MX2014010211A - Lipidos cationicos de trialquilo y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Lipidos cationicos de trialquilo y metodos de uso de los mismos.

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Abstract

La presente invención proporciona composiciones y métodos para la entrega de agentes terapéuticos a células. En particular, estos incluyen novedosos lípidos catiónicos de trialquilo y partículas de ácido nucleico-lípido que proporcionan una encapsulación eficiente de ácidos nucleicos y una entrega eficiente del ácido nucleico encapsulado a células in vivo. Las composiciones de la presente invención son altamente potentes, permitiendo por ello un efectivo abatimiento de una proteína objetivo específica a dosis relativamente bajas.

Description

LÍPIDOS CATIÓNICOS DE TRIALQUILO Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/602.990, presentada el 24 de febrero de 2012, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Antecedentes de la invención I. Campo de la invención La presente invención se refiere a lípidos catiónicos de trialquilo novedosos, partículas de lípidos que comprenden uno o más de los lípidos catiónicos de trialquilo, métodos para elaborar las partículas de lípidos, y método para suministrar y/o administrar las partículas de lípidos (por ejemplo, para tratar enfermedades en mamíferos).
II. Descripción de la téenica relacionada Los ácidos nucleicos terapéuticos incluyen, por ejemplo, RNA interferente pequeño (siRNA), micro-RNA (miRNA), oligonucleótidos antisentido, ribozimas, plásmidos y ácidos nucleicos de estimulación inmunitaria. Estos ácidos nucleicos actúan mediante una variedad de mecanismos. En el caso de moléculas RNA interferentes, tales como siRNA y miRNA, estos ácidos nucleicos pueden regular por diminución los niveles intracelulares de proteínas específicas a través de un proceso denominado interferencia de RNA (RNAi). Después de la introducción de RNA interferente en el citoplasma celular, estas construcciones de RNA de cadena (o filamento) doble se pueden unir a una proteína denominada RISC. La cadena (o filamento) de sentido de RNA interferente se desplaza del complejo RISC proporcionando una plantilla dentro de RISC que puede reconocer y unir mRNA con una secuencia complementaria a aquella del RNA interferente unido. Luego de unir el mRNA complementario, el complejo RISC escinde el mRNA y libera las cadenas escindidas. RNAi puede proporcionar una regulación por disminución de proteínas específicas fijando como objetivo la destrucción específica del mRNA correspondiente que codifica la síntesis de proteínas.
Las aplicaciones terapéuticas de RNAi son extremadamente amplias, dado que las construcciones de RNA interferente se pueden sintetizar con cualquier secuencia de nucleótidos dirigida contra una proteína objetivo. A la fecha, las construcciones de siRNA han mostrado la capacidad de regular por disminución específicamente las proteínas objetivo tanto en modelos in vitro como in vivo. Además, las construcciones de siRNA están actualmente siendo evaluadas en estudios clínicos.
Sin embargo, dos problemas que enfrentan las construcciones de RNA interferente hoy en día son, en primer lugar, su susceptibilidad a la digestión de nucleasa en plasma, y en segundo lugar, su limitada capacidad para obtener acceso al compartimiento intracelular donde se pueden unir a RISC al ser administradas sistemáticamente como moléculas de RNA interferentes libres. Estas construcciones de cadena doble se pueden estabilizar mediante la incorporación de enlazadores de nucleótidos modificados químicamente dentro de la molécula, por ejemplo, grupos fosfotioato. Sin embargo, dichos enlazadores modificados químicamente proporcionan solo una protección limitada de la digestión de nucleasa y pueden disminuir la actividad de la construcción. La administración intracelular del RNA interferente se puede facilitar con el uso de sistemas portadores tales como polímeros, liposomas catiónicos, o con la unión covalente de un resto o porción de colesterol a la molécula. Sin embargo, son necesarios los sistemas de administración mejorados para aumentar la potencia de las moléculas de RNA interferentes tales como siRNA y miRNA y para reducir o eliminar los requisitos para los enlazadores de nucleótido modificados químicamente.
Además, aún hay problemas con la capacidad limitada de los ácidos nucleicos terapéuticos tales como RNA interferente para atravesar las membranas celulares (ver Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)) y en los problemas asociados con la toxicidad sistémica, tal como la anafilaxia mediada por el complemento, propiedades coaguladoras alteradas y citopenia (Galbraith, et al., Antisense Nucí. Acid Drug Des. , 4:201 -206 (1994)).
Para intentar mejorar la eficacia, los investigadores también han empleado sistemas portadores basados en lípidos para administrar ácidos nucleicos terapéuticos modificados o no modificados. Zelphati et al. (J. Contr. Reí., 41 :99-1 19 (1996)), describe el uso de liposomas (convencionales) aniónicos, liposomas sensibles al pH, inmunoliposomas, liposomas fusogenicas y agregados lipidíeos catiónicos/antisentido. De manera similar, se ha administrado siRNA sistémicamente en liposomas catiónicos y se ha demostrado que estas partículas de lípido-ácido nucleico proporcionan una regulación por disminución mejorada de las proteínas objetivo en mamíferos que incluyen primates no humanos (Zimmermann et al., Nature 441 : 1 1 1 -1 14 (2006)).
A pesar de este progreso, todavía existe una necesidad en la téenica de composiciones de lípido-ácido nucleico terapéutico mejoradas que sean adecuadas para el uso terapéutico general. Preferentemente, estas composiciones encapsulan los ácidos nucleicos con alta eficacia, tienen altas relaciones fármaco: lípido, protegen el ácido nucleico encapsulado de la degradación y depuración en suero, son adecuados para la administración sistémica y proporcionan una administración intracelular del ácido nucleico encapsulado. Además, estas partículas de lípido-ácido nucleico deberían ser bien toleradas y proporcionar un índice terapéutico adecuado de forma tal que el tratamiento del paciente con una dosis efectiva del ácido nucleico no se asocie con una toxicidad y/o riesgo significativo para el paciente.
Breve descripción de la invención La presente invención proporciona lípidos (amino) catiónicos de trialquilo y partículas de lípidos novedosos que comprenden estos lípidos, que son ventajosos para la administración in vivo de ácidos nucleicos así como composiciones de ácido nucleico-partículas de lípidos adecuadas para el uso terapéutico in vivo. La presente invención también proporciona métodos para realizar estas composiciones, así como métodos para introducir ácidos nucleicos en células usando estas composiciones, por ejemplo, para tratar varias enfermedades. La presente invención también incluye todos los compuestos e intermedios novedosos descritos en la presente.
Tal como se describe en el Ejemplo 2 de la presente, los lípidos catiónicos de trialquilo de la presente invención son más fuertes en un ensayo siRNA ApoB murino que lípidos de otra forma idénticos que tienen cadenas de alquilo más largas.
En un aspecto, la presente invención proporciona un lípido catiónico que tiene una Fórmula (I) estructural: X-A-Y-Z; (l) o sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de esta, donde: X es alquilamino; A es alquilo C ·, a C6 opcionalmente sustituido, donde dicho alquilo CT a C6 opcionalmente sustituido puede ser saturado o insaturado y donde A puede estar o no presente; Y se selecciona del grupo que consiste en cetal, éster, carbamato, éter, y amida opcionalmente sustituido; y Z es un resto o porción hidrofóbico que consiste en tres cadenas de alquilo donde cada una de las cadenas de alquilo tiene una longitud de C8 a Cu, donde cada una de las tres cadenas de alquilo pueden ser saturadas o insaturadas, y donde cada una de las tres cadenas de alquilo está opcionalmente sustituida.
Con respecto a los lípidos de la Fórmula (I), los ejemplos representativos de los grupos alquilamino incluyen dimetilamino, dietilamino y etilmetilamino.
Con respecto a los lípidos de la Fórmula (I), un ejemplo representativo de un sustituyerne opcional presente en los grupos amida y/o carbamato es un grupo alquilo saturado o insaturado (por ejemplo, alquilo C^Ce).
Con respecto a los lípidos de la Fórmula (I), un ejemplo representativo de un sustituyente opcional que puede estar presente en una o más de las tres cadenas de alquilo del resto hidrofóbico Z es un grupo hidroxilo.
Con respecto a lípidos de la Fórmula (I), se comprenderá que donde una cadena de alquilo del resto hidrofóbico Z contiene uno o más enlaces dobles o enlaces triples, por lo tanto esa cadena de alquilo se denomina como insaturada.
Con respecto a lípidos de la Fórmula (I), se comprenderá, para evitar dudas, que una o más cadenas de alquilo para el resto hidrofóbico Z puede incluir un grupo cicloalquilo (por ejemplo, a ciclopropilo).
Con respecto a lípidos de la Fórmula (I), se comprenderá que el termino "éster" incluye esteres que tienen la estructura -C(=0)0- o - 0C(=0)-. El término "amida" incluye amidas que tienen la estructura -C(=0)NR- o -NR(=0)C-. El término "carbamato" incluye carbamatos que tienen la estructura -0C(=0)NR- o -NRC(=0)0-.
Los lípidos de la Fórmula (I) son útiles, por ejemplo, para elaborar las partículas de lípidos de la invención que son útiles, por ejemplo para administrar agentes terapéuticos (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico biológicamente activas, tales como siRNA) a un mamífero (por ejemplo, ser humano) que lo necesite.
En algunas modalidades de los lípidos de la Fórmula (I), Z tiene la fórmula: donde, Ri, R2, y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C8 a Cu , donde cada R^ R2, y R3 pueden ser independientemente saturados o insaturados y donde cada R1, R2, y R3 está opcionalmente sustituido.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una partícula de lipido que comprende uno o más lípidos catiónicos anteriores de la Fórmula (I) o sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de estos. En determinadas modalidades, la partícula de lipido comprende además uno o más lípidos no catiónicos tales como lípidos neutrales. En otras modalidades determinadas, la partícula de lipido comprende además uno o más lípidos conjugados capaces de reducir o inhibir la agregación de partículas. En modalidades adicionales, la partícula de lípido comprende además uno o más agentes activos o agentes terapéuticos.
En determinadas modalidades, el componente lípido no catiónico de la partícula de lípido puede comprender un fosfolípido, colesterol (o derivado de colesterol) o una mezcla de estos. En una modalidad particular, el fosfolípido comprende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), o una mezcla de estos. En algunas modalidades, el componente lipídico conjugado de la partícula de lípido comprende un conjugado de polietilenglicol (PEG)- lípido. En algunos casos, el conjugado PEG-lípido comprende un conjugado PEG-diacilglicerol (PEG-DAG), un conjugado PEG-dialquiloxipropilo (PEG-DAA), o una mezcla de estos. En otras modalidades, el conjugado de lípido comprende un conjugado de polioxazolina (POZ)-lípido tal como un conjugado de POZ-DAA.
En algunas modalidades, el agente activo o agente terapéutico comprende un ácido nucleico. En algunos casos, el ácido nucleico comprende una molécula de RNA interferente tal como, por ejemplo, un siRNA, aiRNA, miRNA, dsRNA de sustrato de Dicer, shRNA, o mezclas de estos. En otros casos determinados, el ácido nucleico comprende DNA monocatenario o bicatenario, RNA, o un híbrido de DNA/RNA tal como, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, una ribozima, un plásmido, un oligonucleótido inmunoestimulatorio, o mezclas de estos.
En otras modalidades, el agente activo o agente terapéutico está completamente encapsulado dentro de la parte de lípido de la partícula de lípido de manera que el agente activo o agente terapéutico en la partícula de lípido sea resistente en una solución acuosa a la degradación enzimática, por ejemplo, mediante una nucleasa o proteasa. En modalidades adicionales, la partícula de lípido es sustancialmente no tóxica para mamíferos tales como seres humanos.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) que comprende: (a) uno o más ácidos nucleicos tales como moléculas RNA interferentes; (b) uno o más lípidos catiónicos de la Fórmula I o sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de este; (c) uno o más lípidos no catiónicos; y (d) uno o más lípidos conjugados que inhiben la agregación de partículas.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) que comprenden: (a) uno o más ácidos nucleicos; (b) uno o más lípidos catiónicos de la Fórmula I o sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptable de estos que comprenden de alrededor de 50 % molar a alrededor de 85 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) uno o más lípidos no catiónicos que comprenden de alrededor 13 % molar a alrededor 49,5 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) uno o más lípidos conjugados que inhiben la agregación de partículas que comprenden de alrededor de 0,5 % molar a alrededor 2 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula.
En un aspecto de esta modalidad, la partícula de lípido (por ejemplo, LNP) comprende: (a) un ácido nucleico; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de este que comprende de alrededor de 52 % molar a alrededor de 62 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) una mezcla de fosfolípido y colesterol o un derivado de esta que 5 comprende de alrededor de 36 % molar a alrededor de 47 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) un conjugado de PEG- lípido que comprende de alrededor 1 % molar a alrededor de 2 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula. Esta modalidad de la partícula de lípido-ácido nucleico en la presente se refiere generalmente ío como la formulación "1 :57". En una modalidad particular, la formulación 1 :57 es un sistema de cuatro componentes que comprende alrededor de 1 ,4 % molar de conjugado de PEG-lípido (por ejemplo, PEG2000-C- DMA), alrededor de 57, 1 % molar de lípidos catiónicos de la Fórmula I o una sal de estos, alrededor de 7, 1 % molar de DPPC (o DSPC), y 15 alrededor de 34,3 % molar de colesterol (o derivado de este).
En otro aspecto de esta modalidad, la partícula de lípido (por ejemplo, LNP) comprende: (a) un ácido nucleico; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de este que comprende de alrededor de 56,5 % molar a 20 alrededor de 66,5 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) colesterol o un derivado de este que comprende de alrededor de 31 ,5 % molar a alrededor de 42,5 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) un conjugado de PEG-lípido que comprende de alrededor 1 % molar a alrededor de 2 % molar de los 25 lípidos totales presentes en la partícula. Esta modalidad de la partícula de I í pido-ácido nucleico en la presente se refiere generalmente como la formulación "1 :62". En una modalidad particular, la formulación 1 :62 es un sistema de tres componentes que no tiene fosfolípidos y comprende alrededor de 1 ,5 % molar de conjugado de PEG-lípido (por ejemplo, PEG2000-C-DMA), alrededor de 61 ,5 % molar de lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este, y alrededor de 36,9 % molar de colesterol (o derivado de este).
Las modalidades adicionales relacionadas con las formulaciones 1 :57 y 1 :62 están descritas en la Publicación de PCT n.° WO 09/127060, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
En otras modalidades, la presente invención proporciona partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) que comprenden: (a) uno o más ácidos nucleicos; (b) uno o más lípidos catiónicos de la Fórmula I o II o sales, por ejemplo, sales farmaceuticamente aceptable de estos que comprenden de alrededor de 2 % molar a alrededor de 50 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) uno o más lípidos no catiónicos que comprenden de alrededor 5 % molar a alrededor 90 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) uno o más lípidos conjugados que inhiben la agregación de partículas que comprenden de alrededor de 0,5 % molar a alrededor 20 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula.
En un aspecto de esta modalidad, la partícula de lípido (por ejemplo, LNP) comprende: (a) un ácido nucleico; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de este que comprende de alrededor de 30 % molar a alrededor de 50 % molar de los 1 í pidos totales presentes en la partícula; (c) una mezcla de fosfolípido y colesterol o un derivado de este que comprende de alrededor de 47 % molar a alrededor de 69 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) un conjugado de PEG-lípido que comprende de alrededor 1 % molar a alrededor de 3 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula. Esta modalidad de la partícula de lípido en la presente se refiere generalmente como la formulación "2:40". En una modalidad particular, la formulación 2:40 es un sistema de cuatro componentes que comprende alrededor de 2 % molar de conjugado de PEG-lípido (por ejemplo, PEG2000-C-DMA), alrededor de 40 % molar de lípidos catiónicos de la Fórmula I o una sal de estos, alrededor de 10 % molar de DPPC (o DSPC), y alrededor de 48 % molar de colesterol (o derivado de este).
En modalidades adicionales, la presente invención proporciona partículas de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, LNP) que comprenden: (a) uno o más ácidos nucleicos; (b) uno o más lípidos catiónicos de la Fórmula I o sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptable de estos que comprenden de alrededor de 50 % molar a alrededor de 65 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) uno o más lípidos no catiónicos que comprenden de alrededor 25 % molar a alrededor 45 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) uno o más lípidos conjugados que inhiben la agregación de partículas que comprenden de alrededor de 5 % molar a alrededor 10 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula.
En un aspecto de esta modalidad, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) un ácido nucleico; (b) un I í pido catiónico de la Fórmula I o una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de este que comprende de alrededor de 50 % molar a alrededor de 60 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) una mezcla de fosfolípido y colesterol o un derivado de este que comprende de alrededor de 35 % molar a alrededor de 45 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) un conjugado de PEG-lípido que comprende de alrededor 5 % molar a alrededor de 10 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula. Esta modalidad de la partícula de lípido-ácido nucleico en la presente se refiere generalmente como la formulación "7:54". En determinados casos, la mezcla de lípido no catiónico en la formulación 7:54 comprende: (i) un fosfolípido de alrededor de 5 % molar a alrededor de 10 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (ii) colesterol o un derivado de este de alrededor 25 % molar a alrededor 35 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula. En una modalidad particular, la formulación 7:54 es un sistema de cuatro componentes que comprende alrededor de 7 % molar de conjugado de PEG-lípido (por ejemplo, PEG750-C-DMA), alrededor de 54 % molar de lípidos catiónicos de la Fórmula I o una sal de estos, alrededor de 7 % molar de DPPC (o DSPC), y alrededor de 32 % molar de colesterol (o derivado de este).
En otro aspecto de esta modalidad, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) un ácido nucleico; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable de este que comprende de alrededor de 55 % molar a alrededor de 65 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; (c) colesterol o un derivado de esta que comprende de alrededor de 30 % molar a alrededor de 40 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula; y (d) un conjugado de PEG-lípido que comprende de alrededor 5 % molar a alrededor de 10 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula. Esta modalidad de la partícula de lípido-ácído nucleico en la presente se refiere generalmente como la formulación "7:58". En una modalidad particular, la formulación 7:58 es un sistema de tres componentes que no tiene fosfolípidos y comprende alrededor de 7 % molar de conjugado de PEG-lípido (por ejemplo, PEG750-C-DMA), alrededor de 58 % molar de lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este, y alrededor de 35 % molar de colesterol (o derivado de este).
Las modalidades adicionales relacionadas con las formulaciones 7:54 y 7:58 están descritas en la solicitud de patente estadounidense publicada n.° US201 1/0076335, presentada el 30 de junio de 2010, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una partícula de lípido tal como una partícula de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, LNP) y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para introducir uno o más agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos en una célula, el método comprende poner en contacto la célula con una partícula de lípido descrita en la presente (por ejemplo, LNP). En una modalidad, la celula está en un mamífero y el mamífero es un ser humano.
En aún otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para la administración in vivo de uno o más agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos, el método comprende administrar a un mamífero una partícula de lípido descrita en la presente (por ejemplo LNP). En determinadas modalidades, las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) se administran mediante uno de las siguientes vías de administración: oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intralesional, intratraqueal, subcutánea e intradermal. En modalidades particulares, las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) se administran de manera sistemática, por ejemplo, mediante vías de administración entérales o parenterales. En modalidades preferidas, el mamífero es un ser humano.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades o trastornos en un mamífero que lo necesita, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de lípido (por ejemplo, LNP) que comprende uno o más agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos. Los ejemplos no taxativos de enfermedades o trastornos incluyen infecciones virales, enfermedades o trastornos hepáticos, y cáncer. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades o trastornos hepáticos mediante la administración de ácido nucleico tal como un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) en partículas de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, LNP), solo o en combinación con un agente reductor de lípidos. Los ejemplos de enfermedades o trastornos de lípidos incluyen, de modo no taxativo, displidemia (por ejemplo, hiperlipidemia tales como niveles bajos de triglicéridos (hipertrigliceridemia) y/o niveles altos de colesterol (hipercolesterolemia)), aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad cardiovascular aterosclerótica (CVD), enfermedad de hígado graso (esteatosis hepática), metabolismo anormal de los lípidos, metabolismo anormal del colesterol, diabetes (incluyendo diabetes tipo 2), obesidad, enfermedad cardiovascular, y otros trastornos relacionados con el metabolismo anormal. Los ejemplos no taxativos de agentes reductores de lípidos incluyen estatinas, fibratos, ezetimibe, tiazolidinadionas, niacina, bloqueadores beta, nitroglicerina, antagonistas de calcio, y aceite de pescado.
En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para disminuir o reducir los niveles de colesterol en un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que lo necesita (por ejemplo, un mamífero con niveles elevados de colesterol en sangre), el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, una formulación de LNP) descrita en la presente que comprende uno o más RNA interferentes (por ejemplo siRNA) que se dirigen a uno o más genes asociados con enfermedades y trastornos metabólicos. En otra modalidad particular, la presente invención proporciona un metodo para disminuir o reducir los niveles de triglicéridos en un mamífero (por ejemplo, un ser humano) que lo necesita (por ejemplo, un mamífero con niveles elevados de triglicéridos en sangre), el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una partícula de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, una formulación de LNP) descrita en la presente que comprende uno o más RNA interferentes (por ejemplo siRNA) que se dirigen a uno o más genes asociados con enfermedades y trastornos metabólicos. Estos métodos se pueden llevar a cabo in vitro usando téenicas de cultivo tisular estándares o in vivo mediante la administración de RNA interferente (por ejemplo, siRNA) usando cualquier medio conocido en la técnica. En modalidades preferidas, el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) se administra a una célula hepática (por ejemplo, hepatocito) en un mamífero tal como un ser humano.
Las modalidades adicionales relacionadas con el tratamiento de una enfermedad o trastorno hepático usando partículas de lípidos están descritos en, por ejemplo, la solicitud PCT n.° PCT/CA2010/000120, presentada el 26 de enero de 2010, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0134189, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad para todo propósito.
En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar trastornos proliferativos de células, tales como el cáncer, mediante la administración de ácido nucleico tal como un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) en partículas de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, LNP), solo o en combinación con un fármaco quimioterapéutico. Los métodos se pueden llevar a cabo in vitro usando téenicas de cultivo tisular estándares o in vivo mediante la administración de RNA interferente (por ejemplo, siRNA) usando cualquier medio conocido en la técnica. En modalidades preferidas, el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) se administra a una célula cancerosa en un mamífero tal como un ser humano, solo o en combinación con un fármaco quimioterapéutico. Las partículas de lípidos-ácido nucleico y/o fármacos quimioterapéuticos también se pueden administran en conjunto con agentes radioterapéuticos, inmunoterapéuticos y/o hormonales convencionales.
Las modalidades adicionales relacionadas para tratar un trastorno proliferativo de células usando una partícula de lípido están descritas en por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 09/082817, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0149403, y la publicación PCT n.° WO 09/129319, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad para todo propósito.
En modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para prevenir o tratar una infección viral tal como una infección de arenavirus (por ejemplo, el virus de Lassa) o filovirus (por ejemplo, virus del Ébola, virus de arburgo, etc.) que causa fiebre hemorrágica o una infección de hepatitis (por ejemplo, virus de la Hepatitis C) que causa hepatitis crónica o grave mediante la administración de un ácido nucleico tal como un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) en partículas de I í pidos-ácido nucleico (por ejemplo, LNP), solo o en combinación con la administración de agentes convencionales usados para tratar o mejorar la afección viral o cualquiera de los síntomas asociados con estos. Los métodos se pueden llevar a cabo in vitro usando téenicas de cultivo tisular estándares o in vivo mediante la administración de RNA interferente usando cualquier medio conocido en la técnica. En determinadas modalidades, el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) se administra a células, tejidos u órganos de un mamífero tal como un ser humano que esté infectado y/o que sea susceptible de estar infectado con el virus de fiebre hemorrágica, tal como, por ejemplo, células del sistema reticuloendotelial (por ejemplo, monocitos, macrófagos, etc.). En otras modalidades determinadas, el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) se administra a células, tejidos u órganos de un mamífero tal como un ser humano que esté infectado y/o que sea susceptible de estar infectado con el virus de la hepatitis, tal como, por ejemplo, células del hígado (por ejemplo, hepatocitos).
Las modalidades adicionales relacionadas con la prevención o tratamiento de una infección viral que usa una partícula de lípido se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0218122, publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0135370, y la solicitud PCT n.° PCT/CA2010/000444, con el título “Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression” ["Composiciones y métodos para silenciar la expresión del virus de la hepatitis C"], presentada el 19 de marzo de 2010, cuyas descripciones se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
Las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) que comprenden uno o más lípidos catiónicos de la Fórmula I o sales, por ejemplo, sales farmaceuticamente aceptables de estas son particularmente ventajosas y adecuadas para usar en la administración de ácidos nucleicos tales como RNA interferente a un sujeto (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano) dado que son estables en la circulación, de un tamaño requerido para el comportamiento farmacodinámico lo que resulta en el ingreso a sitios extravasculares y son capaces de alcanzar poblaciones de células objetivo.
Los objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la téenica a partir de la siguiente descripción detallada y de las figuras.
Descripción detallada de la invención I. Introducción La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de lípidos catiónicos (amino) novedosos que proporcionan ventajas cuando se usan en partículas de lípidos para la administración in vivo de un agente terapéutico o activo tal como un ácido nucleico en una célula de un mamífero. En particular, la presente invención proporciona composiciones de partículas de lípidos-ácido nucleico que comprenden uno o más lípidos catiónicos novedosos descritos en la presente que proporcionan actividad aumentada del ácido nucleico (por ejemplo, RNA interferente) y tolerabilidad mejorada de las composiciones in vivo, lo que resulta en un aumento significativo en el índice terapéutico en comparación con composiciones de partículas de lípidos-ácido nucleico, lo que resulta en un aumento significativo en el índice terapéutico en comparación con las composiciones de partículas de lípidos-ácido nucleico previamente descritas.
En modalidades particulares, la presente invención proporciona lípidos catiónicos novedosos que permiten la formulación de composiciones mejoradas para la administración in vitro e in vivo del RNA interferente tal como siRNA. En la presente se muestra que estas composiciones de partículas de lípidos mejoradas son efectivas en la regulación por disminución (por ejemplo, silenciamiento) los niveles de proteína y/o niveles de mRNA de genes objetivo. Además, se muestra en la presente que la actividad de estas composiciones de partículas de lípidos mejoradas depende de la presencia de lípidos catiónicos novedosos de la invención.
Las partículas de lípidos y composiciones de la presente invención se pueden usar para una variedad de propósitos, incluyendo la administración de agentes terapéuticos encapsulados o asociados (por ejemplo, complejos) tales como ácidos nucleicos a células, tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades o trastornos en un sujeto que lo necesita poniendo en contacto al sujeto con una partícula de lípido que encapsula o está asociada con un agente terapéutico adecuado, donde la partícula de lípido comprende uno o más de los lípidos catiónicos novedosos descritos en la presente.
Tal como se describe en la presente, las partículas de lípidos de la presente invención son particularmente útiles para la administración de ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, moléculas de RNA interferente tal como siRNA. Por lo tanto, las partículas de lípidos y composiciones de la presente invención se pueden usar para disminuir la expresión de genes objetivo y proteínas tanto in vitro como in vivo poniendo en contacto las células con una partícula de lípido que comprende uno o más lípidos catiónicos novedosos descritos en la presente, donde la partícula de lípido encapsula o está asociada con un ácido nucleico que reduce la expresión génica objetivo (por ejemplo, siRNA). De manera alternativa, las partículas de lípidos y composiciones de la presente invención se pueden usar para aumentar la expresión de una proteína deseada tanto in vitro como in vivo poniendo en contacto las células con una partícula de lípido que comprende uno o más lípidos catiónicos novedosos descritos en la presente, donde la partícula de lípido encapsula o está asociada con un ácido nucleico que aumenta la expresión de la proteína deseada (por ejemplo, un plásmido que codifica la proteína deseada).
Varias modalidades de ejemplo de los lípidos catiónicos de la presente invención, partículas de lípidos y composiciones que la comprenden, y su uso para administrar agentes terapéuticos o activos tales como ácidos nucleicos para modular la expresión de proteínas y genes, se describen con más detalle a continuación.
II. Definiciones Tal como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a estos a menos que se especifique lo contrario.
El término "alrededor de" cuando se usa en conexión con la cantidad de un componente en una partícula de lípido o formulación de la presente invención comprende valores que son mayores o menores que 5 % de la cantidad establecida del componente (por ejemplo, alrededor de 10 % comprende valores de 9,5 % a 10,5 %). El término "alrededor de" por lo tanto también comprende valores que son mayores o menores que 1 %, 2 %, 3 %, o 4 % de la cantidad establecida del componente.
El término "RNA interferente" o "RNAi" o "secuencia RNA interferente" tal como se usa en la presente incluye RNA de cadena simple (por ejemplo, miRNA maduro, oligonucleótidos de RNAi de cadena simple, oligonucleótidos de iADN de cadena simple) o RNA de cadena doble (es decir, RNA dúplex tal como siRNA, dsRNA de sustrato de Dicer, shRNA, aiRNA, o pre-miRNA) que es capaz de reducir o inhibir la expresión de una secuencia o gene objetivo (por ejemplo, mediante la mediación de la degradación o inhibición de la traducción de mRNA que son complementarios con la secuencia de RNA interferente) cuando el RNA interferente está en la misma célula que la secuencia o gene objetivo. Por lo tanto, el RNA interferente se refiere a RNA de cadena simple que es complementario con una secuencia de mRNA objetivo o con el RNA de cadena doble formada por dos cadenas complementarias o por una cadena simple complementaria entre sí. El RNA interferente puede tener identidad completa o sustancial con la secuencia o gene objetivo, o puede comprender una región de mal apareamiento (es decir, un motivo de mal apareamiento). La secuencia del RNA interferente puede corresponder al gene objetivo de longitud completa, o a una subsecuencia de esta. Preferentemente, las moléculas de RNA interferentes se sintetizan químicamente.
RNA interferente incluye “RNA interferente pequeño” o “siRNA”, por ejemplo, RNA interferente de alrededor de 15-60, 15-50, o 15-40 (dúplex) nucleótidos de longitud, más típicamente alrededor de 15-30, 15-25, o 19-25 (dúplex) nucleótidos de longitud, y tiene preferentemente de alrededor de 20-24, 21 -22, o 21 -23 (dúplex) nucleótidos de longitud (por ejemplo, cada secuencia complementaria del siRNA de cadena doble tiene de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, o 19-25 nucleótidos de longitud, preferentemente de alrededor de 20-24, 21 -22, o 21 -23 nucleótidos de longitud, y el siRNA de cadena doble tiene de alrededor de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, o 19-25 pares de base de longitud, preferentemente de alrededor de 18-22, 19-20, o 19-21 pares de base de longitud). Los dúplex de siRNA pueden comprender excedentes de 3’ de alrededor 1 a alrededor 4 nucleótidos o alrededor 2 a alrededor 3 nucleótidos y extremos de fosfato 5'. Los ejemplos de siRNA incluyen, de modo no taxativo, una molécula de polinucleótido de cadena doble ensamblada de dos moléculas de cadenas separadas, donde una cadena es la cadena de sentido y la otra es la cadena antisentido complementaria; una molécula de polinucleótido de cadena doble ensamblada de una molécula de cadena única, donde las regiones antisentido y sentido están unidos mediante un enlazador que no está basado en ácido nucleico o que está basado en ácido nucleico; una molécula de polinucleótido de cadena doble con una estructura secundaria de horquilla que tiene regiones antisentido y sentido complementaria entre sí; y una molécula de polinucleótido circular de cadena simple con dos o más estructuras bucle y un tallo que tiene regiones antisentido y sentido complementarias entre sí, donde el polinucleótido circular se puede procesar in vivo o in vitro para generar una molécula siRNA activa de cadena doble.
Preferentemente, las siRNA se sintetizan químicamente. siRNA también se pueden generar mediante escisión de dsRNA más largos (por ejemplo, dsRNA mayor que alrededor de 25 nucleótidos de longitud) con el E. coli RNasa III o Dicer. Estas enzimas procesan el dsRNA en siRNA biológicamente activas (ver, por ejemplo, Yang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 99:9942-9947 (2002); Calegari et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 99: 14236 (2002); Byrom et al. , Ambion TechNotes, 10(1 ) :4-6 (2003); Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 31 :981 -987 (2003); Knight et al., Science, 293:2269-2271 (2001 ); y Robertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)). Preferentemente, dsRNA tienen al menos 50 nucleótidos a alrededor de 100, 200, 300, 400, o 500 nucleótidos de longitud. Un dsRNA puede tener una longitud de hasta 1000, 1500, 2000, 5000 nucleótidos de longitud, o más. El dsRNA puede codificar una transcripción de gene completa o una trascripción de gene parcial. En determinados casos, siRNA se puede codificar por un plásmido (por ejemplo, transcrito como secuencias que se pliegan automáticamente en dúplexes con bucles de horquilla).
Tal como se usa en la presente, el término "motivo de mal apareamiento" o "región de mal apareamiento" se refiere a una parte de una secuencia de RNA interferente (por ejemplo, siRNA) que no tiene 100 % de complementariedad con su secuencia objetivo. Un RNA interferente puede tener al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más regiones de mal apareamiento. Las regiones de mal apareamiento pueden ser contiguas o pueden ser separadas por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o más nucleótidos. Los motivos o regiones de mal apareamiento pueden comprender un nucleótido único o pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o más nucleótidos.
La frase "expresión que inhibe un gene objetivo" se refiere a la capacidad de un RNA interferente (por ejemplo, siRNA), u otro agente terapéutico para silenciar, reducir o inhibir la expresión de un gene objetivo. Para examinar la extensión de un silenciamiento génico, una muestra de prueba (por ejemplo, una célula de muestra en un cultivo que expresa el gene objetivo) o un mamífero de prueba (por ejemplo, un ser humano o un modelo de animal tal como un roedor (por ejemplo, ratón) o un modelo primate no humano (por ejemplo, un mono)) se pone en contacto con un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) que silencia, reduce o inhibe la expresión del gene objetivo. La expresión del gene objetivo en la muestra de la prueba o en el animal de prueba se compara con la expresión del gene objetivo en una muestra de control (por ejemplo, una muestra de células en un cultivo que expresan el gene objetivo) o un mamífero de control (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano o un modelo de animal tal como un roedor (por ejemplo, ratón) o un modelo de primate no humano (por ejemplo, mono)) que no está en contacto con el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) o que no se le administró este. Se le puede asignar un valor de 100 % a la expresión del gene objetivo en una muestra de control o un mamífero de control. En modalidades particulares, el silenciamiento, inhibición o reducción de la expresión de un gene objetivo se logra cuando el nivel de la expresión genica objetivo en la muestra de prueba o el mamífero de prueba en relación con el nivel de expresión génica en la muestra de control o el mamífero de control es de alrededor de 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, o 0 %. En otras palabras, el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) silencia, reduce o inhibe la expresión de un gene objetivo mediante al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100 % en una muestra de prueba o mamífero de prueba en relación con el nivel de expresión génica objetivo en una muestra de control o mamífero de control que no está en contacto con el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) o que no se le administró este. Los ensayos adecuados para determinar el nivel de expresión génica objetivo incluyen, de modo no taxativo, la examinación de los niveles de mRNA y proteína usando téenicas conocidas por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, transferencia dot, transferencia Northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, así como también ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la técnica.
Una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente activo o agente terapéutico tal como un RNA interferentes es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, por ejemplo, una inhibición de expresión de una secuencia objetivo en comparación con el nivel de expresión normal detectado en la ausencia de un RNA interferente. La inhibición de la expresión de un gene objetivo o secuencia objetivo se logra cuando el valor obtenido con un RNA interferente en relación con el control es de alrededor de 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 0 %. Los ensayos adecuados para medir la expresión de un gene objetivo o secuencia objetivo incluyen, por ejemplo, la examinación de los niveles de RNA y proteína usando téenicas conocidas en la técnica, tal como, transferencia dot, transferencia Northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, así como también ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la técnica.
Por "disminución", "disminuir", "reducción", "reducir" una respuesta inmunitaria mediante un RNA interferente se pretende decir que un aumento detectable de una respuesta inmunitaria a un RNA interferente (por ejemplo, un RNA interferente modificado) u otro agente terapéutico. La cantidad de disminución de una respuesta inmunitaria mediante un RNA interferente modificado se puede determinar con relación al nivel de una respuesta inmunitaria en presencia de un RNA interferente no modificado. Una disminución detectable puede ser de alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % O menos que la respuesta inmunitaria detectada en presencia de un RNA interferente no modificado. Una disminución en la respuesta inmunitaria de la RNA interferente se mide típicamente mediante la disminución en producción de citocinas (por ejemplo, IFNy, IFNa, TNFa, IL-6, o IL-12) mediante una célula respondedora in vitro o una disminución en la producción de citocinas en el suero de un sujeto mamífero luego de la administración del RNA interferente.
Tal como se usa en la presente, el término "célula respondedora" se refiere a una célula de mamífero que produce una respuesta inmunitaria detectable cuando se pone en contacto con un RNA interferente inmunoestimulatorio tal como un siRNA no modificado. Las células respondedoras incluyen, por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) esplenocitos y similares. Las respuestas inmunitarias detectables incluyen, por ejemplo, producción de citocinas o factores de crecimiento tal como TNF-a, IFN-a, IFN-b, IFN-g, IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TGF y combinaciones de estos. Las respuestas inmunitarias detectables también incluyen, por ejemplo, la inducción de la proteína inducida por interferón con repeticiones de tetratricopéptido 1 ( IFIT1 ) mRNA.
La "identidad sustancial" se refiere a una secuencia que se híbrida a una secuencia de referencia en condiciones rigurosas, o a una secuencia que tiene un porcentaje de identidad específico en una región específica de una secuencia de referencia.
La expresión "condiciones de hibridación rigurosa" se refiere a condiciones en las que un ácido nucleico se híbrida en su secuencia objetivo, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencias y diferirán en distintas circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas superiores. Una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean alrededor de 5-10 °C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH y fuerza iónica definidos. La Tm es la temperatura (según la concentración nucleica, de pH y fuerza iónica definidos) en la que el 50 % de las sondas complementarias al objetivo se hibridan a la secuencia objetivo en el equilibrio (ya que las secuencias objetivo están presentes en exceso, a Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones rigurosas pueden lograrse también con la adición de agentes desestabilizadores tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces hibridación de fondo, preferentemente 10 veces hibridación de fondo.
Las condiciones de hibridación rigurosas de ejemplo pueden ser como siguen: formamida al 50 %, 5x SSC, y SDS al 1 %, incubación a 42 °C, o, 5x SSC, SDS al 1 %, incubación a 65 °C, con lavado en 0,2x SSC, y SDS al 0, 1 % a 65 °C. Para la PCR, una temperatura de alrededor de 36 °C es típica para la amplificación de rigurosidad baja, aunque las temperaturas de alineamiento pueden variar entre 32 °C y 48 °C dependiendo de la longitud del cebador. Para la amplificación de PCR de alta rigurosidad, es típica una temperatura de alrededor de 62 °C, aunque las temperaturas de alineamiento de alta rigurosidad pueden 5 variar entre alrededor de 50 °C a alrededor de 65 °C, dependiendo de la longitud del cebador y la especificidad. Las condiciones típicas de ciclos tanto para amplificaciones severass y bajas incluyen una fase de desnaturalización de 90 °C-95 °C durante 30 seg.-2 min., una fase de alineamiento que dura 30 seg.-2 min., y una fase de extensión de ío alrededor de 72 °C durante 1 -2 min. Los protocolos y guías para las reacciones de amplificación severas y baja están proporcionadas, por ejemplo, en Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. (1990).
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre ellos en condiciones 15 severas aún son sustancialmente identicos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codón permitida por el código genético. En estos casos, los ácidos nucleicos se hibridan típicamente en condiciones de 20 hibridación de rigurosidad moderada. Las "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" incluyen una hibridación en un amortiguador de formamida al 40 %, NaCI 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, y un lavado en 1X SSC a 45 °C. Una hibridación positiva es al menos dos veces hibridación de fondo. Los expertos en la téenica rápidamente reconocerán que pueden utilizarse condiciones alternativas de hibridación y lavado para proporcionar condiciones de rigurosidad similar. Las directrices adicionales para determinar los parámetros de hibridación se proporcionan en varias referencias, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds.
Los términos "sustancialmente idénticos" o "identidad sustancial", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son los mismos (es decir, al menos alrededor de 60 %, preferentemente al menos alrededor de 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de identidad en una región específica), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada como se midió usando uno de los algoritmos de comparación de las secuencias siguientes o mediante el alineamiento manual e inspección visual. Esta definición, cuando el contexto lo indica, también se refiere de manera análoga al complemento de una secuencia. Preferentemente, la identidad sustancial existe en una región que tiene al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 nucleótidos de longitud.
Para comparar las secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos.
Pueden usarse los parámetros de programa predeterminados o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias luego calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa.
Una "ventana de comparación" tal como se usa en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquier cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en alrededor de 5 a alrededor de 60, usualmente alrededor de 10 a alrededor de 45, más usualmente alrededor de 15 a alrededor de 30 en las cuales una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia con la misma cantidad de posiciones contiguas después de que las dos secuencias fueron alineadas de manera óptima. Los métodos para alinear las secuencias para su comparación son conocidos en la téenica. El alineamiento de secuencias óptimo para su comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981 ), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (1995 suplemento)).
Los ejemplos no limitantes de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et ál, Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), respectivamente. Se usan BLAST y BLAST 2.0 con los parámetros descritos en la presente para determinar el porcentaje de identidad de secuencia para los ácidos nucleicos de la invención. El software para la realización del análisis con BLAST se encuentra públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información Bioteenológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Otro ejemplo es un algoritmo de alineación global para determinar el porcentaje de identidad de secuencia tal como el algoritmo Needleman-Wunsch para alinear secuencias de nucleótidos (por ejemplo, RNA) o proteínas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)) que proporciona un indicio de la probabilidad por la cual ocurriría una equivalencia entre dos secuencias de nucleótidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor que alrededor de 0,2, más preferentemente menor que alrededor de 0,01 y más preferentemente menor que alrededor de 0,001.
El termino "ácido nucleico" tal como se usa en la presente se refiere a un polímero que contiene al menos dos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en ambas formas de cadena simple o doble e incluye DNA y RNA. El DNA puede estar en forma de, por ejemplo, moléculas antisentido, DNA plásmido, DNA precondensado, un producto de PCR, vectores (P1 , PAC, BAC, YAC, cromosomas artificiales), casetes de expresión, secuencias quiméricas, DNA cromosomal, o derivados y combinaciones de estos grupos. El RNA puede tener forma de RNA interferente pequeño (siRNA), dsRNA de sustrato de Dicer , RNA horquilla pequeños (shRNA), RNA interferente asimétrico (aiRNA), micro RNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, tRNA, RNA viral (vRNA), RNA multivalente (MV RNA) y combinaciones de estos. Los ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótido conocidos o enlaces o residuos estructurales modificados, que son sintéticos, de origen natural, y de origen no natural, y que tienen propiedades de unión similares como el ácido nucleico de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen de modo no taxativo, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos de 2’-O-metilo y ácidos nucleicos-péptido (PNA, por sus siglas en inglés). A menos que se restrinja de manera específica, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que poseen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. A menos que se indique lo contrario, una secuencia ácidos nucleicos particular también abarca de manera implícita las variantes modificadas de manera conservadora de esta (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias así como también la secuencia indicada de manera explícita. En específico, las sustituciones de codones redundantes pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxinosina (Batzer et al. , Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991 ); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). Los "nucleótidos" contienen una azúcar desoxirribosa (DNA) o ribosa (RNA), una base y un grupo fosfato. Los nucleótidos se unen mediante los grupos fosfato. Las "bases" incluyen purinas y pirimidinas, que incluyen además, compuestos naturales, adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina, y análogos naturales y derivados sintéticos de purinas y pirimidinas, que incluyen, de modo no taxativo, modificaciones que colocan nuevos grupos reactivos tales como, de modo no taxativo, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y alquilhaluros.
El término "gene” se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, DNA o RNA) que comprende secuencias de codificación de longitud completa o de longitud parcial necesarias para la producción de un polipéptido o un polipéptido precursor.
El "producto génico" tal como se usa en la presente, se refiere a un producto de un gene tal como una transcripción de RNA o un polipéptido.
El termino "lípido" refiere a un grupo de compuestos orgánicos que incluyen, de modo no taxativo, ésteres de ácidos grasos y son caracterizados porque son insolubles en agua, pero solubles en muchos solventes orgánicos. Se dividen usualmente en al menos tres clases: (1 ) "I í pidos simples" que incluyen grasas y aceites así como también ceras; (2) "lípidos compuestos", que incluyen fosfolípidos y glicolípidos; y (3) "lípidos derivados" tales como esteroides.
El término "partícula de lípido" incluye una formulación de lípidos que se puede usar para administrar un agente activo o un agente terapéutico, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, un RNA interferente), a un sitio objetivo de interés (por ejemplo, células, tejidos, órganos y similares). En modalidades preferidas, la partícula de lípido de la invención es una nanopartícula de lípido, que se forma típicamente a partir de un lípido catiónico, un lípido no catiónico y opcionalmente, un lípido conjugado que evita la agregación de la partícula. En otras modalidades preferidas, que se pueden referir como "partículas de lípidos-ácido nucleico", el agente activo o el agente terapéutico, tal como un ácido nucleico, se puede encapsular en la parte del lípido de la partícula, protegiéndolo de esa manera de la degradación enzimática.
Tal como se usa en la presente, el término "LNP" se refiere a una nanopartícula de lípido. Una LNP representa una partícula elaborada a partir de lípidos, por ejemplo, un lípido catiónico, un lípido no catiónico y opcionalmente, un lípido conjugado que evita la agregación de partículas), donde el ácido nucleico (por ejemplo, un RNA interferente) está completamente encapsulado dentro del lípido. En determinados casos, las LNP son extremadamente útiles para las aplicaciones sistemicas, porque pueden presentar una vida útil de circulación extendida luego de la inyección intravenosa (i.v.), se pueden acumular en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración) y pueden mediar el silenciamiento de la expresión del gene objetivo en estos sitios distales. El ácido nucleico puede formar complejos con un agente condensante y se puede encapsular dentro de una LNP como se estableció en la publicación PCT n.° WO 00/03683, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
Las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) típicamente tienen un diámetro promedio de alrededor de 30 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor 40 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor 50 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor 60 nm a alrededor de 130 nm, de alrededor 70 nm a alrededor de 110 nm, de alrededor 70 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor 80 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor 90 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor 70 a alrededor de 90 nm, de alrededor 80 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor 70 nm a alrededor de 80 nm, o alrededor de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, o 150 nm, y prácticamente no son tóxicas. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de lípidos de la presente invención, son resistentes a la degradación en soluciones acuosas para degradarse con una nucleasa. Las nanopartículas y sus metodos de preparación se describen en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0142025 y 2007/0042031 , cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Tal como se usa en la presente, "lípido encapsulado" puede referirse a una partícula de lípido que proporciona un agente activo o un agente terapéutico, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, un RNA interferente) con encapsulación completa, encapsulación parcial, o ambas). En una modalidad preferida, el ácido nucleico está completamente encapsulado en la partícula de lípido (por ejemplo, para formar un LNP).
El término "conjugado de lípido" se refiere a un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas de lípidos. Dichos conjugados de lípidos incluyen, de modo no taxativo, conjugados de PEG-lípido tales como, por ejemplo, PEG acoplado a dialquiloxipropilos (por ejemplo, conjugados PEG-DAA), PEG acoplado a diacilgliceroles (por ejemplo,, conjugados PEG-DAG), PEG acoplado a colesterol, PEG acoplado a fosfatidiletanolaminas, y PEG conjugado con ceramidas (ver, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,885,613), lípidos PEG catiónicos, conjugados de polioxazolina (POZ)-lípido, oligómeros de poliamida (por ejemplo, conjugados de ATTA-lípido), y mezclas de estos. Se describen ejemplos adicionales de conjugados de POZ-lípido en la Publicación PCT n.° WO 2010/006282. PEG o POZ se pueden conjugar directamente al lípido o se pueden unir al lípido mediante un resto enlazador. Cualquier resto enlazador adecuado para acoplar el PEG o el POZ a un lípido se puede usar, incluyendo por ejemplo, restos enlazadores que no contienen ester y restos enlazadores que contienen éster. En determinadas modalidades preferidas, se usan restos enlazadores que no contienen éster, tales como amidas o carbamatos. La descripción cada una de las patentes anteriores se incorporan a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
El término "lípido antipático" se refiere en parte a cualquier material adecuado donde la parte del material lípido se orienta en una fase hidrofóbica, mientras que la parte hidrofílica se orienta hacia una fase acuosa. Las características hidrofílicas derivan de la presencias de grupos cargados o polares tales como carbohidratos, fosfatos, carboxílicos, sulfatos, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxilo y otros grupos similares. La hidrofobicidad se puede conferir mediante la inclusión de grupos apolares que incluyen, de modo no taxativo, grupos hidrocarburos alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y tales grupos sustituidos por uno o más grupos aromáticos, cicloalifáticos o heterocíclicos. Los ejemplos de compuestos anfipáticos incluyen, de modo no taxativo, fosfolípidos, aminolípidos y esfingolípidos.
Los ejemplos representativos de fosfolípidos incluyen, de modo no taxativo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, ácido fosfatidíco, palmitoiloleoil fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, y dilinoleoilfosfatidilcolina. Otros compuestos que no tienen fósforo, tal como esfingolípido, familias de glicoesfingolípidos, diacilgliceroles, y b- aciloxiácidos, también se encuentran dentro del grupo designado como lípidos antipáticos. De manera adicional, los lípidos antipáticos descritos anteriormente se pueden mezclar con otros lípidos incluyendo triglicéridos y esteróles.
El término "lípido neutro" se refiere a cualquiera de una cantidad de especies de lípidos que existen ya sea en forma zwitteriónica neutral o no cargada a un pH seleccionado. A un pH fisiológico, dichos lípidos incluyen, por ejemplo, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrósidos, y diacilgliceroles.
El término "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido antipático así como también cualquier otro lípido neutral o lípido aniónico.
El término "lípido aniónico" se refiere a cualquiera lípido que está cargado negativamente a pH fisiológico. Estos lípidos incluyen, de modo no taxativo, fosfatidilgliceroles, cardiolipinas, diacilfosfatidilserinas, ácidos diacilfosfatídicos, N-dodecanoil fosfatidiletanolaminas, N-succinil fosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lisilfosfatidilgliceroles, palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), y otros grupos modificadores aniónicos unidos a lípidos neutrales.
El término "lípido hidrofóbico" se refiere a compuestos que tienen grupos apolares que incluyen, de modo no taxativo, grupos hidrocarburos alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y tales grupos opcionalmente sustituidos por uno o más grupos aromáticos, cicloalifáticos o heterociclicos. Ejemplos adecuados incluyen, de modo no taxativo, diacilglicerol, dialquilglicerol, N-N-dialquilamino, 1 ,2-diaciloxi-3-aminopropano y 1 ,2-dialquil-3-aminopropano.
El término "fusogénico" se refiere a la capacidad de una partícula lipídica, tal como una LNP, de fusionarse con las membranas de una célula. Las membranas pueden ser la membrana o membranas de plasma que rodean los organelos, por ejemplo, endosoma, núcleo, etc.
Tal como se usa en la presente, el término "solución acuosa" se refiere a una composición que comprende agua en su totalidad o en parte.
Tal como se usa en la presente, el término "solución de lípido orgánico" se refiere a una composición que comprende, en su totalidad o en parte, un solvente orgánico que tiene un lípido.
"Sitio distal", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un sitio separado físicamente, que no está limitado a un lecho capilar adyacente, pero incluye sitios distribuidos ampliamente a través de un organismo.
"Estable en suero" en relación a las partículas de lípidos-ácido nucleico, tal como LNP, significa que la partícula no está degradada de forma significativa luego de la exposición a un ensayo de nucleasa o suero que degradaría de forma significativa el RNA o el DNA libre. Ensayos adecuados incluyen, por ejemplo, un ensayo de suero estándar, un ensayo de ADNsa, o un ensayo de RNAsa.
"Administración sistémica", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la administración de partículas de lípidos que llevan a una amplia biodistribución de un agente activo tal como un RNA de interferencia (por ejemplo, siRNA) dentro de un organismo. Algunas teenicas de administración pueden llevar a una administración sistémica de determinados agentes, pero no de otros. La administración sistémica significa que se expone una cantidad útil, preferentemente terapéutica de un agente a la mayoría de las partes del cuerpo. Para obtener una biodistribución amplia generalmente se requiere una vida sanguínea de modo que el agente no sea degradado o eliminado rápidamente (por ejemplo, por los órganos por donde pasa primero (hígado, pulmón, etc.) o por unión celular no específica, rápida) antes de alcanzar un sitio de enfermedad distal al sitio de administración. La administración sistémica de partículas de lípidos se puede realizar por cualquier medio conocido en la técnica que incluye, por ejemplo, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal. En una modalidad preferida, la administración sistémica de partículas de lípidos es por administración intravenosa.
La "administración local", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la administración de un agente activo tal como un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) directamente a un sitio objetivo dentro de un organismo. Por ejemplo, se puede administrar un agente de forma local mediante inyección directa en un sitio de enfermedad tal como un tumor u otro sitio objetivo tal como un sitio de inflamación o un órgano objetivo tal como el hígado, corazón, páncreas, riñón y similares.
El término "mamífero" se refiere a cualquier especie mamífera tal como un ser humano, ratón, rata, perro, gato, hámster, conejillo de indias, conejo, ganado, y similares.
El término "cáncer" se refiere a cualquier miembro de una clase de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolados de células anormales. El término incluye todos los tipos de cáncer conocidos y afecciones neoplásicas, ya sean caracterizadas como malignas, benignas, tejido blando, o sólido, y cánceres de todas las etapas y grados incluyendo cánceres pre y postmetastásicos. Ejemplos de diferentes tipos de cáncer incluyen, de modo no taxativo, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer anal, cáncer del ducto biliar, cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago (gástrico), cáncer esofágico; cáncer de vesícula biliar, cáncer pancreático, cáncer de apéndice, cáncer de mama, cáncer de ovario; cáncer de cérvix, cáncer de próstata, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células renales), cáncer del sistema nervioso central, glioblastoma, cáncer de piel, linfomas, coriocarcinomas, cáncer de cabeza y cuello, sarcomas osteogénicos, y cáncer de sangre. Ejemplos no limitativos de tipos específicos de cáncer de hígado incluyen carcinoma hepatocelular (HCC, por sus siglas en inglés), cáncer de hígado secundario (por ejemplo, causado por metástasis de algún otro tipo de célula cancerosa no hepática), y hepatoblastoma. Tal como se usa en la presente, un "tumor" comprende una o más células cancerosas.
El término "RNA Multivalente", abreviado como "MV RNA", se refiere a un complejo de polinucleótidos compuesto de al menos tres polinucleótidos, donde cada polinucleótido está hibridado, junto con toda o parte de su longitud, a al menos dos de los otros polinucleótidos del complejo y donde uno o más de los polinucleótidos incluye opcionalmente una región objetivo que es capaz de hibridarse a una secuencia de ácidos nucleicos objetivo. Cada polinucleótido puede tener, por ejemplo, entre 10 y 60 nucleótidos de longitud. La o las regiones objetivos dentro de un polinucleótido pueden ser capaces de hibridarse a una secuencia de ácido nucleico objetivo que es la misma o diferente de las secuencias de ácido nucleico objetivos a la que la o las regiones objetivos de los otros polinucleótidos del complejo hibridado. Un RNA multivalente se puede sintetizar in vitro (por ejemplo, por síntesis química) o, por ejemplo, se puede procesar a partir de un precursor dentro de una célula viva. Por ejemplo, un precursor puede ser un polinucleótido lineal que incluye cada uno de los polinucleótidos del RNA multivalente, que se introduce en una célula viviente y se escinde allí para formar un RNA multivalente. El término "ARN multivalente" incluye tal precursor que se pretende escindir dentro de una célula viviente. El término "ARN multivalente" también abarca, a modo de ejemplo, los complejos de polinucleótidos tripartita descritos, de forma específica o genérica, en la solicitud internacional de patente publicada que tiene el número de solicitud internacional PCT/US201 0/036962.
III. Lípidos catiónicos novedosos La presente invención proporciona, ínter alia, lípidos catiónicos (amino) novedosos que se pueden utilizar de forma ventajosa en las partículas de lípidos descritas en la presente para la administración in vitro y/o in vivo de agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos a las células. Los lípidos catiónicos novedosos de la invención tienen las estructuras establecidas en la Fórmula I en la presente, e incluyen los enantiómeros (R) y/o (S) de esta.
En algunas modalidades, un lípido de la presente invención comprende una mezcla racémica. En otras modalidades, un lípido de la presente invención comprende una mezcla de uno o más diastereómeros. En determinadas modalidades, un lípido de la presente invención está enriquecido en un enantiómero, de modo que el lípido comprende al menos alrededor de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de exceso enantiomérico. En otras modalidades determinadas, un lípido de la presente invención está enriquecido en un diastereómero, de modo que el lípido comprende al menos alrededor de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de exceso enantiomérico. En determinadas modalidades adicionales, un lípido de la presente invención es quiralmente puro (por ejemplo, comprende un único isómero óptico). En modalidades adicionales, un lípido de la presente invención está enriquecido en un isómero óptico (por ejemplo, un isómero ópticamente activo), de modo que el lípido comprende al menos alrededor de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de exceso isomérico. La presente invención proporciona la síntesis de los lípidos catiónicos de la Fórmula I como una mezcla racémica o en forma ópticamente pura.
Los términos "lípido catiónico" y "aminolípido" se utilizan de manera intercambiable en la presente para incluir aquellos lípidos y sales, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de estas que tienen uno, dos, tres o más ácidos grasos o cadenas de alquilos grasos y un grupo principal amino pH valoradle (por ejemplo, un grupo principal alquilamino o dialquilamino). El lípido catiónico está típicamente protonado (es decir, cargado positivamente) a un pH menor que el pKa del lípido catiónico y es sustancialmente neutral a un pH superior al pKa. Los lípidos catiónicos de la invención también se pueden llamar lípidos catiónicos valorables.
El término "sales" incluye cualquier complejo catiónico y aniónico, tal como el complejo formado entre un lípido catiónico descrito en la presente y uno o más aniones. Ejemplos no taxativos de aniones incluyen aniones inorgánicos y orgánicos, por ejemplo, hidruro, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, oxalato (por ejemplo, hemioxalato), fosfato, fosfonato, fosfato de hidrógeno, fosfato de dihidrógeno, óxido, carbonato, bicarbonato, nitrato, nitrito, nitruro, bisulfito, sulfuro, sulfito, bisulfato, sulfato, tiosulfato, sulfato de hidrógeno, borato, formato, acetato, benzoato, citrato, tratrato, lactato, acrilato, poliacrilato, fumarato, maleato, itaconato, glicolato, gluconato, malato, mandelato, tiglato, ascorbato, salicilato, polimetacrilato, perclorato, clorato, clorito, hipoclorito, bromato, hipobromito, yodato, un alquilsulfonato, un arilsulfonato, arsenato, arsenita, cromato, dicromato, cianuro, cianato, tiocianato, hidróxido, peróxido, permanganato, y mezclas de estos. En modalidades particulares, las sales de los lípidos catiónicos descritos en la presente son sales cristalinas. En modalidades particulares, las "sales" son "sales farmacéuticamente aceptables".
El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto, cuyas sales derivan de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos conocidos en la téenica. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales metálicas (inorgánicas) y sales orgánicas, que incluyen de modo no taxativo a aquellos enumerados en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edición, pág. 1418 (1985). Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, solo a modo de ejemplo, sales de ácidos inorgánicos tales como hidrocloruro, sulfato, fosfato, disfosfato, hidrobromuro, y nitrato o sales de un ácido orgánico tales como malato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, citrato, acetato, lactato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato o palmoato, salicilato y estearato. De manera similar, los cationes farmacéuticamente aceptables incluyen, de modo no taxativo, sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio (especialmente sales de amonio con aminas secundarias). Las sales particulares de esta invención por las razonas citadas anteriormente incluyen sales de potasio, sodio, calcio y amonio.
El término "alquilo" incluye un hidrocarburo alifático saturado, cíclico o no cíclico, de cadena lineal o ramificada, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados, representativos incluyen, de modo no taxativo, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, y similares, mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen, de modo no taxativo, isopropilo, sec-butilo, isobutilo, ferc-butilo, isopentilo y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen, de modo no taxativo, los cicloalquilos C3-s descritos en la presente, mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen, de modo no taxativo, los cicloalquenilos C3-8 descritos en la presente.
El termino "heteroalquilo" incluye un hidrocarburo alifático saturado, cíclico o no cíclico, de cadena lineal o ramificada tal como se define anteriormente que tiene entre alrededor de 1 a alrededor de 5 heteroátomos (es decir, 1 , 2, 3, 4 o 5 heteroátomos) tales como, por ejemplo, O, N, Si, y/o S, donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden opcionalmente oxidarse y opcionalmente se puede cuaternizar el heteroátomo de nitrógeno. El grupo heteroalquilo se puede unir al resto de la molécula mediante un átomo de carbono o un heteroátomo.
El término "alquilo cíclico" incluye cualquiera de los grupos cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo sustituidos o no sustituidos descritos más adelante.
El término "cicloalquilo" incluye un grupo alquilo cíclico sustituido o no sustituido que tiene entre alrededor de 3 a alrededor de 8 átomos de carbono (es decir, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono) como vértices del anillo. Los grupos cicloalquilo preferidos incluyen aquellos que tienen de alrededor de 3 a alrededor de 6 átomos de carbono como vértices del anillo. Ejemplos de grupos cicloalquilo C3-8 incluyen, de modo no taxativo, ciclopropilo, metil-ciclopropilo, dimetil-ciclopropilo, ciclobutilo, metil-ciclobutilo, ciclopenti lo , metil-ciclopentilo, ciclohexilo, metil-ciclohexilo, dimetil-ciclohexilo, cicloheptilo, y ciclooctilo, así como otros grupos cicloalquilo C3.8 sustituidos.
El término "heterocicloalquilo" incluye un grupo alquilo cíclico sustituido o no sustituido tal como se define anteriormente que tiene entre alrededor de 1 a alrededor de 3 heteroátomos como miembros del anillo seleccionados del grupo que consiste en O, N, Si, y S, donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden opcionalmente oxidarse y opcionalmente se puede cuaternizar el heteroátomo de nitrógeno. El 5 grupo heterocicloalquilo se puede unir al resto de la molécula mediante un átomo de carbono o un heteroátomo.
El término "cicloalquenilo" incluye un grupo alquenilo cíclico sustituido o no sustituido que tiene entre alrededor de 3 a alrededor de 8 átomos de carbono (es decir, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono) ío como vértices del anillo. Los grupos cicloalquenilo preferidos son aquellos que tienen de alrededor de 3 a alrededor de 6 átomos de carbono como vértices del anillo. Ejemplos de grupos cicloalquenilo C3-8 incluyen, de modo no taxativo, ciclopropenilo, metil-ciclopropenilo, dimetil-ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, ib cicloheptenilo, y ciclooctenilo, así como otros grupos cicloalquenilo C3-8 sustituidos.
El término "heterocicloalquenilo" incluye un grupo alquenilo cíclico sustituido o no sustituido tal como se define anteriormente que tiene entre alrededor de 1 a alrededor de 3 heteroátomos como miembros del 20 anillo seleccionados del grupo que consiste en O, N, Si, y S, donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden opcionalmente oxidarse y opcionalmente se puede cuaternizar el heteroátomo de nitrógeno. El grupo heterocicloalquenilo se puede unir al resto de la molécula mediante un átomo de carbono o un heteroátomo. 25 El término "alcoxi" incluye un grupo de la fórmula alquil-O-, donde "alquilo" tiene la definición previamente dada. Ejemplos no taxativos de grupos alcoxi incluyen metoxi, etoxi, n-propoxi, iso- propoxi, n-butoxi, iso- butoxi, sec-butoxi y ferc-butoxi.
El término "alquenilo" incluye un alquilo, tal como se define anteriormente, que contiene al menos un enlace doble entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen ambos isómeros cis y trans. Los alquenilos ramificados de cadena lineal representativos incluyen, de modo no taxativo, etilenilo, propilenilo, 1 -buten i lo , 2-butenilo, isobutilenilo, 1 -pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1 -butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, y similares. Los alquenilos cíclicos representativos están descritos anteriormente.
El término "alqumilo" incluye cualquier alquilo o alquenilo, tal como se define anteriormente, que contiene adicionalmente al menos un enlace triple entre carbonos adyacentes. Los alquinilos ramificados y de cadena lineal representativos incluyen, de modo no taxativo, acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1-butinil, y similares.
El término "arilo" incluye un grupo hidrocarburo poliinsaturado, típicamente aromático que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (hasta tres anillos) que están fusionados juntos o enlazados de forma covalente, y que lleva opcionalmente uno o más sustituyentes, tales como, por ejemplo, halógeno, trifluorometilo, amino, alquilo, alcoxi, alquilcarbonilo, ciano, carbamoilo, alcoxi carbamoilo, metilendioxi, carboxi, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, hidroxi, nitro, y similares. Los ejemplos no taxativos de grupos arilos insustituidos incluyen fenilo, naftilo y bifenilo. Los ejemplos de grupos arilo sustituidos incluyen, de modo no taxativo, fenilo, clorofenilo, trifluorometilfenilo, clorofluorofenilo y aminofenilo.
Los términos "alquiltio", "alquilsulfonilo", "alquilsulfinilo" y "arilsulfonilo" incluyen grupos que tienen la fórmula -S-R', -S(O)2-R\ -S(0)-R' y -S(0)2Rj, respectivamente, donde R' es un grupo alquilo tal como se definió previamente y Rj es un grupo arilo tal como se definió previamente.
Los términos "alqueniloxi" y "alqumiloxi" incluyen grupos que tienen la fórmula -O-R1, donde R1 es un grupo alquenilo o alquinilo, respectivamente.
Los términos "alqueniltio" y "alquiniltio" incluyen grupos que tienen la fórmula -S-Rk, donde Rk es un grupo alquenilo o alquinilo, respectivamente.
El término "alcoxicarbonilo" incluye un grupo que tiene la fórmula -C(O)0-R', donde R1 es un grupo alquilo tal como se definió anteriormente y donde el número total de átomos de carbono se refiere a los restos carbonilos y alquilo combinados.
El término "acilo" incluye cualquier alquilo, alquenilo, o alquinilo donde el carbono en el punto de unión está sustituido con un grupo oxo, tal como se define más adelante. Los siguientes son ejemplos no taxativos de grupos acilo: -C(=0)alquilo, -C(=0)alquenilo, y C(=0)alquinilo.
El término "heterociclo" incluye un anillo monocíclico de 5 a 7 miembros, o un anillo heterocícliclo, bicíclico de 7 a 10 miembros que es aromático, saturado o insaturado, y que contiene de 1 o 2 heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre, y donde los heteroátomos de nitrógeno y de azufre pueden oxidarse opcionalmente, y se puede cuaternizar el heteroátomo de nitrógeno, incluyendo los anillos bicíclicos donde cualquiera de los heterociclos antemencionados están fusionados a un anillo de benceno. El heterociclo puede estar unido a traves de cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen, de modo no taxativo, heteroarilos tal como se definen más adelante, así como morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantomilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, y similares.
El término "heteroarilo" incluye un heterociclo aromático de 5 a 10 miembros que contiene uno, dos o más heteroátomos seleccionados de nitrógeno (N), oxígeno (O) y azufre (S). El heteroarilo se puede sustituir en uno o más átomos de carbono con sustituyentes tales como, por ejemplo, halógeno, alquilo, alcoxi, ciano, haloalquilo (por ejemplo, trifluorometilo), heterociclilo (por ejemplo, morfolinilo o pirrolidinilo), y similares. Ejemplos no taxativos de heteroarilos incluyen piridinilo y furanilo.
El término "halógeno" incluye fluoro, cloro, bromo y yodo.
Los términos “alquilo opcionalmente sustituido”, “alquilo cíclico opcionalmente sustituido", "alquenilo opcionalmente sustituido", "alqumilo opcionalmente sustituido", "acilo opcionalmente sustituido" y "heterociclo opcionalmente sustituido" significa que, cuando está sustituido, al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza con un sustituyente. En el caso de un sustituyente "oxo" (=0), se reemplazan dos átomos de hidrógeno. Ejemplos no taxativos de sustituyentes incluyen oxo, halógeno, heterociclo, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry, -NRxS02Ry, -C(=0)Rx, -C( = 0)ORx, -C( = 0)NRxRy, -SOnRx y -SOnNRxRy, donde n es 0, 1 , o 2, Rx y Ry son iguales o diferentes y son independientemente hidrógeno, alquilo o heterocilo, y cada uno de los sustituyentes de alquilo y heterocilo se pueden sustituir adicionalmente con uno o más de oxo, halógeno, -OH, -CN, alquilo, -ORx, heterociclo, -NRxRy, -NRxC( = 0)Ry, -NRxS02Ry, -C( = 0)Rx, -C( = 0)0Rx, -C( = 0)NRxRy, -SOnRx, y -SOnNRxRy. El termino "opcionalmente sustituido", cuando se utiliza antes de una lista de sustituyentes, significa que cada uno de los sustituyentes en la lista puede estar opcionalmente sustituido tal como se describe en la presente.
En un aspecto, la presente invención proporciona un lípido catiónico que tiene una Fórmula (I) estructural: C-A-U-Z,(I) o sales de este, donde: X es alquilamino; A es alquilo Ci a C6 opcionalmente sustituido, donde dicho alquilo Ci a C6 opcionalmente sustituido puede ser saturado o insaturado y donde A puede estar o no presente; Y se selecciona del grupo que consiste en cetal, éster; éter, carbamato, opcionalmente sustituido y amida opcionalmente sustituida; y Z es un resto hidrofóbico que consiste en tres cadenas de alquilo donde cada una de las cadenas de alquilo tiene una longitud de C8 a Cu, donde cada una de las tres cadenas de alquilo pueden ser independientemente saturadas o insaturadas, y donde cada una de las tres cadenas de alquilo está opcionalmente sustituida.
En algunas modalidades de los lípidos de la Fórmula (I), Z tiene la fórmula: donde, R 1 , R2, y R3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C8 a Cu ; donde cada Ri , R2, y R3 pueden ser independientemente saturados o insaturados y donde cada Ri , R2, y R3 está opcionalmente sustituido.
En modalidades particulares, un lípido de la Fórmula (I) tiene una de las siguientes estructuras: Compuesto 13, Compuesto 14, Compuesto 22 I Compuesto 24, Compuesto 27, Compuesto 28, Compuesto 40, Compuesto 42, Compuesto 62, Compuesto 71, Compuesto 79, Compuesto 83, Compuesto 90 En algunas modalidades, el I í pido catiónico forma una sal (por ejemplo, una sal cristalina) con uno o más aniones. En otra modalidad particular, el lípido catiónico es la sal de oxalato (por ejemplo, hemioxalato) de este, que es preferentemente una sal cristalina. En modalidades particulares, el lípido catiónico forma una sal farmaceuticamente aceptable con uno o más aniones.
También se encuentra dentro del alcance de la presente invención las formas cristales, hidratos y solvatos de los compuestos descritos en la presente.
Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante téenicas de síntesis orgánica conocidas, que incluyen los métodos descritos en los Ejemplos. En algunas modalidades, la síntesis de los lípidos catiónicos de la invención puede requerir el uso de grupos protectores. La metodología del grupo protector es conocida por los expertos en la téenica (véase, por ejemplo, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Green, T.W. et al. , Wilcy-lnterscience, ciudad de Nueva York, 1999). Brevemente, los grupos protectores dentro del contexto de esta invención son cualquier grupo que reduce o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional. Se puede agregar un grupo protector a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante determinadas reacciones y luego se quita para revelar el grupo funcional original. En algunos casos, se utiliza un "grupo protector de alcohol". Un "grupo protector de alcohol" es cualquier grupo que disminuye o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional de alcohol. Se pueden agregar y quitar los grupos protectores mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica.
En determinadas modalidades, los lípidos catiónicos de la presente invención tienen al menos un grupo que se puede protonar o desprotonar, de modo que el lípido está cargado positivamente a un pH del pH fisiológico o debajo de este (por ejemplo, pH 7,4), y neutral a un segundo pH, preferentemente a un pH fisiológico o superior a este. Los expertos en la técnica entenderán que la adición o eliminación de protones como una función de pH es un proceso de equilibrio, y que la referencia a un lípido neutral o cargado se refiere a la naturaleza de la especie predominante y no requiere que todos los lípidos estén presentes en la forma cargada o neutral. Los lípidos que tienen más de un grupo que se puede protonar o desprotonar, o que son zwiterriónicos, no están excluidos de ser utilizados en la invención.
En otras modalidades determinadas, los lípidos que se pueden protonar de acuerdo con la invención tienen un pKa del grupo que se puede protonar en el intervalo de alrededor de 4 a alrededor de 1 1. Lo más preferible es un pKa de alrededor de 4 a alrededor de 7, dado que estos lípidos serán catiónicos en una etapa de formulación de pH más baja, mientras que las partículas serán neutralizadas en la superficie en gran parte (aunque no completamente) utilizando pH fisiológico de alrededor de pH 7,4. Uno de los beneficios de este pKa es que al menos algunos ácidos nucleicos asociados con la superficie externa de la partícula perderán su interacción electrostática a pH fisiológico y serán eliminados por diálisis simple, reduciendo de esta manera en gran parte la susceptibilidad de la partícula a la depuración.
IV. Agentes activos Los agentes activos (por ejemplo, agentes terapéuticos) incluyen cualquier molécula o compuesto capaz de ejercer un efecto deseado en una célula, tejido, órgano o sujeto. Tales efectos pueden ser, por ejemplo, biológicos, fisiológicos y/o cosméticos. Los agentes activos pueden ser cualquier tipo de molécula o compuesto que incluye, de modo no taxativo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, moléculas pequeñas y mezclas de estas. Ejemplos no taxativos de ácidos nucleicos incluyen moléculas de RNA interferente (por ejemplo, siRNA, dsRNA de sustrato de Dicer, shRNA, aiRNA, y/o miRNA), oligonucleótidos antisentido, plásmidos, ribozimas, oligonucleótidos inmunoestimulatorios, y mezclas de estos. Ejemplos de peptidos o polipéptidos incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos; anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos recombinantes y/o anticuerpos Primatized™), citocinas, factores de crecimiento, factores apoptóticos, factores que inducen la diferenciación, receptores de superficie celular y sus ligandos, hormonas y mezclas de estos. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, de modo no taxativo, moléculas orgánicas pequeñas o compuestos tales como cualquier agente convencional o fármaco conocido por los expertos en la téenica.
En algunas modalidades, el agente activo es un agente terapéutico o una sal o derivado de este. Los derivados de agentes terapéuticos pueden ser terapéuticamente activos ellos mismos o pueden ser profármacos, que se vuelven activos luego de modificación adicional. Por lo tanto, en una modalidad, un derivado de agente terapéutico retiene parte o toda la actividad terapéutica en comparación con el agente sin modificar, mientras que en otra modalidad, un derivado de agente terapéutico es un profármaco que no tiene actividad terapéutica, pero que se vuelve activo luego de modificación adicional.
A. Ácidos nucleicos En determinadas modalidades, las partículas de lípidos de la presente invención están asociadas con un ácido nucleico, que tiene como resultado una partícula de ácido nucleico-lípido (por ejemplo, LNP). En algunas modalidades, el ácido nucleico se encuentra totalmente encapsulado en la partícula del lípido. Tal como se usa en la presente, el termino "ácido nucleico" incluye cualquier oligonucleótido o polinucleótido, con fragmentos que contienen hasta 60 nucleótidos generalmente denominados oligonucleótidos, y fragmentos más largos denominados polinucleótidos. En modalidades particulares, los oligonucleótidos de la invención tienen entre alrededor de 15 a alrededor de 60 nucleótidos de longitud. El ácido nucleico se puede administrar solo en las partículas de lípidos de la invención, o en combinación (por ejemplo, administrado conjuntamente) con partículas de lípidos de la invención que comprenden péptidos, polipéptidos o pequeñas moléculas tales como fármacos convencionales.
En el contexto de esta invención, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a un polímero u oligómero de nucleótido o monómeros de nucleósido que consisten en bases de origen natural, uniones de azúcares y entre azúcares (esqueleto). Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" también incluyen polímeros u oligómeros que comprenden monómeros de origen no natural, o partes de estos, que funcionan de manera similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos se prefieren a menudo en vez de las formas nativas por propiedades tales como, por ejemplo, absorción celular mejorada, inmunogenicidad reducida, y estabilidad aumentada en la presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos generalmente se clasifican como desoxirribo- oligonucleótidos o ribo-oligonucleótidos. Un desoxirribo-oligonucleótido consiste en un azúcar de 5 carbonos llamado desoxirribosa unido de forma covalente al fosfato en los carbonos 5’ y 3’ de este azúcar para formar un polímero alternante, sin ramificar. Un ribo-oligonucleótido consiste en una estructura de repetición similar donde el azúcar de 5 carbonos es ribosa.
El ácido nucleico que está presente en una partícula de ácido nucleico-lípido de acuerdo con esta invención incluye cualquier forma de ácido nucleico conocida. Los ácidos nucleicos utilizados en la presente pueden ser DNA o RNA de cadena simple, o DNA o RNA de cadena doble, o híbridos de DNA-RNA. Se describen en la presente ejemplos de DNA de cadena doble e incluyen, por ejemplo, genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y terminación, y sistemas de auto replicación tales como DNA viral o plásmido. Se describen en la presente ejemplos de RNA de cadena doble e incluyen, por ejemplo, siRNA y otros agentes RNAi tales como dsRNA de sustrato de Dicer, shRNA, aiRNA, y pre-miRNA. Los ácidos nucleicos de una sola cadena incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, miRNA maduro y oligonucleótidos formadores de triplex.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden tener varias longitudes, que dependen generalmente en la forma particular del ácido nucleico. Por ejemplo, en modalidades particulares, los plásmidos o genes pueden tener de alrededor de 1000 a alrededor de 100.000 residuos de nucleótidos de longitud. En modalidades particulares, los oligonucleótidos pueden variar de alrededor de 10 a alrededor de 100 nucleótidos de longitud. En varias modalidades relacionadas, los oligonucleótidos, ambos de cadena simple, de cadena doble y de cadena triple, pueden variar en longitudes de alrededor de 10 a alrededor de 60 nucleótidos, de alrededor de 15 a alrededor 60 nucleótidos, de alrededor de 20 a alrededor 50 nucleótidos, de alrededor de 15 a alrededor 30 nucleótidos, o de alrededor de 20 a alrededor 30 nucleótidos de longitud.
En modalidades particulares, un oligonucleótido (o una cadena de este) de la invención se híbrida específicamente o es complementaria a una secuencia de polinucleótidos objetivo. Los terminos "específicamente hibridable" y "complementaria" tal como se usa en la presente indican un grado suficiente de complementariedad de modo que ocurra una unión específica y estable entre el DNA o RNA objetivo y el oligonucleótido. Se entiende que un oligonucleótido no necesita ser 100 % complementario con su secuencia de ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridable. En modalidades preferidas, un oligonucleótido es específicamente hibridable cuando la unión del oligonucleótido a la secuencia objetivo interfiere con la función normal de la secuencia objetivo para causar una pérdida de utilidad o expresión de esta, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido a secuencias no objetivo en condiciones donde se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico o, en el caso de ensayos in vitro, en condiciones donde se llevan a cabo los ensayos. Por lo tanto, el oligonucleótido puede incluir 1 , 2, 3 o más sustituciones de bases en comparación con la región de una secuencia génica o mRNA objetivo o a la que h ibriza específicamente. 1. siRNA El componente siRNA de las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención es capaz de silenciar la expresión de un gene objetivo de interés. Cada cadena del dúplex siRNA tiene típicamente de alrededor de 15 a alrededor de 60 nucleótidos de longitud, preferentemente alrededor de 15 a alrededor de 30 nucleótidos de longitud. En determinadas modalidades, el siRNA comprende al menos un nucleótido modificado. El siRNA modificado es generalmente menos inmunoestimulatorio que una secuencia siRNA sin modificar correspondiente y retiene actividad RNAi contra el gene objetivo de interés. En algunas modalidades, el siRNA modificado contiene al menos un nucleótido 2’OMe purina o pirimidina tal como 2’OMe-guanosina, 2’OMe-uridina, 2’OMe-adenosina, y/o el nucleótido 2’OMe-citosina. Los nucleótidos modificados pueden estar presentes en una cadena (es decir, sentido y antisentido) o ambas cadenas del siRNA. En algunas modalidades preferidas, uno o más nucleótidos de uridina y/o guanosina están modificados (por ejemplo, modificados con 2’OMe) en una cadena (es decir, sentido o antisentido) o ambas cadenas del siRNA. En estas modalidades, el siRNA modificado puede comprender además uno o más nucleótidos de adenosina modificada (por ejemplo, modificada con 2’OMe) y/o de citosina modificada (por ejemplo, modificada con 2’OMe).
En otras modalidades preferidas, uno o más nucleótidos de uridina y/o guanosina están modificados (por ejemplo, modificados con 2’OMe) en una cadena (es decir, sentido o antisentido) o ambas cadenas del siRNA. Las secuencias de siRNA pueden tener excedentes (por ejemplo, excedentes de 3’ o 5’ tal como se describen en Elbashir et al., Genes Dev., 15:188 (2001 ) o Nykánen et al. , Cell, 107:309 (2001 )), o puede que no tenga excedentes (es decir, tienen extremos romos).
En modalidades particulares, la incorporación selectiva de nucleótidos modificados, tales como nucleótidos de uridina y/o guanosina 2’OMe en la región de cadena doble de cualquiera de las dos cadenas del siRNA, reduce o completamente anula la respuesta inmunitaria a la molecula de siRNA. En determinados casos, las propiedades inmunoestimulatorias de secuencias de siRNA específicas y su capacidad de silenciar la expresión génica se pueden balancear u optimizar mediante la introducción de modificaciones 2’OMe mínimas y selectivas dentro de la región de cadena doble del dúplex siRNA. Esto se puede lograr en dosis de siRNA terapéuticamente viables sin inducción de citocina, toxicidad y efectos fuera del objetivo asociado con el uso de siRNA sin modificar.
El siRNA modificado generalmente comprende de alrededor de 1 % a alrededor de 100 % (por ejemplo, alrededor de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100 %) nucleótidos modificados en la región de cadena doble del dúplex de siRNA. En determinadas modalidades, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos modificados. En otras modalidades determinadas, algunos o todos los nucleótidos modificados en la región de cadena doble del siRNA tienen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos entre sí. En una modalidad preferida, ninguno de los nucleótidos modificados en la región de cadena doble del siRNA están adyacentes entre sí (por ejemplo, hay un espacio de al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos sin modificar entre cada nucleótido modificado).
En algunas modalidades, menos de alrededor del 50 % (por ejemplo, menos de alrededor del 49 %, 48 %, 47 %, 46 %, 45 %, 44 %, 43 %, 42 %, 41 %, 40 %, 39 %, 38 %, 37 %, o 36 %, preferentemente menos que alrededor del 35 %, 34 %, 33 %, 32 %, 31 % o 30 %) de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos modificados (por ejemplo, 2’O e). En un aspecto de estas modalidades, menos de alrededor del 50 % de los nucleótidos de uridina y/o guanosina en la región de cadena doble de una o ambas cadenas del siRNA se modifican de forma selectiva (por ejemplo, solo se modifican). En otro aspecto de estas modalidades, menos que alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA, donde el siRNA comprende al menos un nucleótido 2’OMe-guanosina y al menos un nucleótido 2’OMe-uridina, y donde los nucleótidos 2’OMe-guanosina y los nucleótidos 2’OMe-uridina son los únicos nucleótidos 2’OMe presentes en la región de cadena doble. En aún otro aspecto de estas modalidades, menos que alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA modificados, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe seleccionados del grupo que consiste en nucleótidos 2’OMe-guanosina, nucleótidos 2’OMe-uridina, nucleótidos 2’OMe-adenosina, y mezclas de estos, y donde el siRNA no comprende nucleótidos 2’OMe-citosina en la región de cadena doble. En un aspecto adicional de estas modalidades, menos que alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA, donde el siRNA comprende al menos un nucleótido 2’OMe-guanosina y al menos un nucleótido 2’OMe-uridina, y donde los siRNA no comprenden nucleótidos 2’OMe-citosina en la región de cadena doble. En otro aspecto de estas modalidades, menos que alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA modificados, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe seleccionados del grupo que consiste en nucleótidos 2’OMe-guanosina, nucleótidos 2’OMe-uridina, nucleótidos 2’OMe-adenosina, y mezclas de estos, y donde los nucleótidos 2’OMe en la región de cadena doble no están adyacentes entre sí.
En otras modalidades, de alrededor de 1 % a alrededor de 50 % (porejemplo,de alrededorde 5 %-50 %,10 %-50 %,15 %-50 %,20 %-50 %,25 %-50 %,30 %-50 %,35 %-50 %,40 %-50 %,45 °/í-50 %,5 %-45 %,10 %-45 %,15 %-45 %,20 %-45 %,25 %-45 %,30 % -45 %,35 %-45 %,40 %-45 %,5 %-40 %,10 %-40 %,15 %-40 %,20 % 40 %,25 %-40 %,25 %-39 %,25 %-38 %,25 %-37 %,25 %-36 %,26 % -39 %,26 %- 38 %,26 %-37 %,26 %-36 %,27 %-39 %,27 %-38 %,27 % -37 %,27 %- 36 %,28 %-39 %,28 %-38 %,28 %-37 %,28 %-36 %,29 % -39 %,29 %- 38 %,29 %-37 %,29 %-36 %,30 %-40 %,30 %-39 %,30 % -38 %,30 %- 37 %,30 %-36 %,31 %-39 %,31 %-38 %,31 %-37 %,31 % -36 %,32 %-39 %,32 %-38 %,32 %-37 %,32 %-36 %,33 %-39 %,33 % -38 %,33 %- 37 %,33 %-36 %,34 %-39 %,34 %-38 %,34 %-37 %,34 % -36 %,35 %- 40 %,5 %-35 %,10 %-35 %,15 %-35 %,20 %-35 %,21 % -35 %,22 %-35 %,23 %-35 %,24%-35 %,25 %-35 %,26 %-35 %,27 % -35 %,28 %-35 %,29 %-35 %,30 %-35 %,31 %-35 %,32%-35 %,33 % -35 %,34 %-35 %,30 %-34 %,31 %-34 %,32 %-34 %,33 %-34 %,30 % -33 %,31 %- 33 %,32 %-33 %,30 %-32 %,31 %-32 %,25 %-34 %,25 % -33 %,25 %- 32 %,25 %-31 %,26 %-34 %,26 %-33 %,26 %-32 %,26 % -31 %,27 %- 34 %,27 %-33 %,27 %-32 %,27 %-31 %,28 %-34 %,28 % -33 %,28 %- 32 %,28 %-31 %,29 %-34 %,29 %-33 %,29 %-32 %,29 °,6-31 %,5 %-30 %,10 %-30 %,15 %-30 %,20 %-34%,20 %-33 %,20 °/í>-32% ,20 %- 31 %,20 %-30 %,21 %-30 %,22%-30 %,23 %-30 %,24%·-30 %,25 %-30 %,25 %-29 %,25 %-28 %,25 %-27 %,25 %-26 %,26 % -30 %,26 %- 29 %,26 %-28 %,26 %-27 %,27 %-30 %,27 %-29 %,27 % -28 %,28 %- 30 %,28 %-29 %,29 %-30 %,5 %-25 %,10 %-25 %,15 % -25 %,20 %-29 %,20 %-28 %,20 %-27 %,20 %-26 %,20 %-25 %,5 %-20 %,10 %- 20 %, 15 %-20 %, 5 %-15 %, 10 %-15 %, o 5 %-10 %) de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos modificados. En un aspecto de estas modalidades, de alrededor del 1 % a alrededor del 50 % de los nucleótidos de uridina y/o guanosina en la región de cadena doble de una o ambas cadenas del siRNA se modifican de forma selectiva (por ejemplo, solo se modifican). En otro aspecto de estas modalidades, de alrededor del 1 % a alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA, donde el siRNA comprende al menos un nucleótido 2’OMe-guanosina y al menos un nucleótido 2’OMe-uridina, y donde los nucleótidos 2’OMe-guanosina y los nucleótidos 2’OMe-uridina son los únicos nucleótidos 2’OMe presentes en la región de cadena doble. En aún otro aspecto de estas modalidades, de alrededor del 1 % a alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA modificados, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe seleccionados del grupo que consiste en nucleótidos 2’OMe-guanosina, nucleótidos 2’OMe-uridina, nucleótidos 2’OMe-adenosina, y mezclas de estos, y donde el siRNA no comprende nucleótidos 2’OMe-citosina en la región de cadena doble. En un aspecto adicional de estas modalidades, de alrededor del 1 % a alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA, donde el siRNA comprende al menos un nucleótido 2’OMe-guanosina y al menos un nucleótido 2'OMe-uridina, y donde los siRNA no comprenden nucleótidos 2’OMe-citosina en la región de cadena doble. En otro aspecto de estas modalidades, de alrededor del 1 % a alrededor del 50 % de los nucleótidos en la región de cadena doble del siRNA comprende nucleótidos 2’OMe, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe en ambas cadenas del siRNA modificados, donde el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe seleccionados del grupo que consiste en nucleótidos 2’OMe-guanosina, nucleótidos 2’OMe-uridina, nucleótidos 2’OMe-adenosina, y mezclas de estos, y donde los nucleótidos 2’OMe en la región de cadena doble no están adyacentes entre sí.
Se describen intervalos, porcentajes, y patrones de modificaciones adicionales que se pueden introducir en siRNA en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0135372, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. a) Selección de secuencias siRNA Se pueden identificar secuencias siRNA adecuadas utilizando cualquier medio conocido en la téenica. Típicamente, los métodos descritos en Elbashir et al., Nature, 41 1 :494-498 (2001 ) y Elbashir et al. , EMBO J., 20:6877-6888 (2001 ) están combinados con normas de diseño racional establecidas en Rcynolds et al., Nature Biotech., 22(3):326-330 (2004).
Como un ejemplo no taxativo, la secuencia de nucleótidos 3’ del codón de inicio AUG de una transcripción del gene objetivo de interés se puede escanear en busca de secuencias de dinucleótidos (por ejemplo, AA, NA, CC, GG, o UU, donde N = C, G, o U) (véase, por ejemplo, Elbashir et al. , EMBO J., 20:6877-6888 (2001 )). Los nucleótidos ubicados próximos a 3’ de las secuencias de dinucleótidos están identificados como secuencias siRNA potenciales (es decir, una secuencia objetivo o una secuencia de cadena de sentido). Típicamente, los 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35 o más nucleótidos ubicados próximos a 3’ de las secuencias de dinucleótidos se identifican como secuencias de siRNA potenciales. En algunas modalidades, la secuencia de dinucleótidos es una secuencia AA o NA y los 19 nucleótidos ubicados próximos a 3’ de los dinucleótidos de AA o NA están identificados como secuencias siRNA potenciales. Las secuencias siRNA están usualmente separadas en diferentes posiciones a lo largo de la longitud del gene objetivo. Para mejorar adicionalmente la eficiencia del silenciamiento de las secuencias siRNA, se pueden analizar las secuencias de siRNA potenciales para identificar sitios que no contienen regiones de homología con respecto a otras secuencias de codificación, por ejemplo, en la célula u organismo objetivo. Por ejemplo, una secuencia siRNA adecuada de alrededor de 21 pares de base típicamente no tendrá más de 16-17 pares de bases contiguos de homología con respecto a secuencias de codificación en la célula u organismo objetivo. Si se van a expresar las secuencias siRNA a partir de un promotor de RNA Pol III, se seleccionan las secuencias siRNA que no tengan más de 4 A o T contiguas.
Luego de que se ha identificado una secuencia siRNA potencial, se puede diseñar una secuencia complementaria (es decir, una secuencia de cadena antisentido). Una secuencia de siRNA potencial también puede ser analizada utilizando una variedad de criterios conocidos en la téenica. Por ejemplo, para aumentar su eficiencia de silenciamiento, las secuencias siRNA se pueden analizar por un algoritmo de diseño racional para identificar secuencias que tienen una o más de las siguientes características: (1 ) contenido de G/C de alrededor de 25 % a alrededor de 60 % de G/C; (2) al menos 3 A/U en las posiciones 15-19 de la cadena de sentido; (3) sin repeticiones internas; (4) una A en la posición 19 de la cadena de sentido; (5) una A en la posición 3 de la cadena de sentido; (6) una U en la posición 10 de la cadena de sentido; (7) sin G/C en la posición 19 de la cadena de sentido; y (8) sin G en la posición 13 de la cadena de sentido. Las herramientas de diseño de siRNA que incorporan algoritmos que otorgan valores adecuados de cada una de estas características y son útiles para la selección de siRNA se pueden encontrar en, por ejemplo, http://ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html. Un experto en la técnica apreciará que las secuencias con una o más de las características antemencionadas se pueden seleccionar para análisis y pruebas adicionales como secuencias de siRNA potenciales.
Adicionalmente, las secuencias de siRNA potenciales con uno o más de los siguientes criterios generalmente se pueden eliminar como siRNA: (1 ) las secuencias que comprenden un tramo de 4 o más de las mismas bases en una fila; (2) secuencias que comprenden homopolímeros de G (es decir, para reducir los efectos no específicos posibles debido a características estructurales de estos polímeros; (3) secuencias que comprenden motivos de base triple (por ejemplo, GGG, CCC, AAA, o TTT); (4) secuencias que comprenden tramos de 7 o más G/C en una fila; y (5) secuencias que comprenden repeticiones directas de 4 o más bases dentro de los candidatos que tienen como resultado estructuras internas de plegamiento sobre sí mismas. Sin embargo, un experto en la téenica apreciará que las secuencias con una o más de las características antemencionadas aún se pueden seleccionar para análisis y pruebas adicionales como secuencias de sIRNA potenciales.
En algunas modalidades, las secuencias de siRNA potenciales se pueden analizar adicionalmente en función de la asimetría dúplex de siRNA tal como se describe en, por ejemplo, Khvorova et al., Cell, 115:209-216 (2003); y Schwarz et al., Cell, 115: 199-208 (2003). En otras modalidades, las secuencias de siRNA potenciales se pueden analizar adicionalmente en función de la estructura secundaria en el sitio objetivo tal como se describe en, por ejemplo, Luo et al., Biophys. Res. Commun., 318:303-310 (2004). Por ejemplo, la estructura secundaria en el sitio objetivo se puede modelar utilizando el algoritmo Mfold (disponible en http://mfold.burnet.edu.au/rna_form) para seleccionar las secuencias de siRNA que favorecen la accesibilidad en el sitio objetivo donde hay menos estructura secundaria en forma de apareamiento de bases y de bucles de horquillas.
Una vez que se ha identificado una secuencia siRNA, la secuencia se puede analizar en busca de la presencia de cualquier propiedad inmunoestimulatoria, por ejemplo, utilizando un ensayo de citocina in vitro o un modelo animal in vivo. Los motivos en la cadena de sentido y/o antisentido de la secuencia siRNA tal como motivos enriquecidos con GU (por ejemplo, 5’-GU-3’, 5’-UGU-3’, 5’-GUGU-3’, 5’-UGUGU-3’, etc.) también pueden proporcionar una indicio de si la secuencia puede ser inmunoestimulatoria. Luego de que se descubre que una molécula siRNA es inmunoestimulatoria, esta se puede modificar para disminuir sus propiedades inmunoestimulatorias tal como se describe en la presente. A modo de ejemplo no taxativo, una secuencia siRNA se puede poner en contacto con una célula de mamífero respondedora en condiciones tales que la célula produce una respuesta inmunitaria detectable para determinar si el siRNA es un siRNA inmunoestimulador o no inmunoestimulador. La célula de mamífero respondedora puede ser de un mamífero sin tratamiento anterior (es decir, un mamífero que no ha estado antes en contacto con el producto génico de la secuencia siRNA). La célula de mamífero respondedora puede ser, por ejemplo, una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), un macrófago y similares. La respuesta inmunitaria detectable puede comprender la producción de una citocina o un factor de crecimiento tal como, por ejemplo, TNF-a, IFN-a, IFN-b, IFN-g, IL-6, IL-12, o una combinación de estos. Una molécula de siRNA que se identifica como inmunoestimulatoria, se puede modificar luego para disminuir sus propiedades inmunoestimulatorias al reemplazar al menos uno de los nucleótidos en la cadena de sentido y/o antisentido con nucleótidos modificados. Por ejemplo, se pueden reemplazar menos de alrededor del 30 % (por ejemplo, menos que alrededor de 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 %) de los nucleótidos en la región de cadena doble de los dúplex siRNA con nucleótidos modificados tales como nucleótidos 2’OMe. Se puede entonces poner en contacto el siRNA modificado con una célula de mamífero respondedora tal como se describe anteriormente para confirmar que sus propiedades inmunoestimulatorias se han reducido o anulado.
Ensayos in vitro adecuados para detectar una respuesta inmunitaria incluyen, de modo no taxativo, la téenica de inmunoensayo de tipo emparedado de anticuerpos monoclonales dobles de David et al. (patente estadounidense n.° 4,376, 1 10); ensayos de tipo emparedado de anticuerpos monoclonales-policlonales (Wide et al. , en Kirkham y Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods , E. y S. Livingstone, Edinburgh (1970)); el método “transferencia Western” de Gordon et al. (patente estadounidense n.° 4,452,901 ); inmunoprecipitación de ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem., 255:4980-4983 (1980)); ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) tal como la describe, por ejemplo, Raines et al., J. Biol. Chem., 257:5154-5160 (1982); técnicas inmunocitoquímicas, incluyendo el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol., 39:477 (1980)); y neutralización de actividad (Bowen-Pope et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :2396-2400 (1984)). Además de los inmunoensayos descritos anteriormente, se encuentran disponibles una cantidad de otros inmunoensayos, que incluyen aquellos descritos en las patentes estadounidenses n.° 3,817,827; 3,850,752; 3,901 ,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; y 4,098,876. La descripción de estas referencias se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
Un ejemplo no taxativo de un modelo in vivo para detectar una respuesta inmunitaria incluye un ensayo de inducción de citocina en un ratón in vivo tal como se describe en, por ejemplo, Judge et al. , Mol. Ther. , 13:494-505 (2006). En determinadas modalidades, el ensayo se puede realizar de la siguiente manera: (1 ) siRNA se puede administrar mediante inyección intravenosa estándar en la vena lateral de la cola; (2) se puede recolectar sangre mediante punción cardíaca alrededor de 6 horas luego de la administración y se puede procesar como plasma para análisis de citocina; y (3) las citocinas se pueden cuantificar utilizando kits de ELISA de tipo emparedado conforme a las instrucciones del fabricante (por ejemplo, IFN-a de ratón y humano (PBL Biomedical; Piscataway, NJ); IL-6 y TNF-a humano (eBioscience; San Diego, CA); e IL-6, TNF-a, e IFN-g de ratón (BD Biosciences; San Diego, CA)).
Anticuerpos monoclonales que unen específicamente citocinas y factores de crecimiento se encuentran comercialmente disponibles de múltiples fuentes y se pueden generar utilizando métodos conocidos en la téenica (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) y Harlow y Lañe, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Coid Spring Harbor Publication, Nueva York (1999)). La generación de anticuerpos monoclonales se ha descrito previamente y se puede lograr mediante cualquier medio conocido en la técnica (Buhring et al. , en Hybridoma, Vol. 10, n.° 1 , pp. 77-78 (1991 )). En algunos métodos, el anticuerpo monoclonal está marcado (por ejemplo, con cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, eléctricos, ópticos o químicos) para facilitar la detección. b) Generación de moléculas siRNA Se puede proporcionar siRNA en varias formas que incluyen, por ejemplo, como uno o más dúplex de RNA interferente pequeño (siRNA) aislados, como RNA de cadena doble (dsRNA) con mayor longitud, o como siRNA o dsRNA transcrito a partir de un casete transcripcional en un plásmido de DNA. En algunas modalidades, el siRNA se puede producir de forma enzimática o por síntesis orgánica parcial/total, y los ribonucleótidos modificados se pueden introducir por síntesis enzimática u orgánica in vitro. En determinados casos, cada cadena se prepara químicamente. Los métodos para sintetizar las moléculas de RNA son conocidas en la téenica, por ejemplo, los métodos de síntesis química como se describe en Verma y Eckstein (1998) o como se describe en la presente.
Una población de RNA se puede utilizar para proporcionar RNA de precursor largo, o se puede utilizar RNA de precursores largos que tienen identidad sustancial o completa con respecto a una secuencia objetivo para hacer los siRNA. Los RNA se pueden aislar a partir de células o tejido, sintetizados y/o clonados conforme a métodos conocidos por los expertos en la técnica. El RNA puede ser una población mezclada (obtenida a partir de células o tejido, transcrito a partir de cDNA, sustraído, seleccionado, etc.), o puede representar una única secuencia objetivo. El RNA puede ser de origen natural (por ejemplo, aislado a partir de muestras de tejido o células), sintetizado in vitro (por ejemplo, utilizando polimerasa T7 o SP6 y productos PCR o un cDNA clonado, o químicamente sintetizado.
Para formar un dsRNA de mayor longitud, para RNA sintéticos, el complemento también se transcribe in vitro y se híbrida para formar un dsRNA. Si se utiliza una población de RNA de origen natural, los complementos de RNA también se proporcionan (por ejemplo, para formar dsRNA para la digestión mediante RNAsa III o Dicer de E. coli), por ejemplo, mediante la transcripción de cDNA que corresponden a la población de RNA, o mediante el uso de polimerasas de RNA. Las RNA precursoras luego se hibridan para formar RNA de cadena doble para la digestión. Los dsRNA se pueden administrar a un sujeto o se pueden digerir in vitro antes de la administración.
Los métodos para aislar RNA, sintetizar RNA, hibridar ácidos nucleicos, elaborar y analizar bibliotecas de cDNA, y realizar PCR son conocidas en la téenica (véase, por ejemplo, Gubler y Hoffman, Gene, 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra Ausubel et al., supra), como lo son también los métodos PCR (véase, las patentes estadounidenses n.° 4,683, 195 y 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., ed, 1990)). Las bibliotecas de expresión también son conocidas por los expertos en la técnica. Los textos básicos adicionales que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen a Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ed., 1994). La descripción de estas referencias se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
Preferentemente, los siRNA se sintetizan químicamente. Los oligonucleótidos que comprenden las moléculas de siRNA de la invención se pueden sintetizar utilizando cualquiera de una variedad de téenicas conocidas en la técnica, tales como aquellas descritas en Usman et al., J. Am. Chem. Soc. , 109:7845 (1987); Scaringe et al. , Nucí. Acids Res. , 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucí. Acids Res. , 23:2677-2684 (1995); y Wincott et al., Methods Mol. Bio. , 74:59 (1997). La síntesis de oligonucleótidos hace uso de grupos protectores y de acoplamiento de ácidos nucleicos comunes, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5’ y fosforamiditas en el extremo 3’. A modo de ejemplo no taxativo, se pueden llevar a cabo síntesis a pequeña escala en un sintetizador Applied Biosystems utilizando un protocolo a escala de 0.2 mhioI. De manera alternativa, las síntesis en la escala de 0,2 mhhoI se pueden realizar en un sintetizador de placa de 96 pocilios de Protogene (Palo Alto, CA). Sin embargo, una escala más grande o más pequeña de síntesis también se encuentra del alcance de esta invención. Reactivos adecuados para la síntesis de oligonucleótidos, métodos para la desprotección de RNA, y métodos para la purificación de RNA son conocidos por los expertos en la técnica.
Las moléculas de siRNA también se pueden sintetizar mediante una técnica de síntesis en tándem, donde ambas cadenas se sintetizan como un único fragmento o cadena de oligonucleótido continuo separado por un enlazador escindible que se escinde posteriormente para proporcionar fragmentos o cadenas separadas que se hibridan para formar el dúplex siRNA. El enlazador puede ser un enlazador polinucleótido o un enlazador que no sea polinucleótido. La síntesis en tándem de siRNA se puede adaptar rápidamente en plataformas de síntesis de multipocillos/multiplacas así como en plataformas de síntesis a gran escala empleando reactores de lote, columnas de síntesis y similares. De manera alternativa, las moléculas siRNA se pueden ensamblar a partir de dos oligonucleótidos distintos, donde un oligonucleótido comprende la cadena de sentido y la otra comprende la cadena antisentido del siRNA. Por ejemplo, cada cadena se puede sintetizar de forma separada y unida mediante hibridación o ligación luego de la síntesis y/o desprotección. En otras instancias determinadas, las moléculas siRNA se pueden sintetizar como un único fragmento de oligonucleótido continuo, donde las regiones sentido y antisentido auto complementarias se hibridan para formar un dúplex siRNA que tiene una estructura secundaria de horquilla. c) Modificación de las secuencias siRNA En determinados aspectos, las moléculas siRNA comprenden un dúplex que tiene dos cadenas y al menos un nucleótido modificado en la región de cadena doble, donde cada cadena tiene alrededor de 15 a alrededor de 60 nucleótidos de longitud. De forma beneficiosa, el siRNA modificado es menos inmunoestimulatorio que una secuencia siRNA sin modificar correspondiente, pero retiene la capacidad de silenciar la expresión de una secuencia objetivo. En modalidades preferidas, el grado de modificaciones químicas introducidas en la molecula siRNA establece un equilibrio entre la reducción o la anulación de las propiedades inmunoestimularias de siRNA y la retención de la actividad RNAi. A modo de ejemplo no taxativo, una molécula siRNA que direcciona un gene de interés se puede modificar mínimamente (por ejemplo, modificado menos que alrededor de 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, o 5 %) en nucleótidos selectivos de uridina y/o guanosina dentro del dúplex siRNA para eliminar la respuesta inmunitaria generada por el siRNA mientras que retiene su capacidad para silenciar la expresión génica objetivo.
Ejemplos de nucleótidos modificados adecuados para su uso en la invención incluyen, de modo no taxativo, ribonucleótidos que tienen un grupo 2’-O-metilo (2’OMe), 2’-deoxi-2’-fluoro (2’F), 2’-deoxi, 5-C-metilo, 2’-0-(2-metoxietilo) (MOE), 4’-tio, 2’-amino, o 2’-C-alilo. Nucleótidos modificados que tienen una conformación Northern tales como aquellas descritas en, por ejemplo, Saenger, Principies of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed. (1984), también son adecuados para utilizar en las moléculas siRNA. Tales nucleótidos modificados incluyen, de modo no taxativo, nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNA, por sus siglas en inglés) (por ejemplo, nucleótidos de 2’-0, 4’-C-metileno-(D-ribofuranosil)), nucleótidos de 2’-0-(2-metoxietil) (MOE), nucleótidos de 2’-metil-tio-etil, nucleótidos de 2’-deoxi-2’-fluoro (2’F), nucleótidos de 2’-deoxi-2’-cloro (2’CI), y nucleótidos de 2’-azido. En determinados casos, las moléculas de siRNA descritas en la presente incluyen uno o más nucleótidos de pinza ( G-clamp ). Un nucleótido de pinza se refiere a una citosina modificada análoga donde las modificaciones confieren la capacidad de unir con hidrógeno ambas caras de Watson-Crick y Hoogsteen de un nucleótido de guanina complementario dentro de un dúplex (véase, por ejemplo, Lin et al. , J. Am. Chem. Soc., 120:8531 -8532 (1998)). Además, se pueden incorporan en las moléculas siRNA los nucleótidos que tienen un análogo de bases de nucleótido tales como, por ejemplo, C-fenilo, C-naftilo, otros derivados aromáticos, inosina, carboxamidas de azol, y derivados de nitroazol tales como 3-nitropirrol, 4-nitromdol, 5-nitroindol, y 6-nitroindol (véase, por ejemplo, Loakes, Nucí. Acids Res., 29:2437-2447 (2001 )).
En determinadas modalidades, las moléculas siRNA pueden comprender además una o más modificaciones químicas tales como restos de casquete terminal, modificaciones en la estructura del fosfato y similares. Ejemplos de restos de casquete terminal incluyen, de modo no taxativo, residuos abásicos desoxi invertidos, modificaciones de glicerilo, nucleótidos 4’,5’-metileno, nucleótidos 1 -(b-D-eritrofuranosilo), nucleótidos 4’-tio, nucleótidos carbocíclicos, nucleótidos 1 ,5-anhidrohexitol, nucleótidos L, nucleótidos a, nucleótidos con base modificada, nucleótidos freo-pentofuranosilo, nucleótidos acíclicos 3’, 4’-seco, nucleótidos acíclicos 3,4-dihidroxibutilo, nucleótidos acíclicos 3,5-dihidroxipentilo, restos nucleótidos 3’-3’-invertidos, restos abásicos 3’-3’-invertidos, restos de nucleótidos 3’-2’-¡nvertidos, restos abásicos 3’-2’-invertidos, restos de nucleótidos 5’-5’-invertidos, restos abásicos 5’- 5’-¡nvertidos, restos abásicos 3’-5’-invertidos, fosfato 5’-amino-alquilo, fosfato 1 ,3-diamino-2-propilo, fosfato 3-aminopropilo, fosfato 6-aminohexilo, fosfato 1 ,2-aminododecilo, fosfato hidroxipropilo, fosfato 1 ,4-butanediol, 3’-fosforamidato, 5’-fosforamidato, hexilfosfato, fosfato aminohexilo, 3’-fosfato, 5’-amino, 3'-fosforotioato, 5’-fosforotioato, fosforoditioato y metilfosfonato que forman puentes o no, o restos 5’-mercapto (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,998,203; Beaucage et al., Tetrahedron 49: 1925 (1993)). Ejemplos no taxativos de modificaciones de estructura de fosfato (es decir, que resultan en enlaces internucleótidos modificados) incluyen sustituciones defosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, amidato, carbamato, carboximetilo, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal y alquilsilil (véase, por ejemplo, Hunziker et al., Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, en Modern Synthetic Methods, VCH, 331 -417 (1995); Mesmaeker et al. , Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, en Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39 (1994)). Tales modificaciones químicas pueden ocurrir en el extremo 5’ y/o 3’ de la cadena de sentido, antisentido o ambas cadenas de siRNA. La descripción de estas referencias se incorporan a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
En algunas modalidades, la cadena de sentido y/o antisentido de la molécula siRNA puede comprender además un excedente en el extremo 3’ que tiene alrededor de 1 a alrededor de 4 (por ejemplo, 1 , 2, 3 o 4) ribonucleótidos 2’-deoxi, ribonucleótidos de uridina modificados (por ejemplo, 2’OMe) o no modificados y/o cualquier otra combinación de nucleótidos modificados (por ejemplo, 2’OMe) y no modificados.
Ejemplos adicionales de nucleótidos modificados y tipos de modificaciones químicas que se pueden introducir en las moleculas siRNA se describen, por ejemplo, en la patente de GB n.° GB 2,397,818 B y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0192626, 2005/0282188 y 2007/0135372, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Las moléculas siRNA descritas en la presente pueden comprender opcionalmente uno o más no nucleótidos en una o ambas cadenas de siRNA. Tal como se usa en la presente, el término "no nucleótido" se refiere a cualquier grupo o compuesto que se puede incorporar en una cadena de ácido nucleico en lugar de una o más unidades de nucleótido, que incluye sustituciones de fosfato y/o azúcar, y permite que las bases remanentes exhiban su actividad. El grupo o compuesto es abásico en que no contiene una base de nucleótido comúnmente reconocida tal como la adenosina, guanina, citosina, uracilo o timina y por lo tanto le falta una base en la posición 1’.
En otras modalidades, la modificación química del siRNA comprende unir un conjugado a la molécula de siRNA. El conjugado se puede unir al extremo 5' y/o 3' de la cadena antisentido y/o sentido del siRNA mediante una unión covalente tal como, por ejemplo, un enlazador biodegradable. El conjugado también se puede unir a siRNA, por ejemplo, a través de un grupo carbamato u otro grupo enlazador (ver por ejemplo, publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0074771 , 2005/0043219, y 2005/0158727). En determinados casos, el conjugado es una molécula que facilita la administración del siRNA en una célula. Los ejemplos de moléculas de conjugados adecuadas para la unión con siRNA incluyen de modo no taxativo, esteroides tales como colesterol, glicoles tales como polietilenglicol(PEG), albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés), ácidos grasos, carotenoides, terpenos, ácidos biliares, folatos (por ejemplo, ácido fólico, análogos de folato y derivados de estos), azúcares (por ejemplo, galactosa, galactosamina, galactosamina de N-acetilo, glucosa, mañosa, fructosa, fucosa, etc.), fosfolípidos, péptidos, ligandos para receptores celulares capaces de mediar la absorción celular y combinaciones de estos (ver por ejemplo, la publicación de patentes estadounidense n.° 2003/0130186, 2004/0110296, y 2004/0249178; la patente estadounidense n.° 6,753,423). Otros ejemplos incluyen el resto lipofílico, vitamina, polímero, péptido, proteína, ácido nucleico, molécula pequeña, oligosacárido, conglomerado de carbohidrato, intercalador, surco menor aglutinante, agente de escisión, y moléculas de conjugado de agente de reticulación descritas en la publicación de la solicitud de patente n.° 2005/01 19470 y 2005/0107325. Aun otros ejemplos incluyen 2'-O-alquilamina, 2'-0-alcoxialquilamina, poliamina, pirimidina modificada con C5-catiónica, péptido catiónico, grupo guanidinio, grupo amidininio, moléculas de conjugado de aminoácido catiónicas descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0153337. Los ejemplos adicionales incluyen el grupo hidrofóbico, compuesto activo de membrana, compuesto penetrante celular, señal de direccionamiento celular, modificador de interacción, y moléculas de conjugado de estabilizador estérico descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0167090. Los ejemplos adicionales incluyen las moléculas de conjugado descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0239739. Se puede evaluar el tipo de conjugado utilizado y el alcance de la conjugación a la molécula de siRNA para mejorar los perfiles farmacocinéticos, biodisponibilidad y/o la estabilidad de siRNA a la vez que retienen actividad de RNAi. De tal manera, el experto en la téenica puede analizar las moléculas de siRNA que tienen varios conjugados unidos a él para identificar los que tienen propiedades mejoradas y actividad RNAi completa usando una variedad de modelos de animales in vivo o cultivos celulares in vitro bien conocidos. Las descripciones de las patentes anteriores se incorporan a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia. d) Genes objetivo El componente de siRNA de las partículas de lípidos-ácido nucleico descritas en la presente se pueden usar para regular por disminución o silenciar la traducción (es decir, expresión) de un gene de interés. Los genes de interés incluyen, de modo no taxativo, genes asociados con infección viral y supervivencia, genes asociados con enfermedades metabólicas y trastornos (por ejemplo, enfermedades y trastorno hepáticas), genes asociados con tumorigénesis o transformación celular (por ejemplo, cáncer), genes angiogénicos, genes inmunomoduladores tales como los asociados con respuestas autommunitarias e inflamatorias, genes de ligandos de receptores, y genes asociados con trastornos neurodegenerativos.
En modalidades particulares, la presente invención proporciona un cóctel de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más moléculas de siRNA que silencia la expresión de genes múltiples de interés. En algunas modalidades, el cóctel de las moléculas de siRNA está completamente encapsulado en una partícula de lípido tal como una partícula de lípido-ácido nucleico (por ejemplo, LNP). Las moléculas de siRNA se pueden encapsular conjuntamente en la misma partícula de lípido, o se puede formular cada especie de siRNA presente en el cóctel en partículas separadas.
Los genes asociados con infecciones virales y supervivencia incluyen los expresados por un hospedador (por ejemplo, un factor de hospedador tal como un factor de tejido (TF, por sus siglas en inglés) o un virus para unir, entrar y duplicar en una célula. Las secuencias virales asociadas con enfermedades virales crónicas son de particular interés. Las secuencias virales de interés particular incluyen secuencias de Filovirus tales como el virus del Ébola y virus de Marburgo (ver, por ejemplo, Geisbert et al., J. Infecí. Dis. , 193:1650-1657 (2006)); Arenavirus tal como el Lassa virus, Junin virus, Machupo virus, Guanarito virus, y Sabia virus (Buchmeier et al., Arenaviridae the viruses and their replication, In: FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4ta edición, Lippincott-Raven, Filadelfia, (2001 )); Virus de la influenza tales como virus de la Influenza A, B, y C, (ver por ejemplo, Steinhauer et al. , Annu Rev Genet., 36:305-332 (2002); y Neu ann et al., J Gen Virol., 83:2635-2662 (2002)); virus de la Hepatitis (ver por ejemplo, Hamasaki et al., FEBS Lett ., 543:51 (2003); Yokota et al., EMBO Rep., 5 4:602 (2003); Schlomai et al. , Hepatology, 37:764 (2003); Wilson et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 100:2783 (2003); Kapadia et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 100:2014 (2003); y FIELDS VIROLOGY, Knipe et al. (eds.), 4ta edición, Lippincott-Raven, Ph iladelph ia (2001 )); virus de la inmunodeficiencia humana (V1H) (Banerjea et al., Mol. Ther., 8:62 ío (2003); Song et al., J. Virol., 77:7174 (2003); Stephenson, JAMA, 289:1494 (2003); Qin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 100: 183 (2003)); virus del Herpes (Jia et al. , J. Virol., 77:3301 (2003)); y virus del papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés) (Hall et al., J. Virol., 77:6066 (2003); Jiang et al. , Oncogene, 21 :6041 (2002)). 15 Las secuencias de ácido nucleico de filovirus de ejemplo que se pueden silenciar incluyen, de modo no taxativo, secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas estructurales (por ejemplo, VP30, VP35, nucleoproteína (NP), proteína de polimerasa (L-pol)) y proteínas asociados a membranas (por ejemplo, VP40, glicoproteína (GP), VP24). 20 Las secuencias de genoma completas para el virus del Ébola se establecen en, por ejemplo, los números de acceso en GenBank NC_002549; AY769362; NC_006432; NC_004161 ; AY729654; AY354458; AY142960; AB050936; AF522874; AF499101 ; AF272001 ; y AF086833. Las secuencias del virus del Ébola VP24 se establecen en, por ejemplo, 25 los números de acceso en GenBank U77385 y AY058897. Las secuencias del virus del Ébola L-pol se establecen en, por ejemplo, el número de acceso en GenBank X671 10. Las secuencias del virus del Ébola VP40 se establecen en, por ejemplo, el número de acceso en GenBank AY058896. Las secuencias del virus del Ébola NP se establecen en, por ejemplo, el número de acceso en GenBank AY058895. Las secuencias del virus del Ébola GP se establecen en, por ejemplo, el número de acceso en GenBank AY058898; Sánchez et al., Virus Res. , 29:215-240 (1993); Will et al. , J. Viro!., 67: 1203-1210 (1993); Volchkov et al.., FEBS Lett. , 305: 181-184 (1992); y la patente estadounidense n.° 6,713,069. Las secuencias del virus del Ébola adicionales se establecen en, por ejemplo, los números de acceso en GenBank L11365 y X61274. Las secuencias de genoma completo para el virus de Marburgo se establecen en, por ejemplo, los número de acceso de GenBank NC_001608; AY430365; AY430366; y AY358025. Las secuencias del virus de Marburgo GP se establecen en, por ejemplo, los números de acceso en GenBank AF005734; AF005733; y AF005732. Las secuencias del virus de Marburgo VP35 se establecen en, por ejemplo, los números de acceso en GenBank AF005731 y AF005730. Las secuencias del virus del Ébola adicionales se establecen en, por ejemplo, los números de acceso en GenBank X64406; Z29337; AF005735; y Z12132. Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan las secuencias de ácido nucleico de virus de Marburgo y virus del Ébola incluyen las descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0135370 y en la solicitud provisional estadounidense n.° 61/286,741 , presentada el 15 de diciembre de 2009, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Las secuencias de ácido nucleico de Arenavirus de ejemplo que se pueden silenciar incluyen, de modo no taxativo, secuencias de ácido nucleico que codifican nucleoproteína (NP), glicoproteína (GP), L-polimerasa (L) y proteína Z (Z). Las secuencias de genoma completas para el Lassa virus se establecen en por ejemplo, los números de acceso de GenBank NC_004296 (segmento S de LASV) y NC_004297 (segmento L de LASV). Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan las secuencias de ácido nucleico de Lassa virus incluyen las descritas en la solicitud provisional de patente estadounidense n.° 61/319,855, presentada el 31 de marzo de 2010, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Las secuencias de ácido nucleico hospedadoras que pueden ser silenciadas incluyen, de modo no taxativo, secuencias de ácido nucleico que codifican factores hospedadores tales como el factor de tejido (TF) que se conoce que juegan un papel importante en la patogénesis de los virus de fiebre hemorrágica. La secuencia de mRNA de TF se establece en el número de acceso de GenBank NM_001993. Los expertos en la téenica observarán que TF también se conoce como F3, factor de coagulación III, tromboplastina y CD142. Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan las secuencias de ácido nucleico de TF incluyen las descritas en la solicitud provisional de patente estadounidense n.° 61/319,855, presentada el 31 de marzo de 2010, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Las secuencias de ácido nucleico de virus de la influenza de ejemplo que se pueden silenciar incluyen, de modo no taxativo, secuencias de ácido nucleico que codifican nucleoproteínas (NP), proteínas de matriz (M 1 y M2), proteínas no estructurales (NS1 y NS2), polimerasa de RNA (PA, PB1 , PB2), neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA). Las secuencias de NP de Influenza A se establecen en, por ejemplo, los números de acceso de GenBank NC_004522; AY818138; AB166863; AB188817; AB189046; AB189054; AB189062; AY646169; AY646177 ; AY651486; AY651493; AY651494; AY651495; AY651496; AY651497; AY651498; AY651499; AY651500; AY651501 ; AY651502; AY651503; AY651504; AY651505; AY651506; AY651507; AY651509; AY651528; AY770996; AY790308; AY818138; y AY818140. Las secuencias de PA de Influenza A se establecen en, por ejemplo, los números de acceso de GenBank AY818132; AY790280; AY646171 ; AY818132; AY818133; AY646179; AY818134; AY551934; AY651613; AY651610; AY651620; AY651617; AY651600; AY651611 ; AY651606; AY651618; AY651608; AY651607; AY651605; AY651609; AY651615; AY651616; AY651640; AY651614; AY651612; AY651621 ; AY651619; AY770995; y AY724786. Los ejemplos no taxativos de moléculas de siRNA que direccionan secuencias de ácido nucleico del virus de la influenza incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0218122, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
Las secuencias de ácido nucleico del virus de la hepatitis de ejemplo que se pueden silenciar incluyen, de modo no taxativo, secuencias de ácido nucleico involucradas en la transcripción y traducción (por ejemplo, En1 , En2, X, P) y secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas estructurales (por ejemplo, proteínas nucleares incluyendo proteínas relacionadas con C y C, proteínas de envolturas incluyendo proteínas S, M y/o L, o fragmentos de estas) (ver, por ejemplo, FIELDS VIROLOGY, supra ). Las secuencias de ácido nucleico del virus de la hepatitis C (VHC) de ejemplo que se pueden silenciar incluyen, de modo no taxativo, la región no traducida 5' UTR (5'-UTR), la región no traducida 3' UTR (3'-UTR), la región de codón de iniciación de traslación de poliproteínas, la secuencia del sitio interno de entrada de ribosomas (IRES, por sus siglas en inglés) y/o secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína nuclear, la proteína E1 , la proteína E2, la proteína p7, la proteína NS2, la proteasa/helicasa NS3, la proteína NS4A, la proteína NS4B, la proteína NS5A y la polimerasa de RNA dependiente de RNA de NS5B. Las secuencias de genomas de VHC se establecen en, por ejemplo, números de acceso de Genbank NC_004102 (genotipo de VHC 1 a), AJ238799 (genotipo de VHC 1 b), NC_009823 (genotipo de VHC 2), NC_009824 (genotipo de VHC 3), NC_009825 (genotipo de VHC 4), NC_009826 (genotipo de VHC 5), y NC_009827 (genotipo de VHC 6). Las secuencias de ácido nucleico del virus de la Hepatitis A se establecen por ejemplo, en el n.° de acceso de Genbank NC_001489; las secuencias de ácido nucleico del virus de la Hepatitis B se establecen por ejemplo, en el n.° de acceso de Genbank NC_003977; las secuencias de ácido nucleico del virus de la Hepatitis D se establecen por ejemplo, en el n.° de acceso de Genbank NC_001653; las secuencias de ácido nucleico del virus de la Hepatitis E se establecen por ejemplo, en el n.° de acceso de Genbank NC_001434; y las secuencias de ácido nucleico del virus de la Hepatitis G se establecen por ejemplo, en el n.° de acceso de Genbank NC_001710. El silenciamiento de las secuencias que codifican genes asociados con la supervivencia e infección viral se pueden usar de manera conveniente en combinación con la administración de agentes convencionales usados para tratar la afección viral. Los ejemplos no taxativos de moléculas de siRNA que direccionan secuencias de ácido nucleico del virus de la hepatitis incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0281 175, 2005/0058982, y 2007/0149470; patente estadounidense n.° 7,348,314; y publicación de PCT n.° PCT/CA2010/000444, con el título “Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression,” ["Composiciones y métodos para silenciar la expresión del virus de la hepatitis C"] presentada el 19 de junio, 2010, con el número de expediente del representante 020801 -008910PC, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad y a todos los efectos.
Los genes asociados con las enfermedades metabólicas y los trastornos (por ejemplo, trastornos en donde el hígado es el objetivo y las enfermedades y trastornos hepáticas) incluyen, de modo no taxativo, genes expresados en displidemia, tal como, por ejemplo, apolipoproteína B (APOB) (número de acceso de Genbank NM_000384), apolipoproteína Clll (AP0C3) (número de acceso de Genbank NM_000040 y NG_008949 REGIÓN: 5001 ..8164), apolipoproteína E (APOE) (número de acceso de Genbank NM_000041 y NG_007084 REGIÓN: 5001..8612), proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) (número de acceso de Genbank NM_174936), diacilglicerol O-aciltransferasa tipo 1 (DGAT1 ) (número de acceso de Genbank NM_012079), diacilglicerol 0-aciltransferasa tipo 2 (DGAT2) (número de acceso de Genbank NM_032564), receptores de hígado X tales como LXRa y LXR (número de acceso de Genbank NM_007121 ), receptores de farnesoide X (FXR) (número de acceso de Genbank NM_005123), proteína de unión al elemento regulador de esterol (SREBP, por sus siglas en inglés), sitio 1 proteasa (S1 P), 3-hidroxi-3-metilglutarilo coenzima-A reductasa (HMG coenzima-A reductasa); y genes expresados en la diabetes, tales como, por ejemplo, glucosa 6-fosfatasa (ver, por ejemplo, Forman et al., Cell, 81 :687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol., 9:72 (1995), Zavacki et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:7909 (1997); Sakai et al., Cell, 85: 1037-1046 (1996); Duncan et al. J. Biol. Chem., 272.12778-12785 (1997); Willy et al., Genes Dev., 9: 1033-1045 (1995); Lehmann et al., J. Biol. Chem., 272:3137-3140 (1997); Janowski et al., Nature, 383:728-731 (1996); y Peet et al., Cell, 93:693-704 (1998)).
Un experto en la téenica observará que los genes asociados con las enfermedades y trastornos metabólicos (por ejemplo, enfermedades y trastornos en los que el hígado es el objetivo y enfermedades y trastornos hepáticos) incluyen genes que se expresan también en el propio hígado y genes expresados en otros órganos y tejidos. El silenciamiento de las secuencias que codifican genes asociados con trastornos y enfermedades metabólicas se pueden usar de manera conveniente en combinación con la administración de agentes convencionales usados para tratar las enfermedades o trastornos. Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan el gene APOB incluyen las descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0134189, 2006/0105976, y 2007/0135372, y la publicación PCT n.° WO 04/091515, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines. Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan el gene APOC3 incluyen las descritas en la solicitud PCT n.° PCT/CA2010/000120, presentada el 26 de enero de 2010, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines. Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan el gene PCSK9 incluyen las descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0173473, 2008/0113930, y 2008/0306015, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines. Las moléculas de siRNA que direccionan el gene DGAT1 se pueden diseñar usando los compuestos antisentido descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0185559, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Las moléculas de siRNA que direccionan el gene DGAT2 se pueden diseñar usando los compuestos antisentido descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0043524, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
Los genes asociados con la tumorigénesis o transformación celular (por ejemplo, cáncer u otra neoplasia) incluyen por ejemplo, genes implicados en la ubiquitinación p53, ubiquitinación c-Jun, deacetilación de histona, regulación del ciclo celular, regulación transcripcional y combinaciones de estos. Los ejemplos no taxativos de las secuencias de genes asociadas con la transformación celular o la tumorigénesis incluyen treonina/serina cinasas tales como la cinasa 1 tipo polo (PLK-1 ) (número de acceso de Genbank NM_005030; Barr et al. , Nat. Rev. Mol. Cell Biol. , 5:429-440 (2004)) y cinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4) (número de acceso de Genbank NM_000075); ligasas de ubiquitina tales como COP1 (RFWD2; número de acceso de Genbank NM_022457 y NM_001001 740) y la ring-box 1 (RBX1 ) (ROC1 ; número de acceso de Genbank NM_014248); ti ros i na cinasas tales como WEE1 (número de acceso de Genbank NM_003390 y NM_001 143976); cinesina mitótica tales como Eg5 (KSP, KIF1 1 ; número de acceso de Genbank NM_004523); factores de transcripción tal como forkhead box M1 (FOXM1 ) (número de acceso de Genbank NM_202002, NM_021 953, y NM_202003) y RAM2 (R1 o CDCA7L; número de acceso de Genbank NM_018719, NM_001127370, y NM_001127371 ); inhibidores de la apoptosis tal como XIAP (número de acceso de Genbank NM_001 167); subunidades de signalosoma COP9 tal como CSN1 , CSN2, CSN3, CSN4, CSN5 (JAB1 ; número de acceso de Genbank NM_006837); CSN6, CSN7A, CSN7B, y CSN8; y histonas deacetilasas tales como HDAC1 , HDAC2 (número de acceso de Genbank NM_001527), HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, etc.
Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan el gene PLK-1 incluyen las descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0107316, y 2007/0265438, y la publicación PCT n.° WO 09/082817, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines. Los ejemplos no taxativos de moléculas de siRNA que direccionan genes XIAP y Eg5 incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0149403, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Los ejemplos no taxativos de moléculas siRNA que direccionan el gene CSN5 incluyen los descritos en la publicación PCT n.° WO 09/129319, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Los ejemplos no taxativos de las moléculas de siRNA que direccionan los genes COP1 , CSN5, RBX1 , HDAC2, CDK4, WEE1 , FOXM1 , y RAM2 incluyen las descritas en la solicitud provisional de patente estadounidense n.° 61/245, 143, presentada el 23 de setiembre de 2009, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Los ejemplos adicionales de secuencias de genes asociadas con la tumorigénesis o transformación celular incluyen la translocación de secuencias tales como genes de fusión MLL, BCR-ABL (Wilda et al., Oncogene, 21 :5716 (2002); Scherr et al. , Blood, 101 : 1566 (2003)), TEL-AML1 , EWS-FL11 , TLS-FUS, PAX3-FKHR, BCL-2, AML1 -ETO, y AML1 -MTG8 (Heidenreich et al. , Blood, 101 :3157 (2003)); secuencias sobrexpresadas tales como genes de resistencia a múltiples fármacos (Nieth et al., FEBS Lett., 545: 144 (2003); Wu et ál, Cáncer Res. 63:1515 (2003)), cielinas (Li et al., Cáncer Res., 63:3593 (2003); Zou et al. , Genes Dev., 16:2923 (2002)), beta-catenina (Verma et al., Clin Cáncer Res., 9: 1291 (2003)), genes de telomerasa (Kosciolek et al., Mol Cáncer Ther., 2:209 (2003)), c-MYC, N-MYC, BCL-2, receptores del factor de crecimiento (por ejemplo, EGFR/ErbB1 (números de acceso de Genbank NM_005228, NM_201282, NM_201283, y NM_201284; ver también, Nagy et al. Exp. Cell Res., 285:39-49 (2003)), ErbB2/HER-2 (números de acceso de Genbank NM_004448 y NM_001005862), ErbB3 (números de acceso de Genbank NM_001982 y NM_001005915), y ErbB4 (números de acceso de Genbank NM_005235 y NM_001042599)), y secuencias mutadas tales como RAS (Tuschl y Borkhardt, Mol. Interventions, 2: 158 (2002)). Los ejemplos no taxativos de moléculas de siRNA que direccionan el gene de EGFR incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0149403, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Las moléculas de siRNA que direccionan los genes VEGFR se establecen en, por ejemplo, GB 2396864; la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0142895; y CA 2456444, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
El silenciamiento de las secuencias que codifican las enzimas de reparación de DNA encuentran utilidad en la combinación con la administración de agentes quimioterapéuticos (Collis et al., Cáncer Res., 63:1550 (2003)). Las proteínas que codifican genes asociados con la migración de tumores también direccionan secuencias de interés, por ejemplo, integrinas, selectinas y metaloproteinasas. Los ejemplos anteriores no son exclusivos. Los expertos en la téenica comprenderán que cualquier secuencia de genes parcial o completa que facilita o promueve la tumorigénesis o transformación celular, crecimiento tumoral o migración de tumores se puede incluir como una secuencia plantilla.
Los genes angiogenéticos son capaces de promover la formación de nuevos vasos. Los genes angiogénicos de interés particular incluyen, de modo no taxativo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Reich et al., Mol. Vis., 9:210 (2003)), factor de crecimiento placentario (PGF), VEGFR-1 (Flt-1 ), VEGFR-2 (KDR/Flk-1 ), y similares. Las moléculas de siRNA que direccionan genes de VEGFR se establecen, por ejemplo en GB 2396864; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0142895; y CA 2456444, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia a todos los efectos.
Los genes inmunomoduladores son genes que modulan una o más respuestas inmunitarias. Los genes de inmunomodulador de ejemplo incluyen (por ejemplo, TGF-a, TGF-b, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, CGF, GM-CSF, SCF, etc.), interleucinas (IL-2, IL-4, IL-12 (Hill et al., J. Immunol. , 171 :691 (2003)), IL-15, IL-18, IL-20, etc.), interferones (por ejemplo, IFN-a, IFN-b, IFN-g, etc.), y TNF. Los genes de Fas y ligando Fas también son secuencias que direccionan inmunomoduladores de interés (Song et al. , Nat. Med., 9:347 (2003)). Los genes que codifican moléculas de señalización secundaria en las células linfoides y hematopoyéticas también se incluyen en la presente invención, por 5 ejemplo, en las cinasas de la familia Tec tales como la tirosina cinasa de Bruton (Btk) (Heinonen et al. , FEBS Lett., 527:274 (2002)).
Los genes de ligando receptores de células incluyen ligandos que son capaces de unirse a receptores de superficie celular (por ejemplo, receptores citocina, receptores del factor de crecimiento, receptores con ío actividad tirosina cinasa, receptores acoplados a la proteína G, receptores de insulina, receptores EPO, etc.) para modular (por ejemplo, inhibir) la vía fisiológica en la que está involucrada el receptor (por ejemplo, la proliferación celular, tumorigénesis, transformación celular, mitogénesis, etc.). Los ejemplos no taxativos de genes de ligando de 15 receptores celulares incluyen citocinas (por ejemplo, TNF-a, interferones tales como IFN-a, IFN-b, y IFN-g, interleucinas tales como I L- 1 a , I L- 1 b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL- 23, IL-27, quimiocinas, etc.), factores de crecimiento (por ejemplo, EGF, HB-EGF, VEGF, PEDF, SDGF, bFGF, HGF, TGF-a, TGF-b, BMP1 -20 BMP15, PDGF, IGF, NGF, b-NGF, BDNF, NT3, NT4, GDF-9, CGF, G- CSF, GM-CSF, GDF-8, EPO, TPO, etc.), insulina, glucagón, ligandos de receptores acoplados a la proteína G, etc.
Las plantillas que codifican una expansión de las repeticiones de trinucleótidos (por ejemplo, repeticiones CAG) encuentran utilidad en el 25 silenciamiento de secuencias patogénicas en trastornos neurodegenerativos causados por la expansión de repeticiones de trinucleótidos, tales como la atrofia muscular espinobulbular y enfermedad de Huntington (Caplen et al. Hum Mol. Genet., 1 1 : 175 (2002)).
Además de su utilidad para silenciar la expresión de cualquiera de los genes antes descritos con fines terapéuticos, las siRNA descritas en la presente también son útiles para aplicaciones de investigación y desarrollo, y aplicaciones diagnósticas, profilácticas, de pronóstico, clínicas y de otras aplicaciones para el cuidado de la salud. Como un ejemplo no taxativo, las siRNA se pueden usar en los estudios de validación de objetivos dirigidos para analizar si un gene de interés tiene el potencial de ser un agente terapéutico. Las siRNA también se pueden usar en estudios de identificación de objetivo con el objetivo de descubrir genes como agentes terapéuticos potenciales. e) Modalidades de siRNA de ejemplo En algunas modalidades, dicha cadena de la molécula de siRNA comprende de alrededor de 15 a alrededor de 60 nucleótidos de longitud (por ejemplo, alrededor de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, o 19-25 nucleótidos de longitud, o 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, o 25 nucleótidos de longitud). En una modalidad particular, el siRNA está químicamente sintetizada. Las moléculas de siRNA de la invención son capaces de silenciar la expresión de una secuencia objetivo in vitro y/o in vivo.
En otras modalidades, el siRNA comprende al menos un n ucleótido modificado. En determinadas modalidades, el siRNA comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más nucleótidos modificados en la región de cadena doble. En modalidades particulares, menos de alrededor de 50 % (por ejemplo, menos de alrededor de 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, o 5 %) de los nucleótidos en la región de cadena doble de la siRNA comprenden nucleótidos modificados. En modalidades preferidas, de alrededor de 1 % a alrededor de 50 % (por ejemplo de alrededor de 5 %-50 %, 10 %-50 %, 15 %-50 %, 20 %-50 %, 25 %-50 %, 30 %-50 %, 35 %-50 %, 40 %-50 %, 45 %-50 %, 5 %-45 %, 10 %-45 %, 15 %-45 %, 20 %-45 %, 25 %-45 %, 30 %-45 %, 35 %-45 %, 40 %-45 %, 5 %-40 %, 10 %-40 %, 15 %-40 %, 20 %-40 %, 25 %-40 %, 30 %-40 %, 35 %-40 %, 5 %-35 %, 10 %-35 %, 15 %-35 %, 20 %-35 %, 25 %-35 %, 30 %-35 %, 5 %-30 %, 10 %-30 %, 15 %-30 %, 20 %-30 %, 25 %-30 %, 5 %-25 %, 10 %-25 %, 15 %-25 %, 20 %-25 %, 5 %-20 %, 10 %-20 %, 15 %-20 %, 5 %- 15 %, 10 %-15 %, o 5 %-10 %) de los nucleótidos en la región de cadena doble de el siRNA comprende nucleótidos modificados.
En modalidades adicionales, el siRNA comprende nucleótidos modificados que incluyen, de modo no taxativo, nucleótidos de 2’-O-metilo (2’OMe), nucleótidos de 2’-deoxi-2’-fluoro (2’F), nucleótidos de 2’-deoxi, nucleótidos de 2’-0-(2-metoxietilo) (MOE), nucleótidos de ácido nucleico bloqueados (LNA), y mezclas de estos. En modalidades preferidas, el siRNA comprende nucleótidos 2’OMe (por ejemplo, nucleótidos de pirimidina y/o purina de 2’OMe) tales como, por ejemplo, nucleótidos de guanosina de 2’OMe, nucleótidos de uridina de 2’OMe, nucleótidos de adenosina de 2’OMe, nucleótidos de citosina de 2’OMe o mezclas de estos. En una modalidad particular, el siRNA comprende al menos un nucleótido de guanosina de 2’OMe, nucleótido de uridina de 2’OMe o mezclas de estos. En determinados casos, el siRNA no comprende nucleótidos de citosina de 2’OMe. En otras modalidades, el siRNA comprende una estructura de bucle de horquilla.
En determinadas modalidades, el siRNA comprende nucleótido en una cadena (es decir, sentido o antisentido) o ambas cadenas de la región de cadena doble de la molécula de siRNA. Preferentemente, los nucleótidos de guanosina y/o uridina se modifican en posiciones selectivas en la región de cadena doble del dúplex de siRNA. Con respecto a las modificaciones de nucleótidos de uridina al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los nucleótidos de uridina la cadena de sentido y/o antisentido puede ser un nucleótido de uridina modificada tal como un nucleótido de uridina de 2'OMe. En algunas modalidades, cada nucleótido de uridina en la cadena de sentido y/o antisentido es un nucleótido de uridina de 2’OMe. Con respecto a las modificaciones de nucleótidos de guanosina al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los nucleótidos de guanosina de la cadena de sentido y/o antisentido puede ser un nucleótido de guanosina modificada tal como un nucleótido de guanosina de 2'OMe. En algunas modalidades, cada nucleótido de guanosina en la cadena de sentido y/o antisentido es un nucleótido de guanosina de 2’OMe.
En determinadas modalidades, se pueden modificar al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más motivos 5’-GU-3’ en una secuencia de siRNA, por ejemplo, introduciendo mal apareamientos para eliminar los motivos 5’-GU-3’ y/o introduciendo nucleótidos modificados tales como nucleótidos 2’OMe. Los motivos de 5’-GU-3’ pueden estar en la cadena de sentido, la cadena antisentido, o en ambas cadenas de la secuencia de siRNA. Los motivos 5’-GU-3’ pueden estar adyacentes entre sí, o alternativamente pueden estar separados por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 o más nucleótidos.
En algunas modalidades, una molécula de siRNA modificado es menos inmunoestimulatoria que una secuencia de siRNA no modificado. En dichas modalidades, la molécula de siRNA modificada con propiedades inmunoestimulatorias reducidas retiene ventajosamente la actividad de RNAi contra la secuencia objetivo. En otra modalidad, las propiedades inmunoestimulatorias de la molécula de siRNA modificado y su capacidad de silenciar la expresión génica objetivo se puede equilibrar u optimizar mediante la introducción de modificaciones de 2' OMe selectivas y mínimas dentro de la secuencia de siRNA tales como, por ejemplo, dentro de la región de cadena doble del dúplex de siRNA. En determinados casos, el siRNA modificado es al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100% menos inmunoestimulatoria que el siRNA no modificado correspondiente. Será evidente para los expertos en la téenica que las propiedades inmunoestimulatorias de la molécula de siRNA modificado y la molécula de siRNA no modificado correspondiente se puede determinar mediante, por ejemplo, la medición de los niveles de INF-a y/o IL-6 de alrededor de dos a alrededor de doce horas después de la administración sistémica en un mamífero o transfección de una célula respondedora de mamífero utilizando un sistema de administración a base de lípidos adecuados (tal como el sistema de administración de LNP descrito en la presente).
En otras modalidades, una molécula de siRNA modificado tiene un IC50 (es decir, concentración de inhibición máxima media) menor o igual a diez veces el siRNA no modificado correspondiente (es decir, el siRNA modificado tiene un IC50 menor o igual a diez veces la IC50 del siRNA no modificado correspondiente). En otras modalidades, el siRNA modificado tiene una IC50 menor o igual que las tres veces de la secuencia de siRNA no modificado correspondiente. En aún otras modalidades, el siRNA modificado tiene una IC50 menor o igual que las dos veces del siRNA no modificado correspondiente. Será fácilmente aparente para los expertos en la téenica que se puede una curva de respuesta de dosis y se pueden determinar fácilmente los valores de IC50 para el siRNA modificado y el siRNA no modificado correspondiente usando métodos conocidos para los expertos en la técnica.
En otra modalidad, una molécula de siRNA modificado o no modificado es capaz de silenciar al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de la expresión de la secuencia objetivo con relación a un control negativo (por ejemplo, solo amortiguador, una secuencia de siRNA que esté dirigida a un gene diferente, una secuencia de siRNA desalineada, etc.).
En aún otra modalidad, una molécula de siRNA modificada es capaz de silenciar al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 5 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de la expresión de la secuencia objetivo con relación a la secuencia de siRNA no modificado correspondiente ío En algunas modalidades, la molécula de siRNA no comprende modificaciones de estructura de fosfato, por ejemplo, en la cadena de sentido o antisentido de la región de cadena doble. En otras modalidades, la molécula de siRNA comprende una, dos, tres, cuatro o más modificaciones de estructura de fosfato, por ejemplo, en la cadena 15 de sentido o antisentido de la región de cadena doble. En modalidades preferidas, el siRNA no comprende modificaciones de estructura de fosfato.
En modalidades adicionales, el siRNA no comprende nucleótidos 2'-deox¡, por ejemplo, en la cadena de sentido y/o antisentido de la 20 región de cadena doble. En aún otras modalidades adicionales, el siRNA comprende uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos 2'-deoxi, por ejemplo, en la cadena de sentido o antisentido de la región de cadena doble. En modalidades preferidas, el siRNA no comprende nucleótidos 2'-deoxi. 25 En determinados casos, el nucleótido en el extremo 3' de la región de cadena doble en una cadena de sentido y/o antisentido no es un nucleótido modificado. En otros casos determinados, los nucleótidos cerca del extremo 3' (por ejemplo dentro de uno, dos, tres o cuatro nucleótidos del extremo 3') de la región de cadena doble en la cadena de sentido y/o antisentido no son nucleótidos modificados.
Las moléculas de siRNA descritas en la presente pueden tener excedentes de 3' de uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos en uno o ambos lados de la región de cadena doble o puede no tener excedentes (es decir, tener extremos romos) en uno o ambos lados de la región de cadena doble. En determinados casos, el excedente 3' en la cadena de sentido y/o antisentido comprende independientemente uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos modificados tales como nucleótidos 2'OMe y/o cualquier otro nucleótido modificado descrito en la presente o conocido en la téenica.
En modalidades particulares, los siRNA se administran usando un sistema portador tal como una partícula de lípido-ácido nucleico. En una modalidad preferida, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) una o más moléculas de siRNA; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este; y (c) un lípido no catiónico (por ejemplo, DPPC, DSPC, DSPE, y/o colesterol). En determinados casos, la partícula de lípido-ácido nucleico puede comprender además un lípido conjugado que evita la agregación de partículas (por ejemplo, PEG-DAA y/o POZ-DAA). 2. dsRNA de sustrato de Dicer Tal como se usa en la presente, el término "dsRNA de sustrato de Dicer" o "molécula de RNAi precursora" pretende incluir cualquier molécula precursora que se procese in vivo mediante Dicer para producir un siRNA activa que se incorpora al complejo RISC para la interferencia de RNA de un gene objetivo.
En una modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer tiene una longitud suficiente para que se procese mediante Dicer para producir una siRNA. De acuerdo con esta modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer comprende (i) una primera secuencia de oligonucleótido (también llamada la cadena de sentido) que tiene entre alrededor de 25 y alrededor de 60 nucleótidos de longitud (por ejemplo, alrededor de 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, o 25-30 nucleótidos de longitud), preferentemente entre alrededor de 25 y alrededor de 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud), y (ii) una segunda secuencia de oligonucleótidos (también llamada la cadena antisentido) que se híbrida a la primera secuencia en condiciones biológicas, tales como las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula. La segunda secuencia de oligonucleótido puede tener entre alrededor de 25 y alrededor de 60 nucleótidos de longitud (por ejemplo, alrededor de 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, o 25-30 nucleótidos de longitud), y tiene preferentemente entre alrededor de 25 y alrededor de 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud). Además, una región de una de las secuencias, particularmente de la cadena antisentido, del dsRNA de sustrato de Dicer tiene una longitud de secuencia de al menos alrededor de 19 nucleótidos, por ejemplo, de alrededor de 19 a alrededor de 60 nucleótidos (por ejemplo, alrededor de 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35, 19-30, o 19-25 nucleótidos) preferentemente de alrededor de 19 a alrededor de 23 nucleótidos (por ejemplo, 19, 20, 21 , 22, o 23 nucleótidos) que son lo suficientemente complementarios a una secuencia de nucleótidos de la RNA producido a partir del gene objetivo para desencadenar una respuesta de RNAi.
En una segunda modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer tiene varias propiedades que mejoran su procesamiento mediante Dicer. De acuerdo con esta modalidad, el dsRNA tiene una longitud suficiente para que se procese mediante un Dicer para producir un siRNA y tiene al menos una de las siguientes propiedades: (i) el dsRNA es asimétrico, por ejemplo, tiene un excedente de 3' en la cadena antisentido; y/o (¡i) el dsRNA tiene un extremo 3' modificado en la cadena de sentido para dirigir la orientación de la unión de Dicer y el procesamiento del dsRNA a un siRNA activo. De acuerdo con esta última modalidad, la cadena de sentido comprende a partir de alrededor de 22 a alrededor de 28 nucleótidos y la cadena antisentido comprende alrededor de 24 a alrededor de 30 nucleótidos.
En una modalidad, dsRNA de sustrato de Dicer tiene un excedente en el extremo 3' de la cadena antisentido. En otra modalidad, la cadena de sentido se modifica para el procesamiento y la unión de Dicer y mediante los modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la cadena de sentido. Los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, aciclonucleótidos, y similares, y las moléculas estéricamente impedidas tales como las moléculas fluorescentes y similares. Cuando se utilizan los modificadores nucleótidos reemplazan ribonucleótidos en el dsRNA de manera que la longitud del dsRNA no cambie. En otra modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer tiene un excedente en el extremo 3' de la cadena antisentido y la cadena de sentido se modifica para el procesamiento de Dicer. En otra modalidad, el extremo 5' de la cadena de sentido tiene un fosfato. En otra modalidad, el extremo 5' de la cadena antisentido tiene un fosfato. En otra modalidad, la cadena antisentido o la cadena de sentido o ambas cadenas tienen uno o más nucleótidos modificados de 2’-O-metilo (2’OMe). En otra modalidad, la cadena antisentido contiene nucleótidos modificados 2’OMe. En otra modalidad, la cadena antisentido contiene un excedente de 3' que está compuesto de nucleótidos modificados de 2’OMe. La cadena antisentido puede incluir también nucleótidos modificados 2’OMe adicionales. Las cadenas sentido y antisentido se hibridan en condiciones biológicas, tales como las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula. Además, una región de una de las secuencias, particularmente de la cadena antisentido, del dsRNA de sustrato de Dicer tiene una longitud de cadena de al menos 19 nucleótidos, donde estos nucleótidos se encuentran en la región con 21 nucleótidos adyacentes al extremo 3' de la cadena antisentido y son suficientemente complementarios a una secuencia de nucleótidos del RNA producida a partir del gene objetivo. Además, de acuerdo con esta modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer también puede tener una o más de las siguientes propiedades adicionales: (a) la cadena antisentido tiene un desplazamiento hacia la derecha de la 21 -mer típica (es decir, la cadena antisentido incluye nucleótidos en el lado derecho de la molécula cuando se compara con la 21 -mer típica); (b) las cadenas no tienen por qué ser completamente complementarias, es decir, las cadenas pueden contener mal apareamientos simples; y (c) modificaciones base tales como los ácidos nucleicos bloqueados pueden estar incluidos en el extremo 5' de la cadena de sentido. Én una tercera modalidad, la cadena de sentido comprende de alrededor de 25 a alrededor de 28 nucleótidos (por ejemplo, 25, 26, 27, o 28 nucleótidos), donde los 2 nucleótidos en el extremo 3' de la cadena de sentido son desoxirribonucleótidos. La cadena de sentido contiene un fosfato en el extremo 5'. La cadena de sentido comprende de alrededor de 26 a alrededor de 30 nucleótidos (por ejemplo, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos) y contiene un excedente 3' de 1 -4 nucleótidos. Los nucleótidos que comprenden el excedente 3' se modifican con ribonucleótidos modificados 2’OMe. La cadena antisentido contiene nucleótidos modificados de 2’OMe alternantes que comienzan en el primer monómero de la cadena antisentido adyacente al excedente 3', y se extiende 15-19 nucleótidos del primer monómero adyacente al excedente 3'. Por ejemplo, para una cadena antisentido de 27 nucleótidos y contando la primera base en el extremo 5' de la cadena antisentido como el número de posición 1 , las modificaciones de 2’OMe serían colocadas en las bases 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 26 y 27. En una modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer tiene la siguiente estructura: 5’-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3’ 3-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5’ donde “X” = RNA, “p" = un grupo fosfato, “X” = RNA de 2’OMe, “Y” es un dominio excedente compuesto de 1 , 2, 3, o 4 monómeros de RNA que opcionalmente son monómeros de RNA de 2’OMe y “D” = DNA. La cadena superior es la cadena de sentido, y la cadena inferior es la cadena antisentido.
En una cuarta modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer tiene varias propiedades que mejoran su procesamiento mediante Dicer. De acuerdo con esta modalidad, el dsRNA tiene una longitud suficiente para que se procese mediante un Dicer para producir un siRNA y tiene al menos una de las siguientes propiedades: (i) el dsRNA es asimetrico, por ejemplo, tiene un excedente de 3' en la cadena de sentido; y/o (ii) el dsRNA tiene un extremo 3' modificado en la cadena antisentido para dirigir la orientación de la unión de Dicer y el procesamiento de la dsRNA a un siRNA activo. De acuerdo con esta modalidad, la cadena de sentido comprende de alrededor de 24 a alrededor de 30 nucleótidos (por ejemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos) y la cadena antisentido comprende de alrededor de 22 a alrededor de 28 nucleótidos (por ejemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 nucleótidos). En una modalidad, dsRNA de sustrato de Dicer tiene un excedente en el extremo 3' de la cadena de sentido. En otra modalidad, la cadena antisentido se modifica para el procesamiento y la unión de Dicer y mediante los modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la cadena antisentido. Los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, aciclonucleótidos, y similares, y las moleculas estéricamente impedidas tales como las moléculas fluorescentes y similares. Cuando se utilizan los modificadores nucleótidos reemplazan ribonucleótidos en el dsRNA de manera que la longitud del dsRNA no cambie. En otra modalidad, el dsRNA tiene un excedente en el extremo 3' de la cadena de sentido y la cadena antisentido se modifica para el procesamiento de Dicer. En una modalidad, la cadena antisentido tienen un 5'- fosfato. Las cadenas sentido y antisentido se hibridan en condiciones biológicas, tales como las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula. Además, una región de una de las secuencias, particularmente de la cadena antisentido del dsRNA tiene una longitud de cadena de al menos 19 nucleótidos, donde estos nucleótidos están adyacentes al extremo 3' de la cadena antisentido y son suficientemente complementarios a una secuencia de nucleótidos del RNA producida a partir del gene objetivo. Además, de acuerdo con esta modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer también puede tener una o más de las siguientes propiedades adicionales: (a) la cadena antisentido tiene un desplazamiento hacia la izquierda de la 21 -mer típica (es decir, la cadena antisentido incluye nucleótidos en el lado izquierdo de la molécula cuando se compara con la 21 -mer típica); y (b) las cadenas no tienen por qué ser completamente complementarias, es decir, las cadenas pueden contener mal apareamientos simples.
En una modalidad preferida, el dsRNA de sustrato de Dicer tiene una estructura asimétrica, con la cadena de sentido con una longitud de 25 pares de base y la cadena de sentido con una longitud de 27 pares de base con un excedente 3' en la base 2. En determinados casos, ese dsRNA que tiene una estructura asimétrica comprende además 2 desoxinucleótidos en el extremo 3' de la cadena de sentido en lugar de dos de los ribonucleótidos. En otros casos determinados, ese dsRNA que tiene una estructura asimétrica contiene además modificaciones 2'OMe en las posiciones 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, y 25 de la cadena antisentido (donde la primera base en el extremo 5' de la cadena antisentido es la posición 1 ). En determinados casos adicionales, este dsRNA que tiene una estructura asimétrica contiene además un excedente 3' en la cadena antisentido que comprende 1 , 2, 3, o 4 nucleótidos de 2’OMe (por ejemplo, un excedente 3' de nucleótidos de 2’OMe en las posiciones 26 y 27 en la cadena antisentido).
En otra modalidad, el dsRNA de sustrato de Dicer se puede diseñar seleccionando primero una secuencia de siRNA de cadena antisentido que tiene una longitud de al menos 19 nucleótidos. En algunos casos, el siRNA antisentido está modificada para incluir alrededor de 5 a alrededor de 1 1 ribonucleótidos en el extremo 5’ para proporcionar una longitud de alrededor de 24 a alrededor de 30 nucleótidos. Cuando la cadena antisentido tiene una longitud de 21 nucleótidos, 3-9, se pueden agregar preferentemente 4-7, o más preferentemente 6 nucleótidos en el extremo 5’. Si bien los ribonucleótidos agregados pueden ser complementarios a la secuencia de genes objetivo, no es necesaria la complementariedad total entre la secuencia objetivo y el siRNA antisentido. Eso es, el siRNA antisentido resultante es suficientemente complementario con la secuencia objetivo. Luego se produce una cadena de sentido que tiene alrededor de 22 a alrededor de 28 nucleótidos. La cadena de sentido es prácticamente complementaria con la cadena antisentido para hibridarse a la cadena antisentido en condiciones biológicas. En una modalidad, la cadena antisentido se sintetiza para contener un extremo 3' modificado para dirigir el procesamiento de Dicer de la cadena antisentido. En otra modalidad, la cadena antisentido de la dsRNA tiene un excedente 3'. En una modalidad adicional, la cadena de sentido se sintetiza para contener un extremo 3' modificado para la unión y el procesamiento de Dicer y la cadena antisentido del dsRNA tiene un excedente 3'.
En una modalidad relacionada, el siRNA antisentido puede estar modificado para incluir alrededor de 1 a alrededor de 9 ribonucleótidos en el extremo 5' para proporcionar una longitud de alrededor de 22 a alrededor de 28 nucleótidos. Cuando la cadena antisentido tiene una longitud de 21 nucleótidos, se pueden agregar 1 -7, preferentemente 2-5 o más preferentemente 4 ribonucleótidos al extremo 3'. Los ribonucleótidos agregados pueden tener cualquier secuencia. Si bien los ribonucleótidos agregados pueden ser complementarios a la secuencia de genes objetivo, no es necesaria la complementariedad total entre la secuencia objetivo y el siRNA antisentido. Eso es, el siRNA antisentido resultante es suficientemente complementario con la secuencia objetivo.
Luego se produce una cadena de sentido que tiene alrededor de 24 a alrededor de 30 nucleótidos. La cadena de sentido es prácticamente complementaria con la cadena antisentido para hibridarse a la cadena antisentido en condiciones biológicas. En una modalidad, la cadena antisentido se sintetiza para contener un extremo 3' modificado para dirigir el procesamiento de Dicer. En otra modalidad, la cadena de sentido del dsRNA tiene un excedente 3'. En una modalidad adicional, la cadena antisentido se sintetiza para contener un extremo 3' modificado para la unión y el procesamiento de Dicer y la cadena de sentido del dsRNA tiene un excedente 3'.
Las secuencias de dsRNA de sustrato de Dicer adecuadas se pueden identificar, sintetizar y modificar usando cualquier medio conocido en la teenica para el diseño, síntesis y modificación de las secuencias de siRNA. En modalidades particulares, el dsRNA de sustrato de Dicer se administra usando un sistema portador tal como una partícula de lípido-ácido nucleico. En una modalidad preferida, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) una o más moléculas de dsRNA de sustrato de Dicer; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este; y (c) un lípido no catiónico (por ejemplo, DPPC, DSPC, DSPE, y/o colesterol). En determinados casos, la partícula de lípido-ácido nucleico puede comprender además un lípido conjugado que evita la agregación de partículas (por ejemplo, PEG-DAA y/o POZ-DAA).
Las modalidades adicionales relacionadas con el dsRNA de sustrato de Dicer de la invención, así como también métodos para diseñar y sintetizar dichos dsRNA se describen en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0244858, 2005/0277610 y 2007/0265220 y en la solicitud provisional estadounidense n.° 61/184,652, presentada el 5 de junio de 2009, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad a todos los 5 efectos. 3. shRNA Un "ARN de horquilla pequeña" o "ARN de horquilla corta" o "shRNA" incluye una secuencia de RNA corta que hace una vuelta de ío horquilla firme que se puede usar para silenciar la expresión génica mediante interferencia de RNA. Los shRNA de la invención se pueden sintetizar químicamente o transcribir de un casete de transcripción en un plásmido de DNA. La estructura de horquilla de shRNA se escinde por la maqumaria celular en siRNA que luego se une al complejo de 15 silenciamiento inducido por RNA (RISC, por sus siglas en inglés).
Los shRNA de la invención son típicamente de alrededor de 15-60, 15-50, o 15-40 (dúplex) nucleótidos de longitud, más típicamente alrededor de 15-30, 15-25, o 19-25 (dúplex) nucleótidos de longitud, y tienen preferentemente de alrededor de 20-24, 21 -22, o 21 -23 (dúplex) 20 nucleótidos de longitud (por ejemplo, cada secuencia complementaria del shRNA de cadena doble es de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, o 19-25 nucleótidos de longitud, preferentemente de alrededor de 20-24, 21 -22, o 21 -23 nucleótidos de longitud, y el shRNA de cadena doble es de alrededor de 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, o 19-25 pares de 25 base de longitud, preferentemente de alrededor de 18-22, 19-20, o 19-21 pares de base de longitud). Los dúplex de shRNA pueden comprender excedentes de 3’ de alrededor 1 a alrededor 4 nucleótidos o alrededor 2 a alrededor 3 nucleótidos en la cadena antisentido y/o extremos de 5'-fosfato en la cadena de sentido. En algunas modalidades, el shRNA comprende una secuencia de cadena antisentido y/o cadena de sentido de alrededor de 15 a alrededor de 60 nucleótidos de longitud (por ejemplo, alrededor de 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30, o 15-25 nucleótidos de longitud), preferentemente de alrededor de 19 a alrededor de 40 nucleótidos de longitud (por ejemplo, alrededor de 19-40, 19-35, 19-30, o 19-25 nucleótidos de longitud), más preferentemente de alrededor de 19 a alrededor de 23 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 19, 20, 21 , 22, o 23 nucleótidos de longitud).
Los ejemplos no taxativos del shRNA incluyen una molécula de polinucleótido de cadena doble ensamblada a partir de una molécula de cadena simple, donde las regiones sentido y antisentido están unidas mediante un enlazador basado en ácido nucleico o no basado en ácido nucleico; y una molécula de polinucleótido de cadena doble con una estructura secundaria de horquilla que tienen regiones antisentido y sentido autocomplementarias. En modalidades preferidas, las cadenas sentido y antisentido de los shRNA están unidas mediante una estructura de bucle que comprende de alrededor de 1 a alrededor de 25 nucleótidos, de alrededor de 2 a 20 nucleótidos, de alrededor de 4 a alrededor de 15 nucleótidos, de alrededor de 5 a alrededor de 12 nucleótidos o 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos.
Las secuencias de shRNA adecuadas se pueden identificar, sintetizar y modificar usando cualquier medio conocido en la téenica para el diseño, síntesis y modificación de las secuencias de siRNA. En modalidades particulares, los shRNA se administran usando un sistema portador tal como una partícula de lípido-ácido nucleico. En una modalidad preferida, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) una o más moléculas de shRNA; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este; y (c) un lípido no catiónico (por ejemplo, DPPC, DSPC, DSPE, y/o colesterol). En determinados casos, la partícula de lípido-ácido nucleico puede comprender además un lípido conjugado que evita la agregación de partículas (por ejemplo, PEG-DAA y/o POZ-DAA).
Las modalidades adicionales relacionadas con el shRNA de la invención, así como también métodos para diseñar y sintetizar dichos shRNA se describen en la solicitud provisional estadounidense n.° 61/184,652, presentada el 5 de junio de 2009, cuya descripción se incorpora a la presente mediante referencia en su totalidad a todos los efectos. 4. aiRNA Al igual que el siRNA, el RNA interferente asimétrico (aiRNA) puede reclutar el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) y producir un silenciamiento efectivo de una variedad de genes en células de mamífero mediante la mediación de la escisión específica de secuencias para la secuencia objetivo entre el nucleótido 10 y 11 con relación al extremo 5' de la cadena antisentido (Sun et al. , Nat. Biotech., 26:1379-1382 (2008)). Típicamente, una molécula de aiRNA comprende un dúplex de RNA corto que tiene una cadena de sentido y una cadena antisentido, donde el dúplex contiene excedentes en los extremos 3' y 5' de la cadena antisentido. El aiRNA es generalmente asimétrico porque la cadena de sentido es más corta en ambos extremos cuando se compara con la cadena de sentido complementaria. En algunos aspectos, las moléculas aiRNA se pueden diseñar, sintetizar y hibridar en condiciones similares a las usadas para las moléculas de siRNA. Como un ejemplo no taxativo, las secuencias de aiRNA se pueden seleccionar y generar usando los métodos descritos anteriormente para seleccionar las secuencias de siRNA.
En otra modalidad, los dúplexes de aiRNA de varias longitudes (por ejemplo, alrededor de 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, o 14-17 pares de bases, más típicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 pares de bases) se pueden diseñar con excedentes en los extremos 3' y 5' de la cadena antisentido para direccionar un mRNA de interés. En determinados casos, la cadena de sentido de la molécula aiRNA tiene de alrededor de 10-25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, o 14-17 nucleótidos de longitud, más típicamente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleótidos de longitud. En otros casos determinados, la cadena de sentido de la molécula aiRNA tiene de alrededor de 15-60, 15-50 o 15-40 nucleótidos de longitud, más típicamente alrededor de 15-30, 15-25, o 19-25 nucleótidos de longitud y es preferentemente de alrededor de 20-24, 21-22, o 21 -23 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, el excedente antisentido 5' contiene uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos que no dirigen (por ejemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc.). En otras modalidades, el excedente antisentido 3' contiene uno, dos, tres, cuatro o más nucleótidos que no dirigen (por ejemplo, "AA", "UU", "dTdT", etc.). En determinados aspectos, las moleculas de aiRNA descritas en la presente comprenden uno o más nucleótidos modificados, por ejemplo, en la región (dúplex) de cadena doble y/o en los excedentes antisentido. Como un ejemplo no taxativo, las secuencias de aiRNA pueden comprender uno o más de los nucleótidos modificados descritos anteriormente para las secuencias de siRNA. En una modalidad preferida, la molécula de aiRNA comprende nucleótidos de 2'OMe tales como, por ejemplo, nucleótidos de 2'OMe-guanosina, nucleótidos de 2'OMe-uridina, o mezclas de estos.
En determinadas modalidades, las moléculas de aiRNA pueden comprender una cadena antisentido que corresponde a la cadena antisentido de una molécula de siRNA, por ejemplo, una de las moléculas de siRNA descritas en la presente. En modalidades particulares, los aiRNA se administran usando un sistema portador tal como una partícula de lípido-ácido nucleico. En una modalidad preferida, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) una o más moléculas de aiRNA; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este; y (c) un lípido no catiónico (por ejemplo, DPPC, DSPC, DSPE, y/o colesterol). En determinados casos, la partícula de lípido-ácido nucleico puede comprender además un lípido conjugado que evita la agregación de partículas (por ejemplo, PEG-DAA y/o POZ-DAA).
Las secuencias de aiRNA adecuadas se pueden identificar, sintetizar y modificar usando cualquier medio conocido en la teenica para el diseño, síntesis y modificación de las secuencias de siRNA. Las modalidades adicionales relacionadas con las moléculas de aiRNA de la invención están descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0291 131 , y publicación PCT n.° WO 09/127060, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad para todo propósito. 5. miRNA Generalmente, las micro RNA (miRNA) son moléculas de RNA de cadena simple de alrededor de 21 -23 nucleótidos de longitud que regulan la expresión génica. Los miRNA están codificados por genes de cuyos DNA están trascritos, pero los miRNA no están traducidos en proteínas (ARN no codificante), en lugar de esto, cada transcripción primaria (un miRNA pri) se procesa en una estructura corta de tallo-bucle llamada una pre-miRNA y finalmente en una miRNA madura y funcional. Las moléculas de miRNA maduras son parcial o totalmente complementarias con una o más moléculas de RNA mensajero (mRNA) y su función principal es regular por disminución la expresión génica. La identificación de las moléculas de miRNA se describe, por ejemplo, en Lagos-Qumtana et al. , Science, 294:853-858; Lau et al., Science, 294:858-862; y Lee et al., Science, 294:862-864.
Los genes que codifican miRNA son mucho más largos que la molécula miRNA madura procesada. Los miRNA primero se transcriben como transcripciones primarias o miRNA pri con un casquete y una cola poli-A y se procesa en estructuras de tallo-bucle cortas de ~70 nucleótidos conocidas como los pre-miRNA en los núcleos celulares. Este proceso se realiza en animales mediante un complejo de proteínas conocido como el complejo Microprocesador, que consiste en la nucleasa Drosha y la proteína de unión de RNA de cadena doble Pasha (Denli et al., Nature, 432:231 -235 (2004)). Después, estos pre-miRNA se procesan para madurar el miRNA en el citoplasma mediante la interacción con el endonucleasa Dicer, que también inicia la formación del complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) (Bernstein et al., Nature, 409:363-366 (2001 ). Tanto la cadena de sentido como la cadena antisentido de DNA pueden funcionar como plantillas para dar lugar a miRNA.
Cuando Dicer escinde el tallo-bucle de pre-miRNA, se forman dos moléculas de RNA cortas complementarias, pero solo una se integra en el complejo RISC. Esta cadena se conoce como la cadena guía y se selecciona mediante la proteína argonauta, la RNasa catalíticamente activa en el complejo RISC, sobre la base de la estabilidad del extremo 5' (Preall et al. , Curr. Biol. , 16:530-535 (2006)). La cadena restante, conocida como la cadena pasajero o antiguía se degrada usando el sustrato de complejo de RISC (Gregory et al. , Cell, 123:631 -640 (2005)). Luego de la integración en el complejo RISC activo, los miRNA forman pares de bases con sus moléculas mRNA complementarias e inducen la degradación del mRNA objetivo y/o silenciamiento translacional.
Las moléculas de miRNA de mamífero son usualmente complementarias a un sitio en la 3' UTR de la secuencia de mRNA objetivo. En determinados casos, la hibridación de miRNA con el mRNA objetivo inhibe la translación de proteínas mediante el bloqueo de la maqumaria de traducción de proteínas. En otros casos determinados, la hibridación de miRNA con el mRNA objetivo facilita la escisión y degradación del mRNA objetivo mediante un proceso similar a la interferencia de RNA (RNAi). El miRNA también puede dirigir la metilación de sitios genómicos que corresponden al mRNA objetivo. Generalmente, la función de miRNA en asociación con un complemento de proteínas se llama colectivamente el miRNP.
En determinados aspectos, las moléculas de miRNA descritas en la presente son de alrededor de 15-100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, o 15-40 nucleótidos de longitud, más típicamente de alrededor de 15-30, 15-25, o 19-25 nucleótidos de longitud, y preferentemente alrededor de 20-24, 21 -22, o 21-23 nucleótidos de longitud. En otros aspectos determinados, las moléculas de miRNA pueden comprender uno o más nucleótidos modificados. Como un ejemplo no taxativo, las secuencias de miRNA pueden comprender uno o más de los nucleótidos modificados descritos anteriormente para las secuencias de siRNA. En una modalidad preferida, la molécula de miRNA comprende nucleótidos de 2'OMe tales como, por ejemplo, nucleótidos de 2'OMe-guanosina, nucleótidos de 2'OMe-uridina, o mezclas de estos.
En modalidades particulares, los miRNA se administran usando un sistema portador tal como una partícula de lípido-ácido nucleico. En una modalidad preferida, la partícula de lípido-ácido nucleico comprende: (a) una o más moléculas de miRNA; (b) un lípido catiónico de la Fórmula I o una sal de este; y (c) un lípido no catiónico (por ejemplo, DPPC, DSPC, DSPE, y/o colesterol). En determinados casos, la partícula de I í pido-ácido nucleico puede comprender además un lípido conjugado que evita la agregación de partículas (por ejemplo, PEG-DAA y/o POZ-DAA).
En otras modalidades, uno o más agentes que bloquean la actividad de un miRNA que se dirige a un mRNA de interés se administran usando una partícula de lípido de la invención (por ejemplo, una partícula de I i pido-ácido nucleico tal como LNP). Los ejemplos de agentes bloqueadores incluyen, de modo no taxativo, oligonucleótidos bloqueadores estéricos, oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueados y oligonucleótidos de morfolino. Tales agentes bloqueadores pueden unirse directamente al miRNA o al sitio de unión de miRNA en el mRNA objetivo.
Las modalidades adicionales relacionadas con las moléculas de miRNA de la invención están descritas en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0291 131 , y publicación PCT n.° WO 09/127060, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad para todo propósito. 6. Oligonucleótidos antisentido En una modalidad, el ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido dirigido a un gene o secuencia objetivo de interés. Los términos "oligonucleótido antisentido" o "antisentido" incluyen oligonucleótidos que son complementarios con una secuencia polinucleótida objetivo. Los oligonucleótidos antisentido son cadenas simples de DNA O RNA que son complementarias con una secuencia elegida. Los oligonucleótidos de RNA antisentido previenen la traducción de las cadenas de RNA complementarias mediante la unión al RNA. Los oligonucleótidos de DNA antisentido se pueden usar para dirigirse a un RNA específico, complementario (codificante o no codificante). Si ocurre la unión, este híbrido de ADN/ARN puede ser degradado por la enzima RNasa H. En una modalidad particular, los oligonucleótidos antisentido comprenden de alrededor de 10 a alrededor de 60 nucleótidos, más preferentemente de alrededor de 15 a alrededor de 30 nucleótidos. El término también abarca los oligonucleótidos antisentido que puede que no sean exactamente complementarios respecto al gene objetivo deseado. Por lo tanto, la invención se puede utilizar en instancias donde las actividades específicas que no son objetivo se encuentran con antisentido, o donde una secuencia antisentido que contiene uno o más mal apareamientos con la secuencia objetivo es la más preferida para un uso particular.
Se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido son eficaces y que se dirigían a inhibidores de síntesis de proteínas, y, consecuentemente, se pueden utilizar para inhibir específicamente la síntesis de proteínas mediante un gene objetivo. La eficacia de los oligonucleótidos antisentido para inhibir la síntesis de las proteínas está bien establecida. Por ejemplo, la síntesis de la poligalactauronasa y el receptor muscarínico de la acetilcolina tipo 2 son inhibidos por los oligonucleótidos antisentido dirigidos a sus secuencias mRNA respectivas (vease, la patente estadounidense n.° 5,739, 1 19 y 5,759,829). Además, los ejemplos de la inhibición antisentido han sido demostrados con la cielina de la proteína nuclear, el gene de resistencia múltiple a los fármacos (MDR1 ), ICAM-1 , E-selectina, STK-1 , receptor GABAA estriado, y EGF humano (véase, Jaskulski et al. , Science, 240: 1544-6 (1988); Vasanthakumar et al., Cáncer Commun. , 1 :225-32 (1989); Peris et al. , Brain Res Mol Brain Res. , 15;57:310-20 (1998); y las patentes estadounidenses n.° 5,801 ,154; 5,789,573; 5,718,709 y 5,610,288). Además, también se ha descrito que las construcciones antisentido inhiben y se pueden utilizar para tratar una variedad de proliferaciones celulares anormales, por ejemplo, cáncer (ver, patente estadounidense n.° 5,747,470; 5,591 ,317; y 5,783,683). La descripción de estas referencias se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
Los métodos para producir los oligonucleótidos antisentido son conocidos en la téenica y se pueden adaptar fácilmente para producir un oligonucleótido antisentido que se dirige a cualquier secuencia de polinucleótidos. La selección de secuencias de oligonucleótidos antisentido específicas para una secuencia objetivo dada se basa en el análisis de la secuencia objetivo elegida y la determinación de la estructura secundaria, Tm, la energía de unión y la estabilidad relativa. Los oligonucleótidos antisentido se pueden seleccionar en función de su incapacidad relativa para formar dímeros, horquillas, y otras estructuras secundarias que reducirían o prohibirían la unión específica al mRNA objetivo en una célula hospedadora. Las regiones objetivo más preferidas del mRNA incluyen aquellas regiones en o cerca del codón de inicio de la traducción de AUG y aquellas secuencias que son sustancialmente complementarias a las regiones 5’ de la mRNA. Estas consideraciones del análisis de la estructura secundaria y de la selección del sitio objetivo se pueden realizar, por ejemplo, utilizando el software OLIGO v.4 para los análisis de cebadores (Molecular Biology Insights) y/o el software de algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al. , Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)). 7. Ribozimas Conforme a otra modalidad de la invención, las partículas de ácido nucleico-lípidos están asociadas con las ribozimas. Las ribozimas son complejos de ARN-proteínas que tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad endonucleasa (véase, Kim et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 84:8788-92 (1987); y Forster et al., Cell, 49:211 -20 (1987)). Por ejemplo, una gran cantidad de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia fosfoéster con un alto grado de especificidad, lo cual escinde generalmente solo uno de varios fosfoésteres en un sustrato de oligonucleótidos (véase, Cech et al., Cell, 27:487-96 (1981 ); Michel et al., J. Mol. Biol. , 216:585-610 (1990); Reinhold-Hurek et al., Nature, 357: 173-6 (1992)). Esta especificidad se ha atribuido al requisito de que el sustrato se una, mediante interacciones de formación de pares de bases específicas, a una secuencia de guía interna ("IGS", por sus siglas en inglés) del ribozima antes de la reacción química.
Al menos seis variedades básicas de moléculas de RNA enzimáticas de origen natural son conocidas en la actualidad. Cada uno puede catalizar la hidrólisis de las uniones fosfodiester del RNA in trans (y por lo tanto puede escindir otras moléculas de RNA) en condiciones fisiológicas. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan uniéndose primero a un RNA objetivo. Tal unión ocurre a través de la parte de unión objetivo de un ácido nucleico enzimático que se mantiene cerca de una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el RNA objetivo. Por lo tanto, el ácido nucleico enzimático primero reconoce y luego une un RNA objetivo mediante la formación de bases complementarias, y una vez unidas al sitio correcto, actúan enzimáticamente para cortar el RNA objetivo. La escisión estratégica de dicho RNA destruirá su capacidad de dirigir la síntesis de una proteína codificada. Luego de que un ácido nucleico enzimático ha unido y escindido su RNA objetivo, se libera de ese RNA para buscar otro objetivo y puede unir y escindir repetidamente nuevos objetivos.
La molécula de ácido nucleico enzimática se puede formar un motivo de cabeza de martillo, horquilla, virus de la hepatitis d, intrón del grupo I o RNA de RNasa P (asociado con una secuencia de guía de RNA), o RNA de Neurospora VS, por ejemplo. Ejemplos específicos de los motivos de cabeza de martillo están descritos en, por ejemplo, Rossi et al., Nucleic Acids Res. , 20:4559-65 (1992). Los ejemplos motivos de horquilla están descritos en, por ejemplo, EP 0360257, Hampel et al., Biochemistry, 28:4929-33 (1989); Hampel et al. , Nucleic Acids Res. , 18:299-304 (1990); y la patente estadounidense n.° 5,631 ,359. Un ejemplo del motivo del virus de la hepatitis d se describe en, por ejemplo, Perrotta et al., Biochemistry, 31 :11843-52 (1992). Un ejemplo del motivo de RNasa P se describe en, por ejemplo, Guerrier-Takada et al., Cell, 35:849-57 (1983). Los ejemplos del motivo de la ribozima de RNA de Neurospora VS está descrita en, por ejemplo, Saville et al., Cell, 61 :685-96 (1990); Saville et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8826-30 (1991 ); Collins et al., Biochemistry, 32:2795-9 (1993). Un ejemplo del intrón del Grupo I está descrito en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4,987,071. Las características importantes de las moleculas de ácido nucleico enzimático utilizadas conforme a la invención son que tienen un sitio de unión de sustrato específico que es complementario a uno o más de las regiones de DNA o RNA del gene objetivo, y que tienen secuencias de nucleótidos dentro de o rodeando ese sitio de unión de sustrato que imparte una actividad de escisión de RNA a la molécula. Por lo tanto, las construcciones de ribozimas no tienen por qué estar limitadas a motivos específicos mencionados en la presente. La descripción de estas referencias se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
Los métodos para producir una ribozima dirigida a cualquier secuencia de polinucleótidos son conocidos en la téenica. Las ribozimas pueden estar diseñadas tal como se describen en, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 93/23569 y WO 94/02595, y sintetizadas para ser sometidas a prueba ¡n vitro y/o in vivo tal como se describen allí. La descripción de estas publicaciones PCT se incorporan a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
La actividad de las ribozimas se puede optimizar al alterar la longitud de los grupos de unión de ribozimas o de las ribozimas que se sintetizan químicamente con modificaciones que previenen su degradación mediante ribonucleasas de suero (véase, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 92/07065, WO 93/15187, WO 91/03162, y WO 94/13688; EP 92110298.4; y la patente estadounidense n.° 5,334,711 , que describe varias modificaciones químicas que se pueden hacer a los restos de azúcar de moléculas de RNA enzimáticas, cuya descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines), modificaciones que aumentan su eficacia en células, y la eliminación de bases de células madre II para acortar los tiempos de la síntesis del RNA y reducir los requisitos químicos. 8. Oligonucleótidos inmunoestimuladores Los ácidos nucleicos asociados con las partículas de lípidos de la presente invención pueden ser inmunoestimuladores, que incluyen oligonucleótidos inmunoestimuladores (ISS; de cadena simple o doble) capaces de inducir una respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto, que puede ser un mamífero tal como un ser humano. Los ISS incluyen, por ejemplo, determinados palíndromos que llevan a estructuras secundarias horquilla (véase, Yamamoto et al., J. Immunol., 148:4072-6 (1992)), o motivos CpG, así como otras características de ISS conocidas (tal como dominios multi-G; véase, la publicación PCT n.° WO 96/11266, la cual se incorpora en su totalidad a la presente a todos los efectos mediante esta referencia).
Se considera que los ácidos nucleicos inmunoestimuladores no son específicos de la secuencia cuando no se requiere que se unan y reduzcan específicamente la expresión de una secuencia objetivo para provocar una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, determinados ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden comprender una secuencia correspondiente a una región de un gene o mRNA de origen natural, pero aún pueden ser considerados ácidos nucleicos inmunoestimuladores no específicos de la secuencia.
En una modalidad, el ácido nucleico u oligonucleótido inmunoestimulador comprende al menos un dinucleótido CpG. El oligonucleótido o dinucleótido CpG puede estar metilado o sin metilar. En otra modalidad, el ácido nucleico inmunoestimulador comprende al menos un dinucleótido CpG que tienen una citosina metilada. En una modalidad, el ácido nucleico comprende un único dinucleótido CpG, donde la citosina en el dinucleótido CpG está metilada. En una modalidad alternativa, el ácido nucleico comprende al menos dos dinucleótidos CpG, donde al menos una citosina en los dinucleótidos CpG está metilada. En una modalidad adicional, cada citosina en los dinucleótidos CpG presente en la secuencia está metilada. En otra modalidad, el ácido nucleico comprende una pluralidad de dinucleótidos CpG, donde al menos uno de los dinucleótidos CpG comprende una citosina metilada. Ejemplos de oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para usar en las composiciones y métodos de la presente invención están descritos en la publicación PCT n.° WO 02/069369, WO 01/15726, y WO 09/086558; patente estadounidense n.° 6,406,705; y Rancy et al., J. Pharm. Exper. Ther. , 298: 1185-92 (2001 ), cuyas descripciones se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos. En determinadas modalidades, los oligonucleótidos utilizados en las composiciones y métodos de la invención tienen una estructura fosfodiéster (“PO”) o una estructura fosforotioato (“PS”), y/o al menos un residuo de citosina metilada en un motivo CpG.
B. Otros agentes activos En determinadas modalidades, el agente activo asociado con las partículas de lípidos de la invención pueden comprender una o más proteínas, polipéptidos o compuestos o moléculas orgánicas pequeñas terapéuticos. Ejemplos no taxativos de tales agentes o fármacos terapéuticamente eficaces incluyen fármacos oncológicos (por ejemplo, fármacos de quimioterapia, agentes terapéuticos hormonales, agentes inmunoterapéuticos, agentes radioterapéuticos, etc.), agentes reductores de lípidos, fármacos antivirales, compuestos antiinflamatorios, antidepresivos, estimulantes, analgésicos, antibióticos, medicación anticonceptiva, antipiréticos, vasodilatadores, antiangiogénicos, agentes citovasculares, inhibidores de transducción de señal, fármacos cardiovasculares tales como agentes antiarrítmicos, hormonas, vasoconstrictores y esteroides. Estos agentes activos se pueden administrar solos en las partículas de lípidos de la invención, o en combinación (por ejemplo, administrado conjuntamente) con partículas de lípidos de la invención que comprenden ácido nucleico tal como RNA interferente.
Ejemplos no taxativos de fármacos quimioterapéuticos incluyen fármacos a base de platino (por ejemplo, oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes alquilantes (por ejemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, busulfán, melfalán, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), anti-metabolitos (por ejemplo, 5-fluorouracil (5-FU), azatioprina, metotrexato, leucovorin, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, pemetrexed, raltitrexed, etc.), alcaloides vegetales (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorrelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (taxol), docetaxel, etc.), inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, irinotecán (CPT-11 ; Camptosar), topotecán, amsacrina, etopósido (VP16), fosfato de etopósido, tenipósido, etc.), antibióticos antitumor (por ejemplo, doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc.), inhibidores de la tirosina cinasa (por ejemplo, gefitinib (Iressa®), sunitinib (Sutent®; SU1 1248), erlotinib (Tarceva®; OSI-1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinib (Cl 1033), semaxinib (SU5416), vatalanib (PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), imatinib (Gleevec®; STI571 ), dasatinib (BMS-354825), leflunomida (SU101 ), vandetanib (Zactima™; ZD6474), etc.), sales farmacéuticamente aceptables de estos, esteroisómeros de estos, derivados de estos, análogos de estos, y combinaciones de estos.
Ejemplos de agentes terapéuticos hormonales convencionales incluyen, de modo no taxativo, esteroides (por ejemplo, dexametasona), finasterida, inhibidores de aromatasa, tamoxifeno, y goserelina así como otros agonistas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH, por sus siglas en ingles).
Ejemplos de agentes inmunoterapéuticos convencionales incluyen, de modo no taxativo, inmunoestimuladores (por ejemplo, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), levamisol, interleucina-2, interferón alfa, etc.), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD20, anti-HER2, anti-CD52, anti-HLA-DR, y anti-VEGF), inmunotoxinas (por ejemplo, conjugado de anticuerpo monoclonal-caliqueamicina anti-CD33, conjugado de anticuerpo monoclonal-exotoxina de pseudomonas anti-CD22, etc.), y radiommunoterapia (por ejemplo, anticuerpo monoclonal anti-CD20 conjugado a 1111 n , 90Y, o 131l, etc.).
Ejemplos de agentes radioterapéuticos convencionales incluyen, de modo no taxativo, radionúclidos tales como 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111ln, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At y 212B¡, opcionalmente conjugado con anticuerpos dirigidos contra antígenos de tumor.
Fármacos oncológicos adicionales que se pueden utilizar conforme a la invención incluyen, de modo no taxativo, alquerano, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozola, araC, trióxido de arsénico, bexaroteno, biCNU, carmustina, CCNU, celecoxib, cladribina, ciclosporina A, citosina arabinosida, citoxán, dexrazoxano, DTIC, estramustina, exemestano, FK506, gemtuzumab-ozogamicina, hidrea, hidroxiurea, idarrubicina, interferón, letrozol, leustatina, leuprolida, litretinoína, megastrol, L-PAM, mesna, metoxsaleno, mitramicina, mostaza de nitrógeno, pamidronato, Pegademasa, pentostatina, sodio de porfímero, prednisona, rituxán, estreptozocina, STI-571 , taxotero, temozolamida, VM-26, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrrubicina y velbán. Otros ejemplos de fármacos oncológicos que se pueden utilizar conforme a la invención son la elipticina y los análogos o derivados de la elipticina, epotilonas, inhibidores de la cinasa intracelular, y camptotecinas.
Los ejemplos no taxativos de agentes reductores de lípidos para tratar una enfermedad o trastorno lípido asociado con triglicéridos elevados, colesterol y/o glucosa incluyen estatinas, fibratos, ezetimina, tiazolidinedionas, niacina, bloqueador beta, nitroglicerina, antagonistas de calcio, aceite de pescado, y mezclas de estos.
Ejemplos de fármacos antivirales incluyen, de modo no taxativo, abacavir, acyclovir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, arbidol, atazanavir, atripla, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, inhibidores de entrada, famciclovir, combinaciones de dosis fijas, fomivirsen, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, inhibidores de fusión, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidores de la integrasa, interferón de tipo III (por ejemplo, moléculas IFN-l tales como IFN-A1 , IFN-A2 e IFN-A3), interferón tipo II (por ejemplo, IFN-g), interferón tipo I (por ejemplo, IFN-a tal como IFN-a, IFN-b, I FN-K, IFN-d, IFN-e, I FN-T, IFN-w, y IFN-z PEGilado), interferón, lamivudina, lopinavir, lovirida, MK-0518, maraviroc, moroxidina, nelfinavir, nevirapina, nexavir, análogos de nucleósidos, oseltamivir, penciclovir, peramivir, pleconaril, podofilotoxina, inhibidores de proteasa, inhibidores de transcriptasa inversa, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saqumavir, estavudina, mejoradores sinérgicos, tenofovir, disoproxilo de tenofovir, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina, sales farmacéuticamente aceptables de estos, esteroisómeros de estos, derivados de estos, análogos de estos y mezclas de estos.
V. Partículas lipídicas En determinados aspectos, la presente invención proporciona partículas de lípidos que comprenden uno o más lípidos catiónicos (amino) o sales de estos descritos en la presente. En algunas modalidades, las partículas de lípidos de la invención comprenden además uno o más lípidos no catiónicos. En otras modalidades, las partículas de lípidos comprenden además uno o más lípidos conjugados capaces de reducir o inhibir la agregación de partículas. En modalidades adicionales, las partículas de lípidos comprenden además uno o más agentes activos o agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos terapéuticos (por ejemplo, RNA interferente tal como siRNA).
Las partículas de lípidos incluyen, de modo no taxativo, vesículas de lípidos tales como liposomas. Tal como se usa en la presente, una vesícula de lípidos incluye una estructura que tiene membranas que contienen lípidos que rodean un interior acuoso. En modalidades particulares, las vesículas de lípidos que comprenden uno o más de los lípidos catiónicos descritos en la presente se utilizan para encapsular ácidos nucleicos dentro de las vesículas de lípidos. En otras modalidades, las vesículas de lípidos que comprenden uno o más de los lípidos catiónicos descritos en la presente se ligan con ácidos nucleicos para formar lipoplexos.
Las partículas de lípidos de la invención típicamente comprenden un agente activo o agente terapeutico, un lípido catiónico, un lípido no catiónico, y un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas. En algunas modalidades, el agente activo o agente terapéutico está completamente encapsulado dentro de la parte de lípido de la partícula del lípido de manera que el agente activo o agente terapéutico en la partícula del lípido sea resistente en una solución acuosa a la degradación enzimática, por ejemplo, mediante una nucleasa o proteasa. En otras modalidades, las partículas de lípidos son sustancialmente no tóxicas para los mamíferos tales como los seres humanos. Las partículas de lípidos de la invención típicamente tienen un diámetro medio de alrededor de 30 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 40 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 130 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 1 10 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 90 nm. Las partículas de lípidos de la invención también tienen típicamente una relación lípido:agente terapéutico (por ejemplo, I í pido : ácido nucleico) (relación de masa/masa) de alrededor de 1 :1 a alrededor de 100: 1 , de alrededor de 1 : 1 a alrededor de 50: 1 , de alrededor de 2: 1 a alrededor de 25:1 , de alrededor de 3: 1 a alrededor de 20: 1 , de alrededor de 5: 1 a alrededor de 15: 1 , o de alrededor de 5: 1 a alrededor de 10: 1.
En modalidades preferidas, las partículas de lípidos de la invención son partículas de ácido nucleico-lípido estables en suero (LNP) que comprende un RNA interferente (por ejemplo, siRNA, dsRNA de sustrato de Dicer, shRNA, aiRNA, y/o miRNA), un lípido catiónico (por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos de la Fórmula I o sales de estos tal como se establecen en la presente), un lípido no catiónico (por ejemplo, mezclas de uno o más fosfolípidos y colesterol), y un lípido conjugado que inhibe la agregación de las partículas (por ejemplo, uno o más conjugados de PEG-lípidos y/o POZ-lípidos). El LNP puede comprender al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más moléculas de RNA interferente modificadas o no modificadas. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se describen en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,753,613; 5,785,992; 5,705,385; 5,976,567; 5,981 ,501 ; 6,1 10,745; y 6,320,017; y la publicación PCT n.° WO 96/40964, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
En las partículas de ácido nucleico-lípido de la invención, el ácido nucleico puede estar totalmente encapsulado dentro de la parte lipídica de la partícula, protegiendo de esta manera el ácido nucleico de la degradación nucleasa. En modalidades preferidas, un LNP que comprende un ácido nucleico tal como un RNA interferente está completamente encapsulado dentro de la parte lipídica de la partícula, protegiendo de esta manera el ácido nucleico de la degradación nucleasa. En determinados casos, el ácido nucleico en el LNP no está sustancialmente degradado luego de la exposición de la partícula a una nucleasa a 37 °C por al menos alrededor de 20, 30, 45, o 60 minutos. En otras instancias determinadas, el ácido nucleico en el LNP no está sustancialmente degradado luego de la incubación de la partícula en suero a 37°C por al menos alrededor de 30, 45, o 60 minutos o al menos alrededor de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, o 36 horas. En otras modalidades, el ácido nucleico está ligado con la parte lipídica de la partícula. Uno de los beneficios de las formulaciones de la presente invención es que las composiciones de la partícula de lípido-ácido nucleico son sustancialmente no tóxicas para los mamíferos tales como los seres humanos.
El término "completamente encapsulado" indica que el ácido nucleico en el partícula de lípido-ácido nucleico- no se degrada de forma significativa luego de la exposición al suero o a un ensayo de nucleasa que degradaría de forma significativa el DNA o RNA libre. En un sistema completamente encapsulado, preferentemente menor que alrededor de 25 % del ácido nucleico en la partícula se degrada en un tratamiento que normalmente degradaría el 100 % del ácido nucleico libre, más preferentemente se degrada menos que alrededor de 10 %, y más preferentemente menos que alrededor de 5 % del ácido nucleico en la partícula. "Completamente encapsulado" también indica que las partículas de ácido nucleico-lípido son estables en suero, esto es, que no se descomponen rápidamente en sus partes de componentes luego de la administración in vivo.
En el contexto de ácidos nucleicos, una encapsulación completa se puede determinar al realizar un ensayo de exclusión con tinta fluorescente impermeable a la membrana, que utiliza una tinta que tiene fluorescencia aumentada cuando está asociada con un ácido nucleico. Las tintas específicas tales como OliGreen® y RiboGreen® (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA) se encuentran disponibles para la determinación cuantitativa de DNA plásmido, desoxirribonucleótidos de cadena simple, y/o ribonucleótidos de cadena simple o doble. La encapsulación se determina al agregar la tinta a una formulación liposomal, se mide la fluorescencia resultante, y se compara con la fluorescencia observada luego de la adición de una pequeña cantidad de detergente no iónico. La interrupción mediada por detergente de la bicapa liposomal libera el ácido nucleico, lo que permite interactuar con la tinta impermeable a la membrana. La encapsulación de ácido nucleico se puede calcular como E = (l0 - l)/l0, donde I e l0 se refieren a las intensidades de fluorescencia antes y después de la adición de detergente (véase, Wheeler et al., Gene Ther. , 6:271 -281 (1999)).
En otras modalidades, la presente invención proporciona una composición de partícula de ácido nucleico-lípido (por ejemplo, LNP) que comprende una pluralidad de partículas de ácido nucleico-lípido.
En algunas instancias, la composición LNP comprende ácidos nucleicos que están completamente encapsulados dentro de la parte lipídica de las partículas, de modo que de alrededor de 30 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 40 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 50 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 60 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 70 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 80 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 90 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 30 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 40 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 50 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 60 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 70 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 80 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 85 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 90 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 30 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 40 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 50 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 60 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 70 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 80 % a alrededor de 90 %, o al menos alrededor de 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % (o cualquier fracción de esta o intervalo de este) de las partículas tienen el ácido nucleico encapsulado allí.
En otras instancias, la composición LNP comprende ácidos nucleicos que están completamente encapsulados dentro de la parte lipídica de las partículas, de modo que de alrededor de 30 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 40 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 50 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 60 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 70 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 80 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 90 % a alrededor de 100 %, de alrededor de 30 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 40 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 50 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 60 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 70 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 80 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 85 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 90 % a alrededor de 95 %, de alrededor de 30 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 40 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 50 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 60 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 70 % a alrededor de 90 %, de alrededor de 80 % a alrededor de 90 %, o al menos alrededor de 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % (o cualquier fracción de esta o intervalo de este) del ácido nucleico ingresado se encuentra encapsulado en las partículas.
Dependiendo del uso que se le pretende dar a las partículas de lípidos de la invención, las proporciones de los componentes se pueden variar y la eficacia de administración de una formulación particular se puede medir utilizando, por ejemplo, un ensayo de parámetros de liberación endosomal (ERP, por sus siglas en ingles).
En modalidades particulares, la presente invención proporciona una composición de partícula de lípido (por ejemplo, LNP) que comprende múltiples partículas de lípidos descritos en la presente y un antioxidante. En determinados casos, el antioxidante en la composición de la partícula de lípido reduce, previene y/o inhibe la degradación de un lípido catiónico presente en la partícula de lípido. En instancias donde el agente activo es un ácido nucleico terapéutico tal como un RNA interferente (por ejemplo, siRNA), el antioxidante en la composición de la partícula de lípido reduce, previene y/o inhibe la degradación de la carga del ácido nucleico, por ejemplo, al reducir, prevenir, y/o inhibir la formación de aductos entre el ácido nucleico y el lípido catiónico. Ejemplos no taxativos de antioxidantes incluyen antioxidantes hidrofílicos tales como agentes quelantes (por ejemplo, quelantes metálicos tales como ácido etílendiaminatetracetico (EDTA), citrato, y similares), antioxidantes lipofílicos (por ejemplo, isómeros de vitamina E, polifenoles, y similares), sales de estos; y mezclas de estos. Si se necesita, el antioxidante está típicamente presente en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir y/o reducir la degradación del lípido catiónico y/o agente activo presente en la partícula, por ejemplo, al menos alrededor de 20 mM EDTA o una sal de esta, o al menos alrededor de 100 mM de citrato o una sal de este. Un antioxidante tal como EDTA y/o citrato se puede incluir en cualquier etapa o en múltiples etapas en el proceso de formación de la partícula de lípido descrita en la Sección VI (por ejemplo, antes de, durante y/o luego de la formación de la partícula de lípido).
Modalidades adicionales relacionadas con métodos para prevenir la degradación de lípidos catiónicos y/o agentes activos (por ejemplo, ácidos nucleicos terapéuticos) presentes en partículas de lípidos, composiciones que comprenden partículas de lípidos estabilizadas por estos métodos, métodos para elaborar estas partículas de lípidos, y métodos para administrar y proporcionar estas partículas de lípidos están descritas en la solicitud de patentes internacional n.° PCT/CA2010/001919, titulada “SNALP Formulations Containing Antioxidants” [Formulaciones SNALP que contienen antioxidantes], presentada el 1 de diciembre de 2010, cuya descripción se incorpora a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
A. Lípidos catiónicos Cualquiera de los lípidos catiónicos novedosos de la Fórmula I o sales de estos que se establecen en la presente se pueden utilizar en las partículas de lípidos de la presente invención (por ejemplo, LNP), ya sea solo o en combinación con uno o más de otras especies de lípidos catiónicos o especies de lípidos no catiónicos.
Otros lípidos catiónicos o sales de estos que también pueden estar incluidos en la presente invención incluyen, de modo no taxativo, 1.2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (D Un DMA), 1 ,2-dilinoleniloxi- N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1 ,2-di-Y-linoleniloxi-/\/,/\/-dimetilaminopropano (g-DLenDMA), 1 ,2-dilinoleiloxi-(N,N-dimet¡l)-butil-4-amina (C2-DLinDMA), 1 ,2-dilinoleoiloxi-(N,N-dimetil)-butil-4-amina (C2-DLinDAP), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA; también conocido como “XTC2” o “C2K”), 2,2-dilinoleil-4-(3-dimetilaminopropil)-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA; “C3K”), 2,2-dilinoleil-4-(4-dimetilaminobutil)-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA; “C4K”), 2,2-dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1 ,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2.2-dilinoleil-4-N-metilpepiazino-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 2,2-dioleoil-4-dimetilaminometil-[1 ,3]-dioxolano (DO-K-DMA), 2,2-diestearoil-4-dimetilaminometil-[1 ,3]-dioxolano (DS-K-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N-morfolino-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-MA), cloruro de 2,2-Dilinoleil-4-trimetilamino-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K-TMA.CI), 2,2-dilinoleil-4,5- bis(dimetilaminometil)-[1 ,3]-dioxolano (DLin-K2-DMA), 2 , 2-dili noleil-4-metilpiperz¡na-[1 ,3]-dioxolano (D-Lin-K-N-metilpiperzina), butanoato de (6Z,9Z,28Z,31 Z)-heptatriaconta-6,9,28,31 -tetraen-19-il 4-(dimetilamino) (DLin-M-C3-DMA; “MC3”), dilinoleilmetil-3-dimetilaminopropionato (DLin-M-C2-DMA; también conocido como DLin-M-K-DMA o DLin-M-DMA), 1 ,2-dioeilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DO-C-DAP), 1 ,2-dimiristoleoil-3-dimetilaminopropano (DMDAP), cloruro de 1 ,2-dioleoil-3-trimetilaminopropano (DOTAP.CI), 1 ,2-dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1 ,2-dilinoleioxi-3- (dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1 ,2-dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1 ,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1 ,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1 -linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1 ,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.CI), sal de cloruro de 1 ,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.CI), 1 ,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1 ,2-propanediol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1 ,2-propanedio (DOAP), 1 ,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibután-4-oxi)-1 -(cis,cis-9, 12-octadecadienoxy)propano (CLinDMA), 2-[5’-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3’-oxapentoxi)-3- imeti-1-(cis,cis-9’,1 -2’-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (DMOBA), 1 ,2-N,N’-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1 ,2-N,N’-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DLincarbDAP), cloruro de N,N-dioleil-N,N- dimetilamonio (DODAC), 1 ,2-dioleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DODMA), 1 ,2-disteariloxi-N, N-dimetilaminopropano (DSDMA), cloruro de N-(1 -(2,3-dioleiloxi)prop¡l)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1 -(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), 3 -(N-(N’,N’-dimetilaminoetano)-carbamoil)colesterol (DC-Chol), bromuro de amonio de N-(1 ,2-dim¡ristiloxiprop-3-il)-N,N-d¡metil-N-hidroxietilo (DMRIE), 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1 -propanaminiotrifluoroacetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), análogos de estos, y mezclas de estos.
Lípidos catiónicos adicionales o sales de estos que pueden estar presentes en las partículas de lípidos descritas en la presente incluyen lípidos catiónicos novedosos tales como CP-LenMC3, CP-y-LenMC3, CP-MC3, CP-DLen-C2K-DMA, CP-yDLen-C2K-DMA, CP-C2K-DMA, CP-DODMA, CP-DPetroDMA, CP-DLinDMA, CP-DLenDMA, CP-yDLenDMA, análogos de estos, y combinaciones de estos. Los lípidos catiónicos adicionales o sales de estos que pueden estar presentes en las partículas de lípidos descritas en la presente incluyen análogos MC3 tales como LenMC3, y-LenMC3, MC3MC, MC2C, MC2MC, MC3 Tioéster, MC3 Éter, MC4 Éter, MC3 Alqumo, MC3 Amida, Pan-MC3, Pan-MC4, Pan-MC5, y combinaciones de estos. Lípidos catiónicos adicionales o sales de estos que pueden estar presentes en las partículas de lípidos descritas en la presente incluyen los lípidos catiónicos novedosos descritos en la solicitud de patente internacional n.° PCT/CA2010/001029, titulada “Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids” ["Lípidos catiónicos mejorados y metodos para la administración de ácidos nucleicos"], presentada el 30 de junio, 2010. Lípidos catiónicos adicionales o sales de estos que pueden estar presentes en las partículas de lípidos descritas en la presente incluyen los lípidos catiónicos descritos en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2009/0023673. La descripción de cada una de estas patentes se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
En algunas modalidades, el lípido catiónico adicional forma una sal (preferentemente una sal cristalina) con uno o más aniones. En otra modalidad particular, el lípido catiónico adicional es la sal de oxalato (por ejemplo, hemioxalato) de este, que es preferentemente una sal cristalina.
La síntesis de los lípidos catiónicos tales como DLinDMA y DLenDMA, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0083780, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La síntesis de lípidos catiónicos tales como g-DLenDMA, C2-DLinDMA y C2-DLinDAP, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la solicitud de patente internacional n.° PCT/CA2010/001029, titulada “Improved Cationic Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids” [Lípidos catiónicos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos], presentada el 30 de junio, 2010, cuya descripción se incorpora a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
La síntesis de los lípidos catiónicos tales como DLin-K-DMA, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la publicación PCT n.° WO 09/086558, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La síntesis de los lípidos catiónicos tales como DLin-K-C2-DMA, DLin-K-C3-DMA, DLin-K-C4-DMA, DLin-K6-DMA, DLin-K-MPZ, DO-K-DMA, DS-K-DMA, DLin-K-MA, DLin-K-TMA.CI, DLin-K2-DMA, D-Lin-K-N-metilpiperzina, DLin-M-C2-DMA, DO-C-DAP, DMDAP, y DOTAP.CI, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la publicación PCT n.° WO 2010/042877, titulada “Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery of Nucleic Acids” [Amino lípidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos"], presentada el 9 de octubre de 2009, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La síntesis de DLin-M-C3-DMA, así como los lípidos catiónicos adicionales, se describen, por ejemplo, en la solicitud provisional estadounidense n.° 61/384,050, presentada el 17 de setiembre de 2010, titulada “Novel Cationic Lipids and Methods of Use Thereof” [Lípidos catiónicos novedosos y método para su uso], cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La síntesis de los lípidos catiónicos tales como DLin-C-DAP, DLinDAC, DLinMA, DLinDAP, DLin-S-DMA, DLin-2-DMAP, DLinTMA.CI, DLinTAP.CI, DLinMPZ, DLinAP, DOAP y DLin-EG-DMA, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la publicación PCT n.° WO 09/086558, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La síntesis de los lípidos catiónicos tales como CLinDMA, así como lípidos catiónicos adicionales, se describe en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2006/0240554, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La síntesis de una cantidad de otros lípidos catiónicos y análogos relacionados se ha descrito en la patente estadounidense n.° 5,208,036; 5,264,618; 5,279,833; 5,283, 185; 5,753,613; y 5,785,992; y en la publicación PCT n.° WO 96/10390, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines. De manera adicional, se pueden utilizar una cantidad de preparaciones comerciales de lípidos catiónicos, tales como, por ejemplo, LIPOFECTIN® (que incluye DOTMA y DOPE, disponible en GIBCO/BRL); LIPOFECTAMINE® (que incluye DOSPA y DOPE, disponible en GIBCO/BRL); y TRANSFECTAM® (que incluye DOGS, disponible en Promega Corp.).
En algunas modalidades, el lípido catiónico comprende de alrededor de 50 % molar a alrededor de 90 % molar, de alrededor de 50 % molar a alrededor de 85 % molar, de alrededor de 50 % molar a alrededor de 80 % molar, de alrededor de 50 % molar a alrededor de 75 % molar, de alrededor de 50 % molar a alrededor de 70 % molar, de alrededor de 50 % molar a alrededor de 65 % molar, de alrededor de 50 % molar a alrededor de 60 % molar, de alrededor de 55 % molar a alrededor de 65 % molar, o de alrededor de 55 % molar a alrededor de 70 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total 5 presente en la partícula. En modalidades particulares, el lipido catiónico comprende alrededor de 50 % molar, 51 % molar, 52 % molar, 53 % molar, 54 % molar, 55 % molar, 56 % molar, 57 % molar, 58 % molar, 59 % molar, 60 % molar, 61 % molar, 62 % molar, 63 % molar, 64 % molar, o 65 % molar (o cualquier fracción de estos) del lípido total presente en ío la partícula.
En otras modalidades, el lípido catiónico comprende de alrededor de 2 % molar a alrededor de 60 % molar, de alrededor de 5 % molar a alrededor de 50 % molar, de alrededor de 10 % molar a alrededor de 50 % molar, de alrededor de 20 % molar a alrededor de 50 % molar, de 15 alrededor de 20 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 40 % molar, o de alrededor de 40 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula.
Porcentajes e intervalos adicionales de lípidos catiónicos 20 adecuados para utilizar en las partículas de lípidos de la presente invención están descritas, por ejemplo, en la publicación PCT n.° WO 09/127060, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
Debe entenderse que el porcentaje del lípido catiónico presente 25 en las partículas de lípidos de la invención es una cantidad objetivo, y que la cantidad real del I í pido catiónico presente en la formulación puede variar, por ejemplo, en ± 5 % molar. Por ejemplo, en la formulación de partícula de lípido 1 :57 (por ejemplo, LNP), la cantidad objetivo de lípido catiónico es 57, 1 % molar, pero la cantidad real de lípido catiónico puede ser ± 5 % molar, ± 4 % molar, ± 3 % molar, ± 2 % molar, ± 1 % molar, ± 0,75 % molar, ± 0,5 % molar, ± 0,25 % molar, o ± 0, 1 % molar de la cantidad objetivo, donde el equilibrio de la formulación está hecho de otros componentes lípidos (agregando hasta 100 % molar del total de lípidos presentes en la partícula).
B. Lípidos no catiónicos Los lípidos no catiónicos utilizados en las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) pueden ser cualquiera de una variedad de lípidos sin carga, zwitteriónicos o aniónicos capaces de producir un complejo estable.
Ejemplos no taxativos de lípidos no catiónicos incluyen fosfolípidos tales como lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatid Metan olamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de huevo (ESM), cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), pal m itoi loleoi I-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleiol- fosfatidilglicerol (POPG), dioleoilfosfatidiletanolamina 4- (N- maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxilato (DOPE-mal), dipalm itoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), I isofosfatid ¡Icol i na, dilinoleoilfosfatidilcolina, y mezclas de estos. También se pueden utilizar otros fosfolípidos de diacilfosfatidilcolina y diacílfosfatidiletanolamina. Los grupos acilo en estos lípidos son preferentemente grupos acilo derivados de ácidos grasos que tienen cadenas de carbono C10-C24, por ejemplo, lauroilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo u oleoilo.
Ejemplos adicionales de lípidos no catiónicos incluyen esteróles tales como colesterol y derivados de estos. Ejemplos no taxativos de derivados de colesterol incluyen análogos polares tales como Sa colestanol, éter de db-coprostanol, colesteril-(2’-hidroxi)-etilo, éter colesteri l-(4’-hidroxi)-buti lo , y 6-cetocolestanol; análogos no polares tales como 5a-colestano, colestenona, 5a-colestanona, 5 -colestanona, y decanoato de colesterilo; y mezclas de estos. En modalidades preferidas, el derivado de colesterol es un análogo polar tal como éter de colesteril-(4’-hidroxi)-butilo. La síntesis de éter de colesteril-(2’-hidroxi)-etilo descritos en la publicación PCT n.° WO 09/127060, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
En algunas modalidades, el lípido no catiónico presente en las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) comprende o consiste en una mezcla de uno o más fosfolípidos y colesterol o un derivado de estos. En otras modalidades, el lípido no catiónico presente en las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) comprende o consiste en una mezcla de uno o más fosfolípidos, por ejemplo, una formulación de partícula de lípido libre de colesterol. En aún otras modalidades, el lípido no catiónico presente en las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) comprende o consiste en una mezcla de uno o más fosfolípidos, por ejemplo, una formulación de partícula de lípido libre de colesterol.
Otros ejemplos de lípidos no catiónicos adecuados para utilizar en la presente invención incluyen lípidos que no contienen fósforo tales como, por ejemplo, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, acetil palmitato, glicerolricinoleato, hexadecil estereato, isopropil miristato, polímeros acrílicos anfotéricos, lauril sulfato de trietanolamina, sulfato de alquil-arilo, amidas de ácidos grasos polietiloxilados, bromuro de dioctadecildimetil amonio, ceramida, esfingomielina, y similares.
En algunas modalidades, el lípido no catiónico comprende de alrededor de 10 % molar a alrededor de 60 % molar, de alrededor de 20 % molar a alrededor de 55 % molar, de alrededor de 20 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 20 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 25 % molar a alrededor de 50 % molar, de alrededor de 25 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 50 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 35 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 37 % molar a alrededor de 42 % molar, o alrededor de 35 % molar, 36 % molar, 37 % molar, 38 % molar, 39 % molar, 40 % molar, 41 % molar, 42 % molar, 43 % molar, 44 % molar, o 45 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula.
En modalidades donde las partículas de lípidos contienen una mezcla de fosfolípidos y colesterol o un derivado de colesterol, la mezcla puede comprender hasta alrededor de 40 % molar, 45 % molar, 50 % molar, 55 % molar, o 60 % molar del lípido total presente en la partícula.
En algunas modalidades, el componente fosfolípido en la mezcla puede comprender de alrededor de 2 % molar a alrededor de 20 % molar, de alrededor de 2 % molar a alrededor de 15 % molar, de alrededor de 2 % molar a alrededor de 12 % molar, de alrededor de 4 % molar a alrededor de 15 % molar, o de alrededor de 4 % molar a alrededor de 10 % molar, (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula. En determinadas modalidades preferidas, el componente fosfolípido en la mezcla comprende de alrededor de 5 % molar a alrededor de 10 % molar, de alrededor de 5 % molar a alrededor de 9 % molar, de alrededor de 5 % molar a alrededor de 8 % molar, de alrededor de 6 % molar a alrededor de 9 % molar, de alrededor de 6 % molar a alrededor de 8 % molar, de alrededor de 5 % molar, 6 % molar, 7 % molar, 8 % molar, 9 % molar, o 10 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula. Como ejemplo no taxativo, una formulación de partícula de lípido 1 :57 que comprende una mezcla de fosfolípidos y colesterol puede comprender un fosfolípido tal como DPPC o DSPC a alrededor de 7 % molar (o cualquier fracción de estos), por ejemplo, en una mezcla con colesterol o un derivado de colesterol a alrededor de 34 % molar (o cualquier fracción de estos) del total de lípidos presentes en la partícula. Como otro ejemplo no taxativo, una formulación de partícula de lípido 7:54 que comprende una mezcla de fosfolípidos y colesterol puede comprender un fosfolípido tal como DPPC o DSPC a alrededor de 7 % molar (o cualquier fracción de estos), por ejemplo, en una mezcla con colesterol o un derivado de colesterol a alrededor de 32 % molar (o cualquier fracción de estos) del total de lípidos presentes en la partícula.
En otras modalidades, el componente colesterol en la mezcla puede comprender de alrededor de 25 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 25 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 27 % molar a alrededor de 37 % molar, de alrededor de 25 % molar a alrededor de 30 % molar, o de alrededor de 35 % a alrededor de 40 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula. En determinadas modalidades preferidas, el componente colesterol en la mezcla comprende de alrededor de 25 % molar a alrededor de 35 % molar, de alrededor de 27 % molar a alrededor de 35 % molar, de alrededor de 29 % molar a alrededor de 35 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 35 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 34 % molar, de alrededor de 31 % molar a alrededor de 33 % molar, o alrededor de 30 % molar, 31 % molar, 32 % molar, 33 % molar, 34 % molar, o 35 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula. Típicamente, una formulación de partícula de lípido 1 :57 que comprende una mezcla de 5 fosfolípidos y colesterol puede comprender colesterol o un derivado de colesterol a alrededor de 34 % molar (o cualquier fracción de estos), por ejemplo, en una mezcla con un fosfolípido tal como DPPC o DSPC a alrededor de 7 % molar (o cualquier fracción de estos) del total de lípidos presentes en la partícula. Típicamente, una formulación de ío partícula de lípido 7:54 que comprende una mezcla de fosfolípidos y colesterol puede comprender colesterol o un derivado de colesterol a alrededor de 32 % molar (o cualquier fracción de estos), por ejemplo, en una mezcla con un fosfolípido tal como DPPC o DSPC a alrededor de 7 % molar (o cualquier fracción de estos) del total de lípidos presentes en 15 la partícula.
En modalidades donde las partículas de lípidos están libres de fosfolípidos, el colesterol o un derivado de colesterol puede comprender hasta alrededor de 25 % molar, 30 % molar, 35 % molar, 40 % molar, 45 % molar, 50 % molar, 55 % molar, o 60 % molar del lípido total presente 20 en la partícula.
En algunas modalidades, el colesterol o derivado de este en la formulación de la partícula de lípido libre de fosfolípido puede comprender de alrededor de 25 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 25 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 30 25 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 40 % molar, de alrededor de 31 % molar a alrededor de 39 % molar, de alrededor de 32 % molar a alrededor de 38 % molar, de alrededor de 33 % molar a alrededor de 37 % molar, de alrededor de 35 % molar a alrededor de 45 % molar, de alrededor de 30 % molar a alrededor de 35 % molar, de alrededor de 35 % molar a alrededor de 40 % molar, o alrededor de 30 % molar, 31 % molar, 32 % molar, 33 % molar, 34 % molar, 35 % molar, 36 % molar, 37 % molar, 38 % molar, 39 % molar, o 40 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula. A modo de ejemplo no taxativo, una formulación de la partícula de lípido 1 :62 puede comprender colesterol a alrededor de 37 % molar (o cualquier fracción de este) del lípido total presente en la partícula. A modo de otro ejemplo no taxativo, una formulación de la partícula de lípido 7:58 puede comprender colesterol a alrededor de 35 % molar (o cualquier fracción de este) del lípido total presente en la partícula.
En otras modalidades, el lípido no catiónico comprende de alrededor de 5 % molar a alrededor de 90 % molar, de alrededor de 10 % molar a alrededor de 85 % molar, de alrededor de 20 % molar a alrededor de 80 % molar, de alrededor de 10 % molar (por ejemplo, fosfolípido solo), o alrededor de 60 % molar (por ejemplo, fosfolípido y colesterol o derivados de estos) (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula.
Porcentajes e intervalos adicionales de lípidos no catiónicos adecuados para utilizar en las partículas de lípidos de la presente invención están descritas, por ejemplo, en la publicación PCT n.° WO 09/127060, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
Debe entenderse que el porcentaje del lípido no catiónico presente en las partículas de lípidos de la invención es una cantidad 5 objetivo, y que la cantidad real del lípido no catiónico presente en la formulación puede variar, por ejemplo, en ± 5 % molar. Por ejemplo, en la formulación de la partícula de lípido 1 :57 (por ejemplo, LNP), la cantidad objetivo de fosfolípido es 7,1 % molar y la cantidad objetivo de colesterol es de 34,3 % molar, pero la cantidad real de lípido puede ser ío ± 2 % molar, ± 1 ,5 % molar, ± 1 % molar, ± 0,75 % molar, ± 0,5 % molar, ± 0,25 % molar, o ± 0, 1 % molar de esa cantidad objetivo, y la cantidad real de colesterol puede ser ± 3 % molar, ± 2 % molar, ± 1 % molar, ± 0,75 % molar, ± 0,5 % molar, ± 0,25 % molar, o ± 0, 1 % molar de la cantidad objetivo, donde el equilibrio de la formulación está hecha de 15 otros componentes lípidos (agregando hasta 100 % molar del total de lípidos presentes en la partícula). De manera similar, en la formulación de la partícula de lípido 7:54 (por ejemplo, LNP), la cantidad objetivo de fosfolípido es 6,75 % molar y la cantidad objetivo de colesterol es de 32,43 % molar, pero la cantidad real de lípido puede ser ± 2 % molar, ± 20 1 ,5 % molar, ± 1 % molar, ± 0,75 % molar, ± 0,5 % molar, ± 0,25 % molar, o ± 0, 1 % molar de esa cantidad objetivo, y la cantidad real de colesterol puede ser ± 3 % molar, ± 2 % molar, ± 1 % molar, ± 0,75 % molar, ± 0,5 % molar, ± 0,25 % molar, o ± 0, 1 % molar de la cantidad objetivo, donde el equilibrio de la formulación está hecha de otros 25 componentes lípidos (agregando hasta 100 % molar del total de lípidos presentes en la partícula).
C. Conjugados de lípidos Además de los lípidos catiónicos y no catiónicos, las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) pueden comprender además un conjugado lípido. El lípido conjugado es útil dado que previene la agregación de partículas. Los lípidos conjugados adecuados incluyen, de modo no taxativo, conjugados de lípidos PEG, conjugados de lípidos POZ, conjugados de lípidos ATTA, conjugados de catiónicos-polímeros-lípidos (CPL) y mezclas de estos. En determinadas modalidades, las partículas comprenden ya sea un conjugado PEG-lípido o un conjugado de lípido ATTA junto con un CPL.
En una modalidad preferida, el conjugado lípido es un lípido PEG. Ejemplos de lípidos PEG incluyen, de modo no taxativo, PEG acoplado a dialquiloxipropilos (PEG-DAA) tal como se describe en, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 05/026372, PEG acoplado a diacilglicerol (PEG-DAG) tal como se describe en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2003/0077829 y 2005/008689, PEG acoplado a fosfolípidos tales como fosfatidiletanolamina (PEG-PE), PEG conjugado a ceramidas tal como se describe en, por ejemplo, patente estadounidense n.° 5,885,613, PEG conjugado a colesterol o un derivado de este, y mezclas de estos. La descripción de estos documentos de patentes se incorporan a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia. Los lípidos PEG adicionales adecuados para utilizar en la invención incluyen, de modo no taxativo, mPEG2000-1 ,2-di-O-alquil-sn3-carbomoilglicérido (PEG-C-DOMG). La síntesis de PEG-C-DOMG está descrito en la publicación PCT n.° WO 09/086558, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Conjugados de lípidos PEG adecuados adicionales incluyen, de modo no taxativo, 1-[8’-(1 ,2-dimiristoM-3-propanox¡)-carboxamido-3’,6’-dioxaoctan i l]carbamoil-oo-meti l-poli (eti le ngl icol) (2KPEG-DMG). La síntesis de 2KPEG-DMG está descrito en la patente estadounidense n.° WO 7,404,969, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
PEG es un polímero lineal, soluble en agua de unidades de repetición de PEG etileno con dos grupos de extremo hidroxilo. Los PEG se clasifican por sus pesos moleculares; por ejemplo, PEG 2000 tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2000 daltons, y PEG 5000 tiene un peso molecular promedio de alrededor de 5000 daltons. Los PEG se encuentran comercialmente disponibles en Sigma Chemical Co. y otras compañías e incluyen, de modo no taxativo, los siguientes: monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH), monometoxipolietilenglicol-succinato (MePEG-S), monometoxipolietilenglicol-succinimidil succinato (MePEG-S-NHS), monometoxipolietilenglicol-amina (MePEG-NH2), monometoxipolietilenglicol-tresilato (MePEG-TRES), monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM), así como tales compuestos que contienen un grupo hidroxilo terminal en vez de un grupo metoxi terminal (por ejemplo, HO-PEG-S, HO-PEG-S-NHS, HO-PEG-NH2, etc.). Otros PEG tales como aquellos descritos en las patentes estadounidenses n.° 6,774, 180 y 7,053, 150 (por ejemplo, mPEG (20 KDa) amina) tambien son útiles para preparar los conjugados de lípidos PEG de la presente invención. La descripción de estas patentes se incorporan a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia. Además, el monometoxipolietileneglicol-ácido acético (MePEG-CH2COOH) es particularmente útil para preparar conjugados de lípidos PEG que incluyen, por ejemplo, conjugados PEG-DAA.
El resto PEG de los conjugados de lípidos PEG descritos en la presente pueden comprender un peso molecular promedio que varía de alrededor de 550 daltons a alrededor de 10.000 daltons. En determinados casos, el resto PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 750 daltons a alrededor de 5000 daltons (por ejemplo, de alrededor de 1000 daltons a alrededor de 5000 daltons, de alrededor de 1500 daltons a alrededor de 3000 daltons, de alrededor de 750 daltons a alrededor de 3000 daltons, de alrededor de 750 daltons a alrededor de 2000 daltons, etc.). En modalidades preferidas, el resto PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 daltons a alrededor de 750 daltons.
En determinados casos, el PEG puede estar opcionalmente sustituido por un grupo alquilo, alcoxi, acilo o arilo. El PEG se puede conjugar directamente al lípido o se puede unir al lípido mediante un resto enlazador. Se puede utilizar cualquier resto enlazador adecuado para acoplar el PEG a un lípido, incluyendo, por ejemplo, restos enlazadores que no contienen éster y restos enlazadores que contienen éster. En una modalidad preferida, el resto enlazador es un resto enlazador que no contiene éster. Tal como se usa en la presente, el término "resto enlazador que no contiene éster" se refiere a un resto enlazador que no contiene un enlace de éster carboxílico (-OC(O)-). Los restos enlazadores adecuados que no contienen éster incluyen, de modo no taxativo, amido (-C(O)NH-), amino (-NR-), carbonilo (-C(O)-), carbamato (-NHC(O)O-), urea (-NHC(O)NH-), disulfuro (-S-S-), éter (-O-), succinilo (-(0)CCH2CH2C(O)-), succinamidilo (-NHC(O)CH2CH2C(0)NH-), éter, disulfuro, así como combinaciones de estos (tal como un enlazador que contiene ambos, un resto enlazador carbamato y un resto enlazador amido). En una modalidad preferida, un enlazador carbamato se utiliza para acoplar el PEG al lípido.
En otras modalidades, un resto enlazador que contiene éster se utiliza para acoplar el PEG al lípido. Los restos enlazadores adecuados que contienen éster incluyen, por ejemplo, carbonato (-OC(O)O-), succinoilo, fosfato ésteres (-O-(O)POH-O-), ésteres de sulfonato, y combinaciones de estos.
Las fosfatidiletanolaminas que tienen una variedad de grupos de cadena de acilo de longitudes de cadena y grados de saturación variables se pueden conjugar a PEG para formar el conjugado de lípidos. Tales fosfatidiletanolaminas se encuentran comercialmente disponibles, o se pueden aislar o sintetizar utilizando téenicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Se prefieren las fosfatidil-etanolaminas que contienen ácidos grasos saturados o insaturados con longitudes de cadena de carbono en el rango de C10 to C2o- También se pueden utilizar fosfatidiletanolaminas con ácidos grasos mono- o diinsaturados y mezclas de ácidos grasos saturados y insaturados. Fosfatidiletanolaminas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), y distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE).
El término “ATTA” o “poliamida” incluye, de modo no taxativo, compuestos descritos en las patentes estadounidenses n.° 6,320,017 y 6,586,559, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Estos compuestos incluyen un compuesto que tiene la fórmula: (II) donde R es un miembro que se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y acilo; R1 es un miembro que se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo; u opcionalmente, R y R1 y el nitrógeno al que están unidos forman un resto azido; R2 es un miembro del grupo que se selecciona de hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y una cadena lateral de un aminoácido; R3 es un miembro que se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, alcoxi, mercapto, hidrazino, amino y NR4R5, donde R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo; n es 4 a 80; m es 2 a 6; p es 1 a 4; y q es 0 o 1. Será evidente para los expertos en la teenica que otros poliamidas se pueden utilizar en los compuestos de la presente invención.
El término “diacilglicerol” o “DAG” incluye un compuesto que tiene dos cadenas de acilos grasos, R1 y R2, donde ambos tienen independientemente entre 2 y 30 carbonos unidos a la posición 1 y 2 de glicerol mediante enlaces de éster. Los grupos acilo pueden estar saturados o pueden tener varios grados de insaturación. Los grupos acilo adecuados incluyen, de modo no taxativo, lauroilo (C 2), miristoilo (C14), palmitoilo (C 16) , estearoilo (Ci8), e icosoilo (C2o)· En modalidades preferidas, R1 y R2 son lo mismo, es decir, R1 y R2 son ambos miristoilo (es decir, dimiristoilo), R1 y R2 son ambos estearoilo (es decir, diestearoilo), etc. Los diacilgliceroles tienen la siguiente fórmula general: (III).
El término “dialquiloxipropilo” o “DAA” incluye un compuesto que tiene 2 cadenas de alquilo, R1 y R2, donde ambas tienen independientemente entre 2 y 30 carbonos. Los grupos alquilo pueden estar saturados o pueden tener varios grados de insaturación. Los dialquiloxipropilos tienen la siguiente fórmula general: En una modalidad preferida, el lípido PEG es un conjugado de PEG-DAA que tiene la siguiente fórmula: (v) , donde R1 y R2 se seleccionan independientemente y son grupos alquilo de cadena larga que tienen entre alrededor de 10 a alrededor de 22 átomos de carbono; PEG es un polietilenglicol; y L es un resto enlazador que no contiene un áster o un resto enlazador que contiene un áster tal como se describe anteriormente. Los grupos alquilo de cadena larga pueden ser saturados o insaturados. Los grupos alquilo adecuados incluyen, de modo no taxativo, decilo (Cío), laurilo (Ci2), miristilo (C14), palmitilo (C16), estearilo (C18), e icosilo (C2o)· En modalidades preferidas, R1 y R2 son lo mismo, es decir, R1 y R2 son ambos miristilo (es decir, dimiristilo), R1 y R2 son ambos estearilo (es decir, diestearilo), etc.
En la Fórmula V anterior, el PEG tiene un peso molecular promedio que varía de alrededor de 550 daltons a alrededor de 10.000 daltons. En determinados casos, el PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 750 daltons a alrededor de 5000 daltons (por ejemplo, de alrededor de 1000 daltons a alrededor de 5000 daltons, de alrededor de 1500 daltons a alrededor de 3000 daltons, de alrededor de 750 daltons a alrededor de 3000 daltons, de alrededor de 750 daltons a alrededor de 2000 daltons, etc.). En modalidades preferidas, el PEG tiene un peso molecular promedio de alrededor de 2.000 daltons o a alrededor de 750 daltons. El PEG puede estar opcionalmente sustituido con grupos alquilo, alcoxi, acilo o arilo. En determinadas modalidades, el grupo hidroxilo terminal está sustituido con un grupo metoxi o metilo.
En una modalidad preferida, “L” es un resto enlazador que no contiene éster. Enlazadores adecuados que no contienen éster incluyen, de modo no taxativo, un resto enlazador amido, un resto enlazador amino, un resto enlazador carbonilo, un resto enlazador carbamato, un resto enlazador urea, un resto enlazador éter, un resto enlazador disulfuro, un resto enlazador succinamidilo y combinaciones de estos. En una modalidad preferida, el resto enlazador que no contiene éster es un resto enlazador carbamato (es decir, un conjugado PEG-C-DAA). En otra modalidad preferida, el resto enlazador que no contiene éster es un resto enlazador amido (es decir, un conjugado PEG-A-DAA). En aún otra modalidad preferida, el resto enlazador que no contiene éster es un resto enlazador succinamidilo (es decir, un conjugado PEG-S-DAA).
En modalidades particulares, el conjugado de lípido PEG se selecciona de: PEG-C-DOMG) .
Los conjugados de PEG-DAA se sintetizan utilizando téenicas estándar y reactivos conocidos por los expertos en la técnica. Se reconocerá que los conjugados de PEG-DAA contendrán varios enlaces de amida, amina, éter, tio, carbamato y urea. Los expertos en la técnica reconocerán que los métodos y reactivos para formar estos enlaces son bien conocidos y están fácilmente disponibles. Ver, por ejemplo, March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wilcy 1992); Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989); y Furniss, VOGEL’S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY, 5.a edición. (Longman 1989). También será evidente que cualquier grupo funcional puede necesitar protección y desprotección en diferentes puntos en la síntesis de los conjugados de PEG-DAA. Los expertos en la técnica reconocerán que dichas técnicas son bien conocidas. Ver, por ejemplo Green y Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wilcy 1991 ).
Preferentemente, el conjugado de PEG-DAA es un conjugado de PEG-dideciloxipropilo (C10) conjúgate, un conjugado de PEG-dilauriloxipropilo (C12), un conjugado de PEG-dimiristiloxipropilo (C 4), un conjugado de PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6), o un conjugado de PEG-diesteariloxipropilo (C18). En estas modalidades, PEG tiene preferentemente un peso molecular promedio de alrededor de 750 o de alrededor de 2000 daltons. En una modalidad particularmente preferida, el conjugado de PEG-lípido comprende PEG2000-C-DMA, donde el “2000” denota el peso molecular promedio de PEG, la “C” denota el resto enlazador de carbamato, y “DMA” denota dimiristiloxipropilo. En otra modalidad particularmente preferida, el conjugado de PEG-lípido comprende PEG750-C-DMA, donde el “750” denota el peso molecular promedio de PEG, la “C” denota el resto enlazador de carbamato, y “DMA” denota dimiristiloxipropilo. En modalidades particulares, el grupo hidroxilo terminal del PEG se sustituye con un grupo metilo. Los expertos en la teenica apreciarán rápidamente que otros dialquiloxipropilos se pueden usar en los conjugados PEG-DAA de la presente invención.
Además de lo anterior, será fácilmente aparente para los expertos en la técnica que se pueden usar otros polímeros hidrofí líeos en lugar de PEG. Los ejemplos de polímeros adecuados que se pueden usar en lugar de PEG incluyen, de modo no taxativo, polivinilpirrolidona, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, metacrilamida de polihidroxipropilo, polimetacrilamida y polidimetilacrilamida, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, y celulosas derivadas tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.
Además de los componentes anteriores, las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) de la presente invención pueden comprender además lípidos de poli(etilenglicol) (PEG) catiónicos o CPL (ver, por ejemplo, Chen et al., Bioconj. Chem., 1 1 :433-437 (2000); patente estadounidense n.° 6,852,334; Publicación PCT n.° WO 00/62813, las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos).
Los CPL adecuados incluyen compuestos de la Fórmula VI: A-W-Y (VI), donde A, W e Y se describen a continuación.
Con referencia a la Fórmula VI, "A" es un resto de lípido tal como un lípido antipático, un lípido neutral o un lípido hidrofóbico que actúa como un anclaje de lípidos. Los ejemplos de lípidos adecuados incluyen, de modo no taxativo, diacilglicerolilos, dialquilglicerolilos, N-N-dialquilaminos, 1 ,2-diaciloxi-3-aminopropanos, y 1 ,2-dialquil-3-aminopropanos.
"W" es un polímero o un oligómero tal como un oligómero o polímero hidrofílico. Preferentemente, el polímero hidrofílico es un polímero biocompatible que no es inmunogénico o tiene una inmunogenicidad inherente baja. De manera alternativa, el polímero hidrofílico puede ser un antigénico débil si se usa con adyuvantes adecuados. Los polímeros no inmunogénicos incluyen, de modo no taxativo, PEG, poliamidas, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliglicólico/ácido poliláctico y combinaciones de estos. En una modalidad preferida, el polímero tiene un peso molecular de alrededor de 250 a alrededor de 7000 daltons.
"Y" es un resto policatiónico. El término resto policatiónico se refiere a un grupo funcional, compuesto o derivado que tiene una carga positiva, preferentemente al menos 2 cargas positivas a un pH seleccionado, preferentemente pH fisiológico. Los restos policatiónicos adecuados incluyen aminoácidos básicos y sus derivados tales como arginina, asparagina, glutamina, lisina e histidina; espermina; espermidina; dendrímeros catiónicos; poliaminas; azúcares de poliamina y polisacáridos de amino. Los restos policatiónicos pueden ser lineales, tales como tetralisina lineal, con una estructura ramificada o dendrimérica. Los restos policatiónicos tienen entre alrededor de 2 a alrededor de 15 cargas positivas, preferentemente entre alrededor de 2 a alrededor de 12 cargas positivas y más preferentemente entre alrededor de 2 a alrededor de 8 cargas positivas a valores de pH seleccionados. La selección de qué resto policatiónico utilizar se puede determinar por el tipo de aplicación de partícula que se desea.
Las cargas en los restos policatiónicos se pueden distribuir alrededor del resto de partícula completo, o de manera alternativa, pueden ser una concentración diferente de densidad de carga en un área particular del resto de partícula, por ejemplo, un pico de carga. Si la densidad de carga se distribuye en la partícula, la densidad de carga se puede distribuir equitativa o no equitativamente. Todas las variaciones de la distribución de carga del resto policatiónico están comprendidas por la presente invención.
El lípido "A" y el polímero no inmunogenico "W" se puede unir mediante varios métodos y preferentemente mediante un enlace covalente. Se pueden usar métodos conocidos para los expertos en la téenica para el enlace covalente de "A" y "W". Las uniones adecuadas incluyen, de modo no taxativo, uniones amida, amina, carboxilo, carbonato, carbamato, éster e hidrazona. Será evidente para los expertos en la técnica que "A" y "W" deben tener grupos funcionales complementarios para efectuar la unión. La reacción de estos dos grupos, uno en el lípido y el otro en el polímero, proporcionará la unión deseada. Por ejemplo, cuando el lípido es un diacilglicerol y se activa el hidroxilo terminal, por ejemplo con NHS y DCC, para formar un éster activo, y después se hace reaccionar con un polímero que contiene un grupo amino, tal como con una poliamida (ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 6,320,017 y 6,586,559, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad a todos los efectos), se formará un enlace de amida entre los dos grupos.
En determinados casos, el resto policatiónico puede tener un ligando unido, tal como un ligado de direccionamiento o un resto quelante para formar complejos de calcio. Preferentemente, luego de que el ligando se une, el resto catiónico mantiene una carga positiva. En determinados casos, el ligando que se une tiene una carga positiva. Los ligandos adecuados incluyen, de modo no taxativo, un compuesto o dispositivo con un grupo funcional reactivo e incluye lípidos, lípidos antipáticos, compuestos de portador, compuestos de bioafinidad, biomateriales, biopolímeros, dispositivos biomédicos, compuestos detectables analíticamente, compuestos activos terapéuticamente, enzimas, péptidos, proteínas, anticuerpos, estimuladores inmunitarios, radioetiquetas, fluorógenos, biotina, fármacos, haptenos, DNA, RNA, polisacáridos, liposomas, virosomas, micelas, inmunoglobulinas, grupos funcionales, otros restos de direccionamiento o toxinas.
En algunas modalidades, los conjugados de lípidos (por ejemplo, PEG-lípido) comprenden de alrededor de 0, 1 % molar a alrededor de 2 % molar, de alrededor de 0,5 % molar a alrededor de 2 % molar, de alrededor de 1 % molar a alrededor de 2 % molar, de alrededor de 0,6 % molar a alrededor de 1 ,9 % molar, de alrededor de 0,7 % molar a alrededor de 1 ,8 % molar, de alrededor de 0,8 % molar a alrededor de 1 ,7 % molar, de alrededor de 0,9 % molar a alrededor de 1 ,6 % molar, de alrededor de 0,9 % molar a alrededor de 1 ,8 % molar, de alrededor de 1 % molar a alrededor de 1 ,8 % molar, de alrededor de 1 % molar a alrededor de 1 ,7 % molar, de alrededor de 1 ,2 % molar a alrededor de 1 ,8 % molar, o alrededor de 1 ,2 % molar, 1 ,7 % molar, de alrededor de 1 ,3 % molar a alrededor de 1 ,6 % molar o de alrededor de 1 ,4 % molar a alrededor de 1 ,5 % molar, (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula.
En otras modalidades, el conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) comprende de alrededor de 0 % molar a alrededor de 20 % molar, de alrededor de 0,5 % molar a alrededor de 20 % molar, de alrededor de 2 % molar a alrededor de 20 % molar, de alrededor de 1 ,5 % molar a alrededor de 18 % molar, de alrededor de 2 % molar a alrededor de 15 % molar, de alrededor de 4 % molar a alrededor de 15 % molar, de alrededor de 2 % molar a alrededor de 12 % molar, de alrededor de 5 % molar a alrededor de 12 % molar o de a alrededor de 2 % molar (o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula.
En modalidades adicionales, el conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) comprende de alrededor de 4 mol % a alrededor de 10 mol %, de alrededor de 5 mol % a alrededor de 10 mol %, de alrededor de 5 mol % a alrededor de 9 mol %, de alrededor de 5 mol % a alrededor de 8 mol %, de alrededor de 6 mol % a alrededor de 9 mol %, de alrededor de 6 mol % a alrededor de 8 mol %, o alrededor de 5 mol %, 6 mol %, 7 mol %, 8 mol %, 9 mol %, o 10 mol %(o cualquier fracción o intervalo de estos) del lípido total presente en la partícula.
Se describen ejemplos adicionales, porcentajes y/o intervalos de conjugados de lípidos adecuados para usar en las partículas de la presente invención, por ejemplo, en la publicación PCT n.° WO 09/127060, publicación PCT n.° WO 2010/006282, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad para todos los fines.
Se debe comprender que el porcentaje de conjugado de lípido (por ejemplo, PEG-lípido) presente en las partículas de lípidos de la invención es una cantidad objetivo, y que la cantidad real de conjugado de lípido presente en la formulación puede variar, por ejemplo, en ± 2 % molar. Por ejemplo, en la formulación de partícula de lípido 1 :57 (por ejemplo, LNP), la cantidad objetivo de conjugado de lípido es 1 ,4 % molar, pero la cantidad real de conjugado de lípido puede ser ± 0,5 % molar, ± 0,4 % molar, ± 0,3 % molar, ± 0,2 % molar, ± 0, 1 % molar, o ± 0,05 % molar de esa cantidad objetivo, y el equilibrio de la formulación se hace de otros componentes de i ¡pidos (agregando hasta 100 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula). De manera similar, en la formulación de partícula de lípido 7:54 (por ejemplo, LNP), la cantidad objetivo de conjugado de lípido es 6,76 % molar, pero la cantidad real de conjugado de lípido puede ser ± 2 % molar, ± 1 ,5 % molar, ± 1 % molar, ± 0,75 % molar, ± 0,5 % molar, ± 0,25 % molar, o ± 0, 1 % molar de la cantidad objetivo, y el equilibrio de la formulación se hace de otros componentes de lípidos (agregando hasta 100 % molar de los lípidos totales presentes en la partícula).
Un experto en la téenica apreciará que la concentración del conjugado de lípido se puede variar dependiendo del conjugado de lípido utilizado y la tasa en la que la partícula de lípido se vuelve fusogénica.
Mediante el control de composición y concentración del conjugado de lípido, se puede controlar la tasa en la que el conjugado de lípido se intercambia fuera de la partícula de lípido y, en cambio, la tasa en la que la partícula de lípido se vuelve fusogénica. Por ejemplo, cuando se usa un conjugado de PEG-DAA como el conjugado de lípido, la tasa en la que la partícula de lípido se vuelve fusogénica se puede variar, por ejemplo, variando la concentración del conjugado de lípido, variando el peso molecular del PEG o variando la longitud de cadena y grado de saturación de los grupos alquilo en el conjugado de PEG-DAA. Además, se pueden usar otras variables que incluyen, por ejemplo, pH, temperatura, fuerza iónica, etc. para variar y/o controlar la tasa en la que la partícula de lípido se vuelve fusogénica. Otros métodos que se pueden usar para controlar la tasa en la que la partícula de lípido se vuelve fusogénica será evidente para los expertos en la téenica luego de la lectura de esta descripción. También, controlando la composición y concentración del conjugado de lípido, se puede controlar el tamaño de la partícula de lípido (por ejemplo, LNP).
VI. Preparación de las partículas de lípidos Las partículas de lípidos de la presente invención, por ejemplo, LNP, en las que un agente activo o agente terapéutico tal como el RNA interferente (por ejemplo, siRNA) está atrapado dentro de la parte de lípido de la partícula y se protege de la degradación, se puede formar mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, de modo no taxativo, un método de mezcla continua, un proceso de dilución directo y un proceso de dilución en línea.
En modalidades particulares, los lípidos catiónicos pueden comprender lípidos de la Fórmula I o sales de estos, solo o en combinación con otros lípidos catiónicos. En otras modalidades, los lípidos no catiónicos son esfingomielina del huevo (ESM, por sus siglas en inglés), distearoilfosfatidilcolina (DSPC, por sus siglas en inglés), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), 1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC, por sus siglas en ingles), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, 14:0 PE (1 ,2-dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE)), 16:0 PE (1 ,2-dipalmitoil-fosfatidiletanolamina (DPPE)), 18:0 PE (1 ,2-distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE)), 18:1 PE (1 ,2-dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE)), 18: 1 trans PE (1 ,2-dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE)), 18:0-18: 1 PE (1 -estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE)), 16:0-18: 1 PE (1 -palmitoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (POPE)), polímeros basados en polietilenglicol (por ejemplo, PEG 2000, PEG 5000, diacilgliceroles modificados con PEG, o dialquiloxipropilos modificados con PEG), colesterol, derivados de este o combinaciones de este.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona partículas de lípidos-ácido nucleico (por ejemplo, LNP) producidas mediante un método de mezcla continua, por ejemplo, un proceso que incluye proporcionar una solución acuosa que comprende un ácido nucleico (por ejemplo, RNA interferente) en un primer depósito, que proporciona una solución de lípidos orgánica en un segundo depósito (donde los lípidos presentes en la solución de lípidos orgánica se disuelven en un solvente orgánico, por ejemplo, un alcanol inferior, tal como etanol), y mezclando la solución acuosa con la solución de lípidos orgánica de manera que la solución de lípidos orgánica se mezcle con la solución acuosa para que produzca prácticamente al instante una vesícula de lípidos (por ejemplo, liposoma) encapsulando el ácido nucleico dentro de la vesícula de lípido. Estos procesos y el aparato para llevar a cabo este proceso se describen en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2004/0142025, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
La acción de introducir continuamente soluciones de lípido y amortiguadores en un ambiente de mezcla, tal como una cámara de mezcla causa una dilución continua en la solución de lípido con la solución amortiguadora, produciendo de esta manera una vesícula de lípido prácticamente al instante luego de mezclar. Tal como se usa en la presente, la frase "diluir continuamente en la solución de lípido con una solución amortiguadora" (y variaciones) significa generalmente que la solución de lípidos se diluye lo suficientemente rápido en un proceso de hidratación con suficiente potencia para generar vesículas. Mediante la mezcla de la solución acuosa que comprende un ácido nucleico con la solución de lípido orgánica, la solución de lípido orgánica pasa por una dilución en etapas continua en la presencia de la solución amortiguadora (es decir, solución acuosa) para producir una partícula de lípido-ácido nucleico.
Las partículas de lípidos-ácido nucleico formadas usando el método de mezcla continua típicamente tienen un tamaño de alrededor de 30 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 40 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 130 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 1 10 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 80 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 90 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 70 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 80 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 80 nm, menos de alrededor de 120 nm, 1 10 nm, 100 nm, 90 nm, o 80 nm, o alrededor de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 1 15 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, o 150 nm (o cualquier fracción o intervalo de estos). Las partículas formadas de esa manera no se acumulan y opcionalmente se ajusta su tamaño para lograr un tamaño de partícula uniforme.
En otra modalidad, la presente invención proporciona partículas de lípidos-ácido nucleico (por ejemplo, LNP) producidas mediante un proceso de dilución directo que incluye formar una solución de vesícula de lípido (por ejemplo, liposoma) e introduciendo inmediata y directamente la solución de vesícula de lípido en un recipiente recolector que contiene una cantidad controlada de amortiguador de dilución. En aspectos preferidos, el recipiente recolector incluye uno o más elementos configurados para mezclar los contenidos del recipiente de recolección para facilitar la dilución. En un aspecto, la cantidad de amortiguador de dilución presente en el recipiente de recolección es prácticamente igual al volumen de la solución de vesícula de lípido introducida allí. Como un ejemplo no taxativo, cuando se introduce una solución de vesícula de lípido en etanol al 45 % en el recipiente recolector que contiene un volumen igual de amortiguador de dilución proporcionará de manera ventajosa partículas más pequeñas.
En aún otra modalidad, la presente invención proporciona partículas de lípidos-ácido nucleico (por ejemplo, LNP) producidas mediante un proceso de dilución en línea en donde se acopla de manera fluida un tercer depósito que contiene amortiguador de dilución a una segunda región de mezcla. En esta modalidad, la solución de vesícula de lípido (por ejemplo, liposoma) formada en una primera región de mezcla se mezcla inmediata y directamente con el amortiguador de dilución en la segunda región de mezcla. En aspectos preferidos, la segunda región de mezcla incluye un conector en T ubicado de manera que los flujos de la solución de vesícula de lípido y del amortiguador de dilución se encuentren a 180 0 como flujos opuestos; sin embargo, se pueden usar los conectores que proporcionan ángulos más bajos, por ejemplo, de alrededor de 27 0 a alrededor de 180 0 (por ejemplo, alrededor de 90 °). Un mecanismo de bomba proporciona un flujo controlable de amortiguador a la segunda región de mezcla. En un aspecto, la velocidad de flujo del amortiguador de dilución proporcionado en la segunda región de mezcla se controla para que sea prácticamente igual a la velocidad de flujo de la solución de vesícula de lípido introducida allí de la primera región de mezcla. Esta modalidad permite de manera ventajosa un mejor control del flujo del amortiguador de dilución que se mezcla con la solución de vesícula de lípidos en la segunda región de mezcla, y por lo tanto la concentración de la solución de vesícula de lípidos en amortiguador a lo largo de todo el segundo proceso de mezcla. Dicho control de la velocidad de flujo del amortiguador de dilución permite de manera ventajosa la formación de partículas de tamaño pequeño en concentraciones reducidas.
Estos procesos y los aparatos para llevar a cabo estos procesos de diluciones directas y en línea se describen en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0042031 , cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. 5 Las partículas de lípidos-ácido nucleico formadas usando los procesos de diluciones directas y en línea típicamente tienen un tamaño de alrededor de 30 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 40 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 50 nm a alrededor de 150 nm, de alrededor de 60 nm a alrededor de 130 nm, de alrededor de 70 nm a ío alrededor de 1 10 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 80 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 90 nm a alrededor de 100 nm, de alrededor de 70 a alrededor de 90 nm, de alrededor de 80 nm a alrededor de 90 nm, de alrededor de 70 nm a alrededor de 80 nm, menos de alrededor de 120 nm, 110 nm, 100 nm, 90 15 nm, o 80 nm, o alrededor de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 1 10 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, o 150 nm (o cualquier fracción o intervalo de estos). Las partículas formadas de esa manera no se acumulan y opcionalmente se ajusta su 20 tamaño para lograr un tamaño de partícula uniforme.
Si es necesario, las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) se pueden cambiar de tamaño mediante cualquiera de los métodos disponibles para ajustar liposomas. El cambio de tamaño se puede llevar a cabo para lograr un intervalo de tamaño deseado y una 25 distribución relativamente estrecha de los tamaños de partícula.
Existen varias téenicas para ajustar el tamaño de las partículas a un tamaño deseado. Un método para ajustar el tamaño usado para liposomas e igualmente aplicable a las presentes partículas se describe en la patente estadounidense n.° 4,737,323, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. La sonicación de una suspensión de partícula ya sea mediante la sonda o baño de ultrasonido produce una reducción de tamaño progresiva hasta conseguir partículas con un tamaño menor que alrededor de 50 nm. La homogeneización es otro método que depende de la energía de corte para fragmentar las partículas más grandes en partículas más pequeñas. En un procedimiento de homogeneización típico, las partículas se vuelven a pasar por un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan los tamaños de partículas seleccionados, típicamente entre alrededor de 60 y alrededor de 80 nm. En ambos métodos, se puede monitorear la distribución del tamaño de partícula mediante la discriminación de tamaño de partícula de rayo láser convencional o QELS.
La extrusión de las partículas mediante una membrana de policarbonato con poros pequeños o una membrana de cerámica asimétrica también es un método efectivo para la distribución de tamaño relativamente bien definido. Típicamente, la suspensión se pasa por la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaño de partícula deseada. Las partículas se pueden extrudir a través de membranas con poros sucesivamente más pequeños, para lograr una reducción gradual del tamaño.
En algunas modalidades, los ácidos nucleicos presentes en las partículas se condensan previamente como se describe en por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense n.° 09/774, 103, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines.
En otras modalidades, los métodos pueden comprender además agregar policationes no lipidíeos que son útiles para realizar la lipofección de células usando las composiciones presentes. Los ejemplos de policationes no lipidíeos adecuados incluyen, bromuro de hexadimetrina (vendido con el nombre comercial POLYBRENE®, de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, EUA) u otras sales de hexadimetrina. Otros policationes adecuados incluyen, por ejemplo, sales de poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina y polietilenamina. Preferentemente, la adición de estas sales se debe hacer luego de que se hayan formado las partículas.
En algunas modalidades, las relaciones de lípido con respecto a ácido nucleico (relación de masa/masa) en una partícula de lípido-ácido nucleico formada (por ejemplo, LNP) variará de alrededor de 0,01 a alrededor de 0,2, de alrededor de 0,05 a alrededor de 0,2, de alrededor de 0,02 a alrededor de 0, 1 , de alrededor de 0,03 a alrededor de 0, 1 o de alrededor de 0,01 a alrededor de 0,08. La relación de los material de partida (entrada) también está dentro de este intervalo. En otras modalidades, la preparación de partículas utiliza alrededor de 400 mg de ácido nucleico cada 10 mg de lípidos totales o una relación de ácido nucleico con respecto a la masa de lípidos de alrededor de 0,01 a alrededor de 0,08 y, más preferentemente, alrededor de 0,04, que corresponde a 1,25 mg del lípido total cada 50 mg de ácido nucleico. En otras modalidades preferidas, la partícula tiene una relación de masa de I í pido: ácido nucleico de alrededor de 0,08. 5 En otras modalidades, las relaciones de ácido nucleico con respecto a lípido (relaciones de masa/masa) (por ejemplo, LNP) oscilarán de alrededor de 1 (1:1) a alrededor de 100 (100:1), de alrededor de 5 (5:1) a alrededor de 100 (100:1), de alrededor de 1 (1:1) a alrededor de 50 (50:1), de alrededor de 2 (2:1) a alrededor de 50 ío (50:1), de alrededor de 3 (3:1) a alrededor de 50 (50:1), de alrededor de 4 (4:1) a alrededor de 50 (50:1), de alrededor de 5 (5:1) a alrededor de 50 (50:1), de alrededor de 1 (1:1) a alrededor de 25 (25:1), de alrededor de 2 (2:1) a alrededor de 25 (25:1), de alrededor de 3 (3:1) a alrededor de 25 (25:1), de alrededor de 4 (4:1) a alrededor de 25 (25:1), de 15 alrededor de 5 (5:1) a alrededor de 25 (25:1), de alrededor de 5 (5:1) a alrededor de 20 (20:1), de alrededor de 5 (5:1) a alrededor de 15 (15:1), de alrededor de 5 (5:1) a alrededor de 10 (10:1), o alrededor de 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (7:1), 8 (8:1), 9 (9:1), 10 (10:1), 11 (11:1), 12 (12:1), 13 (13:1), 14 (14:1), 15 (15:1), 16 (16:1), 17 (17:1), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (22:1), 23 (23:1), 24 (24:1), o 25 (25:1), o cualquier fracción de estos o intervalo de estos. La relación de los materiales de partida (entrada) tambien está dentro de este intervalo.
Como se discutió anteriormente, el lípido conjugado puede incluir además un CPL. En la presente se discuten una variedad de métodos 25 generales para elaborar LNP-CPL (LNP que contiene CPL). Dos téenicas generales incluyen la téenica de "postinserción", es decir, la inserción de un CPL en, por ejemplo un LNP preformado, y la técnica estándar, donde el CPL se incluye en la mezcla de lípido durante, por ejemplo, las etapas de formación de LNP. La técnica de postinserción tiene como resultado un LNP que tienen CPL principalmente en la cara externa de la membrana de dos capas de LNP, mientras que las técnicas estándares proporcionan LNP que tienen CPL en las caras externa e interna. El método es especialmente útil para las vesículas elaboradas a partir de fosfolípidos (que pueden contener colesterol) y también para vesículas que contienen PEG-lípidos (tales como PEG-DAA y PEG-DAG). Se describen métodos de elaborar LNP-CPL, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.° 5,705,385; 6,586,410; 5,981 ,501 ; 6,534,484; y 6,852,334; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0072121 , y publicación PCT n.° WO 00/62813, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante esta referencia en su totalidad para todo propósito.
Vil. Kits La presente invención también proporciona partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) en forma de kit. En algunas modalidades, el kit comprende un recipiente que está compartimentalizado para llevar los elementos variados de las partículas de lípidos (por ejemplo, los agentes activos o agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos y los componentes de lípido individuales de las partículas). Preferentemente, el kit comprende un recipiente (por ejemplo, un vial o una ampolla) que lleva las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP), donde las partículas se producen mediante uno de los procesos establecidos en la presente. En determinadas modalidades, el kit puede comprender además un desestabilizador de la membrana endosomal (por ejemplo, iones de calcio). Típicamente, el kit comprende las composiciones de partícula de la invención, como suspensión en un portador farmaceuticamente aceptable o en forma deshidratada, con instrucciones para su rehidratación (si está liofilizado) y su administración.
Las partículas de lípidos de la presente invención se pueden adaptar para que se dirijan preferentemente tejidos, órganos o tumores de interés particulares. En algunos casos, la formulación de partícula de lípido 1 :57 (por ejemplo, LNP) se puede usar para dirigir preferentemente el hígado (por ejemplo, tejido de hígado normal). En otros casos, la formulación de partícula de lípido 7:54 (por ejemplo, LNP) se puede usar para dirigir preferentemente tumores sólidos tales como tumores de hígado y tumores fuera del hígado. En modalidades preferidas, los kits de la invención comprenden estas partículas de lípidos dirigidas a tumores y/o dirigidas al hígado, donde las partículas están presentes en un recipiente como una suspensión o de forma deshidratada.
En otros casos determinados, puede ser conveniente tener un resto de direccionamiento unido a la superficie o partícula de lípido para mejorar adicionalmente el direccionamiento de la partícula. Los métodos para unir restos de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpos, proteínas, etc.) para lípidos (tales como los usados en las partículas presentes) son conocidos por los expertos en la téenica.
VIII. Administración de las partículas de lípidos Una vez que se formaron, las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) son útiles para la introducción de agentes activos o agentes terapéuticos (por ejemplo, ácidos nucleicos tales como RNA interferente) en células. Por consiguiente, la presente invención también proporciona métodos para introducir un agente activo o agente terapéutico tal como un ácido nucleico (por ejemplo, RNA interferente) en una célula. En algunos casos, la célula es una célula hepática tal como, por ejemplo, un hepatocito presente en el tejido hepático. En otros casos, la célula es una célula tumoral tal como, por ejemplo, una célula tumoral presente en un tumor sólido. Los métodos se llevan a cabo in vitro o in vivo primero formando las partículas como se describe anteriormente y luego poniendo en contacto las partículas con las células por un período de tiempo suficiente para que se produzca la administración del agente activo o agente terapéutico en las células.
Las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) se pueden adsorber en casi cualquier tipo de célula con las que se mezclan o se ponen en contacto. Una vez que se han adsorbido, las partículas se pueden ingerir medíante endocítosis por una parte de la célula, intercambiar lípidos con las membranas celulares o fusionar con las células. La transferencia o incorporación de la parte de agente activo o agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) de la partícula puede llevarse a cabo mediante cualquiera de estas vías. En particular, cuando se produce la fusión, la membrana de la partícula se integra en la membrana celular y los contenidos de la partícula se combinan con el fluido intracelular.
Las partículas de I í pidos de la invención (por ejemplo, LNP) se pueden administrar solas o en una mezcla con un portador farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, suero fisiológico o amortiguador de fosfato) seleccionadas de acuerdo con la vía de administración y la práctica farmacéutica estándar. Generalmente, la solución salina amortiguada normal (por ejemplo, NaCI 135-150 mM) se utilizará como el portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados incluyen, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 % y similares, incluyendo glicoproteínas para mejorar la estabilidad, tales como la albúmina, lipoproteína, globulina, etc. Portadores adecuados adicionales se describen en, por ejemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Filadelfia, PA, 17.a ed. (1985). Tal como se usa en la presente, "portador" incluye todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antifúngicos y antibacteriales, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administran a un ser humano.
El portador farmacéuticamente aceptable se agrega generalmente después de la formación de partículas de lípido. Por lo tanto, después de que se formó la partícula de lípido (por ejemplo, LNP), la partícula se puede diluir en portadores farmacéuticamente aceptables tales como soluciones salinas amortiguadas normales.
La concentración de partículas en las formulaciones farmacéuticas pueden variar ampliamente, es decir, de menos de alrededor de 0,05 %, usualmente a, o al menos alrededor de 2 a 5 %, hasta alrededor de 10 a 90 % en peso, y serán seleccionadas principalmente por volúmenes fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Por ejemplo, la concentración se puede aumentar para disminuir la carga de fluido asociada con el tratamiento. Esto puede ser particularmente deseable en pacientes que tienen hipertensión grave o insuficiencia cardíaca congestiva asociada con la aterosclerosis. De manera alternativa, las partículas compuestas por lípidos irritantes se pueden diluir para disminuir las concentraciones para reducir la inflamación en el sitio de administración.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden esterilizar por téenicas convencionales y conocidas de esterilización. Las soluciones acuosas se pueden envasar para su uso o filtrarse en condiciones asépticas y liofilizarse, la preparación liofil izada se combina con una solución estéril acuosa antes de su administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sea necesario, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tal como agentes amortiguadores y de ajuste del pH, agentes para ajustar la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio y cloruro de calcio. De manera adicional, la suspensión de partículas puede incluir agentes protectores de lípidos que protegen los lípidos contra daños peroxidativos de los lípidos y radicales libres en el almacenamiento. Son adecuados los inactivadores de radicales libres lipofílicos, tales como alfatocoferol y quelantes específicos de hierro solubles en agua, tales como ferrioxamina.
En algunas modalidades, las partículas de lípidos de la invención (por ejemplo, LNP) son particularmente útiles en los métodos para la administración terapéutica de uno o más ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de RNA interferente (por ejemplo, siRNA). En particular, un objeto de esta invención es proporcionar métodos in vivo e in vitro para el tratamiento de una enfermedad o trastorno en un mamífero (por ejemplo, un roedor tal como un ratón o un primate tal como un ser humano, chimpancé o mono) mediante la regulación por disminución o silenciamiento de la transcripción y/o traducción de una o más secuencias de ácido nucleico objetivo o genes de interés. Como un ejemplo no taxativo, los métodos de la invención son útiles para la administración in vivo del RNA interferente (por ejemplo, siRNA) al hígado y/o tumor de un sujeto mamífero. En determinadas modalidades, la enfermedad o trastorno está asociado con la expresión y/o sobreexpresión de un gene o expresión o sobreexpresión del gene se reduce mediante el RNA interferente (por ejemplo, siRNA). En otras modalidades determinadas, una cantidad terapéuticamente eficaz de la partícula de lípido se puede administrar al mamífero. En algunos casos, un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) se formula en un LNP, y las partículas se administran a pacientes que necesitan dicho tratamiento. En otros casos, se eliminan las células de un paciente, se administra el RNA interferente in vitro (por ejemplo, usando un LNP descrito en la presente) y las células se vuelven a inyectar al paciente.
A. Administración in vivo Se ha logrado la administración sistémica para la terapia in vivo, por ejemplo, administración de ácido nucleico terapéutico a una célula objetivo distal mediante sistemas del cuerpo tales como la circulación usando partículas de lípidos-ácido nucleico tales como los descritos en la publicación PCT n.° WO 05/007196, WO 05/121348, WO 05/120152 y WO 04/002453, cuyas descripciones se incorporan a la presente mediante referencia en su totalidad a todos los efectos. La presente invención también proporciona partículas de I í pidos totalmente encapsuladas que protegen los ácidos nucleicos de la degradación de nucleasa en el suero, son no inmunogénicos, son de tamaño pequeño y son adecuadas para repetir la dosificación.
Para la administración in vivo , la administración puede ser de cualquier manera conocida en la téenica, por ejemplo, mediante inyección, administración oral, inhalación (por ejemplo, intranasal o intratraqueal), aplicación trasdérmica o administración rectal. La administración se puede lograr mediante dosis divididas o únicas. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de forma parenteral, es decir, intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. En algunas modalidades, las composiciones farmaceuticas se administran de manera intravenosa o intraperitoneal mediante la inyección de bolo (ver, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,286,634). La administración de ácido nucleico intracelular también se ha discutido en Straubringer et al., Methods Enzymol. , 101 :512 (1983); Mannino et al. , Biotechniques, 6:682 (1988); Nicolau et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 6:239 (1989); y Behr, Acc. Chem. Res., 26:274 (1993). Otros métodos adicionales para administrar productos terapéuticos a base de lípidos se describen en por ejemplo, la patente estadounidense n.° 3,993,754; 4,145,410; 4,235,871 ; 4,224,179; 4,522,803; y 4,588,578. Las partículas de lípidos se pueden administrar mediante inyección directa al sitio de la enfermedad o mediante inyección en un sitio distal del sitio de la enfermedad (ver, por ejemplo, Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc. , Publishers, Nueva York. pp.70-71 (1994)). La divulgación de las referencias antes descritas se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
En modalidades donde las partículas de lípidos de la presente invención (por ejemplo, LNP) se administran de manera intravenosa, al menos alrededor de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, o 25 % de la dosis total inyectada de las partículas está presente en plasma alrededor de 8, 12, 24, 36, o 48 horas después de la inyección. En otras modalidades, más de alrededor del 20 %, 30 %, 40 % y hasta alrededor de 60 %, 70 %, u 80 % de la dosis total inyectada de las partículas de lípidos está presente en plasma alrededor de 8, 12, 24, 36, o 48 horas después de la inyección. En ciertos casos, más de alrededor de 10 % de múltiples partículas están presentes en el plasma de un mamífero alrededor de 1 hora después de la administración. En otros casos determinados, la presencia de las partículas de lípidos es detectable al menos alrededor 5 de 1 hora después de la administración de la partícula. En determinadas modalidades, la presencia de un agente terapéutico tal como un ácido nucleico es detectable en células de los pulmones, hígado, tumor o en un sitio de inflamación a alrededor de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 o 96 horas después de la administración. En otras modalidades, la regulación ío por disminución de la expresión de una secuencia objetivo mediante un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) es detectable a alrededor de 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 o 96 horas después de la administración. En aún otras modalidades, la regulación por disminución de la expresión de una secuencia objetivo mediante un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) 15 se produce preferentemente en las células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos), células tumorales o en células en un sitio de inflamación. En modalidades adicionales, la presencia o efecto de un RNA interferente (por ejemplo, siRNA) en las células en un sitio próximo o distal al sitio de la administración o en células de los pulmones, hígado 20 o un tumor es detectable a alrededor de 12, 24, 48, 72, o 96 horas, o a alrededor de 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26, o 28 días luego de la administración. En modalidades adicionales, las partículas de lípidos (por ejemplo, LNP) de la invención se administran de forma parenteral o intraperitoneal. 25 Las composiciones de la presente invención, solas o en combinación con otros componentes adecuados se pueden hacer en formulaciones en aerosol (es decir, se pueden "nebulizar") para que se administren mediante inhalación (por ejemplo, por vía intranasal o intratraqueal) (ver, Brigham et al. , Am. J. Sci., 298:278 (1989)). Las formulaciones en aerosol se pueden ubicar en propelentes presurizados aceptables, tales como, diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
En determinadas modalidades, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante atomizadores intranasales, inhalación y/u otros vehículos de administración en aerosol. Se han descrito métodos para administrar composiciones de ácido nucleico directamente en los pulmones mediante atomizadores en aerosol nasales, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5,756,353 y 5,804,212. Asimismo, la administración de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente estadounidense 5,725,871 ) también se conocen en la téenica farmacéutica. De manera similar, la administración de fármacos por vía trasmucosa en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente estadounidense n.° 5,780,045. La divulgación de las patentes antes descritas se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, mediante vía intraarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones inyectables estériles ¡sotónicas acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. En la práctica de esta invención, las composiciones se administran preferentemente, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, oral, tópica, intraperitoneal, intravesical o intratecal.
Generalmente, cuando se administran de manera intravenosa, las formulaciones de partícula de lípido se formulan con un portador farmacéuticamente adecuado. Muchos portadores farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar en las composiciones y métodos de la presente invención. Las formulaciones adecuadas para usar en la presente invención se encuentran, por ejemplo, en REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishíng Company, Filadelfia, PA, 17.a ed. (1985). Se pueden usar una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0,4 %, glicina al 0,3 % y similares, y pueden incluir glicoproteínas para la estabilidad mejorada, tal como albúmina, lipoproteína, globulina, etc. Generalmente, se utilizará una solución salina amortiguada normal (135-150 mM NaCI) como el portador farmacéuticamente aceptable, pero otros portadores adecuados serán suficientes. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante téenicas de esterilización de liposomas convencionales, tales como la filtración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables que sean necesarias para acercarse a las condiciones fisiológicas, tales como el ajuste de pH y agentes amortiguadores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Estas composiciones se pueden esterilizar usando las téenicas referidas anteriormente o de manera alternativa, se pueden producir en condiciones estériles. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para usar o filtrar en condiciones asépticas y liofilizar, la preparación liofilizada se combina con una solución acuosa estéril antes de la administración.
En determinadas aplicaciones, las partículas de lípidos descritas en la presente se pueden administrar mediante administración oral al individuo. Las partículas se pueden incorporar con excipientes y se pueden usar en forma de comprimidos, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, píldoras, grageas, elíxires, enjuagues bucales, suspensiones, atomizadores orales, jarabes, obleas y similares (ver, por ejemplo, patente estadounidense n.° 5,641 ,515, 5,580,579 y 5,792,451 , las cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia a todos los efectos). Estas formas de dosificación orales también pueden contener los siguientes: aglutinantes, gelatina; excipientes, lubricantes y/o agentes saborizantes. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener además de los materiales descritos anteriormente, un portador líquido. Varios materiales adicionales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por supuesto, cualquier material utilizado para la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas.
Típicamente, estas formulaciones orales pueden contener al menos alrededor de 0, 1 % de las partículas de lípidos o más, aunque el porcentaje de las partículas puede, por supuesto, variar y puede tener convenientemente alrededor de 1 % o 2 % y alrededor de 60 % 70 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de partículas en cada composición terapéuticamente útil se puede preparar de manera que se obtendrá una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Los factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán contemplados por el experto en la téenica para preparar dichas formulaciones farmacéuticas, y como tal, pueden ser deseables una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.
Las formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir en: (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz de agente terapéutico envasado tal como ácido nucleico (por ejemplo, RNA interferente) suspendido en diluyentes tales como agua, solución salina o PEG 400, (b) cápsulas, sachets o comprimidos, cada uno conteniendo una cantidad predeterminada de agente terapéutico tal como ácido nucleico (por ejemplo, RNA interferente) como líquidos, sólidos, gránulos o gelatina; (c) suspensiones en un líquido adecuado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas en comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de papa, celulosa microcristalina, gelatina, dióxido de sílice coloidal, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes, rellenos, aglutinantes, diluyentes, agentes amortiguadores, agentes humectantes, conservadores, agentes saborizantes, tintes, agentes desintegrantes y portadores farmacéuticamente compatibles. Las píldoras pueden comprender un agente terapéutico tal como ácido nucleico (por ejemplo, RNA interferente) en un sabor, por ejemplo, sacarosa, así como también pastillas que comprenden el agente terapéutico en una base inerte, tal como emulsiones de acacia y sacarosa o gelatina y glicerina, geles y similares que contienen además del agente terapéutico, portadores conocidos en la téenica.
En otro ejemplo de su uso, las partículas de lípidos se pueden incorporar en un intervalo amplio de formas de dosificación tópicas. Por ejemplo, una suspensión que contiene partículas de lípidos-ácido nucleico tal como LNP se pueden formular y administrar como geles, aceites, emulsiones, cremas para uso tópico, pastas, ungüentos, lociones, espumas, mousses y similares.
Cuando se preparan preparaciones farmacéuticas de las partículas de lípidos de la invención, es preferible usar cantidades de las partículas que hayan sido purificadas para reducir o eliminar partículas vacías o partículas con agentes terapéuticos tales como ácido nucleico asociados con la superficie externa.
Los métodos de la presente invención se pueden llevar a la práctica en una variedad de hospedadores. Los hospedadores preferidos incluyen especies de mamífero, tales como primates (por ejemplo, humanos y chimpancés, así como otros primates no humanos), caninos, felinos, equmos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por ejemplo, ratas y ratones), lagomorfos y cerdos.
La cantidad de partículas administradas dependerá de la relación del agente terapéutico (por ejemplo, ácido nucleico) con respecto al lípido, el agente terapéutico particular (por ejemplo, ácido nucleico) utilizado, la enfermedad o trastorno que se esté tratando, la edad, peso, y estado del paciente, y la decisión del médico, pero generalmente será de alrededor de 0,01 y alrededor de 50 mg por kilogramos de peso corporal, preferentemente de alrededor de 0, 1 y alrededor de 5 mg/kg de peso corporal, o alrededor de 108- 1010 partículas por administración (por ejemplo, inyección).
B. Administración in vitro Para las aplicaciones in vitro, la administración de agentes terapéuticos tales como ácidos nucleicos (por ejemplo, RNA interferente) puede realizarse a cualquier célula de cultivo, ya sea de origen animal o vegetal, vertebrado o invertebrado y de cualquier tejido o tipo. En modalidades preferidas, las células son células animales, más preferentemente células de mamífero, y más preferentemente células humanas (por ejemplo, células tumorales o hepatocitos).
El contacto entre las células y las partículas de lípidos cuando se lleva a cabo in vitro, se realiza en un medio biológicamente compatible. La concentración de partículas varía ampliamente dependiendo en la aplicación particular, pero es generalmente entre alrededor de 1 pmol y alrededor de 10 mmol. El tratamiento de las células con las partículas de lípidos generalmente se lleva a cabo a temperaturas fisiológicas (alrededor de 37 °C) por períodos de tiempo de alrededor de 1 a 48 horas, preferentemente de alrededor de 2 a 4 horas.
En un grupo de modalidades preferidas, una suspensión de partículas de lípidos se agrega a células en placas con 60-80 % de confluencia que tienen una densidad celular de alrededor de 103 a alrededor de 105 células/ml, más preferentemente alrededor de 2 x 104 células/ml. La concentración de la suspensión agregada a las células es preferentemente de alrededor de 0,01 a 0,2 mg/ml, más preferentemente alrededor de 0,1 pg/ml.
Si son necesarios los cultivos tisulares de las células, esto es bien conocido en la téenica. Por ejemplo, Freshncy, Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3.a Ed., Wiley-Liss, Nueva York (1994), Kuchler et al. , Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson y Ross, Inc. (1977), y las referencias citadas en la presente proporcionan una guía general para el cultivo celular. Los sistemas de células cultivadas generalmente tendrán la forma de monocapas de células, aunque también se usan las suspensiones celulares.
Se puede optimizar la eficiencia de administración del LNP u otra partícula de lípido de la invención usando un ensayo de parámetro de liberación endosomal (ERP, por sus siglas en inglés). Un ensayo de ERP se describe en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2003/0077829, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia para todos los fines. Más particularmente, el fin de un ensayo de ERP es distinguir el efecto de varios componentes de lípidos auxiliares y lípidos catiónicos de LNP u otra partícula de lípido basada en su efecto relativo en la unión/absorción o fusión con/desestabilización de la membrana endosomal. Este ensayo permite determinar de manera cuantitativa como cada componente del LNP u otra partícula de lípido afecta la eficiencia de la administración, por lo tanto optimizando el LNP u otra partícula de lípido. Usualmente, una expresión de las medidas del ensayo de ERP de una proteína indicadora (por ejemplo, luciferasa, b-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), etc.) y en algunos casos, una formulación de LNP optimizada para un plásmido de expresión también será adecuado para encapsular un RNA interferente. En algunos casos, un ensayo de ERP se puede adaptar para medir la regulación por disminución de la transcripción o traducción de una secuencia objetivo en la presencia o ausencia de un RNA interferente (por ejemplo, siRNA). Comparando los ERP de cada uno de los LNP varios u otras partículas de lípidos, se puede determinar fácilmente el sistema optimizado, por ejemplo, el LNP u otra partícula de lípido que tenga la mayor absorción en la célula.
C. Células para la administración de partículas de lípidos Las composiciones y métodos de la presente invención se usan para tratar una amplia variedad de tipos de células, in vivo e in vitro. Las células adecuadas incluyen, de modo no taxativo, hepatocitos, células reticuloendoteliales (por ejemplo, monocitos, macrófagos, etc.), células de fibroblastos, células endoteliales, células plaquetarias, otros tipos de células infectadas y/o susceptibles de infectarse con virus, células (madre) hematopoyéticas precursoras, queratinocitos, células de músculo liso y esquelético, osteoblastos, neuronas, linfocitos quiescentes, células diferenciadas de forma terminal, células primarias lentas o sin cielación, células parenquimales, células linfoides, células epiteliales, células óseas y similares.
En modalidades particulares, un agente activo o un agente terapéutico tal como un ácido nucleico (por ejemplo, un RNA interferente) se administran a células cancerígenas (por ejemplo, células de un tumor sólido) incluyendo de modo no taxativo, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de colon, células de cáncer rectal, células de cáncer anal, células de cáncer del conducto biliar, células de cáncer del intestino delgado, células de cáncer de estómago (gástrico), células de cáncer de esófago, células de cáncer de vesícula biliar, células de cáncer pancreático, células de cáncer de apéndice, células de cáncer de mama, células de cáncer de ovario, células de cáncer de cérvix, células de cáncer de próstata, células de cáncer renal, células de cáncer del sistema nervioso central, células de tumor de glioblastoma, células de cáncer de piel, células de linfoma, células de tumor de coriocarcinoma, células de cáncer de cuello y cabeza, celulas de tumor de sarcoma osteogénico, y células de cáncer de sangre.
La administración in vivo de las partículas de lípidos tales como LNP que encapsulan un ácido nucleico (por ejemplo, un RNA interferente) es adecuada para dirigir células de cualquier tipo de célula. Los métodos y composiciones se pueden utilizar con células de una gran variedad de vertebrados, incluyendo mamíferos, tales como, por ejemplo, caninos, felinos, equmos, bovinos, ovinos, caprinos, roedores (por ejemplo, ratones, ratas y cobayos) lagomorfos, cerdos y primates (por ejemplo, monos, chimpancés y seres humanos).
D. Detección de las partículas de lípidos En algunas modalidades, las partículas de lípidos de la presente invención (por ejemplo, LNP) son detectables en el sujeto a alrededor de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más horas. En otras modalidades, las partículas de lípidos de la presente invención (por ejemplo, LNP) son detectables en el sujeto a alrededor de 8, 12, 24, 48, 60, 72, o 96 horas, o alrededor de 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25, o 28 días luego de la administración de las partículas. La presencia de partículas se puede detectar en las células, tejidos u otras muestras biológicas del sujeto. Las partículas se pueden detectar, por ejemplo, mediante la detección directa de partículas, detección de un ácido nucleico terapéutico tal como una secuencia de RNA interferente (por ejemplo, siRNA), detección de la secuencia objetivo de interés (es decir, detectando la expresión o expresión reducida de la secuencia de interés), o una combinación de estas. 1. Detección de partículas Las partículas de lípidos de la invención tal como LNP se pueden detectar usando cualquier método conocido en la téenica. Por ejemplo, una etiqueta se puede acoplar directa o indirectamente a un componente de la partícula de lípido usando métodos bien conocidos en la técnica. Se puede usar una amplia variedad de etiquetas, y la elección de etiqueta dependerá de la sensibilidad deseada, facilidad de conjugación con el componente de partícula de lípido, requisitos de estabilidad e instrumentación disponible y disposiciones de desecho. Las etiquetas adecuadas incluyen, de modo no taxativo, etiquetas espectrales tales como tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína y derivados, tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC, por sus siglas en inglés) y Oregon Green™; rodamina y derivados tales como Texas red, isotiocianato de tetrarodimina (TRUC), etc., digoxigenina, biotina, ficoeritrina, AMCA, CyDyes™ y similares; radioetiquetas tales como 3H, 125l, 35S, 14C, 32P, 33P, etc.; enzimas tales como la peroxidasa de rábano picante, fosfatasa de alcalina, etc.; etiquetas colorimétricas espectrales tales como perlas plásticas o de vidrio coloreadas o de oro coloidales tales como poliestireno, polipropileno, látex, etc. La etiqueta se puede detectar usando cualquier medio conocido en la técnica. 2. Detección de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos (por ejemplo, RNA interferente) se detectan y cuantifican en la presente mediante cualquier cantidad de medios conocidos para los expertos en la teenica. La detección de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante métodos bien conocidas tales como análisis Southern, análisis Northern, electroforesis en gel, PCR, radioetiquetado, conteo de escintilación y la cromatografía por afinidad. Se pueden utilizar métodos bioquímicos analíticos adicionales tales como la espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés), cromatografía de capa fina (TLC, por sus siglas en inglés) y cromatografía por hiperdifusión.
La selección de un formato de hibridación de ácido nucleico no es crítica. Una variedad de formatos de hibridación de ácido nucleico es conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los formatos comunes incluyen ensayos tipo emparedado y ensayos de desplazamiento o competición. Las técnicas de hibridación se describen de modo general en, por ejemplo, “Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach,” Eds. Hames y Higgins, IRL Press (1985).
La sensibilidad de los ensayos de hibridación se pueden mejorar a través del uso de un sistema de amplificación de ácido nucleico que multiplica el ácido nucleico objetivo que se detecta. Las técnicas de amplificación in vitro adecuadas para amplificar secuencias para usar como sondas moleculares o para generar fragmentos de ácido nucleico para las subclonaciones posteriores son bien conocidas. Los ejemplos de técnicas suficientes para guiar a los expertos en los métodos de amplificación in vitro, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación de Ob-replicasa y otras teenicas mediadas por RNA polimerasa (por ejemplo, NASBA™) se encuentran en Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press (2000); y Ausubel et al., SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. y John Wilcy & Sons, Inc. (2002); así como también la patente estadounidense n.° 4,683,202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Arnheim & Levinson (1 de octubre, 1990), C&EN 36; The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); Kwoh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 1 173 (1989); Guatelli et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990); Lomell et al., J. Clin. Chem., 35: 1826 (1989); Landegren et al., Science, 241 :1077 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu y Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringer et al., Gene, 89: 117 (1990); y Sooknanan y Malek, Biotechnology, 13:563 (1995). Los métodos mejorados para clonar ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen en la patente estadounidense n.° 5,426,039. Otros métodos descritos en la técnica son la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA™, Cangene, Mississauga, Ontario) y sistemas de Ob-replicasa. Estos sistemas se pueden usar para identificar directamente los mutantes donde los cebadores de LCR o PCR están diseñados para ser extendidos o ligados solo cuando está presente una secuencia seleccionada. De manera alternativa, las secuencias seleccionadas se pueden amplificar generalmente usando, por ejemplo, los cebadores de PCR no específicos y la región objetivo amplificada luego se sondea para una secuencia específica que indica una mutación. La divulgación de las referencias antes descritas se incorpora a la presente en su totalidad a todos los efectos mediante esta referencia.
Los ácidos nucleicos para usar como sondas, por ejemplo, en metodos de amplificación in vitro, para usar como sondas de genes o como componentes inhibidores se sintetizan químicamente típicamente de acuerdo con el método triéster de fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage et al., Tetrahedron Letts., 22: 1859 1862 (1981 ), por ejemplo, usando un sintetizador automático, como se describe en Needham VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984). La purificación de polinucleótidos, cuando es necesario, se realiza típicamente por electroforesis en gel de acrilamida nativa o por HPLC con intercambio de aniones como se describe en Pearson et al. , J. Chrom., 255: 137 149 (1983). La secuencia de los polinucleótidos sintéticos se puede verificar usando el método de degradación químico de Maxam y Gilbert (1980) en Grossman y Moldave (eds.) Academic Press, Nueva York, Methods in Enzymology, 65:499.
Un medio alternativo para determinar el nivel de transcripción es la hibridación in situ. Los ensayos de hibridación in situ son bien conocidos y se describen generalmente en Angerer et al., Methods Enzymol . , 152:649 (1987). En un ensayo de hibridación in situ, las células se ajustan a un soporte sólido, típicamente a una lámina de vidrio. Si se debe sondear el DNA, las células se desnaturalizan con calor o álcali. Las células luego se ponen en contacto con una solución de hibridación a una temperatura moderada para permitir la hibridación de las sondas específicas que están etiquetadas. Las sondas se etiquetan preferentemente con radioisótopos o indicadores fluorescentes.
IX. Ejemplos La presente invención se describirá en mayor detalle mediante ejemplos específicos. Los ejemplos que siguen se ofrecen a efectos ilustrativos y no se pretende que limiten la invención de forma alguna. Los expertos en la teenica reconocerán fácilmente varios parámetros que no son fundamentales y que se pueden cambiar o modificar para dar básicamente los mismos resultados.
Métodos generales: Todas las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente en una presión positiva de nitrógeno a menos que se establezca de otra manera. Todos los reactivos se compraron de fuentes comerciales y se utilizaron sin purificación adicional. El progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC en gel de sílice 60 F254 (0,25 mm, E. Merck). Se detectaron puntos bajo luz UV o mediante carbonización con anisaldehído o manchas de sulfato de cobre. Todas las cromatografías en columna se llevaron a cabo en gel de sílice 60 (40-60 mM). La relación entre el gel de sílice y el producto bruto varió de 100 a 50:1. Se registraron los espectros de 1H NMR a 300MHz o 400MHz y se hizo referencia de forma interna a los cambios químicos con respecto al solvente protonado residual (CHCI3 7,27 ppm). Las soluciones orgánicas se concentraron al vacío a < 40 °C.
Ejemplo 1 Este Ejemplo describe la síntesis de lípidos catiónicos, trialquilo de ejemplo de la presente invención.
Esquema sintetico para el Compuesto 9 Síntesis del compuesto 2 A una solución enfriada (0 °C) de (Z)-dec-4-en-1 -ol 9 (20 g, 128,0 mmol) y trietilamina (26,7 mL, 191 ,9 mmol) en diclorometano anhidro (200 mL) se le agregó lentamente cloruro de metansulfonilo (14,9 mL, 191 ,9 mmol). La solución se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se diluyó con diclorometano (100 mL). La solución se lavó con bicarbonato de sodio saturado (3 x 150 mL) y luego los lavados acuosos combinados se extrajeron con diclorometano (150 mL). Los extractos de diclorometano combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo se filtró a través de una almohadilla de sílice (diclorometano al 100 %) para proporcionar (Z)-dec-4-enil metanosulfonato 2 como un aceite amarillo (28,5 g, 95 %). Rf 0,5 (CH2CI2 al 100 %).
Síntesis del compuesto 3 A una solución de metanosulfonato de (Z)-dec-4-enilo 2 (28,5 g, 121 , 1 mmol) en 2-metiltetrahidrofurano (280 mL) se agregó bromuro de tetrabutilamonio (48,8 g, 151 ,4 mmol). La solución se agitó a 80 °C durante 30 minutos en nitrógeno, luego se diluyó con éter (150 mL) y se lavó con agua (75 mL) y salmuera (75 mL). La solución de éter se secó en sulfato de magnesio, se filtró y concentró al vacío hasta que se secó. El aceite amarillo pálido se filtró a través de una almohadilla de sílice (hexanos al 100 %) para proporcionar (Z)-1 -bromodec-4-eno 3 como un aceite incoloro (23,0 g, 87 %). Rf 0,9 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 4 A una suspensión de limaduras de magnesio (1 ,4 g, 55, 1 mmol) en THF anhidro (6 mL) en nitrógeno se agregó lentamente una solución de (Z)-1 -bromodec-4-eno 3 (11 ,5 g, 52,5 mmol) en THF (12 mL). La mezcla de reacción se agitó a 45 °C durante 30 minutos en nitrógeno. La solución se enfrió a 0 °C y una solución de formiato de etilo (4, 1 g, 55, 1 mmol) en THF (12 mL) se agregó gota a gota durante más de 5 minutos. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se enfrió a -15 °C y se inactivó lentamente con agua (10 mL) seguido por ácido clorhídrico 5M (15 mL). Luego de que el magnesio se disolvió por completo, la solución se diluyó con agua (50 mL) y se extrajo con hexanos (3 x 75 mL). Los extractos combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo obtenido se disolvió en etanol (40 mL) y se agregó una solución de hidróxido de potasio (4,4 g, 78,7 mmol) en agua (10 mL). La mezcla de reacción se agitó vigorosamente durante 30 minutos y luego se concentró al vacío para quitar el etanol. La solución luego se volvió ácida con ácido clorhídrico' 5 M (15 mL) y se extrajo con hexanos (3 x 75 mL). Los extractos de hexanos combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío hasta que se secaron. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna (hexanos al 100 % respecto a acetato de etilo al 2,5 % en hexanos) para proporcionar (6Z,15Z)-henicosa-6, 15-dien-11 -ol 4 como un sólido amarillo pálido (5,6 g, 35 %). Rf 0,4 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 5 A una solución enfriada (0 °C) de 6Z, 15Z)-henicosa-6, 15-dien-11 5 ol 4 (5,6 g, 18,2 mmol) y trietilamina (3,8 mL, 27,2 mmol) en diclorometano anhidro (50 ml_) se le agregó lentamente cloruro de metanosulfonilo (2, 1 mL, 27,2 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se diluyó con diclorometano (50 mL). La solución se lavó con bicarbonato de sodio ío saturado (3 x 25 mL), luego los lavados acuosos combinados se extrajeron con diclorometano (50 mL). Los extractos de diclorometano combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron al vacío hasta que se secaron. El aceite amarillo pálido se filtró a través de una almohadilla de sílice (DCM al 100 %) para 15 proporcionar metanosulfonato de (6Z, 15Z)-henicosa-6, 15-dien-1 1 -ilo 5 como un aceite incoloro (7,6 g). Rf 0,8 (CH2CI2 al 100 %).
Síntesis del compuesto 6 20 Una solución de (6Z,15Z)-henicosa-6, 15-dien-1 1 -il metanosulfonato 5 (7,6 g, 19,6 mmol) y cianuro de sodio (4,8 g, 98, 1 mmol) en DMF anhidro (60 mL) se calentó a 60 °C durante la noche. 25 Después de terminar, la mezcla de reacción se volcó en agua (200 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Los extractos de acetato de etilo combinados se lavaron con salmuera (3 x 100 mL), se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío hasta secarse. El producto se purificó por cromatografía en columna (hexanos al 100 % respecto a acetato de etilo al 1% en hexanos) para proporcionar (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enenitrilo 6 como un aceite incoloro (6,6 g, 97 %). Rf 0,75 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 7 A una solución enfriada (-78 °C) de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enenitrilo 6 (4,0 g, 12,6 mmol) en diclorometano anhidro (125 mL) se agregó lentamente una solución de 1 M de hidruro de diisobutilalumino en hexanos (5,6 mL, 31 ,5 mmol). La solución se entibió hasta -15 °C y se agitó durante 1 hora. Al finalizar, la reacción se inactivó con ácido clorhídrico al 5 % (30 mL) y se agitó a -15 °C hasta que la evolución del gas de hidrógeno cesó. La solución luego se diluyó con diclorometano (75 mL) y la capa orgánica se lavó con ácido clorhídrico 5 M (100 mL).
Los extractos de diclorometano se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo se purificó por cromatografía en columna (hexanos al 100 % respecto a acetato de etilo al 2 % en hexanos) para proporcionar (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 como un aceite incoloro (3,9 g, 97 %). Rf 0,65 (EtOAc-Hexanos al 5%).
Síntesis del compuesto 8 A una suspensión de limaduras de magnesio (0,6 g, 23,9 mmol) en tetrahidrofurano (5 ml_) se agregó lentamente una solución de (Z)-1 - bromodec-4-eno 3 (4,5 g, 20,5 mmol) en tetrahidrofurano (5 mL). La ío mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se agregó una solución de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 en tetrahidrofurano (5 mL). La solución se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se volcó en ácido clorhídrico al 5 % (50 mL) y hielo (100 mL). La solución se extrajo con éter (2 x 150 mL). Los 15 extractos de éter combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo al 1 % en hexanos) para proporcionar (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16- dien-11 -ol 8 como un aceite incoloro (4,8 g, 76 %). Rf 0,45 (EtOAc-20 Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 9 i 25 A una solución de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11 -ol 8 (0,4 g, 0,9 mmol), clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,2 g, 1 ,3 mmol), clorhidrato de EDCI (0,25 g, 1 ,3 mmol), diisopropiletilamina (0,4 mL, 2,6 mmol) en diclorometano anhidro (10 ml_) se agregó dimetilaminopiridina (5 mg). La solución se sometió a reflujo durante 2 horas y luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se concentró al vacío hasta secarse y se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo al 100 %) para proporcionar 4-(dimetilamino)butanoato de 6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11-ilo 9 como un aceite amarillo pálido. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,36 (m, 6H), 4,93 (m, 1 H), 2,30 (m, 4H), 2,22 (s, 6H), 2,03 (m, 12H), 1 ,88 (m, 2H), 1 ,66-1 , 18 (m, 31 H), 0,90 (m, 9H). Rf 0,3 (MeOH-CH2CI2 al 10%).
Esquema sintetico para los Compuestos 1 1 y 13 , , , .
Síntesis del compuesto 10 A una solución de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ol 8 (2,4 g, 5,2 mmol), ácido 6-bromohexanoico (1 ,5 g, 7,8 mmol), clorhidrato de EDCI (1 ,5 g, 7,8 mmol), diisopropiletilamina (2,0 mL, 15,6 mmol) en diclorometano anhidro (25 mL) se agregó dimetilaminopiridina (15 mg). La solución se sometió a reflujo durante 2 horas, luego se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentró al vacío hasta que se secó. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía en columna en gel de sílice 60 (2” W x 10” L; se eluyó con EtOAc/Hex al 5 %) para proporcionar 6-bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 10 como un aceite incoloro (3,1 g, 94 %). Rf 0,5 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 11 A 6-bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11 -ilo 10 (3, 1 g, 4,9 mmol) en un recipiente de teflón sellado a presión se agregó 5,6 M dimetilamina en etanol (20 ml_) y la reacción se calentó a 70 °C y se agitó durante la noche. Luego que se completó, la reacción se concentró al vacío hasta secarse. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml_) y se lavó con una solución de bicarbonato de sodio (2 x 50 mL). La capa de acetato de etilo se secó en sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío hasta que se secó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAc al 100%) para proporcionar 6-(dimetilamino)hexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11-ilo 11 como un aceite amarillo pálido (2,0 g, 69 %), 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,36 (m, 6H), 4,93 (m, 1 H), 2,27 (m, 10H), 2,00 (m, 12H), 1 ,63 (m, 6H), 1 ,51 (m, 6H), 1 ,28 (m, 25H), 0,90 (m, 9H). Rf 0,3 (MeOH-CH2CI2 al 10%).
Síntesis del compuesto 12 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-bromohexanoato de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11 -ilo 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-il 12 como un aceite incoloro (3,3 g, 61 %) a partir de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11 -ol 8 (4,0 g, 8,7 mmol), ácido 6-bromo-n-valérico (2,4 g, 13,0 mmol), clorhidrato de EDCI (2,5 g, 13,0 mmol), diisopropiletilamina (3,4 g, 26,0 mmol) y dimetilaminopiridina (10 mg). Rf 0,5 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 13 Al utilizar un procedimiento análogo a aquellos descritos para la síntesis de 6-(dimetilamino)hexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 11 , se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 13 como un aceite amarillo pálido (1 ,9 g, 62 %) a partir de dimetilamina 5,6 M en etanol (20 mL). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,45-5,28 (m, 6H), 4,95-4,90 (m, 1 H), 2,34-2,23 (m, 4H), 2,23-2,20 (s, 6H), 2,06-1 ,92 (m, 12H), 1 ,70-1 ,58 (m, 5H), 1 ,58-1 ,44 (m, 5H), 1 ,44-1 , 15 (m, 25H), 0,92-0,87 (m, 9H). Rf 0,4 (MeOH-CH2CI2 al 10%).
Esquema sintetico para el Compuesto 14 - Síntesis del compuesto 14 Un matraz que contenía 5-(dimetilamino)pentanoato de (6Z, 16Z)- 12-((Z)-non-4-en-1-il)tricosa-6, 16-dien-11 -ilo 13 (200 mg, 0,34 mmol) se vació y se volvió a llenar con nitrógeno (dos veces) y luego se trató con Pd/C (150 mg, 10 % p/p) y luego se suspendió en EtOAc (10 mL). El matraz de reacción luego se vació y se volvió a llenar con H2 (3x) y la mezcla se agitó vigorosamente (18 h). El H2 luego se retiró y el matraz se volvió a llenar con N2. La mezcla de reacción se filtró mediante Celite, la torta de filtrado se enjuagó con EtOAc, y el filtrado se concentró. El material bruto se sometió a cromatografía (EtOAc) para proporcionar 5-(dimetilamino)pentanoato de 12-noniltricosan-1 1 -ilo 14 (100 mg, 50 %) como un aceite incoloro. Rf 0,35 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %); ? NMR (400MHz, CDCI3, dH) 4,95-4,90 (m, 1 H), 2,31 (t, 2H), 2,27 (t, 2H), 2,21 (s, 6H), 1 ,68-1 ,60 (m, 3H), 1 ,58-1 ,42 (m, 5H), 1 ,38-1 , 16 (m, 54H), 0,88 (t, 6H).
Esquema sintetico para los Compuestos 19 y 21 I, .
, . ! Síntesis del compuesto 15 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de metanosulfonato de(Z)-dec-4-enilo 2, se obtuvo metanosulfonato de (Z)-non-3-enilo 15 como un aceite amarillo (28,5 g, 92 %) a partir de (Z)-non-3-en-1 -ol (20,0 g, 128,0 mmol), trietilamina (26,7 mL, 191 ,9 mmol) y cloruro de metansulfonilo (14,9 mL, 191 ,9 mmol). Rf 0, 15 (acetato de etilo-hexanos al 30%).
Síntesis del compuesto 16 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de (Z)-1 -bromodec-4-eno 3, se obtuvo (Z)-1 -bromonon-3-eno 16 como un aceite incoloro (27,0 g, cuantitativo) a partir de metanosulfonato de (Z)-dec-4-enilo 15 (28,5 g, 129 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (52,0 g, 161 ,4 mmol). Rf 0,6 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 17 Un matraz de fondo redondo de 100 mL se cargó con limaduras de magnesio (0,6 g, 25,7 mmol) y una barra de agitación. El matraz se secó con una pistola de aire caliente durante 5 minutos. El matraz se cargó con THF (5 mL) y un solo grano de yodo. Se agregó lentamente una solución de (Z)-1 -bromonon-3-eno (4,5 g, 22,0 mmol) en THF (5 mL) a la mezcla y la reacción se sometió a reflujo durante 30 minutos en nitrógeno. La solución se enfrió a temperatura ambiente y se agregó una solución de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (4,7 g, 14,7 mmol) en THF (5 mL). La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente y al finalizar, la mezcla se volcó en HCI al 5 % (50 mL) y hielo (100 mL). La solución se extrajo con eter (2 x 150 mL) y los extractos de éter combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (columna: 2” W x 8” L; se eluyó con Hexanos al 100 % respecto a acetato de etilo al 5 % en hexanos) para proporcionar (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ol 17 como un aceite incoloro (5,4 g, 82 %). Rf 0,5 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 18 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16- ien- 1 1 -ilo 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ilo 18 como un aceite incoloro (0,9 g, 66 %) a partir de (6Z, 15Z)-11-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ol 17 (0,35 g, 0,7 mmol), ácido 5-bromo-n-valérico (0,60 g, 3,4 mmol), EDCI (0,60 g, 3,4 mmol), diisopropiletilamina (0,90 g, 6,7 mmol) y DMAP (5 mg, catalizador). Rf 0,5 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 19 Al utilizar un procedimiento análogo a aquellos descritos para la síntesis de 6-(dimet¡lamino)hexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 11 , se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de (6Z, 15Z)-1 1-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ilo 19 como un aceite incoloro (0,2 g, 24 %) a partir de dimetilamina 5,6 M en etanol (10 mL) y (6Z, 15Z)-1 1-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ol 17 (0,35 g, 0,7 mmol). 1 H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,40-5,28 ( , 6H), 4,97-4,88 (m, 1 H), 2,35-2,24 (m, 4H), 2,24-2,19 (m, 6H), 2,08-1 ,93 (m, 12H), 1 ,70-1 ,55 (m, 3H), 1 ,55-1 ,45 (m, 5H), 1 ,45-1 , 13 (m, 25H), 0,93-0,82 (m, 9H) Rf 0,4 (MeOH-CH2CI2 al 10%).
Síntesis del compuesto 20 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 10, se obtuvo 6-bromohexanoato de (6Z, 15Z)-11 -((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ilo 20 como un aceite incoloro (1 ,4 g, 99 %) a partir de (6Z,15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ol 17 (0,35 g, 0,7 mmol), ácido 6-bromo-n-caproico (0,70 g, 3,4 mmol), EDCI (0,60 g, 3,4 mmol), diisopropiletilamina (0,90 g, 6,7 mmol) y DMAP (5 mg, catalizador). Rf 0,6 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 21 AI utilizar un procedimiento anaiogo a aquellos descritos para la síntesis de 6-(dimetilamino)hexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1 -ilo 11 , se obtuvo 6-(dimetilamino)hexanoato de (6Z,15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-1 1-ilo 21 como un aceite incoloro (1 ,2 g, 92 %) a partir de dimetilamina 5,6 M en etanol (15 mL). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5.44-5.28 (m, 6H), 4.95-4.88 (m, 1 H), 2.33-2.19 (m, 10H), 2.08-1.90 (m, 12H), 1 ,70-1 ,23 (m, 9H), 1 ,23-1 , 14 (m, 26H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0, 15 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 22 , Síntesis del compuesto 22 A una solución de (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-enil)henicosa-6, 15-dien-10-ol 17 (0,5 g, 1 ,1 mmol), clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,3 g, 1 ,7 mmol), clorhidrato de EDCI (0,3 g, 1 ,7 mmol), DIPEA (0,4 g, 3,4 mmol) en diclorometano anhidro (10 mL) se agregó DMAP (5 mg). La solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche en una atmósfera de nitrógeno. La mezcla se concentró in vacuo hasta que se secó y luego se absorbió en DCM (150 mL) y se extrajo con bicarbonato de sodio saturado. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía en columna en gel de sílice 60 (1 : 1 acetato de etilo/hexanos) para proporcionar 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z, 15Z)-1 1-((Z)-dec-4-enil)henicosa-6,15-dien-10-ilo 22 como un aceite incoloro (0,4 g, 67 %). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,40-5,28 (m, 6H), 4,97-4,90 (m, 1 H), 2,36-2,25 (m, 4H), 2,25-2, 19 (m, 6H), 2,07-1 ,95 (m, 12H), 1 ,85-1 ,73 (m, 2H), 1 ,58-1 ,45 (m, 3H), 1 ,45-1 , 10 (m, 24H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,4 (MeOH-CH2CI2 al 10%).
Esquema sintético para los Compuestos 23, 24 y 25 , _ - . - Síntesis del compuesto 23 Una solución de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1 -ol 8 (0,5 g, 1 , 1 mmol) en éter dietilo anhidro (10 mL) se agregó lentamente a una solución de difosgeno (0,2 mL, 1 ,8 mmol) en éter dietilo anhidro, enfriada a aproximadamente -15 °C. La solución se agitó durante 1 hora y luego se agregó N,N,N’-trimetil-1 ,3-propanediamina (1 ,3 mL, 8,7 mmol) a -15 °C. La solución se entibió a temperatura ambiente, se agitó durante 1 hora y se filtró hasta quitar las sales de amonio y urea. El filtrado de dietil éter se concentró al vacío hasta secarse. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo al 100%) para proporcionar 3-(dimetilamino)propil(metil)carbamato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 23 como un aceite incoloro (0, 15 g, 23 %), 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,41 -5,29 (m, 6H), 4,85-4,77 (m, 1 H), 3,35-3,21 (m, 2H), 2,93-2,81 (m, 3H), 2,31 -2, 17 (m, 8H), 2,08-1 ,92 (m, 12H), 1 ,75-1 ,64 (m, 2H), 1 ,64-1 , 15 (m, 31 H), 0,92-0,85 (m, 9H). Rf 0,45 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Síntesis del compuesto 24 5 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 3-(dimetilamino)propil(metil)carbamato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-ío dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 23, se obtuvo 3(dimetilamino)propilcarbamato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa- 6, 16-dien-1 1-ilo 24 como un aceite incoloro (0, 1 g, 17 %) a partir de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-1 1 -o I 8 (0,5 g, 1 , 1 mmol), difosgeno (0,2 ml_, 1 ,8 mmol), piridina, y 3-(Dimetilamino)-1 -propilamina 15 (0,9 g, 8,7 mmol). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,44-5,28 (m, 6H), 4,81 - 4,72 (bs, 1 H), 4,55-4,45 (bs, 1 H), 3,34-3, 15 (m, 3H), 2,45-2, 13 (m, 7H), 2, 10-1 ,86 (m, 12H), 1 ,75-1 ,57 (m, 3H), 1 ,57-1 ,03 (m, 30H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,2 (MeOH-CH2CI2 al 10 %). 20 Síntesis del compuesto 25 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la 25 síntesis de 3-(dimetilamino)prop¡l(metil)carbamato de (6Z, 16Z)-12-((Z)- dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-Mo 23, se obtuvo 2(dimetilamino)etilcarbamato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 25 como un aceite incoloro (0,20 g, 33 %) a partir de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11 -ol 8 (0,5 g, 1 , 1 mmol), difosgeno (0,2 ml_, 1 ,8 mmol) y A/./V-dimetiletilenodiamina (0,8 g, 8,7 mmol). 1 H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,40-5,28 (m, 6H), 5,08-5,01 (bs, 1 H), 4,82-4,73 (bs, 1 H), 3,30-3, 18 (m, 2H), 2,44-2,35 (m, 2H), 2,30-2,20 (m, 6H), 2,07-1 ,91 (m, 12H), 1 ,65-1 , 1 1 (m, 31 H), 0,93-0,85 (m, 9H). Rf 0,4 (MeOH-DCM al 10%).
Esquema sintético para los Compuestos 26, 27 y 28 . ¾0 - .
Síntesis del compuesto 26 Una solución de (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 15-dien-10-ol 17 (2,25 g, 5,036 mmol) y piridina (611 mI_, 7,6 mmol) en Et20 anhidro (15 mL) se agregó a una solución enfriada (0 °C) de difosgeno (910 mL, 7,6 mmol) en Et20 (15 mL). Luego de agitar (10 min) la mezcla de reacción se filtró y concentró para quitar el solvente y gas fosgeno remanente. Un tercio de este cloroformiato (0,879 g, 1 ,679 mmol) se absorbió en Et20 (5 mL) y se agregó a una solución enfriada (0 °C) de N,N dimetiletilenodiamina (367 mL, 3,4 mmol) en Et20 anhidro (5 mL).
Luego de agitar (20 min), la mezcla se filtró, se concentró y se sometió a cromatografía (EtOAc al 100 %) para proporcionar (2- (dimetilamino)etil)carbamato de(6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 15-dien-10-ilo 26 (603 mg, 64 %) como un aceite incoloro, transparente. Rf 0,28 (MeOH/CH2CI2 al 10 %); 1H NMR (400MHz, CDCI3, dH) 5,45-5,36 (m, 6H), 5,30 (br s, 1 H), 4,89-4,78 (m, 1 H), 3,32-3,21 (m, 2H), 2,42 (t, 2H), 2,25 (s, 6H), 2,16-1 ,94 (m, 12H), 1 ,63-1 , 19 (m, 29H), O,92 (t, 9H).
Síntesis del compuesto 27 Una solución enfriada (0 °C) de cloroformiato (0,88 g, 1 ,7 mmol) (como se preparó en la síntesis de (2-(dimetilamino)etil)carbamato de (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 15-dien-10-ilo 26) se disolvió en Et20 anhidro (5 mL) y se agregó a una solución de N,N dimetilpropildiamina (422 mI_, 3,4 mmol) en Et20 anhidro (5 mL). Al finalizar (20 min), la solución se filtró, se concentró y luego el material bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 100 %) para proporcionar (3-(dimetilam¡no)propil)carbamato de (6Z, 15Z)-11 -((Z)-dec- 4-en-1-¡l)docosa-6,15-dien-10-ilo 27 (675 mg, 70%) como un aceite incoloro, transparente. Rf 0,32 (MeOH/CH2CI2 al 10 %); 1H NMR (400MHz, CDCI3, dH) 5,44-5,33 (m, 6H), 4,86-4,78 (m, 1 H), 3,32-3,21 (m, 2H), 2,36 (t, 2H), 2,24 (s, 6H), 2, 14-1 ,97 (m, 12H), 1 ,69 (app, p, 2H), 1 ,61 -1 ,50 (m, 3H), 1 ,50-1 ,20 (m, 27H), 0,91 (t, 9H).
Síntesis del compuesto 28 Una solución enfriada (0 °C) de cloroformato (0,88 g, 1 ,7 mmol) (como se preparó en la síntesis de (2-(dimetilamino)etil)carbamato de (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 15-dien-10-ilo 26) se disolvió en Et20 anhidro (5mL) y se agregó a una solución de N,N,N’ trimetilpropildiamina (492 mI_, 3,4 mmol) en Et20 anhidro (5 ml_). Al finalizar (20 min), la solución se filtró, se concentró y luego el material bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc al 100 %) para proporcionar (3-(dimetilamino)propil)(metil)carbamato de (6Z, 15Z)-1 1 -((Z)-dec-4-en-1 -il)henicosa-6, 15-dien-10-ilo 28 (672 mg, 68 %) como un aceite incoloro, transparente. Rf 0,44 (MeOH/CH2CI2 al 10 %); 1H NMR (400MHz, CDCI3, dH) 5,43-5,32 (m, 6H), 4,85 (br, s, 1 H), 3,38-3,27 (m, 2H), 2,95-2,87 (m, 3H), 2,28 (t, 2H), 2,24 (s, 6H), 2, 14-1 ,96 (m, 12H), 1 ,72 (app, p, 2H), 1 ,67-1 ,49 (m, 3H), 1 ,49-1 ,20 (m, 26H), 0,91 (t, 9H).
Esquema sintetico para los Compuestos 30 y 31 , Un matraz de fondo redondo de 100 mL se cargó con limaduras de magnesio (263 mg, 10,9 mmol) y una barra de agitación. El matraz se secó con una pistola de aire caliente durante 5 minutos, se enfrió en nitrógeno antes de agregar THF (5 mL) y un pequeño grano de yodo. Una solución de (Z)-1-bromodec-4-eno 3 (2 g, 9, 1 mmol) en THF (5 mL) se agregó lentamente. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se agregó etil glioxalato (0,375 mL, 1 ,82 mmol, 50 % de solución en tolueno). Al finalizar, la solución se inactivó con solución de cloruro de amonio saturado (5 mL) y se agitó hasta que el exceso de magnesio se disolvió. La solución se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Los extractos combinados se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y se concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo se purificó por cromatografía en columna (hexanos al 100 % respecto a EtOAc al 20% en hexanos) para proporcionar (6Z,16Z)-11-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11,12-diol 29 como un aceite incoloro (700 mg, 48 %).
Síntesis del compuesto 30 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 4-(dimetilamino)butanoato de 6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ilo 9, se obtuvo 4-(dimetilamino)butanoato de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)-12-hidroxidocosa-6,16-dien-11-ilo 30 como un aceite incoloro (0,10 g, 25 %) a partir de (6Z,16Z)-11-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-diene-11 ,12-diol (0,35 g, 0,7 mmol), clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,20 g, 1,1 mmol), EDCI (0,20 g, 1,1 mmol), diisopropiletilamina (0,3 g, 2,2 mmol) y DMAP (5 mg, catalizador). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,44-5,28 (m, 6H), 5,03-4,95 (m, 1 H), 2,25-2,17 (m, 6H), 2,14-1,65 (m, 14H), 1,65-1,10 (m, 33H), 0,93-0,82 (m, 9H). Rf 0,2 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Síntesis del compuesto 31 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 4-(dimetilamino)butanoato de 6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ilo 9, se obtuvo 3-(dimetilamino)propanoato de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)-12-hidroxidocosa-6,16-dien-11-ilo 31 como un aceite incoloro (0,4 g, 33 %) a partir de (6Z,16Z)-11-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11,12-diol (1,0 g, 2,1 mmol), clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,50 g, 3,1 mmol), EDCI (0,60 g, 3,1 mmol), diisopropiletilamina (0,80 g, 6,3 mmol) y DMAP (5 mg, catalizador). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,40-5,28 (m, 6H), 5,12-5,07 (m, 1H), 4,75-4,55 (bs, 1 H), 2,77-2,65 (m, 1H), 2,65-2,41 (m, 3H), 2,28-2,15 (m, 6H), 2,15-1,92 (m, 12H), 1,67-1,10 (m, 30H), 0,93-0,82 (m, 9H). Rf 0,5 (MeOH-CH2CI2 al 10%).
Esquema sintético para el Compuesto 40 i · \ ' Síntesis del compuesto 33 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 2, se obtuvo metanosulfonato de (Z)-non-3-enilo 33 como un aceite amarillo (33 g, 85 %) a partir de (Z)-non-3-en-1 -ol 32 (25,0 g, 176 mmol), trietilamina (25,0 mL) y cloruro de metansulfonilo (27,2 mL, 352 mmol). Rf 0,68 (CH2CI2).
Síntesis del compuesto 34 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 3, se obtuvo bromuro de ((Z)-non-3-enilo 34 como un aceite amarillo (20,2 g, 85 %) a partir de metanosulfonato de (Z)-non-3-enilo (25,7 g, 1 17 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (52,6 g, 163 mmol). Rf 0,73 (hexanos).
Síntesis del compuesto 35 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 4, se obtuvo (6Z, 13Z)-nonadeca-6, 13-dien-10-ol 35 (9, 1 1 g, 85 %) como un aceite incoloro a partir de bromuro de (Z)-non-3-enilo (15,8 g, 76,8 mmol), limaduras de magnesio (2,0 g, 82 mmol), formiato de etilo (6,36 mL, 79,1 mmol) e hidróxido de potasio (3,88 g, 69, 1 mmol). Rf 0,43 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 36 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 5, se obtuvo metanosulfonato de (6Z, 13Z)-nonadeca-6,13-dien-10-ilo 36 (11 ,6 g, 99 %) como un aceite incoloro a partir de (6Z, 13Z)-nonadeca-6, 13-dien-10-ol (9,1 1 g, 32,5 mmol), trietilamina (10 mL) y cloruro de metansulfonilo (5,0 mL, 65 mmol). Rf 0,73 (CH2CI2).
Síntesis del compuesto 37 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6, se obtuvo (Z)-2-((Z)-non-3-en-1 -il)undec-5-enenitrilo 37 (7,2 g, 77 %) como un aceite incoloro a partir de metanosulfonato de (6Z, 13Z)-nonadeca-6,13-dien-10-ilo (1 1 ,6 g, 32,3 mmol) y cianuro de sodio (3,96 g, 80,9 mmol). Rf 0,75 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 38 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 7, se obtuvo (Z)-2-((Z)-non-3-en-1 -il)undec-5-enal 38 (5,0 g, 69 %) como un aceite incoloro a partir de D-2-((Z)-non-3-en-1 -il)undec-5-enenitrilo (7,2 g, 24,9 mmol) y DIBAL (49,7 mL como una solución de 1 M en hexanos, 49,7 mmol). Rf 0,69 (10 EtOAc-hexanos).
Síntesis de! compuesto 39 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 8, se obtuvo (6Z, 14Z)-1 1 -((Z)-non-3-en-1 -il)icosa-6, 14-dien-10-ol 39 (1 ,64 g, 76 %) como un aceite incoloro a partir de (Z)-2-((Z)-non-3-en-1 -il)undec-5-enal (1 ,5 g, 5, 1 mmol), bromuro de (Z)-non-3-enilo (1 ,58 g, 7,7 mmol) y limaduras de magnesio (206 mg, 8,5 mmol). Rf 0,46 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 40 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 9, se obtuvo 4-(dimetilam¡no)butanoato de((6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 40 (483 mg, 76 %) como un aceite incoloro a partir de (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ol (500 mg, 1,19 mmol), EDC (686 mg, 3,58 mmol), base de Hünig (726 mI_, 4,17 mmol) y clorhidrato de ácido N,N dimetilaminobutírico (600 mg, 3,58 mmol). Rf 0,43 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 42 . I i , s 42 Síntesis del compuesto 41 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ilo 41 (655 mg, 95 %) como un aceite incoloro a partir de (6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ol (500 mg, 1,19mmol), EDC (686 mg, 3,58 mmol) y ácido 5-bromovalérico (649 mg, 3,58 mmol). Rf 0,54 (EtOAc-Hexanos al 5 %).
Síntesis del compuesto 42 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 11, se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de 6Z,14Z)-11-((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ilo 42 (421 mg, 68 %) como un aceite incoloro a partir de 5-bromopentanoato de (6Z, 14Z)-11 -((Z)-non-3-en-1-il)icosa-6,14-dien-10-ilo (655 mg, 1,13 mmol) y dimetilamina (25 mL como una solución 5,6 M en EtOH). Rf 0,4 (CH3OH-CH2CI2 al 10%).
Esquema sintético para el Compuesto 50 , , i . . - , : , 50 Síntesis del compuesto 44 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 4, se obtuvo henicosan-1 1 -ol 44 (7,06 g, 99 %) como un aceite incoloro a partir de bromodecano (9,4 mL, 45,2 mmol), limaduras de magnesio (1 , 18 g, 48,4 mmol), formiato de etilo (3,74 mL, 46,6 mmol) e hidróxido de potasio (2,28 g, 40,7 mmol). Rf 0,36 (EtOAc-hexanos al 10 %), FW 312,57, C21H440 Síntesis del compuesto 45 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 5, se obtuvo metanosulfonato de henicosan-1 1 -ilo 45 (6,87 g, 78 %) como un aceite incoloro a partir de henicosan-1 1 -o I (7,06 g, 22,6 mmol), trietilamina (22 mL) y cloruro de metansulfonilo (3,5 mL, 45 mmol). Rf 0,86 (CH2CI2).
Síntesis del compuesto 46 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6, se obtuvo 2-decildodecanonitrilo 46 (2,25 g, 40 %) como un aceite incoloro a partir de metanosulfonato de henicosan-11 -ilo (6,87 g, 17,6 mmol) y cianuro de sodio (4,31 g, 87,9 mmol). Rf 0,84 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 47 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 7, se obtuvo 2-decildodecanal 47 (1 ,91 g, 84 %) como un aceite incoloro a partir de 2-decildodecanonitrilo (2,25 g, 7,0 mmol) y DIBAL (14 mL, como una solución de 1 M en hexanos, 14 mmol). Rf 0,51 (EtOAc-Hexanos al 5 %).
Síntesis del compuesto 48 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 8, se obtuvo (Z)-12-decildocos-6-en-1 1 -ol 48 (1 ,08 g, 40 %) como un aceite incoloro a partir de 2-decildodecanal (1 ,91 g, 5,87 mmol), bromuro de (Z)-dec-4-enil (1 ,45 g, 7,05 mmol) y limaduras de magnesio (183 mg, 7,54 mmol). Rf 0,26 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 49 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (Z)-12-decildocos-6-en-11 -ilo 49 (916 mg, 63 %) como un aceite incoloro a partir de (Z)-12-decildocos-6-en-1 1-ol (1 ,08 g, 2,33 mmol), EDC (804 mg, 4, 19 mmol) y ácido 5-bromovalerico (1 ,27 g, 6,99 mmol). Rf 0,29 (EtOAc-Hexanos al 5 %).
Síntesis del compuesto 50 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 11 , se 5-(dimetilamino)pentanoato de (Z)-12-decildocos-6-en-11 -ilo 50 (662 mg, 80 %) como un aceite incoloro a partir de 5-bromopentanoato de (Z)-12-decildocos-6-en-11 -ilo (916 mg, 1 , 16 mmol) y dimetilamina (27 ml_ como una solución 5,6 M en EtOH). Rf 0,51 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 53 , Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 8, se obtuvo (Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docos-16-en-11 -ol 51 (3,37 g, 65 %) como un aceite incoloro a partir de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (3,6 g, 1 1 ,2 mmol), 1-bromodecano (3,5 mL, 16,9 mmol) y limaduras de magnesio (438 mg, 18,0 mmol). Rf 0,31 (EtOAc-Hexanos al 5 %).
Síntesis del compuesto 52 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docos-16-en-1 1 -ilo 52 (4,69 g, 99 %) como un aceite incoloro a partir de (Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docos-16-en-1 1-ol (3,37 g, 7,29 mmol), EDC (2,51 g, 13, 1 mmol) y ácido 5-bromovalerico (3,96 g, 21 ,8 mmol). Rf 0,56 (EtOAc-Hexanos al 5 %).
Síntesis del compuesto 53 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 11 , se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de (Z)-12-decildocos-6-en-1 1-ilo 53 (943 mg, 99 %) como un aceite incoloro a partir de 5-bromopentanoato de (Z)-12-decildocos-6-en-11 -ilo (1 ,0 g, 1 ,6 mmol) y dimetilamina (30 mL como una solución 5,6 M en EtOH). Rf 0,50 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %).
Ejemplo 2 Este Ejemplo compara la eficacia, en un modelo de actividad siRNA ApoB murino, de lípidos de trialquilo de cadena corta de la presente invención respecto a lípidos que tienen cadenas alquilo más largas pero que son de otro modo estructuralmente idénticas a los lípidos de trialquilo de cadena corta.
Las formulaciones de partículas de ácido nucleico-lípidos que contienen lípidos catiónicos fueron evaluados para saber su capacidad de inactivación de la expresión ApoB en los hígados de ratones hembras BALB/c de 7 a 9 semanas de edad. Los ratones se dosificaron de forma intravenosa (vena de la cola) en grupos de tres a 0,02, 0,03 o 0,05 mg/kg. La inactivación ApoB (normalizado al gene constitutivo GAPDH) se midió relativa al PBS como un control negativo. Cada experimento fue finalizado 48 horas luego de la dosificación.
Para comparar con un control positivo, el rendimiento de lípidos trialquilo de cadena corta de la presente invención se compararon con un lípido catiónico potente, referido como C2K, conocido por facilitar la administración de los ácidos nucleicos, in vivo, en partícula de ácido nucleico-lípido ( Nature Biotech., Vol 28(2), 172 (2010)). C2K tiene la siguiente estructura: C2K Tal como se muestra en la Tabla 1 , a una dosis inyectada de 0,02 mg/kg, 10 de 11 lípidos catiónicos de la presente invención (compuestos 9, 13, 14, 19, 22, 27, 40, 42, 50 y 53) mostraron una mayor actividad que C2K.
Tabla 1 : El silenclamiento de ApoB (0,02 mg/kg siRNA) para varios lípidos catiónicos de trialquilo de la presente invención.
Tal como se muestra en la Tabla 2, es un experimento separado, a una dosis inyectada de 0,03 mg/kg, 5 de 7 lípidos catiónicos de la presente invención (compuestos 11 , 13, 19, 23, y 25) mostraron una actividad mayor que C2K.
Tabla 2: Silenciamiento ApoB (0,03 mg/kg siRNA) para varios lípidos catiónicos de trialquilo de cadena corta.
La actividad de los lípidos catiónicos de la presente invención también se comparó con los lípidos catiónicos de trialquilo correspondientes que son estructuralmente idénticos a los lípidos de la presente invención, excepto que las cadenas de alquilo son más largas. Las estructuras de estos lípidos catiónicos de trialquilo de cadenas más largas (identificados como compuestos 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60) se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: estructuras de lípidos catiónicos de trialquilo de cadena larga Los compuestos 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 60 se prepararon de acuerdo a los procedimientos descritos en la solicitud de patente estadounidense n.° 13/235,253, presentada el 16 de septiembre de 2011 , que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Tal como se muestra en la Tabla 4, los lípidos de cadenas más largas 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 se dosificaron a 0,05 mg/kg (2,5 veces la dosis descrita en la Tabla 1 ), y mostraron una inactivación de ApoB que variaba de +25 % a -69 % en comparación con 60 % para C2K (es decir, algunos compuestos mostraron una mejoría moderada sobre C2K).
Tabla 4: Silenciamiento ApoB (0,05 mg/kg siRNA) para varios lípidos catiónicos de trilinoleilo a Silenciamiento ApoB promedio durante cuatro estudios En general, la actividad de los lípidos catiónicos de trialquilo de cadena más corta (C9 a C10) de la presente invención se mejoró sustancialmente cuando se comparó con el lípido equivalente de trilinoleilo (C18) de cadena más larga correspondiente. Por ejemplo, una comparación directa del compuesto 13 con su variante de trilinoleilo 54 mostró una mejoría de -6 % (0,05 mg/kg) a -80 % (0,02 mg/kg) en inactivación de ApoB, a pesar del hecho de que el compuesto 13 se dosificó 2,5 veces menos. La misma tendencia se observó cuando se compararon los compuestos 55 a 11 , 56 a 24 y 57 a 25.
Ejemplo 3 Experimentos adicionales en el modelo ApoB murino utilizaron un lípido catiónico diferente como el control positivo; DLin-MP-DMA. DLin-MP-DMA se describe en la solicitud de patente WO 2011/141705, y tiene la estructura: DLin-MP-DMA Tal como se muestra en la Tabla 5, en el mismo modelo ApoB murino, se demostró que DLin-MP-DMA fue más eficaz que C2K en tres experimentos separados, y es por lo tanto un control positivo válido: Tabla 5. Comparación entre C2K y Dlin-MP-DMA como controles positivos En otro experimento, dos I í pidos más de la presente invención (Compuestos 62 y 71 ) se formularon en nanopartículas lípidas con siRNA para direccionar ApoB. Los ratones se dosificaron de forma intravenosa (vena de la cola) y se sacrificaron 48 h luego de la dosificación. Los hígados se recolectaron y se homogeneizaron, y luego se midió el nivel de silenciamiento ApoB (normalizado al gene constitutivo GAPDH) mediante ensayo Quantigene. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y se expresan como un porcentaje, en comparación con un grupo de control negativo tratado con PBS. La secuencia siRNA utilizada en este experimento fue diferente, y menos potente que la utilizada en el Ejemplo 2. Por lo tanto, las comparaciones entre experimentos no son posibles: Tabla 6: El silenciamiento de ApoB para varios lípidos catiónicos de trialquilo de la presente invención.
El compuesto 71 tuvo actividad similar con respecto al control de DLin-MP-DMA. El compuesto 62 fue significativamente más activo. La síntesis de estos y otros compuestos se describe en el Ejemplo 4.
Ejemplo 4 Estos Ejemplos describen la síntesis de compuestos adicionales de la presente invención.
Esquema sintético para el Compuesto 62 , , 62 Síntesis del compuesto 61 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 5, se obtuvo metanosulfonato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -i l)docosa-6 , 16-d ie n- 1 1 -ilo 61 (1 , 18 g, 90 %) como un aceite incoloro a partir de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 16-dien-1 1 -ol 8 (1 , 12 g, 2,43 mmol), trietilamina (8 mL) y cloruro de metanosulfonilo (0,38 ml_, 4,9 mmol). Rf 0,91 (CH2CI2).
Síntesis del compuesto 62 Una solución de mesilato 61 (1 ,09 g, 2,01 mmol) en tolueno (30 mL) se trató eficazmente con N,N-dimetilaminobutanol (1 ,34 mL, 10, 1 mmol) y NaH (442 mg como una dispersión al 60 % en aceite, 1 1 , 1 m ol). Luego que la evolución del gas cesó, la mezcla de reacción se llevó a reflujo (temperatura del baño 1 15 °C) y se agitó (50 h). La mezcla de reacción luego se enfrió (ta) y se vertió en agua fría y se extrajo con EtOAc. Los orgánicos combinados se lavaron con agua y salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía (EtOAc al 100 %) para proporcionar 4-(((6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 16-dien-1 1 -il)oxi)-N,N-dimetilbutan-1 -amina 62 (143 mg, 13 %) como un aceite amarillo pálido. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,41 -5,30 (m, 6H), 3,46-3,35 (m, 2H), 3, 19-3, 14 (m, 1 H), 2,34 (t, 2H), 2,24 (s, 6H), 2, 10-1 ,93 (m, 12H), 1 ,60-1 ,09 (m, 35H), 0,90 (t, 9H). Rf 0,54 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 71 , , , , , 71 Síntesis del compuesto 63 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 5, se obtuvo metanosulfonato de 3,7-dimetiloctilo 63 (7,47 g, >99 %) como un aceite incoloro a partir de 3,7-dimetiloctan-1 -ol (5,0 g, 31 ,6 mmol), trietilamina (8 mL) y cloruro de metansulfonilo (4,89 ml_, 63,2 mmol). Rf 0,69 (CH2CI2).
Síntesis del compuesto 64 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 3, se obtuvo 1 -bromo-3,7-dimetiloctano 64 como un aceite incoloro (6,0 g, 86 %) a partir de metanosulfonato de 3,7-dimetiloctilo 63 (7,47 g, 31 ,6 mmol) y bromuro de tetrabutilamonio (13,2 g, 41 , 1 mmol). Rf 0,92 (Hexanos).
Síntesis del compuesto 65 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 4, se obtuvo 2,6, 12,16-tetrametilheptadecan-9-ol 65 (7,0 g, cuantitativo) como un aceite incoloro a partir de 1 -bromo-3,7-dimetiloctano 64 (10 g, 45,2 mmol), limaduras de magnesio (1 ,21 g, 49,8 mmol), formiato de etilo (3,8 mL, 47,5 mmol) e hidróxido de potasio (3,8 g, 67,8 mmol). Rf 0,38 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 66 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de 5, se obtuvo metanosulfonato de 2,6,12, 16-tetrametilheptadecan-9-ilo 66 (1 ,56 g, 87 %) como un aceite incoloro a partir de 2,6, 12, 16-tetrametilheptadecan-9-ol 65 (1 ,39 g, 5, 14 mmol), trietilamina (3 mL) y cloruro de metansulfonilo (0,8 mL, 10,3 mmol). Rf 0,8 (CH2CI2).
Síntesis del compuesto 67 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6, se obtuvo 2-(3,7-dimetiloctil)-5,9-dimetildecanonitr¡lo 67 (0,8 g, 56 %) como un aceite incoloro a partir de metanosulfonato de 2,6, 12, 16-tetrametilheptadecan-9-ilo 66 (1 ,56 g, 4,48 mmol) y cianuro de sodio (0,55 g, 11 ,2 mmol). Rf 0,8 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 68 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 7, se obtuvo 2-(3,7-dimetiloctil)-5,9-dimetildecanal 68 (0,63 g, 78 %) como un aceite incoloro a partir de 2-(3,7-dimetiloctil)-5,9-dimetildecanonitrilo 67 (0,8 g, 2,49 mmol) y DIBAL (5,74 mL como una solución de 1 M en hexanos, 5,74 mmol). Rf 0,6 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 69 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 8, se obtuvo 10-(3,7-dimetiloctil)-2, 6, 13, 17-tetrametiloctadecan-9-ol 69 (0,53 g, 62 %) como un aceite incoloro a partir de 2-(3,7-dimetiloctil)-5,9-dimetildecanal 68 (0,6 g, 1 ,85 mmol), 1 -bromo-3,7-dimetiloctano 64 (2,0 g, 9,0 mmol) y limaduras de magnesio (232 mg, 9,67 mmol). Rf 0,37 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 70 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de 10-(3,7-dimetiloctil)-2,6, 13, 17-tetrametiloctadecan-9-ilo 68 (450 mg, en bruto) como un aceite amarillo a partir de 10-(3,7-dimetiloctil)-2,6, 13, 17-tetrametiloctadecan-9-ol 69 (200 mg, 0,43 mmol), EDC (246 mg, 1 ,28 mmol) y ácido 5-bromovalerico (246 mg, 1 ,28 mmol). Rf 0,49 (EtOAc-Hexanos al 5 %).
Síntesis del compuesto 71 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 11 , se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de 10-(3,7-dimetiloctil)-2,6, 13, 17-tetrametiloctadecan-9-ilo 71 (184 mg, 72 % 2 etapas) como un aceite incoloro a partir de 5-bromopentanoato de 10-(3,7-dimetiloctil)-2,6, 13, 17-tetrametiloctadecan-9-ilo 68 (450 mg en bruto) y dimetilamina (10 mL como una solución de 2,0 M en EtOH). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 4,95-4,87 (m, 1 H), 2,33 (t, 2H), 2,28 (t, 2H), 2,23 (s, 6H), 1 ,74-1 ,60 (m, 4H), 1 ,58-0,99 (m, 37H), 0,93-0,79 (m, 27H). Rf 0,43 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 74 || 74 Síntesis del compuesto 72 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 8, se obtuvo (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1 -il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ol 72 (0,62 g, 72 %) como un aceite incoloro a partir de (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (0,6 g, 1 ,87 mmol), 1 -bromo-3,7-dimetiloctano 64 (3,9 g, 17,5 mmol) y limaduras de magnesio (454 mg, 18,7 mmol). Rf 0,61 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 73 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1 -il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ilo 73 (900 mg, en bruto) como un aceite amarillo a partir de (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ol 72 (620 mg, 1 ,34 mmol), EDC (500 mg, 2,6 mmol) y ácido 5-bromovalérico (500 mg, 2,56 mmol). Rf 0,72 (EtOAc-Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 74 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 11 , se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ilo 74 (466 mg, 58 % 2 etapas) como un aceite incoloro a partir de 5-bromopentanoato de (Z)-10-((Z)-dec-4-en-1-il)-2,6-dimetilicos-14-en-9-ilo 73 (900 mg, en bruto) y dimetilamina (15 mL como una solución de 2,0 M en EtOH). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,43-5,29 (m, 4H), 4,94-4,88 (m, 1 H), 2,32 (t, 2H), 2,26 (t, 2H), 2, 15 (s, 6H), 2,08-1 ,93 (m, 8H), 1 ,70-1 ,00 (m, 43H), 0,95-0,83 (m, 15H). Rf 0,42 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 76 . 61 76 Síntesis del compuesto 75 Una solución de 5-bromopentan-1 -ol (1 ,0 g, 5,99 mmol) se preparó con dimetilamina (10 mL, como una solución de 2M en EtOH) en un recipiente sellado y calentado (80 °C). Luego de agitar (16 h) la dimetilamina y EtOH se quitaron bajo presión reducida para proporcionar hidrobromuro de 5-(dimetilamino)pentan-1 -ol 75 (1 ,26 g, cuantitativo) como un sólido amarillo-naranja. Rf 0,25 (CH3OH-CH2CI2 al 10 %).
Síntesis del compuesto 76 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 62, se obtuvo 5-(((6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 16-dien-11 -il)oxi)-N,N-dimetílpentan-1 -amina 76 (864 mg, 37 %) como un aceite amarillo pálido a partir de metanosulfonato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-en-1 -il)docosa-6, 16-dien-1 1 -ilo 61 (1 ,86 g, 3,45 mmol), hidrobromuro de 5-(dimetilamino)pentan-1-ol 75 (1 ,26 g, 5,99 mmol) y NaH (288 mg como una dispersión al 60 % en aceite, 7,2 mmol). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,43-5,32 (m, 6H), 3,46-3,33 (m, 2H), 3, 18-3, 12 (m, 1 H), 2,30-2, 18 (m, 8H), 2,07-1 ,93 (m, 12H), 1 ,61 -1 ,04 (m, 37H), 0,89 (t, 9H). Rf 0,47 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 79 Síntesis del compuesto 77 A una solución enfriada (-15 °C) de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1 -ol 8 (5 g, 10,9 mmol) en diclorometano anhidro (125 mL) en nitrógeno se agregó, gota a gota, dietil cinc (1 M en hexano, 82 mL, 81 ,8 mmol) durante 20 minutos. La solución se agitó durante 70 minutos a 0 °C y luego se agregó diiodometano (6,6 mL, 81 ,8 mmol) cuidadosamente. La solución se agitó durante la noche, y se dejó entibiar hasta temperatura ambiente. Al finalizar, la solución se volcó en agua helada (350 mL) y se diluyó con acetato de etilo (450 mL). Luego se agregó HCI al 5 % (350 mL) para ayudar a aliviar la emulsión que se había formado. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 (sat. ac. 500 mL), agua (500 mL) y salmuera (500 mL). Las capas acuosas combinadas se volvieron a extraer con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se secaron en sulfato de magnesio, se filtraron y concentraron al vacío hasta que se secaron. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (acetato de etilo al 2,5 % en hexanos) para proporcionar un aceite de color rosado. Para quitar el color (l2), el producto purificado se disolvió en diclorometano (150 mL) y se lavó con Na2S2O3 (sat. ac. 2 x 40 mL) para proporcionar 1 ,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil)propil)octan-4-ol 77 como un aceite amarillo pálido (5,54 g, 96,5 %).
Síntesis del compuesto 78 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 10, se obtuvo 6-bromohexanoato de 1 ,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil)propil)octan-4-ilo como un aceite en bruto a partir de 6-(dimetilamino)hexanoato de 1 ,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil)propil)octan-4-il (0,75 g, 1 ,5 mmol), diclorometano anhidro (5,2 mi), ácido 6-bromohexanoico (0,88 g, 4,5 mmol), clorhidrato de 1 -Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,87 g, 4,5 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (5 mg). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 79 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-(dimetiamino)hexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4- enil)docosa-6, 16-dien-1 1-ilo 11 , se obtuvo como un aceite (0,56 g, 59 %) a partir de 6-bromohexanoato de 1 , 8-bis(2-pentilciclo propi l)-5-(3-(2-pentilciclopropil) propil)octan-4-ilo (1 ,0 g, 1 ,5 mmol) y 2,0 M dimetilamina en etanol (3,5 mi). Rf 0,50 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintético para el Compuesto 83 l Síntesis del compuesto 80 A una solución de 2-octildodecan-1 -ol (20 g, 67,0 mmol) en diclorometano anhidro (500 mL) se agregó clorocromato de piridinio (43,2 g, 200 mmol). La solución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente y luego se filtró a través de ua almohadilla de sílice y se eluyó con diclorometano para proporcionar 2-octildodecanal 80 como un aceite incoloro (10,5 g, 50 %).
Síntesis del compuesto 81 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de (6Z, 15Z)-henicosa-6, 15-dien-11 -ol 4, se obtuvo (Z)-12-octildocos-6-en-11 -ol 81 como un aceite incoloro (0,67 g, 92 %) a partir de 2-octildodecanal 80 (0,5 g, 1 ,6 mmol), (Z)-1 -bromodece-4-eno (0,7 g, 3, 1 mmol), magnesio (80 mg, 3,4 mmol), tetrahidrofurano anhidro (0,5 mL), agua (2 mL), EtOH (2 mL) y KOH (0,2 g, 2,8 mmol).
Síntesis del compuesto 82 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6 bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-1 1 -ilo 10, se obtuvo 6-bromohexanoato de (Z)-12-octildocos-6-en-11-ilo 82 como un aceite incoloro (0,78 g, 85 %) a partir de (Z)-12-octildocos-6-en-1 1 -ol 81 (0,67 g, 1 ,5 mmol), diclorometano anhidro (5 mL), ácido 6-bromohexanoico (0,80 g, 4,4 mmol), clorhidrato de 1 -Eti I-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,85 g, 4,4 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (5 mg). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Síntesis del compuesto 83 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-(dimetilamino)hexanoato de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ilo 11, se obtuvo 6-(dimetilamino)hexanoato de (Z)-12-octildocos-6-en-11-ilo 83 como un aceite (103 mg, 14 %) a partir de 6-bromohexanoato de (Z)-12-octildocos-6-en-11 -ilo 82 (0,78 g, 1,3 mmol) y dimetilamina 2,0 M en etanol (3 mL). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,43-5,26 (m, 2H), 4,96-4,91 (m, 1H), 2,33 (t, 4H), 2,26 (s, 6H), 2,08-1,93 (m, 4H), 1,70-1,60 (m, 2H), 1,57-1,43 (m, 4H), 1,40-1,15 (m, 43H), 0,94-0,85 (m, 9H).
Esquema sintetico para el Compuesto 89 I , I , 89 Síntesis del compuesto 84 A una solución enfriada (0 °C) de (E)-etil dec-4-enoato (20 g, 101 mmol) en dietil eter anhidro (350 mL) se agregó hidruro de litio y aluminio (8,9 g, 212 mmol) en nitrógeno. La solución se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se enfrió a 0 °C y se inactivó lentamente con NaOH 5M (30 mL) y se diluyó con éter etílico (100 mL). La solución se agitó durante 30 minutos y se secó en sulfato de magnesio, se filtró y concentró al vacío hasta que se secó para proporcionar (E)-dec-4-en-1 -ol 84 como un aceite (16, 1 g, cuantitativo).
Síntesis del compuesto 85 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de metanosulfonato de (Z)-dec-4-enilo 2, se obtuvo metanosulfonato de (E)-dec-4-enilo 85 como un aceite naranja (32,7 g) a partir de (E)-dec-4-en-1 -ol (16, 1 g, 94,7 mmol), trietilamina (15,5 mL, 11 1 ,7 mmol) y cloruro de metanosulfonilo (15,6 mL, 201 ,7 mmol). Rf 0,65 (CH2CI2 al 100 %).
Síntesis del compuesto 86 Al utilizar un procedimiento análogo al descrito para la síntesis de (Z)-1-bromodec-4-eno 3, se obtuvo (E)-1 -bromodec-4-eno 86 como un aceite (17,9 g, 81 %) a partir de metanosulfonato de (E)-dec-4-enilo 85 (23,5 g, 94,7 mmol), y bromuro de tetrabutilamonio (40,0 g, 124, 1 mmol). Rf 0,85 (EtOAc-Hexanos al 10 %). 5 Síntesis del compuesto 87 ío Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de (6Z,15Z)-henicosa-6, 15-dien-11 -ol 4, se obtuvo (6E, 16Z)-12- ((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11 -ol 87 como un aceite (1 ,28 g, 71 %) a partir de (E)-1 -bromodec-4-eno 86 (1 ,7 g, 7,8 mmol), limaduras de magnesio (0, 19 g, 7,8 mmol), (Z)-2-((Z)-dec-4-enil)dodec-6-enal 7 (1 ,25 15 g, 3,9 mmol) e hidróxido de potasio (0,66 g, 1 1 ,7 mmol). Rf 0,43 (EtOAc- Hexanos al 10 %).
Síntesis del compuesto 88 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-bromohexanoato de (6Z, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa- 25 6, 16-dien-1 1-ilo 10, se obtuvo 5-bromopentanoato de (6E, 16Z)-12-((Z)- dec-4-enil)docosa-6, 16-dien-11-ilo 88 como un aceite (1,36 g, 78 %) a partir de (6E,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11 -ol 87 (1,28 g, 2,8 mmol), y ácido 5-bromo-n-valérico (1,00 g, 5,6 mmol), clorhidrato de 1-Ethil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (1,06 g, 5,6 mmol), diisopropiletilamina (1,1 g, 83,0 mmol) y dimetilaminopiridina (10 mg).
Síntesis del compuesto 89 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 6-(dimetilamino)hexanoato de (6Z,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ilo 11, se obtuvo 5-(dimetilamino)pentanoato de (6E,16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ilo 89 como un aceite (0,45 g, 35 %) a partir de 5-bromopentanoato de (6E, 16Z)-12-((Z)-dec-4-enil)docosa-6,16-dien-11-ilo 88 (1,36 g, 2,2 mmol), y 2 M dimetilamina en etanol (5 mL). 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d 5,45-5,28 (m, 6H), 4,96-4,91 (m, 1H), 2,34-2,25 (m, 2H), 2,06-1,90 (m, 12H), 1,68-1,61 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 5H), 1,45-1,16 (m, 28H), 0,95-0,84 (m, 9H).
Rf 0,46 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Esquema sintetico para el Compuesto 90 , Síntesis del compuesto 89 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 5, se obtuvo metanosulfonato de 1 ,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2-pentilciclopropil)propil)octan-4-il 89 como un aceite incoloro.
Síntesis del compuesto 90 Al utilizar un procedimiento análogo a aquel descrito para la síntesis de 62, se obtuvo 5-((1 ,8-bis(2-pentilciclopropil)-5-(3-(2- pentilciclopropil)propil)octan-4-il)oxi)-N,N-dimet¡lpentan-1 -amina 90 (580 mg) como un aceite amarillo pálido. Rf 0,48 (MeOH-CH2CI2 al 10 %).
Se debe comprender que la descripción anterior pretende ser 5 ilustrativa y no taxativa. Varias modalidades serán evidentes para los expertos en la teenica luego de leer la descripción que antecede. Por lo tanto, el alcance de la invención debería determinarse no con referencia a la descripción que precede sino por el contrario debería determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance total ío de los equivalentes a los cuales dichas reivindicaciones tienen derecho.
Las descripciones de todos los artículos y referencias, que incluyen las solicitudes de patentes, patentes, publicaciones PCT, y números y secuencias de registro de Genbank descritos allí, se encuentran incorporados en la presente mediante referencia para todos los fines. 15

Claims (39)

REIVINDICACIONES
1. Un lípido que tiene una Fórmula (I) estructural: 5 X-A-Y-Z; (l) o sales de este, donde: X es alquilamino; ío A es alquilo C1 a C6 opcionalmente sustituido, donde dicho alquilo Ci a C6 opcionalmente sustituido puede ser saturado o insaturado y donde A puede estar o no presente; Y se selecciona del grupo que consiste en cetal, éster; éter, carbamato opcionalmente sustituido y amida opcionalmente sustituida; y 15 Z es un resto hidrofóbico que consiste en tres cadenas de alquilo donde cada una de las cadenas de alquilo tiene una longitud de C8 a Cu, donde cada una de las tres cadenas de alquilo pueden ser independientemente saturadas o insaturadas, y donde cada una de las tres cadenas de alquilo está opcionalmente sustituida. 20
2. El lípido de la reivindicación 1 , donde cada una de las cadenas alquilo tiene una longitud de C9 a Ci0.
3. El lípido de la reivindicación 1 , donde al menos una de las cadenas alquilo tiene un enlace doble.
4. El lípido de la reivindicación 1 , donde al menos una de las 25 cadenas alquilo tiene un enlace doble de cis.
5. El lípido de la reivindicación 1 , donde al menos una de las cadenas alquilo comprende un resto cicloalquilo.
6. El lípido de la reivindicación 1 , donde X se selecciona del grupo que consiste en dimetilamino, dietilamino y etilmetilamino.
7. El lípido de la reivindicación 1 , donde A está presente.
8. El lípido de la reivindicación 1 , donde Y es un éster o cetal.
9. El lípido de la reivindicación 1 , donde Y es un carbamato opcionalmente sustituido.
10. El lípido de la reivindicación 1 , donde Y es un éter.
11. El lípido de la reivindicación 1 , donde Y es una amida opcionalmente sustituida.
12. El lípido de la reivindicación 1 , donde Z tiene la fórmula: y independientemente del grupo que consiste en alquilo C8 a Cu , donde cada RT , R2 y R3 pueden ser independientemente saturados o insaturados y donde cada R1 R2, y R3 está opcionalmente sustituido.
13. El lípido de la reivindicación 1 , donde el lípido se selecciona del grupo que consiste en: p , Compuesto 11 , Compuesto 13, Compuesto 14, Compuesto 19, Compuesto 21 , Compuesto 22, . Compuesto 23, Compuesto 24, Compuesto 25, Compuesto 26, Compuesto 27, Compuesto 28, Compuesto 30, Compuesto 31 Compuesto 40 Compuesto 42, Compuesto 50, Compuesto 53, Compuesto 62, Compuesto 71 , Compuesto 74 Compuesto 76, Compuesto 79, Compuesto 83, Compuesto 89, y 5 Compuesto 90.
14. Una partícula de lípido que comprende un lípido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
15. La partícula de lípido de la reivindicación 14, donde la ío partícula comprende además un lípido no catiónico.
16. La partícula de lípido de la reivindicación 15, donde el lípido no catiónico se selecciona del grupo que consiste en un fosfolípido, colesterol o una mezcla de un fosfolípido y colesterol.
17. La partícula de lípido de la reivindicación 16, donde el 15 fosfolípido comprende dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), o una mezcla de estos.
18. La partícula de lípido de la reivindicación 16, donde el colesterol es un derivado del colesterol.
19. La partícula de lípido de cualquiera de las reivindicaciones 20 14 a 18, donde la partícula comprende además un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas.
20. La partícula de lípido de la reivindicación 19, donde el lípido conjugado que inhibe la agregación de las partículas comprende un conjugado de polietilenglicol (PEG)-lípido. 25
21. La partícula de lípido de la reivindicación 20, donde el conjugado PEG-lípido comprende un conjugado PEG-diacilglicerol (PEG-DAG), un conjugado PEG-dialquiloxipropilo (PEG-DAA), o una mezcla de estos.
22. La partícula de 1 í pido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21 , donde la partícula comprende adicionalmente un agente terapeutico.
23. La partícula de lípido de la reivindicación 22, donde el agente terapéutico es un ácido nucleico.
24. La partícula de lípido de la reivindicación 23, donde el ácido nucleico es un RNA interferente.
25. La partícula de lípido de la reivindicación 24, donde el RNA interferente se selecciona del grupo que consiste en un RNA interferente pequeño (siRNA), un RNA interferente asimétrico (aiRNA), un micro RNA (miRNA), un dsRNA de sustrato de Dicer, un RNA horquilla pequeño (shRNA) y mezclas de estos.
26. La partícula de lípido de la reivindicación 25, donde el RNA interferente es un siRNA.
27. La partícula de lípido de la reivindicación 22, donde el agente terapéutico no se degrada sustancialmente luego de la incubación de la partícula en el suero a 37 °C durante 30 minutos.
28. La partícula de lípido de la reivindicación 22, donde el agente terapéutico está completamente encapsulado en la partícula.
29. La partícula de lípido de la reivindicación 22, donde la partícula tiene una relación de masa lípido-agente terapéutico de alrededor de 5:1 a alrededor de 15: 1.
30. La partícula de lípido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 29, donde la partícula tiene un diámetro mediano de alrededor de 30 nm a alrededor de 150 nm.
31. Una composición farmacéutica que comprende una partícula de lípido de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 30 y un portador farmacéuticamente aceptable.
32. Un método para introducir un agente terapéutico a la célula, donde el método comprende: contactar la célula con una partícula de lípido de la reivindicación 14.
33. El método de la reivindicación 32, donde la célula está en un mamífero.
34. Un método para la administración in vivo de un agente terapéutico, donde el método comprende: administrarle a un mamífero una partícula de lípido de la reivindicación 14.
35. El método de la reivindicación 34, donde la administración se selecciona del grupo que consiste en administración oral, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarticular, intralesional, intratraqueal, subcutánea, e intradérmica.
36. El método de la reivindicación 34, donde el mamífero es un ser humano.
37. Un método para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero que lo necesita, donde el método comprende: administrarle al mamífero una cantidad eficaz terapéutica de una partícula de lípido de la reivindicación 14.
38. El metodo de la reivindicación 37, donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en una infección viral, una enfermedad o trastorno hepático, y cáncer.
39. El método de la reivindicación 37, donde el mamífero es un ser humano.
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