CN117645549A - 一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用 - Google Patents

一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物及应用。该可离子化脂质的结构如通式I所示，其主要由长碳链、可生物降解的碳酸酯键等结构组成；利用离子化脂质或其药学上可接受的盐及核酸制备的脂质纳米颗粒无毒，可生物降解，递送核酸药物、核酸疫苗，实现高效包载核酸分子，高效胞内蛋白质翻译和表达，具有高效的体内和体外转染效率。本发明对于丰富可离子化脂质的种类，递送核酸药物，预防或治疗疾病具有重要意义。

Description

一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用
技术领域
本发明涉及一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、组合物和应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
生物学中心法则表明，DNA转录的信使mRNA核酸在细胞质内可以表达各种蛋白质。利用这一生物学过程可以治疗各种疾病。但是，核酸分子携带大量负电荷，难以进入由双脂质层保护的细胞。此外，核酸分子非常不稳定，易于被体液或其中的酶降解。因此，核酸分子的胞内递送是一个难题。
利用阳离子载体与核酸分子的阴离子的静电相互作用，组装成纳米颗粒，包括脂质体、聚合物纳米粒、胶束等，是实现核酸负载和递送的途径之一。尽管这类阳离子载体用于体外核酸转染常有良好效果，但显示明显的细胞毒性，用于体内核酸的递送有潜在毒性风险，通常不能用于临床。近年来，由可离子化脂质等构建的脂质纳米颗粒(LipidNanoparticle,LNP)受到重视。可离子化脂质在中性条件下以非离子形式存在，可以显著降低LNP载体的毒性，为LNP递送核酸分子奠定了安全性基础。事实上，这类LNP载体递送的mRNA疫苗已经在临床得到大规模应用。研究发现，可离子化脂质作为LNP载体的关键成分，其结构的细微变化会显著影响核酸的包载率，LNP的溶酶体逃逸效率，以及负载核酸在细胞内的翻译表达效率，进而显著影响疾病预防和治疗效果。因此，基于可离子化脂质的LNP的安全性、递送效率和特异性仍有待提高，尤其需要开发有助于将核酸递送至细胞内的可离子化脂质及其组合物，以达到预防或治疗疾病的目的。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供了一种用于递送核酸基因的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，本发明的第二目的是提供一种包含该可离子化脂质或其药学上可接受的盐的组合物，本发明的第三目的是提供该可离子化脂质或其药学上可接受的盐或该组合在预防或治疗疾病的核酸药物或疫苗中的应用。
技术方案：本发明的一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述可离子化脂质的结构如式I所示，
其中,G1是亚烷基-(CH2)m-，m是4～8的正整数；G2是亚烷基-(CH2)n-，n是4～8的正整数；G3是亚烷基-(CH2)p-，p是2或3；R1是C15～18支链烷基；R2是C15～18支链烷基或C11～14的直链烷基。
本发明可离子化脂质或其药学上可接受的盐是构成核酸递送载体脂质纳米粒(LNP)的关键组分，决定了通过静电作用包载携带负电荷的核酸分子的效率，决定了通过疏水脂质部分与细胞膜作用促进包载核酸的LNP进入细胞内的效率，决定了LNP入胞后通过可离子化脂质质子化而溶胀促进核酸分子从溶酶体逃逸的效率，进而决定了核酸分子的胞内翻译表达或与胞内生物大分子的相互作用。同时，可离子化脂质决定了脂质纳米粒LNP的安全性。可见，可离子化脂质通过各种静电作用、疏水力作用、质子化作用等影响其构建的LNP包载核酸分子的效率、递送核酸分子的递送效率、核酸分子的生物功能。可见，可离子化脂质的结构与LNP功能之间的关系非常复杂。因此，可离子化脂质的结构与以其为主构建的LNP包载的核酸(比如：mRNA)在体内的表达之间无确切的对应关系，规律性不强。
所以，结构差别很小的可离子化脂质构建的LNP在体内递送mRNA及其表达的差异会很大。特别是，可离子化脂质的结构与细胞内转染效率、细胞毒性以及在肌体内的表达之间也无确切的对应关系。结构差异很小的化合物，在转染效率、细胞毒性、细胞内的高表达方面可能差异非常大。因此，筛选合适的可离子化脂质，同时具有高包载率、高转染和表达效率和低细胞毒性是非常困难的事情，常常不得不进行广泛和仔细的筛选，尽量在一定范围总结出有参考价值的规律。
本发明作为包载核酸分子的可离子化脂质或其药学上可接受的盐。首先，叔胺结构是基本条件，作为可离子化结构部分，可以通过质子化后与带负电荷的核酸分子通过静电作用强烈结合。其次，可离子化脂质需要具有如下结构：
强极性头—极性渐变区—非极性尾
强极性头部一方面通过叔胺结构质子化与带负电荷的核酸分子通过静电作用强烈结合，另一方面强极性头部可以与核酸分子形成若干氢键，与核酸分子相互交叠交叉，通过强烈的组装结合，形成亲水性小微区。
非极性尾部主要功能是在亲水性微区周围形成脂质保护外壳，并在胆固醇类分子协助下稳定脂质外壳结构。脂质外壳的厚度与非极性尾部的长度，脂质外壳的破裂与非极性尾部的长度和规整性等相关，适中的非极性尾部长度形成适中的脂质外壳，既对亲水微区形成良好的保护，又不影响LNP入胞后mRNA从溶酶体中逃逸。
极性渐变区是从强极性到非极性之间的中间部分，衔接亲水微区和脂质外壳，其长度对于最大程度地保护亲水微区内的核酸、维持脂质外壳的稳定、促进溶酶体内核酸的逃逸至关重要。
本发明可离子化脂质结构中，二乙醇胺结构是强极性头，可以通过静电作用和氢键作用，与核酸相互交叠、紧密组装和结合，形成亲水微区；C15～C18的支链烷基或C11-C14的直链烷基的非极性尾部与胆固醇一起构成脂质外壳，起到保护亲水微区的作用；从与强极性头相连的第一个碳原子到碳酸酯键作为中间部分，是从强极性头到非极性尾之间的极性渐变区，间隔衔接亲水微区和脂质外壳。极性渐变区的长度与脂质纳米粒结构的稳定性、溶酶体内核酸逃逸和蛋白最高效率的表达密切有关。
最重要的是，非极性区的尾部烷基链通过碳酸酯键与极性区相连。众所周知，碳酸酯键的极性小于羧酸酯键。与羧酸酯键构建的可离子化脂质相比，本发明的碳酸酯键构建的可离子化脂质尾部的疏水性更强，即亲脂性更强，构建的LNP不仅具有更好的保护作用，而且通过亲脂性更强的可离子化脂质与细胞膜双脂质层之间更强的疏水亲脂相互作用使LNP更容易被细胞摄入,实现核酸的高效递送，进而实现蛋白高表达。
并且，因为碳酸酯键的极性小于羧酸酯键，前者构建的可离子化脂质的降解速度慢。本发明的碳酸酯键构建的可离子化脂质构建的LNP降解速度慢，使包载其中的核酸药物有更长的半衰期，有利于蛋白的长久稳定表达。
进一步地，所述R1选自：
进一步地，所述R2选自：
进一步地，所述可离子化脂质选自：
本发明可离子化脂质，相对于现有技术的其它化合物，能够以高的细胞转染效率、低细胞毒性或者无毒性以及在体内的高表达和持续表达来递送核酸，取得了预料不到的技术效果。
本发明的可离子化脂质U-201～U-212，头部是带有两个羟基的二乙醇胺结构，可离子化脂质中间部分结构中两个氮原子之间的碳原子数与碳酸酯之前的亚烷基链部分的碳原子数之和是8或9为优；尾端是15～18个碳原子的支链烷基，或11～14个碳原子的直链烷基，使可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于包载保护核酸和LNP入胞；同时，使溶酶体中质子化后的可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于包载核酸和核酸溶酶体逃逸。尤其是，可离子化脂质中间部分结构中两个氮原子之间的碳原子数为2或3，碳酸酯的亚烷基部分的碳原子数为5或6最优。
本发明还包括一种组合物，所述组合物包括治疗剂或预防剂及用于递送治疗剂或预防剂的载体，其中，所述载体包括本发明所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐中的一种或多种。
进一步地，所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐优选U-201～U-212中的一种或多种。
进一步地，所述治疗剂或预防剂包括小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、DNA等核酸分子中的一种或多种；
进一步地，所述载体与治疗剂或预防剂的质量比为：1～100:1。
进一步地，所述组合物为脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50nm～300nm。
进一步地，所述脂质纳米颗粒的多分散指数≤0.30。
进一步地，所述载体还包括结构脂质，所述结构脂质为胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、谷固醇、麦角固醇、非甾醇、皮质类固醇、熊果酸、番茄碱及α-生育酚中的一种或多种。
进一步地，所述载体还包括中性脂质，所述中性脂质为神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及其衍生物中的一种或多种。
进一步地，所述载体还包括聚合物共轭脂质，所述聚合物共轭脂质为PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的二烷基胺及PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。
进一步地，所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐、结构脂质、中性脂质及聚合物共轭脂质的摩尔比为(15～60)：(15～45)：(5～30)：(0.5-5)。
本发明还包括所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐或本发明所述组合物在制备预防或治疗疾病的核酸药物或核酸疫苗中的应用。
进一步地，所述疾病包括感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管疾病、肾血管疾病、代谢性疾病。
进一步地，所述核酸药物或核酸疫苗可用于动物或人。
进一步地，应用时，经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、体表、鼻内或通过吸入施用。
进一步地，所述核酸药物或核酸疫苗还包括药物常用的赋形剂或稀释剂中的一种或多种。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
本发明提供的可离子化脂质由强极性头—极性渐变区—非极性尾构成，二乙醇胺强极性头部通过静电作用和氢键作用与核酸分子强烈结合，形成亲水性小微区；非极性尾部用于形成脂质保护外壳；极性渐变区是从强极性到非极性之间的中间部分，两个氮原子之间的碳原子数与碳酸酯键之前的亚烷基部分的碳原子数之和为8或9时，极性渐变区的长度最为合适，不仅有利于最高效核酸包载和稳定，而且维持脂质外壳的稳定，并促进溶酶体内核酸逃逸，实现最优的核酸递送和蛋白表达效率。
本发明提供的可离子化脂质由两个碳酸酯键构成可降解结构。与羧酸酯键相比，碳酸酯极性更小，亲脂性强。极性小亲脂性强的碳酸酯键与烷基链尾巴相连，有利于组装构建更稳定的脂质外壳，有利于包载保护核酸分子，有利于可离子化脂质构建的LNP与细胞双脂质层之间相互作用而被细胞高效摄入。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体无毒，可生物降解性。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体高效递送核酸药物或核酸疫苗，实现高效包载核酸分子。
本发明提供的可离子化脂质由碳酸酯键构建而成，降解速度比羧酸酯键慢，包裹在LNP内的核酸在体内递送过程中不易被降解，有利于长时间表达。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体与核酸分子的组合物高效溶酶体逃逸。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体与核酸分子的组合物高效胞内蛋白质翻译和表达。
本发明提供的可离子化脂质由碳酸酯键构建而成，包裹在LNP内的核酸在体内递送过程中不易被降解，有利于保护mRNA，实现更长久的蛋白表达。
本发明提供的可离子化脂质构建的LNP载体与mRNA核酸分子的组合物实现高效细胞内翻译，蛋白表达量达到市售可离子化脂质LNP载体的10倍左右，体内表达萤火虫荧光素酶Fluc蛋白的荧光强度是市售可离子化脂质LNP载体的数倍。
附图说明
图1为U-201～U-212等可离子化脂质制备的VEGFa mRNA-LNP的细胞毒性图。
图2为可离子化脂质U-201、U-203、U-205、U-207、U-209、ALC-0315制备的FlucmRNA-LNP小鼠静脉给药6小时后活体荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实验中所用试剂、设备及其代号或缩写对照如下：
对硝基苯基氯甲酸酯：NPCF；N,N-二环己基碳化二亚胺：DCC；二氯甲烷：DCM；4-二甲氨基吡啶：DMAP；四氢呋喃：THF；碳酸钾：KCO3；碘化钾：KI；二硬脂酰甘油磷脂酰胆碱：DSPC；二异丙基乙胺：DIPE；二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000：DMG-PEG2000；((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)：ALC-0315；8-[(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯：SM-102；月桂醇：LA；N,N’-二异丙基乙胺：DIPE。
薄层色谱法：TLC；飞行时间质谱仪：LC-TOF，AutoflexIII，美国BrukerDaltonics有限公司；核磁共振氢谱仪，Avance500，德国Bruker有限公司。
实施例1
(1)可离子化脂质U-201的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-201：
将5-溴正戊醇(3.32g，20.0mmol)溶于120mLDCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入2-己基癸醇(5.44g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mL DCM稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤。分离得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到5-溴戊基(2’-己基癸基)碳酸酯(A)(产量5.43g，无色油状物，产率57.3％)。
对化合物A进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，434.34，理论值434.2。
对化合物A进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.22-3.96(m,4H),3.47(dt,2H),1.92-1.74(m,2H),1.69(td,3H),1.52-1.15(m,28H),0.88(t,6H)。
将化合物A(1.13g，2.5mmol)溶于10mL THF中，加入10mL乙腈、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、KI(332mg，2.0mmol)，85℃下搅拌反应16h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状终产物O,O’-双(2-己基癸基)-5,5'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二戊基)二碳酸酯(U-201)，计214mg(产率28.4％，纯度97.5％)。
对U-201进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，871.79，理论值871.76。
对U-201进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.14-3.94(m,8H),3.64-3.50(m,4H),2.81-2.54(m,12H),1.71-1.47(m,12H),1.44-1.08(m,54H),0.88(t,12H)。
(2)可离子化脂质U-202的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-202：
将5-溴正戊醇(3.32g，20.0mmol)溶于120mLDCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入9-十七醇(5.73g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mL DCM稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到无色油状的5-溴戊基(2-十七烷基)碳酸酯(B)(产量5.12g，产率53.4％)。
对化合物B进行质谱分析，LC–TOF:[M+H]+，449.45，理论值449.26。
对化合物B进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.24-3.92(m,3H),3.45(dt,2H),1.92-1.71(m,2H),1.68(td,2H),1.52-1.13(m,31H),0.88(t,6H)。
将化合物B(1.12g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、KI(332mg，2.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤,过滤。得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(十七烷-9-基)-5,5'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二戊基)二碳酸酯(U-202)，计194mg(产率25.7％，纯度97.8％)。
对U-202进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，899.94，理论值899.79。
对U-202进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.16-3.92(m,6H),3.62-3.48(m,4H),2.77-2.50(m,12H),1.70-1.42(m,14H),1.40-1.07(m,66H),0.88(t,12H)。
(3)可离子化脂质U-203的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-203：
化合物C的合成
室温下实施例1的(1)中得到的5-溴戊基(2-己基癸基)碳酸酯(A，1.34g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(0.32g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃，旋干除去乙醇，用DCM溶解，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状中间产物C(产量1.03g，产率73.3％)。
对化合物C进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，517.41，理论值517.45。
化合物D的合成
将5-溴正戊醇(3.32g，20.0mmol)溶于120mLDCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入月桂醇(LA)(4.16g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mL DCM稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到化合物D(产量6.72g，产率80.3％)，呈淡黄色油状。
对化合物D进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，379.21，理论值379.17；
对化合物D进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)：δ4.22-4.07(m,4H),3.48(dt,2H),1.93-1.75(m,2H),1.74-1.62(m,4H),1.42-1.27(m,20H),0.99-0.82(m,3H)。
化合物U-203的合成
将化合物C(0.26g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、化合物D(0.30g，0.8mmol)、碳酸钾(0.26g，2.0mmol)、KI(0.17g，1.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O-2-己基癸基-O’-十二烷基-5,5'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二戊基)二碳酸酯(U-203)，计234mg(产率55.4％，纯度97.6％)。
对U-203进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，829.78，理论值829.72。
对U-203进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.12-3.91(m,8H),3.62-3.53(m,4H),2.82-2.55(m,12H),1.68-1.45(m,13H),1.43-1.08(m,48H),0.88(t,9H)。
(4)可离子化脂质U-204的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-204：
化合物E的合成
室温条件下，将实施例1的(2)中得到的5-溴戊基(9-十七烷基)碳酸酯(B,1.36g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(0.32g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃旋干除去乙醇，用DCM溶解粗品，饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状物E(产量0.93g，产率68.3％)。
对化合物E进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，531.41，理论值531.47。
化合物U-204的合成
将化合物E(0.27g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、实施例1(3)的化合物D(0.30g，0.8mmol)、碳酸钾(0.26g，2.0mmol)、KI(0.17g，1.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状物产物O-十七烷-9-基-O’-十二烷基-5,5'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二戊基)二碳酸酯(U-204)，计207mg(产率51.3％，纯度97.8％)。
对U-204进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，843.79，理论值843.73。
对U-204进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.29–3.92(m,7),3.65–3.45(m,4H),2.78–2.52(m,12H),1.85–1.40(m,12H),1.38–1.08(m,57H),0.88(t,9H)。
(5)可离子化脂质U-205的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-205：
6-溴正己醇(3.64g，20.0mmol)溶于120mL DCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入2-己基癸醇(5.44g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mLDCM稀释，用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到无色油状的6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯F(产量6.48g，产率72.4％)。
对化合物F进行质谱分析，LC–TOF:[M+H]+，449.38，理论值449.26。
对化合物F进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.21–3.96(m,4H),3.45(dt,2H),1.92–1.71(m,2H),1.68(td,3H),1.52–1.13(m,30H),0.88(t,6H)。
将化合物F(1.12g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)，KI(332mg，2.0mmol)，在85℃下搅拌反应16-20h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(2-己基癸基)-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二己基)二碳酸酯(U-205)。计354mg(产率34.7％％，纯度98.1％)。
对U-205进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，899.88，理论值899.79。
对U-205进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.17–3.96(m,8H),3.66–3.51(m,4H),2.82–2.54(m,12H),1.73–1.49(m,12H),1.46–1.10(m,58H),0.88(t,12H)。
(6)可离子化脂质U-206的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-206：
6-溴正己醇(3.60g，20.0mmol)溶于120mL DCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入9-十七醇(5.73g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mLDCM稀释，用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到无色油状的6-溴己基(9-十七烷基)碳酸酯(G)(产量4.84g，产率50.2％)。
对化合物G进行质谱分析，LC–TOF:[M+H]+，463.56，理论值463.27。
对化合物G进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.23-3.91(m,3H),3.43(dt,2H),1.92-1.69(m,2H),1.68(td,2H),1.50-1.13(m,33H),0.88(t,6H)。
将化合物G(1.16g，2.5mmol)溶于10mL THF中，加入10mL乙腈、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、KI(332mg，2.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(十七烷-9-基)-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二己基)二碳酸酯(U-206)，计244mg(产率34.7％，纯度97.4％)。
对U-206进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，927.92，理论值927.83。
对U-206进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.15-3.93(m,6),3.64-3.50(m,4H),2.78-2.46(m,12H),1.71-1.44(m,14H),1.42-1.08(m,62H),0.88(t,12H)。
(7)可离子化脂质U-207的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-207：
7-溴正庚醇(3.88g，20.0mmol)溶于120mL DCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入2-己基癸醇(5.44g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mLDCM稀释，用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到无色油状的7-溴庚基(2-己基癸基)碳酸酯(H，产量6.22g，产率69.6％)。
对化合物H进行质谱分析，LC–TOF:[M+H]+，463.41，理论值463.27。
对化合物H进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.23-3.95(m,4H),3.44(dt,2H),1.90-1.72(m,2H),1.68(td,3H),1.52-1.12(m,32H),0.88(t,6H)。
化合物H(1.16g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈，N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺(148mg，1.0mmol)，碳酸钾(550mg，4.0mmol)，KI(332mg，2.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(2-己基癸基)-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二庚基)二碳酸酯(U-207)。计233mg(产率25.3％，纯度98.5％)。
对U-207进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，913.88，理论值913.81。
对U-207进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.19-3.98(m,8H),3.69-3.54(m,4H),2.81-2.49(m,12H),1.74-1.49(m,10H),1.46-1.10(m,62H),0.88(t,12H)。
(8)可离子化脂质U-208的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-208：
7-溴正庚醇(3.88g，20.0mmol)溶于120mLDCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，再在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，反应室温搅拌3h，在此反应液中加入9-十七醇(5.73g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌12h，TLC显示反应完成后，加入80mLDCM稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到无色油状的7-溴庚基(2-十七烷基)碳酸酯(I,产量5.88g，产率64.7％)。
对化合物I进行质谱分析，LC–TOF:[M+H]+，477.42，理论值477.29。
对化合物I进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.23-3.90(m,3H),3.45(dt,2H),1.92-1.67(m,2H),1.68(td,2H),1.48-1.12(m,35H),0.88(t,6H)。
化合物I(1.19g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈，N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺(148mg，1.0mmol)，碳酸钾(550mg，4.0mmol)，KI(332mg，2.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(十七烷-9-基)-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二庚基)二碳酸酯(U-208)。计255mg(产率27.2％，纯度97.6％)。
对U-208进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，941.88，理论值941.84。
对U-208进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.17-3.96(m,6H),3.67-3.52(m,4H),2.80-2.48(m,12H),1.74-1.46(m,12H),1.45-1.12(m,56H),0.88(t,12H)。
(9)可离子化脂质U-209的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-209：
化合物J的合成
室温条件下，将实施例1的(5)中得到的化合物6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(F,1.36g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(0.32g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃旋干除去乙醇，用DCM溶解粗品，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状产物J(产量1.14g，产率75.2％)。
对化合物J进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，531.49，理论值531.47。
化合物K的合成
6-溴正己醇(3.33g，20.0mmol)溶于120mL DCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。在此反应液中加入月桂醇(4.16g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mLDCM稀释，用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到淡黄色油状物K(产量6.32g，产率77.6％)。
对化合物K进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，393.21，理论值393.19；核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)：δ4.22-4.05(m,4H),3.47(dt,2H),1.93-1.73(m,2H),1.72-1.62(m,4H),1.42-1.23(m,22H),0.99-0.80(m,3H)。
化合物U-209的合成
化合物J(0.27g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈，K(0.31g，0.8mmol)，碳酸钾(0.26g，2.0mmol)，KI(0.17g，1.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状物产物O-2-己基癸基-O’-十二烷基-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二己基)二碳酸酯(U-209)，计219mg(产率56.2％，纯度97.9％)。
对U-209进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，843.78，理论值843.73。
对U-209进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.15-3.93(m,8H),3.65-3.52(m,4H),2.85-2.50(m,12H),1.68-1.44(m,13H),1.42-1.07(m,52H),0.88(t,9H)。
(10)可离子化脂质U-210的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-210：
化合物L的合成
室温下将实施例1的(6)中得到的6-溴己基(9-十七烷基)碳酸酯(G，1.38g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(0.32g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃旋干除去乙醇，用DCM溶解粗品，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状产物L(产量0.81g，产率56.6％)。
对化合物L进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，545.49，理论值545.48。
化合物U-210的合成
将化合物L(0.28g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、实施例1(9)的化合物K(0.31g，0.8mmol)、碳酸钾(0.26g，2.0mmol)、KI(0.17g，1.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O-十七烷-9-基-O’-十二烷基-6,6'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二己基)二碳酸酯(U-210)，计242mg(产率61.2％，纯度98.3％)。
对U-210进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，857.81，理论值857.75。
对U-210进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.28–3.93(m,7),3.66–3.43(m,4H),2.83–2.52(m,12H),1.85–1.40(m,13H),1.34–1.02(m,53H),0.88(t,9H)。
(11)可离子化脂质U-211的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-211：
化合物M的合成
室温下将实施例1(7)的7-溴庚基(2-己基癸基)碳酸酯(H,1.43g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺(0.30g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃旋干除去乙醇，用DCM溶解粗品，饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状产物M(产量0.88g，产率58.3％)。对M进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，531.28，理论值531.47。
化合物N的合成
7-溴正庚醇(3.35g，20.0mmol)溶于120mLDCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。反应液中加入月桂醇(4.16g，22.4mmol)，室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mLDCM稀释，用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到淡黄色油状物N(产量6.63g，产率78.9％)。
对化合物N进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，407.24，理论值407.21。
对化合物N进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)：δ4.24–4.03(m,4H),3.46(dt,2H),1.92–1.73(m,2H),1.74–1.61(m,4H),1.40–1.22(m,24H),0.96–0.80(m,3H)。
化合物U-211的合成
将化合物M(0.27g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、化合物N(0.32g，0.8mmol)、碳酸钾(0.26g，2.0mmol)、KI(0.17g，1.0mmol)，85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O-2-己基癸基-O’-十二烷基-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二庚基)二碳酸酯(U-211)，计224mg(产率59.4％，纯度97.6％)。
对U-211进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，857.79，理论值857.75。
对U-211进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.122-3.96(m,8H),3.66-3.55(m,4H),2.81-2.47(m,12H),1.76-1.48(m,11H),1.46-1.09(m,56H),0.88(t,9H)。
(12)可离子化脂质U-212的合成
按照以下路线合成可离子化脂质U-212：
化合物O的合成
室温下将实施例1(8)的7-溴庚基(2-己基癸基)碳酸酯(I,1.44g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(2-氨基乙基)-二乙醇胺(0.30g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃旋干除去乙醇，用DCM溶解粗品，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状产物O(产量0.83g，产率57.1％)。
对化合物O进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，545.49，理论值545.48。
化合物U-212的合成
将化合物O(0.28g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、实施例1(11)的化合物N(0.32g，0.8mmol)、碳酸钾(0.26g，2.0mmol)、KI(0.17g，1.0mmol)，85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O-十七烷-9-基-O’-十二烷基-7,7'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二庚基)二碳酸酯(U-212)，计245mg(产率62.6％，纯度97.6％)。
对U-212进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，871.80，理论值871.76。
对U-212进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.27-3.96(m,7H),3.66-3.52(m,4H),2.80-2.44(m,12H),1.85-1.46(m,10H),1.45-1.12(m,49H),0.88(t,9H)。
(13)可离子化脂质UR-401的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-401：
将4-溴正丁醇(3.04g，20.0mmol)溶于120mLDCM中，加入DMAP(3.60g，30.0mmol)，在0℃下加入NPCF(4.80g，24.0mmol)，室温搅拌反应3h。此反应液中加入2-己基癸醇(5.44g，22.4mmol)，混合物在室温下搅拌反应12h。TLC显示反应完成后，加入80mL DCM稀释，然后用30mL饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的乙酸乙酯/石油醚)，得到无色油状产物4-溴丁基(2-己基癸基)碳酸酯，计4.98g(产率62.2％)。
对4-溴丁基(2-己基癸基)碳酸酯进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，421.24，理论值421.22.
对4-溴丁基(2-己基癸基)碳酸酯进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.26–3.94(m,4H),3.46(dt,2H),1.92-1.76(m,2H),1.69(td,3H),1.50-1.12(m，26H),0.88(t,6H)。
将4-溴丁基(2-己基癸基)碳酸酯(1.05g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、KI(332mg，2.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(2-己基癸基)-4,4'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二丁基)二碳酸酯UR-401,计255mg(产率25.4％,纯度98.2％)。
对UR-401进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，871.79，理论值871.76。
对UR-401进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.14-3.94(m,8H),3.64-3.50(m,4H),2.81-2.54(m,12H),1.71-1.47(m,12H),1.44-1.08(m,54H),0.88(t,12H)。
(14)可离子化脂质UR-402的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-402：
将实施例1的(7)中得到的7-溴庚基(2-己基癸基)碳酸酯(H,1.16g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈，N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(162mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、KI(332mg，2.0mmol)，85℃下搅拌反应20h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(2-己基癸基)-7,7'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二庚基)二碳酸酯(UR-402)，计378mg(产率34.7％，纯度97.4％)。
对UR-402进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，927.86，理论值927.83。
对UR-402进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.19-3.95(m,8H),3.68-3.50(m,4H),2.82-2.52(m,12H),1.75-1.49(m,12H),1.44-1.10(m,62H),0.88(t,12H)。
(15)可离子化脂质UR-403的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-403：
化合物403-1的合成
室温下将实施例1的(7)中得到的7-溴庚基(2-己基癸基)碳酸酯(H，1.43g，3mmol)溶于20mL乙醇中，加入N-(3-氨基丙基)-二乙醇胺(0.32g，20mmol)，升温至50℃，搅拌反应8h。监控反应进程，原料消耗完全后降温至45℃旋干除去乙醇，用DCM溶解粗品，用饱和食盐水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩得到淡黄色油状产物403-1(产量1.02g，产率68.9％)。
对403-1进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，545.49，理论值545.48。
化合物UR-403的合成
将实施例1的(11)中得到的化合物N(0.27g，0.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、化合物404-1(0.32g，0.8mmol)、碳酸钾(0.26g，2.0mmol)、KI(0.17g，1.0mmol)，在85℃下搅拌反应16h。冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状物产物O-十七烷-9-基-O’-十二烷基-7,7'-((3-(双(2-羟乙基)氨基)丙基)氮杂二庚基)二碳酸酯(UR-403)，计233mg(产率49.6％，纯度97.8％)。
对UR-403进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，871.78，理论值871.76。
对UR-403进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.18-3.93(m,8H),3.64-3.50(m,4H),2.84-2.50(m,12H),1.69-1.46(m,13H),1.42-1.05(m,56H),0.88(t,9H)。
(16)可离子化脂质UR-404的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-404：
实施例1的(5)中得到的化合物6-溴己基(2-己基癸基)碳酸酯(F，1.12g，2.5mmol)溶于10mLTHF中，加入10mL乙腈、4-氨基-1-丁醇(89mg，1.0mmol)、碳酸钾(550mg，4.0mmol)、KI(332mg，2.0mmol)，85℃下搅拌20h。TLC显示反应完成后，冷却至室温，过滤，滤渣用DCM洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用DCM萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，柱层析分离(洗脱液：0-5％的甲醇/DCM)，得到淡黄色油状产物O,O’-双(2-己基癸基)-6,6'-((3-羟丁基)氮杂二庚基)二碳酸酯(UR-404)，计466mg(产率47.3％，纯度97.2％)。
对UR-404进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+，826.77，理论值826.74。
对UR-404进行核磁氢谱分析，1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.19–3.93(m,8H),3.62-3.21(m,2H),2.78-2.52(m,6H),1.71-1.44(m,12H),1.42-1.10(m,60H),0.88(t,12H)。
(17)可离子化脂质UR-400的合成
按照以下路线合成可离子化脂质UR-400：
将6-溴己酸-3-己基壬酯(303mg)和N,N-双(2-羟乙基)乙二胺(50mg)溶于乙腈(2mL)中，加入碳酸钾(140mg)和碘化钾(5.6mg)，加热至70℃搅拌反应24小时。反应完毕后待反应液冷却至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得双(3-己基壬基)-6,6'-((2-(双(2-羟乙基)氨基)乙基)氮杂二烷基)二己酸酯(UR-400)(产量125mg，产率45.1％，纯度97.6％),
对UR-400进行质谱分析，LC–TOF:m/z[M+H]+797.8。
对UR-400进行核磁氢谱分析，1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ4.11(t,4H),4.02–3.74(m,1H),3.65(t,4H),2.74(dd,11H),2.34(t,4H),1.64(dq,11H),1.50-1.20
(m,49H),0.94-0.89(m,12H)。
实施例2包载VEGFa mRNA的脂质纳米粒(VEGFa mRNA-LNP)的制备
血管内皮细胞生长因子a(VEGFa)mRNA购自楷拓生物科技(苏州)有限公司。VEGFamRNA(50μg)溶解在pH＝4的柠檬酸溶液中，为水相。可离子化脂质分别是实施例1中的U-201～U-212、UR-400～UR-404或ALC-0315(购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、SM-102(购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司)。按照摩尔比50:38.5:10:1.5取上述可离子化脂质、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000，并溶解在乙醇中作为醇相。用微流控脂质纳米粒制备仪(型号Nano S，联建生物(苏州)有限公司)快速混合水相和有机相，制备一系列VEGFa mRNA-LNP浓溶液。将VEGFa mRNA-LNP浓溶液分别迅速加入到有10倍体积PBS(pH 7.4)的超滤管中，5000r/min离心30min，过膜，得到一系列包裹VEGFa mRNA的VEGFa mRNA-LNP脂质纳米粒溶液，于4℃冰箱备用。
粒径测量：用动态光散射仪(DLS)(马尔文粒度仪,NanoBrook Omin,美国布鲁克海文仪器公司)测量上述上述系列VEGFa mRNA-LNP的粒径(D)、多分散性指数(PDI)。取100μLVEGFa mRNA-LNP溶液，加入900μL蒸馏水稀释，混匀后加入比色皿，置于样品槽中测量，散射角173°，温度25℃。测量结果见表1。
包封率测量：使用RNA试剂盒测量VEGFa mRNA-LNP的包封率。检测原理如下：首先检测VEGFa mRNA-LNP溶液中游离在LNPs颗粒外的VEGFa mRNA的量，然后用Triton-100破坏LNPs结构，使全部mRNA释放到溶液中，检测溶液中所有mRNA的量。两者的差值就是被包封在LNPs颗粒内部的mRNA的量，除以总mRNA的量即为包封率。具体检测步骤参照试剂使用说明书。简而言之，配制TE buffer和2％TE-Triton buffer溶液，测定VEGFamRNA-LNP样品中游离mRNA时，用1×TE buffer稀释VEGFa mRNA-LNP溶液，加100μL稀释后的样品到96孔板。对于总mRNA的测定，用2％ TE-Triton buffer稀释VEGFa mRNA-LNP溶液，添加100μL稀释后的样品到96孔板中。在孔板中添加100μL的RiboGreen染料，孵育5min，打开酶标仪(型号1510，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，设置参数，选择荧光模式，激发光波长485nm，发射光波长528nm，读取数据，按公式(1)计算包封率：
包封率＝((总mRNA-游离mRNA)/总mRNA)×100％(1)
结果见表1。
表1可离子化脂质制备的VEGFa mRNA-LNP粒径D(nm)、粒径分布PDI和包封率(％)
由表1可见，由U-201～U-212制备的VEGFa mRN-LNP平均粒径为93～115nm，多分散性系数(PDI)0.13-0.16，粒径分布均一。由UR-400～UR-404、ALC-0315或SM-102制备的VEGFa mRNA-LNP平均粒径为98-245nm，多分散性系数(PDI)0.16-0.30，LNP粒径分布均一性稍差。
由U-201～U-212制备的VEGFa mRNA-LNP中mRNA的包封率为86.7～91.4％，显示可离子化脂质具有很好的包封效率。因此，U-201～U-212的包封率高，制备的LNP粒径小，分布均一。UR-401～UR-404制备的VEGFa mRNA-LNP的包封率低，容易造成宝贵的VEGFa mRNA损失。UR-400、ALC-0315或SM-102制备的VEGFa mRNA-LNP的包封率达到75％以上。
VEGFa mRNA-LNP稳定性测试：将系列VEGFa mRNA-LNP脂质纳米粒溶液分别按照5％蔗糖计加入蔗糖。将含有5％蔗糖的VEGFa mRNA-LNP脂质纳米粒溶液分别放置在4℃条件下，在第0d、7d、14d、21d和28d时记录溶液外观的变化，用激光粒度仪监测溶液的粒径变化。
结果如下，U-201～U-212制备的VEGFa mRNA-LNP 4℃下存储28天，其粒径无明显变化，说明LNP-mRNA在4℃下有良好的稳定性。而UR-400～UR-404、ALC-0315或SM-102制备的VEGFa mRNA-LNP平均粒径有所增大，尤其是初始粒径较大的LNP粒径增大明显，稳定性较差。
实施例3VEGFa mRNA-LNP的细胞毒性评价
用CCK-8试剂盒检测实施例2制备得到的一系列包裹VEGFa mRNA的脂质纳米粒VEGFa mRNA-LNP溶液细胞毒性。首先，将人胚肾细胞HEK 293T细胞(美国ATCC菌种库)(1×104)接种到96孔板中，加入DMEM培养基，在37℃的细胞培养箱中培养20h，待细胞长到80％的融合度。弃去上清液，用PBS标准溶液洗涤三次，加入Opti-MEM无血清培养基，试验孔中加入制剂。实验组：分别加入实施例2制备得到的一系列不同可离子化脂质构建的LNP包载VEGFa mRNA的脂质纳米粒溶液VEGFa mRNA-LNP(mRNA均为1μg)；mRNA组：裸VEGFa mRNA；对照组(NT)：不加药剂；空白组：无细胞(有培养基)。Lipo3000(Lipofectamine 3000，生化级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)包载等量VEGFa mRNA的LNP溶液为阳性对照。培育20-24h后，每个试验孔中加入10μLCCK-8试剂，孵育2-4h后使用酶标仪检测样品在450nm处的吸光度值，按照公式(2)计算细胞存活率：
其中，ODtreated为实验组OD值，ODcontrol为不加药组OD值，ODblank为空白组OD值(无细胞)，加培养基。测量结果如图1所示。
由图1可见，裸VEGFa mRNA组的细胞存活率为100％，显示mRNA无毒性。由U-201～U-212制备的VEGFa mRNA-LNP组的细胞存活率均为90％以上，说明U-201～U-220构建的LNP包载VEGFa mRNA的脂质纳米粒无明显毒性，显示可离子化脂质良好的生物安全性。由UR-400～UR-404、ALC-0315、SM-102制备的VEGFa mRNA-LNP组的细胞存活率在75％-85％之间，显示较低的毒性。Lipo3000组的细胞存活率仅为35％左右，显示很强的毒性。
因此，U-201～U-212制备的脂质纳米粒包载VEGFa mRNA后无明显毒性，安全性最好。UR-400～UR-404、ALC-0315或SM-102制备的LNP毒性低。Lipo3000含阳离子组分，毒性最强。
实施例4VEGFa mRNA-LNP体外表达
酶联免疫吸附法(ELISA)检测实施例2制备的系列VEGFa mRNA-LNP在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中VEGFa蛋白表达情况。将HUVEC细胞(8×105个细胞/孔)接种在六孔板中，加入DMEM培养基在细胞培养箱(37℃)中培养20h左右，待细胞达80％的融合度。弃去DMEM培养基，在共聚焦皿中加入2mL Opti-MEM无血清培养基，每孔加入等量裸露VEGFa mRNA、VEGFa mRNA-LNP(mRNA＝1μg)。37℃培养24h后，取细胞上清液，用Elisa试剂盒检测VEGFa蛋白表达水平，具体步骤按试剂盒说明书所述(VEGFa蛋白试剂盒，生化级，武汉福因德科技有限公司)。
a)冰箱取出试剂盒，室温放置30min，试剂盒恢复至室温。取96孔板，加入300μL孔板洗涤液，洗涤三次。待孔板干燥，加入100μL细胞上清液，37℃培养箱孵育1h。
b)孵育结束后，取出96孔板，弃去细胞上清液，再次加入300μL孔板洗涤液，洗涤三次。待孔板干燥，加入100μL生物素标记的抗VEGFa蛋白抗体工作液。盖上孔板盖，将孔板置于37℃条件下培养1h。注意：生物素标记的抗VEGFa蛋白抗体工作液需要在使用前15min内配制。
c)弃去生物素标记的抗VEGFa蛋白抗体工作液，加入300μL孔板洗涤液，清洗三次。待孔板干燥，加入100μL的链霉亲和素工作液。37℃孵育1h。
d)孵育结束后，弃去链霉亲和素工作液，清洗孔板三次，加入90μL的TMB底物溶液。37℃条件下孵育15min，加入100μL反应终止液，溶液颜色由蓝变黄。将96孔板置于酶标仪中(型号1510，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，测定OD值，检测波长：450nm。根据带有浓度梯度的标准品孔的OD值绘制标准曲线，将各个样品OD值代入计算，得到最终VEGFa蛋白浓度，结果见表2。
表2可离子化脂质制备的VEGFa mRNA-LNP转染HUVEC细胞后蛋白表达量
可离子化脂质 VEGFa(ng/mL) 可离子化脂质 VEGFa(ng/mL)
U-201 46.4 U-211 36.8
U-202 44.3 U-212 34.2
U-203 43.6 UR-400 28.1
U-204 41.5 UR-401 5.7
U-205 40.7 UR-402 6.2
U-206 39.6 UR-403 4.7
U-207 44.3 UR-404 5.8
U-208 43.8 ALC-0315 23.1
U-209 45.1 SM-102 20.4
U-210 44.2
由表2可见，由U-201～U-212制备的VEGFa mRNA-LNP组表达的VEGFa浓度最高达到34.2～46.4ng/mL，LNP的递送效率和mRNA蛋白表达效率很高，说明可离子化脂质U-201～U-212构建的LNP递送性能突出，LNP溶酶体逃逸和mRNA表达效率优异。由UR-400～UR-404、ALC-0315或SM-102制备的VEGFa mRNA-LNP组表达的VEGFa浓度4.7～28.1ng/mL，显著低于前者，显示较差的递送能力。
结果表明，U-201～U-212制备的脂质纳米粒表达的VEGFa浓度最高，表达效果最好，是UR-400制备的脂质纳米粒蛋白表达效率的2倍左右，是UR-401～UR-404、ALC-0315或SM-102制备的脂质纳米粒蛋白表达效率近5～10倍左右。
实施例5体内表达效果评价试验一
1、包裹Fluc mRNA的脂质纳米粒(Fluc mRNA-LNP)的制备
Fluc mRNA-LNP制备过程同实施例2，萤火虫荧光素酶Fluc mRNA购自楷拓生物科技(苏州)有限公司。通过微流控脂质纳米粒制备仪将Fluc mRNA包裹到LNP中，方法如下：Fluc-mRNA(50μg)溶解在pH＝4的柠檬酸溶液中，为水相。可离子化脂质是实施例1的U-201～U-212、UR-400～UR-404或ALC-0315(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)。按摩尔比50:38.5:9:2.5取可离子化脂质、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000溶解在乙醇中作为醇相。用微流控仪快速混合水相和有机相，制备一系列Fluc mRNA-LNP浓溶液。将Fluc mRNA-LNP浓溶液迅速加入到有10倍体积PBS(pH 7.4)的超滤管中，5000r/min离心30min，过膜，得到系列Fluc mRNA-LNP溶液，于4℃冰箱备用。用马尔文粒度仪测量mRNA-LNP粒径(D)、多分散指数(PDI)。实验过程同实施例2，结果见表3。
表3可离子化脂质等制备的Fluc mRNA-LNP的粒径D(nm)及其分布PDI
可离子化脂质 D PDI 可离子化脂质 D PDI
U-201 95 0.13 U-211 109 0.16
U-202 101 0.15 U-212 114 0.15
U-203 105 0.16 UR-400 124 0.17
U-204 96 0.18 UR-401 165 0.26
U-205 103 0.16 UR-402 178 0.29
U-206 112 0.15 UR-403 192 0.20
U-207 98 0.14 UR-404 230 0.23
U-208 104 0.16 ALC-0315 111 0.18
U-209 90 0.15 SM-102 106 0.15
U-210 93 0.18
2、活体荧光成像实验
将含有20μg Fluc mRNA的上述各LNP制剂经肌肉注射至4-6周龄、重量为17-19g的雌性BALB/C小鼠体内，给药后各时间节点(6h、24h、48h和7d)对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物(D-荧光素钾盐，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。小鼠自由活动5分钟，后经小动物活体成像仪(IVIS Lumina Series III,美国PerkinElmer公司)检测Fluc mRNA在小鼠体内表达蛋白质的荧光总光通量(单位：p/s)，检测结果见表4。
表4给药Fluc mRNA-LNP脂质纳米粒后小鼠活体成像数据
由表4可见，由U-201～U-212制备的Fluc mRNA-LNP的荧光强度高，6小时达到108数量级，荧光最强，24小时开始减弱，但荧光强度仍然接近1x108。结果显示，Fluc mRNA-LNP在体内被细胞高效摄入，并有效释放Fluc mRNA，持续长久高效翻译表达Fluc蛋白，说明可离子化脂质U-201～U-212构建的LNP具有最优的体内递送、溶酶体逃逸和mRNA表达效率。
由UR-401～UR-404制备的Fluc mRNA-LNP组的荧光强度弱，6小时达到106数量级，24小时开始减弱，显示mRNA-LNP在体内被细胞摄入少，且Fluc mRNA翻译表达Fluc蛋白的效率低，说明可离子化脂质构建的LNP的体内递送和mRNA表达效率差。UR-400、ALC-0315制备的Fluc mRNA-LNP组的荧光强度稍弱，6小时达到107数量级，24小时开始减弱，显示mRNA-LNP在体内被细胞摄入较少，且Fluc mRNA翻译表达Fluc蛋白的效率较低。
由U-201～U-212制备的Fluc mRNA-LNP的荧光强度是UR-401～UR-404制备的FlucmRNA-LNP组的荧光强度的100倍左右，是UR-400、ALC-0315的10倍左右。而且，前者持续表达蛋白的时间长。
U-201、U-202、U-203、U-204、U-205、U-206、U-209、U-210结构中两个氮原子之间有三个碳原子，且结构中间的碳酸酯部分为五元或六元亚烷基，即两个氮原子之间的碳原子数与中间的亚烷基部分的碳原子数之和是8或9。U-207、U-208、U-211、U-212结构中两个氮原子之间有两个碳原子，且结构中间的碳酸酯部分为七元亚烷基，即两个氮原子之间的碳原子数与中间的亚烷基部分的碳原子数之和是9。
与之相对地，UR-401结构中两个氮原子之间有三个碳原子，且结构中间的碳酸酯部分为四元亚烷基，即两个氮原子之间的碳原子数与中间的亚烷基部分的碳原子数之和是7。UR-402、UR-403结构中两个氮原子之间有三个碳原子，且结构中间的碳酸酯部分为七元亚烷基，即两个氮原子之间的碳原子数与中间的亚烷基部分的碳原子数之和是10。相差较大的是UR-404，其极性头部结构仅有一个羟基。
U-201～U-212和UR-401、UR-402、UR-403有相同的强极性头部结构二乙醇胺和类似的非极性烷基链脂质结构尾部，但是头部和尾部之间的极性渐变区长度不同。与极性渐变区碳原子数共为7的UR-401，极性渐变区碳原子数共为10的UR-402、UR-403相比，U-201～U-212的极性渐变区碳原子数共为8或9，长度适中。而UR-401极性渐变区长度偏短，UR-402、UR-403极性渐变区长度偏长。
因此，实施例4中U-201～U-212制备的脂质纳米粒表达的VEGFa浓度最高，是UR-401～UR-404等表达的VEGFa浓度的10倍左右，显示前者构建的脂质纳米粒作为递送系统取得了意想不到的优异的mRNA递送和蛋白表达效果。
实施例5中U-201～U-212制备的脂质纳米粒体内表达的Fluc荧光强度高，高强度持续表达最长，蛋白表达效率最高。UR-401～UR-404制备的脂质纳米粒表达荧光强度低，表达效率差。前者是后者的100倍左右，而且持续时间更长。
上述体外和体内验证LNP递送载体性能的实验表明：可离子化脂质的结构与细胞内转染效率、细胞毒性以及在动物体内的表达之间无明显对应关系。结构差异很小的化合物，在转染效率、细胞毒性、细胞内的高表达方面可能差异非常大。因此，筛选合适的可离子化脂质，同时具有高转染和表达效率和低细胞毒性是非常困难的事情。
本发明的可离子化脂质U-201～U-212，头部是二乙醇胺强极性结构，可离子化脂质中间部分结构中两个氮原子之间的碳原子数与碳酸酯的亚烷基部分的碳原子数之和是8或9，构建的LNP的递送性能最优。尾端是15～18个碳原子的支链烷基，或尾部是11～14个碳原子的直链烷基，使可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于包载保护核酸和LNP入胞。同时，使质子化后的可离子化脂质的亲水性和疏水性达到最佳组合，利于核酸包载和LNP溶酶体逃逸。
UR-400是由酯键构建而成的可离子化脂质，UR-400结构中两个氮原子之间有二个碳原子，羧酸酯羧基部分为六元酸，两个氮原子之间的碳原子数与羧酸酯羧酸部分的碳原子数之和是8。尽管UR-400与U-201的区别仅仅在于前者是羧酸酯键而后者是碳酸酯键，其它部分相似或相同，但U-201构建的LNP包载mRNA后显示非常优异的递送表达效果，远远优于UR-400构建的LNP，其结果是意想不到的。分析原因，归因于U-201的碳酸酯键极性小，亲脂性强，导致构建的LNP稳定性高，易于入胞，有利于mRNA的高效递送和蛋白的长久稳定表达。
本发明可离子化脂质U-203、U-209、U-205、U-207、U-202、U-219、U-201、U-206、U-204、U-208、U-210、U-212、U-211，相对于现有技术的其它化合物，以高的细胞转染效率、低细胞毒性或者无毒性以及在体内高表达和持续表达来递送核酸，取得了预料不到的技术效果。与现有技术代表性阳离子脂质结构有显著差别，同时具有高包封率、高转染效率和低细胞毒性，且在体内高蛋白表达及持续表达。
实施例5体内表达效果评价试验二
1、包裹Fluc mRNA的脂质纳米粒(Fluc mRNA-LNP)的制备
Fluc mRNA-LNP制备过程同实施例2，萤火虫荧光素酶Fluc mRNA购自楷拓生物科技(苏州)有限公司。通过微流控脂质纳米粒制备仪将Fluc mRNA包裹到LNP中，方法如下：Fluc-mRNA(50μg)溶解在pH＝4的柠檬酸溶液中，为水相。可离子化脂质是实施例1的U-201、U-203、U-205、U-207、U-209、ALC-0315(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)。按摩尔比50:38.5:10:1.5取可离子化脂质、胆固醇、DSPC和DMG-PEG2000溶解在乙醇中作为醇相。用微流控仪快速混合水相和有机相，制备一系列Fluc mRNA-LNP浓溶液。将Fluc mRNA-LNP浓溶液迅速加入到有10倍体积PBS(pH7.4)的超滤管中，5000r/min离心30min，过膜，得到系列FlucmRNA-LNP溶液，于4℃冰箱备用。用马尔文粒度仪测量mRNA-LNP粒径(D)、多分散指数(PDI)。实验过程同实施例2，结果见表5。
表5可离子化脂质等制备的Fluc mRNA-LNP的粒径D(nm)及其分布PDI
可离子化脂质 D PDI
U-201 95 0.13
U-203 85 0.16
U-205 92 0.15
U-207 96 0.13
U-209 91 0.14
ALC-0315 96 0.16
2、活体荧光成像实验
将含有20μg Fluc mRNA的上述各LNP制剂经肌肉注射至4-6周龄、重量为17-19g的雌性BALB/C小鼠体内，给药后各时间节点(6h、24h、48h和7d)对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物(D-荧光素钾盐，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。小鼠自由活动5分钟，后经小动物活体成像仪(IVIS Lumina Series III,美国PerkinElmer公司)检测Fluc mRNA在小鼠体内表达蛋白质的荧光总光通量(单位：p/s)，检测结果见图2和表6。
表6给药Fluc mRNA-LNP脂质纳米粒后小鼠活体成像数据
图2为可离子化脂质U-201、U-203、U-205、U-207、U-209、ALC-0315制备的FlucmRNA-LNP小鼠静脉给药6小时后活体荧光成像图；其中，1为U-201组；2为U-203组；3为U-205组；4为U-207组；5为U-209组；6为ALC 0315组。图2可见，U-201组荧光强度最强，U-209组次之，ALC-0315组较低。
不同时间活体荧光强度定量结果见表6。由图2和表6可见，由U-201、U-203、U-205、U-207、U-209制备的Fluc mRNA-LNP的荧光强度高，6小时达到1.04～2.33×108数量级，荧光最强，24小时开始减弱，但荧光强度仍然达到0.4～1.0×108。结果显示，Fluc mRNA-LNP在体内被细胞高效摄入，并有效释放Fluc mRNA，持续长久高效翻译表达Fluc蛋白，说明可离子化脂质U-201、U-203、U-205、U-207、U-209构建的LNP具有最优的体内递送、溶酶体逃逸和mRNA表达效率。ALC-0315制备的Fluc mRNA-LNP组的荧光强度稍弱，6小时达到0.94×108，24小时开始减弱，显示mRNA-LNP在体内被细胞摄入较少，且Fluc mRNA翻译表达Fluc蛋白的效率较低。可见，U-201、U-203、U-205、U-207、U-209制备的LNP的递送修改优于ALC-0315制备的LNP。
以上描述了本发明的基本原理和优点。本领域的技术人员应该了解，以上实施例仅用于进一步说明本发明，但并非用以限制本发明的范围，任何所属领域一般技术人员都可以轻易达成的改变均包括在本发明说明书揭示内容和所附权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述可离子化脂质的结构如式I所示，
其中，G1是亚烷基-(CH2)m-，m是4～8的正整数；G2是亚烷基-(CH2)n-，n是4～8的正整数；
G3是亚烷基-(CH2)p-，p是2或3；
R1是C15～18支链烷基；R2是C15～18支链烷基或C11～14的直链烷基。
2.根据权利要求1所述的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述R1选自：
所述R2选自：
3.根据权利要求1所述的可离子化脂质或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述可离子化脂质选自：
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括治疗剂或预防剂及用于递送治疗剂或预防剂的载体，其中，所述治疗剂或预防剂包括小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、DNA核酸分子中的一种或多种；所述载体包括权利要求1-3任一项所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐中的一种或多种；所述载体与治疗剂或预防剂的质量比为：1～100:1。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述组合物为脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒的平均粒径为50nm～300nm；所述脂质纳米颗粒的多分散指数≤0.30。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述载体还包括结构脂质，所述结构脂质为胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、谷固醇、麦角固醇、非甾醇、皮质类固醇、熊果酸、番茄碱及α-生育酚中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述载体还包括中性脂质，所述中性脂质为神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及其衍生物中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述载体还包括聚合物共轭脂质，所述聚合物共轭脂质为聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的二烷基胺及PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐、结构脂质、中性脂质及聚合物共轭脂质的摩尔比为(15～60)：(15～45)：(5～30)：(0.5-5)。
10.权利要求1-3任一项所述可离子化脂质或其药学上可接受的盐或权利要求4-9任一项所述组合物在制备治疗疾病或病症的核酸药物或核酸疫苗中的应用。
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