JP5216219B2 - 薬物運搬体 - Google Patents
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Description
〔1〕 1)薬物担持分子集合体、2)リンカー、ならびに、3)活性化血小板、血管損傷部位及び/又は炎症組織を認識する物質、の結合体である薬物運搬体。
〔2〕 薬物担持分子集合体が、その内水相に薬物が内包されている脂質二分子膜小胞体である、〔1〕に記載の薬物運搬体。
〔3〕 (薬物担持分子集合体)−(リンカー)−(活性化血小板、血管損傷部位及び/又は炎症組織を認識する物質)で表される、〔1〕又は〔2〕に記載の薬物運搬体。
〔4〕 薬物担持分子集合体との結合時に薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子をリンカーが含み、該両親媒性分子を介してリンカーと薬物担持分子集合体が結合している、〔3〕に記載の薬物運搬体。
〔5〕 リンカーが疎水性分子を含み、リンカーと薬物担持分子集合体が、該疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合している、〔3〕に記載の薬物運搬体。
〔6〕 リンカーがスペーサー部分を含む、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔7〕 スペーサー部分が、ポリオキシエチレンである、〔6〕に記載の薬物運搬体。
〔8〕 薬物が、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤からなる群から選ばれる、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔9〕 薬物が、アデノシン二リン酸、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、コンバルキシン、セロトニン、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、シロスタゾール及びベラプロストからなる群から選択される、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔10〕 活性化血小板、血管損傷部位及び/又は炎症組織を認識する物質が、活性化血小板に露出しているインテグリン又はセレクチン、血管損傷部位に露出しているコラーゲン、血管損傷部位に露出しているコラーゲンに結合しているフォンビレブランド因子、炎症組織に露出しているセレクチン及び/又は白血球に露出しているセレクチンリガンドを認識し、活性化血小板及び/又は白血球の凝集塊に取り込まれる物質、及び/又は血管損傷部位及び/又は炎症組織に集積する物質である、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の薬物運搬体。
〔11〕 活性化血小板、血管損傷部位及び/又は炎症組織を認識する物質が、H12、GPIbα、GPIa/IIa、GPVI、MAC−1、フィブリノーゲン、P−セレクチン及びPSGL−1からなる群から選択される、〔10〕に記載の薬物運搬体。
〔12〕 脂質二分子膜小胞体が、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で20〜100%含有する混合脂質から構成され、リンカーと活性化血小板、血管損傷部位及び/又は炎症組織を認識する物質との結合体が該ホスファチジルコリンに対して0.001〜20%含まれている、〔2〕に記載の薬物運搬体。
〔13〕 脂質二分子膜小胞体の粒子径が50〜300nmであり、脂質二分子膜の層数が1〜4枚である、〔12〕に記載の薬物運搬体。
〔14〕 1)薬物担持分子集合体、2)リンカー、ならびに、3)活性化血小板、血管損傷部位及び/又は炎症組織を認識する物質、の結合体である薬物運搬体であって、細胞又は生体組織に到達した際に細胞又は生体組織から物理的な刺激を受けることにより薬物担持分子集合体から薬物が放出される、薬物運搬体。
〔15〕 細胞が活性化血小板又は白血球であり、薬物が、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤からなる群から選ばれる、〔14〕に記載の薬物運搬体。
〔16〕 生体組織が、血管損傷部位又は炎症組織であり、薬物が、血小板凝集惹起剤、血小板凝集抑制剤、血管収縮剤、血管拡張剤及び抗炎症剤からなる群から選ばれる、〔14〕に記載の薬物運搬体。
〔17〕 〔1〕〜〔16〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む診断薬。
〔18〕 〔1〕〜〔16〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む試薬。
〔19〕 〔1〕〜〔16〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む血小板代替剤。
〔20〕 〔1〕〜〔16〕のいずれかに記載の薬物運搬体を含む抗血小板剤。
本発明では、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンとコレステロールとを含む(好ましくはこれらから本質的になる)混合脂質、より具体的には、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で20〜100%含有する混合脂質、から構成されるリン脂質二分子膜小胞体が特に好ましい。
層数は、フィルターの孔径、小胞体の分散媒(pH、温度、イオン強度)によって制御できる。層数の測定方法としては、凍結割断法、小角X線散乱法、スピンラベル脂質を用いた電子スピン共鳴(ESR)、31P−NMRを用いた測定方法、6−p−トルイジノ−2−ナフタレンスルホン酸(TNS)を用いた測定方法などが挙げられる。
H12、GPIbα、GPIa/IIa、GPVI、MAC−1、フィブリノーゲン、P−セレクチン、及びPSGL−1の調製方法に特別の制限はなく、血小板膜から抽出・単離する方法、細胞培養による方法、遺伝子工学的に産生する方法等により調製することができる。
本発明で用いられる認識物質は、本発明の目的が達成される限り、そのアミノ酸配列中の1個または複数個のアミノ酸に欠失、置換、付加もしくは修飾といった任意の変異を施したものであってもよく、例えば天然の認識物質の置換体、類似体、変異体、修飾体、誘導体、糖鎖付加物なども包含される。
GPIbαとしては、GPIbα〔His(1)〜Leu(610)〕、当該α鎖のvWF結合領域の断片等のGPIbα断片、さらに膜貫通部位を欠失したGPIbα断片などが挙げられる。本発明においてより好ましいのは、膜貫通部位を欠失したGPIbα断片である。
より具体的なGPIbα鎖断片として、His(1)〜Cys(485)、His(1)〜Pro(340)、His(1)〜Thr(304)、His(1)〜Ala(302)、His(1)〜Arg(293)〔特開平1−221394号公報、EP0317278〕、Ala(165)〜Leu(184)、Gln(180)〜Phe(199)、His(195)〜Leu(214)、Asn(210)〜Val(229)、Glu(225)〜Ala(244)及びThr(240)〜Tyr(259)〔特開平1−100196号公報〕、Asn(61)〜Thr(75)、Gln(71)〜Ser(85)、Thr(81)〜Leu(95)、Gln(97)〜Arg(111)、Leu(136)〜Leu(150)、Asn(210)〜Ala(224)、Gln(221)〜Asp(235)及びSer(241)〜Asp(255)〔特表平5−503708号公報、WO91/09614〕などが例示される。また、置換体として、His(1)〜Ala(302)からなるGPIbα鎖断片において、Gly(233)またはMet(239)を各々Valに置換したものなどが例示される〔WO93/16712〕。これらのGPIbα鎖断片は全て膜貫通部位を欠失している。膜貫通部位は、GPIbα鎖ではLeu(486)〜Gly(514)が該当する(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84巻,5615〜5619頁,1987年)。
ここで、標的が細胞である場合には、標的は活性化血小板又は白血球であることが好ましい。この場合、薬物運搬体は活性化血小板や白血球の凝集塊に巻き込まれ、血小板や白血球の形態変化による物理的な刺激によって、分子集合体が崩壊して薬物を遊離させる。また、標的が生体組織である場合には、標的は血管損傷部位又は炎症組織であることが好ましい。
リンカーと薬物担持分子集合体が、薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子を介して又は疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合している、薬物担持分子集合体、リンカー及び認識物質の結合体を調製する場合には、リンカーと、認識物質と、両親媒性分子又は疎水性分子との反応産物を予め調製しておき、その後、その反応産物を分子集合体と結合させてもよい。
薬物は、最初から分子集合体に担持させておいてもよいし、分子集合体と、リンカーと、認識物質との結合体を調製後、最後に分子集合体に担持させてもよい。反応条件は、分子集合体の原料に応じて自体公知の条件を使用することができる。薬物担持分子集合体と認識物質との混合比は、最終的な結合体における認識物質の密度の所望値によって調節される。
血小板凝集惹起剤としては、アデノシン二リン酸(ADP)、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、コンバルキシン、セロトニン、エピネフリン、バソプレシン、カルバゾクロム、血液凝固因子(FVIII、FIX)、トロンビン、抗プラスミン剤(例えば、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸)、硫酸プロタミン、エタンシラート、フィトナジオン、結合型エストロゲン(例えば、エストロン硫酸ナトリウム、エクイリン硫酸ナトリウム)などが挙げられる。
血小板凝集抑制剤としては、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、シロスタゾール、ベラプロスト、ヘパリン等のムコ多糖類や、クマリン系抗凝固薬、ヒルジン等の天然抽出物やその誘導体、トロンボモジュリンや活性プロテインC等の生理活性物質などが挙げられる。
血管収縮剤としては、ノルアドレナリン、ノルフェネフリン、フェニレフリン、メタラミノール、メトキサミン、プロスタグランジンF1α、プロスタグランジンF2α、トロンボキサンA2などが挙げられる。
血管拡張剤としては、プロスタグランジンE、プロスタグランジンI2などが挙げられる。
抗炎症剤としては、ステロイド系抗炎症剤(デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメサゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロンなど)、非ステロイド系抗炎症剤(インドメタシン、アセメタシン、フルルビプロフェン、アスピリン、イブプロフェン、フルフェナム酸、ケトプロフェンなど)などが挙げられる。
薬物担持分子集合体に担持される薬物として特に好ましいものとしては、アデノシン二リン酸(ADP)、コラーゲン、コラーゲン由来ペプチド、コンバルキシン、セロトニン、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、シロスタゾール及びベラプロストが挙げられる。
1.Glu2C18の合成
グルタミン酸(2.96g、20mmol)、p−トルエンスルホン酸一水和物(4.56g、24mmol)をベンゼン150mLに溶解し、Dean−Stark装置を用いて105℃で生成水を除去しながら1時間還流した。ステアリルアルコール(11.9mg、44mmol)を加え、105℃で生成水を除去しながらさらに14時間還流した。溶媒を減圧蒸留した後、残分をクロロホルム150mLに溶解し、炭酸ナトリウム飽和水溶液150mLで2回、水150mLで2回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム5gで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を60℃でメタノール400mLに溶解し不溶成分があればろ過し、4℃で再結晶し、濾過後乾燥して白色粉末Glu2C18(13.3g、収率85%)を得た。
クロロホルム5mL中にGlu2C18(115.1mg、176μmol)、トリエチルアミン(TEA)(24.6μL、176μmol)を加えた後にα-マレイミジル
−ω−N−ヒドロキシスクシンイミジルポリエチレングリコール(MAL−PEG−NHS)(Mw=3400)(300mg、58.8μmol)を溶解し、室温で12時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル250mLに滴下し、不溶成分を回収した。回収物をベンゼン中に溶解し凍結乾燥後、白色粉末MAL−PEG−Glu2C18(264.8mg、収率64%)を得た。
MAL−PEG−Glu2C18(n=71)(100mg、25.37μmol)とC末端にシステインを導入したフィブリノーゲンγ鎖C末端400〜411番目のアミノ酸配列(Cys−H12)(CHHLGGAKQAGDV、配列番号2)(32.8mg、25.37μmol)をジメチルホルムアミド(DMF)5mLに溶解し、室温で12時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル250mLに滴下し、不溶成分を回収した。水250mLを加え不溶成分を除去後、凍結乾燥機にて溶媒を除去し、淡黄色粉末H12−MAL−PEG−Glu2C18(62.8mg、収率47%)を得た。
1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(DPPC)(100mg、136μmol)、コレステロール(52.7mg、136μmol)、及び、1,5−ジヘキサデシル−N−スクシニル−L−グルタメート(DHSG)(19.0mg、13.6μmol)の混合脂質(本明細書における脂質濃度の表記では、混合脂質であっても単に脂質と記載している)、ならびに、PEG−Glu2C18(PEG−DSPE、日本油脂製、4.74mg、0.817μmol)又はH12−MAL−PEG−Glu2C18(4.34mg、0.817μmol)をベンゼン5mLに溶解し、凍結乾燥を3時間行った。乾燥後、アデノシン二リン酸(ADP)溶液(0、1、10、25又は100mM)8.5mLを加え12時間撹拌したのち造粒装置を用いてフィルター(3000nm→800nm→650nm→450nm→300nm→220nm×2)を通過させ粒径制御した。超遠心分離(33000rpm、30分)を2回行い、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)5mL中に分散させ小胞体分散液とした。さらに、小胞体分散液をゲルろ過(Sephadex G25)して、外水相に微量に残存するADPを完全に除去した。
上記手順により、ADP内包H12−PEG小胞体(平均粒子径250±80nm、平均層数1.6;Glu2C18は小胞体の構成成分の一部となっている。以下同様)、ADP未内包H12−PEG小胞体(平均粒子径230±70nm、平均層数1.8)、ADP内包PEG小胞体(平均粒子径240±90nm、平均層数1.5)、ADP未内包PEG小胞体(平均粒子径250±90nm、平均層数1.8)の分散液を得た。
回収した小胞体分散液の脂質濃度の定量(リン脂質C−テストワコー、和光純薬工業製)を行ったところ、脂質濃度は18±5mg/mLであった。後述の動物実験では、PBSを用いて各小胞体分散液の脂質濃度を0.25、1.0、2.5、5.0、10mg/mLの濃度に調整したものを4mL/kgで投与し、1、4、10、20、40mg/kg(脂質量換算)となるように投与した。
小胞体の層数(平均層数)は以下のようにして算出した。
ADP未内包H12−PEG小胞体の分散液(0.5wt%、0、20、30、50、70、90μL)をPBSにて希釈し3mLに定容した。TNS水溶液(70μM)又は純水を100μLずつ添加し、室温で12時間振とうした。蛍光測定し(λex=321nm、λem=445nm)、脂質濃度と蛍光強度の比例式を算出し、傾きK1とした。孔径0.05μmのフィルターを通過させたPEG小胞体の分散液(0.5wt%、0、20、30、50、70、90μL)でも、同様に、TNS水溶液(70μM)又は純水を添加し、室温で12時間振とうした後、傾きK2を算出し、平均層数N=K1/K2を算出した。ADP未内包H12−PEG小胞体、ADP内包PEG小胞体、ADP未内内包PEG小胞体についても同様に平均層数を算出した。
以下、H12−MAL−PEG−Glu2C18を用いて作製したADP内包H12−PEG小胞体とADP未内包H12−PEG小胞体をそれぞれH12−PEG(ADP)小胞体、H12−PEG小胞体と表記する。また、PEG−Glu2C18を用いて作製したADP内包PEG小胞体とADP未内包PEG小胞体をそれぞれPEG(ADP)小胞体、PEG小胞体と表記する。
H12−PEG(ADP)小胞体(1mg/mL)を2%ラウリルエーテル(C12E10)で可溶化し、HPLC(Abs. 260nm)にてADPの定量を行った。
水和時(調製時)のADP濃度(0、10、25、100mM)に対する脂質10mg/mL中に内包されたADP濃度の関係を図2に示す。内包されたADP濃度は水和時のADP濃度に比例し、内包濃度を制御できることを確認した。また、粒径(250±80nm)から内水相のADP濃度を算出すると、水和時のADP濃度とほぼ同等であった。
全血(1/10(v/v) 3.8%クエン酸ナトリウム)を遠心分離し(600rpm、15分)、多血小板血漿(PRP)を得た。沈殿成分を更に遠心分離して(2500rpm、10分)、乏血小板血漿(PPP)を得た。PPPにて血小板数を調整したPRP([血小板]=1.0×105/μL、50μL)にADP内包濃度の異なるH12−PEG(ADP)小胞体を添加し([脂質]=1mg/mL、10μL)、37℃、10分間撹拌した。血小板活性化マーカーであるFITC標識PAC−1(20μL)を添加後、37℃で10分間振とうし、ホルムアルデヒド(f.c. 1%)にて固定した。サンプルをフローサイトメトリーにより試験した。ポジティブコントロール群はADP刺激時とし、ネガティブコントロール群はPEG小胞体とした。
ADPの内包濃度が1.5mM以下のPEG(ADP)小胞体あるいはH12−PEG(ADP)小胞体を血小板に添加した系では、ADP未内包小胞体添加系と比較してPAC−1結合率はほぼ同等であり、血小板を活性化させないことを確認した(図3)。一方、内包濃度のもっとも高いPEG(ADP)小胞体、H12−PEG(ADP)小胞体(6mM)を血小板に添加した系では血小板の活性化を引き起こすことが判明した。
以下の実験では、FACS測定により血小板を活性化させないことが明らかとなったADP内包濃度が1.5mMであるPEG(ADP)小胞体及びH12−PEG(ADP)小胞体、ならびに、PEG小胞体及びH12−PEG小胞体を用いた。PPPにて血小板数を調整したPRP([血小板]=2.0×105/μL、180μL)に小胞体分散液(10μL)を添加した後、コラーゲン(f.c. 0.4μg/mL、10μL)にて血小板凝集を惹起させ、透過度変化を計測した(図4)。
PEG小胞体(a)を添加したところ、PBS添加系と比較して血小板凝集に何ら影響を与えないことを確認した。PEG小胞体(a)の代わりにH12−PEG小胞体(b)を添加したところ、透過度が増大し血小板凝集促進効果が確認できた。これは、H12−PEG小胞体が血小板と多点結合し、血小板凝集を促進したためと考えられる。PEG(ADP)小胞体(c)では(b)と比較して凝集が亢進し、H12−PEG(ADP)小胞体(d)では(c)の促進効果以上であった。他方、(d)を存在させただけ(すなわちコラーゲン非存在下、(e))では血小板の凝集は惹起されないことも確認した。従って、コラーゲンによって血小板の凝集が惹起され、直ちに小胞体が物理的にその凝集塊に巻き込まれ小胞体が変形してADPが放出されたと考えられる。(d)の効果は、H12を担持させたことによる多点結合とADP放出との相乗効果によるものと考えられる。
さらに、コラーゲン添加から約1分後に、コラーゲン刺激による血小板形状変化に伴う緩やかな透過度の減少が見られる((a)及び(b))。しかしながら、ADP内包系(c)及び(d)では、コラーゲン添加後、直ちに透過度の上昇が見られ、これはADP刺激に特有の現象である。これにより、血小板凝集によってH12−PEG(ADP)小胞体(d)からのADPの放出が惹起されたことが示唆された。
ウィスター系雄性ラット(8週齢,250〜270g)にブスルファン(20mg/kg)を尾静脈投与し、投与後10日目を血小板減少症モデルラット([血小板]=20×104/μL)とした。セボフラン麻酔後、サンプルを投与し、投与5分後に尾先端から1cmの部位に長さ2.5mm、深さ1mmの傷をつけ、その部分を生理食塩水中に浸し、出血時間を測定した。
血小板減少症モデルラットに生理食塩水を投与したところ(4mL/kg)、出血時間は682±198秒であり、正常ラット([血小板]=80×104/μL)の出血時間(178±56秒)と比較して、約3.8倍延長した(図5)。脂質濃度を2.5、10mg/mLに調整したH12−PEG小胞体分散液を投与したところ(4mL/kg)、投与量依存的に出血時間は短縮し、10、40mg/kg(脂質量換算)における出血時間は、それぞれ573±127、335±96秒となった。そこで、脂質濃度0.25、1、2.5mg/mLに調整したH12−PEG(ADP)小胞体分散液(ADP内包濃度1mM)を投与したところ(4mL/kg)、1、4、10mg/kg(脂質量換算)における出血時間は、それぞれ543±134、521±88、349±49秒となり、H12−PEG小胞体にて短縮効果の確認できた1/4の投与濃度で短縮できることが判明した。以上より、ADP内包によるH12−PEG小胞体の止血効果向上がin vivoにて確認された。
ニュージーランドホワイトウサギ(11週齢、2.5kg)にブスルファン(30mg/kg)を尾静脈投与し、投与後15日目を血小板減少症モデルウサギ([血小板]=2.6×104/μL)とした。ケタミン/セラクタール麻酔後、0.5mL/分の速度でサンプルを投与し、投与30分後に耳介周囲静脈に長さ6mmの傷をつけ、その部分を生理食塩水中に浸し出血時間を測定した。
血小板減少症モデルウサギに生理食塩水を投与したところ(4mL/kg)、出血時間は1695±197秒であり、正常ウサギ([血小板]=41×104/μL)の出血時間(112±24秒)と比較して、約15倍延長した(図6)。陽性対照群としてウサギ血小板を0.4×109、2.0×109、4.0×109/kgで投与したところ、血小板数依存的に出血時間を短縮させた(それぞれ1505±410、863±440、505±257秒)。そこで、脂質濃度を2.5、5.0mg/mLに調整したH12−PEG(ADP)小胞体分散液(4mL/kg)を投与したところ、出血時間はそれぞれ881±303、433±52秒であり、生理食塩水群と比較して投与量依存的に有意に出血時間を短縮させ、血小板投与群のそれに匹敵した。従って、H12−PEG(ADP)小胞体は血小板減少モデルウサギの出血時間を効率よく短縮させることが確認された。
PEG(ADP)小胞体又はH12−PEG(ADP)小胞体の分散液(10mg/kg(脂質量換算)、ADP内包濃度0、1、10mM)を投与した際の出血時間を測定した。出血時間の測定は、正常ラット及び血小板減少症モデルラットを用いて7.と同様に行った。結果を図7に示す。H12−PEG小胞体(すなわち、ADP内包濃度0)投与系では出血時間短縮効果は見られないが、H12−PEG(ADP)小胞体では血小板減少症モデルラットの生理食塩水投与系と比較して出血時間の有意な短縮がみられ、PEG(ADP)小胞体にて短縮効果の確認できた1/10の投与濃度で同程度の短縮が得られた。以上から、PEG(ADP)小胞体よりもH12−PEG(ADP)小胞体の方が優れた止血効果を有することが確認された。
PEG小胞体、H12−PEG小胞体についてADP内包量の異なる小胞体(PEG(ADP)小胞体、H12−PEG(ADP)小胞体)を調製した。ADP内包濃度の算出は小胞体を2%ラウリルエーテルで可溶化させHPLC(260nm)にて行った。ADP内包の効果を血小板凝集計により評価した。PPPにて血小板数を調整した血小板減少血漿(PLT)([血小板]=10×104/μL、180μL)を調製し、小胞体分散液を10μL添加後、ADP(30〜45μM、10μL)を添加し、透過率を計測した。添加小胞体はADP内包濃度が0、0.1、0.5、1.0、2.0もしくは10.0mMであるPEG(ADP)小胞体又はH12−PEG(ADP)小胞体を用いた。評価はPEG小胞体添加時の透過率との差により行った。ADPを用いて血小板凝集を惹起させた時の結果を図8に示す。H12−PEG(ADP)小胞体添加系はADP内包濃度1mM以上で内包効果が確認でき、それ以上の高濃度内包小胞体においてもその内包効果はほぼ同等であった。また、PEG(ADP)小胞体添加系についてはその内包効果は確認できなかった。
N−[6−(ビオチンアミド)ヘキシル]−3’−(2’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド(Bio−HPDP、10mg、18.5μmol)をDMF5mLに溶解し、ジチオスレイトール水溶液(1M)を20μL添加し、室温で30分攪拌後、MAL−PEG−Glu2C18(73.0mg、18.5μmol)を添加し、室温で12時間撹拌した。反応溶液をジエチルエーテル250mLに滴下し、不溶成分を回収した。水250mLを加え不溶成分を除去後、凍結乾燥機にて溶媒を除去し、淡黄色粉末Bio−MAL−PEG−Glu2C18を得た(Bio:ビオチン)。
H12−PEG(ADP)小胞体添加系中の小胞体観察を目的とし、H12−PEG(ADP)小胞体にBio−MAL−PEG−Glu2C18を導入し、その凝集塊を凍結超薄切し透過型電子顕微鏡にて免疫電子顕微鏡観察した(図9)。血小板間に小胞体が巻き込まれていることが確認され、また血小板の各部位にBio−MAL−PEG−Glu2C18が点在することから、小胞体が凝集塊中で崩壊していることが示唆された。
1.CF内包PEG小胞体及びCF内包H12−PEG小胞体の製造
実施例1の1.〜3.に記載の手順に準じて、10mMの5(6)−カルボキシフルオレセイン(CF)を内包させたPEG小胞体及びH12−PEG小胞体を作製した。CF内包量は、実施例1の4.と同様にして定量した。
CF内包PEG小胞体(平均粒子径230±80nm、平均層数1.8)
CF内包H12−PEG小胞体(平均粒子径240±50nm、平均層数1.6)
2.血小板凝集に伴う小胞体内包物放出量の定量
CF(10mM)内包PEG小胞体又はCF(10mM)内包H12−PEG小胞体をPRP([血小板]=2.0×105/μL、[vesicle]=f.c. 0.05mg/mL)に添加後、ADPにより血小板凝集を惹起し([ADP]=f.c. 2μM)、血小板凝集計にて透過度変化を測定した。測定終了後、遠心分離(1200rpm、5分)にて凝集塊を除去した。この時、ADP未添加系において、血小板のみを除去し、2%ラウリルエーテル(C12E10)にて小胞体を可溶化した際の蛍光強度(A)を測定し、100%と定義した。この上清中(小胞体分散液)の蛍光強度(B)を測定し、血小板凝集塊への小胞体取込み率を算出した。さらに、この上清を遠心分離(33000rpm、45分)して小胞体を除去し、その上清の蛍光強度(C)を測定し、血小板凝集塊に取込まれた小胞体からのCF放出率を算出した。
血小板凝集塊へのCF内包PEG−小胞体、CF内包H12−PEG小胞体の取込み率は、それぞれ13±5、17±5%であり、両者ともほぼ同等であった。そこで、取込まれた小胞体からのCF放出率を測定したところ、それぞれ0.6±0.5、10±1%となった(表1)。これは、小胞体にH12を担持させたことにより、小胞体と血小板との結合が強固となり、小胞体が血小板凝集に巻込まれた際の物理的な刺激に伴ってCF放出率が増大したためと考えられる。
配列番号2:デザインペプチド
Claims (16)
- 1)薬物担持分子集合体、2)リンカー、ならびに、3)活性化血小板を認識する物質、の結合体である薬物運搬体であって、薬物がアデノシン二リン酸であり、アデノシン二リン酸が、薬物担持分子集合体を構成する脂質10mg/mL中に1〜6mM内包される、薬物運搬体。
- 薬物担持分子集合体が、その内水相に薬物が内包されている脂質二分子膜小胞体である、請求項1に記載の薬物運搬体。
- (薬物担持分子集合体)−(リンカー)−(活性化血小板を認識する物質)で表される、請求項1又は2に記載の薬物運搬体。
- 薬物担持分子集合体との結合時に薬物担持分子集合体の構成成分の一部となる両親媒性分子をリンカーが含み、該両親媒性分子を介してリンカーと薬物担持分子集合体が結合している、請求項3に記載の薬物運搬体。
- リンカーが疎水性分子を含み、リンカーと薬物担持分子集合体が、該疎水性分子を介して薬物担持分子集合体に結合している、請求項3に記載の薬物運搬体。
- リンカーがスペーサー部分を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の薬物運搬体。
- スペーサー部分が、ポリオキシエチレンである、請求項6に記載の薬物運搬体。
- 活性化血小板を認識する物質が、活性化血小板に露出しているインテグリン又はセレクチンを認識し、活性化血小板の凝集塊に取り込まれる物質である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の薬物運搬体。
- 活性化血小板を認識する物質が、H12及びフィブリノーゲンからなる群から選択される、請求項8に記載の薬物運搬体。
- 脂質二分子膜小胞体が、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンであるホスファチジルコリンに対してコレステロールをモル比で20〜100%含有する混合脂質から構成され、リンカーと活性化血小板を認識する物質との結合体が該ホスファチジルコリンに対して0.001〜20%含まれている、請求項2に記載の薬物運搬体。
- 脂質二分子膜小胞体の粒子径が50〜300nmであり、脂質二分子膜の層数が1〜4枚である、請求項10に記載の薬物運搬体。
- 細胞又は生体組織に到達した際に細胞又は生体組織から物理的な刺激を受けることにより薬物担持分子集合体から薬物が放出される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の薬物運搬体。
- 細胞が活性化血小板である、請求項12に記載の薬物運搬体。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の薬物運搬体を含む診断薬。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の薬物運搬体を含む試薬。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の薬物運搬体を含む血小板代替剤。
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