ES2700198T3 - Liposoma sensible al pH de unión a nucleolina - Google Patents

Liposoma sensible al pH de unión a nucleolina Download PDF

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ES2700198T3 ES09750844T ES09750844T ES2700198T3 ES 2700198 T3 ES2700198 T3 ES 2700198T3 ES 09750844 T ES09750844 T ES 09750844T ES 09750844 T ES09750844 T ES 09750844T ES 2700198 T3 ES2700198 T3 ES 2700198T3
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Abstract

Un sistema de suministro dirigido por ligando que comprende al menos un ligando unido a un soporte que transporta un agente, donde: - el ligando es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 - el soporte es un liposoma sensible al pH con capacidad de liberación activada intracelular; - el agente es un agente terapéutico, de diagnóstico y/o de imágenes, encapsulado, atrapado o intercalado en el soporte.

Description

DESCRIPCIÓN
Liposoma sensible al pH de unión a nucleolina
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los campos de enfermedades y trastornos humanos, más específicamente a métodos de migración dirigida y suministro selectivo de un agente a células humanas, combinando la especificidad de dirección con la liberación activada intracelular de la carga. La presente invención puede aplicarse, por ejemplo, en el tratamiento y/o diagnóstico de diferentes tipos de cáncer, así como otras enfermedades y trastornos.
Información antecedente
Entre las enfermedades y trastornos humanos, el cáncer es la causa principal de muerte en todo el mundo occidental. Aunque, en la mayoría de los casos, el diagnóstico a menudo va seguido de cirugía y el pronóstico es favorable, a menudo aparecen formas recidivantes después de la cirugía, lo que indica que ya había metástasis presentes en el momento en que se detectó la enfermedad. Este es el obstáculo principal para una remisión completa del tumor.
La quimioterapia tradicional constituye una de las modalidades de tratamiento más importantes contra el cáncer. Los agentes quimioterapéuticos, tras su administración sistémica, se caracterizan generalmente por un alto volumen de distribución que da lugar a una mala selectividad hacia las células tumorales y acumulación en tejidos sanos. Dicho patrón de distribución puede dar lugar a toxicidades aumentadas contra los tejidos normales que también muestran tasas proliferativas potenciadas, tal como la médula ósea, el tubo gastrointestinal y los folículos capilares. La mielosupresión, la alopecia o la mucositis son ejemplos de algunas de las consecuencias más desagradables e indeseadas del combate del cáncer con tratamiento convencional (Ferrara, 2005). Los efectos secundarios que se producen como resultado de las toxicidades a los tejidos normales significan que los agentes quimioterapéuticos antineoplásicos a menudo se administran a dosis subóptimas, lo que provoca el fracaso eventual del tratamiento. Esto a menudo va acompañado por el desarrollo de resistencia a fármacos y enfermedad metastásica. El suministro de fármacos dirigido hacia las células tumorales, por otro lado, ofrece la posibilidad de superar estas consecuencias dirigiendo y concentrando el agente terapéutico únicamente en el sitio diana deseado, aumentando la eficacia terapéutica mediante la muerte aumentada de las células tumorales y la incidencia disminuida de los efectos secundarios en los tejidos sanos (Allen, 2002).
Las células tumorales requieren un suministro de sangre exclusivo y eficaz, que no puede proporcionarse por los vasos existentes en tejidos normales (Folkman, 1990). Por lo tanto, la angiogénesis, un proceso habitual en la curación de heridas, empieza a desarrollarse para crear una red de vasos sanguíneos apropiada para irrigar la masa celular novedosa. Como la angiogénesis está controlada por factores pro- y antiangiogénicos, parece que es una diana prometedora en el tratamiento del cáncer (Ferrara, 2005). Los vasos angiogénicos presentan características distintas a diferentes niveles, principalmente en los marcadores expresados en la superficie celular (Carmeliet, 2003). Muchos de estos marcadores de vasos tumorales son proteínas asociadas con angiogénesis inducida por tumor y algunos son específicos para determinados tumores (Pasqualini, 2002). Dirigir los agentes terapéuticos a la vasculatura de los tumores, en oposición a las propias células tumorales, ofrece algunas ventajas adicionales: la eliminación del suministro sanguíneo del tumor puede suprimir profundamente el crecimiento tumoral; los vasos sanguíneos son más fácilmente accesibles al tratamiento administrado por vía intravenosa que las células tumorales, y aunque los vasos sanguíneos tumorales adquieren una "característica distintiva" asociada al tumor, están compuestos de células normales que no adquieren fácilmente mutaciones que podrían dar lugar además a resistencia a fármacos (Boehm, 1997); además, la dirección a la vasculatura tumoral evita problemas asociados con la resistencia intrínseca a fármacos tales como los relacionados con una mala penetración del fármaco en el tumor debido a altos gradientes de presión intersticial dentro de los tumores (Feron, 2004). La selectividad del tratamiento contra células endoteliales derivadas de tumor proliferativo y la toxicidad mínima probablemente se consiguen porque la angiogénesis en el adulto está limitada a la curación de heridas, la ovulación, el embarazo y la ateroesclerosis (Folkman, 2007; Folkman, 2005; Hanahan, 1996). En términos generales, la selectividad del tratamiento puede conseguirse diseñando un sistema donde el agente se oculta, mientras que la superficie se decora de una manera en que tiene la capacidad de dirigir el sistema al sitio diana, aprovechando una o más características distintas del sitio patológico. A este respecto, una de las estrategias más importantes en la farmacología del cáncer guiada de forma molecular es el desarrollo de técnicas que pueden modificar las características cinéticas de los fármacos encapsulándolos en nanosistemas, como los liposomas.
El desarrollo de liposomas física y biológicamente estables, compuestos de un polímero hidrófilo, como polietilenglicol, PEG, en su superficie, con un tamaño promedio de 100 nm y que contienen fármacos quimioterapéuticos, tales como doxorrubicina, fue un logro significativo que, presumiblemente, dará un gran impacto en el futuro de la nanotecnología, dentro del campo de la salud humana. El recubrimiento de la superficie de los liposomas con un polímero hidrófilo como PEG, contribuye fuertemente a la formación de una nube hidrófila alrededor de los liposomas (Needham, 1992 n.° 44; Woodle, 1992 n.° 39; Hristova, 1995 n.° 45; Hajitou, 2006 n.° 62). Tras la inyección intravenosa, dicha cubierta hidrófila disminuye drásticamente la tasa y el grado de interacciones electrostáticas e hidrófobas entre la superficie de los liposomas y los componentes sanguíneos que median la eliminación de liposomas de la sangre y/o la disgregación (Lasic, 1991; Needham, 1992; Torchilin, 1994; Woodle, 1992). La capacidad de los liposomas con PEG injertado cargados de fármaco de circular durante mucho tiempo en la sangre, favorece su acumulación en los tumores sólidos (Wu, 1993). Dicha acumulación, así como la de macromoléculas o fármacos poliméricos, se potencia enormemente en el tejido tumoral respecto a los tejidos sanos, un fenómeno conocido como permeabilidad y retención potenciadas, que se observan generalmente en tumores sólidos viables y de crecimiento rápido (Maeda, 2001). Este fenómeno se mantiene mediante una angiogénesis extensiva y drenaje linfático alterado en el intersticio tumoral (Maeda, 2000). Los vasos tumorales poseen un revestimiento celular y regular compuesto de células endoteliales ramificadas o solapantes desorganizadas, conectadas de forma suelta, que contribuyen a la filtración de los vasos tumorales (Carmeliet, 2003; Hashizume, 2000). Como un ejemplo, se demostró previamente que los liposomas con PEG injertado, después del transporte transendotelial a través de huecos entre las células endoteliales, presentaban acumulación extravascular significativa en los tumores (Yuan, 1994). Mejoras adicionales en la toxicidad selectiva de los fármacos antiproliferativos podrían conseguirse acoplando ligandos selectivos para la célula diana a la superficie del liposoma. Se requieren relativamente pocas moléculas de ligando por liposoma (10-20) para suministrar de forma selectiva altas cargas de fármacos en las células diana mediante el mecanismo de internalización mediada por receptor (Allen, 2002). A diferencia de otros sistemas de suministro tales como inmunoconjugados o inmunotoxinas con fármacos, que suministran pocas moléculas de fármacos o toxina (<10) por molécula de anticuerpo (o inmunotoxina), los liposomas dirigidos a ligando pueden explotarse para suministrar miles de moléculas de fármaco usando unas pocas decenas de moléculas de ligandos covalentemente acopladas a la superficie del liposoma (Sapra, 2003). El acoplamiento de un ligando a un soporte debe ser un método simple, rápido, eficaz y reproducible, que produzca enlaces no tóxicos y estables. Además, la reacción de acoplamiento no debe alterar la eficacia de carga del fármaco, las tasas de liberación del fármaco, ni las propiedades biológicas de los ligandos, por ejemplo, el reconocimiento de y la eficacia de unión a la diana (Papahadjopoulos, 1991).
La versatilidad de los liposomas como sistema de suministro permite el control de la ubicación (suministro espacial), así como de la tasa de liberación (suministro temporal) del agente transportador. Los liposomas sensibles a pH constituyen un ejemplo típico donde puede conseguirse tanto el suministro espacial como el suministro temporal. Habitualmente están compuestos de un lípido en forma de cono neutro como dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y un anfífilo débilmente ácido, tal como hemisuccinato de colesterilo (CHEMS), y están diseñados para formar una bicapa lipídica estable a pH neutro o básico, pero para desestabilizarse rápidamente en un endosoma acidificante (Fonseca, 2005). Como los liposomas sensibles a pH pueden facilitar la liberación citosólica de las moléculas impermeables de membrana, podría ser factible combinar su uso con un ligando de dirección que promueva la endocitosis mediada por receptor. Globalmente, el desarrollo de un nanosistema sensible a pH estabilizado estéricamente acoplado covalentemente a un ligando de dirección, que pueda dirigirse a células específicas, como células tumorales y/o células endoteliales existentes en los vasos sanguíneos tumorales, que contenga un fármaco quimioterapéutico, tal como doxorrubicina, puede tener un impacto importante en el índice terapéutico de la carga encapsulada, en el tratamiento de enfermedades como cáncer de mama humano.
El documento WO 03/087124 divulga péptidos HMGN2 y moléculas relacionadas que migran de forma dirigida selectivamente a vasos sanguíneos tumorales y células tumorales.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un sistema de suministro dirigido por ligando como se define en las reivindicaciones adjuntas a la misma. El sistema proporciona un nanosistema con una composición lipídica sensible a pH (o que incorpora un agente de alteración sensible a pH), que encapsula un agente (como un fármaco o un compuesto de diagnóstico) y armado sobre la superficie con un ligando de dirección. Dicho sistema, tras su administración sistémica, por ejemplo, tiene la capacidad de dirigirse a poblaciones celulares específicas como las células tumorales y/o células endoteliales que existen en los vasos sanguíneos tumorales. Tras alcanzar las células diana, el nanosistema puede unirse a las células diana y se internaliza mediante endocitosis mediada por receptor, donde la acidificación del medio activa la desestabilización del nanosistema. Dicha desestabilización da lugar a la liberación a una alta tasa de la carga asociada para permitir la liberación intracelular eficaz y, por tanto, la concentración aumentada de la carga transportada en el sitio diana. Esta tecnología versátil permite el reemplazo de la composición lipídica, de la carga encapsulada y del ligando, dependiendo del propósito (tratamiento o diagnóstico) y/o el tipo de enfermedad.
Globalmente, esta invención proporciona, como beneficio principal, actividad terapéutica o de diagnóstico mejorada mediante la especificidad de acción y la liberación activada de la carga encapsulada (al nivel de la célula o células diana), así como efectos secundarios adversos reducidos. El campo de aplicación para el sistema incluye tratamiento o diagnóstico para cáncer y para otras enfermedades incluyendo, aunque sin limitación, inflamación, enfermedades infecciosas o enfermedades y trastornos oculares.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 - Asociación celular de varias formulaciones de liposomas con células de cáncer de mama humano o células endoteliales microvasculares humanas. Los liposomas no dirigidos marcados con rodamina (SL), marcados con F3 (SLF3) o los liposomas dirigidos con un péptido no específico (SLNS), a 1,2 mM de lípido total/pocillo se incubaron con 106 de (A) líneas celulares de mama tumoral humana (MDA-MB-435S) o (B) endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1), a 4 °C o 37 °C durante 1 h. Los datos se expresan como nmol de lípido total por mg de proteína, y son la media de cuatro experimentos, cada uno hecho por triplicado.
Figura 2 - Asociación celular de varias formulaciones de liposomas con líneas celulares específicas y no específicas. SL o SLF3 marcado con rodamina se incubaron con 106 de líneas celulares específicas (MDA-MB-435S o HMEC-1) o no específicas (MCF-7 o TSA), durante 1 h a 4°C o 37 °C. Los resultados se muestran como el valor medio de triplicados de un experimento representativo.
Figura 3 - Ensayo de inhibición competitiva de la asociación celular de SLF3 con líneas celulares específicas. Se preincubó un millón de (A) células de mama tumoral humana (MDA-MB-435S) o (B) endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) con 50 01 de péptido F3 libre o sin el péptido durante 30 min a 37 °C, seguido de 1 h de incubación son SLF3 marcado con rodamina (a 0,8 mM de TL/pocillo) a 4 °C o 37 °C. Los resultados se muestran como el valor medio de triplicados de un experimento representativo.
Figura 4 - Asociación celular de varias formulaciones de liposomas con células cancerosas de mama humano o células endoteliales microvasculares humanas analizadas por citometría de flujo. Se incubó un millón de (A) células de mama tumoral humana (MDA-MB-435S) o (B) endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) con liposomas SL (verde), SLF3 (rosa) o SLNS (azul) marcados con rodamina o calceína de encapsulación a una concentración de 0,6 mM de TL/pocillo, durante 1 h a 4 °C (línea discontinua) o 37 °C (línea continua). Las células se desprendieron con tampón de disociación, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato pH=7,4 (PBS) e inmediatamente se procesaron en un FACSscan (Becton Dickinson) para detectar la rodamina o calceína asociada a las células. La diferencia entre la asociación celular de los liposomas SLF3 marcados con rodamina a 37 °C y 4 °C se representa mediante una línea púrpura discontinua.
Figura 5 - Efecto de varios inhibidores de endocitosis sobre la asociación celular de SLF3 con (A) células MDA-MB-453S o (B) HMEC-1. Se preincubó un millón de (A) células de mama tumoral humana (MDA-MB-435S) o (B) endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) con medio de sacarosa 0,45 M, genisteína 200 pM y wortmanina 0,03 pM y LY-29400 50 pM durante 30 min a 37 °C, con el fin de inhibir las rutas endocíticas mediadas por clatrina y caveolas y la macropinocitosis, respectivamente. Después de ello las células se incubaron con SLF3 marcado con rodamina (0,2 mM de TL/pocillo durante 1 h) o con el control correspondiente de cada ruta: Alexa-Fluor-Transferrina (0,05 mg/ml durante 30 min), BODIPYS-LactoCer (0,5 mM durante 10 min) o FITC-Dextrano (10 mg/ml durante 1 h) para evaluar la eficacia de la inhibición de las rutas de endocitosis mediadas por clatrina y caveolas y la macropinocitosis, respectivamente. La asociación celular de cada control y SLF3 marcado con rodamina también se realizó a 4 °C sin pretratamiento con inhibidores. Los datos se muestran como las medias /- D.T. basándose en triplicados de al menos dos experimentos independientes.
Figura 6 - Asociación celular de varias formulaciones de liposomas con células cancerosas de mama humana o células endoteliales microvasculares humanas analizadas por microscopia confocal. (A) Se incubaron células de mama tumoral humana (MDA-MB-435S) o (B) endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1) con liposomas (1) SLF3, (2) SL, (3) SLNS no sensibles al pH o con liposomas (4) SLF3, (6) SL, (6) SLNS sensibles al pH marcados con rodamina y calceína de encapsulación a una concentración de 0,6 mM de TL/pocillo durante 1 h a 37 °C (fila superior) o 4 °C (fila inferior). Las células se lavaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se montaron en medio de montaje de Movioll (Calbiochem) y se visualizaron con un microscopio confocal de barrido de láser LSM-510 (Carl Zeiss LSM510 Meta, Zeiss). Todos los parámetros instrumentales que pertenecen a la detección de fluorescencia y los análisis de imágenes se mantuvieron constantes para permitir la comparación de muestras.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un nanosistema que combina una capacidad de dirección a subconjuntos celulares específicos (como células tumorales y/o células vasculares), conseguido mediante acoplamiento de un ligando de dirección de internalización en una superficie del nanosistema, y liberación intracelular activada (tras la activación mediante acidificación del medio) de la carga encapsulada a una alta tasa.
Como se muestra en este documento, el término "carga" o "agente" significa la parte de un total más grande que es distinto del empaquetado requerido para transportarlo.
El término "ligando" indica la molécula unida a un soporte que puede dirigir específicamente un sistema a una diana. El ligando diana de la invención es KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK (SEQ ID NO: 1) (F3), que se une a nucleolina (Hajitou, 2006)). El término "péptido" se usa ampliamente para indicar péptidos, fragmentos de proteínas y similares, mientras que "peptidomimético" se usa para indicar una molécula de tipo péptido que tiene la actividad de unión del péptido de migración dirigida, incluyendo compuestos que contienen modificaciones químicas, aminoácidos de origen no natural, peptoide y similares.
El ligando es susceptible de identificarse basándose en su capacidad de migrar de forma dirigida a un órgano específico, como un tumor, pero no al tejido no diana correspondiente.
Las expresiones "migrar de forma dirigida", "migrar de forma dirigida selectivamente" o "unión específica" significan que el sistema dirigido interactúa con el órgano diana, de una manera específica de ligando y/o de célula, después de administrarse al sujeto.
Como se usa en este documento, el término "tumor" incluye células del parénquima tumoral, estroma de mantenimiento y vasos sanguíneos angiogénicos que infiltran la masa de células tumorales. Los términos "normal" o "no tumoral" se usan para hacer referencia a un tejido que no es un "tumor".
"Sistema" o "conjugado" se refiere a la combinación de entidades interdependientes, en este documento presentadas como el agente, soporte y ligando, para formar un total integrado con la capacidad de interactuar con un órgano o célula diana.
El material físico, químico o biológico unido a una molécula de migración dirigida se denomina "soporte" y encierra un agente a dirigir a una célula específica. En la invención, el soporte es un liposoma sensible al pH. Preferiblemente, el vehículo de suministro que actúa como soporte es un liposoma compuesto de, aunque sin limitación, fosfatidilcolina de soja completamente hidrogenada, fosfatidiletanolamina de metoxi-polietilenglicol, fosfatidiletanolamina de maleimida-polietilenglicol, N-metilpalmitoiloleoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, palmitoiloleoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, difitanoilfosfatidilcolina, esfinomielina, fosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterilo, colesterol o una combinación de los mismos. El soporte no debe ser tóxico para la expresión normal de las moléculas de superficie celular y para la fisiología normal del sujeto y no debe ocluir la circulación. Si el sujeto usado para el estudio no tiene que sacrificarse para recoger un tejido tumoral o normal, el soporte también debe ser biodegradable.
El término "molécula" se usa en este documento para indicar un agente químico orgánico polimérico o no polimérico, un ácido nucleico o un oligonucleótido, un péptido, un péptido o un peptidomimético o una proteína, anticuerpo, fragmento de crecimiento o un fragmento del mismo que presenta conformación lineal o cíclica, o un compuesto de origen no natural.
La invención proporciona un sistema compuesto del soporte que encierra un agente, unido al ligando, que posibilita la dirección selectiva y específica hacia moléculas sobreexpresadas en la célula diana, para diagnosticar, tratar o corregir una enfermedad y/o un trastorno.
El ligando de la invención se une a la superficie del soporte de una manera que la secuencia específica puede interactuar con la molécula diana sobreexpresada sobre la superficie de una célula específica. Un espaciador apropiado, con o sin un grupo reactivo, puede ubicarse entre el ligando y el soporte, de tal manera que no se impida la interacción mencionada. La conjugación de PEG al péptido requiere un grupo funcional adecuado en el extremo del PEG y el extremo N del péptido. Cuando una amina (-péptido-NH-PEG) es el grupo funcional de unión, un PEG con un grupo final funcionalizado por un haluro (por ejemplo, CI, -Br y -I) o un sulfonato (por ejemplo, -OSO2-C6H4-CH3,-OSO2-CH2CF3) puede usarse para acoplar con el grupo amino en el extremo N. Cuando un uretano (péptido-NHC(O)O-PEG) es el grupo funcional de unión, un PEG con un grupo final funcionalizado por un carbonato activo (por ejemplo, -C(O)-Im, -OC(O)-pNP, -OC(O)-NHS, -OC(O)-TCP) puede usarse para acoplar con el grupo amino en el extremo N. Cuando una amida (péptido- NHC(O)-PEG) es el grupo funcional de unión; un PEG con el grupo final funcionalizado por el grupo carboxilo activado (por ejemplo, el grupo carboxilo activado por DCC/HOBt, DCC/dimetilaminopiridina (DMAP), DIPCDI/HOBt y EDC/n Hs ) puede usarse para acoplar con el grupo amino en el extremo N. Cuando un tioéster (péptido-C(O)CH2SC(O)-PEG) es el grupo funcional de unión, un PEG con el grupo final funcionalizado por el tioácido (-PEG-C(O)S) puede usarse para acoplar con el extremo N modificado en bromoacetilo (péptido- C(O)CH2Br). Cuando un tioéter (péptido-C(O)CH2SCH2-PEG) es el grupo funcional de unión, un PEG con el grupo final funcionalizado por el grupo tiol (-PEG-CH2SH) puede usarse para acoplar con el extremo N modificado en bromoacetilo (péptido- C(O)CH2Br). Cuando el tioéter de un conjugado de maleimida/tio es el grupo funcional de unión, un PEG con el grupo final funcionalizado por un grupo tiol (C(O)-PEG-C(O)CH2CH2SH) puede usarse para acoplar con el extremo N modificado en el grupo maleimida (maleimida--CH2CH2C(O)-péptido) (Zalipsky, 1995).
Las aminas primarias, presentes en el extremo N de una biomolécula, pueden modificarse con la introducción de grupos SH. En una realización preferida de la presente invención, esta modificación puede conseguirse usando reactivo de Traut (clorhidrato de 2-iminotiolano). Los grupos tiol pueden reaccionar directamente con la maleimida presente en la superficie del soporte, que da lugar a un enlace tioéter estable. En estas circunstancias, la inmovilización de un péptido tiolado crea un espaciador de cinco átomos de longitud (maleimida-S-CH2CH2C(O)NH-péptido).
El grupo reactivo presente en el espaciador no solamente puede ser un medio eficaz de unir el ligando al soporte, sino que también puede contener una marca para facilitar la recuperación o identificación del sistema. La identificación del ligando o el soporte unido al ligando con un marcador conocido permite recoger las células in vitro o los órganos o tejidos in vivo, recuperar las moléculas y compararlas con la población celular del órgano o tejido de control. La expresión "célula, órgano o tejido de control" significa una células, órgano o tejido diferente aquel para el que se desea la identificación de la molécula de migración dirigida.
El conjugado puede ser multivalente, que presente más de un ligando de migración dirigida que migra de forma dirigida selectivamente a la molécula o moléculas indicadas en las células diana. El conjugado puede dirigirse a la célula diana mediante un ligando externo unido covalentemente a su superficie directamente o mediante un grupo reactivo insertado en el soporte. La molécula de migración dirigida de la invención puede unirse a otros soportes además de los liposomas, tal como un sistema de suministro físico, químico o biológico o una célula, tras la administración. Además, de acuerdo con el método de la invención, una diversidad de agentes terapéuticos puede dirigirse a los vasos sanguíneos tumorales y las células tumorales en un sujeto.
La doxorrubicina (DXR) es un agente quimioterapéutico ampliamente usado en tratamiento contra el cáncer con propiedades antiangiogénicas (Devy, 2004). Otros agentes quimioterapéuticos usados satisfactoriamente incluyen fármacos alquilantes, tales como ciclofosfamida, clorambucilo, melfalán, busulfán, lomustina, carmustina, clormetina (mustina), estramustina, treosulfán, tiotepa, mitobronitol; antibióticos citotóxicos, tales como doxorrubicina, epirrubicina, aclarrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona (mitozantrona), bleomicina, dactinomicina y mitomicina; antimetabolitos, tales como metotrexato, capecitabina, citarabina, fludarabina, cladribina, gemcitabina, fluorouracilo, raltitrexed (tomudex), mercaptopurina, tegafur y tioguanina; alcaloides de la vinca, tales como vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina y etopósido; otros fármacos neoplásicos, tales como amsacrina, altetarmina, crisantaspase, dacarbacina y temozolomida, hidroxicarbamida (hidroxiurea), pentostatina, compuestos de platino incluyendo: carboplatino, cisplatino y oxaliplatino, porfímero de sódico, procarbacina, razoxano; taxanos incluyendo: docetaxel y paclitaxel; inhibidores de topoisomerasa I, incluyendo inotecán y topotecán, trastuzumab y tretinoína; SN-38, ET-743, TLK 286; agentes antiinflamatorios: ibuprofeno, aceclofenaco, acemetacina, azapropazona, celecoxib, dexcetoprofeno, diclofenaco de sodio, diflunisal, cetodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flubiprofeno, indometacina, acetaminocina, piroxicam, rofecoxib, sulindaco, tenoxicam, ácido tiaprofenuico, aspirina y benorilato; agentes antiangiogénicos o agentes angiolíticos tales como, aunque sin limitación: angiostatina (fragmento de plasminógeno), antitrombina III antiangiogénica, Angiozyme, a BT-627, Bay 12-9566, Benefin, bevacizumab, BMS-275291, inhibidor derivado de cartílago (CDI), CAI, fragmento del complemento CD59, CEP-7055, Col 3, combretastatina A-4, endostatina (fragmento de colágeno XVIII), fragmento de fibronectina, Gro-beta, halofuginona, heparinasas, fragmento de hexasacárido de heparina, HMV833, gonadotropina coriónica humana (hCG), IM-862, interferón-alfa/beta/gamma, proteína inducible por interferón (IP-10), interleucina-12, Kringle 5. (fragmento de plasminógeno), marimastat, inhibidores de metaloproteinasa (TIMP), 2-metoxiestradiol, MMI 270 (CGS 27023A), MoAbIMC-1C11, Neovastat, NM-3, Panzem, PI-88, inhibidor de ribonucleasa placentaria, inhibidor del activador de plasminógeno, factor-4 plaquetario (PF4), prinomastat, fragmento de prolactina de 16 kDa, proteína relacionada con proliferina (PRP), PTK 787/ZK 222594, retinoides, Solimastat, escualamina, SS 3304, SU 5416, SU6668, SU11248, tetrahidrocortisol-S, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina-1 (TSP-1), TNP-470, factor de crecimiento transformante beta (TGF-b), vasculostatina, vasostatina (fragmento de calreticuina), ZD6126, ZD 6474, inhibidores de la fasnesiltransferasa (FTI), bifosfonatos. Las porfirinas también se usan ampliamente en tratamiento del cáncer, así como en el tratamiento de enfermedades y trastornos oculares, dentro del tratamiento fotodinámico. Por tanto, el fármaco dirigido puede ser un agente citotóxico, antineoplásico, antiinflamatorio, antiangiogénico, angiolítico, de alteración vascular o un agente para el tratamiento fotodinámico. El fármaco o una combinación de dos o más fármacos puede encapsularse, atraparse, intercalarse dentro del núcleo o asociarse con el vehículo de suministro.
El conjugado debe tener un diámetro comprendido entre 100 y 200 nm para conseguir mejor el propósito final de encontrar la célula diana a través de la circulación pasando de forma relativamente no impedida a través de los lechos capilares sin ocluir la circulación (Drummond, 1999). El sistema se administra al sujeto, que puede ser un vertebrado tal como un mamífero, particularmente un ser humano y pasa a través del tumor y su vasculatura donde interactúa específicamente con las células diana.
La selectividad de dirección depende de la sobreexpresión de un receptor de superficie celular en únicamente uno o unos pocos tipos de células. Los controles pueden ser un péptido similar que carece de la secuencia de unión o una línea celular diferente que no sobreexpresa el receptor para el ligando diana presentado en el ejemplo II.
Un conjugado para unirse selectivamente a la célula diana debe superar obstáculos tales como distancias de difusión largas, adherencia de células ocluyentes, un estroma fibroso denso y los altos gradientes de presión intersticial hacia el interior de la masa tumoral (McDonald, 2002). Estas son las razones por las que la dirección vascular también surge como una opción agradable, ya que las células endoteliales son fácilmente accesibles para un conjugado en circulación. Además, los vasos angiogénicos presentan diferentes características a diferentes niveles, tales como paredes estructuralmente irregulares, flujo sanguíneo típicamente pobre y anómalo y filtración (Carmeliet, 2003; Pasqualini, 2002). Globalmente, estas características pueden facilitar, por un lado, la metastatización del tumor y, por otro lado, que el agente terapéutico alcance el tumor. Afectando a la capacidad de una red vascular tumoral de organizarse, se esperan beneficios adicionales, por ejemplo, y en el caso de tratamiento antineoplásico, en el tumor primario y también en metástasis. Además, los receptores celulares expresan una naturaleza conservativa, que significa que el tumor y las células vasculares, concretamente las células endoteliales, pueden compartir los mismos marcadores superficiales. Por tanto, una molécula de migración dirigida al tumor que se une a una molécula diana en la vasculatura tumoral de un ratón también puede unirse a la molécula diana correspondiente en la vasculatura tumoral de un ser humano u otro mamífero. De hecho, la misma molécula diana puede estar compartida por diferentes tumores (Folkman, 1997). Sin embargo, con el propósito final de administrar un conjugado terapéutico a un sujeto, tal como un mamífero, se deben poseer propiedades aceptables farmacéuticas de acuerdo con la vía de administración y la ubicación de la diana. Varios sistemas, como los liposomas, son no tóxicos, biocompatibles, se preparan y administran fácilmente, que son características ventajosas para administración parenteral en una cantidad eficaz para permitir el efecto terapéutico, de diagnóstico o de detección. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad necesaria para producir la acción deseada.
El conjugado puede incorporar un agente quimioterapéutico citotóxico, un agente de diagnóstico, un agente de detección o un agente terapéutico génico. El contenido del conjugado puede incorporarse o encapsularse de una manera pasiva o activa y el mecanismo de suministro puede controlarse manipulando la composición del sistema. El microentorno tumoral muestra características únicas que pueden se ventajosas para promover la alteración del sistema y la liberación de su contenido. La mala organización vascular y el drenaje linfático alterado dan lugar a la acumulación de productos de metabolismo celular, tal como ácido láctico y carbónico, que reduce el valor de pH del medio extracelular (Gatenby, 2004). Lo mismo sucede en la ruta endosómica, donde la alteración y liberación del contenido del conjugado tiene lugar en endosomas tempranos y tardíos (Simoes, 2004).
Los liposomas pueden estar compuestos de anfífilos débilmente ácidos y lípidos en forma de cono neutros para permitir el control sobre la alteración de la membrana lipídica. A pH fisiológico, se forman liposomas estables, pero la acidificación activa la protonación de los grupos carboxílicos de los anfífilos, tales como c He MS (Straubinger, 1993), reduciendo su efecto estabilizante y, por tanto, dando lugar a desestabilización liposómica, ya que en estas condiciones las moléculas con forma de cono como fosfatidiletanolamina (PE) revierten a su fase hexagonal invertida. La elección de los estabilizantes anfífilos, así como su porcentaje molar con respecto al contenido de PE viene impuesto por las propiedades deseadas de los liposomas, incluyendo el grado de internalización celular, la capacidad fusogénica, la sensibilidad al pH y la estabilidad en líquidos biológicos (Drummond, 2000).
Una tasa más rápida de liberación de fármaco desde endosomas o liposomas da lugar a un suministro más rápido del fármaco a su sitio intracelular de acción, provocando una eficacia terapéutica mejorada (Ishida, 2006).
En el ejemplo ilustrado en este documento, el receptor que se une específicamente al ligando ensayado se ha identificado como nucleolina (Christian, 2003).
La nucleolina es una fosfoproteína nucleolar que no es una histona, ubicua de células eucariotas en crecimiento exponencial. Se describe como con una función en el control de la organización de la cromatina nucleolar, empaquetado del pre-ARN, transcripción de ADNr y ensamblaje del ribosoma. Por lo tanto, está implicada en la proliferación y crecimiento, citocinesis, replicación, embriogénesis y nucleogénesis. La proteína aparece en células antes de que empiece la transcripción y la síntesis en el ribosoma (Srivastava, 1999).
El péptido nucleolina consiste en un dominio en el extremo NH2 cargado negativamente, un dominio de unión a ARN y un dominio en el extremo COOH rico en motivos RGG. La primera región tiene una función de grupo de alta movilidad análogo. La fosforilación de este dominio potencia la degradación de la nucleolina por proteasas, que compromete su estabilidad, pero es crucial para la transcripción del ADNr. El dominio globular central está implicado en el reconocimiento del pre-ARN, la condensación y el empaquetado en el nucleolo. El dominio en el extremo carboxilo controla la interacción de la nucleolina con proteínas ribosómicas, permitiendo el acceso de los ARN a los motivos de unión a ARN ubicados en la región central de la nucleolina. Tanto el extremo amino como el extremo carboxilo pueden estar regulados por proteólisis. La nucleolina escindida activa las endonucleasas autolíticas, que fragmentan el ADN causando apoptosis. En células en proliferación, la expresión de un inhibidor de proteolítico evita la autodegradación de la nucleolina. Por lo tanto, los niveles de esta proteína están elevados en tumor y otras células de división rápida (Srivastava, 1999).
Una molécula de migración dirigida para nucleolina puede ser un anticuerpo antinucleolina o un péptido derivado de proteolina de grupo alta movilidad (HMGN-2), tal como el fragmento de 31 aminoácidos que corresponde a la secuencia KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK (SEQ ID NO: 1) (F3), identificada por colecciones de presentación en fagos (Porkka, 2002). F3 se une al dominio en el extremo NH2 de la nucleolina y puede acumularse preferentemente en la vasculatura angiogénica de tumores, en comparación con vasos no tumorales. Como la nucleolina está presente en la superficie celular en una forma fosforilada y en la membrana del núcleo, el péptido puede internalizarse mediante sus células diana específicas y transportarse al núcleo. Se reconoce que el péptido F3 mostrado en este documento es útil para la migración dirigida a células tumorales y endoteliales (Porkka, 2002) y que puede adherirse a un soporte para formar un conjugado que puede transportar una carga tal como un agente quimioterapéutico, un agente de diagnóstico o un agente de imágenes dirigido a células implicadas en el crecimiento tumoral.
Como se muestra en el ejemplo 1, para la encapsulación activa del sistema basado en lípidos acoplado covalentemente con el péptido F3, la mezcla de lípidos que forman liposomas se seca para formar una película delgada y se hidrata con un medio acuoso que contiene las especies de soluto que formarán la fase acuosa en el interior de la vesícula. Después de ello, esas especies se retiran y se añade el fármaco al exterior del liposoma para una carga remota. Pueden aplicarse métodos tales como cromatografía de exclusión molecular, diálisis o centrifugación para retirar el fármaco no encapsulado. En otra realización, puede incluirse un agente de retención en el interior del liposoma para formar complejos con el agente de encapsulación y dar lugar a su retención.
El uso de lípidos con altas temperaturas de transición (diestearoilfosfatidilcolina (DSPC); fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)) y la incorporación de colesterol (CHOL) y conjugados lipídicos tales como diestearoilfosfatidiletanolamina con polietilenglicol (DSPE-PEG), da lugar a una disminución significativa de filtración de los fármacos encapsulados durante la circulación en la sangre o en el medio extracelular. Además, dichos lípidos también reducen las interacciones no específicas entre los liposomas y las proteínas del suero (opsoninas), evitando de ese modo la eliminación del liposoma por las células del sistema reticuloendotelial (RES), aumentando el tiempo em circulación para optimizar la interacción del sistema con las células diana (Allen, 1987; Gabizon, 1992).
El tamaño de los liposomas puede manipularse forzando el pase de las vesículas a través de membranas con tamaño de poro apropiado en una extrusora. Se aconseja que los liposomas tengan un tamaño suficientemente pequeño para permitir su pase a través de capilares y para extravasar desde el compartimento vascular si tienen que abordarse las células tumorales (Yuan, 1994).
El péptido F3 se acopla a la superficie del liposoma mediante un enlace imidoéster entre el grupo tiol del péptido derivatizado y el grupo maleimida en la superficie del soporte. La conjugación de un péptido a un soporte puede afectar potencialmente a la capacidad de migración dirigida del sistema. Como se muestra en este documento, la especificidad del péptido y su capacidad de migración dirigida al receptor diana no se ven afectadas (ejemplos II y III). Es importante enfatizar que la encapsulación de un agente también es susceptible a comprometer su acción deseada. En el presente caso, se demuestra que el agente encapsulado mantiene sus características y acción características (ejemplos II y III).
Se realizaron estudios de internalización celular mediante la comparación de células incubadas con conjugados dirigidos o no dirigidos a temperaturas permisivas (37 °C) y no permisivas (4 °C) para la internalización. Los resultados confirman la importancia del ligando en el reconocimiento del sistema por las células diana. Además, otras líneas celulares, tales como MCF-7 y TSA no muestran diferencia entre los niveles de internalización del conjugado dirigido y no dirigido, lo que indica que el sistema puede migrar de forma dirigida a un tumor específico y células endoteliales vasculares tumorales. La especificidad del ligando de dirección se confirma mediante un ensayo de unión competitiva (ejemplo II).
Los mecanismos por los que un sistema entra en una célula son distintos y habitualmente se dividen en dos categorías amplias: fagocitosis, un proceso restringido a células de mamífero especializadas, y pinocitosis, que se produce en todas las células de mamíferos y comprende macropinocitosis, endocitosis mediada por clatrina, endocitosis mediada por caveolas, así como otras rutas endocíticas menos caracterizadas independientes de clatrina y caveolas (Conner, 2003).
Como se muestra en el ejemplo III, la internalización en las células es muy dependiente de la energía y la ruta endocítica mediada por clatrina parece ser el portal más probable de energía del conjugado a las células tumorales y endoteliales de vasos sanguíneos angiogénicos.
Las observaciones de microscopia confocal corroboran los resultados de los estudios de internalización (ejemplo II). Los controles no dirigidos no muestran tinción para el marcador lipídico en oposición a las muestras dirigidas por F3. Las células incubadas con liposomas sensibles a pH dirigidos por ligando muestran una tinción intracelular verde más evidente que los liposomas no sensibles a pH dirigidos. Dichos resultados indican que pueden esperarse beneficios terapéuticos con una formulación dirigida que pueda promover la liberación activada intracelular de un agente encapsulado tanto a células tumorales como endoteliales en un sujeto.
La actividad antitumoral y antiangiogénica de la doxorrubicina puede ser un buen modelo para demostrar el potencial de la plataforma tecnológica inventada. Como un ejemplo, se encapsularon doxorrubicina en un nanosistema basado en lípidos, se acopla covalentemente a un péptido y se incuba con células de cáncer de mama y endoteliales en diferentes intervalos de concentración de fármaco durante tiempos predeterminados (ejemplo IV).
Los resultados demuestran que la actividad citotóxica del fármaco suministrado por el sistema dirigido de la invención está aumentada contra células que sobreexpresan nucleolina en comparación con células que no sobreexpresan nucleolina. La incubación de las células con un sistema compuesto de un agente terapéutico y una molécula de migración dirigida diana es más eficaz a la hora de provocar la muerte celular que la incubación con el sistema sin el ligando específico. La citotoxicidad de los conjugados de lípido dirigidos a péptido que contiene doxorrubicina contra MDA-MB-435S (células de carcinoma ductal de mama) y HMEC-1 (células epiteliales mamarias humanas) se comparó in vitro con doxorrubicina libre, conjugados no dirigidos que contienen doxorrubicina o conjugados dirigidos mediante un péptido no específico. Los resultados demuestran que la acumulación selectiva del conjugado aumenta la toxicidad del agente, reduciendo la dosificación necesaria para inducir un 50 % de muerte celular.
La composición única del sistema permite la interacción específica con células diana junto con el suministro intracelular programado de la carga, provocando una mayor eficacia de acción del agente transportador. Estas características se congregan por primera vez en la misma plataforma tecnológica, lo que la diferencia de las presentadas en la bibliografía.
Los documentos WO 2005/094383, WO 2000/023570, WO 2007/039783, WO 2003/084508, WO 2001/085093 y WO 1998/016201 se refieren a nanovesículas basadas en lípidos con la capacidad de promover la liberación activada tras un estimula adecuado. No obstante, el sistema descrito en este documento es único en término de su composición lipídica y especificidad de dirección, mecanismo de liberación de la carga y tiene la ventaja adicional de mostrar propiedades adecuadas para administración intravenosa tales como: tiempos prolongados de circulación en sangre debido a interacciones no específicas reducidas con proteínas del suero (opsoninas), evitando de ese modo la eliminación del liposoma por las células del sistema reticuloendotelial (RES); un diámetro suficientemente pequeño para evitar émbolos o apoplejía, tras su administración y para facilitar la extravasación desde vasos sanguíneos a la masa tumoral.
El documento WO 2003/087124, aunque menciona el ligando F3 para ejemplificar el nanosistema dirigido de este documento, no incluye nanovesículas basadas en lípido con la capacidad de promover la liberación activada intracelular de la carga asociada.
El documento WO 2007/100904 se refiere al péptido F3 como un ligando específico putativo de un conjugado de fármaco de L-metionasa que no tiene la capacidad de internalizarse por las células endoteliales de la vasculatura tumoral y no es un sistema basado en lípidos.
El documento WO 2005/019429 se refiere a dos niveles diferentes de dirección celular: células tumorales y endoteliales. Sin embargo, el propósito de esta invención (potenciar la fagocitosis o la actividad fagocítica) es bastante diferente del descrito en este documento (potenciar la endocitosis mediada por receptor para diagnosticar, tratar o corregir una enfermedad o un trastorno).
La presente invención según se reivindica satisface la necesidad de un suministro con selectividad y programado de una carga a poblaciones celulares específicas dentro de un órgano diana, como, por ejemplo, células tumorales y/o vasculares (células endoteliales, células parietales) de vasos sanguíneos angiogénicos tumorales, inhibiendo, en el caso de un tumor, su crecimiento, desarrollo y metastatización.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la presente invención.
Ejemplo I
Preparación y caracterización de diferentes nanosistemas basados en lípidos
Este ejemplo proporciona métodos para encapsular una carga tal como un agente quimioterapéutico en un nanosistema basado lípidos y para acoplar una molécula de migración dirigida tal como un péptido a su superficie. Los liposomas no sensibles al pH estaban compuestos de fosfatidilcolina de soja completamente hidrogenada, colesterol, metoxi(polietilenglicol) de diestearoilfosfatidiletanolamina (2000); maleimida(polietilenglicol) de diestearoilfosfatidiletanolamina (2:1:0,06:0,04, relación molar). La capa lipídica se hidrató a 65 °C en solución de sulfato de amonio 250 nM, pH 5,5.
La formulación sensible al pH estaba compuesta de dioleoilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterilo, fosfatidilcolina de soja completamente hidrogenada; colesterol y metoxi(polietilenglicol) de diestearoilfosfatidiletanolamina (2000); maleimida(polietilenglicol) de diestearoilfosfatidiletanolamina (4:2:2:2:018:0,12, relación molar). La película lipídica se hidrató a 65 °C en solución de sulfato de amonio 250 mM, pH 8,5.
Ambas formulaciones se extruyeron secuencialmente a través de membranas de policarbonato de 0,2 y 0,1 pm de tamaño de poro a 65 °C usando una miniextrusora LipoFast (Lipofast, Avestin) para obtener una distribución uniforme de tamaños (Daleke, 1990). El tampón se intercambió en una columna Sephadex 0-50 equilibrada con NaCH3COOH 100 mM/ NaCI 70 mM pH 5,5 para la formulación no sensible al pH y con Trizmabase 25 mM/sacarosa al 10% pH 9 para la formulación sensible al pH. Después se incubó doxorrubicina con los liposomas durante 1 h a 65 °C en ausencia de luz y se encapsuló mediante el método de gradiente de sulfato de amonio (Bolotin EM, 1994). La doxorrubicina libre se retiró procesando los liposomas a través de una columna Sephadex G-50 equilibrada con ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM/tampón de NaCl 140 mM pH 7,4 (HBS) (para liposomas no dirigidos), h EpES 25 mM/MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) 25 mM/NaCl 140 mM pH 6,5 (para liposomas no sensibles al pH dirigidos) o HEPES 25 mM/MES 25 mM/NaCl 140 mM pH 7,2 (para liposomas sensibles al pH dirigidos). Para preparar adicionalmente liposomas dirigidos, el derivado tiolado del péptido F3 (Genosphere Biotechnologies) se obtuvo por reacción del péptido con clorhidrato de 2-mercaptopropionimidato (también conocido como 2-iminotiolano), a una relación molar 1:5 en HEPES 25 mM/tampón de NaCl 140 mM (pH=8), durante 1 h a temperatura ambiente. Los liposomas después se incubaron durante una noche a temperatura ambiente con el péptido activado a una relación molar de maleimida/péptido activado de 1:2. La activación y acoplamiento del péptido F3 tuvo lugar en una atmósfera de N2 inerte en material de vidrio siliconado (Sigmacote, Sigma). Los grupos maleimida libres se inactivaron mediante incubación con un exceso de 2-mercaptoetamol durante 30 min a temperatura ambiente. El péptido no acoplado se separó en una columna Sepharose CL-4B equilibrada con HBS pH 7,4.
Las concentraciones finales de lípidos se determinaron basándose en el ensayo de fosfora lipídico de Fiske y Subarrow (Bartlett, 1959). La doxorrubicina encapsulada se cuantificó midiendo la absorbancia de UV a 492 nm. Se consiguió una concentración final de 120-180 119 de doxorrubicina por ilmol de fosfolípido (eficacia de carga de un 95 %). La eficacia de carga se determinó usando la fórmula [(concentración final de DXR/concentración final de lípidos totales)/(concentración inicial de DXR/concentración inicial de lípidos totales)] x 100. El tamaño de los liposomas varió entre 100-150 nm, medido por dispersión dinámica de láser con un analizador de tamaños de partícula submicrométricos Coulter.
Ejemplo II
Estudios de asociación celular
Cultivo celular
Se cultivaron células MDA-MB-435S y HMEC-1 en RMPI 1640 Sigma complementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10 % (v/v) (Invitrogen), 100 U/ml de penicilina, 1001,19/ml de estreptomicina (Sigma) (medio completo) y se mantuvieron dentro de su fase de crecimiento exponencial a 37 °C en una incubadora humidificada (humedad de un 90 %) que contenía CO2 al 5 %. El medio de las células HMEC-1 también se complementó con 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) de ratón y 1 pg/ml de hidrocortisona (Sigma). MCF-7 (ATCC) y TSA (ATCC) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma), complementado como se describe anteriormente (medio completo).
Estudios de asociación celular
Se realizaron estudios de asociación celular por fluorimetría, citometría de flujo y microscopia confocal.
Se incubaron liposomas marcados con rodamina (dirigidos, dirigidos mediante un péptido no específico (NS) -ARALPSQRSR (SEQ ID NO: 2) (Porkka, 2002) - o no dirigido), con un millón de células tumorales (m Da -MB-435s ) o endoteliales (HMEC-1) a 4 o 37 °C y dentro de un intervalo de concentración de lípidos de 0,1-1,2 mM de lípidos totales/pocillo.
Para evaluar la asociación celular por fluorimetría, las células se lisaron y se midió la fluorescencia de rodamina en el sobrenadante de un fluorímetro de lector de placa SpectraMax Gemini EM (Molecular Devices). La proteína celular se determinó por el kit de ensayo de proteína BCATP4 (Pierce). Los resultados se expresaron como nmol de lípidos totales/mg de proteína.
Para determinar la asociación celular y el suministro de la carga por citometría de flujo, las células se incubaron con liposomas marcados con rodamina o cargados con calceína a 37 o 4 °C, durante 1 h, se desprendieron con tampón de disociación, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato pH=7,4 (PBS) e inmediatamente se procesaron en un FACSscan (Becton Dickinson) para detectar la rodamina (FL2-H) y la calceína (FL1-H) asociadas a las células. Se recogió un total de 40000 eventos y los archivos se analizaron con el programa informático Cell Quest Pro.
A 37 °C, la extensión y la tasa de asociación celular y suministro de la carga observadas para liposomas dirigidos por péptido fueron mayores que las observada para liposomas no dirigidos o liposomas dirigidos mediante un péptido no específico, lo que señala que la interacción de los primeros con las células diana era específica de péptido (figura 1). La asociación celular mejorada reveló un aumento con el aumento de la concentración lipídica (datos no mostrados). El aumento sustancial en los niveles de asociación para liposomas dirigidos por péptido según se elevaba la temperatura desde temperaturas no permisivas (4 °C) hasta temperatura permisiva (37 °C) para la endocitosis, sugirió que se estaban internalizando (figura 1). Los liposomas dirigidos y no dirigidos presentaban extensiones similares de captación celular cuando se incubaban con líneas celulares no específicas como las células TSA y MCF-7, lo que revela que la interacción de los liposomas dirigidos por F3 era específica de célula (figura 2).
Evidencias adicionales para apoyar la endocitosis de los liposomas dirigidos provienen de la fluorescencia intracelular observada en experimentos confocales realizados a 37 °C en oposición a lo que sucedía a 4 °C, donde se observaba poca o ninguna tinción.
Los liposomas se marcan doblemente con rodamina (marcador rojo de la membrana lipídica) y calceína (marcador verde del núcleo acuoso). Se sembraron células MDA-MB-435S o HMEC-1 en cubreobjetos de vidrio en placas de fondo plano de 12 pocillos a una densidad de 2x105 células por pocillo. Después de completarse la adhesión, las células se incubaron a 4 °C o 37 °C con los liposomas marcados de forma fluorescente durante 1 h y se lavaron tres veces con PBS, seguido de fijación con paraformaldehído al 4 % en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células se montaron en medio de montaje Moviol® (Calbiochem) y se visualizaron con un microscopio confocal de barrido láser LSM-510 (Carl Zeiss LSM510 Meta, Zeiss), usando un láser de excitación de 488 nm y 561 nm y un objetivo de inmersión en aceite 63x/1,40. Las células se seccionaron ópticamente y se adquirieron imágenes (512x512 píxeles) usando el programa informático LSM-510. Todos los parámetros instrumentales que pertenecen a la detección de la fluorescencia en los análisis de imágenes se mantuvieron constantes para permitir la comparación de muestras.
Los resultados de la microscopia confocal sobre la captación intracelular de liposomas dirigidos por F3 demuestran que después de 1 h de incubación, los liposomas marcados con rodamina (rojos), fueran sensibles al pH o no sensibles al pH, estaban ubicados dentro de las células diana. Por el contrario, después de la incubación con liposomas no dirigidos, no se observaba fluorescencia roja dentro o fuera de las células. Las células incubadas con el péptido no específico para la molécula diana sobreexpresada en la superficie celular mostraban únicamente una leve fluorescencia roja. Estos hallazgos corroboran los diferentes niveles de contenido de rodamina celular cuantificado por fluorimetría y citometría de flujo tanto en células tumorales como endoteliales microvasculares incubadas con las diferentes formulaciones. Además, se observa una tinción verde intracelular difusa tras la incubación con liposomas dirigidos sensibles al pH cargados a 37 °C, en oposición a la tinción puntead observada con la formulación no sensible al pH dirigida, que confirma una liberación intracelular mejorada de la carga liposómica cuando se suministra mediante la primera formulación.
Inhibición competitiva
Las células se sembraron en una placa de fondo plano de 48 pocillos a una densidad de un millón de células por pocillo. Después de la adherencia, las células se preincubaron 30 min con péptido F3 libre a una concentración no tóxica de 50 IAM a 4 o 37 °C. Los controles se incubaron con medio de cultivo. Después de ello, se añadieron liposomas marcados con rodamina con PEG injertado dirigidos por F3 y se incubaron adicionalmente durante 1 h a las temperaturas mencionadas. La asociación celular se evaluó por fluorimetría como se describe previamente. La migración dirigida de los liposomas con PEG injertado dirigido por F3 a las células de cáncer de mama se inhibe cuando el péptido F3 sintético se preincuba con las células diana (figura 3), lo que sugiere, de acuerdo con los resultados de fluorimetría, citometría de flujo y experimentos confocales, que el sistema se está internalizando por la endocitosis mediada por receptor.
Ejemplo III
Mecanismos de captación celular
La macropinocitosis, una forma distinta de endocitosis depende de un gradiente de sodio y puede bloquearse por amilorida y N-etil-N-isopropilamilorida (EIPA), inhibidores del intercambiador de Na+/H+. También depende del reordenamiento de microfilamentos de F-actina y de la fosfoinosítido 3-cinasa (PI3), una enzima clave en la señalización posterior de la macropinocitosis. La inhibición de la elongación de F-actina por la citocalasina B y de PI3 por wortmanina y LY-294002 bloquea la macropinocitosis de forma eficaz (Rejman, 2005). El dextrano marcado con FITC (FITC-Dextrano, Sigma), usado como control para esta ruta, se incubó con células para evaluar la eficacia de la inhibición por wortmanina y LY-294002.
Se sembraron células MDA-MB-435S y HMEC-1 en placas de 48 pocillos a una densidad de un millón de células por pocillo y se permitió que se adhirieran durante 24 h. Después de ello, se preincubaron con los inhibidores durante 30 min y posteriormente se coincubaron con SLF3 marcado con rodamina durante 1 h. El contenido celular de rodamina de los grupos tratados con inhibidor se comparó entonces con un control sin inhibidor. Los resultados se calcularon de acuerdo con la fórmula: (concentración del marcador en células tratada con inhibidor/concentración del marcador en células sin inhibidor) x 100.
Como se representa en las figuras 4 y 5, la citocalasina B no disminuye el contenido celular de rodamina, mientras que la inhibición con wortmanina y LY-294002 causan una disminución mínima de aproximadamente un 20 % en ambas líneas celulares. Esto demuestra que la macropinocitosis no es una ruta principal respecto a la acumulación intracelular de liposomas dirigidos por F3.
La endocitosis mediada por caveolas es otro portal de entrada en la célula y se sabe que se inhibe por filipina y genisteína (Rejman, 2005). Se informó de que BODIPY-lactosilceramida (BODIPY-lactocer, Molecular Probes) se internaliza exclusivamente mediante un mecanismo mediado por caveolas (Puri, 2001), que se usó como control para la inhibición de esta ruta. El bloqueo mediado por genisteína de las tirosina cinasas necesarias para este tipo de endocitosis provoca una ligera disminución en el contenido celular de rodamina (12,2% del control para MDA-MB-435S y 7,87 % para células HMEC-1).
En experimentos adicionales, se bloqueó la endocitosis mediada por clatrina con medio hipertónico. Se usó Alexa-Fluor-Transferrina (Molecular Probes) como control positivo para evaluar la eficacia de los inhibidores mencionados previamente. Se observa una fuerte disminución del contenido celular de rodamina (65,7 % en células MDA-MB-435S y 31% en células HMEC-1) después del tratamiento con sacarosa 0,45 M. Estos resultados corroboran la observación mencionada previamente en el ejemplo II de que internalización en las células es muy dependiente de la energía, ya que una disminución en la temperatura de incubación de 37 a 4 °C estaba acompañada por una reducción de 2,4 veces del contenido celular de rodamina. Además, estos estudios indican que los liposomas dirigidos por péptido F3 se internalizan mediante un mecanismo mediado por receptor, muy probablemente mediante la ruta de endocitosis mediada por clatrina, que se refuerza por los resultados de inhibición competitiva descritos en el ejemplo II, donde las células incubadas previamente con el péptido libre mostraban una disminución en el contenido de rodamina en oposición a las células de control no incubadas con el péptido.
Ejemplo IV
Estudios de citotoxicidad
Se determinó la citotoxicidad in vitro de doxorrubicina libre (DXR) y liposomas que contienen DXR para las células MDA-MB-435S y HMEC-1 usando el ensayo de proliferación de MtT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (Mosmann, 1983). En resumen, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 8000 células por pocillo y se incubaron con DXR libre, liposomas sensibles al pH no dirigidos (o no sensibles al pH) que contenían DXR o liposomas sensibles al pH dirigidos (o no sensibles al pH) que contenían DXR. Controles adicionales incluían péptido libre y liposomas dirigidos vacíos. Las células se incubaron durante 1, 3, 24 y 48 h a 37 °C en una atmósfera de un 95 % humedad y un 5 % de CO2. Al final del tiempo de incubación, las células se lavaron suavemente dos veces con PBS frío para retirar el DXR y se mantuvieron en medio fresco durante un total de 96 h. Después de la incubación, el medio se reemplazó por una solución de 0,5 mg/ml de MTT y las células se incubaron adicionalmente durante 4 h a 37 °C en una atmósfera de un 95 % de humedad y un 5 % de CO2. Los cristales se disolvieron en isopropanol ácido y se leyó la absorbancia en cada pocillo a 570 nm en un lector de microplaca (Multiscan EX - Thermo Electron Corporation). Se determinó la CI50 de DXR mediada por las diferentes formulaciones a partir de las curvas de dosis/respuesta.
La citotoxicidad de DXR, libre o encapsulada en liposomas con PEG injertado, se comparó como una función del tiempo. La CI50 disminuye según aumenta la exposición de las células al fármaco de 1 h a 48 h (tabla 1). Después de 24 h de incubación, SLF3[DXR] es al menos 17 veces más citotóxica que SL[DXR] contra células MDA-MB-435S y 4,4 veces más citotóxica contra células HMEC-1, lo que sugiere que la inhibición e internalización de los liposomas dirigidos están contribuyendo a la citotoxicidad aumentada. Esta observación se refuerza por la naturaleza no citotóxica de los liposomas vacíos y por el hecho de que todas las formulaciones basadas en lípidos ensayadas mostraban filtración mínima en HBS y medio de cultivo (datos no mostrados). Como se demuestra por microscopia confocal, la formulación sensible a pH permite que una gran cantidad de fármaco llegue a estar fácilmente biodisponible, dando lugar a una concentración intracelular aumentada de DXR, que justifica los mayores niveles de citotoxicidad.
DXR libre tiene los máximos niveles de citotoxicidad contra todas las líneas celulares in vitro, pero no distingue entre líneas celulares que expresan el receptor diana y líneas celulares que no expresan el receptor diana. Es importante señalar que los resultados de citotoxicidad in vitro obtenidos con fármaco libre no tienen en cuenta la farmacocinética desfavorable y la biodistribución que presenta la doxorrubicina in vivo (Gabizon, 1994). Como la DXR libre se redistribuye rápida y ampliamente a los tejidos después de la administración sistémica, se espera que la formulación dirigida sensible al pH, con su capacidad de unirse selectivamente a células diana y de suministrar de forma eficaz (intracelular) la carga encapsulada, tendrá ventajas sobre el fármaco libre in vivo.
Globalmente, el tratamiento de células endoteliales y tumorales humanas con liposomas sensible al pH dirigidos por péptido que contienen doxorrubicina (SLF3[DXR] sensible al pH), induce una inhibición más rápida y más fuerte del crecimiento celular que las otras formulaciones ensayadas que contienen doxorrubicina (SUDXR sensible al pH no dirigido] sensible al pH, o liposomas dirigidos a péptido o no dirigidos, no sensibles al pH SLF3IDXR] y SLIDXRJ, respectivamente) (tabla 1). La liberación de doxorrubicina activada de forma intracelular dirigida (tras la disminución del pH) demostró ser una característica crucial para la mejora drástica de la actividad citostática de doxorrubicina, cuando se suministra por liposomas sensibles al pH dirigidos por péptido.
DXR SL[DXR] SLF3[DXR] SL[DXR] SLF3[DXR] sensible sensible al H al H
Figure imgf000013_0001
Tiempo h
1 0,434 ± 0,030 614,6 ± 0,029 > 300 87,66 ± 0,062 47,69 ± 0,064 3 0,401 ± 0,059 89,16 ± 0,108 11,54 ± 7,540 12,07 ±2,541 6,688 ± 0,119 24 0,072 ± 0,010 31,6 ± 0,661 7,2 ± 0,093 3,57 ± 0,200 0,195 ± 0,049 48 0,058 ± 0,008 3,575 ± 0,052 0,856 ± 0,091 0,03 ± 0,026 ND
MDA-MB-435S
Tiempo (h)
1 1,608 ± 0,460 > 800 > 300 > 500 > 600
3 1,449 ± 0,270 > 700 230,5 ± 0,042 > 400 4,950 24 0,232 ± 0,045 > 700 41,24 ± 0,069 87,33 ± 0,139 3,953 ± 0,263 48 0,113 ± 0,078 > 700 25,5 ± 0,049 55,2 ± 0,049 3,366 ± 0,124 Tabla 1 - Citotoxicidad de varias formulaciones de DXR contra líneas celulares MDA-MB-435S o HMEC-1. Las células se incubaron con DXR libre o DXR encapsulada en liposomas con PEG injertado, no dirigidas o dirigidas por F3 sensibles al pH o no sensibles al pH, durante 1, 3, 24 y 48 h a 37 °C en una atmósfera de un 95 % de humedad y un 5 % de CO2. Después de ello, las células se lavaron con PBS y se incubaron con medio de cultivo reciente durante un tiempo total de 96 h. La CI50 se determinó por el ensayo de proliferación de MTT. Los datos son las medias ± DT de tres experimentos independientes, cada uno hecho por triplicado.
Referencias
Allen TM. Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy. Nat Rev Cancer 2002; 2: 750-763.
Allen TM, Chonn A. Large unilamellar liposomes with low uptake into the reticuloendothelial system. FEBS Lett 1987; 223: 42-46.
Bartlett GR. Phosphorus assay in column chromatography. J Biol Chem 1959; 234: 466-468.
Boehm T, Folkman J, Browder T, O'Reilly MS. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 1997; 390: 404-407.
Bolotin EM CR, Bar LK, Emanuel SN, Lasic DD, Barenholz Y. Ammonium sulphate gradients for efficient and stable remote loading of amphipathic weak bases into liposomes and ligandoliposomes. J Liposome Res 1994; 4: 455-479.
Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med 2003; 9: 653-660.
Christian S, Pilch J, Akerman ME, Porkka K, Laakkonen P, Ruoslahti E. Nucleolin expressed at the cell surface is a marker of endothelial cells in angiogenic blood vessels. J Cell Biol 2003; 163: 871-878.
Conner SD, Schmid SL. Regulated portals of entry into the cell. Nature 2003; 422: 37-44.
Daleke DL, Hong K, Papahadjopoulos D. Endocytosis of liposomes by macrophages: binding, acidification and leakage of liposomes monitored by a new fluorescence assay. Biochim Biophys Acta 1990; 1024: 352-366.
Devy L, de Groot FM, Blacher S, Hajitou A, Beusker PH, Scheeren HW, Foidart JM, Noel A. Plasmin-activated doxorubicin prodrugs containing a spacer reduce tumor growth and angiogenesis without systemic toxicity. Faseb J 2004; 18: 565-567. Drummond DC, Meyer 0, Hong K, Kirpotin DB, Papahadjopoulos D. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors. Pharmacol Rev 1999; 51: 691-743.
Drummond DC, Zignani M, Leroux J. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery. Prog Lipid Res 2000; 39: 409-460.
Feron 0. Targeting the tumor vascular compartment to improve conventional cancer therapy. Trends Pharmacol Sci 2004; 25: 536-542.
Ferrara N, Kerbel RS. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 2005; 438: 967- 974.
Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst 1990; 82: 4-6.
Folkman J. Addressing tumor blood vessels. Nat Biotechnol 1997; 15: 510.
Folkman J. Angiogenesis: an organizing principie for drug discovery? Nat Rev Drug Discov 2007; 6: 273-286. Folkman J, Ryeom S. Is oncogene addiction angiogenesis-dependent? Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2005; 70: 389-397.
Fonseca C, Moreira JN, Ciudad CJ, Pedroso de Lima MC, Simoes S. Targeting of sterically stabilised pH-sensitive liposomes to human T-leukaemia cells. Eur J Pharm Biopharm 2005; 59: 359-366.
Gabizon A, Papahadjopoulos D. The role of surface charge and hydrophilic groups on liposome clearance in vivo. Biochim Biophys Acta 1992; 1103: 94-100.
Gabizon A, Catane R, Uziely B, Kaufman B, Safra T, Cohen R, Martin F, Huang A, Barenholz Y. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethyleneglycol coated liposomes. Cancer Res 1994; 54: 987-992.
Gatenby RA, Frieden BR. Information dynamics in carcinogenesis and tumor growth. Mutat Res 2004; 568: 259­ 273.
Hajitou A, Pasqualini R, Arap W. Vascular targeting: recent advances and therapeutic perspectives. Trends Cardiovasc Med 2006; 16: 80-88.
Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 1996; 86: 353-364.
Hashizume H, Baluk P, Morikawa S, McLean JW, Thurston G, Roberge S, Jain RK, McDonald DM. Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness. Am J Pathol 2000; 156: 1363-1380.
Hristova EN, Cecco S, Niemela JE, Rehak NN, Elin RJ. Analyzer-dependent differences in results for ionized calcium, ionized magnesium, sodium, and pH. Clin Chem 1995; 41: 1649-1653.
Ishida T, Okada Y, Kobayashi T, Kiwada H. Development of pH-sensitive liposomes that efficiently retain encapsulated doxorubicin (Dx R) in blood. Int J Pharm 2006; 309: 94-100.
Lasic DD, Martin FJ, Gabizon A, Huang SK, Papahadjopoulos D. Sterically stabilized liposomes: a hypothesis on the molecular origin of the extended circulation times. Biochim Biophys Acta 1991; 1070: 187-192.
Maeda H. The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumorselective macromolecular drug targeting. Adv Enzyme Regul 2001; 41: 189-207.
Maeda H, Wu J, Sawa T, Matsumura Y, Hoh K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Release 2000; 65: 271-284.
McDonald DM, Baluk P. Significance of blood vessel leakiness in cancer. Cancer Res 2002; 62: 5381-5385. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63.
Needham D, McIntosh TJ, Lasic DD. Repulsive interactions and mechanical stability of polymer-grafted lipid membranes. Biochim Biophys Acta 1992; 1108: 40-48.
Papahadjopoulos D, Allen TM, Gabizon A, Mayhew E, Matthay K, Huang SK, Lee KD, Woodle MC, Lasic DD, Redemann C, et al. Sterically stabilized liposomes: improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy. Proc Natl Acad Sci U S A 1991; 88: 11460-11464.
Pasqualini R, Arap W, McDonald DM. Probing the structural and molecular diversity of tumor vasculature. Trends Mol Med 2002; 8: 563-571.
Porkka K, Laakkonen P, Hoffman JA, Bernasconi M, Ruoslahti E. A fragment of the HMGN2 protein homes to the nuclei of tumor cells and tumor endothelial cells in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 7444-7449.
Puri V, Watanabe R, Singh RD, Dominguez M, Brown JC, Wheatley CL, Marks DL, Pagano RE. Clathrindependent and -independent internalization of plasma membrane sphingolipids initiates two Golgi targeting pathways. J Cell Biol 2001; 154: 535-547.
Rejman J, Bragonzi A, Conese M. Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in gene transfer mediated by lipo- and polyplexes. Mol Ther 2005; 12: 468-474.
Sapra P, Allen TM. Ligand-targeted liposomal anticancer drugs. Prog Lipid Res 2003; 42: 439-462.
Simoes S, Moreira JN, Fonseca C, Duzgunes N, de Lima MC. On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56: 947-965.
Srivastava M, Pollard HB. Molecular dissection of nucleolin's role in growth and cell proliferation: new insights. Faseb J 1999; 13: 1911-1922.
Straubinger RM. pH-sensitive liposomes for delivery of macromolecules into cytoplasm of cultured cells. Methods Enzymol 1993; 221: 361-376.
Torchilin VP, Omelyanenko VG, Papisov MI, Bogdanov AA, Jr., Trubetskoy VS, Herron JN, Gentry CA. Poly(ethylene glycol) on the liposome surface: on the mechanism of polymer-coated liposome longevity. Biochim Biophys Acta 1994; 1195: 11-20.
Woodle MC, Matthay KK, Newman MS, Hidayat JE, Collins LR, Redemann C, Martin FJ, Papahadjopoulos D. Versatility in lipid compositions showing prolonged circulation with sterically stabilized liposomes. Biochim Biophys Acta 1992; 1105: 193-200.
Wu NZ, Da D, Rudoll TL, Needham D, Whorton AR, Dewhirst MW. Increased microvascular permeability contributes to preferential accumulation of Stealth liposomes in tumor tissue. Cancer Res 1993; 53: 3765-3770.
Yuan F, Leunig M, Huang SK, Berk DA, Papahadjopoulos D, Jain RK. Microvascular permeability and interstitial penetration of sterically stabilized (stealth) liposomes in a human tumor xenograft. Cancer Res 1994; 54: 3352­ 3356.
Zalipsky S. Functionalized poly(ethylene glycol) for preparation of biologically relevant conjugates. Bioconjug Chem 1995; 6: 150-165.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de suministro dirigido por ligando que comprende al menos un ligando unido a un soporte que transporta un agente, donde:
• el ligando es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1
• el soporte es un liposoma sensible al pH con capacidad de liberación activada intracelular;
• el agente es un agente terapéutico, de diagnóstico y/o de imágenes, encapsulado, atrapado o intercalado en el soporte.
2. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 1, donde el liposoma sensible al pH comprende dioleoilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterilo, fosfatidilcolina de soja completamente hidrogenada, fosfatidiletanolamina de metoxi-polietilenglicol, fosfatidiletanolamina de maleimida-polietilenglicol, N-metilpalmitoiloleoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, palmitoiloleoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, colesterol o una combinación de los mismos.
3. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 1, donde el liposoma sensible al pH comprende un lípido de alta temperatura de transición seleccionado de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC); colesterol; y un conjugado lipídico que es diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG).
4. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 1, donde el liposoma sensible al pH comprende dioleoilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterilo, fosfatidilcolina de soja completamente hidrogenada; colesterol, diestearoilfosfatidiletanolamina metoxi(polietilenglicol) (2000) y diestearoilfosfatidiletanolamina maleimida(polietilenglicol) a relación molar 4:2:2:2:0,18:0,12.
5. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 1, donde el agente terapéutico comprende un agente citotóxico, antineoplásico, antiinflamatorio, antiangiogénico, angiolítico, de alteración vascular, terapéutico fotodinámico o combinaciones de los mismos.
6. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 5, donde el agente es uno o más seleccionados del grupo que consiste en fármacos alquilantes; antibióticos citotóxicos; antimetabolitos; alcaloides de la vinca; amsacrina; altetarmina; crisantaspasa; dacarbacina; temozolomida; hidroxicarbamida (hidroxiurea); pentostatina; compuestos de platino; porfímero de sódico; procarbacina; razoxano; taxanos; inhibidores de topoisomerasa I; trastuzumab; tretinoína; SN-38, ET-743, TLK 286; agentes antiinflamatorios; agentes antiangiogénicos o agentes angiolíticos; ABT-627; Bay 12-9566; Benefin; bevacizumab; BMS-275291; inhibidor derivado de cartílago (CDI); CAI; fragmento del complemento CD59; CEP-7055; Col 3; combretastatina A-4; endostatina (fragmento de colágeno XVIII); fragmento de fibronectina; Gro-beta; halofuginona; heparinasas; fragmento de hexasacárido de heparina; HMV833; gonadotropina coriónica humana (hCG); IM-862; interferónalfa/beta/gamma; proteína inducible por interferón (IP-10); interleucina-12; Kringle 5. (fragmento de plasminógeno); marimastat; inhibidores de metaloproteinasa (TIm P); 2-metoxiestradiol; MMI 270 (c Gs 27023A); MoAbIMC-1C11; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; inhibidor de ribonucleasa placentaria; inhibidor del activador de plasminógeno; factor-4 plaquetario (PF4); prinomastat; fragmento de prolactina de 16 kDa; proteína relacionada con proliferina (PRP); PTK 787/ZK 222594; retinoides; Solimastat; escualamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; trombospondina-1 (TSP-1); TNP-470; factor de crecimiento transformante beta (TGF-b); vasculostatina; vasostatina (fragmento de calreticuina); ZD6126; ZD 6474; inhibidores de la fasnesiltransferasa (FTI); bifosfonatos y porfirinas.
7. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 6, donde los fármacos alquilantes son uno o más de ciclofosfamida, clorambucilo, melfalán, busulfán, lomustina, carmustina, clormetina (mustina), estramustina, treosulfán, tiotepa, o mitobronitol; los antibióticos citotóxicos son uno o más de doxorrubicina, epirrubicina, aclarrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona (mitozantrona), bleomicina, dactinomicina o mitomicina; los antimetabolitos son uno o más de metotrexato, capecitabina, citarabina, fludarabina, cladribina, gemcitabina, fluorouracilo, raltitrexed (tomudex), mercaptopurina, tegafur o tioguanina; los alcaloides de la vinca, son uno o más de vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina o etopósido; los compuestos de platino son uno o más de carboplatino, cisplatino u oxaliplatino; los taxanos son uno o más de docetaxel o paclitaxel; los inhibidores de topoisomerasa I son uno o ambos de inotecán o topotecán; los agentes antiinflamatorios son uno o más de ibuprofeno, aceclofenaco, acemetacina, azapropazona, celecoxib, dexcetoprofeno, diclofenaco de sodio, diflunisal, cetodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flubiprofeno, indometacina, acetaminocina, piroxicam, rofecoxib, sulindaco, tenoxicam, ácido tiaprofenuico, aspirina y benorilato; los agentes antiangiogénicos o agentes angiolíticos son uno o más de angiostatina (fragmento de plasminógeno), antitrombina III antiangiogénica o Angiozyme.
8. El sistema de suministro dirigido por fármaco de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los agentes antiinflamatorios son uno o más de ibuprofeno, aceclofenaco, acemetacina, azapropazona, celecoxib, dexcetoprofeno, diclofenaco de sodio, diflunisal, cetodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flubiprofeno, indometacina, acetaminocina, piroxicam, rofecoxib, sulindaco, tenoxicam, ácido tiaprofenuico, aspirina y benorilato.
9. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 1, donde se coloca un espaciador entre el ligando y el soporte.
10. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 9, donde el espaciador comprende una marca.
11. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el agente es doxorrubicina.
12. El sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo con la reivindicación 1, donde el sistema se marca con un radionúclido o una molécula fluorescente.
13. Un sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.
14. Un sistema de suministro dirigido por ligando de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en el diagnóstico y/o la formación de imágenes de tumores y/o la vasculatura tumoral en un sujeto.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8231895B2 (en) 2008-05-22 2012-07-31 Universidade De Coimbra Targeted delivery to human diseases and disorders
US9260517B2 (en) 2009-11-17 2016-02-16 Musc Foundation For Research Development Human monoclonal antibodies to human nucleolin
TWI397428B (zh) * 2009-12-29 2013-06-01 Ind Tech Res Inst 標的第四介白素受體之傳輸系統
WO2011119058A2 (en) 2010-03-22 2011-09-29 Universidade De Coimbra F3-peptide targeted lipid-based nanoparticles useful for the treatment of angiogenesis-dependent diseases
DE102010060498B4 (de) 2010-11-11 2013-04-18 Caprotec Bioanalytics Gmbh Isolierung und funktionale Identifizierung ganzer Zellen
DE102010064525B3 (de) * 2010-11-11 2014-01-02 Caprotec Bioanalytics Gmbh Isolierung und funktionale Identifizierung ganzer Zellen
CN102086356B (zh) * 2010-11-18 2012-09-05 李祥文 实木复合地板用粘接膜
ES2390147B1 (es) * 2011-02-11 2013-08-05 Fundación Progreso Y Salud Nanoliposomas funcionalizados con péptidos bioactivos como sistemas para mejorar la citotoxicidad de fármacos antitumorales.
WO2012101309A1 (es) * 2011-01-24 2012-08-02 Fundación Progreso Y Salud Nanoliposomas funcionalizados con peptidos
ES2389347B1 (es) * 2011-01-24 2013-09-13 Fundacion Progreso Y Salud Nanoliposomas funcionalizados con peptidos.
CN103371975A (zh) * 2012-04-16 2013-10-30 上海现代药物制剂工程研究中心有限公司 靶向长循环脂质体制剂及其制备方法
US9687569B2 (en) 2012-08-16 2017-06-27 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Theranostic nanoparticle and methods for making and using the nanoparticle
US20160058886A1 (en) * 2013-04-13 2016-03-03 Universidade De Coimbra Platform for targeted delivery to stem cells and tumor cells and uses thereof
EP3019203A4 (en) 2013-07-09 2017-04-26 President and Fellows of Harvard College Endothelial cell genes and uses thereof
EP3019199A4 (en) 2013-07-09 2017-03-15 President and Fellows of Harvard College Microvessel endothelial cell surface markers and uses thereof
WO2015061206A2 (en) 2013-10-21 2015-04-30 North Carolina State University Methods and constructs for compound delivery
BR112016011195A2 (pt) 2013-11-18 2017-09-19 Rubius Therapeutics Inc Células eritroides enucleadas e seus métodos de fabricação, composição farmacêutica e seu uso, uso de uma população de células eritroides, biorreator, mistura de células e dispositivo médico
KR20220150986A (ko) 2014-04-01 2022-11-11 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 면역조절을 위한 방법 및 조성물
WO2015166987A1 (ja) * 2014-04-30 2015-11-05 富士フイルム株式会社 リポソーム組成物及びその製造方法
SI3138555T1 (sl) 2014-04-30 2021-06-30 Fujifilm Corporation Liposomski sestavek in proizvodni postopek zanj
CN105250225A (zh) * 2015-05-26 2016-01-20 苏州海特比奥生物技术有限公司 一种康普瑞汀纳米聚合物胶束冻干制剂及其制备方法
WO2019016784A1 (en) * 2017-07-21 2019-01-24 Universidade De Coimbra ANTI-NUCLEOLIN ANTIBODIES
CN108042490B (zh) * 2018-01-10 2020-09-15 华中科技大学 纳米载药系统、其制备方法、药物组合物及在治疗癌症中的应用
WO2020076173A1 (en) 2018-09-21 2020-04-16 Universidade De Coimbra Nanodelivery tissue targeting at low systemic exposures and methods thereof
CN114288422B (zh) * 2022-01-21 2023-04-28 陕西科技大学 一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体及其制备方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4907897A (en) 1996-10-11 1998-05-11 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US7456012B2 (en) 1997-11-06 2008-11-25 Cellectricon Ab Method and apparatus for spatially confined electroporation
US6440736B1 (en) 1998-10-16 2002-08-27 U-Bisys B.V. Altering the properties of cells or of particles with membranes derived from cells by means of lipid-modified proteinaceous molecules
WO2001085093A2 (en) 1999-12-23 2001-11-15 Neurochem, Inc. Compounds and methods for modulating cerebral amyloid angiopathy
US7749492B2 (en) * 2001-01-05 2010-07-06 Nationwide Children's Hospital, Inc. AAV vectors and methods
AU2003225432A1 (en) 2002-04-04 2003-10-20 Applied Nanosystems B.V. Delivery of a substance to a pre-determined site
WO2003087124A2 (en) 2002-04-05 2003-10-23 The Burnham Institute Hmgn2 peptides and related melecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
US20050196343A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-08 Molecular Therapeutics, Inc. Degradable nanoparticles
US20080188421A1 (en) 2004-03-31 2008-08-07 Bredesen Dale E Hunter-Killer Peptides and Methods of Use
EP1976547A1 (en) 2005-11-11 2008-10-08 Vascular Biosciences R-ras activity in vascular regulation
WO2007100904A2 (en) 2006-02-28 2007-09-07 The Board Of Regent Of The University Of Oklahoma Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to tumor cells or tumor vasculature and production thereof
JP2008162981A (ja) 2006-12-28 2008-07-17 Japan Science & Technology Agency ビオチン化ないしホーミングペプチド提示型バイオナノカプセル
WO2009005793A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Avi Biopharma, Inc. Tissue specific peptide conjugates and methods
US8231895B2 (en) * 2008-05-22 2012-07-31 Universidade De Coimbra Targeted delivery to human diseases and disorders
WO2010008876A2 (en) 2008-06-24 2010-01-21 The Regents Of The University Of California Method for preparation of micellar hybrid nanoparticles for therapeutic and diagnostic applications and compositions thereof

Also Published As

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