KR101933623B1 - 엘라스틴 유사 폴리펩티드 및 암 세포 표적화 물질을 포함하는 리포좀 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

엘라스틴 유사 폴리펩티드 및 암 세포 표적화 물질을 포함하는 리포좀, 그를 포함하는 약학적 조성물, 및 그를 이용하여 활성성분을 표적부위에 전달하는 방법이 제공된다.

Description

엘라스틴 유사 폴리펩티드 및 암 세포 표적화 물질을 포함하는 리포좀 및 그의 용도{Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof}
엘라스틴 유사 폴리펩티드 및 암 세포 표적화 물질을 포함하는 리포좀, 그를 포함하는 약학적 조성물, 및 그를 이용하여 활성성분을 표적부위에 전달하는 방법에 관한 것이다.
리포좀은 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특징지워질 수 있다. 작은 유니라멜라 소포 (SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포 (LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포 (multivesicular vesicle)라고 한다.
리포좀은 제형화되어 수성 내부 공간 (interior space) 내에 (수용성 활성성분) 또는 지질 이중층 내에 (수불용성 활성성분) 분배된 치료 제제, 약물 또는 다른 활성제를 가질 수 있다. 또한, 콜레스테롤과 같은 소수성 물질은 마이셀 중에 포함되고, 이 마이셀이 리포좀의 내부 공간에 포함되어질 수 있다.
혈류 중에서 짧은 반감기를 갖는 활성성분은 리포좀을 통한 전달에 특히 적합하다. 예를 들면, 많은 항암제 (anti-neoplastic agents)는 혈류 중에서 짧은 반감기를 가지고 있어, 비경구 투여가 적합하지 않은 것으로 알려져 있다. 그러나, 혈류를 통한 활성성분의 부위 특이적 전달을 위한 리포좀의 사용은 세내피 시스템 (reticuloendothelial system: RES)의 세포에 의하여 혈액으로부터 리포좀을 빠르게 제거하는 것에 의하여 제한될 수 있다.
리포좀은 정상적으로는 리키 (leaky)하지 않지만, 리포좀 막에 구멍이 형성되거나, 막이 분해되거나 용해되거나, 막 온도가 상전이 온도까지 증가되면, 리키하게 될 수 있다. 개체 중의 표적부위에서의 온도의 상승 (hyperthermia)은 리포좀 온도를 상전이 온도 이상으로 올리고, 그에 따라 리포좀 내용물의 방출을 야기할 수 있다. 이는 치료적 제제의 선택적 전달에 사용될 수 있다. 그러나, 리포좀의 상전이 온도가 정상 조직 온도보다 현저하게 높은 경우 이 기법은 사용이 제한될 수 있다.
따라서, 활성성분을 효율적으로 전달하는데 사용될 수 있는 리포좀이 여전히 요구되고 있다.
미국 특허출원공개공보 2007/0078085 (2007.04.05.)
Kyunga Na et al., 'Elastin-like polypeptide modified liposomes for enhancing cellular uptake into tumor cells', Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2012 (available online 2 Nov. 2011), Vol. 91, pp.130-136.
일 양상은 엘라스틴 유사 폴리펩티드 및 암 세포 표적화 물질을 포함하는 리포좀을 제공하는 것이다.
다른 양상은 활성성분을 포함하는 엘라스틴 유사 폴리펩티드 및 암 세포 표적화 물질을 포함하는 리포좀을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 리포좀을 이용하여 개체의 체내의 표적 부위에 활성성분을 효율적으로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 지질 이중층; 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (elastin-like polypetide: ELP); 및 지질 이중층 안정화제를 포함하고, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 있고, 상기 지질 이중층은 암 세포 표적화 물질이 결합된 제1 지질분자를 포함하는 것인 리포좀을 제공한다.
용어 "암 세포 표적화 물질 (tumor cell targeting material)"은 암 세포 또는 암 세포 주변으로, 예를 들면, 다른 부위에 비하여 우세하게 이동될 수 있는 물질을 말한다. 상기 물질은 암 세포에 특이적으로 결합하거나, 암세포에 의하여 특이적으로 섭취되거나, 암 주변의 혈관, 즉 암 혈관 (tumor vasculature)에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다. 용어 "암 혈관 (tumor vasculature)에 특이적으로 결합하는 물질"은 정상 혈관보다 종양 혈관에 더 많이 존재하는 물질에 대하여 결합하는 물질을 포함한다. 종양 혈관은 대부분의 정상 성인 조직에서 발견되는 혈관과는 형태적으로 기능적으로 상이할 수 있다. 종양 미세순환을 포함하는 혈관 즉, 종양 혈관의 공통적 특징은 팽창되고 긴 모양 (dilated and elongated shapes), 막다른 말단 (blind ends), 튀어나온 리키한 싹 (bulges and leaky sprout), 직경의 갑작스런 변화, 광범위한 꼬부라짐 (extensive tortuosity) 및 혈관 압축의 증거 (evidence of vascular compression)일 수 있다. 상기 물질은 암 혈관 세포 또는 암 혈관의 세포외 환경에 특이적으로 존재하는 물질, 예를 들면 수용체에 결합하는 리간드 또는 항체일 수 있다.
암 세포 표적화 물질은 상기 물질은 RGD 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 유도체, 비오틴 또는 그의 유도체, 폴레이트 또는 그의 유도체, 및 암 세포에 특이적 항원에 결합하는 항체 또는 그 유도체, 항체 단편 또는 그 유도체, 또는 리간드 또는 그 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 물질은 RGD 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 유도체일 수 있다. 상기 유도체는 *가 고리화된 아미드 결합 (-CO-NH-) 위치를 나타내는 시클릭 R*GDYK* 펩티드일 수 있다. 상기 유도체는 RGD 서열을 포함하는 시클릭 펩티드로서, RGD 서열, 고리화된 아미드 결합(-CO-NH-) 및 시스테인 말단에서 활성 히드로술피드 기를 갖는 것일 수 있다. 상기 시클릭 펩티드의 아미노산 서열은 X*YRGDYZ*로서 *는 고리화 위치를 나타내고, X는 유리 히드로술피드기를 포함하는 시스테인 잔기를 나타내고, Y는 하나이상의 아미노산 또는 적절한 길이의 아미노산 서열을 나타내고, Z는 시스테인 잔기와 고리를 형성할 수 있는 아미노산을 나타낸다. 상기 시클릭 펩티드의 아미노산 서열은 X*GRGDSPZ*로서 *는 고리화 위치를 나타내고, X는 유리 히드로술피드기를 포함하는 시스테인 잔기를 나타내고, Z는 하나이상의 아미노산 또는 적절한 길이의 아미노산 서열을 나타낸다. 상기 시클릭 펩티드의 아미노산 서열은 X*GRGSPK*로서 *는 고리화 위치를 나타내고, X는 유리 히드로술피드기를 포함하는 시스테인 잔기를 나타낸다. RGD 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 유도체는 -숙시닐-과 같은 적절한 링커에 의하여 지질분자에 결합될 수 있다.
제1 지질분자는 하기 구조식을 갖는 DSPE-cRGDYK 분자인 것일 수 있다. 여기서, RGD 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 유도체는 cRGDYK-CO-(CH2)3-(CO)- 모이어티일 수 있다.
Figure 112012008612509-pat00001
(식 1)
제1 지질분자는 DSPE-cRGDyK 분자뿐만 아니라, cRGDyK 모이어티 그 자체 또는 -CO-(CH2)3-(CO)-와 같은 링커를 매개로 연결된 임의의 인지질일 수 있다. 상기 링커는 PEG 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 인지질은 C12 내지 C24의 하나이상의 지방산 에스테르일 수 있다. 상기 제1 지질분자는 DSPE-PEG-cRGDyK 분자일 수 있다. 예를 들면, 하기 식의 DSPE-PEG2000-cRGDyK일 수 있다.
Figure 112012008612509-pat00002
(식 2).
상기 물질은 60 아미노산 잔기 이하의 길이를 갖고 CRGRRST (서열번호 8), CRSRKG(서열번호 9), 및 CKAAKNK (서열번호 10)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드로서, 상기 펩티드는 전악성 췌장 혈관 (premalignant pancreatic vasculature), 악성 췌장 혈관 또는 췌장 종양 세포에 선택적으로 이동하는 (home)하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "지질 이중층 (lipid bilayer)"은 지질 분자의 2개 층으로 구성된 막을 나타낸다. 지질 이중층은 자연적으로 존재하는 막, 예를 들면, 세포막, 핵막 및 바이러스 엔벨로프와 유사한 두께를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 지질 이중층의 두께는 10nm 이하, 예를 들면, 1nm 내지 9nm, 2nm 내지 8nm, 2nm 내지 6nm, 2nm 내지 4nm 또는 2.5 nm 내지 3.5 nm의 두께를 갖는 것일 수 있다. 지질 이중층은 이온, 단백질 및 다른 분자가 그들이 있어야 할 곳에 유지되게 하고 있을 필요가 없는 곳으로 확산하여 가지 못하도록 하는 장벽 (barrier)이다. 자연적 지질 이중층은 보통 대부분 인지질로 구성된다. 인지질은 친수성 헤드 (head)와 2개의 소수성 테일을 가지고 있다. 인지질이 물에 노출되는 경우, 그들은 자체가 2층 시트 (이중층)로 배열되어 모든 테일은 시트의 중심을 향하게 된다. 이 이중층의 중심은 물을 거의 포함하지 않고 물에 용해되나 오일에 용해되지 않는 당 또는 염과 같은 분자를 또한 배제한다. 특정 헤드 그룹을 가진 인지질은 이중층의 표면 화학을 결정할 수 있다. 또한, 지질 테일은 예를 들면, 이중층의 상을 결정함으로써 막 특성에 영향을 미칠 수 있다. 지질 이중층은 낮은 온도에서 고체 겔 상을 취하나 더 높은 온도에서는 유동상 (fluid state)으로 상전이를 할 수 있다. 지질 이중층 내의 지질의 충진 (packing)은 또한 스트레칭 및 굽힘 (bending)에 대한 저항성을 포함한, 그의 기계적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 생물학적 막은 보통 인지질 외의 다른 여러 지질 타입을 포함할 수 있다. 동물 세포에서 특히 중요한 예는 콜레스테롤이다. 콜레스테롤은 지질 이중층을 강화하고 투과도를 낮추는 것을 도울 수 있다.
상기 지질 이중층 (lipid bilayer)을 구성하는 "지질 분자"는 친수성 헤드와 소수성 테일을 가진 분자일 수 있다. 상기 지질 분자는 C12 내지 C50의 탄소 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 지질 분자는 인지질일 수 있다. 상기 인지질은 C16 내지 C24의 탄소 원자를 갖는 것일 수 있다. 상기 인지질은 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 및 포스파티딜 에탄올아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 상기 하나 이상의 인지질은 2개의 아실기를 가진 것일 수 있다. 또한, 상기 인지질은 약 10℃ 내지 약 70℃, 예를 들면, 약 38℃ 내지 약 45℃의 상전이 온도를 갖는 것일 수 있다. 상기 인지질은 아실기가 포화된 것 또는 불포화된 것일 수 있다. 상기 인지질은 2이상의 인지질 분자의 혼합물일 수 있다. 2이상의 인지질 분자의 혼합에 의하여 다양한 상전이 온도를 갖는 지질 이중층이 생성될 수 있다.
인지질 분자는 예를 들면, 2개의 아실기를 갖는 것으로서, C12 포화된 사슬 인지질 (Tc = 약 10℃), C14 포화된 사슬 인지질 (Tc = 약 24℃), C16 포화된 사슬 인지질 (Tc = 약 41℃), C18 포화된 사슬 인지질 (Tc = 약 55℃), C20 포화된 사슬 인지질 (Tc = 약 65℃), C22 포화된 사슬 인지질 (Tc = 약 70℃), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 포스파티딜콜린이 그들의 아실 사슬의 길이에 따라 비슷한 방식으로 변하는 상전이 온도와 유사하게, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민, 스핀고미엘린 및 강글리오시드도 사용될 수 있다.
C16 포화된 사슬 인지질의 예는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)일 수 있다. DPPC는 약 41.5℃의 상전이 온도를 갖는 포화 사슬 (C16) 인지질이다. C18 포화된 사슬 인지질의 예는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DSPC)일 수 있다. DSPC는 약 55.10℃의 상전이 온도를 갖는 포화 사슬 (C18) 인지질이다.
상기 지질 이중층에는 인지질 외에 다른 막-형성 물질이 사용될 수 있다. 고상 막을 형성하는 예시적 물질은 볼라 지질 또는 박테리아 지질일 수 있다. 또한, 수용성 폴리머 (예, 폴리에틸렌글리콜) 및 수불용성 폴리머 (예, 폴리프로필렌옥시드 및 폴리에틸에틸렌)을 포함하는 블록 코폴리머가 사용될 수 있다.
용어 "주 지질 (primary lipid)"은 리포좀 이중층에서 리포좀 이중층 물질의 주요 지질 성분 (main lipid component)을 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 인지질 70%와 콜레스테롤 30%로 구성된 리포좀 이중층에서, 인지질은 주 지질이다.
지질 이중층은 온도에 따라 다른 상 거동(phase behavior)을 할 수 있다. 주어진 온도에서 지질 이중층은 액체 또는 젤 (고체) 중 하나로 존재할 수 있다. 지질 분자는 젤상으로부터 액체상으로 전이하는 특성 온도 (characteristic temperature)를 갖는다. 두 상에서 지질 분자는 상기 이중층을 가로질러 뒤집히는 것(flip-flopping)이 저해되고 있으나, 액체상 이중층에서 주어진 지질분자는 이웃하는 분자와 위치를 교환할 것이다. 이 무작위 교환 (random walk exchange)은 지질분자가 막의 표면을 가로질러 확산하고 돌아다닐 수 있도록 한다. 액체상 이중층과는 달리, 젤상 이중층 중의 지질은 위치가 고정되어 있다.
지질 이중층의 상기 상 거동은 이웃하는 지질 분자 사이의 친화성 (attractive) 반데르 발스 상호작용의 강도에 의하여 결정될 수 있다. 더 긴 테일을 가진 지질 분자는 상호작용하는 면적이 더 커서 이 상호작용의 강도를 증가시키고, 결과적으로 지질 분자 운동성을 감소시킨다. 따라서, 주어진 온도에서, 짧은 테일을 가진 지질분자는 다른 것은 같고 더 긴 테일을 가진 지질분자에 비하여 더 유동적일 수 있다. 전이온도는 지질 분자 테일의 불포화의 정도에 의하여 또한 영향을 받을 수 있다. 불포화된 이중결합은 알칸 사슬에서 뒤틀림 (kink)를 생성하여, 지질 충진 (packing)을 파괴할 수 있다. 이 파괴는 이웃 사슬에서 부가적 유연성 (flexibility)를 부여할 수 있는 이중층 내에 추가의 자유 공간 (free space)을 생성할 수 있다.
대부분의 천연 막은 다른 지질 분자의 복합 혼합물이다. 상기 복합 혼합물의 성분들 중 일부가 주어진 온도에서 액체이고, 다른 성분은 젤 상인 경우, 바다에 떠 있는 빙산과 같이, 두 상은 공간적으로 분리된 영역에서 공존한다.
용어 "상전이 온도 (phase transition temperature)"는 물질이 고체상에서 액체상으로 (용융 온도 (melting temperature)라고도 함) 또는 액체상에서 고체상으로 상이 변하는 온도를 나타낸다. 상기 물질은 지질분자, 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하지 않은 지질 이중층 또는 리포좀, 또는 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함한 지질 이중층 또는 리포좀을 포함한다.
상기 리포좀은 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (elastin-like polypeptide: ELP)를 포함하고, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 있는 것일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 지질 이중층을 구성하고, 거기에 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 상기 지질 이중층에 고정할 수 있는 특성, 예를 들면 소수성 특성을 가진 분자인 것일 수 있다. 상기 모이어티는 상기 지질 이중층에 전체 또는 일부분이 충진될 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층을 구성하는 지질 분자와 동일하거나 다른 지질 분자인 것일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 소수성 부분으로만 구성된 분자 또는 소수성 부분과 친수성 부분을 포함하는 양친매성 분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 소수성 부분과 친수성 부분을 포함하는 양친매성 분자는 소수성 부분은 지질 이중층의 내부 방향으로 배치되어 있고 친수성 부분은 지질 이중층의 외부 방향으로 배치되어 있고 엘라스틴-유사 폴리펩티드에 결합되어 있는 것일 수 있다. 여기서, "외부 방향"이라는 지질 이중층의 중심으로부터 외부 방향을 나타내는 것으로, 리포좀의 내부 방향 또는 리포좀의 외부 방향을 나타낸다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 생체막에 천연적으로 존재하는 지질 분자이거나 생체막에 천연적으로 존재하지는 않지만 지질 이중층을 구성할 수 있는 지질분자인 것일 수 있다.
상기 생체막에 천연적으로 존재하는 지질 분자는 인지질 또는 그의 유도체, 스테롤 또는 그 유도체, 스핑고지질 또는 그 유도체 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 인지질 또는 그 유도체는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 스테롤 또는 그 유도체는 콜레스테롤 또는 그의 유도체, 또는 스쿠알렌 또는 그 유도체일 수 있다. 상기 스핑코지질은 스핑고미엘린 또는 강클리오시드 또는 이들의 유도체일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 인지질, 스테롤 또는 스핑고지질은 생체내 합성과정에서 생성되는 중간체 또는 전구체를 포함한다. 예를 들면, 포스포글리세리드, 스핀고신, 세라미드 또는 세레브로시드를 포함한다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 포화 또는 불포화 탄화수소, 포화 또는 불포화 아실 분자 또는 포화 또는 불포화 알콕시 분자일 수 있다.
소수성기를 포함하는 모이어티와 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 접합은 생리적 또는 병적 조건에서 절단가능하지 않거나, 절단 가능한 결합에 의하여 이루어진 것일 수 있다. 절단 가능한 결합의 예는, pH 절단가능한 링커, 열전달가능한 링커, 광 (radiation) 절단가능한 링커, 수용액에서 전달되는 링커를 매개하여 이루어진 결합일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드 N 말단의 N 또는 C 말단의 카르보닐 (-C(O)-)기와의 결합에 의하여 접합되어 있는 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 측쇄의 작용기, 예를 들면, 아미노기, 카르보닐기, 히드록시기, 티올기, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 작용기와의 반응에 의하여 형성된 결합에 의하여 연결된 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 N 원자와의 아민 또는 아미드 결합을 통하여 접합되어 있는 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 C 말단의 카르보닐기와 아미드 또는 에스테르 결합을 통하여 접합되어 있는 것일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는, 소수성기 부분이 C4-C30, 예를 들면, C14-C24의 탄소수, 또는 C16-C24의 탄소수를 갖는 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는, 예를 들면, 미리스토일 (C14), 팔미토일 (C16), 스테아로일 (C18), 아라키도닐 (C20), 베헤노닐 (C22) 또는 리그노세로일 (C24)일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 소수성 효과 (hydrophobic effect)에 의하여 지질 이중층에 충진될 수 있으며, 그에 따라 상기 소수성기를 포함하는 모이어티에 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 상기 리포좀에 고정되어질 수 있다.
용어 "엘라스틴-유사 폴리펩티드 (elastin-like polypeptide)"는 온도에 따라 구조 (conformation) 변화를 하는 아미노산 중합체의 일 종류를 나타낸다. 일 구체예에서, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 "역상전이 거동 (inverse phase transitioning behavior)"을 갖는 중합체일 수 있다. 역상전이 거동이란 "역상전이 온도 (inverse phase transition temperature: Tt)" 이하의 온도에서는 수성 용액에 용해성이고, 온도가 역상전이 온도 보다 높은 온도로 상승하는 경우, 불용성으로 되는 것을 나타낸다. 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 온도가 상승함에 따라 고도로 용해성인 긴 사슬 (elongated chain)로부터 크게 감소된 용해도를 갖는 단단하게 접혀진 응집체 (tightly folded aggregate)로 전이할 수 있다. 이러한 역상전이는 온도의 상승에 따라 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 구조가 β-턴 및 찌그러진 β-구조 (distorted β-structure)를 더 많이 가지게 됨으로써 유도되는 것일 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 약 10℃ 내지 약 70℃의 상전이 온도를 갖는 것일 수 있다.
역상전이 거동 특성은 엘라스틴-유사 폴리펩티드가 지질 이중층의 구성 성분에 연결되어 있는 경우, 온도가 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 Tt 보다 낮은 온도에서 높은 온도로 상승함에 따라 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 수축 및 자가 조립으로 인하여, 지질 이중층을 파괴할 수 있다. 상기 지질 이중층의 파괴는 지질 이중층의 투과성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 지질 이중층을 포함하는 리포좀에 포함된 활성성분은 더 높은 투과도로 리포좀으로부터 외부로 방출될 수 있다. 그러나, 하나이상의 구체예들이 특정한 작용 기작에 한정되는 것은 아니다.
엘라스틴-유사 폴리펩티드의 역상전이 거동에 의한 리포좀을 구성하는 지질 이중층의 파괴는 지질 이중층을 구성하는 지질 분자들, 즉 지질 이중층의 상전이 온도에 따라 달라질 수 있다. 지질 이중층은 그의 상전이 온도 이하에서는 젤상, 그 이상에서는 액체 (결정성) 상으로 존재할 수 있다. 지질 이중층이 젤상으로 존재하는 경우, 엘라스틴-유사 폴리펩티드가 역상전이 거동에 의하여 β-턴 구조를 갖는 구조로 변경되더라도, 지질 이중충의 파괴는 일어나지 않거나 제한적일 수 있다. 반면, 지질 이중층이 액체상으로 존재하는 경우, 엘라스틴-유사 폴리펩티드가 역상전이 거동에 의하여 β-턴 구조를 갖는 구조로 변경됨에 따라, 지질 이중충의 파괴는 유도될 수 있다. 즉, 지질 이중층이 젤상으로 존재하는 경우에 비하여 액체상으로 존재하는 경우, 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 역상전이는 지질 이중층의 파괴를 더 효율적으로 유도할 수 있다. 따라서, 리포좀에 포함된 활성 성분의 방출 온도는 리포좀의 지질 이중층의 상전이 온도 및 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 역상전이 온도를 조절함으로써, 조절될 수 있다. 예를 들면, 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함한, 지질 이중층 또는 리포좀의 상전이 온도는 약 10℃ 내지 약 70℃, 예를 들면 약 39℃ 내지 약 45℃일 수 있다.
상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 측쇄가 아닌 말단에 접합된 것일 수 있다. 또한, 상기 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 말단에 측쇄가 아닌 아미노 또는 카르복실기에 접합될 수 있다. 상기 모이어티는 하나의 사슬을 가진 소수성기 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 상기 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 N 원자와의 아민 또는 아미드 결합을 통하여 접합되거나 C 말단의 카르보닐기와 아미드 또는 에스테르 결합을 통하여 접합될 수 있다. 여기서, 상기 모이어티는 C4-C30, 예를 들면, C14-C24의 탄소수, 또는 C16-C24의 탄소수를 갖는 탄화수소일 수 있다.
하나 이상의 구체예에 따른, 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하는 리포좀은 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하지 않고 지질 이중층만을 포함하는 리포좀에 비하여, 리포좀에 포함된 활성 성분을 효율적으로 방출하는데 사용될 수 있다. 이는 단순히 지질 이중층의 지질 분자의 상전이를 이용하는 경우에는 리포좀에 포함된 활성 성분의 리포좀 외부로의 방출은 지질 분자의 확산에 의하여 유도되는 반면, 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하는 리포좀의 경우, 지질 분자의 확산에 의하여 유도되는 것에 더하여, 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 역상전이 거동, 즉 수축 및 조립 (assembly)에 의하여 지질 이중층 파괴에 의하여 추가적으로 활성성분의 방출이 유도되기 때문일 수 있다. 여기서, 상기 활성 성분은 리포좀의 내부 공간 또는 지질 이중층의 내부 또는 양쪽에 포함된 것일 수 있다. 또한, 상기 리보좀은 상기 물질과 암 또는 암 주변, 예를 들면 종양 혈관과의 상호 작용에 의하여, 용이하게 암 또는 종양 혈관으로 전달되거나 종양 혈관에서 체류하는 시간이 증가될 수 있다.
상기 리포좀은 지질 안정화제를 포함한다. 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하는 리포좀의 경우, 지질 이중층 중에 지질 이중층의 안정성을 높이기 위하여 도입된 지질 이중층 안정화제가 존재하는 경우, 활성 성분을 효율적으로 방출할 수 있다. 상기 안정화제는 지질 이중층의 상전이온도 이상, 바람직하게는 보다 높은 상전이 온도를 갖는 지질인 것일 수 있다. 상기 안정화제는 스테로이드, 스핑코지질 또는 그 유도체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 안정화제는 지질 이중층에 삽입 (incorporation)될 수 있는 특성을 가진 스테로이드인 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 용어 "스테로이드 (steroid)"란 융합된 4개의 시클로알칸 고리의 형태 즉, 왼쪽으로부터 오른쪽으로 A,B 및 C 고리로 명명된 3개의 시클로헥산 고리와 하나의 시클로펜탄 고리 (D 고리)를 포함하는 고난 (gonane) 또는 그로부터 유래된 골격을 포함하는 유기 화합물을 나타낸다. 여기서 "그로부터 유래된 골격"이란 상기 고난 골격에 불포화 결합이 도입된 것을 포함한다. 상기 스테로이드는 4개의 고리에 부착된 관능기 및 고리의 산화 상태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 상기 스테로이드는 상기 고리에 친수성 관능기를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 스테로이드는 상기 고리에 히드록실기를 갖는 것일 수 있다. 상기 스테로이드는 스테롤일 수 있다. 용어 "스테롤(sterol)"이란 스테로이드의 한 형태로서, 3번 위치에 히드록실기를 갖고 콜레스탄 (cholestane)으로부터 유래된 골격을 갖는 것을 나타낸다. 여기서 "유래된 골격"이란 콜레스탄 골격에 불포화 결합이 도입된 것을 포함한다. 상기 스테로이드는 식물, 동물 및 곰팡이에서 발견되고 있는 스테로이드를 포함한다. 예를 들면, 동물 또는 곰팡이에서와 같이 라노스테롤 또는 식물에서와 같이 시클로아르테놀 (cycloartenol)로부터 만들어진 것일 수 있다. 상기 스테롤은 콜레스테롤 또는 그의 유도체를 포함한다. 여기서 "유도체 (derivative)"란 콜레스테롤의 유도체로서 지질 이중층에 삽입되는 성질을 유지하고 있는 것을 의미한다. 상기 유도체는 콜레스테롤의 지방산 에스테르를 포함한다. 상기 지방산은 C6 내지 C50 지방산일 수 있다. 상기 안정화제는 콜레스테롤, 시스토스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤, 4,22-스티그마스타디엔-3-온, 스티그마스테롤 아세테이트, 라노스테롤, 시클로아르테놀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하고 있지 않은, 단순 지질 이중층을 포함하는 리포좀은 상기 안정화제, 예를 들면, 콜레스테롤이 포함되면 경우, 활성성분의 방출이 현저하게 감소될 수 있다. 따라서, 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 포함하는 리포좀의 경우, 지질 이중층 안정화제를 사용함으로써 지질 이중층 또는 리포좀의 안정성을 유지하면서도, 활성성분을 효율적으로 방출할 수 있다. 특히, 좁은 온도 범위에서, 예를 들면 약 39℃ 내지 약 45℃의 범위에서 약물을 효율적으로 방출할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 아미노산 서열에 의하여 정의될 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 일부분 또는 전체가 VPGXG (서열번호 1), PGXGV (서열번호 2), GXGVP (서열번호 3), XGVPG (서열번호 4), GVPGX (서열번호 5) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위를 1회 이상 포함하고, 여기서 V는 발린, P는 프롤린, G는 글리신, X는 프롤린이 아닌 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산인 것일 수 있다. 여기서, 각 반복 단위의 X는 동일하거나 다른 아미노산일 수 있다. 상기 반복 단위는 얻어진 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 상전이 특성을 제거하지 않는 하나 이상의 아미노산 또는 다른 링커 모이어티에 의하여 서로 분리되거나, 말단 부분이 상기 하나 이상의 아미노산 또는 다른 링커 모이어티로 될 수 있다. 상기 반복 단위 대 다른 아미노산 또는 링커 모이어티의 비율은 상기 반복 단위와 다른 아미노산을 기준으로 약 0.1% 내지 약 99.9%의 상기 반복 단위로 된 것일 수 있다. 상기 선택된 반복 단위는 2 이상 반복, 예를 들면 2 내지 200회 반복되는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 또는 이들의 조합이 1회 이상 직렬 반복된 블록 (tandemly-repeated blocks)이거나 또는 VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 또는 이들의 조합이 1회 이상 직렬 반복된 블록을 포함하는 것일 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 역상전이 거동 현상이 유지되는 한, VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 또는 이들의 조합만으로 구성된 것뿐만 아니라, 분자 내부에 그외의 다른 부분 (portion), 예를 들면, 링커 및 차단기를 포함할 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 N 말단 또는 C 말단이 소수성기를 포함하는 모이어티와 결합되어 있는 것일 수 있다. 또한, 소수성기를 포함하는 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 측쇄 중의 반응성기와 결합에 의하여 접합될 수 있다. 상기 반응성기는 아미노기, 히드록실기, 티올기 또는 카르복실기일 수 있다. 소수성기를 포함하는 모이어티와 결합되어 있지 않은 반대편 말단은 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 예를 들면, 소수성기를 포함하는 모이어티와 엘라스틴-유사 폴리펩티드가 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 N 말단을 통하여 결합된 경우, 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 C 말단의 카르복실기는 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 상기 차단은 생체적합하거나, 면역원성이 없거나, 특이적 전달에 도움을 주거나, 생체 분해 시스템으로부터 회피될 수 있는 물질과 결합 또는 반응되어 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 차단은 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 C 말단의 카르복실기와 아미노기와의 결합에 의하여 아미드 결합을 형성함으로써 이루어질 수 있다. 상기 아미노기는 암모니아 분자 (즉, -CO-NH2 형성), 일차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민일 수 있다. 상기 일차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민은 각각 C1-C10, 예를 C1-C6의 탄소수를 갖는 것일 수 있다. X는 발린 또는 알라닌일 수 있다.
상기 반복 단위는 서로 독립적으로 1 이상의 정수회 반복되어 포함될 수 있다. 상기 반복회수는 서로 독립적으로 2 내지 200, 2 내지 100, 2 내지 80, 2 내지 60, 2 내지 40, 2 내지 10, 2 내지 12, 2 내지 8, 2 내지 6, 4 내지 100, 8 내지 80, 10 내지 60, 12 내지 40, 20 내지 40, 4 내지 10, 4 내지 8, 또는 4 내지 6의 정수인 것일 수 있다.
상기 리포좀에 있어서, 지질 이중층의 주 지질 분자: 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 몰비는 선택되는 지질 이중층의 특성 및 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 특성에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 주 지질 분자: 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 몰비는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50의 몰비일 수 있다. 예를 들면 주 지질 분자 (DPPC 또는 DPPC와 DSPC의 혼합물): 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (팔미토일-(VPGXG)n-NH2 또는 스테아로일-(VPGXG)n-NH2, n은 2 내지 12)의 몰비는 50 내지 99.0: 0.1 내지 50일 수 있다.
상기 리포좀에 있어서, 지질 이중층 중에 지질 이중층의 안정성을 높이기 위한 지질 이중층 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 지질 이중층의 상전이온도 보다 높은 상전이 온도를 갖는 지질인 것일 수 있다. 상기 안정화제는 스테롤 또는 글리코지질인 것일 수 있다. 상기 스테롤은 콜레스테롤 또는 그 유도체인 것일 수 있다. 상기 안정화제, 예를 들면, 콜레스테롤은 지질 이중층을 강화하고 투과도를 낮추는 것을 도울 수 있다. 따라서, 상기 안정화제, 예를 들면 콜레스테롤은 정상적인 체내 온도에서 리포좀이 안정적으로 존재하도록 할 수 있다. 주 지질 분자: 상기 안정화제, 예를 들면 콜레스테롤은 50 내지 99.9:0.1 내지 50의 몰비인 것일 수 있다. 주 지질 분자: 상기 안정화제, 예를 들면 콜레스테롤은 50 내지 99.9:0.1 내지 50, 예를 들면, 50 내지 99.9: 1 내지 50, 50 내지 99.9: 3 내지 50, 50 내지 99.9: 5 내지 50, 50 내지 99.9: 7 내지 50, 50 내지 99.9: 9 내지 50, 50 내지 99.9: 11 내지 50, 50 내지 99.9: 15 내지 50, 50 내지 99.9: 20 내지 50, 50 내지 99.9: 20 내지 35, 50 내지 99.9: 20 내지 30, 50 내지 99.9: 25 내지 30, 50 내지 99.9: 25 내지 50, 50 내지 99.9: 30 내지 50, 50 내지 99.9: 35 내지 50, 50 내지 99.9: 1 내지 35, 50 내지 99.9: 3 내지 30, 50 내지 99.9: 5 내지 25, 50 내지 99.9: 7 내지 20, 또는 50 내지 99.9: 9 내지 15일 수 있다.
리포좀은 간 및 이자 (세포내피계 (endothelial system) 또는 RES의 기관)의 마크로파아지에 의한 빠른 섭취로 인하여 혈중 반감기가 상대적으로 짧아, 리키한 종양 조직에서 축적되지 않을 수 있다. 리포좀은 빠른 RES 섭취를 회피하여 혈중 순환 시간을 증가시키도록 고안될 수 있다. 상기 지질 이중층은 예를 들면, 친수성 중합체로 유도체화된 지질 유도체, 예를 들면, 인지질 유도체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 올리고사카라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 유도체는 C4-C30, 예를 들면 C16-C24의 인지질에 PEG가 접합된 것일 수 있다. 상기 유도체는 DPPC-PEG, 또는 DSPE-PEG인 것일 수 있다. 상기 PEG는 분자량 180 내지 50,000 Da일 수 있다. DSPE-PEG는 X가 메톡시인, 식 3의 구조를 갖는 것일 수 있다. 식 3에서 PEG는 분자량 2000Da, 5000Da, 10000Da, 또는 20000Da일 수 있다.
Figure 112012008612509-pat00003
(식 3)
상기 리포좀은 유니라멜라 소포 (unilamellar vesicle: SUV) 또는 멀티소포성 소포 (multivesicular vesicles)일 수 있다. 상기 리포좀은 직경 50nm 내지 500nm, 예를 들면, 50nm 내지 400nm, 50nm 내지 300nm, 50nm 내지 200nm, 100nm 내지 500nm, 100nm 내지 400nm, 100nm 내지 300nm, 또는 100nm 내지 200nm일 수 있다.
상기 리포좀의 일 구체예는 상기 지질 이중층은 인지질, 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (ELP), 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체 및 콜레스테롤을 포함하는 것일 수 있다. 상기 지질 이중층은 인지질, 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드, 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체 및 콜레스테롤에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 구체예에서, 상기 인지질: 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드: 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체: 및 콜레스테롤은 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 0.1 내지 50의 몰비, 예를 들면, 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 20 내지 50, 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 20 내지 30, 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 25 내지 30, 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 20 내지 50, 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 20 내지 30, 또는 50 내지 99.9: 0.1 내지 50: 0 내지 10: 25 내지 30일 수 있다.
상기 인지질은 DPPC인 것일 수 있다. 상기 인지질은 DPPC와 DSPC의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 인지질은 DPPC: DSPC가 1: 0 내지 0.5, 예를 들면, 1: 0.1 내지 0.5의 몰비인 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 상기 모이어티는 아실기이고, 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 (VPGXG)n 또는 (GVPGX)m를 포함하고, X는 프롤린이 아닌 아미노산이고, n 또는 m은 1 이상의 정수인 것일 수 있다. X는 발린 또는 알라닌일 수 있다. n은 1 내지 12이고, m은 1 내지 12인 것일 수 있다. 상기 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 스테아로일-(GVPGX)2-6인 것일 수 있다. 스테아로일-(GVPGX)2-6의 카르복실 말단의 카르복실기는 차단되거나 차단되지 않을 수 있다. 상기 차단은 카르복실기와 아미노기 (예, 암모니아: -CO-NH2 형성)의 결합에 의한 아미드 결합에 의하여 차단되어 있을 수 있다.
상기 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체는 DPPC-PEG, 또는 DSPE-PEG일 수 있다. 상기 PEG는 분자량 180 내지 50,000 Da일 수 있다.
상기 일 양상에 따른 리포좀은 약 10℃ 내지 약 70℃의 상전이 온도, 예를 들면, 10℃ 내지 60℃, 10℃ 내지 55℃, 10℃ 내지 45℃, 20℃ 내지 60℃, 20℃ 내지 55℃, 30℃ 내지 45℃, 30℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 45℃를 갖는 것일 수 있다. 상전이 온도는 주 지질 분자의 탄소 사슬 길이, 불포화 결합의 수, 지질분자의 혼합 및 이들의 조합에 의하여 조절될 수 있다. 예를 들면, 상전이 온도가 낮은 DPPC에 DPPC 보다 높은 DSPC를 혼합하는 경우, DPPC와 DSPC의 혼합물로 구성된 리포좀은 DPPC만으로 구성된 리포좀 보다 상전이 온도가 높아질 수 있다. 상기 리포좀은 실온에서 젤상인 것일 수 있다.
일 양상에 따른 리포좀은 제1 활성성분 및 제2 활성성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 더 포함할 수 있다. 제1 활성성분은 항암제일 수 있다. 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 내부 (interior)에 포집되어 있는 것일 수 있다. 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 지질 이중층에 포집되어 있는 것일 수 있다. 또는, 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 외표면에 위치하는 것일 수 있다. 상기 리포좀은 제1 활성성분 및 제2 활성성분을 모두를 포함할 수 있다. 제2 활성성분은 진단 작용제일 수 있다. 상기 항암제는 메토트렉세이트, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 엘립티신, 캄토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 프레드니손, 메틸-프레드니손, 비프로부펜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 진단 작용제는 이미징제일 수 있다. 상기 이미징제는 디에틸렌트리아민펜타아세트산-가돌리늄 (DTPA(Gd))일 수 있다. 상기 이미징제는 지질이중층의 지질분자에 접합된 것일 수 있다. 상기 이미징제는 인지질에 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, DTPA(Gd)가 접합된 인지질, 예를 들면, DSPE-DTPA(Gd)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 리포좀은 SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-cRGDyK, 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤; 또는 SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤;을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 리포좀은 SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-cRGDyK, 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤; 또는 SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤;을 포함하는 것일 수 있다. 여기서, SA는 스테아로일이며, V는 VPGVG를 나타낸다.
다른 양상은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 및 리포좀을 포함하는 활성성분을 개체에 전달하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 리포좀은 항암제인 제1 활성성분, 및 제2 활성성분 중 어느 하나 또는 모두; 지질 이중층; 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (elastin-like polypetide: ELP); 및 지질 이중층 안정화제를 포함하고, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 있고, 상기 지질 이중층은 암 세포 표적화 물질이 결합된 제1 지질분자를 포함하는 것인 리포좀인 것인 조성물을 제공한다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 상기 담체 또는 희석제는 물 예를 들면, 식염수 및 멸균수, 링거액, 완충제, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 리포좀에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 리포좀은 수성 매질 중에 분산되어 있는 것일 수 있다. 상기 수성 매질은 생리식염수 또는 PBS를 포함하는 것일 수 있다.
제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 내부 공간에 포집되어 있는 것일 수 있다. 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 지질 이중층에 포집되어 있는 것일 수 있다. 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 외부 표면에 위치하는 것일 수 있다. 상기 리포좀은 39℃ 내지 45℃의 상전이 온도를 갖는 것일 수 있다. 상기 리포좀은 실온에서 젤상인 것일 수 있다. 상기 리포좀은 제1 활성성분 및 제2 활성성분을 모두를 포함할 수 있다. 제2 활성성분은 진단 작용제일 수 있다. 상기 항암제는 메토트렉세이트, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 엘립티신, 캄토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 프레드니손, 메틸-프레드니손, 비프로부펜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 진단 작용제는 이미징제일 수 있다. 상기 이미징제는 디에틸렌트리아민펜타아세트산-가돌리늄 (DTPA(Gd))일 수 있다. 상기 이미징제는 지질이중층의 지질분자에 접합된 것일 수 있다. 상기 이미징제는 인지질에 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, DTPA(Gd)가 접합된 인지질, 예를 들면, DSPE-DTPA(Gd)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 조성물 중 리포좀은 SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-cRGDyK, 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤; 또는 SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤;을 포함하는 것일 수 있다. 또는 상기 리포좀은 SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-cRGDyK, 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤; 또는 SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-cRGDyK, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤;을 포함하는 것일 수 있다. 여기서, SA는 스테아로일이며, V는 VPGVG를 나타낸다.
상기 개체는 인간 또는 인간을 제외한 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 원숭이, 생쥐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
다른 양상은 개체의 체내의 표적 부위에 활성성분을 전달하는 방법으로서, 활성성분을 포함하는 리포좀을 개체에게 투여하는 단계로서, 상기 리포좀은 항암제인 제1 활성성분, 및 제2 활성성분 중 어느 하나 또는 모두; 지질 이중층; 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (elastin-like polypetide: ELP); 및 지질 이중층 안정화제를 포함하고, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 있고, 상기 지질 이중층은 암 세포 표적화 물질이 결합된 제1 지질분자를 포함하는 것인 단계; 및 상기 개체의 표적 부위를 상기 투여 단계 전, 동시, 및 후 중 하나이상의 시기에 가열하여 상기 표적 부위에서 상기 리포좀으로부터 상기 활성성분을 방출시키는 단계;를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법은 활성성분을 포함하는 리포좀을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 활성성분을 포함하는 리포좀에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 리포좀은 상전이 온도 39℃ 내지 45℃인 것일 수 있다.
상기 투여는 비경구 투여일 수 있다. 상기 비경구 투여는 예를 들면, 정맥내 투여, 피하, 근육내, 체강내 (복강, 관절, 또는 안강), 또는 직접 주사에 의하여 투여될 수 있다. 직접 주사는 병증의 부위 예를 들면, 종양 부위에 직접 주사하는 것일 수 있다. 상기 리포좀은 정맥과 같은 혈액 내에 투여하고, 혈류에 의하여 종양 부위와 같은 표적 부위에 전달될 수 있다. 상기 표적 부위는 리키한(leaky) 특성을 갖는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 개체의 표적 부위를 상기 투여 단계 전, 동시, 및 후 중 하나이상의 시기에 가열하여 상기 표적 부위에서 상기 리포좀으로부터 상기 활성성분을 방출시키는 단계를 포함한다. 상기 가열은 임상적 과정으로 가열되거나, 염증과 같은 체내의 다른 부위에 비하여 내재적으로 더 높은 표적 부위와 연관될 것일 수 있다. 상기 임상적 과정에 의한 가열은, 직접적 열전달, 예를 들면, 수조의 더운 액체 매질, 예를 들면 물에 신체를 접촉시키는 것, 표적 부위에 초음파, 예를 들면, 고강도 집중된 초음파 (high intensity focused ultrasound)를 가하는 것, 또는 자기장, 예를 들면, 증폭된 자기장 (amplified magnetic field: AMF), 마이크로파 및/또는 라디오파 (radiofrequency)를 가하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 표적 부위는 병적인 증상이 존재하는 위치, 예를 들면, 종양혈관, 또는 종양 부위 (예, 고형 종양)일 수 있다. 상기 가열은 39℃ 내지 45℃로 가열하는 것일 수 있다.
제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 내부 공간에 포집되어 있는 것일 수 있다. 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 지질 이중층에 포집되어 있는 것일 수 있다. 제1 및/또는 제2 활성성분은 상기 리포좀의 외부 표면에 위치하는 것일 수 있다. 상기 리포좀은 39℃ 내지 45℃의 상전이 온도를 갖는 것일 수 있다. 상기 리포좀은 실온에서 젤상인 것일 수 있다. 상기 리포좀은 제1 활성성분 및 제2 활성성분을 모두를 포함할 수 있다. 제2 활성성분은 진단 작용제일 수 있다. 상기 항암제는 메토트렉세이트, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 엘립티신, 캄토테신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 프레드니손, 메틸-프레드니손, 비프로부펜 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 진단 작용제는 이미징제일 수 있다. 상기 이미징제는 디에틸렌트리아민펜타아세트산-가돌리늄 (DTPA(Gd))일 수 있다. 상기 이미징제는 지질이중층의 지질분자에 접합된 것일 수 있다. 상기 이미징제는 인지질에 접합된 것일 수 있다. 예를 들면, DTPA(Gd)가 접합된 인지질, 예를 들면, DSPE-DTPA(Gd)일 수 있다.
상기 방법은 제2 활성성분은 이미징제이고, 상기 투여 단계 후 제2 활성성분을 검출하여, 암 혈관 부위를 이미지화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은, 상기 이미지화 단계에서 얻어진 암 혈관 부위의 이미지에 근거하여 암 혈관 부위를 특이적으로 가열하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 이미지화는 MRI, 초음파, CT, 레이저, 적이선, PET, 및/또는 다른 이미지화 기술를 포함한 비침습적 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 또한, 초음파 또는 라디파 라디오미터를 사용한 방법에 의하여 이루어질 수 있다.
일 양상에 따른 리포좀에 의하면, 온도에 따른 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 수축 또는 자가조립에 의하여, 투과성이 조절될 수 있다. 따라서, 상기 리포좀은 활성성분을 개체의 표적 부위인 종양 혈관 부위에 효율적으로 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다.
활성성분을 포함하는 상기 리포좀은, 리포좀 자체의 상전이 온도뿐만 아니라, 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 상전이 온도에 의하여 투과성이 조절될 수 있다. 따라서, 상기 리포좀이 생체 온도에서 더 안정한 조성을 갖는 경우, 예를 들면, 생체 온도에서 더 안정하게 리포좀을 유지될 수 있도록 하기에 유효한 양의 콜레스테롤과 같은 지질 이중층을 안정화시키는 분자가 포함되어 있는 상태에서도, 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 상전이 온도에 의하여 투과성이 효율적으로 조절될 수 있다.
다른 양상에 따른 리포좀을 포함하는 활성성분을 개체에 전달하기 위한 약학적 조성물에 의하면, 활성성분을 개체에 효율적으로 종양 혈관 부위에 전달하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 개체의 체내의 표적 부위에 활성성분을 투여하는 방법에 의하면, 활성성분을 개체의 체내의 표적 부위인 종양 혈관에 효율적으로 전달할 수 있다.
도 1은 실시예 1~3에 따른 SA-V3-NH2, DPPC+DSPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤을 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다. DPPC/DSPC 몰비는 100/0 (실시예 1), 75/25 (실시예 2), 50/50 (실시예 3)으로 사용되었다.
도 2는 실시예 4,2,5,6에 따른 SA-V3-NH2, DPPC/DSPC(75/25), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:5, 0.55:55:2:10, 0.55:55:2:15, 0.55:55:2:20 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 7,2,8,9에 따른 SA-V3-NH2 DPPC/DSPC(75/25), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.275:55:2:10, 0.55:55:2:10, 1.1:55:2:10, 2.75:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 10, 11에 따른 SA-V3-NH2, DPPC/DSPC/DSPE-DTPA(Gd) (75/24/1 or 75/20/5), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 2, 10, 11에 따른 SA-V3-NH2, DPPC/DSPC/DSPE-DTPA(Gd) (75/25/0 or 75/24/1 or 75/20/5), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀의 MRI T1 weighted image를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 12에 따른 SA-V3-NH2, DPPC/DSPC(75/25), DSPE-PEG-cRGD 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀의 온도민감성 약물방출거동을 나타낸다.
도 7은 실시예 13에 의해 실시된 U-87MG에 대한 in vitro FACS 결과이다.
도 8은 실시예 13에 의해 실시된 U-87MG에 대한 in vitro FACS 결과이다.
도 9는 실시예 13에 의해 실시된 KB cell에 대한 in vitro FACS 결과이다.
도 10은 실시예 13에 의해 실시된 KB cell에 대한 in vitro FACS 결과이다.
도 11은 실시예 14에 의해 실시된 U-87MG에 대한 confocal microscopy 관찰 결과를 나타내고 있다.
도 12는 실시예 15에 의해 실시된 cRGD 도입 온도민감성 리포좀에 대한 세포독성을 보여주고 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 내지 9에서는 암혈관에 특이적으로 결합하는 물질이 결합되지 않은 리포좀을 제조하고 그의 온도 민감성을 확인하였다. 또한, 실시예 10 내지 11에서는 조영제가 봉입된 리포좀의 온도 민감성 및 조영효과를 확인하였다. 실시예 12 내지 15에서는 암혈관에 특이적으로 결합하는 물질이 결합된 리포좀을 제조하고 그의 온도 민감성을 확인하였으며, 세포내 전달 효과 및 세포독성을 확인하였다.
실시예 1: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
스테아로일-VPGVG VPGVG VPGVG-NH2 (서열번호 3: 이하 "SA-V3-NH2"라고도 한다), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (암모늄 염) [1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)] (DSPE-PEG), 및 콜레스테롤을 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 유니라멜라 소포 형태의 리포좀을 제조하였다.
구체적으로, SA-V3-NH2을 메탄올 중에 용해시키고, DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤은 클로로포름 중에 용해시켰다. 상기 메탄올 용액과 클로로포름 용액을 둥근 바닥 플라스크에서 혼합한 후 회전 증발기 (rotary evaporater)를 사용하여 상온에서 용매를 증발시켜 상기 용기의 내벽 상에 지질 박막을 형성시켰다.
다음으로, 상기 용기에 250mM 암모늄 술페이트 용액을 상온에서 첨가하여, 상기 지질 박막을 수화시켰다.
상기 수화된 용액을 상온에서 공극 크기 100nm의 폴리카르보네이트 막을 통과시켜 유니라멜라 소포 형태의 리포좀을 제조하였다. 제조되어진 리포좀 용액을 25mM TrisㆍHCl이 채워진 Sephadex G-50 칼럼을 통과시켜 리포좀 내부는 250mM 암모늄 술페이트가 외부는 25mM TrisㆍHCl로 이루어진 리포좀 용액을 제조하였다. 독소루비신 (doxorubicin: DOX)는 주지질 성분대비 1:0.2의 질량비로 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 생리식염수가 채워진 Sephadex G-50 칼럼 (GE healthcare)을 통과시켜 봉입되지 않은 DOX를 제거하였다. 그 결과, DOX가 리포좀의 수성 내부에 포집되어 있는 리포좀을 제조하였다 (90%이상의 봉입효율). 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 150nm를 가졌다.
제조된 리포좀 제형의 인 비트로 안정성 및 열 민감도는 생리식염수의 존재하에서 25℃ 내지 55℃의 온도에서 5분 동안 인큐베이션하여 상기 리포좀의 수성 내부로부터 주변 용액으로 방출되는 DOX의 백분율을 측정함으로써 평가하였다.
인큐베이션 후, 상기 시료의 형광 강도는 리포좀으로부터 방출된 DOX의 양을 결정하기 위하여 적절히 희석 후 여기 파장 (λex) = 488nm 및 방출 파장 (λem)= 612nm에서 측정되었다. 특정 온도에서 인큐베이션에 따른 상대적 백분율 형광 강도는 1% Triton X-100 (에탄올)의 첨가에 의하여 상기 리포좀 시료의 파괴 후 얻어진 포집된 물질의 총 방출량 (total release)에 대하여 비교함으로써 계산되었다.
실시예 2: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
DPPC 대신 DPPC/DSPC 조성을 75/25 몰비로 제조한 것을 제외하고는 실시예 1의 조성과 동일한 조성으로 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
실시예 3: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
DPPC 대신 DPPC/DSPC 조성을 50/50 몰비로 제조한 것을 제외하고는 실시예 1의 조성과 동일한 조성으로 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 180nm를 가졌다.
도 1은 실시예 1,2,3에 따른 SA-V3-NH2, DPPC (또는 DPPC+DSPC 혼합물), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, DPPC와 DSPC의 혼합시 약물방출온도가 증가하였다. 최대 방출량은 70%를 초과하였다. 41℃의 상전이 온도를 갖는 DPPC와 54℃의 상전이 온도를 갖는 DSPC의 혼합을 통해 상전이 온도 조절이 가능하여 약물방출온도 제어가 가능하여진다.
실시예 4: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 조성은 0.55:55:2:5 몰비인 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
실시예 5: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 조성은 0.55:55:2:15 몰비인 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
실시예 6: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 조성은 0.55:55:2:20 몰비인 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
도 2는 실시예 4,2,5,6에 따른 SA-V3-NH2, DPPC+DSPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:5, 0.55:55:2:10, 0.55:55:2:15, 0.55:55:2:20 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, DPPC+DSPC 대비 콜레스테롤 함유량이 높아질수록 42℃에서의 최대약물방출량이 감소하였다. 이는 콜레스테롤이 DPPC+DSPC로 이루어진 리포좀 멤브레인의 상전이를 방해하여 약물방출이 저해되는 것으로, 42℃에서 80%이상의 약물방출을 구현하기 위해서는 DPPC+DSPC 대비 콜레스테롤 함유량이 약 20%이하여야 한다는 것으로 확인되어진다.
실시예 7: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 조성은 0.275:55:2:10 몰비인 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
실시예 8: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 조성은 1.1:55:2:10 몰비인 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
실시예 9: 리포좀의 제조 및 열 민감도의 측정
SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 조성은 2.75:55:2:10 몰비인 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
도 3은 실시예 7,2,8,9에 따른 SA-V3-NH2 DPPC+DSPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.275:55:2:10, 0.55:55:2:10, 1.1:55:2:10, 2.75:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, DPPC+DSPC 대비 SA-V3-NH2 함유량에 상관없이 42℃에서의 최대약물방출량이 80% 이상이었다. 이를 통하여 SA-V3-NH2의 함유량이 최대약물방출량에 관여하지 않는 것으로 확인되었다. 단, 실시예 9의 조성 2.75:55:2:10 몰비로 리포좀이 제조되는 경우, 약물방출시작 온도가 2~3℃ 낮아지게 되었다. 이는 리포좀에 도입된 SA-V3-NH2 분자간의 상호작용에 의한 것으로 여겨지나, 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
실시예 10: 조영제 도입 리포좀 제조
DSPC/DPPC 대신 DPPC/DSPC/DSPE-DTPA(Gd)를 75/24/1 몰비로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 리포좀 수성내부에 DOX가 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
실시예 11: 조영제 도입 리포좀 제조
DSPC/DPPC 대신 DPPC/DSPC/DSPE-DTPA(Gd)를 75/20/5 몰비로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 조성으로 리포좀 수성내부에 DOX가 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다.
도 4는 실시예 10, 11에 따른 SA-V3-NH2 DPPC+DSPC+DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀으로부터 온도에 따른 DOX 방출 프로필을 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, DPPC/DSPC/DSPE-DTPA(Gd) 75/24/1 (실시예 10), 75/20/5 (실시예 11) 몰비로 제조된 리포좀의 약물방출거동이 유사하게 나타났다. 42도에서의 최대약물방출량은 80% 이상이었다. 이를 통하여 Magnetic resonance imaging (MRI) 조영제인 DSPE-DTPA(Gd) 도입 리포좀이 온도민감성 약물방출을 나타내는 것이 확인되었다.
도 5는 실시예 2, 10, 11에 따른 SA-V3-NH2 DPPC+DSPC+DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀의 MRI T1 weighted image를 나타내는 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, DPPC/DSPC, DPPC/DSPC/DSPE-DTPA(Gd) 75/25 (실시예 2), 75/24/1 (실시예 10), 75/20/5 (실시예 11) 몰비로 제조된 리포좀에서 DSPE-DTPA(Gd) 함유량이 증가할수록 T1 weighted image가 밝게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 도입된 DSPE-DTPA(Gd)가 MRI 조영을 가능하게 함을 확인하였다.
실시예 12: 암혈관 표적화 cRGD 도입 리포좀 제조
DSPE-PEG 대신 DSPE-PEG-cRGD를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 DOX가 리포좀 수성내부에 포집된 리포좀을 제조하였다. 제조된 리포좀은 Zeta-sizer (Malvern inst.) 기기에 의하여 측정된, 평균 직경 170nm를 가졌다. 본 실시예에 사용된 DSPE-PEG-cRGD는 아래의 구조식을 갖는 DSPE-PEG2000-cRGD 분자를 사용하였다.
Figure 112012008612509-pat00004
(식 2).
도 6은 실시예 12에 따른 SA-V3-NH2 DPPC+DSPC, DSPE-PEG-cRGD 및 콜레스테롤 0.55:55:2:10 몰비로 사용하여 제조된 리포좀의 온도민감성 약물방출거동을 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이 표적물질인 DSPE-PEG-cRGD 도입된 리포좀이 42℃에서 약 80% 이상의 약물방출을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 13: cRGD 도입 리포좀의 암표적 특성 ( 세포내 전달, FACS )
cRGD로 수식된 온도민감성 리포좀의 암표적 특성을 확인하기 위하여 cRGD와 결합 친화도가 높은 αvβ3 인테그린이 과발현된 U-87MG (Human glioblastoma-astrocytoma, epithelial-like cell line) 세포와 αvβ3 인테그린이 과발현되지 않은 KB 세포에 대한 세포내전달 효과를 확인하였다. 또한, cRGD 수식여부에 대한 영향을 확인하기 위하여 실시예 2 (cRGD 미수식)와 실시예 12 (cRGD 수식)에서 제조된 DOX 봉입 리포좀을 사용하였다.
cRGD와 결합하는 αvβ3 인테그린이 과발현된 U-87MG 세포를 6웰에 5x105개/well의 분포로 10% Fetal bovine serum (FBS)가 포함된 Minimum Essential Medium Eagle (MEM) 2 mL 에서 24시간 동안 키워주었다. 실시예 2 또는 실시예 12에서 제조된 리포좀을 DOX 농도 30μg/mL의 농도로 처리하고 37℃에서 2시간 동안 유지시켜주었다. MEM을 제거한 후 1% bovine serum albumin (BSA) 이 포함된 생리식염수로 씻어주고 새로운 MEM을 채워주었다. 37℃와 42℃에서 30분간 유지시켜준 후 MEM을 제거하고 1% BSA 포함 생리식염수로 씻어주었다. Cell dissociation solution (Sigma Aldrich)으로 세포를 well에서 분리하여 Fluorescence activated cell sorting (FACS)를 수행하여, 세포를 검출하였다.
U-87MG에서의 세포내전달과 비교하기 위하여 αvβ3가 과발현되지 않은 KB 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI1640 media에서 키운 것을 제외하고는 U-87MG와 동일한 방법으로 준비하여 FACS를 측정하였다.
도 7,8,9,10은 U-87MG와 KB 세포에서의 FACS 측정 결과를 나타내고 있다. 도 7에서 보여주는 바와 같이 37℃도에서 처리한 경우, cRGD가 도입되지 않은 실시예 2의 리포좀에 비해 cRGD가 도입된 실시예12의 리포좀이 상대적으로 많은 양이 세포내로 전달된 것을 확인할 수 있었다. 또한 42℃에서 세포를 처리한 경우 도 8에서 나타나는 바와 같이 더 높은 형광값이 나타나는 것을 알수 있다. 42℃에서 처리하는 경우 리포좀이 약물을 방출하여 DOX의 형광이 높아져서 전체적인 형광값이 높아짐을 알 수 있었다.
도 9와 10에서는 αvβ3 인테그린이 과발현되지 않은 KB 세포에 대한 표적효과를 나타낸다. cRGD가 수식된 경우 (실시예12) 수식되지 않은 리포좀 (실시예2)에 비해 약간 더 높은 형광을 나타내지만 U-87MG에 비해 많은 양이 세포내로 전달되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
U-87MG와 KB 세포에 대한 세포내 전달 효과를 확인함으로써 cRGD 수식이 선택적으로 αvβ3 인테그린이 과발현된 세포에 대해서만 전달되는 것을 확인하였다.
실시예 14: cRGD 도입 리포좀의 암표적 특성 ( 세포내 전달, Confocal microscopy )
cRGD로 수식된 온도민감성 리포좀의 암표적 특성을 확인하기 위하여 cRGD와 결합 친화도가 높은 αvβ3 인테그린이 과발현된 U-87MG에 대한 세포내전달 효과를 confocal microscopy를 통해 확인하였다. 또한, cRGD 수식 여부에 대한 영향을 확인하기 위하여 실시예 2 (cRGD 미수식)와 실시예 12 (cRGD 수식)에서 제조된 DOX 봉입 리포좀을 사용하였다.
cRGD와 결합하는 αvβ3 인테그린이 과발현된 U-87MG 세포를 96-웰에 5x103개/well의 분포로 10% Fetal bovine serum (FBS)가 포함된 Minimum Essential Medium Eagle (MEM) 100 μL 에서 24시간동안 키워주었다. 실시예 2 또는 실시예 12에서 제조된 리포좀을 DOX농도 30μg/mL의 농도로 처리하고 37℃에서 1시간동안 유지시켜주었다. MEM을 제거한 후 1% bovine serum albumin (BSA) 이 포함된 생리식염수로 씻어주고 새로운 MEM을 채워주었다. 42℃에서 30분간 유지시켜준 후 MEM을 제거하고 1% BSA 포함 생리식염수로 씻어주고 IN CELL ANALYZER (GE healthcare)를 이용하여 image를 관찰하였다.
도 11은 U-87MG 세포에서의 관찰 측정 결과를 나타내고 있다. 도 11에서 cRGD가 도입되지 않은 실시예 2의 리포좀에 비해 cRGD가 도입된 실시예12의 리포좀이 상대적으로 많은 양이 세포내로 전달된 것을 확인할 수 있었다.
U-87MG 세포에 대한 세포내 전달 효과를 확인함으로써 cRGD 수식이 선택적으로 αvβ3 인테그린이 과발현된 세포에 대해서만 전달되는 것을 확인하였다.
실시예 15: cRGD 도입 리포좀의 암표적 특성 (세포독성)
cRGD로 수식된 온도민감성 리포좀의 암표적 특성을 확인하기 위하여 cRGD와 결합 친화도가 높은 αvβ3 인테그린이 과발현된 U-87MG (Human glioblastoma-astrocytoma, epithelial-like cell line) 세포에 대한 독성을 확인하였다.
cRGD와 결합하는 αvβ3 인테그린이 과발현된 U-87MG 세포를 96-웰에 5x105개/well의 분포로 10% FBS가 포함된 MEM 100μL 에서 24시간 동안 키워주었다. 실시예 2 또는 실시예 12에서 제조된 리포좀을 DOX 농도 30μg/mL의 농도로 처리하고 37℃에서 1시간동안 유지시켜주었다. MEM을 제거한 후 1% BSA 이 포함된 생리식염수로 씻어주고 새로운 MEM을 채워주었다. 37℃와 42℃에서 30분간 유지시켜주었다. 37℃에서 2일동안 유지한 후 WST-1 분석을 이용하여 처리한 약물과 리포좀의 독성을 확인하였다.
도 12는 리포좀에 대한 세포독성을 보여주고 있다. 실시예 2에서 제조한 리포좀은 37℃에서 처리한 리포좀은 세포가 거의 모두 생존하였으나 42에서 처리한 경우 약 75%의 세포가 생존한 것을 확인하였다. 이는 일부 확산에 의해 세포내로 전달된 리포좀이 37℃에서 약물을 방출하지 않아 독성을 나타내지 않지만, 42℃에서 약물을 방출하여 독성이 나타나는 것으로 여겨진다. 그러나, 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다. 반면에 cRGD가 수식된 실시예 11에서 제조된 리포좀은 수용체 매개 엔토시토시스(receptor mediated endocytosis)에 의해 세포내로 전달이 많이 되었는데 37℃에서 약물이 방출되지 않아 독성을 나타내지 않고 42℃에서 처리된 경우 약물을 방출하여 약 40%의 세포생존도를 나타내었다. 이는 도 10의 FACS 결과와 일치하는 것으로서 cRGD 도입을 통해서 세포내 약물전달을 높일 수 있다는 것을 확인시켜주고 있다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> liposome comprising elastin-like polypeptide and use thereof <130> PN094952 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa denotes amino acid other than proline <400> 1 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence <220> <221> VARIANT <222> (3) <223> Xaa denotes amino acid other than proline <400> 2 Pro Gly Xaa Gly Val 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa denotes amino acid other than proline <400> 3 Gly Xaa Gly Val Pro 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Xaa denotes amino acid other than proline <400> 4 Xaa Gly Val Pro Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa denotes amino acid other than proline <400> 5 Gly Val Pro Gly Xaa 1 5 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence modified with stearoylation and amidation <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Amino terminal nitrogen is stearoylated <220> <221> VARIANT <222> (30) <223> Carboxy terminal carboxy group is amidated with -NH2 <400> 6 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-like polypeptide unit sequence modified with stearoylation at amino terminal and amidation at carboxy terminal <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> Amino terminal nitrogen is stearoylated <220> <221> VARIANT <222> (15) <223> Carboxy terminal carboxyl group is amidated with -NH2 <400> 7 Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated peptide homing to malignant pancreatic vasculature <400> 8 Cys Arg Gly Arg Arg Ser Thr 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated peptide homing to malignant pancreatic vasculature <400> 9 Cys Arg Ser Arg Lys Gly 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isolated peptide homing to malignant pancreatic vasculature <400> 10 Cys Lys Ala Ala Lys Asn Lys 1 5

Claims (50)

  1. 지질 이중층; 소수성기를 포함하는 모이어티가 접합된 엘라스틴-유사 폴리펩티드 (elastin-like polypeptide: ELP); 및 지질 이중층 안정화제를 포함하고, 상기 소수성기를 포함하는 모이어티는 상기 지질 이중층에 충진되어 있고, 상기 지질 이중층은 암 세포 표적화 물질이 결합된 제1 지질분자를 포함하고, 상기 지질 이중층은 인지질을 포함하는 것인 리포좀으로서,
    SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG-cRGDyK, 및 콜레스테롤;
    SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG-cRGDyK, DSPE-PEG 및 콜레스테롤;
    SA-V3-NH2, DSPC+DPPC, DSPE-PEG-cRGDyK, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤;
    SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-PEG-cRGDyK, 및 콜레스테롤;
    SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-PEG-cRGDyK, DSPE-PEG 및 콜레스테롤; 또는
    SA-V3-NH2, DPPC, DSPE-PEG-cRGDyK, DSPE-DTPA(Gd), DSPE-PEG 및 콜레스테롤; 을 포함하고,
    여기서 SA-V3-NH2는 V는 발린, P는 프롤린, G는 글리신인 것인 스테아로일-VPGVG VPGVG VPGVG-NH2이고, DSPC는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린이고, DPPC는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린이고, DSPE는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이고, DTPA(Gd)는 디에틸렌트리아민펜타아세트산-가돌리늄이고, 상기 DSPE-PEG-cRGDyK는 -[OCH2CH2]n-은 분자량이 180 내지 50, 000Da인 것인 하기 구조를 갖는 것인 리포좀:
    Figure 112018114942543-pat00022
    (식2).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 지질 이중층은 친수성 중합체로 유도체화된 인지질 유도체를 포함하고, 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 올리고사카라이드 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 리포좀.
  6. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 39℃ 내지 45℃의 상전이 온도를 갖는 것인 리포좀.
  7. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 직경 50nm 내지 500nm인 것인 리포좀.
  8. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 제1 활성성분 및 제2 활성성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 더 포함하고, 제1 활성성분은 항암제인 것인 리포좀.
  9. 삭제
  10. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 및 리포좀을 포함하는 활성성분을 개체에 전달하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 리포좀은 항암제인 제1 활성성분, 및 제2 활성성분 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 청구항 1의 리포좀인 것인 조성물.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, 상기 리포좀은 39℃ 내지 45℃의 상전이 온도를 갖는 것인 조성물.
  13. 삭제
  14. 제10항에 있어서, 상기 리포좀은 직경 50nm 내지 500nm인 것인 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 개체의 체내의 표적 부위에 활성성분을 전달하는 방법으로서,
    활성성분을 포함하는 리포좀을 개체에게 투여하는 단계로서, 상기 리포좀은 항암제인 제1 활성성분, 및 제2 활성성분 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 청구항 1의 리포좀인 것인 단계; 및
    상기 개체의 표적 부위를 상기 투여 단계 전, 동시, 및 후 중 하나이상의 시기에 가열하여 상기 표적 부위에서 상기 리포좀으로부터 상기 활성성분을 방출시키는 단계;를 포함하는 것인 방법으로서,
    상기 활성 성분은 약리학적으로 활성인 성분 또는 진단 작용제이고, 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물인 것인 방법.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서, 상기 리포좀은 39℃ 내지 45℃의 상전이 온도를 갖는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 가열은 39℃ 내지 45℃로 가열되는 것인 방법.
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