CN117003659A - 一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用 - Google Patents

一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用。该可离子化脂质的结构如式I所示，其主要由长碳链、可生物降解的酯键等结构组成；利用离子化脂质或其药学上可接受的盐及核酸制备的脂质纳米颗粒无毒，可生物降解，递送核酸药物、核酸疫苗，实现高效包载核酸分子，高效胞内蛋白质翻译和表达，具有高效的体内和体外转染效率。本发明对于丰富可离子化脂质的种类，递送核酸药物，预防或治疗疾病具有重要意义。

Description

一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用
技术领域
本发明涉及一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用，属于医药技术领域。
背景技术
据生物学中心法则，由DNA转录的核酸在细胞质内表达蛋白质。这一生物学过程可以用于治疗各种疾病。但是，核酸分子不稳定，很容易被体液中的酶降解，且因为携带大量负电荷，难以进入细胞。因此，核酸分子的递送是一个难题。
含阳离子的载体可以有效负载核酸分子，其原理是利用载体的阳离子与核酸分子的阴离子的静电相互作用，组装成纳米载体，包括脂质体、聚合物纳米粒、胶束等。这些阳离子载体用于体外核酸转染有一定效果，但常显示细胞毒性，用于体内有潜在的毒副作用。近年来，由可离子化脂质等构建的脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle,LNP)受到青睐。可离子化脂质在中性条件下以非离子形式存在，可以显著降低LNP载体的毒性，为LNP递送核酸分子奠定了理论基础。得益于此，这类LNP载体递送的核酸新冠疫苗已经在临床得到应用。科学家仔细研究发现，可离子化脂质作为LNP载体的主要成分，其结构的细微变化会显著影响核酸的包载率，LNP纳米载体的溶酶体逃逸效率，以及负载核酸在细胞内的翻译表达效率，进而显著影响疾病预防和治疗效果。因此，基于可离子化脂质的LNP的安全性、功效和特异性仍有待提高。尤其是，需要开发有助于将核酸递送至细胞的改进的可离子化脂质及其组合物，以达到预防或治疗疾病的目的。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供了一种用于递送核酸的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，本发明的第二目的是提供一种包含该可离子化脂质或其药学上可接受的盐的组合物，本发明的第三目的是提供该可离子化脂质或其药学上可接受的盐或该组合物在治疗疾病或病症的核酸药物、核酸疫苗中的应用。
技术方案：本发明的一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述可离子化脂质的结构如式I所示，
其中，X是-C(＝O)O-；n是5或6；Y是(HO(CH2)2)2N(CH2)m-，m是2或3，且m+n＝8，即所述可离子化脂质结构中两个氮原子之间的碳原子数m与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数(n+1)之和是9；R1是C15～18支链烷基，R2是C15～18支链烷基或C11～14的直链烷基。
本发明可离子化脂质或其药学上可接受的盐是构成核酸递送载体脂质纳米粒(LNP)的关键组分，决定了通过静电作用包载携带负电荷的核酸分子的效率，决定了通过疏水脂质与细胞膜作用促进包载核酸的LNP进入细胞的效率，决定了LNP入胞后通过可离子化脂质质子化而溶胀促进核酸分子从溶酶体中逃逸的效率，进而决定了核酸分子的胞内翻译表达或与胞内生物大分子的相互作用。同时，可离子化脂质决定了脂质纳米粒的安全性。可见，可离子化脂质通过各种静电作用、疏水力作用、质子化作用等影响其构建的LNP包载核酸分子的效率、核酸分子的递送效率、核酸分子的生物功能，非常复杂。因此，可离子化脂质的结构与其为主构建的LNP包载的核酸(比如：mRNA)在体内的表达之间无确切的对应关系，规律性不强。所以，结构差别很小的可离子化脂质构建的LNP在体内递送mRNA及其表达的差异会很大。特别是，可离子化脂质的结构与细胞内转染效率、细胞毒性以及在动物体内的表达之间也无确切的对应关系。结构差异很小的化合物，在转染效率、细胞毒性、细胞内的高表达方面可能差异非常大。因此，筛选合适的可离子化脂质，同时具有高包载率、高转染和表达效率和低细胞毒性是非常困难的事情，常常不得不进行广泛和仔细的筛选，尽量在小范围总结出有参考价值的规律。
本发明作为包载核酸分子的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，首先，叔胺结构是基本条件，作为可离子化结构，可以通过质子化后与带负电荷的核酸分子通过静电作用强烈结合；其次，可离子化脂质需要具有如下结构：
强极性头—极性渐变区—非极性尾
强极性头部一方面通过叔胺结构质子化与带负电荷的核酸分子通过静电作用强烈结合，另一方面可以与核酸分子形成若干氢键，与核酸分子相互交叠交叉，形成更好的结合，形成亲水性小微区。
非极性尾部主要功能是在亲水性微区周围形成脂质保护外壳，并在胆固醇类分子协助下稳定。脂质外壳的厚度与非极性尾部的长度，脂质外壳的破裂与非极性尾部的长度和规整性等相关，影响mRNA的逃逸和表达。
极性渐变区是从强极性头到非极性尾之间的中间部分，衔接亲水微区和脂质外壳，其长度对于保护亲水微区内的核酸、维持脂质外壳的稳定、促进溶酶体内核酸的逃逸至关重要。
本发明可离子化脂质结构中，二乙醇胺结构是强极性头，可以通过静电作用和氢键作用，与核酸相互交叠、紧密结合，形成亲水微区；C15～C18的支链烷基或C11～C14的直链烷基非极性尾部与胆固醇一起构成脂质外壳，起到保护亲水微区的作用；与强极性头相连的第一个碳原子开始到酯键作为中间部分，是从强极性头到非极性尾之间的极性渐变区，间隔衔接亲水微区和脂质外壳。极性渐变区的长度与脂质纳米粒结构的稳定性、溶酶体内核酸逃逸和蛋白表达有关。研究发现，两个氮原子之间的碳原子数m与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数(n+1)之和为9时，不仅有最高的核酸包载率，稳定性，而且显示最优的核酸递送和蛋白表达效果。
进一步地，所述R1选自：
进一步地，所述R2选自：
进一步地，所述可离子化脂质选自：
本发明可离子化脂质U-101～U112，相对于现有技术的其它化合物，能够以高的细胞转染效率、低细胞毒性或者无毒性以及在体内的高表达和持续表达来递送核酸，取得了预料不到的技术效果。
本发明提供的可离子化脂质U-101～U112，头部是两个羟基的二乙醇胺结构，可离子化脂质中间部分结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和是9为优。尾端是15～18个碳原子的支链烷基，或11～14个碳原子的直链烷基使可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于包载保护核酸和LNP入胞。同时使质子化后的可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于包载核酸和LNP溶酶体逃逸。尤其是，可离子化脂质结构中两个氮原子之间的碳原子数为3，羧酸酯羧酸部分的碳原子数为6最优。
本发明所述一种组合物，所述组合物包括治疗剂或预防剂及用于递送治疗剂或预防剂的载体，其中，所述载体包括本发明所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐中的一种或多种。
进一步地，所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐优选U101～U-112中的一种。
进一步地，所述治疗剂或预防剂包括小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、DNA等核酸分子中的一种或多种；
进一步地，所述载体与治疗剂或预防剂的质量比为：1～100:1。
进一步地，所述组合物为脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50nm～300nm。
进一步地，所述脂质纳米颗粒的多分散指数≤0.40。
进一步地，所述载体还包括结构脂质，所述结构脂质为胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、谷固醇、麦角固醇、非甾醇、皮质类固醇、熊果酸、番茄碱及α-生育酚中的一种或多种。
进一步地，所述载体还包括中性脂质，所述中性脂质为神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油及其衍生物中的一种或多种。
进一步地，所述载体还包括聚合物共轭脂质，所述聚合物共轭脂质为PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的二烷基胺及PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。
进一步地，所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐、结构脂质、中性脂质及聚合物共轭脂质的摩尔比为(15～60)：(15～45)：(5～30)：(0.5-5)。
本发明所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐或本发明所述组合物在制备治疗疾病或病症的核酸药物、核酸疫苗中的应用。
进一步地，所述疾病或病症包括感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管疾病、肾血管疾病、代谢性疾病。
进一步地，所述核酸药物、核酸疫苗可用于动物或人。
进一步地，所述应用时经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、体表、鼻内或通过吸入施用。
进一步地，所述核酸药物、核酸疫苗还包括药物常用的赋形剂或稀释剂中的一种或多种。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
本发明提供的可离子化脂质化合物由强极性头—极性渐变区—非极性尾构成，二乙醇胺强极性头部通过静电作用和氢键作用与核酸分子强烈结合，形成亲水性小微区；非极性尾部用于形成脂质保护外壳；极性渐变区是从强极性头到非极性尾之间的中间部分，两个氮原子之间的碳原子数m与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数(n+1)之和为9时，极性渐变区的长度最为合适，不仅有利于最高核酸包载率，稳定性，而且维持脂质外壳的稳定，促进溶酶体内核酸逃逸，实现最优的核酸递送和蛋白表达效率。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体无毒，可生物降解性。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体高效递送核酸药物、核酸疫苗，实现高效包载核酸分子。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体与核酸分子的组合物高效溶酶体逃逸。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体与核酸分子的组合物高效胞内蛋白质翻译和表达。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体与mRNA核酸分子的组合物实现高效细胞内翻译，蛋白表达量达到市售可离子化脂质LNP载体的10倍左右，体内表达萤火虫荧光素酶Fluc蛋白的荧光强度是市售可离子化脂质LNP载体的100倍左右。
附图说明
图1为U-101～U-112、UR-301-UR-304、ALC-0315及SM-102等可离子化脂质制备的新冠S蛋白RBD mRNA-LNP经4℃存储28天后平均粒径变化图；
图2为U-101～U-112、UR-301-UR-304、ALC-0315及SM-102等可离子化脂质制备的新冠S蛋白RBD mRNA-LNP的细胞毒性图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实验中所用试剂、设备及其代号或缩写对照如下：
N,N-二环己基碳化二亚胺：DCC；二氯甲烷：DCM；4-二甲氨基吡啶：DMAP；四氢呋喃：THF；碳酸钾：K2CO3；碘化钾：KI；二硬脂酰甘油磷脂酰胆碱：DSPC；二异丙基乙胺：DIPE；二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000：DMG-PEG2000；二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000：DSPE-PEG2000；((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)：ALC-0315；8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯：SM-102；
薄层色谱法：TLC；飞行时间质谱仪：LC-TOF，AutoflexIII，美国BrukerDaltonics有限公司；核磁共振氢谱仪，Avance500，德国Bruker有限公司。
实施例1
(1)可离子化脂质U-101的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-101：
6-溴己酸(5.76g，29.8mmol)溶于DCM(100mL)中，加入DCC(7.50g，36.4mmol)，25℃下搅拌10min。2-己基癸烷-1-醇(6.0g，24.8mmol)和DMAP(170mg)加入到上述溶液中，室温搅拌反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离提纯(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物6-溴己酸-2’-己基癸酯(A)(8.5g，产率77.3％)。对6-溴己酸-2’-己基癸酯进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+419.34，理论值419.24；核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ3.97(d,J＝5.8Hz,2H)，3.40(t,J＝6.8Hz,2H)，2.33(t,J＝7.4Hz,2H)，1.92-1.82(m,2H)，1.64(dp,J＝15.4,6.4,5.2Hz,3H)，1.48(p,J＝7.6,7.1Hz,2H)，0.88(t,J＝6.9Hz,6H)。
6-溴己酸-2’-己基癸酯(1.05g，2.5mmol)溶于10mL THF中，加入乙腈(10mL)、N-3-氨基丙基-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、碘化钾(332mg，2.0mmol)，83℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(2-己基癸基)-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二己酸酯(U-101)354mg(产率35.3％，纯度97.3％)。
对U-101进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+839.785，理论值839.77。
对U-101进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ3.97(d,J＝5.8Hz,2H)，3.84-3.75(m,1H)，3.46-3.37(m,2H)，3.33(d,J＝6.2Hz,2H)，2.71-2.39(m,6H)，2.30(t,J＝7.5Hz,2H)，1.69-1.55(m,4H)，1.34-1.20(m,51H)，1.04(t,J＝7.0Hz,3H)，0.90-0.84(m,12H)。
(2)可离子化脂质U-102的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-102：
7-溴庚酸6.0g溶于100mL DCM中，加入7.50g DCC，25℃下搅拌10min。加入2-己基癸烷-1-醇6.0g和DMAP 170mg，室温反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离提纯(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物7-溴庚酸-2’-己基癸酯(B)9.1g(产率81.2％)。进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+433.48，理论值433.23。
7-溴庚酸-2’-己基癸酯1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈(10mL)、N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺160mg、碳酸钾550mg、碘化钾330mg，83℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(2-己基癸基)-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(U-102)380mg(产率39.6％，纯度97.8％)。
对U-102进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+853.46，理论值853.79。
对U-102进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ3.97(d,4H)，3.83-3.45(m,4H)，2.65-2.36(m,12H)，2.30(t,4H)，1.67-1.50(m,4H)，1.34-1.20(m,56H)，0.92-0.84(m,12H)。
(3)可离子化脂质U-103的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-103：
1)化合物C的合成
DCC 7.50g加入到含有5.76g 6-溴己酸的80mL DCM溶液中，室温下搅拌20min。然后，加入正十二醇4.6g和DMAP 170mg，反应过夜。反应完成后，旋蒸除去溶剂得到粗产物，经硅胶柱色谱法(洗脱液：甲醇/二氯甲烷＝1/20)提纯，得到无色油状产物6-溴己酸-1’-十二烷基酯(C)7.3g(产率75.3％)。
对C进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):δ3.96(d,J＝5.8Hz,2H)，3.38(t,J＝6.8Hz,2H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.90–1.81(m,2H)，1.62(dp,J＝15.4,6.4,5.2Hz,3H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,2H)，1.33-1.06(m,19H)，0.88(t,J＝6.9Hz,3H)。
2)化合物D的合成
实施例1(1)的化合物A(1.25g)溶于20mL乙醇中，加入3-氨基丙醇(1.5g)，升温至50℃，搅拌反应8h，薄层色谱监控反应进程。原料消耗完全后降至室温，旋干除去乙醇。粗品用DCM溶解，饱和食盐水洗涤三次，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱液：0-10％的甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄色油状物6-(3-羟丙基)氨基-己酸-O-(2’-己基)-1’-癸酯(D)1.18g(产率81.3％)。
对D进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):3.97(d,J＝5.8Hz,2H),δ3.66(d,J＝5.8Hz,2H)，2.65-2.55(m,4H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.67-1.60(m,5H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,2H)，1.33-1.06(m,26H)，0.88(t,J＝6.9Hz,6H)。
3)化合物E的合成
化合物D(0.87g)溶于10mL THF中，加入10mL乙腈、化合物C(1.16g)、K2CO3(0.550g)、KI(0.33g)，在85℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，反应液冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。浓缩液经硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物产物E(1.12g，产率68.7％)。
对E进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):3.96(d,J＝5.8Hz,4H),δ3.66(d,J＝5.8Hz,2H)，2.65-2.55(m,4H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.67-1.60(m,9H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,4H)，1.33-1.06(m,51H)，0.88(t,J＝6.9Hz,9H)。
4)化合物F的合成
冰水浴条件下，化合物E(0.83g)溶于2mL氯仿中。氩气保护下，将溶有二氯亚砜(SOCl2,0.35g)的5mL氯仿溶液逐滴加入到上述溶液中。滴加完成后升至室温，搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，旋蒸除去溶剂，获得粗产物。粗产物经硅胶柱层析提纯(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物F(0.72g，产率86.7％)。
对F进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):3.96(d,J＝5.8Hz,4H),δ3.72(d,J＝5.8Hz,2H)，2.64-2.53(m,4H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.98-1.94(m,2H)，1.67-1.60(m,7H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,4H)，1.33-1.06(m,51H)，0.88(t,J＝6.9Hz,9H)。
5)化合物U-103的合成
化合物F(0.43g)溶于10mL THF中，加入5mL乙腈、0.2mLN,N’-二异丙基乙胺、0.25g二乙醇胺盐酸盐，69℃下搅拌过夜。加入NaI(10mg)，在65℃下反应72h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤。滤渣用DCM洗涤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。浓缩液用硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物O-2-己基癸基-O’-十二烷基-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二己酸酯(U-103)0.26g(产率55.7％，纯度97.6％)。
对U-103进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+783.71,理论值783.26。
对U-103进行1H NMR分析(500MHz,CDCl3):δ3.96(d,J＝5.8Hz,4H),3.72-3.61(m,4H),3.02(d,J＝106.3Hz,6H),2.79-2.60(m,6H),2.34(dt,J＝14.6,7.2Hz,4H),1.94(s,2H),1.76-1.54(m,11H),1.50-1.06(m,48H),1.00-0.78(m,9H)。
(4)可离子化脂质U-104的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-104：
1)化合物G的合成
DCC 7.50g加入到80mL含有6.19g 7-溴庚酸的DCM溶液中，室温搅拌20min。加入正十二醇4.6g和DMAP 170mg，反应过夜。反应完成后，旋蒸除去溶剂，得到粗产物，经硅胶柱色谱法(洗脱液：甲醇/二氯甲烷＝1/20)提纯，得到无色油状产物7-溴庚酸正十二烷基酯(G)7.5g(产率73.6％)。
对化合物G进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):δ3.96(d,J＝5.8Hz,2H)，3.36(t,J＝6.8Hz,2H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.88–1.80(m,2H)，1.60(dp,J＝15.4,6.4,5.2Hz,3H)，1.44(p,J＝7.6,7.1Hz,2H)，1.35-1.06(m,21H)，0.88(t,J＝6.9Hz,3H)。
2)化合物H的合成
室温下将实施例1(2)的化合物B(1.29g)溶于20mL乙醇中，加入乙醇胺(1.2g)，升温至50℃，搅拌8h，薄层色谱监控反应进程。原料消耗完全后降至室温。旋干除去乙醇，用DCM溶解，用饱和食盐水洗涤三次，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经硅胶柱层析分离(洗脱液：0-10％的甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄色油状物7-(2-羟乙基)氨基-庚酸-O-(2’-己基)-1’-癸酯(H)1.01g(产率74.3％)。
对化合物H进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):3.97(d,J＝5.8Hz,2H),δ3.64(d,J＝5.8Hz,2H)，2.66-2.54(m,4H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.65-1.58(m,3H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,2H)，1.34-1.04(m,28H)，0.88(t,J＝6.9Hz,6H)。
3)化合物I的合成
化合物H(0.87g)溶于10mL THF中，加入乙腈(10mL)、化合物G(1.20g)、K2CO3碳酸钾(0.550g)、KI(0.33g)，在85℃下搅拌反应20h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物产物I1.23g(产率73.6％)。
对该化合物I进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):3.96(d,J＝5.8Hz,4H),δ3.66(d,J＝5.8Hz,2H)，2.68-2.54(m,4H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.65-1.58(m,7H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,4H)，1.36-1.04(m,55H)，0.88(t,J＝6.9Hz,9H)。
4)化合物J的合成
冰水浴条件下，化合物I(0.85g)溶于2mL氯仿中。氩气保护下，将溶有二氯亚砜(SOCl2,0.35g)的5mL氯仿溶液逐滴加入到上述溶液中。滴加完毕后，升至室温，搅拌反应20h。薄层色谱显示反应完成后，旋蒸除去溶剂，获得粗产物。粗产物经硅胶柱层析提纯(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物J 0.68g(产率79.4％)。
对J进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):3.96(d,J＝5.8Hz,4H),δ3.72(d,J＝5.8Hz,2H)，2.60-2.52(m,4H)，2.31(t,J＝7.4Hz,2H)，1.97-1.93(m,2H)，1.68-1.60(m,5H)，1.46(p,J＝7.6,7.1Hz,4H)，1.36-1.08(m,55H)，0.88(t,J＝6.9Hz,9H)。
5)化合物U-104的合成
化合物J(0.44g)溶于10mL THF中，加入5mL乙腈、0.2mLN,N’-二异丙基乙胺、0.25g二乙醇胺盐酸盐，70℃下搅拌过夜。加入NaI(10mg)，在65℃下反应72h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物O-2-己基癸基-O’-十二烷基-6,6'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(U-104)0.31g(产率64.4％，纯度98.1％)。
对U-104进行质谱分析，LC-TOF:m/z[M+H]+797.73，理论值797.29。
对对U-104进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3):δ3.96(d,J＝5.8Hz,4H),3.72–3.0(m,4H),3.04(d,J＝106.3Hz,6H),2.82–2.62(m,6H),2.32(dt,J＝14.6,7.2Hz,4H),1.94(s,2H),1.74–1.52(m,9H),1.50–1.06(m,52H),1.00–0.78(m,9H)。
(5)可离子化脂质U-105的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-105：
6-溴己酸5.76g溶于100mL DCM中，加入DCC7.50g，25℃下搅拌10min。加入1-辛基壬烷-1-醇6.0g和DMAP 170mg，室温反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物6-溴己酸-1’-辛基壬酯(K)8.3g，产率75.5％。
对6-溴己酸-1’-辛基壬酯进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+433.56，理论值433.26。
6-溴己酸-1’-辛基壬酯1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈(10mL)、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 500mg、KI 320mg，83℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(1-辛基壬基)-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二己酸酯(U-105)330mg(产率34.3％，纯度97.6％)。
对U-105进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+867.47，理论值867.81。
对U-105进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.85(dt,J＝12.5,6.2Hz,2H),3.64(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.96–2.42(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,4H),2.03–1.46(m,20H),1.40–1.06(m,52H),1.02–0.70(m,12H).
(6)可离子化脂质U-106的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-106：
7-溴庚酸6.0g溶于100mL DCM中，加入DCC 7.50g，25℃下搅拌10min。加入1-辛基壬烷-1-醇6.0g和DMAP 170mg，室温反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得粗产物。粗产物经硅胶柱层析提纯(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物7-溴庚酸-1’-辛基壬酯(L)8.9g(产率74.2％)。
对7-溴庚酸-1’-辛基壬酯进行质谱分析，LC–TOF:[M+H]+，447.37，理论值447.28。
7-溴庚酸-1’-辛基壬酯1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈10mL、N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 550mg、KI 330mg，83℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(1-辛基壬基)-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(U-106)410mg(产率40.6％，纯度98.1％)。
对U-106进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+881.68，理论值881.82。
对U-106进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.86(dt,J＝12.5,6.2Hz,2H),3.63(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.94–2.38(m,12H),2.26(t,J＝7.4Hz,4H),2.01–1.41(m,18H),1.39–1.05(m,54H),1.01–0.69(m,12H)。
(7)可离子化脂质U-107的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-107：
1)化合物M的合成
室温下实施例1(5)的化合物K(1.25g)溶于20mL乙醇中，加入3-氨基丙醇(1.5g)，升温至50℃，搅拌8h，薄层色谱监控反应进程。原料消耗完全后降至室温。旋干除去乙醇，用DCM溶解，用饱和食盐水洗涤三次，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱液：0-10％的甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄色油状物6-(3’-羟丙基)氨基-己酸-O-(1-辛基)-1-壬酯(M)1.12g(产率84.2％)。
对M进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+427.54，理论值427.70。
2)化合物N的合成
化合物M(0.80g)溶于10mL THF中，加入10mL乙腈、6-溴己酸十二烷基酯(实施例1(3)的化合物C，1.16g)、K2CO3(0.55g)、KI(0.33g)，在85℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，反应液冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物产物N1.10g(产率78.5％)。
对N进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+710.25，理论值710.17。
3)化合物P的合成
冰水浴条件下，化合物N(0.80g)溶于2mL氯仿中。氩气保护下，将溶有二氯亚砜(0.35g)的5mL氯仿溶液逐滴加入到上述溶液中。滴加完毕后，升至室温，搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，旋蒸除去溶剂，获得粗产物。粗产物经硅胶柱层析提纯(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物P(0.63g，产率77.8％)。
对产物P进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+728.45，理论值728.61。
4)化合物U-107的合成
化合物P(0.5g)溶于10mL THF中，加入5mL乙腈、0.2mL N,N’-二异丙基乙胺、0.25g二乙醇胺盐酸盐，69℃下搅拌过夜。加入NaI(10mg)，在65℃下反应72小时。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物O-1-辛基壬基-O’-十二烷基-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二己酸酯(U-107)0.29g(产率52.7％，纯度97.4％)。
对U-107进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+797.43，理论值797.29。
对U-107进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.86-4.62(m,3H),3.63(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.96–2.38(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,4H),2.06–1.50(m,18H),1.45–1.07(m,46H),1.02–0.72(m,9H)。
(8)可离子化脂质U-108的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-108：
1)化合物Q的合成
室温下将实施例1(6)的化合物L1.25g溶于20mL乙醇中，加入2-氨基乙醇1.5g，升温至50℃，搅拌反应8h，薄层色谱监控反应。原料消耗完全后降至室温，旋干除乙醇，用DCM溶解，饱和食盐水洗涤三次，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱液：0-10％的甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄色油状物7-(2’-羟乙基)氨基-庚酸-O-(1-辛基)-1-壬酯(Q)1.05g(产率79.5％)。对Q进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+427.54，理论值427.70。
2)化合物R的合成
化合物Q(0.80g)溶于10mL四氢呋喃中，加入10mL乙腈、2-十二烷基7-溴庚酸酯(实施例1(4)的化合物G，1.2g)、K2CO3(0.55g)、KI(0.33g)，85℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，反应液冷至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。浓缩液经硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物产物R1.05g(产率75.0％)。
对R进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+710.25，理论值710.17。
3)化合物S的合成
冰水浴条件下，化合物R(0.80g)溶于2mL氯仿中。氩气保护下，将溶有二氯亚砜(0.35g)的5mL氯仿溶液逐滴加入到上述溶液中。滴加完成后，升至室温，搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，旋蒸除去溶剂，获得粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离提纯(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物S 0.72g(产率88.9％)。
对S进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+728.45，理论值728.61。
4)化合物U-108的合成
化合物S(0.5g)溶于10mL THF中，加入5mL乙腈、0.2mL N,N’-二异丙基乙胺、0.25g二乙醇胺盐酸盐，69℃下搅拌过夜。加入NaI(10mg)，在65℃下反应72小时。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物O-1-辛基壬基-O’-十二烷基-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(U-108)0.26g(产率47.3％，纯度98.3％)。
对U-108进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+797.43，理论值797.29。
对U-108进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.88-4.67(m,3H),3.64(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.94–2.38(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,4H),2.10–1.49(m,16H),1.41–1.05(m,46H),1.02–0.72(m,9H).
(9)可离子化脂质U-109的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-109：
6-溴己酸(5.76g)溶于DCM(100mL)中，加入DCC 7.50g，25℃下搅拌10min。1-庚基辛烷-1-醇6.0g和DMAP 170mg加入到上述溶液中，室温反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离提纯(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物6-溴己酸-1’-庚基-辛酯(T)6.2g(产率56.4％)。
对化合物T进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+405.19，理论值405.45。
化合物T(1.0g)溶于10mL THF中，加入乙腈(10mL)、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg)、K2CO3(550mg)、KI(332mg)，83℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状双(1-庚基辛基)-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二己酸酯(U-109)，计378mg，产率35.6％，纯度97.3％。
对U-109进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+811.47，理论值811.31。
对U-109进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.86(dt,J＝12.5,6.2Hz,2H),3.63(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.98–2.42(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,4H),2.03–1.44(m,20H),1.41–1.09(m,44H),1.02–0.68(m,12H)。
(10)可离子化脂质U-110的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-110：
7-溴庚酸6.0g溶于100mL DCM中，加入DCC 7.50g，25℃下搅拌10min。加入1-庚基辛烷-1-醇6.0g和DMAP 170mg，室温反应过夜。反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，得到粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离提纯(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物7-溴庚酸-1’-庚基辛酯8.4g，产率76.4％。
对7-溴庚酸-1’-庚基辛酯进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+419.48，理论值419.41。
7-溴庚酸-1’-庚基辛酯1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈10mL、N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 550mg、KI 330mg，83℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(1-庚基辛基)-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(U-110)，计405mg，产率38.2％，纯度97.6％。
对U-110进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+825.26，理论值825.34。
对U-110进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.86(dt,J＝12.5,6.2Hz,2H),3.61(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.95–2.40(m,12H),2.28(t,J＝7.4Hz,4H),2.01–1.43(m,18H),1.41–1.05(m,46H),1.02–0.66(m,12H).
(11)可离子化脂质U-111的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-111：
1)化合物U的合成
室温下将实施例1(9)的化合物T(1.25g)溶于20mL乙醇中，加入3-氨基丙醇(1.5g)，升温至50℃，搅拌8h，薄层色谱监控反应进程。原料消耗完全后降至室温。旋干除去乙醇，用DCM溶解，饱和食盐水洗涤三次，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱液：0-10％的甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄色油状物6-(3-羟丙基)氨基-己酸-O-(1-辛基)-1-壬酯(U)1.10g(产率78.6％)。对化合物U进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+399.54，理论值399.65。
2)化合物V的合成
化合物U(0.80g)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、6-溴己酸十二烷基酯(实施例1(3)的化合物C，1.16g)、K2CO3(0.55g)、KI(0.33g)，在85℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，反应液冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。浓缩液经硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物产物V 0.94g(产率67.1％)。
对化合物V进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+682.45，理论值682.11。
3)化合物W的合成
冰水浴条件下，化合物V(0.80g)溶于2mL氯仿中。氩气保护下，将溶有二氯亚砜(0.35g)的5mL氯仿溶液逐滴加入到上述溶液中。滴加完成后升至室温，25℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，旋蒸除去溶剂，获得粗产物。粗产物经硅胶柱层析提纯(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得黄色油状产物W(0.71g，产率87.7％)。
对化合物W进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+ 700.26，理论值700.56。
4)化合物U-111的合成
化合物W(0.5g)溶于10mLTHF中，加入5mL乙腈、0.2mL N,N’-二异丙基乙胺、0.25g二乙醇胺盐酸盐，69℃下搅拌过夜。加入NaI(10mg)，在65℃下反应72小时。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤。滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物O-1-庚基辛基-O’-十二烷基-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二己酸酯(U-111)0.26g(产率50.5％，纯度97.3％)。
对U-111进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+769.47，理论值769.23。
对U-111进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.86-4.65(m,3H),3.63(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.94–2.42(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,4H),2.03–1.47(m,18H),1.41–1.07(m,42H),1.02–0.66(m,9H).
(12)可离子化脂质U-112的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-112：
实施例1(10)的化合物7-溴庚酸-1’-庚基辛酯(1.25g)溶于20mL乙醇中，加入2-氨基乙醇(1.5g)，升温至50℃，搅拌8h，薄层色谱监控反应进程。原料消耗完全后降至室温。旋干除去乙醇，用DCM溶解，用饱和食盐水洗涤三次，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，硅胶柱层析分离(洗脱液：0-10％的甲醇/二氯甲烷)，得到浅黄色油状物7-(2-羟乙基)氨基-己酸-O-(1-辛基)-1-壬酯(112-1)0.95g(产率67.9％)，进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+399.54，理论值399.65。
化合物112-1(0.80g)溶于10mL THF中，加入10mL乙腈、7-溴庚酸十二烷基酯(实施例1(4)的化合物G，1.16g)、K2CO3(0.55g)、KI(0.33g)，85℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，反应液冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。浓缩液经硅胶柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物产物112-2(0.86g，产率61.4％)，进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+696.25，理论值696.11。
冰水浴条件下，化合物112-2(0.80g)溶于2mL氯仿中。氩气保护下，将溶有二氯亚砜(0.35g)的5mL氯仿溶液逐滴加入到上述溶液中，25℃下搅拌反应16h。薄层色谱显示反应完成后，旋蒸除去溶剂，获得粗产物。粗产物经硅胶柱层析提纯(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得黄色油状产物112-3(0.64g，产率79.0％)。
对112-3进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+714.22，理论值714.56。
化合物112-3(0.5g)溶于10mLTHF中，加入5mL乙腈、0.2mL N,N’-二异丙基乙胺、0.25g二乙醇胺盐酸盐，69℃下搅拌过夜。加入NaI(10mg)，在65℃下反应72h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤.得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/二氯甲烷)，得到黄色油状产物O-1-庚基辛基-O’-十二烷基-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(U-112)0.24g(产率45.7％，纯度97.8％)。
对U-112进行质谱分析，LC-TOF：m/z[M+H]+783.34，理论值783.26。
对U-112进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)δ4.85-4.66(m,3H),3.63(dd,J＝9.9,4.9Hz,4H),2.96–2.37(m,12H),2.30(t,J＝7.4Hz,4H),2.14–1.49(m,16H),1.43–1.06(m,42H),1.02–0.71(m,9H).
(13)可离子化脂质UR-301的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-301：
实施例1(1)的化合物A1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈10mL、N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 550mg、KI 330mg，83℃下搅拌反应16h。反应结束后，溶液冷却至室温，过滤。滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(2-己基癸基)-6,6'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(UR-301)412mg(产率40.8％，纯度96.8％)。
对UR-301进行质谱分析，LC–TOF:，m/z[M+H]+825.88，理论值825.76。
对UR-301进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ3.97(d,4H)，3.83-3.45(m,4H)，2.65-2.36(m,12H)，2.30(t,4H)，1.67-1.50(m,4H)，1.34-1.20(m,52H)，0.92-0.84(m,12H)。
(14)可离子化脂质UR-302的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-302：
实施例1(2)的化合物B1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈10mL、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 600mg、KI 350mg，83℃下搅拌反应16h。反应结束后，溶液冷却至室温，过滤。滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(2-己基癸基)-7,7'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二庚酸酯(UR-302)386mg(产率38.2％，纯度97.6％)。
对UR-302进行质谱分析:m/z[M+H]+867.38，理论值867.81；1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ3.97(d,4H)，3.74-3.60(m,4H)，2.65-2.25(m,16H)，2.07-2.12(m,2H),1.69-1.49(m,6H)，1.38-1.05(m,60H)，0.90-0.84(m,12H)。
(15)可离子化脂质UR-303的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-303：
8-溴辛酸6.0g溶于100mLDCM中，加入DCC 7.50g，25℃下搅拌10min。加入2-己基癸烷-1-醇6.0g和DMAP 170mg，室温反应过夜。反应结束后，旋蒸除去溶剂，得粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物8-溴辛酸-2’-己基癸酯7.9g，产率71.8％。对8-溴辛酸-2’-己基癸酯进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+447.36，理论值447.28。
8-溴辛酸-2’-己基癸酯1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈10mL、N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 550mg、KI 330mg，83℃下搅拌反应16h。反应结束后，溶液冷却至室温，过滤。滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(2-己基癸基)-8,8'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二辛酸酯(UR-303)计356mg，产率35.2％，纯度97.6％。
对UR-303进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+881.68，理论值881.82。
对UR-303进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ3.97(d,4H)，3.74-3.60(m,4H)，2.65-2.25(m,16H)，2.01-2.10(m,2H)，1.69-1.49(m,4H)，1.38-1.05(m,64H)，0.90-0.84(m,12H)。
(15)可离子化脂质UR-304的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-304：
5-溴戊酸5.5g溶于100mL DCM，加入DCC 7.00g，室温搅拌10min。加入2-己基癸烷-1-醇6.0g和DMAP 160mg，室温反应过夜。反应结束后，旋蒸除去溶剂，得粗产物。粗产物经硅胶柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚＝5/95,v/v)，得到无色油状产物5-溴戊酸-2’-己基癸酯6.4g(产率63.9％)。对5-溴戊酸-2’-己基癸酯质谱分析，LC-TOF:m/z[M+H]+405.57，理论值405.45。
5-溴戊酸-2’-己基癸酯1.0g溶于10mL THF中，加入乙腈10mL、N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺160mg、K2CO3 550mg、KI 330mg，83℃下搅拌反应16h。反应结束后，溶液冷却至室温，过滤。滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离，得到淡黄色油状产物双(2-己基癸基)-5,5'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二烷基)二戊酸酯(UR-304)321mg(产率39.6％，纯度97.2％)。
对UR-304进行质谱分析:m/z[M+H]+811.46，理论值811.31；1HNMR分析(500MHz,CDCl3)：δ3.74-3.60(m,4H)，2.65-2.25(m,16H)，2.07-2.12(m,2H),1.69-1.49(m,6H)，1.38-1.05(m,52H)，0.90-0.84(m,12H)。
实施例2包裹RBD mRNA的脂质纳米粒(RBD mRNA-LNP)的制备与物理化学性质表征
新冠病毒奥密克戎(Omicron)毒株S蛋白受体结合域RBD mRNA购自楷拓生物科技(苏州)有限公司。RBD mRNA(50μg)溶解在pH＝4的柠檬酸溶液中，为水相。可离子化脂质分别是实施例1中的U-101～U-112、UR-301～UR-304或ALC-0315(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、SM-102(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)。按照摩尔比50:38.5:10:1.5取可离子化脂质、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000，并溶解在乙醇中作为醇相。用微流控脂质纳米粒制备仪(型号Nano S，联建生物(苏州)有限公司)快速混合水相和有机相，制备了一系列RBD mRNA-LNP浓溶液。将RBD mRNA-LNP浓溶液分别迅速加入到有10倍体积PBS(pH 7.4)的超滤管中，5000r/min离心30min，过膜，得到一系列包裹Omicron毒株S蛋白RBD mRNA的RBD mRNA-LNP脂质纳米粒溶液，于4℃冰箱备用。
粒径测量：用动态光散射仪(DLS)(马尔文粒度仪,NanoBrook Omin,美国布鲁克海文仪器公司)测量上述一系列RBD mRNA-LNP的粒径(D)、多分散性指数(PDI)。取100μL RBDmRNA-LNP溶液，加入900μL蒸馏水稀释，混匀后加入比色皿，置于样品槽中测量，散射角173°，温度25℃。测量结果见表1。
包封率测量：使用RNA试剂盒测量RBD mRNA-LNP的包封率。检测原理如下：首先检测RBD mRNA-LNP溶液中游离在LNPs颗粒外的RBD mRNA数量，然后用Triton-100破坏LNPs结构，使得全部mRNA释放到外部溶液，检测溶液中所有mRNA的数量。两者的差值就是被包封在LNPs颗粒内部的mRNA数量，除以总mRNA的量即为包封率。具体检测步骤参照Invitrogen公司的试剂使用说明书。简而言之，配制TE buffer和2％TE-Triton buffer溶液，测定RBD mRNA-LNP样品中游离mRNA时，用1×TE buffer稀释RBD mRNA-LNP溶液，加100μL稀释后的样品到96孔板。对于总mRNA的测定，用2％TE-Triton buffer稀释RBD mRNA-LNP溶液，添加100μL稀释后的样品到96孔板中。在孔板中添加100μL的RiboGreen染料，孵育5min，打开酶标仪(型号1510，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，选择荧光模式，激发光波长485nm，发射光波长528nm，读取数据，按公式(1)计算包封率：
包封率＝((总mRNA-游离mRNA)/总mRNA)×100％(1)
结果见表1。
表1可离子化脂质等制备的RBD mRNA-LNP粒径(D)、粒径分布(PDI)和包封率
由表1可见，由U-101～U-112等制备的RBD mRN-LNP平均粒径为80-110nm，多分散性系数(PDI)0.12-0.16，说明粒径分布均一。由UR-301～UR-304、ALC-0315或SM-102制备的RBD mRN-LNP平均粒径为87-231nm，多分散性系数(PDI)0.19-0.31，说明LNP粒径较大，分布均一性差。由U-101～U-112制备的RBD mRNA-LNP中mRNA的包封率为88.3-93.4％，显示本发明的可离子化脂质具有很高的包封效率。由UR-301～UR-304、ALC-0315或SM-102制备的RBDmRN-LNP的包封率为64.5-83.4％，包封效率低，容易造成宝贵的RBD mRNA损失。
RBD mRNA-LNP稳定性测试：将系列RBD mRNA-LNP脂质纳米粒溶液分别放置在4℃条件下，在第0d、7d、14d、21d和28d时记录溶液外观的变化，用激光粒度仪监测溶液的粒径变化。结果如图1所示。
由图1可见，4℃下存储28天，U-101～U-112制备的RBD mRNA-LNP粒径无明显变化，说明LNP-mRNA在4℃下有良好的稳定性。而UR-301～UR-304、ALC-0315或SM-102制备的RBDmRNA-LNP平均粒径有所增大，尤其是初始粒径较大的LNP粒径增大明显，稳定性较差。
实施例3RBD mRNA-LNP的细胞毒性评价
用CCK-8试剂盒检测实施例2制备得到的一系列包裹Omicron毒株S蛋白RBD mRNA的脂质纳米粒RBD mRNA-LNP溶液细胞毒性。首先，将HEK 293T细胞(美国ATCC菌种库)(1×104)接种到96孔板中，加入DMEM培养基，在37℃的细胞培养箱中培养20h，待细胞长到80％的融合度。弃去上清液，用PBS标准溶液洗涤三次，加入Opti-MEM无血清培养基，试验孔中加入LNP制剂。实验组：分别加入实施例2制备的一系列不同可离子化脂质构建的LNP包载RBDmRNA的脂质纳米粒溶液RBD mRNA-LNP(mRNA均为1μg)；mRNA组：裸RBD mRNA；对照组(NT)：不加药剂；空白组：无细胞(有培养基)。Lipo3000(Lipofectamine 3000，生化级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)包载等量RBD mRNA的LNP溶液为阳性对照。培育24h，每个试验孔中加入10μLCCK-8试剂，孵育2-4h后使用酶标仪检测样品在450nm处的吸光度值，按照公式(2)计算细胞存活率：
其中，ODtreated为实验组OD值，ODcontrol为不加药组OD值，ODblank为空白组OD值(无细胞)，加培养基。测量结果如图2所示。
由图2可见，裸RBD mRNA组的细胞存活率为100％，显示mRNA无毒性。由U-101～U-112制备的RBD mRNA-LNP组的细胞存活率均为90％以上，说明U-101～U-112构建的LNP包载RBD mRNA的脂质纳米粒无明显毒性，显示可离子化脂质良好的生物安全性。由UR-301～UR-304、ALC-0315、SM-102制备的RBD mRN-LNP组的细胞存活率在75％-85％之间，显示较低的毒性。Lipo3000组的细胞存活率仅为35％左右，显示很强的毒性。
因此，U-101～U-112的包封率最高，制备的脂质纳米粒无明显毒性，安全性最好。UR-301～UR-304、ALC-0315或SM-102制备的LNP毒性低。Lipo3000含阳离子组分，毒性最强。
实施例4Omicron RBD mRNA-LNP体外表达
实施例2制备的Omicron RBD mRNA-LNP溶液进行ELISA实验。将HEK293T细胞(8×105个细胞/孔)接种在六孔板中，加入DMEM培养基在细胞培养箱(37℃)中培养20h左右，待细胞达80％的融合度。弃去DMEM培养基，在共聚焦皿中加入2mL Opti-MEM无血清培养基，每孔加入等量裸露RBD mRNA、RBD mRNA-LNP(mRNA＝1μg)。37℃培养24h后，取细胞上清液，用Elisa试剂盒检测RBD蛋白表达水平，具体步骤按试剂盒说明书所述(新冠RBD蛋白试剂盒，生化级，武汉福因德科技有限公司)。
a)冰箱取出试剂盒，室温放置30min，试剂盒恢复至室温。取96孔板，加入300μL孔板洗涤液，洗涤三次。待孔板干燥，加入100μL细胞上清液，37℃培养箱孵育1h。
b)孵育结束后，取出96孔板，弃去细胞上清液，再次加入300μL孔板洗涤液，洗涤三次。待孔板干燥，加入100μL生物素标记的抗Omicron RBD蛋白抗体工作液。盖上孔板盖，将孔板置于37℃条件下培养1h。注意：生物素标记的抗Omicron RBD蛋白抗体工作液需要在使用前15min内配制。
c)弃去生物素标记的抗Omicron RBD蛋白抗体工作液，加入300μL孔板洗涤液，清洗三次。待孔板干燥，加入100μL的链霉亲和素工作液。37℃孵育1h。
d)孵育结束后，弃去链霉亲和素工作液，清洗孔板三次，加入100μL的TMB底物溶液。37℃条件下孵育20min，加入100μL反应终止液，溶液颜色由蓝变黄。将96孔板置于酶标仪中(型号1510，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，测定OD值，检测波长：450nm。根据带有浓度梯度的标准品孔的OD值绘制标准曲线，将各个样品OD值代入计算，得到最终RBD蛋白浓度，结果见表2。
表2可离子化脂质制备的mRNA-LNP转染细胞后蛋白表达数据
可离子化脂质 RBD,ng/mL 可离子化脂质 RBD,ng/mL
U-101 50.6 U-110 41.6
U-102 49.3 U-111 44.3
U-103 49.6 U-112 42.8
U-104 48.7 UR-301 6.8
U-105 48.4 UR-302 4.5
U-106 47.8 UR-303 6.4
U-107 47.6 UR-304 5.4
U-108 45.7 ALC-0315 8.5
U-109 43.2 SM-102 10.2
由表2可见，HEK293T细胞中，由U-101～U-112制备的RBD mRNA-LNP组表达的RBD浓度高达42.8～50.6ng/mL，LNP的递送效率和蛋白表达效率最高，显示可离子化脂质构建的LNP良好的递送性能。由UR-301～UR-304、ALC-0315、SM-102制备的RBD mRN-LNP组表达的RBD浓度4.5～10.2ng/mL。
U-101～U-112制备的RBD mRNA-LNP组表达的RBD蛋白浓度是UR-301～UR-304制备的RBD mRN-LNP组表达的蛋白浓度的10倍左右。
U-101～U-112制备的RBD mRNA-LNP组表达的RBD蛋白浓度是ALC-0315、SM-102制备的RBD mRN-LNP组表达的蛋白浓度的5倍左右。
U-101、U-103、U-105、U-107、U-109、U-111结构中两个氮原子之间有三个碳原子，且结构中羧酸酯的羧基部分为六元酸，也就是其结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和是9。U-102、U-104、U-106、U-108、U-110、U-112结构中两个氮原子之间有两个碳原子，且结构中羧酸酯的羧基部分为七元酸，即两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和也是9。
与之相对地，UR-301结构中两个氮原子之间只有两个碳原子，结构中羧酸酯的羧基部分为六元酸，两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和是8。UR-304结构中两个氮原子之间有三个碳原子，结构中羧酸酯的羧基部分为五元酸，两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和是8。UR-302结构中两个氮原子之间有三个碳原子，羧酸酯的羧基部分为七元酸，结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和是10。UR-303结构中两个氮原子之间也只有两个碳原子，但羧酸酯的羧基部分为八元酸，两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和是10。
U-101～U-112和UR-301～UR-304具有相同的强极性头部结构和类似的非极性脂质结构尾部。与极性渐变区碳原子数共为8的UR-301和UR-304，以及极性渐变区碳原子数共为10的UR-302和UR-303相比，U-101～U-112的极性渐变区碳原子数共为9，长度适中。而UR-301和UR-304极性渐变区长度偏短，UR-302和UR-303极性渐变区长度偏长。
因此，U-101～U-112制备的脂质纳米粒表达的RBD浓度最高，表达效果最好。而UR-301～UR-304制备的脂质纳米粒表达的RBD浓度很低，表达效率很差。ALC-0315或SM-102制备的LNP表达效率也偏低，与其结构相差较大有关。
显然U-101～U-112制备的脂质纳米粒表达的RBD浓度是UR-301～UR-304等表达的RBD浓度的10倍，显示U-101～U-112系列脂质构建的LNP作为递送系统取得了意想不到的优异的mRNA递送和蛋白表达效果。
实施例5包载VEGFa mRNA的脂质纳米粒(VEGFa mRNA-LNP)的制备
血管内皮细胞生长因子a(VEGFa)mRNA购自楷拓生物科技(苏州)有限公司。脂质纳米粒制备过程和条件同实施例2，用VEGFa mRNA替代RBD mRNA。用实施例1的可离子化脂质、市售ALC-0315、SM-102等制备包载VEGFa mRNA的脂质纳米粒，得到系列VEGFa mRNA-LNP溶液置于4℃冰箱备用。
VEGFa mRNA-LNP粒径测量、包封率测量同实施例2，结果见表3。
表3可离子化脂质制备的VEGFa mRNA-LNP粒径D、粒径分布PDI和包封率
由表3可见，由U-101～U-112制备的VEGFa mRN-LNP平均粒径为80～118nm，多分散性系数(PDI)0.11-0.15，粒径分布均一。由UR-301～UR-304、ALC-0315或SM-102制备的RBDmRN-LNP平均粒径为84-270nm，多分散性系数(PDI)0.21-0.35，LNP粒径分布均一性差。
由U-101～U-112制备的VEGFa mRNA-LNP中mRNA的包封率为88.3～93.2％，显示可离子化脂质具有很高的包封效率。UR-301～UR-304、ALC-0315或SM-102制备的RBD mRN-LNP的包封率为49.4～84.1％，包封效率低，容易造成宝贵的VEGFa mRNA损失。
因此，U-101～U-112的包封率高，制备的LNP粒径小，分布均一。UR-301～UR-304的包封率低，LNP粒径大。
实施例6VEGFa mRNA-LNP体外表达
酶联免疫吸附法(ELISA)检测实施例5制备的VEGFa mRNA-LNP在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中VEGFa蛋白表达情况。实验过程同实施例4，不同之处在于：将HUVEC细胞接种在六孔板中(8×105个细胞/孔)，实施例5制备的各种mRNA-LNP代替实施例4中的各种RBDmRNA-LNP，步骤d)中TMB底物溶液的体积为90μL，37℃条件下孵育15min。测量结果见表4。
表4可离子化脂质制备的VEGFa mRNA-LNP转染HUVEC细胞后蛋白表达量
可离子化脂质 VEGFa,ng/mL 可离子化脂质 VEGFa,ng/mL
U-101 52.8 U-110 36.8
U-102 48.7 U-111 41.7
U-103 49.6 U-112 36.1
U-104 47.9 UR-301 4.8
U-105 48.3 UR-302 3.7
U-106 45.5 UR-303 6.2
U-107 47.7 UR-304 4.9
U-108 45.3 ALC-0315 7.9
U-109 39.2 SM-102 11.3
由表4可见，由U-101～U-112制备的VEGFa mRNA-LNP组表达的VEGFa浓度最高达到36.1～52.8ng/mL，LNP的递送效率和蛋白表达效率很高，说明可离子化脂质U-101～U-112构建的LNP递送性能突出，LNP溶酶体逃逸和mRNA表达效率优异。而由UR-301～UR-304、ALC-0315、SM-102制备的VEGFa mRNA-LNP组表达的VEGFa浓度3.7～11.3ng/mL，显著低于前者，显示较差的递送能力。
结果表明，U-101～U-112制备的脂质纳米粒表达的VEGFa浓度最高，表达效果最好，是UR-301～UR-304制备的脂质纳米粒表达效率近10倍左右。
实施例7体内表达效果评价
1、包裹Fluc mRNA的脂质纳米粒(Fluc mRNA-LNP)的制备
制备过程同实施例2，萤火虫荧光素酶Fluc mRNA购自楷拓生物科技(苏州)有限公司。通过微流控脂质纳米粒制备仪将Fluc mRNA包裹到LNP中，方法如下：Fluc-mRNA(50μg)溶解在pH＝4的柠檬酸溶液中，为水相。可离子化脂质是实施例1的U-101～U-112、UR-301～UR-304及市售ALC-0315和SM-102(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)。按摩尔比50:38.5:10:1.5取可离子化脂质、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000溶解在乙醇中作为醇相。用微流控仪快速混合水相和有机相，制备一系列Fluc mRNA-LNP浓溶液。将Fluc mRNA-LNP浓溶液迅速加入到有10倍体积PBS(pH 7.4)的超滤管中，5000r/min离心30min，过膜(0.22微米)，得到系列Fluc mRNA-LNP溶液，于4℃冰箱备用。用马尔文粒度仪测量mRNA-LNP粒径(D)、多分散指数(PDI)。实验过程同实施例2，结果见表5。
表5可离子化脂质等制备的Fluc mRNA-LNP的粒径和包封率
2、活体荧光成像实验
含有20μg Fluc mRNA的上述各LNP制剂经肌肉注射至4-6周龄、重量为17-19g的雌性BALB/C小鼠体内，给药后时间节点(6h、24h、48h和7d)对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物(D-荧光素钾盐，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。小鼠自由活动5分钟，后经小动物活体成像仪(IVIS Lumina Series III,美国PerkinElmer公司)检测Fluc mRNA在小鼠体内表达蛋白质的荧光总光通量(单位：p/s)，检测结果见表6。
表6给药Fluc mRNA-LNP脂质纳米粒后小鼠活体成像数据
由表6可见，由U-101～U-112制备的Fluc mRNA-LNP的荧光强度高，6小时达到108数量级，荧光最强，24小时开始减弱，但荧光强度仍然接近1x108。结果显示，Fluc mRNA-LNP在体内被细胞高效摄入，并有效释放Fluc mRNA，持续高效翻译表达Fluc蛋白，说明可离子化脂质U-101～U-112构建的LNP具有最优的体内递送、溶酶体逃逸和mRNA表达效率。进一步比较体内mRNA递送和蛋白表达效果，U-101～U-108优于U-109～U-112。
由UR-301～UR-304制备的Fluc mRNA-LNP组的荧光强度弱，6小时达到106数量级，24小时开始减弱，显示mRNA-LNP在体内被细胞摄入少，且Fluc mRNA翻译表达Fluc蛋白的效率低，说明可离子化脂质构建的LNP的体内递送和mRNA表达效率差。ALC-0315、SM-102制备的Fluc mRNA-LNP组的荧光强度稍弱，6小时达到107数量级，24小时开始减弱，显示mRNA-LNP在体内被细胞摄入较少，且Fluc mRNA翻译表达Fluc蛋白的效率较低。
由U-101～U-112制备的Fluc mRNA-LNP的荧光强度是UR-301～UR-304、ALC-0315、SM-102制备的Fluc mRNA-LNP组的荧光强度的100倍左右。而且，前者持续表达蛋白的时间长。这些可离子化脂质的递送能力顺序如下：U-101>U-103>U-102>U-105>U-104>U-106>U-107>U-108>U-111>U-109>U-110>U-112(远大于)>>SM-102>ALC-0315>UR-301～UR-304。
U-101、U-103、U-105、U-107、U-109、U-111结构中两个氮原子之间有三个碳原子，且结构中羧酸酯的羧基部分为六元酸，即两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和是9。U-102、U-104、U-106、U-108、U-110、U-112结构中两个氮原子之间有两个碳原子，且羧酸酯羧基部分为七元酸，即两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和也是9。与之相对，UR-301、UR-304结构中两个氮原子之间分别有两、三个碳原子，羧酸酯羧基部分分别为六元酸和五元酸，两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和是8。UR-302结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和是10。UR-303结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和也是10。
U-101～U-112和UR-301～UR-304有相同的强极性头部结构和类似的非极性烷基链脂质结构尾部，但是头部和尾部之间的极性渐变区长度不同。与极性渐变区碳原子数共为8的UR-301和UR-304,极性渐变区碳原子数共为10的UR-302和UR-303相比，U-101～U-112的极性渐变区碳原子数共为9，长度适中。而UR-301极性渐变区长度偏短，UR-302和UR-303极性渐变区长度偏长。因此，实施例2和4中U-101～U-112制备的脂质纳米粒表达的RBD浓度均是UR-301～UR-304等表达的RBD浓度的10倍，显示前者构建的脂质纳米粒作为递送系统取得了意想不到的优异的RBD mRNA递送和蛋白表达效果。实施例5和6中由U-101～U-112制备的脂质纳米粒表达的VEGFa浓度最高，是UR-301～UR-304等表达的VEGFa浓度近10倍，显示前者构建的脂质纳米粒作为递送系统取得了意想不到的优异的VEGFa mRNA递送和蛋白表达效果。
实施例7中U-101～U-112制备的脂质纳米粒体内表达的Fluc荧光强度高，高强度持续表达最长，蛋白表达效率最高。UR-301～UR-304制备的脂质纳米粒表达荧光强度低，表达效率差。前者是后者的100倍左右，而且持续时间更长。
此外，U-101、U-103、U-105、U-107、U-109、U-111与U-102、U-104、U-106、U-108、U-110、U-112相比，尽管他们的结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和均为9，但是U-101、U-103、U-105、U-107、U-109、U-111构建的脂质纳米粒递送mRNA所表达蛋白的荧光强度比U-102、U-104、U-106、U-108、U-110、U-112构建的脂质纳米粒递送mRNA所表达蛋白的荧光强度更高一些。所以，本发明的结构中两个氮原子之间有三个碳原子，羧酸酯羧基部分为六元酸的可离子化脂质有更优的递送效率。
上述体外和体内验证LNP递送载体性能的实验表明：可离子化脂质的结构与细胞内转染效率、细胞毒性以及在动物体内的表达之间无明显对应关系。结构差异很小的化合物，在转染效率、细胞毒性、细胞内的高表达方面可能差异非常大。因此，筛选合适的可离子化脂质，同时具有高转染和表达效率和低细胞毒性是非常困难的事情。
本发明的可离子化脂质U-101、U-103、U-105、U-107、U-109、U-111、U-102、U-104、U-106、U-108、U-110、U-112，头部是两个羟基的二乙醇胺强极性结构，可离子化脂质中间部分结构中两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数之和是9，构建的LNP的递送性能最优。尾端是15～18个碳原子的支链烷基，或尾部是11～14个碳原子的直链烷基，使可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于包载保护核酸和LNP入胞。同时，使质子化后的可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于核酸包载和LNP溶酶体逃逸。尤其是，可离子化脂质中间部分结构中两个氮原子之间的碳原子数为3，羧酸酯羧酸部分碳原子数为6更优。
由此，可离子化脂质递送能力U-101～U-108优于U-109～U-112，顺序如下：U-101>U-103>U-102>U-105>U-104>U-106>U-107>U-108>U-111>U-109>U-110>U-112>>(远大于)SM-102>ALC-0315>UR-301～UR-304。
本发明可离子化脂质U-101、U-103、U-105、U-107、U-109、U-111、U-102、U-104、U-106、U-108、U-110、U-112，相对于现有技术的其它化合物，以高的细胞转染效率、低细胞毒性或者无毒性以及在体内高表达和持续表达来递送核酸，取得了预料不到的技术效果。与现有技术代表性阳离子脂质结构有显著差别，同时具有高包封率、高转染效率和低细胞毒性，且在体内高蛋白表达及持续表达。

Claims (10)

1.一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述可离子化脂质的结构如式I所示，
其中，X是-C(＝O)O-；n是5或6；Y是(HO(CH2)2)2N(CH2)m-，m是2或3，且m+n＝8，即所述可离子化脂质结构中两个氮原子之间的碳原子数m与羧酸酯的羧酸部分的碳原子数(n+1)之和是9；R1是C15～18支链烷基，R2是C15～18支链烷基或C11～14的直链烷基。
2.根据权利要求1所述的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R1选自：
所述R2选自：
3.根据权利要求1所述的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述可离子化脂质选自：
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括治疗剂或预防剂及用于递送治疗剂或预防剂的载体，其中，所述治疗剂或预防剂包括小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、DNA核酸分子中的一种或多种；所述载体包括权利要求1-3任一项所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐中的一种或多种；所述载体与治疗剂或预防剂的质量比为：1～100:1。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50nm～300nm；所述脂质纳米颗粒的多分散指数≤0.40。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述载体还包括结构脂质，所述结构脂质为胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、谷固醇、麦角固醇、非甾醇、皮质类固醇、熊果酸、番茄碱及α-生育酚中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述载体还包括中性脂质，所述中性脂质为神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及其衍生物中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述载体还包括聚合物共轭脂质，所述聚合物共轭脂质为聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的二烷基胺及PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐、结构脂质、中性脂质及聚合物共轭脂质的摩尔比为(15～60)：(15～45)：(5～30)：(0.5-5)。
10.权利要求1-3任一项所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐或权利要求4-9任一项所述组合物在制备治疗疾病或病症的核酸药物、核酸疫苗中的应用。
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