JP2007533750A - 緩和なチオール分解条件下で遊離可能なポリマー結合体 - Google Patents

Abstract

医薬又は蛋白質のような、アミン−又はヒドロキシル−含有化合物から誘導される配位子に結合された、脂質、又はポリエチレングリコールのような親水性ポリマーを有する式（Ｉ）：

の結合体は貯蔵の条件下で安定であり、かつ、緩和なチオール分解条件下で開裂が可能であり、望ましくない副生物を生成することなく、アミン−又はヒドロキシル−含有化合物をその本来の形態で再生する。

Description

本発明は、医薬又は蛋白質のようなアミン−又はヒドロキシル−含有化合物から誘導される配位子に、開裂可能な結合をした、脂質、又はポリエチレングリコールのような親水性ポリマーを有する結合体に関する。本結合体は、緩和なチオール分解条件下で開裂でき、アミン−又はヒドロキシル−含有化合物を本来の形態で再生する。

文献
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ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性ポリマーは、ポリペプチド、医薬及びリポソームのような種々の基質の免疫原性を低減及び／又は血液循環寿命を改良するためにその基質の修飾用に用いられている。例えば、非経口投与された蛋白質は免疫原性であり得て、生体内で迅速に分解され得る。従って、患者において治療に有用な蛋白質の血中濃度を得ることは困難であり得る。それらの困難を克服するための取り組みとして蛋白質へのＰＥＧの結合化が記載されている。米国特許第４，１７９，３３７号においてＤａｖｉｓらは、より少ない免疫原性を有し、実質的な割合の生理的活性を維持するＰＥＧ−蛋白質結合体を生成するために、酵素及びインシュリンのような蛋白質にＰＥＧを結合させることを開示している。Ｖｅｒｏｎｅｓｅら［Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１１巻：１４１−１５２頁（１９８５年）］は、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼを改変するためにポリエチレングリコール類をクロロギ酸フェニルで活性化することを開示している。米国特許第４，７６６，１０６号及び第４，９１７，８８８号においてＫａｔｒｅらは、ポリマー結合化により蛋白質を可溶化することを開示している。米国特許第４，９０２，５０２号（Ｎｉｔｅｃｋｉら）及びＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／１３５４０（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．）には、免疫原性を低減させ、半減期を長くするために、組み換え型蛋白質へのＰＥＧ及び他のポリマーの結合化が記載されている。

リポソームの血液循環寿命を改良することにおける使用のためのＰＥＧも記載されている（米国特許第５，１０３，５５６号）。細網内皮系により認識され除去されることからリポソームをマスクする又は遮蔽するために、ＰＥＧが脂質の頭部極性基に共有結合されている。

蛋白質のような生物学的に活性な分子の、ポリマーでの修飾は、その分子の活性をしばしば低減するので、開裂可能な結合を有する蛋白質−ポリマー結合体が用いられている。Ｇａｒｍａｎ（米国特許第４，９３５，４６５号）は、可逆的な結合基により蛋白質に結合された水溶性ポリマーで修飾された蛋白質を記載している。遊離可能なＰＥＧ鎖を有するリポソームも記載されており、ＰＥＧ鎖は、ｐＨにおける変化のような適する刺激にさらされたときにリポソームから遊離される（ＷＯ９８／１６２０１）。

いくつかの場合において、リポソーム又は分子からのポリマーの遊離は、その分子又は脂質の構造における変化をもたらす。それらの化学的に修飾された構造は、生体内で予測できない、潜在的に負の効果を有し得る。

ＰＥＧ−医薬結合体の開裂が医薬を遊離する結合化戦略が米国特許第６，３４２，２４４号及び第６，２１４，３３０号に記載されている。前者には、チオキノンメチドのような副生物の遊離を有する、ジチオベンジル部分の開裂が記載されている。後者には、クマリンのような副生物の遊離を有する、加水分解に不安定なアリールエーテルの開裂が記載されている。

一般的に、貯蔵条件下で結合が安定であるが、生体内で開裂可能であり、望ましくない副生物の生成がなく、結合された分子をその最初の形態で遊離する、開裂可能な結合体を提供することが望ましい。

発明の概要
従って、親水性ポリマーに共有的に、しかし可逆的に結合された配位子を有する結合体を提供することが本発明の目的である。その配位子は、アミン−又はヒドロキシ−含有化合物から誘導される。その結合が開裂されると、その配位子はその本来の形態で再生される。

一つの面において、本発明は、一般構造Ｉ:

［構造中、Ｒ^１Ｘはアミン−又はヒドロキシル−含有配位子であり、Ｘは酸素、第一級窒素又は第二級窒素であり、
Ｍは、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルは、ヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれ、
Ｄ形状構造は、Ｍ及びジスルフィド基Ｓ−Ｓがシス−１，２−配向又はオルト配向で結合している５−又は６−員環を表し、
Ｒ^ａは、水素、又は前記環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表し、
Ｌは、更にアリール又はアラルキルで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を形成し得て、
Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した脂質又は親水性ポリマーを更に有する]
を有する結合体を包含する。

本結合体は典型的には、Ｌ又はＲ^ａに結合した親水性ポリマーを有する。選ばれた態様では、Ｌ及びＲ^ａは環を形成しない。

親水性ポリマーは、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリ（ヒドロキシプロピル）オキサゾリン、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリレート、ポリ（ヒドロキシエチル）アクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアスパルタミド及びそれらのコポリマーであることができ、好ましい親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールのようなポリエーテルである。

５−又は６員環は、好ましくは芳香環、より好ましくはベンゼン環である。一つの態様では、Ｍがシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−であり、結合体が構造Ｉａ：

を有する。

この態様では、Ｒ^ｂ及びＲ^ｃの各々は好ましくは水素である。好ましくは、親水性ポリマーはＬに結合しており、Ｒ^ａに結合していない。

Ｒ^ａは、例えば、水素、又はＲ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、フルオロ、クロロ（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる単一の置換基であることができる。好ましくは、Ｒ^ａは、水素、又はＲ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、シアノ、ニトロ、フルオロ及びクロロ（式中、Ｒはメチル又はエチルである）から選ばれる単一の置換基である。選ばれた態様において、Ｒ^ａは水素である。

好ましくは、Ｌは構造、−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−を有し、−ＣＲ^３Ｒ^４がジスルフィド基に結合しており、Ｒ^３及びＲ^４は、Ｈ、アルキル、アリール及びアラルキルから独立して選ばれ、Ｒ^５及びＲ^６は、Ｈ及びメチルから独立して選ばれる。好ましくは、Ｒ^３及びＲ^４の各々は、水素、メチル、エチル及びプロピルから独立して選ばれる。より好ましくは、Ｒ^４はＨであり、Ｒ^３は、水素、メチル、エチル及びプロピルから成る群から選ばれる。選ばれた態様では、Ｒ^４はＨであり、Ｒ^３は、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５及びＣ_３Ｈ_８から成る群から選ばれる。

上記構造Ｉの一つの態様では、Ｌ及びＲ^ａは、シス−１，２−配向又はオルト配向で５−又は６−員環に結合しており、Ｌ及びＲ^ａは一緒に５−乃至７−員環の一つを更に形成している。そのような態様において、親水性ポリマーは５−又は６−員環（すなわち、「Ｄ形状構造」、好ましくはベンゼン環）に結合し得るか、又はＬ及びＲ^ａにより形成された更なる５−乃至７−員環の一つに結合し得る。

Ｒ^１Ｘにより表される配位子は典型的には脂質又は生物学的に活性な化合物である。選ばれた態様において、その配位子は、例えばポリペプチド、アミン含有医薬又はアミン含有脂質であることができるアミン含有配位子である。アミン含有脂質は好ましくは、二つの炭化水素の尾部基を有する燐脂質である。配位子がポリペプチドから誘導される場合、そのポリペプチドは、例えば酵素又はサイトカインであることができる。

関連する面において、本発明は、アミン−又はヒドロキシル−含有分子の、構造ＩＩ：

［構造中、Ｚは、ヒドロキシル基又はアミノ基により置換され得る脱離基であり、
Ｍは、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルはヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれ、
Ｄ形状構造は、Ｍ及びジスルフィド基Ｓ−Ｓがシス−１，２−配向又はオルト配向で結合している５−又は６−員環を表し、
Ｒ^ａは、水素、又は前記環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表し、
Ｌは、更にアリール又はアラルキルで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を形成し得て、
Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した脂質又は親水性ポリマーを更に有する]
を有する化合物との反応により得られる結合体を提供する。

構造ＩＩの好ましい態様、すなわち、変数Ｍ、Ｌ及びＲ^ａ並びに脂質又は親水性ポリマーに関して、は、上記の構造Ｉに関して記載したそれらに対応する。例えば、一つの態様では、本化合物は構造ＩＩａ：

（式中、５−又は６−員環はベンゼン環であり、Ｍはシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−である）
を有する。

脱離基Ｚは、好ましくは、クロリド、ｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシテトラヒドロフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシピリジン、４−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジン、１−ヒドロキシ−６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、イミダゾール、トリアゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、ペンタフルオロフェノール、トリフルオロフェノール及びトリクロロフェノールから成る群から選ばれる。

他の面において、本発明は、先に記載した構造Ｉを有する結合体を血流に投与し、それにより、生体内で、前記結合体のチオール開裂反応によりアミン−又はヒドロキシル−含有分子Ｒ^２ＸＨが前記結合体から遊離されることによる、血流にアミン−又はヒドロキシル−含有分子Ｒ^２ＸＨを投与する方法を提供する。本結合体の好ましい態様は、先に記載した通りである。本方法は、開裂反応により遊離される蛍光部分の検出により、前記分子の遊離をモニターすることを更に含み得る。

更なる面において、本発明は、親水性ポリマー鎖の表面被覆を有し、先に記載した構造Ｉ（構造中、Ｒ^１Ｘはアミン−又はヒドロキシル−含有脂質、好ましくは燐脂質を表す）を有する脂質−ポリマー結合体を含有するリポソームを提供する。構造Ｉ中の他の変数の好ましい態様は先に記載した通りである。本リポソームは、閉じ込められた治療剤を含有し得る。関連する面において、本発明は、そのようなリポソームを含有し、親水性ポリマーに安定して結合した小胞体形成脂質をさらに含有するリポソーム組成物を提供する。好ましくは、親水性ポリマーに結合した脂質の総モル％は１％乃至約２０％である。本リポソーム組成物の好ましい態様では、小胞体形成脂質に安定して結合している親水性ポリマーは、構造Ｉの結合体に含有された親水性ポリマーよりも短い。

又、先に記載された結合体、及び塩水、緩衝液等のような医薬的に容認できる運搬物質を含有する組成物も提供される。

本発明のそれらの及び他の目的及び特徴は、下記の、発明の詳細な記載を添付図面と組み合わせて読むと、より完全に認識されるであろう。

発明の詳細な記載
Ｉ．定義
本明細書において用いられている「ポリペプチド」、特定の長さに関する限定がない、アミノ酸のポリマーである。従って、例えば用語、ペプチド、オリゴペプチド、蛋白質及び酵素がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語には又、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、燐酸化等も含まれる。

本明細書に用いられている「親水性ポリマー」は、室温において、ある程度の水への溶解度をそのポリマーに与える、水中に可溶性の部分を有するポリマーをいう。例としての親水性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド、前記ポリマー類のコポリマー類及びポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマーが含まれる。それらのポリマーの多くの性質及び反応は米国特許第５，３９５，６１９号及び第５，６３１，０１８号に記載されている。

「反応性官能基を有するポリマー」又は「結合のための結合機構を有するポリマー」は、共有結合を形成するために他の化合物との反応のために、修飾された、典型的には（しかし、必ずではない）末端部分において修飾されたポリマーをいう。そのような反応性官能基を有するためにポリマーを官能化するのに有効な反応技法は、当業者により容易に決定され、及び／又は例えば、米国特許第５，６１３，０１８号；ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＥｕｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒ．Ｊ．、１９巻（１２）：１１７７−１１８３（１９８３）；又はＺａｌｉｐｓｋｙらによるＢｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４巻（４）：２９６−２９９（１９９３）に開示されている。

本明細書において用いられている「アルキル」は、いずれかの炭素原子から一つの水素原子の除去によりアルカンから誘導され、かつ式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１を有する基をいう。分岐状のアルカン類の末端炭素原子からの一つの水素原子の除去により誘導される基は、ノルマルアルキル（ｎ−アルキル）基：Ｈ[ＣＨ_２]_ｎの部分集合を形成する。基ＲＣＨ_２−、Ｒ_２ＣＨ−（ＲはＨではない）及びＲ_３Ｃ−（ＲはＨではない）は、それぞれ第一級、第二級及び第三級アルキル基を表す。

「低級アルキル」は、１−６の、より好ましくは１−４の、炭素原子を有するアルキル基をいう。

「ヒドロカルビル」は、炭素及び水素から成る基、すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル及び非複素環アリールを包含する。

「アリール」は、単一環（例えばフェニル）、２つの縮合環（例えばナフチル）又は３つの縮合環（例えばアントラシル又はフェナントリル）を有する置換された又は非置換の一価の芳香族基をいう。この用語は一般的に、フリル、ピロール、ピリジル及びインドールのような、芳香環中に一つ以上の窒素、酸素又は硫黄原子を有する芳香環基であるヘテロアリール基を含む。「置換された」は、アリール基における一つ以上の環水素が弗素、塩素又は臭素のようなハロゲン化物で、一つ又は二つの炭素原子を有する低級アルキル基で、又はニトロ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、メトキシ、ハロメトキシ、ハロメチルもしくはハロエチルで置き代えられていることを意味する。

「アラルキル」とは、アリール基、例えばベンジル及びフェネチルで更に置換されている低級アルキル（好ましくはＣ_１−Ｃ_４、より好ましくはＣ_１−Ｃ_２）置換基をいう。

「脂肪族ジスルフィド」結合とはＲ’−Ｓ−Ｓ−Ｒ’’（Ｒ’ 及びＲ’’の各々は、さらに置換され得る、線状の又は分岐状のアルキル鎖である）の形態の結合をいう。

本明細書に用いられている「安定な」結合とは、本明細書で記載されているジスルフィド結合よりも、生体内で、かなり、より安定である官能基を含む結合をいう。例には、アミド類、エーテル類及びアミン類が含まれるが、それらに限定されない。

「小胞体形成脂質」とは、二重層膜の内部の疎水性領域と接触している疎水性部分と、二重層膜の外部の極性表面に配向した極性頭部基部分を有している、疎水性部分及び極性の頭部基部分を有する両親媒性脂質をいい、燐脂質により例示されるように、水中で二重層小胞体を即座に形成し得るか、又は脂質二重層に安定に組み込まれる。そのような小胞体形成脂質は典型的には一つ又は二つの疎水性アシル炭化水素鎖又は一つのステロイド基を含み、極性頭部基においてアミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールのような化学的に反応性の基を有し得る。例には、２つの炭化水素鎖が典型的には長さが約１４−２２炭素原子であり、不飽和の種々の程度を有する、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）のような燐脂質が含まれる。他の小胞体形成脂質には、セレブロシド類及びガングリオシド類のような糖脂質、及びコレステロールのようなステロール類が含まれる。

ＩＩ．本発明の、貯蔵安定で生体内開裂可能な結合体
Ａ．構造
本発明は、生物学的に活性な分子又はリポソームの脂質構成成分のような分子が、生体内で開裂可能な結合により更なる部分に結合している結合体を提供する。典型的には、分子の薬理学的な性質を高めるために、例えば免疫原性を低減させるために及び／又は投与後の人体内における溶解度又は循環時間を増大させるために、結合部分が提供される。次に、その結合は生体内で開裂され、生物学的に活性な最初の形態でその分子が遊離する。

しばしば、本結合体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合された、蛋白質又は他のアミン−もしくはヒドロキシル−含有分子を有する。しかし、結合体、例えば、高められた胃腸管系の及びＢＢＢ輸送のために脂質−蛋白質結合体又は脂質−医薬結合体、表面改質されたリポソームにおける使用のための脂質−ポリマー結合体等、は、実際には適する官能基を有する２つの分子の間で生成され得る。

一つの面において、本発明は、脂質又はポリマーに結合された下記の一般構造Ｉ：

を有するジスルフィド含有結合体を提供する。

本構造Ｉでは、Ｒ^１Ｘはアミン−又はヒドロキシル−含有配位子を表し、Ｘは、本結合体の開裂の後に遊離される分子（例えばＲ^１ＸＨ又はＲ^１ＸＨ_２）から誘導される酸素、第一級窒素又は第二級窒素である。前記分子は、蛋白質、ポリペプチド又は小さな分子の医薬化合物のような生物学的に活性な化合物であることができる。代替としては、その配位子は、アミン含有脂質、典型的には燐脂質、例えば二つの炭化水素の尾部基を有するホスファチジルエタノールアミン、から誘導され得る。

式Ｉにおける“Ｄ”形状構造は５−又は６−員環を表す。その環は、飽和され得ており、例えば、シクロヘキサン、シクロペンタン、又はテトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、ピロリジンもしくはモルホリンのような複素環であることができる。その代替として、その環は、不飽和であり得て、例えばシクロヘキセンであることができる。その環は、好ましくは芳香環、例えばベンゼン、ナフタレン又はアントラセンであり、より好ましくはベンゼンである。又、一つ以上の環原子（基Ｓ−Ｓ及びＭが結合している原子を除いて）が、窒素、酸素又は硫黄で置換されている複素芳香環も含まれる。好ましい単環系には、ピリジン、ピリミジン、２，４−イミダゾール、２，４−チアゾール及び２，４−オキサゾール、並びに２，５−ピロール、２，５−フラン及び２，５−チオフェンが含まれる。その環は好ましくは炭素環である。その環は最も好ましくはベンゼン環である。

基Ｍ及びジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）は、シス−１，２−配向又はオルト配向で５−又は６−員環に結合されている。M自体は、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルはヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれる。好ましくは、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ及びメチルから独立して選ばれ、一つの態様では、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々はＨである。

好ましい態様では、前記環はベンゼン環であり、Ｍはシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−であり、構造Ｉａ：

を与える。

構造Ｉ及びＩａに関して、Ｒ^ａは、水素、又は５−もしくは６−員環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビル、好ましくはＣ_１−Ｃ_４ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表す。ハロゲンは好ましくはフルオロ又はクロロであり、Ｒは好ましくは０乃至２つのハロゲン置換基を有する。

好ましくは、更なる縮合環は、存在する場合、５つ乃至７つの環原子、好ましくは５つ又は６つの環原子を有する。いずれの安定な縮合環系も含まれ得る。例には、ナフタレン、２，６−又は２，７−ベンズイミダゾール、２，６−又は２，７−ベンゾチアゾール及び２，６−又は２，７−ベンゾオキサゾール、２，４−又は２，６−インドール、キノリン、並びに５−環又は６−環における一つ以上の非縮合化炭素原子が窒素で置換されている類似体が含まれるが、それらに限定されない。

選ばれた態様では、Ｒ^ａは、先に記載したように、水素、又はＲ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ及びハロゲン（式中、Ｒは、先に定義した通りである）から選ばれる単一の置換基である。更なる態様では、Ｒ^ａは、水素であるか、又はＲ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、シアノ、ニトロ、カルボキシル、フルオロ及びクロロ（式中、Ｒは、メチル又はエチルである）から選ばれる単一の置換基である。一つの態様では、Ｒ^ａは水素である。

Ｌは、さらにアリールで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基を表す。好ましくは、Ｌは構造、−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−を有し、−ＣＲ^３Ｒ^４がジスルフィド基に結合しており、Ｒ^３及びＲ^４は、Ｈ、アルキル、アリール及びアラルキルから独立して選ばれ、Ｒ^５及びＲ^６は、Ｈ及びメチルから独立して選ばれる。

構造Ｉにおいて、Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を、好ましくは５−乃至７−員環の一つを形成し得る。その場合、Ｒ^ａ及びジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）は、好ましくは、シス−１，２−配向又はオルト配向で５−又は６−員環（Ｉａにおいてベンゼン環）に結合している。

本結合体は、構造Ｉにおける、Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した、脂質又は親水性ポリマー、すなわち、配位子Ｒ^１Ｘが結合される部分、を更に有する。脂質又は親水性ポリマーがＲ^２で表される場合に、結合の可能な部位の例は下記の構造（ｉ−ｉｖ）で表される。例えば、脂質又は親水性ポリマーは、下記の構造（ｉ）におけるようにＬの末端に結合され得るか、又は直接［例えば構造（ｉｉ）］又は置換基Ｒ^ａを介して［例えば構造（ｉｖ）］、５−又は６−員環に結合され得る。又、Ｒ^ａ及びＬ自体が結合して環を形成［構造（ｉｉｉ）］し、Ｒ^２がこの環に結合（典型的にはＲ^ａ又はＬのいずれかへの結合によって）する態様も含まれる。

選ばれた態様［例えば、（ｉ）及び（ｉｉ）］では、Ｒ^ａ及びＬは環を形成しない。更なる態様では、Ｒ^２はＬの末端に結合している［下記の構造（ｉ）］。

ＬがＲ^ａに結合して環を形成するか否かは、その結合体が、開裂時に２つの又は３つのフラグメント（そのうちの一つは、その本来の形態での分子、Ｒ^１ＸＨ又はＲ^１ＸＨ_２である）を生成するか否かを決定する。上記構造により示されているように、波線が、起り得る開裂の位置を表す場合、構造（ｉ−ｉｉ）は開裂時に３つのフラグメントを生成し、結合体（ｉｉｉ−ｉｖ）は開裂時に２つのフラグメントを生成する。本発明のこの面については、後に、より詳細に記載する。

更に後にも記載されているように、結合体の開裂の速度を調節するために、ジスルフィド基の隣の位置におけるＬの置換の変形体（例えば、Ｌが−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−である場合、Ｒ^３及び／又はＲ^４の変形体）が用いられ得る。例えば、開裂の、より迅速な速度を達成するために、Ｒ^３及びＲ^３は水素である。開裂の、より遅い速度は、Ｒ^３及びＲ^４の１つ又は両方についてアルキル、アラルキル又はアリール基を選ぶことにより、ジスルフィドを立体的に妨げることにより達成される。好ましくは、Ｒ^３及びＲ^４は、水素及び低級（Ｃ_１乃至Ｃ_６）アルキルから独立して選ばれる。選ばれた態様において、Ｒ^３及びＲ^４の各々は、水素、メチル、エチル及びプロピルから独立して選ばれる。

脂質又は親水性ポリマーは、典型的には、アミド、エステル、カルバメート又はそれらの硫黄類似体（アミド類及びカルボネート類が好ましい）のような安定な結合基を介して構造Ｉに結合される。そのような結合基による結合の方法は、本技術分野でよく知られている。例えば、そのような基を介してＰＥＧを種々の部分に結合させる方法は、例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９９，２００１；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，２００２；Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００２；Ｍｏｌｉｎｅｕｘ，２００２，２００３；Ｈａｒｒｉｓら、２００３；及び他の文献に記載されている。

親水性ポリマー又は脂質は、又、標的化部分、典型的には遊離の末端に結合された標的化部分も有し得る。そのような標的化部分には、共有の米国特許第６，６６０，５２５号に記載されたものが含まれ、それらの記載を引用により本明細書に組み込む。標的化部分の非限定的な例には、上皮癌及び骨髄幹細胞を標的にするためには抗体、葉酸塩；肝細胞を標的にするためには燐酸ピリドキシル、ガラクトース；肝細胞及び血管内皮細胞を標的にするためにはアポリポ蛋白質；脳内皮細胞を標的にするためにはトランスフェリン；腫瘍上皮細胞を標的にするためにはＶＥＧＦ；血管内皮細胞を標的にするためにはＶＣＡＭ−１又はＩＣＡＭ−１；好中球及び白血球を標的にするためにはＭａｃ−１；ＣＤ４＋リンパ球を標的にするためにはＨＩＶ ＧＰ１２０／４１又はＨＩＶ ＧＰ１２０ Ｃ４ドメインペプトマー；活性化血小板を標的にするためにはフィブロネクチン；及びアテローム性動脈硬化性プラークにおける内皮細胞及び平滑筋細胞を標的にするためにはオステオポンチンが含まれる。

種々の官能性側基を有するポリペプチド配位子のようないくつかの配位子では、複数のポリマーＲ^２が配位子に結合され得る。それらは、単独での又は生体内でより安定な結合と組み合わされて、先に示された複数の構造Ｉを介して結合され得る。そのポリマーの分子量の選択は、その配位子に結合したポリマー鎖の数に依存し得て、より大きな分子量のポリマーは、結合されたポリマー鎖の数が小さい場合にしばしば選ばれ、又、逆も同じである。

図１は、本発明による例示的な結合体の構造を示している。その結合体は、上記構造Ｉａの一つの態様であり、Ｒ^ａ乃至Ｒ^ｃの各々が水素である。従って、その結合体は、ジチオシンナメート（ＤＴＣ）構造に基づいている。

その結合体におけるＲ^２は、式、ＣＨ_３Ｏ(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｎ（式中、ｎは好ましくは約１０乃至約２，３００であり、それは約４４０ダルトン乃至約１００，０００ダルトンの分子量に相当する）より表され得る親水性ポリマーであるメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。そのポリマーの分子量の選択は、結合された配位子の選択に、ある程度依存している。リポソームにおける使用のために、配位子がアミン含有脂質から誘導される態様では、ＰＥＧ分子量の好ましい範囲は約７５０ダルトン乃至約１０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン乃至約５，０００ダルトンである。配位子がアミン含有ポリペプチドから誘導される態様では、ＰＥＧ分子量の好ましい範囲は約２，０００ダルトン乃至約４０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００ダルトン乃至約２０，０００ダルトンである。Ｒ^２は種々の親水性ポリマー及び脂質から選択され得ることが認識されるであろう。例示的なポリマーは先に記載されている。

この結合体において、Ｌは−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−であり、式中、Ｒ^４乃至Ｒ^６は水素であり、Ｒ^３は変わり得る。先に記載したように、Ｒ^３は水素、アルキル、アリール又はアラルキルであり得る。この結合体におけるＸＲ^１は一級アミン含有分子、例えば医薬又は蛋白質である。ｍＰＥＧが、ウレタン（カルバメート）基を介してＬの末端に結合している。

Ｂ．合成
図２は、下記の実施例１−６にも記載されている、例示的なＰＥＧ−蛋白質結合体の合成のための例示的方法を示している。その技法は、例えば、異なる分子Ｒ^１又はポリマーＲ^２の置換により、又は結合基及び／又は環における置換を変えることにより、有機合成及び生物結合化学の技術における熟練者により容易に変えられ得る。

先に記載したように、好ましい態様では、ジスルフィドが結合される環はベンゼン環であり、Ｍはシス−オレフィンを含む。この態様によるシス−メルカプト桂皮酸は、公表された操作（Ｐａｎｅｔｔａ及びＲａｐｏｐｏｒｔ，１９８２）により、オルトエステル置換アルキンのチオフェノールへの付加により合成され得る。この操作は、下記の実施例１に記載されているように、チオフェノール（１）及びオルトプロピオール酸トリエチルからシス−メルカプト桂皮酸（２）を製造するために用いられた。

図２において、結合基Ｌの結合は、その遠位末端において、更なる結合のために有用な官能基、この場合はアミノ基、を有するアルカンチオールとの反応により達成される。示された作用剤、２−メルカプトプロピルアミンヒドロクロリド（３、Ｒ＝ＣＨ_３）は、対応するアミノアルコールから、Ｏｗｅｎ，１９６７年の方法により製造され得る。種々のＲ基を有する類似のアミノアルキルチオール誘導体が同様の様式で製造され得る。

混合されたジスルフィド（４）は、例えば、ＭｕｋａｉｙａｍａらによるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５６巻：５９０７−５９０８（１９６８）の方法により、アミノアルカンチオールの、アジドカルボン酸ジエチルのような活性化剤との反応、続いて芳香族チオールとの反応により生成され得る。代替として、Ｓ．Ｊ．ＢｒｏｉｓらによるＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９２巻：７６２９−３１（１９７０）に記載されているように、アミノアルカンチオールで活性化されたジスルフィドを生成するために塩化メトキシカルボニルスルフェニルが用いられ得る。その活性化されたジスルフィドは芳香族チオールと反応され得て、ジスルフィド（４）を生成する（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９９参照）。

次に、Ｒ^２部分の結合のために、この場合、ウレタン（カルバメート）結合によるＰＥＧの結合のために、Ｌの末端アミノ基が用いられる。それは、種々の公表された手順［例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ及びＭｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、ワシントンＤＣ、３１８−３４１頁（１９９７）における］により、ｍＰＥＧ−クロロホルメートとの反応により達成され得る。ポリマーのクロロホルメートは、ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５巻：１００（１９９２）により、無水ｍＰＥＧ−ＯＨ溶液のホスゲン化により生成され得る。代替としては、前記結合は、又、公知の方法により、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート及び末端アミンの反応により形成され得る［例えば、Ｈ．Ｃ．ＣｈｉｕらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４巻：２９０−２９５（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、１９９２；及びＺａｌｉｐｓｋｙ及びＭｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ、１９９７；先に引用した両方を参照］。

次に、標準法により、蛋白質（又は、結合される他の分子、例えばアミン含有−又はヒドロキシ−含有医薬）を遊離カルボキシル基に結合させる。例えば、カルボジイミド媒介エステル化操作を用いて、その酸を、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５）に変換し得る［例えば、Ｇ．Ｗ．ＡｎｄｅｒｓｏｎらによるＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８６巻：１８３９（１９６４）を参照］。代替として、それは、作用剤、Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートを用いて達成され得る［Ｒ．ＫｎｏｒｒらによるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３０巻（１５）：１９２７−３０（１９８９）；Ｍ．ＷｉｌｃｈｅｋらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：４９１（１９９４）］。

蛋白質のアミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させるための多くの一般的な手順がある。代表的な操作については、例えば、ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５巻：１００（１９９２）又はＨ．Ｃ．ＣｈｉｕらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４巻：２９０（１９９３）を参照。

そのような反応の種々のパラメーター、例えば、ＮＨＳ作用剤の量、蛋白質におけるアミノ基の数、反応緩衝液のｐＨ、温度及び反応継続時間、に依存して、種々の程度のＰＥＧ化を有するある範囲の蛋白質−ポリマー結合体種を得ることができる。必要な場合、一般式、（ｍＰＥＧ）_ｎ−蛋白質の結合体混合物が種々のクロマトグラフ技術により分別され得る。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより、１：１結合体（すなわちｎ＝１の場合）を単離することはしばしば可能である。

先の合成に関して、本発明は又、アミン−、ヒドロキシ−又はカルボキシル−含有化合物の、一般的な構造式ＩＩ：

（式中、Ｍ、Ｒ^ａ及びＬは先に記載した通りであり、Ｚは脱離基である）を有する化合物との反応により得られる結合体を含有する組成物を含み、構造式ＩＩを有する化合物は、Ｌに、Ｒ^ａに、又は先に記載されているように、前記のＤ形状構造により表される５−又は６−員環に結合した脂肪又は親水性ポリマーをさらに有する。

脱離基Ｚは、ＤＳＰＥ、ポリペプチド又はアミン含有医薬のようなアミン−又はヒドロキシ−含有配位子化合物との反応により置換される。脱離基は、前記配位子化合物における置換基の反応性によって選択される。適する脱離基には、クロリド、ｐ−ニトロフェノール、ｏ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシテトラヒドロフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−グルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシピリジン、４−ヒドロキシピリジン、２−ヒドロキシピリジン、１−ヒドロキシ−６−トリフルオロメチルベンゾトリアゾール、イミダゾール、トリアゾール、Ｎ−メチル−イミダゾール、ペンタフルオロフェノール、トリフルオロフェノール及びトリクロロフェノールが含まれる。典型的には、そのような反応は、配位子へのエステル又はアミド結合を形成する。

Ｃ．結合体の開裂
先に記載したように、結合体の開裂は、ジスルフィド結合の開裂により開始される。それは生体内での、システイン又はグルタチオンのような内発性作用剤により開始されるチオール分解機構により生じる。開裂の速度は、ジスルフィド基の隣の結合基の構造を変えることにより調節され得て、開裂速度は、後に記載する方法を用いて生体外で評価され得る。

開裂反応は、結合体の構造に依存して、最初に２つ又は３つの開裂生成物を生成し得る。例えば、図３は、図１のｍＰＥＧ−ＤＴＣ−(ＮＨ−配位子)結合体のチオール分解開裂の、３フラグメント開裂反応における機構を示している。ｏ−ジチオシンナミル部分のジスルフィド基は、例えば、システイン（示されているように）又は他の天然に存在する還元剤の存在下で、チオール分解により開裂される。結合体の開裂及び分解に十分なチオール分解条件を人為的に引き起こすために又は開裂を促進するために外来の還元剤も与えられ得る。

図３に示されているように、開裂時に、５−又は６−員環（図３ではベンゼン環）における生成したチオール基が、閉環反応において、アミド部分からのアミン含有配位子を置換する。アミン含有化合物は、その本来の、修飾されていない形態で再生される。Ｒ^２、すなわちこの場合はｍＰＥＧ、は、そのとき、チオール含有開裂剤、システインに結合されているＬに結合されたままである。閉環反応において生成された三番目の物質は、その結合体の置換に依存して、公知の安定な化合物であるチオクマリン、又はその誘導体である。

図４は、Ｌ及びＲ^ａが結合している態様における結合体の、２−フラグメント開裂をもたらす開裂を示している。図１Ｃの態様では、結合体は、ジチオシンナミル基において再び構造化されている。前記構造（ｉｖ）におけるようにＲ^２は芳香環に結合されている。例えば、Ｒ^２は、図１におけるように、カルバメートを介して結合されたＰＥＧであることができる。

代替として、Ｒ^２は、前記構造（ｉｉｉ）におけるように、Ｌ−Ｒ^ａ環に結合され得る。開裂時に、結合された分子は、同様の機構により、その本来の形態（例えば、Ｒ^１ＮＨ_２）で再び遊離される。二番目のフラグメントは、開裂剤の残基（図４において、システインとして示されている）とポリマー又は他の基Ｒ^２との両方に結合されたチオクマリン誘導体である。

生物学的に適切な条件下での結合体のチオール分解開裂は、システイン、グルタチオン又はアルブミンのような生理的に存在するチオールとのインキュベーションにより示され得る［ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＰｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２８巻：７３（２００１）］。遊離蛋白質又は他の遊離された分子の発生はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされ得る。開裂の速度は、時間とともに消失する結合体種の濃度を観察することにより、又は遊離蛋白質（又は他の遊離された分子）が出現するときに、それを測定することにより、モニターされ得る。チオクマリン誘導体は発色性であると一般的に報告されているので、遊離されたチオクマリン又はその誘導体は同様に一般的に容易に検出され得る。チオクマリンの遊離の速度は、蛍光分光法により観察され得る。

結合された分子が結合された形態において生物学的に不活性である場合、生物学的活性の復活を観察することにより開裂をモニターすることができる［例えば、ＰＥＰＴＩＤＥＳ：ＴＨＥ ＷＡＶＥ ＯＦ ＴＨＥ ＦＵＴＵＲＥ（Ｍ．Ｌｅｂｌ、Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ編、Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃ．、２００１、９５３頁）におけるＺａｌｉｐｓｋｙらによる“Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”；Ｒ．Ｂ．ＧｒｅｅｎｗａｌｄらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１４巻：３９５（２００３）を参照］。チオール分解開裂の速度は、ジスルフィド結合の隣のＲ基、例えば、メチルからイソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル等まで、のサイズを大きくすることにより、かなり低減され得る。

本結合体は、還元剤の不存在下で貯蔵される場合に安定性であるという利点、及びチオールのような適する還元剤の存在下では、医薬として有用な速度で開裂するという利点を提供する。特に、貯蔵安定性は、開裂可能なフェニルエステルに基づく、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄらによる米国特許第６，２１４，３４０に記載された結合体の貯蔵安定性より優れている。前記エステル類は、一般的にアルキルエステル類より速い速度で加水分解を受ける（例えば、Ｑｕｉｃｋら、１９７８；Ｂｌａｙら、１９８８；１９９２年３月を参照）。周囲貯蔵条件下で、そのような加水分解が起こり得て、ましてや還元性開裂は起こり得る。

ＩＩＩ．本結合体の例示的適用
Ａ．本発明のｍＰＥＧ−脂質結合体を含有するリポソーム組成物
一つの態様では、アミン含有配位子化合物はアミン含有脂質である。本明細書において言及される脂質は、典型的には、少なくともおよそ８つの炭素原子を有する少なくとも一つの炭化水素鎖（“尾部”）、より好ましくは約８−２４の炭素原子を有する一つのアシル炭化水素鎖、を有する水不溶性分子を意図する。好ましい脂質は、アミン含有極性頭部基とアシル鎖を有する脂質である。例示的脂質は、ステアロイルアミンのような単一のアシル鎖又は２つのアシル鎖を有する燐脂質類である。アミン含有頭部基を有する好ましい燐脂質にはホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンが含まれる。単数の又は複数の脂質尾部は、好ましくは約１２乃至約２４の炭素原子を有し、完全に飽和され得るか又は部分的に飽和され得る。一つの好ましい脂質は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。しかし、当業者は、この記載の範囲内に包含される広範囲の脂質を認識するであろう。又、脂質は、本来、アミン基を含有し得るか又はアミン基を含有するために誘導化され得ることを認識するであろう。先に記載したような炭化水素鎖を有しない他の脂質部分、例えばコレステロールアミンも適している。

一つの態様では、本発明の結合体はリポソーム中に配合される。リポソームは種々の治療目的のために、そして特に、全身的適用により治療剤を標的領域又は細胞に運ぶために用いられる閉鎖脂質小胞体である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性ポリマー鎖の表面被覆を有するリポソームは、ポリマー被覆を有しないリポソームよりも長い血液循環寿命を提供するので、医薬運搬体として望ましい。ポリマー被覆におけるポリマー鎖はリポソームを遮蔽し、リポソームのまわりに、水溶媒和したポリマー鎖の「硬いブラシ」を生成する。このように、そのポリマーは、血液蛋白質に対するバリヤーとして作用し、血液蛋白質の結合、並びに大食細胞及び細網内皮系の他の細胞による取り込み及び除去に対してのリポソームの認識を防ぐ。

典型的には、ポリマー鎖の表面被覆を有するリポソームは、脂質混合物中に約１乃至約２０モル％の脂質−ポリマー結合体を含有させることにより製造される。脂質−ポリマー結合体の実際の量は、ポリマーの分子量により、より多量又はより少量にされ得る。

種々の態様において、先に記載した１乃至約２０モル％の脂質におけるポリマー鎖が、本明細書に示された開裂可能な結合構造により、又は好ましい態様では、そのような結合の、生体内で、より安定である結合との組み合わせにより、脂質に結合される。その場合、より高い分子量のポリマー鎖は、好ましくは本明細書に示される開裂可能な結合構造により結合され、より短いポリマー鎖は、より安定な結合により結合される。

他の態様では、ポリマー鎖のいくらか又はすべてが、遊離末端において、先に記載したように標的化部分を有する。

本発明のポリマー−脂質結合体、好ましくはＲ^３及び／又はＲ^４（構造ＩについてのＬの定義において）が水素でないポリマー−脂質結合体、を含有するリポソームは、ポリマーと脂質が脂肪族ジスルフィド結合により結合されているポリマー−脂質結合体を含有するリポソームよりも長い血液循環寿命を有する。

重要なことに、本発明のポリマー−脂質結合体の開裂は、非修飾形態における最初の脂質の再生をもたらす。天然でない修飾された脂質は生体内で望ましくない作用を有し得るので、その再生は望ましい。同時に、本結合体は還元剤の不存在下で貯蔵されるときに安定である。

Ｂ．ポリペプチド結合体
他の態様では、本発明は、アミン含有配位子化合物がポリペプチドである、先に記載した結合体を包含する。本発明のポリマー−ポリペプチド結合体の製造についての好ましい合成反応技法では、図２において５で示されているようなｍＰＥＧ−ＤＴＣ−脱離基化合物が、実施例１−５に記載された合成経路のような合成経路により製造される。前記脱離基は、例えば、示されているように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェニルカーボネート又は先に記載した他のいずれかであることができる。ジスルフィドの隣のＲ基は、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５等であることができ、ジスルフィド開裂の望ましい速度により選ばれる。次に、ｍＰＥＧ−ＤＴＣ−ＮＨＳ化合物、５、又は同等物は、ポリペプチドにおけるアミン部分に結合され、ウレタン（カルバメート）結合を形成する。

ＰＥＧのようなポリマー鎖の、ポリペプチドへの結合は、しばしば、ポリペプチドの酵素活性又は他の生物学的活性、例えば受容体結合を低減させる。しかし、ポリペプチドのポリマー修飾は、そのポリペプチドの増大した血液循環寿命という利点を提供する。本発明において、ポリマー−ポリペプチド結合体は、患者に投与される。本結合体が循環すると、血中システイン及び他の生体内チオール類のような生理学的還元条件にさらされることにより、ポリペプチドからの親水性ポリマー鎖の開裂が開始される。ポリペプチドから親水性ポリマー鎖が遊離されると、ポリペプチドの生物学的活性が次第に復活する。このように、ポリペプチドは最初、生体分布のために十分な血液循環寿命を有し、ポリマー鎖が開裂すると、時間をかけて、その完全な生物学的活性をとり戻す。

ポリマー鎖のいくらか又はすべてが、遊離末端において、先に記載したように、標的化部分を有し得る。

種々の態様において、ポリマー鎖は、本明細書に示されている開裂可能な結合化構造により、又はそのような結合の、生体内でより安定な結合との組み合わせにより、ポリペプチドに結合される。後者の取り組みは、可逆的結合での、生物学的活性のために必須なポリペプチドにおけるアミノ基へのＰＥＧ鎖の結合をさせ、より安定な結合での、ペプチド活性に必須でないアミノ基への結合をさせる。

先に記載した親水性ポリマーのいずれも使用のために企図されることが認識されるであろう。好ましい態様では、そのポリマーはポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、である。そのポリマーの分子量は、ポリペプチド、ポリペプチドにおける反応性アミンの数及びポリマー修飾結合体の望ましいサイズにより選ばれる。

使用のために企図されるポリペプチドは限定されず、天然産又は組換えにより生成されたポリペプチドであることができる。小さなヒト組換え型ポリペプチドが好ましく、１０−３０ＫＤａの範囲のポリペプチドが好ましい。例示的ポリペプチドには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン類及びインターフェロン類のようなサイトカイン類、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、酵素等が含まれる。ウイルスの表面が、本明細書に記載されているような開裂可能な結合により結合されている一つ以上のポリマー鎖を含有するように改質されているウイルス性ポリペプチドも企図される。セルトランスフェクション用の遺伝子を含有するウィルスの改質は、ウィルスの循環時間を延長し、その免疫原性を低減させ、それにより外来遺伝子の供給を改良する。

Ｃ．アミン含有医薬結合体
本発明の更なる他の態様では、前記の構造Ｉのアミン含有配位子はアミン含有医薬から誘導される。例えば、治療薬の、ＰＥＧでの修飾は、その医薬の血液循環寿命を改良するために、かつ免疫原性を低減させるために有効である。

本結合体は、特定の医薬を提供するのに必要な修飾を用いて先に記載された反応技法のいずれかにより製造される。広範囲の治療薬が反応性アミン部分を有し、本発明は、そのような医薬を、限定なく企図している。例には、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン及びシプロフロキサシンが含まれる。

下記の実施例は、本明細書に記載された発明を更に説明するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１：シス−メルカプト桂皮酸（２）の製造（図２を参照）
本化合物は、以下に記載するような、Ｊ．Ａ．Ｐａｎｅｔｔａ及びＨ．Ｒａｐｏｐｏｒｔ［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４７巻：２６２６−２６２８（１９８２）］により公表された操作により合成され得る。

新たに蒸留したチオフェノール（１；図２参照）（２．０ｇ、１８ミリモル）、オルトプロピオン酸トリエチル［Ｈ．ＳｔｅｔｔｅｒらによるＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ２０７（１９７３年）の操作により製造される］（３．２７ｇ、１９ミリモル）及びピバル酸（１．６ｇ、１５ミリモル）のｐ−シメン、１０ｍｌ中溶液を還流で２６時間加熱した。溶媒を除去し、残渣を、溶離剤としてヘキサン／エーテル（９／１）を用いる、シリカゲルにおけるクロマトグラフにかけ、２．７９ｇ（７５％の収率）の２−メルカプト桂皮酸エチルが淡黄色の液体として得られた：ＩＲ ３０００、１７２０、１６００、１４９５、１４４０ｃｍ^−１；ＮＭＲδ７．６５（ｄ，１Ｈ）、７．１−７．４５（ｍ，４Ｈ）、５．５５（ｄ，１Ｈ）、４．０５（ｑ，２Ｈ）、１．１５（ｔ，３Ｈ）；質量スペクトル Ｃ_１１Ｈ_１２Ｏ_２Ｓについての計算値 質量／電荷 ２０８．０５５８（Ｍ＋）、実測値２０８．０５６０

先の合成された２−メルカプト桂皮酸エチル（１ｇ、５．４ミリモル）を９５％エタノール、１０ｍｌ中に溶解し、ＫＯＨ（０．７５ｇ、１３．４ミリモル）を添加した。その反応混合物を還流で２時間加熱し、次に２５℃に冷却し、５％の水性ＨＣｌで酸性にした。その水性相をエーテルで抽出（３×２０ｍｌ）し、合わせた有機画分を水（２０ｍｌ）及びブライン（２０ｍｌ）で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮し、０．８５ｇ（８７％）の結晶質の桂皮酸２を得た。融点１２８−１２９℃；ＵＶλ_ｍａｘ＝２５０ｎｍ（ε＝７３５０Ｍ^−１・ｃｍ^−１）及び２７５（９７００）；ＮＭＲ δ７．８（ｄ，１Ｈ）、７．１５−７．４５（ｍ，４Ｈ）、５．５（ｄ，１Ｈ）；分析 Ｃ_９Ｈ_８Ｏ_２Ｓについての計算値：Ｃ、６０．０；Ｈ、４．５、実測値：Ｃ、６０．２；Ｈ、４．６

実施例２：２−メルカプトプロピルアミン塩酸塩（３、Ｒ＝ＣＨ _３ ）の製造
本化合物は対応するアミノアルコールから、例えばＴ．Ｃ．ＯｗｅｎのＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１３７３−１３７６（１９６７）により記載された操作により製造することができる。簡単に説明すると、本化合物を硫酸でエステル化し、硫酸アミノアルキルにし、続いて、二硫化炭素及びアルカリで環化し、チアゾリジンチオンを得て、次に、それを加水分解し、本生成物を得る。種々のＲ置換基を有する類似のアミノアルカンチオール誘導体が同様な方法で製造され得る。

ジチオ桂皮酸（ＤＴＣ）結合化合物の生成：
実施例３：混合された二硫化物２−アミノプロピルジチオ桂皮酸（４）の合成
Ｔ．ＭｕｋａｉｙａｍａらによるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、５６：５９０７−５９０８（１９６８）に記載された操作により、２−メルカプトプロピルアミン塩酸塩（３）（実施例２）の、アジドカルボン酸ジエチルとの反応、続いてシス−メルカプト桂皮酸（２）（実施例１）との反応により、混合された二硫化物（４）を得た。代替として、Ｓ．Ｊ．Ｂｒｏｉｓらによる、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９２巻：７６２９−３１（１９７０）において記載されているように、（３）を、メトキシカルボニルスルフェニルクロリドと反応し得て、２−（メトキシカルボニルジチオ）プロピルアミン塩酸塩を生成し、続いて、メルカプト桂皮酸（２）との反応により、混合された二硫化物（４）を生成した［Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１０巻：７０３−７（１９９９）参照］。

実施例４：ｍ−ＰＥＧ−ウレタン結合ジチオ桂皮酸（ｍＰＥＧ−ＤＴＣ、５ａ）の合成
この変換は、２−アミノプロピルジスルファニル桂皮酸（４）（実施例３）の、ｍＰＥＧ−クロロホルメートとの反応により達成され得る。例えば、Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ及びＳ．Ｍｅｎｏｎ−ＲｕｄｏｌｐｈによるＰｏｌｙ(ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ)：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、ワシントンＤＣ、１９９７年、３１８−３４１頁を参照。Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５巻：１００−１１４（１９９２）により、ｍＰＥＧクロロホルメートは、無水ｍＰＥＧ−ＯＨ溶液のホスゲン化により容易に生成される。

代替としては、ウレタン結合は、Ｈ．−Ｃ．ＣｈｉｕらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４巻：２９０−２９５（１９９３）；先に引用したＺａｌｉｐｓｋｙら（１９９２）による文献；又は先に引用したＺａｌｉｐｓｋｙら（１９９７）による文献の操作により、２−アミノプロピルジスルファニル桂皮酸（４）（実施例３）の、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートとの反応により生成され得る。

実施例５：ｍＰＥＧ−ＤＴＣ ＮＨＳエステル（５）の合成
ｍＰＥＧ−ウレタン結合ジチオ桂皮酸（５ａ）は、本技術分野で公知の、例えば、Ｇ．Ｗ．ＡｎｄｅｒｓｏｎらによるＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８６：１８３９（１９６４）；Ｒ．ＫｎｏｒｒらによるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３０巻：１９２７（１９８９）；又はＭ．ＷｉｌｃｈｅｋらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５巻：４９１（１９９４）に記載されているようなエステル化操作を用いて、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換され得る。

実施例６：ｍＰＥＧ−ＤＴＣ−蛋白質結合体（６）の製造
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５）は、種々の公表された操作により、蛋白質のアミノ基と、典型的には、中性又は塩基性のｐＨ（ｐＨ７−９）における水性緩衝液中で反応され得る。代表的な操作については、先に引用されたＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９２）；Ｈ．Ｃ．ＣｈｉｕらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４巻：２９０（１９９３）を参照。ｍＰＥＧ作用剤と、蛋白質におけるアミノ基との比、反応緩衝液のｐＨ、温度及び反応の継続時間のような種々の反応パラメーターにより、種々の程度のＰＥＧ化を有する、ある範囲の結合体種を得ることができる。一般式、（ｍＰＥＧ）_ｎ−蛋白質の結合体混合物が種々のクロマトグラフ技術により分別され得る。ｎ＝１を有する（ｍＰＥＧ）_ｎ−蛋白質結合体を、例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することはしばしば可能である。

実施例７：ｍＰＥＧ−ＤＴＣ−蛋白質結合体のチオール分解開裂
生物学的関連条件下でのチオール分解に応答しての脱ＰＥＧ化は、システイン、グルタチオン又はアルブミンのような生理的に存在するチオールとともに前記結合体をインキュベーションすることにより示され得る［Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＰｒｏｃｅｅｄ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２８巻：７３（２００１）］。開裂可能なＰＥＧ−蛋白質結合体の、遊離蛋白質への変換は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、モニターすることができる。反応の速度は、時間に伴う前記結合体種の消失として、その結合体種の濃度を測定することにより、又は出現しているときに遊離蛋白質を測定することにより、追跡することができる。前記結合体がＰＥＧ化の結果として生物学的活性がない場合、開裂条件下での蛋白質の生物学的活性の復活の時間経過を測定することができる［Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｈｅ Ｗａｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ、Ｍ．Ｌｅｂｌ及びＲ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ編、Ａｍｅｒ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃ．、２００１、９５３頁における、Ｓ．ＺａｌｉｐｓｋｙらによるＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ｔｈｉｏｌｙｔｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｉｔｓ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｒ．Ｂ．ＧｒｅｅｎｗａｌｄらによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１４巻：３９５（２００３）］。

例１４
本発明を特定の態様に関して記載したが、当業者には、本発明から逸脱することなく種々の変更及び改変がなされ得ることが明らかであろう。

ジチオシンナミル（ＤＴＣ）がメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）部分及びアミン含有配位子に結合している、本発明の一つの態様による結合体を示す。 ｍＰＥＧ−ＤＴＣ−ＮＨＳエステル結合体の合成のための合成反応技法を示す。 図１のｍＰＥＧ−ＤＴＣ−蛋白質結合体のチオール分解開裂及び得られる生成物を示す。 本発明の他の結合体のチオール分解開裂及び得られる生成物を示す。

Claims (40)

1. 構造Ｉ:
   

   

   
   ［構造中、Ｒ^１Ｘはアミン−又はヒドロキシル−含有配位子であり、Ｘは酸素、第一級窒素又は第二級窒素であり、
   Ｍは、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルは、ヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれ、
   Ｄ形状構造は、Ｍ及びジスルフィド基Ｓ−Ｓがシス−１，２−配向又はオルト配向で結合している５−又は６−員環を表し、
   Ｒ^ａは、水素、又は前記環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表し、
   Ｌは、更にアリール又はアラルキルで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
   Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を形成し得て、
   Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した脂質又は親水性ポリマーを更に有する]
   を有する結合体。
2. Ｌ及びＲ^ａが環を形成しない、請求項１に記載の結合体。
3. Ｌに又はＲ^ａに結合した親水性ポリマーを有する、請求項２に記載の結合体。
4. ５−又は６−員環が芳香環である、請求項２に記載の結合体。
5. 芳香環がベンゼン環であり、Ｍがシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−であり、従って、前記結合体が構造Ｉａ：
   

   

   
   を有する、請求項４に記載の結合体。
6. Ｒ^ｂ及びＲ^ｃの各々が水素である、請求項５に記載の結合体。
7. Ｒ^ａにでなくＬに結合した親水性ポリマーを有する、請求項６に記載の結合体。
8. Ｒ^ａが水素である、請求項７に記載の結合体。
9. Ｌが構造、−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−を有し、−ＣＲ^３Ｒ^４がジスルフィド基に結合しており、Ｒ^３及びＲ^４が、Ｈ、アルキル、アリール及びアラルキルから独立して選ばれ、Ｒ^５及びＲ^６が、Ｈ及びメチルから独立して選ばれる、請求項５に記載の結合体。
10. Ｒ^３及びＲ^４の各々が、水素、メチル、エチル及びプロピルから独立して選ばれる、請求項９に記載の結合体。
11. Ｒ^４が水素であり、Ｒ^３が、水素、メチル、エチル及びプロピルから成る群から選ばれる、請求項１０に記載の結合体。
12. Ｌ及びＲ^ａがシス−１，２−配向又はオルト配向で５−又は６−員環に結合しており、Ｌ及びＲ^ａが、更に５−乃至７−員環の一つを一緒に形成している、請求項１に記載の結合体。
13. ５−又は６−員環に結合した親水性ポリマーを有する、請求項１２に記載の結合体。
14. 前記の更なる５−乃至７−員環の一つに結合した親水性ポリマーを有する、請求項１２に記載の結合体。
15. 構造:
    

    

    
    ［構造中、Ｒ^１Ｘはアミン−又はヒドロキシル−含有配位子であり、Ｘは酸素、第一級窒素又は第二級窒素であり、
    Ｍは、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルは、ヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれ、
    Ｄ形状構造は、Ｍ及びジスルフィド基Ｓ−Ｓがシス−１，２−配向又はオルト配向で結合している５−又は６−員環を表し、
    Ｒ^ａは、水素、又は前記環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表し、
    Ｌは、更にアリール又はアラルキルで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
    Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を形成し得て、
    Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した脂質又は親水性ポリマーを更に有する]
    を有する結合体を血流に投与することを含む、血流に、アミン−又はヒドロキシル−含有分子Ｒ^２ＸＨを投与する方法。
16. Ｌ及びＲ^ａが環を形成しない、請求項１５に記載の方法。
17. 親水性ポリマーがＬ又はＲ^ａに結合している、請求項１６に記載の方法。
18. 前記の５−又は６−員環がベンゼン環であり、Ｍがシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−であり、従って、前記結合体が構造Ｉａ：
    

    

    
    を有する、請求項１６に記載の方法。
19. 親水性ポリマーがＲ^ａにでなくＬに結合している、請求項１８に記載の方法。
20. Ｒ^ａが水素である、請求項１９に記載の方法。
21. Ｌが構造、−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−を有し、−ＣＲ^３Ｒ^４がジスルフィド基に結合しており、Ｒ^３及びＲ^４が、Ｈ、アルキル、アリール及びアラルキルから独立して選ばれ、Ｒ^５及びＲ^６が、Ｈ及びメチルから独立して選ばれる、請求項１８に記載の方法。
22. Ｒ^３及びＲ^４の各々が、水素、メチル、エチル及びプロピルから独立して選ばれる、請求項２１に記載の方法。
23. Ｌ及びＲ^ａがシス−１，２−配向又はオルト配向で５−又は６−員環に結合しており、Ｌ及びＲ^ａが、更に５−乃至７−員環の一つを一緒に形成している、請求項１５に記載の方法。
24. 親水性ポリマーが５−又は６−員環に結合している、請求項２３に記載の方法。
25. 親水性ポリマーが前記の更なる５−乃至７−員環の一つに結合している、請求項２３に記載の方法。
26. 前記開裂反応により遊離された蛍光部分の検出により、前記分子の遊離をモニターすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
27. 親水性ポリマー鎖の表面被覆を有し、構造Ｉ:
    

    

    
    ［構造中、Ｒ^１Ｘはアミン−又はヒドロキシル−含有脂質であり、Ｘは酸素、第一級窒素又は第二級窒素であり、
    Ｍは、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルはヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれ、
    Ｄ形状構造は、Ｍ及びジスルフィド基Ｓ−Ｓがシス−１，２−配向又はオルト配向で結合している５−又は６−員環を表し、
    Ｒ^ａは、水素、又は前記環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表し、
    Ｌは、更にアリール又はアラルキルで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
    Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を形成し得て、
    Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した親水性ポリマーを有する]
    を有する脂質−ポリマー結合体を含有するリポソーム。
28. Ｌ及びＲ^ａが環を形成せず、親水性ポリマーがＬに結合している、請求項２７に記載のリポソーム。
29. ５−又は６−員環がベンゼン環であり、Ｍがシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−であり、従って、前記結合体が構造Ｉａ：
    

    

    
    を有する、請求項２７に記載のリポソーム。
30. Ｒ^ａが水素である、請求項２９に記載のリポソーム。
31. Ｌが、構造、−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−を有し、−ＣＲ^３Ｒ^４がジスルフィド基に結合しており、Ｒ^３及びＲ^４が、Ｈ、アルキル、アリール及びアラルキルから独立して選ばれ、Ｒ^５及びＲ^６が、Ｈ及びメチルから独立して選ばれる、請求項２９に記載のリポソーム。
32. Ｒ^３及びＲ^４の各々が、水素、メチル、エチル及びプロピルから独立して選ばれる、請求項３１に記載のリポソーム。
33. Ｌ及びＲ^ａが、シス−１，２−配向又はオルト配向で５−又は６−員環に結合しており、Ｌ及びＲ^ａが、更に５−乃至７−員環の一つを一緒に形成している、請求項２６に記載のリポソーム。
34. 親水性ポリマーが５−もしくは６−員環に結合しているか、又は前記の更なる５−乃至７−員環の一つに結合している、請求項３３に記載のリポソーム。
35. 閉じ込められた治療剤をさらに含有する、請求項２７に記載のリポソーム。
36. アミン−又はヒドロキシル−含有分子の、構造ＩＩ：
    

    

    
    ［構造中、Ｚは、ヒドロキシル基又はアミノ基により置換され得る脱離基であり、
    Ｍは、シス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−、−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−及び−ＣＲ^ｂＲ^ｄ−ＣＲ^ｃＲ^ｅ−（式中、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ及びＲ^ｅの各々は、Ｈ、メチル、置換メチル、フルオロ及びクロロから独立して選ばれ、メチルは、ヒドロキシル、フルオロ又はクロロで置換され得る）から選ばれ、
    Ｄ形状構造は、Ｍ及びジスルフィド基Ｓ−Ｓがシス−１，２−配向又はオルト配向で結合している５−又は６−員環を表し、
    Ｒ^ａは、水素、又は前記環上の、Ｒ、ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＯＨ、Ｃ(Ｏ)ＯＲ、ＯＣ(Ｏ)ＯＲ、Ｃ(Ｏ)ＮＲ_２、ＯＣ(Ｏ)ＮＲ_２、シアノ、ニトロ、ハロゲン及び更なる縮合環（式中、Ｒは、更にハロゲンで置換され得るＣ_１−Ｃ_６ヒドロカルビルである）から選ばれる一つ以上の置換基を表し、
    Ｌは、更にアリール又はアラルキルで置換され得る、線状の又は分岐状のＣ_１−Ｃ_６アルキル基であり、
    Ｌ及びＲ^ａは一緒に環を形成し得て、
    Ｌに、Ｒ^ａに、又は５−もしくは６−員環に結合した脂質又は親水性ポリマーを更に有する]
    を有する化合物との反応により得られる結合体。
37. Ｌ及びＲ^ａが環を形成しない、請求項３６に記載の結合体。
38. Ｌに結合した親水性ポリマーを有する、請求項３７に記載の結合体。
39. ５−又は６−員環がベンゼン環であり、Ｍがシス−ＣＲ^ｂ＝ＣＲ^ｃ−であり、従って、前記化合物が構造ＩＩａ：
    

    

    
    を有する、請求項３８に記載の結合体。
40. Ｌが、構造、−ＣＲ^３Ｒ^４−ＣＲ^５Ｒ^６−を有し、−ＣＲ^３Ｒ^４がジスルフィド基に結合しており、Ｒ^３及びＲ^４が、Ｈ、アルキル、アリール及びアラルキルから独立して選ばれ、Ｒ^５及びＲ^６が、Ｈ及びメチルから独立して選ばれる、請求項３９に記載の結合体。

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