UA120026C2 - Триалкілкатіонні ліпіди і способи їх застосування - Google Patents

Триалкілкатіонні ліпіди і способи їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA120026C2
UA120026C2 UAA201410393A UAA201410393A UA120026C2 UA 120026 C2 UA120026 C2 UA 120026C2 UA A201410393 A UAA201410393 A UA A201410393A UA A201410393 A UAA201410393 A UA A201410393A UA 120026 C2 UA120026 C2 UA 120026C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
lipid
mol
mirna
nucleotides
compounds
Prior art date
Application number
UAA201410393A
Other languages
English (en)
Inventor
Джеймс ХЕЙС
Джэймс Хэйс
Марк ВУД
Алан Мартін
Алан МАРТИН
Original Assignee
Арбутус Біофарма Корпорейшн
Арбутус Биофарма Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арбутус Біофарма Корпорейшн, Арбутус Биофарма Корпорэйшн filed Critical Арбутус Біофарма Корпорейшн
Publication of UA120026C2 publication Critical patent/UA120026C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/20—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/02—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C217/04—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C217/06—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one etherified hydroxy group and one amino group bound to the carbon skeleton, which is not further substituted
    • C07C217/08—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one etherified hydroxy group and one amino group bound to the carbon skeleton, which is not further substituted the oxygen atom of the etherified hydroxy group being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/02—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C217/46—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/06—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the hydroxy groups esterified by carboxylic acids having the esterifying carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/20—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/02—Systems containing only non-condensed rings with a three-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Цей винахід стосується композицій і способів для доставки терапевтичних агентів у клітини. Зокрема, вони включають нові, триалкільні, катіонні ліпіди і нуклеїнові кислотно-ліпідні частинки, які забезпечують ефективну інкапсуляцію нуклеїнових кислот і ефективну доставку інкапсульованої нуклеїнової кислоти в клітини in vivo. Композиції за цим винаходом є дуже потужними, дозволяючи тим самим ефективно нейтралізувати конкретний цільовий білок у відносно низьких дозах.

Description

0001) Ця заявка заявляє пріоритет на основі попередньої заявки США 61/602990, поданої 24 лютого 2012, яка включена у цей опис шляхом посилання у повному обсязі.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Ї. Область техніки (0002) Цей винахід відноситься до нових триалкіл катіонних ліпідів, ліпідним часткам, що містять один або більше триалкіл катіонних ліпідів, способам одержання часток ліпідів, а також способам доставки і введення ліпідних часток (наприклад, для лікування захворювання у ссавців).
ІЇ. Опис попереднього рівня техніки
ІЇ0003| Терапевтичні нуклеїнові кислоти включають, наприклад, малі інтерферуючі РНК (міРНК), мікроРНК /(мікроРНК), антисмислові олігонуклеотиди, рибозими, плазміди, (і імуностимулюючі нуклеїнові кислоти, але, не обмежуючись ними. Ці нуклеїнові кислоти діють за допомогою різних механізмів. У разі інтерферуючих молекул, РНК, таких як міРНК і мікроРНК, ці нуклеїнові кислоти можуть знижувати регуляцію внутрішньоклітинного рівня специфічних білків за допомогою процесу, який називають РНК-інтерференцією (РНКІ). Після введення інтерферуючих РНК у цитоплазму клітини, ці двониткові конструкції РНК можуть зв'язуватися з білком, що називається КІЗС. Кодуюча нитка інтерферуючої РНК, що переміщена з комплексу
КІЗС, забезпечує матрицю всередині КІЗС, яка може розпізнавати і зв'язувати мРНК з комплементарною послідовністю зв'язаної інтерферуючої мРНК. Зв'язавши комплементарну
МРНК, КІЗС комплекс розщеплює РНК і звільняє розщеплені нитки. РНКі може забезпечити зниження регуляції специфічних білків за допомогою цільового специфічного знищення відповідних мРНК, які кодують синтез білка. (0004) Терапевтичне застосування РНКІі дуже широке, оскільки інтерферучі РНК конструкції можуть бути синтезовані з будь-якою нуклеотидною послідовністю, направленою проти білка- мішені. На сьогоднішній день, міРНК конструкції показали здатність специфічно знижувати регуляцію білка-мішені як іп міїго, так і іп мімо модельних умовах. Крім того, міРНК конструкції на даний час оцінюються в клінічних дослідженнях.
ІО00О5І Проте, дві проблеми на даний час стоять перед, інтерферуючими РНК конструктами, по-перше, їх сприйнятливість до нуклеазного розщеплювання в плазмі і, по-друге, їх обмежена
Зо здатність одержувати доступ до внутрішньоклітинного простору, де вони можуть зв'язувати
КІЗС системно, як вільні, інтерферуючі РНК молекули. Ці дволанцюжкові конструкції можуть бути стабілізовані шляхом введення хімічно модифікованих нуклеотидних лінкерів у молекули, наприклад, фосфотіоатних груп. Проте, такі хімічно модифіковані лінкери забезпечують лише обмежений захист від нуклеази і можуть знижувати активність конструкції. Внутрішньоклітинна доставка інтерферуючих РНК може бути полегшена за рахунок використання систем-носіїв, таких як полімери, катіонні ліпосоми, або шляхом ковалентного приєднання групи холестерину до молекули. Проте, покращення систем доставки необхідне для збільшення специфічної активності інтерферуючих РНК молекул, таких як міРНК і мікроРНК і для зменшення або усунення потреби у хімічно модифікованих нуклеотидних лінкерах.
ІО0ОбЇ Крім того, залишаються проблеми з обмеженою здатністю терапевтичних нуклеїнових кислот, таких як що інтерферуючі РНК, пересікати клітинні мембрани (див., Мавззом еї аї.,
Віоспіт. Віорнуз. Асіа, 1197:95-1082 (1994)) і проблеми, пов'язані з системною токсичністю, такі як комплемент-опосередкована анафілаксія, змінені коагулятивні властивості, і цитопенія (Са!ргайн еї а!., Апіїзепзе Мисі. Асіа Огиа Оев., 4:201-206 (1994)).
І0007| У спробі покращити ефективність, дослідники також використовували системи-носії на основі ліпідів, щоб доставити хімічно модифіковані або немодифіковані терапевтичні нуклеїнові кислоти. 2еїрпаї еї аї. (9. Сопіг. Кеї., 41:99-119 (1996)) описує використання аніонних (звичайних) ліпосом, чутливих до рН ліпосом, імуноліпосом, злитих ліпосом і катіонних ліпідних/антисмислових агрегатів. Аналогічно, міРНК були системно введені в катіонні ліпосоми, і ці нуклеїнові кислотно-ліпідні частки, як повідомляється, забезпечують покращену знижуючу регуляцію білків-мішеней у ссавців, включаючи приматів (7іттегтапп еї аї., Маїиге, 441: 111- 114 (2006)). 0008) Не дивлячись на цей прогрес, залишається потреба у даної області для покращення ліпідно-терапевтичних композицій нуклеїнових кислот, які придатні для загального терапевтичного використання. Бажано, ці композиції інкапсулюватимуть нуклеїнові кислоти з високою ефективністю, мають високе співвідношення препарат:ліпід, захищають інкапсульовану нуклеїнову кислоту від деградації і розщеплювання в сироватці, прийнятні для системної доставки, а також забезпечують внутрішньоклітинну доставку інкапсульованої нуклеїнової кислоти. Крім того, ці частки нуклеїнових кислот, ліпідів, мають бути добре переносимими, і бо забезпечувати адекватний терапевтичний індекс, такий, що лікування пацієнта ефективною дозою нуклеїнової кислоти не пов'язане з істотною токсичністю і ризиком для пацієнта.
Короткий опис винаходу (0009) Цей винахід відноситься до нових триалкіл катіонних (аміно) ліпідів і ліпідним часткам, що містять ці ліпіди, які є вигідними для іп мімо доставки нуклеїнових кислот, а також кислотно- ліпідних композицій нуклеїнових часток, придатних іп мімо для терапевтичного застосування.
Цей винахід також відноситься до способів одержання таких композицій, а також способів введення нуклеїнових кислот у клітини за допомогою цих композицій, наприклад, для лікування різних хворобливих станів. Цей винахід також включає всі нові сполуки і проміжні сполуки, розкриті у цьому документі. 0010) Як описано у прикладі 2 у цьому документі, триалкіл катіонні ліпіди за цим винаходом є потужнішими, у мишачому АроВ міРнНК аналізі, ніж інші ідентичні ліпіди, що мають довші алкільні ланцюги.
ЇОО11| В одному з аспектів цей винахід відноситься до катіонних ліпідів, що мають структурну формулу (1):
Х-А-У-2; (І) або їх солей, наприклад, їх фармацевтично прийнятних солей, де:
Х є алкіламіногрупою;
А є від С: до Сє необов'язково заміщеним алкілом, де вказаний необов'язково заміщений С1-
Св-алкіл може бути насиченим або ненасиченим, і де А може бути присутнім або може не бути присутнім;
У вибраний з групи, що складається з кеталю, складного ефіру, необов'язково заміщеного карбамата, ефіру, і необов'язково заміщеного аміда; і 2 є гідрофобним фрагментом, що складається з трьох алкільних ланцюгів, де кожен з алкільних ланцюгів має довжину від Св до Сі, де кожен з трьох алкільних ланцюгів може бути насиченим або ненасиченим, і де кожен з трьох алкільних ланцюгів є необов'язково заміщеним.
І0012| Відносно ліпідів за формулою (І), типові приклади алкіламіногруп складаються з диметиламіно-, діетиламіно-, і етилметиламіногруп. 0013) Знову відносно ліпідів за формулою (І), типовий приклад присутності необов'язкового замісника у вигляді карбамата і амідної групи є насиченою або ненасиченою алкільною групою (наприклад, С:-Св алкіл). 0014) Знову відносно ліпідів за формулою (І), типовий приклад необов'язкового замісника, який може бути присутнім на одній або більше з трьох алкільних ланцюгів гідрофобного фрагмента 2 є гідроксильною групою. 0015) Знову відносно ліпідів за формулою (І), має бути зрозуміло, що там, де алкільний ланцюг гідрофобного фрагмента 7 містить один або декілька подвійних зв'язків або потрійних зв'язків, алкільний ланцюг називають ненасиченим. 0016) Знову відносно ліпідів за формулою (І), має бути зрозуміло, щоб уникнути сумнівів, що один або більше алкільний ланцюг, що містить гідрофобний фрагмент 7 може включати циклоалкільну групу (наприклад, циклопропіл).
Ї0О017| Знову відносно ліпідів за формулою (І), слід розуміти, що термін "ефір" містить складні ефіри, що мають структуру -С(-0)0- або -0ОС(-0)-. Термін "амід" містить аміди, що мають структуру -С(-0О)МА- або -МА(-О0)С-. Термін "карбамат" містить карбамати, що мають структуру -ОС(-О)МВ- або -МАС(-О)О-.
І0018| Ліпіди за формулою (І) можуть бути використані, наприклад, для виготовлення ліпідних часток за цим винаходом, які корисні, наприклад, для доставки терапевтичних агентів (наприклад, біологічно активних молекул нуклеїнових кислот, таких як міРНК) ссавцеві (наприклад, людині), який потребує цього. 0019) У деяких варіантах реалізації ліпідів за формулою (І), 2 має формулу:
Ви 7 зоре 5О з де Кі, В» і Кз, кожен окремо, незалежно вибрані з групи, що складається з Св - Счї алкілу, де кожен з Кі, В», і Кз незалежно один від одного може бути насиченим або ненасиченим, і де кожен з Кі, Н», і Ез є необов'язково заміщеним. 0020) У додатковому аспекті цей винахід відноситься до ліпідних часток, що містять один або більше з вищезгаданих катіонних ліпідів за формулою І! або їх солей, наприклад,
фармацевтично прийнятних солей. У деяких варіантах реалізації ліпідні частки додатково містять один або більше некатіонних ліпідів, такі як нейтральні ліпіди. У деяких інших варіантах реалізації ліпідні частки додатково містять один або більше кон'югованих ліпідів, здатних знижувати або інгібувати агрегацію часток. У додаткових варіантах реалізації ліпідні частки додатково містять один або більше активних агентів або терапевтичних агентів. 0021) У деяких варіантах реалізації, некатіонний ліпідний компонент ліпідної частки може містити фосфоліпід, холестерин (або похідне холестерину), або їх суміш. У одному конкретному варіанті реалізації фосфоліпід містить дипальмітоїлфосфатидилхолін (ОРРО), дистеароїлфосфатидилхолін (О5РС), або їх суміш. У деяких варіантах реалізації цього винаходу кон'югований ліпідний компонент з ліпідної частки містить поліетиленгліколь (РЕС)- ліпідний кон'югат. У деяких випадках РЕС-ліпідний кон'югат містить РЕС-діацилгіцерол (РЕС- рАС) кон'югат, РЕО-діалкілоксипропіловий (РЕС-ОАА) кон'югат, або їх суміш. У інших варіантах реалізації ліпідний кон'югат містить поліоксазолін (РОЇ) - ліпідний кон'югат, такий як кон'югат
РО7-РАА. (00221) У деяких варіантах реалізації активна речовина або терапевтичний агент включає нуклеїнову кислоту. В деяких випадках, нуклеїнова кислота містить інтерферуючу молекулу
РНК, таку як, наприклад, у міРНК, аіРНК, мікроРНК, дисер-субстратну дсРНК, мхРНК, або їх суміші. У деяких інших випадках, нуклеїнова кислота містить одноланцюжкову або дволанцюжкову ДНК, РНК або ДНК/РНК гібрид такі, наприклад, як антисмисловий олігонуклеотид, рибозим, плазміди, імуностимулюючі олігонуклеотиди або їх суміші.
І0023| В інших варіантах реалізації активний агент або терапевтичний агент повністю інкапсулюються у ліпідну частину ліпідної частки таким чином, що активний агент або терапевтичний агент у ліпідній частці є стійкими у водному розчині до ферментативного розщеплювання, наприклад, за допомогою нуклеази або протеази. В інших варіантах реалізації ліпідні частки, по суті, є нетоксичними для ссавців, таких як люди. (0024) У деяких варіантах реалізації, цей винахід забезпечує ліпідні частки (наприклад, І МР), включають: (а) одну або декілька нуклеїнових кислот, таких як інтерферуючі молекули РНК; (Б) один або декілька катіонних ліпідів за формулою І або їх солей, наприклад, фармацевтично прийнятних солей; (с) один або декілька некатіонних ліпідів; і (4) один або більше кон'югованих
Зо ліпідів, які інгібують агрегацію часток. 0025) У деяких варіантах реалізації, цей винахід забезпечує ліпідні частки (наприклад,
І МР), що містять: (а) одну або декілька нуклеїнових кислот; (б) один або декілька катіонних ліпідів за формулою І або їх солей, наприклад, фармацевтично прийнятних солей, що містять від близько 50 моль 95 до близько 85 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) один або декілька некатіонних ліпідів, що містять від близько 13 моль 95 до близько 49,5 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (4) один або більше кон'югованих ліпідів, які інгібують агрегацію часток, що містять від близько 0,5 моль 95 до близько 2 моль 905 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
І0026)| В одному аспекті варіанту реалізації, ліпідні частки (наприклад, І МР) містять: (а) нуклеїнову кислоту; (Б) катіонний ліпід за формулою І або його сіль, наприклад, фармацевтично прийнятну сіль, що містить від близько 52 моль 95 до близько 62 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) суміш фосфоліпідів і холестерину або його похідного, що містить від близько 36 моль 95 до близько 47 мольоо від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (4) РЕС-ліпідний кон'югат, що містить від близько 1 моль 95 до близько 2 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Цей варіант реалізації нуклеїнових кислотно-ліпідних часток зазвичай називають у даному описі як "1:57" композиція. В одному конкретному варіанті реалізації композиція 1:57 складається з чотирьохкомпонентної системи, що містить близько 1,4 моль 95 РЕОС-ліпідного кон'югата (наприклад, РЕ2000-С-ОМА), близько 57,1 моль 95 катіонного ліпіду за формулою І або його сіль, близько 7,1 моль 95 ОРРС (або О5РС), і близько 34,3 моль до холестерину (або їх похідних).
І0027| У іншому аспекті цього варіанту реалізації, ліпідна частка (наприклад, І МР) містить: (а) нуклеїнову кислоту; (Б) катіонний ліпід за формулою ! або його сіль, наприклад, фармацевтично прийнятну сіль, що містить від близько 56.5 моль 95 до близько 66.5 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) холестерин або його похідне, що містить від близько 31,5 моль 95 до близько 42,5 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (4) РЕС-ліпідний кон'югат, що містить від близько 1 мольоо до близько 2 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Цей варіант реалізації нуклеїнової кислотно-ліпідної частки зазвичай називається в цьому описі як "1:62" композиція. В одному конкретному варіанті реалізації композиція 1:62 є системою з трьох компонентів, яка є вільною від фосфоліпіду і 60 містить близько 1,5 моль 95 РЕС-ліпідного кон'югата (наприклад, РЕС2000-С-ОМА), близько
61.5 моль 95 катіонного ліпіду за формулою І або його солі, і близько 36,9 моль 95 холестерину (або його похідного). 0028) Додаткові варіанти реалізації, що відносяться до 1:57 і 1:62 композиціям, описані у
РСТ публікації УМО 09/127060, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 00291 У інших варіантах реалізації цей винахід пропонує ліпідні частки (наприклад, І МР), що містять: (а) одну або декілька нуклеїнових кислот; (б) один або декілька катіонних ліпідів за формулою І або ІЇ або їх солей, наприклад, фармацевтично прийнятних солей, що містять від близько 2 моль 95 до близько 50 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) один або більше некатіонний ліпід, що містить від близько 5 моль 95 до близько 90 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; ії (4) один або більше кон'югований ліпід, який інгібує агрегацію часток, що містить від близько 0,5 моль 95 до близько 20 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
І0ОЗ30) В одному аспекті цього варіанту реалізації, ліпідна частка (наприклад, І МР) містить: (а) нуклеїнові кислоти; (Б) катіонний ліпід за формулою ! або його сіль, наприклад, фармацевтично прийнятну сіль, що містить від близько 30 моль 95 до близько 50 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) суміш фосфоліпідів і холестерину або його похідного, що містить від близько 47 моль 95 до близько 69 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (4) РЕС-ліпідного кон'югата, що містить від близько 1 моль 95 до близько З моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Цей варіант реалізації ліпідних часток, як правило, згадується у цьому документі як "2:40" композиція. В одному конкретному варіанті реалізації композиція 2:40 є системою з чотирьох компонентів, які містяться у близько 2 моль 95 РЕС-ліпідних кон'югатів (наприклад, РЕС2000-С-ЮОМА), близько 40 моль 95 катіонного ліпіду за формулою І або його солі, близько 10 мольбо ОРРС (або О5РО), і близько 48 моль 95 холестерину (або його похідного). 0031) У ще одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до нуклеїнових кислотно- ліпідних часток (наприклад, І МР) що містять: (а) одну або декілька нуклеїнових кислот; (Б) один або декілька катіонних ліпідів за формулою | або їх солей, наприклад, фармацевтично прийнятних солей, що містять від близько 50 моль 95 до близько 65 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) один або більше некатіонних ліпідів, що містять від близько 25 моль 95 до близько 45 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (а) один або більше кон'югованих ліпідів, які інгібують агрегацію часток, що містяться від близько 5 моль 95 до близько 10 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
І0032| У одному аспекті цього варіанту реалізації нуклеїнова кислотно-ліпідна частка містить: (а) нуклеїнові кислоти; (Б) катіонний ліпід за формулою І або його сіль, наприклад, його фармацевтично прийнятну сіль, що містить від близько 50 моль 95 до близько 60 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) суміш фосфоліпідів і холестерину або його похідного, що містить від близько 35 моль 95 до близько 45 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (4) РЕОС-ліпідний кон'югат, що містить від близько 5 моль 95 до близько 10 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Цей варіант реалізації нуклеїнових кислотно-ліпідних часток зазвичай називають у даному описі як "7:54" композиція. В деяких випадках, некатіонна ліпідна суміш у композиції 7:54 містить: (ї) фосфоліпід від близько 5 моль 95 до близько 10 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (її) холестерин або його похідне від близько 25 моль 95 до близько 35 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. У одному конкретному варіанті реалізації композиція 7:54 є системою з чотирьох компонентів, яка містить близько 7 моль 95 РЕС- ліпідного кон'югата (наприклад,
РЕС750-С-ОМА), близько 54 моль 95 катіонного ліпіду за формулою І або його сіль, близько 7 моль 95 ОРРС (або О5РС), і близько 32 моль 95 холестерину (або його похідного).
І0033| В іншому аспекті цього варіанту реалізації нуклеїнова кислотно-ліпідна частка включає: (а) нуклеїнову кислоту; (Б) катіонний ліпід за формулою І або його сіль, наприклад, його фармацевтично прийнятну сіль, що містить від близько 55 моль 95 до близько 65 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; (с) холестерин або його похідне, що містить від близько 30 моль 95 до близько 40 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці; і (4)
РЕаС-ліпідний кон'югат, що містить від близько 5 моль 95 до близько 10 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Цей варіант реалізації нуклеїнової кислотно-ліпідної частки зазвичай називають у цьому описі як "7:58" композиція. В одному конкретному варіанті реалізації композиція 7:58 є системою з трьох компонентів, яка є вільною від фосфоліпіду і містить близько 7 моль 95 РЕС-ліпідного кон'югата (наприклад, РЕФ750-С-ЮОМА), близько 58 моль 95 катіонного ліпіду за формулою І або його сіль, і близько 35 моль 95 холестерину (або 60 його похідного).
І0034| Додаткові варіанти реалізації, що відносяться до 7:54 і 7:58 композиціям, описані в опублікованій патентній заявці Ме 052011/0076335, поданій 30 червня 2010, опис якої включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 0035) Цей винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, що містять ліпідні частки, такі як нуклеїнові кислотно-ліпідні частки (наприклад, МР) і фармацевтично прийнятні носії. (0036) В іншому аспекті цей винахід відноситься до способів введення одного або більше терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти, у клітину, включаючи контакт клітини з ліпідною часткою, описаною у цьому документі (наприклад, І МР). У одному варіанті реалізації клітина є клітиною ссавця і ссавцем є людина.
І0037| У ще одному аспекті, цей винахід відноситься до способів доставки в природних умовах одного або декількох терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти, причому спосіб включає введення ссавцеві ліпідної частки, описаної в цьому документі (наприклад, ГМР). У деяких варіантах реалізації цього винаходу ліпідні частки (наприклад, МР) вводять одним з наступних шляхів введення: пероральним, інтраназальним, внутрішньовенним, внутрішньочеревинним, внутрішньом'язовим, внутрішньосуглобним, внутрішньоосередковим, внутрішньотрахеальним підшкірним, і внутрішньошкірним. У конкретних варіантах реалізації частки ліпідів (наприклад, І МР) вводять системно, наприклад, за допомогою ентерального або парентерального шляхів введення. У бажаних варіантах реалізації ссавець є людиною. 0038) В іншому аспекті, цей винахід відноситься до способів лікування захворювання або розладу у ссавця, який потребує цього, що включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості ліпідної частки (наприклад, ЇМР) що містить один або більше терапевтичний агент, такий як нуклеїнові кислоти. Необмежуючі приклади захворювань або порушень містять вірусну інфекцію, захворювання або порушення печінки і рак. Бажано ссавець є людиною.
Ї0039| У деяких варіантах реалізації цей винахід відноситься до способів лікування захворювання або розладу печінки шляхом введення нуклеїнової кислоти, такої як інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) у нуклеїнових кислотно-ліпідних частках (наприклад,
ІГ МР), окремо або в комбінації з гиполіпідемічним агентом. Приклади ліпідних захворювань і розладів містять дисліпідемії (наприклад, гіперліпідемії, такі як підвищення рівня тригліцеридів (гіпертригліцеридемія) та/або підвищення рівня холестерину (гіперхолестеринемія)), атеросклероз, коронарна хвороба серця, захворювання коронарної артерії, атеросклерозне захворювання серцево-судинної системи (СМО), жирова хвороба печінки (стеатоз печінки), порушення ліпідного обміну, порушення метаболізму холестерину, цукровий діабет (у тому числі цукровий діабет 2 типу), ожиріння, серцево-судинні захворювання, а також інші розлади, пов'язані з порушенням метаболізму, але не обмежуються ними. Не обмежуючі приклади гиполіпідемічних агентів містять статини, фібрати, езетиміби, тіазолідиндіони, ніацини бета- блокатори, нітрогліцерини, антагоністи кальцію, і риб'ячий жир.
ІЇ0040| У одному конкретному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу зниження або зменшення рівня холестерину у ссавця (наприклад, людини), який потребує цього (наприклад, ссавцеві з рівнем холестерину у крові), причому спосіб включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості нуклеїнових кислотно-ліпідних часток (наприклад, композиція
ЧР), описаної у цьому документі, що містять одну або більше інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК), які призначаються для одного або декількох генів, пов'язаних з метаболічними захворюваннями і розладами. В іншому конкретному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу зниження або зменшення рівня тригліцеридів в організмі ссавця (наприклад, людини), який потребує цього (наприклад, ссавця з підвищеним рівнем тригліцеридів у крові), причому спосіб включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості нуклеїнової кислотно-ліпідної частки (наприклад, композиція І МР), описаної у цьому документі, що містить одну або декілька інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК), які призначаються для одного або декількох генів, пов'язаних з метаболічними захворюваннями і розладами. Ці способи можуть бути проведені іп міго з використанням стандартних технічних прийомів з культурою тканини або іп мімо шляхом введення інтерферуючої РНК (наприклад, міРНК) за допомогою будь-яких засобів, відомих у даній області. У бажаних варіантах реалізації інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) надходить у клітини печінки (наприклад, гепатоцити) у ссавця, такого як людина.
І0041| Додаткові варіанти релізації, пов'язані з лікуванням захворювання печінки або порушенням використання ліпідних часток описані наприклад, у РСТ заявці
РСТ/СА2010/000120, поданій 26 січня 2010, і заявці на патент США Мо 2006/0134189, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. бо 00421 В інших варіантах реалізації цей винахід відноситься до способів лікування клітинного проліферативного порушення, такого як рак, шляхом введення нуклеїнової кислоти, такої як інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) у нуклеїнових кислотно-ліпідних частках (наприклад,
ІГ МР), окремо або в комбінації з хіміотерапевтичними препаратами. Ці методи можуть бути виконані іп міго з використанням стандартних технічних прийомів з культурою тканини або іп мімо шляхом введення інтерферуючої РНК (наприклад, міРНК) за допомогою будь-яких засобів, відомих у даній області. У бажаних варіантах реалізації інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) надходить у клітину раку у ссавця, такого як людина, окремо або в комбінації з хіміотерапевтичним препаратом. Нуклеїнові кислотно-ліпідні частки і хіміотерапевтичні препарати також можуть бути введені спільно із звичайними гормональними, імунотерапевтичними і радіотерапевтичними агентами. 0043) Додаткові варіанти реалізації, пов'язані з лікуванням клітинного проліферативного порушення, що використовують ліпідну частку, описані, наприклад, у РСТ публікації УМО 09/082817, заявці на патент США Мео2009/0149403, і РСТ публікації УМО 09/129319, розкриття яких включене у цей опис як посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0044| У ще одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способів профілактики або лікування вірусної інфекції, такий як ареновірус (наприклад, вірус лихоманки Ласса) або філовірус (наприклад, вірус Ебола, вірус Марбург і так далі), інфікування якими призводить до геморагічної лихоманки або гепатиту (наприклад, вірус гепатиту С), які викликають гострі або хронічні гепатити шляхом введення нуклеїнової кислоти, такої як інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) у нуклеїнових кислотно-ліпідних частках (наприклад, І МР), окремо або у поєднанні з введенням звичайного засобу, що застосовується для лікування або полегшення вірусного стану або будь-якої з ознак, пов'язаних з ним. Ці способи можуть бути виконані іп міго з використанням стандартних технічних прийомів з культурою тканини або іп мімо шляхом введення інтерферуючої РНК з використанням будь-яких засобів, відомих у даній області. У деяких варіантах реалізації, інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) доставляється у клітини, тканини або органи ссавця, такого як людина, які інфіковані та/або допускається зараження вірусом геморагічної лихоманки, таких як, наприклад, клітин ретикулоендотеліальної системи (наприклад, моноцитів, макрофагів і так далі). У деяких інших варіантах реалізації, інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) доставляється у клітини, тканини або органи ссавця,
Зо такого як людина, які інфіковані та/"або допускається зараження вірусом гепатиту, таких як, наприклад, клітин печінки (наприклад, гепатоцитів). 0045) Додаткові варіанти реалізації, що відносяться до профілактики або лікування вірусної інфекції з використанням ліпідної частки, описані, наприклад, у заявці на патент США Мо 2007/0218122, заявці на патент США 2007/0135370, і РСТ заявці РСТ/СА2010/000444, що називається "Композиції і способи для пригнічення експресії вірусу гепатиту С", поданої 19 березня 2010, описи яких наведені у цьому документі як посилання у повному обсязі для всіх цілей. 00461) Ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР), що містять один або більше катіонний ліпід за формулою | або його солі, наприклад, фармацевтично прийнятні солі, є особливо бажаними, і є прийнятними для використання при введенні нуклеїнових кислот, таких як інтерферуючі РНК, суб'єктові (наприклад, ссавцеві, такому як людина), оскільки вони стабільні в обігу, мають необхідний розмір для фармакодинамічної поведінки при доступі до екстраваскулярним сайтам і здатні досягати популяції клітин-мішеней. 00471 Інші цілі, ознаки і переваги цього винаходу будуть очевидні для фахівця у даній області з наступного детального опису і фігур.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
І. Вступ 0048) Цей винахід заснований, частково, на відкритті нових катіонних (аміно) ліпідів, які забезпечують переваги при використанні ліпідних часток для доставки іп мімо активного або терапевтичного агента, такого як нуклеїнова кислота, у клітину ссавця. Зокрема, цей винахід відноситься до композиції нуклеїнових кислотно-ліпідних часток, що включають один або новіший катіонний ліпід, описаний у цьому документі, які забезпечують підвищення активності нуклеїнової кислоти (наприклад, інтерферуючої РНК) і покращують переносимість композицій іп мімо, внаслідок чого значно збільшеується терапевтичний індекс у порівнянні з композиціями нуклеїнових кислотно-ліпідних часток, описаних вище. 0049) У конкретних варіантах реалізації, цей винахід забезпечує нові катіонні ліпіди, які дозволяють розробити покращені композиції для іп міїго і іп мімо доставок інтерферуючих РНК, таких як міРНК. Показано, що у цьому документі ці покращувані композиції ліпідних часток ефективні при знижуючій регуляції (наприклад, виключенні) рівнів білка та/або рівнів мРНК бо генів-мішеней. Крім того, в цьому документі показано, що активність цих покращених композицій ліпідних часток залежить від присутності нових катіонних ліпідів згідно винаходу. 00501 Ліпідні частки і композиції за цим винаходом можуть бути використані для різних цілей, у тому числі доставки інкапсульованих або зв'язаних (наприклад, комплексів) терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти у клітини, як іп міїго, так і іп мімо. Відповідно, цей винахід також відноситься до способів лікування захворювань або порушень у суб'єктів, які потребують цього, шляхом контакту суб'єкта з ліпідною часткою, яка інкапсулює або зв'язує відповідний терапевтичний агент, який відрізняється тим, що ліпідна частка містить один або більше нових катіонних ліпідів, описаних у цьому документі.
ЇО051| Як описано у цьому документі, ліпідні частки за цим винаходом особливо корисні для доставки нуклеїнових кислот, у тому числі, наприклад, РНК-інтерферуючих молекул, таких як міРНК. Таким чином, можуть бути використані частки ліпідів і композиції за цим винаходом для зниження експресії генів-мішеней і білків іп міїго і іп ммо шляхом контактування клітин з ліпідною часткою, що містить один або більше новий катіонних ліпідів, описаних у цьому документі, в якому ліпідна частка інкапсулює або зв'язує нуклеїнову кислоту, яка зменшує експресію генів- мішеней (наприклад, міРНК). Альтернативно, ліпідні частки і композиції за цим винаходом можуть бути використані для збільшення експресії цільового білка іп міго і іп мімо шляхом контакту клітин з ліпідною часткою, що містить один або більше нових катіонних ліпідів, описаних у цьому документі, який інкапсульований у ліпідну частку або пов'язаний з нуклеїновою кислотою, що підвищує експресію бажаного білка (наприклад, плазміду, що кодує бажаний білою). 0052 Різні прикладні варіанти реалізації катіонних ліпідів за цим винаходом, ліпідних часток і композицій, що їх містять, і їх використання для доставки активних або терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти, щоб модулювати експресії генів і білків, детальніше описані нижче.
ІІ. Визначення 0053) У цьому описі наступні терміни мають значення, закріплені за ними, якщо не вказане інше. (0054) Термін "близько", використовуємий у зв'язку з кількістю компонента в ліпідній частці або композиції за цим винаходом містить значення, плюс або мінус 595 від вказаної кількості компонента (наприклад, близько 1095 охоплює значення від 9,595 до 10,595). Термін "близько", отже, також містить значення, плюс або мінус 195, 295, 395, або 495 від вказаної кількості компонента. 0055) Терміни "інтерферуючі РНК" або РНКІ" або "Інтерферуючі послідовності РНК", що використовуються у цьому документі, включають одноланцюжкові РНК (наприклад, зрілі мікроРНК, ссРНК олігонуклеотиди, ССДНК олігонуклеотиди) або дволанцюжкові РНК (тобто, дуплекс РНК, такі як міРНК, дисер-субстратні длРНК, мхРНК, аїіРНК, або пре-мікроРНК), які здатні зменшувати або інгібувати експресію гена-мішені або послідовності (наприклад, безпосереднім втручанням у деградацію або інгібуванням трансляції мРНК, комплементом послідовності інтерферуючої РНК), коли інтерферуюча РНК знаходиться у тій же клітині, що і ген-мішень або послідовність. Інтерферуючі РНК, таким чином, відносяться до одноланцюжкових РНК, комплементарним послідовності мРНК-мішені або дволанцюжкової
РНК, утвореної двома комплементарними нитками або однією, самостійно комплементарним ланцюгом. Інтерферуючі РНК можуть мати істотну або повну тотожність з цільовим геном або послідовністю, або можуть містити ділянка невідповідності (тобто невідповідний мотив).
Послідовність інтерферуючих РНК може відповідати цільовому гену повної довжини, або його підпослідовності. Бажано, інтерферуючі РНК-молекули синтезовані хімічно. (0056) Інтерферуючі РНК включають ті, що "малі-інтерферуючі РНК" або "міР НК", наприклад, інтерферуючі РНК з близько 15-60, 15-50 або 15-40 (дуплекс) нуклеотидів, типовіше близько з 15-30, 15-25, або 19-25 (дуплекс) нуклеотидів у довжину, і бажано близько з 20-24, 21-22, або 21-23 або (дуплекс) нуклеотидів у довжину (наприклад, кожна комплементарна послідовність у дволанцюжковій міРНК представлена 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, або 19-25 нуклеотидами в довжину, близько 20-24, 21-22, або 21-23 нуклеотидами у довжину, і дволанцюжкові міРНК представлені близько 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, або 19-25 парами основ у довжину, бажано близько 18-22, 19-20, або 19-21 парами основ у довжину). МіРНК дуплекси можуть включати 3' виступаючих від близько 1 до близько 4 нуклеотидів або від близько 2 до близько З нуклеотидів і 5 фосфат кінців. Приклади міРНК містять дволанцюжкову молекулу полінуклеотиду, зібрану з двох окремих скручених молекул, в якій один ланцюг є смисловим ланцюгом, а інший є додатковим антисмисловим ланцюгом; дволанцюжкову молекулу полінуклеотиду, зібрану з одноланцюжкової молекули, де смислова і антисмислова області зв'язані за допомогою нуклеїнового кислотно-основного або ненуклеїнового кислотно-основного 60 лінкера; дволанцюжкову молекулу полінуклеотиду з шпилькою вторинної структури, що має самокомплементарну смислову і антисмислову області; і кільцеву одноланцюжкову молекулу полінуклеотиду з двома або більше структурами петлі і штока, що має самокомплементарную смислову і антисмислову області, де круговий полінуклеотид може бути оброблений іп мімо або іп міго, щоб сформувати активну дволанцюжкову молекулу мігРНК.
Ї0057| Бажано, міРНК є хімічно синтезованими. МІРНК також можуть бути отримані шляхом розщеплювання довгої длРНК (наприклад, длРНК більшої, ніж близько 25 нуклеотидів у довжину) за допомогою РНКази І або Дайсер Е. соїї. Ці ферменти перетворюють длРНК на біологічно активну міРНК (див., наприклад, Уапад еї аї., Ргос. Маїй!. Асай. сі. ОБА, 99:9942-9947 (2002); Саедагі єї аї., Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА, 99:14236 (2002); Вугот єї а!., Атріоп ТеспМоїев, 10(1):4-6 (2003); КаулазакКі єї аї., Мисівїс Асід5 Вез., 31:981-987 (2003); Кпідні єї аї., осіепсе, 293:2269-2271 (2001); апа Кобегізоп еї аї., у. ВіоЇ. Спет., 243:82 (1968)). Бажано, длРНК має від щонайменше 50 нуклеотидів до близько 100, 200, 300, 400, або 500 нуклеотидів у довжину.
ДлРНК може мати довжину 1000, 1500, 2000, 5000 нуклеотидів у довжину, або більше. ДЛРНК може кодувати весь транскрипт гена або частковий транскрипт гена. У деяких випадках, міРнК можуть бути закодовані за допомогою плазміди (наприклад, прописані у вигляді послідовностей, які автоматично складаються в дуплексів з шпильковими петлями). 0058) Як використовується у цьому документі, терміни "мотив невідповідності" або "ділянка невідповідності" відносяться до частини послідовності інтерферуючих РНК (наприклад, мігРНК), яка не має 10095 комплементарності з цільовою послідовністю. Інтерферуюча РНК може мати щонайменше один, два, три, чотири, п'ять, шість, або більше невідповідних областей.
Невідповідні області можуть бути безперервними або можуть бути розділені за допомогою 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше нуклеотидів. Невідповідні мотиви або ділянки можуть складатися з одного нуклеотиду або можуть містити два, три, чотири, п'ять, або більше нуклеотидів.
І0059| Фраза "інгібувати експресію гена-мішені" відноситься до здатності інтерферуючих
РНК (наприклад, міРНК), або інших терапевтичних агентів вимикати, зменшувати або інгібувати експресію гена-мішені. Щоб досліджувати міру виключення генів, тестовані зразок (наприклад, зразок клітин у культурі, експресуючих ген-мішень) або тестований ссавець (наприклад, ссавець, такий як людина або тваринна модель, така як модель гризуна (наприклад, миші) або
Зо нелюдського примату (наприклад, мавпи)) приводять у контакт з інтерферуючою РНК (наприклад, міРНК), що вимикає, зменшує або інгібує експресію гена-мішені. Експресія гена- мішені у досліджуваному зразку або піддослідній тварині у порівнянні з експресією гена-мішені у контрольному зразку (наприклад, зразку клітин у культурі, експресуючих ген-мішень) або контрольному ссавцеві (наприклад, ссавцеві такому як людина або тваринна модель, наприклад, модель гризуна (наприклад, миші) або нелюдського примату (наприклад, мавпи)), що не контактує з або не піддається введенню інтерферуючої РНК (наприклад, міРНК).
Експресії гена-мішені у контрольному зразку або контрольному ссавцеві може бути надане значення 10095. У конкретних варіантах реалізації, виключення, інгібування або зниження експресії гена-мішені досягається, коли рівень експресії гена-мішені в досліджуваному зразку або тестованому ссавцеві у порівнянні з рівнем експресії гена-мішені у контрольному зразку або контрольному ссавцеві складає близько 9595, 9095, 8595, 8095, 75905, 7095, 6590, 6095, 5595, 5095, 4595, 4095, 3595, 3095, 25905, 2095, 15 95, 1095, 595 або 095. Іншими словами, інтерферуюча РНК (наприклад, міРНК) вимикає, зменшує або інгібує експресію гена-мішені щонайменше близько на 595, 1095, 1595, 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 8590, 9095, 9595 або 10095 у тестованому зразку, або тестованому ссавцеві у порівнянні з рівнем експресії генів-мішеней у контрольному зразку або контрольному ссавцеві, які не контактують з або не піддаються введенню інтерферуючої РНК (наприклад, мігРНК). Відповідні аналізи для визначення рівня експресії гена-мішені включають, без обмеження, рівні тестування білка або
МРНК з використанням способів, відомих фахівцям у даній області, таких як, наприклад, дот блот аналіз, Нозерн-блоттинг, іп 5йи гібридизація, ЕГІЗА, імунопреципітація, функції ферментів, а також фенотипічні аналізи, відомі фахівцям у даній області.
І0060| Термін "ефективна кількість" або "тнерапевтично ефективна кількість" активного агента або терапевтичного агента, такого як інтерферуюча РНК, є кількістю, достатньою для одержання бажаного ефекту, наприклад, інгібування експресії послідовності-мішені у порівнянні з нормальним рівнем експресії, виявленому у відсутності інтерферуючих РНК. Інгібування експресії послідовності-мішені або гена-мішені досягається тоді, коли значення, отримане за допомогою інтерферуючих РНК по відношенню до контролю складає близько 9595, 9095, 8595, 8096, 75905, 7090, бб9ю, б0бо, оо, 5095, 4595, 4095, 3595, 3095, 2595, 2095, 1595, 1095, 595 або 0965.
Відповідні аналізи для виміру експресії гена-мішені або послідовності-мішені включають, бо наприклад, тестування рівнів білка або РНК з використанням способів, відомих фахівцям у даній області, таких як дот блот аналіз, Нозерн-блоттинг, іп 5йи гібридизація, ЕГІ5А, імунопреципітація, ферментні функції, а також фенотипічні аналізи, відомі фахівцям у даній області. 0061) Під "знижувати", "зниження", "зменшувати" або "зменшення" імунної відповіді за допомогою інтерферуючих РНК мають на увазі зниження виявляємої імунної відповіді, що дається на інтерферуючі РНК (наприклад, змінені інтерферуючі РНК) або інші терапевтичні агенти. Кількість зниження імунної відповіді за допомогою модифікованих інтерферуючих РНК може бути визначено по відношенню до рівня імунної відповіді у присутності немодифікованих інтерферуючих РНК. Зменшення, що виявляється, може бути близько 595, 10905, 1595, 2090, 25905,
Зоо, ЗБор, 4090, 459, БО, 5596, боро, бБоо, 7090, 7596, 809, 8595, 9095, 9596, 10095 або нижчим, ніж імунна відповідь, що виявляється у присутності немодифікованих інтерферуючих РНК.
Зниження імунної відповіді на інтерферуючі РНК, як правило, вимірюється за допомогою зниження продукування цитокінів (наприклад, ІЕМУу, ІЄМа, ТМРа, 1-6, або ІІ -12) за допомогою клітини, що відповідає, іп міго або зменшенням продукування цитокінів у сироватці ссавця після введення інтерферуючих РНК. (0062) Як використовується в цьому документі, термін "клітина, що відповідає" відноситься до клітини, бажано клітини ссавця, яка віробляє імунну відповідь, що детектується, при контакті з імуностимулюючою інтерферуючою РНК, такою як немодифікована міРНК. Приклади імунокомпетентних клітин містять, наприклад, дендритні клітини, макрофаги, мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС), спленоцити і тому подібне. Імунні реакції, що виявляються, включають, наприклад, продукування цитокінів або факторів зростання, таких як ТМЕ-а, ІЕМ-а,
ІЕМ-В, ТЕМ- у, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-10, 11-12, І -13, ТОК, а також їх комбінації. Імунні реакції, що виявляються, також включають, наприклад, індукцію інтерферон-індукованого білка з тетратрикопептид повтором 1 (ІРІТ1) мРНК.
Ї0063| "В основному ідентична" відноситься до послідовності, яка гібридизується з еталонною послідовністю в жорстких умовах або з послідовністю, яка має вказаний відсоток ідентичності до вказаної ділянки еталонної послідовності. (0064) Термін "жорсткі умови гібридизації" відноситься до умов, при яких нуклеїнова кислота гібридизується з цільовою послідовністю, як правило, у вигляді складної суміші нуклеїнових кислот, але без інших послідовностей. Жорсткі умови є послідовність-залежними (і відрізнятимуться у різних обставинах. Довші послідовності гібридизуються, зокрема, при вищих температурах. Обширний посібник для гібридизації нуклеїнових кислот знаходиться у ТіЇ55еп,
Тесппіднев5 іп Віоспетівігу апа Моїесшіаг Віоіоду-Нубгіділайоп м/йп Мисівїс Ргорев5, "Омегміем/ ОЇ ргіпсіріе5 ої пубгіаіїгацоп апа (Ше 5ігагеду ої писієїс асій аззауб5" (1993). Як правило, жорсткі умови вибираються так, щоб бути близько 5-107С нижче за точку плавлення (Тп) для конкретної послідовності при визначеній іонній силі рН. Ти є температурою (при визначеній іонній силі, рН і нуклеїновій концентрації), при якій 5095 зондів, комплементарних до мішені, гібридизують з послідовністю-мішенню у рівновазі (оскільки послідовності-мішені присутні у надлишку, при Та, 5095 зондів зайнято у рівновазі). Жорсткі умови можуть бути також досягнуті з додаванням дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Для селективної або специфічної гібридизації, позитивний сигнал щонайменше у два рази, бажано у 10 разів більше початкової гібридизації.
Ї0065| Прикладні жорсткі умови гібридизації можуть бути наступними: 5095 формаміду,
Бхо5С, і 1956 505, інкубації при 42"С, або, 5х55С, 195 505, інкубації при 65"С, з промиванням у 0.2х550 і 0,195 505 при 65"С. Для РСК, при температурі близько 36"С, що характерно для ампліфікації низької жорсткості, хоча температура відпалу може варіюватися між близько 32"С і 48"С залежно від довжини праймера. Для високої жорсткості РСОК-ампліфікації температура близько 62"С є типовою, хоча висока жорстка температура відпалу може знаходитися в діапазоні від близько 507"С до близько 65"С, залежно від довжини праймера і специфічності.
Типові умови циклу для ампліфікації високої і низької жорсткості включають фазу денатурації 90"0-957С протягом 30 сек.-2 хв., фазу відпалу тривалістю 30 сек.-2 хв., і фазу розширення близько 72"С протягом 1-2 хв. Протоколи і керуючі принципи для реакцій ампліфікації з низькою і високою жорсткістю передбачені, наприклад, в Іппі5 еї аі., РОК Ргоїосоїі5, А сСціде о Меїйподв апа Арріісайоп5, Асадетіс Ргезв5, Іпс. М.У. (1990). 0066) Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються один з одним у жорстких умовах усе ще, по суті, ідентичні, якщо поліпептиди, які вони кодують, є по суті ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли копію нуклеїнової кислоти створюють з використанням максимуму віродженого кодону, що допускається генетичним кодом. У таких випадках, нуклеїнові кислоти, як правило, гібридизуються у помірно жорстких умовах гібридизації. Приклади "помірно жорстких умов гібридизації" включають гібридизацію у буфері 4095 формаміду, 1 М Масі, 195 505 при 37"С і бо промивання в 1Х 55С при 45"С. Позитивна гібридизація щонайменше удвічі більше початкової.
Фахівці легко зрозуміють, що альтернативні умови гібридизації і відмивання можуть бути використані, щоб забезпечити умови аналогічної жорсткості. Додаткові керуючі принципи для визначення параметрів гібридизації надані у багаточисельних посиланнях, наприклад, Сигтепі
Ргоїосої5 іп Моіесшаг Віоіоду, А!йзибеї еї аї., едв.
І0067| Терміни "по суті ідентичні" або "в основному ідентичні", в контексті двох або більше нуклеїнових кислот, відносяться до двох або більше послідовностей або підпослідовностям, які однакові або мають певний відсоток нуклеотидів, які Є однаковими (тобто, щонайменше близько 6096, бажано щонайменше близько 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095 або 9595 ідентичності у межах певної ділянки), при порівнянні і вірівнюванні для максимальної відповідності у рамці порівняння, або позначена область вимірюється за допомогою одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом ручного вірівнювання і візуального огляду. Це визначення, коли контекст вказує, також аналогічно відноситься до комплементу послідовності.
Бажано, значна ідентичність існує у ділянці, яка має щонайменше близько 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, або 60 нуклеотидів у довжину.
ЇО068| Для порівняння послідовностей, як правило, одна послідовність діє як еталонна послідовність, з якою порівнюють тестові послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовностей, тестована і еталонна послідовності вводяться у комп'ютер, позначають координати підпослідовності, за необхідності, і позначають параметри програми алгоритму послідовності. Можуть бути використані параметри програми за умовчанням, або можуть бути визначені альтернативні параметри. Потім алгоритм порівняння послідовностей розраховує відсоток збігу послідовностей для тестових послідовностей відносно еталонної послідовності, на основі параметрів програми.
І0069) "Рамка порівняння", як вона використана в цьому документі, містить посилання на сегмент будь-якого одного з ряду суміжних положень, вибраних з групи, що складається з близько від 5 до близько 60, зазвичай від близько 10 до близько 45, більш зазвичай від близько 15 до близько 30, в якому послідовність можна порівняти з еталонною послідовністю однієї і тієї ж кількості суміжних положень після того, як ці дві послідовності оптимально вірівняно. Способи вірівнювання послідовностей для порівняння, добре відомі у даній області техніки. Оптимальне вірівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, за допомогою
Зо алгоритму локальної гомології Зтіїп апа Умаїегтап, Аду. Аррі. Майп., 2:482 (1981), за допомогою алгоритму вірівнювання гомології Меедієтап апа У/ип5с, 9. Мої. Віої!., 48:443 (1970), у способі пошуку подібності Реагзоп апа Гіртап, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА, 85:2444 (1988), з використанням комп'ютерних реалізацій цих алгоритмів (ЗАР, ВЕЗТРЇТ, ЕА5ТА, апа ТЕАЗТА іп
Ше УУізсопзіп Сепеїйсз 5оймшаге РасКаде, Сепеїйсв Сотриїег Стор, 575 Зсієпсе Ог., Мадізоп,
УМ), або ручним вірівнюванням і візуальним оглядом (см, наприклад, Сиггепі Ргоїосої5 іп
Моїесшіаг Віоіоду, А!йзибеї еї аї!., вав. (1995 зиррієтепі)). 0070 Не обмежуючі приклади алгоритмів, які підходять для визначення відсотка ідентичності послідовності і схожості послідовностей, є алгоритми ВГА5Т і ВГАБ5Т 2.0, які описані в Айбспи! еї аїЇ., Мис. Асій5 Ке5., 25:3389-3402 (1977) та АБС! еї аї., У. Мої. Віо!., 215:403-410 (1990), відповідно. ВГАБТ і ВГАБТ 2.0 використовуються з описаними у цьому документі параметрами, щоб визначити процентну ідентичність послідовностей для нуклеїнових кислот згідно винаходу. Програмне забезпечення для реалізації ВІА5Т аналізів є загальнодоступним через Національний центр біотехнологічної інформації (пер:/Лумли.пеобі.піт.пій.дом/). Іншим прикладом є алгоритм глобального вірівнювання для визначення відсотка ідентичності послідовності, такий як алгоритм МееаІетап-У/п5сп для вірівнювання білкових або нуклеотидних (наприклад, РНК) послідовностей.
ІЇ0071| Алгоритм ВІАБТ також виконує статистичний аналіз схожості між двома послідовностями (див., наприклад, Кагіїп апа Аїйб5спиї, Ргос. Маї!. Асай. сі. ОБА, 90:5873-5787 (1993)). Одним з показників схожості за допомогою алгоритму ВГА5Т є найменша сумарна вірогідність (Р(М)), яка забезпечує індикацію вірогідності, з якою збіг між двома нуклеотидними послідовностями був би випадковим. Наприклад, нуклеїнова кислота вважається аналогічній еталонній послідовності, якщо найменша сумарна вірогідність при порівнянні тестової нуклеїнової кислоти з еталонною нуклеїновою кислотою менше, ніж близько 0,2, бажаніше менше ніж близько 0,01, і найбажаніше менше ніж близько 0,001.
І0072| Термін "нуклеїнова кислота", використаний у цьому документі, відноситься до полімеру, що містить щонайменше два дезоксирибонуклеотида або рибонуклеотида в будь-якій одноланцюжковій або дволанцюжковій формі і містить ДНК і РНК. ДНК може бути у формі, наприклад, антисмислових молекул, ДНК плазмід, заздалегідь конденсованої ДНК, РСК- продукта, векторів (РІ, РАС, ВАС, МАС, штучних хромосом), касет експресії, химерних бо послідовностей, хромосомної ДНК, або похідних і комбінації цих груп. РНК може бути у вигляді тих, що малих інтерферують РНК (міРНК), Дайсер-субстратних деРНК, невеликої шпильки РНК (НШРНК), асиметричних інтерферуючих РНК (аіРНК), мікроРНК (мікроРНК), мРНК, тРНК, рРНК,
ТРНК, вірусної РНК (вРНК), полівалентної РНК (ПВ РНК), а також їх комбінації. Нуклеїнові кислоти включають нуклеїнові кислоти, що містять відомі аналоги нуклеотидів або модифікованих залишків або зв'язків, які Є синтетичними, такими, що зустричаються у природі, не зустричаються в природі, і які мають схожі властивості зв'язування як еталонної нуклеїнової кислоти. Приклади таких аналогів містять, без обмеження, фосфоротіоати, фосфорамідати, метил-фосфонати, хіральні метил-фосфонати, 2'-О-метил рибонуклеотиди, і пептид-нуклеїнові кислоти (ПНК). Без спеціального обмеження, термін охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі аналоги природних нуклеотидів, які мають аналогічні властивості зв'язування як еталонної нуклеїнової кислоти. Якщо не вказане інше, конкретна послідовність нуклеїнової кислоти також побічно охоплює її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміни віроджених кодонів), алелі, ортологи, ЗМР і комплементарні послідовності, а також послідовності, вказані в явному вигляді. Зокрема, заміни віроджених кодонів можуть бути досягнуті шляхом створення послідовності, в якій третє положення одного або більше вибраних (або всіх) кодонів заміщено змішано-основним та/або дезоксиінозиновими залишками (Ваїгег еї аІ,, Мисієїс Асій Вев., 19:5081 (1991); ОНізика еї аї., 9. Віої. Спет., 260:2605-2608 (1985);
Воззоїїпі єї аЇ., Мої. Сеїї. Ргобез, 8:91-98 (1994)). "Нуклеотиди" містять цукри дезоксирибози (ДНК) або рибози (РНК), основу, і фосфатну групу. Нуклеотиди зв'язані один з одним через фосфатні групи. "Основи" містять пурини і піримідини, які додатково містять природні сполуки аденін, тимін, гуанін, цитозин, урацил, інозин, і природні аналоги і синтетичні похідні пуринів і піримідинів, які містять модифікації але не обмежуються ними, які мають нові реакційноспроможні групи, такі як аміни, спирти, тіоли, карбоксилати і алкілгалогеніди, але не обмежуючись ними. 0073) Термін «ген» відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК або
РНК), яка містить часткову довжину або цілі довжини послідовностей кодування, необхідні для одержання поліпептиду або попередника поліпептиду. 0074) "Генний продукт", як він використаний у цьому документі, відноситься до продукту гена, такого як РНК-транскрипт або поліпептид.
Зо 0075) Термін "ліпід" відноситься до групи органічних сполук, які охоплюють складні ефіри жирних кислот, але не обмежуються ними, і характеризується тим, що нерозчинні у воді, але розчинні у багатьох органічних розчинниках. Вони, як правило, поділяються щонайменше на три класи: (1) "прості ліпіди", які включають жири і масла, а також віски; (2) "складні ліпіди", які містять фосфоліпіди і гліколіпіди; і (3) "похідні ліпіди", такі як стероїди. 0076) Термін "ліпідна частка" охоплює ліпідний препарат, який може бути використаний для доставки активного агента або терапевтичного агента, такого як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК), у той сайт-мішень, що цікавить (наприклад, клітину, тканину, орган і тому подібне). У бажаних варіантах реалізації ліпідна частка за цим винаходом є ліпідною наночасткою, яка, як правило, формується з катіонного ліпіду, некатіонного ліпіду, і, необов'язково, кон'югованого ліпіду, який запобігає агрегації часток. У інших бажаних варіантах реалізації, які можуть бути віднесені до "нуклеїнових кислотно-ліпідних часток", активний агент або терапевтичний засіб, наприклад нуклеїнова кислота, можуть бути інкапсульовані в ліпідну частину частки, тим самим захищаючи її від ферментативного розщеплювання.
ІЇ0077| Як використовується у цьому документі, термін "СМР" відноситься до ліпідної наночастки. МР є часткою, виготовленою з ліпідів (наприклад, катіонний ліпід, некатіонний ліпід, і, необов'язково, кон'югований ліпід, що запобігає агрегації часток), де нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК) повністю інкапсулюються у ліпід. У деяких випадках, І МР надзвичайно корисні для системних застосувань, оскільки вони можуть мати розширений життєвий цикл після внутрішньовенної (в.в.) ін'єкції, вони можуть накопичуватися в дистальних ділянках (наприклад, фізично відокремлених сайтах від сайту введення), і вони можуть опосередкувати виключення експресії цільових генів у цих дистальних сайтах. Нуклеїнова кислота може бути у вигляді комплексу з конденсуючим агентом і інкапсульованими усередині
МР, як викладено у публікації РСТ МО 00/03683, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 0078) Ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) зазвичай мають середній діаметр від близько 30 нм до близько 150 нм, від близько 40 нм до близько 150 нм, від близько 50 нм до близько 150 нм, від близько 60 нм до близько 130 нм, від близько 70 нм до близько 110 нм, від близько 70 нм до близько 100 нм, від близько 80 нм до близько 100 нм, від близько 90 нм до близько 100 нм, від близько 70 до близько 90 нм, від близько 80 нм до близько 90 нм, від 60 близько 70 нм до близько 80 нм, або близько 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм, або 150 нм, і по суті не токсичні. Крім того, нуклеїнові кислоти, якщо вони присутні в ліпідних частках за цим винаходом, є стійкими у водному розчині до деградації з нуклеазою. Ліпідні наночастки і спосіб їх одержання описані, наприклад, у публікації заявки на патент США Мо 2004/0142025 і 2007/0042031, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0079| У цьому описі, "інкапсульований ліпід' може відноситися до ліпідної частки, яка забезпечує активний агент або терапевтичний засіб, такий як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК), з повною герметизацією, частковою герметизацією, або обома. У бажаному варіанті реалізації нуклеїнова кислота повністю поміщена в ліпідну частку (наприклад, з утворенням І МР). (00801) Термін "ліпідний кон'югат" відноситься до кон'югованого ліпіду, який інгібує агрегацію часток ліпідів. Такі ліпідні кон'югати охоплюють РЕС-кон'югати ліпідів, таких як, наприклад, РЕС сполучені з діалкілоксипропілами (наприклад, РЕС-кон'югат и ОБАА), РЕС сполучений з діацилгліцеринов (наприклад, РЕС -кон'югатів ПАС), РЕС сполучені з холестерином, пов'язані з
РЕС фосфатидилетаноламіни, і РЕС, кон'юговані з церамідами (див., наприклад, патент США
Мо 5885613), катіонні ліпіди РЕС, поліоксазолінові (РОЇ) -ліпідні кон'югати, поліамідні олігомери (наприклад, АТТА-ліпідні кон'югати) і їх суміші, але не обмежуються ними. Додаткові приклади
РО? -ліпідних кон'югатів описані в РСТ публікації МО 2010/006282. РЕС або РО можуть бути кон'юговані безпосередньо з ліпідом або можуть бути пов'язані з ліпідами за допомогою лінкерной частини молекули. Може бути використаний будь-який зв'язуючий фрагмент, призначений для поєднання РЕС або РО/ з ліпідом, у тому числі, наприклад, лінкерні фрагменти, що не містять ефір і лінкерні фрагменти, що містять ефір. У деяких бажаних варіантах реалізації використовуються ті лінкерні фрагменти, що не містять ефір, такі як аміди або карбамати. Розкриття кожного з вказаних вище патентних документів включені у даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0081| Термін "амфіпатичні ліпіди" відноситься, зокрема, до будь-якого відповідного матеріалу, який відрізняється тим, що гідрофобна частина ліпідного матеріалу орієнтована в гідрофобній фазі, тоді як гідрофільна частина орієнтована у напрямку до водної фази.
Зо Гідрофільні характеристики витікають з присутності полярних або заряджених груп, таких як вуглеводних, фосфатних, карбонових, сульфатних, аміно, сульфгідрильних, нітро, гідроксильних, і інших подібних груп. Гідрофобність може бути досягнута за рахунок включення неполярних груп, які охоплюють довголанцюжкові, насичені і ненасичені аліфатичні вуглеводневі групи, і такі групи, заміщені однією або більше ароматичною, циклоаліфатичною або гетероциклічною групою (ами), але не обмежуються ними. Приклади амфіпатичних сполук охоплюють фосфоліпіди, аміноліпіди і сфінголіпіди, але не обмежуються ними. 0082) Типові приклади фосфоліпідів охоплюють фосфатидилхолін, фосфатидилетаноламін, фосфатидилсерин, фосфатидилінозитол, фосфатидну кислоту, фосфатидилхолін, пальмітоїлолеоїл лізофосфатидилхолін, лізофосфатидилетаноламін, дипальмітоїлфосфатидилхолін, дистеароїлфосфатидилхолін, діолеоїлфосфатидилхолін, (Іі дилінолеоїлфосфатидилхолін, але не обмежуються ними. Інші сполуки, без фосфору, такі як сфінголіпіди, сімейство глікосфінголіпідів, діацилгліцерини і рД-ацилокси кислоти, також знаходяться в групі, що визначається як амфіпатичні ліпіди. Крім того, амфіпатичні ліпіди, описані вище, можуть бути змішані з іншими ліпідами, у тому числі тригліцериди і стерини. (0083) Термін "нейтральний ліпід" відноситься до будь-якого з декількох видів ліпідів, які існують або в незарядженій, або в нейтральній цвіттер-іонній формі при вибраному значенні рн.
При фізіологічному значенні рнН, такі ліпіди охоплюють, наприклад, діадилфосфатидилхолін, діацилфосфатидилетаноламін, церамід, сфінгомієлін, цефалін, холестерин, цереброзиди і діацилгліцерини. 00841 Термін "некатіонний ліпід" відноситься до будь-якого амфіпатичного ліпіду, а також будь-якого іншого нейтрального ліпіду або аніонного ліпіду. 0085 Термін "аніонний ліпід" відноситься до будь-якого ліпіду, який негативно заряджений при фізіологічному значенні рН. Ці ліпіди охоплюють фосфатидилгліцерини, кардіоліпіни, діацилфосфатидилсерини, діадилфосфорну кислоту, М-додеканоїл фосфатидилетаноламіни,
М-сукциніл фосфатидилетаноламіни, М-глютарилдіадилфосфатидилетаноламін, лізилфосфатидилгліцероли, пальмітоїлолеголфосфатидилгліцерол (РОРО), і інші аніонні модифікації груп, поєднаних у нейтральні ліпіди, але не обмежуються ними. (0086) Термін "гідрофобний ліпід" відноситься до сполук, що мають неполярні групи, які охоплюють довголанцюжкові насичені і ненасичені аліфатичні вуглеводневі групи і такі групи, 60 необов'язково заміщені однією або декількома ароматичними, циклоаліфатичними або гетероциклічними групами, але не обмежуються ними. Прийнятні приклади охоплюють діацилгліцерин, діалкілгліцерол, М,М-діалкіламін, 1,2-діацилокси-3-амінопропан і 1,2-діалкіл-3- амінопропан, але не обмежуються ними.
І0087| Термін "злиті" відноситься до здатності ліпідної частки, такої як І МР, зливатися з мембранами клітини. Мембрани можуть бути або плазматичними мембранами або мембранами, що оточують органели, наприклад, ядерце, ядро, і так далі.
Ї0088| Як використовується у цьому документі, термін "водний розчин" відноситься до композиції, що містить у цілому або частково, воду.
Ї0089| Як використано у даному описі, термін "органічний розчин ліпідів" відноситься до композиції, що містить у цілому або частково, органічний розчинник, що містить ліпід. 0090) "Дистальний сайт", як він використаний у цьому документі, відноситься до фізично окремого місця, яке не відокремлене від капілярного русла, але охоплює ділянки, широко розподілені по всьому організму. 00911 "Сироватка-стабільний" по відношенню до нуклеїнової кислотно-ліпідної частки, такої як І МР, позначає, що частка неїстотно деградувала після дії сироватки або нуклеази, що істотно руйнує вільну ДНК або РНК. Прийнятні аналізи охоплюють, наприклад, стандартний сироватковий аналіз, аналіз ДНКази, або аналіз РНКази.
Ї0092| "Системна доставка" як вона використана у цьому документі, відноситься до доставки ліпідних часток, що призводить до широкого біорозподілу активного агента, такого як інтерферуючі РНК (наприклад, міРНК) в організмі. Деякі способи введення можуть привести до системної доставки певних агентів, але не інших. Системна доставка позначає, що корисна, бажана терапевтична кількість лікарського засобу, піддає дії більшу частину тіла. Щоб отримати широкий біорозподіл, зазвичай потрібний такий час життя у крові, щоб агент не швидко деградував або очищувався (наприклад, за допомогою пресистемних органів (печінки, легенів і так далі) або швидкого, неспецифічного зв'язування клітинами) до досягнення сайту хвороби, дистального до сайту введення. Системна доставка ліпідних часток може здійснюватись за будь-яким способом, відомим у даній області, у тому числі, наприклад, внутрішньовенно, підшкірно і внутрішньочеревно. У бажаному варіанті реалізації, системна доставка ліпідних часток є внутрішньовенною доставкою. 0093) "Локальна доставка", як використовується у цьому документі, відноситься до доставки активного агента, такого як інтерферуючі РНК (наприклад, міРНК) безпосередньо у сайт-мішень в організмі. Наприклад, агент може бути доставлений на місце шляхом прямої ін'єкції у місце захворювання, такого як пухлина або іншого сайту-мішені, такого як ділянка запалення або органу-мішені, такого як печінка, серце, нирки, підшлункова залоза і тому подібне. 00941 Термін "ссавець" відноситься до будь-якого виду ссавців, такому як людина, миші, щури, собаки, кішка, хом'як, морська свинка, кролик, худоба і тому подібне.
ЇО095| Термін "рак" відноситься до будь-якого члена класу захворювань, що характеризуються неконтрольованим зростанням аберантних клітин. Цей термін включає всі відомі види раку і пухлинних станів, чи вони охарактеризовані як злоякісні, доброякісні, м'яких тканин, або твердих, і раку на всіх етапах і мірах, у тому числі до і після метастатичних ракових утворень. Приклади різних видів раку охоплюють рак печінки, рак легенів, рак товстої кишки, рак прямої кишки, анальний рак, рак жовчних проток, рак малого кишковика, рак шлунку (гастроскопічний), рак стравоходу; рак жовчного міхура, рак підшлункової залози, рак апендикса, рак молочної залози, рак яєчників; рак шийки матки, рак передміхурової залози, рак нирки (наприклад, нирково-клітинний рак), рак центральної нервової системи, гліобластоми, рак шкіри, лімфому, хоріокарциному, раки голови і шиї, остеогенні саркоми, рак крові, але не обмежуються ними. Необмежуючі приклади конкретних типів раки печінки включають гепатоцелюлярну карциному (НСС), вторинний рак печінки (наприклад, викликаний метастазами деяких інших ракових клітин непечінкового типа), і гепатобластому. Як використано у цьому документі, "пухлина" містить одну або більше ракових клітин. (0096) Термін "полівалентні РНК", скорочено "ПВ РНК", відноситься до полінуклеотидного комплексу, що складається як мінімум з трьох полінуклеотидів, в якому кожен полінуклеотид гібридизують по всій довжині або по його частині, до щонайменше двох інших полінуклеотидів комплексу і які відрізняються тим, що один або більше полінуклеотидів необов'язково містить область-мішень, яка здатна до гібридизації з послідовністю нуклеїнової кислоти. Кожен полінуклеотид може мати, наприклад, від 10 до 60 нуклеотидів у довжину. Область-мішеньі) в полінуклеотиді можуть бути здатна до гібридизації з послідовністю-мішенню нуклеїнової кислоти, яка є однаковою або відмінною, від послідовності(ей) нуклеїнової кислоти-мішені, З яким область-мішень(ї) інших полінуклеотидів комплексу гібридизує. Багатовалентні РНК бо можуть бути синтезовані іп міго (наприклад, шляхом хімічного синтезу) або, наприклад, вони можуть бути отримані з попередника у живій клітині. Наприклад, попередник може бути лінійним полінуклеотидом, який містить кожен з полінуклеотидів багатовалентних РНК, які вводять в живу клітину, і розщеплюється в ній з утворенням багатовалентних РНК. Термін "полівалентні
РНК" охоплює такого попередника, який призначений для того, щоб бути розщепленим усередині живої клітини. Термін "полівалентні РНК" також охоплює, як приклад, трибічні полінуклеотидні комплекси, описані, зокрема або, загалом, в опублікованій міжнародній патентній заявці, що має номер міжнародної заявки РСТ/О52010 /036962.
І. Нові катіонні ліпіди
І0097| Цей винахід передбачає, зокрема, нові катіонні (аміно) ліпіди, які можуть бути переважно використані в ліпідних частках, описаних у цьому документі, для іп міго та/або іп мімо доставок терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти, в клітини. Нові катіонні ліпіди згідно винаходу мають структури за формулою І, викладені у цьому документі, і містять їх (К) та/або (5) енантіомери. 0098) У деяких варіантах реалізації ліпід, згідно цьому винаходу, містить рацемічну суміш. У інших варіантах реалізації ліпід, за цим винаходом, включає суміш одного або більше діастереомерів. У деяких варіантах реалізації ліпід, за цим винаходом, збагачений одним енантіомером, таким чином, щоб ліпід містив щонайменше близько 5595, 6095, 6595, 70905, 7590, 8095, 8595, 9095, або 9595 енантіомерного надлишку. У деяких інших варіантах реалізації ліпід, за цим винаходом, збагачений одним діастереомером, таким чином, щоб ліпід містив щонайменше близько 5595, 6095, 6595, 7095, 7595, 80905, 8595, 9095, або 9595 діастереомерного надлишку. У деяких додаткових варіантах реалізації ліпід, за цим винаходом, є хірально чистим (наприклад, містить один оптичний ізомер). У інших варіантах реалізації ліпід, за цим винаходом, збагачений одним оптичним ізомером (наприклад, оптично активним ізомером), таким чином, щоб ліпід містив щонайменше близько 5595, 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095 або 9595 надлишку ізомерів. Цей винахід забезпечує синтез катіонних ліпідів за формулою І у вигляді рацемічної суміші або в оптично чистій формі.
І0099| Терміни "катіонний ліпід" і "аміно ліпід" використовуються в цьому документі взаємозамінно і охоплюють ті ліпіди і солі, наприклад, фармацевтично прийнятні солі, які мають одну, дві, три або більше жирних кислот або жирних алкільних ланцюгів і рН-титруємі
Зо амінокислотні кінцеві групи (наприклад, алкіламіно або діалкіламіно кінцеву групу). Катіонний ліпід, як правило, протонований (тобто позитивно заряджений) при рН нижче рКа катіонного ліпіду і по суті нейтральний при рН вище рКа. Катіонні ліпіди згідно винаходу також можуть бути названі титруємими катіонними ліпідами. 01001 Термін "солі" охоплює будь-який аніонний і катіонний комплекс, такий як комплекс, утворений між катіонним ліпідом, описаним у цьому документі, і одним або більше аніоном.
Необмежуючі приклади аніонів охоплюють неорганічні і органічні аніони, наприклад, гідрид, фторид, хлорид, бромід, йодид, оксалат (наприклад, гемиоксалат), фосфат, фосфонат, гідрофосфат, дигідрофосфат, оксид, карбонат, бікарбонат, нітрат, нітрит, нітрид, бісульфіт, сульфід, сульфіт, бісульфат, сульфат, тіосульфат, гідросульфат, борат, форміат, ацетат, бензоат, цитрат, тартрат, лактат, акрилат, поліакрилат, фумарат, малеат, ітаконат, гліколят, глюконат, малат, манделат, тиглат, аскорбінова кислота, саліцилат, поліметакрилат, перхлорат, хлорат, хлорит, гіпохлорит, бромат, гіпоброміт, йодат, алкілсульфонат, арилсульфонат, арсенат, арсеніт, хромат, біхромат, ціанід, ціанат, тіоціанат, гідроксид, пероксид, перманганат і їх суміші. У конкретних варіантах реалізації, солі катіонних ліпідів, описаних у цьому документі, є кристалічними солями. У конкретних варіантах реалізації, "солі" є "фармацевтично прийнятними солями".
І0101) Термін "фармацевтично прийнятні солі" відноситься до фармацевтично прийнятних солей сполук, солі яких, отримані з різних органічних і неорганічних протиіонів, добре відомі у даній області техніки. Фармацевтично прийнятні солі охоплюють як металеві (неорганічні) так і органічні солі, у тому числі перераховані в Кетіпдіоп'є Рпагтасецшісаї! 5сіепсев, 171п Еайоп, ра. 1418 (1985), але не обмежуючись ними. Фармацевтично прийнятні солі охоплюють, як приклад, солі неорганічних кислот, такі як гідрохлорид, сульфат, фосфат, дифосфат, гідробромід і нітрат, або солі органічних кислот, такі як малат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, ацетат, лактат, метансульфонат, п-толуолсульфонат або пальмоат, саліцилат і стеарат. Аналогічно фармацевтично прийнятні катіони охопплюють натрій, калій, кальцій, алюміній, літій і амоній (особливо амонієві солі з вторинними амінами), але не обмежуються ними. Конкретні солі за даним винаходом за причинами, вказаними вище, охоплюють калій, натрій, кальцій і амонієві солі. 01021) Термін "алкіл" охоплює прямий або розгалужений ланцюг, нециклічний або циклічний, бо насичений аліфатичний вуглеводень, що містить від 1 до 24 атомів вуглецю. Типові насичені алкіли з прямим ланцюгом охоплюють метил, етил, н-пропіл, н-бутил, н-пентил, н-гексил, і подібні до них, але не обмежуються ними, тоді як насичені розгалужені алкіли охоплюють ізопропіл, втор-бутил, ізобутил, трет-бутил, ізопентил і тому подібне, але не обмежуються ними.
Типові насичені циклічні алкіли охоплюють сз-я циклоалкіли, але не обмежуються ними, описані у цьому документі, тоді як ненасичені циклічні алкіли охоплюють Сз-в циклоалкеніли, описані у цьому документі, але не обмежуються ними.
ІО1031| Термін "гетероалкіл" охоплює лінійний або розгалужений ланцюг, нециклічний, або циклічний, насичений аліфатичний вуглеводень, як визначено вище, що містить від близько 1 до близько 5 гетероатомів (тобто 1, 2, 3, 4 або 5 гетероатомів), таких як, наприклад, О, М, 5 5, де атоми азоту і сірки можуть бути окислені, і гетероатом азоту може бути, необов'язково, кватернізованим. Гетероалкільна група може бути приєднана до останньої частини молекули через атом вуглецю або гетероатом. (0104) Термін "циклічний алкіл" охоплює будь-який заміщений або незаміщений циклоалкіл, гетероциклоалкіл, циклоалкеніл, гетероциклоалкеніл і групи, описані нижче.
І01051| Термін "циклоалкіл" охоплює заміщену або незаміщену циклічну алкільну групу, що має від близько З до близько 8 атомів вуглецю (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 атомів вуглецю) як верхнє кільце. Бажані циклоалкільні групи охоплюють групи, що мають від близько З до близько б атомів вуглецю у верхньому кільці. Приклади Сзв циклоалкільних груп охоплюють циклопропіл, метил-циклопропіл, диметил-циклопропіл, циклобутил, метил-циклобутил, циклопентил, метил-циклопентил, циклогексил, метил-циклогексил, диметил-циклогексил, циклогептил і циклооктил, а також інші заміщені Сз-в циклоалкільні групи, але не обмежуються ними.
ІО106) Термін "гетероциклоалкіл" охоплює заміщену або незаміщену циклічну алкільну групу, як визначено вище, що містить від близько 1ї до близько З гетероатомів як членів кільця, вибраних з групи, що складається з О, М, Зі і 5, в якому атоми азоту і сірки необов'язково можуть бути окислені, і гетероатом азоту може бути кватернізований. Гетероциклоалкільна група може бути приєднана до останньої частини молекули через атом вуглецю або гетероатом.
ІО107| Термін "циклоалкеніл" охоплює заміщену або незаміщену циклічну алкенільную групу,
Ко) що містить від близько З до близько 8 атомів вуглецю (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 атомів вуглецю) як верхнє кільце. Бажаними є циклоалкенільні групи, що мають від близько З до близько 6 атомів вуглецю у верхньому кільці. Приклади Сз-в циклоалкенільних груп охоплюють циклопропеніл, метил-циклопропеніл, диметил-циклопропеніл, циклобутеніл, циклопентеніл, циклогексеніл, циклогептеніл, циклооктеніл і так же як інші заміщені Сз-яв циклоалкенільні групи. 0108) Термін "тгетероциклоалкеніл" охоплює заміщену або незаміщену циклічну алкенільну групу, як визначено вище, що містить від близько 1 до близько З гетероатомів як членів кільця, вибраних з групи, що складається з 0, М, 5і і 5, де атом азоту і сірки атоми необов'язково можуть бути окислені, і гетероатом азоту може бути кватернізований. Гетероциклоалкенільна група може бути приєднана до останньої частини молекули через атом вуглецю або гетероатом.
ІЇО109| Термін "алкокси" охоплює групу за формулою алкіл-О-, в якій, "алкіл" має раніше вказане визначення. Необмежуючі приклади алкоксигруп включають метокси, етокси, н- пропокси, ізопропокси, н-бутокси, ізо-бутокси, втор-бутокси і трет-бутокси. 0110) Термін "алкеніл" охоплює алкіл, як визначено вище, що містить, щонайменше, один подвійний зв'язок між сусідніми атомами вуглецю. Алкеніли охоплюють як цис, так і трансизомери. Представлені прямим і розгалуженими ланцюгами алкеніли охоплюють етиленіл, пропіленіл, 1-бутеніл, 2-бутеніл, ізобутеніл, 1-пентеніл, 2-пентеніл, З-метил-1-бутеніл, 2-метил- 2-бутеніл, 2,3-диметил-2-бутеніл і тому подібне, але не обмежуються ними. Типові циклічні алкеніли описані вище.
ІО111| Термін "алкініл" охоплює будь-який алкіл або алкеніл, як визначено вище, який додатково містить щонайменше один потрийний зв'язок між сусідніми атомами вуглецю.
Представники прямого і розгалуженого ланцюга, алкініли охоплюють, без обмеження, ацетиленіл, пропініл, 1-бутиніл, 2-бутиніл, 1-пентиніл, 2-пентиніл, З-метил-1 бутиніл і тому подібне. 0112) Термін "арил" охоплює зазвичай поліненасичену ароматичну вуглеводневу групу, яка може бути одим кільцем або декількома кільцями (до трьох кілець), які з'єднуються разом, або зв'язані ковалентно, і які необов'язково несуть один або більше замісників, таких як, наприклад, галоген, трифторметил, аміно, алкіл, алкокси, алкілкарбоніл, ціано, карбамоїл, алкоксикарбамоїл, метилендіокси, карбокси, алкоксикарбоніл, амінокарбоніл, 60 алкіламінокарбоніл, діалкіламінокарбоніл, гідроксі, нітро і тому подібне. Необмежуючі приклади незаміщених арильних груп охоплюють феніл, нафтил і біфеніл. Приклади заміщених арильних груп охоплюють феніл, хлорфеніл, трифторметилфеніл, хлорфторфеніл, і амінофеніл, але не обмежуються ними. 0113) Терміни "алкілтіо", "алкілсульфоніл", "алкілсульфініл" і "арилсульфоніл" охоплюють групи, що мають формулу -5-В, -5(0)2-В, -5(0)-В! і -5(0)2ВІ, відповідно, де В! є алкільною групою, як визначено вище, і Е/ позначає арильну групу, як визначено раніше. 0114) Терміни "алкенілокси" і "алкінілокси" охоплюють групи, що мають формулу -О-В., в якій В! є алкенільною або алкінільною групою, відповідно. 0115) Терміни "алкенілтіо" і "алкінілтіо" охоплюють групи, що мають формулу -5-НК, де КК є алкенілом або алкінілом, відповідно. 0116) Термін "алкоксикарбоніл" охоплює групу, що має формулу -С(0)О-В, де Б є алкільною групою, як визначено вище, і в якій загальне число атомів вуглецю відноситься до об'єднаних алкільних і карбонільних фрагментів.
ІО117| Термін "ацил" охоплює будь-який алкіл, алкеніл або алкініл, де вуглець в точці приєднання заміщений оксогрупою, як визначено нижче. Нижче наведені необмежуючі приклади ацильних груп: -«С(-О)алкіл, -С(-О)алкеніл, і -«С(-О)алкініл. 0118) Термін "гетероцикл" охоплює 5-7--ленне моноциклічне, або 7-10-членне біциклічне гетероциклічне кільце, яке є або насиченим, або ненасиченим, або ароматичним і яке містить 1 або 2 гетероатомів, незалежно вибраних з азоту, кисню і сірки, і де гетероатоми азоту і сірки можуть бути, необов'язково, окислені, а гетероатом азоту може бути, необов'язково, кватернізований, у тому числі біциклічним кільцем, в якому будь-який з вказаних вище гетероциклів злитий з бензоловим кільцем. Гетероцикл може бути приєднаний через будь-який гетероатом або атом вуглецю. Гетероцикли охоплюють гетероарили, як визначено вище, а також морфолініл, піролідиноніл, піролідиніл, піперидиніл, піперизиніл, гідантоїніл, валеролактаміл, оксираніл, оксетаніл, тетрагідрофураніл, тетрагідропіраніл, тетрагідропіридиніл, тетрагідротіофеніл, тетрагідропримидинил, тетрагідротіопіраніл, тетрагідропіримідиніл, тетрагідротіофеніл, тетрагідротіопіраніл і тому подібне, але не обмежуються ними.
І0О119| Термін "гетероарил" охоплює ароматичний 5-10-членний гетероцикл, який містить
Зо один, два або більше гетероатомів, вибраних з азоту (М), кисню (ФО) і сірки (5). Гетероарил може бути заміщений по одному або більше атомам вуглецю замісниками, такими як, наприклад, галоген, алкіл, алкокси, ціано, галогеналкіл (наприклад, трифторметил), гетероцикліл (наприклад, морфолініл або піролідиніл), і тому подібне. Необмежуючі приклади гетероарилів охоплюють піридиніл і фураніл. 012091 Термін "галоген" охоплює фтор, хлор, бром і йод. 01211 Терміни "необов'язково заміщений алкіл", "необов'язково заміщений циклічний алкіл", "необов'язково заміщений алкеніл", "необов'язково заміщений алкініл", "необов'язково заміщений ацил" і "необов'язково заміщений гетероцикл" позначають, що щонайменше один атом водню заміщений замісником. У разі "оксо" замісника (50), два атоми водню є заміщеними. Необмежуючі приклади замісників охоплюють галоген, оксо, гетероцикл, -СМ, -ОВХ, -МАХВУ, -МАХО(-О)ВУ, -МАХЗО»ВУ, -С(-0О)8Х, -С(-0)ОВ8х, -С(-О)МАХВУ, -5ОА8Х, і -5БОоМА"ВУ, де п дорівнює 0, 1, ог 2, Кх ї КУ можуть бути однаковими або різними і незалежно представленими воднем, алкілом або гетероциклом, кожен з алкільних і гетероциклічних замісників можуть бути додатково заміщені одним або більше з оксо, галогену, -ОН, -СМ, алкілу, -ОНВХ, гетероциклу, -
МАХВУ, -МАХО(-О)ВУ, -МАХБО» ВУ, -Ф0(-0О)8Х, -Б(-0)О8х, -С(-О)МАХВУ, -«50285х, і -:5:00МАХВУ. Термін "необов'язково заміщений", коли використовується перед списком замісників, означає, що кожен із замісників у списку може бути необов'язково заміщений, як описано у цьому документі.
ІО122| В одному з аспектів цей винахід відноситься до катіонних ліпідів, що мають структурну формулу (1):
Х-А-У-2; (І) або їх солям, де:
Х є алкіламіногрупою;
А є від С: до Сє необов'язково заміщеним алкілом, де вказаний необов'язково заміщений С1-
Св-алкіл може бути насиченим або ненасиченим, і де А може бути присутнім або може не бути присутнім;
УМ вибраний з групи, що складається з кеталю, складного ефіру, необов'язково заміщеного карбамата, ефіру, і необов'язково заміщеного аміда; і 2 є гідрофобним фрагментом, що складається з трьох алкільних ланцюгів, де кожен з алкільних ланцюгів має довжину від Св до Сі, де кожен з трьох алкільних ланцюгів може бути бо насиченим або ненасиченим, і де кожен з трьох алкільних ланцюгів є необов'язково заміщеним.
ІО123)| У деяких варіантах реалізації ліпідів за Формулою (І), 2 має формулу: в. 7 зоре
Кз де, Кі, Р», і Кз, кожен окремо, вибрані з групи, що складається з від Св до Сі алкіла, де кожен з Кі, Н», і Кз може незалежно бути заміщеним або незаміщеним, і де кожен з Кн, Н», і з є необов'язково заміщеним.
ІО124| У конкретних варіантах реалізації, ліпід за Формулою (І) має одну з наступних структур: о ЩІ ран --
Сполука 9, о Щі
Арт о д-
Сполука 11, о -- -
Сполука 13, (о)
Сполука 14, о --
Сполука 19, 9 З
Ар о шо
Сполука 21,
ІТ Що подо
Сполука 22, о -- ква --
Сполука 23, о -- квар ш--
Н
Сполука 24, о Щі
Ач --
Н
Сполука 25, 9 Що рано --
Н
Сполука 26, о - ут то --
Сполука 27, о - утро --
Сполука 28,
Шо о) - т - но - ж
Сполука 30, ит -
Сполука 31,
Ти 5 повага
Сполука 40, о -- дити
Сполука 42, о --
Сполука 50, (в) -
Сполука 53, ол --
Сполука 62, (в)
Сполука 71,
в) аа --
Сполука 74, нава -- «пня
Сполука 76, (6) ра я
Сполука 79, о Щі
А
Сполука 83, о с
Сполука 89, або
Сполука 90.
ІЇО125) У деяких варіантах реалізації цього винаходу катіонний ліпід утворює сіль (наприклад, кристалічну сіль) з одним або більше аніоном. У одному конкретному варіанті реалізації катіонний ліпід є оксалатом (наприклад, гемиоксалатом) солі, який бажано є кристалічною сіллю. У конкретних варіантах реалізації катіонний ліпід утворює фармацевтично прийнятну сіль з одним або більше аніоном.
ІО126| Також включеними в обсяг цього винаходу є кристалічні форми, гідрати і сольвати сполук, описаних у цьому документі.
ІЇО127| Сполуки за винаходом можуть бути отримані за допомогою відомих органічних способів синтезу, у тому числі за способами, описаних у прикладах. У деяких варіантах реалізації синтез катіонних ліпідів за винаходом може вимагати використання захисних груп.
Методологія захисних груп добре відома фахівцям у даній області (дивись, наприклад, Ргоїесіїме Стоишрз іп Огдапіс зупіпевзів, Стееп, Т.М. еї. аї., ММіеу-Іпіегзсіепсе, Мем Могк Сіїу, 1999).
Якщо коротко, то захисні групи у контексті цього винаходу є будь-якою групою, яка зменшує або усуває небажану реакційну здатність функціональної групи. Захисна група може бути додана до функціональної групи для того, щоб замаскувати її реакційну здатність у ході деяких реакцій, а потім видалена для того, щоб показати первинну функціональну групу. В деяких випадках
Зо використовується "спиртова захисна група". "Спиртова захисна група" означає будь-яку групу, яка зменшує або усуває небажану реактивність функціональної спиртової групи. Захисні групи можуть бути додані і видалені за допомогою способів, добре відомих у даній області техніки. 0128) У деяких варіантах реалізації катіонні ліпіди за цим винаходом мають щонайменше одну протонуєму або депротонуєму групу, таку, що ліпід позитивно заряджений при рн на рівні або нижче за фізіологічне значення рН (наприклад, рН 7,4), і нейтральний на другому рН,
бажано на рівні або вище фізіологічного рН. Має бути зрозуміло будь-якому фахівцеві у даній області техніки, що додавання або видалення протонів залежить від рН рівноважного процесу, і, що посилання на заряджений або нейтральний ліпід відноситься до характеру переважаючого виду і не вимагає, щоб усі ліпіди були присутні у зарядженій або нейтральній формі. Ліпіди, які мають більше однієї протонуємої або депротонуємої групи, або які є цвіттер-іонами, не виключаються з використання у цьому винаході. 0129) У деяких інших варіантах реалізації, протонуємі ліпіди, відповідно до винаходу мають рКа протонуємих груп у діапазоні від близько 4 до близько 11. Найбільш бажаним є рКа від близько 4 до близько 7, тому що ці ліпіди будуть катіонними при низькому значенні рн препарату, тоді як частки будуть у значній мірі (хоча і не повністю) поверхнево нейтралізовані при фізіологічному значенні рН близько рН 7,4. Однією з переваг цієї рКа є те, що щонайменше частина нуклеїнової кислоти, пов'язана із зовнішньою поверхнею частки, втрачатиме свою електростатичну активність при фізіологічному рН і буде видалена шляхом простого діалізу, що значно знижує сприйнятливість частки до очищення.
ІМ. Активні агенти 01301 Активні агенти (наприклад, терапевтичні агенти) охоплюють будь-яку молекулу або сполуку, здатні надавати бажаний ефект на клітини, тканини, органи або суб'єкта. Такі ефекти можуть бути, наприклад, біологічними, фізіологічними та/або косметичними. Активні агенти можуть бути будь-яким типом молекули або сполуки, у тому числі нуклеїновими кислотами, пептидами, поліпептидами, малими молекулами, і їх сумішами, але не обмежуючись ними.
Необмежуючі приклади нуклеїнових кислот охоплюють молекули інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК, Дайсер-субстратні дсРНК, мшРНК, аїРНК, та/або мікроРНК), антисмислові олігонуклеотиди, плазміди, рибозими, імуностимулюючі олігонуклеотиди і їх суміші. Приклади пептидів або поліпептидів містять, без обмеження, антитіла (наприклад, поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, фрагменти антитіл; гуманізовані антитіла, рекомбінантні антитіла, рекомбінантні людські антитіла, та/або антитіла, Ргітаїігей"мМ), цитокіни, фактори зростання, фактори апоптозу, фактори, що індукують диференціювання, рецептори клітинної поверхні і їх ліганди, гормони, а також їх суміші. Приклади малих молекул містять невеликі органічні молекули або сполуки, такі як будь-які звичайні агенти або лікарські засоби, відомі фахівцям у
Ко) даній області, але не обмежуються ними.
ЇО131| У деяких варіантах реалізації активний агент є терапевтичним агентом, або його сіллю, або його похідним. Похідний терапевтичний агент може бути терапевтично активним сам по собі або він може бути проліками, які стають активними при подальшій модифікації. Таким чином, в одному варіанті реалізації похідне терапевтичного агента зберігає всю або деяку терапевтичну активність у порівнянні з немодифікованим агентом, тоді як в іншому варіанті реалізації, похідне терапевтичного агента представлено проліками, в яких відсутня терапевтична активність, але які стають активними після подальшої модифікації.
А. Нуклеїнові кислоти
ІО132| У деяких варіантах реалізації, ліпідні частки за цим винаходом пов'язані з нуклеїновою кислотою, внаслідок чого одержують нуклеїнові кислотно-ліпідні частки (наприклад, І МР). У деяких варіантах реалізації нуклеїнова кислота повністю поміщена в ліпідну частку. Як використано в цьому описі, термін "нуклеїнова кислота" охоплює будь-який олігонуклеотид або полінуклеотид, з фрагментами, що містять до 60 нуклеотидів, які зазвичай називають олігонуклеотидами, і довші фрагменти, які називають полінуклеотиди. У конкретних варіантах реалізації, олігонуклеотиди за цим винаходом складаються з від близько 15 до близько 60 нуклеотидів у довжину. Нуклеїнові кислоти можуть бути введені окремо у ліпідні частки за цим винаходом, або в комбінації (наприклад, що спільно вводяться) з ліпідними частками за винаходом, що містять пептиди, поліпептиди, або невеликі молекули, такі як звичайні ліки.
ІО133) У контексті цього винаходу, термін "полінуклеотид" і "олігонуклеотид" відносяться до полімеру, або олігомеру нуклеотиду або нуклеозидним мономерів, що складаються з основ, що зустричаються у природі, цукрів і інтерцукрів (основ) лінкерів. Терміни "полінуклеотид" і "олігонуклеотид" також охоплюють полімери або олігомери, що містять мономери, які не зустрічаються у природі, або їх частини, які функціонують аналогічним чином. Такі модифіковані або заміщені олігонуклеотиди часто є бажаніше нативних форм через їх властивості, таких як, наприклад, підвищене клітинне поглінання, зменшена імуногенність, і підвищена стабільність у присутності нуклеаз.
ІО134| Олігонуклеотіди зазвичай класифікуються як дезоксирибоолігонуклеотиди або рибоолігонуклеотиди. Дезоксирибоолігонуклеотіди складаються з 5-вуглецевого цукру, так бо званого дезоксирибоза, приєднаного ковалентно до фосфату в 5' і 3' атомах вуглецю цього цукру з утворенням змінного, нерозгалуженого полімеру. Рибоолігонуклеотід складається з подібної структури, що повторюється, де 5-вуглецевий цукор є рибозою. 0135) Нуклеїнова кислота, яка присутня у нуклеїновій кислотно-ліпідній частці відповідно до цього винаходу включає будь-яку форму відомої нуклеїнової кислоти. Нуклеїнові кислоти, використані у цьому документі, можуть бути одноланцюжковою ДНК або РНК, або дволанцюжковою ДНК або РНК, або ДНК-РНК гібридом. Приклади дволанцюжкової ДНК описані у цьому документі і містять, наприклад, структурні гени, гени, що містять контрольні і термінальні гени, і системи, що самореплікуються, такі як вірусна або плазмідна ДНК. Приклади дволанцюжкової РНК описані у цьому документі, і включають, наприклад, міРНК і інші агенти, такі як ІРНК, Дайсер-субстратні дсРНК, мшРНК, аїіРНК, і пре-мікроРНК. Одноланцюжкові нуклеїнові кислоти містять, наприклад, антисмислові олігонуклеотиди, рибозими, зрілі мікроРНК, і триплекс формуючі олігонуклеотиди.
ІО136| Нуклеїнові кислоти згідно винаходу можуть бути різної довжини, що зазвичай залежить від конкретної форми нуклеїнової кислоти. Наприклад, у конкретних варіантах реалізації плазміди або гени можуть складатися з від близько 1000 до близько 100000 нуклеотидних залишків у довжину. У конкретних варіантах реалізації, олігонуклеотиди можуть варіюватися від близько 10 до близько 100 нуклеотидів у довжину. У різних варіантах реалізації, пов'язаних з олігонуклеотидами, як одноланцюжковими, дволанцюжковими, і три- ланцюжковими, можуть варіюватися по довжині від близько 10 до близько 60 нуклеотидів, від близько 15 до близько 60 нуклеотидів, від близько 20 до близько 50 нуклеотидів, з від близько 15 до близько 30 нуклеотидів, або від близько 20 до близько 30 нуклеотидів у довжину.
ІО137| У конкретних варіантах реалізації олігонуклеотид (або його ланцюг) за винаходом специфічно гібридизуется з або є комплементарною послідовністю полінуклеотиду-мішені.
Терміни "специфічно гібридизується" і "комплементарні", що використовуються у цьому документі, показують достатню міру комплементу, так що між ДНК або РНК мішені і олігонуклеотида відбувається стабільне і специфічне зв'язування. Зрозуміло, що олігонуклеотид може не бути на 10095 комплементарним цільовій послідовності нуклеїнової кислоти, аби специфічно гібридизуватись. У бажаних варіантах реалізації олігонуклеотид специфічно гібридизується, коли олігонуклеотид зв'язується з послідовністю-мішенню, що перешкоджає
Зо нормальній функції послідовності-мішені, щоб викликати втрату його корисності або експресії, і є достатня міра комплементарності, щоб уникнути неспецифічного зв'язування олігонуклеотида з послідовністю-немішенню в умовах, коли бажане специфічне зв'язування, тобто, у фізіологічних умовах у разі аналізів іп мімо або терапевтичного лікування, або, в разі аналізів іп міго, в умовах, в яких аналізи проводяться. Таким чином, олігонуклеотид може включати 1, 2, З або більше базових замін у порівнянні з ділянкою генної послідовності або мРНК, так що вона уражує або з якою вона специфічно гібридизується. 1. міРНК
ЇО138| Компонент міРНК нуклеїнової кислотно-ліпідної частки за цим винаходом здатний вимикати експресію цільового гена. Кожна нитка дуплексу міРНК, як правило, має від близько 15 до 60 нуклеотидів у довжину, бажано від близько 15 до близько 30 нуклеотидів у довжину. У деяких варіантах реалізації міРНК містить щонайменше один модифікований нуклеотид.
Модифіковані міРНК, як правило, менш імуностимулюючі, ніж відповідні немодифіковані послідовності міРНК і зберігають активність ІРНК відносно цільового гена. У деяких варіантах реалізації змінена міРНК містить щонайменше один 2'ОМе псечовинний або піримідиновий нуклеотид, такий як 2'ОМе-гуанозиновий, 2'ОМе-уридиновий, 2'ОМе-аденозиновий та/або 2"ОМе-цитозиновий нуклеотид. Модифіковані нуклеотиди можуть бути присутніми в одному ланцюзі (тобто, смислові і антисмислові) або в обох ланцюгах міРнНК. У деяких бажаних варіантах реалізації один або більше з уридинового талабо гуанозинового нуклеотиду модифіковані (наприклад, 2'ОМе-модифікований) в одному ланцюзі (тобто, смисловий і антисмисловий) або обох ланцюгах міРНК. У цих варіантах реалізації змінена міРНК може додатково містити один або декілька модифікованих (наприклад, 2'ОМе-модифікований аденозин) та/«або змінених (наприклад, 2'ОМе-модифіковані нуклеотиди) цитозинів. У інших бажаних варіантах реалізації лише уридинові та/або гуанозинові нуклеотиди є модифікованами (наприклад, 2'ОМе-модифікований) в одному ланцюзі (тобто, смислові і антисмислові) або в обох ланцюгах міРНК. МіРНК послідовності можуть мати виступи (наприклад, 3' або 5' виступи, як описано в ЕЇІразпіг еї аІ., зепе5 Оеу., 15:188 (2001) або МуКкапеп еї аї., СеїІЇ, 107:309 (2001)), або можуть мати липкий кінець (тобто мають тупі кінці). 0139) У конкретних варіантах реалізації селективне введення модифікованих нуклеотидів, таких як 2'ОМе-уридинових та/або гуанозинових нуклеотидів у дволанцюжкові ділянки однієї або бо обох ланцюгів міРНК зменшує або повністю відміняє імунну відповідь на цю міРНК молекулу. В деяких випадках, імуностимулюючі властивості специфічних послідовностей міРНК і їх здатність вимикати експресію гена може бути оптимізована або врівноважена введенням мінімальних і селективних модифікацій 2'ОМе в дволанцюжкову область дуплексу міРНК. Це може бути досягнуто при терапевтично життєздатних дозах міРНК без індукції цитокінів, токсичності, і щоб уникнути нецільових ефектів, пов'язаних з використанням немодифікованої мігРНК. (0140) Модифіковані міРНК загалом містять від близько 195 до близько 10095 (наприклад, від близько 195, 295, 395, 495, 595, 690, 7905, 895, 995, 10905, 1195, 1295, 1395, 1495, 1595, 1695, 17905, 18965, 1996, 2096, 2190, 220, 23, 24, 2590, 26, 2790, 289ю, 299, 3090, Збю, 4090, 45905, З0Ую, 5590, бос, бос, 7095, 795, 8095, 8595, 9095, 9595, або 10095) модифікованих нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці дуплексу міРНК. У деяких варіантах реалізації один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять або більше нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРнК містять модифіковані нуклеотиди. У деяких інших варіантах реалізації деякі або всі модифіковані нуклеотиди в дволанцюжковій ділянці міРНК є 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше нуклеотидами окремо один від одного. В одному з бажаних варіантів реалізації, жоден з модифікованих нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК не є суміжними один з одним (наприклад, існує розрив, щонайменше, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або немодифікованими нуклеотидами між кожним модифікованим нуклеотидом). 0141) У деяких варіантах реалізації, менше ніж близько 5095 (наприклад, менше ніж близько 4995, 4895, 4795, 4695, 4595, 4495, 4395, 4295, 4195, 4095, 3995, 3895, 3795 або 3695, бажано менше ніж близько 3595, 34905, 3395, 32905, 3195 або 3095) нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРнК містять модифіковані (наприклад, 2'ОМе) нуклеотиди. У одному з аспектів цих варіантів реалізації менше ніж близько 5095 уридинових та/або гуанозинових нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці однієї або обох ланцюгів міРНК вибірково (наприклад, лише) змінені. В іншому аспекті цих варіантів реалізації, менше ніж близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що міРНК містить 2'.ОМе нуклеотиди в обох ланцюгах міРНК, який відрізняється тим, що міРНК містить щонайменше один 2'ОМе-гуанозиновий нуклеотид і принаймні один 2'ОМе-уридиновий нуклеотид, і де 2'ОМе- гуанозиновий нуклеотид і 2'ОМе-уридиновий нуклеотид є єдиними 2'ОМе нуклеотидами, присутніми в дволанцюжковій ділянці. У ще одному аспекті цих варіантів реалізації, менше ніж близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що міРНК містить 2'ОМе нуклеотиди в обох ланцюгах модифікованої міРНК, в якому міРНК містить 2'ОМе нуклеотиди, вибрані з групи, що складається з 2'ОМе- гуанозинових нуклеотидів, 2':ОМе-уридинових нуклеотидів, 2:ОМе-аденозинових нуклеотидів і їх сумішей, і де міРНК не містить 2'Ме-цитозинових нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці. У ще одному аспекті цих варіантів реалізації, менше ніж близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що міРНК включає 2 ОМе нуклеотиди в обох ланцюгах міРНК, в якому міРНК містить щонайменше один 2'ОМе-гуанозин нуклеотиду і принаймні один 2'Ме-уридин нуклеотидів, і де міРНК не містить 2'ОМе-цитозин нуклеотидів в дволанцюжковій ділянці. У іншому аспекті цих варіантів реалізації, менше ніж близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що містять міРНК 2'ОМе нуклеотидів в обох ланцюгах модифікованої міРНК, в якому міРНК складається з 2'ОМе нуклеотидів, вибраних з групи, що складається з 2'ОМе- гуанозинових нуклеотидів, 2'ОМе-уридинових нуклеотидів, 2:ОМе-аденозинових нуклеотидів і їх сумішей, і де нуклеотиди 2'ОМе у дволанцюжковій ділянці знаходяться не поруч один з одним. 01421 У інших варіантах реалізації, від близько 195 до близько 5095 (наприклад, від близько
Бус-5О0Ую, 1095-5090, 1595-5095, 2090-5090, 2590-5090, З09о-5О090, 3590-5095, 4095-5095, 4595-5090,
Бус-4БУв, 1090-4596, 1595-4595, 2090-4595, 2590-4595, 3090-4595, 3590-4595, 4090-4590, 5Уо-4090, 1О6-4090, 1590-4096, 2090-4096, 2590-4096, 2590-3990, 2590-3890, 2590-3790, 2590-3690, 2690-3990, 2606-3896, 26-37, 2бою-3бою, 270-390, 270-380, 270-370, 2790-3690, 2890-3990, 2890-3890, 280-370, 2890-3690, 290-390, 290-380, 290-370, 290-336, 3090-4090, ЗО0Уо-39Уо, 3090-3890,
ЗОфо-3З79ю, ЗОфо-Збоую, 310-390, 3190-3890, 3190-3790, 3190-36, 3290-3990, Зеуо-38У0, З29Уо-3790о,
Зато-3бою, ЗЗУо-39У0, 33-30, ЗЗУо-3/Уо, ЗЗо-3бю, ЗАУо-ЗУУо, 3490-3890, ЗАЧо-З/Уо, 3490-3690,
ЗБою-4090, боо-ЗБ9ю, 1090-3590, 1590-3590, 2090-3590, 2190-3590, 2290-3596, 2390-3590, 2490-3590, 2590-3590, 26-30, 2790-3590, 2890-3590, 290-350, ЗО0до-35Ую, 3190-3590, Зеуо-35У0, 3390-3590,
Зафо-ЗБ5ою, ЗОдо-ЗАУю, 3190-3490, Зеуо-ЗАУо, ЗЗУо-З4Фю, ЗО0до-ЗЗУю, 3190-3390, Зеуо-ЗЗУю, 3090-3290,
З1Фо-З2ою, 2590-3490, 2590-3390, 2590-3290, 2590-3190, 2бус-ЗАУю, 2690-3390, 2бус-З2Уо, 2690-3190, 27-34, 270-330, 27 Чо-Зею, 2170-3190, 29о-З4Фю, 2890-3390, 2890-3290, 2890-3190, 2990-3490, 290-330, 29-32, 2990-3190, бУо-ЗОФю, 1090-3090, 1590-3090, 2090-3490, 2090-3390, 2090-3290, 2096-3196, 2090-3090, 2190-3090, 2290-3090, 230-300, 2490-3090, 2590-3090, 2590-2990, 2590-2890, 60 2590-2790, 20-26, 2бою-З09ю, 26-29, 260-280, 26-20, 2790-3090, 270-290, 2790-2890,
2890-3095, 2890-2995, 2995-3095, бУв-2590, 1090-2595, 1595-2595, 2096-2995, 2090-2895, 2095-2790, 2096-2690, 2090-2590, 590-209, 1090-2090, 1590-2090, 59о-1595, 1095-1595, або 5956-1095) нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять модифіковані нуклеотиди. В одному з аспектів цих варіантів реалізації, від близько 195 до близько 5095 уридинових та/або гуанозинових нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці одного або обох ланцюгів міРНК вибірково (наприклад, лише) змінені. В іншому аспекті цих варіантів реалізації, від близько 195 до близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що міРНК включає 2'ОМе нуклеотиди в обох ланцюгах киРНК, що відрізняється тим, що міРНК містить, щонайменше один 2'ОМе-гуанозиновий нуклеотид і принаймні один 2'ОМе-уридиновий нуклеотид, і де 2'ОМе-гуанозиновий нуклеотид і 2':ОМе-уридиновий нуклеотид є єдиними 2-ОМе нуклеотидами, присутніми у дволанцюжковій ділянці. У ще одному аспекті цих варіантів реалізації, від близько 195 до близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що міРНК містить 2'ОМе нуклеотиди в обох ланцюгах модифікованої міРНК, де міРНК містить 2'ОМе нуклеотиди, вибрані з групи, що складається з 2"ОМе-гуанозинових нуклеотидів, 2'ОМе-уридинових нуклеотидів, 2'ОМе-аденозинових нуклеотидів і їх сумішей, і де міРНК не містить 2'ОМе-цитозинових нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці У ще одному аспекті цих варіантів реалізації, від близько 195 до близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що міРНК містить 2'ОМе нуклеотиди в обох ланцюгах міРНК, в якому міРНК містить щонайменше один 2'ОМе-гуанозин нуклеотиду і принаймні один 2'ОМе-уридин нуклеотидів, і де міРНК не містить 2'ОМе-цитозин нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці. В іншому аспекті цих варіантів реалізації, від близько 195 до близько 5095 нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять 2'ОМе нуклеотиди, які відрізняються тим, що містять міРНК 2'ОМе нуклеотидів в обох ланцюгах модифікованої міРНК, де міРНК складається з 2'ОМе нуклеотидів, вибраних з групи, що складається з 2'ОМе-гуанозинових нуклеотидів, 2'ОМе- уридинових нуклеотидів, 2'ОМе-аденозинових нуклеотидів і їх сумішей, і де нуклеотиди 2'ОМе у дволанцюжковій ділянці знаходяться не поруч один з одним. 0143) Додаткові діапазони, відсотки і зразки модифікацій, які можуть бути введені в міРНК, описані в заявці на патент США Мо 2007/0135372, розкриття якої включене у цей опис шляхом
Зо посилання у повному обсязі для всіх цілей. а) Селекція послідовностей міРНК (0144) Прийнятні послідовності міРНК можуть бути ідентифіковані з використанням будь- яких засобів, відомих у даній області. Як правило, способи, описані в ЕЇІбазпіг еї аї., Майге, 411:494-498 (2001) і ЕІразпіг еї аІ., ЕМВО .., 20:6877-6888 (2001) поєднуються з алгоритмом конструктивного розрахунку, викладеними в Кеупоїаз еї аї., Маїиге Віоїесп., 22(3):326-330 (2004). 0145) Як необмежуючий приклад, нуклеотидна послідовність 3'ініціаторного АОС кодона транскрипта з гена-мішені, що цікавить, може бути сканована на динуклеотидні послідовності (например, АА, МА, СС, 0, або 0, де М - С, з або І) (див., наприклад, ЕІрабзпіг еї аІ., ЕМВО у., 20:6877-6888 (2001)). Нуклеотиди безпосередньо 3 з динуклеотидними послідовностями визначені як потенційні послідовності міРНК (тобто послідовностей-мішеней або ланцюгів смислових послідовностей). Як правило, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 або більше нуклеотидів безпосередньо 3' з динуклеотидними послідовностями визначені як потенційні послідовності міРНК. У деяких варіантах реалізації динуклеотидна послідовність є АА або послідовність МА і 19 нуклеотидів безпосередньо 3 до АА або МА динуклеотидам ідентифіковані як потенційні послідовності міРНК. Послідовності міРНК, як правило, розташовані в різних положеннях уздовж довжини гена-мішені. Для подальшого підвищення ефективності виключення міРнК послідовностей, потенційні послідовності міРНК можуть бути проаналізовані, щоб визначити ділянки, які не містять області гомології з іншими кодуючими послідовностями, наприклад, у цільовій клітині або організмі. Наприклад, відповідна послідовність міРНК має близько 21 пару основ, як правило, не більше ніж 16-17 суміжних пар основ, гомологічних з кодуючою послідовністю в клітині-мішені або організмі Якщо послідовності міРНК не мають бути експресовані від промотора РНК Рої ПП, послідовності міРНК не вистачає на більше ніж 4 суміжними А або Т, які були вибрані. 0146) Після того, як потенційні послідовності міРНК були ідентифіковані, комплементарна послідовність (тобто послідовність антисмислового ланцюга) може бути розроблена.
Потенційна послідовність міРНК також може бути проаналізована з використанням різних критеріїв, відомих у даній області. Наприклад, для підвищення ефективності їх виключення, міРНК послідовності можуть бути проаналізовані за допомогою алгоритму конструктивного розрахунку для ідентифікації послідовностей, які мають одну або більше з наступних ознак: (1) 60 вміст (/С від близько 2595 до близько 6095 (3/С; (2) щонайменше, З А/О зв'язаними у положеннях 15-19 смислового ланцюгу; (3) не включаючи внутришні повтори; (4) у положенні 19 смислового ланцюгу; (5) у положенні З смислового ланцюгу; (б) ОО в положенні 10 смислового ланцюгу; (7) 5/С у положенні 19 смислового ланцюгу; і (8) без С у положенні 13 смислового ланцюгу. Конструкторські інструменти міРнНК, які містять алгоритми, які привласнюють відповідні значення кожної з цих особливостей і корисних для відбору міРНК, можна знайти на, наприклад, пер://поте. и пК/БоКствпо/5іР НК/5іРНК.іті. Спеціалісту в даній області техніки буде зрозуміло, що послідовності з одним або декількома з вказаних вище характеристик, можуть бути вибрані для подальшого аналізу і випробувань як потенційні послідовності міРНК. 01471 Крім того, потенційні послідовності міРНК з одним або більше з наступних критеріїв часто можуть бути усунені, як міРНК: (1) послідовності, що містять ділянку 4 або більше однакових основ у ряду; (2) послідовності, що містять гомополімери С (тобто, для того, щоб зменшити можливі неспецифічні ефекти, обумовлені структурними характеристиками цих полімерів; (3) послідовності, що містять потрійні базові мотиви (наприклад, Осо, ССС, ААА, або
ТТ); (4) послідовності, що містять ділянки 7 або більше б/С у рядку, і (5), послідовності, що містять прямі повтори, з 4 або більше базових з кандидатами, результуючими у внутрішні структури, загнуті назад. Проте, фахівцям у даній області буде зрозуміло, що послідовності з одним або декількома з вищезгаданих характеристик усе ж можуть бути вибрані для подальшого аналізу і випробувань як потенційні послідовності міРНК.
ЇО148) У деяких варіантах реалізації потенційні послідовності міРНК можуть бути додатково проаналізовані на основі дуплексної асиметриї міРНК, як описано, наприклад, у Кпмогома еї аї.,
СеїІ, 115:209-216 (2003); і Зспуагл еї аї., СеїІ, 115:199-208 (2003). В інших варіантах реалізації потенційні послідовності міРНК можуть бути додатково проаналізовані на основі вторинної структури в сайті-мішені, як описано, наприклад, у шо еї аї., Віорпу5. Ке5. Соттип., 318:303- 310 (2004). Наприклад, вторинна структура у сайті-мішені може бути змодельована за допомогою алгоритму МІоЇЯ (доступний на пер:/Лллоїа.ригпеї еди.аш/РНК тогіт), щоб вибрати міРНК послідовності, які сприяють доступу на сайти-мішені, де менше вторинної структури, яка присутня у формі парних основ і стволових петель. 0149) Після того, як потенційна послідовність міРНК була визначена, послідовність може бути проаналізована на предмет наявності будь-яких імуностимулюючих властивостей,
Зо наприклад, з використанням іп міго цитокінового аналізу або іп мімо в тваринній моделі. Мотиви в смислових, і антисмислових ланцюгах послідовності міРНК, такі як (О-багаті мотиви (наприклад, 5-00-3 5-Ц0(0-3, 5-0И0050-3, 5-00Ц(00-3, і так далі) можуть також забезпечувати індикацію, якщо послідовність буде імуностимулюючою. Після того, як молекула міРНК виявляється імуностимулюючою, вона може бути змінена для того, щоб зменшити її імуностимулюючі властивості, як описано в цьому документі. Як необмежуючий приклад, послідовність міРНК може контактувати з клітиною-респондером ссавця у таких умовах, що клітина продукує імунну відповідь, що виявляється, щоб визначити, чи є міРНнК імуностимулюючою або неімуностимулюючою міРНК. Клітина-респондер ссавця може бути від нативних ссавців (наприклад, у ссавця, який раніше не був у контакті з генним продуктом послідовності міРНК). Клітина-респондер ссавця може бути, наприклад, периферичною мононуклеарною клітиною крові (РВМС), макрофагом і тому подібним. Імунна відповідь, що виявляється, може включати продукції цитокінів або факторів зростання, таких як, наприклад,
ТМЕ-а, ІЕМ-а, ІЕМ-В, ІЕМ-у, 1-6, 1/-12, або їх комбінацією. Молекули міРНК визначені як імуностимулюючі можуть бути модифіковані, щоб зменшити її імуностимулюючі властивості шляхом заміни щонайменше одного з нуклеотидів смислового та/або антисмислового ланцюга модифікованими нуклеотидами. Наприклад, менше ніж близько 3095 (наприклад, менше ніж близько 3095, 2595, 2095, 1595, 1095 або 595) нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці дуплексу міРнНК можуть бути замінена модифікованими нуклеотидами, такими як 2'Ме нуклеотиди.
Модифіковані міРНК можуть потім вступити в контакт з клітинами-респондерами ссавця, як описано вище, щоб підтвердити, що їх імуностимулюючі властивості були зменшені або скасовані.
ІЇО150| Прийнятні іп мійго тести для визначення імунної відповіді охоплюють, але не обмежуються ними, методика сендвич-імуноаналіза подвійного моноклонального антитіла по
Баміда єї аї. (0.5. Раїєпі Мо. 4,376,110); сендвіч-аналіз моноклонально-поліклональних антитіл (М/іде еї аї., іп КіКНат апа Нипієг, едв5., Вадіоїттипоаззау Меїподз, Е. апа 5. І іміпдвіопе,
Едіпригуой (1970)); Метод "Вестерн-блоттінг" (Согдоп еї а). (0.5. Раїепі Мо. 4,452,901); імунопреципітація міченого ліганда (Вгом/п еї аї., 9. ВіоЇ. Спет., 255:4980-4983 (1980)); ензим- зв'язуючий імуноферментний аналіз (ЕГІ5А), як описано, наприклад, у Каїпе5 еї аї., 9. Віої.
Спет., 257:5154-5160 (1982); імуноцитохімічні способи, у тому числі використання фторохромів бо (Вгоокз еї аї., Сіїп. Ехр. Іттипої., 39:477 (1980)); і нейтралізацію активності (Вожмеп-Роре еї аї.,
Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 81:2396-2400 (1984)). На додаток до описаних вище імунологічних досліджень, доступний ряд інших імунологічних досліджень, у тому числі тих, які описані в патентах США Мо 3817827; 3850752; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; і 4098876.
Розкриття цих посилань включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІО151)| Необмежуючий приклад іп мімо моделі для виявлення імунної відповіді містить іп мімо дослідження індукції цитокінів мишей, як описано, наприклад, у Упаде еї аї., Мої. ТНег., 13:494- 505 (2006). У деяких варіантах реалізації, аналіз може бути виконаний таким чином: (1) міРнК можуть бути введені за допомогою стандартної внутрішньовенної ін'єкції у бічну хвостову вену; (2) кров може бути відібрана через сердечну пункцію через близько 6 годин після введення і оброблена, як плазма для аналізу цитокінів; і (3) цитокіни можуть бути пораховані з використанням сендвич ЕГІЗА комплектів відповідно до інструкцій виготівника (наприклад, мишасті і людські ІЄМ-а (РВІ. Віотеадісаї; Різсаїаугау, МУ); людські 1-6 і ТМЕ-са (еВіозсіепсе; зап
Ріедо, СА); і мишачі І -6, ТМЕ-а, і ІЕМ-у (ВО Віозсіепсе5; Зап Оієдо, СА)).
ЇО152| Моноклональні антитіла, які специфічно зв'язують цитокіни і фактори зростання, є комерційно доступними з різних джерел і можуть бути створені з використанням способів, відомих у даній області (див., наприклад, Копіег еї аї., Маїиге, 256: 495-497 (1975) апа Напомж апа Гапе, АМТІВООСІЕЄ5, А ГАВОВАТОНУ МАМИАЇ, Со бргіпд Натог Рибіїсайоп, Мем Моїк (1999)). Генерування моноклональних антитіл було описане раніше, і може бути виконано будь- яким способом, відомим у даній області техніки (Вийгіпод еї аї!., іп Нубгідота, Мої. 10, Мо. 1, рр. 77-18 (1991)). У деяких способах, моноклональне антитіло помічають (наприклад, будь-якою композицією, яка виявляється спектроскопічними, фотохімічними, біохімічними, електричними, оптичними, або хімічними засобами) для полегшення виявлення. р) Генеруючі молекули міРНК 0153) МІРНК можуть бути представлені в різних формах, включаючи, наприклад, у вигляді одного або що більше ізольованих малих-інтерферуючих РНК (міРНК) дуплексів, у вигляді довгих дволанцюжкових РНК (длРНК), або у вигляді транскрибованих міРНК або длРНК від касети транскрипції в плазмідній ДНК. У деяких варіантах реалізації, міРНК, можуть бути отримані ферментативно або частично/повністю органічним синтезом, і модифіковані
Зо рибонуклеотиди можуть бути введені за допомогою іп міго ферментативного або органічного синтезу. У деяких випадках, кожен ланцюг одержують хімічним шляхом. Способи синтезу молекул РНК, відомі у даній області, наприклад, способи хімічного синтезу, як описано у Мегта апа ЕскКзвівіп (1998), або як описано у цьому документі. 0154) Популяція РНК може бути використана для забезпечення довгих РНК-попередників, або довгих РНК-попередників, які мають істотну або повну схожість з вибраною послідовністю- мішенню і можуть бути використані, щоб одержати міРНК. РНК може бути виділена з клітин або тканин, синтезована, та/або клонована відповідно до способів, добре відомих фахівцям у даній області. РНК може бути у змішаній популяції (одержана з клітин або тканин, транскрибованих з
КДНК, заміщена, вибрана, і так далі), або може бути єдиною послідовністю-мішенню. РНК може бути такою, що зустрічається в природі (наприклад, виділена із зразків тканини або клітин), синтезована іп міго (наприклад, з використанням 17 або 5Рб полімерази і РСЕ-продуктів або клонованої кКДНК), або хімічно синтезованою. 0155) Для того, щоб сформувати довгу длРНК для синтетичних РНК, комплемент також транскрибується у пробірку і гібридизується з утворенням длРНК. При використанні популяції, що зустричається у природі, РНК, РНК комплемент також передбачений (наприклад, для формування длРНК для розщеплювання Е. соїї РНКази ПШ або Дайсер), наприклад, шляхом транскрипції КДНК, що відповідає популяції РНК, або за допомогою РНК-полімерази. РНК- попередники потім гібридизують з утворенням дволанцюжкових РНК для розщеплювання.
ДлРНК можуть бути безпосередньо введені суб'єктові або можуть бути розщеплені іп міго перед введенням.
ЇО156| Способи виділення РНК, синтез РНК, гібридизація нуклеїнових кислот, створення і скринінг бібліотек кКДНК, і постановка РСЕК добре відомі у даній області (див., наприклад, Сибіег апа Ноїйтап, Сепе, 25:263-269 (1983); Затьгоок еї аї., зирга; А!,5ибеї еї аї., вирга), як і РСК способи (див, патенти США Мо 4683195 і 4683202; РСК РгоїосоЇ5: А Сціде то Меїйпод5 апа
Арріїсайоп5 (Іппіб5 еї аї., ед5, 1990)). Бібліотеки експресії також добре відомі фахівцям у даній області. Додаткові базові тексти, що розкривають загальні способи використання у цьому винаході, охоплюють ЗзатрбгоокК еї аї!., МоїІесшаг Сіопіпу, А Гарогаїгу Мапиаї! (214 ей. 1989);
Ктгіедіег, Сепе Тгапеїег апа Ехргеззіоп: А І арогаїогу Мапиа! (1990); та Ситепі Ргоїосої5 іп
МоїІесшіаг Віоіоду (Ає,йзибеї еї аї., ед5., 1994). Розкриття цих посилань включені в цей опис бо шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІЇО157| Бажно, міРНК є хімічно синтезованими. Олігонуклеотіди, які містять молекули міРНК за винаходом, можуть бути синтезовані з використанням будь-якої з безлічі методик, відомих у даній області, таких як ті, що описані в Озтап еї аї., У. Ат. Спет. 5ос., 109:7845 (1987); Зсагіпає еї аї., Мисі. Асіаб5 Нев., 18:5433 (1990); М/іпсоїї єї аї., Мисі. Асідб5 Нев., 23:2677-2684 (1995); та
Уміпсої еї аіІ., МеїШоаз Мої. Віо., 74:59 (1997). Синтез олігонуклеотидів використовує поширені нуклеїново-кислотні поєднувальні і захисні групи, такі як диметокситритил на 5'-кінці і фосфорамідитів на 3'-кінці Як необмежуючий приклад, дрібномасштабний синтез може проводитися на синтезаторі Арріїей Віозузіет5 з використанням протоколу масштабу 0,2 мкмоль. Крім того, синтез при масштабі шкали 0,2 мкмоль може бути виконаний на синтезаторі 9б-лункового планшета від Ргоїосдепе (Раю Айо, СА). Проте, більший або менший масштаб синтезу також входить в обсяг цього винаходу. Прийнятні реагенти для синтезу олігонуклеотидів, способів видалення захисних для РНК груп і способи очищення РНК відомі фахівцям у цій області техніки. 0158) Молекули міРНК також можуть бути синтезовані за допомогою методики тандемного синтезу, в якому обидва ланцюга синтезуються у вигляді одного безперервного олігонуклеотидного фрагмента або ланцюга, розділених розщеплюваним лінкером, який потім розщеплюється, щоб забезпечити окремі фрагменти або ланцюги, які гібридизуються з утворенням дуплексу міРНК. Лінкер може бути полінуклеотидним лінкером або ненуклеотидним лінкером. Тандемний синтез міРнНК може бути легко адаптований до обох багатолункових/багатодискових платформ синтезу, а також платформам синтезу великого масштабу, що використовують періодичні реактори, колони синтезу, і тому подібне. З іншого боку, молекули міРНК можуть бути зібрані з двох окремих олігонуклеотидів, в яких один олігонуклеотид містить смисловий ланцюг, а інший містить антисмисловий ланцюг міРнНК.
Наприклад, кожен ланцюг може бути синтезований окремо і з'єднуватися разом за допомогою гіоридизації або лігування після синтезу та/або зняття захисту. У деяких інших випадках, молекули міРНК можуть бути синтезовані у вигляді одного безперервного олігонуклеотидного фрагмента, де самокомплементарна смислова і антисмислова ділянки гібридизують з утворенням міРНК дуплексу, що має вторинну структуру шпильки. е) Модифіковані послідовності міРНК
Зо ЇО159| У деяких аспектах, молекули міРНК містять дуплекс, що має два ланцюги і щонайменше один модифікований нуклеотид у дволанцюжковій ділянці, в якій кожен ланцюг має від близько 15 до близько 60 нуклеотидів у довжину. Бажано, модифіковані міРНК є менш імуностимулюючими, ніж відповідні немодифіковані послідовності міРНК, але зберігають здатність вимикати експресію послідовності-мішені. У бажаних варіантах реалізації міра хімічної модифікації введеної в молекулу міРНК порушує баланс між зменшенням або відміною імуностимулюючої властивості міРНК і утриманням активності ІРНК. Як необмежуючий приклад, молекула міРНК, яка націлена на ген, що цікавить, може бути мінімально модифікована (наприклад, менше ніж на близько 3095, 2595, 2095, 1595, 1095 або 595 модифікована) при селекції уридинового та/або гуанозинового нуклеотидів у межах дуплексу міРНК для усунення імунної відповіді, згенерованої міРНК, при збереженні своєї здатності вимикати експресію гена- мішені. 0160) Приклади модифікованих нуклеотидів, придатних для використання в цьому винаході, охоплюють рибонуклеотиди, що мають 2'-О-метил-(2'ОМе), 2'-дезокси-2"-фтор (2'Є), 2'-дезокси, 5-С-метил, 2'-0-(2-метоксиетил) (МОЕ), 4"-тіо, 2'-аміно або 2--С-аліл, але не обмежуються ними.
Модифіковані нуклеотиди, що мають Нозерн конформацію, такі як щоті, які описані, наприклад, у Заеподег, Ргіпсіріе5 ої Мисіевїс Асій Бігисіиге, Зргіпдег-Мегіад Еа. (1984), також є прийнятними для використання у молекулах міРНК. Такі модифіковані нуклеотиди охоплюють, без обмеження, замкнуті нуклеїнові кислоти (І МА) нуклеотидів (наприклад, 2-0, 4"-С-метилен-(О- рибофуранозил) нуклеотидів), 2'-0-(2-метоксиетил) (МОЕ) нуклеотидів, 2'-метил-тіо-етил нуклеотидів, 2'--дезокси-2'-фтор (2'Є) нуклеотидів, 2'-дезокси-2'"-хлор (2'СІ) нуклеотидів і 2'-азидо нуклеотидів. У деяких випадках, молекули міРНК, описані в цьому документі, містять один або більше С-зажимних нуклеотидів. (з-зажим відноситься до нуклеотидного модифікованого цитозинового аналогу, в якому модифікації додають здатність до водневого зв'язку як Уотсона-
Кріка, так і Хугстена стикатися з гуаніновим комплементарним нуклеотидом у дуплексі (см, наприклад, І іп еї аї., У. Ат. Спет. 5ос., 120:8531-8532 (1998)). Крім того, нуклеотиди, що мають нуклеотидний базовий аналог, такі як, наприклад, С-феніл, С-нафтил, інші ароматичні похідні, інозин, азол карбоксаміди і нітроазол похідні, такі як З-нітропірол, 4-нітроіндол, 5-нітроіндол, і 6- нітроїндол (див., наприклад, І оаКе5, Мисі. Асід5 Кев5., 29:2437-2447 (2001)) можуть бути включені в молекули мігРНК. бо 0161) У деяких варіантах реалізації молекули міРНК можуть додатково містити один або декілька хімічних модифікацій, таких як фрагменти термінального кепа, фосфатні модифікації скелета, і тому подібне. Приклади фрагментів кінцевих кепів охоплюють, без обмеження, інвертовані дезокси безосновні залишки, модифікації гліцерину, 4,5'-метилен нуклеотиди, 1-(рД-
ЮО-еритрофуранозил) нуклеотиди, 4-тіо нуклеотиди, карбоциклічні нуклеотиди, 1,5- ангідрогекситол нуклеотиди, І-нуклеотиди а-нуклеотиди, модифіковані основи нуклеотидів, трео-пентафуранозил нуклеотиди, ациклічні 3',4"-втор нуклеотиди, ациклічні 3,4-дигідроксибутил нуклеотиди, ациклічні 3,5-дигідроксипентил нуклеотиди, 3'3'-інвертовані нуклеотидні фрагменти, 3-3-інвертовані безосновні фрагменти, 3'-2'-інвертовані нуклеотидні фрагменти, 3-2'- інвертовані безосновні фрагменти, 5'-5'-інвертовані нуклеотидні фрагменти, 5'-5-інвертовані безосновні фрагменти, 3'-5'-дезокси інвертовані безосновні фрагменти, 5'-аміно-алкіл, фосфат, 1,3-діаміно-2-пропіл фосфат, З-амінопропіл фосфат, б-аміногексил фосфат, 1,2-амінододецил фосфат, фосфат гідроксипропіл, 1,4-бутандіол фосфат, 3'-фосфонової кислоти, 5'-фосфорної кислоти, гексилфосфат, аміногексил фосфат, 3'-фосфат-, 5'-аміно-, З'-фосфоротіоат, 5'- фосфоротіоат, фосфородитіоат, і утворення зшивання або неутворення зшивання метилфосфонатними або 5'-меркапто фрагментами (див., наприклад, патент США Мо 5998203;
Веаийсаде еї аї., Теігапедгоп 49:1925 (1993)). Необмежуючі приклади модифікацій фосфатних скелетів (результуючі у модифіковані межнуклеотидні зв'язки) охоплюють фосфоротіватні, фосфородитіоатні, метилфосфонатні, фосфотриефірні, морфолінові, амідатні, карбаматні, карбоксиметилцеллюлозні, ацетомедіатні, поліамідні, сульфонатні, сульфонамідні, сульфаматні, формацетальні, тіоформацетальні, і алкілсилільні заміни (см, наприклад, Нипгікег еїа!., Мисієїс Асій Апаіодцев: Зупіпевів апа Ргорегііє5, у Модет Зупіпеїйіс Меїподз, МСН, 331-417 (1995); Мез5таєкКег єї аІ., Моме! Васкропе Керіасетепів Тог Оїїдописіеоїйдез, у Сагропуагаїе
Модаіїісайопе іп Апіїзепбоє Везеєагсі, АС5, 24-39 (1994)). Такі хімічні модифікації можуть відбуватися на 5'-кінці та/або 3-кінці смислового ланцюга, антисмисловому ланцюзі або обох ланцюгах міРНК. Розкриття цих посилань включене у даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0162| У деяких варіантах реалізації, смисловий тал«або антисмисловий ланцюг молекули міРНК може додатково містити 3'-кінцевий виступ, що має близько від 1 до 4 (наприклад, 1, 2, З або 4) 2-дезокси рибонуклеотидів, модифікованого (наприклад, 2ОМе) таабо
Зо немодифікованого уридинового рибонуклеотиду, і будь-яку іншу комбінацію модифікації (наприклад, 2'ОМе) і немодифікованих нуклеотидів.
І0163| Додаткові приклади модифікованих нуклеотидів і типів хімічних модифікацій, які можуть бути введені у молекулу міРНК, описані, наприклад, у патенті Великобританії ОВ 2397818 В і публікації заявки на патент США Мо 2004/0192626, 2005/0282188 і 2007/0135372, вміст яких включений у цей опис як посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0164)| Молекули міРнНК, описані у цьому документі, можуть необов'язково містити один або декілька ненуклеотидів в одній або обох ланцюгах міРНК. Як використано в цьому описі, термін "ненуклеотид" відноситься до будь-якої групи або сполуки, які можуть бути включені у ланцюг нуклеїнової кислоти за місцем одного або декількох нуклеотидних одиниць, у тому числі цукри таа/бо фосфатні заміни, і дозволяють основам, що залишилися, проявляти активність. Група сполук є безосновною, якщо вона не містить загальновизнані нуклеотидні основи, такі як аденозин, гуанін, цитозин, урацил або тимін і, отже, не мають основи в 1'-положенні.
І0165| В інших варіантах реалізації, хімічна модифікація міРнНК містить прикріплення кон'югата до молекули міРНК. Кон'югат може бути прикріплений на 5' та/або 3'-кінець смислового талабо антисмислового ланцюга міРНК через ковалентний зв'язок, такий як, наприклад, біорозкладаний лінкер. Кон'югат може бути також прикріплений до міРНК, наприклад, через карбаматну групу або іншу зв'язуючу групу (див., наприклад, публікації заявки на патент США Мо5. 2005/0074771, 2005/0043219 і 2005/0158727). У деяких випадках, кон'югатом є молекула, яка полегшує доставку кіРНК у клітину. Приклади кон'югатів молекул, прийнятних для прикріплення до міРНК охоплюють, без обмеження, стероїди, такі як холестерин, гліколі, такі як поліетиленгліколь (РЕС), людський сироватковий альбумін (НА), жирні кислоти, каротиноїди, терпени, жовчні кислоти, фолати (наприклад, фолієві кислоти, аналоги фолієвої кислоти і їх похідні), цукри (наприклад, галактоза, галактозамін, М-ацетил- галактозамін, глюкоза, маноза, фруктоза, фукоза і так далі), фосфоліпіди, пептиди, ліганди для клітинних рецепторів, здатних опосередкувати клітинне поглінання і їх комбінації (див., наприклад, публікацію заявки на патент США МоМо 2003/0130186, 2004/0110296, і 2004/0249178; патент США Мо 6753423). Інші приклади охоплюють ліпофільний Фрагмент, вітаміни, полімери, пептиди, білок, нуклеїнову кислоту, малу молекулу, олігосахарид, вуглеводний кластер, інтеркалятор, білок, що зв'язується з малою борозною, розщеплюючі агенти, і зшиваючі агенти бо молекул кон'югата, описаного в публікації заявки на патент США Мо 2005/0119470 і
2005/0107325. Проте, інші приклади охоплюють 2'"-О-алкіламін, 2'-О-алкоксіалкіл амін, поліамін,
Сб-катіонний модифікований піримідин, катіонний пептид, гуанідинову групу, амідинініум групу, катіонні амінокислотні молекули кон'югата, описаного в заявці на патент США публікація Мо 2005/0153337. Додаткові приклади охоплюють гідрофобні групи, мембранні активні сполуки, клітина-проникаючі сполуки, сигнали клітинної орієнтації, інтеракційні модифікати, і просторові стабілізатори молекул кон'югата, описані в заявці на патент США Мо 2004/0167090. Додаткові приклади охоплюють молекули кон'югата, описаного в заявці на патент США Мо 2005/0239739.
Тип використовуваного кон'югата і міра кон'югації з молекулою міРНК можуть бути оцінені для покращення фармакокінетичних профілів, біологічної доступності та/або стабільності міРНК, зберігаючи при цьому активність ІРНК. Таким чином, фахівець у даної області може знайти молекули міРНК, що мають різні кон'югати, приєднані до неї, щоб ідентифікувати ті, що мають покращені властивості і повну ІРНК активність, використовуючи будь-яку з множини добре відомих іп міго клітинних культур або в іп мімо тваринних моделях. Розкриття описаних вище патентних документів включене у цей опис як посилання у повному обсязі для всіх цілей. а) Гени-мішені (0166) Компонент мігРНК нуклеїнової кислотно-ліпідної часток, описаних у цьому документі, можуть бути використані для придушення або виключення трансляції (тобто, експресії) гена, що цікавить. Гени, що цікавлять, охоплюють гени, що асоціюються з вірусною інфекцією і експресією, гени, пов'язані з метаболічними захворюваннями і розладами (наприклад, захворювання печінки і розлади), гени, пов'язані з пухлинами або трансформованими клітинами (наприклад, раку), ангіогенні гени, гени-імуномодулятори, такі як ті, які пов'язані із запальними і аутоїммунними реакціями, гени рецепторів ліганда і гени, що асоціюються з нейродегенеративними розладами, але не обмежуються ними. 0167) У конкретних варіантах реалізації, цей винахід забезпечує суміш з двох, три, чотири, п'яти, шести, семи, восеми, дев'яти, десяти або більше молекул міРНК, які вимикають експресію декількох генів, що представляють інтерес. У деяких варіантах реалізації суміш з молекул міРНК, які повністю заключених у ліпідну частку, таку як нуклеїнову кислотно-ліпідну частку (наприклад, МР). Молекули міРНК можуть бути спільно поміщені у ту ж ліпідну частку, або кожен вид міРНК, присутній у суміш, може бути приготований у вигляді окремих часток.
Зо ІО168) Гени, пов'язані з вірусною інфекцією і виживанням, охоплюють ті, що експресуються господарем (наприклад, фактор господаря, наприклад, тканинний чинник (ТЕ)) або вірус зв'язується, включається, і реплікується у клітині. Особливий інтерес представляють вірусні послідовності, що асоціюються з хронічними вірусними захворюваннями. Особливо цікаві вірусні послідовності містять послідовності Філовірусів, таких як вірус Ебола і Марбург вірус (див., наприклад, Сеїзрегі еї аї., у. Іптесі. Оі5., 193:1650-1657 (2006)); Аренавірусів, таких як вірус
Ласса, вірус Хунін, вірус Мачупо, вірус Гуанаріто і вірус Сабіа (Висптеіег єї а!., Агепамігідає: Ше мігизе5 апа ІНеїг геріїсайоп, Іп: Рівіїде Мікоіоду, Кпіре еї аї. (ед5.), 4 еєдй., Іірріпсой-Намеп,
РІійадеїрпіа (2001)); вірусів грипу, таких як грип А, В, і С віруси (див., наприклад, 5іеіппацег еї аім, Аппи Рем Сієпеї., 36:305-332 (2002); і Мештапп еї аїЇ., У Сбеп МігоїЇ., 83:2635-2662 (2002)); вірусів гепатиту (див., наприклад, Натавзвакі еї аіІ., РЕВЗ І ейї., 543:51 (2003); ХоКоїа єї аІ., ЕМВО
Вер., 4:602 (2003); ЗспІотаї єї аї!., Нерайоіоду, 37:764 (2003); М/іЇзоп сеї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі.
ОА, 100:2783 (2003); Карадіа єї аї., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 100:2014 (2003); і Рівеід5 Мігоіоду,
Кпіре еї аї. (едвз.), 4 еєд., Іірріпсой-Камеп, Рпйаадеїрпіа (2001)); Вірус Імунодефіцита Людини (ВІЛ) (Вапегієа єї аї., Мої. Тпег., 8:62 (2003); 5оп4 еї аї., у. Мігої!., 77:7174 (2003); терпепзоп,
УАМА, 289:1494 (2003); Оіп еї аї!., Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА, 100:183 (2003)); Герпес віруси (да еї аї., 9. Мігої., 77:3301 (2003)); і Вірус Папіломи Людини (НРУ) (Наї! еї аї., 9. Мігої!., 77:6066 (2003);
Лапа еїаї., Опсодепе, 21:6041 (2002)). 0169) Прикладні Філовірусні послідовності нуклеїнових кислот, які можна вимкнути, містять послідовності нуклеїнових кислот, що кодують структурні білки (наприклад, МРЗО, МРЗ5, нуклеопротеїн (МР), полімеразний білок (І-Рої)) і мембранно-зв'язані білки (наприклад, УР40, глікопротеїн (ГП), МР24), але не обмежуються ними. Повні послідовності генома для вірусу
Ебола викладені, наприклад, у Генбанк Мо МС 002549; Ам769362; МС 006432; МС 004161;
АУ729654; АУЗ354458; АУ142960; АВО50936; АЕ522874; АР499101; АР272001; і АРО86833.
Послідовності вірусу Ебола МР24 викладені, наприклад, у Генбанк Мо 77385 і АМО58897.
Послідовності Вірусу Ебола І-Рої викладені в, наприклад, ГенбБанк Мо Х67110. Послідовності
Вірусу Ебола МР40 викладені в, наприклад, Генбанк Мо АУО58896. Послідовності Вірусу Ебола
МР викладені, наприклад, в Генбанк Мо АУО58895. Послідовності Вірусу Ебола ОР викладені, наприклад, в ГенБбанк Ме АУО58898; Запспе еї аї., Міги5 Кев5., 29:215-240 (1993); МЛ! єї аї., 9.
Мігої!., 67:1203-1210 (1993); МоІснКом єї аІ., ЕЕВ5 Гей, 305:181-184 (1992); і патенті США Мо 60 6713069. Додаткові послідовності вірусу Ебола викладені, наприклад, у ГенБанк Мо 111365 і
Хб61274. Повні послідовності генома для вірусу Марбурга викладені, наприклад, у ГенБанкмМо
МС 001608; АУ430365; АУ430366; і АУ358025. СР послідовності вірусу Марбурга викладені, наприклад, у ГенБанк Мо АБ005734; АБО05733; і АБ0О05732. Послідовності Марбург Вірусу МР35 викладені у, наприклад, Генбанк Мо АРО05731 і АРО05730. Додаткові послідовності Марбург вірусу викладені, наприклад, у ГенБанк Мо Хб4406; 229337; АБО05735; і 712132. Не обмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують послідовності нуклеїнової кислоти вірусу Ебола і
Марбург вірусу включають ті, які описані в заявці на патент США Мо 2007/0135370 і попередньої заявки США Мо 61/286741, поданої 15 грудня 2009, розкриття яких включені у цей документ шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 0170 Прикладні послідовності нуклеїнових кислот ареновіруса, які можуть бути вимкнені, містять послідовності нуклеїнових кислот, що кодують нуклеопротеїн (МР), глікопротеїн (СР), 1 - полімеразу (У), і 7 білок (7), але не обмежуються ними. Повні послідовності генома для вірусу лихоманки Ласса викладені, наприклад, у ГенбБанк Мо МС 004296 (І А5М сегмент 5) і МС 004297 (АБЗМ сегмент І). Необмежуючі приклади молекул міРНК, направлених на послідовності нуклеїнових кислот вірусу Ласса, включають ті, що описані в попередній заявці США Мо 61/319855, поданої 31 березня 2010, вміст якої включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 0171) Приклади послідовностей нуклеїнових кислот господарів, які можуть бути вимкнені, включають послідовності нуклеїнових кислот, кодуючих чинників, що містять такі, як тканинний чинник (ТЕ), який, як відомо, відіграє важливу роль у патеногенезі вірусів геморагічної лихоманки, але не обмежуються ними. Послідовність МРНК ТЕ викладено в ГенБанк Мо
ММ 001993. Фахівцям у даній області техніки буде зрозуміло, що ТЕ також відомий як ЕЗ, фактор згортання крові ПШ, тромбопластин і СО142. Необмежуючі приклади молекул мігбРНК, орієнтованих на послідовності нуклеїнових кислот ТЕ, містять ті, які описані в попередній заявці
США Мо 61/319855, поданій 31 березня 2010, вміст якої включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 01721) Прикладні послідовності нуклеїнової кислоти вірусу грипу, які можуть бути вимкнені, охоплюють послідовності нуклеїнових кислот, що кодують нуклеопротеїн (МР), матричні білки (МІ і М2), неструктурні білки (М51 і М52), РНК-полімеразу (РА, РВІ, РВ2), нейрамінидазу (МА) і гемаглютинін (НА), але не обмежуються ними. Послідовності грипу А МР викладені, наприклад, у ГенБанк Мо МС 004522; АУ818138; АВ166863; АВ188817; АВ189046; АВ189054; АВ189062;
АУба46169; АУб46177; АМУб651486; АУб51493; АУб51494; АУб51495; АУб51496; АУб651497;
АУб51498; АУб51499; АМб651500; АУб51501; АМб651502; АУб51503; АМб51504; АУб651505;
АУб651506; АУб51507; АМб651509; АМ651528; АМ770996; АМ790308; АМУ818138; і АУ818140.
Послідовності грипу А РА викладені, наприклад, у ГенБанк Мо АУ818132; АУ790280; АУ646171;
АУ818132; АУ818133; АМУб46179; АУ818134; АМ551934; АУб51613; АМб51610; АУб651620;
АУб51617; АУб51600; АМб651611; АУб51606; АМб651618; АУб651608; АМб51607; АУб651605;
АУб51609; АУб51615; АМб651616; АУб51640; АМб651614; АУб651612; АУб651621; АУб51619;
АУ770995; і АУ724786. Необмежуючі приклади молекул міРНК, направлених на послідовності нуклеїнових кислот вірусу грипу, охоплюють ті, які описані в заявці на патент США Мо 2007/0218122, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІЇО173| Приклади послідовностей нуклеїнових кислот вірусу гепатиту, які можуть бути вимкнені, охоплюють послідовності нуклеїнових кислот, що беруть участь в транскрипції і трансляції (наприклад, Еп!, Еп2, Х, Р), і послідовності нуклеїнових кислот, що кодують структурні білки (наприклад, основні білки, у тому числі С і С-родинні білки, капсидні і білки оболонки, включаючи 5, М і Ї. білки, або їх фрагменти) (див., наприклад, Ріеїд5 Мігоіоду, зирга) але не обмежуються ними. Прикладні послідовності нуклеїнових кислот вірусу Гепатиту С (ВГС), які можуть бути вимкнені, включають 5'-нетранслюєму ділянку (5'-ОТВ), З3':нетранслюєму ділянку (3'-ОТК), поліпротеїновий кодон ділянки ініціації трансляції, послідовність внутрішнього рибосомального сайту входу (ІКЕ5), та/або послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують основний білок, білок ЕТ, Е2 білків, білок Р7, білок М52, М53 протеазу/геліказу, М54А білок, білок, М54В, М55А білок, та/або М55В РНК-залежну РНК-полімеразу, але не обмежуються ними.
Послідовності генома ВГС, наведені у, наприклад, Генбанк Мо МС 004102 (ВГС генотипу Та),
АуЧ2г38799 (ВГС генотипу 15), МС 009823 (ВГС генотипу 2), МС 009824 (ВГС генотипу 3),
МС 009825 (ВГС генотипу 4), МС 009826 (ВГС генотипу 5), і МС 009827 (ВГС генотипу 6).
Послідовності нуклеїнових кислот вірусу гепатиту А викладені, наприклад, у ГенБанк Мо
МС 001489; Послідовності нуклеїнових кислот вірусу гепатиту В, викладені, наприклад, в
ГенБанк Ме МС 003977; Послідовності нуклеїнової кислоти вірусу Гепатиту О, викладені в, бо наприклад, Генбанк Ме МС 001653; Послідовності нуклеїнової кислоти вірусу Гепатиту Е,
викладені, наприклад, в Генбанк Мо МС 001434; і послідовності нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, викладені, наприклад, у Генбанк Мо МС 001710. Виключення послідовностей, які кодують гени, що асоціюються з вірусною інфекцією і виживанням, зручно можуть бути використані у поєднанні з введенням звичайних засобів, що використовуються для лікування вірусного стану. Необмежуючі приклади молекул міРНК, направлених на послідовності нуклеїнових кислот вірусу гепатиту, охоплююють ті, що описані в публікації патентної заявки
США Ме 2006/0281175, 2005/0058982, і 2007/0149470; у патенті США Мо 7348314; і РСТ заявці
РСТ/СА2010 / 000444, озаглавленій "Композиції і способи для придушення експресії вірусу гепатиту С", поданої 19 березня 2010, що має реєстраційний номер Мо 020801-008910РС, описи яких включені у цей документ як посилання для всіх цілей.
І0174| Гени, що асоціюються з метаболічними захворюваннями і розладами (наприклад, розладами, в яких печінка є мішенню, і захворюваннями і розладами печінки), охоплюють, але не обмежуються ними, гени, які експресуються при дисліпідемії, такі як, наприклад, аполіпопротеїн В (АРОВ) (номер доступу в ГенБанк Мо ММ 000384), аполіпопротеїн СІ (АРОСЗ) (ГенБанк реєстраційні номери МоМо ММ 000040 і МО 008949 КЕСІОМ:. 5001..8164), аполіпопротеїн Е (АРОЕ) (ГенБанк реєстраційні номер а МоМо ММ 000041 ї МО 007084
ЕЕСІОМ:. 5001..8612), пропротеїн конвертази субтилізина / Кенікс тип 9 (РОБКО) (номер доступу у ГенБанк Мо ММ 174936), діацилгліцерин типа О-ацилтрансфераза 1 (ОСАТІ) (номер доступу в
ГенБанк Ме ММ 012079), діацилгліцерол О-ацилтрансфераза тип 2 (ОБАТ2) (номер доступу в
ГенБанк Мо ММ 032564), рецептори печінки Х, такі як І ХКа і Г ХЕВ (ГенБанк інвентарний номер
Мо ММ 007121), фарнесоїдні рецептори Х (ЕХК) (номер доступу у ГенбБанк Ме ММ 005123), стериновий-регуляторний елемент-зв'язуючий білок (ЗКЕВР), сайт-1 протеази (51Р), З-гідрокси-
З-метилглутарил кофермент-А-редуктази (ГМГ-коензим А-редуктази); і гени експресії діабету, такі як, наприклад, глюкозо-6-фосфатази, але не обмежуючись ними (див., наприклад, Богтап еїаї.,Сеїї, 81:687 (1995); 5ео! єї а!., Мої. Епаостіпої., 9:72 (1995), 7амаскі еї а!., Ргос. Маї). Асад.
Зсі. ОБА, 94:7909 (1997); ЗакКаї єї аї., Сеїї, 85:1037-1046 (1996); Юипсап еї аї., у. ВіоЇ. Спет., 272:12778-12785 (1997); М/Шу еї аІ., Сепе5 Оєм., 9:1033-1045 (1995); Ії енптапп еї аї., У. Віої.
Спет., 272:3137-3140 (1997); дапомувкі єї аї., Маїшге, 383:728-731 (1996); і Реєї еї а!., СеїІ, 93:693- 704 (1998)).
Зо 01751 Фахівцеві в даній області техніки буде зрозуміло, що гени, пов'язані з метаболічними захворюваннями і розладами (наприклад, захворюваннями і розладами, в яких печінка є мішенню, і захворюваннями і розладами печінки), охоплюють гени, які експресуються у самій печінці, а також і гени експресії в інших органах і тканинах. Придушення послідовностей, які кодують гени, пов'язані з метаболічними захворюваннями і розладами, зручно можуть бути використані у поєднанні з введенням звичайних засобів, що використовуються для лікування захворювань або розладів. Необмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують ген АРОВ, містять ті, які описані в публікації патентної заявки США Мо 2006/0134189, 2006/0105976 і 2007/0135372 і РСТ публікації М/О 04/091515, описи яких наведені у цьому документі як посилання у повному обсязі для всіх цілей. Необмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують ген АРОСЗ, містять ті, які описані в РСТ заявці РСТ/СА2010/000120, поданій 26 січня 2010, вміст якої включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
Необмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують ген РОБКО, містять ті, які описані в публікації заявки на патент США Мо 2007/0173473, 2008/0113930 ії 2008/0306015, описи яких включені у даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Приклади молекул міРНК, що уражують ген ОСБАТІ можуть бути сконструйовані з використанням антисмислових сполук, описаних у заявці на патент США Мо 2004/0185559, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Приклади молекул міРНК, що уражують ген роАТ2, можуть бути сконструйовані з використанням антисмислових сполук, описаних в заявці на патент США Мо 2005/0043524, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ЇО176| Гени, що асоціюються з генезисом пухлин або клітинною трансформацією (наприклад, раку або інших неоплазій), охоплюють, наприклад, гени, що беруть участь в роЗ3 убіквітинуванні, с-Уцп убіквітинуванні, деацетилюванні гістонів, регуляції клітинного циклу, регуляції транскрипції, і їх комбінації. Необмежуючі приклади послідовностей генів, що асоціюються з онкогенезом або трансформацією клітин включають серин/греонін кінази, такі як роіо-подібна кіназа 1 (РІ К-1) (ГенБанк, реєстраційний номер Мо ММ 005030; Вагтг еї аї., Маї. Кеу.
Мої. Сеї! Віої!., 5:429-440 (2004)) і циклін-залежна кіназа 4 (СОК4) (ГенБанк, інвентарний Мо
ММ 000075); убіквітин лигази, такі як СОР1 (ЕЕУМ/О2; ГенБанк МоМо ММ 022457 і ММ 001001740) і ринг-бокс 1 (ЕВХ1) (КОС1; номер доступу в Генбанк Мо ММ 014248); тирозинкінази, такі як бо МЕЕ1 (ГенБанк Мо ММ 003390 ії ММ 001143976); мітотичні кинезини, такі як Ед5 (КСП, КІР11;
Зо номер доступу у Генбанк Мо ММ 004523); транскрипціні фактори, такі як форкхед бокс М1 (РОХМ'І1) (ГенБанк МоМо ММ 202002, ММ 021953 і ММ 202003.) і КАМ2 (КІ або СОСА7І;
ГенБанк МоМо ММ 018719, ММ 001127370 і ММ 001127371); інгібітори апоптозу, таких як ХІАР (ГенБанк, інвентарний Мо ММ 001167); СОРУ підодиниці сигналосоми, такі як С5М1, СеМ2, с5М3, С5М4, СЗМ5 (9АВІ1; номер доступу у ГенБбанк Мо ММ 006837); С5Мб6, С5М7А, СЗМВ, і
СЗМВ8; і гістондеацетилази, такі як НОАСІ, НОАС2 (номер доступу в Генбанк Мо ММ 001527),
НОАСЗ, НОАС4, НОАС5, НОАСб, НОАС7, НОАСВ, НОАСО і так далі.
І0177| Необмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують ген РІ К-1, охоплюють ті, які описані в публікації заявки на патент США Мо 2005/0107316 і 2007/0265438; і публікації РСТ Мо
УМО 09/082817, розкриття яких включене у цей опис як посилання у повному обсязі для всіх цілей. Необмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують гени Ед5 і ХІАР охоплюють ті, які описані в заявці на патент США Мо 2009/0149403, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Необмежуючі приклади молекул міРНК, приголомшуючих С5М5 ген, охоплюють ті, які описані в РСТ публікації УМО 09/129319, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Не обмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують СОРІ, С5М5, КВХ1, НОАС2, СОКЯ4, МЕЕ1, ЕОХМІ, і
КАМАЕО гени охоплюють ті, які описані в попередній заявці США 61/245143, поданій 23 вересня 2009, опис якої включений у цей документ як посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІЇ0178| Додаткові приклади послідовностей генів, пов'язаних з генезисом пухлин або трансформацією клітин охоплюють транслокаційні послідовності, такі як гени МІГ. синтезу, ВСК-
АВІ. (М/йда єї аї., Опсодепе, 21:5716 (2002); ЗесНе!тт єї аї., Віоса, 101:1566 (2003)), ТЕІ -АМІ 1,
ЕМ/5-ЕІ1, ТІ 5-6О5, РАХЗ-ЕКНВ, ВСІ -2, АМІ 1-ЕТО, і АМІ 1-МТОа8 (Неїдепгвєїси еї аї., Віосад, 101:3157 (2003)); надекспресовані послідовності, такі як гени множинної лікарської стійкості (Міеїй еї аІ., РЕВЗ І ей, 545:144 (2003); Ми еї аЇ, Сапсег Ке5. 63:1515 (2003)), цикліни (і еї аї.,
Сапсег Кевх., 63:3593 (2003); 70и еї аї!., сСепе5 Оем., 16:2923 (2002)), бета-катеніни (Мепта еї аї.,
Сіп Сапсег Кез., 9:1291 (2003)), гени теломерази (Козсіоїек еї аІ,, МоЇ Сапсег Тег., 2:209 (2003)), с-ММС, М-МУС, ВСІ-2, рецептори факторів зростання (див., ЕСЕК/ЕГЬВІ1 (ГенБанк реєстраційні номери МоМо ММ 005228, ММ 201282, ММ 201283, і ММ 201284; см також, Маду еї аі. Ехр. Сеїї Вев., 285:39-49 (2003), ЕптВ2/НЕНВ-2 (ГенБанк реєстраційні номери МоМо
Зо ММ 004448 і ММ 001005862), ЕГтЬВЗ (ГенБанк реєстраційні номери МоМо ММ 001982 і
ММ 001005915), ії ЕГЬВ4 (ГенБанк реєстраційні номери МоМо ММ 005235 і ММ 001042599)), і послідовності мутантів, такі як КАБ (Ти5спІ апа Вогкпагаї, Мої. Іпіегмепіоп5, 2:158 (2002)).
Необмежуючі приклади молекул міРНК, що уражують ген ЕСЕК, охоплюють ті, які описані в заявці на патент США Мо 2009/0149403, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Молекули міРНК, які націлені на МЕСЕК гени, викладені, наприклад, у ОВ 2396864; Патентній заявці США Мо 2004/0142895; і СА 2456444, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІЇО179| Сайленсинг послідовностей, що кодують ДНК-репаративні ферменти, знаходить застосування разом із введенням хіміотерапевтичних агентів (Соїї5 еї аІ.,, Сапсег Ке5., 63:1550 (2003)). Гени, що кодують білки, пов'язані з міграцією пухлини, також уражують послідовності, що представляють інтерес, наприклад, інтегрини, селектини і металопротеїнази. Наведені приклади не є винятковими. Фахівцям у даній області техніки буде зрозуміло, що будь-яка ціла або часткова послідовність гена, який сприяє або сприяє генезису пухлин або трансформації клітин, зростанню пухлини або міграції пухлини, можуть бути включені як матрична послідовність.
ІЇО180| Ангіогенні гени здатні сприяти формуванню нових судин. Ангіогенні гени, що представляють особливий інтерес, включають чинник зростання ендотелію судин (МЕСБЕ) (Кеїсп еї аї., Мої. Мі5., 9:210 (2003)), плацентарний чинник зростання (РОЕ), МЕСЕМ-1 (Е-1), МЕСЕВ-2 (КОВ/НРІК-1), і тому подібне, але не обмежуючись цим. Молекули міРНК, які націлені на МЕСЕК гени викладені, наприклад, у ОВ 2396864; патентній заявці США Мо 2004/0142895; і СА 2456444, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІО181| Гени імуномодулятори це гени, які модулюють одну або більше імунних реакцій.
Приклади генів-імуномодуляторів включають, без обмеження, фактори зростання (наприклад,
Таврг-а, ТОБ-ДВ, ЕСЕ, ЕСЕ, ІСЕ, МОБ, РОСЕ, СОБ, ОМ-С5Е, ЗСЕ, і т.д.), інтерлейкіни (наприклад,
І-2, 1-4, 11-12 (НІЇ еї аї., У. Іттипої., 171:691 (2003)), 1-15, 11-18, 1-20, їі т.д.), інтерферони (наприклад, ІЕМ-са, ІЕМ-В, ІЕМ-у, і т.д.), і ТМЕ. Гени Раз і Раз5-ліганда також є імуномодуляторами послідовностей-мішеней, що представляють інтерес (5о0па еї аї., Маї. Мей., 9:347 (2003)). Гени, що кодують молекули вторинних сигналів у кровотворних і лімфоїдних клітинах, також включені у цей винахід, наприклад, сімейство кіназ Тес, такі як тирозинкінази Брутона (ВІК) (Неіпопеп еї 60 аІ.,, ЕЕВ5 Гейї., 527:274 (2002)).
І0О182| Гени ліганда клітинного рецептора охоплюють ліганди, які здатні зв'язуватися з рецепторами клітинної поверхні (наприклад, рецептори цитокінів, рецептори факторів зростання, рецептори з активністю тирозинкінази, рецептори, пов'язані з С-білком, рецептори інсуліну, ЕРО-рецептори, і так далі), для модулювання (наприклад, інгібування) фізіологічного шляху, в який включений рецептор (наприклад, проліферації клітин, канцерогенезу, трансформації клітин, митогенезі, і так далі). Необмежуючі приклади лігандів генів клітинного рецептора охоплюють цитокіни (наприклад, ТМЕ-а, інтерферони, такі як ІЕМ-са, ІЕМ-В ї ІЄМ-у, інтерлейкіни, такі як І--1Та, 12 -1рД, 1--2, 11 -4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 11 -9, 1-10, 1-12, 11-13, 11-15, 1-17,
І -23, 1-27, хемокіни і так далі), фактори зростання (наприклад, ЕСЕ, НВ-ЕСЕ, МЕС, РЕОБЕ, зранг, БЕаЕ, Нанг, Ттавг-а, ТОБ-В, ВМРІ1І-ВМРІ15, РОСЕ, ІСЕ, МОБ, Д-МОаЕ, ВОМЕ, МТЗ, МТА,
СОБ-9, СОР, а-С5Р, ЯМ-С5Е, СОБ-8, ЕРО, ТРО, їі так далі), інсулін, глюкагон, ліганди рецептору, пов'язаного з с-білком і так далі.
ЇО183| Шаблони кодування для розширення тринуклеотидних повторів (наприклад, САС повтору) знаходять застосування у виключенні патогенної послідовності при нейродегенеративних розладах, викликаних розширенням тринуклеотидних повторів, таких як спинобулбулярної м'язової атрофії і хвороби Хантінгтона (Саріеп еї аїЇ.,, Нит. Мої. Сепеї., 11:175 (2002)). 0184) На додаток до його корисності при виключенні експресії будь-якого з вищеописаних генів у терапевтичних цілях, міРНК, описані у цьому документі, також корисні у науково- дослідних і дослідних застосуваннях, а також діагностиках, профілактичних, прогностичних, клінічних і інших галузях охорони здоров'я. Як не обмежуючий приклад, міРНК може бути використана у перевірочних дослідженнях, направлених на цільову перевірку, чи може ген, що цікавить, мати потенціал, щоб бути терапевтичною мішенню. МіРНК також можуть бути використані в ідентифікаційних дослідженнях мішеней, направлених на виявлення генів, як потенційні терапевтичні мішені. е) Прикладні варіанти реалізації міРНК
ІО185) У деяких варіантах реалізації кожен ланцюг молекули міРНК містить від близько 15 до близько 60 нуклеотидів у довжину (наприклад, близько 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, або 19- 25 нуклеотидів у довжину, або 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, або 25 нуклеотидів у
Зо довжину). В одному конкретному варіанті реалізації міРНК хімічно синтезовані. Молекули міРНК за винаходом здатні вимикати експресію послідовності-мішені іп міго та/або іп мімо.
ІО186| В інших варіантах реалізації міРНК містить щонайменше один модифікований нуклеотид. У деяких варіантах реалізації міРНК містить один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять або більше модифікованих нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці. У конкретних варіантах реалізації, менше ніж близько 5095 (наприклад, менше ніж близько 5095, 4596, 4095, 3595, 3095, 2590, 2095, 1595, 1095 або 595) нуклеотидів у дволанцюжковій область міРНК містять модифіковані нуклеотиди. У бажаних варіантах реалізації від близько 195 до близько 5095 (наприклад, від близько 595-509, 1095-5090, 1595-5095, 2095-5095, 2590-5090, З09о-
БОбю, З5Уо-5090, 4096-5090, 4595-5096, 5590-4595, 1090-4595, 1595-4595, 2090-4595, 2590-4590, З09о- 4595, 3595-4595, 4090-4595, 590-409, 1095-4090, 1595-4095, 2095-4096, 2595-4095, 3090-4095, З5Ув- 409, 5уо-359о, 1090-3595, 1590-3595, 2090-3595, 2590-3595, 3090-3595, 59Уо-ЗО9Уо, 1095-3090, 1595-3090, 2095-3096, 2596-3095, 590-250, 1096-2595, 1596-2590, 2095-2590, 590-209, 1090-2090, 1590-2095, 59Уо- 1595, 1095-1595 або 5956-1095) з нуклеотидів у дволанцюжковій ділянці міРНК містять модифіковані нуклеотиди.
ІО187| В інших варіантах реалізації, міРНК містить модифіковані нуклеотиди, у тому числі 2'-
О-метил (2'ОМе) нуклеотид, 2'-дезокси-2'-фтор (2'Є) нуклеотид, 2'--дезокси нуклеотид, 2'-0-(2- метоксиетил) (МОЕ) нуклеотид, замкнуті нуклеїнові кислоти (І.МА) нуклеотиди і їх суміші, але не обмежуючись ними. У бажаних варіантах реалізації цього винаходу міРНК містить 2'ОМе нуклеотид (наприклад, 2'ОМе пуринові і піримідинові нуклеотиди), такі як, наприклад, 2'ОМе- гуанозиновий нуклеотид, 2'ОМе-уридиновий нуклеотид, 2'ОМе-аденозиновий нуклеотид, 2'ОМе- цитозиновий нуклеотид, або їх суміші. В одному конкретному варіанті реалізації міРНК містить, щонайменше, один 2'ОМе-гуанозиновий нуклеотид, 2'ОМе-уридиновий нуклеотид або їх суміші.
В деяких випадках, міРНК не містить 2'ОМе-цитозиновий нуклеотид. У інших варіантах реалізації міРНК містить структуру петлі шпильки.
ЇО188| У деяких варіантах реалізації, міРНК містить модифіковані одноланцюжкові нуклеотиди (тобто, смислові і антисмислові) або дволанцюжкові у дволанцюжковій ділянці молекули міРНК. Бажано, уридинові та/або гуанозинові нуклеотиди модифіковані в селективних позиціях у дволанцюжковій ділянці дуплексу міРНК. Що стосується модифікованих уридинових нуклеотидів, то щонайменше один, два, три, чотири, п'ять, шість або більше з нуклеотидів бо уридину в смисловому та/або антисмисловому ланцюзі можуть бути модифікованими уридиновими нуклеотидами, такими як 2'ОМе-уридиновий нуклеотид. У деяких варіантах реалізації, кожен нуклеотид уридину в смисловому та/або антисмисловому ланцюзі є 2'ОМе- уридиновим нуклеотидом. Що стосується модифікованих гуанозинових нуклеотидів, то щонайменше, один, два, три, чотири, п'ять, шість або більше з нуклеотидів гуанозина в смисловому та/або антисмисловому ланцюзі можуть бути модифікованими гуанозиновими нуклеотидами, такими як гуанозин-2-ОМе нуклеотид. У деяких варіантах реалізації, кожен гуанозиновий нуклеотид у смисловому та/або антисмисловому ланцюзі є гуанозин-2'"ОМе нуклеотидом. 0189) У деяких варіантах реалізації щонайменше один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, або більше 5-40И-3" фрагментів у послідовності міРНК можуть бути модифіковані, наприклад, шляхом введення неспівпадань для усунення 5-(20-3" фрагментів талабо шляхом введення модифікованих нуклеотидів, таких як 2'ОМе нуклеотиди. 5-С4:50-3 фрагмент може бути в смисловому ланцюзі, антисмисловому ланцюзі або обох ланцюгах послідовності міРНК. 5'-с30-3" фрагменти можуть бути поруч один з одним або, альтернативно, вони можуть бути розділені 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 або більше нуклеотидами.
ЇО190| У деяких варіантах реалізації модифікована молекула міРНК є менш імуностимулюючою, ніж відповідна немодифікована послідовність міРНК. У таких варіантах реалізації модифікована молекула міРНК із зниженими імуностимулюючими властивостями бажано зберігає ІРНК активність відносно послідовності-мішені. В іншому варіанті реалізації імуностимулюючі властивості модифікованої молекули міРНнНК і її здатність вимикати експресію гена-мішені можуть бути збалансовані або оптимізовані шляхом введення мінімальних і селективних модифікацій 2'ОМе в послідовності міРНК, такі як, наприклад, у дволанцюжкову область дуплексу міРНК. У деяких випадках, модифікована міРНК є щонайменше на близько бою, 1096, 1595, 2096, 2590, ЗО0Ую, 3590, 4095, 4595, 5090, 5595, 6090, 6595, 7090, 7590, 809, 8595, 9090, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 менш імуностимулюючою, ніж відповідна немодифікована міРНК. Фахівцям у даній області техніки буде очевидно, що імуностимулюючі властивості модифікованої молекули міРНК і відповідної немодифікованої молекули міРНК, можуть бути визначені, наприклад, вимірами рівнів ІМЕ-сй та/або 1/-6 від близько два до близько дванадцяти годин після системного введення ссавцеві або трансфекції в клітини ссавців респондента з використанням відповідної системи доставки на основі ліпіду (наприклад, І. МР системи доставки, розкритої у цьому документі). 0191 В інших варіантах реалізації модифікована молекула міРНК має ІСбво (тобто половина від максимальної інгібуючої концентрації менше або рівною десятикратній відповідній немодифікованій міРНК (тобто, модифікована міРНК має ІСзо, яка є меншою або рівною десятикратній ІСво відповідній немодифікованій міРНК). У інших варіантах реалізації модифікована міРНК має ІСво менше або рівну трикратній відповідній немодифікованій послідовності міРНК. У інших варіантах реалізації модифікована міРНК має ІСво менше або рівну двократній відповідній немодифікованій міРНК. Це буде очевидно фахівцям у даній області техніки, що крива доза-відповідь може бути згенерована і ІСх5о для модифікованої міРнК і відповідною немодифікованими міРНК можуть бути легко визначені за допомогою способів, відомих фахівцям у даній області.
І0192)| В іншому варіанті реалізації немодифікована або модифікована молекули міРнК здатні вимикати щонайменше близько 595, 1095, 1595, 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 50905,
ББУю, бою, 6595, 7096, 7590, 7690, 7790, 78905, 790, 80905, 8195, 8290, 8390, 8495, 8595, 869, 8790, 8895, 8995, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 від експресії послідовності-мішені відносно негативного контролю (наприклад, лише буфер, послідовність міРНК, яка призначається іншому гену, зашифрована послідовність міРНК і так далі).
І0193| У ще одному варіанті реалізації модифікована молекула міРНК здатна вимикати щонайменше близько 595, 1095, 1595, 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 55 95, 6095, 65905,
ТОуо, 7590, 76б9о, 77, 7890, 79Ую, 8095, 8195, 8295, 8390, 8495, 8590, 869Ую, 8795, 8895, 8995, 909, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або 10095 від експресії послідовності-мішені відносно відповідної немодифікованої послідовності міРНК. (0194) У деяких варіантах реалізації молекула міРНК не містить модифікованих скелетів фосфатів, наприклад, у смисловому та/або антисмисловому ланцюзі дволанцюжкової ділянки. В інших варіантах, міРНК містить один, два, три, чотири, або більше модифікованих скелетів фосфатів, наприклад, у смисловому та/або антисмисловому ланцюзі дволанцюжкової ділянки. У бажаних варіантах реалізації міРНК не містить модифікованих скелетів фосфатів. 0195) У інших варіантах реалізації міРНК не містить 2'-дезокси нуклеотидів, наприклад, у смисловому та/або антисмисловому ланцюзі дволанцюжкової ділянки. У наступних варіантах 60 реалізації міРНК містить один, два, три, чотири, або більше 2'-дезокси нуклеотидів, наприклад, у смисловому та/(або антисмисловому ланцюзі дволанцюжкової ділянки. У бажаних варіантах реалізації міРНК не містить 2'-дезокси нуклеотидів.
ЇО196)| У деяких випадках, нуклеотид на 3'-кінці дволанцюжкової ділянки в смисловому та/або антисмисловому ланцюзі не є модифікованим нуклеотидом. У деяких інших випадках, нуклеотиди поблизу 3'-кінця (наприклад, в одному, двох, трьох або чотирьох нуклеотидах 3'- кінця) дволанцюжкової ділянки в смисловому таабо антисмисловому ланцюзі не є модифікованими нуклеотидами.
І0197| Молекули міРНК, описані в цьому документі, можуть мати 3' виступи з одного, двох, трьох, чотирьох або більше нуклеотидів на одній або обох сторонах дволанцюжкової ділянки, або можуть не мати виступів (тобто мають тупі кінці) на одній або з обох боків у дволанцюжковій ділянці. У деяких варіантах реалізації виступ 3' на смисловому та/або антисмисловому ланцюзі, незалежно містить один, два, три, чотири або більше модифікованих нуклеотидів, таких як 2ОМе нуклеотиди та/або будь-якого іншого модифікованого нуклеотиду, описаних у цьому документі, або відомого в даній області. 0198) У конкретних варіантах реалізації, міРНК вводять за допомогою системи носія, такого як нуклеїнова кислотно-ліпідна частка. У бажаному варіанті реалізації нуклеїнова кислотно- ліпідна частка містить: (а) одну або більше молекул міРНК; (б) катіонний ліпід за формулою або його сіль; і (с) некатіонний ліпід (наприклад, ОРРС, О5РС, О5РЕ, та/або холестерин). У деяких випадках, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка може додатково містити зв'язаний ліпід, який запобігає агрегації часток (наприклад, РЕС-БАА і РО2-ОАА). 2. Дайсер-субстратні дсРНК
ІЇ0199| Як використовується у цьому документі, термін "Дайсер-субстратна дсРНК" або "молекула попередника ИРНК" призначений для включення будь-якої молекули-попередника, яка обробляється іп мімо Дайсер з утворенням активної міРНК, яка включається у комплекс
КІЗС для РНК інтерференції гена-мішені.
ІО2О0І| В одному варіанті реалізації Дайсер-субстратна дсРНК має достатню довжину для того, щоб вона оброблялася за допомогою Дайсер для одержання міРНК. Згідно цього варіанту реалізації, Дайсер-субстратна дсоРНК містить (ї) першу послідовність олігонуклеотида (що також називається смисловим ланцюгом), який знаходиться між близько 25 і близько 60 нуклеотидів у
Ко) довжину (наприклад, близько 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, або 25-30 нуклеотидів у довжину), бажано між близько 25 і близько 30 нуклеотидів у довжину (наприклад, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 нуклеотидів у довжину) і (ії) другу послідовність олігонуклеотида (що також називається антисмисловим ланцюгом), яка гібридизуется з першою послідовністю в біологічних умовах, таких як умови, виявлені у цитоплазмі клітини. Друга послідовність олігонуклеотида може бути між близько 25 і близько 60 нуклеотидів у довжину (наприклад, близько 25-60, 25-55, 25-50, 25-45, 25-40, 25-35, або 25-30 нуклеотидів у довжину), і, бажано, між близько 25 і близько 30 нуклеотидів (наприклад, 25, 26, 27, 28, 29, або 30 нуклеотидів у довжину). Крім того, область однієї з послідовностей, зокрема, антисмислового ланцюга
Дайсер-субстратної дсРНК має довжину послідовності, що дорівнює щонайменше близько 19 нуклеотидів, наприклад, від близько 19 до близько 60 нуклеотидів (наприклад, близько 19-60, 19-55, 19-50, 19-45, 19-40, 19-35, 19-30, або 19-25 нуклеотидів), бажано від близько 19 до близько 23 нуклеотидів (наприклад, 19, 20, 21, 22 або 23 нуклеотидів), які Є достатньою мірою комплементарними до нуклеотидної послідовності РНК, отриманої з гена-мішені, щоб викликати реакцію ІРНК.
ІО2О1| У другому варіанті реалізації, Дайсер-субстратна доРНК має декілька властивостей, які покращують її обробку за допомогою Дайсер. Згідно цьому варіанту реалізації, дсРНК має довжину, достатню, щоб вона оброблялася Дайсер для одержання міРНК і мала щонайменше одну з наступних властивостей: () доРНК є асиметричною, наприклад, має 3'-виступ на антисмисловому ланцюзі; та/або (ії) дсРНК має модифікований 3'-кінець на смисловому ланцюзі для прямої орієнтації при скріпленні Дайсер і обробленій деРНК до активної міРНК. Відповідно до цього останнього варіанту, смисловий ланцюг містить від близько 22 до близько 28 нуклеотидів і антисмисловий ланцюг містить від близько 24 до близько 30 нуклеотидів. (0202| У одному варіанті реалізації Дайсер-субстратна дсоРНК має виступ на 3'-кінці антисмислового ланцюга. В іншому варіанті реалізації винаходу смисловий ланцюг модифікований для зв'язування Дайсер і обробки за допомогою відповідних модифікаторів, розташованих на 3"-кінці смислового ланцюга. Прийнятні модифікатори охоплюють нуклеотиди, такі як дезоксирибонуклеотиди, ациклонуклеотиди і тому подібні, і стерично утруднені молекули, такі як флуоресцентні молекули і тому подібне. При використанні нуклеотидних модифікаторів, вони замінюють рибонуклеотиди в дсРНК таким чином, що довжина дсРНК не змінюється. В бо іншому варіанті реалізації Дайсер-субстратна дсРНК має виступ на 3'-кінці антисмислового ланцюга і смисловий ланцюг модифікований для обробки Дайсер. У іншому варіанті реалізації,
Б'і-іінець смислового ланцюга має фосфат. У іншому варіанті реалізації, 5'-кінець антисмислового ланцюга має фосфат. У іншому варіанті реалізації, антисмисловий ланцюг або смисловий ланцюг, або обидва ланцюги мають одну або декілька 2'-О-метил (2'ОМе) модифікованих нуклеотидів. У іншому варіанті реалізації, антисмисловий ланцюг містить 2-ОМе модифіковані нуклеотиди. В іншому варіанті реалізації антисмисловий ланцюг містить 3'-виступ, який складається з 2'ОМе модифікованих нуклеотидів. Антисмисловий ланцюг може також містити додаткові 2ОМе модифіковані нуклеотиди. Смислові і антисмислові ланцюги відпалюються в біологічних умовах, таких як умови, що знаходяться в цитоплазмі клітини. Крім того, ділянка однієї з послідовностей, зокрема, антисмислового ланцюга, Дайсер-субстратної
ДОРНК має довжину послідовності, що дорівнює щонайменше близько 19 нуклеотидів, причому ці нуклеотиди знаходяться в 21-нуклеотидній області, що примикає до 3'-кінця антисмислового ланцюга і достатньо комплементарні нуклеотидній послідовності РНК, отриманій з гена-мішені.
Крім того, відповідно до цього варіанту, Дайсер-субстратна дсРНК може також мати одну або декілька з наступних додаткових властивостей: (а) антисмисловий ланцюг має зрушення праворуч від типового 21-мера (тобто, антисмисловий ланцюг містить нуклеотиди на правій частині молекули в порівнянні з типовим 21-мером); (б) ланцюги не можуть бути повністю комплементарними, тобто ланцюги можуть містити прості невідповідності спаровувань; і (с) основні модифікації, такі як блокування нуклеїнової кислоти, можуть бути включені в 5'-кінець смислового ланцюга. 0203) У третьому варіанті реалізації, смисловий ланцюг містить від близько 25 до близько 28 нуклеотидів (наприклад, 25, 26, 27, або 28 нуклеотидів), в якому 2 нуклеотиди на 3'-кінці смислового ланцюга є дезоксирибонуклеотидами. Смисловий ланцюг містить фосфат на 5'- кінці. Антисмисловий ланцюг містить від близько 26 до близько 30 нуклеотидів (наприклад, 26, 27, 28, 29, або 30 нуклеотидів) і містить 3'-виступ з 1-4 нуклеотидів. Нуклеотиди, що містять 3'- виступ, модифіковані 2'ОМе модифікованими рибонуклеотидами. Антисмисловий ланцюг містить 2'ОМе модифіковані нуклеотиди, що чергуються, починаючи з першого мономера антисмислового ланцюга, прилеглого до 3'-виступу, і розширення 15-19 нуклеотидів від першого мономера, що прилягає до 3'-виступу. Наприклад, для 27-нуклеотидного антисмислового
Зо ланцюга і підрахунку перша основа на 5'-кінці антисмислового ланцюга у положенні номер 1, 2ОМе модифікації буде розміщена на місці основ 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,26,127. У одному варіанті реалізації Дайсер-субстратна доРНК має наступну структуру: 5Б-рРХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХоО-3
З-УХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХХ р-5 де "ХХ" - РНК, "р'- фосфатна група, "Х"' - 2ОМе РНК, "у" є виступом домена, який складається з 1, 2, 3, 4 або РНК мономерів, які є необов'язковими 2'ОМе РНК мономерами і "0" - ДНК. Верхній ланцюг є смисловим ланцюгом, а нижній ланцюг є антисмисловим ланцюгом.
І0204| У четвертому варіанті реалізації Дайсер-субстратна доРНК має декілька властивостей, які підвищують її обробку Дайсер. Згідно цьому варіанту реалізації, дсРНК має довжину, достатню для того, щоб вона оброблялася Дайсер для одержання міРНК і щонайменше одну з наступних властивостей: (ї) дсРНК є асиметричною, наприклад, має 3'- виступ на смисловому ланцюзі; і (її) ДсРНК має модифікований 3'-кінець на антисмисловому ланцюзі, щоб направляти орієнтацію зв'язування Дайсер і обробки доРНК до активної міРНК.
Згідно цьому варіанту реалізації, смисловий ланцюг містить від близько 24 до близько 30 нуклеотидів (наприклад, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 нуклеотидів) і антисмисловий ланцюг містить від близько 22 до близько 28 нуклеотидів (наприклад, 22, 23, 24, 25, 26, 27, або 28 нуклеотидів). У одному варіанті реалізації Дайсер-субстратна дсРНК має виступ на 3'-кінці смислового ланцюга. В іншому варіанті реалізації, антисмисловий ланцюг модифікований для зв'язування Дайсер і обробки за допомогою відповідних модифікаторів, розташованих на 3'-кінці антисмислового ланцюга. Прийнятні модифікатори включають нуклеотиди, такі як дезоксирибонуклеотиди, ациклонуклеотиди і тому подібне, і стерично утруднені молекули, такі як флуоресцентні молекули і тому подібне. При використанні нуклеотидних модифікаторів, вони замінюють рибонуклеотиди у десРНК таким чином, що довжина доеРНК не змінюється. В іншому варіанті реалізації винаходу дсеРНК має виступ на 3'-кінці смислового ланцюга і антисмисловий ланцюг модифікований для обробки Дайсер. У одному варіанті реалізації, антисмисловий ланцюг має 5'--фосфат. Смислові і антисмислові ланцюги відпалюють у біологічних умовах, таких як умови, що знаходяться у цитоплазмі клітини. Крім того, ділянка однієї з послідовностей, зокрема, антисмислового ланцюга, доРНК має довжину послідовності, що дорівнює щонайменше 19 нуклеотидам, причому ці нуклеотиди примикають до 3'"-кінця антисмислового бо ланцюга і є у достатній мірі комплементарні нуклеотидній послідовності РНК, отриманою з гена-
мішені. Крім того, відповідно до цього варіанту реалізації, Дайсер-субстратна дсРНК може також мати одну або декілька наступних додаткових властивостей: (а) антисмисловий ланцюг має ліве зрушення від типового 21-мера (тобто, антисмисловий ланцюг містить нуклеотиди по лівій частині молекули у порівнянні з типовим 21-мером); і (б) ланцюги можуть не бути повністю комплементарними, тобто ланцюги можуть містити прості невідповідності спаровування.
ІЇ0О205| У бажаному варіанті реалізації, Дайсер-субстратна дсРНК має асиметричну структуру, із смисловим ланцюгом, що має довжину 25 пар основ, і антисмисловим ланцюгом, що має довжину 27 пар основ з 2-ма основами на 3'-виступі. В деяких випадках, ця дсРНК, що має асиметричну структуру, додатково містить 2 дезоксинуклеотида на 3'-кінці смислового ланцюга замість двох рибонуклеотидів. У деяких інших випадках, ця досРНК, що має асиметричну структуру, додатково містить 2'ОМе модифікації у положеннях 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, і 25 антисмислового ланцюга (у якому перша основа на 5'-кінці антисмислового ланцюга знаходиться у положенні 1). У деяких додаткових випадках, ця дсРНК, що має асиметричну структуру, додатково містить 3'-виступ на антисмисловому ланцюзі, що містить 1, 2, З або 4 2ОМе нуклеотидів (наприклад, З3'-виступ 2'ОМе нуклеотидів у положеннях 26 і 27 на антисмисловому ланцюзі). 0206) У іншому варіанті реалізації, Дайсер-субстратна дсРНК може бути розроблена за допомогою початкового вибору міРНК послідовності антисмислового ланцюга, що має довжину щонайменше 19 нуклеотидів. У деяких випадках, антисмислова міРНК модифікована, щоб містити від близько 5 до близько 11 рибонуклеотидів на 5'-кінці, щоб забезпечити довжину від близько 24 до близько 30 нуклеотидів. Коли антисмисловий ланцюг має довжину 21 нуклеотид, 3-9, бажано 4-7, бажаніше 6 нуклеотидів можуть бути додані на 5'-кінець. Не дивлячись на те, що додані рибонуклеотиди можуть бути комплементарними послідовності гена-мішені, повна комплементарність між цільовою послідовністю і антисмисловою міРНК не вимагається. Тобто, у результаті антисмислова міРНК є достатньою мірою комплементарною з послідовністю- мішенню. Смисловий ланцюг, який потім віробляється, має від близько 22 до близько 28 нуклеотидів. Смисловий ланцюг, по суті, є комплементарним антисмисловому ланцюгу для відпалювання антисмислового ланцюга в біологічних умовах. У одному варіанті реалізації, смисловий ланцюг синтезується для того, щоб містити модифікований 3'-кінець і направити
Зо Дайсер обробку антисмислового ланцюга. В іншому варіанті реалізації, антисмисловий ланцюг
ДОРНК має 3'"-виступ. У додатковому варіанті реалізації, смисловий ланцюг синтезується для того, щоб містити модифікований 3'-кінець для зв'язування і обробки Дайсер, і антисмисловий ланцюг деРНК має 3'-виступ. 0207) У родинному варіанті реалізації антисмислова міРНК може бути модифікована, щоб містити від близько 1 до близько 9 рибонуклеотидів на 5'-кінці для того, щоб забезпечити довжину від близько 22 до близько 28 нуклеотидів. Коли антисмисловий ланцюг має довжину у 21 нуклеотид, 1-7, бажано 2-5, бажаніше 4 рибонуклеотидів можуть бути додані на 3'-кінці.
Додані рибонуклеотиди можуть мати будь-яку послідовність. Не дивлячись на те, додані рибонуклеотиди можуть бути комплементарними послідовності гена-мішені, повна комплементарність між цільовою послідовністю і антисмисловою міРНК не потрібна. Тобто, у результаті антисмислова міРНК є достатньою мірою комплементарною з послідовністю- мішенню. Смисловий ланцюг, який потім віробляється, має від близько 24 до близько 30 нуклеотидів. Смисловий ланцюг, по суті, доповнює антисмисловий ланцюг для відпалювання антисмислового ланцюга в біологічних умовах. У одному варіанті реалізації антисмисловий ланцюг, який синтезується для того, щоб містити модифікований 3'-кінець, щоб направити обробку Дайсер. У іншому варіанті реалізації смислового ланцюга дсеРНК має 3'-виступ. У ще одному варіанті реалізації синтезують антисмисловий ланцюг, який містить модифікований 3'- кінець для зв'язування Дайсер і обробки, і смисловий ланцюг деРНК має 3'-виступ.
І0208| Прийнятні Дайсер-субстратні дсоРНК послідовності можуть бути визначені, синтезовані і змінені за допомогою будь-яких засобів, відомих у даній області для проектування, синтезу і модифікації послідовностей міРНК. У конкретних варіантах реалізації, Дайсер- субстратну деРНК вводять за допомогою системи носія, такого як нуклеїнова кислотно-ліпідна частка. У бажаному варіанті реалізації, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка містить: (а) одну або більше Дайсер-субстратних молекул деРНК; (б) катіонний ліпід за формулою І або його сіль; і (с) некатіонний ліпід (наприклад, ОРРС, ЮО5РС, ОРЕ та/або холестерин). У деяких випадках, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка може додатково містити зв'язаний ліпід, який запобігає агрегації часток (наприклад, РЕС-БАА та/або РО2-ОАА). 0209) Додаткові варіанти реалізації, що відносяться до Дайсер-субстратної деРНК згідно винаходу, а також способам проектування і синтезу таких дсРНК, описані в публікаціях 60 патентних заявок США МоМо 2005/0244858, 2005/0277610 і 2007/0265220 і попередньої заявки
США Мо 61/184652, поданої 5 червня 2009 року, опис яких включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 3. МШРНК
І(0210| "Мала шпилька РНК" або "коротка шпилька РНК" або "мшРНК" містить коротку послідовність РНК, яка робить крутий поворот у вигляді шпильки, яка може бути використана для придушення експресії гена за допомогою РНК-інтерференції. МШРНК за винаходом можуть бути синтезовані хімічно або транскрибовані з касет транскрипцій у плазмідну ДНК. Структура шпильки МШРНК розщеплюється клітинними механізмами в міРНК, яка потім зв'язується з РНК- індукованим вимикаючим комплексом (КІЗС). (0211) МшШРНК за винаходом, як правило, мають близько 15-60, 15-50, 15-40 або (дуплекс) нуклеотидів, більше зазвичай близько 15-30, 15-25, 19-25 або (дуплекс) нуклеотидів у довжину, і бажано близько 20-24, 21-22, 21-23 або (дуплекс) нуклеотидів у довжину (наприклад, кожна комплементарна послідовність у дволанцюжковій мшеРНК має 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, або 19-25 нуклеотидів у довжину, бажано близько 20-24, 21-22, або 21-23 нуклеотидів у довжину, і дволанцюжкова мшРНК складає близько 15-60, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, або 19-25 пар основ у довжину, бажано близько 18-22, 19-20, або 19-21 пара основ у довжину). МШРНК дуплекси можуть містити 3' виступи від близько 1 до близько 4 нуклеотидів або від близько 2 до близько З нуклеотидів на антисмисловому ланцюзі і 5'-фосфат-кінці на смисловому ланцюзі. У деяких варіантах реалізації цього винаходу МмшШРНК містить послідовності смислового ланцюга талабо антисмислового ланцюга від близько 15 до близько 60 нуклеотидів у довжину (наприклад, близько 15-60, 15-55, 15-50, 15-45, 15-40, 15-35, 15-30, або 15-25 нуклеотидів у довжину), бажано від близько 19 до близько 40 нуклеотидів у довжину (наприклад, близько 19- 40, 19-35, 19-30, або 19-25 нуклеотидів в довжину), бажаніше від близько 19 до близько 23 нуклеотидів у довжину (наприклад, 19, 20, 21, 22, або 23 нуклеотидів у довжину).
І0212| Необмежуючі приклади мшШРНК включають дволанцюжкову полінуклеотидну молекулу, зібрану з одноланцюжкової молекули, де смислова і антисмислова ділянки зв'язані за допомогою лінкера на основі ненуклеїнової кислоти або на основі нуклеїнової кислоти; і дволанцюжкова полінуклеотидна молекула з вторинною структурою у вигляді шпильки має самокомплементарні смислову і антисмислову ділянки. У бажаних варіантах реалізації,
Зо смисловий і антисмисловий ланцюги в мшРНК зв'язані структурними петлями, що містять від близько 1 до близько 25 нуклеотидів, від близько 2 до близько 20 нуклеотидів, від близько 4 до близько 15 нуклеотидів, від близько 5 до близько 12 нуклеотидів або 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або більше нуклеотидів.
ІЇ0213| Прийнятні послідовності мшШРНК можуть бути ідентифіковані, синтезовані, і модифіковані за допомогою будь-яких засобів, відомих у даній області для проектування, синтезу і модифікації послідовностей міРНК. У конкретних варіантах реалізації, МШРНК вводять за допомогою системи носіїв, такої як нуклеїнова кислотно-ліпідна частка. У бажаному варіанті реалізації, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка містить: (а) одну або більше молекул мшРНК; (б) катіонний ліпід за формулою І або його сіль; і (с) некатіонний ліпід (наприклад, ОРРС, О5РС,
ОРЕ, та/або холестерин). У деяких випадках, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка може додатково містити зв'язаний ліпід, який запобігає агрегації часток (наприклад, РЕС-ОАА та/або
РО7-РАА). (0214) Додаткові варіанти реалізації мшеРНК, що відносяться до винаходу, а також способи проектування і синтезу таких мшРНК описані в попередній заявці США 61/184652, поданій 5 червня 2009 року, опис якої включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 4. АЇРНК
ІО215| Як ії міРНК, асиметрична інтерферуюча РНК (аїРНК)У може утворювати РНК- індукований вимкнений комплекс (КІЗС) і призвести до ефективного виключення різних генів у клітинах ссавців шляхом опосередкування послідовність-специфічного розщеплювання послідовності-мішені між нуклеотидами 10 і 11 по відношенню до 5'-кінця антисмислового ланцюга (Зип еї аї., Маї. Віоїесп., 26:1379-1382 (2008)). Як правило, молекули аіРНК містять короткий РНК дуплекс, що має смисловий ланцюг і антисмисловий ланцюг, де дуплекс містить виступи на 3' ії 5' кінцях антисмислового ланцюга. АЇРНК, як правило, асиметричні, оскільки смисловий ланцюг коротший на обох кінцях у порівнянні з комплементарним антисмисловим ланцюгом. У деяких аспектах, айРНК молекули можуть бути розроблені, синтезовані і відпалюватися в умовах, аналогічних тим, які використовуються для молекул мігРНК. Як не обмежуючий приклад, послідовності айРНК можуть бути вибрані і отримані з використанням способів, описаних вище для вибору послідовності міР НК. бо (0216) У іншому варіанті, аЇРНК дуплекси різної довжини (наприклад, близько 10-25, 12-20,
12-19, 12-18, 13-17, або 14-17 пар основ, типовіше 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або 20 пар основ), можуть бути розроблені з виступами на 3' і 5' кінцях антисмислового ланцюга меНК- мішені, що цікавить. У деяких випадках, смисловий ланцюг молекули аіРНК складає близько 10- 25, 12-20, 12-19, 12-18, 13-17, або 14-17 нуклеотидів у довжину, типовіше 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, або 20 нуклеотидів у довжину. У деяких інших випадках, антисмисловий ланцюг молекули аіїРНК складає близько 15-60, 15-50, або 15-40 нуклеотидів у довжину, типовіше близько 15-30, 15-25, або 19-25 нуклеотидів у довжину, і бажано близько 20-24, 21-22, або 21-23 нуклеотидів у довжину. 0217) У деяких варіантах реалізації, 5 антисмисловий виступ містить один, два, три, чотири, або більше нуклеотида-немішені (наприклад, "АА", "ШО", татат", і так далі). В інших варіантах, 3" антисмисловий виступ містить один, два, три, чотири, або більше нуклеотида-немішені (наприклад, "АА", "ШО", татат", і так далі). У деяких аспектах, молекули аїіРНК, описані в цьому документі, можуть містити один або декілька модифікованих нуклеотидів, наприклад, у дволанцюжковій (дуплексній) ділянці тал"або в антисмислових виступах. Як не обмежуючий приклад, послідовності айїРНК можуть містити один або декілька модифікованих нуклеотидів, описаних вище для послідовностей міРНК. У бажаному варіанті молекула містить аїРНК 2'ОМе нуклеотидів, таких як, наприклад, 2'ОМе-гуанозинових нуклеотидів, 2'ОМе-уридинових нуклеотидів або їх сумішей. 0218) У деяких варіантах, молекули аіїРНК можуть містити антисмисловий ланцюг, який відповідає антисмисловому ланцюгу молекули міРНК, наприклад, одній з молекул міРНК, описаних у цьому документі. У конкретних варіантах реалізації, аїРНК вводять за допомогою системи носія, такої як нуклеїнова кислотно-ліпідна частка. У бажаному варіанті реалізації, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка містить: (а) одну або декілька молекул аіРНК; (б) катіонний ліпід за формулою І або його сіль; і (с) некатіонний ліпід (наприклад, ОРРС, О5РС, ОРЕ, та/або холестерин). У деяких випадках, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка може додатково містити зв'язаний ліпід, який запобігає агрегації часток (наприклад, РЕС-БАА та/або РО2-РАА). (0219) Прийнятні послідовності аїРНК можуть бути ідентифіковані, синтезовані, і змінені за допомогою будь-яких засобів, відомих у даній області для проектування, синтезу і модифікації послідовностей міРНК. Додаткові варіанти реалізації, пов'язані з молекулами айРнкК за винаходом, описані в заявці на патент США Мо 2009/0291131 і РСТ публікації УМО 09/127060, описи яких включені у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 5. МікроРНК
І0220| Як правило, мікроРНК (мікроРНК) є одноланцюжковими молекулами РНК, що складаються з близько 21-23 нуклеотидів у довжину, які регулюють експресію генів. МікроРНК кодуються генами ДНК, від якої вони транскрибуються, але мікроРНК не транслюються в білок (не кодуючі РНК); замість цього, кожен первинний транскрипт (прі-мікроРНК) перетворюється на коротку структуру петлі на стеблі під назвою пре-мікроРНК і, нарешті, у функціонально зрілу міРНК. Зрілі молекули мікроРНК є частково або повністю комплементарними до однієї або більше РНК (мРНК) молекулам, і їх основна функція полягає в придушенні експресії генів.
Ідентифікація молекул мікроРНК описується, наприклад, у Гадо5з-Оціпіапа єї аї., бсієпсе, 294:853-858; І а єї аї., бсіепсе, 294:858-862; та І ее ві аї., 5сіепсе, 294:862-864. (02211 Гени, що кодують мікроРНК, є набагато довшими, ніж оброблені молекули зрілої мікроР НК. МікроРНК спочатку транскрибується як первинний транскрипт або прі-мікроРНК з кепом і полі-А хвостом і перетворюється на коротку, « 70-нуклеотидів структуру петлі на стеблі, відому як пре-мікроРНК у ядрі клітини. Ця обробка виконується в тваринах за допомогою білкового комплексу, відомого як комплекс Мікропроцесор, що складається з нуклеази Дроша і дволанцюжкового РНК-зв'язуючого білка Паша (Оеєгпії еї аї., Майиге, 432:231-235 (2004)).. Ці пре- мікроРНК потім перетворюються на зрілі мікроРНК у цитоплазмі шляхом взаємодії з ендонуклеазою Дайсер, яка також ініціює утворення РНК-індукованого виключення комплексу (ВІБС) (Вегпвієїп єї аї., Маїшге, 409:363-366 (2001). Обидва - і смисловий ланцюг або антисмисловий ланцюг ДНК можуть функціонувати як шаблони для збільшення кількості мікроРНК.
І0222| Коли Дайсер розщеплює петлю на стеблі пре-мікроРНК, утворюються дві комплементарні молекули РНК, але лише одна інтегрується у комплекс КІЗС. Цей ланцюг відомий як напрявляючий ланцюг і вибирається аргонавт білка, каталітично активної РНКази в комплексі КІЗС, на основі стійкості 5'-кінця (Ргеаї! еї аї., Сигг. Віо!І., 16:530-535 (2006)). Решта ланцюгів, відомі як антипровідникові або супроводжуючі ланцюги, розкладаються як субстратний РІС комплекс (сгедогу еї аї., СеїЇ, 123:631-640 (2005)). Після інтеграції в активний комплекс КІЗС, пари мікроРНК основ з комплементарними молекулами мРНК і викликають бо деградацію мРНК-мішені та/або виключення трансляції.
(0223) Молекули мікроРНК ссавців, як правило, комплементарні сайту в 3 ОТ послідовності
МРНК-мішені. В деяких випадках, відпалювання мікроРНК у мРНК-мішені інгібує трансляцію білка шляхом блокування організації трансляції білка. У деяких інших випадках, відпалювання мікроРНК у мікроРНК-мішені полегшує розщеплювання і деградацію мікроРНК-мішені за допомогою процесу, подібного до інтерференції РНК (ІРНК). МікроРНК можуть приголомшувати метилування ділянок геномів, які відповідають мікроРНК-мішеням. Як правило, функцію мікроРНК у поєднанні з комплементом білків колективно називають мікрокМР. (0224) У деяких аспектах, молекули мікроРНК, описані в цьому документі, мають близько 15- 100, 15-90, 15-80, 15-75, 15-70, 15-60, 15-50, або 15-40 нуклеотидів у довжину, типовіше близько 15-30, 15-25, або 19-25 нуклеотидів у довжину, і бажано близько 20-24, 21-22, або 21-23 нуклеотидів у довжину. У деяких інших аспектах, молекули мікроРНК можуть містити один або декілька модифікованих нуклеотидів. Як не обмежуючий приклад, послідовності мікроРНнК можуть містити один або декілька модифікованих нуклеотидів описаних вище послідовностей міРНК. У бажаному варіанті молекула міРНК містить 2'ОМе нуклеотиди, такі як, наприклад, 2"ОМе-гуанозиновий нуклеотид, 2'ОМе-уридиновий нуклеотид або їх суміші. (0225) У конкретних варіантах реалізації, мікроРНК вводять за допомогою системи носіїв, такий як нуклеїнова кислотно-ліпідна частка. У бажаному варіанті реалізації, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка містить: (а) одну або більше молекул мікроРНК; (б) катіонний ліпід за формулою | або його сіль; і (с) некатіонний ліпід (наприклад, ОРРС, ОРОС, О5РЕ, та/або холестерин). У деяких випадках, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка може додатково містити зв'язаний ліпід, який запобігає агрегації часток (наприклад, РЕС-БАА та/або РО2-РАА). (0226) У інших варіантах, один або декілька агентами, які блокують активність у мікроРНК- мішенях мРНК, що цікавлять, вводять із використанням ліпідної частки за винаходом (наприклад, нуклеїнова кислотно-ліпідна частка, така як МР). Приклади блокуючих агентів охоплюють стеричні блокуючі олігонуклеотиди, закриті олігонуклеотиди нуклеїнових кислот і морфоліно олігонуклеотиди, але не обмежуються ними. Такі блокуючі агенти можуть зв'язуватися безпосередньо з мікроРНК або з сайтом зв'язування мікроРНК на мРНК-мішені.
І0227| Додаткові варіанти реалізації, пов'язані з молекулою мікроРНК за винаходом, описані у заявці на патент США Мо 2009/0291131 і РСТ публікації М/О 09/127060, розкриття яких
Зо включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 6. Безсмислові олігонуклеотиди (0228) У одному варіанті реалізації нуклеїнова кислота є антисмисловим олігонуклеотидом, що вражає ген-мішень або послідовність, що цікавить. Терміни "антисмисловий олігонуклеотид" або "антисмисловий" охоплюють олігонуклеотиди, комплементарні мішені - полінуклеотидній послідовності. Антисмислові олігонуклеотиди представлені одиноланцюжковими ДНК або РНК, які комплементарні до вибраної послідовності. Антисмислові РНК олігонуклеотиди запобігають трансляції комплементарних ланцюгів РНК шляхом зв'язування з РНК. Антисмислові олігонуклеотиди ДНК можуть використовуватися для ураження специфічної, комплементарної (кодуючої або некодуючої) РНК. Якщо відбувається зв'язування, цей ДНК/РНК гібрид може бути деградований за допомогою ферменту РНКази Н. У конкретному варіанті реалізації, антисмислові олігонуклеотиди містять від близько 10 до близько 60 нуклеотидів, бажаніше від близько 15 до близько 30 нуклеотидів. Термін також охоплює антисмислові нуклеотиди, які не можуть бути точно комплементарними бажаному гену-мішені. Таким чином, винахід може бути використаний у тих випадках, коли не-мішенні неспецифічні активності виявлені антисмисловими, або там, де антисмислова послідовність, що містить одну або декілька неспівпадань з послідовністю-мішенню, є найбільше бажаною для конкретного використання. (0229| Антисмислові олігонуклеотиди були продемонстровані як ефективні і уражують інгібітори синтезу білка, і, отже, можуть бути використані для специфічного інгібування синтезу білка гена-мішені. Ефективність антисмислових олігонуклеотидів для інгібування синтезу білка добре відома. Наприклад, синтез полігалактоуронази і ацетилхолінового рецептора мускарину типа 2 пригнічуються антисмисловими олігонуклеотидами, направленими на їх відповідні послідовності мРНК (див. патенти США МоМо 5739119 і 5759829). Крім того, приклади антисмислового інгібування були продемонстровані з ядерним білком цикліном, геном множинної лікарської стійкості (МОКІ), ІСАМ-1, Е-селекція, ЗТК-1, рецептором стриарного
САВАА, і людського ЕСЕ (див. Чазкиї5Кі єї аї!., 5сіепсе, 240:1544-6 (1988); Мазапіпакитаг" еї аї.,
Сапсег Соттип., 1:225-32 (1989); Регіз єї аї!., Вгаіп Рез Мо! Вгаїп Нев., 15:557:310-20 (1998); і патентах США МоМо 5801154; 5789573; 5718709 і 5610288). Крім того, також були описані антисмислові конструкції, що інгібують і можуть бути використані для лікування різних патологічних клітинних розростань, наприклад, раку (див. патенти США МоМо 5747470; 5591317 і бо 5783683). Розкриття цих посилань включені у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0230) Способи одержання антисмислових олігонуклеотидів відомі у даній області і можуть бути легко адаптовані для одержання антисмислових олігонуклеотидів, які вражують будь-яку полінуклеотидну послідовність. Вибір антисмислової олігонуклеотидної послідовності, специфічної для даної послідовності-мішені, оснований на аналізі вибраної послідовності- мішені і визначення вторинної структури, Тт, енергії зв'язування і відносної стабільності.
Антисмислові олігонуклеотиди можуть бути вибрані на основі їх відносної нездатності утворювати димери, шпильки або інші вторинні структури, які дозволили б зменшити або забороняти специфічне зв'язування з мРНК-мішенню в клітині-господарі. Найбільше бажані цільові ділянки мРНК охоплюють ті ділянки на або поблизу кодону ініціації трансляції АОС і ті послідовності, які істотно комплементарні 5' ділянці мРНК. Аналіз цих вторинних структур і вибір сайту-мішені можуть бути виконані, наприклад, за допомогою у.4 програмного забезпечення для аналізу праймера ОГІСО (Молекулярні Біологічні Інсайти) та/або програмного забезпечення алгоритму ВГАЗТМ 2.0.5 (Ан5спці еї аї., Мисієїс Асід5 Кев., 25:3389-402 (1997)). 7. Рибозими
ІО231| Відповідно до іншого варіанту реалізації цього винаходу, нуклеїнові кислотно- ліпідні частки пов'язані з рибозимами. Рибозіми є РНК-білюовими комплексами, що мають конкретні каталітичні домени, які мають активність ендонуклеаз (див., Кіт еї аї!., Ргос. Май. Асай. 5бі.
И5БА., 84:8788-92 (1987); і Рогеїег єї аї., СеїЇ, 49:211-20 (1987)). Наприклад, велика кількість рибозимів прискорює реакцію передачі фосфоефірів з високою мірою специфічності, часто розщеплюючи лише один з декількох фосфоефірів в олігонуклеотидному субстраті (див. Сесії єї а!., Сеїї, 27:487-96 (1981); Міснеї! еї аї., у. Мої. Віої., 216:585-610 (1990); Веїіппоїд-Нитек еї аї.,
Маїшцге, 357:173-6 (1992)). Ця специфіка була приписана до вимоги, що субстрат зв'язується через специфічну взаємодію по спаровуванню основ на внутришній провідній послідовності ("705") рибозима заздалегідь до протікання хімічної реакції. (0232| Щонайменше шість основних сортів ферментативних молекул РНК відомі у природі у наш час. Кожна з них може каталізувати гідроліз РНК фосфодіефірних зв'язків іп їгапв (і, отже, може розщеплювати інші молекули РНК) у фізіологічних умовах. Загалом, ферментні нуклеїнові кислоти діють за допомогою первинного зв'язування з РЕНК-мішенню. Таке зв'язування
Зо відбувається через мішень-зв'язуючу ділянку ферментативної нуклеїнової кислоти, яка проходить у безпосередній близькості від ферментативної частини молекули, яка діє за допомогою розщеплювання РНК-мішені. Таким чином, ферментативна нуклеїнова кислота спершу визначає, а потім зв'язує РНК-мішені за допомогою комплементарного спаровування основ, і як тільки вона зв'язана з правильним сайтом, діє за допомогою ферментативного разщеплювання РНК-мішені. Стратегічне розщеплювання такої РНК-мішені знищить її здатність направляти синтез закодованого білка. Після того, як ферментативна нуклеїнова кислота зв'язала і розщепила РНК-мішень, вона звільняється від цієї РНК ї шукає іншу ціль і може неодноразово зв'язувати і розщеплювати нові цілі.
І0233| Ферментативна молекула нуклеїнової кислоти може бути сформовані в молот, шпильку, вірус гепатиту б, інтрон групу | або РНПазу РНК (у поєднанні з направляючою послідовністю РНК) або Нейроспора проти РНК фрагмент, наприклад. Конкретні приклади фрагментів молотка описані, наприклад, у Козв5і еї аї., Мисівїс Асід5 Кев., 20:4559-65 (1992).
Приклади фрагментів шпильки описані, наприклад, в ЕР 0360257, Натреї! еї аї., Віоспетівігу, 28:4929-33 (1989); Натреї! еї аї., МисіІвіс Асій5 Нев., 18:299-304 (1990); ії патенті США Мо 5,631,359. Приклад фрагмента вірусу гепатиту б описаний, наприклад, у Реїтойа еї аї.,
Віоспетівігу, 31:11843-52 (1992). Приклад фрагмента РНПази описаний, наприклад, у Спцегтівег-
ТакКкада еї а!., Сеїї, 35:849-57 (1983). Приклади Нейроспора проти РНК рибозимного фрагмента описані у, наприклад, ЗаміМе еї аї., СеїЇ, 61:685-96 (1990); ЗаміНе еї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 88:8826-30 (1991); СоШпе еї аї., Віоспетівту, 32:2795-9 (1993). Приклад групи І! інтрону описаний, наприклад, у патенті США Мо 4987071. Важливими характеристиками ферментативних молекул нуклеїнових кислот, що використовуються відповідно до цього винаходу є те, що вони мають специфічний субстратний сайт зв'язування, комплементарний до однієї або більше ділянкам гена-мішені ДНК або РНК, і що вони мають нуклеотидні послідовності, в межах або оточуючі сайт субстратного зв'язування, які додає РНК розщеплюючу активність до молекули. Таким чином, рибозимні конструкції не повинні обмежуватися конкретними фрагментами, згаданими у цьому документі. Розкриття цих посилань включені у даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (02341 Способи одержання рибозимів, що уражують будь-яку полінуклеотидну послідовність, відомі у даній області. Рибозіми можуть бути сконструйовані, як описано, наприклад, у публікації 60 РСТ МоМо УМО 93/23569 і МО 94/02595, і синтезовані, аби бути випробуваними іп міїго та/або іп мімо, як описано у ній. Розкриття цих публікацій РСТ включені у даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0235) Активність рибозимів можна оптимізувати, змінюючи довжину рибозимних ділянок зв'язування або хімічним синтезом рибозимів із змінами, які запобігають їх деградації у сироватці рибонуклеази (див., наприклад, в публікації РСТ МоМо МО 92/07065, УМО 93/15187,
УМО 91/03162 і УМО 94/13688, ЕР 92110298,4, і в патенті США Мо 5334711, які описують різні хімічні модифікації, які можуть бути зроблені з цукровими фрагментами ферментативних молекул РНК, розкриття яких наведені у цьому документі шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей), модифікації, які збільшують їх ефективність у клітинах, і видалення стволових основ ІЇ для скорочення часу синтезу РНК і зменшення потреби в хімічних речовинах. 8. Імуностимулюючі олігонуклеотиди (0236) Нуклеїнові кислоти, пов'язані з ліпідними частками за цим винаходом, можуть бути імуностимулюючими, у тому числі імуностимулюючими олігонуклеотидами (155; одно- або дволанцюжковими), здатними індукувати імунну відповідь при введенні суб'єктові, який може бути, наприклад, ссавцем, таким як людина. ІЗ5 охоплюють, наприклад, визначені палиндроми, що призводять до утворення шпильки вторинних структур (див., Хататоїо еї аї., У. Іттипої., 148:4072-6 (1992)), або Сро фрагменти, а також інші відомі особливості І55 (такі як мульти-Сї домени, див. РСТ публікацію УМО 96/11266, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей).
ІЇ0237| Імуностимулюючі нуклеїнові кислоти, як вважають, є неспецифічними послідовностями, коли не потрібно, щоб вони специфічно зв'язувалися з і знижували експресію послідовності-мішені, щоб спровокувати імунну реакцію. Таким чином, визначені імуностимулюючі нуклеїнові кислоти можуть містити послідовності, що відповідають ділянці з природним геном або мРНК, але вони все ж таки можуть бути розглянуті як неспецифічні послідовності імуностимулюючих нуклеїнових кислот. (0238) У одному варіанті реалізації імуностимулююча нуклеїнова кислота або олігонуклеотид містить щонайменше один динуклеотид Сро. Олігонуклеотид або Сро дінуклеотид може бути неметилованим або метилованим. У іншому варіанті реалізації імуностимулююча нуклеїнова кислота містить щонайменше один динуклеотид Сро, що має метилований цитозин. У одному
Зо варіанті реалізації нуклеїнова кислота містить один дінуклеотид Сро, в якому цитозин у дінуклеотиді Сро є метилованим. У альтернативному варіанті реалізації нуклеїнова кислота містить щонайменше два дінуклеотиди Сро, в яких щонайменше один цитозин у динуклеотиді
Сро метилований. У додатковому варіанті реалізації кожен цитозин у дінуклеотиді Сро, що присутній у послідовності, метилований. У іншому варіанті реалізації нуклеїнова кислота містить множину Сро динуклеотидів, в якій щонайменше один з динуклеотидів Сро містить метилований цитозин. Приклади імуностимулюючих олігонуклеотидів, придатних для використання в композиціях і способах за цим винаходом, описані в публікації РСТ М/О МоМо 02/069369, УМО 01/15726 і МО 09/086558; у патенті США Мо 6406705; і в Вапеу вї аї!., У. Ріпатпт.
Ехрег. Тнег., 298:1185-92 (2001), вміст яких включений у цей опис як посилання у повному обсязі для всіх цілей. У деяких варіантах реалізації, олігонуклеотиди, що використовуються в композиціях і способах за цим винаходом, мають фосфодіефірну ("РО") основу або фосфортіоатну ("РБ5") основу, талабо щонайменше один метилований цитозиновий залишок у фрагменті Сро.
В. Інші активні агенти 0239) У деяких варіантах реалізації активний агент, зв'язаний з ліпідними частками згідно винаходу може містити один або більше терапевтичних білків, поліпептидів або малих органічних молекул або сполук. Не обмежуючі приклади таких терапевтично ефективних агентів або ліків охоплюють онкологічні препарати (наприклад, хіміотерапевтичні препарати, гормональні терапевтичні агенти, імунотерапевтичні агенти, рентгенотерапевтичні агенти і так далі), гіполіпідемічні засоби, противірусні препарати, протизапальні сполуки, антидепресанти, стимулятори, анальгетики, антибіотики, протизаплідні препарати, жарознижуючі засоби, судинорозширювальні засоби, анти-ангіогени, цитоваскулярні агенти, інгібітори сигнальної трансдукції серцево-судинні препарати, такі як антиаритмічні агенти, гормони, судинозвужувальні і стероїди. Ці активні речовини можуть бути введені окремо в ліпідну частку за цим винаходом, або в комбінації (наприклад, такі, що спільно вводиться) з ліпідними частками згідно винаходу, що містять нуклеїнову кислоту, таку як інтерферуюча РНК.
І0240| Не обмежуючі приклади хіміотерапевтичних препаратів охоплюють препарати на основі платини (наприклад, оксаліплатин, цисплатин, карбоплатин, спіроплатин, іпроплатин, сатраплатин і так далі), алкілуючі агенти (наприклад, циклофосфамід, іфосфамід, хлорамбуцил, бо бусульфан, мелфалан, мехлоретамін, урамустин, тіотепа, нітрозомочевини, і так далі),
антиметаболіти (наприклад, 5-фторурацил (5-ФУ), азатіоприн, метотрексат, лейковорин, капецитабін, цитарабін, рлоксуридин, флударабін, гемцитабін, пеметрексед, ралтитрексед, і так далі), рослинні алкалоїди (наприклад, вінкристин, вінбластин, вінорелбін, віндезин, подофіллотоксин, паклітаксел (таксол), доцетаксел, і так далі), інгібітори топоізомерази (наприклад, іринотекан (СРТ-11; Камптосар), топотекан, амсакрин, етопозид (МР16), етопозид фосфат, теніпозид, і так далі), протипухлинні антибіотики (наприклад, доксорубіцин, адріаміцин, даунорубіцин, епирубіцин, актиноміцин, блеомицин, митомицин, митоксантрон, пликамицин і так далі), тирозин кінази (наприклад, гефітиніб (Іге552У), сунитиніб (Зщепі?; 5011248), ерлотиніб (Тагсема?; О51-1774), лапатиніб (Б5УУ572016; СУУ2016), канертиніб (С! 1033), семаксиніб (505416), ваталаніб (РТК787 / 2К222584), сорафеніб (ВАМ 43-9006), іматиніб (Сівемесе; 5ТІ571), дазатиніб (ВМ5-354825), лефлуномід (З0О101), вандетаміб (7асійта"; 206474), і так далі), їх фармацевтично прийнятні солі, їх стереоізомери, їх похідні, їх аналоги, а також їх комбінації.
І0241| Приклади традиційних гормональних терапевтичних агентів охоплюють, без обмеження, стероїди (наприклад, дексаметазон), фінастерид, інгібітори ароматази, тамоксифен, і гозерелін, а також інші агоністи гонадотропін-вивільняючого гормону (СпАН).
І0242| Приклади традиційних імунотерапевтичних агентів охоплюють імуностимулятори (наприклад, Васійи5 СаІтейце-Ссцегіп (ВСО), левамізол, інтерлейкін-2, альфа-інтерферон і так далі), моноклональні антитіла (наприклад, анти-СО20, анти-НЕК2, анти-СО52, анти-НІ А-ОКЕ, і анти-МЕСОЕ моноклональні антитіла), імунотоксини (наприклад, анти-СОЗ3 моноклональне антитіло, кон'югат -каліхеаміцин, анти-СО22 моноклональне антитіло-екзотоксин Рзендотопав кон'югат, і так далі), і радіоімунотерапія (наприклад, анти-СО20 моноклональне антитіло, кон'юговане з 11п, 90Уу, або "І, ії так далі), але не обмежуючись ними). (0243) Приклади традиційних радіотерапевтичних агентів охоплюють радіонукліди, такі як я75с, би, 67би, 895, 86у, 87у, 90у, 105ДН, пд, 1, п7топ, Март, 15351171, 166Но, 177| у, 186Ве, 188Ве,
ПД, і 212Ві, можливо, кон'юговані з антитілами, направленими проти пухлинних антигенів, але не обмежуються ними. (0244) Додаткові онкологічні препарати, які можуть бути використані відповідно до винаходу, включають алкеран, алопуринол, альтретамін, амифостин, анастрозол, агасС, триоксид миш'яку,
Ко) бексаротен, БіСМИО, кармустин, ССМИ, целекоксиб, кладрибін, циклоспорин «А, цитозинарабінозид, цитоксан, дексразоксан, ЮТІС, естрамустин, ексеместан, ЕК5БОб, гемтузумаб-озогаміцин, гедреа, гідроксісечовину, ідарубіцин, інтерферон, летрозол, леустатин, леупролід, літретиноїн, мегастрол, Г-РАМ, месна, метоксален, мітраміцин, азот гірчиці, памідронат, пегадемаз, пентостатин, натрій порфімер, преднізолон, ритуксан, стрептозоцин,
ЗТІ-571, таксотером, темозоламід, ММ-26, тореміфен, третиноїн, АТКА, валрубіцин, і велбан, але не обмежуються ними. Інші приклади онкологічних препаратів, які можуть бути використані відповідно до винаходу, представлені еліптицином і аналогами або похідними еліптицина, епотилоном, внутрішньоклітинними інгібіторами кіназ, і камптотецином.
І0245| Необмежуючі приклади гиполіпідемічних агентів для лікування ліпідного захворювання або розладу, пов'язаного з підвищеними тригліцеридами, холестерином, та/або глюкозою, включають статини, фібрати, езетиміби, тіазолідиндіони, ніацин, бета-блокатори, нітрогліцерини, антагоністи кальцію, риб'ячий жир і їх суміші. (0246) Приклади противірусних препаратів охоплюють, але не обмежуються ними, абакавір, ацикловір, ацикловір, адефовір, амантадин, ампренавір, арбідол, атазанавір, атрипла, сидофовір, комбівір, дарунавір, делавірдин, диданозин, дококанол, едоксудин, ефавіренц, емтрицитабін, енфувіртид, ентекавір, інгібітори введення, фамцикловір, фіксовані дози комбінованих препаратів, фомівірсен, фосампренавір, фоскарнет, фосфонет, інгібітори злиття, ганцикловір, ібацитабін, імуновір, ідоксуридин, іміквімод, індинавір, інозин, інгібітори інтегрази, інтерферон типа І (наприклад, молекули ІЕМ-Х, такі як ТЕМ-АТ, ТЕМ-А2 ії ІЕМ-АЗ), інтерферон типа
ІЇ (наприклад, ІЄМ-у), інтерферон типа І (наприклад, ІЄМ-а, такий, як пегільований ІЄМ-са, ІЕМ-ВД,
ІЕМ-к, ТЕМ-б, ІЕМ-є, ІЕМ-т, ТЕМ-о, ї ТЕМ-С), інтерферон, ламівудин, лопінавір, ловірид, МК-0О518, маравірок, мороксидин, нелфінавір, невірапін, нексавір, аналоги нуклеозида, осельтамивір, пенцикловір, перамивір, плеконарил, подофіллотоксин, інгібітори протеази, інгібітори зворотної транскриптази, рибавірин, римантадин, ритонавір, саквинавір, ставудин, синергетичні підсилювачі, тенофовір, дизопроксил, типранавір, трифлуридин, тризивір, тромантадин, трувада, валацикловір, валганцикловір, викривірок, видарабін, вірамідин, зальцитабін, занамивір, зидовудин, його фармацевтично прийнятні солі, їх стереоізомери, їх похідні, їх аналоги і їх суміші.
М. Ліпідні частки 60 0247) У деяких аспектах цей винахід забезпечує ліпідні частки, що містять один або більше з катіонних (аміно) ліпідів або їх солей, описаних у цьому документі. У деяких варіантах реалізації, ліпідні частки за цим винаходом додатково містять один або більше некатіонних ліпідів. У інших варіантах реалізації ліпідні частки додатково містять один або більше кон'югованих ліпідів, здатних знижувати або інгібувати агрегацію часток. У додаткових варіантах реалізації ліпідні частки додатково містять один або більше активних агентів або терапевтичних агентів, таких як терапевтичні нуклеїнові кислоти (наприклад, інтерферуючі РНК, такі як міРНК). 02481 Ліпідні частки містять ліпідні бульбашки, такі як ліпосоми, але не обмежуються ними.
Як використовується у цьому документі, ліпідні бульбашки містять структуру, що містить ліпідні мембрани, що захищають від водного середовища. У конкретних варіантах реалізації, ліпідні бульбашки, що містять один або більше з катіонних ліпідів, описаних у цьому документі, використовуються для інкапсуляції нуклеїнових кислот у межах ліпідних везикул. У інших варіантах реалізації, ліпідні бульбашки, що містять один або більше з катіонних ліпідів, описаних у цьому документі, в комплексі з нуклеїновими кислотами утворюють ліпоплекси.
І0249| Ліпідні частки за цим винаходом зазвичай містять активну речовину або терапевтичний агент, катіонний ліпід, некатіонний ліпід і зв'язаний ліпід, який інгібує агрегацію часток. У деяких варіантах реалізації активна речовина або терапевтичний агент повністю інкапсулюються у ліпідній частині ліпідної частки таким чином, що активний агент або терапевтичний засіб у ліпідній частці є стійким у водному розчині, до ферментативного розкладання, наприклад, нуклеазою або протеазою. В інших варіантах реалізації ліпідні частки, описані у цьому документі, є по суті нетоксичними для ссавців, таких як люди. Ліпідні частки за цим винаходом зазвичай мають середній діаметр від близько 30 нм до близько 150 нм, від близько 40 нм до близько 150 нм, від близько 50 нм до близько 150 нм, від близько 60 нм до близько 130 нм, від близько 70 нм до близько 110 нм, або від близько 70 до близько 90 нм.
Ліпідні частки за винаходом також зазвичай мають співвідношення ліпід-терапевтичний агент (наприклад, ліпід:нуклеїнова кислота) (мас./мас. співвідношення) від близько 1:11 до близько 100:1, від близько 1:11 до близько 50:1, від близько 2:1 до близько 25:1, від близько 3:1 до близько 20:1, від близько 5:1 до близько 15:1, або від близько 5:1 до близько 10:1.
І0250| У бажаних варіантах реалізації, ліпідні частки за цим винаходом є сироватко- стабільними нуклеїновими кислотно-ліпідними частками (МР), що містять інтерферуючі РНК (наприклад, міРНК, Дайсер-субстратну дсРНК, мшРНК, аїіРНК, та/або мікроРНК), катіонний ліпід (наприклад, один або більше катіонний ліпід за формулою І або їх солей, викладеними у цьому документі), некатіонний ліпід (наприклад, суміші одного або більше фосфоліпідів і холестерина), і кон'югований ліпід, який інгібує агрегацію частки (наприклад, один або більше РЕОС-ліпідні та/або РОЇ -ліпідні кон'югати). | МР може містити, щонайменше, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10 або більше немодифікованих та/або модифікованих молекул інтерферуючих РНК. Нуклеїнові кислотно-ліпідних частки і спосіб їх одержання описані, наприклад, у патентах США МоМо 5753613; 5785992; 5705385; 5976567; 5981501; 6110745; і 6320017 і публікації РСТ номер МО 96/40964, описи яких кожен включений сюди шляхом посилання у повному обсязі для всіх ціле й. 0251) У нуклеїнових кислотно-ліпідних частках за цим винаходом нуклеїнова кислота може бути повністю інкапсульована в ліпідну частину частки, тим самим захищаючи нуклеїнову кислоту від деградації нуклеазою. У бажаних варіантах реалізації І МР, що містить нуклеїнову кислоту, таку як інтерферуючі РНК, повністю інкапсульована в ліпідній частині частки, тим самим захищаючи нуклеїнову кислоту від розкладання нуклеазою. У деяких випадках, нуклеїнова кислота в МР по суті не розкладається після дії на частку нуклеази при 377"С протягом щонайменше близько 20, 30, 45 або 60 хвилин. У деяких інших випадках, нуклеїнова кислота в ЇМР по суті не деградируется після інкубації частки в сироватці при 37"С протягом щонайменше близько 30, 45 або 60 хвилин або щонайменше близько 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 або 36 годин. У інших варіантах реалізації нуклеїнова кислота утворює комплекс з ліпідною частиною частки. Однією з переваг композицій за цим винаходом є те, що нуклеїнові кислотно-ліпідні частки, по суті, не токсичні для ссавців, таких як люди. (02521) Термін «повністю інкапсульована" вказує на те, що нуклеїнова кислота в нуклеїновій кислотно-ліпідній частці істотно не розкладається після аналізу контакту з сироваткою або нуклеазою, яка істотно розкладає вільну ДНК або РНК. У повністю інкапсульовані системи, бажано менше ніж близько 2595 від нуклеїнової кислоти у частці розкладається при лікуванні, що, як правило, розкладається 10095 вільної нуклеїнової кислоти, бажаніше менше ніж близько 1095, ії найбажаніше менше ніж близько 5 95 від нуклеїнової кислоти в частці розкладається. "Герметичне" також вказує на те, що нуклеїнові кислотно-ліпідні частки у сироватці крові є стабільними, тобто, що вони не швидко розкладаються на складові частини при введенні іп мімо. бо 0253) У контексті нуклеїнових кислот, повна інкапсуляція може бути визначена виконанням аналізу непроникності мембрани для флуоресцентного барвника, який використовує барвник, що має підвищену флуоресценцію при зв'язуванні з нуклеїновою кислотою. Конкретні барвники, такі як ОїЇїСгеєп? і КіросСгееп? (Іпмйгодеп Согр.; Сагізрай, СА) доступні для кількісного визначення ДНК плазмід, одноланцюжкових дезоксирибонуклеотидів, та/або одно- або дволанцюжкових рибонуклеотидів. Інкапсуляція визначається шляхом додавання барвника в ліпосомну композицію, виміри флуоресценції, і порівнянням її із спостережуваною флуоресценцією при додаванні невеликої кількості неіоногенного детергента. Детергент- опосередковане порушення ліпосомального бішару звільняє інкапсульовану нуклеїнову кислоту, що дозволяє йому взаємодіяти з мембраною, непроникною для фарби. Інкапсуляція нуклеїнової кислоти може бути розрахована як Е - (Іс - Ло, де І ії І» відносяться до інтенсивності флуоресценції до і після додавання детергента (див., УУпеєїЇег еї аІ., Сепе ТПег., 6:271-281 (1999)).
І0254)| У інших варіантах реалізації цей винахід відноситься до композиції нуклеїнової кислотно-ліпідної частки (наприклад, І МР), що містить множину нуклеїнових кислотно-ліпідних часток.
ІЇО255| У деяких випадках, МР композиція, що містить нуклеїнову кислоту, повністю інкапсульована у ліпідну частину часток, таких, що від близько 3095 до близько 10095, від близько 4095 до близько 10095, від близько 5095 до близько 10095, від близько 6095 до близько 10095, від близько 7095 до близько 10095, від близько 8095 до близько 10095, від близько 9095 до близько 10095, від близько 3095 до близько 9595, від близько 4095 до близько 9595, від близько 5095 до близько 9595, від близько 6095 до близько 9595, від близько 7095 до близько 9595, від близько 8095 до близько 9595, близько від 8595 до близько 9595, від близько 9095 до близько 9595, від близько 3095 до близько 9095, від близько 4095 до близько 90905, від близько 5095 до близько 9095, від близько 6095 до близько 9095, від близько 7095 до близько 9095, від близько 8095 до близько 9095, або щонайменше близько 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, 6595, 70965, 7595, 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) часток мають нуклеїнову кислоту, інкапсульовану всередині них.
І(О256| У інших випадках, МР композиція містить нуклеїнову кислоту, повністю інкапсульовану у ліпідну частину часток, таку, що від близько 3095 до близько 10095, від близько
Ко) 4095 до близько 10095, від близько 5095 до близько 10095, від близько 6095 до близько 10095, від близько 7095 до близько 10095, від близько 8095 до близько 10095, від близько 9095 до близько 10095, від близько 3095 до близько 9595, від близько 4095 до близько 9595, від близько 50905 до близько 9595, від близько 6095 до близько 9595, від близько 7095 до близько 9595, від близько 8095 до близько 9595, близько від 8595 до близько 9595, від близько 9095 до близько 9595, від близько 3095 до близько 9095, від близько 4095 до близько 9095, від близько 5095 до близько 9095, від близько 6095 до близько 9095, від близько 7095 до близько 9095, від близько 8095 до близько 9095, або щонайменше близько 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, 6595, 7095, 7590, 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) нуклеїнової кислоти, що вноситься, інкапсулюється у частках. (0257| Залежно від передбачуваного використання ліпідних часток за цим винаходом, пропорції компонентів можна змінювати, і ефективність доставки конкретної композиції може бути виміряна за допомогою, наприклад, аналізу параметра ендосомального вивільнення (ЕВР).
І0258| У конкретних варіантах реалізації цей винахід відноситься до композиції ліпідної частки (наприклад, ГМР), що містить множину ліпідних часток, описаних у цьому документі, і антиоксиданти. В деяких випадках, антиоксиданти у складі ліпідних часток зменшують, запобігають та/або інгібують розкладання катіонного ліпіду, присутнього у ліпідній частці. У випадках, коли активний агент є терапевтичною нуклеїновою кислотою, такою як інтерферуючі
РНК (наприклад, міРНК), антиоксидант у ліпідній частці композиції зменшує, запобігає та/або інгібує розкладання корисного навантаження нуклеїнової кислоти, наприклад, за рахунок скорочення, запобігання та/або інгібування утворення аддуктів між нуклеїновою кислотою і катіонним ліпідом. Необмежуючі приклади антиоксидантів охоплюють гідрофільні антиоксиданти, такі як хелатуючі агенти (наприклад, хелати металів, такі як етилендіамінтетраоцтову кислоту (ЕЮОТА), цитрат і тому подібне), ліпофільні антиоксиданти (наприклад, ізомери вітаміну Е, поліфеноли, і тому подібне), їх солі; і їх суміші. Якщо необхідно, антиоксидант, як правило, присутній у кількості, достатній для того, щоб запобігти, інгібування та/або зменшити розкладання катіонного ліпіду та/"або справжнього активного агента у частці, наприклад, щонайменше близько 20 мМ ЕОТА, або її сіль, або щонайменше близько 100 мМ цитрату, або його солі. Антиоксидант, такий як ЕОТА і цитрат, може бути включений на будь- бо якій стадії або у декілька етапів у процесі формування часток ліпідів, описаних у розділі МІ
(наприклад, до, під час і після формування ліпідної частки). 0259) Додаткові варіанти реалізації, пов'язані з методами запобігання деградації катіонних ліпідів та/або активних агентів (наприклад, терапевтичних нуклеїнових кислот), присутні у ліпідних частках, композиціях, що містять ліпідні частки, стабілізовані за допомогою цих способів, способи одержання цих часток ліпідів і способи доставки та/або введенні цих ліпідних часток описані в міжнародній заявці РСТ/СА2010/001919, що називається "ЗМАЇ Р. композиції, що містять антиоксиданти", поданій 1 грудня 2010 року, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
А. Катіонні ліпіди (02601 Будь-який з нових катіонних ліпідів за формулою І або його солі, викладені в цьому документі, можуть бути використані в ліпідних частках за цим винаходом (наприклад, І МР), окремо або в комбінації з одним або декількома іншими видами катіонних ліпідів або видами некатіонних ліпідів. 02611) Інші катіонні ліпіди або їх солі, які також можуть бути включені в ліпідні частки за цим винаходом, охоплюють 1,2-дилінолеїлокси-М,М-диметиламінопропан (ОСіпОМА), 1,2- диліноленілокси-М,М-диметиламінопропан (ОЇ епоМА), 1,2-ди-у-ліноленілокси-М,М- диметиламінопропан (у-ОГепОМА), 1,2-дилінолеїлокси-(М,М-диметил)-бутил-4-амін (С2-
ОЦиОМА), 1,2-дилінолеїлокси-(М,М-диметил)-бутил-4-амін. (С2-ОГ іпОрАР), 2,2-дилінолеїл-4-(2- диметиламіноетил)-(1,3|-діоксалан (ОГГіп-К-С2-ОМА; також відомі як "ХТС2" або "С2КУ, 2,2- дилінолеїл-4-(З-диметиламінопропіл)-(1,3|-діоксалан (ОГіп-К-С3-ОМА; "СЗК"У), 2,2-дилінолеїл-4- (4-диметиламінобутил)-(1,3|-діоксалан (ОГСіп-К-С4-ОМА; "б4КУ, 2,2-дилінолеїл-5- диметиламінометил-|1,3|-діоксан (ОГСіп-Кб-ОМА), 2,2-дилінолеїл-4-М-метилпепіазин-|1,3|- діоксалан (ОГіп-К-МР2), 2,2-дилінолеїл-4-диметиламінометил-|1,3|-діоксалан (ОГіп-К-ОМА), 2.,2- діолеоїл-4-диметиламінометилі-|1,3|-діоксалан (0О-К-ОМА), 2,2-дистеароїл-4- диметиламінометил-|1,3|-діоксалан. (05-К-ОМА), 2,2-дилінолеїл-4-М-морфоліно-(1,3|-діоксалан (ОЦи-К-МА), /2,2-дилінолеїл-4-триметиламіно-(1,3|-діоксалан хлорид (0 іп-К-ТМА.СІ), 2,2- дилінолеїл-4,5-біс(диметиламінометил)-(1,3|-діоксалан (ОСіп-К2-ОМА), 2,2-дилінолеїл-4- метилпепіазин-|1,3|-діоксалан (0-ІГ іп-К-М-метилпепіазин) (627, 97, 287, 312)-гептатриаконта- 6,9,28,31-тетраен-19-іл 4-(диметиламіно)бутаноат (ОО іп-М-С3-ОМА; "МС3"), дилінолеїлметил-3- диметиламінопропіонат (ОО іп-М-С2-ОМА; також відомі як ОСІ іп-М-К-ОМА або 0 їп-М-ОМА), 1,2- діоеилкарбамоїлокси-3-диметиламінопропан (00-С-ОАР), 1,2-димиристолеоїл-3- диметиламінопропан (ОМОАР), 1,2-діолеоїл-З-триметиламінопропан хлорид (ООТАР.СІ), 1,2- дилінолеїлкарбамоїлокси-3-диметиламінопропан (ОСіп-С-ОАР), 1,2-дилінолетокси-3- (диметиламіно) ацетоксипропан (ОГіп-САС), 1,2-дилінолеїокси-3-морфолінопропан (ОО іп-МА), 1,2-дилінолеїл-З3-диметиламінопропан (ОГіпОрАР), 1,2-дилінолеїлтіо-3-диметиламінопропан (ОЦа-5-ОМА), 1-лінолеоїл-2-лінолеоїлоксо-3-диметиламінопропан (ОСіп-2-ОМАР), 1,2- дилінолеїлокси-З-триметиламінопропан хлоридна сіль (ОГіп-ТМА.СІ), 1,2-дилінолеоїл-3- триметиламінопропан хлоридна сіль (ОГіп-ТАР.СІ), 1,2-дилінолеїлокси-3-(М- метилпіперазино)пропан (ОГіп-МР), 3-(М,М-дилінолеїламіно)-1,2-пропандіол (ОГіпАР), 3-(М,М- діолеїламіно)-1,2-пропандіо (ООАР), 1,2-дилінолеїлоксо-3-(2-М,М-диметиламіно)етоксипропан (ОЦп-ЕС-ОМА), З-диметиламіно-2-(холест-5-ен-3-бета-оксибутан-4-окси)-1-(цис, цис-9,12- октадієнокси)дупропан (СііпОМА), 2-|5'-(холест-5-ен-3-бета-окси)-3'-оксапентокси)-3-димети-1- (цис,цис-9',1-2'-октадекадієнокси)упропан (СрііпоОМА), М,М-диметил-3,4-діолеїлоксбензиламін (ОМОВА), 1,2-М,М'-діолеїлкарбаміл-З3-диметиламінопропан (роОсагррАР), 1,2-М,М'- дилінолеїлкарбаміл-З-диметиламінопропан (ОГіпсагбОАР), /М,М-діолеїл-М,М-диметиламоній хлорид (БОБАС), 1,2-діолеїлокси-М,М-диметиламінопропан (ОМА), 1,2-дистеарилокси-М, М- диметиламінопропан (ОБОМА), М-(1-(2,3-діолеїлокси)пропіл)-М,М,М-триметиламоній хлорид (СОТМА), М,М-діастерил-М,М-диметиламоній бромід (О0БАВ), М-(1-(2,3-діолеїлокси)пропіл)-
М,М,М-триметиламоній хлорид (ООТАР), 3-(М-(М';М'-диметиламіноетан)-карбамоїл) холестерол (0С-Хол), М-(1,2-диміристилоксипроп-3-іл)-М,М-диметил-М-гідроксіетил амоній бромід (ОМКІЕ), 2,3-діолеїлокси-М-(2(спемін-карбоксамідо)етил|-М,М-диметил-1-пропанамонійтгрифлюороацетат (ОБРА), діоктадециламідогліцил спермін (БО5), їх аналоги, і їх суміші, але не обмежуються ними. (02621 Додаткові катіонні ліпіди або їх солі, які можуть бути присутніми в ліпідних частках, описаних у цьому документі, містять нові катіонні ліпіди, такі як СР-Ї єепМОЗ, СР-у-І епМОЗ, СтР-
МОЗ, СР-ОЇ еп-С2К-ОМА, СР-УОЇ еп-С2К-ОМА, СР-С2К-ОМА, СР-ПООМА, СР-ОРетоООМА, СрР-
РОЦпОМА, СР-ОЇ епОМА, СР-У0і епОМА, їх аналоги, а також їх комбінації. Додаткові катіонні ліпіди або їх солі, які можуть бути присутніми в ліпідних частках, описаних у цьому документі, містять МОЗ аналоги, такі як ГепмМео3, у-їеєепмМОоЗ3, МСОЗМО, МС2С, МС2МС, МОЗ тіоефір, МСЗ 60 ефір, МС4 ефір, МОЗ алкін, МСЗ амід, Рап-МСЗ3, Рап-МС4, Рап-МСО5, а також їх комбінації.
Додаткові катіонні ліпіди або їх солі, які можуть бути присутніми у ліпідних частках, описаних у цьому документі, містять нові катіонні ліпіди, описані в міжнародній заявці на патент
РСТ/СА2010/001029, що називається "Покращені катіонні ліпіди і способи доставки нуклеїнових кислот", поданій 30 червня 2010 р. Додаткові катіонні ліпіди або їх солі, які можуть бути присутніми у ліпідних частках, описаних у цьому документі, містять катіонні ліпіди, описані у заявці на патент США Мо 2009/0023673. Розкриття кожного з цих патентних документів включено у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІЇ0О263| У деяких варіантах реалізації додатковий катіонний ліпід утворює сіль (бажано кристалічну сіль) з одним або більше аніоном. У одному конкретному варіанті реалізації додатковий катіонний ліпід є оксалатовою (наприклад, геміоксалат) сіллю, яка бажано є кристалічною сіллю. (0264) Синтез катіонних ліпідів, таких як ОГіпОМА їі ОГепОМА, а також додаткових катіонних ліпідів описаний у заявці на патент США Мо 2006/0083780, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0265| Синтез катіонних ліпідів, таких як уУ-ОЇепОМА, С2-айпата і С2-аїйпаар, а також додаткових катіонних ліпідів описані у міжнародній заявці на патент РСТ/СА2010/001029, що називається "Покращені катіонні ліпіди і способи доставки нуклеїнових кислот", поданій 30 червня 2010 року, опис якої включений у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0266) Синтез катіонних ліпідів, таких як БІ ІМ-К-ОМА, а також додаткових катіонних ліпідів описаний у РСТ публікації УМО 09/086558, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0267| Синтез катіонних ліпідів, таких як ОО іп-К-С2-ОМА, 0 іп-К-С3-ЮОМА, ОО іп-К-С4-ОМА,
ОЦа-Кб-ОМА, ОЇ іп-К-МРЯ, 0О-К-ОМА, 05-К-ОМА, ОЇ іп-К-МА, ОО іп-К-ТМА.СІ, Оіп-К2-ОМА, 0-
Мп-К-М-метилпіперзин, ОГіп-М-С2-ОМА, 0О-С-ВЮАР, ОМОАР, і СОТАР.СІ, а також додаткових катіонних ліпідів описаний у публікації РСТ МО 2010/042877, що називається "Покращені аміноліпіди і способи доставки нуклеїнових кислот», поданій 9 жовтня 2009 року, розкриття який включено в цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0268) Синтез ОІ іп-М-С3-ОМА, а також додаткових катіонних ліпідів, описаний наприклад, у
Зо попередній заявці США 61/384050, поданій 17 вересня 2010 року, що називається "Нові катіонні ліпіди і способи їх застосування", розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0269) Синтез катіонних ліпідів, таких як СО іп-С-ОАР, ОО іпрАС, ОГіпМА, ОО іпбАР, ПІ іп-5-
ОМА, 0 іп-2-ОМАР, ОГіп ТМА.СІ, ОГСіпТАР.СІ, ОСіпМРА, ОГіпАР, ООАР, ії і іп-ЕС-ОМА, а також додаткових катіонних ліпідів описані у РСТ публікації УМО 09/086558, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0270| Синтез катіонних ліпідів, таких як СГіІпОМА, а також додаткових катіонних ліпідів описані в заявці на патент США Мо 2006/0240554, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І02711| Синтез ряду інших катіонних ліпідів і родинних аналогів були описані в патентах США
Мо 5208036; 5264618; 5279833; 5283185; 5753613 і 5785992; і публікації РСТ Мо МУО 96/10390, описи кожного включені в цей документ шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Крім того, ряд комерційних препаратів катіонних ліпідів можуть бути використані, такі як, наприклад
ПРОЕЕСТІМ? (у тому числі ПОТМА і ОРЕ, доступний від СОПІВСО/ВЕІ); ПРОЕЕСТАМІНЄЯ (у тому числі ПООБРА і ОРЕ, доступний від СІВСО/ВКІ); і ТКАМ5ЕЕСТАМ? (у тому числі 0ОС5, доступний від Рготеда Согр.). (0272) У деяких варіантах реалізації цього винаходу катіонний ліпід містить від близько 50 моль 95 до близько 90 моль 95, від близько 50 моль 90 до близько 85 моль 95, від близько 50 моль 95 до близько 80 моль 95, від близько 50 моль 95, або близько 75 моль 95, від близько 50
БО моль 95 до близько 70 моль 95, від близько 50 моль 95 до близько 65 моль 95, від близько 50 моль 95 до близько 60 моль 95, від близько 55 моль 95 до близько 65 моль 95, або від близько 55 моль 95 до близько 70 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. У конкретних варіантах реалізації катіонний ліпід містить близько 50 моль 95, 51 моль 95, 52 моль 95, 53 моль 95, 54 моль 95, 55 моль 95, 56 моль 95, 57 моль 95, 58 моль 95, 59 моль 95, 60 моль 95, 61 моль 95, 62 моль 95, 63 моль 95, 64 моль 95 або 65 моль 95 (або будь-якої їх фракції) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. (0273) В інших варіантах реалізації катіонний ліпід містить від близько 2 моль 95 до близько 60 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 50 моль 95, від близько 10 моль 95 до близько 50 моль 95, від близько 20 моль 95, або близько 50 моль 95, від близько 20 моль 95 до близько 40 60 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 40 моль 95, або близько 40 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
І0274| Додаткові відсотки і діапазони катіонних ліпідів, придатних для використання у ліпідних частках за цим винаходом, описані, наприклад, у РСТ публікації УМО 09/127060, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0275) Слід розуміти, що відсоток катіонного ліпіду, присутнього у ліпідних частках, за цим винаходом, є кількістю мішеней, і що фактична кількість катіонного ліпіду, присутнього в композиції, може змінюватись, наприклад, у межах ж 5 моль 95. Наприклад, в 1:57 препараті ліпідної частки (наприклад, І МР), кількість мішеней катіонного ліпіду складає 57,1 моль 95, але фактична кількість катіонного ліпіду може бути х 5 моль 95, х 4 моль 95, 5 З моль 9б, ж 2 моль 95, 1 моль 95, ж 0,75 моль 95, ж 0,5 мольбОо, ж 0,25 моль 95 або х 0,1 моль 95 цієї кількості мішеней, причому залишок препарату складений з інших ліпідних компонентів (доданих до 100 моль 95 загальних ліпідів, присутніх у частці).
В. Некатіонні ліпіди
І0276| Некатіонні ліпіди, що використовуються у ліпідних частках за цим винаходом (наприклад, І МР), можуть бути будь-якими з множини нейтральних незаряджених, цвіттеріонних або аніонних ліпідів, здатних утворювати стабільний комплекс.
І0277| Необмежуючі приклади некатіонних ліпідів охоплюють фосфоліпіди, такі як лецитин, лізолецитин, фосфатидилетаноламін, фосфатидилсерин, лізофосфотидилетаноламін, фосфатидилінозитол, сфінгомієлін, яєчний сфінгомієлін (Е5БМ), цефалін, кардіоліпін, фосфатидну кислоту, цереброзид, дицетилфосфат, дистеароїлфосфатидилхолін (О5РС), діолеоїлфосфотидилхолін (ОРОС), дипальмітоїлфосфатидилхолін (ОРРО), діолеоїлфосфотидилгліцерол (ОРГ), дипальмітоїлфосфатидилгліцерол (ОРРС), діолеоїлфосфотидилетаноламін (СОРЕ), пальмітоїлолеоїл-фосфатидилхолін (РОРОС), пальмітоїлолеоїл-фосфатидилетаноламін (РОРЕ), пальмітоїлолеоїл-фосфатидилгліцерин (РОРС), діолеоїлфосфотидилетаноламін /4-(М-малеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат (ОРЕ-МАМ, дипальмітоїл-фосфатидилетаноламін (ОРРЕ), диміристоїл- фосфатидилетаноламін (ОМРЕ), дистеароїл-фосфатидилетаноламін (О5РЕ), монометиловий- фосфатидилетаноламін, диметил-фосфатидилетаноламін, дієлаїдоїл-фосфатидилетаноламін (ОЕРЕ), стеароїлолеоїл-фосфатидилетаноламін (БОРЕ), лізофосфатидилхолін,
Зо дилінолеоїлфосфотидилхолін і їх суміші. Інші діадилфосфотидилхолін і діацилфосфотидилетаноламін фосфоліпіди також можуть бути використані. Ацильні групи у цих ліпідах бажано є ацильними групами, одержаними з жирних кислот, що мають С:1о-Сг24 вуглецеві ланцюги, наприклад, лаурил, міристоїл, пальмітоїл, стеароїл або олеоїл. (0278) Додаткові приклади некатіонних ліпідів охоплюють стерини, такі як холестерин і його похідні. Необмежуючі приклади похідних холестерину охоплюють полярні аналоги, такі як 5а- холестанол, 5рВ-копростанол, холестерил- (2'-гідрокси)етил ефір, холестерил-(4-гідрокси)бутил ефір, і 6-кетохолестанол; неполярні аналоги, такі як 5а-холестан, холестенон, 5а-холестанон, 5В-холестанон і холестерил деканоат; і їх суміші. У бажаних варіантах реалізації похідне холестерину є полярним аналогом, таким як холестерил-(4-гідрокси)бутил ефір. Синтез холестерил-(2'-гідрокси)етил ефіру описаний у РСТ публікації МО 09/127060, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
І0279| У деяких варіантах реалізації, некатіонний ліпід, присутній у ліпідній частці (наприклад, МР), містить або складається з суміші одного або більше фосфоліпідів і холестерина або його похідного. В інших варіантах реалізації, некатіонний ліпід, присутній у ліпідній частці (наприклад, І МР), містить або складається з одного або більше фосфоліпідів, наприклад, композиція без холестерину з ліпідною часткою. В інших варіантах реалізації, некатіонний ліпід, присутній у ліпідній частці (наприклад, МР), містить або складається з холестерину або його похідного, наприклад, препарату без фосфоліпіду з ліпідною часткою.
І0280)| Інші приклади некатіонних ліпідів, придатних для використання у цьому винаході, включають безфосфорні ліпіди, такі як, наприклад, стеариламін, додециламін, гексадециламін, ацетил пальмітат, гліцеролрицинолеат, гексадецил стеарат, ізопропілміристат, амфотерні акрилові полімери, триетаноламін лаурил-сульфат, алкіл-арил сульфат, поліетилоксилатний амід жирних кислот, діоктадецилдиметил бромід, кераміди, сфингомієлин, і тому подібне. (02811 У деяких варіантах реалізації, некатіонний ліпід містить від близько 10 моль 95 до близько 60 моль 95, від близько 20 моль 95 до близько 55 моль 95, від близько 20 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 20 моль 95 до близько 40 моль 95, від близько 25 моль 95 до близько 50 моль 95, від близько 25 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 30 моль 905 до близько 50 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 40 мольоо, від близько 35 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 37 моль 90 до 60 близько 42 моль 95, або близько 35 моль 95, 36 моль 95, 37 моль 95, 38 моль 95, 39 моль 95, 40 моль 95, 41 моль 95, 42 моль 95, 43 моль 95, 44 моль 95 або 45 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. (02821 У варіантах реалізації, де ліпідні частки містять суміш фосфоліпідів і холестерину або похідні холестерину, суміш може містити аж до близько 40 моль 95, 45 моль 95, 50 моль 95, 55 моль 95 або 60 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. 0283) У деяких варіантах реалізації, фосфоліпідний компонент у суміші може складати від близько 2 моль 906 до близько 20 моль 95, від близько 2 моль 95 до близько 15 моль 95, від близько 2 моль 95 до близько 12 моль 95, від близько 4 мольдо до близько 15 моль 9», або від близько 4 моль 95 до близько 10 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці У деяких бажаних варіантах реалізації компонент фосфоліпіду у суміші складає від близько 5 моль 95 до близько 10 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 9 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 8 моль 95, від близько б моль 905 до близько 9 моль 95, від близько 6 моль 95 до близько 8 моль 95 або від близько 5 моль 95, 6 моль
Фо, 7 моль 95, 8 моль 95, 9 моль 95, або 10 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Як необмежуючий приклад, 1:57 ліпідна композиція часток, що містить суміш фосфоліпідів і холестерину, може містити фосфоліпід, такий як ОРРС або О5РС, близько 7 моль 95 (або будь-якої їх фракції), наприклад, у суміші з холестерином або похідним холестерину при близько 34 моль 95 (або будь-якої їх фракції) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. В іншому необмежуючому прикладі, 7:54 ліпідна композиція часток, що містить суміш фосфоліпідів і холестерину, може містити фосфоліпід, такий як ОРРС або О5РС, близько 7 моль 95 (або будь-якої їх фракції), наприклад, у суміші з холестерином або похідним холестерину при близько 32 моль 95 (або будь-якої їх фракції) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. (0284) У інших варіантах реалізації компонент холестерину в суміші може складати від близько 25 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 25 моль 95 до близько 40 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 40 моль 95, від близько 27 моль 95 до близько 37 мольоо, від близько 25 моль 95 до близько 30 мольо»о, або від близько 35 моль 95 до близько 40 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. У деяких бажаних варіантах реалізації компонент холестерину в суміші складає від близько 25 моль 95 до близько 35 моль 95, від близько 27 моль до до близько 35 моль 95, від близько 29 моль 95 до близько 35 моль 95, від близько 30 моль 90 до близько 35 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 34 моль 95, від близько 31 моль 95 до близько 33 моль 95, або близько 30 моль 95, 31 моль 95, 32 моль 95, 33 моль 95, 34 моль 95, або моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у 35 частці. Як правило, 1:57 ліпідна композиція часток, що містить суміш фосфоліпідів |і холестерину, може містити холестерин або похідне холестерину близько 34 моль 95 (або будь- якій їх фракції), наприклад, у суміші з фосфоліпідом, таким як ОРРС або О5РС, при близько 7 моль 95 (або будь-якій їх фракції) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Як правило, 7:54 ліпідна композиція часток, що містить суміш фосфоліпідів і холестерину, може містити холестерин або похідне холестерину близько 32 моль 95 (або будь-якій їх фракції), наприклад, у суміші з фосфоліпідом, таким як ОРРС або ЮО5РС, при близько 7 моль 95 (або будь-якій їх фракції) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. (0285) У варіантах реалізації, де ліпідні частки є безфосфоліпідними, холестерин або його похідне можуть містити до близько 25 моль 95, 30 моль 95, 35 моль 95, 40 моль 95, 45 моль 95, 50 моль 95, 55 моль 95, або 60 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. (0286) У деяких варіантах реалізації, холестерин або його похідне фосфоліпіду у безліпідній частці може складати від близько 25 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 25 моль 905 до близько 40 моль 95, від близько 30 моль 95, або близько 45 моль 95, від близько 30 моль 90 до близько 40 моль 95, від близько 31 моль 95 до близько 39 моль 95, від близько 32 моль 95 до
БО близько 38 моль 95, від близько 33 моль 95 до близько 37 моль 95, від близько 35 моль 95 до близько 45 моль 95, від близько 30 моль 95 до близько 35 моль 95, від близько 35 моль 95 до близько 40 моль 95, або близько 30 моль 95, 31 моль 95, 32 моль 95, 33 моль 95, 34 моль 95, 35 моль 95, 36 моль 95, 37 моль 95, 38 моль 95, 39 моль 95 або 40 моль 95 (або будь-якій їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. Як не обмежуючий приклад, композиція часток ліпідів 1:62 може містити холестерин при близько 37 моль 95 (або будь-якій їх фракції) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. В іншому необмежуючому прикладі, композиція часток ліпідів 7:58 може містити холестерин при близько 35 моль 95 (або будь-якій їх фракції) від загальної кількості ліпідів, що знаходяться в частці. (0287) У інших варіантах реалізації, не-катіонний ліпід містить від близько 5 моль 95 до 60 близько 90 моль 95, від близько 10 моль 95 до близько 85 моль 95, від близько 20 моль 95 до близько 80 моль 95, близько 10 моль 95 (наприклад, лише фосфоліпід), або близько 60 моль 905 (наприклад, фосфоліпід і холестерин або його похідне) (або будь-яку їх фракцію або їх діапазон) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
І0288| Додаткові відсотки і діапазони некатіонних ліпідів, придатні для використання в ліпідних частках за цим винаходом, описані, наприклад, у РСТ публікації УМО 09/127060, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання для всіх цілей.
І0289| Слід розуміти, що відсоток некатіонних ліпідів, присутніх у ліпідних частках за цим винаходом, є кількістю мішеней, і що фактична кількість присутніх некатіонних ліпідів у композиції може змінюватись, наприклад, на ж 5 моль 95. Наприклад, у 1:57 препараті ліпідної частки (наприклад, І МР), кількість мішеней фосфоліпіду складає 7,1 моль 95 і кількість мішеней холестерину складає 34,3 моль 95, але фактична кількість фосфоліпідів може бути ж 2 мольбоб, ж 1,5 моль», ж 1 моль 95, 5 0,75 мольбОо, ж 0,5 мольбо, х 0,25 моль 95, або х 0,1 моль 95 цієї суми мішеней, а фактична кількість холестерину може бути хх З мольоб, 5 2 мольоо, ж 1 моль», ж 0,75 моль 95, - 0,5 мольУб, ж 0,25 мольбо, або ж 0,1 мольоо цієї суми мішеней, причому залишок препарату складений з інших ліпідних компонентів (до додавання 100 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці). Аналогічним чином, у 7:54 препараті ліпідних часток (наприклад, І МР), кількість мішеней фосфоліпіду складає 6.75 мольбОо і кількість мішеней холестерину складає 32,43 мольоо, але фактична кількість фосфоліпіду може бути 5 2 моль 95, 1,5 моль 95, - 1 моль 95, ж 0,75 моль 95, 5 0,5 моль 95 ж 0,25 моль 95 або х 0,1 моль 95 цієї кількості мішеней, і фактична кількість холестерину може бути ж З мольбоб, 5 2 моль 95, ж 1 моль
Фо, - 0,75 моль 95, ж 0,5 моль 95, х 0,25 моль 95, або ж 0,1 моль 95 цієї кількості мішеней, причому залишок препарату складений з інших ліпідних компонентів (додавання до 100 моль 95 від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці).
С. Ліпідні кон'югати
ІО290| На додаток до катіонних і некатіонних ліпідів, ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) можуть додатково містити ліпідний кон'югат. Кон'югований ліпід є корисним у тому, що він запобігає агрегації часток. Прийнятні ліпідні кон'югати охоплюють РЕС-кон'югати ліпідів, РО2-ліпідні кон'югати, АТТА-ліпідні кон'югати, катіонно-полімерно-ліпідні кон'югати (СРІ)), а також їх суміші, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації частки містять
Ко) або РЕС-кон'югати ліпідів, або АТТА-ліпідні кон'югати разом із СРІ. 0291) У бажаному варіанті реалізації ліпідний кон'югат є РЕС-ліпідом. Приклади РЕО-ліпідів охоплюють РЕС, поєднаний із діалкілоксипропілами (РЕС-ОАА), як описано, наприклад, у РСТ публікації УМО 05/026372, РЕС, поєднаний з діацилгліцеринами (РЕС-ЮОАС), як описано у, наприклад, публікаціях заявок на патент США МоМо 2003/0077829 і 2005/008689, РЕС, поєднаний з фосфоліпідами, такими як фосфатидилетаноламін (РЕС-РЕ), кон'югований з РЕО церамід, як описано, наприклад, у патенті США Мо 5885613, кон'югований з РЕС холестерин або його похідні, а також їх суміші, але не обмежуються ними. Розкриття цих патентних документів включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
Додаткові РЕС-ліпіди, придатні для використання у цьому винаході, охоплюють, без обмеження, тРЕС2000-1,2-ді-О-алкіл-зп3-карбомоїлгліцерид (РЕБ-С-ЮОМО). Синтез РЕОС-О- ромо описаний у РСТ публікації УМО 09/086558, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Проте, додаткові прийнятні РЕОС-кон'югати ліпідів містять, без обмеження, 1-І8-1 2-диміристоїл-З-пропанокси)-карбоксамідо-3",6'- діоксаоктанілікарбамоїл-ю-метил-полі(етилгліколь) (2КРЕС-ОМО). Синтез 2КРЕС-ОМО описаний у патенті США Мо 7404969, опис якого включений у цьому документі шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0292) РЕС є лінійним, водорозчинним полімером етилену РЕС ланок, що повторюються, з двома кінцевими гідроксильними групами. РЕС класифікують по їх молекулярній масі; наприклад, РЕС 2000 має середню молекулярну масу близько 2000 дальтон, і РЕС 5000 має середню молекулярну масу близько 5000 дальтон. РЕС є комерційно доступними від бідта
Спетіса! Со. і інших компаній, і охоплюють наступні: монометоксиполіетиленгліколь (МеРЕеЕС-
ОН), монометоксиполіетиленгліколя-сукцинат (МеРЕсС-5), монометоксиполіетиленгліколя- сукцинімідил сукцинат (МеРЕС-5-МН5), монометоксиполіетиленгліколя-амін (МеРЕС-МН»5г), монометоксиполіетиленгліколя-трезилат (МеРЕО-ТКЕЗ5), монометоксиполіетиленгліколя- імідазоліл-карбоніл (МеРЕС-ІМ), але не обмежуються ними, а також такі сполуки, що містять кінцеву гідроксильну групу замість термінальної метокси групи (наприклад, НО-РЕС-5, НО-РЕВ- 5-МН5, НО-РЕС-МН», і так далі). Інші РЕС, такі як описані у патентах США МоМо 6774180 і 7053150 (наприклад, МРЕФС(20 кДа)амін) також можуть бути використані для одержання РЕС- кон'югатів ліпідів для реалізації цього винаходу. Опис цих патентів включені в даний опис бо шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Крім того, монометоксиполіетиленгліколь оцтової кислоти (МеРЕС-СН.СООН) особливо корисний для одержання РЕС-кон югатів ліпідів, у тому числі, наприклад, РЕО-кон'югатів ВСАА. (0293) РЕС фрагмент з РЕОС-ліпідних кон'югатів, описаних у цьому документі, може містити середню молекулярну масу в діапазоні від близько 550 дальтон до близько 10000 дальтон. У деяких випадках, фрагмент РЕС має середню молекулярну масу від близько 750 дальтон до близько 5000 дальтон (наприклад, від близько 1000 дальтон до близько 5000 дальтон, близько від 1500 дальтон до близько 3000 дальтон, близько від 750 дальтон до близько 3000 дальтон, від близько 750 дальтон до близько 2000 дальтон, і так далі). У бажаних варіантах реалізації винаходу фрагмент РЕС має середню молекулярну масу близько 2000 дальтон або близько 750 дальтон.
І0294| В деяких випадках, РЕС може бути необов'язково заміщений алкільною, алкокси, ацильною, або арильною групою. РЕС може бути кон'югований безпосередньо з ліпідом або може бути зв'язаний з ліпідами за допомогою лінкерної частини молекули. Будь-який зв'язуючий фрагмент, призначений для сполуки РЕС до ліпіду, може бути використаний, у тому числі, наприклад, не-ефір, що містить лінкерні фрагменти і складні ефіри, що містять лінкерні фрагменти. У бажаному варіанті реалізації зв'язуючий фрагмент є не-ефіром, що містить лінкерну групу. Як використано в цьому описі, термін "не-ефір, що містить зв'язуючий фрагмент" відноситься до лінкера, який не містить карбоксильний ефірний зв'язок (ОС(О)-). Прийнятні не- ефіри, що містять лінкерні фрагменти, охоплюють амідо (С(О)МН-), аміно (-МА-), карбоніл (С(О)- 20), карбамат (-МНОС(0О)0-), сечовини (-МНОС(О)МН-), дисульфід (-55-), ефір (-0-), сукциніл (- (ФФОССНСНеС(О)-), сукцинамідил (-«МНС(О)СНа.СНеС(О)МН-), ефір, дисульфід, а також їх комбінації (наприклад, лінкери, що містять як карбамат лінкерний фрагмент, так і амідо лінкер).
У бажаному варіанті реалізації, карбаматний лінкер використовується для сполуки РЕС з ліпідом.
І0295| У інших варіантах реалізації, складний ефір, що містить зв'язуючий фрагмент використовується для приєднання РЕС до ліпіду. Прийнятні складні ефіри, що містять лінкерні групи, охоплюють, наприклад, карбонат (ОС(Ф)0-), сукциноїл, фосфатні ефіри (-0О-(0)-О-РОН), сульфонатні складні ефіри і їх комбінації.
І0296| Фосфатіділетаноламіни, що мають різні групи ацилових ланцюгів різної довжини
Зо ланцюга і міри насичення, можуть бути кон'юговані з РЕС із одержанням ліпідного кон'югата.
Такі фосфатидилетаноламіни є комерційно доступними, або можуть бути ізольовані або синтезовані з використанням звичайних способів, відомих фахівцям у даній області. Бажані фосфатидилетаноламіни містять насичені або ненасичені жирні кислоти 3з довжиною вуглецевого ланцюга в інтервалі від Сто до Сго. Фосфатіділетаноламіни з одноатомними або диненасиченими жирними кислотами і суміші насичених і ненасичених жирних кислот також можуть бути використані. Прийнятні фосфатидилетаноламіни охоплюють диміристоїлфосфатидилетаноламін (ОМРЕ), дипальмітоїл-фосфатидилетаноламін (ОРРЕ), діолеоїлфосфотидилетаноламін (ОРЕ) і дистеароїлфосфатидилетаноламін (О5РЕ), але не обмежуються ними.
І0297| Термін «АТТА» або «поліамід» охоплює, без обмеження, сполуки, описані в патентах
США МоМо 6320017 і 6586559, описи яких включені у цьому документі шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Ці сполуки охоплюють сполуки, що мають формулу: ї я
Е МА (СТсноюув(СНІ/ С «МНС о в б/в де К є членом, вибраним з групи, що складається з водню, алкілу і ацила; ЕК! є членом, вибраним з групи, що складається з водню і алкілу; або необов'язково, Кі К' і атом азоту, до якого вони приєднані, утворюють азидо фрагмент; К? є членом групи, вибраним з водню, необов'язково заміщеного алкілу, необов'язково заміщеного арила і бічного ланцюга амінокислоти; КЗ є членом, вибраним з групи, що складається з водню, галогену, гідроксі, алкокси, меркапто, гідразино, аміно і МЕУВ», де К" і Е? незалежно є воднем або алкілом; п приймає значення від 4 до 80; т приймає значення від 2 до 6; р приймає значення від 1 про 4; і д приймає значення 0 або 1. Фахівцям у даній області вочевидь, що і інші поліаміди можуть бути використані у сполуках для реалізації цього винаходу.
І0298| Термін "діацилгліцерин" або "САС" охоплює сполуку, що має 2 жирні ацильні ланцюги, К!' ії К-, обидва з яких незалежно один від одного мають від 2 до 30 атомів вуглецю, сполучених з гліцерином в 1 і 2-положенні за допомогою ефірного зв'язку. Ацильні групи можуть бути насиченими або мати різну міру ненасиченості. Прийнятні ацильні групи охоплюють лауроїл (Сг), міристоїл (Са), пальмітоїл (Св), стеароїл (Св) і ікозоїл (Сго), але не обмежуються ними. У бажаних варіантах реалізації, КЕ і Б? є однаковими, тобто КЕ! і 22 обидва є міристоїлом (тобто, диміристоїлом), Б' і К? обидва є стеароїлом (тобто, дистеароїлом) і так далі.
Діацилгліцеріни мають наступну загальну формулу:
Го)
ЩО о ня снІОют (1). (02991 Термін "діалкілоксипропіл" або "САА" охоплює сполуки, що мають 2 алкільні ланцюги,
В'ї К-, обидві з яких незалежно один від одного мають від 2 до 30 атомів вуглецю. Алкільні групи можуть бути насиченими або мати різну міру ненасиченості. Діалкілоксипропіли мають наступну загальну формулу: ноя ! сно!
ОН ру
ЇОЗО0І| У бажаному варіанті реалізації винаходу РЕС-ліпід є кон'югатом РЕС-ВОАА, що має наступну формулу: снОо-в ще нале де ЕК" і В? незалежно вибрані і представлені довголанцюжковими алкільними групами, що мають від близько 10 до близько 22 атомів вуглецю; РЕС є поліетиленгліколем; і Ї. є не-ефіром, що містить лінкерну частину, або складним ефіром, що містить лінкер, як описано вище.
Алкільні групи з довгим ланцюгом можуть бути насиченими або ненасиченими. Прийнятні алкільні групи охоплюють децил (Со), лаурил (Сіг2), міристил (Са), пальмітил (Счє), стеарил (Стів), і ікозил (Сго), але не обмежуються ними. У бажаних варіантах реалізації, Кі К? є однаковими, тобто, К' ії Кг обидва є міристилом (тобто, диміристилом), К' і К2 обидва є стеарилом (тобто, дистеарилом), і так далі. 0301 У формулі М вище, РЕС має середню молекулярну масу в діапазоні від близько 550 дальтон до близько 10000 дальтон. У деяких випадках, РЕС має середню молекулярну масу від близько 750 дальтон до близько 5000 дальтон (наприклад, від близько 1000 дальтон до близько 5000 дальтон, близько від 1500 дальтон до близько 3000 дальтон, близько від 750 дальтон до близько 3000 дальтон, близько від 750 дальтон до близько 2000 дальтон, і так далі). У бажаних варіантах реалізації винаходу РЕС має середню молекулярну масу близько 2000 дальтон або близько 750 дальтон. РЕС може бути необов'язково заміщеним алкільною, алкокси, адильною,
або арильною групами. У деяких варіантах реалізації, термінальна гідроксильна група заміщена метокси або метильною групою. 03021 У бажаному варіанті реалізації, "І" не є складним ефіром, що містить лінкерну групу.
Прийнятні нескладні ефіри, що містять лінкери, охоплюють амідо лінкерний фрагмент, аміно лінксерний фрагмент, карбонільний лінкерний фрагмент, карбаматний лінкерний фрагмент, сечовинний лінкерний фрагмент, простий ефірний лінкерний фрагмент, дисульфідний лінкерний фрагмент, сукцинамідил лінкерний фрагмент, а також їх комбінації, але не обмежуються ними.
У бажаному варіанті реалізації не-ефір, що містить зв'язуючий фрагмент, є зв'язуючим фрагментом карбамінової кислоти (тобто, кон'югат РЕС-С-ЮОАА). У іншому бажаному варіанті реалізації не-ефір, що містить зв'язуючий фрагмент, є амідо лінкерним фрагментом (тобто, кон'югатом РЕС-А-ЮАА). У ще одному бажаному варіанті реалізації не-ефір, що містить зв'язуючий фрагмент, є сукцинамідил лінкерним фрагментом (тобто, кон'югатом РЕС-5-БАА).
ЇОЗОЗІ| У деяких варіантах реалізації, РЕС-ліпідні кон'югати вибрані з: р и а ши кит дит пит рр дите ЯК ча « ще ни І І
Шо и се в с чи (ВББ-СЗ ОМА 2 й З и ол о сл нь но р але щ- ще ше т Я п
ТЕС ВОМС,
І0304| Кон'югати РЕС-ДАА синтезовані з використанням стандартних методик і реагентів, відомих фахівцям у даній області. Слід мати на увазі, що кон'югати РЕС-ОАА міститимуть різні аміди, аміни, ефірні, тіо, карбамати, і уретанові лінкери. Фахівцям у даній області техніки буде зрозуміло, що способі і реагенти для утворення цих зв'язків добре відомі і легко доступні. Див., наприклад, Магсй, АОМАМСЕО ОКСАМІС СНЕМІЗТЕУ (УмМіеу 1992); І агоск, СОМРАЕЕНЕМ5ІМЕ
ОКОСАМІС ТКАМЗЕОРЄМАТІОМЗ (МСН 1989); і Ригпіє5, МОСЕ! З ТЕХТВООК ОЕ РКАСТІСАЇГ.
ОРЄСАМІС СНЕМІ5ТЕКУ, 5ІпП ей. (Гопдтап 1989). Крім того, слід розуміти, що присутність будь- яких функціональних груп може зажадати захисту і зняття захисту в різних точках при синтезі кон'югатів РЕС-БАА. Фахівцям у даній області техніки буде зрозуміло, що такі способи добре відомі. Див., наприклад, бгееп апа Уушіх, РКОТЕСТІМЕ СКОШРБ5 ІМ ОКСАМІС 5УМТНЕЗІЗ (УМієу 1991).
ЇО3О5| Бажано, РЕС-ЮДАА кон'югат є РЕС-дидецилоксилпропіл (Стіо) кон'югатом, РЕС- дилаурилоксипропіл (С1і2) кон'югатом, РЕОС-диміристилоксипропіл (С:і4) кон'югатом, РЕС- дипальмітилоксипропіл (Сів) кон'югатом, або РЕС-дистеарилоксипропіл (Сів) кон'югатом. У цих варіантах реалізації, РЕС бажано має середню молекулярну масу від близько 750 або близько 2000 дальтон. У одному особливо бажаному варіанті реалізації винаходу РЕС-ліпідний кон'югат містить РЕС2000-С-ОМА, який відрізняється тим, що "2000" позначає середню молекулярну масу РЕСб, "С" позначає карбаматний лінкерний фрагмент, і "ОМА" позначає диміристилоксипропіл. У іншому особливо бажаному варіанті реалізації винаходу РЕС-ліпідний кон'югат містить РЕС750-С-ОМА, який відрізняється тим, що "750" позначає середню молекулярну масу РЕС, "С" позначає карбаматний лінкерний фрагмент, і "ОМА" позначає диміристилоксипропіл. У конкретних варіантах реалізації, терминальна гідроксильна група РЕС заміщена метильною групою. Фахівцям у даній області техніки повинно бути зрозуміло, що інші діалкілоксипропіли можуть бути використані в РЕС-ДАА кон'югатах за цим винаходом. 0306) На додаток до вищевикладеного, фахівцям у даній області техніки вочевидь, що інші гідрофільні полімери можуть бути використані замість РЕС. Приклади прийнятних полімерів, які можуть бути використані замість РЕС, охоплюють полівінілпіролідон, поліметилоксазолін, поліетилоксазолін, полігідроксипропіл, метакриламід, поліметакриламід і полідиметилакриламід, полімолочна кислота, полігліколева кислота, і похідні целюлоза, такі як гідроксіетилцелюлоза або гідроксиметилцелюлоза.
ЇО307| На додаток до вказаних вище компонентів, ліпідні частки (наприклад, І МР) за цим винаходом можуть додатково містити катіонний полі(етилгліколь) (РЕС) ліпіди або СРІ (див., наприклад, Спеп еї аї., Віосопі Спет., 11:433-437 (2000); патент США Мо 6852334; РСТ публікація УМО 00/62813, описи яких включені у даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей).
ІОЗО8)| Прийнятні СРІ. містять сполуки за формулою МІ:
А-МІ-ХУ (МІ) де А, МУ, і У описані нижче. (0309) Із посиланням на Формулу МІ, "А" є фрагментом ліпіду, таким, як амфіфатичний ліпід, нейтральний ліпід, або гідрофобний ліпід, який діє як ліпід-фіксатор. Прийнятні приклади ліпідів охоплюють діацилгліцероли, діалкілгліцероли, М-М-діалкіламіни, 1,2-діацилокси-З-амінопропани, і 1,2-діалкіл-3-амінопропани, але не обмежуючись ними.
ІЇОЗ310| "М/ є полімером або олігомером, таким як гідрофільний полімер або олігомер.
Бажано, гідрофільний полімер є біосумісним полімером, який є неімуногенним або має низьку імуногенність. Альтернативно, гідрофільний полімер може бути слабоантигенним при використанні з відповідними ад'ювантами. Прийнятні полімери охоплюють неімуногенні РЕбС, поліаміди, полімолочну кислоту, полігліколеву кислоту, співполімери полімолочної кислоти/полігліколевої кислоти і їх комбінації, але не обмежуються ними. У бажаному варіанті реалізації полімер має молекулярну масу від близько 250 до близько 7000 дальтон. 0311) "у" є полікатіонним фрагментом. Термін «полікатіонний фрагмент» відноситься до сполуки, похідного або функціональної групи, що має позитивний заряд, бажано щонайменше 2 позитивних заряди у вибраному рН, бажано фізіологічному рН. Прийнятні полікатіонні фрагменти охоплюють основні амінокислоти і їх похідні, такі як аргінін, аспарагін, глутамін, лізин, гістидин і спермін; спермідин; катіонні дендримери; поліаміни; поліамінові цукри і полісахариди амінокислоти. Полікатіонні фрагменти можуть бути лінійними, такими як лінійний тетралізин, розгалуженими або дендритними по структурі. Полікатіонні фрагменти мають від близько 2 до близько 15 позитивних зарядів, бажано від близько 2 до близько 12 позитивних зарядів, а бажаніше від близько 2 до близько 8 позитивних зарядів у вибраних значеннях рн.
Вибір полікатіонних фрагментів може бути визначений за допомогою типа додатка часток, які потрібні. 03121 Зв'язки полікатіонних фрагментів можуть бути або розподілені по всьому фрагменту частки, або як альтернатива, вони можуть бути дискретно концентровані по щільності заряду в одному конкретному районі фрагмента частки, наприклад, заряду спайка. Якщо щільність заряду поширюється по частці, щільність заряду може бути рівномірно розподілена або нерівномірно розподілена. Усі варіації розподілу заряду полікатіонного фрагмента входять в
Зо обсяг цього винаходу. 03131 Ліпід "А" і неїмуногенний полімер "МУ" можуть бути приєднані різними способами і бажано за рахунок ковалентного приєднання. Способи, відомі фахівцям у даній області, можуть бути використані для ковалентного приєднання "А" і "МУ". Прийнятні зв'язки включають амідні, амінні, карбоксильні, карбонатні, карбаматні, складноефірні, і гідразонові зв'язки, але не обмежуються ними. Фахівцям у даній області техніки вочевидь, що "А" і "Му" повинні мати додаткові функціональні групи для здійснення зв'язку. Реакція цих двох груп, однієї на ліпіді, а іншої на полімері, забезпечуватимуть бажаний зв'язок. Наприклад, коли ліпід є діацилгліцерином і кінцеві гідроксильні групи активуються, наприклад, за допомогою МНЗ і ОСС, з утворенням активного складного ефіру, і потім піддаються взаємодії з полімером, який містить аміногрупу, наприклад, за допомогою поліаміду (див., наприклад, патенти США МоМо 6320017 і 6586559, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей), між двома групами утворюється амідний зв'язок. 03141 В деяких випадках, полікатіонний фрагмент може бути приєднаний до ліганду, такому як ліганд-мішень або хелатуючий фрагмент для утворення комплексу з кальцієм. Бажано, після того, як ліганд приєднаний, катіонний фрагмент зберігає позитивний заряд. У деяких випадках, ліганд, який приєднаний, має позитивний заряд. Прийнятні ліганди охоплюють сполуки або пристрої з реакційноспроможною функціональною групою, але не обмежуються ними, і охоплюють ліпіди, амфіпатичні ліпіди, сполуки-носії, біоафінні сполуки, біоматеріали, біополімери, біомедичні пристрої, сполуки, що аналітично виявляються, терапевтично активні сполуки, ферменти, пептиди, білки, антитіла, імунні стимулятори, радіоактивні мітки, флюорогени, біотин, лікарські засобі, гаптени, ДНК, РНК, полісахариди, ліпосоми, міцелли, віросоми, імуноглобуліни, функціональні групи, інші фрагменти-мішені або токсини.
ЇОЗ315) У деяких варіантах реалізації ліпідний кон'югат (наприклад, РЕС-ліпід) містить від близько 0,1 моль 95 до близько 2 моль 95, від близько 0,5 мольбо до близько 2 моль 95, від близько 1 моль 95 до близько 2 моль 95, від близько 0,6 моль 95 до близько 1,9 моль 95, від близько 0,7 моль 95 до близько 1,8 моль 95, від близько 0,8 моль 95 до близько 1,7 моль 905, від близько 0,9 мольоо до близько 1,6 моль 95, від близько 0,9 моль 95 до близько 1,8 моль 95, від близько 1 моль 95 до близько 1,8 моль 90, від близько 1 моль 95 до близько 1,7 моль 95, від близько 1,2 моль 95 до близько 1,8 моль 95, від близько 1,2 мольбо до близько 1,7 моль 905, від 60 близько 1,3 моль 95 до близько 1,6 моль 95, або від близько 1,4 моль 95 до близько 1,5 моль 95
(або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
ІО316) У інших варіантах реалізації ліпідний кон'югат (наприклад, РЕС-ліпід) містить від близько 0 моль 95 до близько 20 моль 95, від близько 0,5 моль 95 до близько 20 моль 95, від близько 2 моль 95 до близько 20 моль 95, від близько 1,5 моль 95 до близько 18 моль 95, від близько 2 моль 95 до близько 15 моль 95, від близько 4 моль 95 до близько 15 моль 95, від близько 2 моль 95 до близько 12 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 12 моль 95, або близько 2 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці.
ІО317| У інших варіантах реалізації ліпідний кон'югат (наприклад, РЕС-ліпід) містить від близько 4 моль 95 до близько 10 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 10 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 9 моль 95, від близько 5 моль 95 до близько 8 моль 95, від близько 6 моль 95 до близько 9 моль 95, від близько 6 моль 95 до близько 8 моль 95 або від близько 5 моль 95, 6 моль 95, 7 моль 95, 8 моль 95, 9 моль 95 або 10 моль 95 (або будь-якої їх фракції або їх діапазону) від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці. 0318) Додаткові приклади, відсотки та/або діапазони ліпідних кон'югатів, придатних для використання в ліпідних частках за цим винаходом, описані, наприклад, у публікації РСТ Мо УМО 09/127060 і публікації РСТ Мо УМО 2010/006282, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІО3191| Слід розуміти, що відсоток ліпідних кон'югатів (наприклад, РЕС-ліпідів), присутніх у ліпідних частках за цим винаходом, є кількістю мішеней, і ця фактична кількість ліпідних кон'югатів, присутніх у композиції, може варіювати, наприклад, у межах 5 2 мольоо. Наприклад, у 1:57 препараті ліпідної частки (наприклад, І МР), цільова кількість ліпідних кон'югатів складає 1,4 моль 95, але фактична кількість ліпідних кон'югатів може бути х 0,5 моль 95, хх 0,4 моль 95, ж 0,3 моль 95, ж 0,2 моль 95, ж 0,1 моль», або ж 0,05 мольоо від цієї кількості мішеней, причому останній препарат може бути складений з інших ліпідних компонентів (додавання до 100 моль до від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці). Аналогічним чином, у 7:54 препараті ліпідної частки (наприклад, І МР), кількість мішеней ліпідних кон'югатів складає 6,76 мольоо, але фактична кількість ліпідних кон'югатів може бути ж 2 моль 95, 5 1,5 моль 95, ж 1 моль 95, ж 0,75 моль 95, ж 0,5 моль 95, ї 0,25 моль 95 або ж 0,1 моль 95 від цієї кількості мішеней, причому останній препарат може бути складений з інших ліпідних компонентів (додавання до 100 моль
Фо від загальної кількості ліпідів, присутніх у частці). 0320) Фахівцеві у даній області техніки буде зрозуміло, що концентрація ліпідних кон'югатів може змінюватися залежно від ліпідного кон'югата, що застосовується, і швидкості, 3 якою ліпідна частка повинна зливатися.
ІЇО321| Контролюючи склад і концентрацію ліпідного кон'югата, можна контролювати швидкість, з якою ліпідні кон'югати утворюються з ліпідних часток і, у свою чергу, швидкість, з якою ліпідна частка зливається. Наприклад, коли кон'югат РЕС-ЮАА використовується як ліпідний кон'югат, швидкість, 3 якою ліпідна частка зливається, можна варіювати, наприклад, шляхом зміни концентрації ліпідного кон'югата, шляхом зміни молекулярної маси РЕС, або шляхом зміни довжини ланцюгу і мірі насичення алкільних груп кон'югата РЕС-ОАА. Крім того, інші змінні, у тому числі, наприклад, рН, температура, іонна сила і так далі, можуть бути використані для зміни та/або контролювання швидкості, з якою ліпідна частка зливається. Інші способи, які можуть бути використані для того, щоб контролювати швидкість, з якою ліпідна частка зливається, стануть очевидними фахівцям у даній області техніки після прочитання цього розкриття. Крім того, шляхом регулювання складу і концентрації ліпідного кон'югата можна контролювати розмір ліпідної частки (наприклад, І МР).
МІ. Підготовка ліпідних часток
ІОЗ322| Ліпідні частки за цим винаходом, наприклад, ЇМР, в яких активний агент або терапевтичний засіб, такий як інтерферуючі РНК (наприклад, міРНК) є поміщеними в ліпідну
БО частину частки і захищеними від розкладання, можуть бути утворені будь-яким способом, відомим у даній області, у тому числі способом безперервного змішування, способом прямого розбавлення, і способом розбавлення в режимі реального часу, але не обмежуючись ними. (0323) У конкретних варіантах реалізації катіонні ліпіди можуть містити ліпіди за формулою або їх солі, окремо або в комбінації з іншими катіонними ліпідами. В інших варіантах реалізації некатіонні ліпіди є яєчним сфінгомієліном (Е5М), дистеароїлфосфатидилхоліном (О5РС), діолеоїлфосфатидилхоліном (0ОРС), 1-пальмітоїл-2-олеоїл-фосфатидилхоліном (РОРС), дипальмітоїл-фосфатидилхоліном (ОРРС), монометилов-фосфатидилетаноламіном, диметил- фосфатидилетаноламіном, 14:10 РЕ (1,2-диміристоїл-фосфатидилетаноламіном (ОМРЕ)), 16:0
РЕ /(1,2-дипальмітоїл-фосфатидилетаноламіном (ОРРЕ)), 18:10 РЕ (1,2-дистеароїл- бо фосфатидилетаноламіном (О5РЕ)), 18:1 РЕ (1,2-діолеоїл-фосфатидилетаноламіном (СОРЕ)),
18:11 транс-РЕ (1,2-діелаїдоїл-фосфатидилетаноламіном (ОЕРЕ)), 18:0-18:11 РЕ (1-стеароїл-2- олеоїл-фосфатидилетаноламіна (БОРЕ)), 16:0-18:71 РЕ (1-пальмітоїл-2-олеоїл- фосфатидилетаноламін (РОРЕ)), полімерами на основі поліеєтиленгліколя (наприклад, РЕО 2000, РЕС 5000, РЕС-модифіковані діацилгліцерини, або РЕС-модифіковані діалкілоксипропіли), холестерином, їх похідними або їх комбінаціями.
ІО324)| У деяких варіантах реалізації цей винахід відноситься до нуклеїнових кислотно- ліпідних часток (наприклад, І КР), отриманих за допомогою способу безперервного змішування, наприклад, способу, який включає одержання водного розчину, що містить нуклеїнову кислоту (наприклад, інтерферуючу РНК) у першому резервуарі, одержання органічного розчину ліпідів у другому резервуарі (де ліпіди присутні в органічному ліпідному розчині, розчиненому в органічному розчиннику, наприклад, нижчому алканолі, такому як етанол), і змішування водного розчину з органічним розчином таким чином, що органічний ліпідний розчин змішується з водним розчином так, щоб по суті миттєво віробляти ліпідні бульбашки (наприклад, ліпосоми), що інкапсулюють нуклеїнову кислоту в ліпідних бульбашках. Цей спосіб і пристрій для реалізації цього способу детально описані в заявці на патент США Мо 2004/0142025, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. 0325) Дія безперервного введення ліпідів і буферних розчинів у середовище змішування, наприклад, у камеру змішувача, викликає безперервне розбавлення ліпідного розчину з буферним розчином, внаслідок чого одержують ліпідні бульбашки по суті миттєво при змішуванні. Як використано в цьому описі, фраза "безперервне розбавлення розчину ліпідів із буферним розчином" (і варіації) у загальному випадку позначає, що ліпідний розчин розбавляли досить швидко в процесі гідратації з достатньою силою для реалізації генерування бульбашок.
При змішуванні водного розчину, що містить нуклеїнову кислоту, з органічним розчином ліпідів, органічний розчин ліпідів зазнає ступінчастого безперервного розбавлення у присутності буферного розчину (тобто, водного розчину) з одержанням нуклеїнових кислотно-ліпідних часток.
ІО326| Нуклеїнові кислотно-ліпідні частки, сформовані за способом безперервного змішування, як правило, мають розмір від близько 30 нм до близько 150 нм, від близько 40 нм до близько 150 нм, від близько 50 нм до близько 150 нм, від близько 60 нм до близько 130 нм,
Ко) від близько 70 нм до близько 110 нм, від близько 70 нм до близько 100 нм, від близько 80 нм до близько 100 нм, від близько 90 нм до близько 100 нм, від близько 70 до близько 90 нм, від близько 80 нм до близько 90 нм, від близько 70 нм до близько 80 нм, менше ніж близько 120 нм, 110 нм, 100 нм, 90 нм або 80 нм або близько 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм, або 150 нм (будь-якої їх фракції або діапазону в ній). Частки, таким чином, не агрегують і, необов'язково, такий розмір дозволяє досягти однорідного розміру часток.
І0327| У іншому варіанті реалізації цей винахід відноситься до нуклеїнової кислотно-ліпідної частки (наприклад, МР), отриманої шляхом способу прямого розбавлення, що включає формування розчину ліпідних бульбашок (наприклад, ліпосом) і негайного і безпосереднього введення розчину ліпідних бульбашок у збірний резервуар, що містить регульовану кількість буфера для розведення. У бажаних аспектах, збірний резервуар включає один або більше елементів, сконфігурованих з можливістю перемішування вмісту цього резервуару, щоб полегшити розчинення. В одному аспекті, кількість буфера для розведення, присутнього в збірному резервуарі, по суті дорівнює об'єму ліпідних бульбашок розчину, введеного в нього. Як необмежуючий приклад, ліпідні бульбашки розчину у 4595 етанолі при введенні в накопичувальний резервуар, що містить рівний об'єм буфера для розведення, будуть переважно отримані у вигляді дрібних часток. (0328) У ще одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до нуклеїнових кислотно- ліпідних часток (наприклад, І МР), отриманих за допомогою способу лінійного розбавлення, в якому третій резервуар, що містить буфер для розведення гідравлічно сполучений з другою ділянкою змішення. У цьому варіанті реалізації, розчин ліпідних бульбашок (наприклад, ліпосом), утворений у першій зоні змішування, відразу ж змішували з буфером для розведення у другій зоні змішування. У бажаних аспектах, друга зона змішування містить Т-образний елемент, розташований таким чином, що потоки розчину ліпідних бульбашок і буфера з'єднуються як протилежні на 1807 потоки; проте, з'єднувальні елементи, що забезпечують малий кут ковзання, можуть бути використані, наприклад, від близько 27" до 180" (наприклад, близько 907). Насосний механізм забезпечує контрольований потік буфера до другої області змішування. В одному аспекті, швидкість потоку буфера розведення, що подається в другу зону бо змішування, контролюється так, щоб бути по суті рівною швидкості потоку розчину ліпідних бульбашок, введеного у нього з першого змішувача області. Цей варіант бажано забезпечує більший контроль потоку буфера розведення для змішування з розчином ліпідних бульбашок у другій зоні змішування, а отже, і концентрацію розчину ліпідних бульбашок у буфері протягом другого способу змішування. Такий контроль витрати буфера розведення переважно забезпечує формування часток малого розміру при знижених концентраціях.
І0329| Ці процеси і апарати для проведення цих прямих лінійних розведень і процеси розведення детально описані в заявці на патент США Мо 2007/0042031, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІО330| Нуклеїнові кислотно-ліпідні частки, що формуються з використанням прямого розбавлення і способів лінійного розбавлення, як правило, мають розмір від близько 30 нм до близько 150 нм, від близько 40 нм до близько 150 нм, від близько 50 нм до близько 150 нм, від близько 60 нм до близько 130 нм, від близько 70 нм до близько 110 нм, від близько 70 нм до близько 100 нм, від близько 80 нм до близько 100 нм, від близько 90 нм до близько 100 нм, від близько 70 до близько 90 нм, від близько 80 нм до близько 90 нм, від близько 70 нм до близько 80 нм, менше ніж близько 120 нм, 110 нм, 100 нм, 90 нм або 80 нм або близько 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм, 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм, 110 нм, 115 нм, 120 нм, 125 нм, 130 нм, 135 нм, 140 нм, 145 нм, або 150 нм (або будь-яку їх фракцію або діапазон у ньому). Частки, таким чином, не агрегують, і, необов'язково, формуються такого розміру, щоб досягти однорідного розміру часток. 03311 За необхідності, розмір ліпідних часток за цим винаходом (наприклад, І МР) може бути розрахований за допомогою будь-якого зі способів, доступних для формування розміру ліпосом.
Зміна розмірів може бути здійснена для того, щоб досягти бажаного розміру і відносно вузького розподілу часток за розмірами. 03321 Деякі методи доступні для визначення розміру часток до потрібного розміру. Один із способів калібрування, що використовується для ліпосом і в рівній мірі застосовний до даної частки, описаний у патенті США Мо 4737323, опис якого включений у цьому документі шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Ультразвукова обробка суспензії часток або в ємності, або в зонді, призводить до поступового зменшення розмірів часток до менше ніж близько 50 нм у розмірі. Гомогенізація є ще одним способом, що грунтується на розділенні
Зо енергії фрагментів великих часток на дрібніші. У типовій процедурі гомогенізації, частки рециркулюють через стандартний емульсійний гомогенізатор до вибраних розмірів часток, які спостерігатимуться, як правило, між близько 60 і близько 80 нм. У обох способах, розподіл часток за розмірами можна контролювати за допомогою звичайного лазерного променя дискримінацію часток за розмірами, або ОБЕЇ 5. 03331 Екструзія часток через невеликі пори полікарбонатної мембрани або асиметричної керамічної мембрани є також ефективним способом зниження розмірів часток у відносно добре визначеному розподілі за розмірами. Як правило, суспензію циклічно пропускають через мембрану один або кілька разів до того часу, поки бажаний розподіл часток за розмірами не буде досягнутий. Частки можуть бути послідовно екструдовані через менші пори мембрани, щоб досягти поступового зменшення розміру. 0334) У деяких варіантах реалізації, нуклеїнові кислоти, присутні в частках, ресуспендовані, як описано, наприклад, у заявці на патент США 09/744103, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІО335| В інших варіантах реалізації способи можуть додатково включати додавання неліпідних полікатіонів, які корисні для реалізації ліпофекації клітин з використанням даних композицій. Приклади прийнятних неліпідними полікатіонов охоплюють, гексадиметрин бромід (продається під торгівельною маркою РОГІВКЕМЕ?, від АЇйгісй СПетіса! Со., Мімакее,
Муівсопбіп, ОБА) або інших солей гексадиметрина. Інші прийнятні полікатіони охоплюють, наприклад, солі полі-І -орнітина, полі-І -аргініна, полі-І -лізина, полі-ЮО-лізина, поліаліламіна і поліетиленіміна. Додавання цих солей відбувається, бажано, після того, як частки були сформовані. 0336) У деяких варіантах реалізації нуклеїнова кислота в співвідношенні з ліпідом (мас./мас. співвідношення) утворює нуклеїнову кислотно-ліпідну частку (наприклад, І МР), яка знаходиться в інтервалі від близько 0,01 до близько 0,2, від близько 0,05 до близько 0,2, від близько 0,02 до близько 0,1, від близько 0,03 до близько 0,1 або від близько 0,01 до близько 0,08.
Співвідношення первинних матеріалів (що вносяться) також потрапляє у вказаний діапазон. В інших варіантах реалізації препарат часток використовує близько 400 мкг нуклеїнової кислоти на 10 мг загального ліпіду або масове співвідношення нуклеїнової кислоти до ліпіду складає від близько 0,01 до близько 0,08 і, бажаніше, близько 0,04, що відповідає 1,25 мг загального ліпіду бо на 50 мкг нуклеїнової кислоти. В інших бажаних варіантах реалізації частка має масове співвідношення нуклеїнова кислота:ліпід близько 0,08.
І0337| У інших варіантах реалізації співвідношення ліпіду до нуклеїнової кислоти (мас./мас. співвідношення) в утвореній нуклеїновій кислотно-ліпідній частці (наприклад, ІМР) варіюватиметься від близько 1 (1:1) до близько 100 (100:1), від близько 5 (5:1) до близько 100 (10071), від близько 1 (1:1) до близько 50 (50:1), від близько від 2 (2:1) до близько 50 (50:1), від близько З (3:11) до близько 50 (50:1), від близько 4 (4:1) до близько 50 (50:1), від близько 5 (5:1) до близько 50 (50:1), від близько 1 (121) до близько 25 (25:1), близько від 2 (2:1) до близько 25 (25:1), від близько З (3:11) до близько 25 (25:1), від близько 4 (4:11) до близько 25 (25:1), від близько 5 (5:1) до близько 25 (25:1), від близько 5 (5:1) до близько 20 (20:1), від близько 5 (5:1) до близько 15 (15:1), від близько 5 (5:1) до близько 10 (10:1), або близько 5 (5:1), 6 (6:1), 7 (771), 8 (8:71), 9 (9:11), 10 (10:11), 11 (111), 12 (12:11), 13 (131), 14 (14:11), 15 (15:11), 16 (16:1), 17 (177), 18 (18:1), 19 (19:1), 20 (20:1), 21 (21:1), 22 (2221), 23 (23:1), 24 (241), або 25 (2521), або будь-якої їх фракції або діапазону в ньому. Співвідношення первинних матеріалів (що вносяться) також потрапляє у вказаний діапазон. 0338) Як описано вище, кон'югований ліпід може додатково містити СРІ.. Різноманітність загальних способів одержання І МР-СРІ (МР, що містить СРІ) обговорюються у цьому документі. Два загальні способи охоплюють техніку "після вставки", тобто вставку СРІ. у, наприклад, заздалегідь сформирований І МР і "стандартний" спосіб, в якому СРІ. включають у ліпідну суміш протягом, наприклад, кроків формування І МР. Пост-вставний спосіб призводить до І МР, що містить СРІ 5, основному на зовнішній поверхні двошарової мембрани І МР, тоді як стандартні способи забезпечують І МР, що містять СРІ 5, на внутришніх і зовнішніх поверхнях.
Цей спосіб особливо корисний для бульбашок, виготовлених із фосфоліпідів (які можуть містити холестерин), а також для бульбашок, що містять РЕС-ліпіди (наприклад, РЕС-Оааз і РЕС-БАС).
Способі одержання І МР-СРІ 5 розкриті, наприклад, у патентах США МоМо 5705385; 6586410; 5981501; 6534484 і 6852334; патентній заявці США Мо 2002/0072121; і публікації РСТ Мо УМО 00/62813, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
МІЇ. Набори 0339 Цей винахід також надає ліпідні частки (наприклад, І МР) у формі набору. У деяких
Зо варіантах реалізації набір містить контейнер, який розділений для вмісту різних елементів ліпідних часток (наприклад, активних агентів або терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти і окремі ліпідні компоненти часток). Бажано, щоб набір містив контейнер (наприклад, флакон або ампулу), що містить ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР), який відрізняється тим, що частки одержують по одному із способів, викладених у цьому документі. У деяких варіантах реалізації набір може додатково містити дестабілізатори ендосомальних мембран (наприклад, іони кальцію). Набор зазвичай містить частки композиції за цим винаходом або у вигляді суспензії у фармацевтично прийнятному носієві, або в дегідратованій формі, з інструкціями по їх регідратації (у разі ліофілізованих) і введення. 03401 Ліпідні частки за цим винаходом можуть бути пристосовані переважно для ураження конкретної тканини, органу або пухлині, що представляють інтерес. В деяких випадках, 1:57 композиція ліпідної частки (наприклад, МР) може бути використана для ураження переважно печінки (наприклад, нормальної тканини печінки). В інших випадках, 7:54 композиція ліпідної частки (наприклад, МР) може бути використана для ураження переважно твердих пухлин, таких як пухлини печінки і пухлини за межами печінки. У бажаних варіантах реалізації набори за цим винаходом містять такі печінка-вражаючі тал«або пухлина-вражаючі ліпідні частки, в яких частки присутні в контейнері у вигляді суспензії або в дегідратованій формі.
ЇО341| У деяких інших випадках, може бути бажано, мати фрагмент-мішень, прикріплений до поверхні ліпідної частки для подальшого підвищення вражаючої здатності частки. Способи кріплення фрагмента-мішені (наприклад, антитіла, білка і так далі), до ліпідів (таким, як ті, що використовуються у данній частці) відомі фахівцям у цій області техніки.
МІ. Введення ліпідних часток (03421) Після формування, ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) можуть бути використані для введення активних агентів або терапевтичних агентів (наприклад, нуклеїнових кислот, таких як інтерферуючі РНК) у клітини. Таким чином, цей винахід також відноситься до способів введення активної речовини або терапевтичного агента, такого як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК) у клітину. В деяких випадках, клітина є клітиною печінки, такою як, наприклад, гепатоцит, який присутній у тканині печінки. В інших випадках, клітина є пухлинною клітиною, такою як, наприклад, пухлинна клітина, що присутня у твердій пухлині.
Способи здійснюються іп міїго або іп мімо, спочатку відбувається утворення частки, як описано 60 вище, і потім контакт часток із клітинами протягом періоду часу, достатнього для того, щоб відбулася доставка активного агента або терапевтичного агента до клітин. 03431 Ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) можуть бути адсорбовані на майже будь-якому типові клітин, з якими вони змішуються або вступають у контакт. Після адсорбції, частки можуть бути піддані або ендоцитозу частиною клітин, обміну ліпідами з клітинними мембранами, або злиттю з клітинами. Передача або введення активного агента або терапевтичного агента (наприклад, нуклеїнової кислоти) порції часток може проходити через будь-який один з цих шляхів. Зокрема, коли відбувається злиття, мембрана часток є інтегрованою в клітинну мембрану і містити частку у поєднанні з внутрішньоклітинною рідиною. (0344) Ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) можуть бути введені або окремо, або в суміші з фармацевтично прийнятним носієм (наприклад, фізіологічним розчином або фосфатним буфером), вибраним відповідно до шляху введення і стандартної фармацевтичної практики. Як правило, нормальний сольовий буфер (наприклад, 135-150 мМ Масі), буде використаний як фармацевтично прийнятний носій. Інші прийнятні носії охоплюють, наприклад, воду, буферну воду, 0,495 сольовий розчин, 0,395 гліцин і тому подібні, у тому числі глікопротеїни для підвищення стабільності, такі як альбумін, ліпопротеїн, глобулін і так далі.
Додаткові прийнятні носії описані, наприклад, у КЕМІМОСТОМ'Є РНАКМАСЕШТІСАЇГ. ЗСІЕМСЕЗ5,
Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, Рпйааеїрпіа, РА, 171й еа. (1985). Як використано в цьому документі, "носій" охоплює будь-який і всі розчинники, дисперсійні середовища, транспортні засобі, покриття, розчинники, антибактеріальні і протигрибкові агенти, ізотонічні і затримуючі всмоктування агенти, буфери, розчини, суспензії носія, колоїди, і тому подібні. Фраза "фармацевтично прийнятний" відноситься до молекулярних часток і композицій, які не продукують алергічну або подібну несприятливу реакцію при введенні людині. 0345) Фармацевтично прийнятний носій зазвичай додають після утворення ліпідної частки.
Таким чином, після того, як ліпідна частка (наприклад, МР) формується, частка може бути розбавлена у фармацевтично прийнятному носієві, такому як нормальний сольовий буферний розчин.
І0346| Концентрація часток у фармацевтичних препаратах може широко варіювати, тобто від менше ніж близько 0,05 95, як правило, на рівні або, щонайменше близько від 2 до 5 95, до близько від 10 до 90 95 по масі, і будуть обрані, перш за все, за об'ємом рідини, в'язкістю і тому подібне, відповідно до конкретного способу введення. Наприклад, концентрація може бути збільшена, щоб знизити навантаження рідини, пов'язане з лікуванням. Це може бути особливо бажаним у пацієнтів, які мають атеросклероз, асоційований із застійною серцевою недостатністю або важкою гіпертензією. З іншого боку, частки, що складаються із ліпідів, що викликають роздратування, можуть бути розбавлені до низьких концентрацій, щоб зменшити запалення у місці введення.
Ї0О347| Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть бути стерилізовані за допомогою звичайних, добре відомих способів стерилізації. Водні розчини можуть бути упаковані для використання або профільтровані в асептичних умовах і ліофілізовані, ліофілізований препарат об'єднують із стерильним водним розчином перед введенням. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як коректори рН і буферні агенти, агенти, що регулюють тонічність, і тому подібні, наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію і хлориду кальцію. Крім того, суспензія часток може містити ліпідні захисні агенти, які захищають ліпіди від вільних радикалів і ліпід-перекисних пошкоджень при зберіганні. Ліпофільні безрадикальні гасителі, такі як альфатокоферол, і розчинні у воді залізо-специфічні хелатори, такі як ферріоксамін, є прийнятними. 0348) У деяких варіантах реалізації, ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) є особливо корисними у способах терапевтичної доставки одного або декількох нуклеїнових кислот, що містять послідовність інтерферуючої РНК (наприклад, міРНК). Зокрема, завданням цього винаходу є забезпечення способів іп міїго і іп мімо лікування захворювань або розладів у ссавця (наприклад, гризунів, таких як миші, або приматів, таких як людина, шимпанзе, або мавпа) за допомогою виключення або придушення транскрипції та/або трансляції однієї або більше цільової послідовності нуклеїнових кислот або генів, що представляють інтерес. Як необмежуючий приклад, способи за винаходом можуть бути використані для доставки іп мімо інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК) у печінку і в пухлину у ссавця. У конкретному варіанті реалізації, захворювання або розлад є асоційованим з експресією та/або надекспресією гена і експресією або надекспресією гена, що знижена інтерферучою РНК (наприклад, міРНК). У конкретному варіанті реалізації, терапевтично ефективна кількість ліпідної частки може бути введена ссавцеві. В деяких випадках, інтерферуюча РНК (наприклад, мігРНК) поміщена в І МР, і 60 частки вводяться пацієнтові, який потребує такого лікування. В інших випадках, клітини вилучають у пацієнта, інтерферуючі РНК доставляються іп міго (наприклад, з використанням
І МР, описаних у цьому документі), і клітини назад вводяться пацієнтові.
А. Введення іп мімо (0349) Системна доставка для терапії іп мімо, наприклад, доставка терапевтичної нуклеїнової кислоти в дистальну клітину-мішень за допомогою систем організму, таких як циркуляція, була досягнута з використанням часток нуклеїнових кислот, ліпідів, таких як ті, які описані в публікаціях РСТ МоМо МО 05/007196, УМО 05/1121348, УМО 05/120152 ії УМО 04/002453, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Цей винахід також надає повністю інкапсульовані частки ліпідів, які захищають нуклеїнову кислоту від деградації нуклеазою в сироватці, які є неїмуногенними, невеликими за розміром, і які Є прийнятними для повторної дози.
ЇО35О| Для введення у природних умовах, введення може бути здійснене будь-яким способом, відомим у даній області, наприклад, за допомогою ін'єкції, перорального введення, інгаляції (наприклад, інтраназальної або інтратрахеальної), трансдермального застосування, або ректального введення. Введення може бути здійснене за допомогою однієї або декількох доз. Фармацевтичні композиції можуть бути введені парентерально, тобто, інтраартикулярно, внутрішньовенно, внутрішньочеревно, підшкірно або внутрішньом'язово. У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції вводять внутрішньовенно або внутрішньочеревно за допомогою ін'єкції ударної дози (див., наприклад, патент США Мо 5286634). Внутрішньоклітинна доставка нуклеїнової кислоти також обговорювалася в Зігацбгіпдег еї аЇ., Мемйоде5 Епгутої., 101:512 (1983); Маппіпо еї аї., Віоїесппідиевз, 6:682 (1988); Місоїаи еї аї., Стї. Вем. Тег. Огиа
Сатієг Буві., 6:239 (1989); і Вейг, Асс. Спет. Кев., 26:274 (1993). Проте, інші способі введення ліпідів на основі терапевтичних засобів описані, наприклад, у патентах США Мо 3993754; 4145410; 4235871; 4224179; 4522803; і 4588578. Частки ліпідів можуть бути введені шляхом прямої ін'єкції в місці хвороби або у вигляді ін'єкцій у вузлі, дистальному від місця захворювання (див., наприклад, Сицімег, НОМАМ СЕМЕ ТНЕКАРУ, МагуАпп Гіебеті, Іпс., Рибіїзпеге, Мем/ МогК. рр.70-71(1994)). Розкриття описаних вище посилань включені в даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ІО351) У варіантах реалізації, де ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) вводять
Ко) внутрішньовенно, щонайменше близько 595, 1095, 1595, 2095, або 2595 від загального об'єму ін'єкції дози часток присутні в плазмі через близько 8, 12, 24, 36, або 48 год після ін'єкції. В інших варіантах реалізації, більше ніж близько 2095, 30905, 4095 і до порядка 6095, 7095 або 80965 від загального введеної дози ліпідних часток були присутні в плазмі крові через близько 8, 12, 24, 36, або 48 год після ін'єкції. У деяких випадках більше ніж близько 1095 від множини часток присутні в плазмі ссавця через близько 1 годину після введення. У деяких інших випадках, присутність часток ліпідів можна виявити принаймні близько через 1 годину після введення часток. У деяких варіантах реалізації, наявність терапевтичного агента, такого як нуклеїнова кислота, можна виявити в клітинах легенів, печінці, пухлині, або у місці запалення через близько 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 або 96 годин після введення. В інших варіантах реалізації, виключення експресії послідовності-мішені за допомогою інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК) можна виявити близько через 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72 або 96 годин після введення. В інших варіантах реалізації, придушення експресії послідовності-мішені за допомогою інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК) відбувається переважно в клітинах печінки (наприклад, гепатоцитах), пухлинних клітинах, або в клітинах в області запалення. В інших варіантах реалізації, наявність або ефект інтерферуючих РНК (наприклад, міРНК) можна виявити в клітинах на місці, проксимальному або дистальному до місця введення або в клітинах легенів, печінці або пухлині через близько 12, 24, 48, 72 або 96 годин, або через близько 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 24, 26 або 28 днів після введення. У додаткових варіантах реалізації ліпідні частки (наприклад,
І МР) за цим винаходом вводять парентерально або внутрішньочеревно. 03521 Композиції за цим винаходом або окремо, або в комбінації з іншими прийнятними компонентами, можуть бути перетворені на аерозольні препарати (наприклад, вони можуть бути "розпилюваними") для введення за допомогою інгаляції (наприклад, інтраназально або внутрішньотрахеально) (див., Вгідпат еї аї., Ат. 9. Зсі., 298:278 (1989)). Аерозольні препарати можуть бути поміщені під тиском у прийнятні пропеленти, такі як дихлордифторметан, пропан, азот і тому подібне. 0353) У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції можуть бути доставлені за допомогою інтраназальних спреїв, інгаляцій, талабо інших транспортних засобів аерозольної доставки. Способі доставки композиції нуклеїнових кислот безпосередньо в легені через носові аерозолі були описані, наприклад, у патентах США МоМо 5756353 і 5804212. Так само, доставка бо лікарських засобів із використанням інтраназальних мікрочасток смоли і лізофосфатидил-
гліцеринових сполук (патент США 5725871) також добре відомі у фармацевтичної області. Крім того, доставка лікарського засобу через слизову оболонку у формі опорної політетрафлюоретеїленової матриці описана в патенті США Ме 5780045. Розкриття описаних вище патентів включені в даний опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. (0354) Композиції, придатні для парентерального введення, такі як, наприклад, шляхом внутрішньосуглобного (у суглоби), внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньошкірного, внутрішньочеревного, і підшкірного, містять водні і неводні ізотонічні розчини, стерильні ін'єкційні, які можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні чинники, ї розчинені речовини, які додають композиції ізотонічність з кров'ю передбачуваного реципієнта, а також водні і неводні стерильні суспензії, які можуть містити суспендуючі агенти, солюбілізатори, загусники, стабілізатори і консерванти. У практичному застосуванні цього винаходу, композиції бажано вводять, наприклад, шляхом внутрішньовенної інфузії, перорально, місцево, внутрішньочеревно, всередину сечового міхура, або інтратекально.
ЇО355| Як правило, при внутрішньовенному введенні, композиції ліпідних часток скомпоновані з прийнятним фармацевтичним носієм. Багато фармацевтично прийнятних носіїв можуть бути використані у композиціях і способах за цим винаходом. Прийнятні композиції для використання у цьому винаході можна знайти, наприклад, у КЕМІМОТОМ'Є РНАКМАСЕШТІСАГС
ЗСІЕМСЕ5, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, РпйПадеїрпіа, РА, 171й ей. (1985). Можуть бути використані різні водні носії, наприклад, вода, забуферена вода, 0,495 сольовий розчин, 0,395 гліцин і тому подібне, а також можуть містити глікопротеїни для підвищення стабільності, такі як альбумін, ліпопротеїн, глобулін і так далі. Як правило, нормальний буферний сольовий розчин (135-150
ММ Масі), буде використаний як фармацевтично прийнятний носій, але достатньо і інших прийнятних носіїв. Ці композиції можуть бути стерилізовані способами звичайної ліпосомальної стерилізації, наприклад, фільтрацією. Ці композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як коректуючі рн і буферні агенти, агенти, що коректують концентрацію, змочуючі агенти і тому подібне, наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, монолаурат сорбіту, олеат триетаноламіну і так далі. Ці композиції можуть бути стерилізовані з використанням способів, вказаних вище, або, альтернативно, вони можуть бути виготовлені в
Зо стерильних умовах. Отримані водні розчини можуть бути упаковані для використання або профільтровані в асептичних умовах і ліофілізовані, ліофілізований препарат об'єднують із стерильним водним розчином перед введенням.
ЇО356) У деяких випадках, ліпідні частки, описані у цьому документі, можуть бути доставлені за допомогою перорального введення індивідуумові. Частки можуть бути об'єднані з ексципієнтами і використані у вигляді пігулок для прийому всередину, буккальних пігулок, пастилок, капсул, пілюль, коржиків, еліксирів, рідини для полоскання рота, суспензії, спрея, сиропів, вафель і тому подібне (див., наприклад, патенти США МоМо 5641515, 5580579, і 5792451, розкриття яких включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей). Ці пероральні лікарські форми можуть також містити: зв/'язуючі речовини, желатин; наповнювачі, змащуючі речовини та/(або ароматизатори. Коли одинична дозована форма є капсулою, вона може містити, на додаток до матеріалів, описаних вище, рідкий носій. Різні інші матеріали можуть бути присутніми у вигляді покриття або для модифікації фізичної форми дозованої одиниці. Звичайно, будь-який матеріал, використаний для приготування будь-якої лікарської форми, має бути фармацевтично чистим і по суті нетоксичним у використаних кількостях.
ІО357| Як правило, ці оральні препарати можуть містити щонайменше близько 0,195 ліпідних часток або більше, хоча доля часток може, звичайно, варіюватися і може складати від близько 196 або 295 до близько 6095 або 7095 або більше по масі або об'єму від загального об'єму композиції. Природньо, що кількість часток у кожній терапевтично корисній композиції, яка може бути приготована, є такою, що прийнятна доза буде отримана у будь-який момент з одиничної дози сполуки. Такі чинники, як розчинність, біодоступність, біологічний період напіврозпаду, шляхи введення, термін придатності продукту, а також інші фармакологічні міркування будуть зрозумілі фахівцеві у даній області одержання таких фармацевтичних композицій, і, як такі, різні дозування і схеми лікування можуть бути бажаними. 0358) Композиції, придатні для перорального введення, можуть містити: (а) рідкі розчини, такі як ефективна кількість упакованого терапевтичного агента, такого як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК), суспендовані в розчинниках, таких як вода, сольовий розчин, або РЕС 400; (р) капсули, саше або пігулки, кожна з яких містить заздалегідь визначену кількість терапевтичного агента, такого як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК), у вигляді бо рідин, твердих речовин, гранул, або желатину; (с) суспензії у відповідній рідині; і (4) прийнятні бо емульсії. Таблетовані форми можуть містити один або більше компонентів з лактози, сахарози, маніту, сорбіту, фосфату кальцію, кукурудзяного крохмалю, картопляного крохмалю, мікрокристалічної целюлози, желатину, колоїдного діоксиду кремнію, тальку, стеарату магнію, стеаринової кислоти, і інші допоміжні речовини, барвники, наповнювачі, єднальні речовини, розчинники, буферні агенти, зволожуючі агенти, консерванти, віддушки, барвники, розпушувачі і їх фармацевтично сумісні носії. Таблетовані форми можуть включати терапевтичний агент, такий як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК) з ароматизатором, наприклад, сахарозою, а також пастилки, що містять терапевтичний агент в інертній основі, такій як емульсія, гель і тому подібне, що містить желатин і гліцерин, або сахарозу і гуміарабік, що містить, на додаток до терапевтичного агента, носії, відомі у даній області. 0359) В іншому прикладі їх використання, ліпідні частки можуть бути включені у широкий діапазон актуальних лікарських форм. Наприклад, суспензія, що містить частки нуклеїнових кислот, ліпідів, такі як МР, може бути виготовлена і введена у вигляді гелів, масел, емульсій, кремів, паст, мазей, лосьйонів, пін, мусси, і тому подібного.
ІО360| При приготуванні фармацевтичних препаратів з ліпідних часток за цим винаходом, бажано використовувати кількість часток, які були очищені, щоб зменшити або усунути порожні частки або частки з терапевтичними агентами, наприклад, нуклеїновими кислотами, пов'язаними із зовнішньою поверхнею.
ЇОЗ361| Способи за цим винаходом можуть бути реалізовані в різних господарях. Бажані господарі охоплюють види ссавців, таких як примати (наприклад, людини і шимпанзе, а також інших приматів), псових, тварин із сімейства котячих, коней, корів, овець, кіз, гризунів (наприклад, щурів і мишей), зайцеподібних і свиней. (0362) Кількість часток, що вводяться, залежатиме від співвідношення терапевтичного агента (наприклад, нуклеїнових кислот) до ліпідів, особливо від використаного терапевтичного агента (наприклад, нуклеїнової кислоти), захворювання або розладу, який лікують, віку, маси і стану хворого, і рішення лікаря, але зазвичай складає від близько 0,01 до близько 50 мг на кілограм маси тіла, бажано від близько 0,1 до близько 5 мг/кг маси тіла, або близько 108-100 часток на введення (наприклад, ін'єкції).
В. Введення іп міїго
Зо ІО363)| Для застосування іп міїго, доставка терапевтичних агентів, таких як нуклеїнові кислоти (наприклад, інтерферуючі РНК) може бути зроблена в будь-яку клітину, вирощену в культурі, будь вона рослинного або тваринного походження, хребетних і безхребетних, і з будь-якої тканини або типа. У бажаних варіантах реалізації клітини є клітинами тварин, бажаніше клітинами ссавців, і найбажаніше клітинами людини (наприклад, пухлинні клітини або гепатоцити). (0364) Контакт між клітинами і ліпідними частками, коли він здійснюється в умовах іп міїго, відбувається в біологічно сумісному носієві. Концентрація часток варіюється в широких межах залежно від конкретного застосування, але зазвичай складає від близько 1 мкмоль до близько 10 ммоль. Лікування клітин ліпідними частками зазвичай проводять при фізіологічних температурах (близько 37"С) протягом періоду часу від близько 1 до 48 годин, бажано від близько 2 до 4 годин. 0365) В одній групі бажаних варіантів реалізації у суспензію ліпідних часток додається 60- 8095 поєднаних покриваючих клітин, що мають щільність клітин від близько 103 до близько 1095 клітин/імл, бажаніше близько 2 х 107 клітин/мл. Концентрація доданої до клітин суспензії складає, бажано, від близько 0,01 до 0,2 мкг/мл, бажаніше близько 0,1 мкг/мл.
ІОЗ66)| Випадки, коли тканинні культури клітин можуть бути необхідними, добре відомі у даній області техніки. Наприклад, Егезппеу, Сийиге ої Апітаї! СеїЇ5, а Мапиаї ої Вазіс Тесппідие, Зга
Еа., М/Пеу-Гівв, Мем Могк (1994), Киспіег еї а!., Віоспетіса! Меїйподз іп Сеї!!ї Сипйиге апа Мігоіоду,
Бомаеп, Ниїспіпзоп апа Коз55, Іпс. (1977), і наведені там посилання дають загальне керівництво по культурі клітин. Культивовані клітинні системи часто будуть у вигляді моношарів клітин, хоча також використовуються клітинні суспензії.
І0367| Використання аналізу Ендосомального Параметра Вивільнення (ЕКР) може оптимізувати ефективність доставки І МР або інших ліпідних часток за цим винаходом. ЕКР- аналіз детально описаний у заявці на патент США Мо 2003/0077829, розкриття якої включене у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей. Конкретніше, мета ЕЕР аналізу полягає в можливості розрізняти вплив різних катіонних ліпідів і допоміжних ліпідних компонентів ЇМР або інших ліпідних часток на основі їх відносного впливу на зв'язування/поглинання або злиття з/дестабілізацію ендосомної мембрани. Цей аналіз дозволяє визначити кількісно, як кожен компонент Ї МР або інших ліпідних часток впливає на ефективність 60 доставки і, таким чином, оптимізувати І МР або інші ліпідні частки. Як правило, ЕКР-аналіз вимірює експресію репортерного білка (наприклад, люциферази ВДВ-галактозидази, зеленого флуоресцентного білка (СЕР), і так далі), а в деяких випадках, І МР препарат, оптимізований для експресії плазміди, також може бути доцільним для інкапсуляції інтерферуючих РНК. У інших випадках, ЕКР-аналіз може бути виконаний з можливістю виміру знижуючої регуляції транскрипції або трансляції послідовності-мішені в присутності або у відсутність інтерферуючих
РНК (наприклад, міРНК). При порівнянні ЕКР для кожного з різних МР або інших ліпідних часток, можна легко визначити оптимізовану систему, наприклад, ЇМР або інших ліпідних часток, яка має найбільше поглінання у клітині.
С. Клітини для доставки ліпідних часток 0368) Композиції і способі за цим винаходом використовуються для лікування широкого спектру типів клітин, іп мімо і іп міго. Прийнятні клітини охоплюють гепатоцити, ретикуло- ендотеліальні клітини (наприклад, моноцити, макрофаги і так далі), фібробласти, ендотеліальні клітини, клітини тромбоцитів, інші типи клітин, інфіковані і чутливі до інфекції вірусами, гемопоетичні попередники (стволові) клітини, кератиноцити, скелетні і гладкі м'язові клітини, остеобласти, нейрони, лімфоцити, що покояться, термінально диференційовані клітини, повільні або нециклічні первинні клітини, паренхімні клітини, лімфоїдні клітини, епітеліальні клітини, кісткові клітини, і тому подібні, але не обмежуються ними. 0369) У конкретних варіантах реалізації активний агент або терапевтичний засіб, такий як нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК), надходить у ракові клітини (наприклад, клітини твердої пухлини), у тому числі клітини раку печінки, клітини раку легенів, раку товстої кишки, клітини раку прямої кишки, анальні ракові клітини, ракові клітини жовчних проток, клітини раку малої кишки, ракові клітини живота (шлунку), ракові клітини стравоходу, ракові клітини жовчного міхура, ракові клітини підшлункової залози, ракові клітини апендикса, ракові клітини грудей, ракові клітини яєчників, ракові клітини шийки матки, ракові клітини простати, ракові клітини нирки, ракові клітини центральної нервової системи, пухлинні клітини гліобластоми, ракові клітини шкіри, клітини лімфоми, клітини хоріокарциноми, клітини раку голови і шиї, ракові клітини остеогенної саркоми, і ракові клітини крові, але не обмежуючись ними.
ІО370| Іп мімо доставка ліпідних часток, таких як І МР інкапсульована нуклеїнова кислота (наприклад, інтерферуюча РНК) є прийнятною для ураження клітин будь-якого типа. Способи і
Зо композиції можуть бути використані з клітинами широкого спектру хребетних, у тому числі ссавців, таких як, наприклад, псові, тварини сімейства котячих, коні, корови, вівці, кози, гризуни (наприклад, миші, щури і морські свинки), зайцеподібні, свині, і примати (наприклад, мавпи, шимпанзе і люди).
О. Виявлення ліпідних часток
ІЇО371| У деяких варіантах реалізації, ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, ІМР) можуть бути виявлені у суб'єкта через близько 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше годин. У інших варіантах реалізації, ліпідні частки за цим винаходом (наприклад, І МР) можуть бути виявлені у суб'єкта через близько 8, 12, 24, 48, 60, 72 або 96 годин, або близько 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 22, 24, 25, або 28 днів після введення часток. Наявність часток може бути виявлена у клітині, тканині або інших біологічних зразках суб'єкта. Частки можуть бути виявлені, наприклад, шляхом прямого виявлення часток, виявленням терапевтичної нуклеїнової кислоти, такої як інтерферуючі РНК (наприклад, міРНК) послідовності, виявленням послідовностей-мішеней (наприклад, шляхом визначення експресії або зниження експресії послідовності, що цікавить), або їх комбінації. 1. Виявлення часток 03721 Ліпідні частки за цим винаходом, такі як МР, можуть бути виявлені за допомогою будь-якого способу, відомого у даній області. Наприклад, мітка може бути приєднана безпосередньо або опосередковано до компонента ліпідної частки з використанням способів, добре відомих у даній області. Можна використовувати широкий вибір міток. Вибір мітки залежить від необхідної чутливості, простоти сполучення з компонентом ліпідної частки, вимог до стійкості і доступних положень приладів і утилізації. Прийнятні мітки охоплюють спектральні мітки, такі як флуоресцентні барвники (наприклад, флуоресцеїн і його похідні, такі як флуоресцеїн ізотіоціанат (РІТС) ії Огедоп Сгееп'"м; родамін і його похідні, такі як Техаський червоний, тетрародимін ізотіоціанат (ТКІТС), і так далі, дигоксигенін, біотин, фікоеритрин,
АМСА, Субуев м, і тому подібне; радіоактивні мітки, такі як УЗН, 7251, 355, 110, 52р, ЗЗр, і т. д.; ферменти, такі як пероксидаза хріну, лужна фосфатаза, і т.д.; спектральні колориметричні мітки, такі як колоїдне золото або кольорове скло, або пластикові кульки, такі як полістирол, поліпропілен, латекс і тому подібні, але не обмежуються ними. Мітки можуть бути виявлені за допомогою будь-яких засобів, відомих у даній області. бо 2. Виявлення нуклеїнових кислот
ЇО373)| Нуклеїнові кислоти (наприклад, інтерферуючі РНК) виявлені і визначені кількісно у цьому описі за допомогою будь-якого з множини способів, добре відомих фахівцям у даній області. Виявлення нуклеїнових кислот може відбуватися за допомогою добре відомих способів, таких як Саузерн-блоттінг, Нозерн-блоттінг, гель-електрофорез, РСЕ, радіомічення, сцинтиляційного підрахунку і афінної хроматографії. Також можуть бути використані додаткові аналітичні біохімічні методи, такі як спектрофотометрия, рентгенографія, електрофорез, капілярний електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), тонкошарова хроматографія (ТШХ), і гіпердифузійна хроматографія.
ІО374| Вибір формату гібридизації нуклеїнових кислот не є критичним. Різні формати гібридизації нуклеїнових кислот відомі фахівцям у даній області техніки. Наприклад, поширені формати включають сендвіч-аналіз і конкурентний аналіз, або аналіз заміщення. Способи гібридизації, як правило, описані, наприклад, "Мисієїс Асій Нубгідіхайоп, А Ргасіїса! Арргоаснй",
Ед95. Натез апа Ніддіпв, ІВІ. Ргезз (1985). 0375) Чутливість гібридизації може бути підвищена за рахунок використання системи ампліфікації нуклеїнової кислоти, яка мультиплікує нуклеїнову кислоту-мішень для виявлення.
Відомі іп міго способи ампліфікації, придатні для ампліфікації послідовностей для використання як молекулярних зондів або для генерації фрагментів нуклеїнових кислот для подальшого субклонування. Приклади способів, достатніх для фахівця у даній області, такі як способи іп міго, у тому числі ампліфікація полімеразної ланцюгової реакції (РСК), у лігазну ланцюгову реакцію (СЕ), ампліфікація ОД-реплікази та інші РНК-полімераза опосередковані способи (наприклад, МАЗВА "М) знаходяться в Ззатюгоок еї аї., у МоІесшіаг Сіопіпд: А Гарогаїюгу Мапаиаї,
Соіа бргіпд Нагброг І арогаїогу Ргев5 (2000); ії А!изибеї еї аї., Зпогі Ргоїосої5 іп МоїІесшаг ВіоІоду, еа5., Ситепі РгоїосоїЇ5, сЗгеепе Рибіїзпіпуд Ав5зосіацев, Іпс. апа Чдхопп Уміеу 5 Зопв5, Іпс. (2002); а також у патенті США Мо 4683202; РСЕ. протоколи, Керівництво за способами і застосуванню (Іппіз єї а). єдв.) Асадетіс Ргезз Іпс. Зап Оіедо, СА (1990); Атнєїт 8 І еміпгоп (Осіобе" 1, 1990),
СЕМ 36; Те дошта! ОЇ МІН Резвєагсі, 3:81 (1991); Кугоп еї аї., Ргос. Маї!. Асад. сі. О5А, 86:1173 (1989); Сімагнеїїї еї аІ., Ргос. Маї). Асай. осі. ОБА, 87:1874 (1990); Готеї еї аї., у. Сііп.
Спет., 35:1826 (1989); І апдедгеп вї аї!., 5сіепсе, 241:1077 (1988); Мап Вгипі, Віотесппоіоду, 8:291 (1990); Ми апа УлаМасе, Сепе, 4:560 (1989); Вагтіпдег еї аїІ., сепе, 89:117 (1990); та 5ооКпапап
Зо апа Маїек, ВіоїесппоІоду, 13:563 (1995). Удосконалені спсособи клонування іп мйго ампліфікованої нуклеїнової кислоти описані в патенті США Мо 5426039. Інші способі, описані у даній області техніки на основі ампліфікованої послідовності нуклеїнової кислоти (МАЗВА "М,
Сапдепе, Міз5іззацда, Опіагіо) і ОД-репліказні системи. Ці системи можуть бути використані для точного виявлення мутантів, де РОК або СК праймери призначені для продовження або лігування лише тоді, коли вибрана послідовність присутня. Альтернативно, вибрана послідовність може бути як правило, ампліфікована з використанням, наприклад, неспецифічних праймерів РСК і ампліфікована ділянка-мішень пізніше зондується на предмет певної послідовності, що вказує на мутації. Розкриття описаних вище посилань включені у цей опис шляхом посилання у повному обсязі для всіх цілей.
ЇО376| Нуклеїнові кислоти для використання як зонди, наприклад, в іп міго способах ампліфікації, використовують як генні зонди або як інгібітор компонентів, як правило, хімічно синтезовані відповідно до твердої фази фосфорамідитного триефірного способу, описаного
Веаисаде сеї аї., Темпапедгоп Іейнв5., 22:1859 1862 (1981), наприклад, з використанням автоматичного синтезатора, як описано в Мееапйат МапОемапієег еї аї., Мисіеїс Асій5 Кев., 12:6159 (1984). Очищення полінуклеотидів, у разі потреби, як правило, виконується або нативним акриламідним гель-електрофорезом або аніонообмінною ВЕРХ, як описано в Реагхоп еї аї.,, У. Спгот., 255:137 149 (1983). Послідовність синтетичних полінуклеотидів може бути перевірена за допомогою способу хімічного розкладання в Махат і Сіїбегі (1980) у сго5541іпап і
МоїЇдаме (єдв5.) Асадетіс Ргезв, Мем МоїКк, Меїпоаз іп Епгуто!оду, 65:499.
ЇО377| Як альтернативний засіб для визначення рівня транскрипції іп 5йи, виступає гібридизація. Іп 5йи гібридизаційний аналіз добре відомий і, як правило, описаний в Апдегег єї аІ., МеїШод5 Еплутої., 152:649 (1987). В іп 5ійш гібридизації, клітини фіксують на твердому носієві, зазвичай предметному склі. Якщо перевіряють ДНК, клітини денатурують при нагріванні або лузі. Потім клітини вводять у контакт з розчином для гібридизації при помірній температурі, щоб виконати відпалювання специфічних зондів, які помічені. Зонди бажано помічені радіоактивними ізотопами або люмінесцентними репортерами.
ЇХ. Приклади 0378) Цей винахід буде описаний детальніше за допомогою конкретних прикладів. Наступні приклади представлені з метою ілюстрації, ії не призначені для обмеження винаходу жодним бо чином. Фахівці у даній області техніки легко зрозуміють множину некритичних параметрів, які можуть бути змінені або модифіковані з одержанням, по суті, тих самих результатів. 03791 Загальні способи: Всі реакції проводили при кімнатній температурі при позитивному тиску азоту, якщо не вказане інше. Всі реагенти були придбані з комерційних джерел і використовувалися без додаткового очищення. Хід реакції контролювали за допомогою ТІ С на силікагелі 60 254 (0,25 мм, Е. Мегск). Плями були виявлені в УФ-випромінюванні або обвуглюванні плям анісовим альдегідом або сульфатом міді. Всі хроматографії на колонці проводили на силікагелі 60 (40-60мкМ). Співвідношення між силікагелем і сирим продуктом знаходилося в діапазоні від 100 до 50:1. "Н ЯМР спектри реєстрували при 300 Мгц або 400 Мгці хімічні зрушення були внутрішньо прив'язані до залишкового протонованого розчинника (7,27 проміллє СНСІз). Органічні розчини концентрували у вакуумі при « 40"С.
Приклад 1
ІЇОЗ80)| У даному прикладі описаний синтез зразкових, триалкілових, катіонних ліпідів за цим винаходом.
Схема Синтезу для Сполуки 9 даже и жи ясне я нор тн В ви я ши « кетнквею з дю некківв я бай «НЯ де. МО, ти и шо Х ц хв о ак НИ ще ве 4 5
З
Осо -евю брчу УТ ан нан в ки ддддлю чкдени тн
З ї весь в з ря ; вн ль у уник с ти у рутини
ЕМ дтчюююттнятних 0 ПОКЕТНКУ пий ул я :
Синтез Сполуки 2 дн ОМ 0381) До охолодженого розчину (0"С) (2)-дец-4-ен-1-ол 9 (20 г, 128,0 ммоль) і триетиламіна (26,7 мл, 191,9 ммоль) у безводному дихлорметані (200 мл) повільно додавали метансульфонілхлорид (14,9 мл, 191,9 ммоль). Розчин перемішували протягом 30 хв. при кімнатній температурі, потім розбавляли дихлорметаном (100 мл). Розчин промивали насиченим розчином бікарбонату натрію (3 х 150 мл) і потім об'єднані водні фракції екстрагували дихлорметаном (150 мл). Об'єднані екстракти дихлорметану сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Залишок фільтрували через шар силікагеля (10095 дихлорметан) із одержанням (7)-дец-4-еніл метансульфоната 2 у вигляді жовтого масла (28,5 г, 9595). РГО,5 (10095 СНеСіг).
Зо Синтез Сполуки З тини ВИ
І0382| До розчину (27)-дец-4-еніл метансульфоната 2 (28,5 г, 121,1 ммоль) у 2- метилтетрагідрофурані (280 мл) додавали бромід тетрабутиламонію (48,8 г, 151,4 ммоль).
Розчин перемішували при 80"С протягом 30 хвилин в атмосфері азоту, потім розбавляли ефіром (150 мл) і промивали водою (75 мл) і насиченим розчином солі (75 мл). Ефірний розчин сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Блідо-жовте масло фільтрували через шар двоокису кремнію (10095 гексан) із одержанням (2)-1-бромодек-4-ена З у вигляді безбарвного масла (23,0 г, 8795). КГ0,9 (1095 ЕІОАс-гексани).
Синтез Сполуки 4
ОСТ
ЇОЗ383| До суспензії магнієвої стружки (1,4 г, 55,1 ммоль) у безводному ТНЕ (б мл) в атмосфері азоту повільно додавали розчин (27)-1-бромодек-4-ена З (11,5 г, 52,5 ммоль) у ТНЕ (12 мл). Реакційну суміш перемішували при 45"С протягом 30 хвилин в атмосфері азоту. Розчин охолоджували до 0"С і додають розчин етилового ефіру мурашиної кислоти (4,1 г, 55,1 ммоль) у
ТНЕ (12 мл) по краплях протягом 5 хвилин. Розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин, потім охолоджували до -157С і гасили повільно водою (10 мл), потім 5 М хлористоводневою кислотою (15 мл). Після того, як магній повністю розчинився, розчин розбавляли водою (50 мл) і екстрагували гексаном (3х75 мл). Об'єднані екстракти сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Отриманий залишок розчиняли в етанолі (40 мл) і додавали розчин гідроксиду калію (4,4 г, 78,7 ммоль)) у воді (10 мл). Реакційну суміш енергійно перемішували протягом 30 хв, потім концентрували у вакуумі, видаляючи етанол. Потім розчин підкислювали 5 М хлористоводневою кислотою (15 мл) і екстрагували гексаном (3 х 75 мл). Об'єднані екстракти гексанів сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Неочищений продукт очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 гексан до 2,595 етилацетату в гексані) із одержанням (62, 157)- хенікоза 6,15-дієн-11і-ола 4 у вигляді блідо-жовтого масла (5.6 г, 3590). КІ 0.4 (1095 ЕЮАс- гексани).
Синтез Сполуки 5
І0384| До охолодженого розчину (07С) (6727,1572)-хенікоза-6,15-дієн-11-ола 4 (5.6 г, 18,2 ммоль) і триетиламіну (3,8 мл, 27,2 ммоль) у безводному дихлорметані (50 мл) повільно додавали метансульфонілхлорид (2,1 мл, 27,2 ммоль). Реакційну суміш перемішували протягом 2 годин при кімнатній температурі, потім розбавляли дихлорметаном (50 мл). Розчин промивали насиченим розчином бікарбонату натрію (3х25 мл), потім об'єднані водні фракції екстрагували дихлорметаном (50 мл). Об'єднані екстракти дихлорметану сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Блідо-жовте масло фільтрували через шар
Зо двоокиси кремнію (100 бо ЮОСМ) із одержанням (6727, 157)-хенікоза 6,15-дієн-11-іл метансульфоната 5 у вигляді неочищеного безбарвного масла (7.6 г). КГ0.8 (10095 СНесСіг).
Синтез Сполуки 6
ССО
0385) Розчин (67, 152)-хенікоза-6,15-дієн-11-іл метансульфоната 5 (7,6 г, 19,6 ммоль) і ціаніду натрію (4,8 г, 98,1 ммоль) у безводному ОМЕ (60 мл) нагрівали до 60"С протягом ночі.
Після закінчення, реакційну суміш виливали у воду (200 мл) і екстрагували етилацетатом (3х100 мл). Комбіновані етилацетатні екстракти промивали насиченим розчином солі (3х100 мл), сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Отриманий продукт очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 гексани до 195 етилацетату в гексані) з одержанням (72)-2-(7)-дец-4-еніл)додец-б-еннітрила 6 у вигляді безбарвного масла (6.6 г, 9795).
АГО.75 (1095 ЕІОАс-гексани).
Синтез Сполуки 7 (о) дово (0386) До охолодженого розчину (-787С) (2)-2-(2)-дец-4-еніл)удодец-6-еннітрил 6 (4,0 г, 12,6 ммоль) у безводному дихлорметані (125 мл) повільно додавали 1М розчин гідриду діззобутилалюмінію в гексані (5,6 мл, 31,5 ммоль). Розчин нагрівали до -157С і перемішували протягом 1 години. Після завершення реакції реакційну суміш гасили 595 хлористоводневою кислотою (30 мл) і перемішували при -157"С, поки виділення водню не припинялося. Потім розчин розбавляли дихлорметаном (75 мл) і органічний шар промивали 5М хлористоводневою кислотою (100 мл). Діхлорметанові екстракти сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії
(10095 гексани до 295 етилацетату в гексанах) із одержанням (2)-2-(27)-дец-4-еніл)удодец-б-аля 7 у вигляді безбарвного масла (3.9 г, 9795). Р 0.65 (595 ЕОАс-гексани).
Синтез Сполуки 8 -
І0О387| До суспензії магнієвої стружки (0,6 г, 23,9 ммоль) у тетрагідрофурані (5 мл) повільно додавали розчин (27)-1-бромодек-4-ена З (4,5 г, 20,5 ммоль) у тетрагідрофурані (5 мл). Реакційну суміш перемішували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, потім додавали розчин (2)- 2-(2)-дец-4-еніл)удодец-б-аля 7 у тетрагідрофурані (5 мл). Розчин перемішували протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, потім виливали у 595 хлористоводневу кислоту (50 мл) і лід (100 мл). Розчин екстрагували ефіром (2х150 мл). Комбіновані ефірні екстракти сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії (195 етилацетат в гексанах) із одержанням (62,162)-12- ((2)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-ола 8 у вигляді безбарвного масла (4.8 г, 7695). КІ 0.45 (1095
ЕЮАс-гексани).
Синтез Сполуки 9 о Щі
А - (0388) До розчину (62, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-ола 8 (0,4 г, 0,9 ммоль), 4- (диметиламіно)бутанової кислоти гідрохлорида (0,2 г, 1,3 ммоль), гідрохлорида ЕОСІ (0,25 г, 1,3 ммоль), діїізопропілетиламіна (0,4 мл, 2,6 ммоль) у безводному дихлорметані (10 мл) додавали диметиламінопіридин (5 мг). Розчин нагрівали із зворотним холодильником протягом 2 годин, потім перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин. Суміш концентрували у вакуумі насухо і очищали колонкової хроматографією (10095 етилацетат) із одержанням 567, 162)-12-(2)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл 4-(диметиламіно)бутанової кислоти 9 у вигляді блідо-жовтого масла. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.36 (м, 6Н), 4.93 (м, 1Н), 2.30 (м, 4Н), 2.22 (с, 6Н), 2.03 (м, 12Н), 1.88 (м, 2Н), 1.66-1.18 (м, З1Н), 0.90 (м, 9Н). КГ0.3 (1095 МеОНнН-СНесСіг).
Зо Схема Синтезу для Сполук 11 і 13 а тити ще те 8 тет ще оо панна в ди іуе ди св св й 8 т пох т БО; РЕА т, Ми п - и а ве с ТА СНит, й ой " х
З зах
Зрлех
ЗДА АищеУХИщУ 2 рт ий тр зт а утютьитьья шаМОМ МИС і а що лова ди чит
Зах
Запкі
Синтез Сполуки 10 о --
Вк и о -щ- (0389) До розчину (62, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-ола 8 (2,4 г, 5,2 ммоль), 6- бромгексанової кислоти (1,5 г, 7,8 ммоль), ЕОСІ тгідрохлорида (1,5 г, 7,8 ммоль), діізопропілетиламіна (2,0 г, 156 ммоль) у безводному дихлорметані (25 мл) додавали диметиламінопіридин (15 мг). Розчин нагрівали із зворотним холодильником протягом 2 годин,
охолоджували до кімнатної температури і концентрували у вакуумі насухо. Реакційну суміш очищали за допомогою колонкової хроматографії на силікагелі 60 (2" МУ х 10" л;7 елюювання сумішшю 595 Етилацетат/гексан) з одержанням (62, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11- іл-6 бромогексаноата 10 у вигляді безбарвного масла (3.1 г, 9495). КІГ0.5 (1095 ЕТАс-гексани).
Синтез Сполуки 11 о Щі р.а -- 03901 До (6727, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11-іл 6-бромогексаноату 10 (3,1 г, 4,9 ммоль) у тефлоновій запечатаньій ємності високого тиску був доданий 5,6 М диметиламін в етанолі (20 мл) і реакційну суміш нагрівали до 707"С і перемішували протягом ночі. Після завершення реакційну суміш концентрували у вакуумі насухо. Залишок розчиняли в етилацетаті (100 мл) і промивали розчином бікарбонату натрію (2 х 50 мл). Етилацетатний шар сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 Етилацетат) із одержанням (62, 162)-12-((2)-дец-4- еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл б-(диметиламіно)гексанової кислоти 11 у вигляді блідо-жовтого масла (2.0 г, 6995), "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.36 (м, 6Н), 4.93 (м, 1Н), 2.27 (м, ТОН), 2.00 (м, 12Н), 1.63 (м, 6Н), 1.51 (м, 6Н), 1.28 (м, 25Н), 0.90 (м, 9Н). ЕГО.3 (10965 МеОН-СНесі»).
Синтез Сполуки 12 о - вини о ш
ІО391| Відповідно до процедури, описаної для синтезу (62, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл-б6 бромогексаноата 10, (67, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл-5 бромопентаноат 12 одержували у вигляді безбарвного масла (3,3 г, 61965) з (67, 162)-12-((27)-дец- 4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-ола 8 (4,0 г, 8,7 ммоль), 6-бром-М-валеріанової кислоти (2,4 г, 13,0 ммоль ), ЕОСІ гідрохлорида (2,5 г, 13,0 ммоль), дізопропілетиламіна (3,4 г, 26,0 ммоль) і диметиламінопіридина (10 мг). КГО.5 (1095 ЕОАс-гексани).
Синтез Сполуки 13
Коо) о - кни о - 0392) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (67, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл 6-(диметиламіно)гексанової кислоти 11, (62, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16- дієн-11-іл 5-(диметиламіно) пентанової кислоти 13 був отриманий у вигляді блідо-жовтого масла (1,9 г, 62965) з 5,6 М диметиламіну в етанолі (20 мл). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.45-5.28 (м, 6Н), 4.95-4.90 (м, 1Н), 2.34-2.23 (м, 4Н), 2.23-2.20 (с, 6Н), 2.06-1.92 (м, 12Н), 1.70-1.58 (м, 5Н), 1.58- 1.44 (м, 5Н), 1.44-1.15 (м, 25Н), 0.92-0.87 (м, 9Н). КГ0.4 (10965 МеОнН-СНесСіг).
Схема Синтезу для Сполуки 14 го пе о а З се тв а ей кі пу ; а и офоови потен по ох і пи дддддаит дис цик ати і Муки ще ї4
Синтез Сполуки 14 (в)
ІЇО393| У колбу, що містить (62,162)-12-((2)-нон-4-ен-1-іл)у-трикоза 6,16-дієн-11-іл о 5- (диметиламіно)пентанової кислоти 13 (200 мг, 0,34 ммоль) відкачували і знову заповнювали азотом (двічі), потім обробляли Ра/сС (150 мг, 10 мас./мас.95), а потім суспендують в ЕІОАс (10 мл). Реакційну колбу потім відкачують і назад заполняють Но (Зх) і суміш енергійно перемішували (18 год). Но потім відкачують і колбу знову наповнюють М». Реакційну суміш фільтрували через целіт, промиваючи фільтрувальний коржик етилацетатом, і фільтрат концентрували. Сирий продукт піддають хроматографії (етилацетат) із одержанням 12- нонілтрикозан-11-іл 5-(диметиламіно)пентанової кислоти 14 (100 мг, 5095) у вигляді безбарвного масла. КГО,35 (1095 СНзЗОН-СНеСІ»); "Н ЯМР (400МГц, СОС», бн) 4,95-4,90 (м, 1Н), 2.31 (т, 2Н), 2,21 (т, 2Н), 2,21 (с, 6Н), 1,68-1,60 (м, ЗН), 1,58-1,42 (м, 5Н), 1,38-1,16 (м, 54Н), 0,88 (т, 6Н).
Схема Синтезу для Сполук 19 і 21 хх м МЖК са ЯЗОК, ке а о Іа І ВН Кос те А ее сн г Не нах я св пи ше тя в я з. зр ЗМ МК и, Ще о ан Ї що. под КАМ КЮ кю кт юю ккд щ й до в: й со ой г ев нртютттья й аа ОА ВХ он же со ч
Ї о єв ям де чаплацн Форд ють вний 5 я р ов нн о п т шафа а и й чи Еанй, М Ка ча ах яких ах РУ
Синтез Сполуки 15
М5О. ит
І0394| Відповідно до процедури, описаної для синтезу (7)-дец-4-еніл метансульфоната 2, (24)-нон-3-еніл метансульфонат 15 одержували у вигляді жовтого масла (28,5 г, 9290) з (2)-нон-3- ен-1-ола (20,0 г, 128,0 ммоль), триетиламіну (26,7 мл, 191,9 ммоль) і метансульфонілхлорида (14,9 мл, 191,9 ммоль). КІГ0.15 (3095 ЕІЮАс-гексани).
Синтез Сполуки 16
Ву ит
І0395| Відповідно до процедури, описаної для синтезу (2)-1-бромодец-4-ена 3, (2)-1- бромонон-3-ен 16 одержували у вигляді безбарвного масла (27.0 г, кількісно) з (7)-дец-4-еніл
Зо метансульфоната 15 (28.5 г, 129 ммоль) і тетрабутиламоній броміду (52.0 г, 161.4 ммоль). КІГ0.6 (1095 ЕЮАс-гексани).
Синтез Сполуки 17 0396) У 100-мл круглодонну колбу поміщали магнієву стружку (0,6 г, 25,7 ммоль) і мішалку.
Колбу висушували з використанням фену протягом 5 хвилин. У колбу завантажують ТНЕ (5 мл) і одне зерно йоду. Додавали розчин (2)-1-бромонон-3-ена (4,5 г, 22,0 ммоль) у ТНЕ (5 мл) повільно до суміші і реакційну суміш кип'ятили із зворотним холодильником протягом 30 хвилин в атмосфері азоту. Розчин охолоджували до кімнатної температури, і розчин (2)-2-(2)-дец-4- еніл)додец-б6б-аля 7 (4,7 г, 14,7 ммоль) був доданий у ТНЕ (5 мл). Розчин перемішували протягом ночі при кімнатній температурі і після закінчення суміш виливали в 595 НСІ (50 мл) і льоду (100 мл). Розчин екстрагували ефіром (2 х 150 мл), і об'єднані ефірні екстракти сушили сульфатом магнію, фильтуювали і концентрували у вакуумі насухо. Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії (колонка: 2 "МУ" х 8 л; з елююванням 10095 гексани до 595 етилацетату в гексанах) із одержанням (67, 152)-11-((2)-4-дец-4-еніл)-хенікоза 6,15-дієн-10-ола 17 у вигляді безбарвного масла (5.4 г, 8295). КГ0.5 (1095 ЕТОАс-гексани).
Синтез Сполуки 18 о - ви --
І0397| Відповідно до процедури, описаної для синтезу (62,162)-12-(27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл-б6 бромогексаноата 10 (67, 152)-11-((27)-дец-4-еніл)-хенікоза 6,15-дієн-10-іл-5 бромопентаноат 18 одержують у вигляді безбарвного масла (0,9 г, 6695) з (67, 1527)-11-((27)-дец- 4-еніл)-хенікоза 6,15-дієн-10-ола 17 (0,35 г, 0,7 ммоль), 5-бром-М-валеріанової кислоти (0,60 г, 3,4 ммоль), ЕОСІ (0,60 г, 3,4 ммоль), дііззопропілетиламін (0,90 г, 6,7 ммоль) і ОМАР (5 мг, каталізатор). КГО.5 (1095 ЕТАс-гексани).
Синтез Сполуки 19 о - крики Ко с (0398) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (67, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іл б-(диметиламіно)гексаноата 11, (627, 152)-11-((2)-дец-4-еніл)хенікоза-6,15-дієн- 10-іла 5-(диметиламіно)пентаноат 19 одержують у вигляді безбарвного масла (0.2 г, 24965) з 5.6
М диметиламіну в етанолі (10 мл) і (62,152)-11-((2)-дец-4-еніл)хенікоза-6,15-дієн-10-ола 17 (0.35 г, 0.7 ммоль). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.40-5.28 (м, 6Н), 4.97-4.88 (м, 1Н), 2.35-2.24 (м, 4Н), 2.24-2.19 (м, 6Н), 2.08-1.93 (м, 12Н), 1.70-1.55 (м, ЗН), 1.55-1.45 (м, 5Н), 1.45-1.13 (м, 25Н), 0.93- 0.82 (м, 9Н). КГ0.4 (1095 МеОнН-СНесіг).
Синтез Сполуки 20 о -
Ве у --
І0399| Відповідно до процедури, описаної для синтезу (62,162)-12-(27)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іл б-бромогексаноата 10, (67, 157)-11-((2)-дец-4-еніл)хенікоза-6,15-дієн-10-іла 6- бромогексаноат 20 одержують у вигляді безбарвного масла (1.4 г, 9995) з (627,152)-11-(2)-дец-4- еніл)хенікоза-б,15-дієн-10-ола 17 (0.35 г, 0.7 ммоль), 6-Бромо-н-капронової кислоти (0.70 г, 3.4 ммоль), ЕОСІ (0.60 г, 3.4 ммоль), діїізопропілетиламіна (0.90 г, 6.7 ммоль) і ОМАР (5 мг, катазизатор). КГО.6 (1095 ЕТАс-гексани).
Синтез Сполуки 21 о Щ
Арт о - 0400) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (67, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іла б-(диметиламіно)гексаноата 11 (67, 152)-11-((2)-дец-4-еніл)хенікоза-6,15-дієн- 10-іла 6-(диметиламіно)гексаноат 21 одержують у вигляді безбарвного масла (1.2 г, 92965) з 5.6
М диметіаміна в етанолі (15 мл). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.44-5.28 (м, 6Н), 4.95-4.88 (м, 1Н), 2.33-2.19 (м, 1ОН), 2.08-1.90 (м, 12Н), 1.70-1.23 (м, 9Н), 1.23-1.14 (м, 26Н), 0.93-0.85 (м, 9Н). Кг 0.15 (1095 МеОнН-СНеСІг).
Схема Синтезу для Сполуки 22 шк | Ії о - но - оон ра -Щ н ЕОСІ, ОІРЕА - 7 ОМАР, СНЬСІ» 22
Синтез Сполуки 22 о Щ ра --
І0401| До розчину (62, 152)-11-((27)-дец-4-еніл)-хенікоза 6,15-дієн-10-ола 17 (0,5 г, 1,1 ммоль), 4-(диметиламіно)бутанової кислоти гідрохлорида (0,3 г, 1,7 ммоль), ЕОСІ гідрохлорида (0,3 г, 1,7 ммоль), додавали ОІРЕА (0,4 г, 3,4 ммоль) у безводному дихлорметані (10 мл) додавали ОМАР (5 мг). Розчин перемішували при кімнатній температурі протягом ночі в атмосфері азоту. Суміш концентрували у вакуумі насухо, потім поміщали у ОСМ (150 мл) і екстрагували насиченим розчином бікарбонату натрію. Реакційну суміш очищали за допомогою колонкової хроматографії на силікагелі 60 (1:11 етилацетат/гексани) з одержанням (62, 152)-11- ((2)-дек4-еніл)-хенікоза 6,15-дієн-10-іл 4-(диметиламіно)бутанової кислоти 22 у вигляді безбарвного масла (0,4 г, 6795). "Н-ЯМР (400 Мгц, СОСІ») б 5.40-5.28 (м, 6Н), 4.97-4.90 (м, 1Н), 2.36-2.25 (м, 4Н), 2.25-2.19 (м, 6Н), 2,07-1,95 (м, 12Н), 1.85-1.73 (м, 2Н), 1.58-1.45 (м, ЗН), 1.45- 1.10 (м, 24Н), 0.93-0.85 (м, 9Н). ЕГ0.4 (1095 МеОнН-СНесі»).
Схема Синтезу для Сполук 23, 24125 п інн с я | о ни а
Зудифосган ЕьО , Ї оф шини Мейо вади Ти тт Арени "вк в-ва й 8 й 23Н-3. п зЕв-нв-? гавк-нН п:
Синтез Сполуки 23 о -- кава -
І0401| Розчин (62, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11-ола 8 (0,5 г, 1,1 ммоль) у безводному діетиловому ефірі (10 мл) повільно додавали до розчину дифосгену (0,2 мл, 1,8 ммоль) у безводному діетиловому ефірі, охолоджували до близько -157С. Розчин перемішували протягом 1 години, потім М,М,М'-триметил-1,3-пропандіаміна (1.3 мл, 8.7 ммоль) додавали при - 1570. Розчин нагрівали до кімнатної температури, перемішували протягом 1 години, а потім фільтрували, щоб видалити солі амонія і сечовини. Фільтрат діетилового ефіру упарювали у
Зо вакуумі насухо. Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 етилацетат) із одержанням (67, 162)-12-(2)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл 3- (диметиламіно)пропіл(метил)карбамата 23 у вигляді безбарвного масла (0,15 г, 2395), "Н ЯМР (400 Мгц, СОСІ») б 5.41-5.29 (м, 6Н), 4.85-4.77 (м, 1Н), 3.35-3.21 (м, 2Н), 2.93-2.81 (м, ЗН), 2.31- 2.17 (м, 8Н), 2.08-1.92 (м, 12Н), 1.75-1.64 (м, 2Н), 1.64-1.15 (м, З1Н), 0,92 -0,85 (м, 9Н). М 0.45 (1095 МЕОН-СНеСі»).
Синтез Сполуки 24 о -- квар --
Н
0403) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (67, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іл З--(диметиламіно)пропіл(метил)карбамата 23, (67, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іл 3З-(диметиламіно)пропілкарбамат 24 одержували у вигляді безбарвного масла
(01 г, 1790) з (627, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса-б,16-дієн-11-олу 8 (0,5 г, 1,1 ммоль), дифосгена (0,2 мл, 1,8 ммоль), піридина, і З-(диметиламіно)-1-пропіламіна (0,9 г, 8,7 ммоль). "Н ЯМР (400
МГц, СОСІз») б 5,44-5,28 (м, 6Н), 4,81-4,72 (бс, 1Н), 4,55-4,45 (бс, 1Н), 3,34-3,15 (м, ЗН), 245-213 (м, 7Н), 2,10-1,86 (м, 12Н), 1,75-1,57 (м, ЗН), 1,57-1,03 (м, ЗОН), 0,93-0,85 (м, 9Н). КГ 0,2 (1095
Ммеон-СнНесі»).
Синтез Сполуки 25
Щ рання --
Н
(0404) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (67, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іл З--(диметиламіно)пропіл(метил)карбамата 23, (67, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса- 6,16-дієн-11-іл 2-(диметиламіно)пропілкарбамат 25 одержували у вигляді безбарвного масла (0.20 г, 33905) з (627, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)удокоса-6,16б-дієн-і1-ола 8 (0.5 г, 1.1 ммоль), дифосгена (0,2 мл, 1,8 ммоль) і М,М-диметилетилендіаміна (0,8 г, 8,7 ммоль). "Н ЯМР (400 МГц,
СОбсІ») б 5,40-5,28 (м, 6Н), 5,08-5,01 (бс, 1Н), 4,82-4,73 (бс, 1Н), 3,30-3,18 (м, 2Н), 2,44-2,35 (м, 2Н), 2,30-2,20 (т, 6Н), 2,07-1,91 (м, 12Н), 1,65-1,11 (м, З1Н), 0,93-0,85 (м, 9Н). ЕГ0,4 (1095 МеОн-
ОСМ).
Схема Синтезу для Сполук 26, 27 і 28 у дит пес сн і Го па дути виття ди З МЖжтх пе до Вдечкмоя во:
М дичини 7 - Ма «й й В и дв ин жи і? й двденякі вав их 29 І зап»сний»
Синтез Сполуки 26 9 що рання --
Н
І0405| Розчин (67, 152)-11-((27)-дец-4-ен-1-ілу-докоса 6,15-дієн-10-ола 17 (2,25 г, 5,036 ммоль) і піридину (611 мкл, 7,6 ммоль) в безводному етилацетаті (15 мл) додавали до охолодженого (072) розчину дифосгену (910 мкл, 7,6 ммоль) в етилацетаті (15 мл). Після перемішування (10 хв) реакційну суміш фільтрували і концентрували для того, щоб видалити
Зо розчинник і газ фосген, що залишився. Третину цієї хлормурашиної кислоти (0,879 г, 1,679 ммоль) розчиняли в етилацетаті (5 мл) і додавали до охолодженого (07"С) розчину з М,М диметилетилендіаміна (367 мкл, 3,4 ммоль) в безводному етилацетаті (5 мл). Після перемішування (20 хвилин), суміш фільтрували, концентрували і піддавали хроматографії (10095 етилацетат) із одержанням (627, 152)-11-((2)-дец-4-ен-1-іл)-б-докоса-15-дієн-10-іл. (2- (диметиламіно)етил)карбамінової кислоти 26 (603 мг, 6495) у вигляді прозорого безбарвного масла. Кг 0,28 (1095 МеОн/СНеСІг); "Н ЯМР (400 Мгц, СОС», бн) 5,45-5,36 (м, 6Н), 5,30 (с, 1Н), 4,89-4,78 (м, 1Н), 3,32-3,21 (м, 2Н), 2,42 (т, 2Н), 2,25 (с, 6Н), 2,16-1,94 (м, 12Н), 1,63-1,19 (м, 29Н), 0,92 (т, 9Н).
Синтез Сполуки 27 о - кран -
Н
І0406| Охолоджений (07"С) розчин ефіру хлормурашиної кислоти (0,88 г, 1,7 ммоль) (одержаний в синтезі (624, 152)-11-((2)-дец-4-ен-1-іл)-докоса-б,15-дієн-10-іл (2- (диметиламіно)етил)карбамінової кислоти 26) розчиняли в безводному етилацетаті (5 мл) і додавали до розчину в М,М диметилетилендіаміні (422 мкл, 3,4 ммоль) у безводному етилацетаті (5 мл). Після закінчення (20 хв), розчин фільтрували, концентрували і неочищений продукт очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 етилацетат) із одержанням (62, 152)-11-((2)-дец-4-ен-1-ілу-докоса 6,15-дієн-10-іл. (3-(диметиламіно)пропіл)укарбамінової кислоти 27 (675 мг, 7095) у вигляді прозорого безбарвного масла. КІ 0,32 (1095 МеОнН/СНеСІг); Н
ЯМР (400МГц, СОСІ», бн) 5,44-5,33 (м, 6Н), 4.86-4.78 (м, 1Н), 3,32-3,21 (м, 2Н), 2,36 (т, 2Н), 2,24 (с, 6Н), 2,14-1,97 (м, 12Н), 1,69 (додаток. п, 2Н), 1,61-1,50 (м, ЗН), 1,50-1,20 (м, 27Н), 0,91 (т, 9Н).
Синтез Сполуки 28 о - аа --
І0407| Охолоджений (07"С) розчин ефіру хлормурашиної кислоти (0,88 г, 1,7 ммоль) (одержаний в синтезі (624, 152)-11-((2)-дец-4-ен-1-іл)-докоса-б,15-дієн-10-іл (2- (диметиламіно)етил)ікарбамінової кислоти 26) розчиняли в безводному етилацетаті (5 мл) і додавали до розчину М,М,М'-диметилетилендіаміна (492 мкл, 3,4 ммоль) у безводому етилацетаті (5 мл). Після закінчення (20 хв.), розчин фільтрували, концентрували і неочищений продукт очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 етилацетат) із одержанням (627, 152)-11-((2)-дец-4-ен-1-іл)-хенікоза-6,15-дієн-10-іл (3- (диметиламіно)пропіл)ух(метил)ікарбамата 28 (672 мг, 6895) у вигляді прозорого безбарвного масла. М 0.44 (1095 МЕОН/СНеСІ»); "Н ЯМР (400МГц, СОС», бн) 5.43-5.32 (м, 6Н), 4,85 (шир. С, 1Н), 3.38-3.27 (м, 2Н), 2.95-2.87 (м, ЗН), 2,28 (т, 2Н У, 2,24 (с, 6Н), 2.14-1.96 (м, 12Н), 1,72 (додаток. п, 2Н), 1.67-1.49 (м, ЗН), 1.49-1.20 (м, 26Н), 0,91 (т, 9Н).
Схема Синтезу для Сполук 30 і 31 м ня Що т з 2) 0 но -ь ну -- о 29 й он і о Щ
ЕОСІ, ОІРЕА Чо -
ОМАР, СНоСІ; 3З0п-2 31п-1
Синтез Сполуки 29 но -
Зо (04041) У 100-мл круглодонну колбу додавали магнієву стружку (263 мг, 10,9 ммоль) і магнітну мішалку. Колбу висушували з використанням фену протягом 5 хв., охолоджували в атмосфері азоту до ТНЕ (5 мл) і додавали невелике зерно йоду. Був доданий розчин (72)-1-бромодец-4-ену
З (2 г, 9,1 ммоль) у ТНЕ (5 мл). Розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин, потім додавали етиловий гліоксалат (0,375 мл, 1,82 ммоль, 5095 розчин у толуолі). Після закінчення розчин гасили насиченим розчином хлориду амонію (5 мл) і перемішували до того часу, поки не розчинився надлишок магнію. Розчин розбавляли водою і екстрагували етилацетатом (3х50 мл). Об'єднані екстракти сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо. Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії (10095 гексани до 2095 етилацетату в гексанах) із одержанням (6727, 162)-11-((2)-дец-4-еніл) докоса-6,16-дієн-11,12 діола 29 у вигляді безбарвного масла (700 мг, 48965).
Синтез Сполуки 30
Шо о) -- т - но Шо 0409) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (6727, 162)-12-((7)-дец-4-еніл)-докоса- 6б.16-дієн-11-іл 4-(диметиламіно)бутанової кислоти 9, (67, 162)-12-(27)-дец-4-еніл)-12- гідроксидокоса-6,16-дієн-11-іл. 4--(диметиламіно)бутанової кислоти 30 одержували у вигляді безбарвного масла (0,10 г, 2595) з (67, 162)-11-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11,12-діола (0,35 г, 0,7 ммоль), 4-(диметиламіно)бутанової кислоти гідрохлорида (0,20 г, 1,1 ммоль), ЕОСІ (0,20 г, 11 ммоль), діізопропілетиламіна (0,3 г, 2,2 ммоль) і ОМАР (5 мг, каталізатор). "Н ЯМР (400 МГц,
СОбсІ») б 5,44-5,28 (м, 6Н), 5,03-4,95 (м, 1Н), 2,25-2,17 (м, 6Н), 2,14-1,65 (м, 14Н), 1,65-1,10 (м,
ЗЗН), 0,93-0,82 (м, 9Н). КГ0,2 (1095 МеЕОН-СНесі»).
Синтез Сполуки 31 поч й - -- оо 0410) Відповідно до процедури, описаної для синтезу (627, 162)-12-((27)-дец-4-еніл) докоса- 6б.16-дієн-11-іл 4-(диметиламіно)бутанової кислоти 9, (67, 162)-12-((27)-дец-4-еніл) -12- гідроксидокоса-6,16-дієн-11-іл З-(диметиламіно) пропаноат 31 одержували у вигляді безбарвного масла (0,4 г, 3395) з (67, 1627)-11-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11,12-діола (1,0 г, 2,1 ммоль), 4-(диметиламіно)бутанової кислоти гідрохлорида (0,50 г, 3,1 ммоль), ЕОСІ (0,60 г, 3,1 ммоль), діїізопропілетиламіна (0,80 г, 6,3 ммоль) і ОМАР (5 мг, каталізатор). "Н ЯМР (400
МГц, СОСІ») б 5,40-5,28 (м, 6Н), 5,12-5,07 (м, 1Н), 4,75-4,55 (шс, 1Н), 2,77-2,65 (м, 1Н), 2,65-2,А41 (м, ЗН), 2,28-2,15 (м, 6Н), 2,15-1,92 (м, 12Н), 1,67-1,10 (м, ЗОН), 0,93-0.82 (м, 9Н). КГ0,5 (1090
Ммеон-СнНесі»).
Схема Синтезу для Сполуки 40
Ко но о тн «ДИ з те Я вини кори КК и че нн сере - р а в я з сн, м мк же ж и и в о ШИ Я Ин ан в о я у вакунаях ХК днини б ЯН вна а че
ВК дис як ки, МЕ. Ж вази а ни Ка а аа КУКИ з Зк се нь КИ Й Енн ай ее ся по МН оди вер ии, СИЛ, й Ху Яни" екдукси нн чнЕ е їх КО орки йти ва Ан В НО ваш баси губа дети, пнгонтюсвнкекнкнннннн ект «В часи збу Кокс с хх ща
Синтез Сполуки 33
ТИ ОМ
І0411| Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 2, (2)-нон-3-еніл метансульфонат 33 одержували у вигляді масла жовтого кольору (33 г, 8590) з (2)-нон-3-ен 1- ола 32 (25,0 г, 176 ммоль), триетиламіну (25,0 мл) і метансульфонілхлориду (27,2 мл, 352 ммоль). КГ0,68 (СНесіг).
Синтез Сполуки 34 м а ль В:
І0412| Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 3, (27)-нон-3-еніл броміду 34 одержували у вигляді жовтого масла (20,2 г, 8595) з (7)-нон-3-еніл метансульфоната (25,7 г, 117 ммоль) і бромід тетрабутиламонію (52,6 г, 163 ммоль). КГ 0,73 (гексани).
Синтез Сполуки 35 пове (0413) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 4, (67, 137)-нондека-6,13-дієн-10-ол 35 (9,11 г, 8595) одержували у вигляді безбарвного масла з (7)-нон-3-еніл броміду (15,8 г, 76,8 ммоль), магнієвої стружки (2,0 г, 82 ммоль), етилформіату (6,36 мл, 79,1 ммоль) і гідроксиду калію (3,88 г, 69,1 ммоль). КГ 0,43 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 36 (0414) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 5, (67, 137)-нондека-6,13-дієн-10-іл метансульфоната 36 (11,6 г, 9995) одержували у вигляді безбарвного масла з (67, 137)-нондека- 6,13-дієн-10-ола (9,11 г, 32,5 ммоль), триетиламіна (10 мл) і метансульфонілхлорида (5,0 мл, 65 ммоль). КІГ0.73 (СНеСіг).
Синтез Сполуки 37 пода (0415) Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 6, (2)-2-((2)-нон-3- ен-1-ілуундец-5-еннітрила 37 (7,2 г, 7795) одержували у вигляді безбарвного масла з (67, 137)- нондека-6б,13-дієн-10-іл метансульфоната (11,6 г, 32,3 ммоль) і ціаніду натрію (3,96 г, 80,9 ммоль). КГО,75 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 38 (в) пово 0416) Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 7, (2)-2-((2)-нон-3-
Зо ен-1-ілуундец-5-аль 38 (5,0 г, 6995) одержували у вигляді безбарвного масла з (2)-2-((27)-нон-3- ен-1-ілуундец-5-еннітрила (7,2 г, 24,9 ммоль) і ОІВАГ. (49,7 мл, як 1 М розчин у гексанах, 49,7 ммоль). КІ 0,69 (10 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 39 от
І0417| Відповідно до процедури, описаної для синтезу 8, (627, 142)-11-((2)-нон-3-ен-1-іл)- ікоса-6,14-дієн-10-ол 39 (1,64 г, 7695) одержували у вигляді безбарвного масла з (7)-2-((2)-нон-3- ен-1-іл)у-ундец-о-аля (1,5 г, 5,1 ммоль), (2)-нон-3-еніл бромід (1,58 г, 7,7 ммоль) і магнієвої стружки (206 мг, 8,5 ммоль). КІГ 0,46 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 40 о Щ рання -
Ї0418| Відповідно до процедури, описаної для синтезу 9, (627, 162)-12-((2)-дец-4-ен-1- ілудокоса-6,16-дієн-11-іл 4-(диметиламіно)бутанової кислоти 40 (483 мг, 7695) одержували у вигляді безбарвного масла з (67, 142)-11-((2)-нон-3-ен-1-іл)-ікоза-6,14-дієн-10-ола (500 мг, 1,19 ммоль), ЕОС (686 мг, 3,58 ммоль), основи Хюніга (726 мкл, 4,17 ммоль) і гідрохлорида М,М- диметиламінобутирової кислоти (600 мг, 3,58 ммоль). КІ 0,43 (1095 СНзЗОН-СНеСІг).
Схема Синтеза для Сполуки 42 їй ям ана ЩІ мов а я тя а в п жди ик пе ана плядятеттяяттян тяж тя тях. яке но шити в; гори диттьит
Що Я я ле КОС, ПеКА у удень пед не ока ня ВМАР, СН, аа
Ко я
З. БМ дкетилнни 5 а о й нн «НИ о ен й ана й
Єхандя. МР Її и М динею дитя, 4
Синтез Сполуки 41 о -
Вг рух о --
І0419| Відповідно до процедури, описаної для синтезу 10, (67, 142)-11-((2)-нон-3-ен-1- іл)ікоза-6,14-дієн-10-іл 5-бромопентаноата 41 (655 мг, 9595) одержували у вигляді безбарвного масла з (67, 142)-11-((2)-нон-3-ен-1-іл)ікоза-6,14-дієн-10-ола (500 мг, 1,19 ммоль), ЕОС (686 мг, 3.58 ммоль) і 5-бромвалеріанової кислоти (649 мг, 3,58 ммоль). КІ 0,54 (595 етилацетат- гексани).
Синтез Сполуки 42 о - аа - - (0420) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 11, (627, 142)-11-((27)-нон-3-ен-1- іл)ікоза-6,14-дієн-10-іл 5-(диметиламіно)пентанової кислоти 42 (421 мг, 6895) одержували у вигляді безбарвного масла З (67, 147)-11-((2)-нон-3-ен-1-іл)ікоза-6,14-дієн-10-іл-5 бромопентаноата (655 мг, 1,13 ммоль) і диметиламіну (25 мл у вигляді розчину в 5,6 М ЕН). КІ 0.4 (1095 СНзЗОН-СН»еСІг).
Схема Синтезу для Сполуки 50
М ан в ЗМ же пли а ін я нн КВ ож «3 джених а у ЯМА . кон, вою 44 путь Псзожеий МО тити тить ван у са ль а во Гзсвья а ав й иа я й м 38 т ск Мдій Кн в
Ними отити отит рт і щ ще седит г нн нн о не нон тТНЕ І ; пит тт а а " Кі
Ж ко а ці не ся Ж о НІ че че о . й пава вит пане -х й ве о
ЕС, НЕБА а а а
ММА сних Й
І БУ з потом Ен пед кит і вомрм у х т- ІЙ пекджтн і Є, й я шен, ко Е ут
Ж
Синтез Сполуки 44 шов 0421) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 4, хенікозан-11-ол 44 (7,06 г, 99905) одержували у вигляді безбарвного масла з бромдекана (9,4 мл, 45.2 ммоль), магнієвої стружки (1,18 г, 48,4 ммоль), етилформіата (3,74 мл, 46,6 ммоль) і гідроксида калію (2,28 г, 40,7 ммоль).
ЕГО,36 (1095 етилацетат-гексан), ЕМ 312.57, СгіНагО.
Синтез Сполуки 45 (0422) Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 5, хенікозан-11- ілметансульфонат 45 (6,87 г, 7895) одержували у вигляді безбарвного масла з хенікозан-11-ола (7,06 г, 22,6 ммоль), триетиламіну (22 мл) і метансульфонілхлориду (3,5 мл, 45 ммоль). КІ 0.86 (СНесі»).
Синтез Сполуки 46 пово (0423) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 6, 2-децилдодеканенітрил 46 (2,25 г, 4095) одержували у вигляді безбарвного масла з хенікозан-11-іл метансульфоната (6,87 г, 17.6 ммоль) і ціаніду натрію (4,31 г, 87,9 ммоль). КГО,84 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 47 (в) ово
Ї0424| Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 7, 2- децилдодеканал 47 (1,91 г, 8495) одержували у вигляді безбарвного масла з 2- децилдодеканенітрила (2,25 г, 7,0 ммоль) і ОСІВАГ. (14 мл, у вигляді розчину 1 М в гексанах, 14 ммоль). КГО,51 (595 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 48 овога
Ї0425| Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 8, (2)-12- децилдокос-б-ен-1і-ол 48 (1,08 г, 4095) одержували у вигляді безбарвного масла з 2- децилдодеканала (1,91 г, 5,87 ммоль), (7)-дец-4-еніл броміда (1,45 г, 7,05 ммоль) і магнієвих стружок (183 мг, 7,54 ммоль). КГО,26 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 49 о - вити о (0426) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 10, (2)-12-децилдокос-6-ен-11-іл-5 бромопентаноат 49 (916 мг, 6395) одержували у вигляді безбарвного масла з (7)-12-децилдокос- б-ен-11-олу (1,08 г, 2,33 ммоль), ЕОС (804 мг, 4,19 ммоль) і 5-бромвалеріанової кислоти (1,27 г, 6,99 ммоль). КІГ0,29 (590 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 50 о - кни о
І0427| Відповідно до процедури, описаної для синтезу 11, (27)-12-децилдокос-6-ен-11-іл 5- (диметиламіно)пентанової кислоти 50 (662 мг, 8095) одержували у вигляді безбарвного масла з (2)-12-децилдокос-6-ен-11-іл-5 бромопентаноата (916 мг, 1.16 ммоль) і диметиламіну (27 мл у вигляді розчину 5,6 М ЕН). КГ0.51 (1095 СНЗОН-СНеСІг).
Схема Синтеза для Сполуки 53 е)
УТ й ТНЕ Н 1 Б1
АД ІЙ
ЕОСІ, ОІРЕА
ОМАР, СНЬСІЬ - жо 52 о ую -- 5
Синтез Сполуки 51 0428) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 8, (2)-12-((2)-дец-4-ен-1-іл) докос-16- ен-11-ол 51 (3,37 г, 6595) одержували у вигляді безбарвного масла з (7)-2-((7)-дец-4-еніл)додец- б-аля 7 (3,6 г, 11.2 ммоль), 1-бромдекана (3,5 мл, 16,9 ммол) і магнієвої стружки (438 мг, 18,0 ммоль). КГО,31 (595 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 52 (в) вино - 0429) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 10, (2)-12-((27)-дец-4-ен-1-іл) докос-16- ен-11-іл-5 бромопентаноат 52 (4,69 г, 9995) одержуювали у вигляді безбарвного масла з (2)-12- ((27)-дек4-ен-1-ілудокос-16б-ен-11-ола (3,37 г, 7,29 ммоль), ЕОС (2,51 г, 13.1 ммоль) і 5- бромвалеріанової кислоти (3,96 г, 21,8 ммоль). КІ 0,56 (595 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 53 (о! ки -
Коо) - 0430) Відповідно до процедури, описаної для синтезу 11, (27)-12-децилдокос-6-ен-11-іл 5- (диметиламіно)пентанової кислоти 53 (943 мг, 9995) одержували у вигляді безбарвного масла з (2)-12-децилдокос-6-ен-11-іл-5 бромопентаноата (1,0 г, 1,6 ммоль) і диметиламіну (30 мл у вигляді розчину 5,6 М ЕН). КГ0.50 (1095 СНЗОН-СНеСІг).
Приклад 2
І0431| Цей Приклад порівнює ефективність у мишачій моделі активності АроВ міРнНК, триалкіламін ліпідів коротких ланцюгів за цим винаходом з ліпідами, що мають довші алкільні ланцюги, але які інакше є конструктивно ідентичними з коротким ланцюгом триалкіламін ліпідів.
ІЇ0432| Композиції нуклеїнових кислотно-ліпідних часток, що містять катіонні ліпіди, оцінювали по їх здатності зупиняти експресію АроВ у печінці від 7 до 9-тижневих самок ВАГ! В/с мишей. Мишам вводили внутрішньовенно (у хвостову вену) у групах по три на кожну 0,02, 0,03 або 0,05 мг/кг. Зупинка АроВ (нормализований конститутивний ген ЗАРОН) була виміряна по відношенню до РВ5 як негативний контроль. Кожен експеримент був припинений через 48 годин після прийому препарату.
Ї0433| Для порівняння з позитивним контролем, продуктивність короткого ланцюга триалкіламін ліпідів за цим винаходом порівнювали з висококатіонним ліпідом, що називається
С2К, який, як відомо, полегшує доставку нуклеїнових кислот іп мімо в нуклеїнові кислотно-ліпідні частки (Маїиге Віоїесн., Мої. 28(2),172 (2010)). СК має наступну структуру: пово сж 04341 Як показано в Таблиці 1, при введенні дози від 0,02 мг/кг, 10 з 11 катіонних ліпідів за цим винаходом (сполуки 9, 13, 14, 19, 22, 27, 40, 42, 50 і 53) відображують більшу активність, ніж бок.
Таблиця 1
Сайленсинг АРОВ (0.02 мг/кг міРНК) для різних триалкіл катіонних ліпідів за цим винаходом
Доза міРНк Сполука Сайленсинг АРОВ гена, схожого з РВ5 контролем
У (Печінка АроВ:САРО мРНК співвідношення) нинишининнше нн
Оля мк 0435) Як показано в Таблиці 2, в окремому експерименті, при введенні дози 0,03 мг/кг, 5 з 7 катіонних ліпідів за цим винаходом (сполуки 11, 13, 19, 23, і 25) відображують більшу активність, ніж С2К.
Таблиця 2
Сайленсинг АРОВ (0.03 мг/кг міРНК для різних коротких ланцюгів триалкіл катіонних ліпідів
Сайленсинг АроВ гена, схожого з РВ5
Доза міРнК Сполука контролем (Печінка Аров:ЗАРО мРНК співвідношення) нини нин пов мок (0436) Активність катіонних ліпідів за цим винаходом також порівнювали з відповідними триалкілззаміщеними катіонними ліпідами, які структурно ідентичні ліпідам за цим винаходом, за винятком того, що алкільні ланцюги довше. Структури цих подовжених ланцюгів триалкіламін катіонних ліпідів (визначені як сполуки 54, 55, 56, 57, 58, 59 і 60) наведені у Таблиці 3.
Таблиця З: Структура девтого ланююєа хрианкіл жатізнних лізідів і ат Но з й ра: рай а чо а нн он и --к чнжнМжнЄєньЄєчнчнанлн щі га: Гешй во пн о а п и м о і: а а і в п ов ав -к г ки ие о Бас а а в и о а і а риття м а ка на 5 кання дн о у ки т і і
Я тою М я рода па а во дн і са в оо й ї ши соди и я и и Же в І фа а а есе ми тя роль
М тк дл нанні да а о а с св нов фон
Н й реко джин дя а на а в т -- ї пт . нн Шон в и о ; с У фе мет р ж ди и, 58 но о чи а ее весна пава ве ра
І Й - р ианя ме ов в о в і кс п в сь о Геотчняя а ванна і ча м но а а а вон Кі
Зник М звуки вх Ор а в оса ето сне шо й й ж о пн у а и о бо о со и ва м аа пон Ва ов
Сполуки 54, 55, 56, 57, 58, 59 і 60 були отримані відповідно до процедур, описаних у заявці на патент США Мо 13/235253, поданої 16 вересня 2011, яка включена у цей опис шляхом посилання у повному обсязі. 0437) Як показано у Таблиці 4, довші ланцюги ліпідів 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 вводили в кількості 0,05 мг/кг (2,5 рази дозу, описану в Таблиці 1), і відображається АроВ нокдаун, охоплюючи від ж 2595 до -6995 у порівнянні з 6095 у С2К (тобто, деякі сполуки відображують помірне покращення у порівнянні з С2К).
Таблиця 4
Сайленсинг АроВ (0.05 мг/кг міРНК) для різних трилінолеїл катіонних ліпідів . Сайленсинг АроВ гена, схожого з РВЗ5 контролем
Доза міРНК (Печінка АроВ:САРО МРНК співвідношення) б» мк ни нини: ун а Середній сайленсинг АроВ за чотирма дослідженнями (0438) У цілому, активність коротшого ланцюга (С9-С10) триалкіл катіонних ліпідів за цим винаходом була істотно покращена у порівнянні з відповідним довгим ланцюгом, трилинолеїл (С18) відповідного ліпіду. Наприклад, безпосереднє порівняння сполуки 13 з її трилінолеїл варіантом 54 показало, що удосконалення від -695 (0,05 мг/кг) до -8095 (0,02 мг/кг) у АроВ нокдауні, не дивлячись на те, що сполуку 13 вводили у 2,5 рази менше. Та ж тенденція спостерігається при порівнянні сполук від 55 до 11, від 56 до 24 і від 57 до 25.
Приклад З
І0439| Додаткові експерименти в мишачій моделі АроВ використовували інший катіонний ліпід як позитивний контроль; 0 ІМ-МР-ЮОМА. 0 ІМ-МР- ОМА описаний у заявці на патент УМО 2011/141705, і має структуру: - г па и ца дит си ле ще сов й ЧИ в з й а ун кока, Касссани хзоесзае пек, се оди Би йо - ря 7 ще пи оку с ще ха іль МР оМА тт 04401 Як показано в Таблиці 5, у тій самій мишачій моделі АроВ, було показано, що ОІ ІМ-
МР-ОМА ефективніший, ніж С2К, у трьох окремих експериментах, і, отже, вибраний позитивним контролем:
Таблиця 5
Порівняння між С2К і ОСІМ-МР-ОМА як Позитивним Контролем
Сайленсинг АроВ гена, схожого з РВ5
Доза міРнК Сполука контролем (Печінка Аров:ЗАРО мРНК співвідношення) сксперимент 0.03 мг/кг й 11111111 ТОЦО-МР-ОМА
Експеримент? 0,05 мгїке й 11111111 ТОЦО-МР-ОМА сксперимент з 0.03 мг/кг й 11111111 ТОЦО-МР-ОМА
Ї0441| В іншому експерименті, ще два ліпіди за цим винаходом (сполуки 62 і 71) були поміщені в ліпідні наночастки з міРНК для ураження АроВ. Мишам вводили дози внутрішньовенно (у хвостову вену) і вбивали через 48 год після прийому препарату. Печінку збирали і гомогенізували, а рівень виключення АроВ (нормалізований конститутивний ген
САРОН), вимірювали за допомогою Опцапіїдепе Абзау. Результати показані в Таблиці 6 і виражені у вигляді відсотка по відношенню до РВ5-обробленому негативному контролю. МІРНК послідовності, що використовувались у цьому експерименті, були відмінними і менш потужними, ніж використані у Прикладі 2. Порівняння між експериментами тому не є можливим:
Таблиця 6
АроВ сайленсинг для різних триалкілкатіонних ліпідів згідно цьому винаходу . Сайленсинг АроВ гена, схожого з РВЗ5 контролем
Доза міРНК (Печінка АроВ:САРО мРНК співвідношення)
ОЦп-МР-ОМА 0,04 мг/кг Сполука 62
Сполука 71
ІЇ0442| Сполука 71 мала схожу активність з контролем 0 ІМ-МР-ОМА. Сполука 62 була значно активнішою. Синтез цих і інших сполук описаний у прикладі 4.
Приклад 4
Цей Приклад описує синтез додаткових сполук цього винаходу.
Схема синтезу для Сполуки 62 в в о в ов и См С ме т зна ний ж АААААМАААНАКАХХААААКААЧНКААКА ва а аю й о ов а МН, Толюж ПЗ
В СУ
І 2 -е с МАК, нан по тт тт ти уд жи ки ве
Синтез Сполуки 61
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 5, (62, 162)-12-(2)-дец-4- ен-1-іл)удокоса-б,16-дієн-11-іл метансульфонат 61 (1,18 г, 9095) одержували у вигляді безбарвного масла з (67, 162)-12-(27)-дец-4-ен-1-іл)удокоса-б,16-дієн-11-ола 8 (1,12 г, 2.43 ммоль), триетиламіну (8 мл), і метансульфонілхлорида (0,38 мл, 4,9 ммоль). КГ 0.91 (СНесСіг).
Синтез Сполуки 62 роли я
Розчин мезилата 61 (1,09 г, 2.01 ммоль) у толуолі (30 мл) послідовно обробляли М,М- диметиламінобутанолом (1,34 мл, 10.1 ммоль) і Ман (442 мг у вигляді 6095 дисперсії в маслі, 11,1 ммоль). Після припинення виділення газу реакційну суміш нагрівали із зворотним холодильником (1157"С темп. ванни) і перемішували (50 годин). Реакційну суміш потім
Зо охолоджували (КТ) і виливали в холодну воду, і потім екстрагували етилацетатом. Об'єднані органічні шари промивали водою і сольовим розчином, сушили (Маг25О4), фільтрували, концентрували і очищали за допомогою хроматографії (10095 етилацетат) із одержанням 4- ((62, 162)-12-((2)-4-дек ен-1-іл)удокоса-б,16-дієн-11-іл)окси)-М,М-диметилбутан-1-аміна 62 (143 мг, 1395) у вигляді блідо-жовтого масла. "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ»в) б 5,41-5,30 (м, 6Н), 3,46-3,35
(м, 2Н), 3,19-3,14 (м, 1Н), 2,34 (т, 2Н), 2,24 (с, 6Н), 2,10-1,93 (м, 12Н), 1,60-1,09 (м, З5Н), 0,90 (т, 9Н). ВГО,54 (1095 МеОнН-СНеСі»).
Схема синтезу для Сполуки 71 ще сов й С ВМ, му в й ше АВ дж в в в ей
Що. ! Сноу ! і Мматне щуо ! ! ен пити Шу дення | | СМ ас» і БАдк ВЕ й пеня ще ст чи яв А за
К де Н аку т І і Вма жди сов а нн а о ВВ щі док, ОН з, м А р Ак ТНе і-е 5 а сов ов в с ення скжекя З рі
Й ! і В. С ств Ву Ха ве абертттьитя БОС, ЕН, ЩІ і че рамка, снах сан й ие зв ще 000 утжуютктння
Сн узян ї Ї т тт І кеетттоєтеюттетеєддих ван а а бо р воно | Рі дет, 7
Синтез Сполуки 63 тт
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 5, 3З,7-диметилоктил метансульфонат 63 (7,47 г, »9995) одержували у вигляді безбарвного масла з 3,7-диметилоктан-1-ола (5,0 г, 31.6 ммоль), триетиламіну (8 мл) і метансульфонілхлорида (4,89 мл, 63.2 ммоль). КІ 0.69 (СНеСі»).
Синтез Сполуки 64 туту
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 3, 1-бром-3,7-диметилоктан 64 одержували у вигляді безбарвного масла (6,0 г, 8695) з 3,7-Диметилоктил метансульфоната 63 (7,47 г, 31,6 ммоль) і тетрабутиламоній броміду (13,2 г, 41,1 ммоль). КІГ 0,92 (гексани).
Синтез Сполуки 65
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 4, 2,6,12,16- тетраметилгептадекан-9-ол 65 (7,0 г, вихід кількісний) одержували у вигляді безбарвного масла з 1-бром-3,7-диметилоктана 64 (10 г, 45,2 ммоль), магнієвих стружок (1,21 г, 49,8 ммоль), етилформіату (3,8 мл, 47,5 ммоль) і гідроксида калію (3,8 г, 67,8 ммоль). КІ 0,38 (1095 етилацетат-гексани).
Зо Синтез Сполуки 66
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 5, 2,6,12,16- тетраметилгептадекан-9-іл метансульфонат 66 (1,56 г, 8795) одержували у вигляді безбарвного масла з 2,6,12,16-тетраметилгептадекан-9-ола 65 (1,39 г, 5,14 ммоль), триетиламіна (З мл) і метансульфонілхлорида (0,8 мл, 10.3 ммоль). КГ0.8 (СНесСіг).
Синтез Сполуки 67
М шов
Відповідно до процедури, описаної для синтезу б, 2-(3,7-диметилоктил)-5,9- диметилдеканенітрил 67 (0,8 г, 5695) одержували у вигляді безбарвного масла з 2,6,12,16- тетраметилгептадекан-9-іл метансульфоната 6566 (1,56 г, 4,48 ммоль) і ціаніда натрію (0,55 г, 11,2 ммоль). КГО,8 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 68 (в) ов
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 7, 2-(3,7-диметилоктил)-5,9-диметилдеканал 68 (0,63 г, 7895) одержували у вигляді безбарвного масла з 2-(3,7-диметилоктил)-5,9- диметилдеканенітрила 67 (0,8 г, 2,49 ммоль) і ОІВАГ. (5,74 мл вигляді 1М розчину у гексанах, 5,74 ммоль). КІГ0.6 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 69 «те
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 8, 10-(3,7-диметилоктил)-2,6,13,17- тетраметилоктадекан-9-ол 69 (0,53 г, 6295) одержували у вигляді безбарвного масла з 2- (3,7- диметилоктил)-5,9-диметилдеканала 68 (0,6 г, 1,85 ммоль), 1-бром-3,7-диметилоктана 64 (2,0 г,
Зо 9,0 ммоль) і магнієвої стружки (232 мг, 9,67 ммол). КГО,37 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 70 (в) ви о
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 10, 10-(3,7-диметилоктил)-2,6,13,17- тетраметилоктадекан-9-іл-5 бромопентаноат 68 (450 мг, неочищений) одержували у вигляді жовтого масла з 10-(3,7-диметилоктил)-2,6,13,17-тетраметилоктадекан-9-ола 69 (200 мг, 0,43 ммоль), ЕОС (246 мг, 1,28 ммоль) і 5-бромвалеріанової кислоти (246 мг, 1,28 ммоль). КІ 0,49 (б595 ЕІЮАс-гексани).
Синтез Сполуки 71
(в)
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 11, 10-(3,7-диметилоктил)-2,6,13,17- тетраметилоктадекан-о-іл. 5-(диметиламіно)пентанової кислоти 71 (184 мг, 72905 2 кроків) одержували у вигляді безбарвного масла З 10-(3,7-диметилоктил)-2,6,13,17- тетраметилоктадекан-9-іл-5 бромопентаноата 68 (450 мг, сирого) і диметиламіну (10 мл 2,0 М як розчин ЕН). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 4.95-4.87 (м, 1Н), 2.33 (т, 2Н), 2.28 (т, 2Н), 2.23 (с, 6Н), 1.74-1.60 (м, 4Н), 1.58-0.99 (м, 37Н), 0.93-0.79 (м, 27Н). ЕГ0.43 (1095 СНЗОН-СНесі»).
Схема синтезу для Сполуки 74 о ВгМа бро ПОС Єст- -- ТНЕ - 7 72 о (9) вити он вино ШИ (Снз)»Мн
ЕОСІ, ОІЕРА, я ЕЮН, 80"С
ОМАР, СНЬСІЬ 73 (є) ут -- 74
Синтез Сполуки 72 - жш
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 8, (2)-10-((2)-дец-4-ен-1- іл)-2,6-диметилікоз-14-ен-9-ол 72 (0,62 г, 7290) одержували у вигляді безбарвного масла з (2)-2- ((7)-дец-4-еніл)удодец-б-аля 7 (0,6 г, 1,87 ммоль), 1-бром-3,7-диметилоктана 64 (3,9 г, 17,5 ммоль) і магнієвої стружки (454 мг, 18,7 ммоль). КІГ0,61 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 73 (в) ви о -
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 10, (2)-10-((2)-дец-4-ен-1- іл)-2,6-диметиликоз-14-ен-9-іл 5-бромопентаноат 73 (900 мг, неочищений) одержували у вигляді жовтого масла з (2)-10-((27)-дец-4-ен-1-іл)-2,6-диметиліко3з-14-ен-9-ола 72 (620 мг, 1.34 ммоль),
ЕЮС (500 мг, 2,6 ммоль) і 5-бромвалеріанової кислоти (500 мг, 2.56 ммоль). КІ 0,72 (10965 етилацетат-гексани).
Зо Синтез Сполуки 74 в)
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу 11, (2)-10-((2)-дец-4-ен-1- іл)-2,6-диметиликоз3з-14-ен-9-іл 5-(диметиламіно)пентанової кислоти 74 (466 мг, 58905 2 стадії) одержували у вигляді безбарвного масла з (2)-10-((2)-дец-4-ен-1-іл)-2,6-диметиликоз-14 ен-9-іл- 5 бромопентаноата 73 (900 мг, сирого) і диметиламіну (15 мл у вигляді розчину 2,0 М ЕН). 'Н
ЯМР (400 МГу, СОС») б 5.43-5.29 (м, 4Н), 4.94-4.88 (м, 1Н), 2.32 (І, 2Н), 2.26 (т, 2Н), 2.15 (с, 6Н), 2.08-1.93 (м, 8Н), 1.70-1.00 (м, 43Н), 0.95-0.83 (м, 15Н). ЕГ0.42 (1095 СНЗОН-СНесі»).
Схема Синтезу для Сполуки 76
В пра а чи
Неон азумн фази тт ще й пи пет со да в За їхо очки, а ан 5 риття рова ана я
М дати няття Мен, Толуєи ТНК | М рт дви тити в й те
Синтез Сполуки 75
Нвгосмо ТОН
Розчин 5-бромпентан-1-ола (1,0 г, 5.99 ммоль) був підготовлений з диметиламіном (10 мл, у 2 М розчину в етанолі) у герметичній ємності, і нагрівали (80"С). Після перемішування (16 год) диметиламін і етанол видаляли при зниженому тиску з одержанням 5-(диметиламіно)пентан-1- ола 75 (1,26 г, кількісний вихід) у вигляді жовто-помаранчевої твердої речовини. КІ 0.25 (1090
СНзОнН-СНесСІ»).
Синтез Сполуки 76 лах -- но
Відповідно до процедури, описаної для синтезу 62, 5-((627, 162)-12-(27)-дец-4-ен-1-іл) докоса-6,16-дієн-11-іл)уокси)-М,М-диметилпентан-1-амін 76 (864 мг, 3795) одержували у вигляді блідо-жовтого масла з (67, 162)-12-((2)-дец-4-ен-1-іл)удокоса-6,1 6-дієн-11-ілметансульфоната 61 (1,86 г, 3.45 ммоль), 5-(диметиламіно) пентан-1-ола 75 (1,26 г, 5.99 ммоль) і Ман (288 мг у
Ко) вигляді 6095 дисперсія в маслі, 7,2 ммоль). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.43-5.32 (м, 6Н), 3.46- 3.33 (м, 2Н), 3.18-3.12 (м, 1Н), 2.30-2.18 (м, 8Н), 2.07-1.93 (м, 12Н), 1.61-1.04 (м, 37Н), 0.89 (т, 9Н). ВГО.47 (1095 МеОнН-СНесі»).
Схема Синтезу для Сполуки 79
-- о лев, СНО н олив що -- но -- -35»
Шк сНньсь, ос ЕОС, ОМАР, СНоСІ; 8 "7 о р ЕЮН | о
Ве ин яд т они 78 79
Синтез Сполуки 77
До охолодженого розчину (-15"7С) (627, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11-ола 8 (5 г, 10,9 ммоль) в безводному дихлорметані (125 мл) в атмосфері азоту, був доданий по краплях діетиловий цинк (1 М у гексані, 82 мл, 81,8 ммоль) протягом 20 хвилин. Розчин перемішували протягом 70 хвилин при 0"С, потім обережно додавали дийодметан (6,6 мл, 81,8 ммоль).
Розчин перемішували протягом ночі, дозволяючи йому нагрітися до кімнатної температури.
Після закінчення цього, розчин виливали в крижану воду (350 мл) і розбавляли етилацетатом (450 мл). Потім додавали 595 НСІ (350 мл), щоб допомогти пом'якшити емульсію, яка була створена. Органічний шар промивали насиченими Мансоз (СБ водн. 500 мл), водою (500 мл) і сольовим розчином (500 мл). Об'єднані водні шари знову екстрагували етилацетатом. Об'єднані органічні екстракти сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо.
Залишок очищали за допомогою колонкової хроматографії на силікагелі (2,590 етилацетату в гексанах) з одержанням масла рожевого кольору. Щоб видалити колір, (Іг), очищений продукт розчиняли у дихлорметані (150 мл) і промивали Маге2Оз (насич. вод. 2 х 40 мл) із одержанням 1,8-біс(2-пентилциклопропіл-5-(3-(2-пентилциклопропіл)/пропіл)уоктан-4-ола 77 у вигляді блідо- жовтого масла (5,54 г, 96.5965).
Синтез Сполуки 78
Вк. или (о;
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу (67, 162)-12-(2)-дец-4- еніл)удокоса-б,16-дієн-11ї-іл б бромогексаноата 10, 1,8-біс(2-пентилциклопропіл)-5-(3-(2- пентилциклопропіл)пропіл)октан-4-іл-6 бромогексаноат був одержаний у вигляді неочищеного масла З 1,8-біс(2-пентилциклопропіл)-5-(3-(2-пентилциклопропіл)/пропіл)октан-4-іл 6- (диметиламіно)кислоти (0,75 г, 1,5 ммоль), гексану, безводного дихлорметану (5.2 мл), 6- бромгексанової кислоти (0,88 г, 4,5 ммоль), 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)/карбодіїмід гідрохлориду (0,87 г, 4,5 ммоль) і 4-диметиламінопіридину (5 мг). Продукт використовували на наступній стадії без додаткового очищення.
Синтез Сполуки 79 о
Арк
Відповідно до процедури, що описана для синтезу (67, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)докоса-6,16- дієн-11-іл б6-(диметиламіно)гексаноата 11, одержували у вигляді масла (0,56 г, 5995) з 1,8-біс(2- пентилциклопропіл)-5-(3-(2-пентилциклопропіл)/пропіл)октан-4-іл-6 бромогексаноата (1,0 г, 1,5 ммоль) і 2,0 М розчину диметиламіну в етанолі (3,5 мл). КГ0.50 (1095 МеОН-СНеСІг).
Схема Синтезу для Сполуки 83
З з аа сь м Ве оо о По вертати «Му кт тт пнях Мир миютт ит, І Ктумивкдяю. ТЯ, РЕ з ХКОМ КОН
Кк олив побити Ще тч о с па о ин ск А. ач чно ная ЕЛ й р ше р фа ния
ПО ло бобонюь вна | нн ть маш ведення : о ан сь ан а пінні пад ж еВ ння с А т т т пл
Синтез Сполуки 80 (в) ово
До розчину 2-октилдодекан-1-ола (20 г, 67,0 ммоль) у безводному дихлорметані (500 мл) додавали піридинійхлорхромат (43,2 г, 200 ммоль). Розчин перемішували протягом З годин при кімнатній температурі, потім фільтрували через шар двоокису кремнію, елююючи сумішшю дихлорметану з одержанням 2-октилдодеканал 80 у вигляді безбарвного масла (10,5 г, 5095).
Синтез Сполуки 81 ел.
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу (67, 1572)-хенікоза 6,15- дієн-11-ола 4, (2)-12-октилдокос-6-ен-11-ол 81 одержували у вигляді безбарвного масла (0,67 г, 9295) з 2-октилдодеканала 80 (0,5 г, 1,6 ммоль), (7) -1-бромодек-4-ена (0,7 г, 3,1 ммоль), магнію (80 мг, 3,4 ммоль), безводого тетрагідрофурану (0,5 мл), води (2 мл), етанолу (2 мл) і КОН (0,2 г, 2,8 ммоль).
Синтез Сполуки 82 о - вки
Коо)
Використавши процедуру, аналогічну тій, що описана для синтезу (67, 162)-12-(2)-дец-4- еніл)докоса-6,16-дієн-11-іл б-бромогексаноата 10, (2)-12-октилдокос-6б-ен-11-іл-6 бромогексаноат 82 одержували у вигляді безбарвного масла (0,78 г, 8595) з (7)-12-октилдокос-6- ен-11-ола 81 (0,67 г, 1,5 ммоль), безводного дихлорметану (5 мл), б-бромгексанової кислоти (0,80 г, 4,4 ммоль), 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл) карбодіїмід гідрохлорида (0,85 г, 4,4 ммоль) і 4-диметиламінопіридина (5 мг). Продукт використовують на наступній стадії без додаткового очищення.
Синтез Сполуки 83 о Щі
А
Відповідно до процедури, що описана що для синтезу (67, 162)-12-((27)-дец-4-еніл) докоса- 6,16-дієн-11-іл 6б-(диметиламіно)гексаноата 11, (2)-12-октилдокос-б-ен-11-іл 6- (диметиламіно)гексаноат 83 був одержаний у вигляді масла (103 мг, 1495) з (2)-12-октилдокос-6- ен-11-іл б-бромогексаноата 82 (0,78 г, 1,3 ммоль) і 2,0 М розчину диметиламіну в етанолі (З мл).
ІН ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.43-5.26 (м, 2Н), 4.96-4.91 (м, 1Н), 2.33 (т, 4Н), 2.26 (с, 6Н), 2.08-1.93 (м, 4Н), 1.70-1.60 (м, 2Н), 1.57-1.43 (м, 4Н), 1.40-1.15 (м, 43Н), 0.94-0.85 (м, 9Н).
Схема Синтезу для Сполуки 89 о ШПАІНа, ЕбО М5СІ, ЕбМ
Кот -- ОТ ---Ж муч оС ю ЕТ сНньсІ 84 85 тТвАВ, МетнЕ ро 1) Мо, ТНЕ в --35.5-62620828Ш280808184 ВИ нити ЯНИНИНИНИНННЦЧННІЯСН3ЮО вот 86 2 «Кос су -- 87 7
ДА вер Ї но Вг я - юн 88 о в пн озиоої 89
Синтез Сполуки 84
НО нити
До охолодженого розчину (072) (Е)-етил дец-4-еноата (20 г, 101 ммоль) у безводному діетиловому ефірі (350 мл) додавали гідрид літію (8,9 г, 212 ммоль) в атмосфері азоту. Розчин перемішували протягом 1 години при кімнатній, потім охолоджували до 0"С і гасили повільно, за допомогою 5М Маон (30 мл), і розбавляли діетиловим ефіром (100 мл). Розчин перемішували протягом 30 хв. і сушили сульфатом магнію, фільтрували і концентрували у вакуумі насухо з одержанням (Е)-дец-4-ен-1-ола 84, у вигляді масла (16,1 г, кількісний вихід).
Синтез Сполуки 85
МОЛ нити
Відповідно до процедури, що описана що для синтезу (7)-дец-4-еніл метансульфоната 2, (Е)-дец-4-еніл метансульфонат 85 був одержаний у вигляді помаранчевого масла (32,7 г) з (Е)- дец-4-ен-і-ола (16,1 г, 94,7 ммоль), триетиламіну (15,5 мл, 111,7 ммоль) і
Зо метансульфонілхлорида (15,6 мл, 201,7 ммоль). КІГ 0.65 (10095 СНеСі»).
Синтез Сполуки 86 паль
Відповідно до процедури, що описана що для синтезу (2)-1-бромодек-4-ена 3, (Е)-1- бромодец-4-ен 86 одержували у вигляді масла (17,9 г, 8195) з (Е)-дец-4-еніл метансульфоната 85 (23,5 г, 94,7 ммоль) і броміду тетрабутиламонію (40,0 г, 124,1 ммоль). КІ 0,85 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 87 с
Відповідно до процедури, що описана що для синтезу з одержанням (62, 152)-хенікоза 6,15- дієн-11-ола 4, (6Е, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11-ол 87 у вигляді масла (1,28 г, 7195) одержували з (Е)-1-бромодек-4-ена 86 (1,7 г, 7,8 ммоль), магнієвих стружок (0,19 г, 7,8 ммоль), (2)-2-(2)-дец-4-еніл)удодец-б-аля 7 (1,25 г, 3,9 ммоль) і гідроксиду калію (0,66 г, 11,7 ммоль). КГО,43 (1095 етилацетат-гексани).
Синтез Сполуки 88 о с ви -х -
Відповідно до процедури, що описана що для синтезу (67, 162)-12-(2)-дец-4-еніл)докоса- 6б,16-дієн-11-іл б-бромогексаноата 10, (6бЕ, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)-докоса 6,16-дієн-11-іл-5 бромопентаноат 88 одержували у вигляді масла (1,36 г, 7895) з (6Е, 162)-12-(7)-дец-4- еніл)докоса-6,16-дієн-11-ола 87 (1,28 г, 2,8 ммоль) і 5-бром-М-валеріанової кислоти (1,00 г, 5,6 ммоль), 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)карбодіїміду (1,06 г, 5,6 ммоль), діїзопропілетиламіна (1,1 г, 83,0 ммоль) і диметиламінопіридина (10 мг).
Синтез Сполуки 89 о с
Відповідно до процедури, що описана для синтезу (67, 162)-12-((27)-дец-4-еніл)докоса-6,16- дієн-11-іл 6-(диметиламіно)гексаноата 11, (6Е, 162)-12-((2)-дец-4-еніл)докоса-6,16-дієн-11-іл 5- (диметиламіно)пентанової кислоти 89 одержували у вигляді масла (0,45 г, 3595) з (бе, 162)-12- ((2)-дец-4-еніл)докоса-6б,16-дієн-11-іл-5 бромопентаноата 88 (1,36 г, 2,2 ммоль) і 2 М диметиламіну в етанолі (5 мл). "Н ЯМР (400 МГц, СОСІ») б 5.45-5.28 (м, 6Н), 4.96-4.91 (м, 1Н), 2.34-2.25 (м, 2Н), 2.06-1.90 (м, 12Н), 1.68-1.61 (м, 2Н), 1.55-1.45 (м, 5Н), 1.45-1.16 (м, 28Н), 0.95- 0.84 (м, 9Н). КгГ0.46 (1095 МЕеЕОН-СНесі»).
Зо Схема Синтезу для Сполуки 90 г | ся й НОЙ ВН рю тити мих в в а тих я с ек вити ТЕ вот, тю цк пнечнщиння я ь це ау ве тт зд жити
У в ут ще її рве сь пут ут дуття ! ве на ан за
Синтез Сполуки 89
Відповідно до процедури, що описана для синтезу 5, 1,8-біс(2-пентилциклопропіл)-5-(3-(2- пентилциклопропіл)пропіл)/октан-4-іл метансульфонат 89 одержували у вигляді безбарвного масла.
Синтез Сполуки 90 нас;
Відповідно до процедури, що описана що для синтезу 62, 5-((1,8-біс(2-пентилциклопропіл)-5- (3--2-пентилциклопропіл)пропіл)октан-4-іл)окси)-М,М-диметилпентан-1-амін 90 (580 мг) одержували у вигляді блідо-жовтого масла. РІ 0.48 (1095 МЕОН-СНеСіг). 04431) Слід розуміти, що наведений вище опис призначений для ілюстрації, а не обмеження.
Багато варіантів будуть очевидні фахівцям у даній області техніки після прочитання наведеного вище опису. Обсяг цього винаходу повинен, отже, бути визначений не із посиланням на наведений вище опис, а замість цього має бути визначений із посиланням на формулу винаходу, що додається, разом із повним обсягом еквівалентів, до яких такі вимоги можуть бути пре'явлені. Розкриття всіх статей і посилань, у тому числі патентних заявок, патентів, публікацій
РСТ, ї зразків з ГенБанк і послідовностей, описаних у ньому, включене у цей опис шляхом посилання для всіх цілей.

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Ліпід, що має структурну формулу (1): Х-А-У-7, (І) або його сіль, де: Х є Сі-Свалкіламіногрупою; А є Сі-Свалкілом; У вибраний з групи, що складається з складного ефіру, карбамату та ефіру; і 2 має формулу: В, 7 зоре тк зо З , де Кі, В» і Кз, кожен окремо, вибрані з групи, що складається з Св-Сізалкілу, причому кожен з Ви, Р» і Ез незалежно може бути насиченим або ненасиченим, і кожен з К., Р» і Кз може містити циклоалкільний фрагмент і може бути незаміщений або заміщений С:-Свалкілом.
    2. Ліпід за п. 1, який відрізняється тим, що кожен з алкільних ланцюгів в К:, Н2 і Кз має довжину від Со до Сто.
    З. Ліпід за п. 1, який відрізняється тим, що щонайменше один з алкільних ланцюгів в К., Р» і Кз містить циклоалкільний фрагмент та/або подвійний зв'язок.
    4. Ліпід за п. 1, який відрізняється тим, що Х вибраний з групи, що складається з диметиламіно-, діетиламіно- і етилметиламіногрупи.
    5. Ліпід, який вибраний з групи, що складається з: о Щі ра щ- Сполуки 9 о Щі ра а -- Сполуки 11 о - кава -- Сполуки 13 (е) Сполуки 14 о - -Щж з Сполуки 19 о Щ ра а -- Сполуки 21 о Щ рова Сполуки 22 о -- кава - Сполуки 23 о - мо - Н Сполуки 24 о Щі - ; Сполуки 25 9 щ лоту -- Сполуки 26 о - аа п Н Сполуки 27 о - мо -- Сполуки 28 во о) -- т - но й Сполуки 30 поли ра т ш- Сполуки 31 о Щ подо ооя Сполуки 40 о - шк ; Сполуки 42 о - Сполуки 50 ) Сполуки 53 Сполуки 62 (о) Сполуки 71 6) уито -- -Щ ж ; Сполуки 74 "пня Сполуки 76 (в) ра а Сполуки 79 о Щі ра ан
    Сполуки 83 ква а -- . - і Сполуки 89 Сполуки 90 або його сіль.
    б. Система доставки, яка являє собою ліпідну частинку, що містить ліпід за будь-яким з попередніх пунктів.
    7. Система доставки за п. 6, яка відрізняється тим, що частка додатково містить некатіонний ліпід.
    8. Система доставки за п. 7, яка відрізняється тим, що некатіонний ліпід вибраний з групи, що складається з фосфоліпіду, холестерину або суміші фосфоліпіду і холестерину.
    9. Система доставки за п. 8, яка відрізняється тим, що фосфоліпід містить дипальмітоїлфосфатидилхолін (ОРРС), дистеароїлфосфатидилхолін (ОРОС) або їх суміш.
    10. Система доставки за п. б, яка відрізняється тим, що частинка додатково містить кон'югований ліпід, який інгібує агрегацію частинок.
    11. Система доставки за п. 10, яка відрізняється тим, що кон'югований ліпід, який інгібує агрегацію частинок, містить поліетиленгліколь (РЕС)-ліпідний кон'югат.
    12. Система доставки за п. 6, яка відрізняється тим, що додатково містить терапевтичний агент.
    13. Система доставки за п. 12, яка відрізняється тим, що терапевтичний агент є інтерферуючою РНК, яка вибрана з групи, що складається з малої інтерферуючої РНК (міг НК), асиметричної інтерферуючої РНК (аіРНК), мікроРНК (мікроРНК), дайсер-субстратної РНК (ДСсРНК), малої шпильки РНК (мшРНК) і їх сумішей.
    14. Система доставки за п. 12, яка відрізняється тим, що ліпідна частинка має масове співвідношення ліпід:терапевтичний агент від близько 5:1 до близько 15:1.
    15. Фармацевтична композиція, яка містить систему за п. 6 і являє собою ліпідну частинку та фармацевтично прийнятний носій.
    16. Спосіб введення терапевтичного агента у клітину, що включає контактування клітини з системою доставки за п. 12.
    17. Спосіб для доставки /л у//о терапевтичного агента, що включає введення ссавцеві ліпідної частинки за п. 12.
    18. Спосіб лікування захворювань або порушень у ссавця, який потребує цього, що включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості ліпідної частинки за п. 12.
    19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що захворювання або порушення вибране з групи, що складається з вірусної інфекції, захворювання або порушення печінки і раку.
    20. Ліпід за п. 1, який відрізняється тим, що К:, В» та Ез є незаміщеними.
    21. Система доставки за п. 12, яка відрізняється тим, що терапевтичний агент є матричною РНК (мРНК).
UAA201410393A 2012-02-24 2013-02-22 Триалкілкатіонні ліпіди і способи їх застосування UA120026C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261602990P 2012-02-24 2012-02-24
PCT/US2013/027469 WO2013126803A1 (en) 2012-02-24 2013-02-22 Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA120026C2 true UA120026C2 (uk) 2019-09-25

Family

ID=47884528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201410393A UA120026C2 (uk) 2012-02-24 2013-02-22 Триалкілкатіонні ліпіди і способи їх застосування

Country Status (28)

Country Link
US (4) US9352042B2 (uk)
EP (3) EP2817287B1 (uk)
JP (4) JP6275655B2 (uk)
KR (4) KR102384791B1 (uk)
CN (2) CN110003030A (uk)
AU (1) AU2013222179B2 (uk)
BR (1) BR112014020824B1 (uk)
CA (1) CA2865412C (uk)
CY (1) CY1121232T1 (uk)
DK (1) DK2817287T3 (uk)
ES (2) ES2702874T3 (uk)
HK (1) HK1202855A1 (uk)
HR (1) HRP20182156T1 (uk)
HU (1) HUE041494T2 (uk)
IL (3) IL234266B (uk)
LT (1) LT2817287T (uk)
MX (2) MX356904B (uk)
NZ (1) NZ700075A (uk)
PH (1) PH12014501901A1 (uk)
PL (1) PL2817287T3 (uk)
PT (1) PT2817287T (uk)
RS (1) RS58077B1 (uk)
RU (2) RU2718053C2 (uk)
SG (1) SG11201405157PA (uk)
SI (1) SI2817287T1 (uk)
UA (1) UA120026C2 (uk)
WO (1) WO2013126803A1 (uk)
ZA (1) ZA201406896B (uk)

Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3338765T (pt) 2009-12-01 2019-03-18 Translate Bio Inc Derivado de esteróide adequado para a administração de arnm em doenças genéticas humanas
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
AU2012267531B2 (en) 2011-06-08 2017-06-22 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods for mRNA delivery
CN103748078B (zh) 2011-06-08 2016-11-09 夏尔人类遗传性治疗公司 可裂解脂质
RU2718053C2 (ru) 2012-02-24 2020-03-30 Протива Байотерапьютикс Инк. Триалкиловые катионные липиды и способы их использования
JP6211054B2 (ja) 2012-03-29 2017-10-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 脂質誘導される中性ナノ粒子
BR112014024131A2 (pt) 2012-03-29 2017-07-25 Shire Human Genetic Therapies lipídios catiônicos ionizáveis
WO2013185067A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
AU2013271392B2 (en) 2012-06-08 2018-02-15 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of mRNA to non-lung target cells
MX2015012865A (es) 2013-03-14 2016-07-21 Shire Human Genetic Therapies Metodos para purificacion de arn mensajero.
PT2968586T (pt) 2013-03-14 2018-11-13 Ethris Gmbh Composições de arnm de cftr e métodos e utilizações relacionados
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
MX2015011947A (es) 2013-03-14 2015-12-01 Shire Human Genetic Therapies Metodos y composiciones para administrar anticuerpos codificados por arnm.
US10130649B2 (en) 2013-03-15 2018-11-20 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
US20160151284A1 (en) * 2013-07-23 2016-06-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
MX2016004249A (es) 2013-10-03 2016-11-08 Moderna Therapeutics Inc Polinulcleotidos que codifican el receptor de lipoproteina de baja densidad.
EA201690588A1 (ru) 2013-10-22 2016-09-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Доставка мрнк в цнс и ее применение
CN105813656B (zh) 2013-10-22 2021-01-15 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送信使rna的脂质制剂
JP6608815B2 (ja) 2013-10-22 2019-11-20 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド アルギニノコハク酸合成酵素欠損症のｍＲＮＡ治療
WO2015061491A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
WO2015164773A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger rna
CA2949106C (en) 2014-05-30 2023-10-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
EA033966B1 (ru) 2014-06-24 2019-12-13 Транслейт Био, Инк. Стереохимически обогащенные композиции для доставки нуклеиновых кислот
CA3179824A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
JP6782171B2 (ja) 2014-07-02 2020-11-11 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのカプセル化
EP4159741A1 (en) 2014-07-16 2023-04-05 ModernaTX, Inc. Method for producing a chimeric polynucleotide encoding a polypeptide having a triazole-containing internucleotide linkage
US20170210788A1 (en) 2014-07-23 2017-07-27 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
AU2015300046B2 (en) * 2014-08-07 2019-05-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cationic lipid
WO2016036966A1 (en) 2014-09-04 2016-03-10 Preceres Inc. Hydrazinyl lipidoids and uses thereof
JP6767976B2 (ja) 2014-12-05 2020-10-14 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 関節疾患の治療のためのメッセンジャーｒｎａ治療法
JP2018509406A (ja) * 2015-03-11 2018-04-05 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル フィロウイルス感染症の処置のための方法及び医薬組成物
US10172924B2 (en) 2015-03-19 2019-01-08 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for pompe disease
JP7072386B2 (ja) 2015-06-29 2022-05-20 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 核酸の送達のための脂質および脂質ナノ粒子製剤
AU2016338559B2 (en) 2015-10-14 2022-11-24 Translate Bio, Inc. Modification of RNA-related enzymes for enhanced production
MA46316A (fr) 2015-10-22 2021-03-24 Modernatx Inc Vaccin contre le cytomégalovirus humain
FI3368507T3 (fi) 2015-10-28 2023-03-21 Acuitas Therapeutics Inc Uusia lipidejä ja lipidinanopartikkeliformulaatioita nukleiinihappojen annostelemiseksi
EP3394093B1 (en) 2015-12-23 2022-01-26 Modernatx, Inc. Methods of using ox40 ligand encoding polynucleotides
WO2017120612A1 (en) 2016-01-10 2017-07-13 Modernatx, Inc. Therapeutic mrnas encoding anti ctla-4 antibodies
WO2017177169A1 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Rana Therapeutics, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
EP3842530A1 (en) 2016-06-13 2021-06-30 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US11191849B2 (en) 2016-06-30 2021-12-07 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for delivering messenger RNA
US11253605B2 (en) 2017-02-27 2022-02-22 Translate Bio, Inc. Codon-optimized CFTR MRNA
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP3595727A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 ModernaTX, Inc. Lipid nanoparticle formulation
EP3601576A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
CN110799492B (zh) 2017-04-28 2023-06-27 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂
IL270631B2 (en) 2017-05-16 2024-03-01 Translate Bio Inc Treatment of cystic fibrosis through the administration of mRNA with an optimal codon encoding ctfr
EP3625246A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
EP3668833A1 (en) 2017-08-16 2020-06-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
CA3073018A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
US11866696B2 (en) 2017-08-18 2024-01-09 Modernatx, Inc. Analytical HPLC methods
JP7275111B2 (ja) 2017-08-31 2023-05-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の生成方法
US11167043B2 (en) 2017-12-20 2021-11-09 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
CN118512596A (zh) 2017-12-27 2024-08-20 武田药品工业株式会社 含核酸脂质纳米粒子及其用途
CN118421617A (zh) 2018-08-24 2024-08-02 川斯勒佰尔公司 用于纯化信使rna的方法
MA53650A (fr) 2018-09-19 2021-07-28 Modernatx Inc Lipides peg et leurs utilisations
CN112996854B (zh) 2018-09-19 2024-08-30 摩登纳特斯有限公司 高纯度peg脂质和其用途
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
CN113166783A (zh) 2018-10-09 2021-07-23 不列颠哥伦比亚大学 包含无有机溶剂和去污剂的转染活性囊泡的组合物和系统以及与之相关的方法
CN112912509A (zh) 2018-10-18 2021-06-04 武田药品工业株式会社 T细胞的活化/增殖方法
JP2022506956A (ja) * 2018-11-09 2022-01-17 アルブータス・バイオファーマー・コーポレイション 脂質ナノ粒子製剤
EP3877522A4 (en) * 2018-11-09 2022-11-02 Arbutus Biopharma Corporation LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
EP3938379A4 (en) 2019-03-15 2023-02-22 ModernaTX, Inc. HIV RNA VACCINE
JP2022537324A (ja) 2019-06-18 2022-08-25 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ワクチンおよび抗ｐｄ－１抗体の組合せ
CA3141323A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Helen Horton Recombinant interleukin 12 construct and uses thereof
MA56523A (fr) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Combinaison de vaccins contre le virus de l'hépatite b (vhb) et d'anticorps anti-pd-1 ou anti-pd-l1
WO2020255010A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
CA3143418A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and hbv-targeting rnai
US20220305108A1 (en) 2019-06-20 2022-09-29 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
US20220378917A1 (en) * 2019-06-29 2022-12-01 Precision NanoSystems ULC Ionizable lipids for nucleic acid delivery
EP3999642A1 (en) 2019-07-19 2022-05-25 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Recombinase compositions and methods of use
WO2021055849A1 (en) * 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Headgroup lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020352552A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression
AU2020355000A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein B (APOB) gene expression
EP4118207A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
WO2021188389A2 (en) * 2020-03-17 2021-09-23 Genevant Sciences Gmbh Cationic lipids for lipid nanoparticle delivery of therapeutics to hepatic stellate cells
EP4127187A1 (en) 2020-03-24 2023-02-08 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
CA3172591A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Douglas Anthony KERR Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing gaucher therapeutics
IL298363A (en) 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
JP2023526422A (ja) 2020-05-20 2023-06-21 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー コロナウイルス抗原組成物及びそれらの使用
WO2021243301A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
CA3180101A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
TW202216190A (zh) 2020-07-08 2022-05-01 愛爾蘭商健生科學愛爾蘭無限公司 抗hbv之rna複製子疫苗
KR20230051172A (ko) 2020-07-16 2023-04-17 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노 입자에 사용하기 위한 양이온성 지질
MX2023001109A (es) 2020-07-27 2023-04-24 Anjarium Biosciences Ag Composiciones de moleculas de adn, metodos para elaborar las mismas, y metodos de usos de las mismas.
IL300111A (en) 2020-08-06 2023-03-01 Modernatx Inc The vehicles for the transfer of cargo molecules to the airway epithelium
MX2023002439A (es) 2020-09-03 2023-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones immunogénicas y usos de las mismas.
EP4225326A1 (en) * 2020-10-12 2023-08-16 The Regents of the University of California Endosomal escape domains for delivery of macromolecules into cells
WO2022133230A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
EP4267732A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions of modified trems and uses thereof
WO2022146654A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
US20240156729A1 (en) 2021-02-26 2024-05-16 Ethris Gmbh Formulations for aerosol formation and aerosols for the delivery of nucleic acid
US11952461B2 (en) 2021-03-22 2024-04-09 Sunbio, Inc. Siloxy polyethylene glycol and derivatives thereof
JP2024512669A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションポリペプチド及び癌の処置におけるそれらの使用
CN115197079A (zh) * 2021-04-08 2022-10-18 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种聚乙二醇化脂质及其修饰的脂质体、含该脂质体的药物组合物及其制剂和应用
EP4326860A1 (en) 2021-04-20 2024-02-28 Anjarium Biosciences AG Compositions of dna molecules encoding amylo-alpha-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase, methods of making thereof, and methods of use thereof
US20240216535A1 (en) 2021-04-27 2024-07-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
US20240226324A1 (en) 2021-04-27 2024-07-11 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
EP4330404A1 (en) 2021-04-28 2024-03-06 Genevant Sciences Gmbh Mrna delivery constructs and methods of using the same
CN112979483B (zh) * 2021-05-14 2021-08-06 苏州艾博生物科技有限公司 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及应用
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
EP4373506A1 (en) 2021-07-20 2024-05-29 AGS Therapeutics SAS Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
MX2024003262A (es) 2021-09-17 2024-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones y metodos para producir poliribonucleotidos circulares.
TW202322826A (zh) 2021-10-18 2023-06-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法
MX2024005521A (es) 2021-11-08 2024-05-21 Orna Therapeutics Inc Composiciones de nanoparticulas de lipidos para la administracion de polinucleotidos circulares.
WO2023086465A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
KR20240125931A (ko) 2021-11-24 2024-08-20 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 수두-대상포진 바이러스 면역원 조성물 및 이의 용도
WO2023097003A2 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
KR20240117569A (ko) 2021-11-24 2024-08-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 코로나바이러스 면역원 조성물 및 그의 용도
KR20240118174A (ko) 2021-12-17 2024-08-02 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 변성 조건 하에서의 원형 rna의 풍부화를 위한 방법
CN118679254A (zh) 2021-12-22 2024-09-20 旗舰创业创新六公司 用于纯化多核糖核苷酸的组合物和方法
KR20240118881A (ko) 2021-12-23 2024-08-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 항푸소제닉 폴리펩티드를 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드
CN114957027B (zh) * 2022-01-13 2023-05-19 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023144127A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses
TW202345863A (zh) 2022-02-09 2023-12-01 美商現代公司 黏膜投與方法及調配物
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023160702A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 深圳深信生物科技有限公司 氨基脂质化合物、其制备方法、组合物和应用
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
CN114380724B (zh) * 2022-03-23 2022-05-24 深圳市瑞吉生物科技有限公司 用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途
WO2023183616A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
CN114685784B (zh) * 2022-04-26 2023-09-15 北京清科胜因生物科技有限公司 一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及应用
CN115626983A (zh) * 2022-04-27 2023-01-20 北京清科胜因生物科技有限公司 一种聚(2-噁唑啉)脂质及脂质纳米颗粒
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023233290A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rnai agents targeting pd-l1
CN114940756B (zh) * 2022-06-02 2023-11-07 北京清科胜因生物科技有限公司 一种聚（2-噁唑啉）脂质与脂质纳米颗粒及应用
WO2023232976A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
CN117263818A (zh) * 2022-06-14 2023-12-22 杭州高田生物医药有限公司 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
EP4327829A1 (en) 2022-08-26 2024-02-28 Ethris GmbH Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024042236A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Ethris Gmbh Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024049979A2 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024088808A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon intranasal administration, and uses thereof
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
WO2024119051A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024119039A2 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticles and uses thereof
WO2024121814A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Modified immunomodulators
WO2024129988A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for delivery of therapeutic agents to bone
US20240252520A1 (en) 2023-01-09 2024-08-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Therapeutic agents and their use for treating chronic wounds
US20240238473A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024151583A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2024167885A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory compositions and related methods
WO2024173307A2 (en) 2023-02-13 2024-08-22 Flagship Pioneering Innovation Vii, Llc Cleavable linker-containing ionizable lipids and lipid carriers for therapeutic compositions
WO2024173836A2 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions comprising modified cytosine
US20240285805A1 (en) 2023-02-17 2024-08-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions comprising modified uracil
CN117482066B (zh) * 2023-11-02 2024-08-13 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 脂质组合物和用于脂质组合物的化合物

Family Cites Families (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3817827A (en) 1972-03-30 1974-06-18 Scott Paper Co Soft absorbent fibrous webs containing elastomeric bonding material and formed by creping and embossing
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3993754A (en) 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4086257A (en) 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
CH624011A5 (uk) 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4452901A (en) 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
AU637800B2 (en) 1989-08-31 1993-06-10 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6365730B1 (en) 1990-06-19 2002-04-02 Gene Shears Pty. Limited DNA-Armed ribozymes and minizymes
US5068120A (en) * 1990-08-01 1991-11-26 Nabisco Brands, Inc. Amine ester derivatives as low calorie fat mimetics
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
EP0552178B1 (en) 1990-10-12 1997-01-02 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Modified ribozymes
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US6831166B2 (en) 1992-10-23 2004-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5756353A (en) 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
JPH08500481A (ja) 1992-05-11 1996-01-23 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤
WO1993023011A1 (en) 1992-05-18 1993-11-25 Minnesota Mining And Manufacturing Company Transmucosal drug delivery device
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
AU4769893A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5591317A (en) 1994-02-16 1997-01-07 Pitts, Jr.; M. Michael Electrostatic device for water treatment
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
DE69527206T2 (de) 1994-09-30 2003-02-27 Inex Pharmaceuticals Corp., Vancouver Mittel zum einbringen polyanionischer materialien in zellen
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
WO1996011266A2 (en) 1994-10-05 1996-04-18 Amgen Inc. Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein
US5783683A (en) 1995-01-10 1998-07-21 Genta Inc. Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene
US5580579A (en) 1995-02-15 1996-12-03 Nano Systems L.L.C. Site-specific adhesion within the GI tract using nanoparticles stabilized by high molecular weight, linear poly (ethylene oxide) polymers
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US5646241A (en) * 1995-05-12 1997-07-08 Quantum Materials, Inc. Bleed resistant cyanate ester-containing compositions
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP1489184A1 (en) 1995-06-07 2004-12-22 Inex Pharmaceutical Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5747470A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA
US20030216335A1 (en) 2001-11-30 2003-11-20 Jennifer Lockridge Method and reagent for the modulation of female reproductive diseases and conditions
US20040142895A1 (en) 1995-10-26 2004-07-22 Sirna Therapeutics, Inc. Nucleic acid-based modulation of gene expression in the vascular endothelial growth factor pathway
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US6713069B1 (en) 1996-04-16 2004-03-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for detecting, preventing, and treating African Hemorrhagic Fever
US20050119470A1 (en) 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
AU8428998A (en) 1997-07-24 1999-02-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
ATE237312T1 (de) 1998-07-20 2003-05-15 Protiva Biotherapeutics Inc In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
AU783647B2 (en) 1999-04-20 2005-11-17 University Of British Columbia, The Cationic peg-lipids and methods of use
US6852334B1 (en) 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
JP2003509341A (ja) 1999-08-27 2003-03-11 イネックス ファーマスーティカルズ コーポレイション サイトカインの分泌刺激および免疫応答の誘導組成物
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
ATE398175T1 (de) 2000-12-08 2008-07-15 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
GB0118517D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Mitsubishi Tokyo Pharm Inc Compound
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
WO2003070283A2 (en) 2002-02-22 2003-08-28 Klaus Strebhardt Agent for inhibiting development or progress of proliferative diseases and especially cancer diseases and pharmaceutical composition containing said agent
EP2338478B1 (en) 2002-06-28 2014-07-23 Protiva Biotherapeutics Inc. Method for producing liposomes
ES2322145T3 (es) 2002-07-26 2009-06-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Moleculas pequeñas modificadas de adn inerferente y procedimiento de uso.
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
ATE517992T1 (de) 2002-11-14 2011-08-15 Dharmacon Inc Funktionelle und hyperfunktionelle sirna
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
CA2488224A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
WO2004091515A2 (en) 2003-04-09 2004-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA CONJUGATES
DK1620544T3 (en) 2003-04-17 2019-01-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc MODIFIED iRNA AGENTS
CA2532228C (en) 2003-07-16 2017-02-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
AU2004272646B2 (en) 2003-09-15 2011-11-24 Arbutus Biopharma Corporation Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
AU2005222965B8 (en) 2004-03-15 2010-07-01 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
WO2005120152A2 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
WO2006031901A2 (en) 2004-09-10 2006-03-23 Somagenics, Inc. SMALL INTERFERING RNAs THAT EFFICIENTLY INHIBIT VIRAL GENE EXPRESSION AND METHODS OF USE THEREOF
CA2580707C (en) 2004-09-24 2014-07-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of apob and uses thereof
EP2199298A1 (en) 2004-11-17 2010-06-23 Protiva Biotherapeutics Inc. Sirna silencing of Apolipoprotein B
JP5042863B2 (ja) 2005-02-14 2012-10-03 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 生物学的に活性な分子をデリバリーするための脂質ナノ粒子系組成物および方法
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
AU2006274413B2 (en) 2005-07-27 2013-01-10 Arbutus Biopharma Corporation Systems and methods for manufacturing liposomes
WO2007048046A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of filovirus gene expression
EP1948674A4 (en) 2005-11-02 2009-02-04 Protiva Biotherapeutics Inc MODIFIED SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
WO2007056861A1 (en) 2005-11-18 2007-05-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of influenza virus gene expression
GB0605900D0 (en) * 2006-03-23 2006-05-03 Lipigen As Modulators of nuclear receptors
CA2651839C (en) 2006-05-11 2016-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
MX363224B (es) 2006-10-03 2019-03-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulaciones que contienen lipidos.
KR100996975B1 (ko) * 2007-08-24 2010-11-29 한국화학연구원 혈류 내 순환시간 증가를 위한 단백질로 수식된 리포솜 및이의 제조방법
AU2008342535B2 (en) 2007-12-27 2015-02-05 Arbutus Biopharma Corporation Silencing of polo-like kinase expression using interfering RNA
EP2224912B1 (en) * 2008-01-02 2016-05-11 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
WO2009088891A1 (en) * 2008-01-02 2009-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
PT2279254T (pt) 2008-04-15 2017-09-04 Protiva Biotherapeutics Inc Novas formulações lipídicas para entrega de ácido nucleico
WO2009129319A2 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of csn5 gene expression using interfering rna
CN102149749B (zh) 2008-07-10 2014-06-25 塞瑞纳治疗公司 具有惰性端基的聚噁唑啉、由被保护的引发基团制备的聚噁唑啉以及相关化合物
KR100996976B1 (ko) 2008-08-27 2010-11-29 현대엔지니어링 주식회사 장수명 ｍｔｏ 반응용 촉매 및 이의 제조방법
CA2984026C (en) 2008-10-09 2020-02-11 Arbutus Biopharma Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
KR20220138415A (ko) 2008-11-10 2022-10-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
HRP20211619T1 (hr) * 2009-06-10 2022-02-04 Arbutus Biopharma Corporation Poboljšana formulacija lipida
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
WO2011000106A1 (en) * 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
NZ600725A (en) * 2009-12-18 2015-08-28 Univ British Colombia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011143230A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Alnylam Pharmaceuticals Methods and compositions for delivery of active agents
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
US10077232B2 (en) * 2010-05-12 2018-09-18 Arbutus Biopharma Corporation Cyclic cationic lipids and methods of use
WO2011141703A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
WO2011153120A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
WO2012054365A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
RU2718053C2 (ru) 2012-02-24 2020-03-30 Протива Байотерапьютикс Инк. Триалкиловые катионные липиды и способы их использования
US9744103B1 (en) 2013-03-08 2017-08-29 Chad Ricker Infant teething apparatus
US20160151284A1 (en) 2013-07-23 2016-06-02 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
US10561723B2 (en) 2015-07-21 2020-02-18 Theodore C. Marbley Treatment and prevention of anal conditions

Also Published As

Publication number Publication date
IL290931A (en) 2022-04-01
EP3473611A1 (en) 2019-04-24
US20150064242A1 (en) 2015-03-05
KR20210041135A (ko) 2021-04-14
SG11201405157PA (en) 2014-10-30
DK2817287T3 (da) 2019-01-02
IL234266B (en) 2020-09-30
CA2865412C (en) 2022-07-19
IL234266A0 (en) 2014-11-02
JP2018039844A (ja) 2018-03-15
BR112014020824A2 (uk) 2017-06-20
CA2865412A1 (en) 2013-08-29
RU2718053C2 (ru) 2020-03-30
LT2817287T (lt) 2018-12-27
CY1121232T1 (el) 2020-05-29
US11395854B2 (en) 2022-07-26
BR112014020824B1 (pt) 2022-10-04
AU2013222179A1 (en) 2014-10-09
WO2013126803A1 (en) 2013-08-29
EP3473611B1 (en) 2021-10-20
HK1202855A1 (en) 2015-10-09
KR20140129263A (ko) 2014-11-06
PH12014501901B1 (en) 2014-11-24
HRP20182156T1 (hr) 2019-02-22
CN110003030A (zh) 2019-07-12
PT2817287T (pt) 2018-12-28
KR102384791B1 (ko) 2022-04-08
SI2817287T1 (sl) 2019-02-28
PH12014501901A1 (en) 2014-11-24
KR102239887B1 (ko) 2021-04-13
MX356904B (es) 2018-06-07
US20200306378A1 (en) 2020-10-01
IL276924A (en) 2020-10-29
JP2015509505A (ja) 2015-03-30
JP2021014462A (ja) 2021-02-12
MX2022006512A (es) 2022-07-11
KR102075810B1 (ko) 2020-02-10
MX2014010211A (es) 2015-08-10
EP2817287B1 (en) 2018-10-03
US10561732B2 (en) 2020-02-18
US9352042B2 (en) 2016-05-31
US20170007702A1 (en) 2017-01-12
RU2020111326A (ru) 2020-04-29
JP7110297B2 (ja) 2022-08-01
ES2702874T3 (es) 2019-03-06
EP3988104A1 (en) 2022-04-27
RS58077B1 (sr) 2019-02-28
KR20220045089A (ko) 2022-04-12
ZA201406896B (en) 2016-05-25
CN104321304A (zh) 2015-01-28
AU2013222179B2 (en) 2017-08-24
EP2817287A1 (en) 2014-12-31
KR20200016396A (ko) 2020-02-14
JP6275655B2 (ja) 2018-02-07
PL2817287T3 (pl) 2019-10-31
ES2898912T3 (es) 2022-03-09
RU2014138476A (ru) 2016-04-10
JP2022140533A (ja) 2022-09-26
HUE041494T2 (hu) 2019-05-28
NZ700075A (en) 2016-05-27
US20230109183A1 (en) 2023-04-06
JP6789918B2 (ja) 2020-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12016929B2 (en) Lipid formulations for delivery of therapeutic agents
US11718852B2 (en) Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
UA120026C2 (uk) Триалкілкатіонні ліпіди і способи їх застосування
US20200113832A1 (en) Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
US9126966B2 (en) Cationic lipids and methods of use thereof
US8466122B2 (en) Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US20110313017A1 (en) Snalp formulations containing polyoxazoline-dialkyloxypropyl conjugates
TW201735950A (zh) 用於治療ｂ型肝炎之治療組合物及方法
US20240316206A1 (en) Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents