KR20150021566A - 치료제 전달 제형용 지질 - Google Patents

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프리야 카르마리
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Abstract

본 발명은 리포좀 내에 치료제 전달의 향상에 유용한 이온화성 지질에 관한 것이다.

Description

치료제 전달 제형용 지질{Lipids for therapeutic agent delivery formulations}
본 발명은 치료제(therapeutic agent)의 향상된 전달을 위한 이온화성 지질에 관한 것이다.
본 발명은 2012년 06월 08일 출원된 미국 가출원(Provisional Application) 번호 61/657,480의 이익을 주장하고, 전체로서 참조로 본 명세서에 통합된다.
다수의 기술은 예를 들면, siRNA, 핵산 등과 같은 세포 내로 치료제를 전달하기 위해 이용할 수 있다. 이러한 기술은 바이러스성 및 비-바이러스성 형질 감염 시스템을 포함한다. 비-바이러스성 형질 감염 시스템은 예를 들면, 폴리머(polymer), 지질(lipid), 리포좀(liposome), 미셀(micell), 덴드리머(dendrimer) 및 나노물질(nanomaterial)을 포함할 수 있다. 세포 형질 감염용으로 연구된 폴리머는 양이온성 폴리머, 예를 들면, 폴리(L-라이신) ("PLL"), 폴리에틸렌이민("PEI"), 키토산(chitosan) 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸메타아크릴레이트 ("pDMAEMA")를 포함한다.
그러나, 상기 바이러스성 및 비-바이러스성 형질 감염 기술은 문제점을 가진다. 예를 들면, 바이러스성 시스템은 높은 형질 감염 효율성을 나타낼 수 있으나, 완전히 안전하지 않을 수 있다. 또한, 바이러스성 시스템은 제조가 복잡 및/또는 비쌀 수 있다.
비-바이러스성 감염 시스템은, 예를 들면, 양이온성 폴리머의 이용은 세포 에 플라스미드 DNA에 전달하는 것으로 보고 되었다. 그러나, 양이온성 폴리머는 불안정할 수 있고, 세포에 독성이 있을 수 있다.
상술한 바와 같이, 신규한 화합물, 조성물 및 세포, 조직 및 유기체에 치료제의 전달을 향상시키기 위해 양이온성 조성물을 사용하는 방법이 필요하다.
본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 이온화성 지질 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure pct00001
(여기서,
n 및 m은 독립적으로 1,2,3 또는 4이고;
R1 및 R2는 독립적으로 C10 - 18알킬 또는 C12 - 18알케닐이고;
X는 -CH2-, S, O, N, 또는 부재이고;
L은 C1 - 4알킬렌, -S-C1 - 4알킬렌, -O-C1 - 4알킬렌, -O-C(O)-C1 - 4알킬렌, -S(O)2-C1 - 4알킬렌,
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
이다).
또한, 화학식 I로 표시되는 화합물을 사용한 조성물, 약학적 제형, 약물 전달체 및 방법에 관한 것이다.
도 1 은 이온화성 지질: 본 발명의 이온화성 지질 실시예의 생체 외(in vitro)상승 효과를 나타낸다.
도 2 는 이온화성 지질: 본 발명의 이온화성 지질 실시예의 생체 외(in vitro)상승 효과를 나타낸다.
도 3은 이온화성 지질: 본 발명의 양이온성 지질 실시예의 생체 외(in vitro)상승 효과를 나타낸다.
도 4 는 이온화성 지질: 본 발명의 양이온성 지질 실시예의 생체 내(in vivo)상승 효과를 나타낸다.
본 발명은 세포, 조직 및 유기체에 치료제의 전달에 사용되는 이온화성 지질 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 범위에서는 화학식 I로 표시되는 이온화성 지질 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
[화학식 I]
Figure pct00004
여기서,
n 및 m은 독립적으로 1,2,3 또는 4이고;
R1 및 R2는 독립적으로 C10 - 18알킬 또는 C12 - 18알케닐이고;
X는 -CH2-, S, O, N, 또는 부재이고;
L은 C1 - 4알킬렌, -S-C1 - 4알킬렌, -O-C1 - 4알킬렌, -O-C(O)-C1 - 4알킬렌, -S(O)2-C1 - 4알킬렌,
Figure pct00005
또는
Figure pct00006
이다.
본 발명의 범위 내에서, n 및 m은 동일 또는 상이할 수 있다. 바람직한 실시예에서, n 및 m은 동일하다. 보다 바람직한 실시예에서, n 및 m은 모두 1 또는 n 및 m은 모두 2이다.
본 발명의 실시예에서, X는 결합(bond)이다. 다른 실시예에서, X는 -CH2-이다. 또 다른 실시예에서, X는 S이다. 또한, 바람직하게는 실시예에서, X는 O이다. 나아가, 본 발명의 범위 내의 실시예에서, X는 N이다.
본 발명의 실시예에서, L 는 C1 -4 알킬렌이다. 다른 실시예에서, L은 -S-C1 -4 알킬렌이다. 또한 다른 실시예에서, L은 -O-C1 -4 알킬렌이다. 나아가 다른 실시예에서, L은 -O-C(O)-C1 -4 알킬렌이다. 또한, L은 -S(O)2-C1 -4 알킬렌이다. 나아가, 본 발명의 범위 내의 실시에서, L은
Figure pct00007
이다.
본 발명의 실시예에서, X는 결합이고, L은 바람직하게 C1 -4 알킬렌이다. 예를 들면 L은 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -CH2CH2CH2CH2-를 포함한다. 다른 실시예에서, X는 결합이고, L은
Figure pct00008
이고, 예를 들면,
Figure pct00009
이다.
본 발명의 다른 실시예에서, X는 -CH2-이고, L은 바람직하게 -S-C1 -4 알킬렌이다. 예를 들면 L은 -S-CH2-, -S-CH2-CH2-, -S-CH2CH2CH2-, 및 -S-CH2 CH2CH2CH2-를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, X는 -CH2-이고, L은 바람직하게 -S(O)2-C1 -4 알킬렌이다. 예를 들면 L은 -S(O)2-CH2, -S(O)2-CH2-CH2, -S(O)2-CH2-CH2-CH2-, 및 S(O)2-CH2-CH2-CH2-CH2-를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, X는 -CH2-이고, L은 -O-C1 -4 알킬렌이다. 예를 들면 L은 -O-CH2-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2 CH2CH2-, 및 -O-CH2 CH2CH2CH2-를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, X는 S이고, L은 바람직하게 C1 - 4알킬렌이다. 예를 들면 L은 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2 CH2CH2-, 및 -CH2 CH2CH2CH2-를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, X는 O이고, L은 바람직하게 C1 -4 알킬렌. 예를 들면 L은 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2 CH2CH2-, 및 -CH2 CH2CH2CH2-를 포함한다.
본 발명의 범위 내에서, R1 및 R2은 동일 또는 상이할 수 있다. 바람직하게, R1 및 R2 는 동일하다. 바람직하게, R1 및 R2 는 C10 -18 알킬이다. 또한 바람직하게는 실시예에서, 상기 C10 -18 알킬은 직쇄 C10 -18 알킬이다. 보다 바람직하게는 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 C12 -18 알킬이다. 또한, 바람직하게는 실시예에서 R1 및 R2 는
C12-15 알킬이다. 가장 바람직한 실시예에서, R1 및 R2 는 모두 C13 알킬이다.
본 발명의 다른 실시예에서, R1 및 R2 는 C12 -18 알케닐이다. 바람직하게는, R1 및 R2 는 C13 -17 알케닐이다. 보다 바람직하게는, R1 및 R2 는 각각 올레일이다:
Figure pct00010
본 발명의 다른 실시예에서, R1 및 R2 는 C12 -18 알케닐이다. 바람직하게는, R1 및 R2 는 C13 -17 알케닐이다. 보다 바람직하게는, R1 및 R2 는 각각 리놀레일이다.
Figure pct00011

또한, 본 발명의 범위 내에서는 리포좀 내에 화학식 I의 화합물을 포함하는 조성물이며, 상기 리포좀은 지질 분자 이중층을 포함한다. 화학식 I의 화합물은 조성물에서 지질 분자의 어느 몰%를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 조성물에서 화학식 I의 화합물이 지질 분자의 약 5 내지 약 50 몰%이다.
리포좀 내에 화학식 I의 화합물을 포함하는 본 발명의 조성물은 하나 이상의 화학식 I의 화합물을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 화학식 I의 두 개의 화합물을 포함한다. 다른 실시예에서, 바람직하게는 화학식 I의 두개의 화합물의 몰비는 약 10:30 내지 약 30:10이다.
리포좀 내에 화학식 I의 화합물을 포함하는 본 발명의 조성물은 양이온성 지질을 더 포함할 수 있다. 실시예에서, 상기 양이온성 지질은 조성물의 지질 분자의 약 5 내지 약 40 몰%이다. 또한, 양이온성 지질을 가지는 리포좀 내에 화학식 I의 화합물을 포함하는 이러한 실시예에서, 화학식 I의 화합물과 양이온성 지질의 몰비는 약 5:35 내지 약 35:5이다. 보다 바람직하게는 상기 몰비는 약 10:30 내지 약 30:10이다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 어느 조성물은 액상 매질 (liquid medium)을 더 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 액상 매질은 생물(living organism)에 주입하기 위하여 적당한 것이다. 실시예에서, 상기 액상 매질은 유기 용매를 포함한다. 대체적으로, 본 발명의 특정 실시예에 사용되는 상기 액상 매질은 물 및 유기 용매를 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 액상 매질은 비-수성 매질(non-aqueous medium)을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위에서, 본 발명의 어느 조성물은 적어도 하나의 인지질(phospholipid)을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 어느 조성물은 적어도 하나의 PEG-공액 지질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 내에는 성상 세포 특이적 약물 전달체(stellate-cell-specific drug carrier)이다. 이러한 본 발명의 실시예는 (레티노이드)n-링커-(레티노이드)n, 여기서, 상기 n=0, 1, 2 또는 3이고; 및 상기 링커는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 PEG-같은 분자;로 구성된 표적 분자의 성상 세포 특이적 양만큼의 상기 언급된 어느 조성물을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 본 발명의 약물 전달체는 siRNA 분자를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 범위 내에서는 약학적 제형이다. 본 발명의 범위 내의 약학적 제형은 어느 상기 언급된 본 발명의 약물 전달체 및 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier) 또는 희석제(diluent)를 포함한다. 바람직한 이와 같은 제형에서, 상기 siRNA는 본 발명의 조성물의 리포좀에 의해 캡슐화된다.
나아가, 본 발명의 범위 내에서는 치료를 위한 환자에게 약물 전달 방법이다. 이러한 방법은 본 발명의 범위의 약학적 제형의 제공하는 것 및 환자에게 상기 약학적 제형을 투여하는 것을 포함한다.
정의( Definition )
하기 용어는 본 명세서에서 다음과 같이 사용된다.
여기에서 사용된 "양이온성 지질(cationic lipid)"은 적어도 하나의 지질 부분 및 반대 이온(counter ion)과 관련된 양 전하의 4차 질소를 포함하는 화합물을 의미한다. "지질(Lipids)"은 당 분야에서 소수성(hydrophobic) 알킬 또는 알케닐 부분 및 카르복실산 또는 에스터 부분을 포함하는 것으로 이해된다:
Figure pct00012
및
Figure pct00013
여기에서 사용된, "이온화성 지질(ionizable lipid)" 은 본 발명의 범위 내에서 화학식 I의 화합물을 의미한다. 이러한 화합물은 예를 들면, 이온화 가능한 수소 원자를 포함하는 종과 같이, 적당한 반대 이온 종으로 접촉될 때 대전 종을 형성할 수 있다.
여기에서 사용된, "알킬(alkyl)"은 직쇄 또는 측쇄의 전부 포화된(이중 결합 또는 삼중 결합이 없는) 하이드로카본기, 예를 들면 일반 화학식 -CnH2n + 1를 가지는 기를 의미한다. 상기 알킬기는 1 내지 50 탄소 원자를 가질 수 있다(여기에서 나타날 때마다, "1 내지 50"의 수치 범위는 주어진 범위의 각 정수를 의미한다; 예를 들면, 비록 본 발명에서 어떤 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"이 나타나도 "1 내지 50의 탄소 원자"는 1 탄소 원자, 2 탄소 원자, 3 탄소 원자, 등., 50 탄소 원자로 구성될 수 있는 알킬기를 의미한다.) 또한, 상기 알킬기는 1 내지 30 탄소 원자를 가지는 중간 크기의 알킬일 수 있다. 상기 알킬기는 1 내지 5 탄소 원자를 가지는 저급 알킬일 수 있다. 상기 화합물의 상기 알킬기는 "C1 -4 알킬" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 예를 들면, "C1 -4 알킬"은 알킬 사슬 내에 1 내지 4개의 탄소 원자를 나타내고, 상기 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 t-부틸로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 삼차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용된, "알킬렌"은 알칸디일(alkanediyl) 기능기, 예를 들면, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, 및 등을 의미한다.
여기에서 사용된, "알케닐" 은 하나 이상의 이중결합을 가진 직쇄 또는 측쇄의 탄화수소 사슬로 구성된 알킬기를 의미한다. 알케닐기는 비치환 또는 치환일 수 있다. 치환된 경우, 치환기는 달리 언급하지 않는 한, 알킬기 치환과 관련하여 상술한 바와 같은 기로부터 선택될 수 있다. 올레일(oleyl)은 알케닐기의 예이다.
여기에서 사용된, "약학적 전달체(pharmaceutical carrier)" 용어는 세포 또는 조직 내로 화합물의 합입(incorporation)을 가능하게 하는 화학적 화합물을 의미한다. 예를 들면, 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로 많은 유기 화학물의 흡수를 가능하게 하는 일반적으로 사용되는 전달체이다.
여기에서 사용된, "희석제(diluent)" 용어는 관심의 제형(예를 들면, 상기 제형은 화합물, 레티노이드, 2차 지질(second lipid), 안정화제, 및/또는 치료제를 포함할 수 있다.)을 용해시킬 뿐만 아니라, 제형의 생물학적으로 활성 형태를 안정화시키는 물에 희석되는 화학적 화합물을 의미한다. 완충 용액에 용해되는 염(salt)은 본 기술분야에서 희석제로 이용된다. 일반적으로 사용되는 완충 용액은 인간 혈액의 염 상태를 모방하고 인산염 완충 생리 식염수(phosphate buffered saline)이다. 완충 염은 낮은 농도로 용액의 pH를 조절할 수 있기 때문에, 완충된 희석제는 제형의 생물학적 활성을 변경하는 것은 드물다. 여기에서 사용된 "부형제(excipient)"는 제한(limitation), 대량( bulk), 일관성(consistency), 안정성( stability), 결합 능력(binding ability), 윤활제( lubrication), 붕해 능력(disintegrating ability) 등이 없이 조성물에 제공하기 위하여, 제형에 삽입되는 불활성 물질(inert substance)을 의미한다. "희석제"는 부형제의 유형이다.
본 발명의 범위 내에서 사용된 "유기 용매(Organic solvents)"는 당 분야에서 잘 알려진 것을 포함하고, 예를 들면, C1 - 4알킬알코올, 디메틸 설폭사이드 ("DMSO") 등이 있다.
여기에서 사용된, " 치료제(therapeutic agent)" 는 포유류(mammal)에 치료적으로 효과적인 양을 투여하여, 포유류에 치료적 이득을 제공하는 화합물을 의미한다. 치료제는 여기에서 약물과 같이 언급될 수 있다. 당 기술분야에서는 규제 승인을 받은 약물에 제한되지 않는 "치료제"의 용어로 인식될 수 있다. "치료제"는 여기에서 언급된 화합물, 레티노이드(retinoid), 및/또는 2차 지질 (second lipid)과 효력적으로 관련된 것일 수 있다. 예를 들면,여기에 기재된 2차 지질은 리포좀으로 구성될 수 있고, 상기 치료제는 여기에 기재된 리포좀과 효력적으로 관련된 것일 수 있다.
여기에서 사용된, "레티노이드(retinoid)"는 머리-꼬리 (head-to-tail)방식으로 결합된 4개의 이소프레노이드 (isoprenoid)단위로 구성된 화합물의 클래스의 멤버이다( G. P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents," 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)를 참조). "비타민 A(Vitamin A)"는 레티놀(retinol)의 생물학적 활성이 질적으로 발현되는 레티노이드를 위한 제네릭 디스크립터(generic descriptor)이다. 여기에서, 레티노이드는 제1세대, 제2세대 및 제3세대의 레티노이드를 포함하는 천연 및 합성 레티노이드를 의미한다. 천연적으로 발생하는 레티노이드의 예는, (1) 11-cis-레티날, (2) all-trans 레티놀, (3) 레티닐 팔미테이트 (retinyl palmitate), (4) all-trans 레티노산, 및 (5) 13-cis-레티노산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 나아가, "레티노이드"의 용어는 레티놀(retinol), 레티날(retinal), 레티노산(retinoic acid), 레티노이드( retinoid), 및 이들의 유도체를 포함한다.
여기에서 사용된, "레티노이드 컨쥬게이트(retinoid conjugate)"는 적어도 하나의 레티노이드 부분을 포함하는 분자를 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 레티노이드 컨쥬게이트는 약 0.1 내지 10 몰비 당량으로, 약 0.1 내지 10 몰% 당량의 조성물 또는 제형의 전체 중량을 기준으로 약 0.3 내지 약 30 중량%의 농도로 나타날 수 있다. 바람직하게, 상기 레티노이드 컨쥬게이트는 레티노이드-링커-지질 분자 또는 레티노이드-링커-레티노이드 분자이다.
레티노이드 컨쥬게이트의 예로는 하기 화학식 II의 화합물을 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00014
여기서 q, r, 및 s 는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10이고, 및 이의 거울상 이성질체(enantiomers) 및 부분입체이성질체(diastereomers)이다.
바람직한 화학식 II의 화합물은 상기 q, r, 및 s 가 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7인 것을 포함한다. 보다 바람직한 화학식 II의 화합물은 상기 q, r, 및 s 가 각각 독립적으로 3, 4 또는 5인 것이다. 가장 바람직한 화학식 II의 화합물은 q 는 3, r 은 5, 및 s 는 3인 것이다. 화학식 II의 화합물의 하나의 예로는 다음과 같다:
Figure pct00015
DiVA-PEG-DiVA
입체중심(stereocenter) 및 거울상 이성질체(enantiomers) 및 부분입체이성질체(diastereomers)를 포함하는 DiVA-PEG-DiVA 는 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
여기에서 사용된, “레티노이드-링커-지질 분자(retinoid-linker-lipid molecule)”는 적어도 하나의 지질 부분에 적어도 하나의 링커, 예를 들면 PEG 부분을 통해 결합된 적어도 하나의 레티노이드 부분을 포함하는 분자를 의미한다.
여기에서 사용된 “레티노이드 링커-레티노이드 분자”는 적어도 하나의 레티노이드 부분에 적어도 하나의 링커, 예를 들면 PEG 부분을 통해 다른 레티노이드 부분(동일 또는 상이할 수 있는)에 결합된 분자를 의미한다.
여기에서 사용된, “지질(lipid)” 및 “친유성(lipophilic)” 용어는 여기에서, 당 기술분야에 의해 이해되는 이들의 기원적 의미로 사용된다. 제한되지 않는 지질기 및 친유성기는 지방산(fatty acid), 스테롤(sterol), C2-C50 알킬, C2-C50 헤테로알킬, C2-C50 알케닐, C2-C50 헤테로알케닐, C2-C50 아릴, C2-C50 헤테로아릴, C2-C50 알키닐, C2-C50 헤테로알키닐, C2-C50 c카르복시알케닐, 및 C2-C50 카르복시헤테로 알케닐이다. 지방산( fatty acid)은 12 내지 24 탄소 원자로 구성된 포화 또는 불포화된 긴-사슬 모노카르복실산이다. 지질(lipid)은 필수적으로 물에 불용성으로 약 0.01% (중량 기준) 미만의 물에 대한 용해도를 가지는 것을 특징으로 한다. 여기에서 사용된 “지질 부분(lipid moiety)” 및 “친유성 부분(lipophilic moiety)”은 또 다른 기에 연결되는 이의 지질 또는 일부를 의미한다. 예를 들면, 지질기는 지질의 기능기(카르복실산기와 같은)와 모노머의 적절한 기능기 사이의 화학적 반응에 의해 또 다른 화합물(예를 들면, 모노머(monomer) )에 연결될 수 있다.
여기에서 사용된, "성상 세포(stellate cell)" 는 세포 몸으로부터 발산된 여러 개의 수상 돌기(dendrite)를 가진 신경세포를 의미한다. 성상 세포의 예로는 억제성 신경세포간 세포(inhibitory interneuron) 이다.
여기에서 사용된, “siRNA”는 당 업계에 잘 알려진 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 침묵 RNA(silencing RNA) 의 작은 간섭 RNA를 의미한다. siRNA 는 당 업계에 잘 알려진, 특정 유전자 및 단백질 발현으로 간섭되는 것이 가장 주목할 만한 다양한 효과를 가지는 이중 가닥의 RNA 분자의 클래스이다.
용어”리포좀(liposome)” 은 여기에서 당업자에 의해 이해되는 기원적 의미로 사용되고, 수성 매체에 실질적으로 가까운 구조를 형성하는 극성, 친수성기에 부착된 지질을 포함하는 지질 이중층 구조를 의마한다. 일실시예에서, 상기 리포좀은 치료제 및 레티노이드와 같은 하나 이상의 화합물에 연관될 수 있다. 리포좀은 단일 지질 이중층(즉, 단일층 (unilamellar)으로 구성될 수 있거나, 두 개 이상의 지질 이중층(즉, 다중 층(multilamellar))으로 구성될 수 있다. 리포좀의 내부는 다양한 화합물로 구성될 수 있으나, 리포좀의 외부는 리포좀을 포함하는 수용성 제형으로 접근할 수 있다. 리포좀은 대략적으로 구형 또는 타원형일 수 있다.
일실시예에서, 상기 siRNA가 수용 매체에 접근할 수 있도록 하기 위하여 리포좀에 의해 캡슐화될 것이다. siRNA를 캡슐화하면, 상기 리포좀은 고체 코어를 가질 것이다; 여기에서는, siRNA를 캡슐화하고 “지질 나노입자” 라고 하는 고체 코어를 가지는 리포좀. 다른 일실시예에서, 상기 siRNA는 리포좀에 의해 캡슐화되지 않을 것이다. 다른 실시예에서, 상기 siRNA는 수용액 내의 RNA와 미리 형성된 리포좀을 혼합하여 리포좀의 외부 표면에 착화할 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 siRNA는 수성 매체에 접근할 수 있다. 자신의 외부 표면에 siRNA를 가지는 리포좀은 여기에서 “리포플렉스(lipoplexes)”라고 한다.
본 발명의 제형은 또한 PEG-공액 지질(PEG-conjugated lipid)을 포함할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서의 PEG-공액 지질은 당 분야에 공지된 것이다. 적절한 PEG- 지질은 PEG-인지질(phospholipid) 및 PEG-세라마이드(ceramide), 예를 들면, PEG2000-DSPE, PEG2000-DPPE, PEG2000-DMPE, PEG2000-DOPE, PEG1000-DSPE, PEG1000-DPPE, PEG1000-DMPE, PEG1000-DOPE, PEG550-DSPE, PEG550-DPPE, PEG-550DMPE, PEG-1000DOPE, PEG-BML, PEG-콜레스테롤(Cholesterol). PEG2000-세라마이드, PEG1000- 세라마이드, PEG750- 세라마이드, PEG550- 세라마이드이다.
본 발명의 상술한 조성물은 하나 이상의 인지질, 예를 들면, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(“1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC”), 디팔미토일포스파티딜콜린(“dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC”), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(“1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE”), 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(“1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE”)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 도움(helper) 지질은 DOPE이다.
본 발명의 범위 내에서는 약학적으로 허용가능한 전달체(carrier) 또는 희석제(diluent)가 첨가된 상기 언급된 어느 조성물을 포함하는 약학적 제형이다. 본 발명의 약학적 제형은 적어도 하나의 치료제를 포함할 것이다. 바람직하게, 상기 치료제는 siRNA 이다. 이는 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있는 어느 siRNA분자를 구상한다. 예를 들면, siRNA는 다음을 포함한다:
센스(Sense) (5'->3') GGACAGGCCUCUACAACUATT (SEQ. ID. NO. 1)
안티센스(Antisense) (3'->5') TTCCUGUCCGGAGAUGUUGAU (SEQ. ID. NO. 2)
및
센스(Sense) (5'->3') GGACAGGCCUGUACAACUATT (SEQ. ID. NO. 3)
안티센스(Antisense) (3'->5') TTCCUGUCCGGACAUGUUGAU (SEQ. ID. NO. 4)
siRNA를 포함하는 본 발명의 바람직한 제형에서, 상기 siRNA는 리포좀에 의해 캡슐화된다. 다른 실시예에서, 상기 siRNA는 리포좀의 외부일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 siRNA는 리포좀의 외부에 착화될 수 있다.
또한, 본 발명의 범위에서 환자에게 치료제를 전달하는 방법이다. 이러한 방법은 상술한 어느 조성물 및 약학적으로 허용가능한 전달체 또는 희석제를 포함하는 약학적 제형을 제공하는 것; 및 환자에게 상기 약학적 제형을 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 계면 활성제 (계면 활성제), 약학적 담체, 희석제, 부형제 및 현탁제 또는 이들의 조합; 및 여기에 기재된 제형(예를 들면, 화합물, 레티노이드, 2차 지질, 안정화제, 및/또는 치료제를 포함하는 제형)을 포함하는 약학적 제형에 관한 것이다. 치료적 사용을 위하여 허용가능한 부가적인 약학적 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들면, 본 명세서에서 인용된, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)에 개시되어 있다.
보존제(preservatives), 안정화제(stabilizers), 염료(dyes) 등을 약학적 제형에 제공할 수 있다. 예를 들면, 소듐벤조에이트(sodium benzoate), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 p-하이드록시벤조산의 에스터는 보존제로 첨가될 수 있다. 추가적으로, 산화 방지제( antioxidant) 및 현탁제(suspending agent)를 사용할 수있다.다양한 실시예에서, 알코올, 에스터, 지방족 알코올 설페이트 등은 계면활성제로 사용될 수 있고; 수크로스, 글루코스, 락토스, 전분, 결정화된 셀룰로즈, 만니톨, 라이트 무수 실리케이트, 마그네슘 알루미네이트, 마그네슘 메타 실리케이트 알루미네이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 탄산 칼슘, 나트륨 산 카보네이트, 인산 수소 칼슘, 칼슘 카르복시 메틸 셀룰로오스 등이 부형제로 사용될 수 있고; 코코넛 오일, 올리브 오일, 참기름(sesame oil), 땅콩 오일, 콩이 현탁제 또는 윤활제로서 사용될 수있고; 폴리 비닐의 유도체로서 셀룰로즈 또는 당 또는 메틸 아세테이트 - 메타크릴레이트 공중합체와 같은 탄수화물의 유도체로서 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트가 현탁제로서 사용될 수 있고; 에스테르 프탈레이트 등과 같은 가소제가 현탁제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 기재된 약학적 제형은 그 자체로서 인간 환자에게 투여될 수 있고, 또는 조합 요법으로서 다른 활성 성분 또는 약학적 담체 또는 부형제와 혼합되는 약학적 제형일 수 있다. 본 발명의 화합물의 제형 및 투여에 대한 기술은 “ Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990”에서 찾을 수 있다.
적절한 투여 경로는, 예를 들면, 근육 내, 피하, 정맥 내, 골수 내 주사뿐만 아니라 경막 내, 직접 심실 내(intraventricular), 복강 내(intraperitoneal,), 비강 내(intranasal), 또는 안 내(intraocular) 주사를 포함한 비경구 전달 (parenteral delivery )을 포함한다. 상기 제형(예를 들면, 화합물, 레티노이드, 2 차지질, 안정화제 및 / 또는 치료제를 포함할 수있는 제형)은 또한 소정의 속도로 연장된 및/또는 제시간의, 간격의 투여를 위하여 데포 주사, 삼투압 등을 포함하는 방출 복용 형태를 지속적으로 또는 조절하여 투여할 수 있다. 또한, 투여 경로는 국소적 또는 전신적일 수 있다.
상기 약학적 제형은 공지의 방식, 예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립(granulating), 드라제-제조(dragee-making), 가루(levigating), 유화(emulsifying), 캡슐화, 포괄(entrapping) 또는 타블렛 과정으로 제조될 수 있다.
약학적 제형은 활성 화합물을 약학적으로 사용할 수 있도록 제조하기 위한 과정이 용이한 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 약학적 담체를 사용하여 어느 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제형은 선택하는 투여 경로에 의존한다. 약학적 담체 및 부형제에 대하여 잘 알려진 기술을 적절하게 당 분야에서 이해되도록 사용될 수 있다; 예를 들면, 레밍톤의 약학적 과학(Remington’s Pharmaceutical Sciences).
주입액은 액체 용액 또는 현탁액, 주입 전 액체에 용액 또는 현탁액으로 적절한 고체 형태 또는 에멀전과 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 적절한 부형제는 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로오스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 나트륨 글루타메이트, 시스테인 히드로 클로라이드 등이 있다. 추가적으로, 요구된다면, 주입할 수 있는 약학적 제형은 습윤제, 산도 완충제 등과 같은 비 독성 보조 물질을 소량으로 함유 할 수 있다. 생리학적으로 호환 가능한 버퍼는 행크스 용액(Hanks’s solution), 링거 용액(inger’s solution), 또는 생리 식염수 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 요구된다면, 흡수 강화 제형이 이용될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들면, 정맥 주사 또는 지속 주입을 위한 약학적 제형은 물에 용해되는 형태의 활성 제형의 수용액 (예를 들면, 화합물, 레티노이드, 2차 지질제, 안정 화제 및 / 또는 치료제를 포함 할 수있는 제형) 을 포함한다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스 트란과 같은 현탁액의 점도를 증가 물질을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 또한 높은 농도의 용액의 제조를 허용하는 화합물의 용해도를 증가시키기 위하여 적절한 안정화제 또는 시약(agent)을 함유할 수 있다. 주입용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들면, 방부제가 첨가된 앰플 또는 다중 - 투여 용기로 제조될 수 있다. 상기 제형은 유성 또는 수성 물질에서 현탁액, 용액 또는 에멀전과 같은 형태로 할 수 있고, 현탁제, 안정 화제 및 / 또는 분산제와 같은 제형 화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 활성 성분은 적절한 물질, 예를 들면, 사용 전 멸균 주사용 증류수와 함께 구성을 위하여 분말 형태일 수 있다.
상기 기재의 제조에 추가적으로, 상기 제형은 데포(depot) 제조로서 제형될 수 있다. 장기 작용 제형은 근육 내 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 제형(화합물, 레티노이드, 2차 지질, 안정 화제 및 / 또는 치료제를 포함할 수 있는 제형)은 적절한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 오일의 에멀전) 또는 이온 교환 수지 또는 예를 들면, 난용성 염과 같은 난용성 유도체로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 제형은 국소 전달을 위해 제형화될 수 있고, 국소 전달 비히클의 적용을 위한 적절한 과정을 사용하여 대상자의 피부에 적용될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 공급자를 사용하여 수동적으로 적용될 수 있거나, 이를 모두 포함하는 방법으로 적용될 수 있다. 적용에 따라 상기 제형은 대상자의 피부, 예를 들면 마찰 접종(rubbing)에 의해 할 수 있다. 적용은 하루에 여러 번 또는 하루 한 번 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 하루 1회, 하루 2회 또는 하루 여러 번 대상자의 피부에 적용될 수 있거나, 2일에 1회, 3일에 1회 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회 또는 몇 주에 1회로 적용될 수 있다.
여기에서 일부 실시예는 세포에 치료제를 전달하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 어떤 실시예는 세포에 siRNA와 같은 치료제를 전달하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 기재된 방법에 따라 사용하기 위한 적절한 세포는 원핵 생물, 효모, 식물 및 동물 세포(예를 들면 포유류 세포)를 포함하는 진핵 세포를 포함한다. 일실시예에서, 상기 세포들은 인간 섬유 육종 세포(예를 들면., HT1080 세포주)가 될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 세포들은 간성상 세포(hepatic stellate cell) (LX2 cell line)가 될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포는 암세포가 될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 줄기 세포(stem cell) (pHSC 세포주)일 수 있다. 암에 대한 모델 시스템의 세포주는 유방암 (MCF-7, MDA-MB-438 세포주), U87의 아교 모세포종 세포주, B16F0 세포 (흑색 종), HeLa 세포 (자궁 경부암), A549 세포 (폐암), 및 쥐 종양 세포주 GH3 및 9L을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 실시예에서, 여기에 기재된 상기 제형은 세포를 형질 감염할 수 있다. 이러한 실시예들은 세포에 치료제를 전달하기 위한 치료제를 포함하는 제형으로 그 세포에 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
비정상적 섬유종(abnormal fibrosis)에 의해 특정된 질환을 치료하기 위한 여기에 기재된 제형의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 방법이 개시된다. 비정상적 섬유종(abnormal fibrosis)에 의해 특정된 질병은 암 및/또는 섬유성 질환을 포함할 수 있다. 여기에 기재된 제형으로 치료 또는 개선할 수 있는 암의 유형은 폐암, 췌장암, 유방암, 간암, 위암 및 대장암을 포함 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일실시예에서, 치료 또는 개선할 수 있는 상기 암은 췌장암(pancreatic cancer)이다. 다른 일실시예에서, 치료 또는 개선할 수 있는 상기 암은 폐암(lung cancer)이다. 여기에 기재된 제형으로 치료 또는 개선할 수 있는 섬유성 질환의 유형은 간 섬유화(hepatic fibrosis), 간경변(hepatic cirrhosis), 췌장염(pancreatitis), 췌장 섬유증(pancreatic fibrosis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 성대 흉터(vocal cord scarring), 성대 점막 섬유증(vocal cord mucosal fibrosis), 후두 섬유증(laryngeal fibrosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 골수 섬유증(myelofibrosis), 복막 섬유화(retroperitoneal fibrosis) 및 신원성 전신 섬유증(nephrogenic systemic fibrosis)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일실시에서 치료 또는 개선할 수 있는 질환은 간 섬유화(hepatic fibrosis)이다.
본 명세서에 기재된 제형 및 약학적 조성물은 적절한 수단에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 투여 방법은 생체 조직과 접촉하는 활성 화합물을 전달하기 위하여 당 업자들에 의해 적절하다고 인정되는 (a) 주사에 의한 투여, 피하(subcutaneously), 복강 내(intraperitoneally), 정맥 내(intravenously), 근육 내(intramuscularly), 피 내(intradermally), 안와 내(intraorbitally), 관절낭 내(intracapsularly), 척수 내 (intraspinally), 흉골 내 (intrasternally) 또는 주입 펌프 전달 등; (b) 신장(renal) 또는 심장 영역 (cardiac area)에 직접적으로 주사하는 것과 같은 국소적 투여, 예를 들면, 데포 이식(depot implantation); 이나, 이에 제한되지 않는다.
투여에 적절한 약학적 조성물은 의도된 목적을 달성하기 위하여 유효량으로 활성 성분을 담은 제형 (예를 들면, 화합물, 레티노이드, 2차 지질, 안정 화제 및 / 또는 치료제를 포함 할 수있는 제형)을 포함한다. 투여량으로서 요구되는 여기에 기재된 상기 화합물의 치료학적으로 유효한 양은 투여 경로, 인간을 포함하는 동물의 유형, 치료됨, 및 고려 중인 특정 동물의 신체적 특성에 의존될 수 있다. 상기 투여량은 요구되는 효과를 달성하기 위하여 맞출 수 있으나, 체중, 식이 요법, 약물 병행 및 의학 분야의 당업자가 인식할 수 있는 다른 요소에 의존되어야 할 것이다. 특히, 치료적으로 유효한 양은 치료되는 대상의 생존의 연장 또는 질환의 예방, 완화 또는 개선을 위한 효과적인 화합물의 양을 의미한다. 치료적으로 유효한 양의 결정은 여기에 기재된 상세한 내용에 비추어 당업자의 능력 내에 있다.
당업자에게는 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 투여되어 생체 내 유용한 투여량 및 투여의 특정 모드는 나이, 체중 및 치료되는 포유동물의 종, 공급된 특정 화합물 및 공급된 특정 화합물의 특별한 사용에 의해 다양하게 변화할 것이다. 효과적인 투여량 수준, 요구되는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 수준의 결정은 일상적 약리학 방법을 사용하여 당업자에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 제품의 인간 임상 적용은원하는 효과가 달성될 때까지 증가되는 투여 수준으로서 낮은 투여 수준에서 시작된 다. 대안적으로, 허용가능한 생체 외 연구는 확립된 약리학 방법을 사용하여 현재의 방법으로 확인된 유용한 투여 및 조성물의 투여의 경로를 확립시키기 위하여 사용될 수 있다.
비-인간적 동물 연구에서, 잠재적 제품의 적용은 원하는 효과가 더 도달되지 않거나 부작용이 사라질 때까지 감소되는 투여량으로서 높은 용량의 수준에서 시작된다. 투여량은 요구되는 효과 및 치료 지시에 의존하여 광범위할 수 있다. 전형적으로, 투여량은 약 10 마이크로그램 / kg 내지 약 100 ㎎ / kg 체중일 수 있고, 바람직하게는 약 100 마이크로 그램 / kg 내지 약 10 마이크로 그램 / kg 일 수 있다. 대안 적으로, 투여량은 당업자에게 이해되는 바와 같이, 환자의 표면적에 따라 기초되고 계산될 수 있다.
약학적 조성물에 대한 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개인의 의사에 의해 선택될 수 있다. (예를 들면, 여기에서 인용되는 Fingl et al. 1975, "치료학의 약리학 기초” 특히, 장 1, p. 1 참조). 일반적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 투여량의 범위는 환자의 체중의 약 0.5 내지 1000 mg/kg 일 수 있다. 상기 투여량은 환자에 필요한 바에 따라, 하루 이상의 코스에 주어진 단일의 하나 또는 두 개 이상의 시리즈일 수 있다. 적어도 어떤 조건을 가지는 화합물에 대한 인간의 투여량의 경우, 상기 투여량은 동일 또는 확정된 인간 투여량의 약 0.1 % 내지 약 500%, 보다 바람직하게는 약 25% 내지 약 250% 이다. 새롭게 발견된 약학적 조성물에 대한 경우로 인간 투여량이 확정되지 않았다면, 동물에서 독성 연구 및 효능 연구에 의해 적절한 인간 투여량은 ED50 또는 ID50 값 또는 시험관 내에서 또는 생체 내 연구로부터 유도된 다른 적절한 값으로부터 유추할 수 있다.
독성 또는 장기 기능 장애로 인하여 투여를 종료, 중단 또는 조절하는 방법 및 시기는 주치의가 알고 있어야 함을 주목해야 한다. 반대로, 주치의는 또한 임상적 반응이 충분하지 않다면 높은 수준으로 치료를 조절하는 것을 알고 있어야 한다(독성은 배제함). 관심의 장애의 관리에서 투여되는 투여량의 크기는 투여 경로 및 치료될 상태의 중증도에 따라 달라질 것이다. 증상의 중증도는 예를 들면, 표준 예후 평가 방법에 의해 부분적으로 평가될 수 있다. 또한, 복욕량 및 투여 빈도는 나이, 체중, 개인적 환자의 반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 논의된 것과 유사한 프로그램은 수의학(veterinary medicine)에서 사용될 수 있다.
정확한 투여량은 대부분의 경우에서 약물에 의한 약물 기준으로 결정되더라도 투여량에 대하여 일반화될 수 있다. 성인 환자에 대한 일일 투여 요법은, 예를 들면, 각각 활성 성분에 대하여 약 0.1 mg 내지 2000 mg, 바람직하게는 약 1 mg 내지 약 500 mg, 예를 들면, 5 내지 200 mg일 수 있다. 다른 실시예에서 각각의 활성 성분의 정맥 내, 피하 내 또는 근육 내 투여량은 약 0.01 mg 내지 약 100 mg이고, 바람직하게 약 0.1 mg 내지 약 60 mg, 예를 들면, 약 1 내지 약 40 mg 이 사용된다. 약학적으로 허용 가능한 염의 투여의 경우, 투여량은 유리 염기(free base)로서 계산될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제형은 하루 1 내지 4 를 투여한다. 대안적으로, 상기 제형은 바람직하게 하루 최대 약 1000 mg 의 각각의 활성 성분의 투여량으로 지속적 정맥 내 주입에 의해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 특히 공격적인 질환 또는 감염을 효과적이고 공격적으로 치료하기 위한 특정 상황에서는 상술한 바람직한 투여량의 범위를 초과 또는 훨씬 초과된 양의 여기에 기재된 제형을 투여할 필요가 있을 수 있다. 일실시예에서, 상기 제형은 지속적 요법, 예를 들면, 1주 이상 또는 수월 또는 수년 동안의 기간 동안 투여될 것이다.
투여의 양 및 간격은 조율 효과 또는 최소 유효 농도(MEC)를 유지하기 위한 충분한 활성 부분의 혈장 수준을 제공하기 위하여 개별적으로 조절될 수 있다. 상기 최소 유효 농도는 각각 화합물에 대하여 다양할 수 있으나, 시험관 내(in vitro) 데이터로부터 추정할 수 있다. MEC을 달성하기 위하여 필요한 투여량은 개인의 특성 및 투여 경로에 의존될 수 있다. 그러나, HPLC 분석법 또는 생물 검정(bioassa)은 혈장 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.
투여 간격은 MEC 값을 사용하여 결정할 수 있다. 조성물은 시간의 10-90%, 바람직하게는 30-90%, 가장 바람직하게는 50-90% 에 대한 MEC 혈장 수준을 유지하는 요법을 사용하여 투여되어야 한다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우에, 약물의 효과적인 국소적 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.
투여되는 제형의 양은 치료되는 대상, 그 대상의 체중, 고통의 심각성, 투여 방식 및 처방 의사의 판단에 의존될 수 있다.
본 발명에 개시된 제형 (예를 들면.,화합물, 레티노이드, 2차 지질, 안정 화제 및 / 또는 치료제를 포함할 수 있는 제형)은 공지된 방법을 사용하여 효능과 효과를 평가할 수 있다. 예를 들면, 특정 화합물 또는 특정 화학적 부분을 공유하는 화합물의 서브셋 (subset)의 독성학은 포유류, 바람직하게는 인간, 세포주와 같은 세포주에 대하여 시험관 내 독성을 측정으로 확립될 수 있다. 이러한 연구의 결과는 종종 포유류 또는 특히 인간과 같은 동물에서 독성의 예측이다. 대안적으로, 쥐, 랫트, 토끼 또는 원숭이와 같은 동물 모델에서 특정 화합물의 독성은 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 특정 화합물의 효능은 생체 외 방법, 동물 모델 또는 인간 임상 시험과 같은 여러가지 인식된 방법을 사용하여 확립될 수 있다. 생체 외 모델에서의 인식은 암(cancer), 심혈관질환(cardiovascular disease) 및 다양한 면역 기능 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 질환의 거의 모든 클래스에 대해 존재한다. 유사하게, 허용가능한 동물 모델은 그런 질환의 치료를 위한 화학 물질의 효능의 확립을 위하여 사용된다. 효능의 결정을 위한 모델의 선택은 당업자가 적절한 모델, 투여량 및 투여 경로 및 체제를 선택하여 종래 기술로 유도될 수 있다. 물론 인간 임상 시험은 또한 인간에게 화합물의 효능을 결정하는데 사용될 수 있다.
상기 제형은, 요구된다면, 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 보관할 수 있는 팩( pack) 또는 디스펜서 장치(dispenser) 내에 존재할 수 있다. 상기 팩은 예를 들면, 블리스터 팩(blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 지시와 동반될 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 제조, 사용 또는 약학적 판매를 조절하는 정부기관에 의해 규정된 형태에서의 콘테이너와 관련된 공지와 함께 동반될 수 있고, 상기 공지는 인간 또는 동물에 대한 약물의 형태의 기관에 의한 승인이 반영된다. 공지는 예를 들면, 처방전이 필요한 약물 에 대해 미국 식약청에서 승인된 표시일 수 있고, 승인된 제품에 삽입할 수 있다. 호환 가능한 약학적 담체 내에 제형된 화합물을 포함하는 조성물은 제조될 수 있고, 적절한 용기에 넣고 바람직한 질환의 치료에 대해 표시될 수 있다.
명백하게 입체화학이 명시되지 않았다면, 각각 중심은 독립적으로 R- 구성 또는 S-구성 또는 이의 혼합일 수 있다. 따라서, 여기에서 제시된 화합물은 순수한 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체 혼합물 일 수 있다. 또한, E 또는 Z로 정의될 수 있는 기하학적 이성질체를 생성하는 하나 이상의 이중 결합을 가지는 어느 화합물은 각각 E 또는 Z, 이의 혼합물일 수 있다. 마찬가지로 토토머 형태( tautomeric form)도 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 범위 내에서 바람직한 화학식 I의 화합물을 표 1에 나타내었다. 생체 외(In vitro ) 및 생체 내(in vivo ) 데이터 또한 표 1에 나타내었다.
지질 구조 in vitro
( pHSC )
% KD 		in vivo
(rat DMNQ )
% KD
i- Pr - DC
Figure pct00016
 53%
@ 50 nM		 　
i- Pr - DODC
Figure pct00017
 60%
@ 50 nM		 　
i- DC
Figure pct00018
 89%
@ 200 nM
i- Et -DC ( Et104 )
Figure pct00019
 65%
@ 50 nM		 　
i- Et - DODC
Figure pct00020
 43%
@ 50 nM		 　
i- Prop - DC
Figure pct00021
 55%
@ 50 nM		 　
i- Prop - DODC
Figure pct00022
 55%
@ 50 nM		 　
S104
Figure pct00023
 68%
@ 50 nM		 52% @ 0.5 mpk
S104 - DO
Figure pct00024
 78%
@ 20 nM		 65% @ 0.5 mpk
C104 　
Figure pct00025
 53%
@ 20 nM		 75% @ 0.5 mpk
SO2 - S104
Figure pct00026
 75%
@ 20 nM		 18% @ 0.5 mpk
TU104
Figure pct00027
 76%
@ 20 nM		 　
O104
Figure pct00028
 55%
@ 20 nM		 　
HEDC - M1
Figure pct00029
 53%
@ 20 nM		 　
C104 - DO
Figure pct00030
 32%
@ 20 nM		 　
Pr104
Figure pct00031
 54%
@ 20 nM		 　
Pr104 - DO
Figure pct00032
 27%
@ 20 nM		 　
T104
Figure pct00033
 58%
@ 20 nM		 　
TU104 - DO
Figure pct00034
 81%
@ 20 nM		 　40%
@ 0.25 mpk
CB104
Figure pct00035
 42%
@ 20 nM		 　
CA104
Figure pct00036
 　
INT -4
Figure pct00037
 70%
@ 50 nM		 　
S104 - DMO
Figure pct00038
 40%
@ 10 nM		 　
Pro - DC
Figure pct00039
S104 - DLin
Figure pct00040
TU104 - DLin
Figure pct00041
본 발명은 다음의 실시예를 참고하여 더욱 예시될 수 있다. 이러한 예는 본 발명을 단지 예시할 뿐 이에 제한되지 않는다.
실시예( EXPERIMENTAL SECTION )
((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (프로판-3,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 (i- Pr - DC )의 제조
Figure pct00042
단계 1: 중간체 1: 3,3'- 아잔디일비스(프로판-1-올)의 제조
Figure pct00043
3-아미노-1-프로판올 (14.5 mL, 19.0 mmol), 1-클로로-3-하이드록시 프로판 (8.00 mL, 95.6 mmol) 및 H2O (~50mL) 의 혼합물을 24시간 동안 환류하였다. 포타슘 하이드록사이드 (5.40 g)를 더 첨가하였다. 용해시킨 후, 점성의 오일 및 많은 양의 포타슘 클로라이드가 남도록 모든 물을 감압증류하였다. 이를 필터하고, 건조 아세톤 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 상기 유기층을 오일만 남도록 Na2SO4로, 건조시키고 필터하여 감압증류하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 3,3'-아잔디일비스(프로판-1-올) (12.5g)을 얻었다.
단계 2: 중간체 2: tert -부틸 비스(3-하이드록시프로필)카바메이트의 제조
Figure pct00044
3,3'-아잔디일비스(프로판-1-올) (12.5 g, 95.4 mmol)를 DCM (25 mL)에 묽혔다. 아르곤 가스 존재하에 교반하면서 디-tert-부틸 디카보네이트 (26.0 g, 119 mmol) 의 DCM (25 mL) 용액을 천천히 넣었다. 반응을 밤샘 진행하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 비스(3-하이드록시프로필)카바메이트를 얻었다.
단계 3: 중간체 3: (( tert - 부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 비스 (프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00045
tert-부틸 비스(3-하이드록시프로필)카바메이트(4.00 g, 17.3 mmol), Et3N (4.8 mL, 34.6 mmol) 및 DMAP (529 mg, 4.33 mmol) 를 클로로포름 (50 mL)에 용해시켰다. 얼음 수조에서 교반시키면서, 미리스토일 클로라이드(myristoyl chloride)를 15분 동안 첨가하였다. 상기 첨가는 반응의 온도가 30℃ 를 초과하지 않는 방법으로 수행하였다. 상기 반응을 실온에서 밤샘교반하였다. 다음 날, 반응을 종결하기 위하여 MeOH (50 mL) 및 0.9% 살린 용액(50 mL) 를 첨가하였다. 상기 유기층을 분리하고 1M NaHCO3로 세척하였다. 용매를 Na2SO4로 건조시키고, 필터하고, 감압 농축하여 정제없이 수행하여 오일의 ((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다.
단계 4: 중간체 4: 아잔디일비스 (프로판-3,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 제조
Figure pct00046
((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트 (11.3 g, 17.3 mmol) 를 TFA/CHCl3 (1:1, 20 mL)에 용해시키고, 상기 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반하였다. 상기 물질을 감압농축하였다. 이를 몇번 반복하였다. 상기 물질을 DCM에 녹이고 물로 세척하고, Na2SO4로 건조시켜 감압 농축 및 밤샘 건조하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 아잔디일비스(프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (7.5 g)을 얻었다.
단계 5: i- Pr - DC : ((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (프로판-3,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00047
아잔디일비스(프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (750 mg, 1.35 mmol) 을 DCM (5 mL)에 용해시켜 미리 활성화된 N,N-디메틸글리신 (154 mg, 1.49 mmol), HATU (616 mg, 1.62 mmol) 및 DIEA (495 uL, 2.84 mmol)의 DCM (5 mL) 혼합물에 첨가하였다. 플라스크에 아르곤을 주입하고 실온에서 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 ((2-(디메틸아미노)아세틸)아잔디일)비스(프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트 (465 mg)를 얻었다. QTOF MS ESI+: m/z 639.6 (M + H).
(Z)-((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (프로판-3,1- 디일 ) 디올리에이트 (i- Pr - DODC ) 의 제조
Figure pct00048
단계 1: 중간체 1의 제조: 3,3'- 아잔디일비스 (프로판-1-올)
Figure pct00049
3-아미노-1-프로판올 (14.5 mL, 19.0 mmol), 1-클로로-3-하이드록시 프로판 (8.00 mL, 95.6 mmol) 및 H2O (~50mL) 의 혼합물을 24시간 동안 환류하였다. 포타슘 하이드록사이드 (5.40 g)를 더 첨가하였다. 용해시킨 후, 점성의 오일 및 많은 양의 포타슘 클로라이드가 남도록 모든 물을 감압증류하였다. 이를 필터하고, 건조 아세톤 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 상기 유기층을 오일만 남도록 Na2SO4로, 건조시키고 필터하여 감압증류하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 3,3'-아잔디일비스(프로판-1-올) (12.5g)을 얻었다.
단계 2: 중간체 2의 제조: tert -부틸 비스(3-하이드록시프로필)카바메이트
Figure pct00050
3,3'-아잔디일비스(프로판-1-올) (12.5 g, 95.4 mmol)를 DCM (25 mL)에 묽혔다. 아르곤 가스 존재하에 교반하면서 디-tert-부틸 디카보네이트 (26.0 g, 119 mmol) 의 DCM (25 mL) 용액을 천천히 넣었다. 반응을 밤샘 진행하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 비스(3-하이드록시프로필)카바메이트를 얻었다.
단계 3: 중간체 3의 제조: (Z)-(( tert - 부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 비스 (프로판-3,1-디일) 디올리에이트
Figure pct00051
tert-부틸 비스(3-하이드록시프로필)카바메이트, 트리에틸아민 및 DMAP 를 클로로포름에 용히시켰다. 얼음 수조에서 교반시키면서, 올레일 클로라이드(oleyl chloride)를 15분 동안 첨가하였다. 상기 첨가는 반응의 온도가 30℃ 를 초과하지 않는 방법으로 수행하였다. 상기 반응을 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음 날, 반응을 종결하기 위하여 MeOH (50 mL) 및 0.9% 살린 용액(50 mL) 를 첨가하였다. 상기 유기층을 분리하고 1M NaHCO3로 세척하였다. 용매를 Na2SO4로 건조시키고, 필터하고, 감압 농축하여 정제없이 수행하여 오일의 ((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(프로판-3,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다.
단계 4: 중간체 4의 제조: (Z)- 아잔디일비스 (프로판-3,1- 디일 ) 디올리에이트 TFA 염
Figure pct00052
(Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(프로판-3,1-디일) 디올리에이트 (13.2 g, 17.3 mmol) 를 TFA/CHCl3 (1:1, 20 mL)에 용해시키고, 상기 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반하였다. 상기 물질을 감압농축하였다. 이를 몇번 반복하였다. 상기 물질을 DCM에 녹이고 물로 세척하고, Na2SO4로 건조시켜 감압 농축 및 밤샘 건조하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (Z)-아잔디일비스(프로판-3,1-디일) 디올리에이트 TFA 염을 얻었다.
단계 5: i- Pr - DODC 의 제조: (Z)-((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (프로판-3,1- 디일 ) 디올리에이트
Figure pct00053
(Z)-아잔디일비스(프로판-3,1-디일) 디올리에이트 TFA 염 (750 mg, 1.13 mmol) 을 DCM (5 mL)에 용해시켜 미리 활성화된 N,N-디메틸글리신 (128mg, 1.24mmol), HATU (517mg, 1.36mmol) 및 DIEA (413uL, 2.37mmol) 의 DCM (5mL) 혼합물에 첨가하였다. 플라스크에 아르곤을 주입하고 실온에서 밤샘 교반하였다.상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH 그레디언트를 사용하여 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (Z)-((2-(디메틸아미노)아세틸)아잔디일)비스(프로판-3,1-디일) 디올리에이트 (450 mg)를 얻었다. QTOF MS ESI+: m/z 747.7 (M + H).
((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 , (i- DC )의 제조
Figure pct00054

단계 1: 중간체 1의 제조: (( tert - 부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트
Figure pct00055
N-Boc 디에탄올아민 (MW 205.25; 8.4 g, 0.041 mole), 트리에틸아민 (MW 101.19; 11.5 ml, 0.083 mol) 및 4-(디메틸아미노)피리딘 (MW 122.17; 1.3 g, 0.011 mole) 를 클로로포름 (170 mL)에 용해시켰다. 얼음/물 수조에서 교반시키면서 미리스토일 클로라이드(myristoyl chloride) (MW 246.82; 22 mL, 80.9 mmol) 의 100 mL 클로로포름을 천천히 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 차가운 수조에서 꺼내 실온에서 2시간 교반을 지속하였다. 반응을 종결하기 위하여 200 mL 의 메탄올 및 200 ml 의 0.9% 살린 혼합물을 첨가하였다. 교반을 멈추고 유기층을 분리하였다. 상기 용매를 회전 감압으로 제거하여 더 정제과정을 수행하지 않고 무색 오일의 ((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (25.7 g) 를 얻었다.
단계 2: 중간체 2: 아잔디일비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 제조
Figure pct00056
((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (33.0 g, 0.053 mole) 의 100 ml 의 클로로포름 용액을 트리플루오로아세트산 (150 mL, 2.02 mol)에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤샘 교반하였다. 회전 감압으로 용매를 제거한 후, 결과물의 부드러운 고체를 80 ml 의 메탄올로 재결정하여 흰색 고체의 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (16.6 g) 을 얻었다.
단계 3: i- DC 의 제조: ((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트
Figure pct00057
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염(10g, 16 mmol) 을 디메틸글리신 (42.5g, 25 mmol), DCC (4.7 g, 23 mmol) 및 DIEA (6.33 mL, 40 mmol) 의 피리딘 (20 mL)에 묽혔다. 둥근 바닥 플라스크에 아르곤을 주입하여 상기 반응 혼합물을 55℃ 로 밤샘 가열하였다. 다음날, 상기 반응 혼합물을 농축하였다. After purification by DCM/MeOH으로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 분획물을 농축하여 ((2-(디메틸아미노)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다.
((3-(디메틸아미노) 프로파노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카 노에이트 (i- Et - DC , 여기서 Et104 라고 함) 제조
Figure pct00058
i- Et - DC 의 제조: ((3-(디메틸아미노) 프로파노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트
Figure pct00059
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (1.50 g, 2.85 mmol) 을 DCM (10 mL)로 용해시켜 3-(디메틸아미노)프로피오닉산 HCl 염 (482 mg, 3.14 mmol), HATU (1.30 g, 3.42 mmol) 및 DIEA (1.04 mL, 5.98 mmol) 의 DCM (10 mL)의 미리 활성화된 혼합물에 첨가하였다. 둥근 바닥 플라스크에 아르곤 가스를 주입하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH으로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 분획물을 농축하여 DCM (20 mL) 및 10% K2CO3 (20 mL) 를 넣고 30분 동안 0-5℃ 에서 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고, 수용액 층에서 다시 DCM (2 x10 mL)로 더 추출하였다. 상기 유기층을 합쳐서 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM으로 세척하고 농축하여 ((3-(디메틸아미노)프로파노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (1.01 g)를 얻었다. QTOF MS ESI+: m/z 625.6 (M + H).
(Z)-((3-(디메틸아미노) 프로파노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디올리에이트 , i- Et - DODC 의 제조
Figure pct00060
단계 1: 중간체 1: (Z)-(( tert - 부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디 일) 디올리에이트의 제조
Figure pct00061
N-Boc 디에탄올아민 (17.8 g, 0.087 mole), 트리에틸아민 (24.4 mL, 0.176 mole) 및 4- (디메틸아미노)피리딘 (2.76 g, 0.023 mole) 를 350 ml 의 클로로포름에 용해시켰다. 교반시키면서, 올레일 클로라이드 (61.6 g, 0.174 mole) 의 100 ml 클로로포름에 10분 동안 첨가하였다(대안적으로, 상기 N-Boc 디에탄올아민의 클로로포름 용액은 올레일 클로라이드를 첨가하는 동안 얼음/물 수조에 존재시킨다). 상기 첨가는 50℃가 초과되지 않는 반응 온도에서 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 종결시키기 위하여 200 ml 의 메탄올 및 200 ml 의 0.9% 살린을 첨가하였다. 상기 유기층을 분리하고 2 × 100 ml 의 묽은 소듐바이카보네이트의 수용액으로 세척하였다. 상기 용매를 회전 감압하여 제거하여 노란색 오일의 (Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 (59.5 g)를 얻었다. 상기 물질은 정제과정 없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 0.87 (t,6H, CH3), 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.45 (s, 9H, tBu CH3), 1.59 (m, 4H, CH2CH2C(=O)), 2.00(m, 8H, CH2CH=CH), 2.33 (t, 4H, CH2C(=O)), 3.48 (m, 4H, NCH2CH2O), 4.18 (m, 4H,NCH2CH2O), 5.33 (m, 4H, CH=CH).
단계 2: 중간체 2: (Z)- 아잔디일비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디올리에이트 TFA 염의 제조
Figure pct00062
(Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 (59.5 g, 0.081 mole) 를 트리플루오로아세트산 (100 mL, 1.35 mol) 및100 ml 의 클로로포름으로 두 번 처리하였다. 각각 실온에서 10분동안 교반하고, 각 처리가 종결되면 상기 용매를 각각 회전 감압으로 제거하였다. 상기 잔류물을 200 ml 의 메틸렌클로라이드에 용해시키고, 상기 혼합물을 100 ml의 물로 두번 세척하였다. 상기 잔류물을 메탄올 및 메틸렌클로라이드의 혼합을 용리액으로 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 (Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염 (44.0 g)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 0.87 (t, 6H, CH3), 1.20-1.40 (m, 40H, CH2), 1.59 (m, 4H, CH 2CH2C(=O)),2.00 (m, 8H, CH 2CH=CH), 2.33 (t, 4H, CH 2C(=O)), 3.31 (m, 4H, NCH 2CH2O), 4.38 (m, 4H, NCH2CH 2O), 5.33 (m, 4H, CH=CH).
단계 3: i- Et - DODC : (Z)-((3-(디메틸아미노) 프로파노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디올리에이트의 제조
Figure pct00063
(Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염 (1.50 g, 2.37 mmol) 을 DCM (10 mL)에 용해시키고, 3-(디메틸아미노)프로피오닉산 HCl 염 (383mg, 2.49 mmol), HATU (1.03 g, 2.72 mmol) 및 DIEA (831 uL, 4.77 mmol) 의 DCM (10 mL)의 미리 활성화된 혼합물에 첨가하였다. 둥근 바닥 플라스크에 아르곤 가스를 주입하고, 상기 반응 혼합물을 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH으로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 분획물을 농축하여 DCM (20 mL) 및 10% K2CO3 (20 mL) 를 넣고 30분 동안 0-5℃ 에서 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고, 수용액 층에서 다시 DCM (2 x10 mL)로 더 추출하였다. 상기 유기층을 합쳐서 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM으로 세척하고 농축하여 (Z)-((3-(디메틸아미노)프로파노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트를 얻었다. QTOF MS ESI+: m/z 733.6 (M + H).
((4-(디메틸아미노) 부타노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 [i- Prop - DC ( Pr104 참조)]의 제조
Figure pct00064
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (1.00 g, 1.90 mmol) 을 DCM (5 mL)으로 묽히고 4-(디메틸아미노) 부틸릭 산 HCl 염 (382 mg, 2.28mmol), HATU (867 mg, 2.28 mmol) 및 DIEA (728 uL, 4.18 mmol) 의 DCM (5 mL)의 미리 활성화된 반응 혼합물에 첨가하였다. 둥근 바닥 플라스크에 아르곤 가스를 주입하고, 상기 반응 혼합물을 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH으로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 분획물을 농축하여 DCM (20 mL) 및 10% K2CO3 (20 mL) 를 넣고 30분 동안 0-5℃ 에서 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고, 수용액 층에서 다시 DCM (2 x10 mL)로 더 추출하였다. 상기 유기층을 합쳐서 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM으로 세척하고 농축하여 ((4-(디메틸아미노)부타노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 639.6 (M + H).
(Z)-((4-(디메틸아미노) 부타노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디올리에이 트 [i- Prop - DODC ( also referred to herein as Pr104 - DO )]의 제조
Figure pct00065
(Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. (Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염 (1.00 g, 1.58 mmol) 을 DCM (5 mL)에 묽히고 4-(디메틸아미노) 부틸릭산HCl 염 (317 mg, 1.89 mmol), HATU (719 mg, 1.89 mmol) 및 DIEA (606 uL, 3.48 mmol) 의 DCM (5 mL)의 미리 활성화된 반응 혼합물에 첨가하였다. 둥근 바닥 플라스크에 아르곤 가스를 주입하고, 상기 반응 혼합물을 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. DCM/MeOH으로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 분획물을 농축하여 DCM (20 mL) 및 10% K2CO3 (20 mL) 를 넣고 30분 동안 0-5℃ 에서 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고, 수용액 층에서 다시 DCM (2 x10 mL)로 더 추출하였다. 상기 유기층을 합쳐서 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM으로 세척하고 농축하여 (Z)-((4-(디메틸아미노)부타노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 747.7 (M + H).
(Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디올리에이트 ( S104 - DO )의 제조
Figure pct00066
Figure pct00067
(Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. (Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염 (4.06 g, 6.41 mmol) 을 DCM (60 mL) 의 10% K2CO3 (30 mL)에 넣고 0-5℃에서 교반하였다. 30분 후, 상기 유기층을 분리하고, 상기 수용액층을 DCM (30 mL)으로 다시 추출하였다. 상기 유기층을 합쳐서 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM((~30 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 여과물을 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세트산 (1.26 g, 7.70 mmol), EDC HCl 염 (1.84 g, 9.62 mmol), DMAP (78.3 mg, 0.64 mmol)에 첨가하고, 얇은 현탁액을 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, H2O (60 mL) 및 MeOH (30 mL) 를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, 투명해진 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액을 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출액을 농축하였다. 원료를 플러그 실리카로 필터하고 DCM (40 mL) 및 PBS (pH=11, 50mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 ~10분 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층에서 다시 DCM (15 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 DCM으로 세척하고, 농축하여 (Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 (3.44 g)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 780.2 (M + H).
((5-(디메틸아미노) 펜타노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 ( C104 )의 제조
Figure pct00068
Figure pct00069
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (730 mg, 1.14 mmol) was stirred in DCM (20 mL) with 10% K2CO3 (10 mL) at 0-5 ℃. 30분 후, 상기 유기층을 분리하고, 상기 수용액층을 DCM (10 mL)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 0-5℃에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM (10 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 여과물을 5-(디메틸아미노)펜타노이드산(248 mg, 1.37 mmol), EDC HCl 염 (328 mg, 1.71 mmol), DMAP (14 mg, 0.114 mmol)에 첨가하고, 얇은 현탁액이 투명해질 때까지 실온에서 밤샘 교반하였다 다음날, H2O (20 mL) 및 MeOH (10 mL) 를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, 투명해진 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액을 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출액을 농축하였다. 10% MeOH/DCM 다음으로 100% 에틸아세테이트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후, 상기 정제 잔류물을 DCM (25mL) 및 PBS (pH=11, 25mL)에 넣었다. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층을 DCM (15 mL)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 DCM으로 세척하고, 농축하여 ((5-(디메틸아미노)펜타노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (405 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 654.1 (M + H).
((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 설포닐 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라- 데카노에이트 ( SO2 - S104 )의 제조
Figure pct00070
Figure pct00071
((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트, aka S104, 의 합성은 언급하였다. ((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 의 아르곤을 주입한 둥근 바닥 플라스크에 DCM (10 mL)를 넣었다. 상기 용액을 얼음 수조로 냉각시켰다. 여기에 5분 동안 천천히 mCPBA (DCM의 용액)을 넣었다. 첨가 후, 상기 얼음 수조를 제거하고 반응을 실온에서 밤샘 교반하였다. 3.5 시간 후, 2M DMA/THF (4.55 mL) 를 천천히 넣고, 상기 반응 혼합물을 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 DCM 75 mL으로 묽혔다. H2O (2 x 50 mL) 및 10% K2CO3 (50 mL)으로 세척하였다. 수용액 층을 DCM (40 mL)로 다시 세척하여 추출하였다. 합쳐진 유기물을 건조시키고 (MgSO4), 필터하고, 농축하여 무색 오일을 얻었다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. 에틸아세테이트/MeOH 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 ((2-((2-(디메틸아미노)에틸)설포닐)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (540 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 704.0 (M + H).
((((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 ) 카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 ( TU104 )의 제조
Figure pct00072
단계 1: 중간체 1: 아잔디일비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00073
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염을 DCM (50 mL)에 용해시키고 PBS (pH=11, 50mL) 를 넣었다. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층을 DCM (25 mL)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 DCM으로 세척하고, 농축하여 프리 베이스의 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 를 얻었다.
단계 2: TU104 : ((((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라 - 데카노에이트의 제조
Figure pct00074
트리클로로메틸 클로로포메이트(aka 디포스겐) (257 uL, 2.13 mmol)를 2-(디메틸아미노)에탄티오 HCl 염 (302 mg, 2.13 mmol)의 건조 DCM (20 mL) 의 용액에 첨가하고 4시간 동안 실온에서 아르곤 존재 하에 교반하였다. 다음으로, DCM 및 과량의 디포스겐을 감압 제거하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 프리 염기 (1068 mg, 2.03 mmol), DCM (20 mL) 및 트리에틸아민 (580 uL, 4.16 mmol) 를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 16시간 교반하고, DCM에 묽히고, 1M HCl (75 mL), H2O (75 mL) 및 PBS (pH=11, 75mL)으로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 필터하고, 농축하였다. MeOH/DCM 다음으로 에틸아세테이트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 ((((2-(디메틸아미노)에틸)티오)카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (120 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 657.5 (M + H).
((2-(2-(디메틸아미노) 에톡시 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 ( O104 )의 제조
Figure pct00075
단계 1: 중간체 1: ((2- 브로모아세틸 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00076
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 의 합성은 상기에서 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (1500mg, 2.34mmol) 을 DCM (20mL)에 용해시키고, 얼음-수조에 두었다. 트리에틸아민(685uL, 4.91 mmol) 다음으로 브로모 아세틸 브로마이드 (214uL, 2.46mmol) 를 첨가하였다. 상기 얼음 수조를 제거하고, 상기 반응을 비활성 기체 존재 하에 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, DCM 100mL로 묽혔다. 1M HCl(75mL), H2O (75ml), 포화NaHCO3 용액 (75mL) 및 브라인 용액(75mL)으로 세척하였다. 추출된 수용액을 DCM (25mL)으로 세척하였다. MgSO4으로 건조시키고 필터하고 감압 농축하였다. 100% 에틸 아세테이트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 분획물을 농축하여 ((2-bromo아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (1220mg)를 얻었다.
단계 2: O104 : ((2-(2-(디메틸아미노) 에톡시 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디테트라데카노 - 에이트의 제조
Figure pct00077
둥근 바닥 플라스크에 스터러 바를 넣고 ((2-브로모아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (1.22 g, 1.87 mmol), N,N-디메틸에탄아민 (197 uL, 1.96 mmol), 포타슘아이오다이드 (6.2 mg, 0.0374 mmol) 및 건조 THF (25 mL)를 넣었다. 상기 결과적 용액을 -40℃로 냉각시켰다. DBU (588 uL, 3.93 mmol)를 5분 동안 적한 후, 상기 반응을 2시간 동안 0℃ 로 상온하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. 상기 잔류물을 DCM, 1M HCl (12 mL)에 넣고, 15분 동안 혼합하였다. 다음으로, PBS (pH=11)으로 염기화하였다. 상기 유기층을 분리하고 건조하고(MgSO4), 필터하고 농축하였다. DCM/MeOH 다음으로 100% 에틸아세테이트의 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 ((2-(2-(디메틸아미노)에톡시)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (53 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 655.6 (M + H).
((2-((4-(디메틸아미노) 부타노일 ) 옥시 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라- 데카노에이트 ( HEDC - M1 )의 제조
Figure pct00078
단계 1: 중간체 1: ((2-( 벤질옥시 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00079
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염을 10% K2CO3 (12.5 mL) 의 DCM (25 mL) 으로 0-5℃ 에서 교반하였다. 30분후, 상기 유기층을 분리하고, 상기 수용액층을 DCM (12 mL)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM (12 mL)으로 세척하였다. 힙쳐진 여과물에 벤질옥시아세트산(402 uL, 2.81 mmol), EDC HCl 염 (673 mg, 3.51 mmol), 및 DMAP (29 mg, 0.234 mmol)를 첨가하였다. 상기 현탁액을 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, H2O (25 mL) 및 MeOH (12 mL) 를 첨가하고 10분 동안 교반하여 깨끗한 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액층을 DCM (25 mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 MgSO4 로 건조시키고 필터하여 농축하였다. 헥산/에틸아세테이트 그레디언트로 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 ((2-(벤질옥시)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (1.28 g)를 얻었다.
단계 2: 중간체 2: ((2- 하이드록시아세틸 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00080
((2-(벤질옥시)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (1.28 g, 1.80 mmol) 을 둥근 바닥 플라스크에 서 MeOH (20 mL)에 용해시켰다. 상기 플라스크를 막고 아르곤으로 채웠다. 10% Pd/C (135 mg)를 넣고, 상기 플라스크를 다시 한번 아르곤으로 채웠다. 진공 펌프로 모든 공기를 제거한 다음 H2 로 채운 8” 풍선을 첨가하였다. 반응을 실온에서 거대하게 교반하였다. 30분 후, 상기 반응 혼합물을 필터하고 (셀라이트), 메탄올로 세척하고 잔류물로 농축하여 DCM (25mL) 및 10% K2CO3 (25mL)에 취하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 교반하고 유기층을 분리하였다. 상기 수용액을 다시 DCM (15 mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기물을 건조시키고 (MgSO4), 필터하고, 농축하여 ((2-하이드록시아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (990 mg)를 얻었다.
단계 3: HEDC - M1 : ((2-((4-(디메틸아미노) 부타노일 ) oxy )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디- 데트라데카노에이트의 제조
Figure pct00081
((2-하이드록시아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (990 mg, 1.70 mmol) 를 DCM (20 mL)에서 교반시켜 4-디메틸아미노-부틸릭산(268mg), EDC HCl 염 (487mg) 및 DMAP (21mg) 를 넣었다. 상기 현탁액을 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, H2O (20 mL) 및 MeOH (10 mL) 를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, 투명해진 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액을 DCM (20 mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 건조시키고 (MgSO4), 필터하고, 농축하였다. 원료를 DCM/MeOH 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하였다. 분획물을 농축하여 DCM (25 mL) 및 PBS (pH = 11, 25 mL)에 넣었다. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층에서 DCM (25 mL)로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기물을 건조시키고(MgSO4), 필터하고, 농축하여 ((2-((4-(디메틸아미노)부타노일)oxy)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (672 mg). LCMS ESI+: m/z 697.6 (M + H).
(Z)-((5-(디메틸아미노) 펜타노일 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디올리에이트 ( C104 - DO )의 제조
Figure pct00082
Figure pct00083
(Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. (Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 TFA 염 (1.50 g, 2.37 mmol) 을 DCM (20 mL) 의 10% K2CO3 (10 mL)에 넣고 0-5℃에서 교반하였다. 30분 후, 상기 유기층을 분리하고, 상기 수용액층을 DCM (10 mL)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM(15 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 여과물에 5-(디메틸아미노)펜타노익산(516 mg, 2.84 mmol), EDC HCl 염 (681 mg, 3.55 mmol), DMAP (29 mg, 0.237 mmol)을 넣고, 상기 현탁액을 투명해질때까지 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, H2O (20 mL) 및 MeOH (10 mL) 을 넣고 10분 동안 교반한 후, 투명해진 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액을 DCM으로 추출하였다. 합쳐진 유기물을 건조시키고(MgSO4), 필터하고, 농축하였다. DCM/MeOH 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후, 분획물을 농축하여 DCM (25 mL) 및 PBS (pH = 11, 25 mL)에 넣었다. 상기 혼합물을 실온에서 ~10분 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층에서 다시 DCM (15 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고, 농축하여 (Z)-((5-(디메틸아미노)펜타노일)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 (1.10 g)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 761.7 (M + H).
((5-((디메틸아미노) 메틸 )티오펜-2-카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디- 테트라 데카노에이트 ( T104 )의 제조
Figure pct00084
Figure pct00085
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기에서 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (1004 mg, 1.57 mmol) 을 DCM (20 mL) 의 10% K2CO3 (20mL)에 넣고 0-5℃에서 교반하였다. 30분 후, 상기 유기층을 분리하고, 상기 수용액층을 DCM (10 mL)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 0-5℃ 에서 MgSO4 으로 교반하고, 필터하고, DCM(10 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 여과물에 ((디메틸아미노)메틸)티오펜-2-카르복실산(350 mg, 1.89 mmol), EDC HCl 염 (452 mg, 2.36 mmol), 및 DMAP (19.2 mg, 0.157 mmol)을 첨가하였다. 상기 현탁액을 투명해질때까지 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, H2O (20 mL) 및 MeOH (10 mL) 을 넣고 10분 동안 교반한 후, 투명해진 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액을 DCM (25 mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기물을 건조시키고(MgSO4), 필터하고, 농축하였다. 헥산/에틸아세테이트의 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제한 후, 분획물을 농축하여 DCM (20 mL) 및 PBS (pH = 11, 20 mL)에 넣었다. 상기 혼합물을 실온에서 ~10분 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층에서 다시 DCM (15 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 DCM으로 세척하고, 농축하여 ((5-((디메틸아미노)메틸)티오펜-2-카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (482 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 693.6 (M + H).
(Z)-((((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디올리에이트 ( TU104 - DO )의 제조
Figure pct00086
Figure pct00087
(Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 의 합성은 상기 언급하였다. (Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 (4.20 g, 5.72 mmol) 를 DCM (20 mL)에 용해시키고 얼음 수조에서 0℃ 로 냉각하였다. TFA (20 mL) 를 넣고 상기 혼합물을 불활성 기체 존재 하에 20분 동안 교반하였다. 다음으로, 상기 반응 혼합물을 감압 농축하였다. 잔류물을 10% K2CO3 (20 mL) 및 DCM (20 mL)에 취하여, 20 분동안 얼음 수조에서 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고 건조시키고(MgSO4), 필터하였다. 디포스겐 (1.38 mL, 11.4 mmol) 을 (Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 물질의 DCM에 넣고 실온에서 불활성 기체 존재 하에 교반하였다. 다음날, DCM 및 과량의 디포스겐을 감압 제거 하였다. 2-(디메틸아미노)에탄 티오l HCl 염 (4.05 g, 28.6 mmol) 을 DCM (50 mL) 및 트리에틸아민 (5.2 mL, 37.2 mmol)에 넣고 (Z)-((클로로카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 잔류물을 첨가하였다. 물질을 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, DCM 으로 묽히고, 0.3M HCl (75 mL), H2O (75 mL) 및 10% K2CO3 (75 mL)으로 세척하였다. 추출된 수용액 층을 DCM (25 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 유기물을 MgSO4로 건조하고 필터하고 농축하였다. MeOH/DCM 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (Z)-((((2-(디메틸아미노)에틸)티오)카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 (1.90 g)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 765.7 (M + H).
(((3-(디메틸아미노) 프로폭시 )카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카 - 노에이트(CB104)의 제조
Figure pct00088
Figure pct00089
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트의 합성은 상기 언급하였다. 디포스겐 (266 uL, 2.2 mmol) 을 디메틸아미노프로판올 (413 mg, 4.00 mmol) 의 DCM (10 mL)에 첨가하고 4시간 동안 불활성 기체 존재 하에서 교반하였다. 상기 DCM 및 과량의 디포스겐을 감압 제거하고 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트를 첨가하였다. 상기 둥근 바닥 플라스크에 아르곤을 채우고 DCM (10 mL) 및 트리에틸아민 (859 uL, 6.16 mmol) 을 넣었다. 물질을 실온에서 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 DCM 으로 묽히고, 0.3M HCl (75 mL), H2O (75 mL) 및 10% K2CO3 (75 mL)으로 세척하였다. 추출된 수용액 층을 DCM (25 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 유기물을 MgSO4로 건조하고 필터하고 농축하였다. MeOH/DCM 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (((3-(디메틸아미노)프로폭시)카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (87 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 655.59 (M + H).
(((2-(디메틸아미노) 에톡시 )카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 ( CA104 )의 제조
Figure pct00090
단계 1: 중간체 1: (((4- 나이트로페녹시 )카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디테트라데카 - 노에이트의 제조
Figure pct00091
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염을 건조 DCM (10 mL)에 녹이고 트리에틸아민 (654 uL, 4.69 mmol) 을 첨가하였다. 반응 용기를 불활성 기체로 채우고 4-나이트로페닐 클로로포메이트를 첨가하였다. 물질을 밤샘 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물(50 mL) 및 DCM (50 mL)으로 켄칭하였다. 상기 유기층을 분리하고, 수용액층을 다시 DCM (2 x 50 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기물을 MgSO4로 건조시키고 필터하고 농축하였다. 헥산/에틸아세테이트의 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 농축하여 (((4-나이트로페녹시)카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다.
단계 2: CA104 : (((2-(디메틸아미노) 에톡시 )카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디테트라 - 데카노에이트의 제조
Figure pct00092
(((4- 나이트로페녹시)카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트에, 2-디메틸아미노에탄올 (2 mL) 를 첨가하고 20분 동안 140℃ 로 가열환류하였다.다음으로, 원료 물질을 DCM/MeOH그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (((2-(디메틸아미노)에톡시)카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (38 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 641.7 (M + H).
((2-(디메틸아미노)아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 ( INT -4)의 제조
Figure pct00093
Figure pct00094
(Z)-((2-(디메틸아미노)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올리에이트 의 합성은 3-(디메틸아미노)프로피오닉산에 대한 디메틸글리신 의 치환반응의 i-Prop-DODC 과 유사한 방법으로 제조하였다. QTOF MS ESI+: m/z 720.1 (M + H).
((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카 - 노에이트(S104)의 제조
Figure pct00095
단계 1: 중간체 1: 2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세트산 하이드로클로라이드의 제조:
Figure pct00096
에탄올 (500 mL)을 1-2 분 동안 60 mBar에서 3번 배출하여 제거하고 질소로 재가압하였다. 클로로아세트산(36.9 g, 0.391 mol)을 첨가하고 17-20℃에서 5분 동안 교반하여 투명한 용액을 얻었다. 2-(디메틸아미노)-에탄티올하이드로클로라이드(52.7 g, 0.372 mol)를 넣고, 25℃에서 20분 동안 교반하여 투명한 용액을 형성하였다. 35℃ - 단기간 44℃을 유지하기 위하여 냉각시키면서 고체 쇼듐 하이드록사이드(47.7 g, 1.19 mol)를 20분에 걸쳐 여러번 나누어 넣었다. 거의 즉시 침전물이 형성되었다. 상기 반응 혼합물을 가열하여 2 시간 동안 40℃에서 교반하고, TLC 로 반응 완결을 추적하였다. 셀라이트 545 (74 g) 를 첨가하고 6분 동안 G3 유리-소결 플레이트로 필터하고 에탄올(2 x 105 mL)로 세척하였다. 합쳐진 필터물을 50℃ 욕조에서 감압하여 흰색 고체의 110 g을 얻었다. 혼합된 고체를 물(250 mL)에 녹이고, 노란색 초가 진한 HCl (5.5 mL)을 사용하여 pH를 13.1 (temp. 30℃) 내지 10.5 (temp 31℃)로 조절하였다. 상기 수용액층을 분술물을 제거하기 위하여 DCM (3x 100 mL) 으로 세척하였다(3회 세척 요구). 상기 수용액(pH 10.7, temp. 22℃)에 진한 HCl을 넣어 pH 가 1.4 (57.5 mL added, temp. 35℃)가 되도록 조절하였다. 상기 수용액층을 DCM (100 mL)으로 세척하고 건조될 때까지 농축하였다(욕조 온도 55℃). 톨루엔(250 mL)을 넣고, 상기 혼합물을 다시 건조될 때까지 농축하고(욕조 온도 55℃), 이 과정을 한번 더 반복하여 흰색 고체(98 g)를 얻었다. 아세토나이트릴(50 mL)을 상기 고체에 넣고, 상기 혼합물을 45분 동안 55℃에서 교반하고, G3 유리-소결 플레이트로 필터하였다. 상기 필터 케이크에 아세토나이트릴 (250 mL)을 첨가하고, 상기 혼합물을 25분 동안 55℃에서 교반하고, 아세토나이트릴 (50 mL)로 세척하였다. 합쳐진 필터물을 흰색의 침전물이 생성되도록 300 mL로 농축시켰다. 상기 혼합물을 질소 존재 하에 냉각시키고 30분 동안 0℃에서 교반하였다. 상기 침전물을 G3 유리-소결 플레이트로 필터하고, 상기 필터 케이크를 차가운 아세토나이트릴 (100 mL)로 세척하였다. 감압 하에 3일 동안 건조시켜 47.0 g (63%)의 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세트산 하이드로클로라이드를 얻었다.
단계 2: S104 : ((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 의 제조
Figure pct00097
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (152 g, 238 mmol) 를 DCM (2.3 L) 및 10% 포타슘바이카보네이트(1.15 L)에 넣고 0-5℃에서 교반하였다.상기 유기층을 분리하고, 수용액층을 DCM (1.15 L)으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 30분 동안 0-5℃ 에서 마그네슘 설페이트 하이드레이트 (236 g) 와 교반하고 필터하고 DCM (1.15 L)으로 세척하였다. 합쳐진 여과물에 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세트산 하이드로클로라이드 (57.0 g, 285 mmol), EDC 하이드로클로라이드 (68.4 g, 357 mmol) 및 DMAP (2.91 g, 23.8 mmol)를 첨가하고, 얇은 현탁액이 투명해질때까지 실온에서 밤샘 교반하였다. 물 (2.3 L) 및 메탄올(460 mL)을 첨가하고 10분동안 교반하여 투명해진 유기층을 분리하였다. 현탁의 수용액층(pH 3.0) 을 DCM (575 mL) 으로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 농축하여 하이드로클로라이트 염의 원료143 g 을 얻었다. 상기 원료(142.6g) 를 증류 플라스크에 교체시키고 DCM (500 mL), 및 에틸아세테이트(1 L)를 첨가하였다. 상기 용액을 대기압에서 가열시켜 증류시키고, 상기 증류를 76℃ 의 잔류물을 온도를 얻기 위하여 70분 동안 수행하였다. 전체 부피 1.4 L 을 얻기 위하여 에틸아세테이트 (800 mL), 및 에탄올(70 mL) 을 첨가하였다. 50℃에서 투명해진 용액을 37℃ 로 냉각시키고 결정핵을 첨가하였다. 37-35℃에서 10분 동안 현저한 재결정을 얻어내고, 상기 현탁액을 냉각하여 0℃에서 밤샘 교반하여, 침전물을 필터하고 차가운 에틸아세테이트 (210 mL)로 세척하였다. 실온에서 4.5 시간 펌프 감압 건조하여 흰색 결정의 고체를 하이드로클로라이드 염의 재결정된 물질 134 g를 얻었다.
트라이포타슘포스페이트 (85 g, 0.40 mol) 및 디포타슘 하이드로겐 포스페이트 (226 g, 1.30 mol) 를 정제된 물 (1.7 L)에 넣고, 상기 용액을 pH 10.9로 형성하고 18-20℃로 냉각하였다. DCM (1.3 L) 및 재결정된 S104 하이드로클로라이드 (133.0 g, 0.188 mol) 를 넣고, 상기 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 깨끗한 유기물을 보통의 속도 (35분 정도)로 추출하고, 현탁한 수용액 층을 DCM (650 mL)으로 더 추출하였다. 합쳐진 유기층을 마그네슘설페이트 하이드레이트 (65 g) 와 40분 동안 교반하고, 상기 혼합물을 필터하고, DCM (200 mL)으로 세척하였다. 합쳐진 여과물을 50℃ 의 수조에서 감압 증류 (1시간 동안 감압하는 압력은20 mBar이하). 오일 펌프 진공에서 15-20℃ 의 수조로부터 추가적인 감압을 하여 부드러운 오일의 126 g 얻었다. 완전히 고체화하기 위하여 -20℃ 냉각 욕조에 두고 2일 동안 감압 하에 -20℃에서 냉각하여 S104로 알려진 126 g 의 ((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다. HPLC 는 98.1% 순도를 나타내었다. QTOF MS ESI+: m/z 671.6 (M + H).
(9Z,9'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 비스 ( 테트라데크 -9- 에노에이트 ) ( S104 - DMO )의 제조
Figure pct00098
단계 1: 중간체 1: (9Z,9'Z)-(( tert - 부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 비스(테트라데크-9-에노에이트)의 제조
Figure pct00099
N-Boc-디에탄올아민 (454 mg, 2.21 mmol), 미리스톨레익산(1000 mg, 4.42 mmol) 및 DMAP (54 mg, 0.442 mmol) 를 DCM (25 mL)에 용해시키고 실온의 수조 내 둥근 바닥 플라스크를 위치시키고 불활성 기체를 채웠다. EDC HCl 염 (932 mg, 4.86 mmol)을 5분 동안 3 부분으로 나누어 첨가하였다. 상기 반응은 불활성 기체 존재하에 실온에서 밤샘 교반하였다. 다음날, H2O (25 mL) 을 넣고 10분 동안 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고, 상기 수용액층을 DCM (50 mL)으로 더 추출하였다. 합쳐진 유기물을 10분 동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 농축하였다. 헥산/에틸아세테이트 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (9Z,9'Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(테트라데크-9-에노에이트) (1.10 g)를 얻었다.
단계 2: 중간체 2: (9Z,9'Z)- 아잔디일비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스( 테트라데크 -9-에 노에이 트)의 제조
Figure pct00100
둥근 바닥 플라스크에 (9Z,9'Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(테트라데크-9-에노에이트) (1100 mg, 1.77 mmol) 및 DCM (10 mL) 을 넣고 얼음 수조에 위치시켰다. TFA (10 mL) 를 첨가하고 상기 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하였다. 과량의 TFA의 아제트로피(azeotropy)를 막기 위하여 상기 잔류물에 톨루엔을 첨가하였다. 상기 잔류물을 다시 얼음 수조에 위치시키고 The PBS (pH=11, 25mL) 및 DCM (25mL) 를 첨가하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 교반시키고 상기 유기층을 분리하였다. 현탁한 수용액층을 DCM (10 mL)으로 추출하였다. 합쳐진 유기물을 0℃ 에서 15분 동안 건조시키고 (MgSO4) 필터하고 농축하여 (9Z,9'Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 비스(테트라데크-9-에노에이트) (923 mg)를 얻었다.
단계 3: S104 - DMO : (9Z,9'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스(테트라데크-9-에노에이트)의 제조
Figure pct00101
(9Z,9'Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 비스(테트라데크-9-에노에이트) (923 mg, 1.77 mmol), 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세트산 (346 mg, 2.12 mmol) 및 EDC HCl 염 (509 mg, 2.66 mmol)의 혼합물을 DCM (10 mL)에 현탁시켰다. DMAP (21.6 mg, 0.177 mmol) 를 넣고 상기 혼합물을 실온에서 밤샘 교반하였다.다음날, H2O (10 mL) 및 MeOH (10 mL) 을 첨가하고 10분 동안 교반하고 투명해진 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액층을 DCM (2 x 20 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 MgSO4로 건조시키고 필터하여 농축하였다. DCM/MeOH으로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 농축된 분획물을 DCM (25 mL) 및 PBS (pH=11, 25mL)에 취하였다. 상기 혼합물을 실온에서 ~10분 교반하였다. 다음으로, 상기 유기층을 분리하고, 수용액층에서 다시 DCM (2 x 15 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 건조 시키고(MgSO4),필터하고 농축하여 (9Z,9'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(테트라데크-9-에노에이트) (589 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 667.6 (M + H).
(R)-((1- 메틸피롤리딘 -2-카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 디테트라데카노에이트 ( Pro - DC )의 제조
Figure pct00102
단계 1: Pro - DC : (R)-((1- 메틸피롤리딘 -2-카르보닐) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트의 제조
Figure pct00103
아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염의 합성은 상기에서 언급하였다. 아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 TFA 염 (1000 mg, 1.56 mmol) 을 DCM (10 mL)에서 교반하고 N-메틸-L-프롤린 (228 mg, 1.77 mmol), HOBt.H2O (239 mg, 1.77 mmol) 을 첨가하였다. NMM (365 uL, 3.32 mmol)를 첨가하고 상기 용액이 천천히 투명하게 되었다. EDC 하이드로클로라이드 (518 mg, 2.70 mmol), NMM (257 uL, 2.34 mmol) 및 DMAP (19 mg, 0.156 mmol) 의 DCM (10 mL) 의 현탁액을 첨가하고 상기 혼합물을 용액이 투명해지는 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 다음으로 상기 혼합물을 DCM (50 mL)에 용해시키고 10% K2CO3의 수용액 (60 mL)으로 세척하였다. 유기물을 MgSO4로 건조시키고, 필터하고 농축하였다. 상기 결과적 혼합물을 (0-10)% 메탄올의 DCM 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (R)-((1-메틸피롤리딘-2-카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 637.6 (M + H).
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스 ( 옥타데카 -9,12- 디에노에이트 ) ( S104 - DLin )의 제조
Figure pct00104
단계 1: 중간체 1: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-(( tert - 부톡시카르보닐 ) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)의 제조
Figure pct00105
N-Boc-디에탄올아민 (5 g, 24.4 mmol), 리놀레인산 (14.4 g, 51.2 mmol) 을 DCM (100 mL)에 용해하였다. DMAP (596 mg, 4.88 mmol) 다음으로 EDC HCl 염 (10.3 g, 53.7 mmol) 을 첨가하였다. 상기 반응을 불활성 기체 존재하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 다음으로, 50 mL 의 물 및 50 mL 의 메탄올을 넣고, 상기 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 상기 유기층을 분리하고, 수용액층을 DCM (150 mL)으로 더 추출하였다. 합쳐진 유기물을 10분동안 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 농축하였다. 헥산/에틸아세테이트 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토 그래피로 정제하여 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (15.9 g)를 얻었다.
단계 2: 중간체 2: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)- 아잔디일비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스( 옥타데카 -9,12- 디에노에이트 )의 제조
Figure pct00106
둥근 바닥 플라스크에 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((tert-부톡시카르보닐)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (5.33 g, 7.30 mmol) 를 넣고 DCM (50 mL)를 첨가하고, 얼음 수조에 위치시켰다. TFA (50 mL) 를 첨가하고 상기 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 다음으로, 상기 반응 혼합물을 농축하였다. 과량의 TFA의 아제트로피(azeotropy)를 막기 위하여 상기 잔류물에 톨루엔을 첨가하였다. 상기 잔류물을 다시 얼음 수조에 위치시키고 10% K2CO3 (50mL) 및 DCM (50mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 15분 동안 교반하고 상기 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액 층을 DCM (20 mL)로 추출하였다. 상기 혼합의 유기물을 건조시키고 (MgSO4), 필터하고 농축시켜 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (정량적)으로 얻었다.
단계 3: S104 - DLin : (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)의 제조
Figure pct00107
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (4.68 g, 7.30 mmol), 2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세트산 (1.43 g, 8.76 mmol) 및 EDC HCl 염 (2.10 g, 10.95 mmol) 의 혼합물을 DCM (100 mL)에 현탁시켰다. DMAP (89 mg, 0.73 mmol) 를 넣고, 12시간 동안 실온에서 교반하였다. 물 및 메탄올을 각각 40 mL씩 넣고 10분 동안 교반하여, 깨끗한 유기층을 분리하였다. 상기 탁한 수용액층을 DCM (2 x 20 mL) 으로 추출하고 세척하여 PBS (pH=11, 100mL)로 혼합된 유기추출하였다. 상기 생성물은 MgSO4로 건조시키고 필터하고 농축하였다. 정제는 MeOH 의 DCM 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 모아 농축시켜 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (4.3 g)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 775.9 (M + H).
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스 ( 옥타데카 -9,12- 디에노에이트 ) ( TU104 - DLin )의 제조
Figure pct00108
단계 1: TU104 - Dlin : (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸) 티오 )아세틸) 아잔디일 ) 비스 (에탄-2,1- 디일 ) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)의 제조
Figure pct00109
(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트)의 합성은 이전에 기재하였다. 트리클로로메틸 클로로포메이트(aka 디포스겐) (740 uL, ) 를 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-아잔디일비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (2.6 g) 의 건조DCM (40 mL) 용액에 첨가하고 실온에서 12시간 동안 아르곤 존재 하에 교반하였다. DCM 및 과량의 디포스겐을 감압으로 제거하였다. 2-(디메틸아미노)에탄 티오l HCl 염 (2.9 g), DCM (40 mL) 및 트리에틸아민 (3.7 mL) 을 첨가하였다. 실온에서 16시간 후 상기 반응 혼합물을 DCM 으로 묽히고 10% K2CO3 (75mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4),필터하고 농축하였다. 정제는 DCM/MeOH 다음으로 에틸아세테이트의 그레디언트로 용리한 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (850 mg)를 얻었다. LCMS ESI+: m/z 761.9 (M + H).
리포좀을 함유하는 비- diVA siRNA 의 제형( Formation of non - diVA siRNA containing liposomes )
이온화성 지질(Ionizable lipid), DOPE, 콜레스테롤(cholesterol), 및 PEG-공액 지질을 최종 중량 농도가 ~ 4.4 mg/mL 되도록 무수 에탄올(200 proof)에 용해시켰다. siRNA 를 ~0.26 mg/mL의 농도로 시트레이트 버퍼에 용해시키고, 온도를 35-40℃로 조절하였다. 상기 에탄올/지질 혼합물을 siRNA 함유한 버퍼에 첨가하고 리포좀에 로딩된 siRNA 가 자발적으로 형성하도록 교반하였다. 지질을 siRNA와 전체 지질 대 siRNA의 비가 7:1 내지 14:1 (w:w)에 도달하도록 혼합하였다. 상기 리포좀에 로딩된 siRNA 에서 에탄올을 제거하고 버퍼를 교환하기 위해서 10 배 부피의 PBS로 투석여과하였다. 최종 생성물을 0.22 ?, 멸균 등급, 바이오버든 환원용 필터로 여과하였다. 이 과정은 40-100 nm의 입경, PDI <0.2, 및 >85% RNA 캡슐화 (포획) 효율을 가지는 리포좀을 얻었다.
diVA 로 보조 용해된 리포좀을 함유하는 siRNA 의 제형 (Formation of siRNA containing liposomes co - solubilized with diVA )
siRNA-diVA-리포좀 제형은 상기 언급된 방법으로 제조하였다. diVA-PEG-diVA 를 버퍼를 함유하는 siRNA에 첨가하기 전에 다른 지질(이온화성 지질(Ionizable lipid), DOPE, 콜레스테롤(cholesterol), 및 PEG-공액 지질)을 가지는 무수 에탄올에 보조 용해시켰다. diVA-PEG-diVA의 몰농도(Molar content)는 0.1 내지 5 mol%의 범위였다. 이 과정은 40-100 nm의 입경, PDI <0.2, 및 >85% RNA 캡슐화 (포획) 효율을 가지는 리포좀을 얻었다.
이온화성 및 양이온성 리포좀을 함유하는 siRNA 의 제형( Formation of siRNA containing liposomes with ionizable and cationic lipids )
siRNA-diVA-리포좀 제형 및 siRNA-리포좀 제형을 상기 언급된 방법으로 제조하였다. 양이온성 지질을 버퍼를 함유하는 siRNA에 첨가하기 전에 다른 지질(이온화성 지질(Ionizable lipid), DOPE, 콜레스테롤(cholesterol), PEG-공액 지질 및 diVA-PEG-diVA)을 가지는 무수 에탄올에 보조 용해시켰다. 양이온성 지질의 몰농도(Molar content)는 5 내지 40 mol%의 범위였다. 이 과정은 40-100 nm의 입경, PDI <0.2, 및 >85% RNA 캡슐화 (포획) 효율을 가지는 리포좀을 얻었다.
생체 외 효능( In vitro ( pHSC , gp46 KD @ 20 nM ) efficacy ):
96-웰 플레이트에서 PHSCs를 이온화성 지질 제형 C104, 이온화성 지질 제형 Tu104, 또는 이온화성 지질의 상이한 비율로 혼합 제형(C104:Tu104)으로 이루어지는 제형과 함께 배양하였다. 30분 후, 배지를 신선한 성장 배지로 바꿔주었다. 48시간 후, 세포들을 용해하고, gp46 및 GAPDH mRNA 수준을 정량적 RT-PCR (TaqMan®) 분석으로 측정하고, gp46 수준을 GAPDH 수준으로 표준화하였다. 표준화된 gp46 수준을 모의 제어 세포의 백분율로 표시하였다. 오차 막대는 표준 편차(n=3)를 나타낸다. 상기 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 결과에서 입증된 바와 같이, 두 개의 이온화성 지질의 혼합은 유전자 발현에서 나타나는 상승 작용의 감소를 알 수 있다.
다른 이온화성 지질: 이온화성 지질 및 이온화성 지질:양이온성 지질 혼합에 대하여 유사한 실험을 수행하였다. S104-DO:Tu104-DO 혼합의 결과는 도 2에 나타내었다. HEDODC:Tu104의 혼합의 결과는 도 3에 나타내었다. 이온화성 지질들의 혼합 및 이온화성:양이온성 지질의 혼합은 유전자 발현에서 나타나는 상승 작용의 감소를 알 수 있다.
생체 내 효능( In vivo ( DMNQ ) efficacy ):
표적 제형의 생체 내 활성을 단기 간 손상 모델(Quick Model 또는 DMNQ라 함)에서 평가하였다. 이 모델에서, 상기 단기 간 손상은 gp46 mRNA 수준의 상승이 동반되는 디메틸나이트로스아민(DMN)과 같은 간 독성 시약(hepatotoxic agent)으로 처리하여 유도된다. 이러한 변화를 유도하기 위하여, 수컷 Sprague-Dawley 렛트에 DMN을 6일 연속하여 복강 내에 주사하였다. DMN 처리 기간 종료시점에서, 상기 동물들을 각각의 동물 체중에 기초하여 그룹으로 무작위 배정하였다. DMN의 마지막 주사 후 1 시간, 단일 IV 투여량으로 제형을 투여하였다. 24시간 후, 간엽(liver lobes)을 적출하고, gp46 및 MRPL19 mRNA 수준을 정량적 RT-PCR (TaqMan) 분석으로 측정하였다. gp46에 대한 mRNA 수준을 MRPL19 수준으로 표준화하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다. 이온화성:양이온성 지질의 여러가지 혼합은 단일, 동물 체중의 kg 당 0.5 mg 의 캡슐화된 siRNA의 투여량에 대하여 유전자 발현에서 50% 감소를 달성하였다.
생체 외 독성 결과, 생체 외 세포독성 ( In vitro toxicology data , in vitro cytotoxicity ( HepG2 @ 200 nM ))
[0167] 본 발명의 제형에 S104 의 20몰%의 첨가는 HepG2 세포독성 분석에서 세포 활성도가 27 % 내지 52 %로 향상되었다.
제형 % 활성도
40:30:25:5:2 (HEDC:DOPE:콜레스테롤:Peg-지질:DiVA) 27 ± 5.3 %
20:20:30:25:5:2 (HEDC:S104:DOPE:콜레스테롤:Peg-지질:DiVA) 52 ± 10 %
HepG2 세포 독성 분석 설명:
인간 간 세포암종에서 파생된 부착세포인 HepG2세포를 10% FBS (Hyclone, Logan, Utah Cat# SH30910)로 보충한 MEM/EBSS (Hyclone, Logan, Utah, Cat# SH30024.01)에서 배양하였다. HepG2 세포를 96 웰 Optilux 검은 플레이트(BD Falcon, Cat # BD353220)에서 5000 세포/웰로 밤샘 접종하였다. 제형을 각 웰에 최종 표시된 siRNA 농도 (n=3)로 첨가하였다. 포스트 제형 첨가 48시간 후, 세포 활성을 CellTiter-Glo 발광 세포 활성 분석 키트 (Promega, Cat #G7572)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 화학 발광 신호를 선명 발광 마이크플레이트 리더(Clarity Luminescence Microplate Reader, 502-Biotek, Winooski, Vermont)로 측정하였다. 활성도를 모의 치료 웰에 표준화되어 처리된 제형에서 화학 발광 신호의 %에 기초하여 계산하였다.
생체 내 독성 데이터( In vivo toxicology data )
본 발명의 HEDC:S104 (20:20) 제형이 독성 연구에서 예외적으로 우수한 내성을 나타내었다. 상기 제형을 당업자에 의해 간주되어 렛트 및 원숭이에게 각각 25 mg/kg 및 12 mg/kg으로 정맥 내 주사한 경우 독성이 관찰되지 않았다.
본 발명의 제형으로 형질감염( Transfection with formulations of the description ):
LX-2 및 pHSCs에 대한 형질 감염 방법은 동일하다. 본 발명의 리포좀 제형 또는 리포플렉스 제형을 요구하는 농도에서 성장 배지와 혼합하였다. 상기 혼합물의 100 μl를 96-웰 플레이트의 세포들에 첨가하고, 세포를 5% CO2 배양기에서 30분 동안 37 ℃로 배양하였다. 30분 후, 배지를 신선한 성장 배지로 교체하였다. 형질 감염 48시간 후, 세포들을 제조사의 지시에 따라 Cell-to-Ct lysis reagents (Applied Biosystems)를 사용하여 처리하였다.
HSP47 mRNA 발현 측정을 위한 정량 (q) RT - PCR
HSP47 및 GAPDH TaqMan®분석 및 One-단계 RT-PCR master mix 를 바이오시스템즈에서 구입하였다. 각 PCR 반응은 다음의 조성물을 함유한다: One-단계 RT-PCR mix 5 μl, TaqMan® RT enzyme mix 0.25 μl, TaqMan® 유전자 발현 분석 프로브 (HSP47) 0.25 μl, TaqMan® 유전자 발현 분석 프로브 (GAPDH) 0.5 μl, RNase free water 3.25 μl, Cell lysate 0.75 μl, 총 부피10 μl. GAPDH를 HSP47 mRNA 수준의 상대적 정량을 위한 내인성 대조군으로 사용하였다. 정량적 RT-PCR은 ViiA 7 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosciences)로 수행하였다. 모든 값을 모의 형질감염 세포의 평균 HSP47의 발현으로 표준화하였고, 모의에 비교하여 HSP47의 발현의 백분율로 표시하였다.

Claims (48)

  1. 하기 화학식 I로 표시되는 이온화성 지질(ionizable lipid) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00110

    (여기서,
    n 및 m은 독립적으로 1,2,3 또는 4이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 C10 - 18알킬 또는 C12 - 18알케닐이고;
    X는 -CH2-, S, O, N, 또는 부재이고;
    L은 C1 - 4알킬렌, -S-C1 - 4알킬렌, -O-C1 - 4알킬렌, -O-C(O)-C1 - 4알킬렌, -S(O)2-C1-4알킬렌,
    Figure pct00111
    또는
    Figure pct00112
    이다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 n 및 m은 1인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 n 및 m은 2인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 X는 부재인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 L은 C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 L은 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2CH2- 및 -CH2-CH2CH2CH2-으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 L은
    Figure pct00113
    또는
    Figure pct00114
    인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 L은
    Figure pct00115
    인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 X는 -CH2-인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 L은 -S-C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 L은 -S-CH2- or -S-CH2-CH2- 인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 L은 -S(O)2-C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 L은 -S(O)2-CH2-CH2-인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 L은 -O-C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 L은 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2-인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 L은 -O-C(O)-C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 L은 -O-C(O)-CH2-CH2-CH2-인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 X는 S인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 L은 C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 L은 -CH2-CH2-인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 X는 O인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 L은 C1 - 4알킬렌인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 L은 -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2-인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 C10 - 18알킬인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 C13알킬인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  26. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2 는 각각 C12 - 18알케닐인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 C13 - 17알케닐인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 올레일(oleyl) 또는 리놀레일(linoleyl)인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  29. 지질 분자의 이중층을 포함하는 리포좀 내에 양이온성 지질(cationic lipid) 및 이온화성 양이온성 지질(ionizable cationic lipid)을 포함하는 조성물.
  30. 지질 분자의 이중층을 포함하는 리포좀 내에 제1항의 화합물을 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 화합물은 지질 분자의 5 내지 50 mol%인 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서,
    제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 두 개의 화합물을 포함하고, 상기 두 개의 화합물 몰비는 약 10:30 내지 약 30:10인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제31항에 있어서,
    상기 조성물은 양이온성 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은
    Figure pct00116

    또는
    Figure pct00117

    인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 지질 분자의 5 내지 40 몰%인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    이온화성 지질 및 양이온성 지질의 몰비는 약 5:35 내지 약 35:5인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 제30항에 있어서,
    상기 조성물은 액체 매질(liquid medium)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 액체 매질은 생물에 주입을 위하여 적절한 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 액체 매질은 유기 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 액체 매질은 물 및 유기 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제30항에 있어서,
    상기 조성물은 비수성 매질(non-aqueous medium)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제30항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 인지질(phospholipid)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제30항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 폴리에틸렌글리콜-공액 지질(PEG-conjugated lipid)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. (레티노이드)n-링커-(레티노이드)n 의 구조 (여기서, 상기 n=0, 1, 2 또는 3이고, 링커는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PEG-유사한 분자이다.)로 이루어진 표적 분자의 성상 세포 특이적 양의 제30항의 조성물을 포함하는 성상 세포(stellate-cell) 특이적 약물 전달체.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 siRNA 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  46. 제45항의 약물 전달체 및 약학적으로 허용가능한 전달체(carrier) 또는 희석제(diluent)를 포함하는 약학적 제형.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 siRNA 분자는 리포좀에 의해 캡슐화된 것을 특징으로 하는 약학적 제형.
  48. 제47항의 약학적 제형을 포함하는 약물을 환자에게 전달하는 방법; 및 상기 약학적 제형을 환자에게 투여하는 방법.
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