WO2012049159A1 - Zusammensetzung zur behandlung von krebs mit kontrollierter freisetzung des wirkstoffs - Google Patents

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Bastian Budde
Kai Temming
Anna Arbuzova
Andrea Gramatica
Andreas Herrmann
Jürgen Liebscher
Nicolai Brodersen
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Definitions

  • the present invention relates to a novel composition for the treatment of cancer, which allows to release the active ingredient in the direct presence of the cells to be treated with the active ingredient.
  • the composition comprises a drug carrier in the form of a liposome comprising a disulfide group, wherein in the drug carrier is a cytostatic agent.
  • the invention also relates to a method for the localized release of a cytostatic agent.
  • Drug release drug delivery systems based on liposome carriers of about 100 nm in size are generally known in the medical arts. They are generally regarded as advantageous if a substance which is toxic to certain organs but which can be used as a medicinal agent in other places of the human body should only be released at those desired sites.
  • the abovementioned toxic substances also include so-called cytostatic agents, which, however, can also be used as medical therapeutics in the correct dosage and in application to specific, in particular degenerately diseased tissue types.
  • cytostatic agents which, however, can also be used as medical therapeutics in the correct dosage and in application to specific, in particular degenerately diseased tissue types.
  • liposome carriers is generally understood a substance group consisting of non-toxic phospholipids.
  • polymers such as polyethylene glycols, involved, which are characterized by improved stability in the circulation of treated patients, as the aforementioned polyethylene glycols form a form of steric protection around the actual Lipos omenexcellent.
  • Lipopo! Ymere a substance group consisting of non-toxic phospholipids.
  • liposome carriers are also described by J. Davidsen et al. in "Secreted phospholipase A2 as a novel enzymatic trigger mechanism for localized liposomal drug release and absorption in diseased tissue" published in Biochimica et Biophysica Acta 1609 (2003) 95 - 101. Further, J. Davidsen et al Drug carrier in F rm aforementioned liposome carrier can depend in particular with respect to their release behavior of a variety of chemical and physical parameters whose interaction is not fully understood.
  • the liposome carrier can be prepared from l, 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) and / or 1,2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] (DPPE - PEG2000) and / or 1-0-hexadecanoyl-2-hexanodecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (10-DPPC) and / or 1 -0-hexadecanoyl-2-hexanodecanoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine N- [methoxy] (Polyethylene glycol) -350] (1-O-DPPE-PEG350).
  • DPPC 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
  • DPPE - PEG2000 1,2-hexadecanoyl-
  • calcein can be included in the liposome formulation comprising 1-O-DPPC and 10 mol% of 1-O-DPPE-PEG350. Calcein is referred to as a model substance for drugs. Release of calcein may be as disclosed by J. Davidsen et al. by treatment of this liposome formulation with phospholipase A2 (PLA2). Release is by hydrolytic cleavage of either DPPC or 1-O-DPPC, or 1-O-DPPE-PEG350, which is catalyzed by PLA2 to give a lysolipid and a fatty acid.
  • PDA2 phospholipase A2
  • Davidsen also describes a possibility of using liposome formulations generally for the release of doxorubicin, which is a cytostatic. However, there is no actual disclosure regarding this issue. With that reveal.!. Davidsen et al. neither a cleavage into a hydrophobic and a hydrophilic portion nor that the liposome support can comprise a disulfide bond. In particular, J. Davidsen et al. not that in the course of a cytostatic drug is released.
  • Meng et al. is disclosed in "Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications" published in Biomaterials 30 (2009) 2180-2198 that certain disulfide-bridged polymers either in the polymeric strand or in one of its side chains are suitable for inclusion in drugs According to Meng et al., anti-cancer drugs are also used here, but the substances disclosed there always have a polymeric character because particles, ie solids, are formed from them in which the potential active substances are to be included in no case to substances with lipid character, which would be suitable for the production of liposomes.
  • the disclosed mode of action of the substances is based on the possibility of bond cleavage of the disulfide group, which either dissolves the polymers or removes the polyethylene glycol side chains attached to the polymers with the disulfide group and thus recognizes the particle after application in the patient by its immune system and degradable. Accordingly, the release from the drug carrier according to the disclosure of Meng et al. either upon dissolution of a solid by cleavage of polymeric bonds or through degradation of the solid by the patient's immune system after the particle has become recognizable to them. In no case will the drug be released directly.
  • lipid compositions consist of a hydrophobic "tail group” and a hydrophilic "head group”, wherein the latter hydrophilic "head group” is covalently attached to the hydrophobic "tail group".
  • hydrophilic "head group” a distinction is made between a first and a second region, these two regions being linked by a disulphide group which can be cleaved, for example by glutathione
  • the first region of the hydrophilic "head group” bears, according to WO 2000/059474 AI at physiological pl 1 a positive charge and the second region carries at physiological pH a negative charge.
  • the first region is covalently attached to the hydrophobic "tail group.”
  • the chemical formula of the abovementioned lipid compositions generally disclosed according to WO 2000/059474 A1 is X-Y-S-S-Z.
  • the chemical group X forms the abovementioned hydrophobic " Tail group "and Y, and Z is the first or second region of the hydrophilic head group.
  • the chemical group X as a hydrophobic "tail group” may be a group which is substantially similar to the glycerin body of a fat and to which the chemical group Y is attached via a further chemical group W is tethered.
  • the chemical group W can be selected from the list consisting of CUR -,. NR 3 + (R 3) 2, O, S, C (0) NH, NH (CO), OC (0) NH and OP (0) (OR 3) 0th
  • the chemical group R 3 further contained in the chemical group W may be hydrogen or a C 1 -C 4 alkyl radical.
  • the chemical uppe G Y can be a C 1 -C 12 Alklrest, a C 2 -C 2 -C be 2 alkenyl or C 2 alkynyl group having substituents in the form of alkyl radicals, amino radicals, aminoalkyl radicals, Guanidinresten, Guadininalkylresten, amido or Amidoalkylresten, wherein the aforementioned alkyl, alkenyl or alkynyl radicals of the chemical group Y can be further interrupted by NR 3 , + (R 3 ) 2 , C (O), NHC (H), C (NH) NH, NHC (NH) NH , Alternatively, the chemical group Y may also be an amino acid residue or a peptide.
  • the chemical group Z can be a C 1 -C 2 -alkyl radical, alkenyl radical or an alkynyl radical which in turn is substituted by alkyl radicals, carboxyl radicals, carboxyalkyl radicals, amino acid radicals, peptides, oligonucieotides or so-called "target molecule radicals" can be.
  • the abovementioned chemical groups X, Y and Z must in any case be designed so that the groups X and Y in their entirety have a positive charge at physiological pH and the group Z has a negative charge at physiological pH. Accordingly, in the cleavage of substances of the formula X - Y - S - S - Z on the disulfide group according to WO 2000/059474 Al a group of the type X - Y - S, which is positively charged and a chemical group of the type S Z that is negatively charged.
  • the group of the species XYS by virtue of the fact that it still comprises the "hydrophobic tail group" and a positive charge, is a chemical group which has amphiphilic properties, ie which is hydrophobic in one region and hydrophilic in a region .
  • Group of the type S - Z is due to their negative charge, and by the fact that it comprises a Ci-C 2 alkyl, alkenyl or alkynyl either also amphiphilic or even - particularly short in the case of alkyl radicals, alkenyl radicals or alkynyl radicals - only hydrophilic.
  • WO 2000/059474 AI further discloses that the aforementioned substances for the production of
  • Liposomenträgem are suitable by means of which a targeted release of substances can take place at a site of action. The release is based on the chemical cleavage of the disulfide group.
  • WO 2000/059474 Al also discloses the use of the local liposome carriers for the release of cancer drugs in general. However, WO 2000/059474 A1 does not disclose that a cleavage of a previously amphiphilic substance into a hydrophilic and a hydrophobic fraction can be achieved.
  • the cytostatic agents used in the treatment of cancers are not selective in their cytostatic effect. Thus, this effect generally unfolds both to healthy cells and to the diseased tissue.
  • the cytostatic effect on the healthy cells is a serious side effect of these agents.
  • the patient is often treated with a larger dose of cytostatics than would require the actual tumor disease, as ensured It must be ensured that the amount of active substance administered to the patient still reaches the site of action (the tumor) in sufficiently large doses.
  • the cytostatic side effect on the healthy cells in the determination of the necessary dosage is included in so far as that it is assumed that a part of the cytostatic agent unfolds its effectiveness against healthy lines and thus is no longer available for the effect against the tumor tissue , Accordingly, the above-mentioned side effects in such cases are an intrinsic part of the therapy.
  • Another object is to provide a method for the release of a cytostatic agent which is suitable for the targeted treatment of, for example, tumor diseases, in that the cytostatic agent is released rapidly and as quantitatively as possible only in the immediate vicinity of the site of action of the human body.
  • composition comprising a drug carrier in the form of a liposome containing a cytostatic agent, characterized in that the drug carrier at least one substance according to the formula (I)
  • the at least one substance according to foi (a) in X has a chemical group comprising at least five carbon atoms and comprising at least one ether group and / or amine group or ammonium group, and wherein
  • n and m are independently a natural number from 1 to 30, but the sum of n and m is at least 16 found.
  • the substances according to the formula (I) in the composition according to the invention that they have in the radicals having 1 to 30 carbon atoms chemical groups which have hydrophobic properties and at the same time cause sterically that when introducing the substances according to the formula (I) in a polar medium, these substances arrange themselves so that these hydrophobic chemical groups are arranged inwards, away from the polar solvent, these form optionally with other substances of the same or similar properties liposomes when introduced into polar solvents, such as water.
  • the introduction of the substances according to the formula (I) into a polar medium means that these substances arrange themselves in such a way that the formation of spherical structures in the form of liposomes occurs.
  • lipid double Schichlites wherein the hydrophilic chemical groups X of the substances according to the formula (I) both outside and inside towards the polar solvent, which may also be located in the interior of the aforementioned spherical structures, while the hydrophobic chemical groups Both layers are oriented inside the lipid bilayer.
  • the hydrophilic chemical groups X of the substances according to the formula (I) both outside and inside towards the polar solvent, which may also be located in the interior of the aforementioned spherical structures, while the hydrophobic chemical groups Both layers are oriented inside the lipid bilayer.
  • the cytostatic dissolved in the polar medium, which thus, as long as the lipid bilayer is stable, they can not leave and thus can also develop no cytostatic effect against cells located in the vicinity of the composition.
  • the substances according to the formula (I) in the composition according to the invention are selectively cleavable on the envisaged disulfide group, so that hereinafter a hydrophilic chemical group consisting of the chemical group X and a sulfur radical, and a hydrophobic chemical group comprising the radicals with 1 arise up to 30 carbon atoms.
  • a hydrophilic chemical group consisting of the chemical group X and a sulfur radical
  • a hydrophobic chemical group comprising the radicals with 1 arise up to 30 carbon atoms.
  • the radicals with n, m carbon atoms according to the formula (I) are usually saturated hydrocarbon radicals, as also shown in the formula (I).
  • the radicals with n, m carbon atoms can also be monounsaturated or polyunsaturated radicals.
  • the radicals with n, m carbon atoms can also have one or more double and / or triple bonds.
  • the formula (I) is not to be understood in terms of the hydrocarbon radicals having n, m carbon atoms shown therein, in that these radicals are exclusively saturated hydrocarbon radicals with n, m carbon atoms.
  • the chemical group X in preferred embodiments comprises at least eight carbon atoms.
  • the chemical group X also comprises at least one carboxylic acid ester group in addition to the at least one ether group and / or amine group or ammonium group. It is particularly preferred if the chemical group X comprises either at least two ether groups or at least one amine group or ammonium group and at least two carboxylic acid ester groups.
  • the at least one amine group or ammonium group of the chemical group X of the substances according to the formula (I) in the active substance carriers of the composition according to the invention is a quaternary ammonium group.
  • the substance according to the formula (I) in the composition according to the invention carries at least one positive charge and is present in combination with at least one singly or multiply negatively charged counterion.
  • counterions may be, for example, halogen ions, such as chloride, bromide and / or iodide, but also any other counterions with negative charges.
  • the chemical group X of the substances according to the formula (I) in the composition according to the invention comprises at least three ether groups.
  • the chemical group X is attached via a carboxylic acid ester group to a chemical group Y according to the further preferred embodiment described below.
  • the chemical group X which then more preferably contains only one amine group or ammonium group, is also preferred via this amine group or ammonium group to the rest of the substance according to Tied to formula (I).
  • This embodiment is particularly advantageous because the amine group or ammonium group and the at least three ether groups in their entirety result in a particularly hydrophilic property of the chemical group X.
  • the substances according to the formula (I) in the chemical group X also include therein a phosphate group.
  • the active substance carrier in the form of a liposome which contains a cytostatic agent can also comprise at least one substance according to the formula (I *)
  • the chemical group Y is a chemical group selected from the list consisting of biotin, protein, peptide, glyco group, nucleic acid, nucleoside or nucleotide and wherein X, n and m are the meanings as in Formulas! (I) or in the preferred variants described above.
  • the chemical group Y is biotin in the preferred embodiment of the present invention.
  • the Y chemical group is biotin
  • it may be attached to the X chemical group by either an amide bond or via a carboxylic acid ester group.
  • the chemical group Y may be attached to the chemical group X terminal or as
  • the chemical group Y serves for the (bio) chemical identification.
  • biotin according to the preferred embodiment (bio) chemically clear by streptavidin, can attach to this another chemical and / or biological group, the substance according to the formula (I *) more gives (bio-) chemical properties.
  • an antibody conjugated to streptavidin can be bound to the biotin.
  • only streptavidin can be bound to the biotin and an antibody conjugated to biotin can in turn be bound to the streptavidin. In both cases, this allows the drug carrier to accumulate preferentially over the selective action of the antibody to target molecules of the cells to be treated.
  • this active substance carrier comprises a substance of the formula (I *) in which Y is biotin to which streptavidin is bound, to which in turn a biotin-conjugated antibody is bound.
  • Particularly preferred active substance carriers are those comprising substances according to the formula (Ia)
  • streptavidin is likewise preferably bound to the biotin of the substance according to the formula (Ia) to which in turn a biotin-conjugated antibody is bound.
  • composition according to the invention usually comprises, in addition to the substances of the formulas (I), (I *) and / or (Ia), at least one further substance having at least one chemical group with lipophilic properties and at least one chemical Group with hydrophilic properties.
  • further substances are preferably lipids.
  • Such lipids are usually those from the class of phospholipids, in particular phosphatidylcholine and or phosphatidylethanolamine.
  • Preferred lipids are those selected from the list consisting of La-phosphatidylcholine, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ammonium (l, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-lisamine rhodamine B sulfonyl).
  • the aforementioned further substances arrange themselves when introduced into a polar medium in the same way as the substances according to the formulas (I, I * and Ia).
  • composition according to the invention comprising active substance carriers which comprise the abovementioned further substances usually contains these in a molar proportion of at least 50%, preferably of at least 70%, particularly preferably of 80 to 90%, based on the active ingredient carrier.
  • the active substance carrier comprises two lipids as further substances.
  • one of the two lipids is preferably L- ⁇ -phosphatidylcholine.
  • the L- ⁇ -phosphatidylcholine is particularly preferably that L- ⁇ -phosphatidylcholine which can be obtained from eggs of chickens.
  • the active substance carrier comprises a molar fraction of L- ⁇ -phosphatidylcholine of between 10 and 90% and a proportion of a substance of the formula (I, I * or Ia) relative to the active ingredient carrier.
  • the active ingredient carrier consists of a molar fraction of La-phosphatidylcholine between 10 and 30%, a molar fraction of l, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin between 50 and 65% and a remaining proportion of a substance according to formulas (I, I * or Ia), so that a total of 100% molar fraction based on the active ingredient carrier is obtained.
  • the active substance carriers contained in the composition according to the invention are liposomes which comprise what are known as lipid bilayers, the hydrophilic chemical groups X of the substances just described corresponding to the formulas (I), (I *) (Ia) which form part of these active compound carriers to the polar solvent, while the hydrophobic chemical groups of the substances according to the formulas (I), (I *) or the above-described lipids of both layers are oriented inside the lipid bilayer.
  • the cytostatic agent contained in the composition according to the invention in the active substance carrier is preferably one which is soluble in water or aqueous media to a concentration of up to 3 mmol / l.
  • cytostatics are those selected from the list consisting of doxorubicin, pemetrexed, melphalan, amsacrine, asparaginase, bevacizumab, bleomycin, busulfan, irinotecan, carmustine, daunorubicin, cisplatin, dactinomycin, gancyclovir, cytarabine, dacarbazine, cytarabine, vindesine, oxaliplatin, cyclophosphamide , Cetuximab, etoposide, epirubicin.
  • Fludarabin 5 Fluorouracil, gemcitabine, trastuzumab, ifosfamide, topotecan, cladribine, alemtuzumab, rituximab, methotrexate, mitomycin, mitoxantrone, gemtuzumab, carbopiatin, aldesleukin, bendamustine hydrochloride, paclitaxel, docetaxel, thiotepa, arsenic trioxide, vinblastine, bortezomib, azacitidine, vincristine, vinorelbine, Cidofovir and idarubicin. Very particular preference is given to doxorubicin.
  • Another object of the present invention is a method for releasing a cytostatic agent from a composition comprising a drug carrier in the form of a liposome, characterized in that amphiphilic substances according to the formula (I, I * and / or la) contained in the drug carrier of the composition their disulfide group are split into a hydrophobic and a hydrophilic portion.
  • the cleavage according to the method of the invention may be an enzymatically catalyzed chemical cleavage or may be a non-enzymatically catalyzed reduction in which the disulfide group of the compounds of formula (I, I * and / or Ia) is cleaved as a result of their reduction.
  • the cleavage is an enzymatically catalyzed cleavage.
  • the enzyme which catalyzes such a chemical cleavage is preferably a thioreductase, thiooxidase, thiooxireductase or thidisulfide oxidoreductase.
  • reducing agent a substance selected from the list consisting of glutathione, cysteine, tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), dithiothreithol (DTT) and 1, 4-dithioerythritol ( DTE) is used.
  • TCEP 2,-carboxyethyl) phosphine
  • DTT dithiothreithol
  • DTE 4-dithioerythritol
  • the reducing agent is tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP).
  • the abovementioned reducing agents may be advantageous because they usually have a reduction potential which is only sufficient to reduce at least one of the two sulfur atoms of the disulfide group of the compounds according to the formula (I, I * and / or Ia), thereby cleaving their bond.
  • the reduction potential of the abovementioned reducing agents does not suffice to reduce other chemical groups of the substances according to the formula (I, I * and / or Ia) or groups of the further substances of the active substance carriers according to the invention in the form of a liposome.
  • Glutathione and cysteine are substances which also occur in the body of mammals, in particular humans, on inflammatory changed parts in a particularly high concentration, whereby a targeted release is made possible here in particular with the present invention.
  • the method according to the invention for the release of a cytostatic agent is based on the surprising finding that it is sufficient to cleave the cytostatic agent contained in the active substance carriers according to the formula (I, I * and / or Ia) into a hydrophilic part and a hydrophobic part, which without Being bound to a theory results in the liposome being destabilized to break up and release the drug contained in it.
  • Another object is the use of the compositions described above as a medicament. Especially as a drug for the treatment of cancer.
  • FIG. 1 shows a photograph of the cells obtained by means of differential interference contrast according to example 3.
  • FIG. 2 shows a fluorescence micrograph of the same cells, as also shown in FIG.
  • Example 1 Hersiellee egg ner composition of the invention comprising a drug carrier with a substance of formula (la)
  • the substance according to the formula (Ia) was prepared according to Examples 1-4 of international application PCT / EP2010 / 064272.
  • Table 1 Composition of the active ingredient carrier of the composition according to the invention
  • the deposited film was taken up in cyclohexane (in admixture with 5% by volume of ethanol) and the resulting solution transferred to a glass tube which was frozen at -80 ° C and lyophilized overnight.
  • aqueous doxorubicin hydrochloride solution (1 ml at a concentration of 0.5 mg ml) was added to the dry composition and the mixture was sonicated for 10 minutes.
  • the resulting suspension was subjected to five freezing and thawing operations, each thawing using a 70 ° C water bath.
  • 0.1 ml and after 5 minutes further 0.4 ml of aqueous doxorubicin solution (each with a concentration of 0.5 mg / ml) were added to the suspension.
  • a final concentration of ⁇ 3 mmol / L doxorubicin! lydroch! orid can be achieved.
  • composition according to the invention with doxorubicin hydrochloride as a cytostatic agent with a drug carrier comprising a substance according to formula (Ta) was obtained, wherein in the aforementioned aqueous solution unilamellar vesicles (drug carriers), which are loaded with doxorubicin hydrochloride, formed.
  • an aqueous solution comprising the composition according to Example 1 and 25 ⁇ of an aqueous streptavidin solution (1 mg / ml) were added to a PBS (Phosphate buffered saline) buffer solution without calcium and magnesium ions, so that a total volume of 1 ml was achieved. This mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • composition which comprises active substance carriers composed according to Example 1 comprising the cytostatic doxorubicin hydrochloride and wherein these active substance carriers have on their outer shell anti-human 85HER2 antibodies known to be specific to human pl 85HER2 proteins, located on the surface of human breast cancer cells, specifically.
  • Example 3 Cell Culture Assays with Composition from Example 2
  • Human breast cancer cells of the type BT -474 (DSMZ strain no. ACC 64) were cultured in a 12 ml cell culture flask as monolayer to a confluency of about 70%.
  • the medium used was DM EM with 10% FBS, 5% penicillin-streptomycin and 2 niM I-glutamine.
  • the cells were removed from the bottom of the culture flask with the aid of a 0.05% trypsin / EDTA solution and transferred to a 35 mm glass bottom flask (DM EM: 1: 4 dilution). The cells were incubated at 37 ° C and 5% C0 2 and treated with 1 ml of a PBS solution containing 25 ⁇ of the composition of Example 2.
  • cytostatic doxorubicin hydrochloride Since the cytostatic doxorubicin hydrochloride is known to be fluorescence-active, it was thus possible to detect whether the cytostatic agent was released and absorbed by the cells.
  • FIG. 2 again separately shows the selective fluorescence signal in the cells, wherein the bright spots illustrate the fluorescence signals of doxorubicin in the cells (as shown in FIG. 1 in differential interference contrast recording). These could be recognized in color as red-orange light emission. 1 shows a corresponding fluorescence signal in the interior of the cells in each cell, so that the uptake by the cells and thus the previous release of the doxorubicin hydrochloride is detected. Since no reducing agent was added to the cell culture, the release from the composition according to the invention was carried out solely by the presence of the cells.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, die es erlaubt den Wirkstoff in direkter Gegenwart der mit dem Wirkstoff zu behandelnden Zellen freizusetzen. Die Zusammensetzung umfasst einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms umfassend eine Disulfidgruppe, wobei sich in dem Wirkstoffträger ein Zytostatikum befindet. Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur örtlich begrenzten Freisetzung eines Zytostatikums.

Description

Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs mit kontrollierter Freisetzung des Wirkstoffs
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, die es erlaubt, den Wirkstoff in direkter Gegenwart der mit dem Wirkstoff zu behandelnden Zellen freizusetzen. Die Zusammensetzung umfasst einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms umfassend eine Disulfidgruppe, wobei sich in dem Wirkstoffträger ein Zytostatikum befindet. Die Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur örtlich begrenzten Freisetzung eines Zytostatikums.
Trägersysteme zur Wirkstofffreisetzung basierend auf Liposomenträgem in der Größe von etwa 100 nm sind im Allgemeinen mittlerweile in der medizinischen Technik bekannt. Sie werden im Allgemeinen als vorteilhaft angesehen, wenn eine für bestimmte Organe giftige Substanz, welche aber an anderen Orten des menschlichen Körpers als medizinischer Wirkstoff eingesetzt werden kann, nur an jenen gewünschten Stellen freigesetzt werden soll.
Zu den vorgenannten giftigen Substanzen gehören auch sogenannte Zytostatika, die aber in korrekter Dosierung und in Anwendung auf bestimmte, insbesondere entartet erkrankte Gewebetypen auch als medizinische Therapeutika verwendet werden können. Unter den vorgenannten Liposomenträgem wird im Allgemeinen eine Stoffgruppe verstanden, welche aus nicht giftigen Phospholipiden besteht. Häufig werden in solche Lipos omenträger auch Polymere, wie etwa Polyethylenglykole, eingebunden, welche sich durch eine verbesserte Stabilität im Blutkreislauf von behandelten Patienten auszeichnen, da die vorgenannten Polyethylenglykole eine Form sterischen Schutzes um die eigentlichen Lipos omenträger bilden. Man erhält sogenannte Lipopo!ymere.
Die vorgenannten Aussagen bezüglich Liposomenträgem werden auch durch J. Davidsen et al. in „Secreted phospholipase A2 as a new enzymatic trigger mechanism for localised liposomal drug release and absorption in diseased tissue" erschienen in Biochimica et Biophysica Acta 1609 (2003) 95 - 101 bestätigt. Weiter offenbaren J. Davidsen et al., dass die Eigenschaften solcher Wirkstoffträger i n F rm vorgenannter Liposomenträger insbesondere in Bezug auf ihr Freisetzungsverhalten von einer Vielzahl von chemischen und physikalischen Größen abhängen kann, deren Zusammenspiel noch nicht vollständig verstanden ist.
.1. Davidsen et al. offenbaren in diesem Zusammenhang ihre Untersuchungen bezüglich einer Liposomenformulierung, bestehend aus einem 100 nm durchmessenden Liposomenträger. Der Liposomenträger kann aus l,2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC) und/oder 1,2- hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylen glykol)-2000] (DPPE- PEG2000) und/oder l-0-hexadecanoyl-2-hexanodecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (i-O-DPPC) und/oder 1 -0-hexadecanoyl-2-hexanodecanoyl-sn-glycero-3-phospho ethanolamin-N- [methoxy- (Polyethylen glykol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) bestehen. Die vorgenannten Stoffe werden als Lipide bezeichnet, welche auch multilamellare Vesikel bilden können und welche zu der Stoffgruppe der Phospholipide gehören.
Es wird weiter offenbart, dass in der Liposomenformulierung umfassend 1-O-DPPC und 10 mol-% 1 - O-DPPE-PEG350, Calcein eingeschlossen werden kann. Calcein wird hierbei als Modellsubstanz für Arzneimittel bezeichnet. Eine Freisetzung des Calcein kann gemäß der Offenbarung durch J. Davidsen et al. mittels Behandlung dieser Liposomenformulierung mit Phospholipase A2 (PLA2) erzielt werden. Die Freisetzung erfolgt durch hydrolytische Spaltung von entweder DPPC oder 1-O-DPPC, oder 1-O-DPPE-PEG350, welche durch PLA2 katalysiert wird, wobei ein Lysolipid und eine Fettsäure entstehen. Die durch J. Davidsen offenbarten Liposomenformulierungen w erden nur in Zusammenhang mit den vorgenannten Modellsubstanzen hinsichtlich ihrer Freisetzung beschrieben. J. Davidsen beschreiben auch eine Möglichkeit der Anwendung von Liposomenformulierungen im Allgemeinen für die Freisetzung von Doxorubicin, was ein Zytostatikum ist. Es wird allerdings keine tatsächliche Offenbarung hinsichtlich dieses Sachverhalts gegeben. Damit offenbaren .!. Davidsen et al. weder eine Spaltung in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil, noch dass der Liposomenträger eine Disulfidbindung umfassen kann. Insbesondere offenbaren J. Davidsen et al. nicht, dass im Zuge dessen ein Zytostatikum freigesetzt wird.
Durch Meng et al. wird in „Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications" erschienen in Biomaterials 30 (2009) 2180-2198 offenbart, dass bestimmte Polymere mit Disulfidbrücken entweder im polymeren Strang oder in einer dessen Seitenketten geeignet sind, Wirkstoffe einzuschließen. Zu den Wirkstoffen, die hier Einsatz finden können, zählen gemäß Meng et al. auch Krebsmedikamente. Die dort offenbarten Stoffe weisen aber stets polymeren Charakter auf, da Partikel, d.h. Feststoffe, aus diesen gebi ldet werden, in denen die potentiellen Wirkstoffe eingeschlossen werden sollen. Es handelt sich also in keinem Fall um Stoffe mit Lipidcharakter, die zur Herstellung von Liposomen geeignet wären.
Die offenbarte Wirkweise der Stoffe basiert auf der Möglichkeit der Bindungsspaltung der Disulfidgruppe, wodurch entweder die Polymere aufgelöst werden oder die Polyethylenglykol- seitenketten, die mit der Disulfidgruppe an die Polymere gebunden sind, abgetrennt werden und damit das Partikel nach Anwendung im Patienten durch dessen Immunsystem erkennbar und abbaubar wird. Demnach basiert die Freisetzung aus dem Wirkstoffträger gemäß der Offenbarung nach Meng et al. entweder auf einem Auflösen eines Feststoffes durch Spaltung polymerer Bindungen oder durch Degradation des Feststoffes durch das Immunsystem des Patienten, nachdem das Partikel für diese erkennbar geworden ist. In keinem Fall wird der Wirkstoff direkt freigesetzt. In der WO 2000/059474 AI werden lipide Zusammensetzungen offenbart, die aus einer hydrophoben „Schwanzgruppe" und einer hydrophilen„Kopfgruppe" bestehen, wobei die letztgenannte hydrophile „Kopfgruppe" an die hydrophobe„Schwanzgruppe" kovalent angebunden ist. Innerhalb der hydrophilen„Kopfgruppe" wird zwischen einer ersten und einer zweiten Region unterschieden, wobei diese beiden Regionen durch eine Disulfidgruppe verbunden sind, die, etwa durch Glutathion, gespalten werden kann. Die erste Region der hydrophi l en„Kopfgruppe" trägt gemäß der WO 2000/059474 AI bei physiologischem pl 1 eine positive Ladung und die zweite Region trägt bei physiologischem pH eine negative Ladung. Die erste Region ist kovalent an die hydrophobe „Schwanzgruppe" angebunden. Die gemäß der WO 2000/059474 A I allgemein offenbarte chemische Formel der vorgenannten lipiden Zusammensetzungen ist X - Y - S - S - Z. Hierbei bildet die chemische Gruppe X die vorgenannte hydrophobe„Schwanzgruppe" und Y, sowie Z die erste bzw. zweite Region der hydrophilen Kopfgruppe.
Gemäß der weiteren Offenbarung der WO 2000/059474 AI kann in der vorgenannten chemischen Formel die chemische Gruppe X als hydrophobe „Schwanzgruppe" eine Gruppe sein, die im Wesentlichen dem Glycerinrumpf eines Fettes ähnlich ist und an die die chemische Gruppe Y über eine weitere chemische Gruppe W angebunden ist.
Die chemische Gruppe W kann ausgewählt sein aus der Liste bestehend aus CUR -,. NR3, +(R3)2, O, S, C(0)NH, NH(CO), OC(0)NH und OP(0)(OR3)0. Die in der chemischen Gruppe W weiter enthaltene chemische Gruppe R3 kann Wasserstoff oder ein C1-C4 Alkylrest sein.
Die chemische G uppe Y kann ein C1-C12 Alklrest, ein C2-Ci2 Alkenylrest oder ein C2-Ci2 Alkinylrest mit Substituenten in Form von Alkylresten, Aminoresten, Aminoalkylresten, Guanidinresten, Guadininalkylresten, Amidoresten oder Amidoalkylresten sein, wobei die vorgenannten Alkyl-, Alkenyl-, oder Alkinylreste der chemischen Gruppe Y weiter durch NR3, +(R3)2, C(O), NHC( H), C(NH)NH, NHC(NH)NH unterbrochen sein können. Alternativ kann die chemische Gruppe Y auch ein Aminosäurerest oder ein Peptid sein.
Die chemische Gruppe Z kann gemäß der Offenbarung der WO 2000/059474 AI ein Ci-C!2 Alkylrest, Alkenylrest oder ein Alkinylrest sein, der wiederum mi t Alkylresten, Carboxylresten, Carboxyalkylresten, Aminosäureresten, Peptiden, Oligonucieotiden oder sog. „Zielmolekülresten" substituiert sein kann.
Die vorgenannten chemischen Gruppen X, Y und Z müssen aber in jedem Fall so ausgestaltet sein, dass die Gruppen X und Y in ihrer Gesamtheit bei physiologischem pH eine positive Ladung aufweisen und die Gruppe Z bei physiologischem pH eine negative Ladung aufweist. Demzufolge entsteht bei der Spaltung von Stoffen der Formel X - Y - S - S - Z an der Disulfidgruppe gemäß der WO 2000/059474 AI eine Gruppe der Art X - Y - S, die positiv geladen ist und eine chemische Gruppe der Art S Z. die negativ geladen ist.
In j edem Fall ist die Gruppe der Art X Y S dadurch, dass sie i mmer noch die„hydrophobe Schwanzgruppe" und eine positive Ladung umfasst, eine chemische Gruppe, die amphiphile Eigenschaften aufweist. D.h.. die in einer Region hydrophob und in einer Region hydrophil ist. Die
Gruppe der Art S - Z ist durch ihre negative Ladung und durch die Tatsache, dass diese einen Ci-C!2 Alkylrest, Alkenylrest oder ein Alkinylrest umfasst entweder ebenfalls amphiphil oder sogar - im Fall besonders kurzer Alkylreste, Alkenylreste oder Alkinylreste - nur hydrophil. Die WO 2000/059474 AI offenbart weiter, dass die vorgenannten Stoffe zur Herstellung von
Liposomenträgem geeignet sind, mittels derer eine gezielte Freisetzung von Stoffen an einem Wirkort erfolgen kann. Die Freisetzung basiert auf der chemischen Spaltung der Disulfidgruppe. Die WO 2000/059474 AI offenbart auch die Verwendung der dortigen Liposomenträger zur Freisetzung von Krebsmedikamenten im Allgemeinen. Die WO 2000/059474 AI offenbart aber nicht, dass eine Spaltung eines vorher amphiphilen Stoffes in einen hydrophilen und einen hydrophoben Anteil erzielt werden kann.
Eine solche Aufteilung in einen hydrophilen und einen hydrophoben Anteil würde aber eine besonders effiziente Destabilisierung und Auflösung des mit solchen Stoffen aufgebauten Liposomenträgers ermöglichen. Neben den vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen ist auch allgemein bekannt, dass spezielle Enzyme im Körper eines Säugetiers spezifische Bindungen von Stoffen angreifen und diese spalten. In diesem Zusammenhang offenbaren etwa D. Mustacich et al. in Biochem. J. (2000) 346, 1 -8, „Thioredoxin reductase", dass ein solches Enzym die Thioredoxin reductase (kurz TrxRs) ist. Weiter wird offenbart, dass dieses Enzym insbesondere in Tumorgeweben mindestens zehnmal mehr vorhanden ist als in gesundem Gewebe.
Die bei der Behandlung von Krebserkrankungen verwendeten Zytostatika sind hinsichtlich ihrer zytostatischen Wirkung nicht selektiv. Demnach entfaltet sich diese Wirkung im Allgemeinen sowohl gegenüber gesunden Zeilen, wie auch gegenüber dem erkrankten Gewebe. Die zytostatische Wirkung auf die gesunden Zel len ist eine schwerwiegende Nebenwirkung dieser Wirkstoffe. Im Zuge von solchen Behandlungen wird der Patient vielfach auch mit einer größeren Dosis der Zytostatika behandelt als dies die eigentliche Tumorerkrankung erfordern würde, da sichergestellt werden muss, dass die dem Patienten verabreichte Wirkstoffmenge den Wirkort (den Tumor) noch in ausreichend großer Dosierung erreicht.
Hierzu wird die zytostatische Nebenwirkung auf die gesunden Zellen in der Ermittlung der notwendigen Dosierung insofern mit einberechnet, als dass davon ausgegangen wird, dass ein Teil des zytostatischen Wirkstoffs seine Wirksamkeit gegenüber gesunden Zeilen entfaltet und somit für die Wirkung gegen das Tumorgewebe nicht mehr zur Verfügung steht. Demnach sind die oben genannten Nebenwirkungen in solchen Fällen intrinsischer Bestandteil der Therapie.
Wünschenswert wäre es aber, wenn der Wirkstoff nur am Wirkort freigesetzt würde und nur dort seine Wirkung entfalten würde. Dies würde zum einen eine Verringerung der Dosis und zum anderen eine geringere, negative Beeinträchtigung der Patienten zur Folge haben.
Es ist aber in vielen Fällen zugleich sicherzustellen, dass die Freisetzung des Wirkstoffs am potentiellen Wirkort sofort und möglichst quantitativ und nicht in schleichender Weise stattfindet.
Die vorgenannten Aufgaben werden im oben angegebenen Stand der Technik aber bis heute nicht oder nur mangelhaft gelöst.
Es besteht daher die Aufgabe einen Wirkstoffträger mit einem in diesem enthaltenen Zytostatikum bereitzustellen, der z.B. enzymatisch an einer Disulfidgruppe, enthalten in diesem Wirkstoffträger, gespalten werden kann, so dass eine schnelle und möglichst vollständige Freisetzung des Zytostatikums am Wirkort möglich ist.
Weiter besteht die Aufgabe ein Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums bereitzustellen, welches für die zielgerichtete Behandlung etwa von Tumorerkrankungen geeignet ist, indem das Zytostatikum nur in unmittelbarer Nähe zum Wirkort des menschlichen Körpers schnell und möglichst quantitativ freigesetzt wird.
Als ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung wurde eine Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms das ein Zytostatikum enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger mindestens einen Stoff gemäß der Formel (I)
Figure imgf000006_0001
umfasst, wobei der mindestens eine Stoff gemäß der Foi (a) in X eine chemischen Gruppe umfassend mindestens fünf Kohlenstoffatome und umfassend mindestens eine Ethergruppe und/oder Amingruppe oder Ammoniumgruppe aufweist, und wobei
(b) n und m unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 30 ist, wobei aber die Summe aus n und m mindestens 16 beträgt, gefunden.
Durch die Eigenschaft der Stoffe gemäß der Formel (I) in der er findungs gemäßen Zusammensetzung, dass diese in den Resten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen chemische Gruppen aufweisen, die hydrophobe Eigenschaften besitzen und zugleich sterisch dazu führen, dass bei Einbringen der Stoffe gemäß der Formel (I) in ein polares Medium diese Stoffe sich selber so anordnen, dass diese hydrophoben chemischen Gruppen nach innen, weg vom polaren Lösungsmittel angeordnet sind, bilden diese gegebenenfalls mit weiteren Stoffen gleicher oder ähnlicher Eigenschaften Liposome bei Einbringen in polare Lösungsmittel, wie etwa Wasser.
Demnach führt das Einbringen der Stoffe gemäß der Formel (I) in ein polares Medium dazu, dass diese Stoffe sich selber so anordnen, dass es zur Ausbildung von sphärischen Strukturen in Form von Liposomen kommt.
Dabei entstehen üblicherweise sogenannte Lipiddoppelschicliten, wobei die hydrophilen chemischen Gruppen X der Stoffe gemäß der Formel (I) sich sowohl außen als auch innen hin zum polaren Lösemittel, das sich auch im Inneren der vorgenannten sphärischen Strukturen befinden kann, orientieren, während die hydrophoben chemischen Gruppen beider Schichten ins Innere der Lipiddoppelschicht orientiert sind. Im Inneren des Liposoms befindet sich das Zytostatikum, gelöst im polaren Medium, das somit, solange die Lipiddoppelschicht stabil ist, diese nicht verlassen kann und somit auch gegenüber in der Nähe der Zusammensetzung befindlichen Zellen keine zytostatische Wirkung entfalten kann. Zugleich sind die Stoffe gemäß der Formel (I) in der e findungemäßen Zusammensetzung aber an der vorgesehenen Disulfidgruppe selektiv spaltbar, so dass hiernach eine hydrophile chemische Gruppe bestehend aus der chemischen Gruppe X und einem Schwefelrest, sowie eine hydrophobe chemische Gruppe umfassend die Reste mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen entstehen. Hierdurch kommt es zu einer sofortigen und vollständigen Destabilisierung des vorgenannten Liposoms und damit zu einer sofortigen Freisetzung des enthaltenen Zytostatikums.
Damit wird mit der neuartigen erfindungemäßen Zusammensetzung erstmals die Freisetzung eines Zytostatikums über die Spaltung einer Disulfidbindung und unter Erhalt eines hydrophilen und eines hydrophoben Rests möglich, was es erlaubt, abhängig hiervon das Zytostatikum spontan und nur am gewünschten Wirkort freizusetzen.
Die Reste mit n, m Kohlenstoffatomen gemäß der Formel (I) sind üblicherweise gesättigte Kohlenwasserstoffreste, wie dies auch in der Formel (I) dargestellt ist. Die Reste mit n, m Kohlenstoffatomen können auch einfach oder mehrfach ungesättigte Reste sein. Es können die Reste mit n, m Kohlenstoffatomen somit auch eine oder mehrere Doppel- und/oder Dreifachbindungen aufweisen.
Die Formel (I) ist demnach gemäß der vorliegenden Erfindung hinsichtlich der darin dargestellten Kohlenwasserstoffreste mit n, m Kohlenstoffatomen nicht so zu verstehen, als dass diese Reste ausschließlich gesättigte Kohlenwasserstoffreste mit n, m Kohlenstoffatomen sind.
Die chemis che Grupp e X umfasst in bevorzugten Ausführungsformen mindestens acht Kohlenstoffatome.
Es ist ebenfalls bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X neben der mindestens einen Ethergruppe und/oder Amingruppe oder Ammoniumgruppe auch mindestens eine Carbonsäureestergruppe umfasst. Es ist besonders bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X entweder mindestens zwei Ethergruppen oder mindestens eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe und mindestens zwei Carbonsäureestergruppen umfasst.
Es ist ebenfalls besonders bevorzugt, wenn die mindestens eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe der chemischen Gruppe X der Stoffe gemäß der Formel (I) in den Wirkstoffträgern der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine quarternäre Ammoniumgruppe ist.
In solchen Ausführungsformen trägt der Stoff gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung mindestens eine positive Ladung und liegt in Kombination mit mindestens einem einfach oder mehrfach negativ geladenen Gegenion vor. Solche Gegenionen können etwa Halogenionen, wie Chlorid, Bromid und/oder lodid, aber auch beliebige andere Gegenionen mit negativen Ladungen sein.
Es ist ganz besonders bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X der Stoffe gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung mindestens drei Ethergruppen umfasst. Hierbei ist es bevorzugt, wenn die chemische Gruppe X über eine Carbonsäureestergruppe an ei ne chemische Gruppe Y gemäß der nachstehend beschriebenen weiteren bevorzugten Ausführungsform angebunden ist. Innerhalb dieser ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Stoffe gemäß der Formel (I) in der erfindungemäßen Zusammensetzung ist die chemische Gruppe X, die dann weiter bevorzugt nur eine Amingruppe oder A mmoniumgruppe enthält, ebenfalls bevorzugt über diese Amingruppe oder Ammoniumgruppe an den Rest des Stoffes gemäß der Formel (I) angebunden.
Diese Ausführungsform ist insbesondere vorteilhaft, weil die Amingruppe oder Ammoniumgruppe und die mindestens drei Ethergruppen in ihrer Gesamtheit eine besonders hydrophile Eigenschaft der chemischen Gruppe X zur Folge haben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der er fmdungemäß en Zusammensetzung umfassen in dieser die Stoffe gemäß der Formel (I) in der chemischen Gruppe X auch eine Phosphatgruppe.
In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungemäßen Zusammensetzung kann in dieser Zusammensetzun der Wirkstoffträger in Form eines Liposoms das ein Zytostatikum enthält auch mindestens einen Stoff gemäß der Formel (I*)
Figure imgf000009_0001
umfassen, wobei die chemische Gruppe Y eine chemische Gruppe ausgewählt aus der Liste bestehend aus Biotin, Protein, Peptid, Glykogruppe, Nucleinsäure, Nucleosid oder Nukleotid ist und wobei X, n und m die Bedeutungen, wie in Forme! (I) oder in den vorstehend beschriebenen bevorzugten Varianten haben.
Die chemische Gruppe Y ist in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Biotin.
In der bevorzugten Ausführungsform, in der die chemische Gruppe Y Biotin ist, kann diese entweder durch eine Amidbindung oder über eine Carbonsäureestergruppe an die chemische Gruppe X angebunden sein.
In dieser bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung umfassend Wirkstoffträger mit Stoffen gemäß der Formel (I*) kann die chemische Gruppe Y an die chemische Gruppe X terminal oder als
Seitengruppe angebunden vorliegen.
I n allen Ausführungsformen der Erfindung umfassend Stoffe gemäß der F rmel (I*) dient d ie chemische Gruppe Y der (bio-) chemischen Identifikation. Indem die Gruppe Y etwa im Falle der Verwendung von Biotin gemäß der bevorzugten Ausführungsform (bio-) chemisch eindeutig durch Streptavidin erkannt wird, lässt sich hieran eine weitere chemische und/oder biologische Gruppe anbinden, die dem Stoff gemäß der Formel (I*) weitere (bio-) chemische Eigenschaften verleiht.
So kann etwa ein mit Streptavidin konjugierter Antikörper an das Biotin gebunden werden. Alternativ kann auch nur Streptavidin an das Biotin gebunden werden und ein wiederum mit Biotin konjugierter Antikörper wiederum an das Streptavidin gebunden werden. In beiden Fällen ermöglicht dies, dass der Wirkstoffträger sodann über die selektive Wirkung des Antikörpers bevorzugt an Zielmolekülen der zu behandelnden Zellen akkumuliert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der er findungs gemäßen Zusammensetzung umfasst dieser Wirkstoffträger mit einem Stoff gemäß der Formel (I*) in dem Y Biotin ist, an das Streptavidin gebunden vorliegt, an das wiederum ein mit Biotin konjugierter Antikörper gebunden ist.
Insbesondere bevorzugte Wirkstoffträger sind solche umfassend Stoffe gemäß der Formel (Ia)
Figure imgf000010_0001
(Ia)
Bei diesen insbesondere bevorzugten Zusammensetzungen mit Wirkstoffträgern umfassend Stoffe gemäß der Formel (Ia) ist ebenfalls bevorzugt an das Biotin des Stoffes gemäß der Formel (Ia) Streptavidin angebunden, an das wiederum ein mit Biotin konjugierter Antikörper gebunden ist.
Die vorgenannte, er findungs gemäß e Zusammensetzung umfasst in dem Wirkstoffträger üblicherweise neben den Stoffen gemäß der Formel (I), (I*) und/oder (Ia) mindestens noch einen weiteren Stoff mit mindestens einer chemischen Gruppe mit lipophilen Eigenschaften und mindestens einer chemischen Gruppe mit hydrophilen Eigenschaften. Solche weiteren Stoffe sind bevorzugt Lipide.
Solche Lipide sind üblicherweise jene aus der Stoffklasse der Phospholipide, insbesondere Phosphatidylcholin und oder Phosphatidylethanolamin. Bevorzugte Lipide sind solche ausgewählt aus der Liste bestehend aus L-a-phosphatidylcholin, 1,2- dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Ammonium-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamin-N-lissamin rhodamin B sulfonyl). Die vorgenannten weiteren Stoffe ordnen sich bei Einbringen in ein polares Medium in gleicher Weise wie die Stoffe gemäß den Formeln (I, I* und la) an.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit Wirkstoffträgern, die oben genannte weitere Stoffe umfassen, enthält diese üblicherweise zu einem molaren Anteil von mindestens 50 %, bevorzugt von mindestens 70 %, besonders bevorzugt von 80 bis 90 % bezogen auf den Wirkstoffträger.
In bevorzugten Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemäßen Zusammensetzung umfasst der Wirkstoffträger zwei Lipide als weitere Stoffe.
Innerhalb dieser bevorzugten Ausführungsform ist eines der zwei Lipide bevorzugt L-a- phosphatidylcholin. Besonders bevorzugt ist das L-a-phosphatidylcholin jenes L-a- phosphatidylcholin, welches aus Eiern von Hühnern gewonnen werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfasst der Wirkstoffträger einen molaren Anteil von L-a-phosphatidylcholin zwischen 10 und 90 % und einen Anteil eines Stoffes gemäß Formel (I, I* oder la) bezogen auf den Wirkstoffträger.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung besteht der Wirkstoffträger aus einem molaren Anteil von L-a-phosphatidylcholin zwischen 10 und 30 %, einem molaren Anteil von l ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin zwischen 50 und 65 % und einem verbleibenden Anteil eines Stoffes gemäß Formeln (I, I* oder la), so dass insgesamt 100 % molarer Anteil bezogen auf den Wirkstoffträger erhalten werden.
Die in der er fmdungs gemäßen Zusammensetzung enthaltenen Wirkstoffträger sind Liposomen, die sogenannte Lipiddoppelschichten umfassen, wobei sich die gerade beschriebenen hydrophilen chemischen Gruppen X der Stoffe gemäß der Formeln (I), (I*) (la), die Bestandteil dieser Wirkstoffträger sind, hin zum polaren Lösemittel orientieren, während die hydrophoben chemischen Gruppen der Stoffe gemäß der Formeln (I), (I*) bzw. der vorstehend beschriebenen Lipide beider Schichten ins Innere der Lipiddoppelschicht orientiert sind. Das in der erfindungemäßen Zusammensetzung im Wirkstoffträger enthaltene Zytostatikum ist bevorzugt eines, das in Wasser oder wässrigen Medien zu einer Konzentration von bis zu 3 mmol/1 löslich ist.
Besonders bevorzugte Zytostatika sind jene ausgewählt aus der Liste bestehend aus Doxorubicin, Pemetrexed, Melphalan, Amsacrin, Asparaginase, Bevacizumab, Bleomycin, Busulfan, Irinotecan, Carmustin, Daunorubicin, Cisplatin, Dactinomycin, Gancyclovir, Cytarabin, Dacarbazin, Cytarabin, Vindesin, Oxaliplatin, Cyclophosphamid, Cetuximab, Etoposid, Epirubicin. Fludarabin, 5- Fluorouracil, Gemcitabin, Trastuzumab, Ifosfamid, Topotecan, Cladribin, Alemtuzumab, Rituximab, Methotrexat, Mitomycin, Mitoxantron, Gemtuzumab, Carbopiatin, Aldesleukin, Bendamustin- hydrochlorid, Paclitaxel, Docetaxel, Thiotepa, Arsentrioxid, Vinblastin, Bortezomib, Azacitidin, Vincristin, Vinorelbin, Cidofovir und Idarubicin. Ganz besonders bevorzugt ist Doxorubicin.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums aus einer Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms, dadurch gekennzeichnet, dass amphiphile Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder la) enthalten in dem Wirkstoffträger der Zusammensetzung an ihrer Disulfidgruppe in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil gespalten werden.
Die Spaltung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine enzymatisch katalysierte chemische Spaltung sein oder kann eine nicht enzymatisch katalysierte Reduktion sein, bei der die Disulfidgruppe der Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder la) in Folge ihrer Reduktion gespalten wird. Bevorzugt ist die Spaltung eine enzymatisch katalysierte Spaltung. Das Enzym, das eine solche chemische Spaltung katalysiert, ist bevorzugt eine Thioreductase, Thiooxidase, Thiooxireductase oder Thidisulfidoxidoreductase.
Ebenfalls möglich ist die nicht enzymatisch katalysierte Spaltung der Disulfidgruppe durch Reduktion, wobei als Reduktionsmittel ein Stoff ausgewählt aus der Liste bestehend aus Gluthathion, Cystein, Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), Dithiothreithol (DTT) und 1 ,4-Dithioerythritol (DTE) eingesetzt wird. Bevorzugt ist das Reduktionsmittel Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP).
Die vorgenannten Reduktionsmittel sind unter Umständen vorteilhaft, weil diese üblicherweise ein Reduktionspotential aufweisen, das lediglich ausreicht mindestens eines der beiden Schwefelatome der Disulfidgruppe der Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder la) zu reduzieren, wodurch deren Bindung gespalten wird. Gleichzeitig reicht das Reduktions otential der vorgenannten Reduktionsmittel aber nicht aus andere chemische Gruppen der Stoffe gemäß der Formel (I, I * und/oder la) oder Gruppen der weiteren Stoffe der erfindungsgemäßen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms zu reduzieren.
Damit wird insbesondere sichergestellt, dass eine Spaltung der amphiphilen Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder la) in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil stattfindet, wodurch die er findungs gemäße Freisetzung besonders vorteilhaft erfolgt. Gluthathion und Cystein sind Stoffe, die auch im Körper von Säugern, insbesondere Menschen, an entzündlich veränderten Steilen in besonders hoher Konzentration auftreten, wodurch insbesondere hier mit der vorliegenden Erfindung eine gezielte Freisetzung ermöglicht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass es ausreicht, das in den Wirkstoffträgern enthaltene Zytostatikum gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) in einen hydrophilen Anteil und einen hydrophoben Anteil zu spalten, was ohne an eine Theorie gebunden zu sein dazu führt, dass das Liposom dergestalt destabilisiert wird, dass es aufbricht und den in ihm enthaltenen Wirkstoff freisetzt.
Ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen als Medikament. Insbesondere als Medikament zur Behandlung von Krebs.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele und Abbildungen erläutert, ohne sie jedoch hierauf zu beschränken.
Fig. 1 zeigt eine Aufnahme der Zellen, die mittels Differentialinterferenzkontrast gewonnen wurde, gemäß dem Beispiel 3. Fig. 2 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme derselben Zellen, wie sie auch in Fig. 1 dargestellt sind.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie hierauf zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Hersiellee ei ner erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger mit einem Stoff gemäß Formel (la)
Der Stoff gemäß der Formel (la) wurde gemäß der Beispiele 1-4 der internationalen Anmeldung PCT/EP2010/064272 hergestellt.
Der Stoff gemäß Formel (la), sowie L-a-phosphatidylcholin („eggPC", Fa. Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) und l ,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin („DOPE", Fa. Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) wurden in Chloroform/Methanol (Verhältnis 5: 1 ) gelöst.
Die Anteile der vorgenannten Stoffe an dem später aus dieser Lösung erhaltenen Wirkstoffträger, bezogen auf den Wirkstoffträger sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Zusammensetzung des Wirkstoffträgers der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
Figure imgf000014_0001
Die somit erhaltene Lösung in dem vorgenannten Chlorofom Methanol-Gemisch wurde hiernach in einem Rotationsverdampfer bis zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels behandelt, so dass sich eine Zusammensetzung gemäß Tabelle 1 als Feststoff an der Glaswand des Rotationsverdampfers trocken als Film niederschlug.
Anschließend wurde der niedergeschlagene Film in Cyclohexan (in Mischung mit 5 Vol.-% Ethanol) aufgenommen und die erhaltene Lösung in eine Glasröhre überführt, die bei -80 °C gefroren und über Nacht lyophilisiert wurde.
Hiemach wurde der trockenen Zusammensetzung eine wässrige Doxorubicin-Hydrochlorid-Lösung (1 ml mit einer Konzentration von 0.5 mg ml) zugegeben und die Mischung für 10 Minuten mit Ultraschall behandelt. Die so entstandene Suspension wurde fünf Einfrier- und Auftauvorgängen unterworfen, wobei das Auftauen jeweils mit einem 70 °C warmen Wasserbad erfolgte. Zunächst wurden dann 0.1 ml und nach 5 Minuten weitere 0.4 ml wässrige Doxorubicin Lösung (jeweils mit einer Konzentration von 0.5 mg/ml) zu der Suspension gegeben. Somit konnte eine Endkonzentration von ~ 3 mmol/L Doxorubicin-! lydroch!orid erreicht werden.
Anschließend erfolgte ein 11 -maliges Durchleiten der Suspension durch einen Polycarbonatfilter mit
100 nni Porendurchmesser. Hierdurch wurde die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit Doxorubicin-Hydrochlorid als Zytostatikum mit einem Wirkstoffträger umfassend einen Stoff gemäß Formel (Ta) erhalten, wobei sich in der vorgenannten wässrigen Lösung unilamellare Vesikel (Wirkstoffträger), die mit Doxorubicin-Hydrochlorid beladen sind, bildeten. Um die vorgenannte Zusammensetzung von überschüssigem, in der wässrigen Lösung befindlichen Doxorubicin Hydrochlorid, das sich nicht im Inneren der Wirkstoffträger befindet zu befreien, wurde das Permeat der vorgenannten Filtration über eine in ei ner Zentrifugeneinheit befindliche Gelfiltrationssäule geleitet (Säule: Sephadex G 50 (Fine, Fa. Sigma-Aldrich) in 1 ml Polypropylen Säulen, Fa. Qiagen; Zentrifugation: 3 Minuten bei 100-300 x g). Beispiel 2: Funktionalisieren der Zusammensetzung mit monoclonalen Antikörpern
150 μΐ einer wässrigen Lösung umfassend die Zusammensetzung gemäß Beispiel 1 und 25 μΐ einer wässrigen Streptavidin-Lösung (1 mg/ml) wurden zu einer PBS (Phosphate buffered saline)- Pufferlösung ohne Calcium- und Magnesiumionen gegeben, so dass ein Gesamtvolumen von 1 ml erreicht wurde. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen.
Hiernach wurden 50 μΐ Anti-human-pl 85HER2 Biotin-Konjugat (Fa. Invitrogen, arslruhe, verwendet, wie erhalten) zugegeben und die Mischung bei 4 °C für eine Stunde inkubiert.
Dabei wurde eine Zusammensetzung erhalten, die Wirkstoffträger zusammengesetzt gemäß Beispiel 1 enthaltend das Zytostatikum Doxorubicin-Hydrochlorid umfasst und wobei diese Wirkstoffträger an ihrer äußeren Hülle Anti-human- l 85HER2 Antikörper aufweisen, die bekanntermaßen speziell an humanen pl 85HER2-Proteinen, befindlich auf der Oberfläche von humanen Brustkrebszellen, spezifisch anbinden.
Beispiel 3: Zellkulturtests mit Zusammensetzung aus Beispiel 2
Humane Brustkrebszellen des Typs BT -474 (DSMZ Stamm Nr. ACC 64) wurden in einer 12 ml- Zellkulturflasche als Monolayer bis zu einer Konfluenz von ca. 70% kultiviert. Als Medium wurde DM EM mit 10% FBS, 5% Penicillin-Streptomycin und 2 niM I .-Glutamin verwendet.
Einen Tag vor der mikroskopischen Untersuchung wurden die Zel len vom Boden der Kulturflasche mit Hilfe einer 0,05 %igen Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und in ein 35-mm-Glassbodengefäß überführt ( DM EM. 1 :4 Verdünnung). Die Zellen wurden bei 37 °C und 5% C02 inkubiert und mit 1 ml einer PBS-Lösung, welche 25 μΐ der Zusammensetzung aus Beispiel 2 enthielt, behandelt.
Das Ergebnis dieses Expositionsversuchs wurde fluoreszenz -mikroskopisch ausgewertet (Inverted Epi fluorescence Microscope, Fa. Zeiss, Typ: Axiovert 100). Vor jeder mikroskopischen Aufnahme wurden die Zeilen viermal mit PBS mit Calcium und Magnesiumionen gewaschen.
Für jede Auswertung wurden drei mikroskopische Bilder aufgenommen und die Fluoreszenzintensität jeweils an zehn Stellen innerhalb der Zellen ermittelt und daraus die mittlere Fluoreszenz ermittelt. Analog wurde mit drei ma l zehn Stellen außerh alb der Ze l l en verfahren , um d i e mittlere Hintergrundfluoreszenz zu ermitteln. Die Differenz daraus ergibt das mittlere Fluoreszenzsignal.
Da das Zytostatikum Doxorubicin-Hydrochlori bekanntermaßen fluoresezenzaktiv ist, konnte somit erfasst werden, ob das Zytostatikum freigesetzt und durch die Zellen aufgenommen wurde.
Es zeigte sich hierbei, dass dieses mittlere Fluoreszenzsignal (Differenz aus Hintergrund und Fluoreszenz der Zellen durch den Wirkstoff) 58,94 ± 1 1, 17 (a.u.) betrug. Dies ist ausreichend, um die
Aufnahme und damit die vorhergehende Freisetzung des Zytostatikums zu belegen.
Die Fig. 2 zeigt hierfür noch einmal getrennt das selektive Fluoreszenzsignal in den Zellen, wobei die hellen Stellen die Fluoreszenzsignale des Doxorubicin in den Zellen (wie dargestellt in der Fig. 1 in Differentialinterferenzkontrastaufnahme) verdeutlichen. Diese wären farblich als rot-orange Lichtemission zu erkennen. Man erk ennt bei j eder Z el l e gemäß Fig. 1 ei n entsprechendes Fluoreszenzsignal im I nneren der Zel l en, so dass die Aufnahme durch die Zel len und somit die vorherige Freisetzung des Doxorubicin-Hydrochlorid nachgewiesen ist. Da der Zellkultur kein reduzierendes Agens zugesetzt wurde, erfolgte die Freisetzung aus der erfindungsgemäßen Zusammensetzung alleinig durch Anwesenheit der Zellen.

Claims

Patentansprüche
Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms das ei n
Zytostatikum enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger mindestens einen Stoff gemäß der Formel (I)
Figure imgf000017_0001
umfasst, wobei der mindestens eine Stoff gemäß der Fo me] (I)
(a) in X eine chemischen Gruppe umfassend mindestens fünf Kohlenstoffatome und umfassend mindestens eine Ethergruppe und/oder Amingruppe oder Ammoniumgruppe aufweist, und wobei (b) n und m unabhängig voneinander eine natürliche Zahl von 1 bis 30 ist, wobei aber die
Summe aus n und m mindestens 16 befragt.
2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Gruppe X mindestens acht Kohlenstoffatome umfasst.
3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Gruppe X zusätzlich mindestens eine Carbonsäureestergruppe umfasst.
4. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Amingruppe oder Ammoniumgruppe der chemischen Gruppe X der Stoffe gemäß der Formel (I) in dem Wirkstoffträger eine quarternäre Ammoniumgruppe ist.
5. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger einen Stoff gemäß der Formel (I*)
Figure imgf000017_0002
(I*) umfasst, wobei die chemische Gruppe Y eine chemische Gruppe ausgewählt aus der Liste bestehend aus Biotin, Protein, Peptid, Glykogruppe, Nucleinsäure, Nucleosid oder Nucleotid ist.
Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoffträger einen Stoff gemäß der Formel (la)
Figure imgf000018_0001
(ia) umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese im Wirkstoffträger auch Phospholipide, insbesondere Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylethanolamin umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytostatikum ausgewählt ist aus der Liste bestehend aus Doxorubicin, Pemetrexed, Melphalan, Amsacrin, Asparaginase, Bevacizumab, Bleomycin, Busulfan, Irinotecan, Carmustin, Daunorubicin, Cisplatin, Dactinomycin, Gancyclovir, Cytarabin, Dacarbazin, Cytarabin, Vindesin, Oxaliplatin, Cyclophosphamid, Cetuximab, Etoposid, Epirubicin, Fludarabin, 5 -Fluorouracil, Gemcitabin, Trastuzumab, Ifosfamid, Topotecan, Cladribin, Alemtuzumab, ituximab, Methotrexat, Mitomycin, Mitoxantron, Gemtuzumab, Carboplatin, Aldesleukin, Bendamustin-hydrochlorid, Paclitaxel, Docetaxel, Thiotepa, Arsentrioxid, Vinblastin, Bortezomib, Azacitidin, Vincristin, Vinorelbin, Cidofovir und idarubicin.
Verfahren zur Freisetzung eines Zytostatikums aus einer Zusammensetzung umfassend einen Wirkstoffträger in Form eines Liposoms gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass amphiphile Stoffe gemäß der Formel (I, I* und/oder Ia) enthalten in dem Wirkstoffträger der Zusammensetzung an ihrer Disulfidgruppe, in einen hydrophoben und einen hydrophilen Anteil gespalten werden.
10. Verwendung der Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 als Medikament.
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