CN1235567C - 将紫杉烷输送到正在生成的血管的阳离子性脂质体 - Google Patents

Abstract

生血管内皮细胞被含有某种物质的脂质/DNA复合物或阳离子性脂质体选择性靶向，该物质通过抑制或促进这些细胞的生长而起作用。通过给予含有可检测的标记物的阳离子性脂质体，可以准确地定位血管发生的位点。该复合物可含有核苷酸构建物，该构建物由选择性且排他性地在生血管内皮细胞的环境中被激活的启动子构成。

Description

将紫杉烷输送到正在生成的血管的阳离子性脂质体

                     相关申请的交叉参考

本申请是1998年7月31日申请的09/127177的部分继续申请，而09/127177是1997年3月12日申请的申请号为08/820337、美国专利号为5837283的申请的继续，本文纳入这两项申请的全文作为参考，根据美国法典第35篇第120款，我们要求这些申请的优先权。

                            技术领域

本发明涉及脂质体输送领域，具体而言涉及将紫杉烷输送到血管的阳离子性脂质体输送。

                            背景技术

本发明可以应用于各种不同的疾病和异常的治疗和诊断。虽然本发明并不限于此，但是它还可用于癌症、伤口愈合和许多慢性炎症疾病的治疗中。上述疾病目前常直接采用物理方法进行治疗，如癌组织的外科切除、伤口的缝合和发炎关节的外科切除。此外，可采用化学方法治疗各种疾病。对癌症采用化疗方法，对伤口愈合使用生长激素，对慢性炎症病症使用抗炎药物进行治疗。这些治疗以及相关的治疗通常直接用于癌症、损伤或炎症组织的治疗。为了理解本发明与常规治疗方法的不同，本发明给本治疗技术提供了简要的和全面的描述。

癌症治疗

术语“癌症”包括其治疗、预后和可治愈性不同的各种疾病。诊断和治疗的方法依赖于肿瘤起源部位、播散程度、涉及位点、患者生理状况以及预后。一旦诊断出肿瘤，通常给该肿瘤分期，分期涉及外科技术、体格检查、组织病理学、影像和实验评估进行，以确定疾病的程度，并将该癌症患者群体按治愈的可能性的降序分成组。使用这种系统来设计治疗和确定患者的预后〔Stockadale(1996)，“癌症患者治疗的原则(Principles of Cancer Patient Management)”，ScientificAmerican Medicine，第3卷，D.C.Dale和D.D.Federman(编辑)，Scientific AmericanPress，New Nork〕。癌症的类型和病期可以确定将使用3种常规的治疗类型(外科手术、放疗和化疗)中的哪一种进行治疗。还可选择具有攻击性的、组合方式的治疗设计。为此，对于原发肿瘤可进行外科手术切除，残留的细胞可进行放疗或化疗治疗。Rosenberg(1985)New Engl.J.Med.。

外科手术在癌症的诊断和治疗中起主要作用。通常，需要外科方法进行活检，且外科手术是大多数癌症患者的决定性疗法。还使用外科手术减少肿瘤块、切除转移瘤、解决内科急症以及减轻痛苦和使身体恢复。虽然用于癌症治疗的主要外科技术涉及在直接可视的条件下进行肿瘤切除的手术领域的发展，但是本技术考虑某些切除通过使用内镜方法进行。在癌症治疗中主要关注的是手术风险(F.Stockdale，同上)。

放疗在癌症的最初和姑息性治疗中都起重要的作用。通用远距疗法(兆伏级放疗)和短距疗法(间隙的和腔内的放疗)。在治疗普通的恶性肿瘤的远距疗法中最常用的是X射线形式的电磁辐射，但也使用其电磁辐射与X射线类似但由镭钴和其它元素的放射性同位素放射的γ射线。放疗以不连续的能量束将能量转移到组织中，这种能量束称为光子，光子通过在细胞中产生离子化作用从而损伤恶性的和正常的组织。离子的靶通常是DNA；放疗利用这样的事实：辐射损伤对恶性和非恶性组织不一致——快速分裂的细胞比静止的细胞对DNA损伤更敏感。〔Pass(1993)，J.Natl.CancerInstit，85：443-56〕。放疗与独特的好处以及重要的毒性有关。在辐射可能是唯一可行的局部治疗方法、以及肿瘤涉及面广但辐射还可能是唯一可行的局部治疗方法的某些解剖区域(如纵隔)进行辐射较佳。当不能对患者进行外科手术时，或者当患者的身体状况不允许使用外科方法时也可采用辐射。放疗涉及可能导致早期和晚期辐射效应的组织损伤。早期效应(放疗的急性毒性)包括皮肤的红斑、脱皮、食管炎、恶心、脱发和骨髓抑制(myelosupression)，而晚期效应包括组织坏死和纤维化，并常常决定放疗的限制性毒性(F.Stockdale，同上)。

目前使用的化疗药物几乎都干扰DNA的合成、干扰DNA和RNA合成的前体的供应，或者干扰有丝分裂，因此这些药物以增生的细胞为靶(F.Stockdale，“癌症生长和化疗”，同上)。动物肿瘤研究和人的临床试验显示，药物组合比单一药物产生更高的客观效应比例以及更长的存活〔Frei(1972)，Cancer Res.，32：2593-2607〕。药物合并治疗利用多种药物不同的作用机制和细胞毒性，包括烷基化剂、抗代谢物和抗生素〔Devita等人(1975)，Cancer，35：98-110)。患者的生理状况、肿瘤的生长特征、肿瘤细胞群的异质性和肿瘤的多抗药性状况影响了化疗的疗效。通常，化疗是非靶向的〔虽然这些技术在发展，如Pastan(1986)，Cell，47：641-648〕，可能产生副作用如骨髓抑制(depression)、胃肠炎、恶心、脱发、肝或肺损伤，或者不育。

伤口愈合

伤口愈合是一个复杂和漫长的组织修复和重建过程，涉及许多不同的细胞类型，它需要对各种生化级联反应进行精细的协调的控制，以平衡再生过程。伤口愈合通常分为三个阶段：炎症、增殖和成熟〔Waldort等人(1995)，Adv.Dermatol，10：77-96〕。该过程包括不同的细胞类型迁移到受伤区域、上皮细胞和成纤维细胞的生长刺激、新血管的形成以及胞外基质的生成。这些过程的准确功能依赖于各种细胞因子的生物活化作用〔Bennett等人(1993)，Am.J.Surg.，165：728-37〕。营养物、免疫系统、氧、血量、感染、免疫抑制和红血球的减少都影响伤口愈合〔Witney(1989)，Heart Lung，18：466-474〕。

伤口愈合的质量以及速率常取决于最初损伤的类型和程度。使用3种普通类型的方法治疗创伤，每一种都针对受伤组织的愈合。虽然也可使用橡皮胶、钉(stapling)或电烙，但伤口的闭合最通常是通过缝合而实现(C.R.Wheeless，1996，Wheeless′Textbook of Orthopaedics)(Garrett等人(1984)，J.Hand.Surg.，9(5)：683-92)。皮肤橡皮胶和各种缝合在伤口的初期闭合中各具有某些优点和不利。皮肤橡皮胶导致较少的炎症反应，但不能闭合上皮下的伤口空隙，而由各种缝合导致的炎症反应和由此产生的伤疤则取决于缝合针的大小、缝合材料的直径以及缝合是单丝(monofilament)缝合或是织物的缝合〔Simpson(1977)，Laryngoscope，87：792-816〕。

微生物的接种物的大小、该微生物的毒性以及宿主抗微生物的防御机制将决定伤口是否产生了感染。因此，在伤口的治疗中抗生素也可具有治疗价值〔Edlich(1986)，Emergency Medical Clinics of North America，4(3)：561-80〕。为了选择正确的抗生素、其给药途径，以及为了避免产生副作用，必须理解各种抗生素的药理学作用(Simpson，同上)。近来的研究结果表明抗生素治疗使得细胞增殖和分化进行得更快，因此可能有助于增强伤口修复〔Barrow等人(1994)，Respiration，61：231-5；Maeder等人(1993)，Paraplegia，31：639-44〕。也已使用蛋白水解酶作为受感染伤口的抗生素治疗的佐剂〔Rodeheaver等人(1978)，Am.J.Surg.，136(3)：379-82〕。

单独或组合地局部给予各种细胞因子(如bFGF、EGF、PDGF和TGF-β)可大大加速伤口的愈合〔Moulin(1995)，Eur.J.Cell.Biol.，68：1-7〕。生长因子将细胞吸引到伤口处，刺激它们增殖，并对胞外基质的沉积起深刻的影响。自从开发了通过重组技术大量生产这些细胞因子的能力，许多研究已证明在正常的和损伤的愈合模型中生长因子能放大组织修复的所有方面〔如Schultz等人(1987)，Science，235：350-2；Deuel等人(1991)，Annu.Rev.Med.，42：567-84〕。虽然初步的临床试验已显示生长因子治疗有时会导致组织修复在统计学上显著的改善，但是并不清楚这些结果临床上是否显著，已建议新的临床试验必须集中在用于特殊类型损伤的愈合的生长因子上〔Greenhalgh(1996)，J.Trauma，41：159-67〕。

慢性炎症

天然的、体液的和细胞的免疫机制都包括在慢性炎症疾病的发病机理中〔Seymour等人(1979)，J.Oral Pathol.，8：249-65〕。自身免疫疾病产生于淋巴细胞功能异常。T细胞功能异常可通过细胞介导的免疫性引起疾病，在抗体产生中辅助T细胞的活性可能促使自身抗体的形成。许多这类疾病与某些HLA分子的联系支持了辅助T细胞在自身免疫中的主要作用。耐受性的维持中的一个或多个步骤的失败可能导致自身免疫〔Robinson(1996)，“免疫耐受和自身免疫”，ScientificAmerican Medicine，第2卷，第VI部分，Scientific American Press，New York，p.1-11〕。

在自身免疫疾病中使用几种类型的治疗，所有这些治疗都旨在减少患病组织的免疫反应。例如，可使用抗炎药物剂如非甾族抗炎药物(NSAID)或糖皮质类固醇、缓解诱导药如金盐和/或免疫抑制药如环磷酰胺来治疗类风湿性关节炎(一种自身免疫疾病)。也可使用整形外科手术将发炎过程中损伤的关节取代(参见B.C.Gilliland和M.Mannik，1983，“类风湿性关节炎”，Harrison′s Principles of InternalMedicine，McGraw Hill，New York，P.1977-1984)。近来的工作暗示了同样是针对患病组织的新疗法的可能性，例如在类风湿性关节炎的治疗中TNFα的使用〔Brennan等人(1995)，Br.Med.Bull.，51：368-384〕。

过敏反应指对环境抗原的免疫反应导致炎症和器官功能失调的状况。与自身免疫疾病一样，数据显示了在过敏疾病中免疫系统的几种组分的相互作用。过敏疾病的表达的多样性起因于不同的免疫效应器机制，这些机制引起组织损伤的特殊模式〔Beer等人(1996)，“过敏反应”，Scientific American Medicine，第2卷，第VII部分，Scientific American Press，New York，P.1-29〕。各种过敏疾病的临床特征反映了在患病器官或组织中的免疫介导的炎症反应(如哮喘反映了在气道中的炎症反应)。

使用几种治疗策略来治疗免疫介导的过敏疾病，所有这些治疗都用于减少发炎组织中的免疫反应。例如，在哮喘的治疗中，疗法可涉及环境的控制、药物治疗和变应原的免疫疗法〔Beer等人(1996)，“过敏反应”，Scientific AmericanMedicine，第2卷，第VII部分，Scientific American Press，New York，pp.1-29〕。在哮喘的治疗中，病原体的去除是预防炎症的最成功的方法。但是，这常常是不可能的，因此使用了几类药物。这些药物包括甲基黄嘌呤类(用于扩张支气管)、肾上腺素能刺激剂(刺激α-肾上腺素能受体，支气管扩张药)、糖皮质激素(减少肺中的炎症)、色酮类(下调肥大细胞，减少肺中的炎症)和抗胆碱能药物(支气管扩张药)〔McFadden等人，“由免疫和环境损伤导致的肺疾病”，Harrison′s Principles ofInternal Medicine，McGraw Hill，New York，p.1512-1519〕。为了减少哮喘中的炎症，还已建议了使用可疑的变应原的抽提物进行脱敏作用或免疫疗法〔McFadden和Austen，op.cit.；Jacquemin和Saint-Remy(1995)，Ther.Immunol.，2：41-52〕。

动脉粥样硬化斑块

动脉粥样硬化是许多层斑(脂肪和纤维组织)渐进性地使动脉血管的腔(内部通路)变窄。在美国，动脉粥样硬化的主要的并发症(包括局部缺血性心脏病、心肌梗塞、中风和四肢坏疽)所导致的年死亡率超过一半。

动脉由三层组成：内膜，由内皮和内弹性膜腔侧上的结缔组织组成；中层，由平滑肌细胞和弹性动脉中的弹性纤维以及大血管中的血管滋养管(vasa vasorum)组成；外膜，它是血管壁的外层，由由成纤维细胞、小血管和神经组成的结缔组织鞘膜组成。动脉粥样硬化可发生在任何动脉。在冠状动脉，该疾病可能会导致心脏病发作，在大脑动脉，它可能会导致中风；在外周动脉，它可能会导致四肢坏疽。动脉粥样硬化是个复杂的过程，并未准确知道它是如何开始或是由什么导致。但是，据认为内皮损伤是动脉粥样硬化病灶的形成的起始步骤，可能是由血液动力学应力、血胆固醇过多、高血压或免疫复合物疾病导致的。内皮损伤导致胆固醇和脂质积聚，内膜增厚、平滑肌细胞增殖以及结缔组织纤维的形成。脂肪沉积的堆积和平滑肌细胞的增殖逐渐导致斑的形成，形成的斑块最终使动脉变窄并将其阻断。

已描述了人动脉粥样硬化病灶的内膜中的血管再生，但并未清楚它在动脉粥样硬化的发展中的作用。Moulton等人(1999)，Circulation，99：1726-1732；Isner(1999)，Circulation，99：1653-1655；Depre等人(1996)，Catheterization andCardiovascular Diagnosis，39：215-220。

由动脉粥样硬化和相关病理导致的死亡率清楚地表明当前的治疗是不够的。导致动脉粥样硬化事件的最重要的因素是以低密度脂蛋白存在的胆固醇的高血浆浓度。目前的治疗方法包括抑制肝的合成胆固醇的酶系的药物的使用。

目前的治疗-免疫学

上述疗法已取得不同程度的成功。因为在许多情况中成功比例不尽人意，所以研究还在继续进行，以找出更好的治疗。一个有希望的研究领域涉及到影响免疫系统。通过使用遗传工程和/或化学刺激，有可能修饰和/或刺激免疫反应，从而让机体自身的免疫系统对疾病进行处理，如让抗体破坏癌细胞。这种类型的治疗与上述方法不同之处在于此方法利用生物过程来克服疾病。但是，此方法仍是一种直接的治疗方法，即由产生的抗体直接攻击癌细胞。

本发明可用于治疗，它与常规方法有根本的不同，即本发明不涉及对癌的、损伤的或发炎的细胞的直接影响。

有人已认识到，至少在理论上，通过抑制血管发生来治疗与血管发生相关的癌症或炎症是可能的。在1995年9月28日发表的PCT出版物WO 95/25543中讨论了目前涉及到此思考的典型的例子。这个发表的申请描述了通过给予与据认为在生血管内皮细胞的表面上的抗原结合的抗体从而抑制血管发生。具体而言，该申请描述了给予结合于据认为介导了细胞-细胞和细胞-胞外基质之间的相互作用(通常称为细胞粘附事件)的膜受体α_vβ₃的抗体。通过阻滞这种受体，该治疗有望抑制血管发生并从而治疗癌症和炎症。

                            发明概要

公开了一种选择性地将药物输送到生血管内皮细胞的方法。该方法涉及注射(较佳注射到循环系统中，更佳注射到动脉内)阳离子性脂质体(或多核苷酸/脂质复合物)，它由阳离子性脂质和促进或抑制血管发生的化合物组成；和/或包括可检测的标记物。给药后，阳离子性脂质体选择性地与生血管内皮细胞结合，这意味着与相应的静止的没有进行血管生成的内皮细胞比，脂质体与生血管内皮细胞以两倍或更大(士倍或更大更佳)的比例结合。当脂质体(或多核苷酸/脂质复合物)与生血管内皮细胞结合，它们将被摄取到该内皮细胞中并产生它们所需的作用。该物质能破坏该内皮细胞，进一步促进血管发生，促进凝结和/或标记该内皮细胞，这样可采用适当的方法将其检测。影响生血管内皮细胞的物质可以是核苷酸序列，如编码蛋白质的DNA，当该DNA表达时促进或抑制血管发生。核苷酸序列较佳包含与启动子适当连接启动子的载体中，该启动子较佳仅在生血管内皮细胞中有活性，或者可通过给予一化合物使其在那些细胞中被活化，从而使通过该启动子的激活启动或关闭该基因成为可能。

本发明的一个目的是提供一种选择性地影响生血管内皮细胞、从而抑制或促进血管发生的方法。

本发明的另一目的是提供一种通过给予含有可检测的标记物的阳离子性脂质体诊断血管发生位点的方法，设计该脂质体，以使其选择性地与生血管内皮细胞结合，而不与相应的不进行血管生成的内皮细胞结合。

本发明的又一目的是提供阳离子性脂质体，该脂质体由阳离子性脂质和经特别考虑的化合物构成，设计来抑制或促进血管发生，该化合物可以是水溶性的或易于分散在水中的，或者是与脂质相溶的并掺到脂质层中。

本发明的又一目的是提供含有阳离子性脂质和紫杉烷的阳离子性组合物。

本发明的又一目的是提供一种使与阳离子性脂质结合的紫杉烷靶向生血管内皮细胞的方法。

本发明的又一目的是提供一种以导致局部血管内凝血从而阻碍或完全阻断血液在血管中的流动的方式选择性地影响生血管内皮细胞的方法。

本发明的又一目的是提供一种通过使用可检测的标记物标记细胞来分析生血管内皮细胞、从而使从周围细胞中分离出生血管内皮细胞用于接下来的培养和/或分析成为可能的方法。

本发明的又一目的是提供一种通过将毒性化合物输送到肿瘤的生血管内皮细胞中来破坏有害的肿瘤的方法，该化合物破坏了该生血管内皮细胞，接着破坏肿瘤细胞。

本发明的又一目的是提供一种通过将阳离子性脂质/DNA复合物输送到生血管内皮细胞从而选择性影响生血管内皮细胞的方法，其中，该DNA连接在启动子上，该启动子选择性地在某种环境中被激活，它较佳是独特地与生血管内皮细胞结合，即该启动子不被静止的内皮细胞激活。

本发明的又一目的是提供一种通过输送阳离子性脂质复合物来减少血管中动脉粥样硬化斑块的形成的方法，该复合物含有减少血管发生从而减少斑的形成的物质。

本发明的一个特征是，本发明的阳离子性脂质体选择性地与生血管内皮细胞结合要比它们与不涉及血管发生的相应的内皮细胞的结合高(两倍以上，较佳是10倍以上)。

本发明的一个优点是，可使用本发明的阳离子性脂质体准确地将少量的毒性物质输送到内皮细胞中，这些细胞以某种方式(如被杀死)受到影响，这样血管被破坏或者使之不起作用(如通过血液结块)，给周围组织的营养供应被切断，从而破坏该组织(如破坏实体瘤)。

本发明的另一优点是，可使用本发明的阳离子性脂质体抑制与恶性或良性肿瘤有关的血管发生，这些肿瘤与正在发生的血管发生有关。

本发明的又一优点是，可使用该阳离子性脂质体提供化合物的定点输送，该化合物促进血管发生并从而增强伤口愈合。

本发明的一个重要特征是几类疾病和/或异常的治疗中涉及到的组织并没有被直接处理，而是如通过抑制血管发生，肿瘤的血液供应被切断，肿瘤被杀死，但该肿瘤细胞并没有被任何方式直接处理。

在阅读完本文提供的公开以及附图后，本领域熟练的技术人员将会明白本发明的这些以及其它的目的、优点和特征。

                             附图说明

图1示出正常小鼠卵巢的卵泡中正在发生的血管摄入发红色荧光的CM-DiI标记的DDAB：胆固醇-DNA复合物的荧光显微图(图下险段表示60μm)。

图2示出在其血管被发荧光的外源凝集素染成绿色的RIP1-Tag5小鼠的胰腺肿瘤切片中正在发生的血管摄入发红色荧光的CM-DiI标记的DDAB：胆固醇-DNA复合物的荧光显微图(图下险段表示40μm)。

图3示出正常小鼠胰岛的血管很少或没有摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇-DNA复合物(黄橙色)的低放大率荧光显微图(图下险段表示150μm)。

图4示出RIP1-Tag2小鼠胰腺肿瘤的血管摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇-DNA复合物(黄橙色)的低放大率荧光显微图(图下险段表示150μm)。

图5示出用发荧光的外源凝集素染色(绿色)的正常胰岛血管很少或没有摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体(红橙色)的共聚焦显微图(图下险段表示50μm)。

图6示出RIP1-Tag2小鼠的胰腺肿瘤摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体(红橙色)的共聚焦显微图。通过在静脉内注射脂质体后灌注发荧光Lycopersicon esculentum外源凝集素将血管染色(绿色)(图下险段表示50μm)。

图7示出RIP1-Tag2小鼠的胰腺肿瘤摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体(红橙色)的共聚焦显微图。通过在静脉内注射脂质体后灌注发荧光的Lycopersicon esculentum外源凝集素将血管染色(绿色)(图下险段表示50μm)。

图8示出RIP1-Tag2小鼠的胰腺肿瘤摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体(红橙色)的共聚焦显微图。通过在静脉内注射脂质体后灌注荧光Lycopersicon esculentum外源凝集素将血管染色(绿色)。血管生长的可能位点具有强烈的摄入(图下险段表示50μm)。

图9示出其血管用发荧光的外源凝集素染色的无病原体小鼠气管中的正常血管很少摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体(红橙色)的共聚焦显微图(图下险段表示50μm)。

图10示出肺支原体引起肺感染的小鼠的气管中正在发生的血管摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体(红橙色)的共聚焦显微图(图下险段表示50μm)。

图11示出通过测定静脉注射4小时后的脂质体荧光强度而评估无病原体(正常)小鼠和肺受肺支原体感染的小鼠的气管中血管摄入得克萨斯红-DOTAP：胆固醇脂质体的量的图。用Zeiss LSM 410共聚焦显微镜进行测量。在受感染小鼠的鼻内接种肺支原体，4周后检测。星号表示统计学上显著的差异(P＜0.05，说明标准误差，每组有n＝4只小鼠)。

图12示出肺支原体感染的小鼠的气管中内皮细胞结合DOTAP：胆固醇脂质体的透射电镜图(图下险段表示50μm)。

图13示出肺支原体感染的小鼠的气管中内皮细胞摄入DOTAP：胆固醇脂质体的透射电镜图(图下险段表示80μm)。

图14示出无病原体小鼠的气管的内皮细胞内衬(图A)和受肺支原体感染的小鼠的气管(图B)与阳离子性紫杉醇脂质体结合的荧光显微图。

                       最佳实施方式的详细描述

在描述选择性影响/标记正在发生血管的内皮细胞的本方法以及用于此方法的脂质体之前，应理解本发明并不受所述的特殊脂质体、方法或活性物质限制，而这些当然是可以改变的。还应理解本文所用术语仅仅是为了描述具体的实施方式而不具限制性，因为本发明的范围仅仅由后面的权利要求所限制。

必须注意的是，除非文中有明确说明，否则在本说明书和附带的权利要求书中所使用的单一形式的“一”、“和”和“这”包括复数对象。因而如“脂质体”包括混合物和大量的这种脂质体，“药物”包括大量的药物及其混合物，“方法”包括一种或多种方法或者本文所述的方法的多个步骤。

本文所讨论的出版物都在本申请的申请日前公开。在此并不应认为承认因为这些出版物为现有技术而不授权予本发明。

除非有另外的定义，所有的技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的都一致。虽然所有与本文所述的类似或等同的方法和材料都可以用于实践或者检测本发明，但是本文描述了最佳的方法和材料。为公开和描述本发明的特殊方面(出版物所引用的地方)，本文所引用的所有出版物都被纳入作为参考。

定义

本文所用术语“治疗”通常指获得所需的药理学的和/或生理的效果。从完全或部分预防疾病或其症状来说，该效果可以是预防性的，和/或从部分或完全稳定或治愈疾病和/或该疾病带来的不利影响的角度来说，该效果可以是治疗性的。本文所用“治疗”包括哺乳动物(特别是人)的某疾病的所有治疗，包括：

(a)预防疾病或症状在受试者身上发生，该受试者可能易患该疾病或症状但尚未诊断出；

(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或者

(c)缓解疾病症状，即引起疾病或症状的消退。

本文所用“药学上可接受的盐”指保持母体化合物所需生物活性并且不带来任何不希望的毒理学作用的盐。这种盐的例子包括但不限于：(a)由无机酸形成的加酸盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；由有机酸形成的盐，例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、反丁烯二酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸(pamoic acid)、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸；(b)与多价金属阳离子(如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等)的盐；(c)与由N，N′-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的盐；(d)(a)和(b)或(c)的组合，如单宁酸锌盐；等等。

术语“血管发生”指组织血管形成的过程，该过程涉及新的血管的发育。血管发生有3种机制：(1)新血管形成，内皮细胞从预先存在的血管中迁移出来，开始新的血管的形成；(2)血管发生，血管从前体细胞从头形成；(3)血管扩张，已存在的小血管在直径方向上增大，形成较大的血管〔Blood等人(1990)，Biochem.Biophys.Acta.，1032：89-118〕。

血管发生在新生儿生长的正常过程中和在黄体生长周期过程中的女性生殖系统中是个重要的过程〔见Moses等人(1990)，Science，248：1408-10〕。在正常条件下，所有涉及新形成或已存在或新的血管的重建的过程都是个自我限制的过程，特殊的细胞类型的扩散受到控制并且是协同的。

在伤口愈合和大量的临床疾病的病理中也涉及到血管发生，这些疾病包括组织炎症、关节炎、哮喘、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病和其它的病症。与血管发生有关的临床表现称为血管原性疾病〔Folkman等人(1987)，Science，235：442-7〕。

许多实验已表明，组织能够在正常和病理条件下在血液供应差的条件下产生促进血管发生的血管生成因子。这些因子和化合物在细胞特异性方面有所不同，在诱导新血管的生长的机制方面也不同。这些因子通过许多机制起作用。例如，它们可能诱导内皮细胞的迁移和增殖，或者刺激胶原酶的生产〔见Klagsbrun等人(1991)，Ann.Rev.Physiol.，53：217-39〕。有许多生物测定法能直接确定血管生成活性〔Wilting等人(1991)，Anat.Embrol.(Berl)，183：259-71〕。

已提出在疾病的治疗中可以使用血管生成抑制剂。例如，干扰血管发生可能限制肿瘤的生长。已提出了几种抑制血管发生的方法，包括(1)抑制血管生成因子的释放，(2)使用如单克隆抗体等中和血管生成因子，(3)通过使用抗血管生成因子、已知抑制血管发生的分子抑制内皮细胞应答〔Folkman等人，Seminars inCancer Biology，3：89-96〕。已描述了几种内皮细胞抑制剂，如胶原酶抑制剂、基膜代谢(turnover)抑制剂、抑制血管的(angiostatic)类固醇、真菌衍生的抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物如青霉胺，尤其是α-干扰素〔见Folkman等人(1992)，Seminars in Cancer Biology，3：89-96；参见例如Stepien等人(1996)，J.Endocrinol，150：99-106；Maione等人(1990)，Science，247：77-9〕。

术语“内皮细胞”指那些构成内皮的细胞，它们是排列在循环系统的内表面上的单层鳞状细胞。这些细胞保留细胞分裂的能力，虽然它们在正常情况下增殖缓慢，每年仅进行一次细胞分裂。可通过使用[³H]-胸苷标记S期的内皮细胞来证明其增殖。在正常的血管中，被标记的内皮细胞的比例在动脉的分支点特别地高，在那儿湍流和磨损似乎刺激了代谢〔Goss(1978)，The Physiology of Growth，Academic Press，New York，pp.120-137〕。正常的内皮细胞是静止的，即它们不进行分裂，由此如下所讨论可以将它们与生血管内皮细胞区分开来。

内皮细胞也具有迁移的能力，迁移是血管发生的重要过程。当需要内皮细胞时(如在伤口修复时)或当感觉到需要它们时(如在肿瘤形成时)，内皮细胞在体内形成新的毛细血管。新血管的形成称为血管发生，涉及能促进有丝分裂的分子(血管生成因子)或内皮细胞的化学引诱物(Klagsburn，同上)。在血管发生过程中，内皮细胞能从已存在的毛细血管中迁移出来，开始形成新的血管，即一根血管的细胞以能使该血管伸长的方式迁移(Speidel，Am J.Anat.，52：1-79)。体外研究已证明了内皮细胞的增殖和迁移；放在培养基中的内皮细胞能增殖并自发地发育为毛细血管〔Folkman等人(1980)，Nature，288：551-56〕。

术语“生血管内皮细胞”和“进行血管生成的内皮细胞”等在文中可交换使用，指进行血管发生(如上述)的内皮细胞(如上述)。因而，生血管内皮细胞是以远快于正常条件下一年大约分裂一次的速率增殖的内皮细胞。生血管内皮细胞增殖的速率可以是内皮细胞正常增殖的分化速率的2、5或10倍，或者更多，并且可极大地依赖于患者的年龄和病情、涉及的肿瘤、伤口的类型等因素而改变。倘若正常内皮细胞和生血管内皮细胞之间的增殖程度的差异是可测量的，并且在生物学上认为是显著的，则按本发明可分辨两种类型的细胞，即根据它们与阳离子性脂质体的优先结合，可以分为生血管内皮细胞以及相应的正常的、静止的内皮细胞。

术语“相应的内皮细胞”、“正常或静止的内皮细胞”等指包含在相同类型组织中一些内皮细胞进行血管发生而一些内皮细胞处于静止状态的正常的、静止的内皮细胞(在正常的条件下)。在本发明中，生血管内皮细胞优先被靶向，且其靶向的比例比相应的静止的内皮细胞的靶向要大5倍以上，较佳是10倍以上。

术语“脂质”使用其常规的含义，是一类包括脂肪、脂质、原生质、不溶于水而溶于醇-醚的组分的术语。脂质由脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、固醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨脂质、色脂质(脂色素)和脂肪酸组成。该术语包括天然存在的和人工合成的脂质。本发明较佳的脂质是胆固醇、磷脂(包括磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)和鞘磷脂。脂肪酸可以有12-24个碳原子，最多含有6个不饱和键(双键)，通过酰基或醚键连接到骨架上。连接到骨架上的脂肪酸有一个以上，则脂肪酸可以不同(不对称的)，或者可以仅存在1条脂肪酸链，如溶血卵磷脂。混合的制剂也是可能的，尤其是当非阳离子性脂质是从天然来源得到时，如卵磷脂(磷脂酰胆碱)可从蛋黄、牛心、脑或肝或大豆中纯化得到。也感兴趣的是类固醇和固醇，特别是胆固醇和在3β位被取代的固醇。

本文所用术语“阳离子性脂质”包括本发明任何是阳离子性的脂质(如上述)。当在使用仪器测量出脂质(在生理pH)带正电荷时，可以确定该脂质是阳离子性。当阳离子性脂质中存在脂肪酸时，该脂肪酸可以有12-24个碳原子，最多含有6个不饱和键(双键)，通过酰基或醚键连接到骨架上；也可仅有一个脂肪酸连接到骨架上。当有一个以上的脂肪酸连接到骨架上时，这些脂肪酸可以不同(不对称的)。混合的制剂也是可能的。

术语“脂质体”包括被脂质双层包被的任何区室。脂质体也称脂质囊。为了形成脂质体，脂质分子由伸长的非极性(疏水)部分和极性(亲水)部分组成。分子的疏水和亲水部分较佳位于该伸长的分子结构的两端。当这种脂质分散在水中时，它们自发形成双层膜(称为薄层)。该薄层由脂质分子的两个单层片组成，它们的非极性(疏水)表面彼此相对，它们的极性(亲水)表面面向水介质。由脂质形成的膜以与细胞膜包被细胞内容物类似的方式包被了一部分的水相。因而，脂质体的双层与不含蛋白质组分的细胞膜类似。在本发明中，术语脂质体包括多层脂质体，通常它的直径范围在1-10微米，任何位置都由两个到好几百个同心的脂质双层组成，之间交替出现水层；本发明脂质体还包括由单一脂质层组成的单层囊，它的直径通常约为20-400纳米(nm)、约50-300nm、约300-400nm、约100-200nm，可通过超声波处理多层脂质体、在压力下将多层脂质体挤过具有所需大小的孔的膜或者通过高压均化作用而得到这种单层囊。

含有紫杉烷的较佳脂质体可能是具有单一脂质双层、直径在25-400nm的单层囊。同样，含有紫杉烷、直径约为25400nm的多层囊也是优选的。

可从较佳的脂质体制备优选的多核苷酸(包括DNA、RNA和合成的多核苷酸类似物)脂质体复合物。可制备复合物，这样在每1-50nmol的阳离子性脂质中存在1μg的多核苷酸。当DNA基因盒的表达出所需的最终产物时，可通过制备一系列将标准量的DNA与上述范围内不同量的阳离子性脂质体混合的制剂，凭经验确定最佳的多核苷酸与阳离子性脂质的比例。之后体内给予这些制剂，可以确定获得最高表达的制剂。

可从功能上定义阳离子性脂质体为ζ电势大于0mV的脂质体。

本文所用术语“阳离子性脂质体”包括上述任何是阳离子性的脂质体。该脂质体是在生理pH中被测定为阳离子性的。应注意的是，脂质体本身是个整体，它被测定为阳离子性，表明在它的生理pH时具有可测量的正电荷的脂质体可能在体内环境中连接于其它物质。那些其它物质可能带负电荷，因而产生不带有正电荷的结构。还没有准确测定本发明脂质体在体内环境中的电荷和/或结构。但是，根据本发明，至少使用一些它们本身是阳离子性的脂质来生产本发明的阳离子性脂质体。脂质体不必完全由阳离子性脂质构成，但是必须由足量的阳离子性脂质构成，这样当该脂质体形成并置于处于生理pH的体内环境中时，它起初具有正电荷。

术语“核苷酸序列/阳离子性脂质复合物”指可以是RNA或DNA序列的核苷酸序列与上述至少一种阳离子性脂质体的组合，可以包括中性脂质。当DNA序列和阳离子性脂质组合时，它们将自发地形成非经典脂质体的复合物。本发明特别针对特殊核苷酸序列/阳离子性脂质复合物的形成，其中，核苷酸序列是特别设计来影响生血管内皮细胞的。例如，核苷酸序列可编码杀死生血管内皮细胞的蛋白质。该序列较佳是适当连接于一启动子，该启动子仅在生血管内皮细胞的环境中被选择性激活，即不在相应的静止的内皮细胞中被激活。此外，该复合物可包括阻滞生血管内皮细胞中遗传物质表达的反义序列，从而严重破坏生血管内皮细胞的运作以及/或者将其杀死。DNA可以是质粒或线状的。当需要基因产物时(RNA转录物本身或RNA翻译成蛋白质)，需要DNA启动子序列以及编码基因产物的DNA序列组成的表达盒。具有非磷酸二酯键的核苷酸特别用于反义用途。

术语“结合”指本发明阳离子性脂质体保持与生血管内皮细胞足够接近足够长时间的行为，这样该脂质体和/或它的内容物就进入该内皮细胞中。本发明脂质体可在种种环境下与生血管内皮细胞结合，但较佳是在体内条件下与生血管内皮细胞结合。因而，脂质体可以在与生血管内皮细胞结合前通过与血流中的其它分子或物质连接、结合而被修饰。多种力可能引起脂质体与生血管内皮细胞的结合，如在任何两种不相关的分子(即其它大分子如人血清白蛋白和人运铁蛋白)间的非特异性相互作用。这些分子间作用力可分为4种一般的类型：(1)静电；(2)氢键；(3)疏水；(4)范德华力。静电力是带相反电荷的离子基团之间的相互吸引，如阳离子性脂质体上和生血管内皮细胞上之带或之内相反电荷的基团的相互吸引。吸引力(F)与两个电荷间的距离(d)的平方成反比。氢键力由亲水基团间可逆的氢桥(bridge)的形成提供。本发明脂质体可包括亲水基团，如-COOH，类似的基团可存在于内皮细胞的表面上，可以是-OH、-NH₂。这些力极大地依赖于携带这些基团的两个分子的位置接近。疏水力以与水中的小油滴融合成单一的大油滴相同的方式起作用。因此，在水性环境中，存在在本发明脂质体上的非极性疏水基团倾向于相互结合，且可倾向于与内皮细胞表面上的疏水基团结合。最后，范德华力由分子间产生，它依赖于外部电子云的相互作用。

本文使用术语“选择性结合”和“选择性地靶向”等描述了本发明阳离子性脂质体的性质，该性质导致阳离子性脂质体与生血管内皮细胞结合的程度高于阳离子性脂质体与跟血管发生无关的相应正常内皮细胞的结合。根据本发明，选择性的或优先的结合指与和不进行血管发生的相应的正常内皮细胞的结合相比，脂质体和进行血管发生的内皮细胞的结合达5倍以上。更佳的是，优先的或选择性的结合指脂质体与生血管内皮细胞与相应的正常内皮细胞的选择性在10倍以上。

术语“癌”指不适当的细胞增殖的疾病。临床上当肿瘤组织体积危及到重要器官的功能时，紊乱是最显著的。描述正常组织生长的概念适用于恶性组织，因为正常的和恶性的组织的生长特征类似，不论是单细胞水平还是组织水平。癌症是细胞生长调节失调的疾病，也是组织生长调节失调的疾病。倍增时间指组织或肿瘤大小或细胞数目倍增所需的时间。临床上明显的肿瘤的倍增时间通常比构成肿瘤的细胞的细胞周期时间长得多。但是，与肿瘤不一样，成人正常的肝、心脏或肺没有倍增时间，因为这些器官处于稳定的状态，这样细胞产生和死亡的速度相等〔Stockdale(1996)，“癌症生长和化疗”，Scientific American Medicine，第3卷，Scientific American Press，New York，pp.12-18〕。肿瘤的生长特征是新细胞的产生超过细胞的死亡，肿瘤事件倾向于进行自我更新的干细胞比例增加和细胞成熟的比例相应减少〔McCulloch等人(1982)，Blood，59：601-608〕。对于各肿瘤种群，存在着倍增时间，并且可以确立特殊的生长曲线(Stockdale，同上)。可用gomperzian曲线描述肿瘤的生长模式〔Steel(1977)，肿瘤的生长动力学，牛津大学出版社，New York，p.40〕，该曲线表明，在肿瘤发展过程中，开始时生长速率非常快，随着其大小的增加而逐渐放慢。

本发明总的方面

附图清晰形象地说明了本发明的阳离子性脂质体以生血管内皮细胞为目标的高度选择性方式。本发明一个基本的实施方式涉及一种通过给予(较佳静脉内注射，更佳动脉内注射)一种制剂选择性地影响生血管内皮细胞的方法，该制剂含有药学上可接受的载体和含有一种物质或DNA/阳离子性复合物的阳离子性脂质体。该物质可以是抑制血管发生的化合物、促进血管发生的化合物和/或可检测的标记物。然后使注射剂中的阳离子性脂质体进入沿着正在发生的血管壁排列的生血管内皮细胞中(内吞作用)。该阳离子性脂质体与生血管内皮细胞结合足够长的时间，并以脂质体本身和/或其内容物进入该生血管内皮细胞中的方式结合。之后，进入细胞内的化合物能抑制或促进血管发生，或者仅仅提供一个可检测血管发生的位点的标记物。结合附图能更好理解靶向生血管内皮细胞的选择性。

图1示出小鼠卵巢上具有大的圆形卵泡(黄色)的部分。因为血管生成出现在正常的小鼠卵巢中，所以含有可检测的标记物的阳离子性脂质体与卵泡中正在生长的血管的生血管内皮细胞(红橙色)相结合。但是，在图1中不可能清楚地确定该标记物仅仅与生血管内皮细胞结合，或它是否与卵巢和卵泡中的所有组织都结合。

图2示出静脉内注射了本发明含有可检测标记物的阳离子性脂质体(红橙色)的小鼠胰腺肿瘤的一个切片的荧光显微图。血管发生易于在肿瘤中出现。因而，这张图提示，即本发明的阳离子性脂质体(红橙色)特异性地与生血管内皮细胞(绿色)结合。但是，这些结果不能显著证明本发明的特异性。

图3和4的比较证明了本发明定位血管发生部位的能力。图3示出小鼠正常胰腺组织中的血管。正常内皮细胞的标记比相应的生血管内皮细胞少得多。比较图3和图4清楚地证明了这一点，图4是小鼠胰腺肿瘤相片。图4清楚示出在肿瘤区域中包含在阳离子性脂质体中的标记物(黄橙色)高度积累。图3和4之间的巨大差异表明使用本发明能清楚和准确地标记肿瘤的位置。但是，因为在图4中有这么多的标记物与正在发生的血管结合，所以不可能完全意识到阳离子性脂质体优先靶向生血管内皮细胞的特异性。

图5是正常小鼠胰岛血管(绿色)的照片。少量的红橙色颜色表明阳离子性脂质体与衬在胰腺组织的血管中的正常内皮细胞的有限的结合。

比较图5和6更清楚地显示含有可检测的标记物的阳离子性脂质体的特异性。图6清楚地示出小鼠胰腺肿瘤的正在发生血管的内皮细胞中的标记物的较高程度的积聚。

图7和8生动显示了阳离子性脂质体准确靶向生血管内皮细胞的能力。图7清楚显示荧光标记物仅仅与血管结合，即该标记物并没有泄漏或迁移到周围组织中。在生血管内皮细胞中检测到标记的阳离子性脂质体的图8最生动地显示了特异性，表明该标记物对那些细胞具特异性，并且没有泄漏或迁移到周围组织中。

图9和10证明了与上述相同的效果，但血管发生的模式有差异。图1-8都针对正常组织或癌组织。图9和10分别显示小鼠气管正常的和炎症组织。更具体而言，图9显示气管的正常血管，即无病原体的小鼠气管。图10显示发生了感染诱导血管发生的气管的血管。图10中可检测的标记物的较高浓度明显表明，本发明阳离子性脂质体选择性地与生血管内皮细胞结合，特异性地与已由感染诱导血管发生的气管的内皮细胞结合。

图11代表阳离子性脂质体分别与生血管内皮细胞和相应的不进行血管发生的正常内皮细胞的结合能量的特异性差异。如图11所示，本发明阳离子性脂质体(按照此实验)显示出与生血管内皮细胞的亲和力要比它与不发生血管的相应内皮细胞的亲和力大大约10倍。

图12和13显示本发明阳离子性脂质体如何进入生血管内皮细胞中。在图12中，阳离子性脂质体已与生血管内皮细胞的表面接触。在图13中，阳离子性脂质体已通过内吞作用进入生血管内皮细胞并存在于细胞中。

图14显示无病原体和肺支原体感染的小鼠的气管摄入含有紫杉醇的脂质体制剂，进一步证明了阳离子性脂质体与不进行生血管内皮细胞相比优先与生血管内皮细胞结合并被其摄入。

经过语言描述和图示本发明阳离子性脂质体的特异性，本领域中的熟练技术人员应能生产种种不同的含有许多不同物质的阳离子性脂质体，以便使用本发明。但是，为了完整性，下面描述了阳离子性脂质体和它们的制备方法，以及抑制或促进血管发生的物质。

脂质体

将包括阳离子性脂质(如上述)的脂质(如上述)加到水溶液中并搅拌该溶液几秒钟到数小时可容易地形成脂质体。这个简单的方法自发地产生大的、多层的、直径为约1-10微米的脂质体或囊。这些脂质体由两个到几百个同心脂质双层组成，这些双层间交替出现脂质存在于其中的水层。在该水相中可以包括某种物质如抑制血管发生、促进血管发生或提供可检测的标记物的化合物。该物质可以是水溶性的，或者至少是易于分散在水中。或者，这类物质可包括在脂质双层中。包括在脂质双层中的物质可以是疏水的。

水层的厚度以及脂质体中所包围的水相的总量取决于带电脂质间的静电排斥力与双层间的范德华引力整体上的平衡。因而，水层空间(以及被包围的水性物质的体积)随着膜中带电脂质比例的增加以及水相中电解质(带电离子)浓度的减少而增加。

可以制备不同大小的脂质体。小的脂质体或囊是单层的，大小约为20-400nm，可将多层囊进行超声波处理、在压力下将其挤过有确定大小的孔的膜或者进行高压均化作用而制得。当脂质溶解在有机溶剂或去污剂中，并且该溶解的药物分别通过蒸发或透析除去时，可以得到直径约为0.1-1μM的较大的单层脂质体。采用需要特殊的脂质或者严格的脱水-水合条件的方法进行较小单层脂质体的融合，可以获得与细胞一样大或更大的单层囊。

为了形成本发明的阳离子性脂质体，有必要使用至少一些阳离子性脂质来制备脂质体。但是，本发明阳离子性脂质体不需要完全由阳离子性脂质组成。例如，使用约45％的中性脂质和约55％的阳离子性脂质将产生用于本发明以及优先靶向生血管内皮细胞的阳离子性脂质。

本发明的阳离子性脂质体可包括影响血管发生的物质，还可在水层中包括荧光团或其它的标记物和/或可溶解的化合物。包括影响血管发生的物质和/或标记物的阳离子性脂质体的生成可采用本领域几种标准方法中的任何一种进行，由此，例如，混合1，2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)、胆固醇和得克萨斯红DHPE〔N-(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)-1，2-双十六烷酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺〕，将其蒸干，接着在5％葡萄糖中再水化该脂质膜，得到多层囊(MLVs)。这些束通过聚碳酸酯膜滤器挤出得到单层束。在5％葡萄糖溶液中或其它生理上可接受的赋形剂中以特定的比例一起混合脂质体和将进行复合的物质(如质粒DNA)。有用的阳离子性脂质包括：如Solodin等人(1995)，Biochem，43：13537-13544中所述的DDAB、溴化二甲基双十八烷基铵，甲基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵，1，2-二酰基-3-三甲铵基丙烷〔包括但不限于二油酰基(DOTAP)、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、disearoyl〕，1，2-二酰基-3-二甲铵基丙烷〔包括但不限于二油酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、disearoyl〕、DOTMA、氯化N-[1-[2，3-双(油酰氧基)]丙基]-N，N，N-三甲基铵，DOGS、双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺，DC-胆固醇、3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇，DOSPA、三氟乙酸2，3-二油酰氧基-N-(2(精胺酰胺基)-乙基)-N，N-二甲基-1-丙铵，1，2-二酰基-sn-丙三基-3-乙基磷酸胆碱〔包括但不限于二油酰基(DOEPC)、二月桂酰基、二肉豆蔻酰基、二棕榈酰基、二硬脂酰基、棕榈酰基-油酰基)，β-丙氨酰基胆固醇，CTAB、溴化十六烷基三甲基铵，二C14-脒、N-叔丁基-N′-十四烷基-3-十四烷基氨基丙脒，14Dea2、氯化O，O′-双十四烷酰基-N-(三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺，DOSPER、1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙胺，碘化N，N，N′，N′-四甲基-N，N′-二(2-羟基乙基)-2，3-二油酰氧基-1，4-丁二铵，氯化1-[2-(酰基氧基)乙基]-2-烷基(链烯基)-3-(2-羟基乙基)咪唑啉鎓衍生物如氯化1-[2-(9(Z)-十八碳烯酰氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七碳烯基-3-(2-羟基乙基)咪唑啉鎓(DOTIM)、氯化1-[2-(十六烷酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟基乙基)咪唑啉鎓(DPTIM)，氯化1-[2-十四烷酰氧基乙基]-2-十三烷基-3-(2-羟基乙基)咪唑啉鎓(DMTIM)；如在Felgner等人(1994)，J.Biol.Chem.，269：2550-2561中所述的2，3-二烷基氧基丙基季铵化合物衍生物，在季胺上含有羟基烷基部分，如溴化1，2-二油酰-3-二甲基-羟基乙铵(DORI)、溴化1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基乙铵(DORIE)、溴化1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基丙铵(DORIE-HP)、溴化1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基丁铵(DORIE-HB)、溴化1，2-二油酰氧基丙基-3-二甲基-羟基戊铵(DORIE-HPe)、溴化1，2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙铵(DMRIE)、1，2-二棕榈酰氧基丙基-3-二甲基-羟基乙铵(DPRIE)、溴化1，2-二硬脂酰氧基丙基-3-二甲基-羟基乙铵(DSRIE)。许多上述脂质由市售获得，如从Avanti Polar Lipids公司、Sigma Chemical公司、Molecular Probes公司、NorthermLipids公司、Roche Molecular Biochemicals公司和Promega公司购得。

由阳离子性脂质或者阳离子性脂质与其它脂质〔特别是中性脂质如胆固醇、1，2-二酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(包括但不限于二油酰基(DOPE))、1，2-二酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，天然的蛋黄磷脂酰胆碱(PC)等，合成的单酰基和二酰基磷酸胆碱(如单酰基磷脂酰胆碱(MOPC))和磷酸乙醇胺〕混合制备阳离子性脂质体。上述二酰基衍生物还可包括合成的和天然的不对称脂肪酸和混合的制剂。

上述类型的脂质体和其它本领域熟练技术人员想到的类型可以和含有促进或抑制血管发生的物质和/或标记物的脂质体一起使用在本发明中。本发明脂质体的一个例子是含有抑制血管发生的脂溶性或水溶性的物质的阳离子性脂质体。但是，脂溶性化合物可以存在于脂质双层中。下面描述血管发生抑制剂。但是，应注意的是，本领域熟练技术人员在本发明之后将想到和/或将开发其它类型的抑制剂，以及这样的血管发生抑制剂可易于使用在本发明中。

血管发生抑制剂

肝素是血管发生的增强剂，肝素拮抗剂能阻滞血管发生反应。鱼精蛋白是一种肝素结合蛋白，具有抗血管发生特性〔Taylor等人(1982)，Nature，297：307-312〕，但在临床上并不使用，因为已知它在人体内使用后导致过敏反应。另一抗血管发生药物是肝素结合蛋白Major Basic蛋白，它也有高度毒性，因而没有用于人。但是，这些和其它抑制血管发生但被认为用于人时毒性太强的化合物因为它们在本发明中获得的高度的靶向选择性而可以以非常小的量被很好地使用。

血小板因子4(PF4)具有肝素结合活性和抗血管发生特性，并且由于它不像肝素拮抗剂那么毒，所以可以在临床上使用。如美国专利5112946中所公开的，PF4的化学修饰提高了其抗血管发生的特性。这些修饰包括用荧光素-异氰酸酯修饰它的游离氨基的PF4类似物的制备、具有特异地改变蛋白质结构组分的PF4突变体和保持其抗血管发生特性的PF4片段的制备。具体而言，相应于PF4的羧基末端的13个氨基酸的合成肽具有很强的血管抑制(angiostatic)活性。

许多类固醇已显示出能抑制血管发生。这种抗血管发生活性通过加入肝素或相关分子而得到加强〔Folkman等人(1989)，Science，243：1490-3〕。所谓的“抑制血管类固醇”如四氢可的松能在体内阻滞血管发生。具体是，6α-氟-17，21-二羟基-16β-甲基-孕-4，9-(11)-二烯-3，20-二酮已被用作有效的抑制血管的类固醇。

已发现调节胶原代谢的药物能抑制血管发生。氨基酸脯氨酸的类似物能特异地抑制体内胶原的合成和血管发生。具体是，L-氮杂环丁烷-2-羧酸(LACA)、顺-羟基脯氨酸(CHP)、D，L-3，4-二氢脯氨酸(DHP)和硫杂脯氨酸(TP)各具有抗血管发生活性，它们的抗血管发生活性依次下降〔Ingber等人(1988)，Lab.Invest.，59：44-51〕。这些类似物各种都还增强抑制血管的类固醇和肝素的抗血管发生效果。

如美国专利5192744中所述，在血小板的α颗粒中发现的糖蛋白人血小板反应蛋白以三聚物或单体或片段的形式抑制血管发生。各种形式以糖基化的形式起作用，并预期能以未糖基化的形式起作用。除去与氨基端相关的肝素结合的功能域以及在单体蛋白质的羧基端发现的血小板结合功能域后存在抑制血管发生的特性。

显示层粘连蛋白活性的肽阻滞血管发生并防止组织中过量的血管形成。具有这种活性的特定的肽是：1)酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸；2)脯氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-甘氨酸-精氨酸；3)半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸。预测这些肽以环状形式维持它们的抗血管发生活性。

抑制血管发生的物质的其它例子包括具有胶原酶活性的软骨组织的抽提物、衍生自视网膜色素内皮细胞的蛋白质〔(1985)Arch.Ophthamol.，103：1870-1875〕、由软骨培养细胞诱导的抗癌因子〔Takigawa等人(1988)，Protein，Nucleic Acid andEnzyme，33：1803-7〕、抗炎症药物如消炎痛〔Peterson等人(1986)，Anticancer Res.，6：251-3〕、核糖核酸酶抑制剂〔Shapiro等人(1987)，PNAS，84：2238-41〕、硫酸多糖和肽聚糖的复合物〔如JPA-S63(1988)-119500〕、用于关节炎的金制剂、除莠霉素A〔JPA-S63(1988)-295509〕、蛋白质METH-1和METH-2〔Vazquez等人(1991)，J.Biol.Chem.，274：23349-23357〕、烟曲霉素或烟曲霉醇衍生物。如美国专利5202352所公开的，多种烟曲霉醇衍生物具有抗血管发生活性。上述文献被纳入作为参考，以描述和公开血管发生的抑制剂。

紫杉烷

本发明还提供含有作为抗血管发生药的紫杉烷的阳离子性脂质体。这种脂质体可以抑制血管发生，并从而可用于治疗肿瘤、慢性炎症和其它与血管发生相关的疾病。

“紫杉烷”包括紫杉醇以及任何活性紫杉烷衍生物或前体药物，只要观察到所需的活性，即接触了含有紫杉烷的阳离子性脂质制剂的血管中的血管发生的抑制与不接触该脂质体的血管中的血管发生相比，至少约为2倍、更佳至少约为5倍、更佳至少约为10倍、最佳至少约为50倍以上。

本领域的熟练技术人员可采用许多已知方法容易地确定血管发生是否被抑制。这些方法包括但不限于体外或体内血管侵入合成基质以应答血管发生的促进剂(即致血管发生物质)的方法，如绒膜尿囊膜实验、角膜囊实验以及抑制内皮细胞增殖的实验。这些方法已在文献中详细地描述过，其中包括Vazquez等人(1999)，J.Biol.Chem.，274：23349-23357；和Belotti等人(1996)，Clin.Cancer Res.，2：1843-1849。

可将紫杉烷掺入脂质体的脂质双层中，可使其存在于脂质体的水层中，或者存在于两者之中。因此，在一些实施例中，本发明提供了含有阳离子性脂质和存在于脂质双层中的紫杉烷的阳离子性脂质体。在其中的一些实施例中，阳离子性脂质体在水相中还含有紫杉烷。在另一实些施例中，本发明提供了含有阳离子性脂质和存在于水层中的紫杉烷的阳离子性脂质体。可包含在水层中的紫杉烷包括水溶性紫杉烷(如亲水衍生物)。可掺入阳离子性脂质体的脂质双层中的紫杉烷包括疏水性紫杉烷和疏水的紫杉烷衍生物。

通常，本发明阳离子性脂质体制剂中的紫杉烷的比例少于约20摩尔％。在一些实施例中，阳离子性脂质体制剂含有约0.5-20摩尔％的紫杉烷，在另一些实施例中，其含量约为2-10摩尔％。在另一些实施例中，紫杉烷的含量约为1-5摩尔％，在另外一些实施例中，其含量约为1-3摩尔％。当紫杉烷以约0.5-20摩尔％、约2-10摩尔％、约1-5摩尔％以及约1-3摩尔％的比例掺入阳离子性脂质体中时，紫杉烷基本上不与脂质体的双层分离，以及/或者没有在至少约0.5小时内、通常至少约为1小时、至少约2小时、通常约至少24小时、至少约48小时的时间内，在约4EC-25EC的温度范围内基本上不形成紫杉烷结晶。可掺入更高比例的紫杉烷，只要紫杉烷基本上不与脂质体双层分离和/或基本上不含有紫杉烷结晶。含有紫杉烷的阳离子性脂质体基本上不含有“紫杉烷结晶”，即通常少于约10％、一般少于约5％、常常少于约2％、典型地少于约1％、较佳少于约0.5％的紫杉烷以结晶的形式存在于阳离子性脂质体中。紫杉烷基本上不与脂质双层分离的阳离子性脂质体是与脂质体双层分离的紫杉烷的含量通常少于约20％、一般少于10％、常常少于约5％、典型地少于约1％、较佳少于约0.5％的脂质体。

脂质体-紫杉烷制剂中的阳离子性脂质的比例通常大于约5摩尔％，一般大于约10摩尔％，更通常大于约20摩尔％。在一些实施例中，阳离子性脂质在脂质体-紫杉烷制剂中的含量约为20-99摩尔％。在另外一些实施例中，阳离子性脂质的含量约为30-80摩尔％，在另外一些实施例中，其含量约为40-98摩尔％，在另外一些实施例中，其含量约为40-60摩尔％。上面描述了适用于输送紫杉烷的脂质体组成。紫杉烷也可连接在疏水的有机部分，如脂肪酸、磷脂等，并被掺入脂质体中。已描述了这种紫杉烷衍生物，并且它们适用于本发明中。例如参见美国专利5580899。已描述过含有紫杉醇的磷脂酰胆碱制剂(美国专利5683715)。

含有紫杉烷的阳离子性脂质体制剂对进行生血管内皮细胞(即生血管内皮细胞)有较高的亲和力，优先与其结合并被其摄入，即生血管内皮细胞摄入这种含有紫杉烷的阳离子性脂质体(这样紫杉烷就能进入该细胞中)的量是非生血管内皮细胞摄入这种脂质体的量的至少约2倍、较佳约5倍、更佳约10倍以上。这个比较通常是在细胞-细胞的基础上进行，即在生血管内皮细胞与非生血管内皮细胞的摄入之间进行直接的比较。作为一个实施例，在离体条件下进行了生血管内皮细胞和非生血管内皮细胞摄入比的测定实验，如细胞在动物体内被标记，从动物身上取出，离体检测阳离子性脂质体制剂的摄入。实施例5提供了合适的检测方法的例子。在这个实验中，用已知诱导血管发生的物质处理动物。内皮细胞与含有标记物的阳离子性脂质体/紫杉烷制剂接触，可由用于标记所有内皮细胞的标记物将内皮细胞区分开来。过了一段合适的时间后，所有的内皮细胞都标记上荧光标记。在标记内皮细胞之前、同时或之后可用固定剂灌注该动物。过了一段合适的时间之后(如约1分钟到2小时)，从动物身上取出内皮细胞，通过共聚焦显微镜直接显影，比较含有阳离子性脂质体/紫杉烷制剂相关标记物的内皮细胞的比例与不含有阳离子性脂质体/紫杉烷相关标记物的内皮细胞的比例。通过这种方法，可在生血管内皮细胞和非生血管内皮细胞的摄入之间进行直接的、细胞对细胞的比较。如实施例中所述，可采用任何已知的方法确定阳离子性脂质体是否优先被特定的细胞所摄入，这些方法包括标记的脂质和荧光显微镜的使用。涉及例如测量整个组织的匀浆的摄入的方法一般不佳，因为非内皮细胞的高比例存在可减少信号与背景的比例，从而不能准确反映生血管内皮细胞和非生血管内皮细胞的摄入之间的差异。

可将中性脂质掺入阳离子性脂质体制剂中，并且当存在中性脂质时，其比例可以约为1-80摩尔％，通常约为2-50摩尔％，一般约为40-50摩尔％。可掺入任何中性脂质，包括但不限于磷脂酰乙醇胺(包括但不限于DOPE)、磷脂酰胆碱(包括但不限于蛋PC、DOPC和MOPC)。也可包括磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的混合物。

含有紫杉烷的阳离子性脂质体还可包括可检测的标记物，如本文所作的详细描述，大量的这种标记物在本领域中是已知的。

实施例5提供了显示含紫杉醇的阳离子性脂质体靶向生血管内皮细胞的实验数据。因此，在一些实施例中，本发明提供了含有紫杉醇的阳离子性脂质体。在这些实施例中，一些实施例的阳离子性脂质体含有约20-99摩尔％、约40-70摩尔％、约50-60摩尔％的1，2-二油酰基-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)。一些实施例的阳离子性脂质体含有摩尔比为50∶47∶1∶2的DOTAP∶蛋磷脂酰胆碱(PC)∶若丹明∶DHPE∶紫杉醇。在一些实施例中，阳离子性脂质体含有摩尔比为50∶48∶2的DOTAP∶蛋PC∶紫杉醇。在一些实施例中，阳离子性脂质体含有摩尔比为50∶47∶3的DOTAP∶DOPC∶紫杉醇。在另外一些实施例中，阳离子性脂质体含有摩尔比为50∶47∶3的DOTAP∶DOPE∶紫杉醇。在另外一些实施例中，阳离子性脂质体含有摩尔比为50∶47∶3的DOTAP∶MOPC∶紫杉醇。

紫杉醇通过结合于微管蛋白起到稳定微管结构的作用。在分裂的细胞中，这可导致形成异常的有丝分裂纺锤体。另外，紫杉烷还可以具有抗血管发生活性〔Belotti等人(1996)，Clin.Cancer Res.，2：1843-1849；和Klauber等人(1997)，Cancer Res.，57：81-86〕。本发明的阳离子性脂质体可含有抑制血管发生的任何物质〔包括但不限于紫杉烷(包括但不限于紫杉醇)〕和上述任何血管发生的抑制剂。因此，一些实施例提供了阳离子性脂质体组分，该组分包括紫杉烷和一种或多种其它抗血管发生物质。

紫杉醇是高度衍生化的双萜类〔Wani等人(1971)，J.Am.Chem.Soc.，93：2325-2327〕，已从收获的和干燥的Taxus brevifolia(短叶紫杉)树皮和Taxomycesandreanae(短叶紫杉的内部寄生真菌)中获得〔Stierle等人(1993)，Science，60：214-216〕。采用本领域熟练技术人员周知的技术可以容易地制备“紫杉醇”(参见WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO 93/23555、WO 93/10076，美国专利5294637、5283253、5279949、5274137、5202448、5200534、5229529和EP590267)，或者从各种商业途径获得，例如包括从Sigma Chemical公司，St.Lousi Mo.(从短叶紫杉得到的T7402，或者从云南紫杉得到T-1912)购得，本文所称的“紫杉醇”应该认为包括类似物、制剂和衍生物，例如多西他赛(docetaxel)、TAXOLJ、TAXOTEREJ(多西他赛的制剂)、紫杉醇的10-去乙酰基类似物和3′N-去苯甲酰基-3′N-叔丁氧基羰基类似物。

应认为紫杉醇不仅指普通的化学上可获得的紫杉醇，还包括类似物〔如上述紫杉特乐(taxotere)〕和紫杉醇结合物(如紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。

术语“紫杉烷”还包括大量的已知的衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请WO 99/18113中所述的半乳糖和甘露糖衍生物，WO 99/14209中所述的哌嗪基类和其它衍生物，WO 99/09021、WO 98/22451和美国专利5869680中所述的紫杉烷衍生物，WO 98/28288中所述的6-硫代衍生物，美国专利5821263中所述的次磺酰胺衍生物以及美国专利5415869中所述的紫杉醇衍生物。还包括紫杉醇的前体药物，包括但不限于WO98/58927、WO 98/13059和美国专利5824701中所述的那些药物。

术语“紫杉烷”中还包括紫杉烷的药学上可接受的盐。

可将紫杉烷的混合物掺入阳离子性脂质体中。此外，含有紫杉烷的阳离子性脂质体还可掺入一种或多种其它药学活性化合物，这些化合物包括但不限于抑制血管发生的药物(如除紫杉烷外的药物)和抗癌药。

可从自然来源中分离得到紫杉烷，可化学合成紫杉烷，或者可从商业途径中购得紫杉烷。化学合成的方法在本领域中是周知的，如参见美国专利5580899。

血管发生因子

大量的生物化合物刺激血管发生。在小鸡CAM和兔角膜中，血管生成素已证明为强血管生成因子。从外周血单核细胞分离得到的angiotrophin，是已提出的在正常的伤口愈合中起作用的另一种血管生成化合物〔Biochemistry，27：6282(1988)〕。其它涉及伤口愈合的因子如血纤维蛋白，也诱导血管形成。

血管发生的另一类介体是多肽血管形成因子(如生长因子)，这类因子包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、α-转化生长因子(TGF-α)和血小板相关生长因子(PDGF)。这些分子各自已显示能在体内诱导血管生成。具有血管生成活性的其它类似分子是血管内皮生长因子(VEGF)、α-肿瘤坏死因子(TNF-α)、β-转化生长因子(TGF-β)和肝素结合生长因子(HBGF)。

除了多肽血管形成因子外，还描述了其它血管形成因子。脂质衍生的血管形成因子前列腺素E1和E2是周知的具有血管形成特性的炎症细胞吸引剂〔(1982)，J.Natl.Cancer Inst.，69：475-482〕。在小鸡角膜或在小鸡CAM实验中，烟酰胺引起血管形成反应〔Science，236：843-845(1987)〕。

可检测的标记物

可使用本发明的阳离子性脂质体输送任何一种可检测的标记物。标记物在用来制备脂质体的脂质中是可溶的，或者它们在水或水溶液中(如盐水或葡萄糖水溶液)是可溶的，或至少是可分散的。标记物可以是放射性标记物、荧光标记物、组织化学上或免疫组织化学上可检测的物质，或者是可检测的染料，或者是任何可通过磁共振成象检测到的物质。标记物可以以任何适当的量存在，并且可包括在脂质体中，或者本身或者与抑制或促进血管发生的物质一起与脂质体形成复合物。

剂量

给予患者(可以是循环系统中内皮细胞在发生血管的任何动物)的血管生成抑制剂或促进剂的量随着许多因素改变。例如，相对于小动物，给人提供相当大的量是必要的。血管生成抑制剂或促进剂的量将依赖于患者的大小、年龄、性别、体重和症状以及所给予的药物的效力。在已得知剂量存在相当大的变异的情况下，本领域熟练的技术人员使用本公开，首次给予非常小的量、接着逐渐增加剂量直到获得所需的效果，这样可容易地确定适当的剂量。虽然剂量将在上述因素的基础上有相当大的变化，但是，总的来说，本发明使得给予与靶向周围组织(如靶向肿瘤相比本身)的输送系统来说数量少得多的任何物质成为可能。

核苷酸序列/阳离子性脂质体复合物

当包括DNA和RNA序列的核苷酸序列与脂质混合时，两者形成了复合物。通过选择特定量的核苷酸序列和脂质并且选择具体的脂质，就有可能形成体外不聚集的复合物。涉及这些复合物的形成的一般信息在PCT出版物WO93/12240(1993年6月24日发表)中有所描述，该文被完整地纳入来具体地公开和描述核苷酸序列/脂质复合物的形成。在本发明中，核苷酸序列经特别设计，用来影响生血管内皮细胞而不影响其它的细胞，并且明确不影响其它的相应的内皮细胞，即静止内皮细胞。用在本发明中的DNA序列可适当连接在启动子上，这些启动子经特别设计，这样该核苷酸序列仅仅在生血管内皮细胞的环境中表达。首先，启动子可以是可激活的启动子，它在该序列被输送到生血管内皮细胞之后被激活。更佳的是，将该启动子设计成是在生血管内皮细胞的特定环境中被激活的启动子。在生血管内皮细胞的环境中有许多自然发生的现象，这些现象在静止内皮细胞的环境中不发生。利用这两种类型细胞之间的差异，可将启动子特别地设计成仅在生血管内皮细胞存在时被激活的启动子。

使用特定的基因启动子，可将DNA盒的转录限制在单一的或范围有限的细胞类型中。内皮细胞选择性地表达几种蛋白质，这些蛋白质的基因和它们的启动子已内阐明。已显示，血管内皮生长因子(VEGF)受体flt-1和flk-1基因启动子、vonWillibrand因子(VWF)基因启动子和tie家族基因启动子在连接到报道基因构建上时在内皮细胞中进行直接的选择性表达。引用下述出版物来公开和描述在生血管内皮细胞中被激活的启动子。

Hatva等人(1996)，Am.J.Path.，148：763-75；Strawn等人(1996)，Cancer Res.，56：3540-5；Millauer等人(1996)，Cancer Res.，56：1615-20；Sato等人(1996)，Nature，376：70-4；Ozaki等人(1996)，Human Gene Therapy，13：1483-90；Ronicke等人(1996)，Circulation Res.，79：277-85；Shima等人(1996)，J.Biol.Chem.，271：3877-8；Morishita等人(1995)，J.Biol.Chem.，270：27948-53；Paterson等人(1995)，J.Biol.Chem.，270：23111-8；Korhonen等人(1995)，Blood，86：1828-35。另一有用的方法涉及在内皮细胞中表达单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)，以及接着用前体药物更昔洛韦进行治疗〔Ozaki(1996)〕。

或者，核苷酸序列可以是反义序列，它将结合到必须在生血管内皮细胞中表达的序列上，从而阻滞生血管内皮细胞的天然存在的序列的表达，这种表达对于该细胞的存在来说是必要的。

凝块的形成

本发明可以使用脂质体或核苷酸序列/脂质复合物实现的另一方面，涉及血凝块的形成。具体而言，设计本发明的脂质体或复合物，使其对生血管内皮细胞产生作用，从而导致在该正在发生的血管中产生血凝块。血凝块阻止了营养物和氧流到该血管的剩余部分，引起该血管和周围组织的死亡。

已使用针对肿瘤血管的抗体实现为除去不希望有的肿瘤而在肿瘤血管系统中形成凝块的基本概念。本发明能使用含有促进血栓形成级联的药物的阳离子性脂质获得改进的效果。例如，可构建含有人组织因子(TF)的本发明的阳离子性脂质体，该因子是血栓形成(血液凝固级联)的主要启动蛋白质。

肿瘤细胞依赖血液供应。局部的肿瘤血管中断将导致大量的肿瘤细胞的死亡。肿瘤血管内皮直接与血液接触。但是，肿瘤细胞自身在血流之外，且细胞绝大部分不易于接近注射到循环系统中的许多物质。本发明的这方面和其它方面能特别好地起作用，因为它们靶向的细胞是自身不转化的生血管内皮细胞，即这些细胞是不可能获得使之对治疗出现抗性的变异的细胞。肿瘤细胞发生相当多的突变，这些突变常常使该细胞对治疗产生抗性。其他人已讲到利用抗体介导的靶向减少肿瘤大小所获得的结果：Burrows和Thorpe(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8996-9000；和Huang等人(1997)，Science，275：547-550。

为了实现本发明的凝块形成，较佳的是形成DNA/阳离子性脂质复合物。该复合物将包括编码某种蛋白质〔如人组织因子，这种蛋白质是血栓形成(血液凝固)级联的主要启动受体〕的DNA。编码TF的基因较佳是操作性地连接在一启动子上，该启动子在生血管内皮细胞中激活而在静止内皮细胞的环境中不被激活。因而，复合物的阳离子性脂质将引起该复合物与生血管内皮细胞结合。之后，该复合物将被带进该生血管内皮细胞中，复合物中的DNA将被表达。表达的蛋白质将启动血液凝结级联。当在血管中形成血液结块时，供应给周围肿瘤细胞的氧和营养物将进一步被切断。之后，肿瘤细胞死亡。也可利用人组织因子的变异〔如截短的人组织因子(tTF)〕启动凝块过程。编码tTF和其它因子的遗传物质是已知的(参见上述引用的Huang等人的文献以及那里所引用的出版物)。

减少动脉粥样硬化斑块的方法

本发明还提供减少哺乳动物动脉粥样硬化斑块的方法，该方法包括给予哺乳动物一种含有阳离子性脂质和减少血管发生的物质的组合物，使该组合物与正在生成血管的生血管内皮细胞结合一段时间，并且以组合物进入该生血管内皮细胞中的方式结合，其中，该物质起到减少血管发生的作用，血管发生的减少引起动脉粥样硬化斑块的形成的减少。本文别处详细讨论了抑制血管发生的物质。

术语“动脉粥样硬化”在本领域中是周知的，指导致平滑肌细胞和脂质的逐渐堆积在内膜中的大动脉和中等大小动脉的疾病。病灶(斑块)的连续生长蚕食了动脉壁的其它层，并使管腔变窄。本文所用术语“减少动脉粥样硬化斑块”指当给予具有这种病灶的哺乳动物以本发明含有血管发生抑制剂的阳离子性脂质体时，与使用不含有抗血管发生药的阳离子性脂质体进行治疗的对照哺乳动物中的动脉粥样硬化斑块相比，其动脉粥样硬化斑块或病灶的大小至少减少约10％，更佳至少减少约25％，更佳至少减少约50％，更佳至少减少约75％，最佳至少减少约90％以上。在一些实施例中，动脉粥样硬化斑块完全消失。因此，对于在减少个体动脉粥样硬化斑块的方法中使用的抑制或减少血管发生的物质，其“治疗有效量”或“有效量”是，当给予个体时，该个体的动脉粥样硬化斑块与没有接受该物质的对照受试者形成的斑块相比，其大小至少减少约10％，更佳至少减少约25％，更佳至少减少约50％，更佳至少减少约75％，最佳至少减少约90％以上。

可采用任何已知的方法(包括美国专利5807536中所述的那些方法)、血管造影术(将血管插入血管中，使用造影剂如基于碘的染料使血管成象)以及使用血管内超声波探针成象技术确定动脉粥样硬化斑块是否已缩小。在动物实验中，可目视检查血管切片上斑块大小的减少。例如参见Moulton等人(1999)，Circulation，99：1726-1732。

在一些实施例中，本发明的方法使动脉粥样硬化的一种或多种后遗症减少。因此，本发明提供了一种减少动脉粥样硬化相关疾病病症的方法，这些病症包括但不限于局部缺血性心脏病、心肌梗塞、再狭窄、中风和外周血管疾病。可采用常规的方法(这些方法包括但不限于心电图测定)和本领域中其它标准方法确定一种或多种这样的疾病是否已减少。

本发明减少动脉粥样硬化斑块的方法可用于预防、抑制或减少通过本发明方法或其它方法(如气束血管成形术或冠脉分流术)已被去除的斑块重新发生(重新形成)的可能性。因此，在一些实施例中，该方法包括从患者循环血管中除去动脉粥样硬化斑块的步骤；以及给予该患者含有阳离子性脂质体和抑制血管发生的活性组分的治疗有效量的组合物。可在去除患者的斑块之前、期间或之后给予该由阳离子性脂质体和抑制血管发生的活性成分组成的组合物。

上述阳离子性脂质体中的任何一种或者由阳离子性脂质体组成的制剂，和任何已知的血管发生抑制剂(包括本文所述的)都可以使用在减少动脉粥样硬化斑块的方法中。可使用药学上可接受的赋形剂配制血管发生抑制剂-阳离子性脂质。药学上可接受的赋形剂在本领域中是周知的，并且在Remington：The Science andPractice of Pharmacy〔1995或最新版本，Mack Publishing Co.，Easton，PA〕中有详细的描述。

血管发生的实验模型

使用啮齿动物血管发生模型使本发明易于进行。慢性炎症疾病如哮喘和支气管炎引起气道粘膜中组织和血管的改变。为了研究慢性气道炎症的病理，使用了大鼠和小鼠气管中发生慢性炎症和组织改变的模型。肺支原体感染导致气道粘膜中血管生成。在这个模型中，肺支原体导致气管和支气管上皮的持久的感染。受肺支原体感染的大鼠气道粘膜具有几个明显的异常：1)上皮和固有层增厚；2)上皮的细胞成分改变；3)血管发生；4)正在发生的血管对炎症介质P物质的敏感性(根据血浆泄漏)增加；5)P物质诱导的毛细血管以及小静脉泄漏；和6)毛细血管内皮细胞上P物质受体(NK1受体)数的增加。在这个模型中，血管发生由慢性炎症驱动，血管对炎症介质较敏感。

采用灌注外源凝集素以使管腔的内皮细胞表面染色的研究揭示了大鼠在受肺支原体感染后血管发生的程度。在感染大鼠的气管粘膜中存在大量的毛细血管样血管，这些血管在静脉注射炎症介质P物质后发生泄漏。

在小鼠中，肺支原体导致急性肺部炎症，这在接种后6-9天达到最高点，接着在气道产生持久的感染。小鼠对肺支原体感染的反应非常依赖于品系，例如，C3H品系的小鼠比C57BL品系的小鼠显示出较高的死亡率和细胞因子α-肿瘤坏死因子的较大减少。已描述感染支原体的小鼠气道中粘膜改变的一些方面(如上皮增生)。在经鼻接种肺支原体的C57BL/6小鼠中，气管血管增加的量让人惊讶，这些血管明显地经由新的毛细血管生长。在这个品系中，气管粘膜的血管系统不再平坦，小的血管垂直于粘膜平面垂直生长。在血管分布的增加区域发现大量明显的血管小分支。因而，肺支原体引起的C57BL/6小鼠的感染产生了伴有内皮增生、血管重建和血管发生的慢性气道炎症。相反，在经鼻接种肺支原体的C3H/HeN小鼠中，气管粘膜中血管内皮细胞的量有所增加，但是血管的量没有增加。血管分布增加的原因不是因为血管的长度或数量的增加，而是因为血管直径增加，并且这种血管大小的增加是内皮细胞数倍增加导致。受感染的气管中单个内皮细胞的大小并未显著增加。两个品系小鼠中针对肺支原体的循环抗体的水平类似。因而，肺支原体引起的C3H/HeN小鼠的感染产生慢性气道感染伴血管改变以及内皮增生，但并未显著地增加血管的数量，而C57BL/6小鼠产生内皮增生和新的血管。

在第二个模型中，肿瘤中出现血管发生，这由SV40病毒致癌基因的转基因表达所致。“RIP-Tag”转基因小鼠模型提供了研究在从正常组织到肿瘤得到很好鉴定的进程中血管发生内皮细胞表型变化的机会。在“RIP-Tag”转基因小鼠模型中，来自SV-40病毒的致癌基因大的T抗原(Tag)由大鼠胰岛素启动子(RIP)的一个区域驱动。当将该构建物插入鼠的基因组中时，它诱导Tag在胰岛β细胞中特异地表达，该细胞位于分散在整个胰腺的大约400个小岛中。这些小鼠的所有胰岛都表达Tag，但是，这些小岛直到约6周龄才正常发育。过了这个时间，约50％的小岛成为增生性的。但是，在这些增生的小岛中，有小部分(＜5％)经过约10周后发展成肿瘤。当小岛获得诱导血管发生的能力时，肿瘤发生的这个瓶颈似乎得到克服：因此将肿瘤发生的这个时期称为“血管发生的转换(angiogenic switch)”。类似的血管发生的转换也存在于鼠肿瘤发生的其它模型以及几种人肿瘤中。因而，“RIP-Tag”模型提供了检测肿瘤中血管发生进展的经很好鉴定的框架。

                            实施例

给出下述实施例，是为了给本领域的熟练技术人员提供怎样制备阳离子性脂质体和实施使用这些脂质体的方法的完整的公开和描述，这些实施例并不是对本发明所认为的范围的限制。已尽力确保所使用的数据(如数量、温度等)的准确性，但是应该考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。应注意的是，下面各实施例代表了用这些步骤进行的许多实验，结果被概括了。本领域熟练技术人员将会正确理解，并不是每个实验提供阳性(positive)结果。但是，可以认为下述实施例准确地传达了所获得的结果。

实施例1：阳离子性脂质体在正常小鼠中的分布

标记脂质体和/或质粒DNA，测定静脉内注射后不同时间标记的复合物的细胞分布。使用两种性别的无病原体的小鼠(体重20-25g)进行实验。

由阳离子性脂质DDAB或DOTAP与中性脂质DOPE或胆固醇制备阳离子性的小单层囊脂质体，用得克萨斯红或红荧光羰花青染料DiI或CM-DiI标记，在一些例子中，将该脂质体与含有报道基因(如荧光素酶或β-半乳糖苷酶)的质粒DNA复合。用发荧光的植物外源凝集素荧光素-Lycopersicon esculentum标记内皮细胞。用荧光珠(Duke，500nm)标记单核细胞/巨噬细胞。用DAPI、YO-PRO或Hoechst33342染料标记细胞核。

将最多300μl的含有10-60μgDNA的荧光性脂质体或脂质体-DNA复合物通过尾静脉注射到未麻醉的小鼠中。一些实验在注射复合物后注射500nm的荧光珠。之后5分钟到24小时，用戊巴比妥钠麻醉动物，然后从左心室灌注固定剂(1％的低聚甲醛在磷酸盐缓冲的盐水中)，接着灌注荧光性外源凝集素，以标记血管系统的内皮表面。灌注结束后，取出组织，或者整体制成切片，或者使用Vibratome或组织切片机)将其切成切片。另外，用一些样品进行电子显微镜观察。用表面荧光(epifluoresence)显微镜或共聚焦显微镜检测组织。另外，使用透射电子显微镜检测一些样品。

结果：在注射后5分钟到24小时内检测的小鼠中，CM-DiI或DiI-标记的脂质体或脂质体-DNA复合物在肺中的量最丰富。而且，它们的大多数在肺泡毛细血管的内皮细胞中。肺泡毛细血管中的荧光均匀分布在两肺的所有叶中。另外，一些CM-DiI或DiI荧光出现在血管内的单核细胞/巨噬细胞中。

在肺之后，肝和脾有最大量的标记的脂质体或复合物。在这些组织中，CM-DiI或DiI荧光与荧光珠停留在相同的地方。在肝中，CM-DiI或DiI荧光和荧光珠存在于枯否细胞中。在脾中，它们存在于巨噬细胞中。

卵巢中同样有血管被CM-DiI或DiI-标记的脂质体或复合物明显标记。具体而言，静脉内注射后，小鼠卵巢的大卵泡和黄体正在发生的血管的内皮细胞贪婪地摄入CM-DiI或DiI标记的DDAB：胆固醇脂质体或脂质体-DNA复合物。将这些观察结果拍照记录下来(图1)。其它的卵巢血管含有相对少的标记的复合物。利用这些结果推论，血管发生内皮细胞优先摄入脂质体和脂质体-DNA复合物，即实验中使用的阳离子性脂质体更有可能与进行血管生成的内皮细胞而非不进行血管生成的内皮细胞结合。

小肠的淋巴结和派伊尔淋巴集结的高内皮小静脉的内皮细胞中也含有非常丰富的标记的脂质体或复合物，虽然它们在这些淋巴器官的毛细血管的内皮细胞中分布稀少。在垂体前叶、心肌、膈、肾上腺皮质和脂肪组织的毛细血管内皮细胞中也发现大量的标记的脂质体或复合物。

附着在膀胱、子宫和输卵管的小静脉上的单核细胞/巨噬细胞含有丰富的标记的脂质体或复合物。一些小静脉含有大量的标记的单核细胞/巨噬细胞。另外，这些器官的小动脉、毛细血管和小静脉的内皮细胞有小部分被标记。

在垂体后叶、肾髓质、肠绒毛(回肠)、胰腺和肾上腺髓质的毛细血管内皮细胞中标记的脂质体或复合物相对较少。在脑、甲状腺、肾皮质、胰岛、气管或支气管中，除了个别单核细胞/巨噬细胞外，几乎所有的内皮细胞都没发现标记的脂质体或复合物。

结论：在这些研究中使用的CM-DiI或DiI-标记的DDAB：胆固醇脂质体或脂质体-DNA复合物制剂以3种主要细胞类型为目标：内皮细胞、巨噬细胞和单核细胞。脂质体或复合物的摄入有器官和血管特异性。大多数是在肺的毛细血管内皮细胞和肝与脾的巨噬细胞中被摄入。也靶向卵巢、垂体前叶、心脏、膈、肾上腺皮质和脂肪组织的毛细血管内皮细胞。卵巢摄入脂质体或复合物的血管是血管发生的位置。另外，也靶向淋巴结和肠派伊尔淋巴集结的HEV。其它器官的内皮细胞或巨噬细胞的摄入较少见且变动较大。并不靶向脑、甲状腺、肾皮质、气管和支气管的血管。

另外，实验证明，该脂质体或复合物在大多数器官中没有泄漏出其血管系统。虽然在具有不连续内皮的血管的脾的血管外细胞中发现它们，但是在其它器官它们并未渗出。

最后，大卵泡和黄体的血管贪婪地摄入阳离子性脂质体和脂质体-DNA复合物，这表明正在发生的血管的内皮细胞是优先摄入的位点。

实施例2：RIP-Tag5小鼠中DDAB：胆固醇脂质体或脂质体-DNA复合物的摄入

实施例1的结果表明，卵巢卵泡和黄体中正在发生的血管贪婪地摄入阳离子性脂质体和脂质体-DNA复合物。因此，进行实验以确定肿瘤正在发生的血管的内皮细胞是否也贪婪地摄入阳离子性脂质体或脂质体-DNA复合物。

使用转基因RIP-Tag5模型的肿瘤。参见Hanahan(1985)，Nature，315：115-22；和Hanahan和Folkman(1996)，Cell，86：353-64。在这个模型中，指定的RIP-Tag，即来自SV-40病毒的致癌基因大T抗原(Tag)由大鼠胰岛素启动子(RIP)的一个区域所驱动。当将其插入鼠基因组中时，这个构建物诱导T抗原在胰岛β-细胞中特异地表达。

这个模型一个重要的特点是，肿瘤发展的不同阶段以及由此产生的血管发生的不同阶段在每一RIP-Tag5小鼠中同时存在。虽然所有的300-400个小岛都表达T抗原，但是这些小岛开始时正常发育。然而，在6周龄时，约一半是增生性的，并且在这些增生性小岛中，小部分在10周时发展成为肿瘤。肿瘤发生似乎与血管发生一致。这种转变被称为“血管发生的转换”。Folkman等人(1989)，Nature，339：58-61；和Hanahan和Folkman(1996)，Cell，86：353-64。类似的血管发生的转换似乎存在在肿瘤发生的其它鼠模型以及几种人肿瘤中。Hanahan和Folkman(1996)，Cell，86：353-64。

使用与实施例1相同的方法和材料。具体而言，将CM-DiI或DiI-标记的DDAB：胆固醇脂质体静脉内注射到一只患肿瘤的RIP-Tag5小鼠中，将CM-DiI或DiI标记的DDAB：胆固醇-DNA复合物静脉内注射到另一只RIP-Tag5小鼠中。注射24小时后测定胰岛细胞肿瘤正在发生的血管中的脂质体或复合物的分布，将结果与正常小鼠的胰岛的血管中的分布比较。

结果：观察到两个新的结果：(1)脂质体或复合物被正在发生的血管的内皮细胞摄入，且没有泄漏出该内皮；(2)正在发生的血管的内皮细胞核内体摄入(endosomal uptake)的脂质体或复合物比胰岛的正常血管的内皮细胞摄入的多。(图2是组织样品)。

结论：这个实验得到的结果与正在发生的肿瘤血管优先摄入DDAB：胆固醇脂质体或脂质体-DNA复合物的观点一致。在重复进行该实验前，(1)增加了脂质体-DNA复合物的荧光强度；(2)改进了RIP-Tag5小鼠的肿瘤中摄入阳离子性脂质体和脂质体-DNA复合物的位点的定位方法；(3)更加熟悉RIP-Tag5小鼠胰岛细胞肿瘤中正在发生的血管的结构和功能。

实施例3：RIP-Tag2小鼠中DOTAP：胆固醇脂质体-DNA复合物的摄入

目的：使用得克萨斯红-DHPE替换DiI来增加脂质体-DNA复合物的荧光强度；改进了制备用于定位荧光性阳离子性脂质体-DNA复合物的摄入位点的RIP-Tag2小鼠的胰的方法；并研究了RIP-Tag2小鼠胰岛细胞肿瘤中正在发生的血管的结构和功能。利用这些改进进行实施例2中所述类型的实验，以确定阳离子性脂质体和脂质-DNA复合物是如何被摄入。

方法：制备用得克萨斯红-DHPE标记的阳离子性DOTAP：胆固醇小单层囊脂质体。在5％葡萄糖中，用60μg/300μl质粒DNA以24∶1(nmol/μg)的总脂质：DNA制备脂质体-DNA复合物。通过尾静脉将复合物(300μl)注射到未麻醉的转基因RIP1-Tag2 C57BL/6小鼠和未麻醉的正常C57BL/6小鼠的尾静脉中。

注射复合物4小时后，腹膜内注射戊巴比妥钠50mg/kg将小鼠麻醉。通过升主动脉灌注1％低聚甲醛，将血管系统固定，灌注绿色荧光的外源凝集素将血管系统的管腔表面染色〔Thurston等人(1996)，Am.J.Physiol.，271：H2547-2562〕。组织整个封固，或者在Vectashield中封固Vibratome切片，使用Zeiss Axiophot荧光显微镜或装备氪-氩激光和最佳的光电倍增管的Zeiss LSM 410共聚焦显微镜检测血管。在柯达Ektachrome胶片(ASA 400)上记录影像，或者将影像记录成数字共聚焦影像文件。

结果：实验清楚显示了RIP1-Tag2小鼠胰腺肿瘤中生血管内皮细胞贪婪地摄入得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇-DNA复合物。肿瘤血管对这些复合物的摄入远远超过正常胰岛中相应的内皮细胞的摄入(比较图3和4)。

易于将肿瘤从邻近的组织中区分出来，因为它们的血管受到红色荧光脂质体复合物的强烈标记。肿瘤血管系统的几何形状是可变的，从正常小岛的典型模式到致密的、曲折的、网状的窦状隙血管都显著地大于正常的小岛，并且排列得更密。在后一种情况，血管系统与黄体类似。肿瘤血管标记的强度与肿瘤的大小粗略相关。最大的肿瘤显示最强烈的标记。

小肿瘤到中等大小的肿瘤中的一些血管具有短而粗的、病灶样的动脉瘤样的突出。这些位点特别显著，因为有非常大量的得克萨斯红标记点存在，推测这些点是核内体。这些位点的得克萨斯红标记比相邻血管的大。看起来这些结构可能是毛细血管小分支。在具有致密的、复杂的血管系统的大肿瘤中没有发现这种结构，在那血管都均匀地被强烈地标记。

没有证据表明肿瘤中得克萨斯红标记的复合物的外渗。在肿瘤的血管外红细胞簇中也没有看到得克萨斯红标记的复合物。肿瘤血管系统的强烈标记与卵巢黄体发育早期的标记类似。

实施例4：肿瘤和慢性炎症中正在发生的血管对阳离子性脂质体和脂质体-DNA复 合物的摄入

目的：进行实施例3所述类型的实验，以扩展对血管发生的其它模型的观察。这些实验同样提出了对于阳离子性脂质体靶向正在发生的血管，DNA是否必须存在的问题。检测了4种动物的血管发生模型，看看是否存在正在发生的血管对DOTAP：胆固醇脂质体或脂质体-DNA复合物的优先摄入。

模型：RIP1-Tag2肿瘤模型。生产转基因C57BL/6小鼠，并在出生时通过PCR分析确定其表型。小鼠模型是上面描述的模型。

HPV肿瘤模型。生产转基因HPV(人乳头状瘤病毒)小鼠，并在出生时通过PCR分析确定其表型。使用非转基因同窝交配所得幼仔作为对照。在这个模型中，由人乳头状瘤病毒得到的致癌基因由角蛋白14启动子的某个区域驱动。当将该基因插入鼠基因组中时，这个构建物诱导HPV在表皮细胞中特异地表达。所有的转基因动物出现发育不良，伴随着胸上部和耳的皮肤中的血管发生，有一小部分发展成肿瘤。

小鼠肺支原体感染模型。这种感染导致慢性气道炎症，伴随着气道粘膜中的血管发生。麻醉(腹膜内注射87mg/kg氯胺酮和13mg/kg盐酸赛拉嗪)后，在无病原体、8周龄的雄性和雌性C3H/HeN或C57BL/6小鼠(都从Charles River获得)的鼻内接种50μl、集落形成单位为3×10⁴的肺支原体(5782C-UAB CT7株)。将无病原体的小鼠作为对照，接种无菌的肉汤。将感染和对照小鼠分别装在笼子里，用栅栏隔开。实验结束时测定对肺支原体的抗体的血清水平。注射后研究小鼠1-8周。

大鼠肺支原体感染模型。与小鼠一样，这种感染导致慢性气道疾病，这种疾病的一个特征是气道粘膜中的血管发生。麻醉(腹膜内注射40mg/kg氯胺酮和8mg/kg盐酸赛拉嗪)后，每天在无病原体、8周龄的雄性Wistar大鼠(从Charles River获得)的鼻中接种200μl的5782C4株的肺支原体，连续接种3天。用肉汤接种无病原体的大鼠，将其作为对照。将感染和对照大鼠分别装在笼子中，用栅栏隔开。实验结束时测定对肺支原体和其它病原体的抗体的血清水平(MicrobiologicalAssociates，Bethesda MD)。

方法：如实施例3所述制备阳离子性DOTAP：胆固醇脂质体，用得克萨斯红-DHPE标记。通过小鼠尾静脉注射脂质体，剂量为100μl的360nmol总脂质在5％葡萄糖中的脂质体。通过股静脉注射大鼠。在5％葡萄糖中，使用60μg质粒DNA(200-300μl)以24∶1的总脂质：DNA之比制备脂质体-DNA复合物。通过尾静脉将脂质体或复合物(200-300μl)注射到未麻醉的RIP-Tag2、HPV或肺支原体感染的小鼠中。适当时用非转基因或无病原体的动物作为对照。

在注射后20分钟或4小时后，腹膜内注射50mg/kg的戊巴比妥钠将小鼠或大鼠麻醉。通过升主动脉灌注1％低聚甲醛，将血管系统固定，灌注有绿色荧光的外源凝集素将血管系统的管腔表面染色〔Thurston等人(1996)，Am.J.Physiol.，271：H2547-2562〕。组织整体封固，或者在Vectashield中封固Vibratome切片，使用Zeiss荧光显微镜或共聚焦显微镜检测血管。

通过共聚焦显微术计算荧光性脂质体或复合物的摄入量。简言之，使用20xNA0.6透镜(Zeiss)和共聚焦针孔大小的标准设置、光电倍增管增益和激光能源在荧光素和得克萨斯红信道中的气管的嘴侧区收集焦(z)轴上相隔2.5μm的一系列12张共聚焦影像。投影分别由显示血管(荧光素-L.esculentum)和脂质体(得克萨斯红)的影像系列产生。使用共聚焦软件，在血管影像上确定面积约为200μm²的区域，然后测量脂质体影像相应区域的平均荧光。在邻近这些血管选择的区域测量其荧光来确定背景强度。每组(n＝4)测4根气管，每一气管测25根血管。使用Student检验评估差异的显著性。

如先前所述处理为进行透射电子显微镜观察而制备的组织，McDonald(1994)，Am.J.Physoil.，266：L61-L83。简言之，室温灌注主要固定剂(含3％戊二醛的75mM可卡酸盐缓冲液，pH 7.1，加1％蔗糖、4％PVP、0.05％CaCl₂和0.075％H₂O₂)5分钟，接着灌注辅助固定剂(含3％戊二醛的75mM可卡酸盐缓冲液，pH 7.1，含有0.05％CaCl₂、1％蔗糖和4％PVP)5分钟。室温使组织原位固定1小时，然后取出，于4EC放在辅助固定剂中过夜。用剃刀或组织切碎机修整组织，以锇(2％OsO₄在100mM可卡酸盐缓冲液中的溶液，pH 7.4，于4EC经18小时)后固定(post-fix)，在H₂O中洗涤(于4EC经18小时)，用乙酸双氧铀整体染色(水性，于37EC经48小时)。然后用丙酮使组织脱水，渗入，包埋到环氧树脂中。用超薄切片机切出超薄的切片，将其固定在单槽样品栅上，用Zeiss EM-10电子显微镜检测。

结果：实验揭示缺乏DNA的得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体选择性地靶向RIP1-Tag2小鼠肿瘤的血管发生内皮细胞。这与先前得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇-DNA复合物和DiI标记的DDAB：胆固醇-DNA复合物的结果类似。这个实验以及接下来的对转基因RIP1-Tag2小鼠的实验证实，增生性小岛和肿瘤正在发生的血管对阳离子性脂质体的摄入远远超过相应正常血管的摄入(图5、6、7和8)。在增生性小岛和小肿瘤的一些血管中，脂质体仅被内皮细胞的病灶区域摄入(图8)，而在较大的肿瘤中，参与摄入的范围更大(图6)。摄入的病灶区域被认为是新血管生长的可能位点(图8)。

因为阳离子性脂质体或脂质体-DNA复合物这种性质具有选择性地将物质输送到生血管内皮细胞的潜在的实际应用，所以看起来需要确定肿瘤生血管内皮细胞的这种特性是否在病态的血管发生的其它位点上的内皮细胞也具有。这个问题在实验中被提出，在该实验中，检测了感染肺支原体(导致慢性气道炎症，该疾病的一个特征是血管发生)的小鼠气管中生血管内皮细胞对得克萨斯红标记的DOTAP：胆固醇脂质体的摄入(比较图9和10)。发现慢性炎症区域中的生血管内皮细胞是异常高地摄入阳离子性脂质体的位点(图10)。具体而言，感染支原体的小鼠的气管中的血管有异常大量的摄入。正在发生的血管的共聚焦显微测量显示，感染小鼠的摄入是对照小鼠的摄入的20到30倍以上(图11)。一些正在发生的血管有100倍的摄入。对感染肺支原体小鼠的生血管内皮细胞的共聚焦和电子显微研究表明，阳离子性脂质体首先与核内体结合(图12)，然后内在化到核内体中(图13)。

类似地，阳离子性脂质体被小鼠卵泡和黄体、转基因HPV小鼠发育异常的皮肤以及有肺支原体感染引起的血管发生的大鼠的气管中正在发生的血管贪婪地摄入。

结论：这些实验证实，阳离子性脂质体和脂质体-DNA复合物优先靶向肿瘤的生血管内皮细胞和慢性炎症的位点。

实施例5：慢性炎症中正在发生的血管对含有紫杉醇的阳离子性脂质体的摄入

如实施例4所述，用肺支原体感染C3H/HeN小鼠。用无病原体的小鼠作为对照。将感染小鼠和对照小鼠分别放在笼子中，用栅栏隔开。感染7天后，将150μl由DOTAP∶蛋PC∶若丹明DHPE∶紫杉醇(50∶47∶1∶2)的小单层脂质体制剂注射到小鼠静脉内〔10mM的总脂质(包括紫杉醇)溶液，尾静脉注射150μl；每只小鼠紫杉醇总剂量为26μg〕。注射脂质体20分钟后，给小鼠静脉内注射荧光素标记的Lycopersicon esculentum外源凝集素，将整个躯体的内皮细胞染色。之后如实施例4所述立即用固定剂灌注小鼠整个血管系统。通过这种方式，阳离子性脂质体可根据其红色荧光而得以区分，血管则根据其绿色荧光而得以区分。如实施例4所述，通过共聚焦显微术分析组织切片，计算发荧光的含有紫杉醇的脂质体的摄入量。

结果：对无病原体的小鼠组织的检测显示，含有紫杉醇的阳离子性脂质体被感染小鼠气管血管中的内皮细胞贪婪地摄入。如图14所示，在未感染小鼠的气管血管中几乎没有观察到摄入。这些观察结果证实，含有紫杉醇的阳离子性脂质体具有与不含紫杉醇的阳离子性脂质体相同的靶向特性。

虽然本发明结合特殊的实施例进行描述，但是本领域中的熟练技术人员应理解，在不偏离本发明的实质精神和范围的情况下可进行各种改变以及等价物的取代。另外，具体的情况、材料、物质的组成、方法、方法的步骤可根据本发明的目的、精神和范围进行许多的修改。所有的修改都包括在文中附带的权利要求的范围内。

Claims (32)

1.含有阳离子性脂质和紫杉烷的脂质体组合物的用途，其特征在于，用于制备选择性地影响生血管内皮细胞的药剂，其中，该组合物对生血管内皮细胞的亲和力要大于其对相应的正常内皮细胞的亲和力；该组合物进入生血管内皮细胞后，与正在生成血管的生血管内皮细胞结合。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，将所述组合物注射到循环系统中，在血液中，该组合物与生血管内皮细胞的亲和力是相应的正常内皮细胞的亲和力的2倍以上。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在血液中，所注射的组合物与生血管内皮细胞的亲和力是相应的正常内皮细胞的亲和力的10倍以上，该组合物含有5摩尔％以上的阳离子性脂质，且是静脉内注射的。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述紫杉烷选自紫杉醇、多西他赛、紫杉醇的10-脱乙酰基类似物、紫杉醇的3′N-脱苯甲酰基-3′N-叔丁氧基羰基类似物、紫杉烷的半乳糖或甘露糖衍生物、紫杉烷的哌嗪基衍生物、紫杉烷的6-硫代或磺酰胺衍生物以及连接于疏水部分的紫杉烷。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述紫杉烷是紫杉醇。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生血管内皮细胞与肿瘤相关。

7.一种阳离子性脂质体，它含有：

阳离子性脂质；和

脂质体的脂质双层中的紫杉烷，其中，所述脂质体基本上不含有紫杉烷结晶，紫杉烷基本上不与脂质双层分离，其中所述脂质体含有30-98摩尔％的阳离子性脂质，2-20摩尔％的紫杉烷，所述脂质体的直径为100-400nm。

8.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体还含有可检测的标记物。

9.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体还包括存在于脂质体水层中的水溶性紫杉烷。

10.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述紫杉烷是药学上可接受的。

11.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述紫杉烷是紫杉醇。

12.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述紫杉烷是多西他赛。

13.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体含有2-15摩尔％的紫杉烷和40-98摩尔％的阳离子性脂质。

14.如权利要求7所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述阳离子性脂质体还含有中性脂质。

15.如权利要求14所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体含有1-80摩尔％的中性脂质。

16.如权利要求14或15所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述中性脂质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺以及它们的混合物。

17.如权利要求14或15所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体含有摩尔比为50∶48∶2的DOTAP、蛋磷脂酰胆碱和紫杉醇。

18.如权利要求14或15所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体含有摩尔比为50∶47∶3的DOTAP、DOPC和紫杉醇。

19.如权利要求14或15所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体含有摩尔比为50∶47∶3的DOTAP、DOPE和紫杉醇。

20.如权利要求14或15所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体含有摩尔比为50∶47∶3的DOTAP、MOPC和紫杉醇。

21.一种阳离子性脂质体，它含有

阳离子性脂质；

存在于该脂质体水层中的紫杉烷，其中，该脂质体基本上不含有紫杉烷结晶，其中紫杉烷基本上不与水性隔室分离，其中所述脂质体含有30-98摩尔％的阳离子性脂质，2-20摩尔％的紫杉烷，所述脂质体的直径为100-400nm。

22.如权利要求21所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体的直径为100-200nm。

23.如权利要求21所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体的直径为200-300nm。

24.如权利要求21所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体的直径为100-300nm。

25.如权利要求21所述的阳离子性脂质体，其特征在于，所述脂质体的直径为200-400nm。

26.含有阳离子性脂质和影响血管生成的物质的组合物的用途，其特征在于，用于制备影响血管生成的药剂，其中，所述影响血管生成的物质是紫杉烷，所述组合物与脂质体相关，并且，所述组合物对生血管内皮细胞的亲和力要大于其对相应的正常内皮细胞的亲和力；所述组合物与正在生成的血管的生血管内皮细胞结合。

27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，将所述组合物注射到循环系统中，在血液中，该组合物与生血管内皮细胞的亲和力是与相应的正常内皮细胞的亲和力的2倍以上。

28.如权利要求26所述的用途，其特征在于，在血液中，所注射的组合物与生血管内皮细胞的亲和力是与相应的正常内皮细胞的亲和力的10倍以上，该组合物含有5摩尔％以上的阳离子性脂质，且是静脉内注射的。

29.权利要求7或21所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备抑制血管生成的药剂，其中，所述组合物对生血管内皮细胞的亲和力要大于其对相应的正常内皮细胞的亲和力；所述组合物以进入生血管内皮细胞并抑制血管生成的方式靶定生血管内皮细胞。

30.如权利要求29所述的用途，其特征在于，将所述组合物注射到循环系统中，并且，在血液中，该组合物与生血管内皮细胞的亲和力是其与相应的正常内皮细胞的亲和力的2倍或以上。

31.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述组合物在血液中与生血管内皮细胞的亲和力是其与相应的正常内皮细胞的亲和力的10倍或以上。

32.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述血管生成与选自组织炎症、关节炎、哮喘、肿瘤生长和糖尿病性视网膜病的疾病相关。

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