CN103874482B9 - 脂质体复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以在任意的时刻非侵入性地缓释药物的药物递送系统。本发明涉及一种脂质体复合物，其含有结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质，所述光吸收化合物选自由在近红外区域具有吸收波长的吲哚菁绿色素、酞菁色素、方酸菁色素、克酮酸色素及二亚铵色素构成的组。

Description

脂质体复合物
技术领域
本发明涉及一种可用于药物递送系统等的含有结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质及药剂的脂质体复合物。
背景技术
药物递送系统(Drug Delivery System：DDS)为将药物有效且局部地递送到目标患部(脏器及组织、细胞、病原体等)的技术。与正常组织相比，肿瘤组织中的血管通透性显著增加，因此，高分子及微粒容易从血管中流出。另外，由于淋巴系统不发达，因此，到达肿瘤组织的物质蓄积。这样的特性称为EPR效应，其在对于癌细胞进行被动靶向时成为重要的因素。但是，虽然可利用EPR效应使给药到血管内的药物载体选择性地递送／蓄积在癌组织中，但有效地缓释内包于载体的药剂依然成为问题。
另一方面，近年来，利用在红外区域具有吸收波长的色素的放热作用及产生活性氧的作用(PDT效应)的温热化学疗法及光动力疗法备受关注。其利用近红外光在生物体内的通透性及吸收近红外光的化合物，例如，在专利文献1(日本特开2010-69001号公报)中公开有一种使用吲哚菁绿(ICG)作为感光性着色剂，利用其放热作用及活性氧产生作用的光动力热化学疗法。本文献中记载了通过在动物的肿瘤组织患部注入顺式铂氨及ICG并进行光照射，即使治疗后经过1年，也未确认到肿瘤的复发／转移。
另外，专利文献2(WO00／41726)中公开了一种使用ICG等光敏药剂的经皮光动力学治疗。在本文献的发明中，光敏性药剂递送系统含有由光敏性药剂构成的脂质体递送系统。该脂质体递送系统采用将光敏性药剂作为脂质体制剂进行给药的方式(即，使光敏性药剂内包在脂质体中使用)。但是，在本文献中，仅记载了对于肿瘤组织使用光敏性药剂，未公开同时给药抗癌剂等情况。
在专利文献3(日本特开2007-277218号公报)中公开有一种脂质体组合物，其具备脂质体的亲水层中所内包的亲水性药物和上述脂质体的脂质双层中所内包的疏水性的感光性物质，其中，所述脂质体在光源的照射下，通过光动力作用诱导上述疏水性药物的释放。然而，作为上述感光性物质公开的仅为卟啉，卟啉具有日光皮炎(瘙痒性皮疹、红斑、水疱)等过敏症；恶心、胃肠道损伤、腹泻、胃痛、肚子不适等消化器官症状；以及色素沉着、心悸亢进、发烧、身体不适、面部潮红、黑色便等副作用。
在专利文献4(日本特开2010-266295号公报)中公开一种荧光组织标记物，其具有囊泡群，所述囊泡群通过使磷脂质和吲哚菁绿等近红外荧光色素复合而形成的囊泡内包在亲水性溶剂中，利用乳化剂形成多个胶囊并凝聚而成。然而，其用作荧光组织标记物，未意图应用于光动力热疗法及使药剂包含在脂质体内。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2010-69001号公报
专利文献2：WO00／41726
专利文献3：日本特开2007-277218号公报
专利文献4：日本特开2010-266295号公报
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述，在现有的方法中，其目的仅在于使ICG等光敏剂直接作用于患部，药剂缓释的控制依然成为问题。因此，本发明的目的在于，提供一种可以在任意的时刻非侵入性地缓释药物的药物递送系统。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决所述课题进行了潜心研究，结果发现，使药剂内包在脂质双膜具有近红外吸收色素的脂质体中并进行光照射，由此，可在任意的时间将药剂非侵入性地缓放于患部，以至完成了本发明。即，本发明包含以下的发明。
[1]一种脂质体复合物，其含有结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质，且在脂质体内含有药剂，所述光吸收化合物选自由在近红外区域具有吸收波长的吲哚菁绿色素、酞菁色素、方酸菁色素、克酮酸色素及二亚铵色素构成的组。
[2]如上述[1]所述的脂质体复合物，其中，所述脂质体膜构成物质由脂质构成。
[3]如上述[1]所述的脂质体复合物，其中，所述结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质由下述式(I)表示，
A-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1 (I)
[式中，
A为光吸收化合物；
B1及B2分别独立地为-CH2-、-CH=CH-、-O-、-S-、-NH-、-CO-、-COO-、-OCO-、-NHCO-、-CONH-、-SO2-、-SO2NH-、-NHSO2-、-PO4M-(M为碱金属离子)或-(CH2CH2O)c-(c为1～10的整数)；
D为-CHE2-、-NE2-、-C6H4E2-、-CH2CH(OCOE2)-CH2OCO-或-CHE2-CH2OCO-；
E1为碳原子数8～18的取代或未取代的烃基；
E2为氢或碳原子数8～18的取代或者未取代的烃基；
a为0～4的整数，b为0～6的整数]。
[4]如上述[3]所述的脂质体复合物，其中，B1及B2分别独立地为-CH2-、-CH=CH-、-O-或-S-；
D为-CHE2-(E2如上述[3]所述)。
[5]如上述[4]所述的脂质体复合物，其中，B1及B2为-CH2-。
[6]如上述[1]～[5]中任一项所述的脂质体复合物，其在光热疗法和／或光动力疗法中使用。
[7]如上述[1]～[6]中任一项所述的脂质体复合物，其在荧光成像中使用。
发明效果
根据本发明，可以使所期望的药剂在任意的时刻非侵入性地作用于患部。
附图说明
图1是本发明的脂质体复合物的示意图；
图2表示脂质双膜中具有ICG-8的脂质体分散液(LP-ICG-8，以下相同)及内包ICG的脂质体分散液(ICG)的荧光特性；
图3是荧光观察静脉给药LP-ICG-8或ICG水溶液后的患部的照片；
图4表示大鼠皮下肿瘤模型中的光动力疗法／光热疗法的概要；
图5是肿瘤内给药LP-ICG-8或ICG水溶液之后及48小时后的肿瘤的照片；
图6是对图5的肿瘤组织切片进行了苏木精／伊红(HE)染色的照片；
图7是说明本发明的脂质体复合物的药物缓释能力的图；
图8是肿瘤内给药含有ICG及顺式铂氨(CDDP)的水溶液(ICG+CDDP)或在脂质双膜中具有ICG-8的脂质体中含有内包顺式铂氨的脂质体复合物的水溶液(LP-ICG-8-CDDP)之后及48小时后的肿瘤的照片；
图9是对图8的肿瘤组织切片进行了HE染色的照片；
图10表示ICG-8的单线态氧测定的结果；
图11表示在作为极性溶剂的甲醇中(a)及作为非极性溶剂的氯仿中(b)将ICG-11的荧光光谱特性与ICG相比的结果；
图12表示ICG-11的单线态氧测定的结果；
图13表示ICG-11的产热能力测定的结果；
图14表示ICG-11和ICG的脂质体搭载量测定的结果；
图15表示ICG-11含量的不同导致的粒径分布；
图16表示脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液的UV光谱特性；
图17表示脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液的荧光光谱特性；
图18表示在试管内测定LP-ICG-11的产热能力的结果；
图19表示在生物体内测定LP-ICG-11的产热能力的结果；
图20表示在肿瘤和体表比较LP-ICG-11的体内分布变化的结果；
图21表示在肿瘤和各脏器中比较LP-ICG-11的体内分布变化的结果；
图22表示脑肿瘤的MRI图像(左)及脑肿瘤的近红外线荧光图像(右)；
图23表示治疗后的脑肿瘤体积变化；
图24表示猫(顶浆分泌腺癌、肺及结肠转移)的X光照片(上：治疗前，下：第2疗程)；
图25表示狗(肛周腺癌／淋巴结转移)的X光照片(上：治疗前，下：第1疗程第8天)；
图26表示狗(肛周腺癌／淋巴结转移)的X光照片(左：治疗前，下：第2疗程结束2周后)；
图27表示猫(鼻腔内淋巴瘤)CT照片(治疗前)；
图28表示猫(鼻腔内淋巴瘤)CT照片(第1疗程第7天)；
图29表示猫(鼻腔内淋巴瘤)CT照片(第2疗程第7天)；
图30表示猫(鼻腔内淋巴瘤)CT照片(第2疗程结束第5天)；
图31表示肾脏肿瘤的回波图像(上：治疗前，下：第4疗程)；
图32表示狗的软组织肉瘤的治疗经过(左：第4疗程的小肿瘤，中：第5疗程前半段的溃疡化的肿瘤，右：第5疗程的后半段的坏死的肿瘤)。
具体实施方式
下面，对本发明详细地进行说明。
本发明的脂质体复合物含有结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质，且在脂质体内含有药剂，所述光吸收化合物选自由在近红外区域具有吸收波长的吲哚菁绿色素、酞菁色素、方酸菁色素、克酮酸色素及二亚铵色素构成的组。
在本说明书中，所谓“光吸收化合物”为产生对于吸收近红外区域的光而使脂质体开裂充分的热的化合物，优选进一步产生对于产生单线态氧且／或使肿瘤细胞灭绝充分的热。所谓“近红外区域的吸收波长”，作为光吸收化合物的最大吸收波长，表示700～1400nm，优选表示800～1000nm，特别优选表示800～900nm。
在本说明书中，所谓“脂质体膜构成物质”只要不阻碍脂质双膜的形成就没有特别限定，例如可以举出：脂质、膜稳定剂、抗氧化剂、带电物质、膜蛋白等。
作为脂质，例如可以举出：磷脂质、糖脂、甾醇、饱和或不饱和的脂肪酸等。
作为磷脂质，例如可以举出：磷脂酰胆碱(例如二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱等)、磷脂酰甘油(例如二油酰基磷脂酰甘油、二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油等)、磷脂酰乙醇胺(例如二油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、这些的氢化物等。
作为糖脂，例如可以举出：甘油糖脂(例如硫氧基核糖基甘油酯、二葡萄糖基二甘油酯、二半乳糖基甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、葡萄糖基甘油二酯)、鞘糖脂(例如半乳糖基脑苷脂、乳糖基脑苷脂、神经节苷脂)等。
作为甾醇，例如可以举出：源自动物的甾醇(例如胆甾醇、胆甾醇琥珀酸酯、羊毛甾醇、二氢羊毛甾醇、脱氢胆甾醇、二氢胆甾醇)、源自植物的甾醇(植物固醇)(例如豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇)、源自微生物的甾醇(例如酵母甾醇、麦角甾醇)等。
作为饱和或不饱和的脂肪酸，例如可以举出：棕榈酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等碳原子数12～20的饱和或不饱和的脂肪酸。
膜稳定剂为能够为了使脂质体膜物理或化学稳定或调节脂质体膜的流动性而添加的任意的脂质体膜成分。作为膜稳定剂，例如可以举出：甾醇、甘油或其脂肪酸酯等。
作为甾醇，可以举出与上述相同的具体例，作为甘油的脂肪酸酯，例如可以举出：三油精、三辛酸甘油酯等。
抗氧化剂为能够为了防止脂质体膜的氧化而添加的任意的脂质体膜成分，例如可以举出：生育酚、没食子酸丙酯、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基甲苯等。
带电物质为能够为了对脂质体膜赋予正电荷或负电荷而添加的任意的脂质体膜成分，作为赋予正电荷的带电物质，例如可以举出：硬脂胺、油烯基胺等饱和或不饱和脂肪族胺；二油酰基三甲基铵丙烷等饱和或不饱和阳离子性合成脂质等，作为赋予负电电荷的带电物质，例如可以举出：磷酸二鲸蜡酯、胆固醇琥珀酸单酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
膜蛋白为能够为了维持脂质体膜的结构或对脂质体膜赋予功能性而添加的任意的脂质体膜成分，例如可以举出：膜外在蛋白、膜内在蛋白等。
所谓“结合于光吸收化合物”的脂质体膜构成物质表示脂质体膜构成物质和光吸收化合物共价键合的化合物，作为“结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质”，可优选举出上述式(I)所示的物质。
在上述式(I)中，作为M所示的碱金属离子，例如可以举出：钠离子、钾离子等。
在上述式(I)中，作为E1或E2所示的碳原子数8～18的烃基，例如可以举出：碳原子数8～18、优选碳原子数12～18的烷烃、烯烃(优选双键为2个以下)、炔烃(优选三键为2个以下)，更优选碳原子数14～18的烷烃、烯烃或炔烃。这些烃基例如可以用卤素原子、C1-6烷氧基等取代。
在上述式(I)中，a为0～4、优选0～2的整数。另外，b为0～6、优选0～2的整数。另外，c为1～10、优选1～4、更优选1～2的整数。
在上述式(I)中，可以通过采用上述的分子作为B1及B2来使该分子本身与脂质体表面的磷酸基亲和而稳定化。另外，可通过采用上述的分子作为D来使脂质体锚定于疏水性区域。另外，可以采用上述的分子作为E1及E2，由此，在室温～体温左右，不会使膜流动性降低，能够使膜流动性伴随温度上升而急剧地增大或者减少。另外，可以通过将a及b设在上述的范围，色素从侧链结构离开数减少对脂质体表面的电化学状态的单线态氧产生的影响。
本发明的“脂质体复合物”以构成脂质双膜的物质的总配方量(総配合量)计通常含有0.01～50％(摩尔比)、优选含有0.1～5％(摩尔比)、更优选含有0.1～1％(摩尔比)的上述结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质。作为构成脂质双膜的物质，脂质为必需成分，其配方量以构成脂质双膜的物质的总配方量计通常含有20～99.9％(摩尔比)、优选含有50～99％(摩尔比)、更优选含有80～95％(摩尔比)。进而，为了使脂质膜稳定化，优选加入胆甾醇等。胆甾醇等可以以不损伤本发明的目的的范围的配方量使用。
另外，为了使脂质体在生物体内稳定化，可以用亲水性聚合物修饰脂质体的外表面。作为这样的亲水性聚合物的例子，可以举出：聚乙二醇、聚甲基乙二醇、聚羟基丙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙二醇、聚羟基环氧丙烷等。特别优选的物质为聚乙二醇。其配方量以构成脂质双膜的物质的总配方量计通常含有0.01～10％(摩尔比)、优选0.1～1％(摩尔比)。
另外，为了将脂质体复合物递送到靶部位，可以将结合于能够与存在于细胞膜的表面上的受体或抗原结合的物质(细胞膜结合性物质)的脂质体膜构成物质作为脂质体的脂质双膜的构成成分，作为细胞膜结合性物质，例如可以举出：运铁蛋白、胰岛素、叶酸、透明质酸、抗体或其片段、糖链、生长因子、阿朴脂蛋白等。
本发明的脂质体复合物在脂质体内包含药剂。药剂没有特别限定，例如可以使用抗癌剂等药剂、蛋白、肽、核酸等。作为抗癌剂，可以使用本领域技术人员公知的物质，例如可以举出以下的化合物，烷基化剂：例如环磷酰胺、美法仑、雷莫司汀、异磷酰胺、盐酸氮芥-N-氧化物等；代谢拮抗剂：例如6-巯基嘌呤、核糖苷、依诺他滨、卡莫氟、阿糖胞苷、阿糖胞苷烷磷脂、替加氟、5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷、脱氧氟尿苷、羟基脲、米佐屈脱、巯基嘌呤等；抗肿瘤性抗生素制剂：例如放线菌素D、盐酸阿柔比星、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、盐酸多柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸吡柔比星、净司他丁斯酯、硫酸博来霉素、盐酸博来霉素、丝裂霉素C、新制癌菌素、硫酸培洛霉素等；抗肿瘤性植物成分制剂：例如依托泊甙、盐酸依立替康、多西他赛水合物、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、硫酸长春碱、紫杉醇、以及醋葡醛内酯、乌苯美司、顺式铂氨、西佐糖、索布佐生、云芝多糖k、柠檬酸托瑞米芬、醋酸甲羟孕酮、柠檬酸他莫昔芬、卡铂、盐酸法倔唑水合物、盐酸甲基苄肼、盐酸米托蒽醌、L-天冬酰胺酶、维A酸、奈达铂、溶链菌制剂、氟他胺、喷司他丁、卟吩姆钠、香菇多糖等。
作为上述吲哚菁绿色素，例如可以举出下述式(II-1)所示的化合物，
[式中，X1及X2为-C(CH3)2-、O或S，Y1及Y3为氢或OCH3，Y2及Y4为氢，或Y1和Y2、及Y3和Y4可以分别与这些基团所键合的环一起缩合而形成苯环，Q1及Q2可以为氢或这些基团键合而形成6元环，R1～R3的任一个为-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1[式中的符号与上述式(I)含义相同]，P1为1价的阴离子，即氯离子、溴离子或碘离子，R1～R3为选自由以下的基团构成的组中的基团，
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)nSO3(M) -(CH2)nCOO(M) -(CH2)nPO4(M)
-(CH2)n(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2)mCH3
-(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mOH
-(CH2)nZ1(CH2)mNH2 -(CH2)nZ1(CH2)mSO3(M)
-(CH2)nZ1(CH2)mCOO(M) -(CH2)nZ1(CH2)mPO4(M)
-(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(M)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nZ1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3-(CH2)nZ1(CH2)p-N3
其中，Z1或Z2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-，P2为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，M为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，R4为碳原子数1～18、优选4～10的烷烃、烯烃或炔烃，n或m为0～22、优选为0～4的整数，1为1～22、优选1～4的整数，p为0～17、优选为0～2的整数，x为2～2000、优选为2～150的整数]。
作为上述酞菁色素，可以举出下述式(II-2)所示的化合物，
[式中，R1～R16为以下的基团：
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)nSO3(M) -(CH2)nCOO(M) -(CH2)nPO4(M)
-(CH2)n(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2)mCH3
-(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mOH
-(CH2)nZ1(CH2)mNH2 -(CH2)nZ1(CH2)mSO3(M)
-(CH2)nZ1(CH2)mCOO(M) -(CH2)nZ1(CH2)mPO4(M)
-(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(M)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nZ1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nZ1(CH2)p-N3
其中，R1～R16中的至少1个为-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1[式中的符号与上述式(I)含义相同]，其中，Z1或Z2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-，其中，R17为碳原子数1～24、优选6～18的烷烃、烯烃或炔烃，P1为1价的阴离子，即氯离子、溴离子或碘离子，M1为氢(二个原子)或阳离子，即铅离子、铜离子、铁离子、镁离子、钴离子、锡离子、钛离子或镍离子，M为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，P2为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，n或m为0～22、优选0～4的整数，1为1～22、优选为0～4的整数，p为0～17、优选为0～2的整数，x为2～2000、优选为2～150的整数]。
作为上述方酸菁色素，可以举出下述式(II-3)所示的化合物，
[式中，R1～R8为以下的基团：
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)nSO3(M) -(CH2)nCOO(M) -(CH2)nPO4(M)
-(CH2)n(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2)mCH3
-(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mOH
-(CH2)nZ1(CH2)mNH2 -(CH2)nZ1(CH2)mSO3(M)
-(CH2)nZ1(CH2)mCOO(M) -(CH2)nZ1(CH2)mPO4(M)
-(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(M)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)mZ1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H-(CH2)n-N3 -(CH2)nZ1(CH2)p-N3
其中，R1～R8中的至少1个为-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1[式中的符号与上述式(I)含义相同]，其中，Z1或Z2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-，其中此，R9为碳原子数1～24、优选6～18的烷烃、烯烃或炔烃，M为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，P2为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，n或m为0～22、优选为0～4的整数，1为1～22、优选为1～4的整数，p为0～17、优选为0～2的整数，x为2～2000、优选为2～150的整数]。
作为上述克酮酸色素，可以举出下述式(II-4)所示的化合物，
[式中，R1～R6为以下的基团：
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)nNH2
-(CH2)nSO3(M) -(CH2)nCOO(M) -(CH2)nPO4(M)
-(CH2)n(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2)mCH3
-(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mOH
-(CH2)nZ1(CH2)mNH2 -(CH2)nZ1(CH2)mSO3(M)
-(CH2)nZ1(CH2)mCOO(M) -(CH2)nZ1(CH2)mPO4(M)
-(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH-(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(M)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nZ1(CH2)p-C≡≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nZ1(CH2)p-N3
其中，R1～R6中的至少1个为-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1[式中的符号与上述式(I)含义相同]，其中，Z1或Z2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-，其中，R7为碳原子数1～24、优选6～18的烷烃、烯烃或炔烃，M为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，P2为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，n或m为0～22、优选为0～4的整数，1为1～22、优选为1～4的整数，p为0～17、优选为0～2的整数，x为2～2000、优选为2～150的整数]。
作为上述二亚铵色素，可以举出下述式(II-5)所示的化合物，
[式中，R1～R6为以下的基团：
-(CH2)nCH3 -(CH2)nSH -(CH2)nOH -(CH2)mNH2
-(CH2)nSO3(M) -(CH2)nCOO(M)-(CH2)nPO4(M)
-(CH2)n(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2)mCH3
-(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mSH -(CH2)nZ1(CH2)mOH
-(C2)nZ1(CH2)mNH2 -(CH2)nZ1(CH2)mSO3(M)
-(CH2)nZ1(CH2)mCOO(M) -(CH2)nZ1(CH2)mPO4(M)
-(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH -(CH2)nZ1(CH2CH2O)xH
-(CH2)nPO4(CH2)mCH3(M)
-(CH2)n-C≡C-(CH2)m-H -(CH2)nZ1(CH2)p-C≡C-(CH2)m-H
-(CH2)n-N3 -(CH2)nZ1(CH2)p-N3
其中，R1～R6中的至少1个为-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1[式中的符号与上述式(I)含义相同]，其中，Z1或Z2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH=CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-、-C6H4-，其中，R7为碳原子数1～24、优选6～18的烷烃、烯烃或炔烃，P1为1价的阴离子，即氯离子、溴离子或碘离子，M为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，P2为1价的阳离子，即氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，n或m为0～22、优选为0～4的整数，1为1～22、优选为1～4的整数，p为0～17、优选为0～2的整数，x为2～2000、优选为2～150的整数]。
上述式(II-1)所示的吲哚菁绿色素例如可以根据WO2011／152046号小册子、WO1995／007888号小册子、日本特开平9-124599号公报、日本特开平3-171136号公报、J.Org.Chem.(1995)60,2391等中记载的公知的方法来合成。
具体而言，可以按照下述的方案来合成。
[式中的符号与上述式(II-1)含义相同]。
在用溴化合物(Br-R1)对吲哚衍生物(例如2，3，3-三甲基-4，5-苯并-3H-吲哚)进行烷基化而制成N-R1取代吲哚衍生物后，使其与戊二烯醛缩二苯胺类反应，与己三烯链连接，接着，使N-R2取代吲哚衍生物偶合，由此可以得到目标吲哚菁绿色素。
上述式(II-2)所示的酞菁色素例如可以根据日本特开2004-18561号公报等中记载的公知的方法来合成。
上述式(II-3)所示的方酸菁色素例如可以根据日本特开2011-69846号公报等中记载的公知的方法来合成。
上述式(II-4)所示的克酮酸色素例如可以根据日本特开2007-31644号公报等中记载的公知的方法来合成。
上述式(II-5)所示的二亚铵色素例如可以根据Reports Res.Lab.AsahiGlass Co.，Ltd.(2005)55，67-71“11.ジイモ二ゥム系化合物を用ぃた近赤外線吸收フイルムの耐久性向上”等中记载的公知的方法来合成。
本发明的脂质体复合物可以使用该技术领域中已知的任意的方法来制造，例如可以通过在适当的有机溶剂中溶解结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质、磷脂质和药剂，将其干燥后，使其分散在水性溶液中并重复通过过滤器来制造。或者，可以如该技术领域中已知的、通过超声波处理或反相蒸发法来制造。
作为一个例子，溶解结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质、磷脂质(例如含有卵磷脂的蛋黄卵磷脂)、脂质(例如胆甾醇)、亲水性聚合物的磷脂质衍生物(例如聚乙二醇修饰磷脂质)于适当的有机溶剂中，除去有机溶剂形成薄膜后，加入含有药剂的水溶液。作为水溶液，只要为生理学上可允许的缓冲液就可以使用任意的物质。为了使脂质体复合物在生物体内稳定化，也可以使用含有白蛋白的缓冲液。
接着，若使缓冲液中分散有磷脂质的悬浮液通过孔径0.1～0.2μm的过滤器约10～30次，则可以形成脂质体复合物。脂质体复合物的粒径可以通过改变使用的磷脂质、脂质和／或修饰磷脂质的种类、浓度、过滤器的孔尺寸、过滤器的材质、以及通过过滤器的次数等来适宜调节。也可以根据需要对所形成的脂质体进行尺寸分级，制备具有期望的直径的脂质体。例如为了使其长时间系留在肿瘤组织中，脂质体的粒径优选为20～250nm，更优选为50～200nm的范围。
使用了本发明的脂质体复合物的光热疗法和／或光动力疗法例如可以通过在静脉给药或肿瘤内给药含有规定浓度的本发明的脂质体复合物的生理盐水，一定时间后，利用可照射近红外光的装置对患部进行光照射来进行。脂质体复合物的浓度及光照射时间等可以考虑期望的治疗效果适宜设定。
使用了本发明的脂质体复合物的光热疗法和／或光动力疗法对于各种肿瘤，例如脑肿瘤、胰岛瘤、鼻腔癌、口腔癌、肾脏癌、肺癌、大肠癌、软组织肉瘤、转移癌(胸膜转移、腹膜转移)等显示治疗效果。
在荧光成像中使用本发明的脂质体复合物的情况下，可以单独使用本发明的脂质体复合物，或者可以适宜使用还含有结合于近红外荧光色素的脂质体膜构成物质的脂质体复合物、或使近红外荧光色素内包于脂质体内作为脂质体复合物的脂质双膜的构成成分而成的脂质体复合物。根据情况也可以适宜组合本发明的脂质体复合物和含有结合于近红外荧光色素的脂质体膜构成物质的脂质体复合物和／或在脂质体内包含近红外荧光色素的脂质体。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本特愿2011-223273的说明书和／或附图中所记载的内容。
实施例
下面，利用实施例对本发明进一步具体地进行说明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
[实施例1]吲哚菁绿色素ICG-8的合成
作为本发明的吲哚菁绿色素的ICG-8按照下述的方案合成。
[2，3，3-三甲基-1-(4-磺基丁基)-4，5-苯并吲哚鎓内盐(2)]
在25ml四口烧瓶中混合2，3，3-三甲基-4，5-苯并-3H-吲哚(1)(3.1g，15mmol)和4-丁磺酸内酯(2.1g，15mmol)，对容器内进行氮置换。在80℃下搅拌4小时后，冷却至室温，加入丙酮使反应混合物析出。搅拌片刻后滤取结晶，用丙酮10ml清洗，然后，风干，得到灰色结晶(2)(1.17g，23％)。
[2-(6-乙酰苯胺-1，3，5-己三烯基)-3，3-二甲基-1-(磺基丁基)-4，5-苯并[e]吲哚鎓内盐(3)]
在25ml四口烧瓶中混合吲哚鎓盐(2)(1.04g，3.0mmol)和戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐(0.94g，3.3mmol)，在120℃下搅拌1小时。冷却至室温，搅拌1小时后，滤取结晶。用丙酮喷洗得到的结晶，滤取后，风干，得到暗紫色结晶状的目标物(3)(0.91g，58％)。
[碘化1-十八烷基-2，3，3-三甲基-4，5-苯并[e]吲哚鎓(4)]
在100ml四口烧瓶中混合2，3，3-三甲基-4，5-苯并-3H-吲哚(8.4g，40mmol)、1-碘代十八烷(16.8g，44mmol)及2-丁酮(30ml)，在70℃下搅拌18小时后，冷却至室温，加入醋酸乙酯(40ml)，滤取结晶。用醋酸乙酯喷洗(2次)得到的结晶，滤取后，风干，得到灰色结晶状的目标物(4)(4.4g，19％)。
[4-(2-((1E，3E，5E，7E)-7-(1，1-二甲基-3-十八烷基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)庚-1，3，5-三烯基)-1，1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸(5)]
在50ml三口烧瓶中混合化合物(3)(1.58g，3.0mmol)、吲哚鎓盐(4)(1.77g，3.0mmol)及吡啶16ml并使其溶解，在氮气氛下，在50℃下，使其反应1小时。反应后，排出到水(40ml)中并滤取析出的结晶。用醋酸乙酯拆开得到的粗结晶后，用氯仿／醋酸乙酯(1／1)40ml使滤取得到的结晶重结晶，得到暗绿色的结晶状目标物(5)(1.39g，53％)。
LC-MS的主要的分子离子峰为m／z=867(负)。另外，乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=787nm、ε=2.30×105。
[实施例2]
(1)荧光光谱
·内包ICG的脂质体分散液(ICG)
制备将源自蛋黄的磷脂酰胆碱设为10.0mM及将ICG(Diagnogreen注册商标，第一三共)设为3.2×10-2mM的氯仿／甲醇(9∶1，v／v)溶液，在减压下溶剂蒸馏除去其中3mL，在生成的薄膜中添加生理盐水3mL，用0.22μm孔径的过滤器处理得到脂质体。
·脂质双膜中具有ICG-8的脂质体分散液(LP-ICG-8)
制备将源自蛋黄的磷脂酰胆碱设为10.0mM及将ICG-8设为3.2×10-2mM的氯仿／甲醇(9∶1，v／v)溶液，在减压下溶剂蒸馏除去其中3mL，在生成的薄膜中添加生理盐水3mL，用0.22μm孔径的过滤器处理得到脂质体。
分别测定上述的脂质体分散液的荧光光谱(日本分光FP-6600)，结果，采用激发波长736nm，得到图2所示的荧光光谱。ICG的荧光最大波长为852nm，ICG-8的荧光最大波长为854nm。
(2)静脉给药后的近红外线照相机图像
·ICG水溶液(ICG)
以成为3.2mM的方式溶解ICG于纯水中，用生理盐水稀释100倍。
·脂质双膜中具有ICG-8的脂质体分散液(LP-ICG-8)
制备含有源自蛋黄的磷脂酰胆碱(10.0mM)、胆甾醇(1.0mM)、聚乙二醇修饰型磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)(5.0×10-1mM)、ICG-8(3.2×10-2mM)的氯仿／甲醇(9∶1，v／v)溶液，在减压下蒸馏除去5mL，在生成的薄膜中添加生理盐水5mL，用0.22μm孔径的过滤器处理后，用0.05μm孔径的过滤器进一步处理得到脂质体。
·大鼠
试验中使用F344／Jcl34-36周9L的大鼠。其为使用脑肿瘤细胞9L在皮肤下带癌(神经胶质瘤)的大鼠。肿瘤组织使用肿瘤直径约30mm的组织。刮去肿瘤处的毛后，将ICG水溶液或LP-ICG-8由颈静脉分别给药500μL。给药5分钟后，进行荧光观察(瑞穗医科工业，Hyper Eye Medical System，激发波长760～780nm，荧光波长>780nm)(图3)。大鼠和摄像头的距离设为50cm。
由图3可知，在使用ICG水溶液(ICG)的情况下，色素扩散，ICG未蓄积在肿瘤组织中，但在使用LP-ICG-8的情况下，脂质双膜中含有ICG-8的脂质体(LP-ICG-8)蓄积在肿瘤组织中。
(3)光动力疗法／光热疗法
·ICG水溶液(ICG)(2.5mg／mL)
以成为2.5mg／mL的方式使ICG溶解于纯水中。
·脂质双膜中具有ICG-8的脂质体分散液(LP-ICG-8)
制备含有源自蛋黄的磷脂酰胆碱(10.0mM)、胆甾醇(1.0mM)、聚乙二醇修饰型磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)(5.0×10-1mM)、ICG-8(3.2×10-2mM)的氯仿／甲醇(9∶1，v／v)溶液，在减压下蒸馏除去10mL，在生成的薄膜中添加ICG水溶液(2.5mg／ml)10mL，用0.22μm孔径的过滤器处理后，用0.05μm孔径的过滤器进一步处理得到脂质体。
·大鼠
在F344／Jcl34-36周9L大鼠中使用肿瘤直径约30mm的肿瘤组织。在刮去肿瘤处的毛后，肿瘤内给药2mL的各溶液。给药后，利用光照射装置(东京医研，超激光，Hyper5000)以600～1600nm的波长、5W输出功率光照射20分钟。此时，向肿瘤内部插入温度计进行皮肤表面温度的测定，在皮肤表面为45℃时，将乙醇擦在表面，防止皮肤的烧伤。将大鼠皮下肿瘤模型中的光动力疗法／光热疗法的概要示于图4，将肿瘤内给药LP-ICG-8或ICG水溶液之后及48小时后的肿瘤的照片示于图5，将用本领域技术人员公知的方法进行了苏木精／伊红(HE)染色的各自的组织切片的照片示于图6。由图5可知，在使用LP-ICG-8的情况下，与使用ICG水溶液的情况相比，肿瘤显著萎缩，另外，由图6可知，死细胞占总细胞的比例增大。
(4)利用近红外光控制内包药剂的释放的确认
制备含有ICG-8(3.2×10-2mM)、源自蛋黄的磷脂酰胆碱(10.0mM)的氯仿／甲醇(9／1，v／v)溶液，取其中的3mL在减压下进行溶剂蒸馏除去。对生成的薄膜添加荧光素水溶液(5.0×10-2mM)1.5mL使薄膜溶胀，然后，添加作为荧光消光剂的氯化钴水溶液(2.0mM)1.5mL。利用荧光分光光度计(日本分光FP-6600)，采用激发波长496nm，得到荧光光谱。然后，重复约1W的808nm激光的1分钟照射5次，同样地测定荧光光谱(图7)。由图7确认到由于光照射后的荧光强度降低，因此本发明的脂质体复合物中所内包的荧光素因光照射使脂质体的开裂，从而被缓释。
(5)利用近红外光的顺式铂氨(CDDP)的释放控制
·含有ICG及顺式铂氨(CDDP)的水溶液(ICG+CDDP)
以成为3.2mM的方式使25mg的ICG溶解于生理盐水9ml中，与1ml的顺式铂氨(Randa注册商标，日本化药)混合。
·脂质双膜中具有ICG-8的脂质体中含有内包顺式铂氨的脂质体复合物的水溶液(LP-ICG-8-CDDP)
制备混合1mL的CDDP、及含有ICG-8(3.2mM)的生理盐水9mL而成的水溶液。另一方面，制备采用源自蛋黄的磷脂酰胆碱(10.0mM)、胆甾醇(1.0mM)、聚乙二醇修饰型磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)(5.0×10-1mM)、ICG-8(3.2×10-1mM)的氯仿／甲醇(9∶1，v／v)溶液，在减压下蒸馏除去其中10mL，生成薄膜。在该薄膜中添加含有顺式铂氨的ICG溶液10mL，用0.22μm孔径的过滤器处理后，用0.05μm孔径的过滤器进一步处理得到脂质体复合物。
·大鼠
在F344／Jcl34-36周9L的大鼠中使用肿瘤直径约30mm的肿瘤组织。刮去肿瘤处的毛后，肿瘤内给药2mL的各溶液。给药后利用光照射装置(东京医研，超激光，Hyper5000)以600～1600nm的波长、5W输出功率光照射20分钟。此时，向肿瘤内部插入温度计进行皮肤表面温度的测定，在皮肤表面为45℃时，将乙醇擦在表面，防止皮肤的烧伤。图8表示肿瘤内给药ICG+CDDP或LP-ICG-8-CDDP之后及48小时后的肿瘤的照片，另外，图9表示HE染色的各自的组织薄膜的照片。
由图8可知，在使用LP-ICG-8-CDDP的情况下，与使用ICG+CDDP的情况相比，肿瘤显著萎缩，另外，由图9可知，死细胞占总细胞的比例增大。
[实施例3]ICG-8的单线态氧测定
利用以下的测定确认ICG-8具有单线态氧产生能力。其结果判明，ICG-8具有为了进行光动力疗法所需的单线态氧产生能力。
测定条件如下所述。
采用激发波长690nm、平均输出功率20mW、重复30Hz、脉冲宽度约10nm、使用DCM的色素激光进行激发。
检测使用冷却至-80℃的带门近红外像增强器(NIR-PII)以分光器(焦点距离250mm，光栅600L／mm)分光，测量激发30μ秒后～200μ秒。
将结果示于图10。在图10中，红线表示源自ICG-8的单线态氧(1270nm)的产生，蓝线表示利用β-胡萝卜素(浓度：4μM)的单线态氧的补足。
[实施例4]吲哚菁绿色素ICG-11的合成
作为本发明的吲哚菁绿色素的ICG-11按照下述的方案合成。
[溴化2，3，3-三甲基-1-(2-羧基乙基)-4，5-苯并吲哚(6)]
在25ml四口烧瓶中混合2，3，3-三甲基-4，5-苯并-3H-吲哚鎓(1)(2.3g，11mmol)、3-溴-1-丙酸(1.5g，9.8mmol)及乙腈(10ml)，在65℃下搅拌16小时后，冷却至室温，排出到醋酸乙酯(50ml)中。滤取结晶并用丙酮喷洗得到的结晶，滤取后，风干，得到灰色结晶状的目标物(6)(1.68g，47％)。
[4-(2-((1E，3E，5E，7E)-7-(3-(2-羧基乙基)-1，1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)庚-1，3，5-三烯基)-1，1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸(7)(ICG-6)]
在25ml四口烧瓶中混合化合物(6)(0.55g，1.5mmol)、实施例1中记载的化合物(3)(0.80g，1.5mmol)及吡啶(8ml)，在50℃下搅拌45分钟后，冷却至室温。在减压下浓缩反应液，在残留物中加入水(20ml)并搅拌，接着一点点地加入10％盐酸并搅拌片刻(pH3～4)。滤取结晶后，风干，得到粗生成物(1.12g)。在得到的结晶中加入甲醇／氯仿(5／1)20ml，加热搅拌，冷却后滤取结晶。用甲醇／氯仿使得到的结晶重结晶，滤取后，风干，得到深绿色结晶状的ICG-6(0.38g，37％)。
LC-MS的主要的分子离子峰为m／z=687(负)。另外，乙醇中的最大吸收波长、摩尔吸光系数分别为λmax=786nm、ε=1.86×105。
[4-(2-((1E，3E，5E，7E)-7-(3-(2-(1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇氨基羧基)乙基)-1，1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)庚-1，3，5-三烯基)-1，1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-3-基)丁烷-1-磺酸(8)(ICG-11)]
在25mL四口烧瓶中装入ICG-6(7)(0.5g，0.73mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.17g，1.5mmol)、乙腈(3mL)及氯仿(10mL)，对容器内进行氮置换。保持在2℃的同时经10分钟滴加N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)(0.30g，1.5mmol)和氯仿(2mL)的混合液。慢慢降温至室温，搅拌30分后，过滤反应液。保持在25℃以下的同时减压浓缩滤液，用醋酸乙酯将残留物拆开并过滤收集结晶后，用丙酮喷洗，由此得到ICG-11前体(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的粗结晶(0.66g)。接着，将得到的结晶(0.66g，ca.0.73g)和氯仿(10mL)装入25mL四口烧瓶中，在氮气氛下，经20分钟滴加1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE∶NOF CORPORATION制COATSOMEME-8181)(0.54g，0.73mmol)、三乙胺(0.10g，1.0mmol)及氯仿(5mL)的混合液。在室温下搅拌2.5小时，过滤反应液后，浓缩滤液，用快速柱(SiO2，CHCl3／MeOH=4／1～3／1)精制残留物，由此得到ICG-11(8)(0.37g，36％)。
[实施例5]
(1)ICG-11的荧光光谱特性
在极性不同的水溶液中研究ICG-11的物性并与ICG对照。其结果判明，ICG-11发出比ICG强的荧光。
(a)在作为极性溶剂的甲醇中的比较
判明ICG-11与ICG相比，发出1.5倍强度的荧光。
(b)在作为非极性溶剂的氯仿中的比较
判明ICG未发出荧光，相反ICG-11发出充分的强度的荧光。
将结果示于图11。在图11中，黑线及红线分别表示关于ICG-11(浓度：1μM)及ICG(浓度：1μM)的结果。
(2)ICG-11的单线态氧测定
通过以下的测定确认ICG-11具有单线态氧产生能力。其结果判明，ICG-11具有为了进行光动力疗法所需的单线态氧产生能力。
测定条件如下所述。
采用激发波长690nm、平均输出功率20mW、重复30Hz、脉冲宽度约10nm、使用DCM的色素激光进行激发。
检测使用冷却至-80℃的带门近红外像增强器(NIR-PII)以分光器(焦点距离250mm，光栅600L／mm)分光，测量激发30μ秒后～200μ秒。
将结果示于图12。在图12中，红线表示源自ICG-11的单线态氧(1270nm)的产生，蓝线表示利用β-胡萝卜素(浓度：6μM)的单线态氧的补足。
(3)ICG-11的产热能力
通过以下的条件测定ICG-11具有的产热能力。其结果判明，ICG-11具有为了进行热疗法所需的产热能力(在37℃～43℃间的组织温度上升)。
测定条件如下所述。
采用激发波长808nm、输出功率0.5W／m2进行激发。间隔1秒进行温度测定。
将结果示于图13。在图13中，黑线、红线、蓝线及绿线分别表示ICG-11浓度为0μM、1μM、2μM及4μM时的结果。
(4)脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)的制作方法
(4-a)成形方法
通过改变ICG-11和作为脂质双膜的主要成分的二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)的混合比，研究ICG-11在脂质体中的可搭载量。为了比较研究，研究ICG的可搭载量。
利用氯仿／甲醇(9∶1，v／v)溶液溶解DOPC(10mM)、胆甾醇(5mM)、聚乙二醇修饰型磷脂酰乙醇胺(PEG-PE，0.5mM)、及ICG-11(0～5mM)或ICG(0～0.5mM)，对一部分进行减压干燥，在生成的薄膜中添加生理盐水，用孔径100nm的过滤器处理而得到脂质体分散液。
(4-b)搭载量
通过以下的条件测定ICG-11形成脂质体时在脂质双膜中的导入量。
利用凝胶过滤柱(PD-10，GE公司制)分离定量导入有ICG-11或ICG的脂质体和未导入脂质双膜而游离在脂质体分散液中的ICG-11或ICG(图14)。
其结果判明，ICG-11能够以与作为脂质双膜的主要成分的DOPC最大为ICG-11∶DOPC=1∶2的比例导入(图14a)。
另一方面，判明ICG能够以与作为脂质双膜的主要成分的DOPC最大为ICG∶DOPC=1∶100的比例导入(图14b-(1))。
确认到在以ICG∶DOPC=1∶40(图14b-(2))、ICG∶DOPC=1∶20(图14b-(3))的比例形成脂质体时，未导入脂质双膜中的ICG在分散液中增加。
(4-c)粒径
通过以下的条件测定ICG-11形成脂质体时在脂质双膜中的导入量和粒径的关系。
以各种比例在脂质体中导入ICG-11，使用动态光散射测定装置SZ-100测定脂质双膜中的各含量(0.0、0.5、1.0、5.0、10.0％)中的粒径。
其结果，确认伴随ICG-11的含量的增加，脂质体的粒径分布(图15)变宽，并且算术平均直径(表1)也增加，但任一情况均在满足EPR效应的条件的范围内。
[表1]ICG-11含量的不同导致的脂质体的算术平均直径
(4-d)电动电位
通过以下的条件测定ICG-11形成脂质体时在脂质双膜中的导入量和电动电位的关系。
以各种比例在脂质体中导入ICG-11，使用动态光散射测定装置SZ-100测定脂质双膜中的各含量(0.0、3.1、6.3、12.5、25.0％)中的粒径。
其结果，确认到伴随ICG-11的含量的增加，脂质体的电动电位的绝对值(表2)增加，形成稳定的脂质体。
[表2]ICG-11含量的不同导致的脂质体的电动电位
(5)脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)的UV光谱特性
研究脂质双膜中导入有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)所具有的UV光谱特性，并与ICG对照。其结果判明，通过ICG-11导入到脂质双膜中，吸收光谱在比ICG更靠长波长侧发生变化。
将结果示于图16。在图16中，黑线及红线分别表示关于LP-ICG-11(浓度：10μM)及ICG(浓度：10μM)的测定结果。
(6)脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)的荧光光谱特性
研究脂质双膜中导入有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)所具有的荧光光谱特性，并与ICG对照。其结果，通过ICG-11导入到脂质双膜中，荧光光谱在比ICG更靠长波长侧发生变化，并且确认到发光强度的上升。
将结果示于图17。在图17中，黑线及红线分别表示关于LP-ICG-11(浓度：1μM)及ICG(浓度：1μM)的测定结果。
(7)脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)的产热能力
通过以下的条件测定LP-ICG-11具有的产热能力。其结果判明，LP-ICG-11具有为了进行热疗法所需的产热能力(在37℃～43℃间的组织温度上升)。
(7-a)试管内
测定条件
在试管内填充1.5mL的溶液，采用激发波长808nm、输出功率0.5W／m2进行激发。间隔1秒进行温度测定。
将结果示于图18。在图18中，黑线、红线及蓝线分别表示关于LP-ICG-11、ICG及对照(生理盐水)的测定结果。
(7-b)生物体内
测定条件
由裸鼠的尾静脉给药LP-ICG-11或生理盐水，其3天后，采用激发波长800nm、输出功率0.22W／m2进行激发。间隔1秒进行温度测定。
将结果示于图19。在图19中，黑线及蓝线分别表示关于LP-ICG-11及对照(生理盐水)的测定结果。
(8)脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)的体内分布变化
(8-a)肿瘤和体表的比较
通过随着时间变化将LP-ICG-11具有的肿瘤特异性蓄积能力与体表相比来研究。LP-ICG-11由裸鼠的尾静脉给药，在1小时后、1天后、2天后、3天后测定分布状况。其结果，由给药1天后观察到肿瘤中的特异性蓄积，随着时间的流逝，特异性蓄积变得显著。
将结果示于图20。
(8-b)肿瘤和各脏器的比较
通过随着时间变化将LP-ICG-11具有的肿瘤特异性蓄积能力与其它的脏器相比来研究。LP-ICG-11由裸鼠的尾静脉给药，在1小时后、1天后、2天后、3天后测定分布状况。其结果，由给药1天后观察到肿瘤中的特异性蓄积，随着时间的流逝，特异性累积变得显著。
将结果示于图21。
(9)脂质双膜中具有ICG-11的脂质体分散液(LP-ICG-11)的治疗效果
(9-a)大鼠：脑肿瘤
利用大鼠(F344／Jcl)的脑肿瘤模型研究LP-ICG-11所具有的抗癌效果。
治疗方法
由尾静脉注射给药LP-ICG-11(含有17.5mg)，以以下的方案进行治疗。
1疗程／2周的治疗计划
第1天(星期一)：LP-ICG-11给药
第1天(星期一)：近红外光照射(800nm LED灯、0.25W／m2、20分钟)
第2天(星期二)：近红外光照射(800nm LED灯、0.25W／m2、20分钟)
第3天(星期三)：近红外光照射(800nm LED灯、0.25W／m2、20分钟)
第5天(星期五)：利用MRI进行肿瘤测定
第12天(星期五)：利用MRI进行肿瘤测定
治疗经过
摘出治疗结束后的大鼠的脑，利用近红外线荧光观测装置确认LP-ICG-11在肿瘤组织中的特异性蓄积，结果如图22所示，可以确认LP-ICG-11仅蓄积在肿瘤组织中。
治疗结果
通过LP-ICG-11的抗癌效果，通常4周致死，但带来7周以上的延寿效果(图23)。虽然未达到完全恢复，但可带来有效的治疗效果。在图23中，蓝线、红线及紫线分别表示对照、近红外线照射、LP-ICG-11·近红外线照射。
(9-b)猫：顶浆分泌腺癌、肺及结肠转移
利用顶浆分泌腺癌／肺及结肠转移的猫(猫种类：杂种，年龄：18岁)研究LP-ICG-11具有的抗癌效果。
既往病史
并发以顶浆分泌腺癌为原发灶的肺及结肠转移癌。
治疗方法
由静脉注射给药LP-ICG-11(含有17.5mg)，以以下的方案进行治疗。
1疗程／2周的治疗计划
第1天(星期一)：给药LP-ICG-11
第1天(星期一)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第3天(星期三)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第5天(星期五)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第8天(星期一)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第10天(星期三)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第12天(星期五)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
治疗经过(图24)
第1疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。血便量减少。
第2疗程：确认肺转移肿瘤的一部分消失(图24、下)。
第3疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第4疗程：维持好转状态。在家中死亡。
治疗结果
判明通过LP-ICG-11的抗癌效果，确认到肺转移肿瘤的一部分消失及来自结肠的出血减少，并且可长期维持好转状态。
得到显示缓和医疗中的有效性的结果。
(9-c)狗：肛周腺癌／淋巴结转移
利用肛周腺癌／淋巴结转移的狗(狗种类：蝴蝶犬，年龄：11岁)研究LP-ICG-11所具有的抗癌效果。
既往病史
并发以肛周腺癌为原发灶的腰下淋巴结转移。
治疗方法
由静脉注射给药LP-ICG-11(含有17.5mg)，以以下的方案进行治疗。
1疗程／2周的治疗计划
第1天(星期一)：LP-ICG-11给药
第1天(星期一)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第3天(星期三)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第5天(星期五)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第8天(星期一)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第10天(星期三)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第12天(星期五)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
治疗经过(图25及图26)
第1疗程：可自主排便(PR：部分响应)(图25)。
第2疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)(图26)。
根据与饲主的协议，利用手术进行淋巴结肿瘤的减容积，但第二天死亡。
治疗结果
判明通过LP-ICG-11的抗癌效果，肿瘤缩小，由此可自主排便，带来QOL的提高，并且可长期维持好转状态。
得到显示QOL的提高和姑息医疗中的有效性的结果。
(9-d)猫：鼻腔／眼窝肿瘤(淋巴瘤)
利用鼻腔／眼窝肿瘤的猫(猫种类：杂种，年龄：15岁)研究LP-ICG-11具有的抗癌效果。
治疗方法
由静脉注射给药LP-ICG-11(含有17.5mg)，以以下的方案进行治疗。
1疗程／2周的治疗计划
第1天(星期一)：LP-ICG-11给药
第1天(星期一)：近红外光照射(飞鸟medical公司制，DVL-30D)
第3天(星期三)：近红外光照射(飞鸟medical公司制，DVL-30D)
第5天(星期五)：近红外光照射(飞鸟medical公司制，DVL-30D)
第8天(星期一)：近红外光照射(飞鸟medical公司制，DVL-30D)
第10天(星期三)：近红外光照射(飞鸟medical公司制，DVL-30D)
第12天(星期五)：近红外光照射(飞鸟medical公司制，DVL-30D)
治疗经过(图27～30)
第1疗程：病情发展(PD：病情进展)。
第2疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第3疗程：确认到治疗效果(PR：部分响应)。
治疗结果
由第1疗程并用高浓度维生素C疗法、丸山疫苗疗法、臭氧疗法，由此，LP-ICG-11的抗癌效果显著，带来有效的治疗效果。
(9-e)狗：肾脏肿瘤
利用肾脏肿瘤的狗(狗种类：奇瓦瓦，年龄：5岁)研究LP-ICG-11所具有的抗癌效果。
治疗方法
由静脉注射给药LP-ICG-11(含有17.5mg)，以以下的方案进行治疗。
1疗程／2周的治疗计划
第1天(星期一)：LP-ICG-11给药
第2天(星期二)：近红外光照射(800nm LED灯，0.25W／m2，20分钟)
第5天(星期五)：近红外光照射(800nm LED灯，0.25W／m2，20分钟)
第9天(星期二)：近红外光照射(800nm LED灯，0.25W／m2，20分钟)
第12天(星期五)：近红外光照射(800nm LED灯，0.25W／m2，20分钟)
治疗经过
第1疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第2疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第3疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第4疗程：确认到低回波区域扩大，出现治疗效果(图31)。另外，根据血液检查的结果也检查到(表3)症状的改善(PR：部分响应)。
治疗结果
通过LP-ICG-11的抗癌效果，确认到肾脏肿瘤的缩小，并且健康状况得到改善。虽然未达到完全恢复，但带来有效的治疗效果。
[表3]肾脏肿瘤的血液检查的结果
1疗程 2疗程 3疗程 4疗程
W b c 277 128 96 101×102／uL
R b c 689 616 553 612×104／uL
H g b 13.3 12.1 10.6 11.6g／d1
H c t 43.6 39.2 35.3 39.9％
M c v 63.3 63.6 63.8 63.6fL
M c h 19.3 19.6 19.2 19.0pg
M c h c 30.5 30.9 30.0 29.8g／dL
P l t 62.1 69.7 49.3 28.9×104／uL
L y 26 25 29 19
M o 9 7 4
E o 1 1
G r 251 94 59 77
(9-F)狗：软组织肉瘤
利用右前臂／软组织肉瘤的狗(狗种类：杂种，年龄：6岁)研究LP-ICG-11所具有的抗癌效果。
既往病史
实施右前臂的软组织肉瘤的摘出手术。
每周1次实施2个月、两周1次实施2个月的ICG局部注射的光热疗法，在即将实施下一疗程时复发，因此，再次实施摘出手术(不完全摘出)。
治疗方法
由静脉注射给药LP-ICG-11(含有17.5mg)，以以下的方案进行治疗。
1疗程／2周的治疗计划
第1天(星期一)：LP-ICG-11给药
第1天(星期一)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第3天(星期三)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第5天(星期五)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第8天(星期一)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第10天(星期三)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
第12天(星期五)：近红外光照射(东京医研公司制，超激光，Hyper5000)
治疗经过(图32)
第1疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第2疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第3疗程：维持好转状态(SD：病情稳定)。
第4疗程：在再次手术的近侧的缝合线状的皮肤上处出现小肿瘤，慢慢地肥大(PD：病情进展)
第5疗程：小肿瘤溃疡，进一步肥大后，坏死(PR：部分响应)。
治疗结果
通过LP-ICG-11的抗癌效果，诱导软组织肉瘤坏死，虽然未达到完全恢复，但带来有效的治疗效果。
将本说明书中引用的全部的出版物、专利及专利申请直接作为参考引入到本说明书中。
工业上的可利用性
根据本发明，可以提供能够在任意的时刻非侵入性地缓释药物的药物递送系统。

Claims (14)

1.一种脂质体复合物，所述脂质体复合物含有结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质，且在脂质体内含有药剂，所述光吸收化合物选自在近红外区域具有吸收波长的吲哚菁绿色素，所述脂质体复合物在光热疗法和/或光动力疗法中使用。
2.如权利要求1所述的脂质体复合物，其中，所述脂质体膜构成物质由脂质构成。
3.如权利要求1所述的脂质体复合物，其中，所述结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质由下述式(I)表示，
A-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1 (I)
其中，
A为光吸收化合物；
B1及B2分别独立地为-CH2-、-CH＝CH-、-O-、-S-、-NH-、-CO-、-COO-、-OCO-、-NHCO-、-CONH-、-SO2-、-SO2NH-、-NHSO2-、-PO4M-(M为碱金属离子)或-(CH2CH2O)c-，c为1～10的整数；
D为-CHE2-、-NE2-、-C6H4E2-、-CH2CH(OCOE2)-CH2OCO-或-CHE2-CH2OCO-；
E1为碳原子数8～18的取代或未取代的烃基；
E2为氢或碳原子数8～18的取代或者未取代的烃基；
a为0～4的整数，b为0～6的整数。
4.如权利要求3所述的脂质体复合物，其中，B1及B2分别独立为-CH2-、-CH＝CH-、-O-或-S-，D为-CHE2-，E2如权利要求3所述。
5.如权利要求4所述的脂质体复合物，其中，B1及B2为-CH2-。
6.如权利要求1所述的脂质体复合物，其中，所述结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质由下述式(II-1)表示：
其中，X1及X2各自为-C(CH3)2-、O或S，Y1及Y3各自为氢或OCH3，Y2及Y4各自为氢，或Y1和Y2、及Y3和Y4各自任选地分别与这些基团所键合的环一起缩合而形成苯环，Q1及Q2各自为氢或任选地键合而形成6元环，R1～R3的任一个为-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1，式-(CH2)a-B1-(CH2)b-B2-D-E1中的符号与权利要求3中所述的式(I)中的相应符号含义相同，P1为作为一价阴离子的氯离子、溴离子或碘离子，且R1～R3各自为选自由以下的基团构成的组中的基团，
其中，Z1或Z2为-O-、-NH-、-S-、-SO2-、-CH＝CH-、-SO2NH-、-NHSO2-、-CONH-、-NHCO-、-CO-、-COO-、-OCO-或-C6H4-，P2为作为一价阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，M为作为一价阳离子的氢离子、锂离子、钠离子或钾离子，R4为碳原子数1～18的烷烃、烯烃或炔烃，n或m为0～22的整数，I为1～22的整数，p为0～17的整数，且x为2～2000的整数。
7.如权利要求1所述的脂质体复合物，其中，所述结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质由下述式5表示：
8.如权利要求1所述的脂质体复合物，其中，所述结合于光吸收化合物的脂质体膜构成物质由下述式表示：
9.如权利要求1～8中任一项所述的脂质体复合物，所述脂质体复合物在给药该脂质体复合物后对患部进行光照射的肿瘤的治疗方法中使用。
10.如权利要求1～8中任一项所述的脂质体复合物，所述脂质体复合物在给药该脂质体复合物后对患部进行光照射而产生单线态氧的肿瘤的治疗方法中使用。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的脂质体复合物，其中所述药剂是抗癌剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的脂质体复合物在制备用于光热疗法或光动力疗法的组合物中的用途。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的脂质体复合物在制备用于治疗肿瘤的组合物中的用途，其中在给药所述组合物之后对患部进行光照射。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的脂质体复合物在制备用于治疗肿瘤的组合物中的用途，其中在给药所述组合物之后对患部进行光照射而产生单线态氧。
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