CZ2002850A3 - Kationtový liposom a použití kationtového liposomového prostředku - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká kationtového liposomu, který obsahuje kationtový lipid a taxan v lipidové dvojvrstvě liposomu. Vynález se také týká použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva.

Tato přihláška je částečnou pokračovací přihláškou sériového čísla 09/127 177, podanou 31. července 1998, která je pokračováním přihlášky sériového čísla 08/820 337, podané 12. března 1997, nyní US patent č. 5 837 283, přičemž obě jsou zde zahrnuty formou odkazu ve své celistvosti a k nimž přihlašovatelé nárokují prioritu podle 35 U.S.C. '120.

Dosavadní stav techniky

Předložený vynález se může použít při své aplikaci na léčení a diagnózu četných chorob a různých abnormalit.

Ačkoliv předložený vynález není omezen jako takový, může být použit při léčení rakoviny, k hojení ran a při četných chronických zánětlivých chorobách. Obecně každá z těchto položek je nyní léčena přímo fyzikálními prostředky, jako je chirurgické vynětí rakovinné tkáně, sešití ran a chirurgické vynětí zanícených kloubů. Dále může být každá tato položka léčena chemickými prostředky. Chemoterapie se používá u rakovin, růstové hormony se aplikují při hojení ran a protizánětlivá léčiva se aplikují k léčení chronických zánětlivých stavů. Tyto a související způsoby léčení jsou obecně zaměřeny přímo na léčení rakovinné, poraněné nebo zanícené tkáně. K pochopení skutečnosti, čím

g-i-Si-rk!

se přeložený vynález liší od obvyklých způsobů léčení se poskytuje stručný a obecný popis současných technologií léčení v těchto oblastech.

Léčení rakoviny

Pojem „rakovina zahrnuje spektrum chorob, které se liší léčením, prognózou a nadějí na vyléčení. Přístup k diagnóze a léčení závisí na místě vzniku tumoru, míře diseminace, místě výskytu, fyziologickém stavu pacienta a prognóze. Jakmile je tumor diagnostikován, obvykle se „uspořádá, což je proces, který zahrnuje použití postupů chirurgie, fyzikálního vyšetření, histopatologie, zobrazení a laboratorního vyhodnocení k určení rozsahu choroby a k rozdělení populace pacientů s rakovinou do skupin podle snižující se pravděpodobnosti vyléčení. Takové systémy se používají jak k plánování léčby, tak k určení prognózy pacienta (Stockdale, F., „Principles of Cancer Patient Management, v Scientific Americam Medicíně, díl 3, Dále,

D. C. a Federmann, D. D. (redaktoři), Scientific American Press, New York (1996)). Typ nebo stadium rakoviny mohou rozhodnout o tom, který ze tří obecných způsobů léčení se použije: chirurgický zákrok, radiační léčba a chemoterapie. Lze také zvolit agresivní léčbu s kombinovanou modalitou.

K tomuto účelu lze chirurgický zákrok použít k vynětí primárního tumoru, přičemž zbývající buňky se ošetří radiační léčbou nebo chemoterapií. Rosenberg, New Engl. J. Med. (1985).

Chirurgický zákrok hraje ústřední roli při diagnóze a léčení rakoviny. Obecně platí, že chirurgický přístup se vyžaduje pro biopsii, přičemž chirurgický zákrok může být definitivní léčbou pro většinu pacientů

-1ίο • · ··· · ·· ·· • · · · · · · • · · · · · •Β· s rakovinou. Chirurgický zákrok se také používá k redukci hmoty tumoru, k resekci metastáz, k řešení naléhavých zdravotních situací, k paliativní léčbě a k rehabilitaci. Ačkoliv primární chirurgická technika při léčení rakoviny zahrnuje otevření operačního pole, kde se tumory resekují za přímé vizualizace, umožňují současné techniky provádění některých resekci pomocí endoskopických prostředků. Primárním zájmem při léčení rakoviny je zvážení operačního rizika (Stockdale, F., viz výše).

Radiační léčba hraje důležitou roli jak v primární, tak v paliativní léčbě rakoviny. Obvykle se používají jak teleterapie (megavoltová radiační léčba), tak brachyterapie (intersticiální a vnitrodutinové ozáření). Elektrodynamické ozáření ve formě rentgenových paprsků je nejobvykleji používána v teleterapii k léčení obvyklých maligních tumorů, zatímco jsou rovněž používány paprsky gama, fořma elektromagnetického záření podobného rentgenových paprsků, ale které je emitováno radioaktivními isotopy radia, kobaltu a jiných prvků. Radiační léčba přenáší energii do tkání v podobě oddělených dávek energie nazývaných fotony, které poškozují jak maligní, tak normální tkáně tím, že v buňkách vytvářejí ionizaci. Cílem pro ionty je nej obvykleji DNA, radiační terapie využívá skutečnost, že radiační poškození není mezi maligními a nemaligními tkáněmi uniformní - rychle se dělící buňky jsou citlivější na poškození DNA než buňky v klidové fázi (Pass, J. Nati. Cancer Inst., 85, 443 až 456 (1993)). Radiační léčba je spojena s unikátními přínosy, stejně jako s významnými toxicitami.. Ozáření je výhodné v jistých anatomických oblastech (např. v mediastinu), kde ozáření může být jediným proveditelným lokálním způsobem léčení, přičemž ozáření může také být jedinou proveditelnou lokální

4modalitou pokud je rozsah tumoru velký. Ozáření se také může použít v případě, že pacient shledává chirurgický zákrok nepřijatelným nebo když pacientův zdravotní stav chirurgický zákrok vylučuje. Radiační léčba zahrnuje poškození tkáně, které může vést k časným a pozdním radiačním účinkům. Časné účinky (akutní toxicita radiační léčby) zahrnují zarudnutí kůže, deskvamaci, esofagitidu, nauseu, alopecii a myelosupresi, zatímco pozdní účinky « zahrnují nekrózu a fibrózu tkáně a obvykle určují omezující toxicitu radiační léčby (Stockdale, F., viz výše).

a*

Téměř všechna v současnosti používaná chemoterapeutická činidla interferují se syntézou DNA, za předpokladu, že jde o prekurzory syntézy DNA a RNA, nebo ‘ s mitózou a tak jsou zacílena na proliferující buňky (Stockdale, F., „Cancer Growth and Chemotherapy, viz výše). Výzkumy na zvířecích tumorech a klinické studie na lidech ukazují, že kombinace léčiv vedou k vyšším mírám objektivní odpovědi a delšímu přežití než jednotlivá činidla (Frei, Cancer Res., 32, 2593 až 2607 (1972)). Kombinační terapie léčivy využívá různých mechanismů účinku . a cytotoxických potenciálů četných léčiv,.včetně alkylačních činidel, antimetabolitů a antibiotik (Devita a ' kol., Cancer, 35, 98 až 110 (1975)). Fyziologický stav pacienta, růstové charakteristiky tumoru, heterogenita populace buněk tumoru a status resistence tumoru vůči vícenásobným léčivům ovlivňují účinnost chemoterapie.

Obecně chemoterapie není cílená (ačkoliv se takovéto techniky vyvíjejí, např. Pastan, Cell, 47, 641 až 648 (1986)), přičemž důsledkem mohou být vedlejší účinky, jako je útlum kostní dřeně, gastroenteritida, nausea, alopecíe, poškození jater nebo plic nebo sterilita.

Hojení ran

Hojení ran je složitý a dlouhodobý proces obnovy a remodelování tkáně zahrnující různé typy buněk, který vyžaduje jemně vyladěné řízení -různých biochemických reakčních kaskád k vyvážení regenerativního procesu. Hojení ran je obecně rozděleno do 3 fází: zánět, proliferace a zrání (Waldorf a kol., Adv. Dermatol., 10, 77 až 96 (1995)). Proces zahrnuje migraci různých typů buněk do oblasti rány, stimulaci růstu epíteliálních buněk a fibroblastů, tvorbu nových cév a vytváření extra.celulární matrix. Správné fungování těchto procesů závisí na biologické aktivaci různých cytokinů (Bennett a kol., Am.

J. Surg., 165, 728 až 737 (1993)). Výživa, imunitní systém, kyslík, objem krve, infekce, imunosuprese a snížení počtu červených krvinek jsou faktory ovlivňující hojení ran (Wítney, Heart Lung, 18, 466 až 474 (1989)).

Kvalita stejně jako rychlost hojení ran je obvykle závislá na typu a rozsahu původního poranění.

K léčení ran se používají 3 obecné typy procesů, z nichž každý je zaměřen na hojení poškozené tkáně. Uzavření ran se nejobvykleji provádí sešitím, ačkoliv také lze použít obvaz páskou, svorkování nebo elektrokauterizaci (Wheeless, C.

R., Wheeless' Textbook of Orthopaedics (1996), Garrett a kol., J. Hand Surg., 9(5), 683 až 692 (1984)). Kožní pásky a různá šití jednotlivě při uzavírání ran vykazují jisté přínosy a nevýhody. Kožní pásky způsobují menší zánětlivou re,akci, ale selhávají při uzavírání subepiteliálních prostorů rány, zatímco zánětlivá reakce a následná zjizvení zapříčiněné různými šitími závisí na velikosti šicí jehly, průměru šicího materiálu a na tom, zda jde o jednovláknový • · · · · ·

nebo tkaný šicí materiál (Simpson, Laryngoscope, 87, 792 až

816 (1977)).

V ráně rozhoduje o tom, zda se vyvine infekce velikost inokula mikroorganismů, virulence organismů a mechanismy antibakteriální obrany hostitele. Antibiotika mohou tedy mít při léčení ran terapeutickou hodnotu (Edlich, Emergency Medical Clinics of North America, 4(3), 561 až 580 (1986)). K volbě správného antibiotika, jeho cesty podání a k vyhnutí se jeho vedlejším účinkům je nutno rozumět farmakologickému působení každého antibiotika (Simpson, viz výše). Současné výsledky naznačují, že antibiotická terapie umožňuje rychlejší postup proliferace a diferenciace buněk a může tedy být nápomocná při podpoře hojení rány (Barrow a kol., Respiration, 61, 231 až 235 (1994), Maeder a kol., Paraplegia, 31, 639 až 644 (1993)). Jako pomocné látky k antibiotické léčbě kontaminovaných ran se také používají proteolytické enzymy (Rodeheaver a kol., Am. J. Surg., 136(3), 379 až 382 (1978)).

Topické podávání různých cytokinů, včetně bFGF, EGF, PDGF a TGF-beta, buď samotných nebo v kombinaci, může výrazně zrychlit hojení ran (Moulin, Eur. J. Cell. Biol., 68, 1 až 7 (1995)). Růstové faktory atrahují buňky do rány, stimulují jejich proliferaci a mají silný vliv na ukládání extracelulární matrix. Od vyvinutí schopnosti masové produkce těchto cytokinů rekombinantními technikami ukázaly mnohé studie, že růstové faktory mohou podpořit všechny aspekty obnovy tkáně v modelech normálního a zhoršeného hojení (např. Schultz a kol., Science, 235, 350 až 352 (1987), Deuel a kol., Annu. Rev. Med., 42, 567 až 584 (1991)). Ačkoliv předběžné klinické studie ukázaly, že léčení růstovými faktory příležitostně vede ke

7•to ···· • · • · ·· • to · · · · ·· ·· • «· · • · · statistickému zlepšení obnovy tkáně, není jasné, zda jsou tyto výsledky klinicky významné, přičemž bylo navrženo, že nové klinické studie se musí zaměřit na zacílení růstových faktorů na specifické typy zhoršeného hojení (Greenhalgh, J. Trauma, 41, 159 až 167 (1996)).

Chronický zánět

Přirozené, humorální a buněčné imunitní mechanismy se všechny účastní patogeneze chronických zánětlivých chorob (Seymour a kol., J. Oral Pathol., 129 až 265 (1979)). Autoimunitní choroby jsou důsledkem abnormalit funkce lymfocytů. Abnormality funkce T-buněk mohou být odpovědny za chorobu prostřednictvím imunity zprostředkované buňkami, přičemž aktivita pomocných T-buněk při tvorbě protilátek může přispívat k utváření protilátek. Centrální roli pomocných T-buněk při autoimunitní chorobě je podepřena spojením mnoha z těchto chorob s jistými molekulami HLA. Selhání jednoho nebo více kroků při uchovávání tolerance může vést k autoimunitní reakci (Robinson „Immunologic Tolerance and Autoimmunity, v Scientific American Medicine, díl 2, oddíl VI, Scientific American Press, New York, str. 1 až 11 (1996)).

Pří autoimunitní chorobě se používá několik typů léčení, z nichž všechny jsou zaměřeny na snížení imunitní odpovědi v postižené tkáni. Například při léčení revmatoidní artritidy, což je autoimunitní choroba, se může využít protizánětlivých činidel, jako jsou nesteroidní protizánětlivá činidla (NSAIDs) nebo glukokortikoidy, činidel navozujících remisi, jako jsou soli zlata, a/nebo imunosupresivních léčiv, jako je cyklofosfamid. K náhradě kloubů postižených během zánětlivých procesů se může použít ··*·

8»· ···· ·· ···· • ·

999 také ortopedický chirurgický zákrok (viz Gilliland, B. C. a Marmik, M., „Rheumatoid Arthritis v Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, str. 1977 až 1984 (1983)). Současné práce naznačují možnosti nových způsobů léčení, rovněž zaměřených na postiženou tkáň, jako je použití TNFa při léčení revmatoidní artritidy (Brennan a kol., Br. Med. Bull., 51, 368 až 384 (1995)).

Alergie se týká stavu, kde imunitní odpověď na antigeny z prostředí způsobuje zánět tkáně a dysfunkci orgánu. Jako u autoimunitních chorob u nemocí alergických data naznačují interakci několika složek imunitního systému. Diverzita projevů alergických chorob pochází z různých imunologických efektorových mechanismů, které evokují specifické vzory tkáňového poškození (Beer a kol., „Allergy, v Scientific American Medicine, díl 2, oddíl VIT, Scientific American Press, New York, str. 1 až 29 (1996)). Klinické rysy každé alergické choroby odrážejí imunologicky zprostředkovanou zánětlivou odpověď v postižených orgánech nebo tkáních (např. astma odráží zánětlivou odpověď v dýchacích cestách).

K léčení imunitně zprostředkovaných alergických chorob se využívá několika léčebných strategií, z nichž všechny jsou zaměřeny na snížení imunitní odpovědi v zanícené tkáni. Například při léčení astmatu může léčení zahrnovat regulaci okolního prostředí, farmakoterapii a terapii alergeny (Beer a kol., „Allergy, v Scientific American Medicine, díl 2, oddíl VII, Scientific American Press, New York, str. 1 až 29 (1996)). Při léčení astmatu je nejúspěšnějším prostředkem prevence zánětu eliminace kauzálního činidla. To však často není možné a tak se používá několik tříd léčiv. Ta zahrnují methylxantiny (k — fo — 9«Α AAAA AA AAAA AA AA

AAA AA · AAAA

AAAA AA A AA A « A A A A A AAA A

A AAAA A A A

AAAA AAA AA A AA AAAA bronchodilataci), adrenergní stimulancia (stimulace aadrenergních receptorů, bronchodilatátory), glukokortikoidy (snižují zánět v plicích), chromony (downreguluji mastocyty, snižují zánět v plicích) a anticholinergika (bronchodilatátory)(McFadden a kol., „Lung disease caused by immunologic and environmental injury, v Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw Hill, New York, str. 1515 až 1519). Rovněž byla navržena desenzitizace nebo imunoterapie extrakty podezřelých alergenů ke snížení zánětu u astmatu (McFadden a Austen, viz výše, Jacquemin a Saint-Remy, Ther. Immunol., 2_, 41 až 52 (1995)).

Aterosklerotické pláty

Ateroskleróza je progresivní zúžení lumina (vnitřního průchodu) arterií vrstvami plátů (tuková a fibrózní tkáň). Hlavní komplikace aterosklerózy, včetně ischemické choroby srdeční, infarktu myokardu, mrtvice a gangrény končetin, přispívají k roční mortalitě ve Spojených státech amerických z více než poloviny.

Arterie jsou složeny ze 3 vrstev: intimy, která zahrnuje endotelium a pojivovou tkáň na luminální straně vnitřní elastické vrstvy, medie, která zahrnuje buňky hladké svaloviny a, v elastických arteriích, elastická vlákna, a, ve velkých cévách, vasa vasorum, a adventicii, což je externí vrstva cévní stěny a zahrnuje pouzdro pojivové tkáně složené z fibroblastů, drobných cév a nervů. Ateroskleróza se může objevit v jakékoli arterii.

V koronárních arteriích může vést k infarktům, v mozkových arteriích může vést k mrtvicím a v periferních arteriích může vést ke gangréně končetin. Ateroskleróza je složitý proces, přičemž není přesně známo, jak začíná a co ji

V» ·* «· • Φ · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99.9 99 9999 způsobuje. Nicméně se má za to, že endoteliální poškození je počátečním krokem při tvorbě aterosklerotických lézí, přičemž může být způsobeno hemodynamickou zátěží, hypercholesterolémií, hypertenzí nebo chorobou imunitního komplexu. Poškození endotelu vede k akumulaci cholesterolu a lipidů, ztluštění intimy, proliferaci buněk hladké svaloviny a tvorbě vláken pojivových tkání. Vytváření tukových depozit a proliferace buněk hladké svaloviny postupně vede tvorbě plátů, které eventuálně zúží a blokují arterii.

Byla popsána neovaskularizace uvnitř intimy lidských aterosklerotických lézí, ale její role při progresi aterosklerózy je nejasná (Moulton a kol., Circulation, 99, 1726 až 1732 (1999) , Isner, Circulation, 99, 1653 až 1655 (1999), Depre a kol., Cathetrization and Cardiovascular Diagnosis, 39, 215 až 220 (1996)).

Z míry mortality v důsledku aterosklerózy a souvisejících patologií je jasné, že současné způsoby léčení jsou nedostatečné. Nejdůležitějším faktorem při zapříčiňování aterosklerotických příhod je vysoká koncentrace cholesterolu v plasmě ve formě lipoproteinů s nízkou hustotou. Současné způsoby léčení zahrnují léčiva, která inhibují jaterní enzymatický systém syntézy cholesterolu.

Současné způsoby léčení - imunologie

Výše popsané léčebné režimy mají různé stupně úspěšnosti. Protože míra úspěšnosti má k dokonalosti daleko, pokračují výzkumná pracoviště ve vývoji lepších způsobů léčení. Jedna ze slibných oblastí výzkumu se týká

Η ί*4 44*4 • · 4« * 4 4*

4 « 4 «· 4

4» >44

4· «414 ovlivnění imunitního systému. Použitím genetického inženýrství a/nebo chemické stimulace je možné modifikovat a/nebo stimulovat imunitní odpovědi tak, že vlastní imunitní systém těla léčí chorobu, např. protilátky ničí rakovinné buňky. Tento typ léčení se od výše popsaných liší v tom, že využívá k potlačování choroby biologický proces. Tento způsob léčení je však stále přímým způsobem léčení, což znamená, že vytvořené protilátky přímo atakují rakovinné buňky.

Předložený vynález může být použit při způsobech léčeních, která zahrnují radikální odklon od normálních způsobů léčení v tom, že předložený vynález nezahrnuje přímé ovlivňování rakovinných, poškozených nebo zanícených buněk.

Jiné osoby si povšimly, že, alespoň teoreticky, je možné léčit rakovinu nebo zánět provázené angiogenezí inhibici angiogeneze. Typický příklad současného uvažování ve vztahu k této věci je diskutován v PCT publikaci WO 95/25543, publikované 28. září 1995. Tato publikovaná přihláška popisuje inhibici angiogeneze podáváním protilátky, která se váže na antigen, o němž se věří, že je přítomen na povrchu angiogenních endoteliálních buněk. Specificky tato přihláška popisuje podávání protilátky, která se váže na Ογβ3, což je membránový receptor, o němž se věří, že zprostředkovává interakce buňka-buňka a buňkaextracelulární matrix, které se obecně označují jako děje buněčné adheze. Blokováním tohoto receptoru se doufá, že léčení bude inhibovat angiogenezí a tím léčit rakovinu a zánět.

- tr -

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je kationtový liposom, který obsahuje kationtový lipid a taxan v lipidové dvojvrstvě liposomu, kde liposom neobsahuje v podstatě žádné krystaly taxanu a kde se taxan v podstatě nevyděluje z lipidové dvojvrstvy.

Předmětem tohoto vynálezu také je použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva.

Dále jsou vedeny podrobnější údaje k osvětlení přítomného vynálezu.

Tento vynález je založen na způsobu selektivního dodávání činidel do angiogenních endoteliálních buněk. Tento způsob zahrnuje injikování, výhodně do oběhového systému a výhodněji intraarteriálně, kationtových liposomů (neboli polynukleotid/lipidových komplexů), které obsahují kationtové lipidy a sloučeninu, která navozuje nebo inhibuje angiogenezi a/nebo obsahuje detekovatělnou značku. Po podání se kationtové liposomy selektivně spojí s angiogenními endoteliálními buňkami, což znamená, že se spojí s angiogenními endoteliálními buňkami ve dvojnásobně nebo vyšším poměru (výhodně desetinásobném nebo vyšším), než se spojují s odpovídajícími klidovými endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezi. Když se liposomy (neboli polynukleotid/lipidové komplexy) spojí s angiogenními endoteliálními buňkami, jsou pak zachyceny endoteliální buňkou a vykáží požadovaný účinek. Látka může zničit • · 1 · · «ΒΒΒ» · · • Β · · • 9 ······· *

• ΒΒΒ¹ endoteliální buňku, navodit další angiogenezi, navodit srážení a/nebo označit endoteliální buňku tak, že může být detekována příslušnými prostředky. Látkou, která ovlivňuje endoteliální buňku, může být nukleotidová sekvence, jako je DNA, která kóduje protein, který při expresi navozuje nebo inhibuje angiogenezi. Nukleotidová sekvence je výhodně obsažena ve vektoru operativně spojeném s promotorem, který je výhodně aktivní pouze v angiogenních endoteliálních buňkách nebo může být v těchto buňkách aktivován podáním sloučeniny, čímž se umožní gen zapínat a vypínat aktivací promotoru.

Předmět tohoto vynálezu umožňuje způsob selektivního ovlivňování angiogenních endoteliálních buněk, čímž se inhibuje nebo usnadňuje angiogeneze.

Jiným provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob diagnostiky místa angiogeneze podáním kationtových liposomů obsahujících detekovatelnou značku, kteréžto liposomy jsou upraveny k selektivnímu spojení s angiogenními endoteliálními buňkami a k tomu, že se nespojí s odpovídajícími endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezi.

Dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje kationtové liposomy, kteréžto liposomy se skládají z kationtových lipidů, a sloučeniny, které jsou specificky určeny a upraveny buď k inhibici nebo navození angiogeneze, kteréžto sloučeniny mohou být rozpustné ve vodě nebo snadno dispergovatelné ve vodě nebo kompatibilní s lipidy a začleněny do lipidových vrstev.

Dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje kationtové prostředky obsahující kationtové lipidy a taxan.

Dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob zasažení angiogenních endoteliálních buněk taxanem spojeným s kationtovým lipidem.

Dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob selektivního ovlivnění angiogenních endoteliálních buněk, který vede k lokálnímu srážení krve v cévách, což zpomaluje nebo zcela blokuje průtok krve cévou.

Dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob analýzy angiogenních endoteliálních buněk značením buněk detekovatelnou značkou a tím umožňuje oddělení angiogenních endoteliálních buněk od okolních buněk pro následnou kultivaci a/nebo analýzu.

Ještě dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob destrukce nežádoucího tumoru dodáním toxické sloučeniny do angiogenních endoteliálních buněk tumoru, kterážto sloučenina ničí angiogenní endoteliální buňky a následně ničí buňky tumoru.

Další provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob selektivního ovlivnění angiogenních endoteliálních buněk dodáním komplexu kationtový lipid/DNA do angiogenních endoteliálních buněk, kde DNA je připojena na promotor, který se selektivně aktivuje v prostředí, které je výhodně unikátně spojeno s angiogenními endoteliálními buňkami, tj. promotor se neaktivuje v klidových endoteliálních buňkách.

Dalším provedení tohoto vynálezu poskytuje způsob redukce tvorby aterosklerotického plátu v krevní cévě dodáním

tt * kationtového lipidového komplexu obsahujícího látku, která snižuje angiogenezi, čímž sníží tvorbu plátu.

i ^r Rysem tohoto vynálezu je skutečnost, že kationtové liposomy podle tohoto vynálezu se selektivně spojují s angiogenními endoteliálními buňkami s mnohem vyšší preferencí (dvojnásobnou nebo vyšší a výhodně desetinásobnou nebo vyšší), než se spojují s odpovídajícími endoteliálními buňkami, které se neúčastní angiogeneze.

Výhodou tohoto vynálezu je to, že kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou být použity k přesnému dodávání malých množství toxických sloučenin do

-111-5 endoteliálních buněk, kteréžto buňky jsou postiženy způsobem (tj. usmrceny) tím, že se zničí céva nebo se učiní nefunkčními tím, že se vytvoří krevní sraženina a dodávka živin do okolních tkání (jako jsou buňky tumoru) se odřízne, čímž se tkáň zničí (např. zničení solidního tumoru).

» ή, »

í

Další výhodou tohoto vynálezu je to, že kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou být použity k inhibici angiogenezy spojené s maligními nebo benigními tumory spjatými s probíhající angiogenezí.

Ještě další výhodou tohoto vynálezu je to, že kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou být použity k dodávání do určitého místa sloučenin, které navozují angiogenezi a tím usnadňují hojení ran.

Důležitým rysem tohoto vynálezu je to, že se léčí několik tříd chorob a/nebo abnormalit bez přímého ošetřování tkáně tvořící abnormalitu, např. inhibici angiogenezy se dodávka krve do tumoru odřízne a tumor se zahubí bez přímého ošetřování buněk tumoru jakýmkoli způsobem.

Tyto a další předměty, výhody a rysy předloženého vynálezu budou odborníkovi v oboru zřejmé po přečtení popisu zde poskytnutého v souvislosti s připojenými obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je fluorescenční mikrograf ukazující +6 •ΛΡ··»· příjem komplexů DDAB:cholesterol-DNA značených červeně fluoreskující CM-Dil angiogenními krevními cévami folikulu normálního myšího vaječníku (stupnice: 60 pm) .

Obr. 2 je fluorescenční mikrograf ukazující příjem komplexů DDAB:cholesterol-DNA značených červeně fluoreskující CM-Dil angiogenními krevními cévami řezem tumoru slinivky břišní myší kmene RIPl-Tag5 - cévy jsou obarveny zeleně fluorescenčním lektinem (stupnice: 40 μπι) .

Obr. 3 je fluorescenční mikrograf s malým zvětšením ukazující nízký nebo žádný příjem komplexů DOTAP:cholesterol-DNA značených texaskou červení (žlutooranžová) krevními cévami normálního myšího pankreatického ostrůvku (stupnice: 150 pm).

Obr. 4 je fluorescenční mikrograf s malým zvětšením ukazující příjem komplexů DOTAP:cholesterol-DNA značených texaskou červení (žluto-oranžová) krevními cévami normálního tumoru slinivky břišní myší RIPl-Tag2 (stupnice: 150 pm).

Obr. 5 je konfokální mikrograf ukazující malý nebo žádný příjem liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení (červeno-oranžová) cévami pankreatického ostrůvku obarvenými (zeleně) fluorescenčním lektinem (stupnice: 50 pm).

Obr. 6 ukazuje konfokální mikrograf příjmu liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení (červeno-oranžová) tumorem slinivky břišní u myší RIP1Tag2. Cévy se obarví perfuzí fluorescenčním lektinem

• · * • · · · · · • » · • · ♦ z Lycopersicon esculentum (zeleně) poté, co byly intravenózně injikovány liposomy (stupnice: 50 pm).

Obr. 7 ukazuje konfokální mikrograf příjmu liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení (červeno-oranžová) tumorem slinivky břišní u myší RIP1-Tag2. Cévy se obarví perfuzí fluorescenčním lektinem z Lycopersicon esculentum (zeleně) poté, co byly intravenózně injikovány liposomy (stupnice: 50 pm).

Obr. 8 ukazuje konfokální mikrograf příjmu liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení (červeno-oranžová) tumorem slinivky břišní u myší RIPl-Tag2. Cévy se obarví perfuzí fluorescenčním lektinem z Lycopersicon esculentum (zeleně) poté, co byly intravenózně injikovány liposomy. Možné místo růstu cév vykazuje intenzivní příjem (stupnice: 50 pm).

Obr. 9 je konfokální mikrograf ukazující nízký příjem liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení (červeno-oranžová) normálními krevními cévami trachey u myších cév prostých patogenu barvených fluorescenčním lektinem (stupnice: 50 pm).

Obr. 10 ukazuje konfokální mikrograf příjmu liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení (červeno-oranžová) angiogenními krevními cévami trachey u myší infikovaných Mycoplasma pulmonis (stupnice: 50 pm) .

Obr. 11 je graf ukazující množství příjmu liposomů DOTAP:cholesterol značených texaskou červení krevními cévami myších tracheí prostými patogenu (normální) a infikovanými Mycoplasma pulmonis vyhodnocený měřením ♦ · • ·· *

-£o

L84 4 · · · ·

A · · · · · * ·

44····· intenzity liposomové fluorescence 4 hodiny po intravenózní injekci. Měření se provedou pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 410. Infikované myši se inokulují intranasálně organismy M. pulmonis a vyšetří se o 4 týdny později. Hvězdička označuje statisticky významný rozdíl (p <0,05, střední standardní odchylka, n = 4 myši na skupinu).

Obr. 12 je transmisní elektronový mikrograf ukazující liposomy DOTAP:cholesterol spojené s endoteliální buňkou trachey myši infikované M. pulmonis (stupnice: 50 pm) .

Obr. 13 je transmisní elektronový mikrograf ukazující liposomy DOTAP:cholesterol přijaté endoteliální buňkou trachey myši infikované M. pulmonis (stupnice: 80 pm) .

Obr. 14 je fluorescenční mikrograf ukazující asociaci kationtových paklitaxelových líposomů s endoteliální buněčnou výstelkou trachey myši prosté patogenu (panel A) a trachey myši infikované M. pulmonis (panel B).

Detailní popis výhodných ztělesnění vynálezu

Dříve než se popíší předložené způsoby selektivního ovlivňování/značení angiogenních endoteliálních buněk a liposomy použité při tomto způsobu, podotýká se, že tento vynález není omezen na jednotlivé liposomy, způsoby nebo aktivní látky popsané jako takové, které se samozřejmě mohou lišit. Také se podotýká, že terminologie zde použitá je určena pouze k účelům popisu jednotlivých ztělesnění a není zamýšlena jako omezující,

A — 9 9 9999 ·· ^A ( 9 9 9 · w .· ··*., :

• · · ······* « · protože rozsah předloženého vynálezu bude omezen pouze připojenými patentovými nároky.

Je nutno poznamenat, že singulární forma podstatných jmen a „a, jak se používají v tomto popisu a připojených patentových nárocích, zahrnují také plurální formy, pokud z kontextu jasně nevyplývá opak. Například tedy odkaz na „liposom zahrnuje směsi a velké počty takových liposomů, odkaz na „činidlo zahrnuje velká množství činidel a jejich směsí a odkaz na „způsob zahrnuje jeden nebo více způsobů nebo kroků zde popsaného typu. .

Publikace zde diskutované jsou poskytnuty pouze kvůli jejich obsahu před datem podání předložené přihlášky. Výraz „nic zde uvedený nemá být vykládán jako připuštění skutečnosti, že předložený vynález není oprávněn získat prioritu před takovými publikacemi na základě předchozího vynálezu.

Pokud není definováno jinak, všechny technické a vědecké pojmy zde uvedené mají takové významy, jak jim obecně rozumí odborník v oboru, do kterého tento vynález patří. Ačkoliv jakékoli způsoby a materiály, podobné nebo ekvivalentní způsobům a materiálům zde popsaným, mohou být použity v praxi nebo k testování tohoto vynálezu, jsou výhodné způsoby a materiály popsány zde. Všechny zde citované publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu za účelem zveřejnění a popsání specifických aspektů tohoto vynálezu, pro které je publikace citována.

• 4 4 4 4 ♦ 4 4 · • · · 4 * • «44

4 · 4 4 4 4

Definice

IL-Μ • 4 ·· ♦ 4 4 9

9 ’ · 9 · • 9 · · · 4 · »

Pojmy „léčení, „léčba, „léčit apod. se zde používají v obecném významu získání požadovaného farmakologického a/nebo fyziologického účinku. Tento účinek může být profylaktický ve významu úplné nebo částečné prevence choroby nebo jejích symptomů a/nebo může být terapeutický ve významu částečné nebo úplné stabilizace nebo vyléčení choroby a/nebo nežádoucího účinku přisouditelného chorobě. Pojem „léčení, jak se zde používá, pokrývá jakékoli léčení choroby savce, obzvláště člověka, a zahrnuje:

a) prevenci výskytu choroby nebo symptomů u subjektu, který může být predisponován k chorobě nebo symptomům, ale dosud nebylo diagnostikováno, že jí trpí,

b) inhibici symptomu choroby, tj. zabránění jeho rozvoji nebo

c) úlevu při symptomech choroby; tj., navození regrese choroby nebo symptomu.

Jak se zde používá, odkazuje pojem „farmaceuticky přijatelná sůl na sůl, která si udržuje požadovanou biologickou aktivitu matečné sloučeniny a nevykazuje žádné nežádoucí toxikologické účinky. Příklady takových solí zahrnuj í

a) adiční soli s kyselinou tvořené s anorganickými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou dusičnou apod., a soli s organickými kyselinami, jako je například kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina vinná, kyselina jantarová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina glukonová, kyselina citrónová, kyselina jablečná, kyselina askorbová, kyselina benzoová, kyselina tříslová,. kyselina pamoová, kyselina alginová, •· 999» naftalensulfonové.

a —kyselina polyglutamová, kyseliny kyseliny naftalendisulfonové a kyselina polygalakturonová,

b) soli s polyvalentními kovovými kationty, jako je zinek, vápník, bismut, baryum, hořčík, hliník, měď, kobalt, nikl, kadmium apod., a

c) soli vytvořené s organickým kationtem vytvořeným z N,N'-dibenzylethylendiaminu nebo ethylendiaminu a

d) kombinace a) a b) nebo c) , např. zinečnatá sůl kyseliny tříslové, apod., výčet tím však není omezen.

Pojem „angiogeneze odkazuje na proces tkáňové vaskularizace, který zahrnuje rozvoj nových cév. K angiogenezi dochází třemi mechanismy:

1) neovaskularizací, kde endoteliální buňky migrují z dosud existujících cév, čímž začíná tvorba nových cév,

2) vaskulogenezí, kde se cévy tvoří z prekurzorových buněk de novo nebo

3) cévní expanzí, kde existující malé cévy zvětší svůj průměr k vytvoření větších cév (Blood a kol., Biochem. Biophys. Act, 1032, 89 až 118 (1990)).

Angiogeneze je důležitým procesem při normálních procesech neonatálního růstu a v ženském reprodukčním systému během růstového cyklu žlutého tělíska (viz Moses a kol., Science, 248, 1408 až 1410 (1990)). Za normálních podmínek jsou všechny procesy zahrnující novou tvorbu nebo remodelování existujících nebo nových cév samoomezujícím procesem, přičemž expanze specifických buněčných typů je řízena a vzájemně koordinována.

♦ *·♦

0 0 0 0 · · ♦ 0 0

• 0 00 * 0 0 · ·

0« ·

0 0

0000

Angiogeneze se rovněž účastní hojení ran a patogeneze četných klinických chorob včetně zánětu, artritidy, astmatu, růstu tumoru, diabetické retinopatie a jiných stavů. Klinické projevy spojené s angiogenezi se označuji jako angiogenní choroby (Folkman a kol., Science, 235, 442 až 447 (1987)) .

Mnohé experimenty naznačují, že tkáně mohou vytvářet angiogenní faktory, které navozují angiogenezi za podmínek slabé dodávky krve během jak normálních, tak patologických stavů. Tyto faktory a sloučeniny se liší v buněčné specificitě a v mechanismech, kterými indukují růst nových cév. Tyto faktory působí prostřednictvím různých mechanismů. Například mohou indukovat migraci a proliferací endoteliálních buněk nebo stimulovat tvorbu kolagenázy (viz Klagsbrun a kol., Ann. Rev. Physiol., 53, 217 až 239 (1991)). Existují četná biologická stanovení, která umožňují přímé stanovení angiogenních aktivit (Witting a kol., Anat. Embřyol. (Berl), 183, 259 až 271 (1991)).

Bylo navrženo, že inhibitory angiogeneze mohou být užitečné při léčení chorob. Například interference s angiogenezi může omezit růst tumoru. Bylo navrženo několik prostředků k inhibici angiogeneze včetně

1) inhibice uvolňování angiogenních faktorů,

2) neutralizace angiogenních faktorů za použití takových prostředků, jako jsou monoklonální protilátky a

3) inhibice odpovědí endoteliálních buněk (Folkman a kol., Seminars in Cancer Biology, 3, 89 až 96 (1992)) prostřednictvím antiangiogenních faktorů, tedy molekul o nichž je známo, že inhibují angiogenezi.

3399 »«·· » · ·

9 99 9 9

9 ♦ ♦ 9 99 9 • · 9 • 9 9

9 · • 9 9

Je popsáno několik takových inhibitorů endoteliálních buněk, jako jsou mezi jinými inhibitor kolagenázy, inhibitory obratu bazálni membrány, angiostatické steroidy, inhibitory odvozené z hub, destičkový faktor 4, trombospondin, léky proti artritidě jako je penicilamin, a interferon alfa (viz Folkman a kol., Seminars in Cancer Biology, 3, 89 až 96 (1992), například viz Stepien a kol., J. Endocrinol., 150, 99 až 106 (1996), Maione a kol., Science, 247, 77 až 79 (1990)).

Pojem „endoteliální buňky znamená takové buňky, které tvoří endotel, monovrstvu jednoduchých skvamózních buněk, které vystýlají vnitřní povrch oběhového systému. Tyto buňky si uchovávají kapacitu pro buněčné dělení, ačkoliv proliferují za normálních podmínek velmi pomalu, přičemž buněčné dělení podstupují snad jednou za rok. Proliferace endoteliálních buněk se může demonstrovat za použití [³H]thymidinu ke značení buněk v S fázi.

V normálních cévách je podíl endoteliálních buněk, které se označí, obzvláště vysoký v bodech větvení arterií, kde turbulence a opotřebení stimulují obrat (Goss, The Physiology of Growth, Academie Press, New York, str. 120 až 137 (1978)). Normální endoteliální buňky jsou v klidové fázi, tj. nedělí se a jako takové jsou·od angiogenních endoteliálních buněk nerozlišitelné, jak je diskutováno dále.

Endoteliální buňky mají také schopnost migrace, což je proces důležitý pro angiogenezi. Endoteliální buňky tvoří nové kapiláry in vivo, když je jich třeba, jako při hojení poranění nebo když jsou potřeba při tvorbě tumoru. Tvorba nových cév se nazývá angiogenezi a zahrnuje molekuly (angiogenní faktory), které mohou být mitogenní nebo

24·· 4444

4 4 4 44 ··

4

4 4

4 ·

4

4*4 4

4 4 4 ·

444444 44 * chemoatraktační pro endoteliální buňky (Klagsburn, viz výše). Během angiogeneze mohou endoteliální buňky migrovat z existující kapiláry k započetí tvorby nové cévy, tj. buňky jedné cévy migrují způsobem, který umožňuje prodloužení této cévy (Speidel, Am. J. Anat., 52, 1 až 79). Studie in vitro dokumentují jak proliferaci, tak migraci endoteliálních buněk, endoteliální buňky umístěné v kultuře mohou proliferovat a spontánně vyvinout kapiláry (Folkman a kol., Nátuře, 288, 551 až 556 (1980)).

Pojmy „angiogenní endoteliální buňky a „endoteliální buňky podstupující angiogenezí apod. se zde používají navzájem zaměnitelně ve významu endoteliálních buněk (jak jsou definovány výše), které podstupují angiogenezí (jak je definována výše). Angiogenní endoteliální buňky jsou tedy endoteliální buňky, které proliferují rychlostí daleko přesahující normální stav, kdy k proliferaci dochází zhruba jednou za rok. Míra odlišnosti od normální proliferace endoteliálních buněk může být 2-,

5- nebo 10- nebo vícenásobná ve srovnání s normální proliferaci a může se velmi lišit v závislosti na faktorech, jako je věk a stav pacienta, typ tumoru, typ poranění atd. Za předpokladu, že rozdíl ve stupni proliferace mezi normálními endoteliálními buňkami a angiogenními endoteliálními buňkami je měřitelný a považuje se za biologicky významný, pak jsou tyto dva typy buněk rozlišitelné podle tohoto vynálezu, tj. angiogenní endoteliální buňky rozlišitelné od odpovídajících normálních, klidových endoteliálních buněk za podmínek preferenční vazby kationtových liposomů.

Pojmy „odpovídající endoteliální buňky, „normální nebo klidové endoteliální buňky apod. se

Λ

9F <9 9 · ·» · • 9 to • 9 9· · · · • 999

Ž5• toto toto·· · · ·

4 · · · ·· •·to ··9 94 · toto používají k označení normálních, klidových endoteliálních buněk obsažených ve stejném typu tkáně (za normálních podmínek), když některé z endoteliálních buněk podstupují angiogenezi a některé z endoteliálních buněk jsou v klidové fázi. V souvislosti s předloženým vynálezem angiogenní endoteliální buňky jsou výhodným cílem a jsou cílem s výhodou, která je 5-násobně, výhodně 10-násobně, větší, něž cílení na odpovídající klidové endoteliální buňky.

Pojem „lipid” se používá ve svém obvyklém významu jako generický pojem zahrnující tuky, lipidy, konstituenty protoplasmy rozpustné v alkoholu-etheru, které jsou nerozpustné ve vodě. Lipidy tvoří tuky, mastné oleje, esenciální oleje, vosky, steroidy, steroly, fosfolípidy, glykolipidy, sulfolipidy, aminolipidy, chromolipidy (lipochromy) a mastné kyseliny. Tento pojem zahrnuje jak přirozeně se vyskytující, tak synteticky vytvořené lipidy. Výhodnými lipidy v souvislosti s tímto vynálezem jsou cholesterol, fosfolípidy včetně fosfatidylcholinů a fosfatidylethanolaminů, a sfingomyelíny. Kde se vyskytují mastné kyseliny, mohou mít délku 12 až 24 atomů uhlíku, obsahovat až 6 nenasycených vazeb (dvojných vazeb) a mohou být připojeny na základní řetězec molekuly jak acylovými, tak etherovými vazbami. Kde je na základní řetězec molekuly připojena více než 1 mastná kyselina, mohou být mastné kyseliny rozdílné (asymetrické) nebo může být v řetězci přítomna pouze 1 mastná kyselina, např. lysolecitiny. Jsou také možné smísené formulace, obzvláště když jsou nekationtové lipidy odvozeny z přírodních zdrojů, jako jsou lecitiny (fosfátidylcholiny) vyčištěné z vaječného žloutku, hovězího srdce, mozku nebo jater, nebo ze sójových bobů. Zajímavé jsou také steroidy a steroly, obzvláště cholesterol a steroly substituované v poloze 3β.

Pojem „kationtový lipid je zde používán k zahrnutí jakéhokoli lipidu podle tohoto vynálezu (jak je definován výše), který je kationtový. Lipid bude určen jako kationtový, když má kladný náboj (při fyziologické hodnotě pH), jak se dá změřit přístroji používanými v době měření. Tam, kde jsou na kationtovém lipidu přítomny mastné kyseliny, mohou mít délku 12 až 24 atomů uhlíku, obsahovat až 6 nenasycených vazeb (dvojných vazeb) a mohou být připojeny na základní řetězec molekuly acylovými nebo etherovými vazbami; mohou také být pouze jedním řetězcem mastné kyseliny připojeným na základní řetězec molekuly. Tam, kde je na základní řetězec molekuly připojena více než 1 mastná kyselina, mohou být mastné kyseliny rozdílné (asymetrické). Jsou možné také smísené formulace.

Pojem „liposom zahrnuje jakýkoli kompartment obklopený lipidovou dvojvrstvou. Liposomy se také označují jak lipidové vesikuly. K vytvoření liposomů lipidové molekuly obsahují prodloužené nepolární (hydrofobní) části a polární (hydrofilní) části. Hydrofobní a hydrofilní části molekuly jsou výhodně umístněny na dvou koncích prodloužené molekulární struktury. Když se takovéto lipidy dispergují ve vodě, vytvoří spontánně dvojvrstvě membrány označované jako lamely. Lamely se skládají ze dvou jednovrstevných listů lipidových molekul, které mají své nepolární (hydrofobní) povrchy obrácené proti sobě a své polární (hydrofilní) povrchy obrácené do vodného média. Membrány vytvořené lipidy obklopují část vodné fáze způsobem podobným způsobu, kterým buněčná membrána obklopuje obsah buňky. Dvojvrstva liposomů je tedy podobná buněčné membráně bez proteinových složek přítomných v buněčné membráně. Jak se používá v souvislosti s tímto vynálezem, pojem liposom

ΟΛ-

zahrnuje multilamelární liposomy, které obecně mají průměr v rozmezí od 1 do 10 pm a skládají se od 2 do stovek koncentrických lipidových dvojvrstev střídajících se s vrstvami vodné fáze a také zahrnují unilamelární vesikuly, které se skládají z jedné lipidové vrstvy a obecně mají průměr v rozmezí od asi 20 do asi 400 nm, od asi 50 do asi 300 nm, od asi 300 do asi 400 nm, od asi 100 do asi 200 nm, kteréžto vesikuly mohou být vytvořeny zpracováním multilamelárních liposomů ultrazvukem, extruzi pod tlakem přes membránu s póry s definovanou velikostí nebo homogenizací při vysokém tlaku.

Výhodné liposomy obsahující taxany jsou jednolamelové vesikuly, které mají jednu lipidovou dvojvrstvu a průměr v rozmezí od 25 do 400 nm. Výhodné jsou také multilamelární vesikuly obsahující taxan a které mají průměr v rozmezí od asi 25 do asi 400 nm.

Výhodné polynukleotidové (včetně DNA, RNA a syntetických polynukleotidových analogů) liposomové komplexy se připraví z výhodných liposomů. Komplexy se připraví tak, že 1 pg polynukleotidu je přítomen na každý 1 až 50 nmol kationtového lipidu. Pokud je požadovaným konečným produktem exprese z genové kazety DNA, optimální poměr polynukleotidu ke kationtovému lipidu se určí empiricky, přípravou série formulací, kde se standardní množství DNA smísí s různými množstvími kationtového liposomů v rozmezí popsaném výše. Tyto formulace se poté podávají in vivo, přičemž se může určit formulace poskytující nejvyšší expresi.

Kationtové liposomy mohou být funkčně definovány jako liposomy se zeta potenciálem vyšším než 0 mV.

2β~ ·· ···· 9 9 9 ···

9 ·

999»

9 9

9 9

9 9

9 9

99

9 · 9

9 9

9 9 9

9 9

9999

Pojem „kationtový liposom, jak se zde používá, je míněn k zahrnutí jakéhokoli liposomů jak je definován výše, který je kationtový. Liposom se určí jako kationtový, pokud je přítomen při fyziologické hodnotě pH. Je třeba podotknout, že liposom samotný je entita, která je determinována jako kationtová, což znamená, že liposom, který má měřitelný kladný náboj uvnitř své fyziologické hodnoty pH se může, v in vivo prostředí, připojit na jiné látky. Tyto jiné látky mohou být negativně nabity a tím vést k tvorbě struktury, která nemá kladný náboj. Náboj a/nebo struktura liposomů podle tohoto vynálezu přítomný v in vivo prostředí nejsou přesně stanoveny. Podle tohoto vynálezu však kationtový liposom podle tohoto vynálezu se vytvoří za použití alespoň některých lipidů, které jsou samy o sobě kationtové. Liposom se nemusí nutně skládat z kationtových lipidů, ale musí se skládat z dostatečného množství kationtových lipidů, aby, když se liposom vytvoří a umístí do prostředí in vivo při fyziologické hodnotě pH, měl na počátku kladný náboj.

Pojem „komplex nukleotidová sekvence/kationtový lipid označuje kombinaci nukleotidové sekvence, kterou může být sekvence RNA nebo DNA, která je kombinována s alespoň kationtovými lipidy jak jsou definovány výše a může obsahovat neutrální lipidy. Když se kombinují sekvence DNA a kationtové lipidy, vytvoří spontánně komplexy, které nejsou klasickými liposomy. Předložený vynález se specificky týká tvorby specifických komplexů nukleotidová sekvence/kationtový lipid, kde nukleotidová sekvence je specificky sestavena k ovlivnění angiogenních endoteliálních buněk. Například nukleotidová sekvence může kódovat protein, který usmrcuje angiogenní endoteliální

4 4 4 • 4 4444 • 4 4 • · ·· • 4 ·

buňky. Tato sekvence se výhodně operativně spojí s promotorem, který se selektivně aktivuje pouze v prostředí angiogenní endoteliální buňky, tj. neaktivuje se v odpovídající klidové endoteliální buňce. Déle komplex může zahrnovat sekvenci, která je komplementární sekvencí, která blokuje expresi genetického materiálu v angiogenní endoteliální buňce a tím vážně porušuje chod angiogenní endoteliální buňky a/nebo ji usmrcuje. DNA může být plasmidová nebo lineární. Pokud je požadován genový produkt (buď samotný transkript RNA nebo translatovaný do proteinu), je nezbytná expresní kazeta, která se skládá ze sekvence DNA promotoru a sekvence DNA kódující genový produkt. Nukleotidy s jinými než fosfodiesterovými vazbami se používají obzvláště ke komplementárním použitím.

Pojem „spojuje se s odkazuje na působení kationtových liposomů podle tohoto vynálezu, které zůstávají v těsné blízkosti angiogenních endoteliálních buněk po dostatečně dlouhá časová období tak, že liposom a/nebo jeho obsah vstoupí do endoteliální buňky. Líposomy podle tohoto vynálezu se mohou spojovat s angiogenními endoteliálními buňkami za různých okolností, ale nejvýhodněji, se spojují s angiogenními endoteliálními buňkami za podmínek in vivo. Liposom tedy může být modifikován připojením, vazbou nebo napojením jiných molekul nebo materiálů, které jsou přítomny v krevním řečišti před spojením s angiogenní endoteliální buňkou. Za spojení liposomů s angiogenními endoteliálními buňkami může být odpovědna řada sil, jako jsou nespecifické interakce, ke kterým dochází mezi jakýmikoli dvěma nesouvisejícími molekulami, tj. dalšími makromolekulami, jako je lidský sérový albumin a lidský transferrin. Tyto intermolekulární ti »· ···· ·» ··*· ·♦ .·* >A - ···· ·· · · I * • · · · · ··· ···« ·♦· «« · ·· ···· síly mohou být zatříděny do 4 obecných oblastí, kterými jsou

1) elektrostatická,

2) vodíková,

3) hydrofobní a

4) Van der Waalsova.

Elektrostatické síly existují v důsledku přitahování mezi opačně nabitými iontovými skupinami, jako mezi opačně ♦ nabitými skupinami na kationtové.m liposomu a skupinami přítomnými na nebo v angiogenní endoteliální buňce.

J/ z z

Přitažlivá síla (F) je nepřímo umerna druhé mocnině vzdálenosti (d) mezi náboji. Vodíkové vazebné síly jsou poskytnuty tvorbou reverzibilních vodíkových můstků mezí hydrofilními skupinami. Liposomy podle tohoto vynálezu ⁱ mohou obsahovat hydrofilní skupiny, jako je -COOH, přičemž podobné skupiny mohou být přítomny na povrchu endoteliálních buněk, jako mohou být skupiny -OH nebo -NH₂. Tyto síly jsou velmi závislé na blízké poloze dvou molekul nesoucích tyto skupiny. Hydrofobní síly fungují stejným způsobem, takže olejové kapky se ve vodě spojují k vytvoření jedné velké kapky. Nepolární hydrofobní skupiny, jako jsou skupiny přítomné v liposomech podle tohoto vynálezu, tudíž mají sklon se ve vodném prostředí . spojovat a mohou mít sklon ke spojování hydrofobními * skupinami přítomnými na povrchu endoteliálních buněk.

Nakonec Van der Waalsovy síly se tvoří mezi molekulami a závisí na interakcích mezi externími mraky elektronů.

Pojem „selektivně se spojuje a „selektivně je zaměřen apod. se zde používají k popisu vlastnosti kationtových liposomu podle tohoto vynálezu, která zpsobuje, že kationtové liposomy se spojují s angiogenními endoteliálními buňkami vyšší měrou, než se kationtové

9» 9·

9 9 9

9 9

9 9 ·

9 9

3· 9999

·9«9 • *

9··

9

9

9 9 9

9 9

9* lipsomy spojují s Odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, které se neúčastní angiogeneze. Podle tohoto vynálezu selektivní nebo preferenční spojení znamená, že liposom se spojí 5-násobně nebo vícenásobně vyšší měrou s endoteliálními buňkami, které podstupují angiogenezi ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezi. Výhodněji výhodné nebo selektivní spojení označuje desetinásobnou nebo vícenásobnou selektivitu mezi angiogenními endoteliálními buňkami a odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami.

Pojem „rakovina odkazuje na chorobu z nepříhodné proliferace buněk. Tato porucha je nejvíce evidentní klinicky, když hmota tumorové tkáně oslabuje funkci životních orgánů. Koncepty popisující normální růst tkáně jsou aplikovatelná na maligní tkáň z toho důvodu, že normální a maligní tkáň sdílejí podobné růstové, charakteristiky, jak na úrovni jednotlivé buňky, tak na úrovni tkáně. Rakovina je stejně tak chorobou porušené regulace růstu tkáně, jako chorobou porušené regulace růstu buňky. Čas zdvojení označuje čas, který tkáň nebo tumor potřebuje ke zdvojení velikosti nebo počtu buněk. Čas zdvojení klinicky zřejmého tumoru je obvykle výrazně delší, než čas buněčného cyklu buněk, z nichž se tumor skládá. Na rozdíl od tumoru však normální játra, srdce nebo plíce u dospělého jedince nemají čas zdvojení, protože tyto orgány v rovnovážném stavu, takže rychlosti tvorby buněk a buněčné smrti jsou shodné (Stockdale, „Cancer Growth and Chemotherapy, v Scientifíc Americam Medicine, díl 3, Scientific American Press, New York, str. 12 až 18 (1996)). Růstové charakteristiky tumorů jsou takové, že tvorba nových buněk přesahuje buněčnou smrt, neoplastický děj má sklon k tvorbě zvýšení podílu kmenových buněk, u kterých

φφ· Φ Φ w « *Φ· ··

Φ · 9 9 · · · ·

Φ ΦΦΦ Φ · ♦ <· ·

φ » Λ · <· Φ Φ

Φ * Φ ΦΦ * • Φ ·

ΦΦΦΦ probíhá sebeobnova, a odpovídající snížení v podílu, který postupuje ke zrání (McCulloch a kol., Blood, 59, 601 až 608 (1982)). Pro každou populaci tumoru existuje čas zdvojení, přičemž byly stanoveny specifické růstové křivky (Stockdale, viz výše). Růstový vzor u tumorů může být popsán gomperziánskou křivkou (Steel, Growth kinetics of tumors, Oxford university Press, lne., New York, str. 40 (1977)), která ukazuje, že během vývoje tumoru je rychlost růstu na počátku velmi vysoká a poté se progresivně se zvětšující se velikostí snižuje.

Obecné aspekty vynálezu

Připojené obrázky poskytují jasný vizuální doklad vysoce selektivního způsobu, kterým kationtové liposomy podle tohoto vynálezu míří na angiogenní endoteliální buňky. Základní ztělesnění tohoto vynálezu zahrnuje způsob selektivního ovlivňování angiogenních endoteliálních buněk podáváním (výhodně intravaskulární injekcí, výhodněji intraarteriální injekcí) prostředku, který obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a kationtové liposomy, které obsahují látku nebo DNA/kationtové komplexy. Látkou může být sloučenina, která inhibuje angiogenezi, sloučenina, která navozuje angiogenezi a/nebo detekovatelná značka. Kationtové liposomy v injikovaném prostředku se poté nechají vstoupit do angiogenních endoteliálních buněk (endocytózou), které vystýlají stěny angiogenních krevních cév. Kationtové liposomy se spojují angiogenními endoteliálními buňkami po dostatečnou dobu a takovým způsobem., že liposomy samotné a/nebo obsah liposomů vstoupí do angiogenní endoteliální buňky. Poté sloučenina, která vstoupila do buňky, může inhibovat·nebo navodit angiogenezi nebo pouze poskytnout značku umožňující detekci míst • 0

3J

0 ··· · 0 0 ·

0 0 0 angiogeneze. Selektivita cílení na angiogenní endoteliální buňky může být nejlépe pochopena odkazem na připojené obrázky.

Obr. 1 ukazuje část myšího ovária, která má na sobě umístěn velký kulatý folikl (žlutá barva). Jelikož v normálním myším ováriu dochází k angiogenezi, kationtové liposomy obsahující detekovatelnou značku se spojují s angiogenními endoteliálními buňkami rostoucích krevních cév folikulu (červeno-oranžová barva). Na obr. 1 však není možno jasně určit, že značka je spojena pouze s angiogenními endoteliálními buňkami nebo zda je spojena s veškerou tkání v ováriu a folikulu.

Obr. 2 je fluorescenčním mikrografem ukazujícím řez tumoru slinivky břišní z myši, které byly intravenózně injikovány kationtové liposomy (červeno-oranžová barva) podle tohoto vynálezu obsahujíc detekovatelnou značku.

V tumorech snadno dochází k angiogenezi. Tato fotografie tedy poskytuje jistou indikaci, že kationtové liposomy (červeno-oranžová barva) podle tohoto vynálezu se specificky spojují s angiogenními endoteliálními buňkami (zelená barva). Tyto výsledky však dramaticky nedemonstrují specificitu tohoto vynálezu.

Srovnání obr. 3 a obr. 4 ukazuje schopnost tohoto vynálezu lokalizovat místo angiogeneze. Obr. 3 je fotografie ukazující krevní cévy v normální pankreatické tkáni myši. Značení normálních endoteliálních buněk je mnohem menší než značení angiogenních endoteliálních buněk. To je jasně ukázáno srovnáním obr. 3 a obr. 4, který je fotografií pankreatického tumoru u myši. Obr. 4 jasně ukazuje vysoký stupeň akumulace značky (žluto-oranžová

-46 34barva) obsažené v kationtových li.posomech v oblasti tumoru. Dramatický rozdíl mezi obr. 3 a 4 ukazuje využitelnost předloženého vynálezu k jasnému a přesnému označení místa tumoru. Jelikož je však na obr. 4 s angiogenními krevními cévami spojeno takové množství značek, nemusí být možné plně docenit specificitu kationtových liposomů pro preferenční cílení na angiogenní endoteliální buňky.

i. Obr. 5 je fotografie krevních cév (zelená barva) v normálním ostrůvku myší slinivky břišní. Malé množství ¹ červeno-oranžového zbarvení ukazuje omezené spojení kationtových liposomů s normálními endoteliálními buňkami vystýlajícími krevní cévy pankreatické tkáně.

Specificita kationtových liposomů obsahujících detekovatelnou značku je jasněji ukázána srovnáním obr. 5 a obr. 6. Obr. 6 jasně ukazuje mnohem vyšší stupeň akumulace značky endoteliálními buňkami angiogenních cév tumoru v myším pankreatu.

Přesná schopnost kationtových liposomů cílit na angiogenní endoteliální buňky je dramaticky ukázána na obrázcích 7 a 8. Obr. 7 jasně ukazuje, že fluorescenční . značka je spojena pouze s krevními cévami, tj. značka neuniká nebo nemigruje do okolní tkáně. Specificita je nejdramatičtěji ukázána na obr. 8, který se jasně zaměřuje na značené kationtové liposomy detekované v angiogenních endo-teliálních buňkách, což ukazuje, že značka je specifická pro tyto buňky a neuniká nebo nemigruje do okolní tkáně.

Obrázky 9 a 10 ukazují stejný účinek jaký je popsán výše, ale na jiném modelu angiogeneze. Obrázky 1 až

4« • · 4

4 • «

-η354 · 4

4 4·

4· « jsou všechny zaměřeny buď na normální nebo na rakovinnou tkáň. Obr. 9 nebo obr. 10 ukazují normální a zanícenou tkáň myší trachey. Specifičtěji obr. 9 ukazuje normální cévu trachey, tj. myší tracheu prostou patogenu. Obr. 10 ukazuje cévy trachey s výskytem angiogeneze indukované infekcí. Je zřejmá vyšší koncentrace detekovatelné značky na obr. 10, což ukazuje, že kationtové liposomy podle tohoto vynálezu se selektivně spojují s angiogenními endoteliálními buňkami - specificky se spojují s endoteliálními buňkami trachey, které jsou indukovány k angiogenezi infekcí.

Obr. 11 je graf představující rozdíl ve specificitě kationtových liposomů mezi jejich schopností spjovat se s angiogenními endoteliálními buňkami a odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezi. Jak je ukázáno na obr. 11, kationtové liposomy podle tohoto vynálezu (při tomto experimentu) vykazují přibližně desetinásobně vyšší afinitu k angiogenní endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezi.

•i

Obrázky 12 a 13 ukazují jak kationtové liposomy podle tohoto vynálezu vstupují do angiogenních endoteliálních buněk. Na obr. 12 se kationtové liposomy dostaly do kontaktu s povrchem angiogenní endoteliální buňky. Na obr. 13 vstoupily kationtové liposomy do angiogenní endoteliální buňky endocytózou a jsou přítomny v buňce.

Obr. 14 ukazuje příjem liposomového přípravku obsahujícího paklitaxel tracheami myší prostých patogenu a infikovaných Mycoplasma pulmonis a dále ukazuje, že kationtové liposomy se preferenčně spojují a jsou přijímány

36angiogenními endoteliálními buňkami ve srovnání s endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezi.

Odborník v oboru bude schopen podle slovního popisu a popisu prostřednictvím obrázků specificity kationtových liposomů schopen vyrobit řadu různých kationtových liposomů obsahujících řadu různých látek k využití vynálezu. Pro úplnost však následuje popis kationtových liposomů a způsobů jejich výroby následovaný popisem látek, které buď inhibují nebo navozují angiogenezi.

Liposomy

Liposomy lze snadno vytvořit umístěním lipidů (jak jsou definovány výše), které budou zahrnovat kationtové lipidy (jak jsou definovány výše) do vodného roztoku a mícháním roztokem po dobu několika sekund a hodin. Tento jednoduchý postup spontánně vede k získání velkých, multilamelárních liposomů nebo vesikul s průměry v rozmezí od asi 1 do 10 μπι. Tyto liposomy se skládají ze dvou až několika stovek koncentrických lipidových dvojvrstev, které se mohou střídat s vrstvami vodné fáze, v níž byly lipidy přítomny. Do vodné fáze může být zahrnuta látka, jako je sloučenina, která inhibuje angiogenezi, navozuje angiogenezi nebo poskytuje dete.kovatelnou značku. Látka může být rozpustná ve vodě nebo může být alespoň snadno dispergovatelná ve vodě. Alternativně takové látky mohou být zahrnuty do lipidové dvojvrstvy. Látky, které jsou zahrnuty do lipidové dvojvrstvy mohou být hydrofobní.

Tloušťka vodné vrstvy a tedy celkové množství vodné fáze zachycené v liposomů závisí na rovnováze sil elektrostatického odporu mezi nabitými lipidy a Van der Waalsovými silami mezi dvoj vrstvami jako celkem. Vodný prostor (a tedy objem zachyceného vodného materiálu) se tedy zvyšuje s podílem nabitých lipidů v membráně a se snižujícími se koncentracemi elektrolytů (nabitých iontů) ve vodné fázi.

Mohou se vyrobit liposomy různých velikostí. Malé vytvořené liposomy nebo vesikuly jsou jednolamelární a mají velikost v rozmezí od asi 20 do 400 nm a mohou se vyrobit zpracováním multilamelárních vesikul ultrazvukem, extruzí pod tlakem přes membrány, které mají póry s definovanou velikostí nebo homogenizací při vysokém tlaku. Větší jednolamelární liposomy, které mají velikost v rozmezí od asi 0,1 do 1 pm v průměru, se mohou získat když se lipid solubilizovaný v organickém rozpouštědle nebo povrchově aktivní látce a solubilizační činidlo se odstraní odpařením nebo dialýzou. Fúze menších jednolamelárních liposomů způsoby vyžadujícími určité lipidy nebo přísné podmínky dehydratace-hydratace může vést k získání jednolamelárních nádržek velikých nebo větších než je buňka.

K vytvoření kationtových liposomů podle tohoto vynálezu je nezbytné, aby se liposomy vytvářely za použití alespoň některých kationtových lipidů. Kationtové liposomy podle tohoto vynálezu se však nemusí skládat zcela z kationtových lipidů. Například použití neutrálních lipidů v množství okolo 45 % a kationtových lipidů v množství okolo 55 % povede k získání kationtových lipidů, které jsou užitečné podle tohoto vynálezu a preferenčně míří na angiogenní endoteliální buňky.

-<ioββ• · • · ··

Kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou obsahovat látku, která ovlivňuje angiogenezi a mohou dále obsahovat fluorofor nebo jinou značku a/nebo rozpustnou sloučeninu, ve vodném kompartmentu. Vytváření kationtových liposomů obsahujícíh látku, která ovlivňuje angiogenezi a/nebo značku se může provádět za použití několika způsobů, které jsou.v oboru standardní, kde se například mísí roztoky 1,2-díoleoyl-3-trimethylamoniumpropanu (DOTAP), cholesterolu a texaské červeni DHPE (N-(5-dimethylaminonaftalen-l-sulfonyl)-1,2-dihexadekanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin), odpaří se do sucha a lipidový film se následně rehydratuje v 5% dextróze k získání multilamelárních vesikul (MLVs). Tyto vesikuly se extrudují přes polykarbonátové membránové filtry k získání jednolamelárních vesikul. Liposomy a látky k zapracování, například plasmidová DNA, se smísí ve specifických poměrech s 5% roztokem dextrózy nebo jinou fyziologicky přijatelnou pomocnou látkou. Užitečné kationtové lipidy zahrnují: DDAB, což je dimethyldioktadecyl-amoniumbromid; N-[1-(2,3dioloyloxy)propyl]-Ν,N,N-trimethylamoniummethylsulfát, 1,2diacyl-3-trimethylamoniumpropany (včetně dioleoyl- (DOTAP), dimyristoyl-, dipalmitoyl-, disearoyl-, výčet tím však není omezen); 1,2-diacyl-3-dimethylamoniumpropany (včetně dioleoyl- (DOTAP), dimyristoyl-, dipalmitoyl-, distearoyl-, výčet tím však není omezen); DOTMA, což je N-[1-[2,3-bis(oleoyloxy)]propyl]-N,N,N-trimethyl-amoniumchlorid; DOGS, což je dioktadecylamidoglycylspermin; DC-cholesterol, což je 3β-[Ν-[Ν',Ν'-dimethylaminoethan)karbamoyl]cholesterol; DOSPA, což je 2,3-dioleoyloxy-N-(2—(spermínkarboxamido)ethyl)-N,N-dimethyl-l-propanaminiumtrifluoracetát; 1,2-diacyl-sn-glycero-3-ethylfosfocholiny (včetně dioleoyl(DOECP), dilauroyl-, dimyristoyl-, dipalmitoyl-, distearoyl-, palmitoyl-oleoyl-, výčet tím však není omezen); β-alanylcholesterol; CTAB, což je cetyltrimethylamoniumbromid, diCi₄-amidin, což je N-terc-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidin, 14Dera2, což je 0,0'-ditetradekanoyl-N-(trimethylamonioacetyl)diethanolaminchlorid; DOSPER, což je l,3-dioleoyloxy-2-(6-karboxyspermyl)propylamid; Ν,Ν,Ν',N'-tetramethyl-N,N'-bis (2-hydroxyethyl)-2,3-dioleoyloxy-l,4-butan-diamoniumjodid;

1-[2-(acyloxy)ethyl]-2-alkyl(alkenyl)-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchloridové deriváty, jako je 1-[2-(9(Z)-oktadecenoyloxy)ethyl]-2-(8(Z)-heptadecenyl-3-(2-hydroxyethyl) imidazoliniumchlorid (DOTIM), 1-[2-(hexadekanoyloxy)ethyl]-2-pentadecyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DPTIM) nebo 1-[2-(tetradekanoyloxy)ethyl]-2-tridecyl-3-(2-hydroxyethyl)imidazoliniumchlorid (DMTIM), jak je popsáno v Solodin a kol., Biochem, 4 3, 13537 až 13544 (1995); deriváty kvarterní amoniové 2,3-dialkoxypropylové sloučeniny obsahující na kvarterním aminu hydroxyalkylovou část, jako je 1,2-dioleoyl-3-dimethylhydroxyethylamoniumbromid (DORI), 1,2-dioleoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylamoniumbromid (DORIE), 1,2-dioleoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxypropylamoniumbromid (DORIE-HP),

1.2- dioleoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxybutylamoniumbromid (DORIE-HB), 1,2-dioleoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxypentylamoniumbromid (DORIE-HPe), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylamoniumbromid (DMRIE), 1,2-dipalmitoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylamoniumbromid (DPRIE) nebo

1.2- disteryloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylamoniumbromid (DSRIE), jak jsou popsány například v Felgner a kol., J. Biol. Chem., 269, 2550 až 2561 (1994)). Mnohé z výše uvedených lipidů jsou dostupné komerčně od např. Avantí Polar Lipids, lne.; Sigma Chemical Co.; Molecular Probes, lne.; Northern Lipids, lne.; Roche Molecular Biochemicals a Promega Corp.

V» *«·· ·· ···· ·* ·· • ♦ · «Β · » · · · ···· · · · ft · « • · * · ♦ · * · · · • · · · · · · · ·»····· ·· « · · · · · ·

Kationtové liposomy se připraví z kationtových lipidů samotných nebo ve směsi s jinými lipidy,, obzvláště neutrálními lipidy, jako jsou cholesterol; 1,2-diacyl-sn-glycero-3-fosfoethanolaminy (včetně dioleoyl- (DOPE), výčet tím však není omezen); 1,2-diacyl-sn-glycero-3-fosfocholiny; přirozený fosfatidylcholin z vaječného žloutku (PC) apod.; syntetické mono- a diacylfosfocholiny (např. monoacylfosfatidylcholin (MOPC)) a fosfoethanolaminy. K výše uvedeným diacylderivátům mohou také být přidány asymetrické mastné kyseliny, jak syntetické, tak přírodní a smísené prostředky.

Liposomy výše popsaného typu nebo jiných typů, které si odborník v oboru představí, mohou být použity v předloženém vynálezu s liposomy obsahujícími látku, která buď navozuje nebo inhibuje angiogenezi a/nebo obsahuje detekovatelnou značku. Příkladem liposomů podle tohoto vynálezu jsou kationtové liposomy obsahující látku rozpustnou v lipidech nebo ve vodě, která inhibuje angiogenezi. Sloučeniny rozpustné v tucích však mohou být v lipidové dvojvrstě. Následuje popis inhibitorů angiogeneze. Je však třeba podotknout, že další budou odborníkovi v oboru zřejmé a/nebo je odborník v oboru vyvine podle tohoto vynálezu a že takové inhibitory angiogeneze se mohou snadno použít v souvislosti s předloženým vynálezem.

Činidla inhibující angiogenezi

Heparin je potenciátorem angiogeneze, přičemž antagonisté heparinu mohou blokovat angiogenní odpověď. Protamin, což je protein vážící heparin, vykazuje

4+ • · ·«·· · ♦ ·· ♦ 9 · 9 > * 9 • ♦ · 9 9 *

9 · 9 9 ·

9 9 · 9999 antiangiogenní vlastnosti (Taylor a kol., Nátuře, 297, 307 až 312 (1982)), ale není klinicky užitečný, protože je o něm známo, že způsobuje při podání lidem anafylaktické reakce. Dalším antiangiogenním činidlem je protein vážící heparin, Major Basic Protein, který je také silně toxický a není tedy praktický pro použití u člověka. Avšak v důsledku vysokého stupně selektivity zacílení dosaženého předloženým vynálezem mohou být tyto a jiné sloučeniny, které inhibují angiogenezi, ale které se považují za příliš toxické k terapeutickému použití, dobře užitečné, protože mohou být použity ve velmi malých množstvích.

Destičkový faktor 4 (PF4) vykazuje jak aktivitu vazby heparinu, tak antiangiogenní vlastnosti, a protože není toxický jako jiné antagonisty heparinu, může být klinicky užitečný. Chemické modifikace PF4, jak jsou popsány v US patentu č. 5 112 946, posilují antiangiogenní vlastnosti PF4. Tyto modifikace zahrnují tvorbu analogů PF4 modifikovaných prostřednictvím svých volných aminoskupin fluoresceinisothiokyanátem, mutantů PF4 se specificky změněnou strukturní skladbou proteinu a tvorbu fragmentů PF4, které si podržují antiangiogenní vlastnosti. Obzvláště vykazuje mocnou antiangiogenní aktivitu syntetický peptid ze 13 aminokyselin odpovídající karboxylovému konci PF4.

Inhibice angiogeneze byla ukázána u různých steroidů. Tato antiangiogenní aktivita je potencována přidáním heparinu nebo příbuzných molekul (Folkman a kol., Science, 243, 1490 až 1493 (1989)). Takzvané „angiostatické steroidy, jako je tetrahydrokortizon, mají schopnost blokovat angiogenezi in vivo. Jako mocný angiostatický steroid se používá specificky 6a-fluor-17,21-dihydroxy-16p-methylpregna-4,9-(11)-dien-3,20-dion.

• f · *« ·· 9 ·

U léčiv, která modulují metabolismus kolagenu, bylo nalezeno, že inhibují angiogenezí. Analogy aminokyseliny prolinu specificky inhibují syntézu kolagenu a inhibují angiogenezí in vivo. V sestupném pořádku podle klesající aktivity specificky vykazují antiangiogenní aktivitu L-azetidin-2-karboxylová kyselina (LACA), cis-hydroxyprolin (CHP), D,L-3,4-dehydroprolin (DHP) a thioprolin (TP) (Ingberg a kol., Lab. Invest., 59, 44 až 51 (1988)). Každý z těchto analogů rovněž potencuje antiangiogenní účinky angiostatíckých steroidů a heparinu.

Lidský trombspondin, což je glykoprotein nalezený v alfa granulích destiček, inhibuje angiogenezí v trimerní nebo monomerní nebo fragmentní formě, jak je popsáno v US patentu č. 5 192 744. Každá funguje v glykosylované formě a má se za to, že funguje v neglykosylované formě. Vlastnosti inhibující angiogenezí jsou přítomny po deleci domény vážící heparin spojené s aminokoncem a domény vážící destičku nacházející se na karboxylovém konci monomerního proteinu.

Peptidy vykazující lamininovou aktivitu blokují angiogenezí a zabraňují tvorbě přebytečných krevních cév v tkáních. Specifickými peptidy s takovouto aktivitou jsou:

1) tyrosin-isoleucin-glycin-serin-arginin,

2) prolin-aspartin-serin-glycin-arginin a

3) cystein-aspartát-prolin-glycin-tyrosin-isoleucin-glycinserin-arginin.

U těchto peptidů se předpovídá, že mají svou antiangiogenní aktivitu v cyklické formě.

«· ·*«« ·· • 99 9 • · · · 9

Další příklady látek inhibujících angiogenezi zahrnují extrakty z chrupavkové tkáně vykazující kolagenázovou aktivitu, proteiny odvozené od pigmentových endoteliálních buněk sítnice (Arch. Ophthalmol., 103, 1870 až 1875 (1985)), protirakovinný faktor indukovaný z kultivovaných buněk chrupavky (Takigava a kol., Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 22' 1803 až 1807 (1988), protizánětlivá léčiva, jako je indometacin (Peterson a kol., Anticancer Res., 6, 251 až 253 (1986)), inhibitory ribonukleázy (Shapiro a kol., PNAS, 84, 2238 až 2241 (1987)), komplexy sulfatovaných polysacharidů a glykanů peptidu (např. JPA-S63 (1988)-119500), přípravky proti artritidě ze ziata, herbimycin A (JPA-S63 (1988)-295509) a proteiny METH-1 a METH-2 (Vazquez a kol., J. Biol. Chem., 274, 23349 až 23357 (1999)) a deriváty fumagillinu a fumagillolu. Četné deriváty fumagillolu mají vlastnosti inhibující angiogenezi, jak je popsáno v US patentu č.

202 352. Výše uvedené odkazy jsou zde zahrnuty formou odkazu k popisu a zveřejnění inhibitorů angiogeneze.

Taxany

Tento vynález dále poskytuje katíontové liposomy obsahující taxan jako antiangiogenní činidlo. Takové liposomy mohou inhibovat angiogenezi a jsou užitečné při léčení tumorů, chronického zánětu a dalších chorob spojených s angiogenezi.

„Taxany zahrnují paklitaxel, stejně jako jakýkoli aktivní derivát taxanu nebo prekurzor léčiva pokud se u nich pozoruje aktivita, tj. angiogeneze je inhibována v cévě alespoň 2-násobně, výhodněji alespoň 5-násobně, ještě výhodněji alespoň 10-násobně a ještě více výhodněji

• 4 » ·»«

44*4

50-násobně nebo vícenásobně ve srovnání s angiogenezí v krevních cévách, které nejsou v kontaktu s kationtovou lipidovou formulací obsahující taxan.

Odborník v oboru snadno zjistí, za použití četných známých metod, zda je angiogeneze inhibována. Takovéto metody zahrnují způsoby zahrnující invazi syntetické matrix, in vitro nebo in vivo, cévami v odpověď na látku, která je promotorem angiogeneze (tj. proangiogenní látky), např. stanovení na chorioallantoidní membráně, stanovení na rohovkovém vaku a stanovení inhibice proliferace endoteliálních buněk, výčet tím však není omezen. Takovéto metody byly v literatuře mnohokrát popsány, včetně mezi jinými Vazquez a kol., J. Biol. Chem., 274, 23349 až 23357 (1999) a Belotti a kol., Clin. Cancer Res., 2, 1843 až 1849 (1996).

Taxan může být inkorporován do lipidové dvojvrstvy liposomů, může být přítomen ve vodném kompartmentu nebo v obou. V některých ztělesněních tudíž tento vynález poskytuje kationtový liposom obsahují kationtové lipidy a taxan v lipidové dvojvrstvě.

V některých těchto ztělesněních kationtový liposom dále obsahuje taxan ve vodném kompartmentu. V jiných ztělesněních tento vynález poskytuje kationtové liposomy obsahující kationtové lipidy a taxan ve vodném kompartmentu. Taxany, které mohou být zahrnuty do vodného kompartmentu, zahrnují ve vodě rozpustné taxany (např. hydrofilní derivát). Taxany, které mohou být zahrnuty do lipidové dvojvrstvy kationtového liposomů zahrnují hydrofobní taxany a hydrofobní deriváty taxanu.

*0 0000 ·♦ 0000 00 00 000 00 0 0000

0000 00 0 · · * 0 00000 000 · • 0 0 0 0 000 • 000000 «0 0 00 0000

Obecně podíl taxanu v prostředcích kationtových liposomů podle předloženého vynálezu je méně než asi 20 % molárních. V některých ztělesněních obsahuje prostředek kationtového liposomů taxan v podílu od asi 0,5 molárního % do asi 20 % molárních, v jiných ztělesněních od asi 2 do asi 20 % molárních. V jiných ztělesněních je taxan přítomen od asi 1 do asi 5 % molárních a ještě jiných ztělesněních od asi 1 do asi 3 % molárních. Když je taxan zahrnut do kationtového liposomů v podílu od asi 0,5 molárního % do asi 20 % molárních, od asi 2 do asi 10 % molárních, od asi 1 do asi 5 % molárních, od asi 1 do asi 3 % molárních, taxan se podstatně nevyděluje z liposomální dvojvrstvy a/nebo podstatně netvoří krystaly taxanu po dobu alespoň asi 0,5 hodiny, obecně alespoň okolo 1 hodiny, obecně alespoň okolo 2 hodin, obvykle alespoň okolo 24 hodin, obvykle alespoň okolo 48 hodin, při teplotě mezi asi 4 °C a asi 25 °C. Vyšší podíly taxanu mohou být zahrnuty, pokud se taxan podstatně nevyděluje z liposomální dvojvrstvy a/nebo neobsahuje žádné krystaly taxanu. Kationtové liposomy obsahující taxan neobsahují „v podstatě žádné krystaly taxanu, tj. obecně méně než okolo 10 %, obvykle méně než okolo 5 %, obvykle méně než okolo 2 %, typicky méně než okolo 1 % a výhodně méně než okolo 0,5 % taxanu přítomného v kationtovém liposomů je ve formě krystalů. Kationtový liposom, ve kterém se taxan podstatně nevyděluje z lipidové dvojvrstvy je kationtový liposom, kde obecně méně než okolo 20 %, obvykle méně než 10 %, obvykle, méně než okolo 5 %, typicky méně než okolo 1 % a výhodně méně než okolo 0,5 % taxanu se vydělilo z liposomové dvojvrstvy.

Podíl kationtového lipidu v liposomovém-taxanovém prostředku je obecně vyšší než okolo 5 % molárních, obvykle vyšší než okolo 10 % molárních, obvykleji vyšší než okolo . 99 • ΦΦΦΦ

Φ 9· 9

-Ί*46' φ φ · φ· · • · ·Φ·

Φ ΦΦΦ

9 9

ΦΦΦΦ % molárních. V některých ztělesněních je kationtiový lipid přítomen v liposomovém-taxanovém prostředku v od asi 20 do asi 99 % molárních. V jiných ztělesněních je kationtiový lipid přítomen od asi 30 do asi 80 % molárních, v jiných ztělesněních od asi 40 do asi 98 % molárních a v jiných ztělesněních od asi 40 do asi 60 % molárních. Liposomové prostředky vhodné pro použití při dodávání taxanu jsou popsány výše. Taxan také může být připojen na hydrofobní organickou část, jako mastná kyselina, fosfolipid apod., a inkorporován do liposomů. Takové deriváty taxanu jsou popsány a jsou vhodné pro použití v předloženém vynálezu. Viz např. US patent č. 5 580 899. Fosafatidylcholinové prostředky obsahující taxol jsou popsány (US patent č. 5 683 715).

Kationtové liposomové prostředky obsahující taxan mají vyšší afinitu k, preferenčně se spojují s a jsou přijímány endoteliálními buňkami cév podstupujícími angiogenezi (tj. angiogenními endoteliálními buňkami), tj. kationtové liposomové prostředky obsahující taxany jsou přijímány (tak, že taxan vstupuje do buňky) angiogenními endoteliálními buňkami v množství alespoň 2-násobném, výhodněji alespoň 5-násobném, ještě výhodněji alespoň 10násobném nebo vícenásobném ve srovnání s množstvím přijímaným neangiogenními endoteliálními buňkami. Toto srovnání se obvykle provádí na mezibuněčné úrovni, tj . provede se přímé srovnání mezi příjmem angiogenní endoteliální buňkou a neangiogenní endoteliální buňkou.

Jako příklad se ex vivo provede stanovení k určení poměru příjmu angiogenními ve srovnání s neangiogenními buňkami, např. buňky se označí ve zvířeti in vivo, vyjmou se ze zvířete a stanoví se ex vivo příjem kationtového liposomového prostředku. Příklad vhodné metody pro

00 0 · 0 0 0

0000 00« 0000 000 00 0 0« 0000

V tomto stanovení se že indukuje • · 0 0« 0 • 0 • 0 00

0· 000• 0 stanoveni je poskytnut v příkladu 5. zvíře ošetří látkou, o níž je známo, angiogenezi. Endoteliální buňky se přivedou do kontaktu s kationtovým liposomovým/taxanovým prostředkem, který obsahuje značku, která může být rozlišena od značky používané ke značení všech endoteliálních buněk. Po dostatečné době jsou všechny endoteliální buňky označeny fluorescenční značkou. Zvíře se může perfundovat fixativem před, současné s nebo po značení endoteliálních buněk. Po dostatečné době (např. od asi 1 minuty do asi 2 hodin) se endoteliální buňky vyjmou ze zvířete a, přímou vizualizací konfokální mikroskopií, se srovná podíl endoteliálních buněk obsahujících značku spojenou s kationtovým liposomovým/taxanovým prostředkem s podílem endoteliálních buněk neobsahujících značku spojenou s kationtovým liposomovým/taxanovým prostředkem. Tímto způsobem se může provést přímé, mezibuněčné srovnání mezi příjmem angiogenními endoteliálními buňkami a neangiogenními endoteliálními buňkami. Zda je kationtový liposom preferenčně přijímán danou buňkou se může stanovit za použití známé metody, včetně použití značených lipidů a fluorescenční mikroskopie, jak je popsáno v příkladech. Způsoby zahrnující např. měření příjmu homogenátů celých tkání obecně nejsou výhodné, protože přítomnost velkých podílů neendoteliálních buněk může snížit poměr signálu k pozadí a tedy nemusí přesně odrážet rozdíl mezi příjmem angiogenními endoteliálními buňkami a neangiogenními endoteliálními buňkami.

Neutrální lipid může být zahrnut do kationtového liposomového prostředku a, když je přítomen, může být v podílech od asi 1 molárního % do asi 80 % molárních, obecně od asi 2 do asi 50 % molárních, obvykle od asi 40

48'·· ··»« •9 9999

9 9 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9 99 9999 do asi 50 % molárních. Může být zahrnut jakýkoli neutrální lipid včetně fosfatidylethanolaminu, čímž výčet není omezen, včetně, DOPE, a fosfatidylcholinu, čímž výčet není omezen, včetně, vaječného fosfatidylcholinu, DOPC a MOPC, výčet tím však není omezen. Směsi fosfatidylethanolaminu a fosfatidylcholinu mohou být také zahrnuty.

Kationtové liposomy zahrnující taxan mohou dále obsahovat detekovatelnou značku, jejichž široká škále je v oboru známa, jak je zde v detailu popsáno.

Příklad 5 poskytuje experimentální data ukazující cílení paklitaxel obsahujících kationtových liposomů do angiogenních endoteliálních buněk. V některých ztělesněních tudíž vynález poskytuje kationtové liposomy obsahující paklitaxel. V některých z těchto ztělesnění obsahuje kationtový liposom 1,2-dioleoyl-3-trimethyl-amoniumpropan (DOTAP) od asi 20 do asi 99 % molárních, od asi 40 do asi 70 % molárních, od asi 50 do asi 60 % molárních.

V některých z těchto ztělesnění obsahuje kationtový liposom DOTAP : vaječný fosfatidylcholin(PC) : rhodamin : DHPE : paklitaxel v molárním poměru 50 : 47 : 1 : 2. V jiných ztělesněních obsahuje kationtový liposom DOTAP : vaječný fosfatidylcholin (PC) : paklitaxel v molárním poměru 50 : 48 : 2. V jiných ztělesněních obsahuje kationtový liposom DOTAP : DOPC : paklitaxel v molárním poměru 50 : 47 : 3.

V jiných ztělesněních obsahuje kationtový liposom DOTAP :

DOPE : paklitaxel v molárním poměru 50 : 47 : 3. V jiných ztělesněních obsahuje kationtový liposom DOTAP : MOPC : paklitaxel v molárním poměru 50 : 47 : 3.

Paklitaxel vazbou na tubulin stabilizuje mikrotubulární struktury. V dělících se buňkách to může

to· ···* to* tototo· ·· ··· ·· · ·#«« ···· ·· · ·* · • ····· ··« to • ···· ··* ···· ·«· ·· · ·· ··«· vést k tvorbě abnormálních mitotických vřetének. Kromě toho taxany mají antiangiogenní aktivitu (Belotti a kol., Clin. Cancer Res., 2, 1843 až 1849 (1996) a Kluber a kol., Cancer Res., 57, 81 až 86 (1997)). Kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou obsahovat jakoukoli látku, která inhibuje angiogenezi, včetně taxanu, čímž výčet není omezen, včetně, paklitaxelu, a jakéhokoli z výše popsaných inhibitorů angiogeneze, výčet tím však není omezen.

V některých ztělesněních jsou tudíž poskytnuty kationtové liposomy, které obsahují taxan a jednu nebo více dalších antiangiogenních látek.

Paklitaxel je vysoce derivovaný diterpenoid (Wani a kol., J. Am. Chem. Soc., 93, 2325 až 2327 (1971)), který byl získán ze sklizené a usušené kůry keře tisu Taxus brevifolia a Taxomyces adrenae, což je endofyticá houba tisu Taxus brevifolia (Stierle a kol., Science, 60, 214 až 216 (1993)). „Paklitaxel” (který zde má být chápán jako zahrnující analoga, prostředky a deriváty, jako je například docetaxel, TAXOLJ, TAXOTEREJ (prostředky z docetaxelu) , 10-desacetylová analoga paklitaxelu a 3'N-desbenzoyl-3'N-terc-butoxykarbonylová analoga paklitaxelu) se může snadno připravit za použití technik známých odborníkovi v oboru (viz také WO 94/07882, WO 94/07881,

WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, US patenty čísel 5 294 637, 5 283 253, 5 279 949, 5 274 137,

202 448, 5 200 534, 5 229 529 a EP 590 267) nebo se může získat z četných komerčních zdrojů, včetně například od Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo (T7402 z Taxus brevifolia nebo T-1912 z Taxus yannanensis).

Paklitaxel je třeba chápat ne pouze jako obvyklou chemicky dostupnou formu paklitaxelu, ale i jako analoga

50•4 4444

4 4

4 4 4 4 4

4 •4 4444

4 4

4 ·* 44

4 4 4

4 4

4 4

4444 (např. taxotere, jak je uvedeno výše) a konjugáty paklitaxelu (např. paklitaxel-PEG, paklitaxel-dextran nebo paklitaxel-xylóza).

Do pojmu „taxan jsou také zahrnuty četné známé deriváty včetně jak hydrofilních derivátů, tak hydrofobních derivátů. Deriváty taxanu zahrnují galaktózové a mannózové deriváty popsané v mezinárodní patentové přihlášce č.

WO 99/18113, piperazino- a další deriváty popsané ve WO 99/14209, deriváty taxanu popsané ve WO 99/09021, WO 98/22451 a US patentu č. 5 869 680, β-thioderiváty popsané ve WO 98/28288, sulfenamidové deriváty popsané v US patentu č. 5 821 263 a derivát taxolu popsaný v US patentu č. 5 415 869, výčet tím však není omezen. Dále zahrnuje prekurzory léčiva paklitaxelu včetně prekurzorů léčiva popsaných ve WO 98/58927, WO 98/13059 a v US patentu č. 5 824 701, výčet tím však není omezen.

Do pojmu „taxan dále spadají farmaceuticky přijatelné soli taxanu.

Do kationtových liposomů mohou být zahrnuty směsi taxanů. Dále kationtové liposomy obsahující taxan mohou dále obsahovat jednu nebo více dalších farmaceuticky aktivních látek včetně činidla (např. jiného, než je taxan), které inhibuje angiogenezi a protirakovinného činidla, výčet tím však není omezen.

Taxany se mohou isolovat z přírodních zdrojů, mohou se syntetizovat chemicky nebo se mohou koupit u komerčního zdroje. Způsoby chemické syntézy jsou v oboru známy, viz např. US patent č. 5 580 899.

9999 ·· 9999 99 »9 • · 9 9 9 · · 9 9 9

999 999 99 9

99999 999 9

9 9 9 9 99· •999 ··· 99 9 9999

Angiogenní faktory

Angiogenezi stimulují četné biologické sloučeniny. U angiogeninu bylo ukázáno, že je mocným angiogenním faktorem v kuřecím CAM nebo v králičí rohovce. Angiotrofin, což je faktor isolovaný z monocytů periferní krve, je další angiogenní sloučeninou, u níž byla navržena role při normálním hojení ran (Biochemistry, 27, 6282 (1988)). Další faktory, které se účastní hojení ran, jako je fibrin, také indukují vaskularizaci.

Další třídou mediátorů angiogeneze jsou polypeptidové angiogenní faktory, jako jsou růstové faktory, které zahrnují kyselé a bázické fibroblastové růstové faktory (FGFs), transformující růstový faktor alfa (TGF-α) a růstový faktor odvozený z destiček (PDGF). U každé z těchto molekul bylo ukázáno, že indukuje angiogenezi in vivo. Dalšími podobnými molekulami, které vykazují angiogenní aktivitu jsou vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), faktor nekrózy tumoru alfa (TNF-α), transformující růstový faktor beta (TGF-β) a růstové faktory vážící heparin (HBGFs).

Kromě polypeptidových růstových faktorů jsou popsány další angiogenní faktory. Prostaglandiny Εχ a E₂, což jsou angiogenní faktory odvozené od lipidů, jsou dobře známými atraktanty zánětlivé buňky s angiogenními vlastnosti (J. Nati. Cancer Inst., 69, 475 až 482 (1982)). Nikotínamid způsobuje angiogenní odpověď při testování na kuřecí rohovce nebo při stanovení kuřecího CAM (Science,

236, 843 až 845 (1987)).

Detekovatelné značky • 4 ···· **

4 4 4 4 • 444 * 4 · · * 4 • · 4 4

44 * 444 ··

44«· 44 ♦ · • 4 · 4 4 • 4 4 · • · « « 4

4 4 « • 44 444·

Kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou být použity k dodání detekovatelných značek jakéhokoli druhu. Značky jsou buď rozpustné v lipidu použitém k výrobě liposomů nebo jsou rozpustné nebo alespoň dispergovatelné ve vodě nebo vodném roztoku, jako je vodný roztok chloridu sodného nebo vodný roztok dextrózy. Značkou může být radioaktivní značka, fluorescenční značka, histochemicky nebo imunohistochemicky detekovatelná látka nebo detekovatelné barvivo nebo jakákoli látka detekovatelná zobrazovací technikou magnetické rezonance. Značka může být přítomna v jakémkoli příhodném množství a může být zahrnuta do nebo komplexována s liposomem samotná nebo spolu s látkou, která inhibuje nebo navozuje angiogenezi.

Dávkování

Množství angiogenního inhibitoru nebo promotoru podané pacientovi (kterým může být zvíře s oběhovým systémem s endoteliálními buňkami, které podstupují angiogenezi) se bude měnit podle široké škály faktorů. Například je nezbytné poskytnout větší dávky lidem než menším zvířatům. Množství angiogenního inhibitoru nebo promotoru bude záviset na velikosti, věku, pohlaví, hmotnosti a stavu pacienta, stejně jako na potenci podávané látky. Ukazujíc, že je zde podstatná variabilita pokud jde o dávkování, má se za to, že odborník v oboru může, za použití předloženého popisu, snadno určit příhodné dávkování napřed podáním extrémně malých množství a postupným zvyšováním dávky až se dosáhne požadovaných výsledků. Ačkoliv množství dávky bude velmi záviset na faktorech popsaných výše, obecně předložený vynález umožňuje podat podstatně menší množství jakékoli látky ve

43*» ···· *« ••to· ·· »· * · to * · · · · « ·.

• ·*« ·· · to· · to · · ♦ e · · · » to • · · w · « 9 · •»a · to to · toto * · to · * · · srovnání se systémy dodávání, které míří na okolní tkáň, např. míří na buňky tumoru samotné.

Komplexy nukleotidová sekvence/kationtový lipid

Když se nukleotidové sekvence obsahující sekvence DNA a RNA spojí s lipidy, vytvoří toto dvě složky komplexy. Zvolením příslušného množství nukleotidových sekvencí a lipidů a volbou příslušných lipidů je možné vytvořit komplexy, které se spolu neagregují in vitro. Obecné informace týkající se tvorby takových komplexů jsou popsány v PCT publikaci WO 93/12240, publikované 24. června 1993, která je zde zahrnuta formou odkazu ke specifickému zveřejnění a popisu tvorby komplexů nukleotidová sekvence/lípid. Ve spojení s předloženým vynálezem jsou nukleotidové sekvence sestrojeny specificky k ovlivnění angiogenních endoteliálních buněk a k tomu, aby neovlivnily jiné buňky a specificky aby neovlivnily jiné odpovídající endoteliální buňky, tj. klidové endoteliální buňky.

Sekvence DNA použité ve spojení s předloženým vynálezem jsou operativně spojeny s promotory a tyto promotory jsou specificky sestrojeny tak, že k expresi nukleotidové sekvence dojde pouze v prostředí angiogenní endoteliální buňky. Zaprvé promotorem může být aktivovatelný promotor, který může být aktivován poté, co sekvence byla dodána do angiogenní endoteliální buňky. Výhodněji je promotor sestrojen tak, že se aktivuje ve specifickém prostředí angiogenní endoteliální buňky. V angiogenní endoteliální buňce existují četné přirozeně se vyskytující jevy, které se nevyskytují v prostředí klidové endoteliální buňky.

Využitím výhody rozdílů mezi těmito dvěma buněčnými typy je promotor specificky sestrojen tak, že se aktivuje pouze za přítomnosti angiogenní endoteliální buňky.

• · · · ·· · ·

- $5-54—

Transkripce z kazet DNA může být omezena na jediný buněčný typ nebo na úzký výběr buněčných typů za použití specifického genového promotoru. Endoteliální buňky selektivně exprimují několik proteinů, pro něž byly nalezeny geny a jejich promotory. U genových promotorů receptorů cévního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) flt-1 a flt-2, genového promotoru von Willbrandova faktoru (VWF) a rodiny genových promotorů tie bylo ukázáno, že vykazují selektivní expresi v endoteliálních buňkách při spojení s konstrukty reporterového genu. Následující publikace jsou citovány ke zveřejnění a popisu promotorů, které se aktivují v angiogenních endoteliálních buňkách.

Hatva a kol., Am. J. Path., 148, 763 až 775 (1996), Strawn a kol., Cancer Res., 56, 3540 až 3545 (1996), Millauer a kol., Cancer. Res, 56, 1615 až 1620 (1996), Sáto a kol., Nátuře, 376, 70 až 74 (1996), Ozaki a kol., Human Gene Therapy, 13, 1483 až 1490 (1996), Ronicke a kol., Circulation Res., 7 9, 277 až 285 (1996), Shima a kol., J. Biol. Chem., 271, 3877 až 3878 (1996), Morishita a kol., J. Biol. Chem., 270, 27948 až 27953 (1995), Patterson a kol., J. Biol. Chem., 270, 23111 až 23118 (1995),

Korhonen a kol., Blood, 86, 1828 až 1835 (1995). Další užitečný přístup zahrnuje expresi thymidinkinázy (TK) viru herpes simplex v endoteliálních buňkách a následné ošetření prekurzorem léčiva ganciklovirem (Ozaki (1996)).

Alternativně může nukleotidovou sekvencí být komplementární sekvence, která se bude vázat na sekvence, které musí být exprimovány v angiogenní endoteliální buňce, čímž se blokuje exprese přirozeně se vyskytujících sekvencí

559 9 9999

9 99 9 9 99 99

9 9 · · · 9 9 9 9

9999 9 9 · · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 · ·· ···· angiogenní endoteliální buňky, které jsou nezbytné pro přežití této buňky.

Tvorba sraženiny

Další aspekt tohoto vynálezu, který se může provádět za použití liposomů nebo komplexů nukleotidová sekvence/lipid zahrnuje tvorbu krevních sraženin.

Specificky se sestrojí liposom nebo komplex podle tohoto vynálezu tak, že má účinek na angiogenní endoteliální buňky, což vede k tvorbě krevních sraženin v angiogenních cévách. Krevní sraženiny brání průtoku živin a kyslíku do zbytku cévy, což vede ke smrti cévy a okolní tkáně.

Základní koncept tvorby sraženin ve vaskulatuře tumoru k eliminaci nežádoucího tumoru se provádí za použití protilátek k zacílení na cévy tumoru. Předložený vynález může dosáhnout zlepšených výsledků za použití kationtových lipidů, kteréžto lipidy obsahují činidlo, které navozuje trombogenní kaskády. Například kationtové liposomy podle tohoto vynálezu mohou být sestrojeny k zahrnutí lidského tkáňového faktoru (TF), který je hlavním iniciačním proteinem trombotických kaskád (kaskád srážení krve).

Tumorové buňky jsou závislé na dodávce krve. Lokální přerušení vaskulatury tumoru navodí příval buněčné smrti. Cévní endotel tumoru je v přímém kontaktu s krví. Buňky tumoru samotné však jsou mimo krevní proud a z větší části jsou špatně dostupné pro jakékoli materiály injikované do oběhového systému. Tento aspekt, stejně jako další aspekty tohoto vynálezu, funguje obzvláště dobře v tom, že buňky, na které se míří, jsou angiogenní endoteliální buňky, které samy nejsou transformovány, tj.

šéjsou to buňky, u kterých není pravděpodobné, že budou vykazovat mutace, které jim dodají odolnost vůči terapii. Buňky tumoru podstupují významné mutace a takové mutace jim často poskytnou resistenci vůči terapii. Jiní ukázali výsledky týkající se snížení velikosti tumorů za použití cílení řízeného protilátkami, přičemž přehled následuje: Burrows a Thorpe, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 8996 až 9000 (1993) a Huang a kol., Science, 275, 547 až 550 (1997) .

K provedení srážení krve v souvislosti s předloženým vynálezem je výhodné vytvořit komplex DNA/kationtový lipid. Komplex bude obsahovat DNA, která kóduje protein, jako je lidský tkáňový faktor, kterýžto protein je hlavním iniciačním receptorem pro trombotické kaskády (kaskády srážení krve). Gen kódující TF se výhodně operativně spojí s promotorem, kterýžto promotor se aktivuje v prostředí angiogenni endoteliální buňky a neaktivuje se v prostředí klidové endoteliální buňky. Kationtové lipidy komplexu tedy způsobí, že se komplex spojí s angiogenními endoteliálními buňkami. Poté se komplex vnese do angiogenni endoteliální buňky a DNA z komplexu se exprimuje. Exprimovaný protein bude iniciovat kaskádu srážení krve. Když se v cévě vytvoří krevní sraženiny, odstřihne se další dodávka kyslíku a živin do okolních buněk tumoru. Poté buňky tumoru odumřou.

K navození srážení lze také použít variace lidského tkáňového faktoru, jako je zkrácený lidský tkáňový faktor (tTF). Genetický materiál kódující tTf a jiné faktory je znám (viz výše citovaný odkaz na Huang a kol. a publikace tam citované).

Způsoby redukce aterosklerotických plátů

999 9 «9 *9 9

-<5-ή5799 9 9 · 9 9 9 • « · · • · · · · · 9

9 9 9 9 9

Tento vynález dále poskytuje způsoby redukce aterosklerotických plátů u savce podáváním savci prostředku obsahujícího kationtové lipidy a látku, která redukuje angiogenezi, přičemž prostředek se nechá spojovat s angiogenními endoteliálními buňkami angiogenní cévy po jistou dobu a takovým způsobem, že prostředek vstoupí do angiogenních endoteliálních buněk, kde látka působí k redukci angiogeneze a kde redukce angiogeneze vede k redukci tvorby aterosklerotického plátu. Látky, které inhibují angiogenezi jsou zde detailněji diskutovány jinde.

Pojem „ateroskleróza je v oboru dobře znám a je jím zamýšlena choroba velkých a středních arterií, která vede k progresivní akumulaci buněk hladké svaloviny a lipidů v intimě. Pokračující růst lézí (plátů) zasahuje další vrstvy arteriální stěny a zužuje lumen. Pojem „redukce aterosklerotických plátů jak je zde používán označuje, že aterosklerotický plát nebo léze se zmenší alespoň o asi 10 %, výhodněji alespoň o asi 25 %, ještě výhodněji alespoň o asi 50 %, ještě více výhodně alespoň o asi 75 % a ještě více výhodněji alespoň o asi 90 % nebo více, když se kationtový liposom obsahující inhibitor angiogeneze podá savci, který má takovou lézi, ve srovnání s takovým aterosklerotickým plátem u kontrolního savce léčeného kationtovým liposomem neobsahujícím inhibitor angiogeneze. V některých ztělesněních aterosklerotický plát úplně obliteruje. Pro použití při způsobech redukce aterosklerotického plátu u jednotlivce je „terapeuticky účinné množství nebo „účinné množství látky, která inhibuje nebo redukuje angiogenezi takové množství, které při podání jednotlivci redukuje velikost aterosklerotického plátu alespoň o asi 10 %, výhodněji alespoň o asi 25, ještě

-<?0

-5$výhodněji alespoň o asi 50 %, ještě více výhodně alespoň o asi 75 % a ještě více výhodněji alespoň o asi 90 % nebo více, ve srovnání s velikostí plátu vytvořeného u kontrolního subjektu, kterému se látka nepodává.

Zda došlo k redukci aterosklerotického plátu se může určit radiografickým zobrazením za použití jakékoli známé metody, včetně metod popsaných v US patentu č.

807 536, angiografie, kde se do cévy vsune katetr a kontrastní činidlo jako je barvivo založené na jodu se k zobrazení krevní cévy a zobrazení za použití intravaskulární ultrazvukové sondy. Ve experimentech na zvířeti lze části cévy vizuálně vyšetřit na snížení velikosti plátu. Viz např. Moulton a kol., Circulation, 99, 1726 až 1732 (1999).

V některých ztělesněních vede způsob podle tohoto vynálezu k redukci jedné nebo více komplikací aterosklerózy. Tento vynález tudíž poskytuje způsob redukce chorobného stavu souvisejícího s aterosklerózou včetně ischemické choroby srdeční, infarktu myokardu, restenózy, mrtvic a periferní cévní choroby, výčet tím však není omezen. Zda došlo k redukci jednoho nebo více z těchto chorobných stavů se určí obvyklými způsoby stanoveni včetně elektrokardiografických stanovení a dalších způsobů, které jsou v oboru standardní, výčet tím však není omezen.

Způsoby podle předloženého vynálezu k redukci aterosklerotického plátu jsou užitečné při prevenci, inhibici nebo redukci pravděpodobnosti rekurence (znovuvytvoření) plátu, který byl odstraněn způsobem podle tohoto vynálezu nebo jiným způsobem, jako je balónková angioplastika nebo koronární bypass. V některých

·· »· • > * · $9ztělesněních tento způsob tudíž zahrnuje kroky odstranění aterosklerotického plátu z oběhové cévy pacienta a podávání pacientovi terapeuticky účinného množství prostředku obsahujícího kationtový liposom a aktivní složku, která inhibuje angiogenezi. Prostředek obsahující kationtový liposom a aktivní složku, která inhibuje angiogenezi se může podat; před, během nebo po vynětí plátu z pacienta.

Jakýkoli z kationtových liposomů nebo prostředek obsahující kationtový liposom popsaný zde výše v kombinaci s jakýmkoli inhibitorem (jakýmikoli inhibitory) angiogeneze, včetně inhibitorů angiogeneze zde popsaných, může být použit při způsobech redukce aterosklerotického plátu. Inhibitor angiogeneze-kationtový lipid může být formulován s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou. Farmaceuticky přijatelné pomocné látky jsou v oboru známy a byly mnohokrát popsány, například v Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., Easton, CA (1995) nebo poslední vydání.

Experimentální modely angiogeneze

Předložený vynález byl usnadněn použitím modelů angiogeneze na hlodavcích. Chronické zánětlivé choroby, jako je astma a bronchitida, indukují remodelaci tkáně a cév ve sliznici dýchacích cest. K získání poznatků o patogenezi chronického zánětu dýchacích cest se použije model, kde v tracheách krys a myší probíhá chronický zánět remodelování tkáně. Angiogeneze se vyvíjí ve sliznici dýchacích cest jako důsledek infekce Mycoplasma pulmonis.

V tomto modelu způsobuje organismus Mycoplasma pulmonis přetrvávající infekci epitelu trachey a bronchů. Sliznice » ·*«· · · · · · · ·· B *· ·» ·. · · · • · · · · · · · *

6Θdýchacích cest krys infikovaných M. Pulmonis má několik výrazných abnormalit:

1) ztluštění epitelu a lamina propria,

2) změny ve složení buněk epitelu,

3) angiogeneze,

4) zvýšená citlivost angiogenních cév vůči mediátoru zánětu látce P pokud jde o průsak,

5) látka P indukuje průsak z kapilár stejně jako z venul a

6) zvýšený počet receptorů pro látku P (receptorů NK1) v kapilárních endoteliálních buňkách.

V tomto modelu je angiogeneze poháněna chronickým zánětem, přičemž cévy jsou citlivější vůči mediátorům zánětu.

Studie využívající perfuze lektinů k obarvení povrchu luminálních endoteliálních buněk odhalí rozsah angiogeneze u krys po infekci M. pulmonis. V tracheální sliznici infikovaných krys jsou přítomny četné kapilárovité cévy, přičemž tyto cévy po intravenózní injekci mediátoru zánětu látce P prosakují.

U myší M. pulmonis způsobuje akutní plicní zánět, který vrcholí 6 až 9 dní po inokulaci a je následován persistentní infekcí dýchacích cest. Odpověď myší na infekci M. pulmonis je velmi závislá na kmeni, například myši kmene C3H vykazují vyšší mortalitu a větší snížení cytokinů faktoru nekrózy tumoru-cc než myši kmenů C57BL. U myší infikovaných m. Pulmonis je popsáno několik aspektů remodelování sliznice, jako je epiteliální hyperplasie. U myší kmene C57BL/6 infikovaných nasální inokulaci M. pulmonis se počet tracheálních cév dramaticky zvýší, zjevně růstem nových kapilár. U tohoto kmene není již tracheální slizniční vaskulatura dále planární, přičemž malé cévy rostou kolmo na rovinu sliznice. V oblastech se zvýšenou • 9 «9 • 9 9 9

9 9

-<7♦ 9 999 9

9999 vaskularitou se nacházejí četné zjevné vaskulární výběžky. Infekce myší kmene C57BL/6 M. pulmonis tedy vede ke vzniku chronického zánětu dýchacích cest s endoteliální proliferací, vaskulární remodelací a angiogenezi. Naproti tomu u myší kmene C3H/HeN infikovaných nasální inokulací M. pulmonis se počet vaskulárních endoteliálních buněk ve sliznici trachey zvyšuje ale počet cév nikoli. Zvýšená vaskularizace nenastává v důsledku zvýšení délky nebo počtu cév, ale v důsledku zvýšení průměru cév, přičemž toto zvýšení velikosti cév v infikovaných tracheách se nezvyšuje významně. Hladiny cirkulujících protilátek proti M. pulmonis jsou u obou myších kmenů podobné. Infekce myší kmene C3H/HeN M. pulmonis vytváří chronickou infekci dýchacích cest s remodelováním cév a endoteliální proliferací ale ne s významným zvýšením počtu cév, zatímco u myší kmene C57BL/6 vede k endoteliální proliferací a vzniku nových cév.

V druhém modelu dochází k angiogenezi u tumorů, které jsou výsledkem transgenní exprese virového onkogenu SV40. Model transgenní myši „RIP-Tag poskytuje příležitost studovat fenotypové změny angiogenních endoteliálních buněk v dobře charakterizované progresi z normální tkáně na tumor. V modelu transgenní myši „RIP-Tag je onkogen z viru SV-40, velký T antigen (Tag - smyčka), řízen oblastí promotoru krysího inzulínu (RIP). Když se vloží do myšího genomu indukuje tento konstrukt expresi smyčky (Tag) specificky v pankreatických ostrůvcích β-buněk, které jsou umístěny v přibližně 400 ostrůvků roztroušených ve slinivce břišní. Všechny tyto ostrůvky slinivky břišní v těchto myších exprimují smyčku, avšak tyto ostrůvky se vyvíjejí normálně až do věku 6 týdnů. V tomto bodě se přibližně 50 % ostrůvků stane hyperplastických. Pouze však malá část (méně • •«4

4 44*4 44 »♦4 4 4 4 4444 •444 44 4 44 4 ♦ 444 44 44 4 4

4 4 4 4 4 44 •444444 4· * 44 4444 než 5 %) těchto hyperplastických ostrůvků se během 10 týdnů vyvine do tumoru. Toto úzké hrdlo tumorigeneze se zdá být překonáno když ostrůvek získá schopnost indukovat angiogenezi: proto se tato fáze tumorigeneze nazývá „angiogenní zapnutí. Podobné angiogenní zapnutí také zdá se existuje v jiných modelech myší tumorigeneze stejně jako u několika lidských tumorů. Model „RIP-Tag tedy poskytuje dobře charakterizovaný rámec pro vyšetřování progrese angiogeneze u tumorů.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou uvedeny k tomu, aby se odborníkovi v oboru poskytlo úplné zveřejnění a popis jak vyrobit kationtové liposomy a provést způsob použití takových liposomů a nejsou zamýšleny k omezení rozsahu toho, co se považuje za vynález. Původci vynaložili úsilí k zajištění přesnosti pokud jde o použitá čísla (např. množství, teplotu atd.), ale je třeba počítat s jistými experimentálními chybami a odchylkami. Pokud není uvedeno jinak, díly jsou díly hmotnostní, molekulová hmotnost je průměrná molekulová hmotnost, teplota je ve stupních celsia a tlak je atmosférický nebo téměř atmosférický. Je třeba poznamenat, že každý z příkladů uvedených dále představuje četné experimenty, které byly s postupy provedeny a výsledky byly sumarizovány. Odborník v oboru zjistí, že ne každý experiment poskytuje pozitivní výsledky. Má se však za to, že následující příklady vyjadřují získané výsledky.

Příklad 1

Distribuce kationtových liposomů u normálních myší ··♦ ·

Liposomy a/nebo plasmidová DNA se označí a stanoví se celulární distribuce značených komplexů v různých časech po intravenózní injekci. Tyto experimenty se provedou na myších prostých patogenu (tělesná hmotnost 20 až 25 g) obou pohlaví.

Kationtové malé jednolamelární vesikulové liposomy se připraví z ationtového lipidu DDAB nebo DOTAP a neutrálního lipidu DOPE nebo cholesterolu, označí se texaskou červení nebo červeně fluoreskujícím karbo-kyaninovým barvivém Dii nebo CM-Dil a v některých případech se komplexuje s plasmidovou DNA obsahující reporterový gen, jako je luciferáza nebo β-galaktosidáza. Endoteliální buňky se označí za použití fluorescenčního rostlinného lektinu fluoresceinu z rostliny Lycopersicon esculentum.

Monocyty/makrofágy se označí za použití fluorescenčních kuliček (Duke, 500 nm). Buněčná jádra se označí pomocí DAPI, YO-PRO nebo barviva Hoechst 33342.

Fluorescenční liposomy nebo komplexy liposom-DNA obsahující 10 až 60 μg DNA v až 300 μΐ se injikují neanestetizovaným myším ocasní vénou. V některých experimentech se po těchto komplexech injikují 500nm fluorescenční kuličky. 5 minut až 24 hodin poté se zvířata anestetizují pentobarbitalem sodným a poté se perfundují skrz levou komoru fixativem (1% paraformaldehyd ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku), následuje fluorescenční lektin k označení endoteliálního povrchu vaskulatury. Po perfuzi se tkáně vyjmou a připraví se buď jako celá množství nebo se nařežou na řezy za použití přístroje Vibratom nebo tkáňového nože. Kromě toho se některé vzorky zpracují pro elektronovou mikroskopii. Tkáně se poté vyšetří epifluorescenční mikroskopií nebo konfokální

Λ6

-&r • · ·♦>·

• « · »· 9 99 9 mikroskopií. Kromě toho se některé vzorky vyšetří transmisní elektronovou mikroskopií.

Výsledky: U myší vyšetřených 5 minut až 24 hodin po injekci byly liposomy značené CM-Dil nebo Dii nebo komplexy liposom-DNA nejvíce přítomné v plicích. Dále byly nejpočetnější v endoteliálních buňkách alveolárních kapilár. Fluorescence v alveolárních kapilárách byla stejnoměrně distribuována ve všech lalocích obou plic.

Kromě toho část fluorescence CM-Dil nebo Dii byla v intravaskulárních monocytech/makrofázích.

Vedle plic největší množství značených liposomu a komplexů mají játra a slezina. V těchto orgánech se fluorescence CM-Dil nebo Dii kolokalizuje s fluorescenčními kuličkami. V játrech je fluorescence CM-Dil nebo Dii a kuličky v Kupferových buňkách. Ve slezině jsou v makrofázích.

Rovněž ovária mají cévy silně označené liposomy nebo komplexy značenými CM-Dil nebo Dii. Specificky se pozoruje, že endoteliální buňky v angiogenních cévách velkých folikulů a žlutých tělísek myšího ovária živě přijímají DDAB:cholesterolové liposomy nebo komplexy liposom-DNA značené CM-Dil nebo Dii po intravenózní injekci. Tato pozorování se dokumentují fotograficky (obr. 1). Další ovariální cévy obsahují relativně málo značených komplexů. Tyto výsledky se použijí k dedukci, že angiogenní endoteliální buňky přednostně přijímají liposomy a komplexy liposom-DNA, tj. že kationtové liposomy použité v experimentech se mnohem pravděpodobněji spojí s endoteliální buňkou podstupující angiogenezi ve srovnání

45= · ·♦♦· • 4 · 44 ·* 4444 s odpovídajícími endoteliálními buňkami, které nepodstupují angiogenezí.

Značené liposomy nebo komplexy jsou také četné v endoteliálních buňkách venul vysokého endotelu (HEV) lymfatických uzlin a Peyerových plaků tenkého střeva, zatímco jsou řídké v endoteliálních buňkách kapilár těchto lymfoidních orgánů. Značené liposomy nebo komplexy jsou také četné v kapilárních endoteliálních buňkách přední hypofýzy, myokardu, bránice, kůry nadledvin a tukové tkáně.

Značené liposomy nebo komplexy jsou četné v monocytech/makrofázích připojených k venulám močového měchýře, uteru a vejcovodu. Některé venuly obsahují velká množství značených monocytů/makrofágů. Kromě je značena toho malá část endoteliálních buněk arteriol, kapilár a venul těchto orgánů.

Relativně málo značených liposomů a komplexů je spojeno s kapilárními endoteliálními buňkami zadní hypofýzy, dřeně ledvin, střevních klků (ileum), slinivky břišní a dřeně nadledvin. Téměř žádné značené liposomy nebo komplexy se nenaleznou v endoteliálních buňkách mozku, štítné žlázy, kůry ledvin, ostrůvků slinivky břišní, trachey nebo bronchů s výjimkou příležitostného monocytu/makrofágu.

Závěry: Prostředek DDAB:cholesterolových liposomů nebo komplexů liposom-DNA značených CM-Dil nebo Dii použitý v těchto studiích cílil do tří hlavních typů buněk: endoteliálních buněk, makrofágů a monocytů. Příjem Liposomů nebo komplexů je orgánově a cévně specifický. Většina je přijata kapilárními endoteliálními buňkami plic a makrofágy

jater a sleziny. Kapilární endoteliální buňky vaječníků, přední hypofýzy, srdce, bránice, kůry nadledvin a tukové tkáně jsou rovněž cílem. Cévy, které přijímají liposomy nebo komplexy ve vaječníků jsou místem angiogeneze. Kromě toho jsou cílem HEV nebo lymfatické uzliny a střevní Peyerovy plaky. Zacílení na endoteliální buňky nebo makrofágy jiných orgánů je méně časté a variabilnější. Cílem nejsou cévy v mozku, štítné žláze, kůře ledvin, trachei a bronších.

Kromě toho tyto experimenty dokumentují, že liposomy nebo komplexy neunikají z vaskulatury do většiny orgánů. Ačkoliv jsou nalézány v extravaskulárních buňkách sleziny, která má cévy s diskontinuálním endoteliem, v jiných orgánech se mimo cévy nedostávají.

Konečně živý příjem kationtových liposomů a komplexů liposom-DNA cévami velkých ovariálních folikulů a žlutými tělísky naznačuje, že endoteliální buňky angiogenních cév jsou místem přednostního přijmu.

Příklad 2

Příjem DDAB:cholesterolových liposomů nebo komplexů liposom-DNA u myší RIP-Tag5

Výsledky experimentů z příkladu 1 ukazují, že cévy v ovariálních folikulech a žlutých tělíscích živě přijímají kationtové liposomy a komplexy liposom-DNA. Provede se tudíž experiment k určení, zda endoteliální buňky angiogenních cév tumorů živě přijímají kationtové liposomy a komplexy liposom-DNA.

• · ♦♦ *· Φ··β

9 9 · 9

9999 použije se modle tumorů transgenních RIP-Tag5, viz Hanahan, Nátuře, 315, 115 až 122 (1985) a Hanahan a Folkman, Cell, 86, 353 až 364 (1996) . V tomto modelu, označeném RIP-Tag, je onkogen z viru SV-40, velký T antigen (Tag - smyčka), řízen oblastí promotoru krysího inzulínu (RIP). Když se vloží do myšího genomu indukuje tento konstrukt expresi smyčky (Tag) specificky v pankreatických ostrůvcích β-buněk.

Jedním z důležitých atributů tohoto modelu je to, že v každé myši RIP-Tag5 jsou souběžně přítomna různá stadia vývoje tumoru a tudíž různá stadia angiogeneze. Ačkoliv všech 300 až 400 ostrůvků exprimuje antigen T, ostrůvky se na počátku vyvíjejí normálně. Avšak v 6 týdnech věku je okolo poloviny hyperplastických a z nich se malá část vyvine do tumoru během 10 týdnů. Tumorigeneze zdá se koinciduje s nástupem angiogeneze. Tato konverze se označuje jako „angiogenní zapnutí. Folkman a kol., Nátuře, 339, 58 až 61 (1989) a Hanahan a Folkman, Cell, 86, 353 až 364 (1996). Podobné angiogenní zapnutí zdá se existuje v jiných myších modelech tumorigeneze stejně jako v několika lidských tumorech. Hanahan a Folkman, Cell, 86, 353 až 364 (1996).

Použijí se způsoby a materiály jako v příkladu 1. Specificky se DDAB:cholesterolové liposomy značené CM-Dil nebo Dii intravenózně injikují jedné myši RIP-Tag5 mající tumor a jiné myši RIP-Tag5 se injikují komplexy

DDAB:cholesterol-DNA značené CM-Dil nebo Dii. Distribuce liposomů nebo komplexů v angiogenních cévách tumorů ostrůvků slinivky břišní se vyšetří 24 hodin po injekci a srovná se s distribucí v cévách ostrůvků slinivky břišní normálních myší.

-68♦ · tototo· ·· ·· ·· · · » to to • toto · * to • •to * · · to • •to ··· «· · ·· tototo·

Výsledky: Provedou se dvě nová pozorování:

1) liposomy nebo komplexy se přijmou endoteliálními buňkami angiogenních cév bez průsaku přes endotelium a

2) endosomální příjem liposomů nebo komplexů je vyšší v endoteliálních buňkách angiogenních cév než v endoteliálních buňkách normálních cév ostrůvků slinivky břišní

Obr. 2 zachycuje vzorek tkáně.

Závěry: Tento experiment poskytne výsledky konsistentní s přednostním příjmem DDAB:cholesterolových liposomů nebo komplexů liposom-DNA angiogenními cévami tumoru. Před opakováním experimentu se (1) se zvýší intenzita fluorescence komplexů liposom-DNA, (2) způsoby lokalizace míst příjmu kationtových liposomů a komplexů liposom-DNA v tumorech myší RIP-Tag5 se zlepší a (3) získá se lepší znalost struktury a funkce angiogenních cév v tumorech z buněk ostrůvků slinivky břišní u myší RIP-Tag5.

Příklad 3

Příjem komplexů DOTAP:cholesterolové liposomy-DNA u myší RIP-Tag2

Cíl: Intenzita fluorescence komplexů liposom-DNA se zvýší za použití texaské červeni-DHPE namísto Dii, zlepší se způsob přípravy slinivky břišní myší RIP-Tag2 k lokalizaci míst příjmu fluorescenčních komplexů kationtový liposom-DNA a studuje se struktura a funkceangiogenních cév v tumorech

4 44*4

-6944 4444 4* 44 • 4 4 4 4 4 4

4 4 * 4 4

4 4 4 4 4

4 44 4444 z buněk ostrůvků slinivky břišní u myší RIP-Tag2. S těmito zlepšeními se provedou experimenty typu popsaného v příkladu 2 k určení, jak jsou přijímány kationtové liposomy a komplexy lipid-DNA.

Metodika: Připraví se kationtové malé jednolamelární vesikulární DOTAP:cholesterolové liposomy značené texaskou červení-DHPE. Připraví se komplexy liposom-DNA v celkovém poměru lipid : DNA 24 : 1 (nmol/gg) v 5% glukóze za použití 60 μς plasmidové DNA v 300 μΐ. Komplexy (300 μΐ) se injikují do ocasních vén neanestetizovaných transgenních myší RIPl-Tag2 kmene C57BL/6 a neanestetizovaných myší kmene C57BL/6.

hodiny po injekci komplexů se myši anestetizují íntraperitoneální injekcí Nembutalu 50 mg/kg. Vaskulatura se fixuje perfuzí 1% paraformaldehydem přes horní aortu, přičemž luminální povrch vaskulatury se obarví perfuzí zeleného fluorescenčního lektinu, Thruston a kol., Am. J.

Physiol., 271, H2547 až 2562 (1996). Celé kusy tkáně nebo řezy z přístroje Vibratome se umístí do přístroje Vectashield a cévy se vyšetří za použití fluorescenčního mikroskopu Zeiss Axiophot nebo konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 410 vybaveného krypton-argonovým laserem a optimalizovanými fotonásobičovými trubicemi. Obrázky se zachytí na filmKodak Ektachrome (ASA 400) nebo jako digitální soubory konfokálních obrázků.

Výsledky: Tento experiment jasně ukazuje živý příjem komplexů DOTAP:cholesterolové liposomy-DNA angiogenními endoteliálními buňkami pankreatických tumorů myší RIP1Tag2. Příjem cévami tumoru mnohem převyšuje příjem těchto

90

0 9,9

9 9

9 9

9099 ♦ · ·»·· • · M-H • · · · «

990 · ·

0 0 0 0 0

0 0 9 0

0000 000 00 0 komplexů odpovídajícími endoteliálními buňkami normálních ostrůvků slinivky břišní (srovnej obr. 3 a 4).

Tumory se snadno odliší od sousedních tkání, díky silnému značení svých cév červeně fluoreskujícími liposomovými komplexy. Geometrie vaskulatury tumorů je variabilní, sahající od vzoru typického pro normální ostrůvky po hustou, křivolakou, anastomozující síť sinusoidních cév jasně větších a hustěji zabalených než u normálních ostrůvků. V posledně uvedeném případě vaskulatura připomíná vaskulaturu žlutých tělísek.

Intenzita značení cév tumoru je zhruba úměrná velikosti tumoru. Největší tumory zachytí nejvíce značení.

Některé cévy malé až střední velikosti mají pahýlkovité, fokální protruze podobné aneurysmatu. Tato místa jsou obzvláště jasná v důsledku přítomnosti neobvykle četných skvrn značených texaskou červení, které se považují za endosomy. Značení těchto míst texaskou červení je větší než značení sousedních cév. Zdá se, že tyto struktury mohou být výhonky kapilár. Tyto struktury se nenaleznou ve velkých tumorech, které mají hustou, komplexní vaskulaturu, kde jsou cévy jednolitě silně značeny.

V tumorech není žádný důkaz o extravasaci komplexů značených texaskou červení. Ve shlucích extravaskulárních erytrocytů se také nepozorují žádné komplexy značené texaskou červení. Silné značení vaskulatury tumoru připomíná silní značení ovariálních žlutých tělísek během časných stadií jejich vývoje.

Příklad 4 ·* »*>· 99 ···· 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 999 99 · • * 9 · 9 · · · · · • · · · · 9 9 9

9999 999 99 9 99 9999 tt

Příjem kationtových liposomu a komplexů liposom-DNA angiogenními cévami v tumorech a chronickém zánětu

Cíl: Provádějí se experimenty typu popsaného v příkladu 3 k rozšíření pozorování na jiné modely angiogeneze. Tyto experimenty se také týkají otázky, zda k cílení kationtových liposomů na angiogenní cévy musí být přítomna DNA. Vyšetří se 4 zvířecí modely s ohledem na to, zda existuje přednostní příjem DOTAP:cholesterolových liposomů nebo komplexů liposom-DNA angiogenními cévami.

Modely: Model tumoru RIPl-Tag2. Vytvoří se transgenní myši kmene C57BL/6 a fenotypují se při narození analýzou PCR. Myší model je popsán výše.

Model tumoru HPV. Vytvoří se transgenní myši s HPV (virus lidského papilomu) a při narození se fenotypují analýzou PCR. Netransgení sourozenci z vrhu se použijí jako kontroly. V tomto modelu je onkogen z viru lidského papilomu řízen oblastí keratinového promotoru 14. Když se vloží do myšího genomu, indukuje tento konstrukt expresi HPV specificky v epidermálních buňkách. U všech transgenních myší se vyvine dysplasie provázená angiogenezí v kůži horní části hrudníku a uší, přičemž u malé části se vyvinou tumory.

Model infekce Mycoplasma pulmonis u myší. Tato infekce vede k chronickému zánětu dýchacích cest doprovázenému angiogenezí ve sliznici dýchacích cest. Po anestezii (87 mg/kg ketaminu a 13 mg/kg xylazinu injikováno intraperitoneálně) se intranasálně inokulují patogenu prosté, 8 týdnů staré, samci i samice, myši kmene C3H/HeN nebo kmene C57BL/6 (oba od Charles River) jednotkami

♦ ♦ <·#»· ·· *·*9 99 99 • 99 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 · ·· ··*·

Mycoplasma pulmonis tvořícími kolonii 3xl0⁴ (kmen 5782C-UAB CT7) v objemu 50 μΐ. Myši prosté patogenu slouží jako kontroly a inokulují se sterilním bujónem. Infikované a kontrolní myši se umístí do klecí odděleně za bariérových podmínek. Na konci experimentu se změří sérové hladiny protilátek proti M. pulmonis. Myši se studují 1 až 8 týdnů po infekci.

Model infekce Mycoplasma pulmonis u krys. Stejně jako u myší, způsobuje tato infekce chronickou chorobu dýchacích cest, jejímž jedním rysem je angiogeneze ve sliznici dýchacích cest. Po anestezii (40 mg/kg ketaminu a 8 mg/kg xylazinu injikováno intraperitoneálně) se denně 3 po sobě následující dny intranasálnš inokulují patogenu prostí, 8 týdnů staří, samci krys kmene Wistar (oba od Charles River) Mycoplasma pulmonis kmene 5782C4 v objemu 200 μΐ. Krysy prosté patogenu inokulované sterilním bujónem slouží jako kontroly. Infikované a kontrolní krysy se umístí do klecí odděleně za bariérových podmínek. Na konci experimentu se změří sérové hladiny protilátek proti M. pulmonis (Microbiological Associates, Bethesda, MD).

Metodika: Kationtové DOTAP:cholesterolové liposomy značené texaskou červení-DHPE se připraví podle popisu v přikladu 3. Liposomy se injikují do ocasní vény myší v dávce 360 nmol celkového lipidu v objemu 100 μΐ v 5% glukóze. Krysám se injekce podává femorální vénou. Komplexy liposom-DNA se připraví v poměru celkový lipid : DNA 24 : 1 v 5% glukóze za použití 60 μς plasmidové DNA ve 200 až 300 μΐ. Liposomy nebo komplexy (200 až 300 μΐ) se injikují do ocasní vény neanestetizovaných myší RIP-Tag2, HPV nebo infikovaných M. pulmonis. Netransgenní nebo patogenu prostá zvířata se použijí jako kontroly, jak je příhodno.

730 0 0 0 0 0 ·· » ·0 0000

Za 20 minut nebo 4 hodiny po injekci se myši nebo krysy anestetizují intraperitoneální injekcí Nembutalu 50 mg/kg. Vaskulatura se fixuje perfuzí 1% paraformaldehydem přes horní aortu, přičemž luminální povrch vaskulatury se obarví perfuzí zeleného fluorescenčního lektinu, Thruston a kol., Am. J. Physiol., 271, H2547 až 2562 (1996). Celé kusy tkáně nebo řezy z přístroje Vibratome se umístí do přístroje Vectashield a cévy še vyšetří za použití fluorescenčního mikroskopu Zeiss Axiophot nebo konfokálního mikroskopu.

Množství přijatých fluorescenčních liposomů nebo komplexů se kvantifikuje konfokální mikroskopií. Stručně řečeno, série 12 konfokálních obrázků rozdělených po 2,5 μτη. ve fokální (z) ose se zachytí v rostrální oblasti trachey ve fluoresceinových kanálech a kanálech texaské červeni za použití čočky (Zeiss) 20xNA 0,6 a standardizovaných poloh velikosti konfokální štěrbiny, přírůstku fotonásobiče a příkonu laseru. Projekce se generují ze sérií obrázků ukazujících odděleně cévy (fluorescein-L. esculentum) a liposomy (texaská červeň). Za použití konfokálního softwaru se na obrázcích cév definují oblasti s plochou přibližně 200 μιη², poté se změří průměrná fluorescence odpovídajících oblastí obrázku liposomů. Intenzita pozadí se stanoví měřením fluorescence ve zvolených,oblastech sousedících s cévami. Měření se provedou na 25 cévách na tracheu a na 4 trecheách na skupinu (n = 4). Významnost rozdílů se vyhodnotí Studentovým t testem.

Tkáně připravené pro transmisní elektronovou mikroskopii se zpracují podle předchozího popisu, McDonald, Am. J. Physiol., 266, L61 až L83 (1994). Stručně řečeno, «·*« • · é · • ··· ·» ·

4 · 9 » · • 4 4*4 ·»·* »4· »4 «

-u • 4 •

9 4 • 4 • 4 · • · • 4

4» « »»44 perfuze primárním fixativem (3% glutaraldehyd v 75 mM kakodylátového pufru, pH 7,1, plus 1% sacharóza, 4% PVP, 0,05% chlorid vápenatý a 0,075% peroxid vodíku) po dobu 5 minut při teplotě místnosti je následována perfuzí sekundárního fixativa (3% glutaraldehyd v 75mM kakodylátového pufru, pH 7,1, obsahujícím 0,05% chlorid vápenatý , 1% sacharózu a 4% PVP) po dobu 5 minut. Tkáně se nechají 1 hodinu fixovat in šitu při teplotě místnosti, poté e vyjmou a nechají se přes noc v sekundárním fíxativu při teplotě 4 °C. Tkáně se oříznou žiletkou nebo se nařežou tkáňovým nožem, postfixují se v osmiu (2% oxid osmičelý ve lOOmM kakodylátovém pufru, pH 7,4 o dobu 18 hodin při teplotě 4 °C), promyjí se vodou (18 hodin při teplotě 4 °C) a en bloc se obarví uranyl-acetátem (vodný, 37 °C po dobu 48 hodin) Tkáň se poté dehydratuje acetonem, infiltruje a uloží do epoxidové pryskyřice. Ultratenké řezy se udělají na ultramikrotomu, umístí se do jednootvorových mřížek na vzorek a vyšetří se pomocí elektronového mikroskopu Zeiss EM-10.

Výsledky: Tyto výsledky odhalí, že DOTAP:cholesterolové liposomy značené texaskou červení, za nepřítomnosti DNA, selektivně cílí do angiogenních endoteliálních buněk tumoru u myší RIPl-Tag2, podobně předchozím zjištěním s komplexy DOTAP:cholesterolový liposom-DNA značenými texaskou červení a komplexy DDAB:cholesterolový liposom-DNA značenými Dii. tyto a následné experimenty na transgenních myších RIP1Tag2 potvrdí, že příjem kationtových liposomů angiogenními cévami hyperplastických ostrůvků a tumory daleko přesahuje příjem kationtových liposomů odpovídajícími normálními cévami (obr. 5, 6, 7 a 8). V některých cévách hyperplastických ostrůvků a malých tumorů jsou liposomy endoteliálními buňkami přijímány pouze ve fokálních • ·

-Η75 oblastech (obr. 8), zatímco u velkých tumorů je příjem více generalizován (obr. 6). Fokální oblasti příjmu se považují za možná místa růstu nových cév (obr. 8).

Protože tato vlastnost kationtových liposomů nebo komplexů liposom-DNA má potenciální praktické využití selektivního dodávání látek angiogenním endoteliálním buňkám, zdá se žádoucí určit, zda tato vlastnost angiogenních endoteliálních buněk v tumorech je sdílena endoteliálními buňkami na jiných místech patologické angiogeneze. Tato otázka se řeší v experimentech, kde se vyšetřuje příjem DOTAP:cholesterolových liposomů značených texaskou červení angiogenními endoteliálními buňkami v trechei myší s infekcí Mycoplasma pulmoni, která způsobuje chronický zánět dýchacích cest, jedním z jehož rysů je angiogeneze (srovnej obr. 9 a 10). Angiogenní endoteliální buňky v oblastech chronického zánětu byly shledány na místech neobvykle vysokého příjmu kationtových liposomů (obr. 10). Specificky cévy v tracheách myší infikovaných M. pulmonis mají neobvykle velký příjem. Konfokální mikroskopická měření angiogenních cév ukazují, že infikované myši mají 20- až 30-násobně vyšší příjem než kontroly (obr. 11). Některé angiogenní cévy mají 100-násobný příjem. Konfokální a elektronové mikroskopové studie angiogenních endoteliálních buněk u myší infikovaných M. pulmonis naznačují, že se kationtové liposomy nejprve spojí s endozomy (obr. 12) a poté se do nich internalizuji (obr. 13) .

Podobně jsou kationtové liposomy živě přijímány angiogenními cévami v ovariálních folikulech a žlutých tělíscích u myší, dysplastické kůži transgenních myší HPV a • ·

tt tracheách krys a angiogenezi v důsledku infekce M.

pulmonis.

Závěry: Tyto experimenty potvrzují, že kationtové liposomy a komplexy liposom-DNA přednostně cílí do angiogenních endoteliálních buněk tumorů a míst chronického zánětu.

Příklad 5

Příjem kationtových liposomů obsahujících paklitaxel angiogenními cévami při chronickém zánětu

Myši C3H/HeN se infikují Mycoplasma pulmonis podle popisu v příkladu 4. Myši prosté patogenu slouží jako kontrola. Infikované a kontrolní myši se umístí do klecí odděleně za bariérových podmínek. 7 dní po infekci se myším intravenózně injikuje objem 150 μΐ (150μ1 injekce do ocasní vény lOmM roztoku celkového lipidu (včetně paklitaxelu), celková dávka 26 μρ paklitaxelu na myš) prostředku malých jednolamelárních liposomů složených z DOTAP : vaječný fosfatidylcholin : rhodamin DHPE : paklitaxel (poměr 50 :

: 1 : 2). 20 minut po injekci liposomů se myším intravenózně injikuje fluoresceinem značený lektin z Lycopersicon asculentum k obarvení endoteliálních buněk v těle. Ihned na to se myší vaskulatura perfunduje fixativem podle popisu v příkladu 4. Tímto způsobem se mohou identifikovat kationtové liposomy pomocí jejich červené fluorescence a cévy se mohou identifikovat podle zelené fluorescence. Množství příjmu liposomů obsahujících fluorescenční paklitaxel se kvantifikuje konfokální mikroskopií tkáňového řezu podle popisu v příkladu 4.

• ·

Výsledky: Vyšetření tkání u myší prostých patogenu ukazuje, že kationtové liposomy obsahující paklitaxel jsou endoteliálními buňkami cév dýchacích cest tracheí infikovaných myší přijímány živě. Pozoruje se malý příjem v cévách trachey neinfikovaných myší, jak je ukázáno na obr. 14. Tato pozorování potvrzují, že kationtové liposomy obsahující paklitaxel mají stejné vlastnosti cílení jako kationtové liposomy bez paklitaxelu.

Zatímco předložený vynález je popsán s odkazem na jeho specifická ztělesnění, odborník v oboru pochopí, že mohou být provedeny různé změny a ekvivalenty mohou být nahrazeny, aniž by se opustil skutečný duch a rozsah vynálezu. Kromě toho se mohou provést mnohé modifikace k adaptaci zvláštní situace, materiálu, látky, způsobu, kroku způsobu nebo kroků způsobu, ducha rozsahu předloženého vynálezu. U všech takových modifikací se zamýšlí, že spadají do rozsahu zde připojených patentových nároků.

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kationtový liposom, který obsahuje kationtový lipid a taxan v lipidové dvojvrstvě liposomu, kde liposom neobsahuje v podstatě žádné krystaly taxanu a kde se taxan v podstatě nevyděluje z lipidové dvojvrstvy.
2. 2. Kationtový liposom podle nároku 1, který má průměr od asi 100 do asi 400 nm.
3. 3. Kationtový liposom podle nároku 1, který dále obsahuje detekovatelnou značku.
4. 4. Kationtový liposom podle nároku 1, který dále obsahuje taxan rozpustný ve vodě ve vodném kompartmentu liposomu.
5. 5. Kationtový liposom podle nároku 1, kde taxanem je farmaceuticky přijatelný derivát.
6. 6. Kationtový liposom podle nároku 1, kde taxanem je paklitaxel.
7. 7. Kationtový liposom podle nároku 1, kde taxanem je docetaxel.
8. 8. Kationtový liposom podle nároku 1, ve kterém liposom obsahuje méně než asi 20 % molárních taxanu nebo jeho derivátu a více než asi 20 % molárních kationového lipidu.
9. 9. Kationtový liposom podle nároku 1, ve kterém liposom obsahuje od asi 2 do asi
10. 10 % molárních taxanu a od asi 40 do asi 98 % molárních kationového lipidu.

    99 99 99

    9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 999 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9

    99 99 999 9999 99 9999 <řZ

    - -%9~10. Kationtový liposom podle nároku 1, který dále obsahuje neutrální lipid.
11. 11. Kationtový liposom podle nároku 10, ve kterém liposom obsahuje od asi 2 do asi 10 % molárních taxanu, od asi 40 do asi 98 % molárních kationového lipidu a od asi 2 do asi 50 % molárních neutrálního lipidu.
12. 12. Kationtový liposom podle nároku 10, ve kterém neutrální lipid je vybrán ze souboru zahrnujícího fosfatidylcholin (PC), fosfatidylethanolamin (PE) a jejich směs.
13. 13. Kationtový liposom podle nároku 11, ve kterém liposom obsahuje DOTAP, DOPC a paklitaxel v poměru molárním 50 : 47 :

    3.
14. 14. Kationtový liposom, který obsahuje kationtový lipid a taxan ve vodném kompartmentu liposomů, kde liposom neobsahuje v podstatě žádné krystaly taxanu.
15. 15. Kationtový liposom podle nároku 14, který má průměr od asi 100 do asi 400 nm.
16. 16. Použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva.
17. 17. Použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva w

    &ϋ ·· ·· « · · * • · · · • · ··· • · · ·· · · pro selektivní ovlivňování angiogenních endoteliálních buněk, spočívající v krocích

    a) podávání savci uvedeného prostředku a

    b) umožnění tomuto prostředku spojit se s angiogenními endoteliálními buňkami angiogenních krevních cév po dobu a takovým způsobem, že prostředek vstoupí do angiogenních endoteliálních buněk.
18. 18. Použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva pro léčení nežádoucí angiogeneze enditeliálních buněk, spočívající v podání účinného množství uvedeného kationtového liposomového prostředku savci.
19. 19. Použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva pro inhibici angiogeneze ve spojení s tumorem, spočívající v podání účinného množství uvedeného kationtového liposomového prostředku savci.
20. 20. Použití kationtového liposomového prostředku, který obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva pro redukci tvorby aterosklerotického plátu, spočívající v podání účinného množství uvedeného kationtového liposomového prostředku savci.
21. 21. Použití kationtového liposomového prostředku, který ·« · «» ·· ·*·· r · · · · · · ···· · · · · ·

    1 1 · · · · 9 · 9 9 1 · • ♦ · 9 · · · · ·· *· ··· ···· ·· ·«»· *1

    - Sl· obsahuje kationtový lipid a taxan, jenž má vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami, pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny.
22. 22. Použití podle některého z nároků 16 až 21, při kterém se prostředek podává injekcí do oběhového systému a dále při kterém prostředek má, v krvi, dvojnásobnou nebo vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami.
23. 23. Použití podle nároku 22, při kterém injikovaný prostředek má, v krvi, desetinásobnou nebo vyšší afinitu k angiogenním endoteliálním buňkám ve srovnání s odpovídajícími normálními endoteliálními buňkami a dále při kterém prostředek se skládá z 5 % molárních nebo více kationtových lipidů a prostředek se injikuje intravenózně.
24. 24. Použití podle některého z nároků 16 až 21, při kterém taxan je zvolen ze skupiny sestávající z paklitaxelu, docetaxelu, 10-desacetylových analogů paklitaxelu,

    3'N-desbenzoyl-3'N-terc-butoxykarbonylových analogů paklitaxelu, galaktózového nebo mannózového derivátu taxanu, piperazinového derivátu taxanu, 6-thio- nebo -sulfenamidového derivátu taxanu, a taxanu připojeného na hydrofobní část.
25. 25. Použití podle nároku 26, kde uvedeným taxanem je paklitaxel.
26. 26. Použití podle nároku 26, kde uvedeným taxanem je docetaxel.
27. 27. Použití podle některého z nároků 16 až 21, kde liposom má

    44 4*

    4 4 4 4 4 • 4 4 4 • · 444 4

    4 4 4

    44 4» t

    44 ·· • 4 4 • · 4 • 44

    4 4 4 •4 4444 průměr od asi 100 do asi 400 nm.
28. 28. Použití prostředku podle nároku 1 nebo 14, pro výrobu léčiva.
29. 29. Použití prostředku podle nároku 1 nebo 14, pro výrobu léčiva pro léčení nežádoucí angiogeneze endoteliálních buněk, spočívající v podání účinného množství uvedeného kationtového liposomového prostředku savci.