile des Protoplasmas, das in Wasser unlöslich ist, umfasst. Lipide bilden Fette, fettige Öle, essentielle Öle, Wachse, Steroide, Sterole, Phospholipide, Glycolipide, Sulfolipide, Aminolipide, Chromolipide (Lipochrome) und Fettsäuren. Der Begriff umfasst sowohl natürlich auftretende, als auch synthetisch hergestellte Lipide. Bevorzugte Lipide im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind: Cholesterin, Phospholipide, einschließlich Phosphatidylcholine und Phosphatidylethanolamine, und Sphingomyeline. Sofern es sich um Fettsäuren handelt, können diese 12–24 Kohlenstoffatome lang sein, bis zu 6 ungesättigte Stellen (Doppelbindungen) enthalten und mit dem Rückgrat entweder über Acyl- oder Etherbindungen verbunden sein. Sofern mehr als eine Fettsäure mit dem Rückgrat verknüpft ist, können die Fettsäuren unterschiedlich (asymmetrisch) sein oder es kann auch nur eine Fettsäurekette vorhanden sein, z.B. Lysolecithine. Gemischte Formulierungen sind ebenfalls möglich, besonders wenn die nicht-kationischen Lipide aus natürlichen Quellen stammen, wie zum Beispiel Lecithine (Phosphatidylcholine), die aus Eigelb, Schweineherz, Hirn, Leber oder Sojabohnen gereinigt wurden. Von Interesse sind auch Steroide und Sterole, besonders Cholesterin, und Sterole, die an der 3β-Position substituiert sind.
Der Begriff „kationisches Lipid" wird hierin so verwendet, dass jedes Lipid der Erfindung (wie oben definiert), das kationisch ist, umfasst wird. Das Lipid wird als kationisch bezeichnet, wenn das Lipid (bei physiologischem pH-Wert) eine positive Ladung trägt, die durch die zum Zeitpunkt der Messung verwendeten Instrumente messbar ist. Wenn an dem kationischen Lipid Fettsäuren vorhanden sind, so können sie 12–24 Kohlenstoffatome lang sein, bis zu 6 ungesättigte Stellen (Doppelbindungen) enthalten und mit dem Rückgrat entweder über Acyl- oder Etherbindungen verknüpft sein. Es kann auch nur eine Fettsäurekette mit dem Rückgrat verbunden sein. Wo mehr als eine Fettsäure mit dem Rückgrat verbunden ist, können die Fettsäuren unterschiedlich (asymmetrisch) sein. Gemischte Formulierungen sind ebenfalls möglich.
Der Begriff „Liposom" umfasst jedes Kompartiment, das durch eine Lipid-Doppelschicht umschlossen ist. Liposomen werden auch als Lipid-Vesikel bezeichnet. Um ein Liposom zu bilden, umfassen die Lipidmoleküle elongierte, nicht-polare (hydrophobe) Anteile und polare (hydrophile) Anteile. Die hydrophoben und hydrophilen Anteile des Moleküls befinden sich bevorzugt an zwei Enden einer elongierten Molekülstruktur. Wenn solche Lipide in Wasser dispergiert werden, so bilden sie spontan doppelschichtige Membranen, die als Lamellen bezeichnet werden. Die Lamellen sind aus zwei einzelschichtigen Lagen von Lipidmolekülen zusammengesetzt, die sich mit ihren nicht-polaren (hydrophoben) Oberflächen gegenüber stehen und mit ihren polaren (hydrophilen) Oberflächen zum wässrigen Medium weisen. Die Membranen, die durch die Lipide gebildet werden, umschließen einen Teil der wässrigen Phase, und zwar auf eine ähnliche Weise wie eine Zellmembran, die die Inhalte einer Zelle umschließt. Das heißt, die Doppelschicht eines Liposoms hat Ähnlichkeiten mit einer Zellmembran, ohne die Proteinkomponenten, die in einer Zellmembran vorhanden sind. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff Liposom so verwendet, dass multilamellare Liposomen mit umfasst sind, die allgemein einen Durchmesser im Bereich von 1 bis 10 Mikrometern aufweisen und aus zwischen zwei und hundert konzentrischen Lipid-Doppelschichten, die sich mit Schichten einer wässrigen Phase abwechseln, zusammengesetzt sind. Ebenfalls umfasst sind unilamellare Vesikel, die aus nur einer einzelnen Lipidschicht bestehen und allgemein einen Durchmesser im Bereich von etwa 20 bis etwa 400 Nanometern (nm), etwa 50 bis etwa 300 nm, etwa 300 bis etwa 400 nm, etwa 100 bis etwa 200 nm aufweisen, wobei die Vesikel hergestellt werden können, indem multilamellare Liposomen mit Ultraschall behandelt werden oder unter Druck durch Membranen mit Poren einer definierten Größe extrudiert werden oder einer Hochdruckhomogenisierung unterzogen werden.
Bevorzugte Liposomen, die Taxane umfassen, können unilamellare Vesikel sein, die eine einzelne Lipid-Doppelschicht aufweisen und einen Durchmesser im Bereich von 25–400 nm aufweisen. Ebenfalls bevorzugt sind multilamellare Vesikel, die ein Taxan umfassen, und einen Durchmesser im Bereich von etwa 25 bis etwa 400 nm aufweisen.
Kationische Liposomen können funktionell so definiert werden, dass sie ein Zeta-Potenzial von größer als 0 mV besitzen.
Der Begriff „kationisches Liposom" soll, wie hierin verwendet, jedes Liposom, wie oben definiert, umfassen, das kationisch ist. Das Liposom wird als kationisch bezeichnet, wenn es bei physiologischem pH-Wert vorliegt. Es sollte angemerkt werden, dass das Liposom selbst die Einheit ist, die als kationisch bezeichnet wird, was bedeutet, dass das Liposom, das bei seinem physiologischem pH-Wert eine messbare positive Ladung besitzt, in einem in vivo-Umfeld an andere Substanzen gebunden werden kann. Diese anderen Substanzen können negativ geladen sein und führen daher zu der Bildung einer Struktur, die keine positive Ladung hat. Die Ladung und/oder Struktur eines Liposoms der vorliegenden Erfindung, das in einem in vivo-Umfeld vorliegt, wurde nicht präzise bestimmt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein erfindungsgemäßes kationisches Liposom jedoch unter Verwendung wenigstens einiger Lipide, die selbst kationisch sind, gebildet. Das Liposom muss nicht vollständig aus kationischen Lipiden bestehen, es muss aber eine ausreichende Menge kationischer Lipide umfassen, so dass es dann, wenn das Liposom gebildet wird und in ein in vivo-Umfeld mit physiologischem pH-Wert eingebracht wird, anfangs eine positive Ladung aufweist.
Der Begriff „assoziiert mit" bezieht sich auf die Aktivität kationischer Liposomen der Erfindung, die für eine ausreichend lange Zeit ausreichend nahe an angiogenen Endothelzellen verweilen, so dass das Liposom und/oder sein Inhalt in die Endothelzelle gelangt. Die erfindungsgemäßen Liposomen können unter einer Vielzahl von Umständen mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, am meisten bevorzugt assoziieren sie aber mit angiogenen Endothelzellen unter in vivo-Bedingungen. Das Liposom kann daher durch die Anhaftung, Bindung oder Assoziation anderer Moleküle oder Materialien, die in der Blutbahn vorhanden sind, modifiziert werden, bevor es mit der angiogenen Endothelzelle assoziiert. Eine Vielzahl von Kräften kann für die Assoziation von Liposomen mit angiogenen Endothelzellen verantwortlich sein, wie z.B. unspezifische Wechselwirkungen, die zwischen zwei Molekülen auftreten, die nicht miteinander in Verbindung stehen, d.h. andere Makromoleküle, wie zum Beispiel menschliches Serumalbumin und menschliches Transferrin. Diese intermolekularen Kräfte können in vier allgemeine Bereiche eingeteilt werden, nämlich (1) Elektrostatik, (2) Wasserstoffbindung, (3) Hydrophobizität und (4) Van der Waals-Kräfte. Elektrostatische Kräfte entstehen durch die Anziehung gegensätzlich geladener ionischer Gruppen, wie z.B. zwischen entgegengesetzt geladenen Gruppen auf einem kationischen Liposom und Gruppen, die auf oder in der angiogenen Endothelzelle vorliegen. Die Anziehungskraft (F) ist invers proportional zum Quadrat des Abstands (d) zwischen den Ladungen. Wasserstoffbindungskräfte werden durch die Bildung reversibler Wasserstoffbrücken zwischen hydrophilen Gruppen erzeugt. Die erfindungsgemäßen Liposomen können hydrophile Gruppen, wie zum Beispiel -COOH enthalten und ähnliche Gruppen, wie zum Beispiel die Gruppen -OH, -NH₂, können an der Oberfläche von Endothelzellen vorhanden sein. Diese Kräfte sind weitgehend von der engen Positionierung zweier Moleküle, die diese Gruppen tragen, abhängig. Hydrophobe Kräfte wirken auf dieselbe Weise, wie Öltröpfchen in Wasser unter Bildung eines einzelnen, großen Tropfens verschmelzen. Entsprechend neigen unpolare hydrophobe Gruppen, wie sie auf den erfindungsgemäßen Liposomen vorliegen, in wässrigem Medium dazu, zu assoziieren und sie können dazu neigen, mit hydrophoben Gruppen, die auf der Oberfläche von Endothelzellen vorhanden sind, zu assoziieren. Van der Waals-Kräfte schließlich entstehen zwischen Molekülen und sie sind von den Wechselwirkungen zwischen den äußeren Elektronenwolken abhängig.
Die Begriffe „selektiv assoziieren" und „selektive Ziele" und dergleichen werden hierin verwendet, um eine Eigenschaft der erfindungsgemäßen kationischen Liposomen zu beschreiben, durch die die kationischen Liposomen in einem höheren Ausmaß mit angiogenen Endothelzellen assoziieren, als kationische Liposomen mit korrespondierenden normalen Endothelzellen assoziieren, die nicht an der Angiogenese beteiligt sind. In Verbindung mit der Erfindung bedeutet selektive oder bevorzugte Assoziation, dass das Liposom zu einem fünffachen oder höheren Maß mit den Endothelzellen, die Angiogenese durchlaufen, assoziiert, im Vergleich zu den korrespondierenden normalen Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen. Weiter bevorzugt weist die bevorzugte oder selektive Assoziation eine zehnfache oder größere Selektivität zwischen angiogenen Endothelzellen und korrespondierenden normalen Endothelzellen auf.
Der Begriff „Krebs" bezieht sich auf eine Krankheit mit unangemessener Zellproliferation. Diese Störung wird klinisch am meisten augenscheinlich, wenn das Tumorgewebeknäuel die Funktion lebensnotwendiger Organe beeinflusst. Konzepte, die normales Gewebewachstum beschreiben, sind auf malignes Gewebe anwendbar, weil normales und malignes Gewebe ähnliche Wachstumscharakteristika teilen können, sowohl auf der Ebene einer einzelnen Zelle, als auch auf der Ebene des Gewebes. Krebs ist ebenso eine Erkrankung einer ungeordneten Regulierung des Gewebewachstums, wie auch einer ungeordneten Regulierung des Zellwachstums. Die Verdopplungszeit bezieht sich auf die Zeit, die benötigt wird, damit sich ein Gewebe oder ein Tumor in seiner Größe oder Zellzahl verdoppelt. Die Verdopplungszeit eines klinisch sichtbaren Tumors ist üblicherweise beträchtlich länger als ein Zellzyklus der Zellen, aus denen sich der Tumor zusammensetzt. Im Gegensatz zu einem Tumor haben normale Leber, Herz oder Lungen bei einem Erwachsenen keine Verdopplungsrate, da die Organe sich in einem Gleichgewichtszustand befinden, in welchem die Geschwindigkeiten von Zellproduktion und Zelltod gleich sind (Stockdale (1996) „Cancer growth and chemotherapy", in: Scientific American Medicine, Band 3, Scientific American Press, New York, Seiten 12–18). Die Wachstumscharakteristika von Tumoren sind derart, dass die Produktion neuer Zellen den Zelltod übersteigt. Ein neoplastisches Ereignis führt dazu, dass der Anteil der Stammzellen, die eine Selbsterneuerung durchlaufen, zunimmt, und der Anteil der Stammzellen, die zu einer Reifung fortschreiten abnimmt (McCulloch et al. (1982) Blood 59: 601–608). Für jede Tumorpopulation besteht eine Verdopplungszeit und eine spezifische Wachstumskurve kann festgelegt werden (Stockdale, supra). Das Wachstumsmuster in Tumoren kann durch eine Gomperzianische Kurve beschrieben werden (Steel (1977) Growth kinetics of tumors, Oxford University Press, Inc., New York, Seite 40), die anzeigt, dass die Wachstumsgeschwindigkeit während der Entwicklung eines Tumors anfangs sehr schnell ist und dann progressiv mit zunehmender Größe abnimmt.
Allgemeine Aspekte der Erfindung
Die beigefügten Figuren ermöglichen eine deutliche visuelle Darstellung der hohen Selektivität, mit der die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen angiogene Endothelzellen ansteuern. Eine grundlegende Ausführungsform der Erfindung schließt ein Verfahren zur selektiven Beeinflussung von Endothelzellen ein, bei dem eine Formulierung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und kationische Liposomen, die ein Taxan enthalten, umfasst, verabreicht wird (bevorzugt durch intravaskuläre Injektion, weiter bevorzugt durch intraarterielle Injektion). Die kationischen Liposomen in der injizierten Formulierung können dann (durch Endozytose) in die angiogenen Endothelzellen, welche die Wände der angiogenen Blutgefäße auskleiden, eintreten. Die kationischen Liposomen assoziieren mit den angiogenen Endothelzellen ausreichend lange und in einer Art und Weise, dass die Liposomen selbst und/oder ihr Inhalt in die angiogene Endothelzelle eintreten. Danach tritt das Taxan in die Zelle ein und kann Angiogenese hemmen. Die Selektivität der Zielsteuerung auf angiogene Endothelzellen kann mit Bezug auf die beigefügten Figuren besser verstanden werden.
1 zeigt einen Teil eines Mäuseeierstocks, auf dem ein großer runder Follikel (in gelb) angeordnet ist. Da in einem normalen Mäuseeierstock Angiogenese stattfindet, assoziieren kationische Liposomen, die eine nachweisbare Markierung enthalten, mit angiogenen Endothelzellen der wachsenden Blutgefäße des Follikels (rot-orange). In 1 kann jedoch nicht klar festgestellt werden, ob die Markierung nur mit den angiogenen Endothelzellen im Zusammenhang steht, oder ob sie mit dem gesamten Gewebe innerhalb des Eierstocks und des Follikels assoziiert ist.
2 ist eine Fluoreszenzmikrografie, die einen Abschnitt eines Pankreastumors einer Maus zeigt, die intravenös mit den kationischen Liposomen der Erfindung (rot-orange), die eine nachweisbare Markierung enthalten, injiziert wurde. Angiogenese tritt innerhalb von Tumoren leicht auf. Dieses Foto liefert daher einen gewissen Hinweis darauf, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen (rot-orange) spezifisch mit angiogenen Endothelzellen (grün) assoziieren. Diese Ergebnisse zeigen die Spezifität der Erfindung jedoch nicht definitiv.
Ein Vergleich der 3 und 4 zeigt die Fähigkeit der Erfindung, eine Angiogenesestelle zu lokalisieren. 3 ist ein Foto, das Blutgefäße in einem normalen Pankreasgewebe einer Maus zeigt. Dort sind viel weniger normale Endothelzellen markiert als korrespondierende angiogene Endothelzellen. Dieses wird deutlich gezeigt durch den Vergleich von 3 mit 4, die ein Foto eines Pankreastumors bei einer Maus darstellt. 4 zeigt deutlich im Bereich des Tumors ein hohes Maß an Akkumulierung der Markierung (gelb-orange), die in den kationischen Liposomen enthalten ist. Der drastische Unterschied zwischen 3 und 4 zeigt die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung, eine Tumorstelle deutlich und präzise zu markieren. Da ein so großer Teil der Markierung in 4 mit den angiogenen Blutgefäßen im Zusammenhang steht, kann die Spezifität der kationischen Liposomen, bevorzugt angiogene Endothelzellen anzusteuern, möglicherweise jedoch nicht vollständig gewürdigt werden.
5 ist ein Foto von Blutgefäßen (grün) in einer normalen Mauspankreasinsel. Die kleine Menge an rot-oranger Färbung zeigt die eingeschränkte Assoziation kationischer Liposomen mit normalen Endothelzellen an, die die Blutgefäße des Pankreasgewebes auskleiden.
Die Spezifität kationischer Liposomen, die eine nachweisbare Markierung enthalten, wird noch deutlicher durch den Vergleich von 5 mit 6 gezeigt. 6 zeigt deutlich ein viel höheres Maß der Akkumulierung der Markierung in den Endothelzellen der angiogenen Blutgefäße des Tumors in der Pankreas einer Maus.
Die konkrete Fähigkeit der kationischen Liposomen, angiogene Endothelzellen anzusteuern, wird in den 7 und 8 deutlich gezeigt. 7 zeigt deutlich, dass die fluoreszierende Markierung nur mit den Blutgefäßen im Zusammenhang steht, d.h. die Markierung leckt nicht und wandert nicht in das umgebende Gewebe. Die Spezifität wird am deutlichsten in 8 gezeigt, die klar auf markierte kationische Liposomen fokussiert ist, die in angiogenen Endothelzellen nachgewiesen werden, was zeigt, dass die Markierung spezifisch für diese Zellen ist und nicht leckt oder in das umgebende Gewebe wandert.
Die 9 und 10 zeigen den gleichen Effekt, der weiter oben bereits beschrieben wurde, mit einem anderen Angiogenesemodell. Die 1 bis 8 sind alle entweder auf normales Gewebe oder auf Krebsgewebe gerichtet. Die 9 bzw. 10 zeigen normales und entzündetes Gewebe der Luftröhre einer Maus. Insbesondere zeigt die 9 normale Blutgefäße einer Luftröhre, d.h. eine pathogenfreie Mäuseluftröhre. 10 zeigt die Blutgefäße einer Luftröhre mit dem Auftreten einer durch Infektion hervorgerufenen Angiogenese. Die höhere Konzentration der nachweisbaren Markierung in 10 ist offensichtlich und zeigt an, dass die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen selektiv mit angiogenen Endothelzellen assoziieren – insbesondere assoziieren sie spezifisch mit Endothelzellen der Luftröhre, in der Angiogenese durch eine Infektion hervorgerufen wurde.
11 zeigt ein Diagramm, das den Unterschied in der Spezifität der kationischen Liposomen darstellt, mit angiogenen Endothelzellen und korrespondierenden normalen Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen, assoziieren zu können. Wie in 11 dargestellt wird, zeigen die kationischen Liposomen der Erfindung (in diesem Experiment) eine etwa 10× größere Affinität für angiogene Endothelzellen verglichen mit korrespondierenden Endothelzellen auf, die keine Angiogenese durchlaufen.
Die 12 und 13 zeigen, wie die kationischen Liposomen der Erfindung in die angiogenen Endothelzellen eintreten. In 12 sind kationische Liposomen mit der Oberfläche der angiogenen Endothelzelle in Kontakt getreten. In 13 sind die kationischen Liposomen durch Endozytose in die angiogene Endothelzelle eingetreten und befinden sich innerhalb der Zelle.
14 zeigt die Aufnahme einer Liposomen-Formulierung, die Paclitaxel umfasst, in den Luftröhren pathogenfreier und Mycoplasma pulmonis-infizierter Mäuse und außerdem ist gezeigt, dass kationische Liposomen bevorzugt mit angiogenen Endothelzellen assoziieren und von diesen aufgenommen werden, im Vergleich zu Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen.
Nachdem die Spezifität der erfindungsgemäßen kationischen Liposomen mit Worten beschrieben und mit Hilfe der Figuren gezeigt wurde, kann ein Fachmann eine Vielzahl unterschiedlicher kationischen Liposomen herstellen, die eine Vielzahl unterschiedlicher Substanzen enthalten, um die Erfindung zu verwenden. Zur Vervollständigung werden allerdings im Folgenden kationische Liposomen und ihre Herstellungsverfahren beschrieben, und anschließend werden Substanzen beschrieben, die Angiogenese entweder hemmen oder fördern.
Liposomen
Liposomen können leicht gebildet werden, indem Lipide (wie oben definiert), die kationische Lipide (wie oben definiert) beinhalten, in eine wässrige Lösung gegeben werden und die Lösung für einen Zeitraum von einigen Sekunden bis zu Stunden bewegt wird. Diese einfache Vorgehensweise erzeugt spontan große multilamellare Liposomen oder Vesikel mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 1 bis 10 Mikrometer. Diese Liposomen sind aus zwei bis mehreren hundert konzentrischen Lipid-Doppelschichten zusammengesetzt, die mit Schichten einer wässrigen Phase abwechseln, in denen die Lipide vorhanden waren. Eine Substanz, wie zum Beispiel eine Verbindung die Angiogenese hemmt oder fördert oder eine nachweisbare Markierung bereitstellt, kann in der wässrigen Phase vorhanden sein. Die Substanz kann wasserlöslich sein oder zumindest leicht in Wasser dispergiert werden. Alternativ können solche Substanzen in der Lipid-Doppelschicht enthalten sein. Substanzen, die in der Lipid-Doppelschicht enthalten sind, können hydrophob sein.
Die Dicke der wässrigen Schicht und damit die Gesamtmenge der wässrigen Phase innerhalb des Liposoms, hängt von dem Gleichgewicht der elektrostatischen Abstoßungskräfte zwischen geladenen Lipiden und der Van der Waals-Anziehungskräfte zwischen den Doppelschichten als Ganzes ab. Der wässrige Abstand (und damit das Volumen des eingeschlossenen wässrigen Materials) nimmt daher mit zunehmendem Anteil geladener Lipide in der Membran und mit abnehmenden Elektrolyt-Konzentrationen (geladenen Ionen) in der wässrigen Phase ab.
Es können Liposomen unterschiedlicher Größen hergestellt werden. Kleine Liposomen oder Vesikel, die gebildet werden, sind unilamellar und besitzen eine Größe im Bereich von etwa 20 bis 400 Nanometern. Sie können durch die Behandlung multilamellarer Vesikel mit Ultraschall oder durch Extrusion unter Druck durch Membranen mit einer definierten Porengröße oder durch Hochdruckhomogenisierung hergestellt werden. Größere unilamellare Liposomen mit einer Größe im Bereich von etwa 0,1 bis 1 μm im Durchmesser können erhalten werden, indem das Lipid in einem organischen Lösungsmittel oder einem oberflächenaktiven Mittel solubilisiert und das Solubilisierungsmittel durch Evaporation bzw. Dialyse entfernt wird. Die Fusion kleinerer unilamellarer Liposomen durch Verfahren, die bestimmte Lipide oder stringente Dehydrierungs-Hydrierungs-Bedingungen erfordern, kann zu unilamellaren Gefäßen so groß wie oder größer als Zellen führen.
Um die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen zu bilden, ist es notwendig, dass die Liposomen unter Verwendung mindestens einiger kationischer Lipide hergestellt werden. Die kationischen Liposomen der Erfindung müssen allerdings nicht ausschließlich aus kationischen Lipiden bestehen. Die Verwendung neutraler Lipide in einer Menge von ca. 45% und kationischer Lipide in einer Menge von ca. 55% führt beispielsweise zu kationischen Lipiden, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und die bevorzugt angiogene Endothelzellen ansteuern.
Die erfindungsgemäßen kationischen Liposomen können ein Taxan umfassen und weiterhin einen Fluorophor oder eine andere Markierung und/oder ein lösliches Taxan im wässrigen Kompartiment. Kationische Liposomen, die ein Taxan und gegebenenfalls eine Markierung umfassen, können durch die Verwendung beliebiger der verschiedenen Standardverfahren, die in dem Fachbereich bekannt sind, erzeugt werden, zum Beispiel indem Lösungen von 1,2-Dioleyl-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP), Cholesterin und Texas Red DHPE (N-(5-Dimethylaminonaphthalen-1-sulfonyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin) miteinander vermischt, bis zur Trockenheit evaporiert werden, und der Film anschließend in 5%iger Dextrose rehydriert wird, um multilamellare Vesikel (MLVs) zu erhalten. Diese Vesikel werden durch Polycarbonatmembranfilter extrudiert, um unilamellare Vesikel zu erhalten. Liposomen und die zu verbindende Substanz, zum Beispiel Plasmid-DNA, werden miteinander in spezifischen Verhältnissen in einer 5%-igen Dextroselösung oder einem anderen physiologisch annehmbaren Hilfsstoff vermischt. Zweckmäßige kationische Lipide umfassen: DDAB, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N-[1-(2,3-dioloyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl-ammoniummethylsulfat, 1,2-Diacyl-3-trimethylammoniumpropane (einschließlich aber nicht beschränkt auf Dioleoyl- (DOTAP), Dimyristoyl-, Dipalmitoyl-, Distearoyl-), 1,2-Diacyl-3-dimethylammoniumpropane (einschließlich aber nicht beschränkt auf Dioleoyl-, Dimyristoyl-, Dipalmitoyl-, Distearoyl-) DOTMA, N-[1-[2,3-bis(oleoyloxy)]propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid, DOGS, Dioctadecylamidoglycylspermin, DC-Cholesterin, 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin, DOSPA, 2,3-Dioleoyloxy-N-(2(spermincarboxyamido)-ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoroacetat, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (einschließlich nicht aber beschränkt auf Dioleoyl- (DOEPC), Dilauroyl-, Dimyristoyl-, Dipalmitoyl-, Distearoyl-, Palmitoyloleoyl-), β-Alanylcholesterin, CTAB, Cetyltrimethylammoniumbromid, diC14-Amidin, N-t-Butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin, 14Dea2, O,O'-Ditetradecanolyl-N-(trimethylammonioacetyl)diethanolaminchlord, DOSPER, 1,3-Dioleoyloxy-2-(6-carboxy-spermyl)propylamid, N,N,N',N'-tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butandiammoniumiodid, 1-[2-Acyloxy)ethyl]2-alkyl(alkenyl)3-(2-hydroxyethyl)-imidazoliniumchlorid-Derivate wie 1-[2-(9(Z)-Octadecenoyloxy)ethyl]-2-(8(Z)-heptadecenyl)3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DOTIM), 1-[2-(Hexadecanoyloxy)ethyl]-2-pentadecyl)3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DPTIM), 1-[2-(Tetradecanoyloxy)ethyl]-2-tridecyl)3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DMTIM) – wie in Solodin et al. (1995) Biochem. 43: 13537–13544 beschrieben, Derivate von 2,3-Dialkyloxypropyl-quaternären Ammoniumverbindungen, die einen Hydroxyalkylrest am quaternären Amin enthalten, wie zum Beispiel 1,2-Dioleoyl-3-dimethyl-hydroxyethylammoniumbromid (DORI), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl-ammoniumbromid (DORIE), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxypropyl-ammoniumbromid (DORIE-HP), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxybutyl-ammoniumbromid (DORIE-HB), 1,2-Dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxypentyl-ammoniumbromid (DORIE-HPe), 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl-ammoniumbromid (DMRIE), 1,2-Dipalmityloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl-ammoniumbromid (DPRIE), 1,2-Distearyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl-ammoniumbromid (DSRIE) – wie zum Beispiel in Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 2550–2561 beschrieben. Viele dieser oben genannten Lipide sind kommerziell erhältlich, z.B. bei Avanti Polar Lipids, Inc., Sigma Chemical Co., Molecular Probes, Inc., Northern Lipids, Inc., Roche Molecular Biochemicals und Promega Corp.
Kationische Liposomen werden aus den kationischen Lipiden selbst hergestellt oder in Beimischung mit anderen Lipiden, insbesondere neutralen Lipiden wie Cholesterin, 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminen (einschließlich aber nicht beschränkt auf Dioleoyl- (DOPE), 1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine, natürliches Eigelb-Phosphatidylcholin (PC) und dergleichen, synthetischen Mono- und Diacylphosphocholinen (z.B. Monoacylphosphatidylcholin (MOPC)) und Phosphoethanolaminen. Asymmetrische Fettsäuren, sowohl synthetische als auch natürliche, und gemischte Formulierungen der oben genannten Diacylderivate können ebenfalls eingeschlossen sein.
Liposomen der oben beschriebenen Art und anderer Arten, die einem Fachmann geläufig sind, können in der vorliegenden Erfindung mit den Liposomen, die ein Taxan und gegebenenfalls eine nachweisbare Markierung enthalten, verwendet werden. Ein Beispiel erfindungsgemäßer Liposomen sind kationische Liposomen, die ein lipidlösliches oder wasserlösliches Taxan enthalten. Lipidlösliche Taxane können in der Lipid-Doppelschicht vorhanden sein. Nachfolgend wird eine Beschreibung von Taxanen bereitgestellt. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass weitere Taxane einem Fachmann bekannt sind und/oder nach der vorliegenden Erfindung entwickelt werden, und dass solche Taxane leicht im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Taxane
Die Erfindung stellt weiterhin kationische Liposomen bereit, die ein Taxan als anti-angiogenen Wirkstoff enthalten. Solche Liposomen können Angiogenese hemmen und sind daher bei der Behandlung von Tumoren, chronischen Entzündungen und anderen Erkrankungen, die mit Angiogenese im Zusammenhang stehen, nützlich.
„Taxane" umfassen Paclitaxel sowie jedes aktive Taxan-Derivat oder jede Taxanvorstufe („Prodrug"), solange die geforderte Aktivität beobachtet wird, d.h. die Angiogenese in einem Blutgefäß mindestens etwa zweifach, bevorzugter mindestens etwa fünffach, weiter bevorzugt mindestens etwa zehnfach und noch weiter bevorzugt mindestens etwa fünfzigfach oder stärker gehemmt wird, verglichen mit Angiogenese in einem Blutgefäß, das nicht mit einer Taxan enthaltenden kationischen Lipidformulierung in Kontakt gebracht wird.
Ein Fachmann kann mit Hilfe einer Vielzahl bekannter Methoden leicht feststellen, ob die Angiogenese gehemmt wird. Solche Methoden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Methoden, die die in vitro oder in vivo Invasion einer synthetischen Matrix durch Blutgefäße als Antwort auf einen Angiogenese-fördernden Wirkstoff (d.h. einen pro-angiogenen Wirkstoff) mit sich bringen, wie z.B. ein Chorioallantoischer Membranassay, ein Hornhauttaschenassay und Assays zur Hemmung der Endothelzell-Proliferation. Solche Methoden wurden in der Literatur häufig beschrieben und umfassen inter alia Vazquez et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 23349–23357 und Belotti et al. (1996) Clin. Cancer Res. 2: 1843–1849.
Das Taxan kann in der Lipid-Doppelschicht des Liposoms enthalten sein, es kann im wässrigen Kompartiment des Liposoms vorhanden sein oder es kann in beiden enthalten sein. Entsprechend stellt die Erfindung in einigen Ausführungsformen ein kationisches Liposom, das kationische Lipide und ein Taxan in der Lipid-Doppelschicht umfasst, zur Verfügung. In einigen dieser Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom weiterhin ein Taxan im wässrigen Kompartiment. In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung kationische Liposomen bereit, die kationische Lipide und ein Taxan im wässrigen Kompartiment umfassen. Taxane, die im wässrigen Kompartiment enthalten sein können, umfassen wasserlösliche Taxane (z.B. ein hydrophiles Derivat). Taxane, die in einer Lipid-Doppelschicht eines kationischen Liposoms enthalten sein können, umfassen hydrophobe Taxane und hydrophobe Taxanderivate.
Im Allgemeinen beträgt der Taxananteil in den kationischen Liposomenformulierungen der vorliegenden Erfindung weniger als etwa 20 Mol%. In einigen Ausführungsformen umfasst die kationische Liposomenformulierung Taxan zu einem Anteil von 0,5 Mol% bis 20 Mol%, in anderen Ausführungsformen von 2 Mol% bis 10 Mol%. In noch anderen Ausführungsformen ist das Taxan zu 1 Mol% bis 5 Mol% vorhanden und in noch anderen Ausführungsformen zu 1 Mol% bis 3 Mol%. Wenn ein Taxan in einem kationischen Liposom zu einem Anteil von 0,5 Mol% bis 20 Mol%, von 2 Mol% bis 10 Mol%, von 1 Mol% bis 5 Mol% oder von 1 Mol% bis 3 Mol% enthalten ist, entweicht das Taxan nicht wesentlich aus der liposomalen Doppelschicht und/oder es bildet im Wesentlichen keine Taxankristalle in einem Zeitraum von wenigstens etwa 0,5 Stunden, im Allgemeinen wenigstens etwa 1 Stunde, im Allgemeinen wenigstens etwa 2 Stunden, üblicherweise wenigstens etwa 24 Stunden, üblicherweise wenigstens etwa 48 Stunden, bei einer Temperatur zwischen etwa 4°C und etwa 25°C. Höhere Taxananteile können enthalten sein, solange das Taxan im Wesentlichen nicht aus der liposomalen Doppelschicht entweicht und/oder im Wesentlichen keine Taxankristalle enthält. Die kationischen Liposomen, die ein Taxan umfassen, enthalten „im Wesentlichen keine Taxankristalle", d.h. im Allgemeinen liegen weniger als 10%, üblicherweise weniger als 5%, üblicherweise weniger als 2%, typischerweise weniger als 1% und bevorzugt weniger als 0,5% des Taxans in dem kationischen Liposom in Kristallform vor. Ein kationisches Liposom, in dem das Taxan im Wesentlichen nicht aus der Lipid-Doppelschicht entweicht, ist ein Liposom, aus dem im Allgemeinen weniger als 20%, üblicherweise weniger als 10%, üblicherweise weniger als 5%, typischerweise weniger als 1% und bevorzugt weniger als 0,5% des Taxans aus der Liposom-Doppelschicht entwichen ist.
Der Anteil an kationischem Lipid in der Liposom-Taxan-Formulierung beträgt im Allgemeinen mehr als 5 Mol%, üblicherweise mehr als 10 Mol% und typischerweise mehr als etwa 20 Mol%. In einigen Ausführungsformen ist das kationische Lipid in der Liposom-Taxan-Formulierung zu 20 Mol% bis 99 Mol% vorhanden. In anderen Ausführungsformen ist das kationische Lipid zu 30 Mol% bis 80 Mol% vorhanden, in wieder anderen Ausführungsformen zu 40 Mol% bis 98 Mol% und in noch anderen Ausführungsformen zu 40 Mol% bis 60 Mol%. Liposom-Zusammensetzungen, die zur Verabreichung eines Taxans geeignet sind, wurden weiter oben beschrieben. Das Taxan kann auch an eine hydrophobe organische Gruppe gebunden sein, wie zum Beispiel an eine Fettsäure, ein Phospholipid und dergleichen und es kann in einem Liposom enthalten sein. Solche Taxanderivate wurden beschrieben und sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,580,899. Phosphatidylcholin-Formulierungen, die Taxol umfassen, wurden beschrieben (US-Patent Nr. 5,683,715).
Die kationischen Liposom-Formulierungen, die ein Taxan umfassen, besitzen eine größere Affinität für Endothelzellen in Blutgefäßen, die Angiogenese durchlaufen (also angiogene Endothelzelle) und assoziieren bevorzugterweise mit diesen und werden von diesen aufgenommen, d.h. die kationischen Liposomen, die Taxane umfassen, werden von angiogenen Endothelzellen in einer Menge aufgenommen (so dass das Taxan in die Zelle eintritt), die etwa dem Zweifachen, weiter bevorzugt dem mindestens etwa Fünffachen und noch weiter bevorzugt dem mindestens etwa Zehnfachen oder mehr der Menge entspricht, die von nicht-angiogenen Endothelzellen aufgenommen wird. Dieser Vergleich wird im Allgemeinen auf einer Zell-zu-Zell-Basis aufgestellt, d.h. es wird ein direkter Vergleich zwischen der Aufnahme durch eine angiogene Endothelzelle und durch eine nicht-angiogene Endothelzelle aufgestellt. Als Beispiel wird ein Assay zur Bestimmung des Verhältnisses der Aufnahme durch angiogene Endothelzellen zu der Aufnahme durch nicht-angiogene Endothelzellen ex vivo durchgeführt, d.h. Zellen werden in einen Tier in vivo markiert, aus dem Tier entnommen und ex vivo auf die Aufnahme der kationischen Liposomen-Formulierung hin untersucht. Ein Beispiel eines geeigneten Assay-Verfahrens wird in Ausführungsbeispiel 5 bereitgestellt. In diesem Assay wird ein Tier mit einer Substanz behandelt, von der bekannt ist, dass sie Angiogenese hervorruft. Endothelzellen werden mit der kationischen Liposomen/Taxan-Formulierung in Kontakt gebracht, wobei diese eine Markierung umfasst, die von der Markierung, die dazu verwendet wird, alle Endothelzellen zu markieren, unterschieden werden kann. Nach geeigneter Zeit sind alle Endothelzellen mit einer Fluoreszenz-Markierung markiert. Das Tier kann vor, gleichzeitig oder nach der Markierung der Endothelzellen mit einem Fixativ perfundiert werden. Nach geeigneter Zeit (z.B. zwischen etwa 1 Minute bis zu etwa 2 Stunden) werden die Endothelzellen aus dem Tier entnommen und durch direkte Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie wird der Anteil der Endothelzellen, die die Markierung, die mit der kationischen Liposomen/Taxan-Formulierung assoziiert ist enthalten, mit dem Anteil der Endothelzellen verglichen, die die mit der kationischen Liposomen/Taxan-Formulierung assoziierte Markierung nicht enthalten. Auf diese Weise kann ein direkter Zell-zu-Zell-Vergleich zwischen der Aufnahme durch angiogene Endothelzellen und durch nicht-angiogene Endothelzellen angestellt werden. Ob ein kationisches Liposom bevorzugt durch eine bestimmte Zelle aufgenommen wird, kann mit Hilfe eines beliebigen bekannten Verfahrens bestimmt werden, einschließlich durch die Verwendung markierter Lipide und durch Fluoreszenzmikroskopie, wie in den Beispielen beschrieben. Verfahren, in welchen z.B. eine Messung der Aufnahme in Homogenaten ganzer Gewebe erfolgt, sind im Allgemeinen nicht bevorzugt, da das Vorhandensein eines großen Anteils an nicht-Endothelzellen das Verhältnis von Signal zu Hintergrund verringern kann und daher der Unterschied zwischen der Aufnahme durch angiogene Endothelzellen und durch nicht-angiogene Endothelzellen nicht genau wiedergegeben wird.
Neutrale Lipide können in den kationischen Liposom-Formulierungen enthalten sein und, sofern vorhanden, kann ihr Anteil von 1 Mol% bis 80 Mol%, im Allgemeinen von 2 Mol% bis 50 Mol% und üblicherweise von 40 Mol% bis 50 Mol% betragen. Jedes neutrale Lipid kann enthalten sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf ein Phosphatidylethanolamin, einschließlich aber nicht beschränkt auf DOPE oder ein Phosphatidylcholin, einschließlich aber nicht beschränkt auf Eier-PC, DOPC und MOPC. Mischungen von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin können ebenfalls enthalten sein.
Kationische Liposomen, die ein Taxan umfassen, können weiterhin eine nachweisbare Markierung enthalten, von denen eine große Vielfalt im Fachbereich bekannt ist, wie ausführlich hierin beschrieben.
Beispiel 5 stellt experimentelle Daten bereit, welche die Zielsteuerung von Paclitaxel-enthaltenden kationischen Liposomen auf angiogene Endothelzellen zeigt. Entsprechend stellt die Erfindung in einigen Ausführungsformen kationische Liposomen, die Paclitaxel enthalten, bereit. In einigen dieser Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP) zu 20 Mol% bis 99 Mol%, zu 40 Mol% bis 70 Mol%, zu 50 Mol% bis 60 Mol%. In einigen dieser Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom DOTAP:Eier-Phosphatidylcholin (PC):Rhodamin:DHPE:Paclitaxel in einem molaren Verhältnis von 50:47:1:2. In anderen Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom DOTAP:EierPC:Paclitaxel in einem molaren Verhältnis von 50:48:2. In wieder anderen Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom DOTAP:DOPC:Paclitaxel in einem molaren Verhältnis von 50:47:3. In noch anderen Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom DOTAP:DOPE:Paclitaxel in einem molaren Verhältnis von 50:47:3. In wieder anderen Ausführungsformen umfasst das kationische Liposom DOTAP:MOPC:Paclitaxel in einem molaren Verhältnis von 50:47:3.
Paclitaxel stabilisiert mikrotubuläre Strukturen durch Tubulinbindung. In sich teilenden Zellen kann dies zur Bildung abnormer mitotischer Spindeln führen. Außerdem können Taxane auch eine anti-angiogene Wirkung besitzen (Belotti et al. (1996) Clin. Cancer Res. 2: 1843–1849 und Klauber et al. (1997) Cancer Res. 57: 81–86). Erfindungsgemäße kationische Liposomen können eine beliebige Substanz, die Angiogenese hemmt, einschließlich, nicht aber beschränkt auf ein Taxan, einschließlich nicht aber beschränkt auf Paclitaxel; und beliebige andere der oben beschriebenen Angiogenese-Inhibitoren, umfassen. Folglich werden in einigen Ausführungsformen kationische Liposomen-Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein Taxan und einen oder mehrere andere angiogene Substanzen umfassen.
Paclitaxel ist ein hochgradig derivatisiertes Diterpenoid (Wani et al. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93: 2325–2327), das aus der geernteten und getrockneten Rinde von Taxus brevifolia (Pazifische Eibe) und Taxomyces andreanae, einem endophytischen Pilz der Pazifischen Eibe, gewonnen wird (Stierle et al. (1993) Science 60: 214–216). „Paclitaxel" (das hier so verstanden werden soll, dass auch Analoga, Formulierungen und Derivate umfasst sein sollen, wie zum Beispiel Docetaxel, TAXOLJ, TAXOTEREJ (eine Docetaxel-Formulierung), 10-Desacetylanaloga von Paclitaxel und 3'N-Desbenzoyl-3'N-t-butoxycarbonylanaloga von Paclitaxel) kann leicht durch im Fachbereich bekannte Verfahren hergestellt (siehe dazu ebenfalls WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, US-Pat. Nummern 5,294,637, 5,283,253, 5,279,949, 5,274,137, 5,202,448, 5,200,534, 5,229,529 und EP 590,267 ) oder aus einer Vielzahl kommerzieller Quellen erhalten werden, einschließlich zum Beispiel Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 aus Taxus brevifolia oder T-1912 aus Taxus yannanensis).
Paclitaxel sollte so verstanden werden, dass es sich nicht nur auf die herkömmliche chemisch erhältliche Form von Paclitaxel bezieht, sondern auch auf Analoga (z.B. Taxotere, wie oben bereits bemerkt) und Paclitaxel-Konjugate (z.B. Paclitaxel-PEG, Paclitaxel-Dextran oder Paclitaxel-Xylose).
Von dem Begriff „Taxan" ist außerdem eine Vielfalt bekannter Derivate, einschließlich sowohl hydrophiler, als auch hydrophober Derivate umfasst. Taxan-Derivate umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Galactose- und Mannose-Derivate, welche in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 99/18133 beschrieben sind, Piperazino- und andere Derivate, die in WO 99/14209 beschrieben sind, Taxan-Derivate, die in WO 99/09021, WO 98/22451 und US-Patent Nr. 5,869,680 beschrieben sind, 6-Thioderivate, die in US-Patent Nr. 5,821,263 beschrieben sind, Sulfenamid-Derivate, die in US-Patent Nr. 5,821,263 beschrieben sind und Taxol-Derivate, die in US-Patent Nr. 5,415,869 beschrieben sind. Weiterhin umfasst sind Vorläufer von Paclitaxel („Prodrugs"), einschließlich aber nicht beschränkt auf solche, die in WO 98/58927, WO 98/13059 und US-Patent Nr. 5,824,701 beschrieben sind.
In dem Begriff „Taxan" sind weiterhin pharmazeutisch annehmbare Salze eines Taxans umfasst.
Gemische von Taxanen können in den kationischen Liposomen enthalten sein. Weiterhin kann ein kationisches Liposom, das ein Taxan umfasst, ferner ein oder mehrere zusätzliche, pharmazeutisch wirksame Substanz(en) umfassen, einschließlich aber nicht beschränkt auf ein Mittel (z.B. ein anderes als Taxan), das Angiogenese hemmt und ein Antikrebsmittel.
Taxane können aus natürlichen Quellen isoliert, chemisch synthetisiert oder aus einer kommerziell erhältlichen Quelle erhalten werden. Verfahren zur chemischen Synthese sind im Fachbereich bekannt, siehe z.B. US-Patent Nr. 5,580,899.
Dosierung
Die Menge eines Taxans, die einem Patienten (bei dem es sich um ein beliebiges Tier mit einem Blutkreislaufsystem mit Endothelzellen, die Angiogenese durchlaufen, handeln kann) verabreicht werden soll, wird in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren variieren. Zum Beispiel wäre es notwendig, Menschen eine wesentlich größere Dosis zur Verfügung zu stellen als Tieren. Die Menge eines Taxans wird von der Größe, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht und dem Zustand des Patienten, wie auch von der Wirksamkeit des Taxans, das verabreicht wird, abhängig sein. Nachdem angemerkt wurde, dass bezüglich der Dosierung eine beträchtliche Variationsbreite besteht, wird angenommen, dass ein Fachmann mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung leicht die geeignete Dosierung bestimmen kann, indem zunächst eine extrem kleine Menge verabreicht wird und die Dosis zunehmend erhöht wird, bis das gewünschte Ergebnis erhalten wird. Obwohl die Dosismenge auf Grundlage der oben beschriebenen Faktoren stark variieren wird, ermöglicht es die vorliegende Erfindung im Allgemeinen, wesentlich geringere Mengen eines Taxans zu verabreichen, im Vergleich zu Verabreichungssystemen, die das umgebende Gewebe, wie z.B. die Tumorzellen selbst, ansteuern.
Gerinnselbildung
Ein weiterer Aspekt der Erfindung, der durch die Verwendung von Liposomen durchgeführt werden kann, schließt die Bildung von Blutgerinnseln ein. Insbesondere ist das Liposom dazu konzipiert, dass es eine Wirkung auf angiogene Endothelzellen besitzt, die zu der Bildung von Blutgerinnseln in den angiogenen Blutgefäßen führt. Die Blutgerinnsel verhindern den Fluss von Nährstoffen und Sauerstoff zum restlichen Gefäß, was zum Absterben des Gefäßes und des umliegenden Gewebes führt.
Das Grundkonzept der Bildung von Blutgerinnseln in Tumorblutgefäßen zur Beseitigung eines unerwünschten Tumors wurde mit Hilfe von Antikörpern, die Tumorblutgefäße ansteuern, durchgeführt. Die vorliegende Erfindung konnte verbesserte Ergebnisse erzielen, indem kationische Lipide, die ein Taxan enthalten, das die thrombogenen Kaskaden fördert, verwendet wurden.
Tumorzellen sind von der Blutzufuhr abhängig. Durch die lokale Unterbrechung der Tumorgefäße wird eine Lawine des Tumorzelltods hervorgerufen. Das Tumorblutgefäßendothel befindet sich in direktem Kontakt mit dem Blut. Tumorzellen selbst befinden sich jedoch außerhalb der Blutbahn und sind größtenteils schwer zugänglich für viele Stoffe, die in das Blutgefäßsystem injiziert werden. Dieser Aspekt sowie andere Aspekte der Erfindung funktionieren besonders gut, da es sich bei den Zellen, die angesteuert werden, um die angiogenen Endothelzellen handelt, die selbst nicht transformiert werden, d.h. es sind Zellen, die wahrscheinlich keine Mutationen erwerben, durch die sie therapieresistent werden. Die Tumorzellen erfahren beträchtliche Mutationen, und diese Mutationen machen die Zellen oft therapieresistent. Ergebnisse hinsichtlich einer Verkleinerung der Tumorgröße durch die Verwendung einer Antikörper-gerichteten Ansteuerung wurden anderweitig veröffentlicht, wie zum Beispiel von: Burrows and Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8996–9000 und Huang et al. (1997) Science 275: 547–550.
Verfahren zur Reduzierung von atherosklerotischen Plaques
Die Erfindung stellt des Weiteren Verfahren zur Reduzierung atherosklerotischer Plaques in einem Säuger bereit, indem dem Säuger eine Zusammensetzung verabreicht wird, die kationische Lipide und ein Taxan umfasst, und es der Zusammensetzung ermöglicht wird, ausreichend lange und in einer Weise mit den angiogenen Endothelzellen eines angiogenen Blutgefäßes zu assoziieren, dass die Zusammensetzung in die angiogenen Endothelzellen eindringt, wobei das Taxan die Angiogenese vermindert und die Verminderung von Angiogenese zu einer Reduktion der atherosklerotischen Plaquebildung führt.
Der Begriff „Atherosklerose" ist im Fachbereich gut bekannt und bezeichnet eine Erkrankung großer und mittelgroßer Arterien, die zu der fortschreitenden Akkumulation innerhalb der Intima glatter Muskelzellen und Lipide führt. Das andauernde Wachstum der Läsionen (Plaques) greift auf andere Schichten der Arterienwand über und engt das Lumen ein. Der Begriff „Reduzierung atherosklerotischer Plaques" bedeutet wie hierin verwendet, dass eine atherosklerotische Plaque oder eine Läsion um mindestens etwa 10%, weiter bevorzugt um mindestens etwa 25%, noch weiter bevorzugt um mindestens etwa 50%, noch weiter bevorzugt um mindestens etwa 75% und noch weiter bevorzugt um mindestens etwa 90% oder mehr verringert wird, wenn ein Taxan enthaltendes erfindungsgemäßes kationisches Liposom einem Säuger, das eine solche Läsion aufweist, verabreicht wird, verglichen mit einer solchen atherosklerotischen Plaque in einem Kontrollsäuger, die mit einem kationischen Liposom, das kein Taxan enthält, behandelt wurde. In einigen Ausführungsformen wird die atherosklerotische Plaque komplett beseitigt. Entsprechend ist eine „therapeutisch wirksame Menge" oder „eine wirksame Menge" eines Taxans zur Verwendung in den Verfahren zur Reduzierung einer atherosklerotischen Plaque in einem Individuum, eine Menge, die, wenn sie einem Individuum verabreicht wird, die Größe einer atherosklerotischen Plaque um mindestens etwa 10%, bevorzugt um mindestens etwa 25%, weiter bevorzugt um mindestens etwa 50%, noch weiter bevorzugt um mindestens etwa 75% oder noch weiter bevorzugt um mindestens etwa 90% oder mehr verringert, verglichen mit der Größe einer Plaque, die sich in einem Kontrollsubjekt gebildet hat, dem das Taxan nicht verabreicht wurde.
Ob eine atherosklerotische Plaque reduziert wurde, kann durch radiografische Darstellung unter Verwendung eines beliebigen bekannten Verfahrens einschließlich solcher, die in US-Patent Nr. 5,807,536 beschrieben werden, bestimmt werden, durch Angiografie, bei der ein Katheter in ein Blutgefäß eingeführt und ein Kontrastmittel, wie zum Beispiel ein Farbstoff auf Iodbasis, zur Darstellung des Blutgefäßes verwendet wird und durch Darstellungen unter Verwendung einer intravaskulären Ultraschallsonde. In Tierexperimenten können Blutgefäßabschnitte visuell auf eine Verringerung der Plaquegröße untersucht werden. Siehe zum Beispiel Moulton et al. (1999) Circulation 99: 1726–1732.
In einigen Ausführungsformen führt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu der Verminderung einer oder mehrerer Folgeerkrankungen von Atherosklerose. Entsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verminderung eines Krankheitszustandes bereit, der mit Atherosklerose in Zusammenhang steht, einschließlich aber nicht beschränkt auf ischämisches Herzleiden, Myokardinfarkt, Restenose, Schlaganfälle und periphere Gefäßerkrankung. Ob einer oder mehrere dieser Krankheitszustände vermindert wurden, kann durch herkömmliche Beurteilungsmethoden bestimmt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf elektrokardiografische Bestimmungen und andere Standardverfahren.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Reduktion einer atherosklerotischen Plaque sind nützlich zur Vorbeugung, Hemmung oder Verringerung der Wahrscheinlichkeit oder des Wiederauftretens (Reformation) einer Plaque, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren oder durch ein anderes Verfahren, wie zum Beispiel durch Ballonangioplastie oder eine koronare Bypassoperation, entfernt wurde. In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren daher die Schritte der Entfernung einer atherosklerotischen Plaque aus einem Blutgefäß des Patienten und die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein kationisches Liposom und ein Taxan umfasst, an diesen Patenten. Die Zusammensetzung, die ein kationisches Liposom und ein Taxan umfasst, kann vor, während oder nach der Entfernung der Plaque aus dem Patienten verabreicht werden.
Jedes beliebige der kationischen Liposomen oder Formulierungen, die ein kationisches Liposom umfassen, die hierin beschrieben wurden, kann in Kombination mit einem beliebigen bekannten Taxan einschließlich solchen, die hierin beschrieben sind, in Verfahren zur Reduzierung einer atherosklerotischen Plaque verwendet werden. Das Taxan-kationische Lipid kann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsmittel formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Hilfsmittel sind im Fachbereich bekannt und wurden ausreichend beschrieben, zum Beispiel in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (1995) oder in der jüngsten Ausgabe von Mack Publishing Co., Easton, PA.
Experimentelle Angiogenesemodelle
Die vorliegende Erfindung wurde durch die Verwendung von Nager-Angiogenesemodellen ermöglicht. Chronische Entzündungserkrankungen wie Asthma und Bronchitis verursachen Gewebe- und Blutgefäßumbildung in der Atemwegsmucosa. Um über die Pathogenese einer chronischen Atemwegsentzündung zu lernen, wurde ein Modell verwendet, in dem eine chronische Entzündung und Gewebeumbildung in Luftröhren von Ratten und Mäusen auftritt. Angiogenese entwickelt sich in der Atemwegsmucosa als Folge einer Mycoplasma pulmonis-Infektion. In diesem Modell verursachen Mycoplasma pulmonis-Organismen eine persistierende Infektion im Luftröhren- und Bronchialepithel. Die Atemwegsmucosa von Ratten, die mit M. pulmonis infiziert sind, weist verschiedene deutliche Abnormalitäten auf: 1) die Verdickung des Epithels und der Lamina propria, 2) Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung des Epithels, 3) Angiogenese, 4) erhöhte Empfindlichkeit der angiogenen Blutgefäße für die entzündliche Mediatorsubstanz P hinsichtlich des Austretens von Plasma, 5) das Substanz P induzierte Auslaufen aus Kapillargefäßen sowie aus Venen und 6) die erhöhte Anzahl von Rezeptoren für die Substanz P (NK1-Rezeptoren) auf kapillaren Endothelzellen. In diesem Modell wird Angiogenese durch eine chronische Entzündung verursacht, und die Blutgefäße sind empfänglicher für Entzündungsmediatoren.
Studien, in welchen die luminale Endothelzelloberfläche durch die Perfundierung von Lektinen angefärbt wurde, zeigten das Angiogeneseausmaß in Ratten nach einer M. pulmonis-Infektion. In der Luftröhrenmucosa infizierter Ratten sind zahlreiche kapillarähnliche Gefäße vorhanden, und diese Gefäße lecken in Folge einer intravenösen Injektion der Entzündungsmediatorsubstanz P.
Im Mäusen verursacht M. pulmonis eine akute Lungenentzündung, die ihren Höhepunkt nach 6–9 Tagen nach Inokulation hat, gefolgt von einer persistierenden Atemwegsinfektion. In Mäusen ist die Antwort auf eine Infektion mit M. pulmonis stark abhängig vom Stamm: zum Beispiel zeigen Mäuse des C3H-Stamms eine höhere Mortalität und eine größere Reduktion des Cytokin-Tumornekrosefaktors α als C57BL-Stämme. Einige Aspekte der mucosalen Umbildung, wie Epithelhyperplasie, wurden von den Luftwegen von Mäusen beschrieben, die mit M. pulmonis infiziert sind. In C57BL/6-Mäusen, die durch nasale Inokulation von M. pulmonis infiziert wurden, steigt die Anzahl der Luftröhrenblutgefäße drastisch an, offensichtlich durch das Wachstum neuer Kapillaren. In diesem Stamm ist das Luftröhrenmucosa-Blutgefäßsystem nicht länger eben und kleine Gefäße wachsen senkrecht zur Mucosaebene. Zahlreiche sichtbare Gefäßsprossen werden in Bereichen erhöhter Vaskularität gefunden. Die Infektion von C57BL/6-Mäusen mit M. pulmonis erzeugt daher eine chronische Atemwegsentzündung mit Endothelproliferation, Gefäßumbildung und Angiogenese. Im Gegensatz dazu nimmt in C3H/HeN-Mäusen, die durch nasale Inokulation mit M. pulmonis infiziert wurden, die Anzahl vaskulärer Endothelzellen in der Luftröhrenmucosa zu, die Anzahl von Gefäßen jedoch nicht. Die erhöhte Vaskularität ist nicht die Folge einer Zunahme an Länge oder der Anzahl von Gefäßen, sondern einer Vergrößerung des Gefäßdurchmessers, wobei diese Zunahme der Gefäßgröße die Folge einer Verdopplung der Endothelzellzahl ist. Die Größe individueller Endothelzellen in infizierten Luftröhren nimmt nicht signifikant zu. Die Mengen an zirkulierenden Antikörpern gegen M. pulmonis ist in den zwei Mäusestämmen ähnlich. Eine Infektion von C3H/HeN-Mäusen mit M. pulmonis erzeugt daher eine chronische Atemwegsinfektion mit vaskulärer Umbildung und Endothelproliferation, aber keine signifikante Zunahme der Anzahl der Gefäße, wo hingegen in C57BL/6-Mäusen Endothelproliferation hervorgerufen und neue Gefäße erzeugt werden.
In einem zweiten Modell tritt Angiogenese in Tumoren auf, die aus einer transgenen Expression des viralen SV40 Onkogens resultieren. Das „RIP-Tag" transgene Mausmodell bietet die Möglichkeit, die phänotypischen Veränderungen in angiogenen Endothelzellen in einer gut charakterisierten Progression von normalem Gewebe zu Tumoren zu untersuchen. Im „RIP-Tag" transgenen Mausmodell wird das Onkogen des SV-40 Virus, das große T-Antigen (Tag) durch eine Region des Ratteninsulinpromotors (RIP) angetrieben. Wenn dieses Konstrukt in das murine Genom eingeführt wird, induziert es die Tag-Expression besonders in Pankreasinsel-β-Zellen, die in etwa 400 Inseln verstreut über die Pankreas lokalisiert sind. Alle Pankreasinseln in diesen Mäusen exprimieren Tag, die Inseln entwickeln sich jedoch bis zu einem Alter von etwa 6 Wochen normal. Danach werden etwa 50% der Inseln hyperplastisch. Ein kleiner Anteil dieser hyperplastischen Inseln (< 5%) entwickelt sich jedoch in etwa 10 Wochen zu Tumoren. Es scheint, dass dieser Engpass der Tumorgenese überwunden wird, wenn eine Insel die Fähigkeit erwirbt, Angiogenese zu induzieren: diese Tumorgenesephase wurde daher als „der angiogene Schalter" bezeichnet. Ein ähnlicher Angiogeneseschalter scheint auch in anderen Modellen muriner Tumorgenese, sowie in verschiedenen menschlichen Tumoren zu existieren. Das „RIP-Tag"-Modell liefert daher ein gut charakterisiertes Gerüst für die Untersuchung der Angiogeneseprogression in Tumoren.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen dazu, Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung bereitzustellen, wie kationische Liposomen hergestellt werden und wie die Methodik zur Verwendung solcher Liposomen angewendet wird, und sie sollen nicht dazu dienen, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlenangaben (z.B. Mengen, Temperatur usw.) abzusichern, gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen sollten aber berücksichtigt werden. Sofern nicht anders angegeben, handelt es sich bei Anteilen um Gewichtsanteile, beim Molekulargewicht um die mittlere Molmasse, die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben, und der Druck liegt bei oder nahe dem atmosphärischen Druck. Es sollte beachtet werden, dass jedes der nachfolgenden Beispiele mehrere Experimente, die mit Hilfe der Verfahren durchgeführt wurden, wiedergibt und die Ergebnisse zusammengefasst wurden. Fachleute werden erkennen, dass nicht jedes Experiment positive Ergebnisse liefert. Es wird jedoch angenommen, dass das Nachfolgende einen genauen Überblick über die erzielten Resultate darstellt.
BEISPIEL 1
Verteilung kationischer Liposomen in normalen Mäusen
Liposomen und/oder die Plasmid-DNA wurden markiert und die zelluläre Verteilung der markierten Komplexe wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der intravenösen Injektion bestimmt. Die Experimente wurden in pathogenfreien Mäusen (20–25 g Körpergewicht) beiderlei Geschlechts durchgeführt.
Kationische kleine unilamellare Vesikelliposomen wurden aus dem kationischen Lipid DDAB oder DOTAP und dem neutralen Lipid DOPE oder Cholesterin hergestellt, mit Texas Red oder dem rotem Fluoreszenzcarbocyanin-Farbstoff Dil oder CM-Dil markiert, und in einigen Fällen mit Plasmid-DNA, die ein Reportergen, wie zum Beispiel Luciferase oder β-Galactosidase enthält, komplexiert. Endothelzellen wurden unter Verwendung des fluoreszierenden Pflanzenlecitins Fluorescein-Lycopersicon esculentum markiert. Monocyten/Makrophagen wurden unter Verwendung von fluoreszierenden Perlen (Duke, 500 nm) markiert. Zellkerne wurden mit DAPI, YO-PRO oder dem Hoechst-Farbstoff 33342 markiert.
Fluoreszierende Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe, die 10–60 μg DNA in bis zu 300 μl enthielten, wurden in nicht narkotisierte Mäuse über die Schwanzvene injiziert. In einigen Experimenten wurden im Anschluss an die Komplexe 500 nm große fluoreszierende Perlen injiziert. 5 Minuten bis 24 Stunden danach wurden die Tiere mit Natriumpentobarbital narkotisiert und dann durch das linke Ventrikel mit Fixierlösung (1% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung) perfundiert, gefolgt von dem fluoreszierenden Lectin, um die Endotheloberfläche des Blutgefäßsystems zu markieren. Nach der Perfusion wurden die Gewebe entfernt und entweder als Ganzes präpariert oder mit Hilfe eines Vibratom- oder Gewebeschneiders in Teile geschnitten. Zusätzlich wurden einige Proben für die Elektronenmikroskopie vorbereitet. Die Gewebe wurden durch Epifluoreszenzmikroskopie oder durch konfokale Mikroskopie untersucht. Zusätzlich wurden einige Proben durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.
Ergebnisse: In Mäusen, die 5 Minuten bis 24 Stunden nach der Injektion untersucht wurden, waren CM-Dil- oder Dil-markierte Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe in den Lungen am reichlichsten vorhanden. Weiterhin waren in Endothelzellen der alveolaren Kapillaren am zahlreichsten. Die Fluoreszenz in alveolaren Kapillaren war gleichförmig in allen Lappen beider Lungen verteilt. Außerdem trat in intravaskulären Monocyten/Makrophagen etwas CM-Dil- oder Dil-Fluoreszenz auf.
Neben der Lunge wiesen die Leber und die Milz die größte Menge an markierten Liposomen oder Komplexen auf. In diesen Organen war die CM-Dil- oder Dil-Fluoreszenz mit den fluoreszierenden Perlen co-lokalisiert. In der Leber lagen die CM-Dil- oder Dil-Fluoreszenz und Perlen in den Kupffer-Zellen vor. In der Milz lagen sie in den Makrophagen vor.
Die Eierstöcke wiesen ebenfalls Blutgefäße auf, die stark mit CM-Dil- oder Dil-markierten Liposomen oder Komplexen markiert waren. Insbesondere wurde beobachtet, dass die Endothelzellen in angiogenen Blutgefäßen großer Follikel und Gelbkörperchen des Mäuseeierstocks nach intravenöser Injektion CM-Dil- oder Dil-markierte DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe reichlich aufgenommen hatten. Diese Beobachtungen wurden fotografisch dokumentiert (1). Andere Eierstockblutgefäße enthielten relativ wenige markierte Komplexe. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass angiogene Endothelzellen bevorzugt Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe aufnehmen, d.h. dass die kationischen Liposomen, die in den Experimenten verwendet wurden, eher mit Endothelzellen die Angiogenese durchlaufen, assoziieren, als mit korrespondierenden Endothelzellen, die keine Angiogenese durchlaufen.
Markierte Liposomen oder Komplexe waren außerdem in Endothelzellen hoher endothelialer Venen (HEV) von Lymphgefäßen und Peyerschen Plaques des Dünndarms sehr zahlreich vorhanden, wohingegen sie in Endothelzellen der Kapillaren dieser lymphoiden Organe sehr selten waren. Markierte Liposomen oder Komplexe waren auch in kapillaren Endothelzellen der vorderen Hypophyse, des Myokards, Diaphragmas, Nierencortex und Fettgewebes zahlreich.
Markierte Liposomen oder Komplexe lagen in Monocyten/Makrophagen, die an Venen der Blase des Urintrakts, der Gebärmutter und des Eierstocks gebunden waren, zahlreich vor. Einige Venen enthielten eine große Anzahl markierter Monocyten/Makrophagen. Außerdem war ein kleiner Anteil der Endothelzellen von Arteriolen, Kapillaren und Venen in diesen Organen markiert.
Relativ wenige markierte Liposomen oder Komplexe waren mit kapillaren Endothelzellen der hinteren Hypophyse, renalen Medulla, Darmzotten (Ileum), Pankreas und Nierenmedulla assoziiert. Nahezu keine markierten Liposomen oder Komplexe wurden in Endothelzellen im Gehirn, in der Schilddrüse, dem renalen Cortex, den Pankreasinseln, der Luftröhre oder den Bronchien gefunden, mit Ausnahme gelegentlicher Monocyten/Makrophagen.
Schlussfolgerungen: Die in diesen Studien verwendeten Formulierungen von CM-Dil- oder Dil-markierten DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen, steuerten hauptsächlich drei Zelltypen an: Endothelzellen, Makrophagen und Monocyten. Die Aufnahme von Liposomen oder Komplexen war organ- und gefäßspezifisch. Die meisten wurden von kapillaren Endothelzellen der Lunge und von Makrophagen der Leber und Milz aufgenommen. Kapillare Endothelzellen des Eierstocks, der vorderen Hypophyse, des Herzens, Diaphragmas, Nierencortex und Fettgewebes wurden ebenfalls angesteuert. Bei den Blutgefäßen, die im Eierstock Liposomen oder Komplexe aufnahmen, handelte es sich um Angiogenesestellen. Außerdem wurden HEV der Lymphknoten und Darm-Peyer-Drüsen angesteuert. Endothelzellen oder Makrophagen anderer Organe wurden weniger häufig und variabler angesteuert. Blutgefäße des Gehirns, der Schilddrüse, des renalen Cortex, der Luftröhre und der Bronchien wurden nicht angesteuert.
Außerdem dokumentierten die Experimente, dass die Liposomen oder Komplexe in den meisten Organen nicht aus den Blutgefäßen leckten. Obwohl sie in extravaskulären Zellen der Milz gefunden wurden, die Blutgefäße mit einem diskontinuierlichen Endothel aufweisen, wanderten sie nicht in andere Organe ein.
Die gierige Aufnahme kationischer Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe durch Blutgefäße der großen Eierstockfollikel und Gelbkörperchen weist schließlich darauf hin, dass es sich bei den Endothelzellen angiogener Blutgefäße um bevorzugte Aufnahmeorte handelt.
BEISPIEL 2
Aufnahme von DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen in RIP-Tag5-Mäusen
Die Ergebnisse der Experimente in Beispiel 1 zeigen, dass angiogene Blutgefäße in Eierstockfollikeln und Gelbkörperchen kationische Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe gierig aufgenommen haben. Entsprechend wurde ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob Endothelzellen angiogener Blutgefäße von Tumoren kationische Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe gierig aufnehmen.
Verwendet wurde das transgene RIP-Tag5-Modell für Tumore. Siehe Hanahan, (1985) Nature 315: 115–22; und Hanahan und Folkman (1996) Cell 86: 353–64. In diesem Modell wird das vorgesehene RIP-Tag, das Oncogen des SV-40-Virus, das große T-Antigen (Tag), durch eine Region des Ratteninsulinpromotors (RIP) reguliert. Wenn dieses Konstrukt in das murine Genom eingefügt wird, so induziert es spezifisch in β-Zellen der Pankreasinseln die Expression des T-Antigens.
Eine wichtige Eigenschaft dieses Modells ist, dass verschiedene Stadien der Tumorentwicklung und daher verschiedene Angiogenesestadien gleichzeitig in jeder RIP-Tag5-Maus vorhanden sind. Obwohl alle der 300–400 Inseln das T-Antigen exprimieren, entwickeln sich die Inseln anfangs normal. Im Alter von 6 Wochen ist jedoch etwa die Hälfte hyperplastisch und von diesen entwickelt sich ein kleiner Anteil nach 10 Wochen zu Tumoren. Die Tumorgenese scheint mit dem Beginn der Angiogenese zusammenzufallen. Diese Konversion wurde als „der angiogene Schalter" bezeichnet. Folkman et al. (1989) Nature 339: 58–61 und Hanahan und Folkman (1996) Cell 86: 353–64. Ein ähnlicher angiogener Schalter scheint in anderen murinen Tumorgenesemodellen, sowie in verschiedenen menschlichen Tumoren vorzuliegen. Hanahan und Folkman (1996) Cell 86: 353–64.
Methoden und Materialien wurden wie in Beispiel 1 verwendet. Insbesondere wurden CM-Dil- oder Dil-markierte DDAB:Cholesterin-Liposomen intravenös in eine RIP-Tag5-Maus, die einen Tumor aufwies, und in eine andere RIP-Tag5-Maus injiziert. Die Verteilung der Liposomen oder Komplexe in angiogenen Blutgefäßen der Pankreasinselzelltumore wurde 24 Stunden nach der Injektion untersucht und mit derjenigen in Blutgefäßen der Pankreasinseln normaler Mäuse verglichen.
Ergebnisse: Zwei neue Beobachtungen wurden gemacht: (1) die Liposomen oder Komplexe wurden von Endothelzellen angiogener Blutgefäße aufgenommen ohne über das Endothel hinaus zu lecken und (2) die endosomale Aufnahme der Liposomen oder Komplexe war in Endothelzellen angiogener Blutgefäße größer als in Endothelzellen normaler Blutgefäße von Pankreasinseln (2 stammt von einer Gewebeprobe).
Schlussfolgerungen: Dieses Experiment führte zu Ergebnissen, die mit der bevorzugten Aufnahme von DDAB:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexen durch angiogene Tumorblutgefäße konsistent sind. Bevor das Experiment wiederholt wurde, wurde (1) die Intensität der Fluoreszenz der Liposomen-DNA-Komplexe erhöht, (2) die Methoden zur Lokalisierung der Aufnahmestellen kationischer Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe in Tumoren der RIP-Tag-Mäuse verbessert und (3) eine bessere Kenntnis über Struktur und Funktion angiogener Blutgefäße in Pankreasinselzelltumoren in RIP-Tag5-Mäuse gewonnen.
BEISPIEL 3
Aufnahme von DDAB:Cholesterin-Liposomen-DNA-Komplexen in RIP-Tag2-Mäusen
Ziel: Die Fluoreszenzintensität der Liposomen-DNA-Komplexe wurde durch die Verwendung von Texas Red-DHPE anstelle von Dil erhöht; die Methode zur Präparation der Pankreas von RIP-Tag2-Mäusen zur Lokalisierung von Aufnahmestellen der fluoreszierenden kationischen Liposomen-DNA-Komplexe wurde verbessert und die Struktur und Funktion der angiogenen Blutgefäße in Pankreasinselzelltumoren in RIP-Tag2-Mäusen wurde untersucht. Mit diesen Verbesserungen wurden Experimente, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wurden, durchgeführt, um zu bestimmen, wie kationische Liposomen und Lipid-DNA-Komplexe aufgenommen wurden.
Methoden: Kleine, unilamellare, kationische DOTAP:Cholesterin-Vesikelliposomen, die mit Texas Red-DHPE markiert sind, wurden hergestellt. Liposomen-DNA-Komplexe wurden in einem Lipid: DNA-Gesamtverhältnis von 24:1 (nmol/μg) in 5% Glucose hergestellt, wobei 60 μg Plasmid-DNA in 300 μl verwendet wurden. Die Komplexe (300 μl) wurden in die Schwanzvenen von nicht narkotisierten transgenen RIP1-Tag2-C57BL/6-Mäusen und in nicht narkotisierte normale C57BL/6-Mäuse injiziert.
Vier Stunden nach der Injektion von Komplexen wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Nembutal narkotisiert. Das Gefäßsystem wurde durch die Perfusion von 1% Paraformaldehyd durch die aufsteigende Aorta fixiert und die luminale Oberfläche des Gefäßsystems wurde durch Perfusion von grün fluoreszierendem Lectin angefärbt, Thurston et al. (1996) Am J Physiol 271: H2547–2562. Ganze Gewebehäufchen oder Vibratomschnitte wurden in Vectashield eingebettet, und die Gefäße wurden mit Hilfe eines Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskops oder eines konfokalen Zeiss LSM 410 Mikroskops, das mit einem Krypton-Argon-Laser ausgestattet und mit Fotoverdopplerröhren optimiert war, untersucht. Die Bilder wurden auf Kodak Ektachrome Filmen (ASA 400) oder als digitale konfokale Bildaufzeichnungen aufgenommen.
Ergebnisse: Das Experiment zeigte klar die begierige Aufnahme der Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexe durch angiogene Endothelzellen in Pankreastumoren der RIP1-Tag2-Mäuse. Die Aufnahme durch Tumorgefäße überstieg bei Weitem die Aufnahme dieser Komplexe durch die korrespondierenden Endothelzellen normaler Pankreasinseln (vergleiche die 3 und 4).
Die Tumore konnten aufgrund der starken Markierung ihrer Blutgefäße mit den rot fluoreszierenden Liposomenkomplexen leicht von benachbarten Geweben unterschieden werden. Die Geometrie des Gefäßsystems der Tumore war variabel und reichte vom Muster typischer normaler Inseln bis zu einem dichten gewundenen anastomosierenden Netzwerk sinusförmiger Gefäße, die auffallend größer und dichter gepackt waren als in normalen Inseln. In letzterem Fall erinnerte das Gefäßsystem an das von Gelbkörperchen. Die Markierungsintensität von Tumorgefäßen stand annähernd im Verhältnis zu der Größe des Tumors. Die größten Tumore wiesen am meisten Markierung auf.
Einige Blutgefäße in kleinen bis mittelgroßen Tumoren hatten stummelartige, fokale Aneurysma-ähnliche Protrusionen. Diese Stellen waren besonders auffällig, da ungewöhnlich zahlreichere Texas Red-markierter Punkte vorhanden waren, von denen angenommen wurde, dass es sich um Endosomen handelt. Die Texas Red-Markierung dieser Stellen war stärker als die benachbarter Gefäße. Es schien, dass es sich bei diesen Strukturen um kapillare Auswachsungen handeln könnte. Die Strukturen wurden in großen Tumoren, die ein dichtes komplexes Gefäßsystem aufwiesen, nicht gefunden, wo die Gefäße gleichmäßig stark markiert waren.
Es gab keine Anzeichen einer Extravasation Texas Red-markierter Komplexe in Tumoren. In den Anhäufungen extravaskulärer Erythrozyten in den Tumoren wurden ebenfalls keine Texas Red-markierten Komplexe gefunden. Die starke Markierung des Tumorgefäßsystems erinnerte an das von ovarialen Gelbkörperchen während der frühen Phase ihrer Entwicklung.
BEISPIEL 4
Aufnahme kationischer Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe durch angiogene Blutgefäße in Tumoren und bei chronischer Entzündung
Ziel: Experimente wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden durchgeführt, um die Beobachtungen auf andere Angiogenesemodelle auszuweiten. Diese Experimente beschäftigten sich auch mit der Frage, ob DNA vorhanden sein muss, damit kationische Liposomen angiogene Blutgefäße ansteuern. Vier Angiogenese-Tiermodelle wurden daraufhin untersucht, ob eine bevorzugte Aufnahme von DOTAP:Cholesterin-Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe durch angiogene Blutgefäße erfolgt.
Modelle: RIP1-Tag2-Tumormodell. Transgene C57BL/6-Mäuse wurden produziert und bei ihrer Geburt durch PCR-Analyse phänotypisiert. Das Mäusemodell ist weiter oben beschrieben.
HPV-Tumormodell. Transgene HPV (menschlicher Papilloma-Virus)-Mäuse wurden produziert und bei Geburt durch PCR-Analyse phänotypisiert. Nicht transgene Tiere des Wurfs wurden als Kontrollen verwendet. In diesem Modell wird das Onkogen des menschlichen Papilloma-Virus durch eine Region des Keratin 14-Promotors angetrieben. Wenn dieses Konstrukt in das murine Genom eingebaut wird, induziert es insbesondere in epidermalen Zellen HPV-Expression. Alle transgenen Mäuse entwickeln Dysplasien, die von Angiogenese in der Haut der oberen Brust und der Ohren begleitet wird, und ein kleiner Teil entwickelt Tumore.
Mycoplasma pulmonis-Infektionsmodell in Ratten. Ebenso wie bei Mäusen verursacht diese Infektion eine chronische Atemwegserkrankung, wobei ein Merkmal dieser Erkrankung Angiogenese in der Atemwegsmucosa ist. Nach dem Narkotisieren (40 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin, intraperitoneal injiziert) wurden pathogenfreie 8 Wochen alte männliche Wistar-Ratten (von Charles River) täglich an drei aufeinander folgenden Tagen intranasal mit Mycoplasma pulmonis des 5782C4-Stamms in einem Volumen von 200 μl inokuliert. Pathogenfreie Ratten, die mit Nährlösung inokuliert wurden, dienten als Kontrollen. Infizierte Ratten und Kontrollratten wurden getrennt voneinander unter Barrierebedingungen in Käfigen gehalten. Die Serumwerte von Antikörpern gegen M. pulmonis und andere Pathogene wurden am Ende des Experiments gemessen (Microbiological Associates, Bethesda MD).
Methoden: Kationische DOTAP:Cholesterin-Liposomen, die mit Texas Red-DHPE markiert waren, wurden hergestellt wie unter Beispiel 3 beschrieben. Die Liposomen wurden in eine Schwanzvene der Mäuse injiziert, in einer Dosierung von 360 nmol Lipid gesamt, in einem Volumen von 100 ml, in 5% Glucose. Ratten wurden über die Oberschenkelvene injiziert. Liposomen-DNA-Komplexe wurden bei einem Gesamtverhältnis von Lipid:DNA von 24:1 in 5% Glucose hergestellt, wobei 60 μg Plasmid-DNA in 200–300 μl verwendet wurden. Liposomen oder Komplexe (200–300 μl) wurden in eine Schwanzvene nicht narkotisierter RIP-Tag2-, HPV- oder M. pulmonis-infizierter Mäuse injiziert. Nicht transgene oder pathogenfreie Tiere wurden entsprechend als Kontrollen verwendet.
Nach 20 Minuten oder 4 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse oder Ratten durch eine intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Nembutal narkotisiert. Das Gefäßsystem wurde durch Perfusion von 1% Paraformaldehyd durch die aufsteigende Aorta fixiert und die luminale Oberfläche des Gefäßsystems wurde durch Perfusion mit grünem fluoreszierenden Lectin angefärbt, Thurston et al. (1996), Am. J. Physiol. 271: H2547-2562. Ganze Gewebehäufchen oder Vibratomschnitte wurden in Vectashield eingebettet, und die Gefäße mit einem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop untersucht.
Die aufgenommene der Menge an fluoreszierenden Liposomen oder Komplexen wurde durch konfokale Mikroskopie quantifiziert. Kurz gefasst wurde eine Serie von 12 konfokalen Bildern, die einen Abstand von 2,5 μm in der Fokalachse (z) aufweisen, im rostralen Bereich der Luftröhre in den Fluorescein- und Texas Red-Kanälen gesammelt, wobei eine 20 × NA 0,6 Linse (Zeiss) und Standardeinstellungen für die konfokale Lochblende, den Photomultiplierröhrenwert und die Laserenergie verwendet wurden. Von den Bildserien wurden Projektionen hergestellt, die die Gefäße (Fluorescein-L. esculentum) und Liposomen (Texas Red) getrennt zeigen. Unter Verwendung der konfokalen Software wurden Bereiche mit einer Fläche von etwa 200 μm² auf den Bildern der Gefäße bestimmt und anschließend wurde die durchschnittliche Fluoreszenz der korrespondierenden Bereiche der Bilder der Liposomen gemessen. Die Hintergrundintensität wurde bestimmt, indem die Fluoreszenz in ausgewählten Regionen, die benachbart zu den Gefäßen liegen, gemessen wurde. Die Messungen wurden an 25 Gefäßen pro Luftröhre und 4 Luftröhren pro Gruppe (n = 4) durchgeführt. Die Signifikanz der Unterschiede wurde durch den Student's t-Test bestimmt.
Die Gewebe, die für die Transmissionselektronenmikroskopie präpariert wurden, wurden wie zuvor beschrieben weiter verarbeitet, McDonald (1994) Am. J. Physiol. 266: L61–L83. Kurz gefasst erfolgte zunächst eine Perfusion des ersten Fixativums (3% Glutaraldehyd in 75 mM Cacodylatpuffer, pH 7,1, mit 1% Saccharose, 4% PVP, 0,05% CaCl₂ und 0,075% H₂O₂) für 5 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend eine Perfusion des sekundären Fixativums (3% Glutaraldehyd in 75 mM Cacodylatpuffer, pH 7,1, mit 0,05% CaCl₂, 1% Saccharose und 4% PVP) für 5 Minuten. Die Gewebe wurden für die Fixierung in situ für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen, dann entnommen und über Nacht bei 4°C in sekundärem Fixativum belassen. Die Gewebe wurden mit einer Rasierklinge zurecht geschnitten oder mit einem Gewebeschneider in Scheiben geschnitten, in Osmium postfixiert (2% OsO₄ in 100 mM Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 18 Stunden bei 4°C), in H₂O gewaschen (18 Stunden bei 4°C) und en block mit Uranylacetat (wässrig, 37°C für 48 Stunden) angefärbt. Das Gewebe wurde anschließend mit Aceton dehydriert, infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. Ultradünnschnitte wurden mit einem Ultramicrotom geschnitten, auf Einzelschlitzprobengitter eingebettet und mit einem Zeiss EM-10 Elektronenmikroskop untersucht.
Ergebnisse: Die Experimente zeigten, dass Texas Red-markierte DOTAP: Cholesterin-Liposomen in der Abwesenheit von DNA selektiv angiogene Endothelzellen von Tumoren in RIP1-Tag2-Mäusen ansteuerten, ähnlich wie vorhergehende Befunde mit Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-DNA-Komplexen und Dil-markierten DDAB:Cholesterin-DNA-Komplexen. Dieses und nachfolgende Experimente mit transgenen RIP1-Tag2-Mäusen bestätigten, dass die Aufnahme kationischer Liposomen durch angiogene Blutgefäße hyperplastischer Inseln und Tumoren die Aufnahme der korrespondierenden normalen Gefäße weit überstieg (5, 6, 7 und 8). In einigen Gefäßen hyperplastischer Inseln und kleiner Tumore wurden Liposomen nur in fokalen Bereichen durch Endothelzellen aufgenommen (8), wohingegen in größeren Tumoren die Aufnahme allgemeiner war (6). Fokale Aufnahmebereiche wurden als mögliche Stellen eines neuen Gefäßwachstums vermutet (8).
Da diese Eigenschaft kationischer Liposomen oder Liposomen-DNA-Komplexe den potenziellen praktischen Nutzen einer selektiven Verabreichung von Substanzen an angiogene Endothelzellen aufwies, schien es erstrebenswert zu bestimmen, ob Endothelzellen anderer Stellen pathologischer Angiogenese diese Eigenschaft angiogener Endothelzellen in Tumoren teilen. Auf diese Frage wurden Experimente gerichtet, bei denen die Aufnahme von Texas Red-markierten DOTAP:Cholesterin-Liposomen durch angiogene Endothelzellen untersucht wurde, in der Luftröhre von Mäusen mit einer Mycoplasma pulmonis Infektion, die eine chronische Atemwegsentzündung, die das Merkmal Angiogenese aufweist, hervorruft (vergleiche 9 und 10). Es wurde gefunden, dass angiogene Endothelzellen in Bereichen einer chronischen Entzündung Orte einer ungewöhnlich hohen Aufnahme kationischer Liposomen waren (10). Insbesondere Gefäße in den Luftröhren von Mäusen, die mit M. pulmonis infiziert waren, zeigten eine ungewöhnlich hohe Aufnahmemenge. Konfokale mikroskopische Messungen angiogener Blutgefäße zeigten, dass die infizierten Mäuse eine 20–30fach höhere Aufnahme zeigten als Kontrollen (11). Einige angiogene Gefäße zeigten eine 100fach höhere Aufnahme. Konfokale mikroskopische Untersuchungen und elektronenmikroskopische Untersuchungen angiogener Endothelzellen in Mäusen, die mit M. pulmonis infiziert waren, legten nahe, dass kationische Liposomen zuerst mit Endosomen assoziieren (12) und dann von diesen internalisiert werden (13).
Ähnlich wurden kationische Liposomen begierig durch angiogene Blutgefäße in ovarialen Follikeln und Gelbkörperchen in Mäusen, durch dysplastische Haut transgener HPV-Mäuse und Luftröhren von Ratten mit Angiogenese aufgrund einer M. pulmonis-Infektion, aufgenommen.
Schlussfolgerungen: Diese Experimente bestätigten, dass kationische Liposomen und Liposomen-DNA-Komplexe bevorzugt angiogene Endothelzellen von Tumoren und chronische Entzündungsstellen ansteuern.
BEISPIEL 5
Aufnahme kationischer Liposomen, die Paclitaxel enthalten, durch angiogene Blutgefäße bei chronischer Entzündung
C3H/HeN-Mäuse wurden mit Mycoplasma pulmonis infiziert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Pathogenfreie Mäuse dienten als Kontrollen. Infizierte Mäuse und Kontrollmäuse wurden getrennt voneinander unter Barrierebedingungen in Käfigen gehalten. Sieben Tage nach Infektion wurde den Mäusen intravenös eine Formulierung kleiner unilamellarer Liposomen, die aus DOTAP:EierPC:Rhodamin DHPE:Paclitaxel zusammengesetzt waren (molares Verhältnis 50:47:1:2) in einem Volumen von 150 μl injiziert (150 μl Schwanzveneninjektion einer 10 mM Lösung von Lipid gesamt (einschließlich Paclitaxel), Gesamtdosis 26 μg Paclitaxel per Maus). Zwanzig Minuten nach Injektion der Liposomen wurden die Mäuse intravenös mit Fluorescein-markiertem Lycopersicon esculentum Lectin injiziert, um Endothelzellen im ganzen Körper zu markieren. Direkt danach wurden die Mäuse mit Fixativum durch das Gefäßsystem perfundiert, wie in Beispiel 4 beschrieben. Auf diese Weise konnten kationische Liposomen durch ihre rote Fluoreszenz und Blutgefäße durch ihre grüne Fluoreszenz identifiziert werden. Die aufgenommene Menge an fluoreszierenden Paclitaxel-enthaltenden Liposomen wurde durch konfokale Mikroskopie von Gewebesektionen, wie in Beispiel 4 beschrieben, quantifiziert.
Ergebnisse: Die Untersuchung der Gewebe in pathogenfreien Mäusen zeigte, dass die Paclitaxel-haltigen kationischen Liposomen begierig durch Endothelzellen der Luftwegsblutgefäße in Luftröhren infizierter Mäuse aufgenommen wurden. In Blutgefäßen der Luftröhren nicht infizierter Mäuse wurde eine geringe Aufnahme beobachtet, wie in 14 dargestellt. Diese Beobachtungen bestätigten, dass Paclitaxel-haltige kationische Liposomen dieselben Zielsteuerungseigenschaften besitzen wie kationische Liposomen ohne Paclitaxel.

Claims

Kationisches Liposom, umfassend: mindestens ein kationisches Lipid in einer Menge von mehr als 5 Mol% und gegebenenfalls mindestens ein neutrales Lipid, dadurch gekennzeichnet dass, ein Taxan in einer Menge von weniger als 20 Mol% enthalten ist.
Liposom nach Anspruch 1, umfassend ein Taxan in einer Menge von 0,5 Mol% bis 20 Mol%, bevorzugt von 2 Mol% bis 10 Mol% und besonders bevorzugt von 1 Mol% bis 5 Mol%.
Liposom nach Anspruch 1 oder 2, umfassend mindestens ein kationisches Lipid in einer Menge von 20 Mol% bis 99 Mol%, bevorzugt von 40 Mol% bis 98 Mol%.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend mindestens ein neutrales Lipid in einer Menge von 1 Mol% bis 80 Mol%, bevorzugt von 2 Mol% bis 50 Mol% und besonders bevorzugt von 40 Mol% bis 50 Mol%.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend Taxan-Kristalle in einer Menge von weniger als 10%, bevorzugt von weniger als 5%, besonders bevorzugt von weniger als 2% und am meisten bevorzugt von weniger als 0,5%.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Taxan ein pharmazeutisch annehmbares Derivat ist und ausgewählt ist aus Paclitaxel, Docetaxel, einem 10-Desacetyl Analogon von Paclitaxel, einem 3'N-desbenzoyl-3'N-t-butoxycarbonyl Analogon von Paclitaxel, einem Galactose- oder Mannose-Derivat eines Taxans, einem Piperazin-Derivat eines Taxans, einem 6-Thio- oder einem Sulfenamid-Derivat eines Taxans und einem an eine hydrophobe Einheit gebundenen Taxan.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Taxan Paclitaxel ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 6 worin das Taxan Docetaxel ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Liposom unilamellar ist und einen Durchmesser im Bereich von 20 nm bis 400 nm, bevorzugt von 50 nm bis 300 nm aufweist.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Taxan in einer Lipid-Doppelschicht des Liposoms enthalten ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Taxan in einem wässrigen Kompartiment des Liposoms enthalten ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiter umfassend eine nachweisbare Markierung.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die nachweisbare Markierung eine radioaktive Markierung, eine fluoreszierende Markierung, eine histochemisch oder immunhistochemisch nachweisbare Substanz oder ein nachweisbarer Farbstoff ist.
Liposom nach Anspruch 1, worin das Liposom DOTAP, DOPC und Paclitaxel in einem molaren Verhältnis von 50:47:3 umfasst.
Verwendung eines kationischen Liposoms nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer angiogenetischen Erkrankung.
Verwendung eines kationischen Liposoms nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verringerung der Bildung atherosclerotischer Plaques.
Verwendung eines kationischen Liposoms nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, worin das Liposom mittels Injektion in das Kreislaufsystem verabreicht wird.