KR20030038530A

KR20030038530A - 탁산의 맥관형성 혈관으로의 양이온성 리포좀 송달

Info

Publication number: KR20030038530A
Application number: KR1020027003179A
Authority: KR
Inventors: 맥도날드도날드엠.; 맥린존더블유; 써스톤오가빈
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2003-05-16
Also published as: CN1378443A; ZA200201555B; CZ2002850A3; CA2383412A1; WO2001017508A1; EA200200229A1; HUP0202669A3; KR100591767B1; EP1210065B1; AU7122900A; EA005923B1; MXPA02002579A; JP4848113B2; EE200200127A; CN1235567C; DE60027730D1; WO2001017508A9; ATE324867T1; IL148372A0; IL148372A

Abstract

맥관형성 내피세포는 선택적으로 지질/DNA 복합체 또는 표적화된 세포의 성장을 억제하거나 촉진함에 의해 영향을 미치는 물질을 함유하는 양이온성 리포좀을 선택적으로 표적화한다. 맥관형성 부위는 검출가능한 라벨을 함유하는 양이온성 리포좀을 투여하여 정확하게 위치가 정해질 수 있다. 그 복합체는 맥관형성 내피세포의 분위기에서 선택적으로 및 전적으로 활성화되는 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 구조를 포함할 수 있다.

Description

탁산의 맥관형성 혈관으로의 양이온성 리포좀 송달{CATIONIC LIPOSOME DELIVERY OF TAXANES TO ANGIOGENIC BLOOD VESSELS}

본 발명은 다양한 질환 및 이상(abnormality)의 치료 및 진단에 적용될 수 있다. 본 발명은 암, 창상치유, 그리고 다양한 만성 염증성 질환에 사용될 수 있지만 그에 한정되지 않는다. 현재 일반적으로 암조직을 수술제거하고, 창상을 봉합하고, 염증이 일어나는 관절부를 수술제거하는 것과 같은 물리적인 수단으로 각각을 직접 치료한다. 또한, 각각 화학적 수단으로 치료할 수 있다. 암치료에 화학요법이 적용되고, 창상치료에는 성장 호르몬을 적용하며, 만성 염증 상태 치료에는 항-염증 약물을 적용한다. 이들 및 관련 치료법들은 일반적으로 암성 조직, 손상 조직, 염증 조직을 직접 치료하는 것에 관련된다. 본 발명의 종래의 치료 모달리티와 어떻게 다른지 이해를 돕기 위해, 이러한 기술분야에서의 현재의 치료 기술의 간단하고 일반적인 설명이 제공된다.

암 치료

용어 "암"은 치료, 예후, 치료가능성이 다양한 광범위한 질환들을 포함한다.진단 및 치료는 종양이 발생한 부위, 퍼진 정도, 연루된 부위, 환자의 생리적 상태, 그리고 예후에 따라 접근법이 달라진다. 일단 진단되면, 종양은 보통 "단계"를 정하는데, 그것은 수술, 물리적 검사, 조직병리학, 영상, 그리고 실험실 평가의 기술을 이용하여, 질환의 정도를 결정하고, 치료 가능성이 줄어드는 순서로 암 환자 집단을 그룹으로 나누는 과정이다. 그러한 시스템은 환자에 대한 치료를 계획하고 예후를 결정하는데 사용한다(Stockdale (1996) "암 환자를 돌보는 원리", In: Scientific American Medicine, vol. 3, Dale, D. C., and Federman, D. D. (eds.), Scientific American Press, New York). 암의 종류 또는 단계로 세 종류의 일반적인 치료법(수술, 방사선 요법, 그리고 화학요법)중에서 어느것을 사용할 것인지 결정할 수 있다. 적극적이며, 조합된 모달리티 치료 계획 또한 선택할 수 있다. 이 목적을 위해서, 주 종양을 수술로 제거하고, 남아 있는 세포를 방사선 요법 또는 화학요법으로 치료한다. Rosenberg (1985) New Engl. J. Med.

수술은 암의 진단 및 치료에 있어 중심적인 역할을 한다. 일반적으로, 수술적 접근법은 생체검사에 필요하며, 대부분의 암 환자에 수술은 결정적인 치료법일 수 있다. 수술은 또한 종양의 크기를 줄이고, 전이를 절제하고, 의학적 응급상태를 해결하고, 고식(姑息)하고, 재활하는데 사용될 수 있다. 암 치료를 위한 주요한 수술 기법은 종양을 눈으로 직접 보면서 절개하는 수술 분야의 개발을 포함하지만, 현재의 기법은 내시경 수단으로 약간의 절개를 수행한다. 암 치료법에 있어 주요한 관심사는 수술 위험의 고찰이다(Stockdale, F., 상기 참조).

방사선 요법은 암의 주 치료 및 고식 치료에 있어 중요한 역할을 한다. 원격치료법(메가 볼트 방사선 요법) 및 단기요법(:조직사이 및 강내 방사선 조사)가 통상 사용된다. x-레이 형태의 전자파 방사선을 일반적인 악성 종양 치료에 가장 일반적으로 사용하며, x-레이와 유사하지만, 라듐, 코발트 및 다른 원소들의 방사성 동위원소에 의해 방출되는 전자파 방사선 형태인 감마 레이도 사용된다. 방사선 요법은 에너지를 광량자라고 불리우는 분리된 에너지 패킷으로서 조직에 에너지를 전달하여 세포내에서 이온화하여 악성 및 정상의 조직을 이온화하여 파괴한다. 이온화의 표적은 가장 일반적으로는 DNA이며; 방사선 요법은 악성조직과 비악성조직 간에 방사선 파괴의 정도가 균일하지 않다는 것을 이용한다(잠재성 세포 보다는 빠르게 분할하는 세포들이 DNA 파괴에 보다 민감하다)(Pass (1993) J. Natl. Cancer Instit. 85: 443-56.). 방사선 요법은 특유한 이점과 중요한 독성이 수반된다. 방사선 요법은 특정 해부학 분야에서 바람직하며(예를들면, 종격(縱隔)), 방사선 요법이 유일하게 실행가능한 국소적 치료 방법일 수 있으며, 또한 연루된 종양의 범위가 광범위하다면, 방사선 요법이 유일하게 실행가능한 국소적 모달리티일 수 있다. 또한 방사선 요법은 환자가 수술을 받을 수 없거나, 환자의 의료적 상태로 인해 수술절차를 진행시킬 수 없을때 사용할 수 있다. 방사선 요법은 방사선 초기 효과 및 말기 효과로 이르게할 수 있는 조직 파괴를 포함한다. 초기 효과 (방사선 요법의 급성 독성)는 피부의 홍반, 박리, 식도염, 구역, 탈모증, 그리고 척수억제를 포함하며, 말기 효과는 조직 괴사 그리고 섬유증을 포함하며, 일반적으로 방사선 요법의 한계 독성을 결정한다(Stockdale, F., supra).

현재 사용되는 거의 모든 화학요법제는 DNA 및 RNA 합성 전구체를 갖추어DNA합성 또는 유사분열에 개재하므로써, 증식 세포를 표적으로 한다(Stockdale, F., "Cancer growth and chemotherapy,"supra). 동물 종양 조사 및 인간 임상 시험은 약제를 조합하여 사용하는 것이 단일 약제보다 더 높은 비율로 목적에 부합하여, 더 오래 생존한다는 것을 보여준다(Frei (1972) Cancer Res. 32: 2593-2607). 약물 조합 치료요법은 멀티 드러그(알킬화제, 항대사물질, 및 항생제 포함)의 다른 활성 메카니즘과 세포독성 포텐셜 메카니즘을 사용한다(Devita, et al. (1975) Cancer 35: 98-110). 환자의 생리적 상태, 종양의 성장 특성, 종양 세포 군의 이종성, 및 종양의 멀티드러그 저항 상태는 화학요법의 효율에 영향을 미친다. 일반적으로 화학요법은 사용되지 않으며(비록 이러한 기술들이 개발되고 있지만, e. g. Pastan (1986) Cell 47: 641-648), 그리고 골수 기능 억제, 위소장염, 구역, 간 또는 허파 손상, 또는 불임증과 같은 부작용이 발생할 수 있다.

창상 치유

창상 치유는 다양한 생화학적 폭포상 반응을 잘 조절하는 것을 필요로 하는 많은 다른 세포 타입의 재생과정을 조화시키는 것을 포함하는, 복합적이며 시간이 오래 걸리는 조직 회복 및 재모델링과정이다. 창상 치유는 일반적으로 세 단계(염증, 증식, 및 화농)로 나누어진다(Waldorf, et al. (1995) Adv. Dermatol. 10: 77-96). 그 과정은 다른 세포 타입을 창상 부위로 이동시키는 단계, 상피 세포 및 섬유모세포의 성장을 자극하는 단계, 새로운 혈관을 형성하는 단계, 그리고 세포외 기질을 발생시키는 단계를 포함한다. 이러한 과정이 올바르게 작용하는 것은 다양한 사이토카인의 생물학적 활성에 달려있다(Bennett, et al. (1993) Am. J. Surg.165: 728-37). 영양, 면역계, 산소, 혈액량, 감염, 면역억제, 그리고 적혈구감소는 모두 창상 치유에 영향을 미치는 인자이다(Witney, (1989) Heart Lung 18: 466474).

창상 치유의 특성과 속도는 보통 원래의 부상 종류 및 정도에 의존한다. 창상을 치료하는데에는 일반적인 세 타입의 과정을 사용하고, 각각의 단계는 손상된 조직 치유로 직결된다. 창상을 닫는데에는 테이프, 스테이플, 또는 전기소작기(電氣燒灼器)도 사용될 수 있지만, 가장 일반적으로는 봉합을 이용한다(Wheeless, C. R, 1996, Wheeless'Textbook of Orthopaedics) (Garrett, et al. (1984) J. Hand. Surg. 9 (5): 683-92). 피부 테이프 및 다양한 봉합은 창상의 1 차 폐쇄에 있어서 각각 일정한 이익과 불이익을 보인다. 피부 테이프는 염증반응을 덜 일으키지만, 상피하 창상 공간을 닫기에는 모자라며, 다양한 봉합에 의해 발생되는 염증 반응 및 그 후의 상처는 봉합 바늘, 봉합 물질의 지름, 그리고 단일 필라멘트 또는 직물 봉합인지 여부에 달려있다(Simpson, (1977) Laryngoscope 87: 792-816).

창상에서, 미생물 접종 규모, 미생물 독성, 그리고 숙주 항미생물 방어 메커니즘으로 감염이 진전될 것인지를 결정한다. 그러므로, 창상의 치료법에 있어서 항생물질도 치료요법적인 가치를 가질수 있다(Edlich, (1986) Emergency Medical Clinics of North America 4 (3): 561-80). 적당한 항생물질과 그것의 투여 경로를 선택하고, 부작용을 피하기위해, 각각의 항생물질에 대한 제약학적 활성이 이해되어야 한다(Simpson, supra). 최근의 연구결과는 항생물질 치료요법이 세포증식과 분화를 더욱 빠르게 진전시키며, 그 결과 창상 치료를 증강시키는데 도움이될수 있다는 것을 제시 한다(Barrow, et al. (1994) Respiration 61: 231-5; Maeder, et al. (1993) Paraplegia 31: 639-44). 또한 단백질분해효소도 감염된 창상의 행생물질 치료법에 사용되어 왔다(Rodeheaver, et al. (1978) Am. J. Surg. 136 (3): 379-82). bFGF, EGF, PDGF, 및 TGF-베타의 단독 또는 조합을 포함하는 다양한 사이토카인을 국부적으로 투여하여 창상치료를 상당히 가속화시킬 수 있다(Moulin, (1995) Eur. J. Cell. Biol. 68: 1-7). 성장 인자는 세포를 창상으로 유인하고, 그들의 증식을 자극하며, 세포외 기질 누적에 대해 대단한 영향을 미친다. 재조합 기술에 의해 이들 사이토카인을 대량 생산기술을 발달시켜온 이래, 많은 연구들은 성장 인자가 정상 및 손상 치료 모델에 있어 모든 면의 조직 회복을 증강시킬 수 있다는 것을 증명하였다(e. g., Schultz, et al. (1987) Science 235: 350-2; Deuel, et al. (1991) Annu. Rev. Med. 42: 567-84). 비록, 예비 임상 실험은 성장 인자 치료법이 때때로 조직 회복에 있어 통계적으로 현저하게 개선시킨다는 것을 보여주지만, 이들 결과가 임상적으로 현저한 것인지는 분명하지 않으며, 새로운 임상 실험은 특정 손상 치료 타입의 성장인자를 목적으로 촛점을 맞추어야 함을 제안하고 있다(Greenhalgh, (1996) J. Trauma 41: 159-67).

만성 염증

자연 면역, 체액성 면역 및 세포성 면역 메커니즘이 만성 염증 질환 발병에 관련이 있다(Seymour, et al. (1979) J. Oral Pathol. 8: 249-65). 자가면역 질환은 림프구 기능 이상으로 부터 기인한다. T 세포 기능의 이상은 세포-매개 면역을 통한 질환을 초래할 수 있고, 항체 생산에 있어서 보조 T 세포의 활성은 자가항체형성에 기여할 수 있다. 자가면역 질환에 있어서 보조 T 세포의 중심적인 역할은 특정 HLA 분자를 갖는 이러한 많은 질환들의 연합에 의해 지지 된다. 내성의 지속에 있어 하나 이상의 단계에서의 파손은 자가면역을 초래할 수 있다(Robinson (1996)"Immunologic Tolerance and Autoimmunity,"in: Scientific American Medicine, Vol. 2, Section VI, Scientific American Press, New York, p. 1-11).

자가면역 질환에는 몇가지 타입의 치료법이 사용되며, 그들 모두는 이환 조직의 면역 반응을 줄인다. 예를들면, 자가면역 질환인 류마티스양관절염의 치료법은 비스테로이드성 항염증제(NSAID) 또는 당질코르티코스테로이드와 같은 항염증제, 금 염과 같은 관해유도제(寬解誘導劑), 및/또는 시클로포스파미드와 같은 면역억제 약물를 사용할 수 있다. 염증 과정중에 손상된 관절을 교체하는데 정형외과학이 사용될 수 있다(see Gilliland, B. C., and Mannik, M., 1983,"Rheumatoid Arthritis"In: Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, P. 1977-1984). 최근의 작업은 류마티스양관절염의 치료법에 있어서 TNFa를 사용하는 것과 같이, 이환 조직에 또한 연결되는, 새로운 치료법에 대한 가능성을 제시하였다(Brennan, etal. (1995) Br. Med. Bull. 51: 368-384).

"알레르기"는 주변 항원에 대한 면역 반응이 조직 염증 및 기관 기능장애를 일으키는 상태를 언급한다. 자가면역 질환에서처럼, 그 자료는 알레르기 질환에서의 몇가지 면역계 성분의 상호작용을 제시한다. 다양한 알레르기성 질환의 발현은 다른 면역 작동인자 메카니즘으로부터 기인하며, 그것은 특이성 조직 손상 패턴을 불러 일으킨다(Beer, et al. (1996) "알레르기" In: Scientific AmericanMedicine, Vol. 2, Section VII, Scientific American Press, New York, P. 1-29). 각각의 알레르기성 질환의 임상적 모습은 이환 기관 또는 조직에서 면역적으로 매개되는 염증성 반응을 반영한다(예를들면, 천식은 기도에서의 염증반응을 반영한다).

면역-매개 알레르기성 질환을 치료하는데에는 몇가지 치료 전략이 사용되며, 그러한 치료 전략은 염증 조직에서의 면역 반응을 줄이는 것으로 직결된다. 예를들면, 천식의 치료법에는 환경 조절, 약물요법 그리고 알레르겐 면역요법이 포함될 수 있다.(Beer, et al. (1996) "알레르기" In: Scientific American Medicine, Vol. 2, Section VII, Scientific American Press, New York, pp. 1-29). 천식의 치료법에 있어서, 병원체를 제거하여 성공적으로 염증을 방지한다. 그러나, 종종 이러한 수단은 불가능하기 때문에 몇가지 종류의 약물이 사용되어 왔다. 이러한것들은 (기관지확장에 대해서는)메틸크산틴, 아드레날린 자극제(아드레날린 수용체, 기관지확장제 자극), 당질코르티코이드(허파에서의 염증을 줄임), 크로몬 (비만세포를 하향조절하고, 허파에서의 염증을 줄임), 그리고 항콜린제(기관지확장제)를 포함한다 (McFadden, et al.,"면역 및 환경 상해에 의한 폐질환"In: Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, p. 1512-1519). 짐작되는 알레르겐의 추출물을 사용한 탈감각 또는 면역요법은 또한 천식에서의 염증을 줄이기 위해 제안 되어 왔다(McFadden and Austen, op. cit; Jacquemin and Saint-Remy (1995) Ther. ImmunoL 2: 41-52).

죽상경화성 플라크

죽상경화증은 동맥혈관 내강이 플라크 층(지방성 및 섬유성 조직)으로 인해 점점 좁혀지는 것이다. 주요한 죽상경화증 합병증은 허혈성 심질환, 심근 경색증, 뇌졸중, 그리고 사지의 괴저를 포함하며, 미국 연간 사망율의 절반 이상에 달한다.

동맥은 세가지 층, 즉, 내부 탄성층의 내강쪽의 내피와 연결조직를 포함하는 혈관내막; 민무늬근 세포 및 탄성동맥내 탄성섬유 그리고 대형 혈관내 맥관벽 혈관을 포함하는 중막;그리고 혈관벽의 외부 층이며, 섬유모세포, 소형 혈관 및 신경의 연결 조직초 조성물을 포함하는 외막으로 이루어져 있다. 죽상경화증은 어떠한 동맥에서도 일어날 수 있다. 죽상경화증은 관상동맥에서는 심장 마비로 이를 수 있으며; 대뇌동맥에서는 뇌졸중으로; 그리고 말초 동맥에서는 사지의 괴저로 이를 수 있다. 죽상경화증은 복잡한 과정이며, 정확히 어떻게 발병되고 무엇이 발생시키는지가 알려지지 않았다. 그러나, 내피세포 손상이 죽상경화성 병변 형성에 있어 개시단계라고 믿어지며, 혈행역학적 근육강직, 고콜레스테롤혈증, 고혈압증, 또는 면역 복합 질병에 의해 유발 될 수 있다. 내피세포 손상은 콜레스테롤 및 지질 축적, 내막 비후, 민무늬근 세포 증식, 그리고 연결조직 섬유 형성으로 이른다. 서서히, 지방 축적물이 쌓이고 민무늬근 세포가 증식하면 결국 동맥을 좁히고 막는 플라크를 형성을 초래한다.

인간 죽상경화성 병변 내막내 신혈관화를 지금까지 설명하였지만, 죽상경화증 진전에 있어 그것이 미치는 역할은 확실하지 않다. Moulton, et al. (1999) Circulation 99: 1726-1732 ; Isner (1999) Circulation 99: 1653-1655; Depre, et al. (1996) Catheterization and Cardiovascular Diagnosis 39: 215-220.

죽상경화증 및 관련 병리로 인한 사망율을 보면, 현재의 치료법이 부적절하다는 것이 명백하다. 죽상경화성 사건을 일으키는 가장 중요한 요소는 저밀도 지방단백질 형태로 콜레스테롤이 혈장에 고농축되는 것이다. 현재의 치료 방법은 콜레스테롤 합성을 억제하기 위해 간 효소 시스템을 억제하는 약물을 포함한다.

현재의 치료법-면역

상기 치료 방식은 성공율이 다양하였다. 많은 경우에 있어서 성공율이 완벽하지 않기 때문에, 보다 나은 치료법 개발을 위한 연구가 계속된다. 한가지 주목되는 연구 분야는 면역계에 영향을 미치는 것에 관한 것이다. 유전공학적 및/또는 화학적 자극을 사용하여, 예를들면 항체가 암 세포를 파괴하는 것과 같이, 신체 자신의 면역계가 질병을 치료하도록 면역 반응을 변형 및/또는 자극하는 것을 가능케한다. 이러한 타입의 치료법은 질병과 싸우기위해 생물학적 과정을 이용한다는 점에서 상기한 것들과는 다르지만, 여전히, 형성된 항체가 암세포를 직접 공격하는 직접적인 치료 수단이다.

본 발명은 암세포, 손상된 또는 염증 세포에 직접적으로 영향을 미치는 것을 포함하지 않는다는 점에서 보통의 치료법과는 근본적으로 다른 것을 포함하는 치료법을 이용할 수 있다.

다른 타입은 적어도 이론적으로, 맥관형성을 억제하여 맥관형성과 연관된 암 또는 염증의 치료를 가능하게 한다는 것을 인식하였다. 그러한 것과 관련하여 현재 고찰되는 전형적인 예는 PCT 공보 WO 95/25543(1995년 9월 28일 발행)이다. 공개된 이 출원은 맥관형성 내피세포 표면에 존재한다고 믿어지는 항원에 회합하는항체를 투여하여 맥관형성을 억제하는 것을 설명한다. 구체적으로는, 세포 접착이라고 일반적으로 말하는 세포-세포 및 세포-외인성세포 기질 상호작용을 매개한다고 믿어지는 막수용체인 α_γβ₃에 회합하는 항체를 투여하는 것을 설명한다. 이 치료법은 상기 수용체를 막아서 맥관형성을 억제하고, 암과 염증을 치료하는 치료법이다.

본 발명의 기술분야는 탁산의 혈관으로의 리포좀 송달, 그리고 구체적으로는 양이온성 리포좀 송달이다.

도 1 은 적형광의 CM-DiI로 라벨링된 정상의 마우스 난소내 여포의 맥관형성 혈관내의 DDAB:콜레스테롤-DNA복합체의 흡수를 보여주는 형광현미경사진이다(스케일 바: 60 ㎛);

도 2 는 적형광 CM-DiI-라벨링된 RIPl-Tag 5 마우스 췌장 종양 부위 내의 맥관형성 혈관내의 DDAB:콜레스테롤-DNA복합체의 흡수를 보여주는 형광현미경사진이다--혈관은 형광 렉틴으로 녹색으로 착색됨(스케일 바: 40 ㎛);

도 3 은 Taxas 적색-라벨링된 정상의 마우스 췌장 소도 혈관내의 DOTAP:콜레스테롤-DNA 복합체(옐로우-오렌지)의 흡수가 거의 없는 저배율 형광현미경사진이다 (스케일 바: 150 ㎛);

도 4 는 Taxas 적색-라벨링된 RIP1-Tag 2 마우스내 췌장 종양 혈관내의 DOTAP:콜레스테롤-DNA 복합체(옐로우-오렌지)의 흡수를 보여주는 저배율 형광현미경사진이다(스케일 바: 150 ㎛);

도 5 는 Taxas 적색-라벨링된 정상의 췌장 소도 혈관내의 DOTAP:콜레스테롤 리포좀(레드-오렌지)의 흡수가 거의 없는것을 보여주는 공초점 현미경사진이다. 형광 렉틴(녹색)으로 착색됨(스케일 바 50 ㎛);

도 6 은 Taxas 적색-라벨링된 RIP1-Tag 2 마우스내 췌장 종양의 혈관내의 DOTAP:콜레스테롤 리포좀(옐로우-오렌지)의 흡수 공초점 현미경사진을 보여준다. 리포좀이 정맥내 주사된 후 형광 리코퍼시콘 식용 렉틴(Lycopersicon esculentum lectin)을 살포하여 착색(스케일 바: 50 ㎛);

도 7 은 Taxas 적색-라벨링된 RIPl-Tag 2 마우스 내의 췌장 종양내의 DOTAP:콜레스테롤 리포좀 (레드-오렌지)의 흡수 공초점 현미경사진을 보여준다. 리포좀이 정맥내 주사된 후 형광 리코퍼시콘 식용 렉틴(Lycopersicon esculentum lectin)을 살포하여 착색(스케일 바: 50 ㎛);

도 8 은 Taxas 적색-라벨링된 RIPl-Tag 2 마우스 내의 췌장 종양내의 DOTAP: 콜레스테롤 리포좀 (레드-오렌지)의 흡수 공초점 현미경사진을 보여준다. 리포좀이 정맥내 주사된 후 형광 리코퍼시콘 식용 렉틴(Lycopersicon esculentumlectin)(그린)을 살포하여 착색. 혈관 성장 가능 부위는 강한 흡수를 보임(스케일 바: 50 ㎛);

도 9 는 Taxas 적색-라벨링된 무병원 마우스의 기관내 정상혈관내 DOTAP:콜레스테롤 리포좀 (레드-오렌지)의 거의 흡수되지 않은 공초점 현미경사진이다. 형광성 렉틴으로 녹색으로 착색(스케일 바: 50 ㎛);

도 10 은 Taxas 적색-라벨링된 미코플라즈마(Mycoplasma) 풀모니스 감염 마우스 기관내의 맥관형성 혈관내의 DOTAP:콜레스테롤 리포좀 (레드-오렌지)의 흡수 공초점 현미경사진이다.

도 11 은 정맥내 주사 4 시간 후, 리포좀 발광의 정도를 측정하여 산정된 무병원성(정상의) 혈관 및 미코플라즈마(Mycoplasma)풀모니스 감염 마우스 기관의 Texas 적색-DOTAP:콜레스테롤 리포좀 흡수량을 보여주는 그래프이다. Zeiss LSM 410 공초점 현미경으로 측정. 감염된 마우스는 M. 풀모니스 미생물로 비강으로 접종되었고, 4주후 검사. 별표는 통계적으로 현저한 차이를 나타낸다(P < 0.05, 평균 "SE, n = 4 마우스/군);

도 12 는 M. 풀모니스-감염 마우스 기관내 내피세포와 회합된 DOTAP:콜레스테롤 리포좀을 보여주는 투과 전자 현미경사진이다(스케일 바: 50 ㎛);

도 13 은 M. 풀모니스-감염 마우스 기관내 내피세포에 흡수된 DOTAP:콜레스테롤 리포좀를 보여주는 투과 전자 현미경사진이다(스케일 바: 80 ㎛).

도 14 는 양이온성 파클리탁셀 리포좀과 무병원성 마우스 기관(판넬 A) 및 M. 풀모니스- 감염 마우스 기관(판넬 B)의 내피세포의 회합을 보여주는 형광현미경사진이다

바람직한 구체예의 상세한 설명

본 발명 방법에 사용된 선택적으로 영향을 미치는/라벨링하는 맥관형성 내피세포 및 리포좀을 설명하기전에, 본 발명이 특별한 리포좀, 방법 또는 활성물질에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되므로, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특별한 구체예를 설명하기 위함이고, 그에 제한하도록 의도되지 않는다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된, 단수형 "한(a)" 및 "그(the)"는 문맥상 명확하게 단수형을 나타내지 않는다면, 복수형도 포함한다. 그러므로, 예를들어 "한 리포좀(a liposome)"은 그러한 리포좀 혼합물 및 다수의 그러한 리포좀을 포함한다. "한 제제(an agent)"는 다수의 제제 및 그들의 혼합물을 포함하며, "그 방법(the method)"는 본원에 기술된 한가지 이상의 방법 또는 단계를 포함한다.

본원에서 논의되는 공보는 본 출원의 출원일 이전 개시를 제공한다. 본원의 내용이 선행 발명 공보로 인해 본 발명이 시일이 늦었다는 것을 인정하는 것으로 곡해되어서는 안된다.

다르게 정의되지 않는다면, 본원에 기술된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업계의 당업자들에게 통상 이해되는 의미와 같다. 본원에 기술된 것들에 유사하거나 대등한 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기술된 것들 이다. 본원에 인용된 모든 공보는 그 공보가 인용된 발명의 구체적인 양태를 개시하고 설명할 목적으로 본원에 참고문헌으로포함된다.

정의

용어"치료", "치료하는", "치료하다" 등은 바람직한 제약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는것을 일반적으로 의미하도록 본원에서 사용한다. 그 효과는 질병 또는 그 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 점에서 예방적 효과일 수 있으며, 또는 질병 및/또는 그 질병에 기인한다고 생각되는 역효과에 대해 부분적으로 또는 완전히 안정시키거나 치료한다는 점에서 치료요법적 효과일 수 있다.

본원에 사용된 "치료"는 포유류, 구체적으로는 인간의 모든 질병의 치료를 포함하며,

(a) 질환 또는 증세에 걸릴 가능성이 있으나, 질환 또는 증세를 가지는 것으로 진단되지는 않은 환자에게 유발되는 질환 또는 증세를 방지하는 것;

(b) 질환 증세를 억제하는 것, 즉, 그것의 진전을 막음;또는

(c) 질환 증세를 완화하는 것, 즉, 질환 또는 증세의 회복 유도

를 포함한다.

본원에 사용된, "제약학적으로 허용가능한 염"은 모(母)화합물의 원하는 생물학적 활성은 보유하고, 독물학적으로 원치않는 효과는 없는 염을 말한다.

그러한 염의 예는 (a) 무기산으로 형성된 산첨가염, 예를들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산등; 그리고 예를들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말리산, 아스코르브산, 벤조산, 탄 산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 폴리갈락투론산과 같은 유기산으로 형성된 염; (b) 아연, 칼슘, 비스무스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트등과 같은 다가 금속 양이온을 갖는 염; 그리고 (c) N, N'-디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로로 부터 형성된 유기 양이온으로 형성된 염; 그리고 (d) (a) 및 (b) 또는 (c)의 조합, 예를들면 아연 탄네이트염;등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "맥관형성"은 새로운 혈관의 발달를 포함하는, 조직의 혈관화 과정을 말한다. 맥관형성은 다음의 세가지 메커니즘 중에서 하나를 통해 발생한다: (1) 신혈관화(새로운 혈관을 생성하기 시작하는 기존 혈관밖으로 내피세포의 이동); (2) 혈관발생(혈관의 전구 세포로 부터 새로 발생); 또는 (3)혈관 확장(작은 혈관의 지름이 확대되어 더 큰 혈관의 형성)(Blood, et al. (1990) Biochem Biophys. Acta. 1032: 89-118).

맥관형성은 보통의 신생아 성장 과정 및 황체 성장 주기중의 여성의 생식계에 있어 중요한 과정이다(see Moses, et al. (1990) Science 248: 1408-10). 정상의 상태하에서, 기존의 또는 새로운 혈관을 새로 형성 또는 재모델링을 포함하는 모든 과정은 자기제어성 과정이며, 특정 세포종의 팽창은 조절 및 관리 가능하다.

맥관형성은 조직 염증, 관절염, 종양 성장, 당뇨병성 망막병증 및 다른 상태를 포함하는 많은 임상적 질환의 발병기전 및 창상치료에 또한 포함된다. 맥관형성과 결합된 임상적 징후를 맥관형성 질환이라고 말한다(Folkman, et al. (1987) Science 235: 442-7).

정상 상태 및 생리학적 상태중, 낮은 혈액 공급 상태하에서 맥관형성을 촉진하는 맥관형성 인자를 조직이 생산할 수 있다는 것을 많은 실험들은 제의한다. 이들 인자와 화합물은 세포 특이성 및 새로운 혈관의 성장을 유도하는 메커니즘에 있어 다르다. 이들 인자는 다양한 메커니즘을 통해 작용한다. 예를들면, 내피세포의 이동 및 증식을 유도하거나 콜라게나아제의 생성을 자극할 수 있다( Klagsbrun, et al. (1991) Ann. Rev. Physiol. 53: 217-39 참조). 맥관형성 활성을 직접 결정할 수 있는 많은 생물학적 검정법이 있다(Wilting, et al. (1991) Anat. Embrol. (Berl) 183: 259-71).

맥관형성 억제제가 질환의 치료에 있어 유용할 수 있음이 제안되어 왔다. 예를들면, 맥관형성을 방해하면 종양의 성장을 제한할 수 있다. 맥관형성을 억제하기 위한 다음과 같은 몇가지 수단이 제시되어 왔다. (1)맥관형성 인자 배출 억제, (2)단일클론성 항체와 같은 수단을 사용하여 맥관형성 인자 중화 및 (3)맥관형성을 억제하는 것으로 알려진 항맥관형성 인자의 사용을 통한 내피세포 반응 억제(Folkman, et al. (1992) Seminars in Cancer Biology 3: 89-96). 콜라기나아제 억제제, 기저막 전환 억제제, 맥관형성 스테로이드, 진균류-유도 억제제, 혈소판 제4인자, 트롬보스폰딘, 페니실라민과 같은 관절염 약물, 그리고 알파-인터페론과 같은 몇가지 그러한 내피세포 억제제가 기술된다(Folkman, et al. (1992) Seminars in Cancer Biology 3: 89-96참조; 예를들면 Stepien, et al. (1996) J. Endocrinol. 150: 99-106; Maione, et al. (1990) Science 247: 77-9참조).

용어 "내피세포"는 순환계 내표면 안쪽에 있는 단순 편평세포의 단일층인 내피를 만드는 세포를 의미한다. 이러한 세포는 정상 상태에서 매우 느리게(일년에한번 세포분열) 증식하지만, 세포분열 능력이 있다. 내피세포의 증식은 [3H] 티미딘을 라벨 세포로 이용하여 S 기에서 증명될 수 있다. 정상의 혈관에서 라벨되는 내피세포의 비율은 동맥내 분기점에서 특히 높으며, 그 분기점에서 혈액 와류 및 혈관마모가 전환을 자극하는 것으로 보인다. (Goss, (1978) The Physiology of Growth, Academic Press, New York, pp. 120-137). 정상의 내피세포는 잠재성(즉, 분열하지 않으며, 아래에 설명되는 맥관형성 내피세포와 구별됨)이다.

내피세포는 또한, 맥관형성에 중요한 과정인, 이동 능력이 있다. 내피세포는 창상 치유중과 같이 모세혈관이 필요할 때, 또는 종양 형성중인 때와 같은 감지되는 필요성이 있을때 생체내에서 새로운 모세혈관을 형성한다. 새로운 혈관의 형성을 맥관형성이라고 명명하고, 내피세포에 대해 분열유발성 또는 화학적유인물질일수 있는 분자(맥관형성 인자)를 포함한다(Klagsburn, supra). 맥관형성중에, 내피세포는 기존 모세혈관으로 부터 이주해 나가서, 새로운 혈관을 생성하기 시작할 수 있다. 즉, 혈관의 세포는 그 혈관이 확대되는 방식으로 이동한다(Speidel, Am J. Anat. 52: 1-79). 시험관내 연구로인해, 내피세포의 증식 및 이동; 배양중의 내피세포가 모세혈관 튜브를 증식시키고, 자발적으로 발달한다는 것에 대한 증거를 제공하였다(Folkman, et al. (1980) Nature 288: 551-56).

본원에서 용어 "맥관형성 내피세포" 및 "맥관형성하는 내피세포" 등은 맥관형성하는 (위에서 정의된 것과 같은) 내피세포(위에서 정의된 것과 같은)를 의미하도록 교환가능하게 사용된다. 그러므로, 맥관형성 내피세포는 일년에 대략 한번 세포분열하는 정상 상태보다 훨씬 빠른 비율로 증식하는 내피세포이다. 내피세포의 정상 증식으로 부터의 분화율은 정상 증식의 2x, 5x, 또는 lOx 또는 그 이상일 수 있으며, 환자의 연령, 상태, 종양의 종류, 창상의 종류등과 같은 인자에 따라 매우 다를 수 있다. 정상의 내피세포와 맥관형성 내피세포의 증식 정도의 차이가 측정가능하고 생물학적으로 현저해 보인다면, 두가지 종류의 세포를 구별가능하다, 즉, 양이온성 리포좀의 우선적 회합이라는 점에서 맥관형성 내피세포와 대응하는 정상의 잠재성 내피세포가 구별가능하다.

용어 "대응하는 내피세포" "정상의 또는 잠재성 내피세포" 등은 내피세포중 일부가 맥관형성을 하고, 일부는 잠재성일때, (정상의 상태하에서) 같은 종류의 조직내 함유된 정상의 잠재성 내피세포를 말하기 위해 사용된다. 본 발명과 연관되어, 맥관형성 내피세포가 바람직하게는 표적화되며, 대응하는 잠재성 내피세포의 표적화보다 5배 바람직하게는 10배 이상 우선적으로 표적화된다.

용어 "지질"은 지방, 지질, 알코올-에테르-용해성 원형질의 구성성분(불용성)을 포함하는 일반명으로 그 종래의 의미로 사용된다. 지질은 지방, 지방유, 정유, 왁스, 스테로이드, 스테롤, 인지질, 당지질, 술포리피드, 아미노리피드, 크로모리피드(리포크롬) 및 지방산을 포함한다. 그 용어는 자연 발생 지질와 합성 지질을 포함한다. 본 발명와 연관되어 바람직한 지질은 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 포스포리피드, 그리고 스핑고미엘린이다. 지방산이 있을때에는, 탄소수 12-24개의 긴사슬일수 있으며, 6개의 불포화 이중고리를 함유하며, 아실 또는 에테르 결합으로 주사슬에 연결된다. 주사슬에 하나 이상의 지방산이 있다면, 지방산은 다를수 있으며(비대칭성), 단지 하나의 지방산 사슬, 즉 리소렉시틴이 존재할 수 있다. 혼합 조성물 또한 가능하며, 특히 비-양이온성 지질가 달걀 노린자로 부터 정제된 렉시틴(포스파티딜콜린), 소의 심장, 뇌, 또는 간, 또는 콩과 같은 자연 공급원으로 부터 유도될때 가능하다. 또한 관심있는것은 스테로이드와 스테롤, 특히 콜레스테롤, 그리고 3번 위치에서 치환된 스테롤이다.

본원에서 용어 "양이온성 지질"은 양이온성인 모든 본발명의 지질(위에 정의된 것과 같음)를 포함하도록 사용된다. 지질은 측정시 이용되는 기구에 의해서 측정가능하듯이 양성 전하(생리학적 pH로)를 가지면 양이온성으로 결정될 것이다. 양이온성 지질에 지방산이 있으면, 탄소수 12-24개의 긴사슬일수 있으며, 6개의 불포화 이중고리를 함유하며, 아실 또는 에테르 결합으로 주사슬에 연결된다; 주사슬에는 또한 단 하나의 지방산 사슬이 있을 수 있다. 주사슬에 하나 이상의 지방산이 있다면, 지방산은 다를수 있다(비대칭성). 혼합 조성물 또한 가능하다.

용어 "리포좀"은 지질 이중층으로 둘러싸인 모든 구획을 포함한다. 리포좀은 또한 지질 소포라고도 말한다. 리포좀을 형성하기 위해, 지질 분자는 길게 늘려진 비극성(소수성)부분 및 극성(친수성)부분을 포함한다. 분자의 소수성 및 친수성 부분은 바람직하게는 길게 늘려진 분자 구조 양끝에 위치해 있다. 그러한 지질이 물에 분산되어 있을때, 골층판이라고 일컫는 이중층막을 자발적으로 형성한다. 그 골층판은 서로 마주보는 두개의 단일 지질 분자 시트 층으로 구성되어 있으며, 그 비극성(소수성) 표면은 서로 마주보고 있으며, 그 극성(친수성) 표면은 수성 배지를 마주보고 있다. 지질에 의해 형성된 막은 세포내 함유물을 둘러싸는세포막과 유사한 방식으로 수성층 부분을 둘러싼다. 그러므로, 리포좀 이중층은 세포막 내에 단백질 부분이 없는 세포막과 유사하다. 본 발명과 연관되어 사용될때, 용어 리포좀은 다중골층판 리포좀을 포함한다. 그것은 지름이 1 내지 10 마이크로미터이며, 어느 곳에서든지 수성상 층과 번갈아 가며 2 내지 100 동심원상의 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 또한 단일 지질층으로 구성된 단일골층판 소포를 포함하며, 일반적으로 지름이 약 20 내지 약 400 나노미터(nm), 약 50 내지 약 300 nm, 약 300 내지 약 400 nm, 약 100 내지 약 200 nm 이며, 그 소포는 다중골층판 리포좀을 초음파에 노출시키고, 한정된 크기의 세공을 갖는 막을 통해 압력하에서 압출하고, 고압 균질화하여 생산할 수 있다.

탁산을 포함하는 바람직한 리포좀은 단일 지질 이중층을 갖는 단일골층판 소포일 수 있고, 지름은 25 내지 400 nm이다. 또한 바람직하게는 탁산을 포함하는 다중골층판 소포이며, 지름은 약 25 내지 약 400 nm 이다.

바람직한 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA 및 합성 뉴클레오티드 유사체포함) 리포좀 복합체는 바람직한 리포좀으로 부터 제조될 수 있다. 복합체는 양이온성 지질 1 내지 50 nmol당 폴리뉴클레오티드 1㎍을 넣는 것과 같이 하여 제조될 것이다. DNA 유전자 카세트로 부터의 발현이 바람직한 목적 생성물일때, 폴리뉴클레오티드에 대한 양이온성 지질의 최적의 비율은 실험적으로 일련의 조성물을 제조하여 결정하는데, 그 조성물에는 DNA 표준양이 다른양의 양이온성 리포좀과 상기 범위내에서 혼합되어 있다. 그후 이들 조성물을 생체내로 투여하고, 가장 높게 발현되는 조성물을 결정할 수 있다.

양이온성 리포좀은 0 mV 이상의 제타 포텐셜을 갖는 것으로 기능적으로 정의될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "양이온성 리포좀"은 상기 정의된 양이온성의 모든 리포점을 포함하도록 의도된다. 리포좀은 생리학적 pH로 존재할 때 양이온성으로 결정된다. 리포좀 그자체가 양이온성으로 결정되는 실체이며, 그것의 생리학적 pH내의 측정가능한 양성 전하를 갖는 리포좀은, 생체내 분위기내에서, 다른 물질에 부착될 수 있음을 의미한다. 그 다른 물질은 음전하를 띨수 있으며, 따라서 양전하를 띠지 않는 구조를 형성하게 된다. 생체내 분위기 내의 본 발명 리포좀의 전하 및/또는 구조가 구제적으로 결정되지는 않는다. 그러나, 발명에 따르는 본발명의 양이온성 리포좀은 그자체가 양성인 최소한의 지질을 이용하여 생산될 것이다. 리포좀이 완전하게 양이온성 지질로 구성될 필요는 없지만, 생리학적 pH로 생체내에 리포좀이 형성되고, 안치될때, 리포좀이 개시시에 양성 전하를 갖는 정도의 충분한 양이 포함하여야 한다.

용어 "뉴클레오티드 서열/양이온성 지질 복합체" 는 뉴클레오티드 서열의 조합체를 말한다. 뉴클레오티드 서열은 상기 정의된 최소한의 양이온성 지질과 회합된 RNA 또는 DNA 서열일 수 있으며, 중성 지질을 포함할 수 있다. DNA 서열과 양이온성 지질이 결합되면, 일반적인 리포좀이 아닌 복합체를 자발적으로 형성할 것이다. 본 발명은 특이적 뉴클레오티드 서열/양이온성 지방 복합체 형성에 특히 직접 연결되며, 그 뉴클레오티드 서열은 특히 맥관형성 내피세포에 영향을 미치도록 디자인된다. 예를들면, 뉴클레오티드 서열은 맥관형성 내피세포를 죽이는 단백질을 인코딩할 수 있다. 그 서열은 바람직하게는 맥관형성 내피세포의 분위기 내에서 선택적으로 활성화되는 즉, 대응하는 잠재성 내피세포내에서는 활성화되지 않는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 또한, 그 복합체는 맥관형성 내피세포내의 유전적 발현을 막고, 그럼에 의해 맥관형성 내피세포의 작동을 심각하게 혼란시키거나 및/또는 죽이는 안티센스 서열을 포함할 수 있다.

DNA는 플라스미드 또는 선형일 수 있다. 유전자 산물(그 자체에 의한 RNA전사 또는 단백질로 번역)이 바람직할때, 발현 카세트가 필요하며, 그것은 DNA 프로모터 서열, 및 DNA 서열 인코딩 유전자 산물로 구성되어 있다. 다른것들 보다도 포스포디에스테르를 갖는 뉴클레오티드가 특히 안티센스로 사용된다.

용어 " 와 회합한"은 리포좀 및/또는 그 내용물이 내피세포로 들어가기에 충분히 긴 기간동안 맥관형성 내피세포에 충분히 근접하여 있는 발명의 양이온성 리포좀의 행동을 말한다. 발명의 리포좀은 다양한 환경하에서 맥관형성 내피세포와 회합할 수 있지만, 가장 바람직하게는, 생체내 상태일때 맥관형성 내피세포와 회합한다. 그러므로, 리포좀은 맥관형성 내피세포와 회합하기전에 혈류에 존재하는 다른 분자 또는 물질에 부착, 결속, 또는 회합에 의해 변형될 수 있다. 관련이 없는 2개의 분자, 즉, 인간 혈청 알부민과 인간 트랜스페린과 같은 다른 분자간에 일어나는 비특이적 상호작용과 같은 다양한 힘에 의해 맥관형성 내피세포와 리포좀이 회합할 수 있다. 이러한 분자간의 힘은 하기 일반적인 4 분야로 분류될 수 있다. (1) 정전기적 힘; (2) 수소결합; (3) 소수성 힘; 및 (4)반데르발스 힘. 정전기적 힘은 양이온 리포좀 상에 음전하를 띠는 기와 양이온 리포좀 상에 또는 맥관형성내피세포내에 있는 기 사이에서와 같이 반대로 음이온을 띠는 기 사이의 인력에 기인한다. 인력(F)은 전하간 거리(d)의 제곱에 반비례한다. 수소결합력은 친수성 기 사이에 가역적인 수소 다리를 형성하여 제공된다. 발명의 리포좀은 -COOH와 같은 친수성 기를 포함할 것이며, 유사한기는 -OH,-NH₂기와 같이 내피세포의 표면에 존재할 수 있다. 이러한 힘은 대개 이러한 기가 있는 두개의 분자의 근접 위치에 의존한다. 소수성 힘은 오일 방울이 물에 흡수되어 하나의 큰 방울을 형성하는 것과 동일한 방식으로 작용한다. 따라서, 발명의 리포좀에 존재하는 것과 같은 비극성 소수성 기는 수성 분위기에서 회합하는 경향이 있고, 내피세포의 표면에 존재하는 소수성 기와 회합하는 경향이 있을 수 있다. 마지막으로, 반데르발스 힘은 외부 전자구름 사이의 상호작용에 의존하는 분자간에 형성된다.

본원에서 용어 "선택적으로 회합하는" 및 "선택적인 표적"등은 양이온성 리포좀이 대응하는 정상의 비맥관형성 내피세포와 회합하는 것보다 높은 정도로 양이온성 리포좀을 맥관형성 내피세포와 회합하는 발명의 양이온성 리포좀의 성질을 기술하는데 사용된다. 발명과 연관하여 선택적인 또는 우선적인 회합이라는 것은 리포좀이 대응하는 정상의 비맥관형성 내피세포와 비교하여 볼때, 5 배 이상으로 맥관형성을 하는 내피세포와 회합한다는 것을 의미한다.

더욱 바람직하게는, 우선적인 또는 선택적인 회합은 맥관형성 내피세포 및 대응하는 정상의 내피세포사이의 10 배이상의 선택성을 나타낸다.

용어 "암"은 부적절한 세포 증식 질환을 말한다. 이러한 혼란상태는 임상적으로 종양 조직 벌크가 중요 기관의 작용을 위태롭게 할 때 가장 분명하다. 정상 조직의 성장을 기술하는 개념은 정상 조직과 악성 조직이 단일 세포 수준 및 조직 수준에서 유사한 성장 특성을 보유하므로 악성 조직에 적용가능하다. 암은 세포 성장 조절 장애 만큼이나 많은 조직 성장 조절 장애 질환이다.

배가시간은 조직 또는 종양을 크기 또는 수가 두배 되는데 필요한 시간을 말한다. 임상적으로 명백한 배가시간은 정상 종양이 만들어지는 세포의 세포주기 시간보다 상당히 길다. 그러나, 종양과는 다르게, 성인의 정상의 간, 심장, 또는 허파는 기관이 정상상태에 있을때 배가시간을 갖지 않으므로 세포증식 비율과 세포사 비율은 동일하다(Stockdale, (1996)"암 성장과 화학요법"in: Scientific American Medicine, vol. 3, Scientific American Press, New York, pp. 12-18). 종양의 성장특성은 새로운 세포가 생성되는것이 세포가 죽는것을 초과한다는 것이다; 종양은 자기-갱신을 하는 간세포 비율의 증가 및 대응하는 성숙 과정 비율 감소시키는 경향이 있다(McCulloch, et al., (1982) Blood 59: 601-608). 각각의 종양 집단에 대해, 배가시간은 존재하며, 특이적 성장 곡선이 만들어질 수 있다 (Stockdale, supra). 종양의 성장 패턴은 지오페르지안 곡선으로 기술될 수 있으며(Steel (1977) Growth kinetics of tumors, Oxford University Press, Inc., New York, p. 40), 그것은 종양이 발달하는 중에, 성장 비율은 처음에는 매우 빠르며, 그후 크기가 증가함에 따라 점차 감소한다.

발명의 일반적인 양상

첨부 도면은 발명의 양이온성 리포좀이 맥관형성 내피세포를 표적화하는 매우 선택적인 방식으로 명확한 가시적인 자료를 제공한다. 본 발명의 기본적인 구체예는 제약학적으로 허용가능한 담체 그리고 물질 또는 DNA/양이온성 복합체를 포함하는 양이온성 리포좀을 포함하는 조성물을 (바람직하게는 혈관내 주사, 더욱 바람직하게는 동맥내)투여하여 맥관형성 내피세포에 선택적으로 영향을 미치는 방법을 포함한다. 물질은 맥관형성을 억제하는 화합물, 맥관형성을 촉진하는 화합물 및/또는 검출가능한 라벨일 수 있다. 주사된 조성물 내의 양이온성 리포좀은 (엔도시토시스에 의해) 맥관형성 혈관 벽내의 맥관형성 내피세포로 들어간다. 양이온성 리포좀은 리포좀 자체 및/또는 리포좀의 함유물이 맥관형성 내피세포로 들어가는데 충분한 시간동안 그리고 그러한 방식으로 맥관형성 내피세포와 회합한다. 그후, 세포로 들어가는 화합물은 맥관형성을 억제 또는 촉진할 수 있으며, 또는 단순히 맥관형성 부위를 검출하는 라벨을 제공한다. 맥관형성 내피세포의 표적화의 선택성은 첨부 도면을 참고하여 가장 잘 이해될 수 있다.

도 1 은 마우스 난소 부분과 거기에 착상된 커다란 둥근 여포(오렌지 색)를 보여준다. 맥관형성은 정상의 마우스 난소내에서 발생하기 때문에, 검출가능한 라벨을 함유하는 양이온성 리포좀은 성장하는 여포 혈관(레드 오렌지)의 맥관형성 내피세포와 회합한다. 그러나, 도 1 에서, 라벨이 맥관형성 내피세포와만 회합하였는지 또는 난소 및 여포내의 모든 조직과 회합하였는지를 명확하게 결정하는 것은 불가능하다.

도 2 는 검출가능한 라벨을 함유하는 발명의 양이온성 리포좀(레드 오렌지)에 정맥내 주사된 마우스 췌장 종양 부분을 보여준다. 맥관형성은 종양내에서 쉽게 일어난다.

그러므로, 이 사진은 발명의 양이온성 리포좀(레드 오렌지)이 맥관형성 내피세포(그린)과 특이적으로 회합한다는 암시를 제공한다.

도 3 과 4 를 비교하여 보면 본 발명이 맥관형성의 부위를 정하는 능력이 있음을 증명한다. 도 3 은 마우스의 췌장 정상 조직내 혈관을 보여준다. 대응하는 맥관형성 내피세포보다 훨씬 적은 정상의 내피세포 라벨이 있다. 이것은 도 3을 마우스 췌장 종양 사진인 도 4와 비교하여 명확하게 증명된다. 도 4 는 종양 부위의 양이온성 리포좀내에 함유되어있는 라벨(옐로우-오렌지)이 많이 축적되어 있는 것을 보여준다. 도 3 및 4간의 확실한 차이는 종양 부위를 명확하고 정확하게 표시하는 본 발명의 유용성을 나타낸다. 그러나, 도 4에서 너무 많은 라벨이 맥관형성 혈관과 회합되어 있으므로, 맥관형성 내피세포를 우선적으로 표적화하는 양이온성 리포좀의 특이성을 완전히 이해하는 것은 불가능할 수 있다.

도 5는 정상 마우스 췌장 소도에서의 혈관(그린)의 사진이다. 소량의 레드 오렌지 착색은 췌장조직의 혈관내에 늘어서 있는 정상 내피세포와 양이온성 리포좀의 회합이 한정되어 있음을 지시한다.

검출가능한 라벨을 함유하는 양이온성 리포좀의 특이성은 도 5 와 6을 비교함으로써 보다 명확하게 나타난다. 도 6은 마우스의 췌장내 종양의 맥관형성 혈관의 내피세포내에 훨씬더 높은 정도의 라벨이 축적되어 있음을 보여준다.

도 7 및 8 에서, 양이온성 리포좀이 맥관형성 내피세포를 표적화하는 정확한 능력을 극적으로 보여준다. 도 7 은 형광성 라벨이 오직 혈관과 회합한다는 것을명확하게 보여준다, 즉, 라벨은 주변 조직안으로 유출되거나 이동하는 않는다. 맥관형성 내피세포내에 검출되는 라벨링된 양이온성 리포좀에 명확하게 촛점을 맞춘 도 8에서 특이성이 가장 극적으로 나타나며, 그 라벨은 그러한 세포에 특이적이며, 주변 조직으로 유출되거나 이동하지 않는다는 것을 보여준다.

도 9 및 10 은 맥관형성의 다른 모델로 상기와 동일한 효과를 보여준다. 도 1 내지 8은 모두 정상 또는 암조직을 지정하였다. 도 9 및 10 은 마우스 기관의 정상 및 염증 조직을 각각 보여준다. 더욱 구체적으로는, 도 9 는 기관(즉, 무병원성 마우스 기관)의 정상혈관을 보여준다. 도 10 은 감염-유도 맥관형성이 발생된 기관의 혈관을 보여준다. 도 10 의 검출가능한 라벨의 더 높은 농도는 본 발명의 양이온성 리포좀이 선택적으로 맥관형성 내피세포와 회합(특히, 감염에 의해 맥관형성으로 유도된 기관의 내피세포와 회합)한다는 것을 명백하게 보여준다.

도 11 은 맥관형성 내피세포 및 대응하는 정상의 비맥관형성 내피세포와 회합하는 능력간에 양이온성 리포좀의 특이성에 있어서의 차이를 나타내는 그래프이다. 도 11에 보이는 것과 같이 발명의 양이온성 리포좀(본 실험당)은 대응하는 비맥관형성 내피세포와 비교하여 볼때 맥관형성 내피세포에 대해 대략 lOx 이상의 친화성을 보인다.

도 12 및 13 은 발명의 양이온성 리포좀이 맥관형성 내피세포로 들어가는 방법을 보여준다. 도 12에서, 양이온성 리포좀은 맥관형성 내피세포의 표면에 접촉해 있다. 도 13에서, 양이온성 리포좀은 엔도시토시스에 의해 맥관형성 내피세포로 들어가며, 세포내에 존재한다.

도 14 는 무병원 및 미코플라즈마 풀모니스-감염 마우스 기관내 파클리탁셀을 포함하는 리포좀 조성물의 흡수를 보여주며, 맥관형성을 하지 않는 내피세포와 비교하여, 양이온성 리포좀이 맥관형성 내피세포와 회합하며, 흡수된다는 것을 증명한다.

말과 도면으로 본 발명 양이온성 리포좀의 특이성을 설명한대로, 당업자들은 본 발명을 이용하기 위해 다양한 다른 물질을 함유하는 다양한 다른 양이온성 리포좀을 생성할 수 있을 것이다. 그러나, 완벽을 기하기 위해, 하기하는 것은 맥관형성을 억제하거나 촉진하는 물질의 상세한 설명후에 뒤따르는 양이온성 리포좀 및 그 제조 방법이다.

리포좀

리포좀은 수성용액내에 (상기)양이온성 지질을 포함하는 (상기)지질을 넣고, 수초 내지 수시간동안 교반하여 쉽게 형성될 수 있다. 간단한 과정으로 자발적으로 지름이 약 1 내지 10 마이크로미터인 커다란 다중층 리포좀 또는 소포를 자발적으로 생산한다. 이들 리포좀은 수성상 층 내에 지질이 있으며, 그 수성상 층과 교대로 존재하는 두개 내지 수백개의 동심원 지질 이중층을 포함한다. 맥관형성을 억제하고, 맥관형성을 촉진하고, 또는 검출가능한 라벨을 제공하는 화합물과같은 물질이 수성상 내에 포함될 수 있다. 그 물질은 수용성일 수 있으며, 적어도, 물에 쉽게 분산될 수 있다. 다르게는, 그러한 물질은 지질 이중층내에 포함될 수 있다. 지질 이중층내에 포함되는 물질은 소수성일 수 있다.

수성층 및 리포좀내에 가두어져 있는 수성상의 총 양의 두께는 지질 사이의정전기적 척력 및 이중층 상이의 반데르발스 인력의 전체 균형에 달려있다. 그러므로, 수성 공간(및 가두어진 수성 물질의 부피)은 막내에 하전된 지질의 증가 비율에 따라 그리고 수성상에서 전해질(하전 이온)의 농도 감소에 따라 증가한다.

다양한 크기의 리포좀이 만들어 질 수 있다. 형성되는 작은 리포좀 또는 소포는 단일골층판이며, 약 20 내지 400의 크기를 가지며, 다중골층판 소포를 초음파에 노출시킴에 의해, 한정된 크기를 갖는 막을 통해 압력하에 압출하여, 또는 고압 균질화에 의해 생성할 수 있다. 지름 0.1 내지 1㎛의 범위의 크기를 갖는 큰 단일골층판 리포좀은 지질이 유기 용매 또는 세정제에 용해시켜 얻을수 있으며, 용해된 제제를 증발 또는 투석으로 각각 제거한다. 작은 단일골층판 리포좀을 특별한 지질이나 엄격한 탈수화-수화 상태를 요구하는 방법으로 용해시켜 세포만큼 또는 세포보다 큰 단일골층판 혈관을 생성할 수 있다.

본 발명의 양이온성 리포좀을 형성하기 위해, 리포좀이 최소한의 약간의 양이온성 지질을 사용하여 생성되어야 하는 것이 필요하다. 그러나, 발명의 양이온성 리포좀 전체가 양이온성 지질로 구성될 필요는 없다. 예를들면, 중성지방 약 45 % 및 양이온성 지질 약 55 % 를 이용하여, 발명와 연관되어 유용하며, 바람직하게는 맥관형성 내피세포를 표적화하는 양이온성 지질을 생성할 것이다.

발명의 양이온성 리포좀은 맥관형성에 영향을 미치는 물질을 포함할 수 있고, 플루오로포어 또는 다른 라벨 및/또는 수성 구획 내의 용해성 화합물를 더욱 포함할 수 있다.

맥관형성에 영향을 미치는 물질 및/또는 라벨을 포함하는 양이온성 리포좀의발생은 당업계에서 여러가지의 표준 방법중 어떠한 것을 이용하여 수행할 수 있다. 예를들면, 1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄 프로판(DOTAP), 콜레스테롤 및 Texas 적색 DHPE (N- (5- 디메틸아미노나프탈렌-l-술포닐)-1, 2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민) 용액을 혼합하고, 증발시켜 건조하고 이어서 지질막을 5%덱스트로스에 재수화시켜 다중라미나 소포(MLVs)를 얻는다. 이들 소포는 폴리카르보네이트막 필터을 통해 압출되어 단일골층판을 얻는다. 리포좀 및 혼합되는 물질(예를들면 플라스미드 DNA)은 5% 덱스트로스 용액내에 또는 다른 생리학적으로 허용가능한 부형제와 함께 특별한 비율로 혼합된다. 유용한 양이온성 지질은: DDAB, 디메틸디옥타데실 암모늄 브로마이드; N- [1- (2,3-디올로일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 메틸술페이트;1,2-디아실-3-트리메틸암모늄프로판, (디올레오일(DOTAP), 디미리스토일, 디팔미토일, 디세아로일를 포함하지만 이에 한정되지는 않음); 1,2-디아실-3-디메틸암모늄프로판(디올레오일, 디미리스토일, 디팔미토일, 디세아로일을 포함하지만 이에 한정되지는 않음) DOTMA, N- [1- [2,3-비스(올레일옥시)]프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드; DOGS, 디옥타데실아미도글리실스퍼민; DC-콜레스테롤, 3β- [N- (N', N'- 디메틸아미노에탄)카르바모일] 콜레스테롤; DOSPA, 2,3-디올레오일옥시-N-(2 (스퍼민카르복사미도)에틸)-N, N-디메틸-l-프로판아미늄트리플루오로아세테이트; 1,2-디아실-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린,(디올레오일(DOEPC), 디라우로일, 디미리스토일, 디팔미토일, 디스테아로일, 팔미토일-올레일을 포함하지만 이에 한정되지는 않음); β-알라닐 콜레스테롤; CTAB, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드; 디C14-아미딘, N-t-부틸-N'-테트라데실-3- 테트라데실아미노프로피온아미딘; 14Dea2, O, 0'-디테트라데카노일-N- (트리메틸아미노아세틸)디에탄올아민 클로라이드; DOSPER, 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카르복시스퍼밀)-프로필아미드; N, N, N', N'-테트라메틸-N, N'-비스 (2-히드록실에틸)-2, 3-디올레오일옥시-1, 4-부탄디암모늄 요오다이드; 1-[2-(9 (Z)-옥타데세노일옥시)에틸]-2-(8 (Z)-헵타데세닐-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드 (DOTIM), 1- [2- (헥사데카노일옥시) 에틸]-2-펜타데실-3- (2-히드록시에틸)이미다졸리늄클로라이드(DPTIM)와 같은 1- [2-아실옥시)에틸] 2-알킬(알케닐)-3-(2-히드록시에틸) 이미다졸리늄 클로라이드 유도체 클로라이드 유도체; 1-[2-테트라데카노일옥시)에틸]-2-트리데실-3-(2-히드록시에틸) 이미다졸리늄[2-테트라데카노일옥시) 에틸]-2-트리데실-3-(2-히드록시에틸) 이미다졸리늄 클로라이드(DMTIM)-Solodin et al.(1995) Biochem43:13537-13544에 기술된 것과 같음; 1,2-디올레오일-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORI)와 같이 4차 아민에 히드록시알킬을 함유하는 2,3-디알킬옥시프로필 4차 암모늄 화합물 유도체 ; 1, 2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DORIE); 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시프로필 암모늄 브로마이드 (DORIE-HP); 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸-히드록시부틸 암모늄 브로마이드 (DORIE-HB); 1,2-디올레일옥시프로필-3-디메틸- 히드록시펜틸 암모늄 브로마이드 (DORIE-HPe); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록실에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE); 1,2-디팔미틸옥시프로필-3- 디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DPRIE); 1, 2-디스테릴옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DSRIE)-즉, Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 2550-2561에 기술된 것과 같음. 상기의 많은 지질은 예를들면, Avanti Polar Lipids, Inc.; Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, Inc.; Northerm Lipids, Inc.;Roche Molecular Biochemicals; and Promega Corp.로 부터 상업적으로 이용가능하다.

양이온성 리포좀은 양이온성 지질 자체로 제조할 수 있으며, 또는 다른 지질, 구체적으로는 콜레스테롤; 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, (디올레오일 (DOPE), 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포콜린을 포함하지만 이에 한정되지 않음); 천연 난황 포스파티딜 콜린(PC)등; 합성 모노- 및 디-아실 포스포콜린(예를들면, 모노아실 포스파티딜 콜린(MOPC)) 및 포스포에탄올아민과 같은 중성지방과 혼합하여 제조된다. 상기 디아실 유도체에 대한 비대칭성 합성 및 천연 지방산 및 혼합 조제물이 또한 포함될 수 있다.

상기 종류 및 당업자가 만들수 있는 다른 종류의 리포좀이 맥관형성을 촉진하거나 억제하는 및/또는 검출가능한 라벨을 포함하는 물질을 함유하는 리포좀과 함께 본 발명에서 사용될 수 있다. 발명의 리포좀의 한 가지 예는 맥관형성을 억제하는 지질 용해성 또는 수용성 물질을 함유하는 양이온성 리포좀이다. 그러나, 지질 용해성 화합물은 지질 이중층 내에 있을 수 있다. 다음은 맥관형성 억제제에 대한 설명을 제공한다. 그러나 당업자에게는 다른 방법도 가능하며, 또는 본 발명 이후 더욱 발달될 것이며, 그러한 맥관형성 억제제는 본 발명과 연관되어 쉽게 사용될 수 있음을 주의 하여야 한다.

맥관형성 억제제

헤파린은 맥관형성의 강화제이고, 헤파린 길항제는 맥관형성 반응을 막을 수 있다. 헤파린 결합 단백질인 프로타민은 항맥관형성 특성을 나타낸지만 (Taylor et al. (1982) Nature 297: 307-312), 인간에서의 노출에 대해 아나필락시성 반응을 일으키는 것으로 알려져있기 때문에 임상적으로 유용하지 않다. 또 다른 항맥관형성제는 헤파린 결합 단백질, 주 염기성 단백질(Major Basic Protein)인데, 이는 또한 높은 독성을 나타내고 따라서 인간에게 사용하기에는 실용성이 없다. 그러나, 본 발명으로 얻은 고도의 표적지향화 선택성 때문에, 맥관형성을 억제하지만 치료에 사용하기에는 독성이 너무 많다고 생각되는 이들 및 다른 화합물이 아주 소량으로 사용될 수 있기 때문에 유용해질 수 있다.

혈소판 인자 4(PF4)는 헤파린-결합 활성 및 항맥관형성 특성을 나타내고, 그것이 다른 헤파린 길항제만큼 독성이 아니기 때문에 임상적으로 유용할 수 있다. 미국 특허 명세서 No.5,112,946에 개시된 바와 같이, PF4의 화학적 변형들은 PF4의항맥관형성 특성을 강화한다. 이들 변형들은 플루오레신-이소티오시아네이트로 그들의 자유 아미노 기가 변형된 PF4 유사체, 즉, 단백질의 특이적으로 변화된 구조적 조성을 갖는 PF4 돌연변이체의 생산 및 항맥관형성 특성들을 보유하는 PF4 단편의 생산을 포함한다. 특히, 카르복시 말단에 대응하는 13 아미노산의 합성 펩티드가 유력한 안지오스테틱 활성을 나타내었다.

다양한 스테로이드가 맥관형성을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 항맥관형성 활성은 헤파린 또는 관련 분자들의 첨가에 의해 강화된다(Folkman et al. (1989) Science 243: 1490-3). 테트라히드로코티존과 같은 소위 "안지오스테틱 스테로이드" 는 생체내에서 맥관형성을 막는 능력을 갖는다. 특히, 6α-플루오로-17,21-디히드록시-16β-메틸-프레그나-4,9-(11)-디엔-3,20-디온은 효능있는 안지오스테틱 스테로이드로 사용되었다.

콜라겐 신진 대사를 조절하는 약제들이 맥관형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 아미노산 프롤린의 유사체는 생체내에서 특이적으로 콜라겐 합성을 억제하고 맥관형성을 억제한다. 특히, L-아제티딘-2-카르복시산(LACA), 시스-히드록시프롤린(CHP),D,L-3,4-디히드로프롤린(DHP) 및 티오프롤린(TP) 각각은 활성을 내리기 위한 항맥관형성 활성을 나타낸다(Ingber et al. (1988) Lab. Invest. 59: 44-51). 이들 유사체들 각각은 또한 안지오스테틱 스테로이드 및 헤파린의 항맥관형성 효과를 강화한다.

혈소판의 알파 과립에서 발견된 당단백질인 인간 트롬보스폰딘(thrombospondin)은 미국 특허 5,192,744에 개시된 바와 같이, 삼량체 또는 단량체 또는 단편 형태로 맥관형성을 억제한다. 각각은 당화된 형태로 작용을 하고, 당화되지 않은 형태로도 작용할 것으로 예측된다. 아미노 말단에 결합된 헤파린 결합 영역 및 단량체 단백질의 카르복실 말단에서 발견된 혈소판 결합 영역의 결실에 이어 맥관형성 억제 특성이 존재한다.

라미닌 활성을 나타내는 펩티드는 맥관형성을 막고 조직에서의 과도한 혈관 형성을 방지한다. 그러한 활성을 갖는 특이 펩티드는 :1)티로신-이소레우신-글리신-세린-아르기닌;2)프롤린-아스파르틴-세린-글리신-아르기닌;및 3)시스테인-아스파르테이트-프롤린-글리 신- 티로신-이소레우신-글리신-세린-아르기닌이다. 이들 펩티드는 그들의 항맥관형성 활성을 고리형태로 유지한다고 예측된다.

맥관형성 억제 물질의 다른 예들은 콜라게나아제 활성을 나타내는 연골 조직으로부터의 추출물, 망막의 색소 내피 세포들로부터 유도된 단백질((1985) Arch. Ophthamol. 103: 1870-1875), 배양된 연골 세포로부터 유발된 항암 인자(Takigawa, et al. (1988) Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 33: 1803-7), 인도메타신과 같은 항염제(Peterson et al. (1986) Anticancer Res. 6: 251-3), 리보누클레아제 억제제(Shapiro, et al. (1987) PNAS 84: 2238-41), 술포닉 다당류 및 펩티드 글리칸의 복합체(e. g. JPA-S63 (1988)-119500), 관절염, 허비마이신 A를 위한 골드 조제물(JPA-S63 (1988)-295509); 그리고 단백질 METH-1 및 METH-2 (Vazquez et al. (1999) J. Biol. Chem 274: 23349-23357); 그리고 푸마길린 또는 푸마길올 유도체들을 포함한다. 미국 특허 5,202,352에 개시된 바와 같이, 다수의 푸마길올 유도체는 맥관형성 억제 특성을 갖는다. 상기 참고 문헌들은 맥관형성 억제제를 설명하고 개시하기 위한 참조로 포함된다.

탁산

본 발명은 더 나아가 항맥관형성제를 함유하는 양이온성 리포좀 탁산을 공급한다. 그러한 리포좀은 맥관형성을 억제하고 따라서 종양, 만성염증 및 맥관형성과 관련된 다른 질병의 치료에 유용하다.

"탁산"은 필수 활성이 관찰되는 한, 즉, 탁산을 함유하는 양이온성 지질 조제물과 접촉하지 않는 혈관에서의 맥관형성에 비해, 혈관에서 적어도 약 2배 , 보다 바람직하게는 적어도 약 5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50배 이상 맥관형성이 억제되는 한, 어떠한 활성 탁산 유도체 또는 프로드러그 뿐만 아니라, 파클리탁셀을 포함한다.

당업자들은 공지된 다양한 방법을 사용하여, 맥관형성이 억제되는지 여부를 손쉽게 결정할 수 있다. 그러한 방법들은, 물론 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 시험관내 또는 생체내에서, 맥관형성의 프로모터인 물질(즉, 프로-맥관형성 물질)에 반응하여 혈관에 의한 합성 매트릭스의 침입을 포함하는 방법들, 예를 들면, 융모막요막성 막 분석; 각막 포켓 분석; 및 내피 세포 증식 억제를 위한 분석 등이 포함된다. 그러한 방법들은 문헌에서 충분히 설명되어 있는데, 그 중에서도 특히 Vazquez 외(1999) J. Biol. Chem. 274:23349-23357; 및 Belotti,외 (1996) Clin. Cancer Res. 2:1843-1849을 포함한다.

탁산은 리포좀의 지질 이중층안에 포함될 수 있고, 리포좀의 수성 구획에 존재할 수 있고 또는 둘다 가능하다. 따라서, 몇가지 구체예에서, 본 발명은 양이온성 지질 및 지질 이중층에서의 탁산을 포함하는 양이온성 리포좀을 제공한다. 이들 구체예 중 일부에서, 양이온성 리포좀은 또한 수성 구획에 탁산을 포함한다. 다른 구체예에서는 본 발명은 양이온성 지질 및 수성 구획에서의 탁산을 포함하는 양이온성 리포좀을 제공한다. 수성 구획에 포함될 수 있는 탁산은 수용성 탁산(예를 들어, 친수성 유도체)를 포함한다. 양이온성 리포좀의 지질 이중층안에 포함될 수 있는 탁산은 소수성 탁산 및 소수성 탁산 유도체를 포함한다.

일반적으로, 본 발명의 양이온성 리포좀 조제물에서의 탁산의 비율은 약 20몰% 미만이다. 몇가지 구체예에서, 양이온성 리포좀 조제물은 약 0.5몰% 내지 약 20몰%의 비율로 탁산을 포함하고, 다른 구체예에서는 약 2몰% 내지 약 10몰%을 포함한다. 다른 구체예에서, 탁산은 약 1몰% 내지 약 5몰%로 존재하고, 여전히 다른 구체예에서는,약 1몰% 내지 약 3몰%로 존재한다. 탁산이 약 0.5몰% 내지 약 20몰%, 약 2몰% 내지 약 10몰%, 약 1몰% 내지 약 5몰%, 약 1몰% 내지 약 3몰%의 비율로 양이온성 리포좀에 포함될 때, 약 4EC와 약 25EC 사이의 온도에서, 적어도 약 0.5시간, 일반적으로 적어도 약 1시간, 일반적으로 적어도 약 2시간, 보통 적어도 약 24시간, 보통 적어도 약 48시간의 시간 동안에는, 탁산은 실질적으로 리포좀 이중층으로부터 분할하지 않고, 그리고/또는 실질적으로 탁산 결정을 형성하지 않는다. 탁산이 실질적으로 리포좀 이중층으로부터 분할하지 않고 그리고/또는 실질적으로 탁산 결정을 함유하지 않는 한, 더 높은 비율의 탁산이 회합될 수 있다. 탁산을 포함하는 양이온성 리포좀은 "실질적으로 어떤 탁산 결정도" 함유하지 않는다. 즉, 양이온성 리포좀에 존재하는 일반적으로 약 10% 미만, 보통 약 5% 미만, 보통 약 2% 미만, 전형적으로 약 1% 미만, 그리고 바람직하게는 약 0.5%의 탁산은 결정의 형태이다. 그 안에서 실질적으로 탁산이 지질 이중층으로부터 분할하지 않는 양이온성 리포좀은 거기서 일반적으로 약 20% 미만, 보통 10% 미만, 보통 약 5% 미만, 전형적으로 약 1% 미만, 그리고 바람직하게는 약 0.5% 미만의 탁산이 리포좀 이중층으로부터 분할하는 리포좀이다.

리포좀-탁산 조제물에서 양이온성 지질의 비율은 일반적으로 약 5몰%, 보통 약 10몰%보다 크고, 보다 전형적으로는 약 20몰%보다 더 크다. 몇가지 구체예에서, 양이온성 지질은 리포좀-탁산 조제물에 약 20몰% 내지 약 99몰%의 양으로 존재한다. 또다른 구체예에서, 양이온성 지질은 약 30몰% 내지 약 80몰%의 양으로 존재하고, 다른 구체예에서는, 약 40몰% 내지 약 98몰%로, 그리고 또다른 구체예에서는, 약 40몰% 내지 약 60몰%로 존재한다. 탁산을 운반하는데 사용하기에 적합한 리포좀 조성은 위에서 설명된다. 탁산은 또한 지방산, 인지질 등과 같은 소수성 유기 부분에 부착될 수 있고, 리포좀 안에 포함될 수 있다. 그러한 탁산 유도체들은 설명되었고, 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어 미국 특허 명세서 No.5,580,899 참조. 탁솔을 포함하는 포스파티딜 콜린 조제물이 설명되었다. (미국 특허 명세서 No.5,683,715)

탁산을 포함하는 양이온성 리포좀 조제물은 맥관 형성을 겪고있는 혈관에서의 내피 세포(즉, 맥관형성 내피 세포)에 대해 더 큰 친화력을 갖고, 우선적으로 회합을 하고, 내피 세포에 의해 흡수된다. 즉, 탁산을 포함하는 양이온성 리포좀은 비맥관형성 내피 세포에 의해 흡수된 양보다 적어도 약 2배, 보다 바람직하게는 적어도 약 5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배 또는 그 이상의 더 큰 양으로, 맥관형성 내피 세포에 의해 흡수된다(탁산이 셀안으로 들어간다). 이러한 비교는 일반적으로 세포 대 세포 기반에서 이루어어진다. 즉, 직접적인 비교는 맥관형성 내피 세포와 비맥관형성 내피 세포에 의한 흡수 사이에서 이루어진다. 한가지 예로서, 맥관형성 대 비맥관형성 내피 세포에 의한 흡수의 비율을 결정하기 위한 분석은 생체외에서 수행되는데, 예를 들면, 생체내에서 동물에서의 세포를 라벨링하고, 그것을 동물로부터 떼어내고, 양이온성 리포좀 조제물의 흡수를 위해 생체외에서 분석한다. 적절한 분석법의 예가 실시예 5에서 제공된다. 이 분석에서, 동물은 맥관형성을 일으키는 것으로 공지된 물질로 치료된다. 내피 세포는 모든 내피 세포들을 표시하는데 사용된 라벨과 구별될 수 있는 라벨을 포함하는 양이온성 리포좀/탁산 조제물과 접촉한다. 적절한 시간 후에, 모든 내피 세포들은 형광 라벨로 라벨링된다. 내피 세포의 라벨링 전, 그와 동시에, 또는 그 후에 동물에 고정액을 관류시킬 수 있다. 적절한 시간 후에(예를 들어 약 1분 내지 약 2 시간), 내피 세포를 동물로부터 떼어내어, 그리고 공초점 현미경 관찰로 직접 시각화하여, 양이온성 리포좀/탁산 조제물과 회합되는 라벨을 포함하는 내피 세포들의 비율을 양이온성 리포좀/탁산과 회합되는 라벨을 포함하지 않는 내피 세포들의 비율과 비교한다. 이러한 방식으로, 맥관형성 내피 세포와 비맥관형성 내피 세포에 의한 흡수 사이에서 직접적인, 세포 대 세포의 비교를 할 수 있다. 양이온성 리포좀이 우선적으로 주어진 세포에 의해 흡수되는지 여부는 실시예에서 설명된 바와 같이, 라벨링된 액체 및 형광 현미경 관찰의 사용을 포함하여, 어떠한 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 전체 조직의 균등질에서 흡수의 측정을 포함하는 방법들은 큰 비율의 비내피 세포의 존재가 배경 비율에 대한 신호를 감소시킬 수 있으며 따라서 맥관형성 내피 세포 대 비맥관형성 내피 세포에 의한 흡수 사이의 차이를 정확히 반영하지 못할 수 있기 때문에, 일반적으로 바람직하지 않다.

중성 지질은 양이온성 리포좀 조제물안에 포함될 수 있고, 존재할때는, 약 1몰% 내지 약 80몰%, 일반적으로 약 2몰% 내지 약 50몰%, 보통 약 40몰% 내지 약 50몰%의 비율로 존재할 수 있다. 이것으로 제한되는 것은 아니지만, DOPE을 포함하는 포스파티딜 에탄올아민; 그리고 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 난 PC, DOPC 및 MOPC 를 포함하는 포스파티딜 콜린을 포함하는 어떠한 중성 지질이 회합될 수 있다.

탁산을 포함하는 양이온성 리포좀은 더 나아가 여기서 자세하게 설명된 바와 같이, 당업계에서 공지된 광범위한 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다.

실시예 5는 맥관형성 내피 세포에 대한 파클리탁셀을 함유하는 양이온성 리포좀의 표적지향화를 보여주는 실험 데이타를 제공한다. 따라서, 몇가지 구체예에서 본 발명은 파클리탁셀을 함유하는 양이온성 리포좀을 제공한다. 이들 구체예중의 일부에서는 양이온성 리포좀이 1,2 디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판(DOTAP)을 약 20몰% 내지 약 99몰%로, 약 40몰% 내지 약 70몰%로, 약 50몰% 내지 약 60몰%로 포함한다. 이들 구체예 중 일부에서는, 양이온성 리포좀이 DOTAP:난 포스파티딜 콜린(PC);로다민:DHPE: 파클리탁셀을 50:47:1:2의 몰비로 포함한다. 또다른 구체예에서는 양이온성 리포좀이 DOTAP: 난 PC: 파클리탁셀을 50: 48: 2 의 몰비로 포함한다. 다른 구체예에서는, 양이온성 리포좀이 DOTAP: DOPC: 파클리탁셀을 50:47:3의 몰비로 포함한다. 또다른 구체예에서는, 양이온성 리포좀이 DOTAP: DOPE: 파클리탁셀을 50:47:3 의 몰비로 포함한다. 또다른 구체예에서는, 양이온성 리포좀이 DOTAP: MOPC: 파클리탁셀을 50:47:3 의 몰비로 포함한다.

파클리탁셀은 튜뷸린을 구속함으로써, 미소관 조직을 안정화하는 작용을 한다. 세포를 나누는데 있어서, 이는 비정상 유사분열 방추사의 형성을 초래할 수 있다. 게다가, 탁산은 또한 항맥관형성 활성을 가질 수 있다(Belotti et al.(1996) Clin. Cancer Res. 2: 1843-1849; 및 Klauber et al. (1997) Cancer Res. 57: 81-86). 본 발명의 양이온성 리포좀은 그것이 파클리탁셀로 제한되지는 않지만 파클리탁셀을 포함하여, 이것으로 제한되지는 않지만 탁산을 포함하는 맥관형성을 억제하는 어떠한 물질 및 상기한 맥관형성 억제제 중 어떤 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 탁산 및 하나 이상의 다른 항맥관형성 물질을 포함하는 양이온성 리포좀 조성물이 제공된다.

파클리탁셀은 Taxus brevifolia (Pacific Yew) 및 Taxomyces andreanae, Pacific Yew의 내장성 진균 (Stierle, et al. (1993) Science 60: 214-216. 의 채취되고 건조된 바크로부터 얻은 높게 유도된 디터페노이드(Wani, et al. (1971) J. Am. Chem. Soc. 93: 2325-2327) 이다. "파클리탁셀"은(여기에는 유사체, 조제물 및 예를 들어 도세탁셀, TAXOLJ, TAXOTEREJ (도세탁셀의 조제물), 파클리탁셀의 10-데사세틸 유사체 및 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체와 같은 유도체를 포함하는 것이 이해되어져야 함) 당업계에서 공지된 기술을 이용하여 손쉽게 제조할 수 있고(또한 WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; 미국 특허 Nos. 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; 및 EP 590,267 참조), 또는 예를 들어,Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (Taxus brevifolia 의 T7402 ; 또는 Taxus yannanensis 의 T-1912 )를 포함하여 시중에서 구입가능한 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다.

파클리탁셀은 통상 화학적으로 이용가능한 형태의 파클리탁셀 뿐만 아니라유사체(예를 들어, 위에서 명시한 바와 같은 톡소테르) 및 파클리탁셀 배합체(예를 들어, 파클리탁셀-PEG, 파클리탁셀-덱스트란, 또는 파클리탁셀-크실로스)를 말한다는 것이 이해되어야 한다.

또한 용어 "탁산" 안에는 친수성 유도체 및 소수성 유도체 모두를 포함하여,다양한 공지된 유도체들이 포함된다. 탁산 유도체는 물론 이것으로 제한되지는 않지만, 국제 특허 명세서 WO 99/18113에 기술된 갈락토스 및 만노스 유도체; WO 99/14209 에 기술된 피페라지노 및 다른 유도체;WO 99/09021, WO 98/22451, 및 U. S. Patent No. 5,869,680 에 기술된 탁산 유도체; WO 98/28288에 기술된 6-티오 유도체 ; U. S. Patent No. 5,821,263 에 기술된 술펜아미드 유도체; 그리고 U. S. Patent No. 5,415,869 에 기술된 탁솔 유도체를 포함한다. 그것은 더 나아가 이것으로 제한되지는 않지만, WO 98/58927; WO 98/13059; 및 미국 특허 명세서 No.5,824,701에 기술된 것을 포함하는, 파클리탁셀의 프로드러그를 포함한다.

더 나아가 용어 "탁산"에는 약학적으로 허용가능한 탁산의 염이 포함된다.

탁산의 혼합물은 양이온성 리포좀 안으로 회합될 수 있다. 게다가, 탁산을 포함하는 양이온성 리포좀은 이것으로 제한되지는 않지만, 맥관형성을 억제하는 약제(예를 들면, 탁산 이외에 다른) 및 항암제를 포함하여, 하나 이상의 추가적인 약학적으로 활성인 화합물(들)을 더 포함할 수 있다.

탁산은 자연 공급원으로부터 분리할 수 있고, 화학적으로 합성할 수 있으며, 또는 상업적인 공급원으로부터 구매할 수 있다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 명세서 No.5,580,899 참조.

맥관형성 인자

다수의 생물학적 화합물이 맥관형성을 촉진한다. 안지오제닌(angiogenin)은 병아리 CAM 또는 토끼 각막에서 유력한 맥관형성 인자로 나타났다. 말초혈 단핵세포에서 독립된 인자인 안지오트로핀은 정상의 상처 치유에 역할을 하도록 제안된 또다른 맥관형성 화합물이다(Biochemistry 27:6282(1998). 피브린과 같이, 상처 치유에 포함된 다른 인자들은 또한 혈관화를 유발한다.

맥관형성의 매개체의 또다른 분류는 성장 인자들과 같은, 폴리펩티드 맥관형성 인자들인데, 이는 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(FGFs), 변형 성장 인자 알파(TGF-α) 및 혈소판에서 유래된 성장 인자(PDGF)를 포함한다. 각각의 이들 분자들은 생체내에서 맥관형성을 유발하는 것으로 나타났다. 맥관형성 활성을 나타내는 다른 유사한 분자들은 맥관의 내피 성장 인자(VEGF), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 변형 성장 인자 베타(TGF-β) 및 헤파린 결합 성장 인자(HBGFs)이다.

다른 맥관형성 인자들은 폴리펩티드 맥관형성 인자들에 더하여 설명되었다. 지질에서 유래된 맥관형성 인자인 프로스타글란딘 E1 및 E2은 맥관형성 특성을 갖는 공지된 염증 세포 유인물질이다(1982) J.Natl. Cancer Inst. 69:475-482). 니코틴아미드는 병아리 각막 또는 병아리 CAM 분석에서 시험했을 때 (Science 236:843-845(1987)) 맥관형성 반응을 일으킨다.

검출가능한 라벨

본 발명의 양이온성 리포좀은 어떠한 종류의 검출가능한 라벨을 송달하는데사용될 수 있다. 라벨은 리포좀을 만드는데 사용된 지질에 용해되거나, 또는 그들은 물이나 식염수 또는 덱스트로스 수용액과 같은 수용액안에서 용해성이거나 적어도 분산가능하다. 라벨은 방사성 라벨, 형광 라벨, 조직화학적으로 또는 면역조직화학적으로 검출가능한 물질, 또는 검출가능한 염료, 또는 자기 공명 화상에 의해 검출가능한 어떠한 물질이 될 수 있다. 라벨은 어떠한 적정량으로 존재할 수 있고 리포좀 단독으로 또는 맥관형성을 억제하거나 촉진하는 물질과 함께 포함되거나 혼합될 수 있다.

투여

환자(맥관형성을 겪는 내피 세포를 갖는 순환계를 갖는 어떠한 동물이 될 수 있다)에 투여되는 맥관형성 억제제 또는 촉진제의 양은 넓은 범위의 인자들에 의존하여 변할 것이다. 예를 들어, 더 작은 동물보다 인간에게 실질적으로 더 큰 투여량을 제공해야 할 것이다. 맥관형성 억제제 또는 촉진제의 양은 투여되는 물질의 효능은 물론 환자의 크기, 나이, 성별, 몸무게 및 상태에 따라 변할 것이다. 투여의 관점에서 상당한 변화성이 있다는 것을 나타내었기 때문에, 당업자들은 본 발명의 개시를 사용하여, 처음에 극소량을 투여하고 원하는 결과를 얻을때까지 점진적으로 투여량을 증가시킴으로써 적절한 투여량을 손쉽게 결정할 수 있다고 믿어진다.

뉴클레오티드 서열/ 양이온성 지질 복합체

DNA 및 RNA 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 지질과 회합할 때, 이 두가지는 복합체를 형성한다. 뉴클레오티드 서열 및 지질의 특정양을 선택하고 특정지질을 선택함으로써, 시험관내에서 서로 응집하지 않는 복합체를 형성하는 것이 가능하다. 그러한 복합체의 정보에 관련하는 일반적인 정보는 여기에서 참조로 포함되는 1993년 6월 24일 공개된 PCT 공보 WO 93/12240안에 기술되어 있으며, 특히 뉴클레오티드 서열/지질 복합체의 형성을 개시하고 기술하고 있다. 본 발명과 관련하여, 뉴클레오티드 서열은 특히 맥관형성 내피세포에 영향을 주고 다른 세포에는 영향을 주지 않으며 특히 대응하는 다른 내피 세포, 즉, 잠재성 내피 세포에는 영향을 주지 않도록 설계된다. 본 발명과 관련하여 사용된 DNA 서열은 실시가능하게 프로모터에 연결되고 그러한 프로모터들은 특히 뉴클레오티드 서열의 발현이 오직 맥관형성 내피 세포의 환경 안에서만 얻어지도록 설계된다. 첫째로, 프로모터는 서열이 맥관형성 내피 세포로 송달된 후에 활성화될 수 있는 활성가능한 프로모터가 될 수 있다. 보다 바람직하게는, 프로모터는 그것이 맥관형성 내피 세포의 특정 환경안에서 활성화되도록 설계된다. 잠재성 내피 세포의 환경안에서는 발생하지 않는 맥관형성 내피 세포의 환경안에서 자연적으로 발생하는 현상이 다수 존재한다. 두 가지 타입의 세포 사이의 차이를 이용함으로써, 프로모터가 특히 맥관형성 내피 세포의 존재하에서만 활성화되도록 설계된다.

DNA 카세트로부터 전사는 특정 유전자 프로모터를 사용하는 단일 또는 좁은 범위의 세포 타입으로 제한될 수 있다. 내피 세포는 선택적으로 유전자 및 그들의 프로모터가 밝혀진 몇가지 단백질을 발현한다. 맥관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 flk-1 및 flk-1 유전자 프로모터, von Willibrand 인자(VWF), 그리고 결합 가족 유전자 프로모터는 리포터 유전자 구조물에 연결되었을 때 내피 세포에서 직접적인선택적인 발현을 나타내었다. 하기의 공보들은 맥관형성 내피 세포에서 활성화되는 프로모터들을 개시하고 기술하기 위해 인용된다.

Hatva, et al. (1996) Am. J. Path. 148: 763-75; Strawn, et al. (1996) Cancer Res. 56: 3540-5; Millauer, et al. (1996) Cancer Res. 56: 1615-20; Sato, et al. (1996) Nature 376: 70-4; Ozaki, et al. (1996) Human Gene Therapy 13: 1483-90; Ronicke, et al. (1996) Circulation Res. 79: 277-85; Shima, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 3877-8; Morishita, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 27948-53; Patterson, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 23111-8; Korhonen, et al. (1995) Blood 86: 1828-35. 또다른 유용한 접근은 내피 세포에서 헤르페스 단성 바이러스 티미딘 키나아제(TK)의 발현, 및 이어서 프로드러그 간시클로비르(ganciclovir)로 치료를 포함한다.

대안으로, 뉴클레오티드 서열은 맥관형성 내피 세포 내에서 발현되어야 하는 서열에 회합하여 그로인해 그 세포의 생존을 위해 필요한 맥관형성 상피 세포의 자연적으로 발생하는 서열의 발현을 막는 안티센스 서열이 될 수 있다.

응괴 형성

리포좀 또는 뉴클레오티드 서열/지질 복합체를 사용하여 수행될 수 있는 본 발명의 또다른 관점은 응혈의 형성을 포함한다. 특히, 본 발명의 리포좀 또는 복합체는 맥관형성 혈관에서 응혈의 형성을 초래하는 맥관형성 내피 세포에 영향을 주도록 설계된다. 응혈은 영양물과 산소의 흐름을 막아 혈관의 잔류물을 남기고, 결국 혈관 및 주변 조직의 죽음을 초래한다.

원치 않는 종양을 제거하기 위해 종양 맥관구조 내에서 기본 개념의 응괴 형성은 종양 맥관을 표적지향하는 항체를 사용하여 수행되었다. 본 발명은 지질들이 혈전형성 폭포를 촉진하는 약제를 함유하는 양이온성 지질을 사용하여 개선된 결과를 달성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 양이온성 리포좀은 혈전성(혈액 응고 폭포)의 주 시작 단백질인 인간 조직 인자(TF)를 둘러싸도록 구성될 수 있다.

종양 세포는 혈액 공급에 의존한다. 종양 맥관구조의 국소적 중절은 무더기의 종양 세포 죽음을 초래할 것이다. 종양 맥관 내피는 혈액과 직접 접촉한다. 그러나, 종양 세포 자체가 혈류 밖에 있고, 대부분이 순환계 안으로 주사된 많은 물질에 접근하기 어렵다. 본 발명의 다른 관점들 뿐만 아니라 이 관점은 표적이 되는 세포가 그들 자체가 변형되지 않는 맥관형성 내피 세포, 즉, 치료요법에 내성을 갖도록 만드는 돌연 변이를 받아들이지 않는 세포에서 특히 잘 작용한다. 종양 세포는 상당한 돌연 변이를 겪고 그러한 돌연변이는 종종 치료요법에 세포를 내성으로 만든다. 항체-지정 표적을 사용하여 종양의 크기를 줄이는 관점에 대한 결과는 하기의 다른 기술자들에 의해 교시되었다. Burrows 및 Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8996-9000; 및 Huang et al. (1997) Science 275: 547-550.

본 발명과 관련하여 응괴 형성을 수행하기 위하여, DNA/양이온성 지질 복합체를 형성하는 것이 바람직하다. 이 복합체는 단백질이 혈전성 (혈액 응고) 폭포를 위한 주요 초기 수용체인 인간 조직 인자와 같은 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함할 것이다. 유전자 인코딩 TF는 바람직하게 활동적으로 프로모터가 맥관형성 내피 세포의 환경에서 활성화되고 잠재성 내피 세포의 환경안에서는 활성화되지 않는 프로모터에 연결된다. 따라서, 복합체의 양이온성 지질은 복합체를 맥관형성 내피 세포에 회합시키는 원인이 될 것이다. 그후에, 복합체는 맥관형성 내피 세포 안으로 오게되고 복합체의 DNA가 발현될 것이다. 발현된 단백질은 혈액 응고 폭포를 일으킬 것이다. 응혈이 혈관내에서 형성되면, 한층더 주변 종양 세포에 대한 산소와 영양물 공급이 차단될 것이다. 그후에, 종양 세포는 죽을 것이다. 절단된 인간 조직 인자(tTF)와 같이 인간 조직 인자에 대한 변이는 또한 응고를 일으키는데 사용될 수 있다. 유전 물질 인코딩 tTF 및 다른 인자들은 공지되어 있다. (위에서 인용한 Huang, 외 참고문헌 및 거기에 인용된 공보 참조)

죽상경화성 플라크를 감소시키는 방법

본 발명은 더 나아가 포유류에 양이온성 지질 및 맥관형성을 감소시키는 물질을 포함하는 조성물을 투여하고, 맥관형성 내피 세포로 들어가도록 하는 시간과방식으로 그 조성물을 맥관형성 혈관의 맥관형성 내피 세포와 회합하도록 하고, 거기서 그 물질이 맥관형성을 감소시키는 작용을 하고, 맥관형성의 감소가 죽상경화성 플라크 형성의 감소를 초래하도록 함으로써, 포유류에서 죽상경화성 플라크를 감소시키는 방법들을 제공한다. 맥관형성을 억제하는 물질들은 명세서의 다른 곳에서 더 자세히 논의된다.

용어 "죽상경화증"은 당업계에서 잘 알려진 것이며, 민무늬근세포 및 지질의 혈관내막 안에서 진행성 축적의 원인이 되는 대형 및 중간 크기의 동맥들의 질병을 의미한다. 병소(플라크)의 성장이 계속되면 동맥벽의 다른 층들을 잠식하고 관강을 좁힌다. 용어 "죽상경화성 플라크의 감소"는 여기서 사용된 바와 같이, 항맥관형성제를 함유하지 않는 양이온성 리포좀으로 치료된 대조 표준 포유류에서의 죽상경화성 플라크와 비교할 때, 맥관형성 억제제를 함유하는 본 발명의 양이온성 리포좀을 그러한 병소를 갖는 포유류에 투여할 때, 죽상경화성 플라크 또는 병소의 크기가 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 적어도 약 25%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 이상 감소되는 것을 의미한다. 일부 구체예에서는, 죽상경화성 플라크가 완전히 사라졌다. 따라서, 개체에서 죽상경화증 플라크를 감소시키는 방법으로 사용하기 위해, 맥관형성을 억제하거나 감소시키는 물질의 "치료상으로 효과적인 양" 또는 " 효과적인 양" 이란, 개체에 투여할때, 물질을 투여하지 않은 대조 표준 시험재에서 형성된 플라크의 크기와 비교하여, 죽상경화성 플라크의 크기를 적어도 약 10%, 보다 바람직하게는 적어도 약 25%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 이상 감소시키는 양이다.

죽상경화성 플라크가 감소되었는지 여부는 미국 특허 명세서 No.5,807,536에 기술된 것들을 포함하여, 어떠한 공지된 방법을 사용하여 방사선 사진 촬영 화상에 의해 결정될 수 있다.; 혈관조영술에서는 카테테르를 혈관에 삽입하고 요오드 기재 염료와 같은 대조제가 혈관을 이미지화하는데 사용되고 ; 혈관내의 초음파 탐침을 사용하여 이미지화한다. 동물 실험에서, 혈관 절편들에 대해 시각적으로 플라크의 감소를 검사할 수 있다. 예를 들어, Moulton et al. (1999) Circulation 99: 1726-1732 참조.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법들은 하나 이상의 죽상경화증의 후유증의 감소를 초래한다. 따라서, 본 발명은 이것으로 제한되지는 않지만, 허혈성 심장 질환, 심근경색증, 재협착증, 뇌졸중 및 말초 혈관 질환을 포함하는, 죽상경화증 관련 질병 상태를 감소시키는 방법을 제공한다. 하나 이상의 이들 질병 상태가 감소되었는지 여부는 이것으로 제한되지는 않지만, 심전도 측정법 및 당업계에서 표준인 다른 방법들을 포함하는, 통상의 평가 방법으로 결정될 수 있다.

죽상경화성 플라크를 감소시키기 위한 본 발명의 방법들은 본 발명의 방법 에 의해, 또는 풍선 혈관형성술 또는 관상동맥 바이패스 수술과 같은 다른 방법에 의해 제거된 플라크의 재발(재형성)의 가능성을 예방하고, 억제하고 또는 감소시키는데 유용하다. 따라서, 일부 구체예에서는, 방법들은 환자의 순환 혈관으로부터 죽상경화성 플라크를 제거하는 단계; 그리고 환자에게 양이온성 리포좀과 맥관형성을 억제하는 활성 성분을 포함하는 조성물의 치료상으로 효과적인 양을 투여하는 단계를 포함한다. 양이온성 리포좀과 맥관형성을 억제하는 활성 성분을 포함하는 조성물은 환자로부터 플라크를 제거하기 전, 제거하는 동안 또는 제거한 후에 투여할 수 있다.

어떠한 양이온성 리포좀 또는 상기된 양이온성 리포좀을 포함하는 조성물은, 여기서 설명된 것들을 포함하는 어떠한 공지된 맥관형성 억제제(들)과 조합하여, 죽상경화성 플라크를 감소시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. 맥관형성 억제제-양이온성 지질은 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 조제될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Remington에서: TheScience and Practice of Pharmacy, (1995) 또는 latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PA.에 상세하게 기술되어 있다.

맥관형성의 실험적 모델

본 발명은 맥관형성을 위한 설치류 모델을 사용함으로써 용이하게 되었다. 천식 및 기관지염과 같은 만성 염증 질환은 기도 점막에서 조직 및 맥관의 개형을 유발한다. 만성 기도염의 병인에 대해 알기 위해서, 쥐 및 마우스의 기관에서 만성 염증 및 조직 개형이 발생하는 모델을 사용하였다. 맥관형성은 미코플라스마 동맥 감염의 결과로서 기도 점막에서 발달한다. 이 모델에서, 미코플라스마 폐동맥 세균은 기관 및 기관지 내피에서 지속 감염의 원인이 된다. M. 풀모니스에 감염된 쥐의 기도 점막은 몇가지 독특한 이상을 갖는다.:1) 내피 및 고유층의 비후;2)내피의 세포질 조성에서의 변화;3)맥관형성;4)플라스마 누출의 관점에서 염증성 매개체 물질 P에 대한 맥관형성 혈관의 증가된 감도;5)소정맥 뿐만 아니라 모세혈관으로부터 물질 P-유발된 누출; 및 6)모세혈관 내피 세포상에서 물질 P(NKI 수용체)를 위한 수용체의 증가된 개수. 이 모델에서, 맥관형성은 만성 염증에 의해 추진되고, 혈관은 염증성 매개체에 보다 감염되기 쉽다.

내강(luminal) 내피 세포 표면을 착색하기 위해 렉틴의 관류를 사용한 연구는 M.풀모니스 감염 후에 쥐에서 맥관형성의 정도를 밝혀냈다. 다수의 모세혈관과 같은 혈관들이 감염된 쥐의 기관 점막에 존재하고, 이들 혈관은 하기의 염증성 매개체 물질 P의 정맥 주사를 누출시킨다.

마우스에서, M.풀모니스는 접종 후 6-9일을 절정으로 하는 급성 폐렴과 이어서 기도의 지속 감염의 원인이 된다. M.풀모니스에 의한 감염에 대한 마우스의 반응은 스트레인에 크게 의존한다: 예를 들어, C3H 스트레인의 마우스는 C57BL 스트레인보다 더 높은 사망률과 시토카인 종양 괴사 인자-α의 더 큰 감소를 나타낸다. 내피 과형성과 같이, M.풀모니스에 의해 감염된 쥐의 기도에서 점막의 개형의 몇가지 양상들이 설명되었다. M.풀모니스의 비강 접종으로 감염된 C57BL/6 마우스에서, 명백하게 새로운 모세혈관의 성장에 의해 기관 혈관의 수가 급격하게 증가한다. 이러한 스트레인에서, 기관 점막의 맥관구조는 더이상 2차원 평면이 아니고, 작은 혈관들이 점막의 면에 수직하게 성장한다. 증가된 맥관질 영역에서 다수의 명백한 맥관의 발아들이 발견된다. 따라서, M.풀모니스에 의한 C57BL/6 마우스의 감염은 내피 증식, 맥관의 개형, 및 맥관형성과 함께 만성 기도염을 일으킨다. 대조적으로, M.풀모니스의 비강 접종에 의해 감염된 C3H/HeN 마우스에서는 기관 점막에서의 맥관의 내피 세포의 수가 증가하지만, 혈관의 수는 증가하지 않는다. 증가된 맥관질은 혈관의 길이 또는 수의 증가 때문이 아니라, 혈관 직경의 증가 때문이고, 이러한 혈관 크기의 증가는 내피 세포의 수의 배가의 원인이 된다. 감염된 기관에서 개개의 내피 세포들의 크기는 두드러지게 증가하지 않는다. M.풀모니스에 대한 혈중 항체의 수준은 마우스의 두가지 스트레인에 있어서 비슷하다. 따라서, M.풀모니스에 의한 C3H/HeN 마우스의 감염은 맥관 개형 및 내피 증식과 함께 만성 기도염을 일으키지만 혈관의 수에 있어서는 현저한 증가는 만들지 않는 반면, C57BL/6 마우스에서는 내피 증식 및 새로운 혈관들을 만든다.

두번째 모델에서, 맥관형성은 SV40 바이러스 종양 유전자의 트랜스제닉 발현으로부터 기인하는 종양에서 발생한다. "RIP-Tag" 트랜스제닉 마우스 모델은 정상 조직으로부터 종양까지의 잘 특징지어진 경과에서 맥관형성 내피 세포에서의 표현형 변화를 연구하는 기회를 제공한다. "RIP-Tag" 트랜스제닉 마우스 모델에서, SV-40 바이러스로부터의 종양 유전자, 큰 T 항원(Tag)이 쥐 인슐린 프로모터 (RIP)의 영역에 의해 유도된다. 쥐과 게놈안으로 삽입될 때, 이 구조물은 특히 췌장 전체에 걸쳐서 흩어져 있는 약 400 소도에 집중되어 있는 췌장 소도 β-세포에서 Tag 발현을 유발한다. 이들 마우스에서 췌장의 모든 소도들이 Tag를 발현하지만, 소도들은 대략 나이 6주까지는 정상적으로 발달한다. 이 시점 후에, 소도들의 약 50%가 과형성된다. 그러나, 이들 과형성 소도들 중에서, 작은 부분(< 5% )은 약 10주까지 종양으로 발달한다. 종양 발생에서의 이러한 병목은 소도가 맥관형성을 유발하는 능력을 필요로할 때 극복되는 것으로 나타난다.:따라서 종양발생의 이러한 단계는 "맥관형성 스위치" 라고 이름했다. 유사한 맥관형성 스위치는 또한 몇가지 인간 종양에서뿐만 아니라 쥐과 종양발생의 다른 모델들에서도 존재하는 것으로 나타난다. 따라서, "RIP-Tag" 모델은 종양에서 맥관형성의 경과를 조사하기 위해 잘 특징지어진 구조를 제공한다.

발명의 개요

맥관형성 내피세포에 약제를 송달하는 방법이 개시된다. 그 방법은 맥관형성을 촉진하거나 억제하는 양이온성 지질과 화합물 및/또는 검출가능한 라벨을 포함하는 양이온성 리포좀(또는 폴리뉴클레오티드/지질 복합체)을 바람직하게는 순환계내로, 더욱 바람직하게는 동맥내로 주사하는 것을 포함한다. 투여후, 양이온성 리포좀은 선택적으로 맥관형성 내피세포와 회합하는데, 그것은 대응하는 비맥관형성 내피세포와 회합하는 것보다 2배 이상(바람직하게는 10배이상) 맥관형성 내피세포와 회합한다는 것을 의미한다. 리포좀(또는 폴리뉴클레오티드/지질 복합체)이 맥관형성 내피세포와 회합할때, 내피세포에 의해 흡수되어 바람직한 효과를 갖는다. 그 물질은 내피세포를 파괴할 수 있고, 맥관형성을 더욱 촉진할 수 있으며, 응고의 촉진 및/또는 적당한 수단에 의해 검출될 수 있도록 내피세포를 라벨링할 수 있다. 맥관형성 내피세포에 영향을 미치는 물질은 단백질을 인코딩하는 DNA와 같은 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 그것의 발현시, 맥관형성을 촉진하거나 억제한다. 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터 내에 함유되어 있으며, 그 프로모터는 맥관형성 내피세포에만 바람직하게는 활성되거나, 화합물을 투여한 세포에서만 활성될 수 있으므로, 프로모터의 활성에 의해 유전자를 발현시키거거나 발현시키지 않는 것이 가능하다.

본 발명의 목적은 선택적으로 맥관형성 내피세포에 영향을 미치는 방법을 제공하는 것이며, 그럼에 의해, 맥관형성을 억제하거나 촉진하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 검출가능한 라벨을 포함하는 양이온성 리포좀을 투여하여 맥관형성 부위를 진단하는 것이며, 상기 리포좀을 선택적으로 맥관형성 내피세포와 회합하도록, 그리고 대응하는 비맥관형성 내피세포와는 회합하지 않도록 디자인하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 양이온성 지질과 화합물로 이루어지고, 특히, 맥관형성을 억제하거나 촉진하도록 의도되고 디자인된 양이온성 리포좀을 제공하는 것이며, 그 화합물은 수용성 또는 물에 잘 분산되며, 또는 지질 적합성이며 지질층에 혼합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 양이온성 지질과 탁산을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 양이온성 지질과 회합된 탁산으로 맥관형성 내피세포를 표적지향화하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관내 혈류를 국부적으로 방해 또는 완전히 막는 혈관내 혈병으로 이르는 방식으로 선택적으로 맥관형성 내피세포에 영향을 미치는방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 후에 배양 및/분석을 위해 검출가능한 라벨로 세포를 라벨링하여 맥관형성 내피세포의 주변세포와의 분리를 가능케함으로써 맥관형성 내피세포를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 원하지 않는 종양의 맥관형성 내피세포에 독성 화합물을 송달하여 그 종양을 파괴하는 방법을 제공하는 것이며, 그 화합물은 맥관형성 내피세포를 파괴한 후, 종양 세포를 파괴한다.

본 발명의 또 다른 목적은 양이온성 지질/DNA 복합체를 맥관형성 내피세포에 송달하여 맥관형성 내피세포에 선택적으로 영향을 미치는 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 DNA는 바람직하게는 맥관형성 내피세포와만 유일하게 회합하는 분위기 하에서만 선택적으로 활성화되는 프로모터(즉, 그 프로모터는 잠재성 내피세포에서는 활성화되지 않음)에 부착되어 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 맥관형성을 감소시키는 물질을 함유하는 양이온성 지질 복합체를 송달하여 플라크 형성을 감소시켜 혈관내 죽상경화성 플라크 형성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한가지 양태는 본 발명의 양이온성 리포좀이 대응하는 비맥관형성 내피세포와 회합하는 것보다 훨씬 높게 우선적으로(2배 이상 및 바람직하게는 10배 이상)로 맥관형성 내피세포와 선택적으로 회합하는 것이다.

본 발명의 한가지 장점은 본 발명의 양이온성 리포좀이 소량의 독성 화합물을 내피세포에 정확하게 송달하는데 사용될 수 있다는 것이다. 그 세포는 혈병으로 인해 혈관 파괴 또는 작동불능하게 되는 방식으로 영향을 받고(예를들면, 죽음), 주변 조직(예를들면, 종양 세포)으로의 영양 공급을 중단시켜 조직(예를들면, 고체 종양)을 파괴한다.

본 발명의 또 다른 장점은 본 발명의 양이온성 리포좀을 맥관형성중인 악성 종양 또는 양성 종양과 회합시켜 맥관형성을 억제하는데 사용할 수 있다는 것이다.

본 발명의 또 다른 장점은 양이온성 리포좀을 맥관형성을 촉진하는 화합물을 부위에 직접 송달하여 창상 치유를 강화하는데 사용할 수 있다는 것이다.

본 발명의 중요한 양태는, 이상 조직을 직접 치료를 하지않고, 몇가지 부류의 질환 및/또는 이상을 치료한다는 것이다. 예를들면 종양에 혈액 공급을 중단시켜 맥관형성을 억제하여, 어떠한 방식으로든, 종양 세포를 직접치료하지 않고 죽인다.

본 발명의 이들 그리고 다른 목적, 장점 그리고 양태는 첨부된 도면과 함께 본원에 제공된 명세서를 읽으면 당업자들에게 자명해질 것이다.

하기의 실시예들은 양이온성 리포좀을 만들고 그러한 리포좀을 사용하기 위한 방법론을 수행하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 당업자들에게 제공하기 위해 나오고, 본 발명이라고 간주되는 것의 범위를 제한하려는 목적은 아니다. 사용된 숫자들(예를 들어, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 확보하기 위해 노력했지만, 일부실험적인 에러와 편차가 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 부분은 중량부, 분자량은 평균 분자량; 온도는 섭씨 온도; 압력은 대기압에서 또는 대기근처이다. 하기의 각각의 실시예들은 요약되는 과정 및 결과들과 함께 수행된 다수의 실험을 나타낸다는 것을 주의해야 한다. 모든 실험이 실용적이고 명확한 결과를 제공하지 않았다는 것을 당업자들은 이해해야 할 것이다. 그러나, 하기는 얻어진 결과를 정확하게 전하고 있다고 여겨진다.

실시예 1

정상 마우스에서 양이온성 리포좀의 분포

리포좀 및/또는 플라스미드 DNA를 라벨하고 정맥 주사 후 다양한 시간에서 라벨링된 복합체의 세포 분포를 결정하였다. 실험은 암수 모두 병원체 없는 마우스(20-25g 체중)에서 수행하였다.

Texas Red 또는 레드 형광성 카르보시아닌 염료 DiI 또는 CM-DiI로 라벨링된 양이온성 지질 DDAB 또는 DOTAP 및 중성 지질 DOPE 또는 콜레스테롤로부터 양이온성 작은 단일골층판 소포 리포좀들을 준비하였고, 일부 경우에서 루시페라제 또는 β-갈락토시다제와 같은 리포터 유전자를 함유하는 플라스미드 DNA에 복합되었다. 내피 세포들을 형광성 식물 렉틴 플루오레신-리코페르시콘 식용물질(esculentum)을 사용하여 라벨링하였다. 단핵 세포/대식 세포들을 형광성 비즈(Duke, 500 nm)를 사용하여 라벨링하였다. 세포핵은 DAPI, YO-PRO, 또는 Hoechst 33342 염료로 라벨링하였다.

형광성 리포좀 또는 10-60μg의 DNA를 포함하는 리포좀-DNA 복합체를 300μl이하로 마취시키지 않은 마우스에 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 일부 구체예에서는, 500nm 형광성 비즈를 복합체 후에 주사하였다. 5분 내지 24시간 후에, 동물은 펜토바르비탈 나트륨으로 마취시키고 그후 좌심실을 통해 고정액(인산염 완충된 염류에 대한 1% 파라포름알데히드 용액)를 관류한 후에, 형광성 렉틴으로 맥관구조의 내피 표면을 라벨링하였다. 관류 후에, 조직들을 떼어내고 전체 마운트로 또는 비브라톰 또는 조직 절단기를 사용하여 박편들로 절단하여 준비하였다. 게다가, 일부 표본들은 전자 현미경 관찰로 분석하였다. 조직을 에피형광 현미경 관찰 또는 공초점 현미경 관찰로 검사하였다. 게다가, 일부 표본들은 투과 전자 현미경 관찰로 검사하였다.

결과:주사 후에 5분 내지 24시간동안 검사한 마우스에서, CM-DiI 또는 DiI-라벨링된 리포좀 또는 리포좀-DNA 복합체가 폐에 가장 많았다. 또한, 그들은 폐포 모세혈관의 내피 세포에서 가장 다수였다. 폐포 모세혈관에서 형광은 두가지 폐의 모든 엽들에 균일하게 분포되었다. 게다가, 일부 CM-DiI 또는 DiI 형광은 혈관내의 단핵세포/대식세포들에 존재하였다.

폐 다음으로, 간과 비장이 가장 많은 양의 라벨링된 리포좀 또는 복합체를 가졌다. 이들 기관에서는, CM-DiI 또는 DiI 형광이 형광성 비즈와 공동 집중하였다. 간에는, CM-DiI 또는 DiI 형광과 비스가 Kupffer 세포에 존재하였다. 비장에는, 그들이 대식세포에 있었다.

난소는 또한 혈관들을 CM-DiI 또는 DiI로 라벨링된 리포좀 또는 복합체로 대량으로 라벨링하였다. 특히, 마우스 난소의 큰 난포들 및 황체의 맥관형성 혈관에서 내피 세포가 열심으로 CM-DiI 또는 DiI 라벨링된 DDAB를 흡수하는 것이 관찰되었다. 이들 관찰 결과들은 사진으로 첨부하였다(도 1). 다른 난소의 혈관들은 라벨링된 복합체를 비교적 적게 함유하였다. 이들 결과는 맥관형성 내피 세포들이 우선적으로 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체를 흡수한다는 즉, 실험에서 사용된 양이온성 리포좀들이 맥관형성을 겪고 있지 않은 내피 세포들에 비해서, 맥관형성을 겪고 있는 내피 세포와 훨씬 잘 회합하는 경향이 있었다는 것을 추론하는데 사용되었다.

라벨링된 리포좀 또는 복합체는 또한 림프절의 높은 내피 소정맥(HEV)과 소장의 Peyer의 접포들의 내피 세포에 매우 많았던 반면에, 그들은 이들 림프모양 기관의 모세혈관의 내피 세포에서는 희박하였다. 라벨링된 리포좀 또는 복합체는 또한 동맥 뇌하수체, 심근, 횡경막, 부신 피질 및 지방 조직의 모세혈관 내피 세포들에서도 다수였다.

라벨링된 리포좀 또는 복합체는 방광, 자궁 및 난관의 소정맥들에 부착된 단핵세포/대식세포에 풍부했다. 일부 소정맥들은 다수의 라벨링된 단핵세포/대식세포를 포함하였다. 게다가, 이들 기관에서 소동맥, 모세혈관 및 소정맥의 내피 세포의 작은 부분이 라벨되었다.

비교적 적은 수의 라벨링된 리포좀 또는 복합체들이 뒤뇌하수체, 신장 수질, 장융모(회장), 췌장 및 부신 수질의 모세혈관 내피 세포들과 회합하였다. 경우에 따라 단핵세포/대식세포를 제외하고는, 뇌, 갑상선, 신장 피질, 췌장 소도, 기관 또는 기관지의 내피 세포들에서는 라벨링된 리포좀 또는 복합체가 거의 발견되지 않았다.

결론: 이들 연구에서 사용된 CM-DiI 또는 DiI-라벨링된 DDAB: 콜레스테롤 리포좀 또는 리포좀-DNA 복합체의 조제물은 3가지 주된 세포 타입: 내피 세포, 대식 세포 및 단핵세포를 표적지향 하였다. 리포좀 또는 복합체의 흡수는 기관-및 혈관-특이성이었다. 대부분은 폐의 모세혈관 내피 세포와 간 및 비장의 대식세포들이 흡수하였다. 난소, 동맥 뇌하수체, 심장, 횡경막, 부신 피질 및 지방 조직의 모세혈관 내피 세포들이 또한 표적이 되었다. 난소에서 리포좀 또는 복합체를 흡수하는 혈관들이 맥관형성의 부위였다. 게다가, 림프절의 HEV 및 장 Peyer의 접포들이 표적이 되었다. 다른 기관의 내피 세포 또는 대식 세포들의 표적은 덜 빈번하고 보다 가변성이었다. 뇌, 갑상선, 신장 피질, 기관 및 기관지의 혈관들은 표적이 되지 않았다.

게다가, 실험은 대부분의 기관에서 리포좀 또는 복합체가 맥관구조로부터 누출되지 않았다는 것을 증명하였다. 비록 그들이 불연속 내피와 함께 혈관들을 갖는 비장의 혈관외의 세포에서 발견되었지만, 다른 기관에서는 흘러나오지 않았다.

결국, 큰 난소 난포들 및 황체의 혈관들에 의한 양이온성 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체의 맹렬한 흡수는 맥관형성 혈관의 내피 세포들이 우선적인 흡수의 부위라는 것을 나타낸다.

실시예 2

RIP-Tag5 마우스에서의 DDAB:콜레스테롤 리포좀 또는 리포좀-DNA 복합체의 흡수

실시예 1의 실험 결과는 난소의 난포들과 황체에서 맥관형성 혈관이 양이온성 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체들을 열심으로 흡수한다는 것을 나타내었다. 따라서, 종양의 맥관형성 혈관들의 내피 세포가 양이온성 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체들을 열심으로 흡수하는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.

종양의 트랜스제닉 RIP-Tag5 모델을 사용하였다. Hanahan, (1985) Nature 315: 115-22; 및 Hanahan and Folkman (1996) Cell 86: 353-64 참조. 이 모델에서, RIP-Tag라고 부르는, SV-40 바이러스로부터의 종양 유전자, 큰 T 항원(Tag)는 쥐 인슐린 프로모터(RIP)의 영역에 의해 유도된다. 쥐과 게놈안으로 삽입될때, 이 구조물은 특히 췌장 소도의 β-세포에서 T 항원의 발현을 유발한다.

이 모델의 한가지 중요한 속성은 다양한 단계의 종양 발달 및 따라서 다양한 단계의 맥관형성이 각각의 RIP-Tag5 마우스에 동시에 존재한다는 것이다. 모든 300-400 소도들은 T 항원을 발현하지만, 소도들은 처음에 정상적으로 발달한다. 그러나, 6주의 나이에서 약 절반은 과형성하고, 이들 중, 작은 부분이 10주까지 종양으로 발전한다. 종양발생은 맥관형성의 개시와 동시에 일어나는 것으로 보인다. 이러한 전환은 "맥관형성 스위치"라고 불러왔다. Folkman, et al. (1989) Nature 339: 58-61; 및 Hanahan 및 Folkman(1996) Cell 86: 353-64. 유사한 맥관형성 스부위가 몇가지 인간 종양에서뿐만 아니라 종양발생의 다른 쥐과 모델에 존재하는 것으로 나타난다. Hanahan 및 Folkman(1996) Cell 86: 353-64.

실시예 1에 따라서 방법 및 재료들을 사용하였다. 특히, CM-DiI 또는 DiI-라벨링된 DDAB:콜레스테롤 리포좀을 하나의 종양을 갖는 RIP-Tag5 마우스에 정맥 주사하고, CM-DiI 또는 DiI-라벨링된 DDAB:콜레스테롤-DNA 복합체를 또다른 RIP-Tag5 마우스에 정맥 주사하였다. 췌장 소도 세포 종양의 맥관형성 혈관에서의 리포좀 또는 복합체의 분포를 주사후 24시간 검사하였고, 정상 마우스의 췌장 소도의 혈관에서의 그것과 비교하였다.

결과: 두가지 새로운 관찰을 얻었다.:(1) 내피를 통한 누출없이, 리포좀 또는 복합체는 맥관형성 혈관의 내피 세포에 의해 흡수되었고 (2) 리포좀 또는 복합체의 적혈구 내질의 흡수는 췌장 소도의 정상 혈관의 내피 세포에서보다 맥관형성 혈관의 내피 세포에서 더 컸다.(도 2는 조직 표본의 도면이다.)

결론: 이 실험은 맥관형성 종양 혈관에 의한 DDAB:콜레스테롤 리포좀 또는 리포좀-DNA 복합체의 우선적인 흡수와 일치하는 결과를 주었다. 실험을 반복하기 전에 (1)리포좀-DNA 복합체의 형광 강도가 증가되었고, (2)RIP-Tag 마우스의 종양에서 양이온성 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체의 흡수 부위의 집중화 방법이 개선되었고; (3)RIP-Tag5 마우스에서 췌장 소도 세포 종양에서의 맥관형성 혈관의 구조 및 기능과의 더 큰 친밀성을 얻었다.

실시예 3

RIP-Tag2 마우스에서의 DOTAP:콜레스테롤 리포좀-DNA 복합체의 흡수

목적:DiI의 장소에서 Texas Red-DHPE를 사용함으로써 리포좀-DNA 복합체의 형광 강도가 증가되었다.; 형광성 양이온성 리포좀-DNA 복합체의 흡수의 부위를 한곳에 집중화하기 위해 RIP-Tag2 마우스의 췌장을 준비하는 방법이 개선되었다.; 그리고 RIP-Tag2 마우스에서의 췌장 소도 세포 종양에서의 맥관형성 혈관의 구조 및기능을 연구하였다. 이들 개선들과 함께, 양이온성 리포좀과 지질-DNA 복합체가 어떻게 흡수되는지를 결정하기 위해 실시예 2에서 설명된 타입의 실험을 수행하였다.

방법:Texas Red-DHPE로 라벨링한, 양이온성 DOTAP:콜레스테롤 작은 단일골층판 소포 리포좀들을 준비하였다. 리포좀-DNA 복합체는 300μl로 60μg의 플라스미드 DNA 를 사용하여, 5% 글루코스에서 전체 지질:DNA 의 비가 24:1가 되도록 준비하였다. 복합체(300μl)를 마취하지 않은 트랜스제닉 RIP1-Tag2 C57BL/6 마우스 및 마취하지 않은 정상 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다.

복합체를 주사하고 4시간 후에, 넴뷰탈 50mg/kg을 복강내 주사하여 마우스를 마취시켰다. 맥관구조는 상행대동맥을 통해 1% 파라포름알데히드를 관류함으로써 고정시키고, 맥관구조의 내강 표면은 그린 형광성 렉틴을 관류함으로써 착색하였다, Thurston et al (1996) Am J Physiol 271: H2547-2562. 조직 전체 슬라이드 또는 비브라톰 박편들을 Vectashield로 슬라이드에 고정시키고, 혈관은 Zeiss Axiophot 형광 현미경 또는 크립톤-아르곤 레이저 및 최적화된 광전배증관 튜브가 장착된 Zeiss LSM 410 공초점 현미경을 사용하여 검사하였다. 이미지들은 Kodak Ektachrome 필름(ASA 400)에 또는 디지탈 공초점 이미지 파일로서 기록되었다.

결과: 실험은 RIP1-Tag2 마우스의 췌장 종양에서 맥관형성 내피 세포들에 의한 Texas Red로 라벨링된 DOTAP:콜레스테롤-DNA 복합체의 맹렬한 흡수를 분명히 나타내었다. 종양 혈관에 의한 흡수는 이에 해당하는 정상 췌장 소도들의 내피 세포에 의한 이들 복합체의 흡수를 훨씬 초과하였다. (도 3과 4 비교)

종양들은 그들의 혈관이 레드 형광성 리포좀 복합체로 많이 라벨링되기 때문에 인접한 조직들로부터 손쉽게 구별된다. 종양의 맥관구조의 기하학은 정상 소도들을 대표하는 패턴으로부터 정상 소도들에서보다 현저하게 더 크고 보다 조밀하게 충전된 동양(sinusoid) 혈관들의 조밀한, 사행성, 문합성 망상조직에 이르기까지 가변성이다. 후자의 경우, 맥관구조는 황체의 그것과 유사하였다. 종양 혈관의 라벨링의 강도는 개략적으로 종양의 크기와 관련하였다. 가장 큰 종양이 가장 많은 라벨을 가졌다.

작은 크기 내지는 중간 크기의 종양들에서의 일부 혈관들은 뭉뚝한, 병소의,동맥류와 유사한 돌출부를 가졌다. 이러한 부위들은 적혈구 내질로 추정되는 대단히 많은 수의 Texas Red 라벨링된 점들이 존재하기 때문에 특히 눈에 잘 띄었다. 이들 부위의 Texas Red 라벨은 인접한 혈관들의 그것보다 더 컸다. 이러한 구조물이 모세혈관 발아일 것으로 생각된다. 구조물은 조밀하고, 복잡한 맥관구조를 갖고, 그곳의 혈관들이 균일하게 대량으로 라벨링된 큰 종양에서는 발견되지 않았다.

종양에서 Texas Red 라벨링된 복합체의 혈관외유출의 증거는 없었다. 또한, 종양에서 혈관외 적혈구의 클러스터 내부에서는 어떠한 Texas Red 라벨링된 복합체도 보이지 않았다. 종양 맥관구조의 많은 라벨은 그들 발달의 초기 단계 동안에 난소 황체의 그것과 유사하였다.

실시예 4

종양 및 만성 염증에서 맥관형성 혈관에 의한 양이온성 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체의 흡수

목적: 관찰을 맥관형성의 다른 모델로 확장하기 위해서 실시예 3에서 설명한 타입의 실험을 수행하였다. 이들 실험은 또한 양이온성 리포좀이 맥관형성 혈관을 표적지향하기 위해 DNA가 존재해야 하는지 여부의 의문을 제기하였다. 맥관형성 혈관에 의한 DOTAP:콜레스테롤 리포좀 또는 리포좀-DNA 복합체의 우선적인 흡수가 있는지 여부에 관하여 맥관형성의 4가지 동물 모델을 조사하였다.

모델:RIP1-Tag2 종양 모델. 트랜스제닉 C57BL/6 마우스를 제조하였고 PCR 분석에 의해 출생시 표현(phenotype)되었다. 마우스 모델은 위에서 설명되었다.

HPV 종양 모델. 트랜스제닉 HPV(인간 유두종 바이러스) 마우스를 제조하였고 출생시 표현되었다. 비트랜스제닉 동산아(litter mates)가 대조 표준으로 사용되었다. 이 모델에서, 인간 유두종 바이러스로부터 종양 유전자는 케라틴 14 프로모터의 영역에 의해 유도되었다. 쥐과 게놈안으로 삽입될 때, 이 구조물은 특히 상피 세포에서 HPV 발현을 유발한다. 모든 트랜스제닉 마우스는 상부 흉부 및 귀의 피부에서는 맥관형성을 동반하는 형성장애를 발달시키고, 작은 부분은 종양을 발달시킨다.

마우스에서의 미코플라스마 풀모니스 감염 모델. 이 감염은 기도 점막에서 맥관형성을 동반하는 만성 기도염을 일으킨다. 마취(87mg/kg 케타민 및 13mg/kg 크실라진 복강내 주사)후에, 병원체 없는, 나이 8주, 수컷 및 암컷 C3H/HeN 또는 C57BL/6 마우스(둘다 Charles River로부터 획득)에 3x10⁴군체 형성 단위의 미코플라스마 풀모니스(스트레인 5782C-UAB CT7)를 50μl의 부피로, 비강내 접종하였다.병원체 없는 마우스는 대조 표준으로 사용하고, 살균 육즙으로 접종하였다. 감염된 대조표준 마우스들을 칸막이가 있는 사육 상자에 따로따로 가뒀다. 실험의 마지막에 M.풀모니스에 대한 항체의 혈청 수준을 측정하였다. 마우스는 감염후에 1내지 8주를 연구하였다.

쥐에서의 미코플라스마 풀모니스 감염 모델. 마우스에서와 같이, 이 감염은 만성 기도 질환의 원인이 되는데, 그것의 한가지 특징이 기도 점막에서 맥관형성이다. 마취(40 mg/kg 케타민 및 8 mg/kg 크실라진 복강내 주입)후에, 병원체 없는, 나이 8주, 수컷 Wister 쥐(Charles River로부터 획득)를 200μl 부피의 5782C4 스트레인의 미코플라스마 풀모니스로 3일간 계속하여 매일 비강내 접종하였다. 육즙으로 접종된 항체없는 쥐는 대조표준으로 사용하였다. 감염된 대조표준 쥐들을 칸막이가 있는 사육상자에 따로따로 가뒀다. 실험의 마지막에 M.풀모니스 및 다른 병원체에 대한 항체의 혈청 수준을 측정하였다. (Microbiological Associates, Bethesda MD)

방법:실시예 3에서 설명한바와 같이 Texas Red-DHPE으로 라벨링된 양이온성 DOTAP :콜레스테롤 리포좀을 준비하였다. 리포좀을 5% 글루코스에서 100μl의 부피로 360 nmol 총 지질의 투여량으로 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 쥐들은 대퇴부 정맥을 통해 주사하였다. 리포좀-DNA 복합체는 200-300μl로 60μg의 플라스미드 DNA를 사용하여, 5% 글루코스에서 24:1의 전체 지질:DNA 비로 제조하였다. 리포좀 또는 복합체(200-300μl)를 마취하지 않은 RIP-Tag2, HPV, 또는 M.풀모니스-감염된 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 비트랜스제닉 또는 병원체 없는 동물들을 대조 표준으로, 적절하게 사용하였다.

주사한지 20분 또는 4시간 후에, 마우스 또는 쥐를 넴뷰탈 50mg/kg의 복강내 주사로 마취하였다. 맥관구조는 상행대동맥을 통해 1% 파라포름알데히드를 관류함으로써 고정시키고, 맥관구조의 내강 표면은 그린 형광성 렉틴을 관류함으로써 착색하였다, Thurston et al (1996) Am. J. Physiol. 271: H2547-2562. 조직 전체 슬라이드 또는 비브라톰 박편들은 Vectashield로 슬라이드에 고정시키고, 혈관들은 Zeiss 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 검사하였다.

형광성 리포좀 또는 복합체의 흡수량은 공초점 현미경 관찰로 정량되었다. 간단히 설명하면, 20x NA 0.6 렌즈(Zeiss)와 공초점 핀홀 크기, 광전 배증관 튜브 게인 및 레이저 파우더의 표준화된 세팅을 사용하여 초점 (z)축에서 2.5μm만큼 분리된 일련의 12 공초점 이미지들이 플루오레신 및 Texas Red 채널에서 기관의 문측(rostral) 영역에서 수집되었다. 혈관(플루오레신-L.식용물질) 및 리포좀(Texas Red)을 개별적으로 보여주는 연속 이미지들로부터 투사가 발생되었다. 공초점 소프트웨어를 사용하여, 혈관 이미지들에서 면적이 약 200μm²인 영역이 정의되었고, 그후 리포좀 이미지의 해당하는 영역의 평균 형광을 측정하였다. 배경 강도는 혈관에 인접한 선택된 영역에서 형광을 측정함으로써 결정하였다. 기관 당 25 혈관들 및 그룹당 4 기관들에서 측정이 이루어졌다(n=4). 차이의 중요성은 Student의 시험에 의해 평가되었다.

투과 전자 현미경 관찰을 위해 준비된 조직들을 이전에 설명한 바와 같이 처리하였다. McDonald (1994) Am. J. Physiol. 266: L61-L83. 간단히 설명하면, 5분동안 실온에서 1차 고정액 (75 mM 카코딜레이트 완충제에 대한 3% 글루타르알데히드, pH 7.1, 플러스 1 % 수크로스, 4% PVP, 0.05% CaCl₂, 및 0.075% H₂0₂)을 관류한 후에 이어서 2차 고정액 (카코딜레이트 완충제 75 mM에 대한 3% 글루타르알데히드 용액, pH 7.1, 0.05% CaCl₂, 1% 수크로스 및 4% PVP를 함유)을 5분 동안 관류하였다. 조직들을 고정된 상태로 1시간 동안 실온에 놔두고, 그후 제거하고 밤새 2차 고정액에 4EC에서 두었다. 조직을 면도날로 정돈하거나 또는 조직 절단기로 얇게 자르고, 오스뮴(100 mM 카코딜레이트 완충액에 대해 2% O_SO₄, pH 7.4, 4EC 에서 18 시간동안 )으로 후-고정하고, H₂O(4EC에서 18시간)로 세척하고, 총괄적으로 우라닐 아세테이트(수성, 37EC에서 48시간동안)로 착색하였다. 그후 조직을 아세톤으로 탈수하고, 여과하고, 에폭시 수지에 임베딩하였다. 초마이크로톰으로 초박 박편들을 절단하고, 단일-슬롯 표본 그리드에 마운트하고, Zeiss EM-10 전자 현미경으로 검사하였다.

결과: 실험들은 Texas Red-라벨링된 DOTAP:콜레스테롤-DNA 복합체 및 DiI-라벨링된 DDAB:콜레스테롤-DNA 복합체에서 이전에 발견한 것과 유사하게, Texas Red-라벨링된 DOTAP:콜레스테롤 리포좀이 DNA의 존재하에서, RIP1-Tag2 마우스에서 선택적으로 종양의 맥관형성 내피 세포를 표적지향화 한다는 사실을 밝혀냈다. 트랜스제닉 RIP1-Tag2 마우스에서의 이러한 그리고 그후의 실험들은 과형성성 소도들 및 종양들의 맥관형성 혈관들에 의한 양이온성 리포좀의 흡수가 이에 대응하는 정상 혈관들(도 5,6,7 및 8)의 흡수를 훨씬 초과한다는 것을 확인하였다. 과형성성 소도들 및 작은 종양들의 일부 혈관들에서, 리포좀들은 내피 세포들에 의해 오직 병소 영역에서만 흡수되었고(도 8), 반면에 더 큰 종양에서 흡수는 보다 일반화되었다(도 6). 흡수의 병소 영역은 새로운 혈관 성장의 가능 부위라고 생각되었다(도 8).

양이온성 리포좀 또는 리포좀-DNA 복합체의 이러한 특성은 물질들을 맥관형성 내피 세포에 선택적으로 운반하는 잠재적인 실용 가능성을 갖기 때문에, 종양에서 맥관형성 내피 세포들의 이러한 특성을 병적 맥관형성의 다른 부위에서의 내피 세포들이 공유하는지 여부를 결정하는 것이 바람직한 것으로 생각되었다. 이러한 의문은 만성 기도염을 유발하며, 그것의 한가지 특징이 맥관형성인, 미코플라스마 풀모니스에 감염된 마우스의 기관에서 맥관형성 내피 세포들에 의한 Texas Red-라벨링된 DOTAP:콜레스테롤 리포좀의 흡수를 조사한 실험에서 제기되었다(도9와 10 비교). 만성 염증 영역에서 맥관형성 내피 세포들은 양이온성 리포좀들의 흡수가 현저하게 높은 부위로 밝혀졌다(도 10). 특히, M.풀모니스에 감염된 마우스의 기관에서의 혈관들은 현저하게 큰 양의 흡수를 갖는다. 맥관형성 혈관들의 공초점 현미경 측정은 감염된 마우스가 대조표준보다 20 내지 30배 더 큰 흡수를 갖는다는 것을 보여주었다(도 11). 일부 맥관형성 혈관들은 100배만큼 큰 흡수를 가졌다. M.풀모니스에 감염된 마우스에서 맥관형성 내피 세포들의 공초점 및 전자 현미경 연구는 양이온성 리포좀이 처음으로 적혈구내질과 회합하고 그후 적혈구내질안으로 흡수된다고 제안하였다(도 13).

유사하게, 양이온성 리포좀은 마우스의 난소의 난포들 및 황체에서, 트랜스제닉 HPV 마우스의 형성장애 피부에서 그리고 M.풀모니스로 인한 맥관형성을 갖는 쥐의 기관에서의 맥관형성 혈관에 의해 열심으로 흡수되었다.

결론: 이들 실험들은 양이온성 리포좀 및 리포좀-DNA 복합체가 우선적으로 종양의 맥관형성 내피 세포들 및 만성 감염의 부위들을 표적지향화한다는 것을 확인한다.

실시예 5

만성 감염에서 맥관형성 혈관들에 의한 파클리탁셀을 함유하는 양이온성 리포좀의 흡수

실시예 4에서 설명된바와 같이, C3H/HeN 마우스가 미코플라스마 풀모니스로 감염되었다. 병원체 없는 마우스를 대조표준으로 사용하였다. 감염된 대조표준 마우스는 대조표준 쥐들을 칸막이가 있는 사육상자에 따로따로 가뒀다. 감염 7일 후, DOTAP:난PC:로다민 DHPE:파클리탁셀(50:47:1:2 몰비)로 구성된 작은 단일골층판 리포좀의 조제물을 마우스에 150μl의 부피로 (총 지질의 10mM 용액의 150μl 꼬리 정맥 주사(파클리탁셀 포함); 마우스당 26μg 파클리탁셀의 총 투여량) 정맥내 주사하였다. 리포좀을 주사하고 20분 후, 마우스의 몸 전체의 내피 세포들을 착색하기 위하여 플루오레신-라벨링된 리코페르시콘 식용물질 렉틴으로 정맥내 주사하였다. 그후 즉시, 실시예 4에서 설명한 바와 같이, 마우스에 맥관구조를 통해 고정액을 관류시켰다. 이 방법에서, 양이온성 리포좀을 그들의 레드 형광에 의해 확인할 수 있었고 혈관들을 그들의 그린 형광에 의해 확인할 수 있었다. 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 리포좀을 함유하는 형광성 파클리탁셀의 흡수량은 조직 박편들의 공초점 현미경 관찰에 의해 정량되었다.

결과: 병원체 없는 마우스에서 조직들의 검사는 파클리탁셀을 함유하는 양이온성 리포좀이 감염된 마우스의 기관에서 기도 혈관들의 내피 세포들에 의해 열심으로 흡수되었다는 것을 보여주었다. 도 14에서 나타낸바와 같이, 감염되지 않은 마우스의 기관의 혈관들에서는 흡수가 거의 관찰되지 않았다. 이러한 관찰들은 파클리탁셀을 함유하는 양이온성 리포좀들은 파클리탁셀 없는 양이온성 리포좀과 동일한 표적지향화 특성을 갖는다는 것을 확인하였다.

본 발명은 그것의 특정 구체예들과 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 의도와 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형을 만들 수 있고 등가물들로 대신할 수 있다는 사실을 당업자들은 이해하여야 한다. 게다가, 특별한 상황, 재료, 물질의 조성, 프로세스, 프로세스 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 의도 및 범위에 적합시키기 위해 많은 변형들을 만들 수 있다. 이러한 모든 변형들은 여기에 첨부된 청구항의 범위안에 있도록 의도된다.

Claims

양이온성 지질 및 맥관형성을 초래하는 미치는 물질을 포함하는 조성물을 포유류에 투여하는 단계;및

조성물이 맥관형성 내피세포로 들어가도록 하는 시간동안 및 그러한 방식으로, 조성물을 맥관형성 혈관의 맥관형성 내피세포와 회합시키는 단계;

를 포함하는, 맥관형성 내피세포에 선택적으로 영향을 미치는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물을 순환계로 주사하여 투여하고, 또한 조성물은 대응하는 정상의 내피세포에 비교해 볼때, 혈액 내에서, 맥관형성 내피세포에 대해 2배 이상의 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 친화성은 비-맥관형성 내피세포를 기초로 하여 맥관형성 내피세포에 대해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 친화성을 생체외에서 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 주사된 조성물은 대응하는 정상의 내피세포에 비교해 볼때, 혈액내에서, 맥관형성 내피세포에 대해 10배이상의 친화성을 가지며, 또한 조성물은 5 몰% 이상의 양이온성 지질을 포함하며, 조성물이 동맥내로 주사되는 것을특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 물질은 탁산이고, 맥관형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 양이온성 지질 및 탁산을 포함하는 조성물은 리포좀과 회합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 파클리탁셀의 10-데스아세틸 유사체, 파클리탁셀의 3'N-데스벤조일-3'N-t-부톡시카르보닐 유사체, 탁산의 갈락토오스 또는 만노스 유도체, 탁산의 피페라지노 유도체, 탁산의 6-티오 또는 술펜아미드 유도체, 및 소수성 부분에 부착된 탁산으로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀인 것을 특징으로 하는 방법.
양이온성 지질;및

리포좀의 지질 이중층내의 탁산

을 포함하며, 리포좀은 탁산 결정을 실질적으로 포함하지 않으며, 탁산은 지질 이중층으로 부터 실제로 분할되지 않는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 검출가능한 라벨을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 리포좀의 수성 구획내에 수용성 탁산을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 탁산은 제약학적으로 허용가능한 유도체인 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 탁산은 파클리탁셀인 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 탁산은 도세탁셀인 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 리포좀은 탁산 또는 탁산 유도체 20 몰퍼센트 미만 및 양이온성 지질 약 20 몰퍼센트이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 리포좀은 약 2 몰% 내지 약 10 몰% 탁산, 및 약 40 몰%내지 약 98 몰% 양이온성 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 10 항에 있어서, 상기 양이온성 리포좀은 중성 지질을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 18 항에 있어서, 리포좀은 약 2 몰% 내지 약 10 몰% 탁산, 약 40 몰% 내지 약 98 몰% 양이온성 지질, 그리고 약 2 몰% 내지 약 50 몰% 중성 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 중성 지질은

포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 그리고 PC 및 PE의 혼합물로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 20 항에 있어서, 리포좀은 DOTAP, 난 포스파티딜콜린 및 파클리탁셀을 50: 48: 2 의 몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 20 항에 있어서, 리포좀은 DOTAP, DOPC, 및 파클리탁셀을 50: 47: 3 의 몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 20 항에 있어서, 리포좀은 DOTAP, DOPE, 및 파클리탁셀을 50: 47: 3 의몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
제 20 항에 있어서, 리포좀이 DOTAP, MOPC, 및 파클리탁셀을 50: 47: 3 의 몰비로 포함하는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
양이온성 지질;및

리포좀의 수성 구획내에 탁산

을 포함하며, 실질적으로 탁산 결정을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 양이온성 리포좀.
양이온성 지질 및 맥관형성을 감소시키는 물질을 포함하는 조성물을 포유류에 투여하고,

조성물이 맥관형성 내피세포로 들어가도록 하는 시간동안 및 그러한 방식으로, 조성물을 맥관형성 혈관의 맥관형성 내피세포와 회합시키는 것;

을 포함하며, 맥관형성의 감소로 인해 죽상경화성 플라크 형성이 감소되는것을 특징으로 하는 죽상경화성 플라크를 감소시키는 방법.
제 26 항에 있어서, 조성물을 순환계로 주사하여 투여하고, 또한 조성물은 대응하는 정상의 내피세포에 비교해 볼때, 혈액 내에서, 맥관형성 내피세포에 대해 2배 이상의 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 주사된 조성물은 대응하는 정상의 내피세포에 비교해 볼때, 혈액내에서, 맥관형성 내피세포에 대해 10배이상의 친화성을 가지며, 또한 조성물은 5 몰% 이상의 양이온성 지질을 포함하며, 조성물은 동맥내로 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 조성물은 양이온성 지질을 포함하고, 맥관형성을 감소시키는 물질이 리포좀과 회합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 맥관형성을 감소시키는 물질이 탁산인 것을 특징으로 하는 방법.
환자의 순환계 혈관에서 죽상경화성 플라크를 제거하는 단계;및

양이온성 리포좀 및 맥관형성을 억제하는 활성 성분을 포함하는 조성물의 치료요법적 유효량을 환자에 투여하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자에서 죽상경화성 플라크 형성을 감소시키는 방법.