CN115279743B - 用于核酸递送的可离子化脂质 - Google Patents

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Abstract

本文描述核心式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1包括氨基。这些化合物特别用于核酸和蛋白质治疗剂的配制以及体内和离体递送，用于制备和施行T细胞转染，基因编辑，癌症治疗，癌症预防，以及制备疫苗。

Description

用于核酸递送的可离子化脂质
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月29日提交的US临时专利申请62/868,900和于2020年4月13日提交的63/009,042的优先权。
技术领域
所公开的主题一般地涉及可离子化脂质，特别是能够转染含遗传物质的活细胞的那些可离子化脂质。
背景技术
有关的现有技术
用于疾病、甚至并不具有初始遗传原因的那些疾病的核酸治疗策略数量日益增长。每种核酸治疗具有不同的形式、化学和电荷，并且一般需要不同的递送模式。
自从至少1987年以来，脂质转染(lipofection)已研究用作通过脂质介导的基因递送来改变细胞遗传特性的手段。多年来，已对所述脂质进行精细改良以使它们适应更多的情况。在1990年代使用的是阳离子脂质如DODAC，DOTMA，DDAB和DOTAP，但其被证明对预期的临床应用毒性过大。
临床有关的途径已是为人类使用开发可离子化脂质。可离子化脂质的实例包括1,2-二亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)，二亚油烯基甲基-4-二甲基氨基丁酸盐/酯(DLin-MC3-DMA，参见例如U.S.专利号8,158,601)，和2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)。DLin-MC3-DMA或"MC3"是用于OnpattroTMpatisiran中的获批药物，但有存放期问题。
一直以来都需要临床有关的转染脂质的更多选择。
发明概要
根据本发明实施方式，提供式(I)化合物或其药学上可接受的盐
其中p是0或1；
E1选自-O-δ1，-OC(O)O-δ1，-OC(O)-δ1，-OC(O)N(Q)-δ1，-OC(O)S-δ1，-C(O)N(Q)-δ1，-C(O)O-δ1，-N(Q)C(O)-δ1，-N(Q)C(O)O-δ1，-N(Q)C(O)S-δ1，和-N(Q)C(O)N(Q)-δ1；Q是H或C1-C5烷基；δ1指定连接至R1基团的键；
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基，C2-C6烯基，和C2-C6炔基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有氧(O)或多至2个氮(N)的4-6元环，所述取代基各自独立地选自C1-C6烷基，环丙基，OH，和C1-C3烷氧基；
R5选自C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和2-羟基乙基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3，4或5；
b和c独立地是0，1或2；
c’是1，2，3，4或5；
d是1或2；
e是0，1或2；
E2选自-OC(O)-δ2，-OC(O)O-δ2，-OC(O)N(Q)-δ2，-O-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；Q是H或C1-C5烷基；δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自独立地是直连键，-O-δ3，-CH2OC(O)-δ3，和-CH2O-δ3；δ3指定连接至R7和R8基团的键；
R7和R8各自独立地是C4-C10烷基，C4-C10烯基或C4-C10炔基；
f是0，1，2，3，4或5；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1，2或3；
根据本发明其它实施方式，提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐
其中E1选自-OC(O)O-δ1，-OC(O)-δ1，-OC(O)N(Q)-δ1，和-OC(O)S-δ1；Q是H或C1-C5烷基；和δ1指定连接至R1基团的键；
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有多至2个氮(N)的5-6元环，所述取代基选自C1-C6烷基；
R5选自C1-C6烷基和C3-C6环烷基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3或4；
b和c独立地是0，1或2；
c’是2，3或4；
d是2；
e是0或1；
E2选自-O-δ2，-OC(O)-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；其中δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自独立地是直连键，-O-δ3，-CH2OC(O)-δ3，和-CH2O-δ3；δ3指定连接至R7和R8基团的键；
R7和R8各自独立地是C4-C10烷基，C4-C10烯基或C4-C10炔基；
f是0，1，2，3，4或5；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1或2；
根据本发明其它实施方式，提供式(II)化合物或其药学上可接受的盐
其中E1选自-OC(O)O-δ1，-OC(O)-δ1，-OC(O)N(Q)-δ1，和-OC(O)S-δ1；Q是H或C1-C5烷基；和δ1指定连接至R1基团的键；
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有多至2个氮(N)的5-6元环，所述取代基选自C1-C6烷基；
R5选自C1-C6烷基和环丙基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3或4；
b是0或1；
c是0，1或2；
c’是2，3或4；
d是2；
e是1；
E2选自-O-δ2，-OC(O)-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；其中δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自是直连键；
R7和R8各自独立地选自C4-C10烷基；
f是0或1；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1或2。
根据本发明其它实施方式，提供式(III)化合物或其药学上可接受的盐
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有多至2个氮(N)的5-6元环，所述取代基选自C1-C6烷基；
R5选自C1-C6烷基和环丙基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3或4；
b是0或1；
c是0，1或2；
c’是2，3或4；
d是2；
e是1；
E2选自-O-δ2，-OC(O)-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；其中δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自是直连键；
R7和R8各自独立地选自C4-C10烷基；
f是0或1；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1或2。
根据本发明实施方式，R1是下述之一：
在又一实施方式中，各R2独立地是：
在本发明的其它实施方式中，E1选自：
其中δ1指定连接至R1基团的键。
在本发明的其它实施方式中，E2选自：
其中δ2指定连接至R2基团的键或其药学上可接受的盐。
根据本发明实施方式提供化合物，其选自列于表1的化合物。
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或其药学上可接受的盐。
根据本发明实施方式，还提供列于表2的化合物。
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1通过ChemDraw预测。
本发明的可离子化脂质具有不对称中心，且作为外消旋体、外消旋混合物、单独对映体、对映体混合物、单独非对映体和作为非对映体混合物存在，涵盖全部可能异构体比如互变异构体及其混合物。
在本发明实施方式中，包含表1脂质的经配制的脂质纳米颗粒的实验pKa用2-(对-甲苯氨基)萘-6-磺酸(TNS)测试来计算。TNS测试程序描述于实施例25。
根据本发明实施方式提供脂质混合物组合物，包含任何上述的化合物和与之组合的结构脂质、固醇和稳定剂以及至少一种治疗剂。
在实施方式中，结构脂质包括一种或多种选自DSPC，DSPE，DPPC，DMPC，DOPC，POPC，DOPE和SM的结构脂质。在某些实施方式中，结构脂质是DSPC。在其它实施方式中，结构脂质是DOPE。
在实施方式中，稳定剂包括一种或多种表面活性剂和聚合物缀合的脂质。
在实施方式中，化合物以约10Mol％-90Mol％存在，结构脂质以约0-50Mol％存在，固醇以约0-45Mol％存在，和稳定剂以0-10Mol％存在；并且各组分总mol％加合为100mol％。
在其它实施方式中，化合物以约40Mol％-60Mol％存在，和结构脂质以约11-40Mol％存在；并且各组分总mol％加合为100mol％。
在实施方式中，化合物与其余组分的摩尔比是30Mol％至70Mol％。
在实施方式中，化合物以40Mol％存在，DSPC以20Mol％存在，胆固醇以37.5Mol％存在，和聚氧乙烯(10)硬脂基醚以2.5Mol％存在。在其它实施方式中，化合物以40至47.5Mol％存在，DSPC以12.5Mol％存在，胆固醇以38.5至46Mol％存在，和PEG-DMG2000以1.5Mol％存在。在其它实施方式中，化合物以40至47.5Mol％存在，DOPE以12.5Mol％存在，胆固醇以38.5至46Mol％存在，和PEG-DMG 2000以1.5Mol％存在。
在实施方式中，脂质混合物组合物还包括靶向部分。在实施方式中，固醇是胆固醇。在实施方式中，治疗剂包括一种或多种核酸。在实施方式中，治疗剂包括多肽。
在实施方式中，稳定剂选自PEG-DMG 2000，聚氧乙烯(10)硬脂基醚，聚氧乙烯(40)硬脂酸盐/酯，聚山梨酸酯80，聚氧乙烯(4)月桂基醚，聚氧乙烯(20)硬脂基醚，聚氧乙烯(23)月桂基醚，和D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐/酯。
根据本发明实施方式提供脂质颗粒形式的脂质混合物组合物。
还提供本发明化合物制备治疗剂的用途，用于将治疗剂给予离体细胞。在其它实施方式中，治疗剂是用于癌症治疗中的药物配制剂。在某些实施方式中，治疗剂是用于T细胞修饰中的药物配制剂。在其它实施方式中，治疗剂是疫苗。
在某些实施方式中，治疗剂包括核酸治疗剂。在这些实施方式中，核酸治疗剂是mRNA，siRNA，miRNA，指导RNA，合成的指导RNA，人工染色体，环状或线状DNA，DNA微环，或msDNA。在这些实施方式的某些中，mRNA是自复制RNA分子。
根据本发明实施方式提供脂质混合物组合物用于制备疫苗的用途。在实施方式中，疫苗涉及预防病毒病。在实施方式中，疫苗涉及对抗冠状病毒感染。
根据本发明实施方式，提供上述脂质混合物组合物用于治疗或癌症疫苗中的用途。根据本发明实施方式，提供上述脂质混合物组合物用于体内或离体蛋白质调节的用途。
在实施方式中，mRNA是自复制RNA分子。
根据本发明实施方式提供上文描述的脂质混合物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于调节人类T细胞；CAR-T，TCR，基因-编辑或同种异体的T细胞。
还提供本发明脂质混合物组合物在制备药物中的用途的实施方式，所述药物用于调节T细胞，其中T细胞分离自患者，或已特别对T细胞或同种异体T细胞工程改造的T细胞。
在实施方式中，脂质混合物组合物还包括多肽。在实施方式中，脂质混合物组合物还包括多肽和核酸两者。
在实施方式中，脂质混合物组合物还包括核糖核蛋白。
根据本发明提供化合物，其中各氢之一用卤素取代。在实施方式中，卤素是碘或氟。
根据本发明实施方式提供上文所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中纳米颗粒的实验pKa范围是5.6-7.1。
根据本发明实施方式提供药物组合物，包含上述化合物，和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
附图说明
本公开的其它特征和优势将通过下文详述以及所附附图变得明显，其中：
图1是柱状图，展示活pan T细胞中由mRNA脂质纳米颗粒(LNP)介导的相对GFP表达水平，所述颗粒包含CT10组合物中的DLin-MC3-DMA、PNI 76或PNI 121，N/P比率为10，并且在处理之后48小时通过流式细胞术分析基因表达；
图2是图，展示处理后48h在分离的初代人类T细胞中由mRNA-LNP介导的百分比GFP表达，所述颗粒含有CT10组合物中的脂质MC3或PNI脂质121，N/P比率为10。X轴代表六种不同供体；
图3是柱状图，展示在用eGFP mRNA LNP处理CD4+/CD8+T细胞后通过ELISA确定的eGFP表达定量，所述颗粒包含CT10组合物中的DLin-MC3-DMA、PNI 76、PNI 119、PNI 120、PNI 121和PNI 122，N/P比率为10；
图4是柱状图，显示预先低温贮藏的分离的初代人类T细胞中的GFP表达，所述细胞在活化之后4天用500ng包封mRNA每125,000细胞通过在CT10组合物中含有DLin-MC3-DMA、PNI 127、PNI 328、PNI 329或PNI 541的mRNA-LNP处理，N/P比率为8。GFP MFI(第一栏)、转染效率(中间栏)和存活率(第三栏)在LNP加入之后48小时通过流式细胞术测量；
图5显示两个柱状图，展示分离的初代人类T细胞中由mRNA-LNP介导的GFP表达，所述颗粒含有可离子化脂质Dlin-MC3-DMA，或各自数种新的可离子化脂质PNI脂质(PNI 321、325、328、329、336、534、535、540、541)，使用CT10组合物和N/P比率为8，在T细胞活化后用500ng包封mRNA每125,000T细胞处理3天。在LNP加入之后48h，通过流式细胞术测量转染效率(上)和MFI(下)；
图6是柱状图，展示在mRNA LNP介导的pan T细胞转染之后通过ELISA确定的分泌的和细胞溶质的重组人红细胞生成素(EPO)的表达水平，比较未处理对照("-LNP")，DLin-MC3-DMA，PNI 76或PNI 121，其在LM02组合物中N/P为10。对照是生产商提供的正常人类血清标准品；
图7显示在i.v给予0.5mg/Kg剂量的重组人EPO-编码的mRNA LNP之后在C56BL/6小鼠中的EPO表达水平，所述颗粒含有可离子化的脂质DLin-MC3-DMA，PNI-76，PNI 121或PNI127，在LM02组合物中N/P为6；
图8显示在i.v给予1或3mg/Kg剂量的重组人EPO-编码的mRNA LNP之后在C56BL/6小鼠中的6h(左)和24h(右)EPO表达水平，所述颗粒含有可离子化脂质DLin-MC3-DMA，PNI121或PNI127，使用LM02组合物且N/P为6。PBS用作阴性对照；
图9是散点图，显示在给予LM02 LNAP(LNP)中包封的5-moU EPO mRNA之后6h以mIU/mL计的EPO表达水平，所述颗粒包含多样的15种可离子化脂质化合物(PNI 336，PNI534，PNI 535，PNI 342，PNI 321，PNI 532，PNI 538，PNI 541，PNI 325，PNI 328，PNI 329，PNI 539，PNI 540，PNI 127)，其N/P比率为6和剂量为0.5mg/Kg；
图10显示ELLATM Simple PlexTM自动化ELISA(Protein Simple)测量的在i.v.给予1mg/kg(mpk)5moU rhEPO-编码的mRNA之后48h小鼠中的各种细胞因子水平：IFNg，IL-5，IL-6和TNF-a，其是由LM02组合物且N/P为6的含有可离子化脂质MC3、PNI 121或PNI 127的LNP介导的。PBS是阴性对照；
图11是在用含PNI 127、PNI 329或PNI 328的CAR mRNA LNP(CT10，N/8，500ng包封mRNA每125,000个经处理的T细胞)处理之后48h的CD19 CAR阳性T细胞的流式细胞术直方图(CAR+，虚线右侧)。对照是未处理的人类原代T细胞。在处理之前3天T细胞已活化；
图12是散点图，展示用5μg OVA mRNA LNP疫苗免疫的4只小鼠组的血清中的OVA-特异性IgG抗体滴定度。两次免疫分开10天(第1天、第10天)完成，随后在第二次给予后两周采血，和通过ELISA进行OVA特异性IgG滴定度测量。将50μg剂量的OVA蛋白质用作阳性对照。5μg OVA编码的mRNA引起与高10倍剂量的OVA蛋白质相似的IgG应答；
图13是散点图，展示四只单独小鼠的血清中的OVA-特异性IgG抗体滴定度，所述小鼠是在第1天和第10天用10μg PBS对照，50ug OVA蛋白质，或10μg OVA mRNA LNP疫苗免疫的。OVA-特异性IgG滴定度测量通过ELISA用在第二次给予之后两周取得的血液样品产生。10μg OVA-编码的mRNA引起与高5倍剂量的OVA蛋白质相同或更高的IgG应答；和
图14是展示TNS曲线的图，指出掺入各种可离子化脂质化合物PNI 119，PNI 121，PNI 321，PNI 329，PNI 336，PNI 535，PNI538和PNI 540(LM02组合物)的LNP的表面pKa度量。
应注意在全部所附的附图中，类似特征用类似参考数字指出。
发明详述
在本公开中，措辞"包含"以非限制性含义用来意指包括该措辞后的项目，但不排除未特别提及的项目。应理解在包含或可以包含指定的特征或变量或参数的实施方式中，备择实施方式可以由所述特征、或变量或参数组成或基本上由所述特征、或变量或参数组成。通过不定冠词"一个"提及要素不排除存在多于一个该要素的可能性，除非内容清楚地需要存在一个且仅一个该要素。
在本公开中通过端点描述数字范围包括该范围中囊括的全部数字，包括全部整数、全部整数和全部分数中间值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等)。在本公开中单数形式"一个"和"一种"包括复数指示语，除非内容清楚地另有所指。从而，例如在提及组合物含有"一种化合物"的情况下包括其混合物。
在本公开中术语"或"一般以包括"和/或"的含义使用，除非内容清楚地另有所指。
"脂质"是指结构多样的有机化合物类别，其是脂肪酸衍生物或固醇或可以是类似脂质的物质如类脂质(lipidoid)(实施例C12-200)或聚合物缀合的脂质并且特征是不溶于水但是可溶于许多有机溶剂。
"脂质混合物组合物"。脂质混合物组合物指组分类型，组分比率，和总组分与核酸负荷量的比率。例如，40Mol％可离子化脂质、20Mol％结构脂质、17.5Mol％固醇和2.5Mol％稳定剂的脂质混合物组合物会是脂质混合组合物。
如本文所用，"N/P"是可离子化脂质的胺基团与核酸的那些磷酸基团的摩尔比率。在本发明实施方式中，N/P比率是4至10，和最优选的比率是N/P 4-12。在一种实施方式中，N/P比率是10。核酸组分与该脂质混合物组合物结合以形成脂质核酸颗粒或LNP，其预计比率是比如N/P 4、N/P 6、N/P 8、N/P 10、N/P 12或又一有关的特定N/P比率的可离子化脂质胺(N)与核酸磷酸(P)的比率。
"脂质颗粒"。本发明提供制备自上文描述的脂质混合物组合物的脂质颗粒。脂质颗粒代表含治疗剂和各组分的脂质混合物组合物的物理组织。脂质纳米颗粒是脂质颗粒。脂质颗粒一般是脂质，核酸，胆固醇和稳定剂的球形组装物。阳性和负电荷，比率，以及亲水性和疏水性决定脂质颗粒在尺寸和组分取向方面的物理结构。这些脂质颗粒的结构组织可以导致如脂质体中的具有最小双层的含水内部或者其可以具有如固体核酸脂质纳米颗粒中的固体内部。可以存在一种或多种形式的磷酸酯质单层或双层。脂质颗粒尺寸为1至1000μm。
"存活率"在描述体外细胞的情况下，意指继续生长、分裂并且如细胞类型或组织培养株正常的那样继续生长和分裂的能力。细胞存活率受苛刻条件或处理影响。细胞存活率在离体治疗或肠胃外给药中是关键的。
"可离子化脂质"。本发明化合物包含可离子化脂质。如本文所用，术语"可离子化脂质"是指脂质，其随pH降低至所述脂质的可离子化基团的pKa之下是阳离子或变得可离子化(质子化)，但是在较高pH值则更中性。在pKa之下的pH值，脂质则能够与带负电核酸(例如寡核苷酸)结合。如本文所用，术语"可离子化脂质"包括在pH降低的情况下带正电荷的脂质，和在选择性pH比如生理学pH携带净正电荷的任何许多脂质种类。
可离子化脂质或化合物存在于根据本发明其它实施方式的脂质组合物中，优选比率是约30至约70Mol％，在某些实施方式中，约30Mol％，在其它实施方式中，约40Mol％，在其它实施方式中，约50Mol％，在其它实施方式中，约60Mol％("Mol％"意指特定组分总摩尔的百分比)。术语"约"在该段中表示±5Mol％的范围。DODMA或1,2-二油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷是可离子化脂质，DLin-MC3-DMA或4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基酯也同样。
脂质颗粒可以产生自脂质配制剂，其包括本发明的可离子化脂质。
在某些实施方式中，将结构脂质(也称为"辅助脂质"或"中性脂质")掺入本发明的脂质配制剂和脂质颗粒。本发明的脂质配制剂和脂质颗粒包括占组合物约10至40Mol％的一种或多种结构脂质。适宜的结构脂质支持颗粒在制备期间形成。结构脂质是指许多脂质种类中的任意种，其在生理学pH以阴离子、未带电或中性两性离子形式存在。代表性的结构脂质包括二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，二酰基磷脂酰甘油，神经酰胺，鞘磷脂，二氢鞘磷脂，脑磷脂，和脑苷脂。
示范性结构脂质包括两性离子的脂质，例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)，棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸盐/酯(DOPE-mal)，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，16-O-一甲基PE，16-O-二甲基PE，18-1-反式PE，1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一种优选的实施方式中，结构脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
在又一实施方式中，结构脂质是在生理学pH带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油比如二油酰基磷脂酰基甘油(DOPG)，二棕榈酰基磷脂酰基甘油(DPPG)，棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)，心磷脂，磷脂酰肌醇，二酰基磷脂酰丝氨酸，二酰基磷脂酸，和联接中性脂质的其它阴离子修饰基团。其它适宜的结构脂质包括糖脂(例如单唾液酸神经节苷酯GM1)。
稳定剂或稳定化剂包括在脂质配制剂实施方式中以确保混合物的完整性。稳定剂是一类分子，其破坏或帮助形成分子间的疏水-亲水相互作用。适宜的稳定剂包括但不限于聚山梨酸酯80(也称为吐温80，IUPAC命名2-[2-[3,4-二(2-羟基乙氧基)氧杂环戊烷-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基十八-9-烯酸酯)，Myrj52(聚氧乙烯(40)硬脂酸盐/酯)，和BrijTM S10(聚氧乙烯(10)硬脂基醚)。还可以使用聚乙二醇缀合的脂质。稳定剂可以单独或相互组合使用。
在某些实施方式中，稳定剂包含总脂质混合物的约.1至3Mol％。在某些实施方式中，稳定剂包括总脂质混合物的约0.5至2.5Mol％。在某些实施方式中，稳定剂以大于2.5Mol％存在。在某些实施方式中稳定剂以5Mol％存在。在某些实施方式中稳定剂以10Mol％存在。在某些实施方式中，稳定剂为约0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4,1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5等。在其它实施方式中，稳定剂是脂质混合物的2.6-10Mol％。在其它实施方式中，稳定剂以脂质混合物的大于10Mol％存在。
类固醇包括在优选的脂质混合物组合物中用于某些应用，并且从其制备的脂质颗粒包括固醇比如胆固醇和植物甾醇。在某些实施方式中，在本发明的脂质混合物中，胆固醇以最终脂质混合物的约30至50Mol％存在。另选地，胆固醇以最终脂质混合物的约35至41Mol％存在。在其它实施方式中，固醇不存在。
核酸。本发明的脂质混合物组合物和脂质颗粒可用于核酸的全身性或局部递送。如本文所用，术语"核酸治疗剂"(NAT)意在包括递送入细胞中导致希望效果的任何寡核苷酸或多核苷酸。该定义包括符合本发明提供的相同物理原理的诊断试剂和研究试剂。含有多至50个核苷酸的片段一般称为寡核苷酸，而更长的片段称为多核苷酸。在特别的实施方式中，本发明的寡核苷酸长度是20-50个核苷酸。在本发明实施方式中，寡核苷酸长度是996至4500个核苷酸，如信使RNA的情况。
术语"核酸"也指核苷酸，脱氧核苷酸，修饰的核苷酸，修饰的脱氧核糖核苷酸，修饰的磷酸-糖-骨架寡核苷酸，其它核苷酸，核苷酸类似物，及其组合，并且能够视情况是单链，双链，或含有双链和单链序列两者的部分。mRNA能够是修饰的或未修饰的，碱修饰的，和可以包括不同类型的封端结构比如Cap1。
如本文所用，术语"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互换地使用并且意指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核苷酸(RNA)，其通过核苷酸间磷酸二酯键连接体例如3'-5'和2'-5'翻转连接体、例如3'-3'和5'-5'支化结构，或核苷酸间的类似物连接。多核苷酸具有结合的平衡离子比如H+，NH4+，三烷基铵，Mg2+，Na+等。多核苷酸可以完全地由脱氧核糖核苷酸，完全地由核苷酸，或其嵌合混合物构成。多核苷酸可以包括核苷酸间，核碱基和/或糖类似物。
术语"多肽"在本文中涵盖"寡肽"和"蛋白质"及其三元和四元结构，其在某些实施方式中是治疗剂。寡肽一般地由二至二十个氨基酸组成。多肽是任何长度的通过酰胺键一起连接的许多氨基酸的单个线性链。蛋白质由一种或多种组成和可以包括结构蛋白质，能量催化剂，白蛋白，血红蛋白，免疫球蛋白和酶。
"核糖核蛋白"在某些实施方式中是Cas9蛋白和指导RNA的复合物。在某些实施方式中，核糖核蛋白是本发明各方面中所指的治疗剂。
目前，核酸治疗剂包括脱氧核糖核酸、互补的脱氧核糖核酸、完整基因、核糖核酸、寡核苷酸和核酶，用于靶向各种疾病比如癌症、传染病、遗传病和神经变性疾病的基因治疗。如本文描述，核酸治疗剂(NAT)在其用本发明化合物形成期间掺入脂质颗粒。以该方式可以掺入多于一种核酸治疗剂。它们可以衍生自天然来源，或更一般是合成或培养生长的。核酸治疗剂的实例包括但不限于反义寡核苷酸，核酶，微小RNA，mRNA，核酶，tRNA，tracrRNA，sgRNA，snRNA，siRNA，shRNA，ncRNA，miRNA，mRNA，预集缩DNA，pDNA或适体。核酸试剂用来沉默基因(例如siRNA)，表达基因(例如mRNA)，编辑基因组(例如CRISPR/Cas9)，和重编程细胞以返回源有机体(例如癌症疗法的离体细胞治疗重编程免疫细胞；自体转移或同种异体转移)。
在根据本发明的脂质颗粒中存在的核酸包括任何形式的已知核酸。本文使用的核酸能够是单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂交体。双链DNA的实例包括结构基因，包括控制和终点区域的基因，和自复制系统比如病毒或质粒DNA。双链RNA的实例包括siRNA和其它RNA干扰试剂。单链核酸包括反义寡核苷酸，指导RNA，包括CRISPR-Cas9 gRNA，核酶，微小RNA，mRNA，和形成三链体的寡核苷酸。可以向脂质颗粒中掺入多于一种核酸，例如一起的mRNA和指导RNA，或各自的不同类型，或与蛋白质组合。
质粒DNA是在本发明实施方式中配制的优选核酸。质粒是分离自细胞中染色体DNA的DNA分子，并且能够独立地复制。质粒尺寸的范围是小于1000个核苷酸至数万个核苷酸。最常见的形式是小环状双链DNA。质粒能够合成和递送至哺乳动物细胞用于治疗意图。合成质粒用作分子克隆的载体，用来驱动重组DNA序列在宿主有机体内的复制。质粒可以用物理方法比如电穿孔经由转化，或化学手段如本发明经由脂质颗粒-增强的转染引入细胞。本发明的这些脂质混合物组合物具有相对物理技术的数种优势，包括i)高生物可相容性以及在细胞和组织系统中的低毒性；ii)制备相对容易；iii)亲油基质更不易受在聚合物系统中观察到的侵蚀现象影响；iv)增加的体内循环半衰期，原因是它们对免疫系统的隐形性。
在某些情况下，核酸编码特异性结合至配体的基因工程改造的受体，比如重组受体，和牵涉于代谢途径中的分子，或其功能部分。另选地，牵涉于代谢途径中的分子是重组分子，包括外源物质。基因工程改造的受体和牵涉于代谢途径中的分子可以通过一种核酸或者两种或更多种的不同核酸编码。在某些实例中，第一核酸可能编码特异性结合至配体的基因工程改造的受体而第二核酸可能编码牵涉于代谢途径中的分子。
"治疗剂"如本文所用包括本文所描述的核酸治疗剂，本文所描述的多肽，和多糖，盐，小分子，无机离子和放射性核素。
根据本发明某些实施方式的脂质颗粒能够通过电子显微技术表征。具有基本上固体核心的本发明颗粒具有如电子显微技术所观察到的电子致密核心。一种所述结构公开于Cullis等人的美国专利号9,758,795。电子致密定义为固体核心颗粒投影面积(如2-D低温EM图像显示)的内部50％的面积-平均电子密度不小于颗粒周围的最大电子密度的x％(x＝20％，40％，60％)。电子密度计算为有关区域的图像强度与不含纳米颗粒区域的背景强度差异的绝对值。
本发明的脂质颗粒能够用测量溶液颗粒大小的装置比如MalvernTM ZetasizerTM来评价尺寸。颗粒具有约15至约300nm的平均颗粒直径。用于脂质颗粒的又一术语是"LNP"，其代表"脂质纳米颗粒"。在某些实施方式中，平均颗粒直径大于300nm。在某些实施方式中，脂质颗粒具有约300nm或更小，250nm或更小，200nm或更小，150nm或更小，100nm或更小，或50nm或更小的直径。在一种实施方式中，脂质颗粒具有约50至约150nm的直径。与较大颗粒相比，较小颗粒一般展示增加的体内循环寿命。与较大纳米颗粒相比，较小颗粒具有增加的达到肿瘤位点的能力。在一种实施方式中，脂质颗粒具有约15至约50nm的直径。
混合。根据本发明实施方式的脂质颗粒能够制备如下：标准T-管混合技术，湍流混合，研磨混合，搅动促进有序自组装，或者被动混合全部要素，其中要素自组装为纳米颗粒。已开发各种方法来配制含有基因药物的脂质纳米颗粒(LNP)。比如说，适宜的方法公开于Ansell、Mui和Hope的US专利号5,753,613和Saravolac等人的US专利号6,734,171。这些方法包括在乙醇存在下将预先形成的脂质颗粒与核酸治疗剂(NAT)混合或者将溶于乙醇的脂质与含有NAT的含水介质混合并且获得NAT包封效率65-99％的脂质颗粒。这两种方法依赖可离子化脂质的存在来实现NAT和稳定剂的包封以抑制团聚和形成大结构。所产生的脂质颗粒系统的特性(包括尺寸和NAT包封效率)是对各种脂质混合物组合物参数比如离子强度，脂质和乙醇浓度，pH，NAT浓度和混合速率敏感的1。
微流体两相微滴技术已用来产生单分散聚合物微粒用于药物递送或者产生大囊泡用于包封细胞、蛋白质或其它生物分子。已展示流体动力学流动聚焦(一种普通微流体技术)用来提供试剂的快速混合，构造受控尺寸的单分散脂质体。
通常，用目前的配制程序难以控制参数比如在混合时的相对脂质和NAT浓度以及混合速率，导致所产生的NAT的特征在制剂内部和制剂之间的可变性。自动微混合设备比如设备(Precision NanoSystems Inc，Vancouver，加拿大)使得纳米药(脂质体，脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒)的快速和受控制备成为可能。/>设备经由微流体混合筒实现纳米颗粒的受控分子自组装，其允许纳米颗粒组分以纳升、微升或更大规模进行自定义或平行化的毫秒混合。以小规模快速混合允许对颗粒合成和品质的可重现控制，在更大的设备中这是不可能的。
优选方法并入设备比如微流体混合装置如SparkTM，IgniteTM，BenchtopTM和/>BlazeTM以便实现在一步中将形成过程所用核酸几乎100％包封在颗粒中。在一种实施方式中，脂质颗粒通过这样的过程制备，其中形成过程所用核酸的约90至约100％包封在颗粒中。
Cullis等人的U.S.专利号9,758,795和9,943,846描述使用小体积混合技术的方法和由此衍生的新配制剂。Ramsay等人的U.S.申请Pub.No.20160022580描述更高级的方法，使用小体积混合技术和产品来配制不同的物质。Walsh等人的U.S.专利号9,943,846公开微流体搅拌器，其中待混合的要素具有不同的路径和孔。Wild、Leaver和Taylor的PCT公开WO2017117647公开微流体搅拌器，具有一次性无菌路径。Wild、Leaver和Taylor的U.S.专利号10,076,730公开叉状环形微混合几何形状和它们的微混合应用。Chang、Klaassen、Leaver等人的PCT公开No.WO2018006166公开可编程的自动化微混合器和用于其的混合芯片。Wild和Leaver的US外观设计Nos.D771834、D771833、D772427，和D803416和Chang等人的D800335，D800336和D812242公开具有微通道和混合几何形状的混合筒，用于PrecisionNanoSystems Inc.销售的搅拌器设备。
在本发明实施方式中，用生物学微流体混合装置来制备根据本发明实施方式的脂质颗粒。装置包括第一和第二试剂物流，其充入微流体搅拌器，并且脂质颗粒从出口收集，或进入无菌环境。
第一物流包括第一溶剂中的治疗剂。适宜的第一溶剂包括治疗剂在其中可溶的溶剂并且其可与第二溶剂混合。适宜的第一溶剂包括含水缓冲液。代表性的第一溶剂包括柠檬酸和乙酸缓冲液或其它低pH缓冲液。
第二物流包括第二溶剂中的脂质混合物物质。适宜的第二溶剂包括根据本发明实施方式的可离子化脂质在其中可溶的溶剂，并且其可与第一溶剂混合。适宜的第二溶剂包括1,4-二噁烷，四氢呋喃，丙酮，乙腈，二甲亚砜，二甲基甲酰胺，酸和醇。代表性的第二溶剂包括90％的乙醇水溶液，或无水乙醇。
在本发明的一种实施方式中，适宜的装置包括一个或多个微通道(也即最大尺度小于1毫米的通道)。在一个实例中，微通道具有约20至约300μm的直径。在实例中，微通道的至少一个区域具有主流动方向和一个或多个表面，所述表面具有其中限定的至少一个沟槽或突起，所述沟槽或突起具有与主要方向形成角的取向(例如错开的人字形搅拌器)，如美国专利Pub.No.9,943,846中的描述，或者具有叉状环形流，如美国专利号10,076,730中的描述。为了实现最大混合速率，有利的是避免在混合区域之前的过度流动阻抗。从而，装置的一个实例具有尺度大于1000μm的非微流体通道，以将流体递送至单个混合通道。
更低自动化的微混合方法和设备比如Zhang，S-h等人2和Stroock A等人、U.S.公开的专利申请US20040262223、和Jeffs，LB等人3中公开的那些也用于构造本发明脂质颗粒组合物。
本发明的可离子化脂质可以用来将治疗剂递送至体外或体内的细胞。在特别的实施方式中，治疗剂是核酸，用本发明的核酸-脂质颗粒将其递送至细胞。核酸能够是siRNA，miRNA，LNA，质粒，复制子，mRNA，指导RNA，转位子，或单个基因。在其它实施方式中，待递送至一个或多个细胞的治疗剂是基因编辑技术。基因编辑技术是一类技术，其改变有机体的DNA并且使得在基因组中的特定位置添加、删除或变更遗传物质成为可能。存在用于基因组编辑的数种方法，包括CRISPR-Cas9(规律成簇的间隔短回文重复和CRISPR相关蛋白质9)，TALEN和ZFN4。
在其它实施方式中，治疗剂是寡肽、多肽或蛋白质，用本发明肽-脂质颗粒将其递送至细胞。在其它实施方式中，治疗剂是核酸和蛋白质组分比如Cas9的混合物。方法和脂质混合物组合物可以容易地调整以递送任何适宜的治疗剂，用于治疗会得益于所述治疗的任何疾病或障碍。
在某些实施方式中，本发明提供方法将核酸引入细胞的方法(也即转染)。转染是分子生物学中一般使用的技术，用于将核酸治疗剂(或NATs)从细胞外引入细胞内空间，其目的是所递送基因的转录、翻译和表达。转染效率一般定义为i)在总处理群体中显示递送基因的阳性表达的细胞的百分比，如活或固定细胞成像(检测荧光蛋白质)和流式细胞术所测量，或ii)通过所处理的细胞表达的蛋白质强度或量，如活或固定细胞成像或流式细胞术所分析，或iii)使用蛋白质定量技术比如ELISA或免疫印迹。这些方法可以进行如下：将本发明的颗粒或脂质混合物组合物与细胞接触足够发生细胞内递送的时间段。
典型应用包括用熟知程序来提供siRNA的细胞内递送以敲除或沉默体外和体内的特定细胞靶标。另选地，应用包括递送编码治疗用多肽的DNA或mRNA序列。以该方式，通过供给缺乏或缺失基因的产物来提供对基因疾病的治疗。本发明方法可以在体外，离体或在体内实施。例如，本发明脂质混合物组合物还能够用于将核酸递送至体内的细胞，其使用本领域技术人员已知的方法。在又一实例中，本发明脂质混合物组合物能够用于将核酸递送至离体的患者细胞样品，然后送返患者。
下文描述通过本发明脂质颗粒来递送核酸治疗剂。
对于体内给药，药物组合物优选经肠胃外(例如关节内，经静脉内，经腹膜内，经皮下，鞘内，皮内，气管内，骨内，经肌肉内或肿瘤内)给予。在特别的实施方式中，药物组合物通过推注在静脉内，鞘内或经腹膜内给予。其它给药途径包括局部(皮肤、眼、粘膜)，口，肺，鼻内，舌下，直肠和阴道。
对于离体施用，药物组合物优选给予已从有机体移除的生物学样品，然后洗涤细胞并送返有机体。有机体可以是哺乳动物，尤其可以是人类。该过程例如用于细胞重编程，基因恢复，免疫治疗。
在一种实施方式中，本发明提供调节靶标多核苷酸或多肽表达的方法。这些方法一般包括将细胞与本发明脂质颗粒接触，所述颗粒结合了能够调节靶标多核苷酸或多肽表达的核酸。如本文所用，术语"调节"是指改变靶标多核苷酸或多肽的表达。调节能够表示增加或增强，或其能够表示降低或减少。
在有关的实施方式中，本发明提供治疗表征为多肽在受试者中过表达的疾病或障碍的方法，包括向受试者提供本发明药物组合物，其中治疗剂选自siRNA、微小RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微小RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中siRNA、微小RNA或反义RNA包括多核苷酸，其特异性结合至编码多肽或其补体的多核苷酸。
在有关的实施方式中，本发明提供治疗表征为多肽在受试者中表达不足的疾病或障碍的方法，包括向受试者提供本发明药物组合物，其中治疗剂选自mRNA、自放大RNA(SAM)、自复制DNA或质粒，包括核酸治疗剂，其特异性编码或表达所述表达不足的多肽或其补体。
在实施方式中，本文描述的药物组合物可以通过药学领域已知或此后开发的任何方法制备。通常，所述制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它附加成分结合的步骤。
递送生物学活性剂用于治疗疾病的方法
在一种实施方式中，本发明化合物、组合物以及方法和用途用于将生物学上活性剂递送至肝脏细胞(例如肝细胞)。在一种实施方式中，本发明的化合物、组合物以及方法和用途用于将生物学上活性剂递送至肿瘤或至肿瘤细胞(例如原发肿瘤或转移癌细胞)。在又一实施方式中，化合物、组合物以及方法和用途用于将生物学上活性剂递送至皮肤脂肪，肌肉和淋巴结(皮下给药)。
为了将生物学上活性剂递送至肝或肝细胞，在一种实施方式中经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射、门静脉注射、导管插入、支架)将本发明组合物与肝或肝细胞接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂递送至肾或肾细胞，在一种实施方式中经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射、导管插入、支架)将本发明组合物与患者肾或肾细胞接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂递送至肿瘤或肿瘤细胞，在一种实施方式中，经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射、导管插入、支架)将本发明组合物与患者肿瘤或肿瘤细胞接触，以促进递送。
为了将生物学上活性剂递送至CNS或CNS细胞)，在一种实施方式中，经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射、导管插入、支架、渗透泵给药(例如鞘内或心/脑室))将本发明组合物与患者CNS或CNS细胞(例如脑细胞和/或脊髓细胞)接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂递送至周围神经系统(PNS)或PNS细胞，在一种实施方式中经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射)将本发明组合物与患者PNS或PNS细胞接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂递送至肺或肺细胞，在一种实施方式中经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接向肺组织和细胞的肺给药)将本发明组合物与患者肺或肺细胞接触，以促进递送。
为了将生物学上活性剂递送至脉管系统或血管细胞，在一种实施方式中，经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如钳夹、导管插入、支架)将本发明组合物与患者脉管系统或血管细胞接触，以促进递送。
为了将生物学上活性剂递送至皮肤或皮肤细胞(例如真皮细胞和/或滤泡细胞)，在一种实施方式中，经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接皮肤施用、电离子透入)将本发明组合物与患者皮肤或皮肤细胞(例如真皮细胞和/或滤泡细胞)接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂递送至眼或眼细胞(例如斑、凹、角膜、视网膜)，在一种实施方式中经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下、电离子透入、使用滴眼剂、植入物)将本发明组合物与患者眼或眼细胞(例如斑、凹、角膜、视网膜)接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂递送至耳或耳细胞(例如内耳、中耳和/或外耳细胞)，在一种实施方式中如本领域一般已知比如经由肠胃外给药(例如静脉内、肌内、皮下给药)或局部给药(例如直接注射)将本发明组合物与患者耳或耳细胞(例如内耳、中耳和/或外耳细胞)接触，以促进递送。为了将生物学上活性剂(例如编码免疫原的RNA)递送至免疫系统的细胞(例如抗原提呈细胞、包括专职性抗原提呈细胞)，在一种实施方式中经肌肉内递送本发明组合物，此后免疫细胞能够渗入递送位点并且处理经递送的RNA和/或处理非免疫细胞比如肌肉细胞产生的经编码的抗原。所述免疫细胞能够包括巨噬细胞(例如骨髓衍生的巨噬细胞)，树突状细胞(例如骨髓衍生的类浆细胞树突状细胞和/或骨髓衍生的髓性树突状细胞)，单核细胞(例如人类外周血液单核细胞)等。(例如参见Geall、Andy等人的WO2012/006372)。
免疫。为了免疫意图，本发明组合物一般制备为可注射的肺或鼻气雾剂，或制备于递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴剂等)中。该递送装置能够用来将药物组合物给予受试者例如人类，进行免疫。
根据本发明，出于免疫意图，在某些实施方式中，本发明涵盖递送编码免疫原的RNA。该免疫原引起识别免疫原的免疫应答，从而提供对病原物或对变应原或对肿瘤抗原的免疫。对由病原物引起的疾病和/或感染的免疫是优选的。
RNA随本发明脂质组合物(例如配制为脂质体或LNP)递送。在某些实施方式中，本发明运用其中包封免疫原-编码RNA的LNP。包封于LNP中能够保护RNA免于核糖核酸酶消化。包封效率并不必须是100％。存在外部RNA分子(例如脂质体或LNP外表面上)或"裸"RNA分子(未与脂质体或LNP结合的RNA分子)是可接受的。优选，对于包含脂质和RNA分子的组合物，至少一半RNA分子(例如至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的RNA分子)包封在LNP或复合的LNP中。
某些脂质纳米颗粒可以包含脂质核心(例如组合物可以包含LNP和具有脂质核心的纳米颗粒的混合物)。在这种情况下，RNA分子可以被具有含水核心的LNP包封，并且通过非共价相互作用(例如在带负电RNA与阳离子脂质之间的离子相互作用)与具有脂质核心的LNP复合。用LNP(无论含脂质或含水核心)包封和复合能够保护RNA免受核糖核酸酶消化。包封/复合效率并不必须是100％。存在"裸"RNA分子(未与脂质体结合的RNA分子)是可接受的。优选，对于包含LNP群体和RNA分子群体的组合物，至少一半RNA分子群体(例如，至少例如，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％的RNA分子)包封在LNP中或与LNP复合。
为了递送免疫原-编码RNA，LNP直径的优选范围是60-180nm，和在更特别的实施方式中是80-160nm。LNP能够是包含LNPS群体的组合物的一部分，并且群体中的LNPS能够具有一个范围的直径。对于包含不同直径的LNPS群体的组合物，优选的是(I)至少80％数量的LNPS具有范围60-180nm、例如范围80-160nm的直径，(ii)群体的平均直径(强度例如Z-平均)理想地是60-180nm范围、例如80-160nm范围；和/或复数中的直径具有<0.2的多分散性指数。为了获得希望直径的LNPS，能够使用这样的过程进行混合，其中将RNA水溶液的两个进料物流在单个混合区中与乙醇脂质溶液的一个物流合并，它们全部具有相同流速(例如在微流体通道中)。参见涉及Precision NanoSystems Inc.，Vancouver，加拿大销售的微流体搅拌器的其它描述。
为了形成免疫用途的脂质组合物(例如LNPS)的有用脂质混合物包含：式(I)脂质；胆固醇；和稳定剂比如PEG-DMG。该混合物还可以包括中性两性离子的脂质，比如DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)或DSPE。在某些实施方式中，本发明提供的脂质组合物(比如LNPS)具有佐剂活性，也即不存在免疫原比如蛋白质抗原或核酸(DNA或RNA)比如编码所述抗原的核酸。
RNA分子。在体内给药免疫组合物之后，所递送的RNA被释放并且在细胞内翻译从而原位提供免疫原。在某些实施方式中，RNA是加("+")链的，从而其能够被细胞翻译而不需要任何干预性的复制步骤比如逆转录。在某些实施方式中，RNA是自复制RNA。自复制RNA分子(复制子)能够，在递送至脊椎动物细胞的情况下，甚至在不含任何蛋白质的情况下，导致通过转录从自身制备多个子RNA(经由产生自本身的反义拷贝)。从而在某些实施方式中自复制RNA分子是：(+)链分子，其能够在递送至细胞之后直接翻译，并且该翻译提供RNA-依赖性RNA聚合酶，其然后从所递送的RNA产生反义和正义转录物两者。从而所递送的RNA导致多个子RNA的产生。这些子RNA以及共线的亚基因组转录物可以自己翻译从而原位提供所编码的免疫原的表达，或者可以被转录从而提供具有与所递送的RNA相同含义的额外转录物，其被翻译从而原位提供免疫原的表达。该转录程序的总结果是所引入的复制子RNA数量的放大并且因此所编码的免疫原成为宿主细胞的主要多肽产物。
实现自复制的一个适宜系统是使用基于甲病毒属的RNA复制子。这些(+)链复制子在递送至细胞之后被翻译从而产生复制酶(或复制酶-转录酶)。复制酶被翻译为多聚蛋白，其自裂解提供复制复合物，其构造(+)链递送RNA的基因组(-)链拷贝。这些(-)链转录物能够自身被转录以提供(+)链母体RNA的额外拷贝，并且提供编码免疫原的亚基因组转录物。亚基因组转录物的翻译从而导致感染细胞对免疫原的原位表达。适宜的甲病毒属复制子能够使用来自sindbis病毒，semliki森林病毒，东方马脑炎病毒，委内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。
突变型或野生型病毒序列比如VEEV的减弱TC83突变型能够用于复制子中。优选的自复制RNA分子从而编码(I)RNA-依赖性RNA聚合酶，其能够从自复制RNA分子转录RNA和(ii)免疫原。聚合酶能够是甲病毒属复制酶例如包含一种或多种甲病毒属蛋白质nsPI，nsP2，nsP3和nsP4。虽然在特别的实施方式中天然甲病毒属基因组除了非结构复制酶多聚蛋白之外还编码结构病毒粒子蛋白质，但是本发明的自复制RNA分子并不编码甲病毒属结构蛋白。从而，特别的自复制RNA能够导致基因组RNA本身的拷贝在细胞中产生，但是不导致含RNA的病毒粒子产生。在野生型病毒中永久化所需的甲病毒属结构蛋白不存在于本发明的自复制RNA中，并且它们的位置被编码有关免疫原的基因占据，从而亚基因组转录物编码免疫原而不是结构甲病毒属病毒粒子蛋白。从而，本发明使用的自复制RNA分子可以具有两个开放阅读框：一个编码复制酶，例如第一(5')开放阅读框；另一个开放阅读框编码免疫原，例如第二(3')开放阅读框。在某些实施方式中，RNA可以具有额外(例如下游)开放阅读框例如从而编码其它免疫原或编码附属多肽。自复制RNA分子能够具有与所编码复制酶相容的5'序列。自复制RNA分子能够具有各种长度，但它们一般长约5000-25000个核苷酸，例如8000-15000个核苷酸，或9000-12000个核苷酸。从而，该RNA比常规mRNA递送中所见的更长。在某些实施方式中，自复制RNA长度大于约2000个核苷酸，比如大于约9000、12000、15000、18000、21000、24000或更多个核苷酸。
RNA分子可以具有5'封端(例如7-甲基鸟苷)。该封端能够增强RNA的体内翻译。本发明使用的RNA分子的5'核苷酸可以具有5'三磷酸基团。在封端RNA中，这可以经由5'-至-5'桥连接至7-甲基鸟苷。5'三磷酸能够增强RIG-I结合和从而促进佐剂效果。RNA分子可以具有3'poly A尾部。其还可以包括在其3'端的poly A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。本发明用于免疫意图的RNA分子一般是单链。单链RNA能够一般通过结合至TLR7，TLR8，RNA螺旋酶和/或PKR引发佐剂效果。以双链形式递送的RNA(dsRNA)能够结合至TLR3，并且该受体还能够通过在单链RNA复制期间或在单链RNA二级结构内形成的dsRNA触发。
用于免疫意图的RNA分子能够通过体外转录(IVT)方便地制备。IVT能够使用(cDNA)模板，其是在细菌中以质粒形式构造和传播的，或者合成构造的(例如基因合成和/或聚合酶链-反应(PCR)工程改造方法)。如Hekele、Armin等人的WO2011/005799讨论，自复制RNA能够包括(除了任何5'封端结构以外)一种或多种具有修饰的核碱基的核苷酸。例如，自复制RNA能够包括一种或多种修饰的嘧啶核碱基，比如假尿苷和/或5甲基胞嘧啶残基。然而在某些实施方式中RNA不包括修饰的核碱基，并且可以不包括修饰的核苷酸，也即RNA中的全部核苷酸是标准A、C、G和U核苷酸(例外是任何5'封端结构，其可以包括7'甲基鸟苷)。在其它实施方式中，RNA可以包括包含7'甲基鸟苷的5'封端，并且第一I、2或3 5'核苷酸可以在核糖2'位被甲基化。本发明用于免疫意图的RNA理想地仅包括核苷之间的磷酸二酯连接体，但是在某些实施方式中，其含有氨基磷酸盐/酯，硫代磷酸盐/酯和/或甲基膦酸盐/酯连接体。本发明包括实施方式，其中有多个种类的RNA与本发明提供的脂质组合物配制，比如二、三、四或更多个种类RNA，包括不同类别的RNA(比如mRNA、siRNA、自复制RNA及其组合)。
在某些实施方式中，本发明用于免疫意图的免疫原RNA分子编码多肽免疫原。在这些实施方式中，在给药之后，RNA在体内翻译并且免疫原能够引起接受者中的免疫应答。免疫原可以引起对病原物(例如细菌、病毒、真菌或寄生物)的免疫应答，但是在某些实施方式中，其引起对变应原或肿瘤抗原的免疫应答。免疫应答可以包含抗体应答(通常包括IgG)和/或细胞介导的免疫应答。多肽免疫原一般引起识别相应病原物(或变应原或肿瘤)多肽的免疫应答，但是在某些实施方式中所述多肽可以充当模拟位来引起识别糖类的免疫应答。免疫原一般是表面多肽例如粘附蛋白，血细胞凝集素，被膜糖蛋白，掺料糖蛋白等。RNA分子能够编码单个多肽免疫原或多个多肽。多种免疫原能够作为单个多肽免疫原(融合多肽)或作为分开的多肽存在。如果免疫原表示为来自复制子的分离多肽，那么可以向这些中的一种或多种提供上游IRES或额外的病毒启动子要素。另选地，多种免疫原可以表达自多聚蛋白，其编码与短自催化蛋白酶(例如口蹄疫病毒2A蛋白质)融合的单独免疫原，或者是内蛋白。在某些实施方式中，多肽免疫原(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种免疫原)可以单独使用或与编码一种或多种免疫原(与所述多肽免疫原相同或不同)的RNA分子比如自复制RNA一起使用。
在某些实施方式中免疫原引起对下述的免疫应答：冠状病毒，其免疫原包括但不限于衍生自SARS CoV-1，SARS-CoV-29的那些(Roujian Lu,Xiang Zhao,Juan Li,等人"Genomic Characterisation and Epidemiology of 2019Novel Coronavirus:Implications for Virus Origins and Receptor Binding"Lancet 2020Feb22；395(10224):565-574.doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8.Epub2020Jan 30.)；脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，对其有用免疫原包括但不限于膜蛋白质比如粘附蛋白、自主转运蛋白、毒素、铁采集蛋白和因子H结合蛋白。三种有用多肽的组合公开于Giuliani et al.11(2006)Proc Natl Head Sci USA 103(29):10834-9；链球菌肺炎，对其有用的多肽免疫原公开于Veja,Masignani的WO2009/016515，包括RrgB纤毛亚单位，β-N-乙酰基-己糖胺酶前体(spr0057)，spr0096，通用应激蛋白GSP-781(spr2021，SP2216)，丝氨酸/苏氨酸激酶StkP(SP1732)，和肺炎球菌表面粘附蛋白PsaA；
肝炎病毒，其免疫原能够包括乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，丙肝病毒，δ肝炎病毒，肝炎E病毒，或肝炎G病毒抗原；棒状病毒：免疫原包括但不限于衍生自棒状病毒比如狂犬病毒属(Lyssavirus)(例如狂犬病毒)和水泡性病毒属(Vesiculovirus)(VSV)的那些；杯状病毒科(Caliciviridae)，其免疫原包括但不限于衍生自杯状病毒科的那些，比如Norwalk病毒(诺如病毒)和Norwalk样病毒比如夏威夷病毒和雪山病毒；鸟传染性支气管炎(IBV)，小鼠肝炎病毒(MHV)，和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)；逆转录病毒，其免疫原包括衍生自肿瘤病毒，慢病毒(例如HIV-I或HIV-2)或泡沫病毒的那些；呼肠病毒：免疫原包括但不限于衍生自正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)，轮状病毒属，环状病毒属(Orbivirus)，或科州蜱传热病毒属(Coltivirus)的那些；细小病毒属，其免疫原包括衍生自细小病毒属B19的那些；疱疹病毒，其免疫原包括衍生自人类疱疹病毒的那些，比如单纯性疱疹病毒(HSV)(例如HSV类型I和2)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人类疱疹病毒6(HHV6)，人类疱疹病毒7(HHV7)和人类疱疹病毒8(HHV8)；乳多泡病毒，其免疫原包括衍生自乳头瘤病毒和腺病毒的那些。
在某些实施方式中，免疫原引起对感染鱼类的病毒的免疫应答。
真菌免疫原可以衍生自皮肤真菌和其它机会有机体。
在某些实施方式中，免疫原引起对疟原虫属寄生物比如镰状疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的免疫应答。从而本发明可以用于使对疟疾免疫。在某些实施方式中免疫原引起对鱼虱科(Caligidae)寄生物的免疫应答，特别是来自疮痂鱼虱属(Lepeophtheirus)和鱼虱属(Caligus)的那些例如海虱比如鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirussalmonis)或智利鱼虱(Caligus rogercresseyi)。
在某些实施方式中，免疫原是对癌细胞或实体肿瘤中的新抗原特异性的mRNA。(7)Peng，M.，Mo，Y.，Wang，Y.等人Neoantigen vaccine:an emerging tumorimmunotherapy.Mol Cancer 18,128(2019)。
在某些实施方式中，免疫原是选自下述的肿瘤抗原：(a)癌-睾丸抗原比如NY-ESO-I，SSX2，SCPI以及RAGE，BAGE，GAGE和MAGE家族多肽，例如GAGE-1，GAGE-2，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6和MAGE-12(其能够例如用来应对黑色素瘤，肺，头和颈，NSCLC，乳腺，胃肠道和膀胱肿瘤)；(b)突变抗原，例如p53(与各种实体肿瘤例如结直肠，肺，头颈癌有关)，p21/Ras(与例如黑色素瘤，胰癌和结直肠癌有关)，CDK4(与例如黑色素瘤有关)，MUMI(与例如黑色素瘤有关)，半胱天冬酶-8(与例如头颈癌有关)，CIA 0205(与例如膀胱癌有关)，HLA-A2-R1701，β连环蛋白(与例如黑色素瘤有关)，TCR(与例如T-细胞非霍奇金淋巴瘤有关)，BCR-abl(与例如慢性髓性白血病有关)，磷酸丙糖异构酶，KIA 0205，CDC-27，和LDLRFUT；(c)过表达抗原，例如半乳凝素4(与例如结直肠癌有关)，半乳凝素9(与例如霍奇金病有关)，蛋白酶3(与例如慢性髓性白血病有关)，WT I(与例如各种白血病有关)，碳酸脱水酶(与例如肾癌有关)，醛缩酶A(与例如肺癌有关)，PRAME(与例如黑色素瘤有关)，HER-2/neu(与例如乳腺，结肠，肺和卵巢癌有关)，乳腺球蛋白，甲种胎蛋白(与例如肝瘤有关)，KSA(与例如结直肠癌有关)，胃泌素(与例如胰和胃癌有关)，端粒末端转移酶催化蛋白质，MUC-I(与例如乳腺和卵巢癌有关)，G-250(与例如肾细胞癌有关)，p53(与例如乳腺，结肠癌有关)，和癌胚抗原(与例如乳腺癌，肺癌和胃肠道癌比如结直肠癌有关)；(d)共享抗原，例如黑色素瘤-黑素细胞抗原比如MART-1/Melan A，gp100，MCIR，黑素细胞-刺激激素受体，酪氨酸酶，酪氨酸酶相关性蛋白质-I/TRPI和酪氨酸酶相关性蛋白质-2/TRP2(与例如黑色素瘤有关)；(e)前列腺结合的抗原比如PAP，PSA，PSMA，PSH-PI，PSM-PI，PSM-P2，与例如前列腺癌有关；(f)免疫球蛋白独特型(与例如骨髓瘤和B细胞淋巴瘤有关)。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15，Hom/Mel-40，H-Ras，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EB病毒抗原，EBNA，人乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7，乙肝和C病毒抗原，人类T-细胞亲淋巴病毒抗原，TSP-180，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，mn-23HI，TAG-72-4，CA 19-9，CA 72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，p16，TAGE，PSCA，CT7，43-9F，5T4，791Tgp72，β-HCG，BCA225，BTAA，CA125，CA 15-3(CA 27.29&BCAA)，CA 195，CA 242，CA-50，CAM43，CD68&KPI，CO-029，FGF-5，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB/70K，NY-CO-I，RCASI，SDCCAG16，TA-90(Mac-2结合性蛋白/亲环蛋白C相关蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP，TPS，等。
用于疫苗的药物组合物。本发明药物组合物，特别是用于免疫的那些，可以包括一种或多种小分子免疫增强剂。本发明药物组合物可以包括一种或多种防腐剂，比如硫柳汞或2苯氧乙醇。能够制备无汞和无防腐剂疫苗。
组合物包含免疫学有效量的本文描述的脂质组合物(例如LNPS)，以及视需要的任何其它组分。免疫学有效量是指在单次给药中或作为系列的一部分给予个体的对治疗有效(例如对病原物的预防性免疫应答)的量。该量的变化取决于待治疗个体的健康和身体条件，年龄，待治疗个体的分类组(例如非人灵长类、灵长类等)，个体的免疫系统合成抗体的能力，希望的保护程度，疫苗的配制，主治医生对医学情况的评价，和其它有关因素。期望的是该量落入能够通过常规试验确定的相对宽的范围。
本发明组合物一般按每剂的RNA量表示。优选剂量具有～100pg RNA(例如10-100pg，比如约10pg，25pg，50pg，75pg或100pg)，但是能够在显著更低的水平例如～1pg/剂，～100ng/剂，～10ng/剂，～1ng/剂等观察到表达。本发明也提供含有药物本发明组合物的递送装置(例如注射器，雾化器，喷雾器，吸入器，皮肤贴剂等)。该装置能够用来向脊椎动物受试者给予组合物。
本文描述的LNP-配制的RNA和药物组合物用于在体内用来诱导对有关免疫原的免疫应答。本发明提供在脊椎动物中诱导免疫应答的方法，包括给予有效量的如本文描述的LNP配制的RNA或药物组合物。免疫应答优选是保护性的和优选牵涉抗体和/或细胞-介导的免疫。组合物可以用于初免和加强意图两者。另选地，初免-加强免疫计划能够是RNA和相应多肽免疫原(例如RNA致敏、蛋白质加强)的混合计划。
本发明也提供脂质颗粒(LNP)或药物组合物用于诱导脊椎动物中的免疫应答。本发明也提供LNP或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于诱导脊椎动物中的免疫应答。通过借助这些用途和方法诱导脊椎动物中的免疫应答，所述脊椎动物能够防范各种疾病和/或感染例如对抗如上文所讨论的细菌和/或病毒病。根据本发明的疫苗可以是预防性的(也即预防感染)或治疗性的(也即治疗感染)，但是一般是预防性的。脊椎动物优选是哺乳动物，比如人类或大型兽医学哺乳动物(例如马、牛、鹿、羊、猪)。
本发明组合物一般直接给予患者。直接递送可以通过肠胃外注射实现(例如经皮下，经腹膜内，经静脉内，经肌肉内，皮内，或达到组织的间质空间)。备择递送途径包括直肠，口服(例如片剂、喷雾)，颊，舌下，阴道，局部，透皮或经皮，鼻内，眼，耳，肺或其它粘膜给药。真皮内和肌内给药是两种优选途径。注射可以经由针(例如皮下针)进行，但是可以另选使用无针注射。典型的肌内剂量是0.5ml。本发明可以用来诱导全身性和/或粘膜免疫，优选引起增强的全身性和/或粘膜免疫。剂量能够通过单剂量计划或多剂量计划给予。多剂量可以用于初次免疫计划和/或加强免疫计划。
在多剂量计划中，各剂量可以通过相同或不同的途径提供，例如肠胃外初始和粘膜加强，粘膜初始和肠胃外加强等。多剂量一般分开至少一周(例如约2周，约3周，约4周，约6周，约8周，约10周，约12周，约16周等)给予。在一种实施方式中，多剂量可以在出生之后大约6周、10周和14周例如在6周、10周和14周龄给予，如世界卫生组织的扩展免疫计划("EPI")中所用。在备择实施方式中，两个主要剂量分开约2个月例如分开约7、8或9周给予，随后在第二主要剂量之后约6个月至1年例如在第二主要剂量之后约6、8、10或12个月给予一个或多个加强剂量。在又一实施方式中，三个主要剂量分开约2个月例如分开约7、8或9周给予，随后在第三主要剂量之后约6个月至1年给予一个或多个加强剂量。
基因编辑
基因编辑是能够通过添加、删除或修饰基因组特定位置的基因序列用来改变有机体DNA的一类技术。已开发数种基因组编辑途径，包括CRISPR-Cas9("规律成簇的间隔短回文重复"和CRISPR相关蛋白9("Cas9")。CRISPR-Cas9修饰自细菌中的基因组编辑系统，其从入侵病毒捕获DNA片段并且构造称为CRISPR阵列的DNA片段。CRISPR阵列允许细菌"记住"病毒，从而如果病毒再次侵袭，则细菌从CRISPR阵列产生RNA片段来靶向病毒DNA。细菌然后用Cas9或相似酶切开DNA使病毒失能。
修饰用于基因编辑的CRISPR-Cas9系统类似地工作。产生具有短"指导"序列的小片RNA，所述序列附着(结合)至基因组DNA的特定靶标序列。RNA也结合至Cas9酶。如细菌中那样，修饰的RNA用来识别DNA序列，而Cas9酶在靶向位置切割DNA。尽管Cas9是最通常使用的酶，但也能够使用其它酶(例如Cpf1)。一旦DNA被切割，研究者使用细胞自身的DNA修复机制来添加或删除遗传物质片段，或者通过用定制DNA序列的现有片段替换来改变DNA。
在本发明实施方式中，新的可离子化脂质用作例如CRISPER-Cas系统嵌合RNA多核苷酸序列递送的一部分，用于通过操作有关基因组位点的靶标序列来修饰有机体。其它核酸组分可能包括指导序列，其能够杂交至真核细胞中的靶标序列，反式激活cr配对序列和反式激活cr序列比如描述于CHZHAN，Fen等人的WO14204726A1中的那些。
CRISPR～Cas9系统在实施方式中用来通过将CRISPR-Cas9系统递送至适当位置(也即有关器官或组织内的细胞)以靶向活细胞中的基因。优选组织在下述器官中：肾；消化系统，包括胃、胰、十二指肠、回肠和/或结肠；肺；脑，尤其是神经元，和/或通常的cns；眼，包括视网膜组织；耳，包括内耳；皮肤；肌肉；骨骼；和/或通常的肝。
用根据本发明实施方式的可离子化脂质和组合物编辑的基因是与疾病有关的那些。
按照本公开的药物组合物可以整个，作为单元剂量和/或作为多个单元剂量制备、包装和/或销售。如本文所用，"单元剂量"是指包含预先确定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量可以一般等于将给予受试者的活性成分剂量和/或上述剂量的方便分数，包括但不限于上述剂量的一半或三分之一。
在本公开药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量可以变化，其取决于待治疗的受试者的身份、尺度和/或条件和进一步取决于组合物给予的途径。例如，组合物可以包含0.1百分比至99百分比(w/w)的活性成分。
药物配制剂可以额外地包含药学上可接受的赋形剂，其如本文所用包括但不限于任意的各种溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂等，视适合特定希望剂型而定。用于配制药物组合物的各种赋形剂和制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams and Wilkins,Baltimore,MD,2006)。本文预期使用常规赋形剂介质，除非任何常规赋形剂介质可以与物质或其衍生物不相容，比如产生任何不希望的生物学效果或以有害方式与药物组合物的任何其它组分另外相互作用。
在某些实施方式中，脂质颗粒的颗粒尺寸可以增加和/或减少。颗粒尺寸的变化可以能够帮助平衡生物学反应比如但不限于炎症或可以通过改变生物分布增加递送至哺乳动物的NAT的生物学效果。尺寸还可以用来决定靶标组织，较大颗粒快速清除而较小颗粒达到不同的器官系统。
在制备药物组合物中使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于稀释剂，粘度降低剂，抗氧化剂，溶解度增强剂，填充剂，填料，表面活性剂和/或乳化剂，防腐剂，缓冲试剂，润滑剂，和/或油。赋形剂可以以多种等级获得，其能够是天然、合成或半合成来源的；动物衍生的，植物衍生的，生物技术衍生的(重组体)和/或矿物衍生的；和固体，半固体，液体或气体。所述赋形剂可以任选包括在本发明药物配制剂中。
在某些实施方式中，示范性mRNA，质粒或其它NAT编码选自下述的蛋白质或酶：人类生长激素，红细胞生成素，ATP-结合盒(ABC)运载体，α-1-抗胰蛋白酶，酸α葡糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，羧肽酶N，a-半乳糖苷酶A，α-L-艾杜糖苷酸酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，艾杜糖醛酸硫酸酯酶，N-乙酰基氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶，N-乙酰葡糖胺糖苷酶，α-氨基葡糖苷乙酰基转移酶，N-乙酰基氨基葡萄糖6-硫酸酯酶，N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酯酶，β-葡糖苷酶，半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，BMPER-2，葡糖脑苷脂酶，类肝素磺酰胺酶，肝素-N-硫酸酯酶，溶酶体酸脂酶，玻璃酸酶，半乳糖脑苷脂酶，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)，氨基甲酰基-磷酸合成酶1(CPS 1)，精氨琥珀酸合成酶(ASS 1)，精氨琥珀酸裂合酶(ASL)，精氨酸酶1(ARGl)，囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)，活运动神经元(SMN)，因子VIII，因子IX，转录激活因子样效应物核酸酶TALENS，锌指核酸酶(ZFNs)，(CRISPR)相关蛋白9(Cas9)，和自复制RNA，和低密度脂蛋白受体(LDLR)。
在研究或筛选平台的情况下，使用本发明能够将其它质粒或核酸用于基于细胞的系统。这些包括引入遗传物质以在细胞中诱导特定的生理学或功能变化，比如在重编程过程中产生诱导多能干细胞。在该情况下，将特定基因(称为Yamanaka因子)引入患者衍生的体细胞，其触发细胞逆转为干细胞样状态。这些使得细胞可以无限分裂并且变得多能(能够分化为许多其它下游细胞类型)，其能够用于研究和临床应用两者。这些和相似的基因操作步骤能够通过本发明的脂质颗粒得到增强从而改善在利用诱导干细胞时一般使用的过程的效率。
下文描述用核酸制备的代表性脂质颗粒，其制备方法，其优势证据，和用它们产生治疗益处的方法。
脂质颗粒的脂质混合物组合物产生如下：在微流体搅拌器内将脂质-乙醇溶液与含水缓冲剂快速混合，所述搅拌器设计用来诱导混沌平流和提供受控的混合环境，具有中等雷诺数(24<Re<1000)。微流体通道具有人字形特征或以示于Wild、Leaver和Taylor的PCT公开WO2017117647的方式配置。
脂质颗粒的颗粒尺寸和"多分散性指数"(PDI)通过动态光散射(DLS)测量。PDI指出颗粒分布宽度。这是从(DLS)-测量的强度自相关函数的累积分析计算的参数，假定单颗粒尺寸模式和单指数拟合自相关函数。从生物物理学观点，PDI低于0.1指出样品是单分散的。机械微混合器比如SparkTM和/>Benchtop(Precision NanoSystems Inc.)产生的颗粒是基本上尺寸均质的，假定全部其它变量为中性。更低PDI指出更均匀的脂质颗粒群体。SparkTM设备用于筛选设定以鉴定先导组合物。一旦选择了组合物，脂质颗粒能够用/>Benchtop精细调节。一旦对特定纳米颗粒组合物鉴定了过程参数流速比和总流速，则能够用相同过程参数值将纳米颗粒技术放大。
在优选的实施方式中，核酸是双链脱氧核糖核酸构成的质粒。质粒是位于细胞质当中的遗传结构(与传统细胞遗传物质所在的细胞核相对)，其能够独立于染色体地复制，一般是小环状DNA链。质粒还能够用来构造医学研究的新细胞或动物模型。质粒是分子生物学中的重要工具并且是出现中的治疗剂，原因是它们i)易于操作和分离ii)有能力自复制用于放大的制备iii)长期稳定性iv)在一系列有机体和应用中的功能性。工程改造的质粒除了复制来源(或无，取决于期望用途)之外还具有限制酶识别位点从而允许破开环引入新遗传物质，和选择性标记物比如抗生素抗性基因。质粒可以有约1000bp至约20千碱基对(bp)。
如本文所用，术语"约"定义为意指所述数值的±10％。其用来表示所希望的靶标浓度可能是例如40Mol％，但由于混合的不一致，真实百分比可能变化+/-5Mol％。
如本文所用，术语"基本上"定义为所述数值的±5％。其用来表示所希望的靶标浓度可能是例如40Mol％，但由于混合的不一致，真实百分比可能变化+/-5Mol％。
如本文所用，术语"核酸"定义为物质，其期望在疾病的诊断、治愈、缓和、治疗或预防中具有直接效果，或在恢复、校正或修饰生理学功能中具有直接效果，或充当研究试剂。在优选的实施方式中，核酸是寡核苷酸。在优选的实施方式中，治疗剂是核酸治疗剂，比如RNA多核苷酸。在优选的实施方式中，治疗剂向双链环状DNA(质粒)，线性化的质粒DNA，微环或msDNA(多拷贝单链DNA)。
在本公开中，措辞"包含"以非限制性含义用来意指包括该措辞后的项目，但不排除未特别提及的项目。应理解在包含或可以包含指定的特征或变量或参数的实施方式中，备择实施方式可以由所述特征、或变量或参数组成或基本上由所述特征、或变量或参数组成。通过不定冠词"一个"提及要素不排除存在多于一个该要素的可能性，除非内容清楚地需要存在一个且仅一个该要素。
在本公开中，"转染"意指在实验室和临床环境两者中将核酸转移入细胞中用来诱导有关的特定基因的表达。其一般包括与核酸结合的可离子化脂质，和结构脂质。LIPOFECTINTM和LIPOFECTAMINETM是ThermoFisher Scientific销售的已知商业转染试剂。这些研究试剂含有永久阳离子脂质并且不适于在体内或离体使用。
在本公开中通过端点描述数字范围包括该范围中囊括的全部数字，包括全部整数、全部整数和全部分数中间值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等)。在本公开中单数形式"一个"和"一种"包括复数指示语，除非内容清楚地另有所指。从而，例如描述组合物含有"一种化合物"包括两种或更多种化合物的混合物。在本公开中术语"或"一般以包括"和/或"的含义使用，除非内容清楚地另有所指。
"稳定剂"或稳定化剂是用来鉴定试剂的术语，所述试剂加至形成本发明脂质组合物的可离子化脂质、结构脂质和固醇。稳定剂是本文所描述的非离子型。非离子稳定剂的实例包括：聚山梨酸酯(Tweens)，BrijTM S20(聚氧乙烯(20)硬脂基醚)，BrijTM 35(聚氧乙烯月桂基醚，聚乙二醇月桂基醚)，BrijTM S10(聚乙二醇十八烷基醚，聚氧乙烯(10)硬脂基醚)，MyrjTM 52(聚氧乙烯(40)硬脂酸盐/酯)。在某些实施方式中还使用稳定剂组合，包括聚山梨酸酯和麦芽糖苷，烷基聚糖苷(TBD)，PEG-缀合的脂质或其它聚合物缀合的脂质。
"烷基"意指直链或支化的、非环状或环状的、饱和的脂族烃吗，含有1至24个碳原子。代表性的饱和直链烷基包括甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，n-戊基，n-己基等；而饱和的支化烷基包括异丙基，仲丁基，异丁基，叔丁基，异戊基等。代表性的饱和环状烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基等；而不饱和环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
"烯基"意指如前文所定义的烷基，含有至少一个相邻碳原子之间的双键。烯基包括顺式和反式异构体。代表性的直链和支化烯基包括乙基烯基，丙基烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异丁基烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-甲基-1-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，2,3-二甲基-2-丁烯基等。
"炔基"意指如前文所定义的任何烷基或烯基，其额外含有至少一个相邻碳之间的三键。代表性的直链和支化炔基包括乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-甲基-1丁炔基，等。
术语"酰基"是指被氢，烷基，部分饱和或完全饱和的环烷基，部分饱和或完全饱和的杂环，芳基和杂芳基取代的羰基。例如，酰基包括基团比如(C1-C20)烷酰基(例如甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰，戊酰，己酰，叔丁基乙酰基等)，(C3-C20)环烷基羰基(例如环丙基羰基，环丁基羰基，环戊基羰基，环己基羰基等)，杂环羰基(例如吡咯烷基羰基，吡咯烷-2-酮-5-羰基，哌啶基羰基，哌嗪基羰基，四氢呋喃基羰基等)，芳酰基(例如苯甲酰基)和杂芳酰基(例如噻吩基-2-羰基，噻吩基-3-羰基，呋喃基-2-羰基，呋喃基-3-羰基，1H-吡咯-2-羰基，1H-吡咯-3-羰基，苯并[b]噻吩基-2-羰基等)。
术语"芳基"是指芳族单环，双环或三环烃环系，其中任何环原子都能被取代。芳基部分的实例包括但不限于苯基，萘基，蒽基和芘基。
"杂环"意指3-至7-元单环或7-至10-元双环的饱和、不饱和或芳族的杂环，并且其含有1或2个独立选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可以任选被氧化，并且氮杂原子可以任选被季铵化，包括任何上述杂环稠合至苯环的双环环。杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，乙内酰脲基，戊内酰胺基，环氧乙烷基，氧杂环丁烷基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基等。
术语"杂芳基"是指芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环系，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如碳原子和如果单环、双环或三环分别是1-3、1-6或1-9个的N、O或S的杂原子)，其中任何环原子都能被取代。本文所描述的杂芳基还可以含有共享共用碳-碳键的稠环。术语"烷基杂环"是指杂芳基，其中至少一个环原子用烷基、烯基或炔基取代。
术语"取代的"是指给定结构中的一个或多个氢残基用指定取代基残基替换，所述取代基包括但不限于：卤代，烷基，烯基，炔基，芳基，杂环基，硫醇，烷硫基，氧代，硫代(thioxy)，芳硫基，烷硫基烷基，芳基硫代烷基，烷基磺酰基，烷基磺酰基烷基，芳基磺酰基烷基，烷氧基，芳氧基，芳烷氧基，氨基羰基，烷基氨基羰基，芳基氨基羰基，烷氧羰基，芳氧基羰基，卤代烷基，氨基，三氟甲基，氰基，硝基，烷基氨基，芳基氨基，烷基氨基烷基，芳基氨基烷基，氨基烷基氨基，羟基，烷氧基烷基，羧基烷基，烷氧羰基烷基，氨基羰基烷基，酰基，芳烷氧羰基，羧酸，磺酸，磺酰基，膦酸，芳基，杂芳基，杂环和脂族。应理解取代基可以被进一步取代。示范性取代基包括氨基，烷基氨基，二烷基氨基和环状氨基化合物。
"卤素"意指氟-，氯-，溴-和碘-取代基。
术语"烷基胺"和"二烷基胺"分别指-NH(烷基)和-N(烷基)2残基。术语"羟基烷基"意指-烷基-OH残基。术语"烷基杂环"是指烷基，其中至少一个亚甲基已用杂环替换。
在某些实施方式中，本发明方法可以需要使用保护基团。保护基团方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Protective Groups in Organic Synthesis,Green，T.W.等人，Wiley-Interscience，New York City，1999)。简言之，保护基团在本发明的上下文中是减少或消除官能团的不希望反应性的任何基团。保护基团能够加至官能团以掩盖其在某些反应期间的反应性，然后除去以展示最初的官能团。在某些实施方式中使用"醇保护基团"。"醇保护基团"是减少或消除醇官能团的不希望反应性的任何基团。保护基团能够用本领域熟知的技术加入和除去。
额外地，本发明可以如式(I)、(II)或(III)描述；如式(I)、(II)或(III)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中纳米颗粒的实验pKa范围是5.8-7.1。
本发明化合物可以通过已知有机合成技术制备，包括实施例部分中更加详细描述的方法。本发明的范围可以包括化合物的各种盐，水合物和溶剂化物。本发明化合物还能够包括各种药学上可接受的同位素。本发明化合物包括各种药学上可接受的取代，比如氟化或碘化的衍生物。
本发明化合物能够用各种可能合成路线合成，有机合成领域的技术人员能够容易地选择所述路线。
短语‘药学上可接受的’用来描述化合物、物质、组合物、纳米颗粒悬浮物，其形式为溶液或任何其它形式比如冻干、粉末形式、气雾剂或其它剂型，所述机型在良好医学判断范围内适用于接触人类和动物组织或细胞，具有合理的益处/风险比。益处/风险比率可以源自保护治疗物质比如小分子、核酸、肽或蛋白质免于在生物学环境中在体内或离体降解。
化合物还可以在一种或多种本领域技术人员已知的临床前模型中评价，从而显示药学上有活力的物质比如NAT、肽和蛋白质的治疗检验。这些包括但不限于啮齿动物模型和非人灵长类。
在参考下文对所选实施方式(如附图所展示)中的详述之后，本发明主题的特征和优势将变得更明显。应了解的是，所公开和要求保护的主题能够在各方面进行修饰，全部都不背离权利要求的范围。相应地，附图和说明书被视为示例性而非限制性的，并且所述主题的完整范围如权利要求所述。
实施例
一般考虑：
全部溶剂和试剂是商业产品并且原样使用，除非另有指出。温度按摄氏度计。最终原料、中间体和最终产品的结构由标准分析方法例如MS或NMR确认。除非另有说明，1H NMR谱图在CDCl3溶液中，于298K用AVANCE NEO NanoBay Bruker 400MHz NMR光谱仪记录。化学位移相对TMS(0.00)按百万分之一(ppm)报告而偶联常数J对1H按Hertz(Hz)计。下述缩写用来表示信号图谱：s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，p＝五重峰，m＝多重峰，dd＝双二重峰，br s＝宽单峰，dt＝双三重峰。除非另有说明，柱纯化用IsoleraTM Prime进行，使用等度或梯度组成的适当洗脱液。
全部最终化合物经由反相UHPLC-MS分析(保留时间RT按分计)测定为大于85％纯，使用Shimadzu Nexera UHPLC设备，其配有DAD和ELSD和Acquity Peptide BEH C18 2.1mmx 50mm，1.7μm柱，以及10mM碳酸氢铵水溶液(A)和80:20比率的乙腈:甲醇(B)的梯度。梯度研究在12分钟内于0.8mL/min线性地从80运行至100％B。注射体积是2μL和柱温是环境温度。检测基于多模式，其中电喷雾和大气压化学离子化(ESI和APCI)以正和负模式进行，使用Shimadzu 2020 Single Quad质谱(Science Park，Singapore)和蒸发光散射检测器(ELSD)，除了PNI 76、119、120、121、122和127。PNI76，119，120，121，122和127的低分辨率MS数据用Bruker micrOTOFTM飞行时间质谱记录，配有阳性电喷雾离子化源，在AgilentTM1200 HPLC上进行。甲酸钠用作参比。样品通过流动注射经由HPLC引入，用乙腈/水(0.1％甲酸)作流动相。
缩写
ACD-A＝抗凝柠檬酸右旋糖溶液
AcOH＝乙酸
aq.＝含水
cat.＝催化
DCM＝二氯甲烷
DIPEA＝N,N-二异丙基乙胺
DMAP＝4-二甲基氨基吡啶
DMF＝N,N-二甲基甲酰胺
EDCI＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EPO＝红细胞生成素
ESI＝电喷雾离子化
EtOAc＝乙酸乙酯
Et2O＝二乙醚
g＝克
h＝小时
Hz＝赫兹
K＝开尔文
MC3＝DLin-MC3-DMA
MeOH＝甲醇
mg＝毫克
MHz＝兆赫
min＝分
mL＝毫升
mmol＝毫摩尔
MS＝质谱
NMR＝核磁共振
Pet.＝石油
ppm＝百万分之一
Satd.＝饱和的
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
TLC＝薄层色谱法
TMS＝四甲基硅烷
TNS＝6-(对-甲苯氨基)-2-萘磺酸钠盐
UHPLC＝超高效液相色谱
℃＝摄氏度
实施例1.合成1,4-脱水木糖醇(1)
方案1.化合物1的合成
向配有回流冷凝器的250mL单颈圆底烧瓶加入(±)-木糖醇(20.0g，131.4mmol)和溶于10％aq.H2SO4(10mL)并与其匹配。反应混合物在135℃加热6小时。在TLC指出反应完成之后，反应混合物用饱和NaHCO3水溶液猝灭和冻干，提供粗制(±)-1,4-脱水木糖醇(1，14.5g，23.86mmol，82.0％收率)，是粘稠无色油状物，其用于后续步骤不加进一步纯化。1H(400MHz，MeOD)δ4.16-4.03(m，4H)，3.82(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.74(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.66(d，1H，J＝8.0)。
实施例2。
合成PNI 121，122，127，321，325，328，329，336，538，539和540
方案2.PNI 121，122，127，321，325，328，329，336，538，539和540的一般合成路线
PNI 121：
在N2气氛下向(±)-1(1.25g，9.3mmol)的无水DMF(15mL)溶液加入DMAP(cat.)随后加入4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(1.56g，9.3mmol)的无水DMF(10mL)溶液。将DCM(25mL)加入反应混合物。最终，将固体EDCI盐酸盐(3.56g，18.6mmol)加入反应混合物和在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示(±)-1完全消耗。此外，将DMAP(cat.)加入反应混合物随后加入亚油酸(7.2mL，23.3mmol)和EDCI盐酸盐(7.13g，37.2mmol)。随后，将无水DMF(20mL)和无水CH2Cl2(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物过夜。在旋转式蒸发仪上浓缩反应混合物，用EtOAc(50mL)稀释和用水(3×20mL)洗涤。有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥和在旋转式蒸发仪上蒸发至干，提供粗制混合物，将其通过硅胶柱色谱法纯化用5％MeOH/CH2Cl2作为洗脱液。获得PNI 121，是无色油状物(590mg，0.76mmol)，8％收率。1H(500MHz，CDCl3)δ5.42-5.31(m，9H)，5.13-5.11(m，1H)，4.33-4.23(m，3H)，4.20-4.16(m，1H)，3.76(dd，1H，J＝15.0Hz，5.0Hz)，2.78(表观t，4H，J＝5.0Hz)，2.40-2.32(m，8H)，2.26(s，6H)，2.06(q，8H，J＝15.0Hz，5.0Hz)，1.85-1.79(m，2H)，1.65-1.60(m，4H)，1.39-1.26(m，28H)，0.90(表观t，6H，J＝7.5Hz)。C47H82NO7[M+H]+的分子量计算值772.6091。实测值772.6126。
PNI 122：
在N2气氛下向(±)-1(1.25g，9.3mmol)的无水DMF(15mL)溶液加入DMAP(cat.)随后加入5-(二甲基氨基)戊酸盐酸盐(1.68g，9.3mmol)的无水DMF(10mL)溶液。将DCM(25mL)加入反应混合物。最终，将固体EDCI盐酸盐(3.56g，18.6mmol)加入，反应在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示(±)-1完全消耗。此外，将DMAP(cat.)加入反应混合物随后加入亚油酸(7.2mL，23.25mmol)和EDCI盐酸盐(7.13g，37.2mmol)。随后，将无水DMF(20mL)和无水DCM(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物过夜。在旋转式蒸发仪上浓缩反应混合物，用乙酸乙酯稀释(50mL)和用水洗涤(3×20mL)。有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥和在旋转式蒸发仪上蒸发至干，提供粗制混合物，将其通过硅胶柱色谱法用5％MeOH/DCM作为洗脱液纯化。获得PNI 122，是无色油状物(912mg，1.16mmol)，12％收率。1H(500MHz，CDCl3)δ5.42-5.31(m，9H)，5.13-5.11(m，1H)，4.35-4.23(m，3H)，4.17(dd，1H，J＝10.0Hz，5.0Hz)，3.76(dd，1H，J＝10.0Hz，5.0Hz)，2.78(表观t，4H，J＝5.0Hz)，2.39-2.30(m，8H)，2.25(s，6H)，2.06(q，8H，J＝15.0Hz，5.0Hz)，1.69-1.60(m，6H)，1.52(p，2H，J＝7.5Hz)，1.39-1.26(m，28H)，0.90(表观t，6H，J＝7.5Hz)。C48H84NO7[M+H]+的分子量计算值786.6248。实测值786.6365。
PNI 127：
在N2气氛下在室温下向(±)-1(200mg，1.49mmol)的无水DMF(2mL)溶液加入DMAP(cat.)随后加入1,4-二甲基哌啶-4-羧酸盐酸盐(289mg，1.49mmol)的无水DMF(3mL)溶液。将DCM(5mL)加入反应混合物。最终，将固体EDCI盐酸盐(571mg，2.98mmol)加入，反应搅拌过夜。反应混合物的TLC分析显示(±)-1完全消耗。将DMAP(cat.)加入反应混合物随后加入亚油酸(1.2mL，3.73mmol)和EDCI盐酸盐(1.14g，5.96mmol)。随后，将无水DMF(5mL)和无水DCM(5mL)加入，在室温下搅拌反应混合物过夜。在旋转式蒸发仪上浓缩反应混合物，用EtOAc(20mL)稀释和用水洗涤(3×10mL)。有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥和在旋转式蒸发仪上蒸发至干，提供粗制混合物，将其通过硅胶柱色谱法用5％MeOH/DCM作为洗脱液纯化。获得PNI 127，是无色油状物(225mg，0.28mmol)，19％收率。1H(500MHz，CDCl3)δ5.42-5.31(m，9H)，5.14-5.12(m，1H)，4.34-4.27(m，2H)，4.24(表观d，2H，J＝5.0Hz)，3.76(dd，1H，J＝15.0Hz，5.0Hz)，2.78(表观t，4H，J＝5.0Hz)，2.69(brs，2H)，2.36-2.26(m，8H)，2.20-2.12(m，3H)，2.06(q，8H，J＝15.0Hz，5.0Hz)，1.66-1.60(m，6H)，1.38-1.29(m，28H)，1.22(s，3H)，0.90(表观t，6H，J＝7.5Hz)。C49H84NO7[M+H]+的分子量计算值798.6248。实测值798.6157。
PNI 321：
向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.50g，3.73mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入DMAP(0.046g，0.373mmol)和3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(0.573g，3.73mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液。向该搅拌的溶液加入无水DCM(10mL)，随后加入EDCI盐酸盐(1.429g，7.46mmol)和DIPEA(1.628ml，9.32mmol)。在室温下搅拌反应混合物4h，发现TLC指出1完全消失。将DMAP(0.091g，0.746mmol)加入反应混合物随后加入亚油酸(2.61g，9.32mmol)/无水DMF(7.5mL)。然后将EDCI盐酸盐(2.86g，14.91mmol)和DIPEA(3.26ml，18.64mmol)加入随后加入无水DCM(10mL)。在室温下搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成后，减压蒸发溶剂。将残余物溶于EtOAc(60mL)和用水洗涤(2x50mL)。水层用EtOAc(2x30mL)萃取和经合并的有机层用盐水(2x50mL)洗涤。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用80％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 321(0.265g，0.327mmol，8.78％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，9H)，5.15-5.11(m，1H)，4.34-4.16(m，4H)，3.76(dd，1H，J＝8.0，4.0)，2.78(app t，4H，J＝6.0)，2.63(app t，2H，J＝6.0)，2.52(app t，2H，J＝6.0)，2.36-2.31(m，4H)，2.25(s，6H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.64-1.61(m，4H)，1.38-1.26(m，28H)，0.91-0.88(m，6H)。RT＝3.61分钟。93.7％纯度。ESI-MS：m/z＝759[M+H]+，代表C46H80NO7。
PNI 325：
在氮气氛下在25℃向充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，700mg，5.22mmol)和DMAP(63.8mg，0.522mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入1-甲基哌啶-4-羧酸(747mg，5.22mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液。然后，将无水DCM(10mL)和EDCI盐酸盐(2g，10.44mmol)加入。在室温下在氮气氛下搅拌反应混合物16h和TLC分析显示1完全消耗。将DMAP(63.8mg，0.522mmol)和亚油酸(3659mg，13.05mmol)的DMF(5mL)溶液加入反应混合物。然后将EDCI盐酸盐(2g，10.44mmol)加入随后加入无水DCM(10mL)。在室温下在氮气氛下搅拌反应混合物16小时。由TLC分析确认反应完成，减压浓缩反应混合物。将残余物溶于EtOAc(60mL)和用水(2x50mL)洗涤。水层用EtOAc(2x30mL)萃取和经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 325(0.600g，0.765mmol，14.66％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，9H)，5.11(app s，1H)，4.33-4.15(m，4H)，3.76(d，1H，J＝12.0)，2.83(br s，2H)，2.78(app t，4H，J＝6.0)，2.35-2.29(m，5H)，2.26(s，3H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，2.01-1.89(m，4H)，1.81-1.75(m，2H)，1.68-1.59(m，4H)，1.40-1.26(m，28H)，0.90(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.63分钟。97.4％纯度。ESI-MS：m/z＝785[M+H]+，代表C48H82NO7。
PNI 328：
在氮气氛下在25℃向充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，700mg，5.22mmol)和DMAP(63.8mg，0.522mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入1-甲基吡咯烷-3-羧酸(674mg，5.22mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液。然后，将无水DCM(10mL)和随后EDCI盐酸盐(2g，10.44mmol)加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1完全消耗。然后，将DMAP(63.8mg，0.522mmol)和亚油酸(3659mg，13.05mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入上述反应混合物。然后将EDCI盐酸盐(4002mg，20.88mmol)和无水DCM(10mL)加入。在室温下在氮气氛下搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发反应混合物。将残余物溶于EtOAc(60mL)和用水洗涤(2x50mL)。水层用EtOAc(2x30mL)萃取，经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 328(0.290g，0.377mmol，7.22％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.41-5.30(m，9H)，5.12(app s，1H)，4.34-4.19(m，4H)，3.76(d，1H，J＝12.0)，3.09-3.05(m，1H)，2.82-2.76(m，5H)，2.71-2.51(m，3H)，2.36-2.32(m，7H)，2.14-2.03(m，10H)，1.68-1.60(m，4H)，1.36-1.26(m，28H)，0.90(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.62分钟。93.1％纯度。ESI-MS：m/z＝771[M+H]+，代表C47H80NO7。
PNI 329：
在氮气氛下在25℃向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.7g，5.22mmol)和DMAP(0.064g，0.522mmol)的无水DMF(15mL)溶液加入1,3-二甲基吡咯烷-3-羧酸(0.747g，5.22mmol)的无水DMF(5mL)溶液。然后，将无水DCM(5mL)，EDCI盐酸盐(4.00g，20.88mmol)和DIPEA(2.279ml，13.05mmol)依次加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1完全消耗。向反应混合物加入DMAP(0.064g，0.522mmol)和亚油酸(3.66g，13.05mmol)的无水DMF(5mL)溶液。然后加入EDCI盐酸盐(4.00g，20.88mmol)和DIPEA(3.37g，26.1mmol)随后无水DCM(5mL)。在室温下在氮气氛下搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发反应混合物。将残余物溶于EtOAc(60mL)和用水(2x50mL)洗涤。水层用EtOAc(2x30mL)萃取和经合并的有机层用盐水(2x50mL)洗涤。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用80％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 329(0.090g，0.115mmol，2.199％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.29(m，9H)，5.14-5.12(m，1H)，4.35-4.22(m，4H)，3.76(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.01(app d，1H，J＝8.0)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.71-2.57(m，2H)，2.47-2.39(m，2H)，2.39-2.31(m，7H)，2.09-1.97(m，9H)，1.79-1.67(m，4H)，1.37-1.26(m，31H)，0.88(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.78分钟。91.6％纯度。ESI-MS：m/z＝785[M+H]+，代表C48H82NO7。
PNI 336：
在室温下在氮气氛下向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.7g，5.22mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入DMAP(0.064g，0.522mmol)。向该混合物加入2-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)乙酸(0.731g，5.22mmol)的DMF(5mL)溶液然后无水DCM(5mL)。然后，将EDCI盐酸盐(2.001g，10.44mmol)和DIPEA(2.329ml，13.05mmol)加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1完全消耗。向上述混合物加入DMAP(0.064g，0.522mmol)和亚油酸(3.66g，13.05mmol)的DMF(5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(4.00g，20.88mmol)和DIPEA(3.37g，26.1mmol)加入。最终，将无水DCM(5mL)加入和在室温下搅拌反应混合物16小时。TLC分析显示原料完成。减压蒸发溶剂和将残余物溶于EtOAc(60mL)。EtOAc层用水(2x30mL)洗涤和经合并的水层用EtOAc(2x30mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)和在无水Na2SO4上干燥。将有机层过滤和减压浓缩。粗制物通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 336(0.37g，0.474mmol，9.08％收率)，是淡黄色液体。1H(400MHz，CDCl3)δ7.45(s，1H)，6.88(s，1H)，5.42-5.30(m，9H)，5.11-5.09(m，1H)，4.37-4.20(m，4H)，3.75(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.70-3.69(m，2H)，3.68(s，3H)，2.77(t，4H，J＝6.0)，2.33(t，4H，J＝8.0)，2.05(q，8H，J＝8.0)，1.64-1.59(m，4H)，1.38-1.26(m，28H)，0.89(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.44分钟。89.4％纯度。ESI-MS：m/z＝782[M+H]+，代表C47H77N2O7。
PNI 538：
在室温下在氮气氛下向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.5g，3.73mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入DMAP(0.046g，0.373mmol)。向该混合物加入2-(1-甲基吡咯烷-3-基)乙酸(0.587g，4.10mmol)的DMF(5mL)溶液，然后无水DCM(10mL)。将EDCI盐酸盐(1.429g，7.46mmol)和DIPEA(1.664mL，9.32mmol)加入反应烧瓶的内容物。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1完全消耗。然后加入DMAP(0.455g，3.73mmol)和亚油酸(2.61g，9.32mmol)的DMF(5mL)溶液。向反应混合物加入EDCI盐酸盐(2.86g，14.91mmol)和DIPEA(2.409g，18.64mmol)。最终，将无水DCM(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物16小时。TLC分析显示原料消耗。减压蒸发溶剂和将残余物溶于EtOAc(60mL)。EtOAc层用水洗涤(2x30mL)和经合并的水层用EtOAc(2x30mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)和在无水Na2SO4上干燥。将有机层过滤和减压浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 538(0.165g，0.210mmol，5.64％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.43-5.30(m，9H)，5.12-5.11(m，1H)，4.32-4.14(m，4H)，3.75(dd，1H，J＝12.0，4.0)，2.83-2.73(m，5H)，2.65-2.50(m，3H)，2.46-2.44(m，2H)，2.37-2.82(m，8H)，2.18-2.03(m，10H)，1.55-1.42(m，4H)，1.40-1.24(m，28H)，0.90(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.23分钟。87.0％纯度。ESI-MS：m/z＝785[M+H]+，代表C48H82NO7。
PNI 539：
在氮气氛下在25℃向充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.6g，4.47mmol)和DMAP(0.055g，0.447mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入4-(吡咯烷-1-基)丁酸盐酸盐(0.866g，4.47mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(1.715g，8.95mmol)和无水DCM(10mL)加入。在室温下搅拌反应混合物4小时和TLC分析显示1的完全消耗。向反应混合物加入DMAP(0.109g，0.895mmol)和亚油酸(3.14g，11.18mmol)的无水DMF(7.5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(3.43g，17.89mmol)和无水DCM(10mL)加入。在室温下在氮气氛下搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发反应混合物。将残余物溶于EtOAc(70mL)和用水洗涤(2x40mL)。水层用EtOAc(2x35mL)萃取和经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过柱色谱法(IsoleraTM)用硅胶(100-200目)用70％EtOAc/石油醚纯化，产生PNI 539(0.5g，0.608mmol，13.58％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，9H)，5.13-5.11(m，1H)，4.33-4.14(m，4H)，3.75(dd，1H，J＝12.0，4.0)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.50-2.31(m，12H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.84(p，2H，J＝8.0)，1.78-1.75(m，4H)，1.67-1.60(m，4H)，1.40-1.25(m，28H)，0.90(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.71分钟。90.6％纯度。ESI-MS：m/z＝799[M+H]+，代表C49H84NO7。
PNI 540：
在氮气氛下在25℃向充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.6g，4.47mmol)和DMAP(0.055g，0.447mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入2-(1-甲基哌啶-2-基)乙酸盐酸盐(0.866g，4.47mmol)/无水DMF(2.5mL)。然后，将EDCI(1.715g，8.95mmol)和无水DCM(10mL)加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1完全消耗。向该反应混合物加入DMAP(0.109g，0.895mmol)和亚油酸(3.14g，11.18mmol)的DMF(7.5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(3.43g，17.89mmol)和无水DCM(10mL)加入。在25℃在氮气氛下搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发反应混合物。将残余物溶于EtOAc(70mL)和用水洗涤(2x40mL)。水层用EtOAc(2x35mL)萃取和经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。有机层在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用75％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 540(0.41g，0.500mmol，11.18％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，9H)，5.13-5.11(m，1H)，4.33-4.17(m，4H)，3.75(dd，1H，J＝12.0，4.0)，2.86(br s，2H)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.60(br s，1H)，2.46-2.27(m，9H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.77-1.61(m，10H)，1.40-1.25(m，28H)，0.89(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.79分钟。97.4％纯度。ESI-MS：m/z＝799[M+H]+，代表C49H84NO7。
实施例3。
合成PNI 342和541
方案3.化合物4的合成
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方案4.PNI 342和541的一般合成路线
化合物2：
向搅拌的油酸(58g，205mmol)的无水EtOH(580mL)溶液缓慢加入浓H2SO4(1.094mL，20.53mmol)和将反应混合物回流16h。在TLC指出反应完成后，减压蒸发溶剂。将残余物冷却至0℃，用饱和NaHCO3水溶液中和并用DCM(3x250mL)萃取。经合并的有机层在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩，获得油酸乙酯(2，61.6g，198mmol，97％收率)，是无色油状物。所述酯原样用于后续步骤不加进一步纯化。1H(400MHz，CDCl3)δ5.39-5.31(m，2H)，4.13(q，2H，J＝8.0)，2.29(t，2H，J＝8.0)，2.02(app q，4H，J＝8.0)，1.62(p，2H，J＝8.0)，1.35-1.24(m，23H)，0.89(t，3H，J＝6.0)。RT＝3.73分钟。99.5％纯度。ESI-MS：m/z＝311[M+H]+，代表C20H39O2。
化合物3：
将二碘甲烷(31.2mL，386mmol)的甲苯(120mL)溶液在-15℃在氮气氛下搅拌。在-15℃将二乙基锌(129ml，193mmol，1.5M甲苯溶液)滴加至反应混合物持续30分钟。注：反应混合物的内部温度应保持小于0℃。然后，将2(30g，97mmol)的甲苯(30mL)溶液滴加至上述反应混合物，从而内部温度保持小于0℃。在相同温度搅拌反应混合物15分钟和在30分钟内逐渐让其温热至室温。在室温下搅拌7h之后，TLC分析显示反应完成。将反应混合物冷却至0℃和用饱和NH4Cl水溶液(100mL)猝灭。分开有机层，水层用甲苯(2x75mL)萃取。经合并的有机层在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用6％EtOAc/石油醚纯化，提供3(28.05g，86mmol，89％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ4.13(q，2H，J＝8.0)，2.29(t，2H，J＝8.0)，1.63(p，2H，J＝8.0)，1.38-1.24(m，25H)，1.19-1.08(m，2H)，0.89(t，3H，J＝6.0)，0.68-0.62(m，2H)，0.59-0.54(m，1H)，-0.34(app q，1H，J＝4.0)。RT＝4.01分钟。98.7％纯度。ESI-MS：m/z＝325[M+H]+，代表C21H41O2。
化合物4：
将LiOH(1.660g，69.3mmol)加入搅拌的3(15g，46.2mmol)的EtOH(105mL)和水(45mL)溶液和在环境温度搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成后，减压浓缩反应混合物，获得残余物。残余物用水(100mL)稀释和用MTBE(2x100mL)洗涤。水层冷却至0℃，用6NHCl酸化和用EtOAc(3x300mL)萃取。经合并的有机层在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩，获得4(13.05g，43.0mmol，93％收率)，是白色固体。1H(400MHz，CDCl3)δ2.36(t，2H，J＝6.0)，1.64(p，2H，J＝8.0)，1.39-1.28(m，22H)，1.19-1.10(m，2H)，0.89(t，3H，J＝6.0)，0.68-0.62(m，2H)，0.59-0.54(m，1H)，-0.33(app q，1H，J＝4.0)。RT＝2.91分钟。97.7％纯度。ESI-MS：m/z＝295[M-H]-，代表C19H35O2。
PNI 342：
在室温下在氮气氛下向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.8g，5.96mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入DMAP(0.073g，0.596mmol)。向该混合物加入3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(0.916g，5.96mmol)的无水DMF(3mL)溶液，随后无水DCM(10mL)，然后EDCI盐酸盐(2.287g，11.93mmol)。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析确认1消耗。向上述反应混合物加入DMAP(0.146g，1.193mmol)和4(4.42g，14.91mmol)的无水DMF(10mL)溶液。然后，加入EDCI盐酸盐(4.57g，23.86mmol)，随后无水DCM(10mL)，在室温下搅拌反应混合物16h。TLC分析显示原料完全消耗，减压浓缩反应混合物。将残余物溶于EtOAc(60mL)和用水洗涤。水层用EtOAc(2x30mL)萃取和经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用50％EtOAc/石油醚纯化。产品用10％丙酮/DCM再纯化(IsoleraTM)，提供PNI 342(0.19g，0.240mmol，4.03％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.38-5.35(m，1H)，5.16-5.12(m，1H)，4.34-4.14(m，4H)，3.80-3.74(m，1H)，2.66-2.58(m，2H)，2.55-2.50(m，2H)，2.36-2.31(m，4H)，2.25(s，6H)，1.62(p，4H，J＝8.0)，1.39-1.26(m，44H)，1.19-1.09(m，4H)，0.89(app t，6H，J＝8.0)，0.68-0.62(m，4H)，0.59-0.54(m，2H)，-0.33(app q，2H，J＝4.0)。RT＝5.03分钟。94.7％纯度。ESI-MS：m/z＝791[M+H]+，代表C48H88NO7。
PNI 541：
在25℃向充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.6g，4.47mmol)和DMAP(0.055g，0.447mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入1,4-二甲基哌啶-4-羧酸盐酸盐(0.866g，4.47mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(1.715g，8.95mmol)和无水DCM(10mL)加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1完全消耗。向该反应混合物加入DMAP(0.109g，0.895mmol)和4(3.32g，11.18mmol)的无水DMF(7.5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(3.43g，17.89mmol)和无水DCM(10mL)加入反应混合物。在氮气氛下在室温下搅拌反应混合物16小时。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发反应混合物。将残余物溶于EtOAc(70mL)和用水洗涤(2x40mL)。水层用EtOAc(2x35mL)萃取和经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用65％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI541(0.68g，0.819mmol，18.31％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.35(d，1H，J＝4.0)，5.15-5.13(m，1H)，4.33-4.23(m，4H)，3.76(d，1H，J＝12.0)，2.92(br s，2H)，2.61-2.39(m，4H)，2.36(td，4H，J＝8.0，4.0)，2.22-2.19(m，3H)，1.68-1.57(m，6H)，1.39-1.25(m，47H)，1.19-1.11(m，4H)，0.89(app t，6H，J＝6.0)，0.71-0.62(m，4H)，0.59-0.54(m，2H)，-0.33(q，2H，4.0)。RT＝5.03分钟。96.2％纯度。ESI-MS：m/z＝831[M+H]+，代表C51H92NO7。
实施例4。
合成PNI 535
方案5.PNI 535的合成
在室温下在氮气氛下向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.70g，5.22mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入DMAP(0.064g，0.522mmol)。向该混合物加入3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(0.673g，5.74mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液然后无水DCM(5mL)。然后，将EDCI盐酸盐(2.001g，10.44mmol)和DIPEA(2.329ml，13.05mmol)加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1消耗。向反应烧瓶加入DMAP(0.064g，0.522mmol)和2-己基癸酸5(3.35g，13.05mmol)的DMF(5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(4.00g，20.88mmol)和DIPEA(3.37g，26.1mmol)加入。最终，将无水DCM(5mL)加入和在室温下搅拌反应混合物16h。TLC分析显示原料完成。减压浓缩反应混合物和将残余物溶于EtOAc(60mL)。EtOAc层用水洗涤(2x30mL)和经合并的水层用EtOAc(2x30mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)和在无水Na2SO4上干燥。分开有机层，过滤，和减压浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用60％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 535(0.43g，0.606mmol，11.60％收率)，是无色液体。1H(400MHz，CDCl3)δ5.35-5.32(m，1H)，5.12-5.08(m，1H)，4.34-4.20(m，4H)，3.80-3.73(m，1H)，2.64-2.60(m，2H)，2.53-2.49(m，2H)，2.40-2.31(m，2H)，2.24(s，6H)，1.60-1.53(m，4H)，1.50-1.40(m，4H)，1.34-1.16(m，40H)，0.88(app t，12H，J＝8.0)。RT＝3.08分钟。97.9％纯度。ESI-MS：m/z＝711[M+H]+，代表C42H80NO7。
实施例5.合成PNI 119，120和344
方案6.PNI 119，120和344的一般合成路线
PNI 119：
在N2气氛下向(±)-1(1.25g，9.3mmol)的无水DMF(15mL)溶液加入DMAP(cat.)随后加入4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(1.56g，9.3mmol)的无水DMF(10mL)溶液。在室温下将CH2Cl2(25mL)加入反应混合物。最终，将固体EDCI盐酸盐(3.56g，18.6mmol)加入，反应在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示(±)-1完全消耗。此外，将DMAP(cat.)加入反应混合物随后加入溶于无水DMF(20mL)的肉豆蔻酸(5.32g，23.3mmol)和固体EDCI盐酸盐(7.13g，37.2mmol)。随后，将无水CH2Cl2(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物过夜。在旋转式蒸发仪上浓缩反应混合物，用EtOAc(50mL)稀释和用水洗涤(3×20mL)。有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥和在旋转式蒸发仪上蒸发至干，提供粗制混合物，将其通过柱色谱法用5％MeOH/DCM作为洗脱液纯化。获得PNI 119，是无色油状物(780mg，1.17mmol)，13％收率。1H(500MHz，CDCl3)δ5.36(d，1H，J＝5.0Hz)，5.13-5.11(m，1H)，4.33-4.28(m，2H)，4.25(dd，1H，J＝10.0Hz，5.0Hz)，4.18(dd，1H，J＝10.0Hz，7.5Hz)，3.75(d，1H，J＝10.0Hz)，2.39-2.32(m，6H)，2.28(表观t，2H，J＝5.0Hz)，2.21(s，6H)，1.79(p，2H，J＝7.5Hz)，1.65-1.59(m，4H)，1.33-1.26(m，40H)，0.89(表观t，6H，J＝7.5Hz)。C39H74NO7[M+H]+的分子量计算值668.5465。实测值668.5466。
PNI 120：
在N2气氛下在室温下向(±)-1(1.25g，9.3mmol)的无水DMF(15mL)溶液加入DMAP(cat.)随后加入5-(二甲基氨基)戊酸盐酸盐(1.68g，9.3mmol)的无水DMF(10mL)溶液。将CH2Cl2(25mL)加入反应混合物。最终，将固体EDCI盐酸盐(3.56g，18.6mmol)加入反应混合物和在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示(±)-1完全消耗。此外，将DMAP(cat.)加入反应混合物随后加入溶于无水DMF(20mL)的肉豆蔻酸(5.31g，23.3mmol)和固体EDCI盐酸盐(7.13g，37.2mmol)。随后，将无水DCM(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物过夜。在旋转式蒸发仪上浓缩反应混合物，用EtOAc(50mL)稀释和用水洗涤(3×20mL)。有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥和在旋转式蒸发仪上蒸发至干，提供粗制混合物，将其通过硅胶柱色谱法用5％MeOH/DCM作为洗脱液纯化。获得PNI 120，是无色油状物(1.03g，1.51mmol)，16％收率。1H(500MHz，CDCl3)δ5.35(d，1H，J＝5.0Hz)，5.12-5.11(m，1H)，4.32-4.23(m，3H)，4.16(dd，1H，J＝10.0Hz，7.5Hz)，3.75(d，1H，J＝10.0Hz)，2.38-2.28(m，8H)，2.23(s，6H)，1.68-1.59(m，6H)，1.51(p，2H，J＝7.5Hz)，1.32-1.25(m，40H)，0.88(表观t，6H，J＝7.5Hz)。C40H76NO7[M+H]+的分子量计算值682.5622。实测值682.5589。
PNI 344：
在室温下在氮气氛下向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.500g，3.73mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入DMAP(0.046g，0.373mmol)。向该混合物加入3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(0.437g，3.73mmol)的无水DMF(2.5mL)和无水DCM(10mL)溶液。将EDCI盐酸盐(1.429g，7.46mmol))和DIPEA(1.623ml，9.32mmol)加入和在室温下搅拌反应混合物4h。TLC分析显示1完全消耗。然后，将DMAP(0.046g，0.373mmol)和肉豆蔻酸(2.128g，9.32mmol)的DMF(5mL)溶液加入上述反应混合物。此外，将EDCI盐酸盐(2.86g，14.91mmol)和DIPEA(3.25ml，18.64mmol)加入。最终，将无水DCM(10mL)加入反应混合物和在室温下搅拌16h。由TLC分析确认反应完成，减压浓缩反应混合物。将残余物溶于EtOAc(60mL)和用水洗涤(2x30mL)。水层用EtOAc(2x30mL)萃取和经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 344(0.220g，0.336mmol，9.02％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.38-5.34(m，1H)，5.13-5.11(m，1H)，4.34-4.16(m，4H)，3.76(d，1H，J＝12.0)，2.65-2.61(m，2H)，2.54-2.50(m，2H)，2.36-2.31(m，4H)，2.25(s，6H)，1.62(p，4H，J＝8.0)，1.35-1.22(m，40H)，0.88(app t，6H，J＝6.0)。RT＝3.57分钟。91.8％纯度。ESI-MS：m/z＝655[M+H]+，代表C38H72NO7。
实施例6。
合成PNI 534
方案7.PNI 534的合成
在室温下在氮气氛下向搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，1.0g，7.46mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入DMAP(0.091g，0.746mmol)。向该混合物加入3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(0.961g，8.20mmol)的DMF(2.5mL)溶液然后无水DCM(10mL)。然后，将EDCI盐酸盐(2.86g，14.91mmol)和DIPEA(2.409g，18.64mmol)加入。在室温下搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1消耗。向反应混合物加入DMAP(0.091g，0.746mmol)和十二酸(3.73g，18.64mmol)的无水DMF(5mL)溶液。然后，将EDCI盐酸盐(5.72g，29.8mmol)和DIPEA(4.82g，37.3mmol)加入。最终，将无水DCM(10mL)加入和混合物在室温下搅拌16h。TLC分析显示原料完全消耗。减压浓缩反应混合物和将残余物溶于EtOAc(60mL)。EtOAc层用水洗涤(2x30mL)和经合并的水层用EtOAc(2x30mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)和在无水Na2SO4上干燥。将有机层过滤和减压浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 534(0.230g，0.385mmol，5.16％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.38-5.34(m，1H)，5.16-5.11(m，1H)，4.34-4.15(m，4H)，3.80-3.74(m，1H)，2.64-2.59(m，2H)，2.53-2.49(m，2H)，2.36-2.31(m，4H)，2.24(s，6H)，1.62(p，4H，J＝8.0)，1.36-1.21(m，32H)，0.88(app t，6H，J＝6.0)。RT＝1.85分钟。85.6％纯度。ESI-MS：m/z＝599[M+H]+，代表C34H64NO7。
实施例7。
合成PNI 532
方案8.化合物9的合成
方案9.PNI 532的合成
化合物8：
在室温下在氮气氛下向搅拌的8-(叔丁氧基)-8-氧代辛酸(6，11.36g，49.3mmol的无水DCM(100mL)溶液加入DMAP(0.524g，4.29mmol)。将(Z)-壬-2-烯-1-醇(7，6.1g，42.9mmol)加入上述混合物和继续搅拌15分钟。将反应冷却至0℃和将DCC(9.73g，47.2mmol)加入。让反应混合物达到室温和搅拌16h。TLC分析显示原料完全消耗。将沉淀的脲过滤通过C盐垫和用DCM(2x50mL)洗涤。浓缩经合并的滤液，残余物用饱和NaHCO3水溶液(2x50mL)洗涤。分开有机层，在无水Na2SO4上干燥。减压除去溶剂和残余物通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用3％EtOAc/石油醚纯化，提供辛烷二酸(Z)-1-(叔丁基)8-(壬-2-烯-1-基)酯(8，11.35g，29.8mmol，69.4％收率)。1H(400MHz，CDCl3)δ5.68-5.61(m，1H)，5.56-5.49(m，1H)，4.63(d，2H，J＝4.0)，2.31(t，2H，J＝8.0)，2.20(t，2H，J＝8.0)，2.10(app q，2H，J＝8.0)，1.67-1.57(m，4H)，1.44(s，9H)，1.40-1.25(m，12H)，0.89(t，3H，J＝6.0)。RT＝1.40分钟。89.2％纯度。ESI-MS：m/z＝377[M+Na]+，代表C21H38O4Na。
化合物9：
在室温下在氮气氛下将TFA(10.00mL，130mmol)滴加至搅拌的8(5g，14.10mmol)的无水DCM(50mL)溶液和继续搅拌16h。TLC分析显示存在8。再次，将TFA(10.00mL，130mmol)加入和将反应混合物回流16h。反应并未完全和TLC分析显示存在8。停止反应，减压蒸发混合物。粗制物质通过柱硅胶(100-200目)色谱法(IsoleraTM)用30％EtOAc/石油醚纯化，提供(Z)-8-(壬-2-烯-1-基氧基)-8-氧代辛酸(9，3.41g，11.43mmol，81％收率)，是褐色油状物，还回收600mg的8。1H(400MHz，CDCl3)δ5.68-5.61(m，1H)，5.56-5.49(m，1H)，4.63(d，2H，J＝4.0)，2.37-2.30(m，4H)，2.10(app q，2H，J＝8.0)，1.68-1.60(m，4H)，1.40-1.24(m，12H)，0.89(t，3H，J＝6.0)。
PNI 532：
在室温下在氮气氛下向含有充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，0.5g，3.73mmol)的无水DMF(5mL)溶液的100mL双颈圆底烧瓶加入DMAP(0.046g，0.373mmol)和3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(0.480g，4.10mmol)的无水DMF(2.5mL)溶液。向该混合物加入无水DCM(10mL)，随后EDCI(1.429g，7.46mmol)和DIPEA(1.204g，9.32mmol)。在环境温度搅拌反应混合物4h和TLC分析显示1消耗。将DMAP(0.046g，0.373mmol)加入上述反应混合物。将9(2.78g，9.32mmol)的无水DMF(5mL)溶液加入，随后EDCI盐酸盐(2.86g，14.91mmol)和DIPEA(2.409g，18.64mmol)。最终，将无水DCM(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物16h。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发溶剂和将残余物溶于EtOAc(60mL)。有机层用水洗涤(2x30mL)和水层用EtOAc(2x30mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(2x50mL)和在无水Na2SO4上干燥。分开有机层，过滤和减压浓缩，获得粗制物。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用70％EtOAc/石油醚纯化，提供PNI 532(0.270g，0.340mmol，9.12％收率)，是浅黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.68-5.61(m，2H)，5.55-5.49(m，2H)，5.37-5.34(m，1H)，5.16-5.10(m，1H)，4.62(d，4H，J＝8.0)，4.33-4.10(m，4H)，3.79-3.73(m，1H)，2.65-2.60(m，2H)，2.53-2.50(m，2H)，2.36-2.28(m，8H)，2.25(s，6H)，2.10(q，4H，J＝8.0)，1.67-1.59(m，8H)，1.39-1.24(m，24H)，0.89(app t，6H，J＝6.0)。RT＝2.24分钟。97.2％纯度。ESI-MS：m/z＝795[M+H]+，代表C44H76NO11。
实施例8.合成PNI 127，573，574和575
方案10.PNI 127，573，574和575的一般合成路线
化合物10：
在室温下在氮气氛下向100mL单颈圆底烧瓶加入充分搅拌的(±)-1,4-脱水木糖醇(1，5.1g，38.0mmol)的无水吡啶(25mL)溶液，三苯甲基氯(10.07g，36.1mmol)，并继续搅拌16h。在TLC指出反应完成之后，减压浓缩过量溶剂。将残余物溶于DCM(100mL)和水(200mL)。分开有机层，水层用DCM(3x50mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(3x100mL)，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法用50％EtOAc/石油醚纯化，提供(±)-10(8.65g，22.93mmol，60.3％收率)，是白色胶状固体。1H(400MHz，CDCl3)δ7.47-7.43(m，6H)，7.34-7.30(m，6H)，7.28-7.23(m，3H)，4.32(br s，1H)，4.28-4.23(m，3H)，3.77(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.50(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.43(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.14(br s，1H)。RT＝2.66分钟。99.9％纯度。ESI-MS：m/z＝375[M-H]-for C24H23O4。
化合物11：
在室温下在氮气氛下向250mL三颈圆底烧瓶加入搅拌的亚油酸(6.55g，23.36mmol)的无水DCM(50mL)溶液，DMAP(2.85g，23.36mmol)，EDCI盐酸盐(17.91g，93mmol)和DIPEA(9.38ml，53.7mmol)。搅拌反应混合物15分钟，将(±)-10(3.52g，9.34mmol)的无水DCM(20mL)溶液加入。在搅拌16h之后，反应混合物用水(150mL)猝灭和用DCM(3x50mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(3x75mL)，在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％EtOAc/石油醚纯化，提供(±)-11(7.21g，7.84mmol，33.6％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ7.44-7.42(m，6H)，7.32-7.28(m，6H)，7.26-7.22(m，3H)，5.43-5.31(m，9H)，5.12-5.10(m，1H)，4.35-4.31(m，1H)，4.26(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.74(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.35(app t，1H，J＝8.0)，3.16(dd，1H，J＝8.0，6.0)，2.79(t，4H，J＝6.0)，2.36(t，2H，J＝8.0)，2.16-1.99(m，10H)，1.65(p，2H，J＝8.0)，1.40-1.22(m，30H)，0.90(t，6H，J＝6.0)。RT＝3.95分钟。98.1％纯度。ESI-MS：m/z＝923[M+Na]+，代表C60H84O6Na。
化合物12：
在0℃在氮气氛下将TFA(0.427ml，5.55mmol)加入(±)-11(2.0g，2.219mmol)和三乙基硅烷(1.772ml，11.09mmol)的无水DCM(50ml)溶液。在0℃搅拌反应混合物1h和TLC分析显示11完全消耗。混合物用饱和NaHCO3水溶液(50mL)猝灭和用DCM(2x50mL)萃取。有机层在无水Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用10％EtOAc/石油醚纯化，提供(±)-12(1.15g，1.745mmol，79％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.43-5.29(m，9H)，5.11-5.09(m，1H)，4.51(dd，1H，J＝12.0，8.0)，4.30(dd，1H，J＝8.0，4.0)，4.20-4.16(m，2H)，4.11-4.07(m，1H)，3.76(dd，1H，J＝12.0，4.0)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.37-2.30(m，4H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.69-1.62(m，4H)，1.40-1.25(m，28H)，0.90(t，6H，J＝6.0)。RT＝2.29分钟。92.5％纯度。ESI-MS：m/z＝659[M+H]+，代表C41H71O6。
PNI 127(备择方法)
在氮气氛下向含有充分搅拌的1,4-二甲基哌啶-4-羧酸盐酸盐(0.970g，5.01mmol)的无水DCM(30ml)溶液的100mL双颈圆底烧瓶加入DMAP(0.556g，4.55mmol)和EDCI盐酸盐(1.745g，9.10mmol)。在25℃搅拌反应混合物10分钟，将(±)-12(3g，4.55mmol)的无水DCM(15mL)溶液加入和在25℃搅拌反应混合物16小时。在TLC指出反应完成之后，减压蒸发溶剂。将残余物溶于EtOAc(150mL)和用水(2x100mL)、盐水(2x100mL)洗涤，在无水Na2SO4上干燥，过滤，浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用3％MeOH/DCM纯化，提供PNI 127(2.96g，3.71mmol，81％收率)，是淡黄色油状物。
PNI 574：
在氮气氛下向含有搅拌的2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸(0.125g，0.789mmol)的无水DCM(25mL)溶液的100mL双颈圆底烧瓶加入DMAP(0.102g，0.789mmol)和EDCI盐酸盐(0.348g，1.821mmol)。在25℃搅拌反应混合物10分钟，将(±)-12(0.4g，0.607mmol)的无水DCM(5mL)溶液加入。混合物在25℃搅拌16小时，由TLC分析确认反应完成。反应混合物用水(120mL)猝灭和用DCM(3x50mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(3x75mL)，在无水Na2SO4上干燥，过滤和减压浓缩。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI 574(0.090g，0.101mmol，16.70％收率)，是粘稠红色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，9H)，5.13(s，1H)，4.33-4.14(m，4H)，3.74(d，1H，J＝4.0)，3.27(s，2H)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.73-2.46(m 8H)，2.39-2.26(m，7H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.66-1.58(m，4H)，1.49-1.26(m，28H)，0.90(app t，6H，J＝6.0)。RT＝2.34分钟。93.3％纯度。ESI-MS：m/z＝800[M+H]+，代表C48H83N2O7。
PNI 573：
PNI 573用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 573的合成用下述进行：奎宁环-4-羧酸盐酸盐(0.092g，0.592mmol)/无水DCM(25mL)，DMAP(0.076g，0.592mmol)，EDCI盐酸盐(0.304g，1.593mmol)，和12(0.3g，0.455mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI 573(0.18g，0.226mmol，49.7％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，9H)，5.14-5.07(m，1H)，4.32-4.23(m，3H)，4.11(dd，1H，J＝12.0，8.0)，3.76(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.24-3.05(m，6H)，2.77(t，4H，J＝6.0)，2.33(q，4H，J＝8.0)，2.08-1.98(m，10H)，1.92(app t，4H，J＝8.0)，1.66-1.58(m，4H)，1.42-1.26(m，28H)，0.89(t，6H，J＝6.0)。RT＝2.34分钟。92.4％纯度。ESI-MS：m/z＝796[M+H]+，代表C49H82NO7。
PNI 575：
PNI 575用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 143的合成用下述进行：1-甲基哌啶-3-羧酸(0.085g，0.592mmol)/无水DCM(25mL)，DMAP(0.076g，0.592mmol)，EDCI盐酸盐(0.304g，1.593mmol)，和12(0.3g，0.455mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI575(0.265g，0.338mmol，74.2％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.10(m，9H)，5.11(s，1H)，4.34-4.12(m，4H)，3.77(d，1H，J＝12.0)，2.99-2.59(m，6H)，2.40-2.13(m，7H)，2.11-1.84(m，11H)，1.80-1.52(m，8H)，1.42-1.26(m，28H)，0.90(app t，6H，J＝6.0)。RT＝2.48分钟。93.2％纯度。ESI-MS：m/z＝785[M+H]+，代表C48H82NO7。
实施例9。
合成PNI 576，577和578
方案11.PNI 576，577和578的一般合成路线
化合物13：
化合物13用类似合成11的方法合成。13的合成用下述进行：4(9.06g，30.5mmol)/无水DCM(70mL)，DMAP(4.05g，33.2mmol)，EDCI盐酸盐(10.15g，53.1mmol)，DIPEA(14.28mL，80mmol)，和(±)-10(5.0g，13.28mmol)/无水DCM(30mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％EtOAc/石油醚纯化，提供13(11.1g，11.89mmol，90％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ7.46-7.44(m，6H)，7.34-7.24(m，9H)，5.44(d，1H，J＝4.0)，5.14-5.12(m，1H)，4.37-4.33(m，1H)，4.28(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.76(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.38(dd，1H，J＝12.0，8.0)，3.19(dd，1H，J＝12.0，8.0)，2.39(app t，2H，J＝6.0)，2.18-2.02(m，2H)，1.67(p，2H，J＝8.0)，1.50-1.24(m，46H)，1.19-1.13(m，4H)，0.92(t，6H，J＝6.0)，0.71-0.65(m，4H)，0.62-0.57(m，2H)，-0.30(q，2H，J＝6.0)。
化合物14：
化合物14用类似合成12的方法合成。14的合成用下述进行：(±)-13(11.0g，11.78mmol)和Et3SiH(9.41ml，58.9mmol)/无水DCM(100ml)，和TFA(1.489mL，11.78mmol)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用10％EtOAc/石油醚纯化，提供14(5.5g，7.96mmol，67.5％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.28-5.10(m，2H)，4.53-4.07(m，3H)，3.78-3.56(m，2H)，2.40-2.31(m，4H)，1.68-1.59(m，4H)，1.38-1.10(m，44H)，1.17-1.10(m，4H)，0.89(t，6H，J＝6.0)，0.68-0.62(m，4H)，0.59-0.54(m，2H)，-0.33(q，2H，J＝6.0)。ESI-MS：m/z＝691[M+H]+，代表C43H79O6。
PNI 576：
PNI 576用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 576的合成用下述进行：1-环丙基哌啶-4-羧酸(0.108g，0.637mmol)/无水DCM(15mL)，DMAP(0.085g，0.695mmol)，EDCI盐酸盐(0.222g，1.158mmol)，和14(0.4g，0.579mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用3％MeOH/DCM纯化，提供PNI 576(0.45g，0.534mmol，92％收率)，是黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.35(s，1H)，5.10(s，1H)，4.31-4.18(m，4H)，3.76(d，1H，J＝12.0)，3.05-2.95(m，1H)，2.40-2.12(m，7H)，1.93-1.81(m，2H)，1.76-1.50(m，8H)，1.42-1.26(m，44H)，1.19-1.05(m，4H)，0.89(t，6H，J＝6.0)，0.69-0.61(m，4H)，0.59-0.54(m，2H)，0.48-0.33(m，4H)，-0.33(q，2H，J＝6.0)。RT＝3.35分钟。99.1％纯度。ESI-MS：m/z＝843[M+H]+，代表C52H92NO7。
PNI 577：
PNI 577用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 577的合成用下述进行：1-乙基哌啶-4-羧酸(0.104g，0.658mmol)/无水DCM(20mL)，DMAP(0.085g，0.658mmol)，EDCI盐酸盐(0.290g，1.519mmol)，和14(0.35g，0.506mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI577(0.29g，0.349mmol，69.0％收率)，是粘稠无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.37-5.35(m，1H)，5.13 5.09(m，1H)，4.33-4.16(m，4H)，3.76(d，1H，J＝12.0)，2.95-2.90(m，2H)，2.51-2.25(m，7H)，2.14-1.75(m6H)，1,70-1.55(m，4H)，1.42-1.28(m，44H)，1.17-1.09(m，7H)，0.89(t，6H，J＝6.0)，0.68-0.62(m，4H)，0.59-0.54(m，2H)，-0.33(q，2H，J＝6.0)。RT＝3.59分钟。95.1％纯度。ESI-MS：m/z＝830[M+H]+，代表C51H92NO7。
PNI 578：
PNI 578用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 578的合成用下述进行：2-(1-甲基哌啶-2-基)乙酸(0.096g，0.608mmol)/无水DCM(20mL)，DMAP(0.078g，0.608mmol)，EDCI盐酸盐(0.290g，1.519mmol)，和14(0.35g，0.506mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI 578(0.32g，0.385mmol，76％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.35(s，1H)，5.13(s，1H)，4.32-4.16(m，4H)，3.76(dt，1H，J＝8.0，4.0)，2.81-2.18(m，12H)，1.77-1.51(m，10H)，1.45-1.21(m，44H)，1.19-1.10(m，4H)，0.89(t，6H，J＝6.0)，0.68-0.61(m，4H)，0.59-0.54(m，2H)，-0.33(q，2H，J＝4.0)。RT＝3.61分钟。99.7％纯度。ESI-MS：m/z＝853[M+Na]+，代表C51H91NO7Na。
实施例10。
合成PNI 579和580
方案12.PNI 579和580的一般合成路线
化合物15：
化合物15用类似合成11的方法合成。15的合成用下述进行：2-己基癸酸(3.92g，15.27mmol)/无水DCM(40mL)，DMAP(1.866g，15.27mmol)，随后EDCI盐酸盐(6.37g，33.2mmol)，DIPEA(5.80ml，33.2mmol)，和(±)-10(2.5g，6.64mmol)/无水DCM(10mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用2％EtOAc/石油醚纯化，提供15(5.12g，6.00mmol，90％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ7.47-7.45(m，6H)，7.33-7.22(m，9H)，5.29(d，1H，J＝4.0)，5.09-5.07(m，1H)，4.29-4.24(m，2H)，3.75(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.42(dd，1H，J＝12.0，8.0)，3.22(dd，1H，J＝12.0，4.0)，2.43-2.34(m，1H)，2.22-2.15(m，1H)，1.66-1.38(m，8H)，1.36-1.12(m，40H)，0.92-0.86(m，12H)。
化合物16：
化合物16用类似合成12的方法合成。16的合成用下述进行：(±)-15(5.1g，5.98mmol)/无水DCM(70mL)，三乙基硅烷(4.77mL，29.9mmol)，和TFA(1.151mL，14.94mmol)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用2％EtOAc/石油醚纯化，提供(±)-16(3.23g，5.29mmol，88％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.26(d，1H，J＝4.0)，5.16(s，1H)，4.29(dd，1H，J＝12.0，4.0)，4.21-4.17(m，1H)，3.80-3.74(m，2H)，3.58(dd，1H，J＝12.0。4.0)，2.43-2.32(m，2H)，2.15(br s，1H)，1.67-1.41(m，8H)，1.34-1.19(m，40H)，0.89(t，12H，J＝6.0)。RT＝2.18分钟。99.9％纯度。ESI-MS：m/z＝611[M+H]+，代表C37H71O6。
PNI 579：
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PNI 579用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 579的合成用下述进行：1,4-二甲基哌啶-4-羧酸盐酸盐(0.152g，0.786mmol)/无水DCM(20mL)，DMAP(0.096g，0.786mmol)，EDCI盐酸盐(0.301g，1.571mmol)，和16(0.4g，0.655mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用4％MeOH/DCM纯化，提供PNI 579(0.444g，0.592mmol，90％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.34(d，1H，J＝4.0)，5.11-5.10(m，1H)，4.32-4.27(m，3H)，4.21-4.16(m，1H)，3.74(dd，1H，J＝12.0，4.0)，2.69(br s，2H)，2.41-2.31(m，5H)，2.22-2.14(m，4H)，1.63-1.41(m，10H)，1.30-1.22(m，43H)，0.88(t，12H，J＝8.0)。RT＝2.66分钟。97.4％纯度。ESI-MS：m/z＝751[M+H]+，代表C45H84NO7。
PNI 580：
PNI 580用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 580的合成用下述进行：4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.165g，0.982mmol)/无水DCM(20mL)，DMAP(0.120g，0.982mmol)，EDCI盐酸盐(0.377g，1.964mmol)，和16(0.4g，0.655mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用4％MeOH/DCM纯化，提供PNI 580(0.39g，0.539mmol，82％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.33(d，1H，J＝4.0)，5.10(d，1H，J＝4.0)，4.33-4.21(m，4H)，3.75(dd，1H，J＝8.0，4.0)，2.42-2.29(m，12H)，1.91-1.79(m，2H)，1.64-1.41(m，8H)，1.34-1.20(m，40H)，0.88(t，12H，J＝6.0)。RT＝2.49分钟。98.7％纯度。ESI-MS：m/z＝724[M+H]+，代表C43H82NO7。
实施例11。
合成PNI 581，582和583
方案13.PNI 581，582和583的一般合成路线
化合物17：
在氮气氛下在0℃，在500mL三颈RBF中向搅拌的10(2.0g，5.31mmol)的无水DMF(100mL)和无水THF(100mL)溶液缓慢加入NaH(1.062g，26.6mmol)，在相同温度搅拌反应混合物15分钟。然后，向其加入亚油烯基溴(5.25g，15.94mmol)，将反应混合物缓慢温热至25℃，和搅拌7小时。在TLC指出反应完成之后，反应混合物用冰冷水(250mL)猝灭和用EtOAc(3x120mL)萃取。经合并的有机层用盐水洗涤(3x150mL)，在Na2SO4上干燥，过滤和浓缩，获得粗制物。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用3％EtOAc/石油醚纯化，提供17(2.4g，2.75mmol，51.7％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ7.49-7.45(m，6H)，7.30-7.20(m，9H)，5.42-5.31(m，8H)，4.22-4.18(m，1H)，4.04(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.91-3.86(m，1H)，3.84(d，1H，J＝4.0)，3.73(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.50-3.43(m，2H)，3.39-3.28(m，3H)，3.22(dd，1H，J＝12.0，8.0)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.59(p，4H，J＝4.0)，1.43-1.23(m，32H)，0.91-0.88(m，6H)。RT＝3.86分钟。98.1％纯度。ESI-MS：m/z＝896[M+Na]+，代表C60H88O4Na。
化合物18：
在氮气氛下在0℃，在250mL双颈RBF中向搅拌的17(2.35g，2.69mmol)和Et3SiH(2.149ml，13.45mmol)的DCM(40mL)溶液加入TFA(0.427mL，5.55mmol)和在0℃搅拌反应混合物1h。在TLC指出反应完成之后，反应混合物用饱和NaHCO3溶液(60mL)猝灭和用DCM(2x50mL)萃取。有机层在Na2SO4上干燥，过滤，和浓缩，获得粗制物。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用8％EtOAc/石油醚纯化，提供18(1.46g，2.314mmol，86％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，8H)，4.13(dd，1H，J＝8.0，4.0)，4.09-4.05(m，1H)，3.96-3.92(m 2H)，3.90-3.81(m，2H)，3.75(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.64-3.59(m，1H)，3.47-3.42(m，3H)，2.78(t，4H，J＝6.0)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.62-1.48(m，4H)，1.40-1.26(m，32H)，0.90(t，6H，J＝6.0)。RT＝2.63分钟。99.9％纯度。ESI-MS：m/z＝631[M+H]+，代表C41H75O4。
PNI 581：
在氮气氛下，在100mL双颈RBF中向搅拌的1,4-二甲基哌啶-4-羧酸(0.120g，0.762mmol)的无水DCM(20mL)溶液加入DMAP(0.072g，0.586mmol)和EDCI盐酸盐(0.281g，1.466mmol)，反应混合物在25℃搅拌10分钟。然后，将18(0.37g，0.586mmol)/无水DCM(5mL)加入反应混合物，在25℃搅拌16h。TLC显示多数未反应的原料。再次，在氮气氛下在100mL双颈RBF中向搅拌的1,4-二甲基哌啶-4-羧酸盐酸盐(0.148g，0.762mmol)的无水DCM(10mL)溶液加入DMAP(0.072g，0.586mmol)和EDCI盐酸盐(0.281g，1.466mmol)，反应混合物在25℃搅拌10分钟。然后向该混合物加入第一反应混合物，反应混合物在室温下搅拌16h。在TLC指出反应完成之后，蒸发溶剂，获得残余物。该将残余物溶于EtOAc(130mL)和用水(2x100mL)、盐水(2x100mL)洗涤。有机层在Na2SO4上干燥，过滤和浓缩，获得粗制物。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用4％MeOH/DCM纯化，提供PNI 581(0.395g，0.501mmol，86％收率)，是褐色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.31(m，8H)，4.44-4.38(m，1H)，4.30-4.26(m，1H)，4.22-4.18(m，1H)，4.07(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.93(s，1H)，3.85(d，1H，J＝4.0)，3.75(d，1H，J＝8.0)，3.60-3.54(m，1H)，3.45(t，2H，J＝6.0)，3.41-3.36(m，1H)，3.26(br s，2H)，2.84-2.71(m，6H)，2.65(s，3H)，2.32-2.22(m，2H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.68-1.48(m，6H)，1.38-1.26(m，35H)，0.90(t，6H，J＝6.0)。RT＝4.06分钟。97.8％纯度。ESI-MS：m/z＝771.2[M+H]+，代表C49H88NO5。
PNI 582：
PNI 582用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 582的合成用下述进行：1-甲基哌啶-3-羧酸(0.113g，0.792mmol)/无水DCM(20mL)，DMAP(0.097g，0.792mmol)，EDCI盐酸盐(0.304g，1.585mmol)，和18(0.4g，0.634mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI582(0.43g，0.569mmol，90％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.42-5.30(m，8H)，4.38-4.34(m，1H)，4.23-4.14(m，2H)，4.08(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.92(s，1H)，3.83(s，1H)，3.77(d，1H，J＝12.0)，3.58-3.53(m，1H)，3.45(t，2H，J＝8.0)，3.42-3.36(m，1H)，3.17(br s，1H)，2.93(br s，1H)，2.78(t，4H，J＝8.0)，2.60-2.26(m，4H)，2.17-1.96(m，10H)，1.87-1.74(m，2H)，1.67-1.49(m，6H)，1.38-1.26(m，32H)，0.90(t，6H，J＝6.0)。RT＝2.99分钟。99.2％纯度。ESI-MS：m/z＝756.6[M+H]+，代表C48H86NO5。
PNI 583：
PNI 583用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 583的合成用下述进行：2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酸(0.125g，0.792mmol)/无水DCM(20mL)，DMAP(0.097g，0.792mmol)，EDCI盐酸盐(0.304g，1.585mmol)，和18(0.4g，0.634mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用4％MeOH/DCM纯化，提供PNI 583(0.415g，0.527mmol，83％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ5.41-5.30(m，8H)，4.41(dd，1H，J＝12.0，4.0)，4.25-4.16(m，2H)，4.09(dd，1H，J＝8.0，4.0)，3.92(s，1H)，3.83(d，1H，J＝4.0)，3.76(dd，1H，J＝12.0，4.0)，3.58-3.52(m，1H)，3.44(t，2H，J＝8.0)，3.41-3.36(m，1H)，3.28(s，2H)，2.84-2.58(m，12H)，2.43(s，3H)，2.06(q，8H，J＝8.0)，1.57-1.51(m，4H)，1.40-1.26(m，32H)，0.92-0.86(m，6H)。RT＝2.68分钟。97.9％纯度。ESI-MS：m/z＝771.6[M+H]+，代表C48H87N2O5。
实施例12。
合成PNI 76
方案14.PNI 76的合成
PNI 76：
在N2气氛下向(±)-19(600mg，3.65mmol)的无水DMF(10mL)溶液加入DMAP(cat.)随后加入4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(1.56g，9.3mmol)的无水DMF(10mL)溶液。将CH2Cl2(10mL)加入反应混合物。然后将固体EDCI盐酸盐(1.39g，7.30mmol)加入反应混合物和在室温下搅拌4h。反应混合物的TLC分析显示(±)-19完全消耗。此外，将DMAP(cat.)加入反应混合物随后加入溶于无水DMF(10mL)的肉豆蔻酸(2.73g，11.98mmol)和固体EDCI盐酸盐(3.50g，18.25mmol)。随后，将无水DCM(10mL)加入和在室温下搅拌反应混合物过夜。在旋转式蒸发仪上浓缩反应混合物，用EtOAc(20mL)稀释和用水洗涤(3×10mL)。有机层用盐水洗涤，在无水Na2SO4上干燥和在旋转式蒸发仪上蒸发至干，提供粗制混合物，将其通过硅胶柱色谱法用5％MeOH/DCM作为洗脱液纯化。获得PNI 76，是无色油状物(294mg，0.32mmol)，9％总收率。
PNI 76的HCl盐：
将PNI 76溶于最小量的无水二乙醚。向其加入HCl/醚直至pH变为3-5(pH试纸检查)。蒸发溶剂，加入CH2Cl2并蒸发2-3次以便除去痕量HCl。随后，将化合物溶于少量的去离子水，将其冻干以获得PNI 76的HCl盐。1H(500MHz，CDCl3)δ5.38(d，1H，J＝3.0Hz)，5.22-5.19(m，1H)，5.07(d，1H，J＝5.0Hz)，4.61(d，1H，J＝10.0Hz)，4.26(dd，1H，J＝10.0Hz，5.0Hz)，4.21(dd，1H，J＝10.0Hz，5.0Hz)，4.13(dd，1H，J＝15.0Hz，5.0Hz)，3.79(d，1H，J＝10.0Hz)，2.42-2.29(m，14H)，2.23(表观t，2H，J＝7.5Hz)，1.84(p，2H，J＝6.3Hz)，1.65-1.54(m，6H)，1.30-1.27(m，60H)，0.89(表观t，9H，J＝7.5Hz)。C54H102NO9[M+H]+的分子量计算值908.7555。实测值908.7511。
实施例13。
合成PNI 369
方案15.PNI 369的合成
化合物21：
向搅拌的2-(十二烷基氧基)乙醇(20，3.7g，16.06mmol)和三苯基膦(10.53g，40.1mmol)的无水甲苯(70mL)溶液缓慢加入四溴化碳(13.31g，40.1mmol)和在60℃搅拌反应混合物16h。在TLC分析指出反应完成之后，减压浓缩反应混合物，粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％EtOAc/石油醚纯化，提供1-(2-溴乙氧基)十二烷(21，4.55g，15.20mmol，95％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ3.74(d，2H，J＝6.0)，3.50-3.45(m，4H)，1.59(p，2H，J＝8.0)，1.38-1.21(m，18H)，0.89(t，3H，J＝6.0)。RT＝3.40分钟。96.6％纯度。
化合物22：
化合物22用类似合成17的方法合成。22的合成用下述进行：10(1.0g，2.66mmol)/无水DMF(10mL)和无水THF(10mL)，氢化钠(0.531g，13.28mmol，60％矿物油分散液)，和1-(2-溴乙氧基)十二烷(21，2.337g，7.97mmol)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％EtOAc/石油醚纯化，提供22(1.1g，1.373mmol，51.7％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ7.46(d，6H，J＝8.0)，7.30-7.20(m，9H)，4.25-4.21(m，1H)，4.06-4.02(m，2H)，4.00(d，1H，J＝4.0)，3.79-3.75(m，1H)，3.72-3.58(m，5H)，3.52-3.46(m，3H)，3.41-3.28(m，5H)，3.22(d，1H，J＝8.0，4.0)，1.60(t，2H，J＝6.0)，1.48(p，2H，J＝8.0)，1.35-1.21(m，36H)，0.89(t，6H，J＝6.0)。RT＝2.63分钟。97.8％纯度。ESI-MS：m/z＝823.5[M+Na]+，代表C52H80O6Na。
化合物23：
化合物23用类似合成18的方法合成。23的合成用下述进行：22(1.1g，1.373mmol)和Et3SiH(1.096mL，6.86mmol)/无水DCM(30mL)，和TFA(0.264mL，3.43mmol)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用20％EtOAc/石油醚纯化，提供23(0.58g，1.038mmol，76％收率)，是无色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ4.15-4.03(m，4H)，3.87-3.76(m，4H)，3.66-3.54(m，7H)，3.47-3.43(m，4H)，1.61-1.54(m，4H)，1.36-1.20(m，36H)，0.90-0.87(m，6H)。RT＝1.97分钟。99.1％纯度。ESI-MS：m/z＝559.5[M+H]+，代表C33H67O6。
PNI 369
PNI 369用类似合成PNI 574的方法合成。PNI 369的合成用下述进行：1,4-二甲基哌啶-4-羧酸(0.110g，0.698mmol)/无水DCM(25mL)，DMAP(0.086g，0.698mmol)，EDCI盐酸盐(0.359g，1.879mmol)，和23(0.3g，0.537mmol)/无水DCM(5mL)。粗制产品通过硅胶(100-200目)柱色谱法(IsoleraTM)用5％MeOH/DCM纯化，提供PNI 369(0.21g，0.301mmol，56.0％收率)，是淡黄色油状物。1H(400MHz，CDCl3)δ4.37-4.28(m，2H)，4.21-4.17(m，1H)，4.11-4.07(m，2H)，3.99(d，1H，J＝4.0)，3.81-3.76(m，1H)，3.73-3.69(m，1H)，3.66-3.59(m，3H)，3.57-3.52(m，4H)，3.46-3.41(m，4H)，2.89(br s，2H)，2.48-2.35(m，5H)，2.21(d，2H，J＝12.0)，1.86-1.71(m，2H)，1.60-1.52(m，4H)，1.37-1.20(m，39H)，0.88(t，6H，J＝8.0)。RT＝2.13分钟。98.5％纯度。ESI-MS：m/z＝698.6[M+H]+，代表C41H80NO7。
实施例14。
合成代表性化合物的方案
Scheme 16，Scheme for synthesis of PNI 326，327，335，624，and 625
Scheme17，Alternative route for synthesis of PNI 326，327，335，624，and625
Scheme18，Scheme for synthesis of PNI 626，627，628，629，630，631，and 632
Scheme 19.Scheme for synthesis of PNl 633，634，635，636，and 637
方案20.PNI 633，634，635，636和637的备择合成路线
方案21.PNI 638，639，640，641和642的合成方案
方案22.PNI 343，643，644和645的合成方案
方案23.PNI 646，647，648，649和650的合成方案
方案24.PNI 656，657和658的合成方案
方案25.PNI 659，660，661，662和663的合成方案
方案26.PNI 364，365，368，372和373的合成方案
方案27.PNI 670，671，672，673和674的合成方案
方案28.PNI 675，676，677，678和679的合成方案
方案29.38的合成方案
方案30.PNI 340，341，680，681，682和683的合成方案
方案31.PNI 684，685，686，687和688的合成方案
实施例15.
从人类全血分离初代T细胞并且扩增
除非另有指出，全部试剂购自STEMCELL Technologies，Vancouver，加拿大。
在生物学安全柜中，将冻干人类IL-2在不含钙或镁的无菌1XPBS中重构为0.1mg/ml的浓度。将50μl的该人类IL-2加至50mL的ImmunoCult-XFTM T细胞扩增培养基，产生用于T细胞的培养基。在生物学安全柜中，将7-30mL含ACDA抗凝剂的人类外周全血置于无菌50mL聚丙烯锥形管。
阴性选择方案。从健康人类供体抽取血液并且与ACD-A抗凝剂组合。将pan T细胞阴性选择试剂盒(EasySepTM直接人类T细胞分离试剂盒)用来分离CD4+和CD8+T细胞两者。将细胞保持在补充人类重组IL2(Peprotech)的ImmunoCult-XFTM T细胞扩增培养基中。在分离当天，将细胞用三重活化剂(ImmunoCultTM人类CD3/CD28/CD2T细胞活化剂)活化。
阳性选择方案。从健康人类供体抽取血液并且与ACDA抗凝剂组合。借助LymphoprepTM用密度梯度离心制备PBMC悬浮液。然后从PBMC悬浮液用EasySepTM人类CD3Pos选择试剂盒II阳性选择T细胞。将细胞保持在补充人类重组IL2(Peprotech)的ImmunoCult-XFTM T细胞扩增培养基中。在分离当天，将细胞用三重活化剂(ImmunoCultTM人类CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂)活化。
从血液用EasySepTM直接人类T细胞分离试剂盒分离T细胞。先将50μl/mL的Isolation CocktailTM然后将50μl/mL的EasySepTM RapidSpheresTM加入血液管中。温和混合血液和在室温下(RT)温育5分钟。将管置入EasySepTM 50 MagnetTM设备和在RT温育10分钟。将富集的细胞悬浮液移取入新的无菌50mL聚丙烯管，重复RapidSpheresTM过程。
将该双倍富集的细胞悬浮液移取入新的无菌50mL聚丙烯锥形管和于300g在RT离心10分钟。
除去上清液和将细胞丸再悬浮于10mL PBS和于300g再旋转10分钟以从细胞洗涤任何剩余的上清液。再次除去上清液和将细胞再悬浮于预温热的完整T细胞培养基。抽取样品，进行细胞存活率的锥虫蓝排斥试验(Thermo Fisher)。
实施例16
T细胞的活化/扩增
活化T细胞的科学背景可以参见Trickett A.等人在2003年的文章6。将实施例8的细胞悬浮液在完整T细胞培养基(ThermoFisher)中稀释至1E6细胞/ml，相对每mL T细胞培养基加入25μl的ImmunoCultTM人类CD3/CD28/CD2三重T细胞活化剂TM或ImmunoCultTM人类CD3/CD28双重T细胞活化剂TM来活化T细胞。用放大镜每日计数细胞以监测细胞生长。细胞用完整T细胞培养基稀释以保持约1E6细胞/mL的浓度。在约第5、6或7天，T细胞进入对数生长期，并且发生快速扩增。
为了确认T细胞在对数期，通过流式细胞术(BD Biosciences)评价CD25表达且需要大于80％，并且通过将T细胞总数对时间作图来监测细胞扩增(未显示)。
实施例17
经处理的T细胞的下游处理和分析：
流式细胞术和ELISA
试剂来自Stemcell Technologies，除非另有说明。T细胞分离自单个供体。在脂质颗粒mRNA暴露之后第48h收获经处理的T细胞：将细胞悬浮液转移至预标记的1.5mL管和在300xg于4摄氏度离心10分钟。除去上清液，将丸再悬浮于PBS。加入0.5ul量的BD HorizonTMFixable Viability Stain 575VTM(BD Biosciences)，在RT避光温育混合物10分钟。该染料结合至胺。
细胞再次如上离心，然后用1mL染料缓冲剂(BSA，BD Pharminigen)洗涤两次，将经洗涤的丸稀释于100μl BSA。将下述抗体以2μl体积加入经处理细胞的各管当中：CD25，CD8，CD4，(PerCP-CyTM 5.5小鼠抗人类CD25，BV786小鼠抗人类CD8克隆RPA-T8，和APC-CyTM 7小鼠抗人类CD4克隆SK3，全部来自BD Pharmingen)；但是对照例外：在仅eGFP样品和存活率对照中不加入抗体。在单染料补偿管中，每管仅加入一种抗体。
将各管于4摄氏度温育30分钟，然后加入400μL染料缓冲剂，将细胞再次离心。细胞用1mL染色缓冲剂洗涤1次，并如步骤1中再次旋转。将细胞丸再悬浮于1mL染料缓冲剂和加至预标记的具细胞滤网盖的流动管(Corning Falcon)。
阴性选择方案。从健康人类供体抽取血液并且与ACDA抗凝剂组合。将pan T细胞阴性选择试剂盒(EasySepTM直接人类T细胞分离试剂盒)用来分离CD4+和CD8+T细胞两者。将细胞保持在补充人类重组IL2(Peprotech)的ImmunoCult-XFTM T细胞扩增培养基中。在分离当天，将细胞用三重活化剂(ImmunoCultTM人类CD3/CD28/CD2T细胞活化剂)活化。
人类T细胞的冷冻和解冻。从健康人类供体抽取血液并且与ACDA抗凝剂组合。将pan T细胞阴性选择试剂盒(EasySep直接人类T细胞分离试剂盒)用来分离CD4+和CD8+T细胞两者。细胞用CS10冷冻保存和储存在液氮中。在解冻时，将细胞保持在补充人类重组IL2(Peprotech)的ImmunoCult-XFTM T细胞扩增培养基中。在解冻当天，将细胞用三重活化剂活化，在转染之后，用流式细胞术来产生用于研究的eGFP表达水平以及中位数荧光强度值。
实施例18
将核酸治疗剂(NAT)微流体混合入脂质粒子(LNP)
对全部这些实验使用N/P＝10，除非另有指出。在乙醇中制备脂质混合物组合物溶液：在乙醇中合并来自单独的脂质储备液的预定量的脂质(参见表3)。对于SPARKTM，使用37.5mM的脂质混合物溶液浓度，而对于/>Benchtop或IgniteTM，一般使用12.5mM的脂质混合物溶液。
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IL＝可离子化脂质；Tween80＝聚山梨酸酯80；BRIJTM L4＝聚氧乙烯(4)月桂基醚；BRIJTM S10＝聚氧乙烯(10)硬脂基醚；BRIJTM S20＝聚氧乙烯(20)硬脂基醚；BRIJTM S35＝聚氧乙烯(23)月桂基醚；TPGS 1000＝D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐/酯；脂质H＝等比的吐温20/聚山梨酸酯80/十三烷基-D-麦芽糖苷；稳定剂＝任何稳定剂，包括PEG-DMG或如上文说明书中对该类别所定义。
脂质混合物的组分包括可离子化脂质，结构脂质，胆固醇和稳定剂。可以使用低pH缓冲液(3-6)。对于可离子化的氨基脂质，缓冲剂pH一般低于脂质pKa。
SiRNA，信使RNA或质粒NAT制剂描述如下。对mRNA观察到的颗粒特性一般是50-200nm尺度，取决于脂质组合物。
将信使RNA或质粒NAT用乙酸钠缓冲剂稀释至所需浓度。然后制备脂质核酸颗粒样品：用Spark设备运行两种流体。简言之，按N/P比率(在示例的实施例中为4、6或10)所需将总体积3μL的10-20μg核酸/100mM乙酸钠缓冲剂与16μL的37.5mM脂质混合物溶液混合。在含水输出孔中，立即用48μL的无Ca和Mg的1X PBS(pH 7.4)将设备中制得的脂质核酸颗粒稀释。立即将这些核酸脂质颗粒收集入含有96μL的无Ca和Mg的1X PBS(pH 7.4)的微离心管中。包封效率通过修饰的RibogreenTM测试(Quanti-iT RiboGreenTMRNA测试试剂盒，Fisher)测量。对mRNA观察到的颗粒特性一般是60-200nm，取决于脂质组合物和制备方法。
为了测试，还通过更大的设备IgniteTM制备基于脂质的配制剂。简言之，将350μL mRNA用100mM乙酸钠缓冲剂稀释至0.2至0.3mg/mL的需要浓度。然后制备脂质颗粒样品：以流动比3:1和总流速12ml/分运行两种流体，即含水溶剂中的核酸和乙醇中的脂质混合物。在微流体装置中混合之后，将脂质核酸颗粒(LNAP)样品稀释入不含核糖核酸酶的管中，其含有3至40体积的磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲剂，pH 7.4。最终除去乙醇：在pH 7的PBS中透析，或于3000RPM使用AmiconTM离心过滤器(Millipore，USA)，或使用TFF系统。一旦实现需要的浓度，则用0.2μm过滤器在无菌条件下对脂质核酸颗粒进行滤器灭菌。最终包封效率通过RibogreenTM测试测量。
核酸试剂。将如下文描述的信使RNA或质粒核酸治疗剂(NAT)用乙酸钠缓冲剂稀释至需要的浓度。然后制备LNAP样品：用Spark设备运行两种流体。简言之，按N/P比率(在示例的实施例中为4、6、8或10)所需将总体积32μL的10-20μg核酸/100mM乙酸钠缓冲剂与16μL的37.5mM脂质混合物溶液混合。在含水输出孔中，立即用48μL的无Ca++和Mg++1X PBS(pH 7.4)将设备中制得的微流体混合的LNAP稀释。这些LNAP立即收集入微离心管，其含有96μL的相同pH 7.4缓冲剂。包封效率通过修饰的RibogreenTM测试(Quanti-iT RiboGreenTM RNA测试试剂盒，Fisher)测量。用该信息来建立所希望的剂量。
下述实验中使用的核酸治疗剂模型试剂是：
Trilink eGFP mRNA：Cat.L-7601(Trilink Biotechnologies，SanDiego，CA)；Trilink/>EPO mRNA：Cat.L-7209(Trilink Biotechnologies)；Millipore Sigma TagRFP Simplicon RNA试剂盒：Cat.SCR712(含有TagRFP RNA&B18RRNA两者)(Millipore Sigma加拿大，Oakville Ontario)；含EGFP报告子的CD19 CAR质粒购自Creative Biolabs(Shirley，NY)并且在pcDNA中含有T7启动子(Mut)-信号肽-scFv-CD8铰链跨膜-4-1BB-CD3zeta-T2A-eGFP报告子基因CAR盒(2353bp)。该定制CD19 CAR质粒DNA模板的总尺寸是7649-7661bp。
合成编码CD19 scFv-h(BB±-eGFP报告子基因盒的未修饰的CAR信使RNA(mRNA)转录物：在体外用野生型碱转录和用Trilink Biotechnologies Inc.的AG方法封端(封端1)。该未修饰的CAR mRNA转录物被酶促多腺苷酸化，随后进行DNA酶和磷酸酶处理。最终的mRNA转录物产品进行二氧化硅膜纯化和在1mM柠檬酸钠缓冲剂(pH 6.4)溶液中以浓度1mg/mL包装。该定制的CD19CAR质粒媒介和编码mRNA的CD19 CAR分别购自Creative Biolab和Trilink Biotechnologies Inc。
OVA抗原在疫苗研究中有用，原因是其已用作模型抗原来刺激免疫应答10。通常OVA抗原与敏化剂比如明矾一起使用，但是在OVA抗原以mRNA形式递送的情况下，假设的是不需要敏化剂比如明矾，并且mRNA本身能够通过免疫细胞产生对抗原的应答。使用OVA mRNA L-7610和/>OVA mRNA(5moU)L-7210。
质粒制备：用于该评价的是pCX-EGFP质粒，尺寸5514nt，由GenScript USA Inc，Piscataway，NJ定制，包括氨苄西林抗性，限制酶HINDIII，在ddH2O中。质粒包括GFP表达组分，其仅在质粒于细胞中表达时产生靶标蛋白。
实施例19
脂质比较数据显示eGFP mRNA LNP在初代人类T细胞中的活性
试剂获自Abcam，Cambridge，UK，除非另有说明。用eGFP SimpleStepTM Kit来展示体外mRNA递送和活性。测试按eGFP SimpleStep/>试剂盒方案的指导进行。简言之：将用阴性选择方案预先分离自新鲜人类全血的冷冻人类T细胞解冻和用三重活化剂活化。在活化后10天，以2μg mRNA每500,000细胞对T细胞给予编码eGFP的N/P 10mRNALNP。在用mRNA LNP处理48小时之后收获和裂解T细胞，获得总eGFP含量。
为了将经分离和活化的T细胞(第0天)暴露至配制的mRNA，将2ug CleanCapTM eGFP(Trilink Biotechnologies，San Diego，CA)含mRNA的LNP加至在1mL完整T细胞培养基中的500,000个T细胞，其含1ug/mL重组人ApoE4("ApoE")(Peprotech Inc.，Montreal，加拿大)。
阳性对照是标准脂质(DLin-MC3-DMA或"MC3"脂质数据)，使用Trio活化方案。
LNP基于早先的RibogreenTM测试结果计算。T细胞通过锥虫蓝(Sigma)排斥计数和稀释至500,000个细胞/mL。简言之，在12孔板中，将1mL等分试样加入各孔。加入ApoE，达到各孔中的最终浓度1ug/mL。基于在步骤1中的计算，加入需要量的mRNA LNP(第7天)，将板温育48h。
测试脂质混合物组合物诱导转染的能力，其度量为标记mRNA在T细胞中的中位数荧光强度(通过流式细胞术测量)。通过阴性选择方法选择新鲜分离自人类血液的初代人类T细胞，并用剂量2μg的mRNA每500,000细胞处理。
在40Mol％可离子化脂质、20Mol％结构脂质DSPC、37.5Mol％胆固醇和2.5Mol％BRIJTM S10的N/P比率10的组合物中比较可离子化脂质PNI 76，119，121和MC3。
对于各脂质的转染效率和表达的eGFP量分别示于表4第5和第6栏。图1显示在CT10组合物中含有PNI 76或PNI 121的LNP(N/P比率为10)相对可离子化脂质Dlin-MC3-DMA(MC3)的效能，并且在为了eGFP mRNA表达处理之后48小时通过流式细胞术分析基因表达。发现的是，PNI 76具有与MC3相等的转染效率，而PNI 121则大于MC3。
在有关实验中，用阴性选择方案从新鲜全血分离来自六个不同供体的初代人类T细胞并用三重活化剂活化，然后在活化后7天用mRNA LNP处理。在处理之后48小时通过流式细胞术分析基因表达并且结果示于图2。发现的是：在各种供体中，含有PNI 121的LNP的转染效率大于含有临床确证的MC3的那些。与未处理细胞(未显示)相比，T细胞的存活率未受其用PNI 121处理的影响。
另外，eGFP表达水平通过eGFP ELISA定量，如图3所示。将用阴性选择方案预先分离自新鲜人类全血的冷冻人类T细胞解冻和用三重活化剂活化。在活化后10天，以2μg mRNA每500,000细胞和N/P 10对T细胞给予编码eGFP的CT10 mRNA LNP，所述LNP包含DLin-MC3-DMA，PNI 76，PNI 119，PNI 120，PNI 121和PNI122。蛋白质表达在48小时之后通过eGFPELISA测量。发现的是，全部PNI新脂质介导了eGFP表达。最为显著地，由PNI 121介导的eGFP表达大于MC3。
在有关实验中，确定分离的预先低温贮藏的初代人类T细胞中的GFP表达，所述细胞在活化之后4天用500ng包封mRNA每125,000细胞通过mRNA-LNP处理，所述颗粒含有DLin-MC3-DMA，PNI 127，PNI 328，PNI 329或PNI 541，在CT10组合物中，N/P比率为8。在LNP加入之后48h通过流式细胞术测量GFP MFI(第一栏)，转染效率(中间栏)和存活率(第三栏)，如图4所示。
在LNP加入之后48小时流式细胞术测量GFP MFI。T细胞用阴性分离程序(EasySepTM人类T细胞分离试剂盒，Stemcell Technologies)分离自全血。在活化之后3天用500ng包封mRNA每125,000细胞对T细胞给予mRNA-LNP。LNP是CT10组合物，N/P为8。结果示于图5。在LNP加入之后48h，通过流式细胞术测量转染效率(上图)和MFI(下图)；与MC3相比，PNI 328、329和541显示更高水平的蛋白质表达(MFI)。
表4显示额外实验的定量结果，所述实验使用MC3，PNI 76，PNI 119和PNI 121eGFPmRNA LNPS，在CT10中，N/P 8。
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2通过TNS测试确定。
实施例20
红细胞生成素mRNA递送和表达
将IVD人类Epo ELISA双倍-抗体三明治测试用来展示体外mRNA递送和活性。试剂获自Quantikine，Minneapolis，MN。测试按/>ELISA人类红细胞生成素免疫测定方案。REF DEP00包装插页的指导进行。简言之，用阴性选择方案从新鲜全血分离原代人类T细胞和用三重活化剂活化。在活化后七天，向T细胞给予编码EPO的mRNA LNP，于2μg mRNA每500,000个细胞和N/P 10进行。使用/>人类血清对照。在用mRNA LNP处理48小时之后，收获和裂解T细胞，获得细胞溶质的EPO，并且对培养基上清液采样，获得分泌的EPO。结果示于图6，按mIU/mL计。表5包括图6数据以及PNI 76和121vs MC3的EPO倍数增加。发现的是由含PNI 121的LNP介导的EPO表达高于含有MC3的那些。
对C56BL/6小鼠给予i.v剂量0.5、1或3mg/Kg的重组人EPO-编码的mRNA LNP，所述颗粒含有可离子化脂质MC3，PNI 76，PNI121和PNI 127，使用LM02组合物，N/P为6；用ELISA人类红细胞生成素免疫测定方案测量hEPO蛋白质。0.5mg/Kg剂量的结果示于图7散点图。1和3mg/Kg剂量的结果示于图8的6h(左)和24h(右)hEPO表达水平散点图。
在又一研究中，给予包封在LM02 LNP中的5-moU EPO mRNA，其N/P比率为6和剂量为0.5mg/Kg，包含多样的15种可离子化脂质(PNI 336，PNI 534，PNI 535，PNI 342，PNI321，PNI 532，PNI 538，PNI 541，PNI 325，PNI 328，PNI 329，PNI 539，PNI 540，PNI 127)；用MC3作为对照。用Ella平台和生产商提供的rhEPO微流体筒测量hEPO蛋白质。结果示于图9，其中数种PNI化合物(PNI 328，329，539，540和127)与MC3比较良好。PNI-127，PNI-329，PNI 541和PNI-565在所产蛋白量方面比MC3更佳(比MC3更高的MFI)。
实施例21
脂质核酸颗粒或"LNP"表征和包封
在如上文的描述制备脂质颗粒之后，颗粒尺寸(颗粒的流体动力学直径)通过动态光散射(DLS)用ZetaSizerTM Nano ZSTM(Malvern设备，UK)确定。微调至633nm波长的He/Ne激光用作光源。数据测自散射强度数据，以反向散射检测模式进行(测量角＝173)。测量值是10次运行的平均值，每样品循环两次。Z-平均尺寸报告为颗粒尺寸，和定义为调和的强度平均颗粒直径。
在Spark和Benchtop上制备的包含式(I)化合物的脂质纳米颗粒(LNP)组合物的物理特征示于下表6和7。显示的是LNP的尺寸、尺寸变化(PDI)，包封效率，和pKa。从稳定性，生物分布和细胞膜跨越来说，这些LNP的物理特征是重要的。在全部配制剂中存在良好包封，多分散性(PDI)低于0.3。尺寸和PDI用动态光散射技术测量，而核酸包封效率从修饰的Quant-iT RiboGreen RNA测试计算。
表6：包含各种合成可离子化脂质的GFP-编码的LNP用微流体搅拌器制备。使用CT10组合物，N/P 8。
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表7.包含各种合成可离子化脂质的包封EPO mRNA的LNP用微流体搅拌器制备。在各情况下使用根据LM02的组合物，N/P 6。
实施例22
通过SimplexTM自动化ELISA进行hEPO/细胞因子测量
用自动化ELISA平台"ELLA"，使用SimplexTM抗体小组筒，分析用hEPO mRNA LNP处理的小鼠的血液。测量人类特异性EPO和小鼠特异性IL-5，IL-6，TNF-α和IFN-γ(来自Bio-techne的试剂)。简言之，将50μL样品试剂(稀释生物学样品，质量对照，或校准点样品)的等分试样加入各样品入口，并且将1mL洗涤缓冲剂加入筒上的相应入口。全部免疫测定操作(包括初始系统，流动样品和将它们分入通道中，样品温育，洗涤，再水化和流动二抗，洗涤，再水化和流动链霉抗生物素染料缀合物，温育，洗涤，扫描)都自动处理。提供各玻璃纳米反应器(GNR)值的粗信号水平(相对荧光单元，RFUs)，平均信号值，标准偏差，和方差系数(CV)。用生产商提供的校准方法，通过ELLA自动反拟合RFU值以产生每分析物/样品的分析物浓度。结果示于图10。
将IVD人类Epo ELISA双倍-抗体三明治测试用来展示体内mRNA递送和活性。试剂获自Quantikine，Minneapolis，MN。测试按/>ELISA人类红细胞生成素免疫测定方案REF DEP00包装插页上的指导进行。简言之，分析静脉内给药0.5、1或3mg/kg剂量EPO-编码的mRNA后6h和/或24小时的血清样品的EPO表达，表示为mIU/mL。向生产商提供的EPO抗体预涂层的96孔微量培养板加入标准品，适当稀释的血清和辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的兔抗-EPO多克隆抗体和TMB(四甲基联苯胺)作为底物，温育20分钟。将停止溶液(硫酸)加至孔，于450nm读板，计算EPO浓度。产生的颜色量直接与结合至EPO抗体的缀合物量成比例，其又直接与样本或标准中的EPO量成比例。将吸光度对所提供标准品的浓度作图产生标准曲线。/>人类血清对照(CEP01，CEP 03)用于内部对照。
实施例23
在分离的初代人类T细胞中由mRNA-LNP介导的CD19 CAR表达
在体外暴露之后测试含有MRNA的IL，CT10组合物，N/P为8。CAR媒介pcDNA3.1抗-CD19-h(BBΛ)-EGFP-2nd-CAR(T7 Mut)7661bp购自Creative BioLabs，NY，USA。
用阴性分离程序从全血分离T细胞，而T细胞活化和扩增如上文所述通过在ImmunoCultTM人类T细胞扩增培养基中的三重活化进行。如图11所示，在体外在转染的T细胞中对于PNI PNI 328，PNI329和PNI127 LNP的CD19 CAR表达大于PBS。
实施例24
OVA-编码的mRNA LNP经由肌内给药的体内递送
用具有组合物LM02b的LNP来包封OVA抗原编码的OVA WT mRNA[TriLinkL7610]或/>OVA5-moU mRNA[TriLink L7210]。用/>IgniteTM微流体搅拌器将可离子化脂质，DOPE，胆固醇和PEG-DMG2000全部在乙醇中的脂质混合物与OVA mRNA的低PH缓冲溶液混合，N/P比率为8。LNP用AmiconTM超过滤技术过滤，表征尺寸、PDI和包封效率。尺寸和PDI用动态光散射技术测量，而核酸包封效率从Quant-iT RiboGreenRNA测试计算。这些OVA mRNA-LNP的流体动力学直径是～83nm，多分散性指数是～0.1和包封效率是～97％。
全部动物根据Institutional Animal Care and Use Committee道德方案处理。为了实验，6-8周龄C57BL/6小鼠(n＝4)购自Envigo。在第1和10天，用50μL OVA LNP对小鼠经肌肉内免疫。各小鼠接种一剂在LNP中包封的5μg OVA mRNA。一剂50μg OVA抗原用作阳性对照。在确定的时间间隔，经由隐静脉采血技术收集110-130μL血液，并处理为血清。在第二次免疫后2周，将动物安乐死，经由心脏穿刺收集血液。将血液样品立即处理为血清和在-80摄氏度储存。将血清样品的等分试样解冻并以适当稀释用标准ELISA技术分析OVA表达和IgG度量。
对于血清制备：在收集全血之后，让血液在室温下凝块15-30分钟。于4摄氏度将管于1000-2000xg离心10分钟除去凝块。仔细除去上清液和转移至冰上的无菌的螺帽透明聚丙烯管。
血清样品的OVA ELISA：在接种后于6h经由隐静脉采血收集小鼠血清。用标准三明治ELISA用卵清蛋白(OVA)-ELISA试剂盒abx150365(Abbexa Biologics，Inc.，Arlingtom，TX，USA)组分和根据生产商推荐测量OVA抗原。简言之，向抗体预涂覆的96孔AbrexxaTM微量培养板，将标准、适当稀释的血清、和生物素缀合的试剂加入孔中并且温育1h。加入辣根过氧化物酶(HRP)-缀合试剂并且温育20分钟。将停止溶液加入各孔，用读板器测量于450nm的吸光度，从其计算OVA蛋白质的浓度。
血清样品的抗OVA-IgG ELISA：在第二次免疫后于2周从免疫的小鼠收集血清。作为对各种LNP中的OVA-编码的mRNA的应答，IgG的OVA-特异性产生通过ELISA如上文所述测量。简言之，以2μg蛋白质每孔的浓度为96孔ELISA板预涂覆OVA蛋白，在100mM碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)中于4摄氏度过夜进行。预涂层的板然后用10％FBS(BSA)/7.4缓冲的PBS-吐温-20TM(0.05％)v/v阻断和于37摄氏度温育2h。将血清样品和免疫球蛋白标准品在1％BSA-PBS中适当地稀释(从1:8至1:1000)并且加入96孔板且在RT温育2h。(HRP)-缀合的山羊抗-小鼠IgG(cat#7076，Cell Signaling)以在PBS-吐温-10％FBS中的1:5,000稀释用于标记，温育1h。在温育时间段之后，将辣根过氧化物酶底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺-TMB)加入。在温育30分钟之后，加入2N硫酸的停止溶液和用读板器来确定于450nm的吸光度。PNI ID 325和539的结果示于图12。PNI 127的结果示于图13。
参见表7以及附图，PNI 121、PNI 127、PNI 328、PNI 329和PNI 540在体内蛋白质表达方面与MC3相当。在人类T细胞中的蛋白质表达中，PNI 121、PNI 127、PNI 328、PNI 329和PNI 541在产生的蛋白量方面比MC3更佳(MFIs比MC3更高)。
包含PNI 127、PNI 325、PNI 539的OVA抗原负载的LNP显示有效地引起类似OVA抗原的免疫应答，这显示PNI脂质对于疫苗应用的效用。
表8：各种合成脂质的pKa值和活性得分
实施例25
pKa研究
研究的是，在用不同可离子化脂质获得的LNP中，在LNP转染之后由表面pKa产生的对转基因表达的效果。
各阳离子脂质的pKa在脂质纳米颗粒中用基于6-(对-甲苯氨基)-2-萘磺酸钠盐(TNS，Sigma Aldrich)荧光的测试来确定，该盐是蛋白质构象状态的荧光探针5。用SparkTM在蒸馏水中以浓度3.125mM总脂质配制包含在LM02组合物中的可离子化脂质的空脂质纳米颗粒，然后在低体积池中用1X PBS的30X稀释在ZetasizerTM上表征LNP品质。脂质纳米颗粒用蒸馏水进一步稀释4x至0.781mM总脂质。TNS制备为蒸馏水中的25μM储备溶液。然后将0.781mM总脂质的6.4μL稀释LNP样品与10μL稀释TNS混合，达到最终体积250μL，使用的缓冲剂含有10mM HEPES、10mM MES、10mM NH4OAc和130mM NaCl，其pH范围是以0.5pH增量从3到9。各孔具有的最终浓度是20μM总脂质，1μM TNS和233.4μL缓冲溶液(补足总体积250μL)。
彻底混合样品，在室温下在BioTekTM SynergyTM H1混合多模式单色器TM荧光微读板器中分别用321nm和445nm的激发和发射波长测量荧光强度。用GraphPad PrismTM软件对荧光数据进行S形最佳拟合分析，pKa测量为半数最大荧光强度处的pH。
结果示于图14，其说明LNP的表面pKa度量，所示颗粒掺入可离子化脂质化合物PNI119，PNI 121，PNI 321，PNI 329，PNI 336，PNI 535，PNI 538和PNI 540(LM02组合物)。发现具有较低pKa值的脂质在T细胞中的转基因表达中无活性。发现具有高pKa值的脂质对T细胞有毒性。发现pKa范围5.5-6.9的脂质有促进T细胞中的转基因表达的活性。
实施例26
质粒包封
使用pCX-EGFP质粒，尺寸5514nt，通过GenScript USA Inc，Piscataway，NJ定制。脂质颗粒制备如上文描述。用 IgniteTM系统测试PNI可离子化脂质PNI 121，PNI 127，PNI 328，PNI 329和PNI 541包封适于哺乳动物表达(如上文)的质粒的能力，使用LM02组合物，N/P为6。测试的全部脂质产生了可接受的LNP，其平均流体动力学直径为110nm，PDI为0.2，包封效率大于80％。
虽然上文已描述优选实施方式且在附图中举例说明，对本领域技术人员明显的是可以进行修饰而不背离本公开。所述修饰视为本公开范围所包含的可能变型。
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Claims (46)

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐
其中p是0或1；
E1选自-O-δ1，-OC(O)O-δ1，-OC(O)-δ1，-OC(O)N(Q)-δ1，-OC(O)S-δ1，-C(O)N(Q)-δ1，-C(O)O-δ1，-N(Q)C(O)-δ1，-N(Q)C(O)O-δ1，-N(Q)C(O)S-δ1，和-N(Q)C(O)N(Q)-δ1；Q是H或C1-C5烷基；δ1指定连接至R1基团的键；
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基，C2-C6烯基，和C2-C6炔基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有氧(O)或多至2个氮(N)的4-6元环，所述取代基各自独立地选自C1-C6烷基，环丙基，OH，和C1-C3烷氧基；
R5选自C1-C6烷基，C2-C6烯基，C2-C6炔基，C3-C6环烷基，和2-羟基乙基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3，4或5；
b和c独立地是0，1或2；
c’是1，2，3，4或5；
d是1或2；
e是0，1或2；
E2选自-OC(O)-δ2，-OC(O)O-δ2，-OC(O)N(Q)-δ2，-O-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；Q是H或C1-C5烷基；δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自独立地是直连键，-O-δ3，-CH2OC(O)-δ3，和-CH2O-δ3；δ3指定连接至R7和R8基团的键；
R7和R8各自独立地是C4-C10烷基，C4-C10烯基或C4-C10炔基；
f是0，1，2，3，4或5；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1，2或3。
2.式(II)化合物或其药学上可接受的盐
其中E1选自-OC(O)O-δ1，-OC(O)-δ1，-OC(O)N(Q)-δ1，和-OC(O)S-δ1；Q是H或C1-C5烷基；和δ1指定连接至R1基团的键；
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有多至2个氮(N)的5-6元环，所述取代基选自C1-C6烷基；
R5选自C1-C6烷基和C3-C6环烷基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3或4；
b和c独立地是0，1或2；
c’是2，3或4；
d是2；
e是0或1；
E2选自-O-δ2，-OC(O)-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；其中δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自独立地是直连键，-O-δ3，-CH2OC(O)-δ3，和-CH2O-δ3；δ3指定连接至R7和R8基团的键；
R7和R8各自独立地是C4-C10烷基，C4-C10烯基或C4-C10炔基；
f是0，1，2，3，4或5；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1或2。
3.式(II)化合物或其药学上可接受的盐
其中E1选自-OC(O)O-δ1，-OC(O)-δ1，-OC(O)N(Q)-δ1，和-OC(O)S-δ1；Q是H或C1-C5烷基；和δ1指定连接至R1基团的键；
R1选自：其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有多至2个氮(N)的5-6元环，所述取代基选自C1-C6烷基；
R5选自C1-C6烷基和环丙基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3或4；
b是0或1；
c是0，1或2；
c’是2，3或4；
d是2；
e是1；
E2选自-O-δ2，-OC(O)-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；其中δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自是直连键；
R7和R8各自独立地选自C4-C10烷基；
f是0或1；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1或2。
4.式(III)化合物或其药学上可接受的盐
R1选自：
其中：
R3和R4各自独立地选自C1-C6烷基；另选地，R3和R4可以联接以形成任选用1-2个取代基取代的含有多至2个氮(N)的5-6元环，所述取代基选自C1-C6烷基；
R5选自C1-C6烷基和环丙基；
R6选自H和C1-C6烷基；
a是1，2，3或4；
b是0或1；
c是0，1或2；
c’是2，3或4；
d是2；
e是1；
E2选自-O-δ2，-OC(O)-δ2，-OCH2CH2O-δ2，和-OC(O)(CH2)6C(O)O-δ2；其中δ2指定连接至R2基团的键；
R2选自或具有式-(CH2)g-[L3-(CH2)]h-R9，其中：
L1和L2各自是直连键；
R7和R8各自独立地选自C4-C10烷基；
f是0或1；
L3选自
R9选自H和C4-C8烷基；
g是范围1-18的整数；
h是0，1或2。
5.根据权利要求1、2、3或4的化合物或药学上可接受的盐，其中R1是下述之一：
6.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中各R2独立地是：
7.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中E1选自：
其中δ1指定连接至R1基团的键。
8.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中E2选自：
其中δ2指定连接至R2基团的键，或其药学上可接受的盐。
9.根据下述结构中任一种的化合物：
或其药学上可接受的盐。
10.根据下述结构中任一种的化合物：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
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或其药学上可接受的盐。
11.脂质混合物组合物，包含权利要求1-10中任一项的化合物和与之组合的结构脂质、固醇和稳定剂以及至少一种治疗剂。
12.权利要求11的脂质混合物组合物，其中结构脂质包含一种或多种选自DSPC，DSPE，DPPC，DMPC，DOPC，POPC，DOPE和SM的结构脂质。
13.权利要求11的脂质混合物组合物，其中结构脂质是DSPC。
14.权利要求11的脂质混合物组合物，其中结构脂质是DOPE。
15.权利要求11的脂质混合物组合物，其中稳定剂包含一种或多种表面活性剂和聚合物缀合的脂质。
16.权利要求11的脂质混合物组合物，其中化合物以10Mol％-90Mol％存在，结构脂质以0-50Mol％存在，固醇以0-45Mol％存在，和稳定剂以0-10Mol％存在；并且各组分总mol％加合为100mol％。
17.权利要求16的脂质混合物组合物，其中化合物以40Mol％-60Mol％存在，和结构脂质以11-40Mol％存在；并且各组分总mol％加合为100mol％。
18.权利要求16的脂质混合物组合物，其中化合物与其余组分的摩尔比是30Mol％至70Mol％。
19.权利要求16的脂质混合物组合物，还包含靶向部分。
20.权利要求11的脂质混合物组合物，其中固醇是胆固醇。
21.权利要求11的脂质混合物组合物，其中治疗剂包含一种或多种核酸。
22.权利要求11的脂质混合物组合物，其中治疗剂包含多肽。
23.权利要求11的脂质混合物组合物，其中稳定剂选自PEG-DMG 2000，聚氧乙烯(10)硬脂基醚，聚氧乙烯(40)硬脂酸盐/酯，聚山梨酸酯80，聚氧乙烯(4)月桂基醚，聚氧乙烯(20)硬脂基醚，聚氧乙烯(23)月桂基醚，和D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐/酯。
24.根据权利要求11的脂质混合物组合物，其中所述组合物呈脂质颗粒形式。
25.权利要求1-10中任一项的化合物用来制备治疗剂的用途，用于将治疗剂给予离体细胞。
26.权利要求25的用途，用于蛋白质调节。
27.权利要求1-10中任一项的化合物用于制备药物配制剂的用途，所述药物配制剂用于癌症治疗中。
28.权利要求1-10中任一项的化合物用于制备药物配制剂的用途，所述药物配制剂用于T细胞修饰。
29.权利要求1-10中任一项的化合物在制备疫苗中的用途。
30.权利要求28的化合物的用途，其中治疗剂还包含核酸治疗剂。
31.权利要求30的用途，其中核酸治疗剂是mRNA，siRNA，miRNA，指导RNA，人工染色体，环状或线状DNA，肽或msDNA。
32.权利要求30的用途，其中核酸治疗剂是合成的指导RNA或DNA微环。
33.权利要求31的用途，其中mRNA是自复制RNA分子。
34.权利要求11-24中任一项的脂质混合物组合物用于制备疫苗的用途。
35.权利要求34的用途，其中疫苗涉及预防病毒病。
36.权利要求35的用途，其中疫苗涉及对抗冠状病毒感染。
37.权利要求11-24中任一项的脂质混合物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于调节人类T细胞；CAR-T，TCR，基因编辑或同种异体T细胞。
38.权利要求11-24中任一项的脂质混合物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于调节T细胞，其中所述T细胞分离自患者，或者已对T细胞或同种异体T细胞特别工程改造的T细胞。
39.权利要求29-38中任一项的用途，其中脂质混合物组合物还包含多肽。
40.权利要求29-38中任一项的用途，其中脂质混合物组合物还包含核糖核蛋白。
41.权利要求1-4和6-10中任一项的化合物，其中各氢之一用卤素取代。
42.权利要求41的化合物，其中卤素是碘或氟。
43.药物组合物，包含权利要求1-10中任一项的化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
44.权利要求11-13和15-24中任一项的脂质混合物组合物，其中所述结构脂质是DSPC，所述固醇是胆固醇，所述稳定剂是Brij10，并且其中化合物以40Mol％存在，DSPC以20Mol％存在，胆固醇以37.5Mol％存在，和Brij 10以2.5Mol％存在。
45.权利要求11-13和15-24中任一项的脂质混合物组合物，其中所述结构脂质是DSPC，所述固醇是胆固醇，所述稳定剂是PEG-DMG 2000，并且其中化合物以40至47.5Mol％存在，DSPC以12.5Mol％存在，胆固醇以38.5至46Mol％存在，和PEG-DMG 2000以1.5Mol％存在。
46.权利要求11-12和14-24中任一项的脂质混合物组合物，其中所述结构脂质是DOPE，所述固醇是胆固醇，所述稳定剂是PEG-DMG 2000，并且其中化合物以40至47.5Mol％存在，DOPE以12.5Mol％存在，胆固醇以38.5至46Mol％存在，和PEG-DMG 2000以1.5Mol％存在。
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