CN110003030A - 三烷基阳离子脂质及其使用方法 - Google Patents

三烷基阳离子脂质及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110003030A
CN110003030A CN201910048388.5A CN201910048388A CN110003030A CN 110003030 A CN110003030 A CN 110003030A CN 201910048388 A CN201910048388 A CN 201910048388A CN 110003030 A CN110003030 A CN 110003030A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lipid
sirna
nucleotide
nucleic acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910048388.5A
Other languages
English (en)
Inventor
詹姆斯·海斯
马克·伍德
阿兰·马丁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wild Strawberry Bio Pharmaceutical Co
Protiva Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Wild Strawberry Bio Pharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wild Strawberry Bio Pharmaceutical Co filed Critical Wild Strawberry Bio Pharmaceutical Co
Publication of CN110003030A publication Critical patent/CN110003030A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/20—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/02—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C217/04—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C217/06—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one etherified hydroxy group and one amino group bound to the carbon skeleton, which is not further substituted
    • C07C217/08—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one etherified hydroxy group and one amino group bound to the carbon skeleton, which is not further substituted the oxygen atom of the etherified hydroxy group being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/02—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C217/46—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having etherified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/06—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the hydroxy groups esterified by carboxylic acids having the esterifying carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/20—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/02—Systems containing only non-condensed rings with a three-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供用于将治疗剂递送至细胞的组合物和方法。具体地说，这些包括新型三烷基阳离子脂质和提供有效包囊核酸并在体内将所述包囊的核酸有效递送至细胞的核酸‑脂质颗粒。本发明的组合物为高度有效的，因此允许以相对低的剂量有效敲除特异性靶蛋白。

Description

三烷基阳离子脂质及其使用方法
本申请是申请日为2013年2月22日、发明名称为“三烷基阳离子脂质及其使用方法”的中国专利申请No.201380020104.2的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月24日提交的美国临时申请61/602,990的权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
I.发明领域
本发明涉及新型三烷基阳离子脂质、包含一种或多种三烷基阳离子脂质的脂质颗粒、制造脂质颗粒的方法以及递送和/或施用脂质颗粒(例如，用于治疗哺乳动物体内的疾病)的方法。
II.相关技术描述
治疗性核酸包括例如小的干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒以及免疫刺激性核酸。这些核酸经由各种机理发挥作用。在干扰RNA分子如siRNA和miRNA的情况下，这些核酸可以通过称为RNA干扰(RNAi)的方法下调特异性蛋白的细胞内水平。在将干扰RNA引入到细胞质之后，这些双链RNA构建体可以与称为RISC的蛋白质结合。将干扰RNA的有义链从RISC复合体中置换出来，从而在RISC内提供可以识别并且结合具有与结合的干扰RNA序列互补的序列的mRNA的模板。结合互补mRNA，RISC复合体裂解mRNA并且释放裂解的链。RNAi可以通过靶向编码用于蛋白质合成的相应mRNA的特异性破坏来提供特异性蛋白的下调。
RNAi的治疗应用极其宽泛，因为可以用针对靶蛋白的任何核苷酸序列合成干扰RNA构建体。迄今为止，siRNA构建体在体外模型和体内模型中均已示出特异性下调靶蛋白的能力。另外，siRNA构建体目前在临床研究中被评价。
然而，干扰RNA构建体目前面临的两个问题为：第一，它们对血浆中的核酸酶消化的易感性和第二，它们获得进入细胞内区室的受限制的能力，在所述细胞内区室中，当呈自由干扰RNA分子系统施用时它们可以结合RISC。这些双链构建体可以通过在分子内掺入化学修饰的核苷酸接头例如硫代磷酸酯(phosphothioate)基团来稳定。然而，此类化学修饰的接头仅提供不受核酸酶消化的受限制的保护并且可降低构建体的活性。可以通过使用载体系统如聚合物、阳离子脂质体或通过将胆固醇部分共价附接至分子有利于干扰RNA的细胞内递送。然而，改进的递送系统需要增加干扰RNA分子如siRNA和miRNA的效力并且减少或消除对化学修饰的核苷酸接头的需要。
另外，在治疗性核酸如干扰RNA穿过细胞膜的受限制的能力方面仍存在问题(参见，Vlassov等,Biochim.Biophys.Acta,1197:95-1082(1994))并且在与系统毒性相关的问题中仍存在问题，如补体介导的过敏反应、凝血性质改变以及血细胞减少(Galbraith等,Antisense Nucl.Acid Drug Des.,4:201-206(1994))。
为了试图改进功效，调查研究者还采用基于脂质的载体系统来递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。Zelphati等(J.Contr.Rel.,41:99-119(1996))描述了使用阴离子(常规)脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体、融合脂质体以及阳离子脂质/反义聚集物。类似地，已以阳离子脂质体形式系统施用siRNA，并且已报道这些核酸-脂质颗粒在哺乳动物包括非人灵长类动物体内提供靶蛋白的改进的下调(Zimmermann等,Nature,441:111-114(2006))。
尽管有此进步，本领域仍存在对适用于一般治疗使用的改进的脂质-治疗性核酸组合物的需要。优选地，这些组合物将高效率地包囊核酸，具有高药物:脂质比，保护包囊的核酸免于在血清中降解和清除，适用于系统递送并且提供包囊的核酸的细胞内递送。另外，这些核酸-脂质颗粒应该是耐受良好的并且提供合适的治疗指数，使得在有效剂量的核酸下的患者治疗与对患者的显著毒性和/或危险毫不相关。
发明简述
本发明提供了新型三烷基阳离子(氨基)脂质和有利于核酸的体内递送的包含这些脂质的脂质颗粒、以及适用于体内治疗使用的核酸-脂质颗粒组合物。本发明还提供了制造这些组合物的方法以及使用这些组合物将核酸引入到细胞中例如用于治疗各种疾病病状的方法。本发明还包括本文公开的所有新型化合物和中间体。
如在本文实施例2中所描述，在鼠ApoB siRNA测定中，本发明的三烷基阳离子脂质比其它具有更长烷基链的相同脂质更有效。
一方面，本发明提供了一种具有结构式(I)的阳离子脂质：
X-A-Y-Z；
(I)
或其盐，例如药学上可接受的盐，其中：
X为烷基氨基；
A为C1至C6任选取代的烷基，其中所述C1至C6任选取代的烷基可为饱和或不饱和的，并且其中A可能存在或可能不存在；
Y选自由以下组成的组：缩酮、酯、任选取代的氨基甲酸酯、醚以及任选取代的酰胺；并且
Z为由三个烷基链组成的疏水部分，其中烷基链中的每一个的长度均为C8至C11，其中三个烷基链中的每一个均可为饱和或不饱和的，并且其中三个烷基链中的每一个均为任选取代的。
相对于式(I)的脂质，烷基氨基的代表性实例包括二甲基氨基、二乙基氨基以及乙基甲基氨基。
再相对于式(I)的脂质，存在于氨基甲酸酯和/或酰胺基团上的任选取代基的代表性实例为饱和或不饱和的烷基(例如，C1-C6烷基)。
再相对于式(I)的脂质，可以存在于疏水部分Z的三个烷基链中的一个或多个上的任选取代基的代表性实例为羟基。
再相对于式(I)的脂质，将理解在疏水部分Z的烷基链含有一个或多个双键或三键时，则所述烷基链称为不饱和的。
再相对于式(I)的脂质，为了避免怀疑将理解疏水部分Z的一个或多个烷基链可以包括环烷基(例如，环丙基)。
再相对于式(I)的脂质，将理解术语“酯”包括具有结构-C(＝O)O-或-OC(＝O)-的酯。术语“酰胺”包括具有结构-C(＝O)NR-或-NR(＝O)C-的酰胺。术语“氨基甲酸酯”包括具有结构-OC(＝O)NR-或-NRC(＝O)O-的氨基甲酸酯。
式(I)的脂质例如有用于制造本发明的脂质颗粒，所述脂质颗粒例如有用于向有需要的哺乳动物(例如，人类)递送治疗剂(例如生物活性的核酸分子，如siRNA)。
在式(I)的脂质的一些实施方案中，Z具有下式：
其中，R1、R2和R3各自独立地选自由C8至C11烷基组成的组，其中R1、R2和R3中的每一个均可独立地为饱和或不饱和的，并且其中R1、R2和R3中的每一个均为任选取代的。
在其它方面，本发明提供了一种包含具有式I的一种或多种上述阳离子脂质或其盐例如药学上可接受的盐的脂质颗粒。在某些实施方案中，脂质颗粒进一步包含一种或多种非阳离子脂质，如中性脂质。在某些其它实施方案中，脂质颗粒进一步包含一种或多种能够减少或抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在另外的实施方案中，脂质颗粒进一步包含一种或多种活性剂或治疗剂。
在某些实施方案中，脂质颗粒的非阳离子脂质组分可以包含磷脂、胆固醇(或胆固醇衍生物)或其混合物。在一个具体实施方案中，磷脂包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其混合物。在一些实施方案中，脂质颗粒的缀合的脂质组分包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。在某些例子中，PEG-脂质缀合物包含PEG-二酰甘油(PEG-DAG)缀合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物或其混合物。在其它实施方案中，脂质缀合物包含聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物如POZ-DAA缀合物。
在一些实施方案中，活性剂或治疗剂包含核酸。在某些例子中，核酸包含干扰RNA分子，例如像siRNA、aiRNA、miRNA、切酶-底物dsRNA、shRNA或其混合物。在某些其它例子中，核酸包含单链或双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交体例如像反义寡核苷酸、核酶、质粒、免疫刺激性寡核苷酸或其混合物。
在其它实施方案中，活性剂或治疗剂被完全包囊在脂质颗粒的脂质部分内，使得脂质颗粒中的活性剂或治疗剂在水溶液中对例如由核酸酶或蛋白酶引起的酶促降解有抗性。在另外的实施方案中，脂质颗粒对哺乳动物如人基本无毒。
在某些实施方案中，本发明提供了脂质颗粒(例如，LNP)，其包含：(a)一种或多种核酸如干扰RNA分子；(b)一种或多种式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)一种或多种非阳离子脂质；以及(d)一种或多种抑制颗粒聚集的缀合的脂质。
在一些实施方案中，本发明提供了脂质颗粒(例如，LNP)，其包含：(a)一种或多种核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约50mol％至约85mol％的一种或多种式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约13mol％至约49.5mol％的一种或多种非阳离子脂质；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约0.5mol％至约2mol％的一种或多种抑制颗粒聚集的缀合的脂质。
在此实施方案的一个方面中，脂质颗粒(例如，LNP)包含：(a)核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约52mol％至约62mol％的式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约36mol％至约47mol％的磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约1mol％至约2mol％的PEG-脂质缀合物。核酸-脂质颗粒的这个实施方案在本文中通常称为“1:57”制剂。在一个具体实施方案中，1:57制剂为四组分系统，其包含约1.4mol％PEG-脂质缀合物(例如，PEG2000-C-DMA)、约57.1mol％式I的阳离子脂质或其盐、约7.1mol％DPPC(或DSPC)以及约34.3mol％胆固醇(或其衍生物)。
在此实施方案的另一个方面中，脂质颗粒(例如，LNP)包含：(a)核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约56.5mol％至约66.5mol％的式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约31.5mol％至约42.5mol％的胆固醇或其衍生物；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约1mol％至约2mol％的PEG-脂质缀合物。核酸-脂质颗粒的这个实施方案在本文中通常称为“1:62”制剂。在一个具体实施方案中，1:62制剂为三组分系统，其不含磷脂并且包含约1.5mol％PEG-脂质缀合物(例如，PEG2000-C-DMA)、约61.5mol％式I的阳离子脂质或其盐以及约36.9mol％胆固醇(或其衍生物)。
关于1:57和1:62制剂的另外实施方案描述于PCT公布号WO 09/127060中，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在其它实施方案中，本发明提供了脂质颗粒(例如，LNP)，其包含：(a)一种或多种核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约2mol％至约50mol％的一种或多种式I或II的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约90mol％的一种或多种非阳离子脂质；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约0.5mol％至约20mol％的一种或多种抑制颗粒聚集的缀合的脂质。
在此实施方案的一个方面中，脂质颗粒(例如，LNP)包含：(a)核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约30mol％至约50mol％的式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约47mol％至约69mol％的磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约1mol％至约3mol％的PEG-脂质缀合物。脂质颗粒的这个实施方案在本文中通常称为“2:40”制剂。在一个具体实施方案中，2:40制剂为四组分系统，其包含约2mol％PEG-脂质缀合物(例如，PEG2000-C-DMA)、约40mol％式I的阳离子脂质或其盐、约10mol％DPPC(或DSPC)以及约48mol％胆固醇(或其衍生物)。
在另外的实施方案中，本发明提供了核酸-脂质颗粒(例如，LNP)，其包含：(a)一种或多种核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约50mol％至约65mol％的一种或多种式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约25mol％至约45mol％的一种或多种非阳离子脂质；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％的一种或多种抑制颗粒聚集的缀合的脂质。
在此实施方案的一个方面中，核酸-脂质颗粒包含：(a)核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约50mol％至约60mol％的式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约35mol％至约45mol％的磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％的PEG-脂质缀合物。核酸-脂质颗粒的这个实施方案在本文中通常称为“7:54”制剂。在某些例子中，7:54制剂中的非阳离子脂质包含：(i)占存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％的磷脂；以及(ii)占存在于颗粒中的总脂质的约25mol％至约35mol％的胆固醇或其衍生物。在一个具体实施方案中，7:54制剂为四组分系统，其包含约7mol％PEG-脂质缀合物(例如，PEG750-C-DMA)、约54mol％式I的阳离子脂质或其盐、约7mol％DPPC(或DSPC)以及约32mol％胆固醇(或其衍生物)。
在此实施方案的另一个方面中，核酸-脂质颗粒包含：(a)核酸；(b)构成存在于颗粒中的总脂质的约55mol％至约65mol％的式I的阳离子脂质或其盐，例如药学上可接受的盐；(c)构成存在于颗粒中的总脂质的约30mol％至约40mol％的胆固醇或其衍生物；以及(d)构成存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％的PEG-脂质缀合物。核酸-脂质颗粒的这个实施方案在本文中通常称为“7:58”制剂。在一个具体实施方案中，7:58制剂为三组分系统，其不含磷脂并且包含约7mol％PEG-脂质缀合物(例如，PEG750-C-DMA)、约58mol％式I的阳离子脂质或其盐以及约35mol％胆固醇(或其衍生物)。
关于7:54和7:58制剂的另外实施方案描述于2010年6月30日提交的美国公布专利申请号US2011/0076335中，所述专利申请的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本发明还提供了包含脂质颗粒如核酸-脂质颗粒(例如，LNP)和药学上可接受的载体的药物组合物。
另一方面，本发明提供了用于将一种或多种治疗剂如核酸引入到细胞中的方法，所述方法包括使细胞与本文描述的脂质颗粒(例如，LNP)接触。在一个实施方案中，细胞处于哺乳动物中并且哺乳动物为人。
在又一方面中，本发明提供了用于体内递送一种或多种治疗剂如核酸的方法，所述方法包括向哺乳动物施用本文描述的脂质颗粒(例如，LNP)。在某些实施方案中，脂质颗粒(例如，LNP)通过以下施用途径之一施用：口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、病灶内、气管内、皮下以及皮内。在具体实施方案中，脂质颗粒(例如，LNP)例如经由肠内或肠胃外施用途径系统施用。在优选的实施方案中，哺乳动物为人。
在其它方面，本发明提供了用于治疗有需要的哺乳动物体内的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含一种或多种治疗剂如核酸的脂质颗粒(例如，LNP)。疾病或病症的非限制性实例包括病毒感染、肝脏疾病或病症以及癌症。优选地，哺乳动物为人。
在某些实施方案中，本发明提供了用于通过单独地或与降脂剂组合以核酸-脂质颗粒(例如，LNP)的形式施用核酸如干扰RNA(例如，siRNA)来治疗肝脏疾病或病症的方法。脂质疾病和病症的实例包括但不限于：血脂障碍(例如高血脂症，像甘油三酯水平升高(高甘油三酯血症)和/或胆固醇水平升高(高胆固醇血症))、动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病(CVD)、脂肪肝疾病(肝脂肪变性)、脂质代谢异常、胆固醇代谢异常、糖尿病(包括2型糖尿病)、肥胖症、心血管疾病以及其它关于代谢异常的病症。降脂剂的非限制性实例包括他汀类药物、贝特类药物、依泽替米贝(ezetimibe)、噻唑烷二酮、烟酸、β-阻断剂、硝化甘油、钙拮抗剂以及鱼油。
在一个具体实施方案中，本发明提供了一种用于降低或减小有需要(例如，具有升高的血液胆固醇水平的哺乳动物)的哺乳动物(例如，人)体内的胆固醇水平的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文描述的核酸-脂质颗粒(例如，LNP制剂)，所述核酸-脂质颗粒包含一种或多种靶向与代谢疾病和病症相关的一个或多个基因的干扰RNA(例如，siRNA)。在另一个具体实施方案中，本发明提供了一种用于降低或减小有需要(例如，具有升高的甘油三酯水平的哺乳动物)的哺乳动物(例如，人)体内的甘油三酯水平的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的本文描述的核酸-脂质颗粒(例如，LNP制剂)，所述核酸-脂质颗粒包含一种或多种靶向与代谢疾病和病症相关的一个或多个基因的干扰RNA(例如，siRNA)。这些方法可以使用标准组织培养技术在体外进行或通过使用本领域中已知的任何方式施用干扰RNA(例如，siRNA)在体内进行。在优选的实施方案中，将干扰RNA(例如，siRNA)递送至哺乳动物如人体内的肝脏细胞(例如，肝细胞)中。
关于使用脂质颗粒治疗肝脏疾病或病症的另外实施方案描述于例如2010年1月26日提交的PCT申请号PCT/CA2010/000120和美国专利申请公布号2006/0134189中，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在其它实施方案中，本发明提供了用于通过单独地或与化学治疗药物组合以核酸-脂质颗粒(例如，LNP)的形式施用核酸如干扰RNA(例如，siRNA)来治疗细胞增殖病症如癌症的方法。所述方法可以使用标准组织培养技术在体外进行或通过使用本领域中已知的任何方式施用干扰RNA(例如，siRNA)在体内进行。在优选的实施方案中，单独地或与化学治疗药物组合，将干扰RNA(例如，siRNA)递送至哺乳动物如人体内的癌细胞中。核酸-脂质颗粒和/或化学治疗药物还可以与常规激素剂、免疫治疗剂和/或放射治疗剂共同施用。
关于使用脂质颗粒治疗细胞增殖病症的另外实施方案描述于例如PCT公布号WO09/082817、美国专利申请公布号2009/0149403以及PCT公布号WO 09/129319中，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在另外实施方案中，本发明提供了用于通过单独地以核酸-脂质颗粒(例如，LNP)的形式施用核酸如干扰RNA(例如，siRNA)或与施用用来治疗或改善病毒病状或与此相关的任何症状的常规药剂组合来预防或治疗引起出血热的病毒感染如沙粒病毒(例如，拉沙病毒)或丝状病毒(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒等)感染或引起急性或慢性肝炎的肝炎(例如，丙型肝炎病毒)感染的方法。所述方法可以使用标准组织培养技术在体外进行或通过使用本领域中已知的任何方式施用干扰RNA在体内进行。在某些实施方案中，将干扰RNA(例如，siRNA)递送至感染和/或易感染出血热病毒的哺乳动物如人的细胞、组织或器官中，例如像网状内皮系统的细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞等)。在某些其它实施方案中，将干扰RNA(例如，siRNA)递送至感染和/或易感染肝炎病毒的哺乳动物如人的细胞、组织或器官中，例如像肝脏的细胞(例如，肝细胞)。
关于使用脂质颗粒预防或治疗病毒感染的另外实施方案描述于例如美国专利申请公布号2007/0218122、美国专利申请公布号2007/0135370以及2010年3月19日提交的名称为“Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression”的PCT申请号PCT/CA2010/000444中，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
包含一种或多种式I的阳离子脂质或其盐例如药学上可接受的盐的本发明脂质颗粒(例如，LNP)特别有利于且适合于向受试者(例如，哺乳动物如人)施用核酸如干扰RNA，因为它们在循环中稳定、具有产生进入血管外部位的药效行为所需要的大小以及能够到达靶细胞群。
通过以下详述和附图，本领域技术人员将清楚本发明的其它目的、特征和优点。
发明详述
I.引言
本发明部分地基于新型阳离子(氨基)脂质的发现，所述新型阳离子(氨基)脂质在用于将活性剂或治疗剂如核酸体内递送到哺乳动物的细胞中的脂质颗粒时提供优点。具体地说，本发明提供了包含本文描述的一种或多种新型阳离子脂质的核酸-脂质颗粒组合物，所述核酸-脂质颗粒组合物提供了增加的核酸(例如，干扰RNA)活性和改进的组合物在体内的耐受性，从而与先前描述的核酸-脂质颗粒组合物相比引起治疗指数显著增加。
在具体实施方案中，本发明提供了能实现配制用于体外和体内递送干扰RNA如siRNA的改进组合物的新型阳离子脂质。本文示出这些改进的脂质颗粒组合物有效于下调(例如，沉默)蛋白质水平和/或靶基因的mRNA水平。此外，本文示出这些改进的脂质颗粒组合物的活性取决于本发明的新型阳离子脂质的存在。
本发明的脂质颗粒和组合物可以用于各种目的，包括在体外和在体内将包囊的或缔合的(例如，络合的)治疗剂如核酸递送至细胞中。因此，本发明进一步提供了通过使受试者与包囊或与适合的治疗剂缔合的脂质颗粒接触来治疗有需要的受试者体内的疾病或病症的方法，其中脂质颗粒包含本文描述的一种或多种新型阳离子脂质。
如本文所描述，本发明的脂质颗粒特别有用于递送核酸，包括例如干扰RNA分子如siRNA。因此，本发明的脂质颗粒和组合物可以用来通过使细胞与包含本文描述的一种或多种新型阳离子脂质的脂质颗粒接触在体外和在体内减少靶基因和蛋白质的表达，其中脂质颗粒包囊减少靶基因表达的核酸(例如，siRNA)或与之缔合。或者，本发明的脂质颗粒和组合物可以用来通过使细胞与包含本文描述的一种或多种新型阳离子脂质的脂质颗粒接触在体外和在体内增加所需蛋白质的表达，其中脂质颗粒包囊增强所需蛋白质表达的核酸(例如，编码所需蛋白质的质粒)或与之缔合。
以下进一步详细地描述了本发明的阳离子脂质、脂质颗粒和包含所述脂质颗粒的组合物以及其递送活性剂或治疗剂如核酸以调节基因和蛋白质表达的用途的各种示例性实施方案。
II.定义
如本文所使用，除非另有说明，否则以下术语具有其所赋予的含义。
在与本发明的脂质颗粒或制剂中的组分的量一起使用时，术语“约”涵盖组分的所指量的正或负5％的值(例如，约10％涵盖9.5％至10.5％的值)。术语“约”因此还涵盖组分的所指量的正或负1％、2％、3％或4％的值。
如本文所使用的术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”包括在干扰RNA处于与靶基因或序列相同的细胞中时，能够减少或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导降解或抑制与干扰RNA序列互补的mRNA的翻译)的单链RNA(例如，成熟miRNA、ssRNAi寡核苷酸、ssDNAi寡核苷酸)或双链RNA(即，双链体RNA如siRNA、切酶-底物dsRNA、shRNA、aiRNA或前体miRNA)。干扰RNA因此是指与靶mRNA序列互补的单链RNA或由两条互补链或由单条自身互补链形成的双链RNA。干扰RNA可以与靶基因或序列基本同一或完全同一，或可以包含错配区(即，错配基序)。干扰RNA的序列可以相应于全长靶基因或其子序列。优选地，化学合成干扰RNA分子。
干扰RNA包括“小干扰RNA”或“siRNA”，例如长度为约15-60、15-50或15-40个(双链体)核苷酸的干扰RNA，更通常地长度为约15-30、15-25或19-25个(双链体)核苷酸，并且优选地长度为约20-24、21-22或21-23个(双链体)核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度均为15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸，优选地长度为约20-24、21-22或21-23个核苷酸，并且双链siRNA的长度为约15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个碱基对，优选地长度为约18-22、19-20或19-21个碱基对)。siRNA双链体可以包含约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3’突出端和5’磷酸酯末端。siRNA的实例包括但不限于：由两个分开链分子组装的双链多核苷酸分子，其中一条链为有义链并且另一个为互补反义链；由单链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义区和反义区由基于核酸或基于非核酸的接头连接；具有带自身互补有义区和反义区的发夹二级结构的双链多核苷酸分子；以及具有带自身互补有义区和反义区的两个或更多个环结构和一个茎结构的环形单链多核苷酸分子，其中环形多核苷酸可以在体内或体外加工以产生活性双链siRNA分子。
优选地，化学合成siRNA。还可以通过用大肠杆菌(E.coli)RNA酶III或切酶裂解较长的dsRNA(例如，长度大于约25个核苷酸的dsRNA)来产生siRNA。这些酶将dsRNA加工成生物活性的siRNA(参见，例如Yang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:9942-9947(2002)；Calegari等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14236(2002)；Byrom等，Ambion TechNotes,10(1):4-6(2003)；Kawasaki等,Nucleic Acids Res.，31:981-987(2003)；Knight等,Science,293:2269-2271(2001)；以及Robertson等,J.Biol.Chem.,243:82(1968))。优选地，dsRNA的长度为至少50个核苷酸至约100、200、300、400或500个核苷酸。dsRNA的长度可以像1000、1500、2000、5000个核苷酸一样长或更长。dsRNA可以编码用于整个基因转录或部分基因转录。在某些例子中，可以由质粒编码siRNA(例如，转录为自动折叠到具有发夹环的双链体中的序列)。
如本文所使用，术语“错配基序”或“错配区”是指对其靶序列不具有100％互补性的干扰RNA(例如，siRNA)序列的一部分。干扰RNA可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个错配区。错配区可为邻接的或可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸分开。错配基序或区可以包含单个核苷酸或可以包含两个、三个、四个、五个或更多个核苷酸。
短语“抑制靶基因的表达”是指干扰RNA(例如，siRNA)或另一种治疗剂沉默、减少或抑制靶基因表达的能力。为了检查基因沉默的程度，使测试样品(例如，表达靶基因的培养物中的细胞样品)或测试哺乳动物(例如，哺乳动物如人或动物模型如啮齿动物(例如，小鼠)或非人灵长类动物(例如，猴)模型)与沉默、减少或抑制靶基因表达的干扰RNA(例如，siRNA)接触。比较测试样品或测试动物中的靶基因的表达与不接触或不施用干扰RNA(例如，siRNA)的对照样品(例如，表达靶基因的培养物中的细胞样品)或对照哺乳动物(例如，哺乳动物如人或动物模型如啮齿动物(例如，小鼠)或非人灵长类动物(例如，猴)模型)中的靶基因的表达。对照样品或对照哺乳动物中的靶基因的表达可以指定为100％的值。在具体实施方案中，当相对于对照样品或对照哺乳动物中的靶基因表达的水平在测试样品或测试哺乳动物中的靶基因表达的水平为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，实现沉默、抑制或减少靶基因的表达。换言之，相对于不接触或不施用干扰RNA(例如，siRNA)的对照样品或对照哺乳动物中的靶基因表达的水平，干扰RNA(例如，siRNA)使测试样品或测试哺乳动物中的靶基因的表达沉默、减少或抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。用于确定靶基因表达的水平的适合测定包括但不限于使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或mRNA水平，所述技术例如像斑点印迹、RNA印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及本领域技术人员已知的表型测定。
活性剂或治疗剂如干扰RNA的“有效量”或“治疗有效量”为足以产生所需效果例如与不存在干扰RNA的情况下检测到的普通表达水平相比抑制靶序列的表达的量。当相对于对照使用干扰RNA获得的值为约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％时，实现靶基因或靶序列的表达的抑制。用于测量靶基因或靶序列的表达的适合测定包括，例如使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白质或RNA水平，所述技术如斑点印迹、RNA印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及本领域技术人员已知的表型测定。
由干扰RNA引起的免疫应答“减小(decrease)”、“减小(decreasing)”、“减少(reduce)”或“减少(reducing)”旨在意指给定干扰RNA(例如，修饰的干扰RNA)或其它治疗剂的免疫应答的可检测的减小。可以相对于存在未修饰的干扰RNA情况下的免疫应答水平确定由修饰的干扰RNA引起的免疫应答的减小量。可检测的减小可以比在存在未修饰的干扰RNA情况下检测到的免疫应答低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。通常通过由体外应答细胞引起的细胞因子产生减少(例如，IFNγ、IFNα、TNFα、IL-6或IL-12)或在施用干扰RNA之后哺乳动物受试者的血清中的细胞因子产生减少来测量干扰RNA的免疫应答减小。
如本文所使用，术语“应答细胞”是指在与免疫刺激性干扰RNA如未修饰的siRNA接触时产生可检测的免疫应答的细胞，优选为哺乳动物细胞。示例性的应答细胞包括例如树突细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞(PBMC)、脾细胞等。可检测的免疫应答包括例如产生细胞因子或生长因子如TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TGF及其组合。可检测的免疫应答还包括例如诱导具有三十四肽重复单元1(IFIT1)mRNA的干扰素诱导的蛋白质。
“基本同一”是指在严格条件下与参比序列杂交或与在参比序列的指定区上具有指定百分比同一性的序列杂交的序列。
短语“严格杂交条件”是指在所述条件下，通常在核酸的复杂混合物中，核酸将与其靶序列杂交但不与其它序列杂交的条件。严格条件为序列依赖性的并且在不同情况下将有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详尽指南参见Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays”(1993)。通常，将严格条件选择为比限定离子强度pH下的特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm为平衡时50％的与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶序列过量存在，所以在Tm下，平衡时50％探针被占据)。还可以使用加入去稳定剂如甲酰胺来实现严格条件。针对选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少两倍，优选地为背景杂交的10倍。
示例性的严格杂交条件可以如下：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5x SSC、1％SDS，在65℃下孵育，其中在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。针对PCR，低严格性扩增的温度通常为约36℃，虽然退火温度可取决于引物长度在约32℃与48℃之间变化。针对高严格性PCR扩增，通常的温度为约62℃，虽然高严格性退火温度可以取决于引物长度和特异性在约50℃至约65℃的范围内。通常用于高严格性和低严格性扩增的循环条件包括90℃-95℃的变性阶段持续30秒-2分钟、持续30秒-2分钟的退火阶段以及约72℃的延伸阶段持续1-2分钟。用于低严格性和高严格性扩增反应的方案和指导提供于例如Innis等,PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)中。
如果它们编码的多肽基本上相同，在严格条件下不能彼此杂交的核酸仍然为基本上相同的。例如在使用遗传密码所容许的最大密码子简并产生核酸拷贝时，这种情况就会发生。在此类情况下，核酸通常在中等严格杂交条件下杂交。示例性的“中等严格杂交条件”包括在37℃下、在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中杂交，并且在45℃下用1X SSC洗涤。阳性杂交为背景的至少两倍。本领域技术人员将很容易地认识到，可以使用替代的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。用于确定杂交参数的另外指导提供于许多参考文献中，例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编著。
在两种或更多种核酸背景下的术语“基本同一(substantially identical)”或“基本同一性(substantial identity)”是指当在使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测检查所测量的比较窗口或指定区上比较并且比对最大对应性时，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸(即，在指定区上至少约60％、优选地至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)的两种或更多种序列或子序列。当上下文指明时，这个定义还类似地指序列的互补序列。优选地，基本同一性存在于长度为至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个核苷酸的区上。
针对序列比较，通常一个序列充当参比序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列同一性百分比。
如本文所使用的“比较窗口”包括涉及多个邻接位置中的任一个区段，所述邻接位置选自由约5至约60、通常约10至约45、更通常约15至约30组成的组，其中在两个序列最佳对比之后，可将一个序列与相同数目的邻接位置的参比序列比较。比对用于比较的序列的方法为本领域熟知的。例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444(1988)的相似性方法研究，通过这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,遗传学计算机组,575Science Dr.,Madison,WI)的计算机实现或通过手动比对和目测检查(参见，例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编著(1995增刊))，可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的非限制性实例为BLAST算法和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等,Nuc.Acids Res.,25:3389-3402(1977)和Altschul等,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)中。使用具有本文描述的参数的BLAST和BLAST 2.0来确定本发明的核酸的序列同一性百分比。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。另一个实例为用于确定序列同一性百分比的全局比对算法，如用于比对蛋白质或核苷酸(例如，RNA)序列的Needleman-Wunsch算法。
BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种度量为最小和概率(P(N))，其提供了在两个核苷酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中，最小和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01并且最优选地小于约0.001，认为核酸与参比序列相似。
如本文所使用的术语“核酸”是指以单链或双链形式含有至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物并且包括DNA和RNA。DNA可呈以下形式：例如反义分子、质粒DNA、预先缩合的DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合。RNA可呈以下形式：小的干扰RNA(siRNA)、切酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)、多价RNA(MV RNA)及其组合。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，所述核酸为合成的、天然存在的和非天然存在的，并且其具有与参比核酸类似的结合性质。此种类似物的实例包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸以及肽-核酸(PNA)。除非确切地限制，否则术语涵盖具有与参比核酸类似的结合性质的含有天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指明，否则具体核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。确切地说，简并密码子替换可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合型碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”含有糖脱氧核糖(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基团。核苷酸通过磷酸酯基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物；以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新反应性基团如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯和烷基卤化物的修饰。
术语“基因”是指包含产生多肽或前体多肽所需要的编码部分长度或全长序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。
如本文所使用的“基因产物”是指基因的产物，如RNA转录物或多肽。
术语“脂质”是指包括但不限于脂肪酸的酯的一组有机化合物，并且特征在于不溶于水但溶于许多有机溶剂。它们通常分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生的脂质”如类固醇。
术语“脂质颗粒”包括可以用来向感兴趣的靶部位(例如，细胞、组织、器官等)递送活性剂或治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)的脂质制剂。在优选的实施方案中，本发明的脂质颗粒为脂质纳米颗粒，其通常由阳离子脂质、非阳离子脂质以及任选地防止颗粒聚集的缀合的脂质形成。在可以称为“核酸-脂质颗粒”的其它优选的实施方案中，可以将活性剂或治疗剂如核酸包囊在颗粒的脂质部分中，从而保护其不受酶促降解。
如本文所使用，术语“LNP”是指脂质纳米颗粒。LNP表示由脂质(例如，阳离子脂质、非阳离子脂质以及任选地防止颗粒聚集的缀合的脂质)制成的颗粒，其中核酸(例如，干扰RNA)完全包囊在脂质内。在某些例子中，LNP极其有用于系统应用，因为它们可以在静脉内(i.v.)注射之后显示出延长的循环寿命，它们可以在远端部位(例如，与施用部位物理分开的部位)上累积，并且它们可以在这些远端部位上介导靶基因表达的沉默。核酸可以与缩合剂复合并且包囊在如在PCT公布号WO 00/03683中列出的LNP内，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本发明的脂质颗粒(例如，LNP)的平均直径通常为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且基本无毒。另外，当存在于本发明的脂质颗粒中时，核酸在水溶液中对使用核酸酶的降解有抗性。脂质纳米颗粒及其制备方法公开在例如美国专利申请公布号2004/0142025和2007/0042031中，所述专利申请的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
如本文所使用，“脂质包囊的”可以是指在完全包囊、部分包囊或这两者情况下提供活性剂或治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)的脂质颗粒。在优选的实施方案中，核酸完全包囊在脂质颗粒中(例如，以形成LNP)。
术语“脂质缀合物”是指抑制脂质颗粒聚集的缀合的脂质。此类脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物，例如像偶联至二烷氧基丙基的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、偶联至二酰基甘油的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、偶联至胆固醇的PEG、偶联至磷脂酰乙醇胺的PEG以及缀合至神经酰胺的PEG(参见，例如美国专利号5,885,613)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺低聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)及其混合物。POZ-脂质缀合物的另外实例描述于PCT公布号WO 2010/006282中。PEG或POZ可以直接缀合至脂质或可以经由接头部分连接至脂质。可以使用适合用于将PEG或POZ偶联至脂质的任何接头部分，包括例如含有非酯的接头部分和含酯接头部分。在某些优选的实施方案中，使用了含有非酯的接头部分如酰胺或氨基甲酸酯。每个上述专利文件的公开内容均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
术语“两亲脂质”部分地指其中脂质材料的疏水部分定向到疏水相中而亲水部分定向朝向水相的任何适合的材料。亲水特征来源于极性或带电荷的基团的存在，如碳水化合物、磷酸酯、羧酸、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基以及其它类似基团。可以通过包括非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和的脂肪族烃基和被一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的此类基团。两亲化合物的实例包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。
磷脂的代表性实例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱以及二亚油酰磷脂酰胆碱。缺少磷的其它化合物如鞘脂、糖鞘脂家族、二酰基甘油以及β-酰氧基酸也在称为两亲性脂质的组内。另外，以上描述的两亲脂质可以与包括甘油三酯和甾醇的其它脂质混合。
术语“中性脂质”是指在选择的pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在的许多脂质种类中的任何一种。在生理pH下，此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂以及二酰基甘油。
术语“非阳离子脂质”是指任何两亲脂质以及任何其它中性脂质或阴离子脂质。
术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括但不限于：磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)以及与中性脂质连接的其它阴离子修饰基团。
术语“疏水脂质”是指具有非极性基团的化合物，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和的脂肪族烃基和任选地被一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的此类基团。适合的实例包括但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷以及1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
术语“融合”是指脂质颗粒如LNP与细胞的膜融合的能力。膜可为质膜或包围细胞器例如核内体、细胞核等的膜。
如本文所使用，术语“水溶液”是指全部或部分包含水的组合物。
如本文所使用，术语“有机脂质溶液”是指全部或部分包含具有脂质的有机溶剂的组合物。
如本文所使用的“远端部位”是指物理分开的部位，其不限于相邻毛细血管床，但包括广泛分布在整个生物体中的部位。
与核酸-脂质颗粒如LNP相关的“血清稳定的”意指颗粒在暴露于将显著降解游离DNA或RNA的血清或核酸酶测定之后不会显著降解。适合的测定包括例如标准血清测定、DNA酶测定或RNA酶测定。
如本文所使用的“系统递送”是指引起活性剂如干扰RNA(例如siRNA)广泛生物分布在生物体内的脂质颗粒的递送。施用的一些技术可以引起某些药剂的系统递送，但不会引起其它药剂的系统递送。系统递送意指将有用量，优选地治疗量的药剂暴露于身体的大多数部分。为了获得广泛生物分布，通常需要血液寿命，使得药剂在到达远离施用部位的疾病部位之前不会被快速降解或清除(如通过首过器官(肝脏、肺等)或通过快速非特异性细胞结合)。脂质颗粒的系统递送可以通过本领域中已知的任何方式实现，包括例如静脉内、皮下和腹膜内。在优选的实施方案中，脂质颗粒的系统递送通过静脉内递送实现。
如本文所使用的“局部递送”是指直接向生物体内的靶部位递送活性剂如干扰RNA(例如，siRNA)。例如，可以通过直接注射到疾病部位如肿瘤或其它靶部位如炎症的部位或靶器官如肝脏、心脏、胰腺、肾脏等中来局部递送药剂。
术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物种类，如人、小鼠、大鼠、犬、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制生长的一类疾病的任何成员。术语包括所有已知的癌症和肿瘤性病状，无论表征为恶性的、良性的、软组织或实体以及所有阶段和等级的癌症，包括转移前癌症和转移后癌症。不同类型的癌症的实例包括但不限于：肝癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌、胃(胃部)癌、食道癌；胆囊癌、胰腺癌、阑尾癌、乳腺癌、卵巢癌；宫颈癌、前列腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、中枢神经系统的癌症、成胶质细胞瘤、皮肤癌、淋巴瘤、绒毛膜癌、头颈癌、骨原性肉瘤以及血癌。具体类型的肝癌的非限制性实例包括肝细胞癌(HCC)、继发性肝癌(例如，由一些其它非肝癌细胞类型的转移引起)以及肝母细胞瘤。如本文所使用，“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。
缩写为“MV RNA”的术语“多价RNA”是指由至少三个多核苷酸组成的多核苷酸复合体，其中每个多核苷酸均沿着其所有或部分长度与复合体的至少两个其它多核苷酸杂交并且其中一个或多个多核苷酸任选地包括能够与靶核酸序列杂交的靶向区。每个多核苷酸的长度均可为例如10至60个核苷酸。多核苷酸内的一个或多个靶向区可以能够与复合体的其它多核苷酸的一个或多个靶向区所杂交的一个或多个靶核酸序列相同或不同的靶核酸序列杂交。多价RNA可以在体外合成(例如，通过化学合成)，或例如它可以由前体在活细胞内加工。例如，前体可为包括多价RNA的每个多核苷酸的线性多核苷酸，其被引入到活细胞中并且在其中裂解以形成多价RNA。术语“多价RNA”包括用以在活细胞内部裂解的这样一种前体。术语“多价RNA”还通过实例的方式涵盖在国际申请号为PCT/US2010/036962的出版的国际专利申请中确切或一般描述的三重多核苷酸复合体。
III.新型阳离子脂质
本发明特别提供了新型阳离子(氨基)脂质，其可以有利地在用于将治疗剂如核酸体外和/或体内递送至细胞的本文描述的脂质颗粒中使用。本发明的新型阳离子脂质具有在本文式I中列出的结构，并且包括其(R)对映异构体和/或(S)对映异构体。
在一些实施方案中，本发明的脂质包含外消旋混合物。在其它实施方案中，本发明的脂质包含一种或多种非对映异构体的混合物。在某些实施方案中，本发明的脂质富集在一种对映异构体中，使得脂质包含至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的对映体过量。在某些其它实施方案中，本发明的脂质富集在一种非对映异构体中，使得脂质包含至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的非对映体过量。在某些另外的实施方案中，本发明的脂质为手性纯的(例如，包含单一光学异构体)。在另外实施方案中，本发明的脂质富集在一种光学异构体(例如，光学活性异构体)中，使得脂质包含至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的异构体过量。本发明提供了呈外消旋混合物或以光学纯形式的式I的阳离子脂质的合成。
术语“阳离子脂质”和“氨基脂质”在本文中可互换使用，包括具有一个、两个、三个或更多个脂肪酸或脂肪烷基链和pH可滴定的氨基头基(例如，烷基氨基或二烷基氨基头基)的那些脂质及其盐，例如药学上可接受的盐。阳离子脂质通常在低于阳离子脂质的pKa的pH下质子化(即，带正电荷)并且在高于pKa的pH下基本上为中性。本发明的阳离子脂质还可以称为可滴定的阳离子脂质。
术语“盐”包括任何阴离子和阳离子复合体，如在本文公开的阳离子脂质与一种或多种阴离子之间形成的复合体。阴离子的非限制性实例包括无机阴离子和有机阴离子，例如氢化物、氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、草酸根(例如，半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、氧化物、碳酸根、碳酸氢根、硝酸根、亚硝酸根、氮化物、亚硫酸氢根、硫化物、亚硫酸根、硫酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氢根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、柠檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、富马酸根、马来酸根、衣康酸根、羟乙酸根、葡糖酸根、苹果酸根、扁桃酸根、巴豆酸根、抗坏血酸根、水杨酸根、聚甲基丙烯酸根、高氯酸根、氯酸根、亚氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亚砷酸根、铬酸根、重铬酸根、氰化物、氰酸根、硫氰酸根、氢氧化物、过氧化物、高锰酸根及其混合物。在具体实施方案中，本文公开的阳离子脂质的盐为结晶盐。在具体实施方案中，“盐”为“药学上可接受的盐”。
术语“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐来源于本领域中熟知的各种有机反离子和无机反离子。药学上可接受的盐包括金属(无机)盐和有机盐，其包括但不限于在Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,第1418页(1985)中列出的那些。药学上可接受的盐仅通过实例的方式包括无机酸的盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐以及硝酸盐；或无机酸的盐，如苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐或扑酸盐(palmoate)、水杨酸盐以及硬脂酸盐。类似地药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂以及铵(尤其具有仲胺的铵盐)。用于以上引用的原因的本发明的具体盐包括钾盐、钠盐、钙盐和铵盐。
术语“烷基”包括含有1至24个碳原子的直链或支链、非环状或环状、饱和脂肪族烃。代表性的饱和直链烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，而饱和支链烷基包括但不限于异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性的饱和环状烷基包括但不限于本文描述的C3-8环烷基，而不饱和环状烷基包括但不限于本文描述的C3-8环烯基。
术语“杂烷基”包括具有约1至约5个例如像O、N、Si和/或S的杂原子(即，1、2、3、4或5个杂原子)的如上所定义的直链或支链、非环状或环状、饱和脂肪族烃，其中氮原子和硫原子可任选被氧化并且氮杂原子可任选被季铵化。杂烷基可以通过碳原子或杂原子附接至分子的剩余部分。
术语“环状烷基”包括以下描述的任何取代或未取代的环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基。
术语“环烷基”包括具有约3至约8个碳原子(即，3、4、5、6、7或8个碳原子)作为环顶点的取代或未取代的环状烷基。优选的环烷基包括具有约3至约6个碳原子作为环顶点的那些。C3-8环烷基的实例包括但不限于环丙基、甲基-环丙基、二甲基-环丙基、环丁基、甲基-环丁基、环戊基、甲基-环戊基、环己基、甲基-环己基、二甲基-环己基、环庚基和环辛基以及其它取代的C3-8环烷基。
术语“杂环烷基”包括具有约1至约3个杂原子作为环成员的如上定义的取代或未取代的环状烷基，所述杂原子选自由O、N、Si和S组成的组，其中氮原子和硫原子可任选地被氧化并且氮杂原子可任选地被季铵化。杂环烷基可以通过碳原子或杂原子附接至分子的剩余部分。
术语“环烯基”包括具有约3至约8个碳原子(即，3、4、5、6、7或8个碳原子)作为环顶点的取代或未取代的环状烯基。优选的环烯基为具有约3至约6个碳原子作为环顶点的那些。C3-8环烯基的实例包括但不限于环丙烯基、甲基-环丙烯基、二甲基-环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基和环辛烯基以及其它取代的C3-8环烯基。
术语“杂环烯基”包括具有约1至约3个杂原子作为环成员的如上定义的取代或未取代的环状烯基，所述杂原子选自由O、N、Si和S组成的组，其中氮原子和硫原子可任选地被氧化并且氮杂原子可任选地被季铵化。杂环烯基可以通过碳原子或杂原子附接至分子的剩余部分。
术语“烷氧基”包括式烷基-O-的基团，其中“烷基”具有先前给定的定义。烷氧基的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基以及叔丁氧基。
术语“烯基”包括在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上定义的烷基。烯基包括顺式异构体和反式异构体。代表性的直链和支链烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。代表性的环状烯基如上描述。
术语“炔基”包括在相邻碳之间额外地含有至少一个三键的如上定义的任何烷基或烯基。代表性的直链和支链炔基包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1丁炔基等。
术语“芳基”包括多不饱和的、通常为芳香族的烃基，其可为稠合在一起或共价连接的单环或多环(高达至三个环)，并且其任选地携带一个或多个取代基，例如像卤素、三氟甲基、氨基、烷基、烷氧基、烷基羰基、氰基、氨基甲酰基、烷氧基氨基甲酰基、亚甲基二氧基、羧基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、羟基、硝基等。未取代的芳基的非限制性实例包括苯基、萘基和联苯基。取代的芳基的实例包括但不限于苯基、氯苯基、三氟甲基苯基、氯氟苯基以及氨基苯基。
术语“烷硫基”、“烷基磺酰基”、“烷基亚磺酰基”和“芳基磺酰基”包括分别具有式-S-Ri、-S(O)2-Ri、-S(O)-Ri和-S(O)2Rj的基团，其中Ri为如先前定义的烷基并且Rj为如先前定义的芳基。
术语“烯氧基”和“炔氧基”包括具有式-O-Ri的基团，其中Ri分别为烯基或炔基。
术语“烯硫基”和“炔硫基”包括具有式-S-Rk的基团，其中Rk分别为烯基或炔基。
术语“烷氧基羰基”包括具有式-C(O)O-Ri的基团，其中Ri为如上定义的烷基并且其中碳原子总数是指组合的烷基和羰基部分。
术语“酰基”包括任何烷基、烯基或炔基，其中在附接点上的碳被如下定义的氧基取代。以下为酰基的非限制性实例：-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基。
术语“杂环”包括5元至7元单环的或7元至10元双环的杂环，所述杂环为饱和的、不饱和的或芳香族的，并且其含有1或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮杂原子和硫杂原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可任选地被季铵化，所述杂环包括其中任何以上杂环稠合至苯环的双环。杂环可以经由任何杂原子或碳原子附接。杂环包括但不限于如下定义的杂芳基以及吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基、戊内酰胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“杂芳基”包括含有一个、两个或更多个选自氮(N)、氧(O)和硫(S)的杂原子的芳香族5元至10元杂环。杂芳基可以在一个或多个碳原子上被取代基例如像卤素、烷基、烷氧基、氰基、卤代烷基(例如，三氟甲基)、杂环基(例如，吗啉基或吡咯烷基)等取代。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基和呋喃基。
术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
术语“任选取代的烷基”、“任选取代的环状烷基”、“任选取代的烯基”、“任选取代的炔基”、“任选取代的酰基”以及“任选取代的杂环”意指在取代时，至少一个氢原子被取代基替代。在“氧基”取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被替代。取代基的非限制性实例包括氧基、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx以及-SOnNRxRy，其中n为0、1或2，Rx和Ry为相同的或不同的并且独立地为氢、烷基或杂环，并且每个烷基和杂环取代基可以进一步被以下的一个或多个取代：氧基、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx以及-SOnNRxRy。在列出取代基之前使用时，术语“任选取代的”意指列表中的每个取代基均可为如本文所描述任选取代的。
一方面，本发明提供了一种具有结构式(I)的阳离子脂质：
X-A-Y-Z；
(I)
或其盐，其中：
X为烷基氨基；
A为C1至C6任选取代的烷基，其中所述C1至C6任选取代的烷基可为饱和或不饱和的，并且其中A可能存在或可能不存在；
Y选自由以下组成的组：缩酮、酯、任选取代的氨基甲酸酯、醚以及任选取代的酰胺；并且
Z为由三个烷基链组成的疏水部分，其中烷基链中的每一个的长度均为C8至C11，其中三个烷基链中的每一个均可独立地为饱和或不饱和的，并且其中三个烷基链中的每一个均为任选取代的。
在式(I)的脂质的一些实施方案中，Z具有下式：
其中，R1、R2和R3各自独立地选自由C8至C11烷基组成的组；其中R1、R2和R3中的每一个均可独立地为饱和或不饱和的；并且其中R1、R2和R3中的每一个均为任选取代的。
在具体实施方案中，式(I)的脂质具有以下结构之一：
在一些实施方案中，阳离子脂质与一种或多种阴离子形成盐(例如，结晶盐)。在一个具体实施方案中，阳离子脂质为其草酸根(例如，半草酸根)盐，其优选为结晶盐。在具体实施方案中，阳离子脂质与一种或多种阴离子形成药学上可接受的盐。
在本发明的范围内还包括本文描述的本发明化合物的晶体形式、水合物和溶剂化物。
可以通过已知的有机合成技术，包括在实施例中描述的方法，来制备本发明的化合物。在一些实施方案中，本发明的阳离子脂质的合成可能需要使用保护基。保护基方法为本领域技术人员所熟知(参见，例如PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，Green，T.W.等，Wiley-Interscience，New York City,1999)。简单地说，在本发明的上下文内的保护基为减少或消除官能团的不想要的反应性的任何基团。可以将保护基加到官能团上以掩蔽其在某些反应过程中的反应性，并且然后去除以显现原始官能团。在某些例子中，使用“醇保护基”。“醇保护基”为降低或消除醇官能团的不想要的反应性的任何基团。可以使用本领域熟知的技术添加和去除保护基。
在某些实施方案中，本发明的阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，使得脂质在处于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下或低于生理pH的pH下带正电荷，并且在第二pH下为中性，优选地处于生理pH或高于生理pH。本领域普通技术人员将理解，作为pH的函数的质子的添加或去除为平衡过程，并且参考带电荷或中性脂质是指主要种类的性质并且不需要所有脂质以带电荷的或中性形式存在。具有多于一个可质子化或可去质子化的基团或其为两性离子的脂质不排除用于本发明中。
在某些其它实施方案中，根据本发明的可质子化脂质的可质子化基团的pKa在约4至约11范围内。最优选的为约4至约7的pKa，因为这些脂质在较低pH配制阶段下将为阳离子的，而颗粒在大约pH 7.4的生理pH下将被极大地(虽然不是完全地)表面中和。此pKa的益处之一是与颗粒外表面缔合的至少一些核酸将在生理pH下失去其静电相互作用并且通过简单透析去除，因此极大地减少颗粒对清除的易感性。
IV.活性剂
活性剂(例如，治疗剂)包括能够对细胞、组织、器官或受试者施加所需效果的任何分子或化合物。这些效果可为例如生物的、生理的和/或化妆用的。活性剂可为任何类型的分子或化合物，包括但不限于核酸、肽、多肽、小分子及其混合物。核酸的非限制性实例包括干扰RNA分子(例如，siRNA、切酶-底物dsRNA、shRNA、aiRNA和/或miRNA)、反义寡核苷酸、质粒、核酶、免疫刺激性寡核苷酸及其混合物。肽或多肽的实例包括但不限于抗体(例如，多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；人源化抗体、重组抗体、重组人抗体和/或PrimatizedTM抗体)、细胞因子、生长因子、凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体及其配体、激素及其混合物。小分子的实例包括但不限于小的有机分子或化合物，如本领域技术人员已知的任何常规试剂或药物。
在一些实施方案中，活性剂为治疗剂或其盐或衍生物。治疗剂衍生物可以本身为治疗活性的或它们可以是前药，其在进一步修饰时变为活性的。因此，在一个实施方案中，与未修饰的药剂相比治疗剂衍生物保留一些或所有治疗活性，而在另一个实施方案中，治疗剂衍生物为缺乏治疗活性的前药，但在进一步修饰时变为活性的。
A.核酸
在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒与核酸缔合，从而产生核酸-脂质颗粒(例如，LNP)。在一些实施方案中，核酸完全包囊在脂质颗粒中。如本文所使用，术语“核酸”包括具有通常称为寡核苷酸的含有高达至60个核苷酸的片段和称为多核苷酸的较长片段的任何寡核苷酸或多核苷酸。在具体实施方案中，本发明的寡核苷酸的长度为约15至约60个核苷酸。核酸可以在本发明的脂质颗粒中单独施用或与包含肽、多肽或小分子如常规药物的本发明脂质颗粒组合施用(例如，共同施用)。
在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷酸单体或核苷单体的聚合物或低聚物。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包括包含非天然存在的单体或其功能类似的部分的聚合物或低聚物。此类修饰的或取代的寡核苷酸常常优于天然形式，因为例如像细胞摄取增强、免疫原性减小以及在核酸酶存在下稳定性增加的性质。
寡核苷酸通常分为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧核糖的5-碳糖组成，其在此糖的5’和3’碳上共价连接至磷酸酯以形成交替非支链聚合物。核糖寡核苷酸由类似重复结构组成，其中5-碳糖为核糖。
存在于根据本发明的核酸-脂质颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文使用的核酸可为单链DNA或RNA、或双链DNA或RNA、或DNA-RNA杂交体。本文描述了双链DNA的实例并且包括例如结构基因、包括控制区和终止区的基因以及自我复制系统如病毒或质粒DNA。本文描述了双链RNA的实例并且包括例如siRNA和其它RNAi剂，如切酶-底物dsRNA、shRNA、aiRNA和前体miRNA。单链核酸包括例如反义寡核苷酸、核酶、成熟miRNA以及三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotide)。
本发明的核酸可以具有各种长度，通常取决于核酸的具体形式。例如，在具体实施方案中，质粒或基因的长度可为约1,000个至约100,000个核苷酸残基。在具体实施方案中，寡核苷酸的长度可以在约10至约100个核苷酸范围内。在各种相关实施方案中，单链、双链和三链的寡核苷酸的长度都可以在约10至约60个核苷酸、约15至约60个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸或约20至约30个核苷酸的范围内。
在具体实施方案中，本发明的寡核苷酸(或其链)特异性地与靶多核苷酸序列杂交或与靶多核苷酸序列互补。如本文所使用的术语“可特异性杂交”和“互补”指明充分程度的互补性，使得在DNA或RNA靶与寡核苷酸之间发生稳定的且特异性的结合。应该理解，寡核苷酸不需要与其待特异性杂交的靶核酸序列100％互补。在优选的实施方案中，在寡核苷酸与靶序列的结合干扰靶序列的正常功能以引起其实用性或表达丧失时，寡核苷酸为可特异性杂交的，并且存在充分程度的互补性以避免在其中所需特异性结合的条件下，即在体内测定或治疗处理的情况下在生理条件下、或在体外测定的情况下在其中进行测定的条件下寡核苷酸与非靶序列非特异性结合。因此，与靶向或与其特异性杂交的基因或mRNA序列的区相比，寡核苷酸可以包括1、2、3或更多个碱基取代。
1.siRNA
本发明的核酸-脂质颗粒的siRNA组分能够使感兴趣的靶基因的表达沉默。siRNA双链体的每条链的长度通常均为约15至约60个核苷酸，优选地长度为约15至约30个核苷酸。在某些实施方案中，siRNA包含至少一个修饰的核苷酸。修饰的siRNA的免疫刺激性通常比相应的未修饰的siRNA序列小并且保留对感兴趣的靶基因的RNAi活性。在一些实施方案中，修饰的siRNA含有至少一个2’OMe嘌呤或嘧啶核苷酸，如2’OMe-鸟苷、2’OMe-尿苷、2’OMe-腺苷和/或2’OMe-胞嘧啶核苷酸。修饰的核苷酸可以存在于siRNA的一条链(即，有义或反义的)或两条链中。在一些优选的实施方案中，在siRNA的一条链(即，有义或反义的)或两条链中一个或多个尿苷和/或鸟苷核苷酸被修饰(例如，2’OMe-修饰)。在这些实施方案中，修饰的siRNA可以进一步包含一个或多个修饰的(例如，2’OMe-修饰的)腺苷和/或修饰的(例如，2’OMe-修饰的)胞嘧啶核苷酸。在其它优选的实施方案中，在siRNA的一条链(即，有义或反义的)或两条链中仅有尿苷和/或鸟苷核苷酸被修饰(例如，2’OMe-修饰)。siRNA序列可以具有突出端(例如，如在Elbashir等,Genes Dev.,15:188(2001)或等,Cell,107:309(2001)中描述的3’或5’突出端)，或可以缺乏突出端(即，具有平端)。
在具体实施方案中，将修饰的核苷酸如2’OMe尿苷和/或鸟苷核苷酸选择性掺入到siRNA的任一链或两条链的双链区中减小或完全消除了对所述siRNA分子的免疫应答。在某些例子中，特异性siRNA序列的免疫刺激性质和其使基因表达沉默的能力可以通过在siRNA双链体的双链区内引入最小和选择性的2’OMe修饰来加以平衡或优化。这可以在治疗上可行的siRNA剂量下实现而没有与使用未修饰的siRNA相关的细胞因子诱导、毒性和离靶(off-target)效应。
修饰的siRNA通常在siRNA双链体的双链区中包含约1％至约100％(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的修饰的核苷酸。在某些实施方案中，siRNA的双链区中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个核苷酸包含修饰的核苷酸。在某些其它实施方案中，siRNA的双链区中的一些或所有修饰的核苷酸为彼此分开的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个核苷酸。在一个优选的实施方案中，siRNA的双链区中没有修饰的核苷酸彼此相邻(例如，在每个修饰的核苷酸之间存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个未修饰的核苷酸的间隔)。
在一些实施方案中，在siRNA的双链区中，小于约50％(例如，小于约49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％或36％，优选地小于约35％、34％、33％、32％、31％或30％)的核苷酸包含修饰的(例如，2’OMe)核苷酸。在这些实施方案的一个方面中，在siRNA的一条链或两条链的双链区中，小于约50％的尿苷和/或鸟苷核苷酸被选择性(例如，仅仅)修饰。在这些实施方案的另一个方面中，在siRNA的双链区中小于约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含至少一个2’OMe-鸟苷核苷酸和至少一个2’OMe-尿苷核苷酸，并且其中2’OMe-鸟苷核苷酸和2’OMe-尿苷核苷酸为存在于双链区中的仅有2’OMe核苷酸。在这些实施方案的又一个方面中，在siRNA的双链区中小于约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在修饰的siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含选自由以下组成的组的2’OMe核苷酸：2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸及其混合物，并且其中siRNA在双链区中不包含2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在这些实施方案的另一方面中，在siRNA的双链区中小于约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含至少一个2’OMe-鸟苷核苷酸和至少一个2’OMe-尿苷核苷酸，并且其中siRNA在双链区中不包含2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在这些实施方案的另一个方面中，在siRNA的双链区中小于约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在修饰的siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含选自由以下组成的组的2’OMe核苷酸：2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸及其混合物，并且其中双链区中的2’OMe核苷酸彼此不相邻。
在其它实施方案中，siRNA的双链区中的约1％至约50％(例如，约5％-50％、10％-50％、15％-50％、20％-50％、25％-50％、30％-50％、35％-50％、40％-50％、45％-50％、5％-45％、10％-45％、15％-45％、20％-45％、25％-45％、30％-45％、35％-45％、40％-45％、5％-40％、10％-40％、15％-40％、20％-40％、25％-40％、25％-39％、25％-38％、25％-37％、25％-36％、26％-39％、26％-38％、26％-37％、26％-36％、27％-39％、27％-38％、27％-37％、27％-36％、28％-39％、28％-38％、28％-37％、28％-36％、29％-39％、29％-38％、29％-37％、29％-36％、30％-40％、30％-39％、30％-38％、30％-37％、30％-36％、31％-39％、31％-38％、31％-37％、31％-36％、32％-39％、32％-38％、32％-37％、32％-36％、33％-39％、33％-38％、33％-37％、33％-36％、34％-39％、34％-38％、34％-37％、34％-36％、35％-40％、5％-35％、10％-35％、15％-35％、20％-35％、21％-35％、22％-35％、23％-35％、24％-35％、25％-35％、26％-35％、27％-35％、28％-35％、29％-35％、30％-35％、31％-35％、32％-35％、33％-35％、34％-35％、30％-34％、31％-34％、32％-34％、33％-34％、30％-33％、31％-33％、32％-33％、30％-32％、31％-32％、25％-34％、25％-33％、25％-32％、25％-31％、26％-34％、26％-33％、26％-32％、26％-31％、27％-34％、27％-33％、27％-32％、27％-31％、28％-34％、28％-33％、28％-32％、28％-31％、29％-34％、29％-33％、29％-32％、29％-31％、5％-30％、10％-30％、15％-30％、20％-34％、20％-33％、20％-32％、20％-31％、20％-30％、21％-30％、22％-30％、23％-30％、24％-30％、25％-30％、25％-29％、25％-28％、25％-27％、25％-26％、26％-30％、26％-29％、26％-28％、26％-27％、27％-30％、27％-29％、27％-28％、28％-30％、28％-29％、29％-30％、5％-25％、10％-25％、15％-25％、20％-29％、20％-28％、20％-27％、20％-26％、20％-25％、5％-20％、10％-20％、15％-20％、5％-15％、10％-15％或5％-10％)的核苷酸包含修饰的核苷酸。在这些实施方案的一个方面中，在siRNA的一条链或两条链的双链区中，约1％至约50％的尿苷和/或鸟苷核苷酸被选择性(例如，仅仅)修饰。在这些实施方案的另一个方面中，在siRNA的双链区中约1％至约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含至少一个2’OMe-鸟苷核苷酸和至少一个2’OMe-尿苷核苷酸，并且其中2’OMe-鸟苷核苷酸和2’OMe-尿苷核苷酸为存在于双链区中的仅有2’OMe核苷酸。在这些实施方案的又一个方面中，在siRNA的双链区中约1％至约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在修饰的siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含选自由以下组成的组的2’OMe核苷酸：2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸及其混合物，并且其中siRNA在双链区中不包含2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在这些实施方案的另一方面中，在siRNA的双链区中约1％至约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含至少一个2’OMe-鸟苷核苷酸和至少一个2’OMe-尿苷核苷酸，并且其中siRNA在双链区中不包含2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在这些实施方案的另一个方面中，在siRNA的双链区中约1％至约50％的核苷酸包含2’OMe核苷酸，其中siRNA在修饰的siRNA的两条链中均包含2’OMe核苷酸，其中siRNA包含选自由以下组成的组的2’OMe核苷酸：2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸及其混合物，并且其中双链区中的2’OMe核苷酸彼此不相邻。
可以引入到siRNA中的额外范围、百分比和修饰模式描述于美国专利申请公布号2007/0135372中，所述专利申请的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
a)siRNA序列的选择
可以使用本领域中已知的任何方式鉴定适合的siRNA序列。通常，将在Elbashir等,Nature,411:494-498(2001)和Elbashir等,EMBO J.,20:6877-6888(2001)中描述的方法与在Reynolds等,Nature Biotech.,22(3):326-330(2004)中列举出的合理设计规则组合。
作为非限制性实例，可以扫描来自感兴趣的靶基因的转录物的AUG起始密码子的核苷酸序列3’的二核苷酸序列(例如，AA、NA、CC、GG或UU，其中N＝C、G或U)(参见，例如Elbashir等,EMBO J.,20:6877-6888(2001))。将紧邻二核苷酸序列的3’的核苷酸鉴定为可能的siRNA序列(即，靶序列或有义链序列)。通常，将紧邻二核苷酸序列的3’的19个、21个、23个、25个、27个、29个、31个、33个、35个或更多个核苷酸鉴定为可能的siRNA序列。在一些实施方案中，二核苷酸序列为AA或NA序列，并且将紧邻AA或NA二核苷酸的3’的19个核苷酸鉴定为可能的siRNA序列。siRNA序列通常沿着靶基因的长度在不同位置间隔开。为了进一步增强siRNA序列的沉默效率，可以分析可能的siRNA序列以鉴定例如在靶细胞或生物体中不含有与其它编码序列同源的区的位点。例如，具有约21个碱基对的适合siRNA序列通常在靶细胞或生物体中将不具有多于16-17个与编码序列同源的邻接碱基对。如果siRNA序列将从RNAPol III启动子表达，选择缺乏多于4个邻接A’s或T’s的siRNA序列。
一旦已经鉴定出可能的siRNA序列，可以设计互补序列(即，反义链序列)。还可以使用本领域中已知的各种标准分析可能的siRNA序列。例如，为了增强其沉默效率，可以通过合理的设计算法鉴定具有以下特征中的一个或多个的序列来分析siRNA序列：(1)G/C含量为约25％至约60％G/C；(2)在有义链的位置15-19上有至少3个A/U；(3)没有内部重复；(4)在有义链的位置19上有A；(5)在有义链的位置3上有A；(6)在有义链的位置10上有U；(7)在有义链的位置19上没有G/C；以及(8)在有义链的位置13上没有G。掺入为每个这些特征赋予适合值并且有用于选择siRNA的算法的siRNA设计工具可以在例如http://ihome.ust.hk/～bokcmho/siRNA/siRNA.html中找到。本领域技术人员将了解，可以选择具有一个或多个上述特征的序列用于进一步分析并且测试作为可能的siRNA序列。
另外，具有一个或多个以下标准的可能的siRNA序列可以常常省略为siRNA：(1)包含成排的4个或更多个相同碱基的延伸的序列；(2)包含G的同聚物(即，为了减少由于这些聚合物的结构特征引起的可能的非特异性效应的序列；(3)包含三碱基基序(例如，GGG、CCC、AAA或TTT)的序列；(4)包含成排的7个或更多个G/C的延伸的序列；以及(5)在导致内部折回结构的候选物内包含具有4个或更多个碱基的直接重复的序列。然而，本领域技术人员将了解仍然可以选择具有一个或多个上述特征的序列用于进一步分析并且测试作为可能的siRNA序列。
在一些实施方案中，可以基于如在例如Khvorova等,Cell,115:209-216(2003)和Schwarz等,Cell,115:199-208(2003)中描述的siRNA双链体不对称性进一步分析可能的siRNA序列。在其它实施方案中，可以基于如在例如Luo等,Biophys.Res.Commun.,318:303-310(2004)中描述的在靶位点上的二级结构进一步分析可能的siRNA序列。例如，可以使用Mfold算法(在http://mfold.burnet.edu.au/rna_form上可获得的)来建模靶位点处的二级结构以选择有利于在靶位点进入的siRNA序列，其中存在较少的以碱基配对和茎-环形式的二级结构。
一旦已经鉴定出可能的siRNA序列，就可以例如使用体外细胞因子测定或体内动物模型分析序列的任何免疫刺激性质的存在。siRNA序列的有义链和/或反义链中的基序如富含GU的基序(例如，5’-GU-3’、5’-UGU-3’、5’-GUGU-3’、5’-UGUGU-3’等)还可以提供序列是否可能为免疫刺激性的指示。一旦发现siRNA分子为免疫刺激性的，然后可以如本文所描述对其修饰以减少其免疫刺激性质。作为一个非限制性实例，可以在使得细胞产生可检测的免疫应答以确定siRNA是否为免疫刺激性或非免疫刺激性的siRNA的条件下使siRNA序列与哺乳动物应答细胞接触。哺乳动物应答细胞可以来自初生哺乳动物(即，先前尚未与siRNA序列的基因产物接触的哺乳动物)。哺乳动物应答细胞可以为例如外周血单核细胞(PBMC)、巨噬细胞等。可检测的免疫应答可以包括产生细胞因子或生长因子例如像TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-6、IL-12或其组合。然后可以通过用修饰的核苷酸替代有义链和/或反义链上的至少一个核苷酸来修饰鉴定为免疫刺激性的siRNA分子以减少其免疫刺激性质。例如，在siRNA双链体的双链区中，小于约30％(例如，小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％)的核苷酸可以被修饰的核苷酸如2’OMe核苷酸替代。然后可以使修饰的siRNA与如上描述的哺乳动物应答细胞接触以证实其免疫刺激性质有所减小或消除。
用于检测免疫应答的适合的体外测定包括但不限于David等(美国专利号4,376,110)的双单克隆抗体夹心免疫测定技术；单克隆-多克隆抗体夹心测定(Wide等,在Kirkham和Hunter编著,Radioimmunoassay Methods,E.and S.Livingstone,Edinburgh(1970)中)；Gordon等(美国专利号4,452,901)的“蛋白质印迹”方法；标记配体的免疫沉淀(Brown等,J.Biol.Chem.,255:4980-4983(1980))；例如由Raines等,J.Biol.Chem.,257:5154-5160(1982)所描述的酶联免疫吸附测定(ELISA)；免疫细胞化学技术，包括使用荧光染料(Brooks等,Clin.Exp.Immunol.,39:477(1980))；以及活性的中和(Bowen-Pope等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:2396-2400(1984))。除了以上描述的免疫测定之外，许多其它免疫测定可供使用，包括在美国专利号3,817,827；3,850,752；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074和4,098,876中描述的那些。这些参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
用于检测免疫应答的体内模型的一个非限制性实例包括如在例如Judge等,Mol.Ther.,13:494-505(2006)中描述的体内小鼠细胞因子诱导测定。在某些实施方案中，可以进行的测定如下：(1)可以通过在侧尾静脉中的标准静脉内注射来施用siRNA；(2)在施用后约6小鼠可以通过心脏穿刺收集血液并且加工成血浆用于细胞因子分析；以及(3)可以根据制造商的说明使用夹心ELISA试剂盒来定量细胞因子(例如，小鼠和人IFN-α(PBLBiomedical；Piscataway,NJ)；人IL-6和TNF-α(eBioscience；San Diego,CA)；以及小鼠IL-6、TNF-α和IFN-γ(BD Biosciences；San Diego,CA))。
特异性结合细胞因子和生长因子的单克隆抗体可从多种来源商业上获得并且可以使用本领域中已知的方法产生(参见，例如Kohler等,Nature,256:495-497(1975)以及Harlow和Lane,ANTIBODIES,ALABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Publication,NewYork(1999))。先前已描述了单克隆抗体的产生并且可以通过本领域中已知的任何方式实现(Buhring等,在Hybridoma,第10卷,第1期,第77-78页(1991)中)。在一些方法中，标记(例如，使用通过光谱、光化学、生物化学、电学、光学或化学方式可检测的任何组合物)单克隆抗体以有利于检测。
b)产生siRNA分子
可以若干形式提供siRNA，包括例如呈一种或多种分离的小干扰RNA(siRNA)双链体、呈较长的双链RNA(dsRNA)或呈由DNA质粒中的转录盒转录的siRNA或dsRNA。在一些实施方案中，siRNA可以酶促产生或通过部分/完全有机合成产生，并且修饰的核糖核苷酸可以通过体外酶促或有机合成引入。在某些例子中，化学制备每条链。合成RNA分子的方法为本领域中已知的，例如在Verma和Eckstein(1998)中所描述或如本文所描述的化学合成方法。
RNA群可以用来提供长前体RNA，或与选择的靶序列基本上或完全同一的长前体RNA可以用来制造siRNA。可以根据本领域技术人员熟知的方法从细胞或组织中分离RNA，合成和/或克隆RNA。RNA可为混合群体(从细胞或组织获得，由cDNA转录，减去，选择等)，或可代表单一靶序列。RNA可为天然存在的(例如，从组织或细胞样品中分离的)、体外合成(例如，使用T7或SP6聚合酶和PCR产物或克隆的cDNA)或化学合成。
为了形成长dsRNA，针对合成的RNA，还在体外转录并且杂交补体以形成dsRNA。如果使用天然存在的RNA群，还例如通过转录相应于RNA群的cDNA或通过使用RNA聚合酶提供RNA补体(例如，以形成用于被大肠杆菌RNA酶III或切酶消化的dsRNA)。然后杂交前体RNA以形成用于消化的双链RNA。可以直接向受试者施用dsRNA或可以在施用之前体外消化所述dsRNA。
用于分离RNA、合成RNA、杂交核酸、制造和筛选cDNA文库以及进行PCR的方法为本领域中熟知的(参见，例如，Gubler和Hoffman,Gene,25:263-269(1983)；Sambrook等,同上；Ausubel等,同上)，PCR方法同样如此(参见，美国专利号4,683,195和4,683,202；PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Innis等,编著,1990))。表达文库也为本领域技术人员熟知的。公开了在本发明中使用的一般方法的额外基础文章包括Sambrook等,Molecular Cloning,ALaboratory Manual(第2版1989)；Kriegler,GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等,编著,1994)。这些参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
优选地，化学合成siRNA。包含本发明的siRNA分子的寡核苷酸可以使用本领域中已知的任何各种技术来合成，如在Usman等,J.Am.Chem.Soc.,109:7845(1987)；Scaringe等,Nucl.Acids Res.,18:5433(1990)；Wincott等,Nucl.Acids Res.,23:2677-2684(1995)；以及Wincott等,Methods Mol.Bio.,74:59(1997)中描述的那些。寡核苷酸的合成使用了常见的核酸保护基和偶联基，如5’-末端上的二甲氧基三苯甲基和3’-末端上的亚磷酰胺。作为一个非限制性实例，小规模合成可以在使用0.2μmol规模方案的AppliedBiosystems合成仪上进行。或者，在0.2μmol规模下的合成可以在来自Protogene(PaloAlto,CA)的96孔板合成仪上进行。然而，更大或更小规模的合成也在本发明的范围内。用于寡核苷酸合成的适合试剂、用于RNA去保护的方法以及用于RNA纯化的方法为本领域技术人员已知的。
siRNA分子还可以经由串联合成技术合成，其中两条链均合成为通过可裂解接头分开的单一连续寡核苷酸片段或链，所述可裂解接头随后裂解以提供杂交形成siRNA双链体的分开的片段或链。接头可为多核苷酸接头或非核苷酸接头。siRNA的串联合成可以易于适应多孔/多板合成平台以及采用间歇反应器、合成塔等的大规模合成平台。或者，可以由两个相异的寡核苷酸组装siRNA分子，其中一个寡核苷酸包含siRNA的有义链并且另一个包含siRNA的反义链。例如，可以分开合成每条链并且在合成和/或去保护之后通过杂交或连接连在一起。在某些其它例子中，siRNA分子可以合成为单一连续寡核苷酸片段，其中自身互补有义区和反义区杂交形成具有发夹二级结构的siRNA双链体。
c)修饰siRNA序列
在某些方面中，siRNA分子在双链区中包含具有两条链的双链体和至少一个修饰的核苷酸，其中每条链的长度均为约15至约60个核苷酸。有利地，修饰的siRNA的免疫刺激性比相应的未修饰的siRNA序列的免疫刺激性小，但仍保留使靶序列的表达沉默的能力。在优选的实施方案中，引入到siRNA分子中的化学修饰的程度在siRNA的免疫刺激性质的减小或消除与RNAi活性保留之间达成平衡。作为一个非限制性实例，靶向感兴趣的基因的siRNA分子可以在siRNA双链体内的选择性尿苷和/或鸟苷核苷酸上最小修饰(例如，小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％修饰)以消除由siRNA产生的免疫应答同时保留其使靶基因表达沉默的能力。
适合用于本发明的修饰的核苷酸的实例包括但不限于具有2’-O-甲基(2’OMe)、2’-脱氧-2’-氟(2’F)、2’-脱氧、5-C-甲基、2’-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、4’-硫基、2’-氨基或2’-C-烯丙基的核糖核苷酸。具有Northern构象的修饰的核苷酸如在例如Saenger,Principles of Nucleic Acid Structure,Springer-Verlag编著(1984)中描述的那些也适合用于siRNA分子。此类修饰的核苷酸包括但不限于锁核酸(LNA)核苷酸(例如，2’-O核苷酸、4’-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)、2’-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)核苷酸、2’-甲基-硫代-乙基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸、2’-脱氧-2’-氯(2’Cl)核苷酸以及2’-叠氮基核苷酸。在某些例子中，本文描述的siRNA分子包括一个或多个G型夹核苷酸。G型夹核苷酸是指修饰的胞嘧啶类似物，其中修饰赋予双链体内的互补鸟嘌呤核苷酸的Watson-Crick和Hoogsteen这两个面的氢键能力(参见，例如Lin等,J.Am.Chem.Soc.,120:8531-8532(1998))。另外，具有核苷酸碱基类似物例如像C-苯基、C-萘基、其它芳香族衍生物、肌苷、吡咯羧酰胺(azole carboxamide)以及硝基吡咯衍生物如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚(参见，例如Loakes,Nucl.Acids Res.,29:2437-2447(2001))的核苷酸可以掺入到siRNA分子中。
在某些实施方案中，siRNA分子可以进一步包含一个或多个化学修饰，如末端帽部分、磷酸酯骨架修饰等。末端帽部分的实例包括但不限于：反向脱氧脱碱基残基、甘油基修饰、4’,5’-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、苏型呋喃戊糖基核苷酸、无环3’,4’-闭联核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-反向核苷酸部分、3’-3’-反向脱碱基部分、3’-2’-反向核苷酸部分、3’-2’-反向脱碱基部分、5’-5’-反向核苷酸部分、5’-5’-反向脱碱基部分、3’-5’-反向脱氧脱碱基部分、磷酸5’-氨基-烷基酯、磷酸1,3-二氨基-2-丙酯、磷酸3-氨基丙酯、磷酸6-氨基己酯、磷酸1,2-氨基十二烷基酯、磷酸羟丙酯、磷酸1,4-丁二醇酯、3’-氨基磷酸酯、5’-氨基磷酸酯、磷酸己酯、磷酸氨基己酯、3’-磷酸酯、5’-氨基、3’-硫代磷酸酯、5’-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯以及桥联或未桥联的膦酸甲酯或5’-巯基部分(参见，例如美国专利号5,998,203；Beaucage等,Tetrahedron 49:1925(1993))。磷酸酯骨架修饰(即，产生修饰的核苷酸间键)的非限制性实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化物、氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛以及烷基甲硅烷基取代(参见，例如Hunziker等,Nucleic Acid Analogues:Synthesis andProperties,in Modern Synthetic Methods,VCH,331-417(1995)；Mesmaeker等,NovelBackbone Replacements for Oligonucleotides,in Carbohydrate Modifications inAntisense Research,ACS,24-39(1994))。此类化学修饰可以发生在siRNA的有义链、反义链或这两条链的5’-末端和/或3’-末端。这些参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，siRNA分子的有义链和/或反义链可以进一步包含3’-末端突出端，其具有约1至约4个(例如，1个、2个、3个或4个)2’-脱氧核糖核苷酸、修饰的(例如，2’OMe)和/或未修饰的尿苷核糖核苷酸、和/或修饰的(例如，2’OMe)和未修饰的核苷酸的任何其它组合。
可以引入到siRNA分子中的修饰的核苷酸和化学修饰的类型的其它实例描述于例如英国专利号GB 2,397,818B和美国专利申请公布号2004/0192626、2005/0282188和2007/0135372中，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
本文描述的siRNA分子可以在siRNA的一条链或两条链中任选地包含一个或多个非核苷酸。如本文所使用，术语“非核苷酸”是指可以替代一个或多个核苷酸单元掺入到核酸链中的任何基团或化合物，包括糖和/或磷酸取代，并且允许剩余的碱基展现其活性。所述基团或化合物为脱碱基的，因为其不含有公认的核苷酸碱基如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶并且因此在1’-位置上缺乏碱基。
在其它实施方案中，siRNA的化学修饰包括将缀合物附接至siRNA分子。缀合物可以经由共价附接例如像生物可降解的接头在siRNA的有义链和/或反义链的5’-末端和/或3’-末端上附接。还可以例如通过氨基甲酸酯基团或其它连接基团将缀合物附接至siRNA(参见，例如美国专利申请公布号2005/0074771、2005/0043219和2005/0158727)。在某些例子中，缀合物为有利于siRNA递送至细胞中的分子。适用于附接至siRNA的缀合物分子的实例包括但不限于类固醇如胆固醇、二醇如聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白(HSA)、脂肪酸、类胡萝卜素、萜烯、胆汁酸、叶酸盐(例如，叶酸、叶酸盐类似物及其衍生物)、糖(例如，半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、葡萄糖、甘露糖、果糖、岩藻糖等)、磷脂、肽、能够介导细胞摄取的细胞受体的配体及其组合(参见，例如美国专利申请公布号2003/0130186、2004/0110296和2004/0249178；美国专利号6,753,423)。其它实例包括描述于美国专利申请公布号2005/0119470和2005/0107325中的亲脂性部分、维生素、聚合物、肽、蛋白质、核酸、小分子、寡糖、碳水化合物簇、嵌入剂、小沟粘合剂、裂解剂以及交联剂缀合物分子。又其它的实例包括描述于美国专利申请公布号2005/0153337中的2’-O-烷基胺、2’-O-烷氧基烷基胺、多胺、C5-阳离子修饰的嘧啶、阳离子肽、胍基、脒鎓基团、阳离子氨基酸缀合物分子。其它实例包括描述于美国专利申请公布号2004/0167090中的疏水基、膜活性化合物、细胞穿透化合物、细胞靶向信号、相互作用改性剂以及空间稳定剂缀合物分子。另外的实例包括描述于美国专利申请公布号2005/0239739中的缀合物分子。可以针对siRNA的改进的药物代谢动力学特征、生物利用率和/或稳定性同时保留RNAi活性来评价所使用的缀合物的类型和缀合至siRNA分子的程度。因此，本领域技术人员可以使用任何各种熟知的体外细胞培养物或体内动物模型筛选具有附接至其上的各种缀合物的siRNA分子以鉴定具有改进性质和全部RNAi活性的siRNA分子。上述专利文件的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
d)靶基因
本文描述的核酸-脂质颗粒的siRNA组分可以用来下调或沉默感兴趣的基因的翻译(即，表达)。感兴趣的基因包括但不限于：与病毒感染和存活相关的基因、与代谢疾病和病症(例如，肝脏疾病和病症)相关的基因、与肿瘤发生或细胞转化(例如，癌症)相关的基因、血管生成基因、免疫调节基因如与炎性和自身免疫应答相关的那些、受体配体基因以及与神经变性病症相关的基因。
在具体实施方案中，本发明提供了使感兴趣的多个基因的表达沉默的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个siRNA分子的混合物(cocktail)。在一些实施方案中，siRNA分子的混合物完全包囊在脂质颗粒如核酸-脂质颗粒(例如，LNP)中。siRNA分子可以共同包囊在相同脂质颗粒中，或存在于混合物中的每个siRNA种类可以配制在分开的颗粒中。
与病毒感染和存活相关的基因包括由宿主(例如，宿主因子如组织因子(TF))或病毒表达的那些，以便结合、进入和在细胞中复制。特别感兴趣的是与慢性病毒疾病相关的病毒序列。特别感兴趣的病毒序列包括以下病毒的序列：丝状病毒如埃博拉病毒和马尔堡病毒(参见，例如Geisbert等,J.Infect.Dis.,193:1650-1657(2006))；沙粒病毒如拉沙病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、瓜纳瑞托病毒以及萨比亚病毒(Buchmeier等,Arenaviridae:theviruses and their replication,FIELDS VIROLOGY,Knipe等(编著),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia,(2001))；流感病毒如甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒(参见，例如Steinhauer等,Annu Rev Genet.,36:305-332(2002)；和Neumann等,J GenVirol.,83:2635-2662(2002))；肝炎病毒(参见，例如Hamasaki等,FEBS Lett.,543:51(2003)；Yokota等,EMBO Rep.,4:602(2003)；Schlomai等,Hepatology,37:764(2003)；Wilson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2783(2003)；Kapadia等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2014(2003)；以及FIELDS VIROLOGY,Knipe等(编著),第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(2001))；人免疫缺陷病毒(HIV)(Banerjea等,Mol.Ther.,8:62(2003)；Song等,J.Virol.,77:7174(2003)；Stephenson,JAMA,289:1494(2003)；Qin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:183(2003))；疱疹病毒(Jia等,J.Virol.,77:3301(2003))；以及人乳头瘤病毒(HPV)(Hall等,J.Virol.,77:6066(2003)；Jiang等,Oncogene,21:6041(2002))。
可以被沉默的示例性丝状病毒核酸序列包括但不限于编码结构蛋白(例如，VP30、VP35、核蛋白(NP)、聚合酶蛋白(L-pol))和膜相关蛋白(例如，VP40、糖蛋白(GP)、VP24)的核酸序列。用于埃博拉病毒的完整基因组序列在例如Genbank登记号NC_002549；AY769362；NC_006432；NC_004161；AY729654；AY354458；AY142960；AB050936；AF522874；AF499101；AF272001；以及AF086833中列出。埃博拉病毒VP24序列在例如Genbank登记号U77385和AY058897中列出。埃博拉病毒L-pol序列在例如Genbank登记号X67110中列出。埃博拉病毒VP40序列在例如Genbank登记号AY058896中列出。埃博拉病毒NP序列在例如Genbank登记号AY058895中列出。埃博拉病毒GP序列在例如Genbank登记号AY058898；Sanchez等,VirusRes.,29:215-240(1993)；Will等,J.Virol.,67:1203-1210(1993)；Volchkov等,FEBSLett.,305:181-184(1992)；以及美国专利号6,713,069中列出。额外的埃博拉病毒序列在例如Genbank登记号L11365和X61274中列出。用于马尔堡病毒的完整基因组序列在例如Genbank登记号NC_001608；AY430365；AY430366和AY358025中列出。马尔堡病毒GP序列在例如Genbank登记号AF005734；AF005733和AF005732中列出。马尔堡病毒VP35序列在例如Genbank登记号AF005731和AF005730中列出。额外的马尔堡病毒序列在例如Genbank登记号X64406；Z29337；AF005735和Z12132中列出。靶向埃博拉病毒和马尔堡病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在2009年12月15日提交的美国专利申请公布号2007/0135370和美国临时申请号61/286,741中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
可以被沉默的示例性沙粒病毒核酸序列包括但不限于编码核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)、L-聚合酶(L)和Z蛋白(Z)的核酸序列。用于拉沙病毒的完整基因组序列在例如Genbank登记号NC_004296(LASV区段S)和NC_004297(LASV区段L)中列出。靶向拉沙病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在2010年3月31日提交的美国临时申请号61/319,855中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
可以被沉默的示例性宿主核酸序列包括但不限于编码宿主因子如组织因子(TF)的核酸序列，已知其在出血热病毒的发病机制中起作用。TF的mRNA序列在Genbank登记号NM_001993中列出。本领域技术人员将了解，TF又称为F3、凝血因子III、促凝血酶原激酶以及CD142。靶向TF核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在2010年3月31日提交的美国临时申请号61/319,855中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
可以被沉默的示例性流感病毒核酸序列包括但不限于编码核蛋白(NP)、基质蛋白(M1和M2)、非结构蛋白(NS1和NS2)、RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)、神经氨酸酶(NA)以及血细胞凝集素(HA)的核酸序列。甲型流感病毒NP序列在例如Genbank登记号NC_004522；AY818138；AB166863；AB188817；AB189046；AB189054；AB189062；AY646169；AY646177；AY651486；AY651493；AY651494；AY651495；AY651496；AY651497；AY651498；AY651499；AY651500；AY651501；AY651502；AY651503；AY651504；AY651505；AY651506；AY651507；AY651509；AY651528；AY770996；AY790308；AY818138；以及AY818140中列出。甲型流感病毒PA序列在例如Genbank登记号AY818132；AY790280；AY646171；AY818132；AY818133；AY646179；AY818134；AY551934；AY651613；AY651610；AY651620；AY651617；AY651600；AY651611；AY651606；AY651618；AY651608；AY651607；AY651605；AY651609；AY651615；AY651616；AY651640；AY651614；AY651612；AY651621；AY651619；AY770995；以及AY724786中列出。靶向流感病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2007/0218122中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
可以被沉默的示例性肝炎病毒核酸序列包括但不限于在转录和翻译中涉及的核酸序列(例如，En1、En2、X、P)以及编码结构蛋白(例如，包括C蛋白和C相关蛋白的核心蛋白；包括S蛋白、M蛋白和/或L蛋白的衣壳蛋白和包膜蛋白或其片段)的核酸序列(参见，例如FIELDS VIROLOGY,同上)。可以被沉默的示例性丙型肝炎病毒(HCV)核酸序列包括但不限于5’-非翻译区(5’-UTR)、3’-非翻译区(3’-UTR)、多蛋白翻译起始密码子区、内部核糖体进入位点(IRES)序列、和/或编码以下蛋白质的核酸序列：核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白酶/解旋酶、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、和/或NS5B RNA-依赖的RNA聚合酶。HCV基因组序列在例如Genbank登记号NC_004102(HCV基因型1a)、AJ238799(HCV基因型1b)、NC_009823(HCV基因型2)、NC_009824(HCV基因型3)、NC_009825(HCV基因型4)、NC_009826(HCV基因型5)以及NC_009827(HCV基因型6)中列出。甲型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登记号NC_001489中列出；乙型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登记号NC_003977中列出；丁型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登记号NC_001653中列出；戊型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登记号NC_001434中列出；以及庚型肝炎病毒核酸序列在例如Genbank登记号NC_001710中列出。使编码与病毒感染和存活相关的基因的序列沉默可以方便地与用来治疗病毒病状的常规药剂的施用组合使用。靶向肝炎病毒核酸序列的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2006/0281175、2005/0058982和2007/0149470；美国专利号7,348,314；以及2010年3月19日提交的代理案号为020801-008910PC的名称为“Compositions and Methods for Silencing Hepatitis C Virus Expression”的PCT申请号PCT/CA2010/000444中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
与代谢疾病和病症(例如，其中肝脏为靶的病症以及肝脏疾病和病症)相关的基因包括但不限于在血脂异常中表达的基因例如像载脂蛋白B(APOB)(Genbank登记号NM_000384)、载脂蛋白CIII(APOC3)(Genbank登记号NM_000040和NG_008949REGION:5001..8164)、载脂蛋白E(APOE)(Genbank登记号NM_000041和NG_007084REGION:5001..8612)、前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型(PCSK9)(Genbank登记号NM_174936)、二酰甘油O-酰基转移酶1型(DGAT1)(Genbank登记号NM_012079)、二酰甘油O-酰基转移酶2型(DGAT2)(Genbank登记号NM_032564)、肝脏X受体如LXRα和LXRβ(Genback登记号NM_007121)、法尼酯X受体(FXR)(Genbank登记号NM_005123)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、位点-1蛋白酶(S1P)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶-A还原酶(HMG辅酶-A还原酶)；以及在糖尿病中表达的基因，例如像葡萄糖6-磷酸酶(参见，例如Forman等,Cell,81:687(1995)；Seol等,Mol.Endocrinol.,9:72(1995)、Zavacki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:7909(1997)；Sakai等,Cell,85:1037-1046(1996)；Duncan等,J.Biol.Chem.,272:12778-12785(1997)；Willy等,Genes Dev.,9:1033-1045(1995)；Lehmann等,J.Biol.Chem.,272:3137-3140(1997)；Janowski等,Nature,383:728-731(1996)；以及Peet等,Cell,93:693-704(1998))。
本领域技术人员将了解，与代谢疾病和病症(例如，其中肝脏为靶的疾病和病症以及肝脏疾病和病症)相关的基因包括在肝脏本身中表达的基因以及在其它器官和组织中表达的基因。使编码与代谢疾病和病症相关的基因的序列沉默可以方便地与用来治疗疾病或病症的常规药剂的施用组合使用。靶向APOB基因的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2006/0134189、2006/0105976和2007/0135372以及PCT公布号WO 04/091515中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向APOC3基因的siRNA分子的非限制性实例包括在2010年1月26日提交的PCT申请号PCT/CA2010/000120中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向PCSK9基因的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2007/0173473、2008/0113930和2008/0306015中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。可以使用在美国专利申请公布号2004/0185559中描述的反义化合物设计靶向DGAT1基因的示例性siRNA分子，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。可以使用在美国专利申请公布号2005/0043524中描述的反义化合物设计靶向DGAT2基因的示例性siRNA分子，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
与肿瘤发生或细胞转化(例如，癌症或其它瘤形成)相关的基因包括例如涉及p53遍在蛋白化、c-Jun遍在蛋白化、组蛋白脱乙酰化、细胞周期调节、转录调节及其组合的基因。与肿瘤发生或细胞转化相关的基因序列的非限制性实例包括丝氨酸/苏氨酸激酶如polo样激酶1(PLK-1)(Genbank登记号NM_005030；Barr等,Nat.Rev.Mol.CellBiol.,5:429-440(2004))和细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)(Genbank登记号NM_000075)；泛素连接酶如COP1(RFWD2；Genbank登记号NM_022457和NM_001001740)和环框1(RBX1)(ROC1；Genbank登记号NM_014248)；酪氨酸激酶如WEE1(Genbank登记号NM_003390和NM_001143976)；有丝分裂驱动蛋白如Eg5(KSP、KIF11；Genbank登记号NM_004523)；转录因子如叉头框M1(FOXM1)(Genbank登记号NM_202002、NM_021953和NM_202003)和RAM2(R1或CDCA7L；Genbank登记号NM_018719、NM_001127370和NM_001127371)；细胞凋亡的抑制剂如XIAP(Genbank登记号NM_001167)；COP9信号体亚基如CSN1、CSN2、CSN3、CSN4、CSN5(JAB1；Genbank登记号NM_006837)；CSN6、CSN7A、CSN7B和CSN8；以及组蛋白脱乙酰酶如HDAC1、HDAC2(Genbank登记号NM_001527)、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC8、HDAC9等。
靶向PLK-1基因的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2005/0107316和2007/0265438以及PCT公布号WO09/082817中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向Eg5和XIAP基因的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2009/0149403中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向CSN5基因的siRNA分子的非限制性实例包括在PCT公布号WO09/129319中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向COP1、CSN5、RBX1、HDAC2、CDK4、WEE1、FOXM1和RAM2基因的siRNA分子的非限制性实例包括在2009年9月23日提交的美国临时申请号61/245,143中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
与肿瘤发生或细胞转化相关的基因序列的其它实例包括易位序列如MLL融合基因、BCR-ABL(Wilda等,Oncogene,21:5716(2002)；Scherr等,Blood,101:1566(2003))、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETO以及AML1-MTG8(Heidenreich等,Blood,101:3157(2003))；过表达序列如多药耐药性基因(Nieth等,FEBS Lett.,545:144(2003)；Wu等,Cancer Res.63:1515(2003))、细胞周期蛋白(Li等,Cancer Res.,63:3593(2003)；Zou等,Genes Dev.,16:2923(2002))、β-连环蛋白(Verma等,Clin Cancer Res.,9:1291(2003))、端粒酶基因(Kosciolek等,Mol Cancer Ther.,2:209(2003))、c-MYC、N-MYC、BCL-2、生长因子受体(例如，EGFR/ErbB1(Genbank登记号NM_005228、NM_201282、NM_201283和NM_201284；还参见Nagy等Exp.Cell Res.,285:39-49(2003))、ErbB2/HER-2(Genbank登记号NM_004448和NM_001005862)、ErbB3(Genbank登记号NM_001982和NM_001005915)和ErbB4(Genbank登记号NM_005235和NM_001042599))以及突变序列如RAS(Tuschl和Borkhardt,Mol.Interventions,2:158(2002))。靶向EGFR基因的siRNA分子的非限制性实例包括在美国专利申请公布号2009/0149403中描述的那些，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。靶向VEGFR基因的siRNA分子在例如GB 2396864；美国专利申请公布号2004/0142895以及CA 2456444中列出，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
使编码DNA修复酶的序列沉默与化学治疗剂的施用组合使用(Collis等,CancerRes.,63:1550(2003))。编码与肿瘤迁移相关的蛋白质的基因还靶向感兴趣的序列，例如整联蛋白、选择蛋白和金属蛋白酶。上述实例不是排他的。本领域技术人员将理解，可以包括有利于或促进肿瘤发生或细胞转化、肿瘤生长或肿瘤迁移的任何全部或部分基因序列作为模板序列。
血管生成基因能够促进新血管的形成。特别感兴趣的血管生成基因包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)(Reich等,Mol.Vis.,9:210(2003))、胎盘生长因子(PGF)、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)等。靶向VEGFR基因的siRNA分子在例如GB 2396864；美国专利申请公布号2004/0142895以及CA 2456444中列出，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。免疫调节基因为调节一种或多种免疫应答的基因。免疫调节基因的实例包括但不限于生长因子(例如，TGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCF等)、白细胞介素(例如，IL-2、IL-4、IL-12(Hill等,J.Immunol.,171:691(2003))、IL-15、IL-18、IL-20等)、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)以及TNF。Fas基因和Fas配体基因也是感兴趣的免疫调节靶序列(Song等,Nat.Med.,9:347(2003))。在造血细胞和淋巴样细胞中编码二级信号传导分子的基因也包括在本发明中，例如Tec家族激酶如布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)(Heinonen等,FEBS Lett.,527:274(2002))。
细胞受体配体基因包括能够结合细胞表面受体(例如，细胞因子受体、生长因子受体、具有酪氨酸激酶活性的受体、G-蛋白偶联受体、胰岛素受体、EPO受体等)以调节(例如，抑制)涉及受体的生理途径(例如，细胞增殖、肿瘤发生、细胞转化、有丝分裂发生等)的配体。细胞受体配体基因的非限制性实例包括细胞因子(例如，TNF-α，干扰素如IFN-α、IFN-β和IFN-γ，白细胞介素如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-23、IL-27，趋化因子等)、生长因子(例如，EGF、HB-EGF、VEGF、PEDF、SDGF、bFGF、HGF、TGF-α、TGF-β、BMP1-BMP15、PDGF、IGF、NGF、β-NGF、BDNF、NT3、NT4、GDF-9、CGF、G-CSF、GM-CSF、GDF-8、EPO、TPO等)、胰岛素、胰高血糖素、G-蛋白偶联受体配体等。
编码用于三核苷酸重复(例如，CAG重复)扩增的模板可用于在由三核苷酸重复扩增引起的神经变性病症中使致病序列沉默，所述神经变性病症如脊髓延髓肌肉萎缩(spinobulbular muscular atrophy)和亨廷顿舞蹈病(Caplen等,Hum.Mol.Genet.,11:175(2002))。
除了其用于使治疗目的的任何以上描述的基因的表达沉默之外，本文描述的siRNA还有用于研究和开发应用以及诊断、预防、预后、临床和其它医疗保健应用。作为一个非限制性实例，siRNA可以用于针对测试感兴趣的基因是否可能成为治疗性靶的靶验证研究中。siRNA还可以用于旨在发现作为可能的治疗性靶的基因的靶鉴定研究中。
e)示例性siRNA实施方案
在一些实施方案中，siRNA分子的每条链均包含长度为约15至约60个核苷酸(例如，长度为约15-60个、15-50个、15-40个、15-30个、15-25个或19-25个核苷酸，或长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸)。在一个具体实施方案中，化学合成siRNA。本发明的siRNA分子能够在体外和/或在体内使靶序列的表达沉默。
在其它实施方案中，siRNA包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，siRNA在双链区中包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个修饰的核苷酸。在具体实施方案中，在siRNA的双链区中小于约50％(例如，小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)的核苷酸包含修饰的核苷酸。在优选的实施方案中，在siRNA的双链区中，约1％至约50％(例如，约5％-50％、10％-50％、15％-50％、20％-50％、25％-50％、30％-50％、35％-50％、40％-50％、45％-50％、5％-45％、10％-45％、15％-45％、20％-45％、25％-45％、30％-45％、35％-45％、40％-45％、5％-40％、10％-40％、15％-40％、20％-40％、25％-40％、30％-40％、35％-40％、5％-35％、10％-35％、15％-35％、20％-35％、25％-35％、30％-35％、5％-30％、10％-30％、15％-30％、20％-30％、25％-30％、5％-25％、10％-25％、15％-25％、20％-25％、5％-20％、10％-20％、15％-20％、5％-15％、10％-15％或5％-10％)的核苷酸包含修饰的核苷酸。
在另外的实施方案中，siRNA包含修饰的核苷酸，包括但不限于2’-O-甲基(2’OMe)核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’F)核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸及其混合物。在优选的实施方案中，siRNA包含2’OMe核苷酸(例如，2’OMe嘌呤和/或嘧啶核苷酸)，例如像2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸、2’OMe-腺苷核苷酸、2’OMe-胞嘧啶核苷酸或其混合物。在一个具体实施方案中，siRNA包含至少一个2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸或其混合物。在某些例子中，siRNA不包含2’OMe-胞嘧啶核苷酸。在其它实施方案中，siRNA包含发夹环结构。
在某些实施方案中，siRNA在siRNA分子的双链区的一条链(即，有义或反义的)或两条链中包含修饰的核苷酸。优选地，在siRNA双链体的双链区中的选择性位置修饰尿苷和/或鸟苷核苷酸。关于尿苷核苷酸修饰，有义和/或反义链中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个尿苷核苷酸可为修饰的尿苷核苷酸如2’OMe-尿苷核苷酸。在一些实施方案中，有义和/或反义链中的每个尿苷核苷酸均为2’OMe-尿苷核苷酸。关于鸟苷核苷酸修饰，有义和/或反义链中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个鸟苷核苷酸可为修饰的鸟苷核苷酸如2’OMe-鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，有义和/或反义链中的每个鸟苷核苷酸均为2’OMe-鸟苷核苷酸。
在某些实施方案中，siRNA序列中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个5’-GU-3’基序可以例如通过引入错配以消除5’-GU-3’基序和/或通过引入修饰的核苷酸如2’OMe核苷酸来加以修饰。5’-GU-3’基序可以处于siRNA序列的有义链、反义链或这两条链中。5’-GU-3’基序可以彼此相邻或可选地，它们可以被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸分开。
在一些实施方案中，修饰的siRNA分子的免疫刺激性比相应的未修饰的siRNA序列的免疫刺激性小。在此类实施方案中，具有减小的免疫刺激性质的修饰的siRNA分子有利地保留对抗靶序列的RNAi活性。在另一个实施方案中，修饰的siRNA分子的免疫刺激性质和其使靶基因表达沉默的能力可以通过在siRNA序列内，例如像在siRNA双链体的双链区内引入最小的且选择性的2’OMe修饰来加以平衡或优化。在某些例子中，修饰的siRNA的免疫刺激性比相应的未修饰的siRNA的免疫刺激性小至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。本领域技术人员将很容易看出，修饰的siRNA分子和相应的未修饰的siRNA分子的免疫刺激性质可以通过例如在哺乳动物体内系统施用或使用适当的基于脂质的递送系统(如本文公开的LNP递送系统)转染哺乳动物应答细胞之后约两小时至约十二小时测量INF-α和/或IL-6水平来确定。
在其它实施方案中，修饰的siRNA分子具有小于或等于相应的未修饰的siRNA十倍的IC50(即，半数最大抑制浓度)(即，修饰的siRNA具有小于或等于相应的未修饰的siRNA的IC50十倍的IC50)。在其它实施方案中，修饰的siRNA具有小于或等于相应的未修饰的siRNA序列三倍的IC50。在又其它实施方案中，修饰的siRNA具有小于或等于相应的未修饰的siRNA两倍的IC50。本领域技术人员将很容易看出，可以产生剂量-应答曲线并且修饰的siRNA和相应的未修饰的siRNA的IC50值可以使用本领域技术人员已知的方法容易地确定。
在另一个实施方案中，相对于阴性对照(例如，仅有缓冲液、靶向不同基因的siRNA序列、加扰siRNA序列等)，未修饰或修饰的siRNA分子能够使至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的靶序列的表达沉默。
在又一个实施方案中，相对于相应的未修饰的siRNA序列，修饰的siRNA分子能够使至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的靶序列的表达沉默。
在一些实施方案中，siRNA分子例如在双链区的有义和/或反义链中不包含磷酸酯骨架修饰。在其它实施方案中，siRNA例如在双链区的有义和/或反义链中包含一个、两个、三个、四个或更多个磷酸酯骨架修饰。在优选的实施方案中，siRNA不包含磷酸酯骨架修饰。
在另外的实施方案中，siRNA例如在双链区的有义和/或反义链中不包含2’-脱氧核苷酸。在又另外的实施方案中，siRNA例如在双链区的有义和/或反义链中包含一个、两个、三个、四个或更多个2’-脱氧核苷酸。在优选的实施方案中，siRNA不包含2’-脱氧核苷酸。
在某些例子中，在有义和/或反义链中的双链区的3’-末端上的核苷酸不是修饰的核苷酸。在某些其它例子中，接近有义和/或反义链中的双链区的3’-末端(例如，在3’-末端的一个、两个、三个或四个核苷酸内)的核苷酸不是修饰的核苷酸。
本文描述的siRNA分子可以在双链区的一侧或两侧上具有一个、两个、三个、四个或更多个核苷酸的3’突出端，或可以在双链区的一侧或两侧上缺乏突出端(即，具有平端)。在某些实施方案中，有义和/或反义链上的3’突出端独立地包含一个、两个、三个、四个或更多个修饰的核苷酸如2’OMe核苷酸和/或本文描述或本领域已知的任何其它修饰的核苷酸。
在具体实施方案中，使用载体系统如核酸-脂质颗粒施用siRNA。在优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒包含：(a)一个或多个siRNA分子；(b)式I的阳离子脂质或其盐；以及(c)非阳离子脂质(例如，DPPC、DSPC、DSPE和/或胆固醇)。在某些例子中，核酸-脂质颗粒可以进一步包含防止颗粒聚集的缀合的脂质(例如，PEG-DAA和/或POZ-DAA)。
2.切酶-底物dsRNA
如本文所使用，术语“切酶-底物dsRNA”或“前体RNAi分子”旨在包括由切酶在体内加工以产生活性siRNA的任何前体分子，所述活性siRNA掺入到RISC复合体中用于靶基因RNA干扰。
在一个实施方案中，切酶-底物dsRNA具有足够使得其被切酶加工以产生siRNA的长度。根据此实施方案，切酶-底物dsRNA包含(i)第一寡核苷酸序列(又称为有义链)，其的长度在约25与约60个核苷酸之间(例如，长度为约25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35或25-30个核苷酸)、优选地长度在约25与约30个核苷酸之间(例如，长度为25、26、27、28、29或30个核苷酸)，和(ii)第二寡核苷酸序列(又称为反义链)，其在生物条件下如在细胞的细胞质中存在的条件下与第一序列退火。第二寡核苷酸序列的长度可以在约25与约60个核苷酸之间(例如，长度为约25-60、25-55、25-50、25-45、25-40、25-35或25-30个核苷酸)，并且优选地长度为约25与约30个核苷酸之间(例如，长度为25、26、27、28、29或30个核苷酸)。另外，切酶-底物dsRNA的序列之一(具体地反义链)的区的序列长度为至少约19个核苷酸，例如约19至约60个核苷酸(例如，约19-60、19-55、19-50、19-45、19-40、19-35、19-30或19-25个核苷酸)、优选地约19至约23个核苷酸(例如，19、20、21、22或23个核苷酸)，其足够与从靶基因产生的RNA的核苷酸序列互补以引发RNAi应答。
在第二实施方案中，切酶-底物dsRNA具有增强其被切酶加工的若干性质。根据此实施方案，dsRNA具有足够使得其被切酶加工以产生siRNA的长度并且具有至少一种以下性质：(i)dsRNA为不对称的，例如在反义链上具有3’-突出端；和/或(ii)dsRNA在有义链上具有修饰的3’-末端以指导切酶结合和加工dsRNA为活性siRNA的方向。根据后者的实施方案，有义链包含约22至约28个核苷酸并且反义链包含约24至约30个核苷酸。
在一个实施方案中，切酶-底物dsRNA在反义链的3’-末端上具有突出端。在另一个实施方案中，通过位于有义链的3’-末端上的适合修饰剂来修饰有义链以用于切酶结合和加工。适合的修饰剂包括核苷酸如脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等、以及空间位阻分子如荧光分子等。当使用核苷酸修饰剂时，它们替代dsRNA中的核糖核苷酸使得dsRNA的长度不变。在另一个实施方案中，切酶-底物dsRNA在反义链的3’-末端上具有突出端并且有义链被修饰用于切酶加工。在另一个实施方案中，有义链的5’-末端具有磷酸酯。在另一个实施方案中，反义链的5’-末端具有磷酸酯。在另一个实施方案中，反义链或有义链或这两条链具有一个或多个2’-O-甲基(2’OMe)修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，反义链含有2’OMe修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，反义链含有由2’OMe修饰的核苷酸组成的3’-突出端。反义链还可以包括额外的2’OMe修饰的核苷酸。有义链和反义链在生物条件下，如在细胞的细胞质中存在的条件下退火。另外，切酶-底物dsRNA的序列之一(具体地反义链)的区的序列长度为至少约19个核苷酸，其中这些核苷酸处于与反义链的3’-末端相邻的21个核苷酸区中并且足够与从靶基因产生的RNA的核苷酸序列互补。此外，根据此实施方案，切酶-底物dsRNA还可以具有一个或多个以下额外的性质：(a)反义链从通常的21-聚体向右移(即，当与通常的21-聚体相比时，反义链在分子的右侧上包括核苷酸)；(b)链可以不是完全互补的，即链可以含有简单的错配配对；以及(c)碱基修饰如一个或多个锁核酸可以包括在有义链的5’-末端中。
在第三实施方案中，有义链包含约25至约28个核苷酸(例如，25、26、27或28个核苷酸)，其中有义链的3’-末端上的2个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。有义链在5’-末端上含有磷酸酯。反义链包含约26至约30个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)并且含有具有1-4个核苷酸的3’-突出端。包含3’-突出端的核苷酸被2’OMe修饰的核糖核苷酸修饰。反义链含有在相邻于3’-突出端的反义链的第一个单体处开始并且从相邻于3’-突出端的第一个单体延伸15-19个核苷酸的交替的2’OMe修饰的核苷酸。例如，针对27个核苷酸反义链并且将反义链的5’-末端处的第一个碱基计数为位置编号1，2’OMe修饰将位于碱基9、11、13、15、17、19、21、23、25、26和27。在一个实施方案中，切酶-底物dsRNA具有以下结构：
5′-pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD-3′
3′-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp-5′
其中“X”＝RNA，“p”＝磷酸酯基团，“X”＝2’OMe RNA，“Y”为由1、2、3或4个RNA单体组成的突出端结构域，所述RNA单体任选地为2’OMe RNA单体，并且“D”＝DNA。上面的链为有义链，并且下面的链为反义链。
在第四实施方案中，切酶-底物dsRNA具有增强其被切酶加工的若干性质。根据此实施方案，dsRNA具有足够使得其被切酶加工以产生siRNA的长度并且具有至少一种以下性质：(i)dsRNA为不对称的，例如在有义链上具有3’-突出端；和(ii)dsRNA在反义链上具有修饰的3’-末端以指导切酶结合和加工dsRNA为活性siRNA的方向。根据此实施方案，有义链包含约24至约30个核苷酸(例如，24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)并且反义链包含约22至约28个核苷酸(例如，22、23、24、25、26、27或28个核苷酸)。在一个实施方案中，切酶-底物dsRNA在有义链的3’-末端上具有突出端。在另一个实施方案中，通过位于反义链的3’-末端上的适合修饰剂来修饰反义链以用于切酶结合和加工。适合的修饰剂包括核苷酸如脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等、以及空间位阻分子如荧光分子等。当使用核苷酸修饰剂时，它们替代dsRNA中的核糖核苷酸使得dsRNA的长度不变。在另一个实施方案中，dsRNA在有义链的3’-末端上具有突出端并且反义链被修饰用于切酶加工。在一个实施方案中，反义链具有5’-磷酸酯。有义链和反义链在生物条件下，如在细胞的细胞质中存在的条件下退火。另外，dsRNA的序列之一(具体地反义链)的区的序列长度为至少19个核苷酸，其中这些核苷酸与反义链的3’-末端相邻并且足够与从靶基因产生的RNA的核苷酸序列互补。此外，根据此实施方案，切酶-底物dsRNA还可以具有一个或多个以下额外的性质：(a)反义链从通常的21-聚体向左移(即，当与通常的21-聚体相比时，反义链在分子的左侧上包括核苷酸)；和(b)链可以不是完全互补的，即链可以含有简单的错配配对。
在优选的实施方案中，切酶-底物dsRNA具有不对称结构，其中有义链具有25个碱基对长度，并且反义链具有27个碱基对长度和2个碱基3’-突出端。在某些例子中，具有不对称结构的此dsRNA进一步在有义链的3’-末端含有2个脱氧核苷酸替代两个核糖核苷酸。在某些其它例子中，具有不对称结构的此dsRNA进一步在反义链的位置9、11、13、15、17、19、21、23和25上含有2’OMe修饰(其中反义链的5’-末端处的第一个碱基为位置1)。在某些额外例子中，具有不对称结构的此dsRNA进一步在包含1、2、3或4个2’OMe核苷酸的反义链上含有3’-突出端(例如，在反义链上的位置26和27上的2’OMe核苷酸的3’-突出端)。
在另一个实施方案中，可以通过首先选择长度为至少19个核苷酸的反义链siRNA序列来设计切酶-底物dsRNA。在一些例子中，修饰反义siRNA以在5’-末端上包括约5至约11个核糖核苷酸，得到长度为约24至约30个核苷酸。当反义链的长度为21个核苷酸时，可以在5’-末端上添加3-9个、优选地4-7个或更优选地6个核苷酸。虽然所添加的核糖核苷酸可以与靶基因序列互补，但是靶序列与反义siRNA之间的完全互补是不需要的。也就是说，所得到的反义siRNA足够与靶序列互补。然后产生具有约22至约28个核苷酸的有义链。有义链基本上与反义链互补以在生物条件下与反义链退火。在一个实施方案中，合成有义链以含有修饰的3’-末端，以便指导切酶加工反义链。在另一个实施方案中，dsRNA的反义链具有3’-突出端。在另外的实施方案中，合成有义链以含有用于切酶结合和加工的修饰的3’-末端，并且dsRNA的反义链具有3’-突出端。
在相关的实施方案中，可以修饰反义siRNA以在5’-末端上包括约1至约9个核糖核苷酸，得到长度为约22至约28个核苷酸。当反义链的长度为21个核苷酸时，可以在3’-末端上添加1-7个、优选地2-5个或更优选地4个核糖核苷酸。所添加的核糖核苷酸可以具有任何序列。虽然所添加的核糖核苷酸可以与靶基因序列互补，但是靶序列与反义siRNA之间的完全互补是不需要的。也就是说，所得到的反义siRNA足够与靶序列互补。然后产生具有约24至约30个核苷酸的有义链。有义链基本上与反义链互补以在生物条件下与反义链退火。在一个实施方案中，合成反义链以含有修饰的3’-末端，以便指导切酶加工。在另一个实施方案中，dsRNA的有义链具有3’-突出端。在另外的实施方案中，合成反义链以含有用于切酶结合和加工的修饰的3’-末端，并且dsRNA的有义链具有3’-突出端。
可以使用本领域中已知的用于设计、合成和修饰siRNA序列的任何方式来鉴定、合成和修饰适合的切酶-底物dsRNA序列。在具体实施方案中，使用载体系统如核酸-脂质颗粒施用切酶-底物dsRNA。在优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒包含：(a)一个或多个切酶-底物dsRNA分子；(b)式I的阳离子脂质或其盐；以及(c)非阳离子脂质(例如，DPPC、DSPC、DSPE和/或胆固醇)。在某些例子中，核酸-脂质颗粒可以进一步包含防止颗粒聚集的缀合的脂质(例如，PEG-DAA和/或POZ-DAA)。
与本发明的切酶-底物dsRNA相关的额外实施方案以及设计和合成此类dsRNA的方法在美国专利申请公布号2005/0244858、2005/0277610和2007/0265220以及2009年6月5日提交的美国临时申请号61/184,652中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
3.shRNA
“小发夹RNA”或“短发夹RNA”或“shRNA”包括形成可以用来经由RNA干扰使基因表达沉默的紧密发夹环的短RNA序列。本发明的shRNA可以化学合成或从DNA质粒中的转录盒转录。shRNA发夹结构通过细胞机制裂解为siRNA，然后与RNA-诱导的沉默复合体(RISC)结合。
本发明的shRNA的长度通常为约15-60、15-50或15-40个(双链体)核苷酸，更通常地长度为约15-30、15-25或19-25个(双链体)核苷酸，并且优选地长度为约20-24、21-22或21-23个(双链体)核苷酸(例如，双链shRNA的每个互补序列的长度均为15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸，优选地长度为约20-24、21-22或21-23个核苷酸，并且双链shRNA的长度为约15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个碱基对，优选地长度为约18-22、19-20或19-21个碱基对)。shRNA双链体可以在反义链上包含约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3’突出端和/或在有义链上包含5’-磷酸酯末端。在一些实施方案中，shRNA包含长度为约15至约60个核苷酸(例如长度为约15-60、15-55、15-50、15-45、15-40、15-35、15-30或15-25个核苷酸)、优选地长度为约19至约40个核苷酸(例如，长度为约19-40、19-35、19-30或19-25个核苷酸)、更优选地长度为约19至约23个核苷酸(例如，长度为19、20、21、22或23个核苷酸)的有义链和/或反义链序列。
shRNA的非限制性实例包括由单链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义区和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接；并且双链多核苷酸分子具有带自身互补有义区和反义区的发夹二级结构。在优选的实施方案中，shRNA的有义链和反义链通过环结构连接，所述环结构包含约1至约25个核苷酸、约2至约20个核苷酸、约4至约15个核苷酸、约5至约12个核苷酸或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个核苷酸。
可以使用本领域中已知的用于设计、合成和修饰siRNA序列的任何方式来鉴定、合成和修饰适合的shRNA序列。在具体实施方案中，使用载体系统如核酸-脂质颗粒施用shRNA。在优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒包含：(a)一个或多个shRNA分子；(b)式I的阳离子脂质或其盐；以及(c)非阳离子脂质(例如，DPPC、DSPC、DSPE和/或胆固醇)。在某些例子中，核酸-脂质颗粒可以进一步包含防止颗粒聚集的缀合的脂质(例如，PEG-DAA和/或POZ-DAA)。
与本发明的shRNA相关的额外实施方案以及设计和合成此类shRNA的方法在2009年6月5日提交的美国临时申请号61/184,652中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
4.aiRNA
像siRNA一样，不对称干扰RNA(aiRNA)可以募集RNA-诱导的沉默复合体(RISC)并且通过介导相对于反义链的5’末端的核苷酸10与核苷酸11之间的靶序列的序列特异性裂解而在哺乳动物细胞中导致各种基因的有效沉默(Sun等,Nat.Biotech.,26:1379-1382(2008))。通常，aiRNA分子包含具有有义链和反义链的短RNA双链体，其中双链体在反义链的3’末端和5’末端上含有突出端。aiRNA一般为不对称的，因为当与互补反义链相比时，有义链在两端上更短。在一些方面中，可以在类似于用于siRNA分子的那些条件下设计、合成和退火aiRNA分子。作为一个非限制性实例，可以使用以上描述用于选择siRNA序列的方法选择和产生aiRNA序列。
在另一个实施方案中，可以设计在反义链的3’末端和5’末端上具有突出端的各种长度(例如，约10-25、12-20、12-19、12-18、13-17或14-17个碱基对，更通常地12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对)的aiRNA双链体以靶向感兴趣的mRNA。在某些例子中，aiRNA分子的有义链的长度为约10-25、12-20、12-19、12-18、13-17或14-17个核苷酸，更通常地长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在某些其它例子中，aiRNA分子的反义链的长度为约15-60、15-50或15-40个核苷酸，更通常地长度为约15-30、15-25或19-25个核苷酸，并且优选地长度为约20-24、21-22或21-23个核苷酸。
在一些实施方案中，5’反义突出端含有一个、两个、三个、四个或更多个非靶向核苷酸(例如，“AA”、“UU”、“dTdT”等)。在其它实施方案中，3’反义突出端含有一个、两个、三个、四个或更多个非靶向核苷酸(例如，“AA”、“UU”、“dTdT”等)。在某些方面中，本文描述的aiRNA分子可以例如在双链(双链体)区和/或在反义突出端中包含一个或多个修饰的核苷酸。作为一个非限制性实例，aiRNA序列可以包含一个或多个以上针对siRNA序列描述的修饰的核苷酸。在优选的实施方案中，aiRNA分子包含2’OMe核苷酸例如像2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸或其混合物。
在某些实施方案中，aiRNA分子可以包含相应于siRNA分子例如本文描述的siRNA分子之一的反义链的反义链。在具体实施方案中，使用载体系统如核酸-脂质颗粒施用aiRNA。在优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒包含：(a)一个或多个aiRNA分子；(b)式I的阳离子脂质或其盐；以及(c)非阳离子脂质(例如，DPPC、DSPC、DSPE和/或胆固醇)。在某些例子中，核酸-脂质颗粒可以进一步包含防止颗粒聚集的缀合的脂质(例如，PEG-DAA和/或POZ-DAA)。
可以使用本领域中已知的用于设计、合成和修饰siRNA序列的任何方式来鉴定、合成和修饰适合的aiRNA序列。与本发明的aiRNA分子相关的额外实施方案在美国专利申请公布号2009/0291131和PCT公布号WO 09/127060中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
5.miRNA
通常，微小RNA(miRNA)为调节基因表达的长度为约21-23个核苷酸的单链RNA分子。miRNA由转录它们的DNA的基因编码，但是miRNA并没有翻译为蛋白质(非编码RNA)；相反，每个初始转录物(初始-miRNA)均被加工为称作前体-miRNA的短茎-环结构并且最终成为功能性成熟miRNA。成熟miRNA分子与一个或多个信使RNA(mRNA)分子部分或完全互补，并且其主要功能为下调基因表达。miRNA分子的鉴定在例如Lagos-Quintana等,Science,294:853-858；Lau等,Science,294:858-862；以及Lee等,Science,294:862-864中描述。
编码miRNA的基因比加工的成熟miRNA分子长很多。首先miRNA被转录为初始转录物或具有帽和聚-A尾的初始-miRNA并且在细胞核中被加工成称为前体-miRNA的短的、大约70个核苷酸的茎-环结构。通过称为由核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白Pasha组成的微处理器复合体的蛋白质复合体在动物体内进行此加工(Denli等,Nature,432:231-235(2004))。然后通过与核酸内切酶切酶相互作用在细胞质中将这些前体-miRNA加工为成熟的miRNA，这还启动RNA-诱导的沉默复合体(RISC)的形成(Bernstein等,Nature,409:363-366(2001))。DNA的有义链或反义链可以用作产生miRNA的模板。
当切酶裂解前体-miRNA茎-环时，形成两个互补的短RNA分子，但只有一个合并到RISC复合体中。此链称为引导链并且基于5’末端的稳定性通过RISC复合体中的催化活性RNA酶argonaute蛋白来选择(Preall等,Curr.Biol.,16:530-535(2006))。称为反引导或过客链的剩余链被降解为RISC复合体底物(Gregory等,Cell,123:631-640(2005))。在合并到活性RISC复合体中之后，miRNA与其互补mRNA分子碱基配对并且诱导靶mRNA降解和/或翻译沉默。
哺乳动物miRNA分子通常与靶mRNA序列的3’UTR中的位点互补。在某些例子中，miRNA与靶mRNA的退火通过阻断蛋白质翻译机制而抑制了蛋白质翻译。在某些其它例子中，miRNA与靶mRNA的退火通过类似于RNA干扰(RNAi)的方法有利于靶mRNA的裂解和降解。miRNA还可以靶向相应于靶向的mRNA的基因组位点的甲基化。通常，与蛋白质的补体相关的miRNA功能统称为miRNP。
在某些方面中，本文描述的miRNA分子的长度为约15-100、15-90、15-80、15-75、15-70、15-60、15-50或15-40个核苷酸，更通常地长度为约15-30、15-25或19-25个核苷酸，并且优选地长度为约20-24、21-22或21-23个核苷酸。在某些其它方面中，miRNA分子可以包含一个或多个修饰的核苷酸。作为一个非限制性实例，miRNA序列可以包含一个或多个以上针对siRNA序列描述的修饰的核苷酸。在优选的实施方案中，miRNA分子包含2’OMe核苷酸例如像2’OMe-鸟苷核苷酸、2’OMe-尿苷核苷酸或其混合物。
在具体实施方案中，使用载体系统如核酸-脂质颗粒施用miRNA。在优选的实施方案中，核酸-脂质颗粒包含：(a)一个或多个miRNA分子；(b)式I的阳离子脂质或其盐；以及(c)非阳离子脂质(例如，DPPC、DSPC、DSPE和/或胆固醇)。在某些例子中，核酸-脂质颗粒可以进一步包含防止颗粒聚集的缀合的脂质(例如，PEG-DAA和/或POZ-DAA)。
在其它实施方案中，使用本发明的脂质颗粒(例如，核酸-脂质颗粒如LNP)施用阻断靶向感兴趣的mRNA的miRNA的活性的一种或多种药剂。阻断剂的实例包括但不限于空间阻挡寡核苷酸、锁核酸寡核苷酸以及吗啉代寡核苷酸。此类阻断剂可以直接与miRNA结合或与靶mRNA上的miRNA结合位点结合。
与本发明的miRNA分子相关的额外实施方案在美国专利申请公布号2009/0291131和PCT公布号WO 09/127060中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
6.反义寡核苷酸
在一个实施方案中，核酸为涉及感兴趣的靶基因或序列的反义寡核苷酸。术语“反义寡核苷酸”或“反义”包括与靶向的多核苷酸序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸为与选择的序列互补的DNA或RNA的单链。反义RNA寡核苷酸通过与RNA结合防止互补RNA链的翻译。反义DNA寡核苷酸可以用来靶向特异性的互补(编码或非编码)RNA。如果发生结合，此DNA/RNA杂交体可以被酶RNA酶H降解。在具体实施方案中，反义寡核苷酸包含约10至约60个核苷酸，更优选地约15至约30个核苷酸。术语还涵盖可能不与所需的靶基因精确互补的反义寡核苷酸。因此，本发明可以用于使用反义发现非靶特异性活性的例子中，或其中与靶序列含有一个或多个错配的反义序列为最优选的具体使用的例子中。
已证明反义寡核苷酸为蛋白质合成的有效且靶向的抑制剂，并且因此可以用来通过靶向基因特异性地抑制蛋白质合成。反义寡核苷酸用于抑制蛋白质合成的功效为良好确立的。例如，通过涉及其对应的mRNA序列的反义寡核苷酸抑制聚半乳糖醛酸酶(polygalactauronase)和毒蕈碱2型乙酰胆碱受体的合成(参见，美国专利号5,739,119和5,759,829)。此外，反义抑制的实例已证明有核蛋白细胞周期蛋白、多药耐药性基因(MDR1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABAA受体以及人EGF(参见，Jaskulski等,Science,240:1544-6(1988)；Vasanthakumar等,Cancer Commun.,1:225-32(1989)；Peris等,Brain Res Mol Brain Res.,15；57:310-20(1998)；以及美国专利号5,801,154；5,789,573；5,718,709和5,610,288)。此外，反义构建体也已被描述抑制并且可以用来治疗各种异常的细胞增殖例如癌症(参见，美国专利号5,747,470；5,591,317；以及5,783,683)。这些参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
产生反义寡核苷酸的方法为本领域中已知的并且可以容易地适合产生靶向任何多核苷酸序列的反义寡核苷酸。对给定的靶序列特异性的反义寡核苷酸序列的选择基于选择的靶序列的分析和二级结构、Tm、结合能以及相对稳定性的确定。可以基于其相对不能形成二聚体、发夹或其它二级结构的能力选择反义寡核苷酸，所述结构将在宿主细胞中减少或禁止与靶mRNA的特异性结合。mRNA的高度优选的靶区包括处于或接近AUG翻译起始密码子的那些区和与mRNA的5’区基本上互补的那些序列。这些二级结构分析和靶位点选择考虑可以例如使用OLIGO引物分析软件v.4版(Molecular Biology Insights)和/或BLASTN2.0.5算法软件(Altschul等,Nucleic Acids Res.,25:3389-402(1997))来进行。
7.核酶
根据本发明的另一个实施方案，核酸-脂质颗粒与核酶缔合。核酶为具有拥有核酸内切酶活性的特异性催化结构域的RNA-蛋白质复合体(参见，Kim等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,84:8788-92(1987)；和Forster等,Cell,49:211-20(1987))。例如，大量核酶加速了高度特异性的磷酸酯转移反应，常常在寡核苷酸底物中仅裂解若干磷酸酯之一(参见，Cech等,Cell,27:487-96(1981)；Michel等,J.Mol.Biol.,216:585-610(1990)；Reinhold-Hurek等,Nature,357:173-6(1992))。此特异性归因于在化学反应之前经由特异性碱基配对相互作用的底物与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合的需要。
目前已知天然存在的酶促RNA分子的至少六种基本种类。每种均可以在生理条件下催化反式RNA磷酸二酯键的水解(并且因此可以裂解其它RNA分子)。通常，酶促核酸通过首先与靶RNA结合来起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，所述靶结合部分保持在紧密接近用来裂解靶RNA的分子的酶促部分中。因此，酶促核酸首先识别并且然后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合至正确位点上，起酶促作用以切断靶RNA。战略性裂解这样靶RNA将破坏其直接合成编码的蛋白质的能力。在酶促核酸已结合和裂解其RNA靶标之后，它从所述RNA释放以寻找另一个靶标并且可以重复结合和裂解新靶标。
酶促核酸分子可以在例如锤头、发夹、肝炎δ病毒、I组内含子或RNA酶P RNA(与RNA引导序列相关)或脉孢菌属VS RNA基序中形成。锤头基序的具体实例在例如Rossi等,Nucleic Acids Res.,20:4559-65(1992)中描述。发夹基序的实例在例如EP 0360257、Hampel等,Biochemistry,28:4929-33(1989)；Hampel等,Nucleic Acids Res.,18:299-304(1990)；以及美国专利号5,631,359中描述。肝炎δ病毒基序的实例在例如Perrotta等,Biochemistry,31:11843-52(1992)中描述。RNA酶P基序的实例在例如Guerrier-Takada等,Cell,35:849-57(1983)中描述。脉孢菌属VS RNA核酶基序的实例在例如Saville等,Cell,61:685-96(1990)；Saville等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8826-30(1991)；Collins等,Biochemistry,32:2795-9(1993)中描述。I组内含子的实例在例如美国专利号4,987,071中描述。根据本发明使用的酶促核酸分子的重要特征是它们具有与一个或多个靶基因DNA或RNA区互补的特异性底物结合位点，并且它们在向分子施加RNA裂解活性的底物结合位点内或在其周围具有核苷酸序列。因此，核酶构建体不需要限制于本文提到的具体基序。这些参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
产生靶向任何多核苷酸序列的核酶的方法为本领域中已知的。可以如在例如PCT公布号WO 93/23569和WO 94/02595中所描述设计核酶并且合成以如在其中所描述的在体外和/或体内测试。这些PCT出版物的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
核酶活性可以通过改变核酶结合臂的长度或化学合成具有防止其被血清核糖核酸酶降解的修饰的核酶(参见，例如PCT公布号WO 92/07065、WO 93/15187、WO 91/03162和WO 94/13688；EP 92110298.4；以及美国专利号5,334,711，所述专利描述了可以对酶促RNA分子的糖部分进行的各种化学修饰，所述专利的公开内容出于所有目的各自以引用的方式整体并入本文)，增强其在细胞中的功效的修饰以及去除茎II碱基以缩短RNA合成时间和减少化学需要来优化。
8.免疫刺激性寡核苷酸
与本发明的脂质颗粒缔合的核酸可为免疫刺激性的，包括在向受试者施用时能够诱导免疫应答的免疫刺激性寡核苷酸(ISS；单链或双链)，所述受试者可为哺乳动物如人。ISS包括例如导致发夹二级结构的某些回文序列(参见，Yamamoto等,J.Immunol.,148:4072-6(1992))或CpG基序以及其它已知的ISS特征(如多G结构域；参见PCT公布号WO 96/11266，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
免疫刺激性核酸被认为在不需要它们特异性结合靶序列和减少靶序列的表达以便引起免疫应答时为非序列特异性的。因此，某些免疫刺激性核酸可以包含相应于天然存在的基因或mRNA的区的序列，但是它们可以仍然认为是非序列特异性的免疫刺激性核酸。
在一个实施方案中，免疫刺激性核酸或寡核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸。寡核苷酸或CpG二核苷酸可为未甲基化或甲基化的。在另一个实施方案中，免疫刺激性核酸包含至少一个具有甲基化的胞嘧啶的CpG二核苷酸。在一个实施方案中，核酸包含单个CpG二核苷酸，其中CpG二核苷酸中的胞嘧啶为甲基化的。在替代实施方案中，核酸包含至少两个CpG二核苷酸，其中CpG二核苷酸中的至少一个胞嘧啶为甲基化的。在另外的实施方案中，存在于序列中的CpG二核苷酸中的每个胞嘧啶均为甲基化的。在另一个实施方案中，核酸包含多个CpG二核苷酸，其中至少一个CpG二核苷酸包含甲基化的胞嘧啶。适合用于本发明的组合物和方法的免疫刺激性寡核苷酸的实例在PCT公布号WO 02/069369、WO 01/15726和WO 09/086558；美国专利号6,406,705；以及Raney等,J.Pharm.Exper.Ther.,298:1185-92(2001)中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的寡核苷酸具有磷酸二酯(“PO”)骨架或硫代磷酸酯(“PS”)骨架，和/或在CpG基序中具有至少一个甲基化的胞嘧啶残基。
B.其它活性剂
在某些实施方案中，与本发明的脂质颗粒缔合的活性剂可以包含一种或多种治疗性蛋白、多肽或小的有机分子或化合物。此类治疗有效剂或药物的非限制性实例包括肿瘤药物(例如，化学治疗药物、激素治疗剂、免疫治疗剂、放射治疗剂等)、降脂剂、抗病毒药物、抗炎性化合物、抗抑郁剂、兴奋剂、止痛剂、抗生素、节育药剂、退热剂、血管扩张剂、抗血管生成剂、细胞血管剂(cytovascular agent)、信号转导抑制剂、心血管药物如抗心律不齐剂、激素、血管收缩剂和类固醇。这些活性剂可以在本发明的脂质颗粒中单独施用或与包含核酸如干扰RNA的本发明脂质颗粒组合施用(例如，共同施用)。
化学治疗药物的非限制性实例包括基于铂的药物(例如，奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂、卡铂、螺铂、异丙铂、沙铂等)、烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、美法仑(me lphalan)、氮芥、乌拉莫司汀(uramustine)、噻替派(thiotepa)、亚硝基脲等)、抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)等)、植物生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉醇(紫杉酚)、多西他赛(docetaxel)等)、拓扑异构酶抑制剂(例如，伊立替康(irinotecan)(CPT-11；盐酸伊立替康(Camptosar))、托泊替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)(VP16)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷(teniposide)等)、抗肿瘤抗生素(例如，多柔比星(doxorubicin)、阿霉素、柔红霉素、表柔比星(epirubicin)、放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，吉非替尼(gefitinib)舒尼替尼(sunitinib)(SU11248)、埃罗替尼(erlotinib)(OSI-1774)、拉帕替尼(lapatinib)(GW572016；GW2016)、卡奈替尼(canertinib)(CI 1033)、司马沙尼(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、伊马替尼(imatinib)(STI571)、达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、来氟米特(leflunomide)(SU101)、凡德他尼(vandetanib)(ZactimaTM；ZD6474)等)、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其组合。
常规激素治疗剂的实例包括但不限于类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone))、非那司提(finasteride)、芳香酶抑制剂、他莫昔芬(tamoxifen)和戈舍瑞林(goserelin)以及其它促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)。
常规免疫治疗剂的实例包括但不限于免疫刺激剂(例如，卡介苗(BacillusCalmette-Guérin)(BCG)、左旋咪唑、白细胞介素-2、α-干扰素等)、单克隆抗体(例如，抗CD20、抗HER2、抗CD52、抗HLA-DR以及抗VEGF单克隆单体)、免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-加利车霉素(calicheamicin)缀合物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素缀合物等)以及放射免疫疗法(例如，缀合至111In、90Y或131I等的抗CD20单克隆抗体)。
常规放射治疗剂的实例包括但不限于任选地缀合至针对肿瘤抗原的抗体的放射性核素如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At和212Bi。
根据本发明可以使用的额外肿瘤药物包括但不限于爱克兰(alkeran)、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、araC、三氧化二砷、贝沙罗汀(bexarotene)、biCNU、卡莫司汀(carmustine)、CCNU、塞来考昔(celecoxib)、克拉屈滨(cladribine)、环孢菌素A、阿糖胞苷、环磷酰胺、右雷佐生(dexrazoxane)、DTIC、雌莫司汀(estramustine)、依西美坦(exemestane)、FK506、吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)、羟基脲(hydrea)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、干扰素、来曲唑(letrozole)、克拉立平(leustatin)、亮丙瑞林(leuprolide)、阿利维A酸(litretinoin)、甲地孕酮(megastrol)、L-PAM、美司钠(mesna)、甲氧沙林(methoxsalen)、普卡霉素、氮芥、帕米膦酸盐(pamidronate)、培加酶(Pegademase)、喷司他丁(pentostatin)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、泼尼松(prednisone)、美罗华(rituxan)、链佐星(streptozocin)、STI-571、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、VM-26、托瑞米芬(toremifene)、维甲酸(tretinoin)、ATRA、戊柔比星(valrubicin)以及长春碱。根据本发明可以使用的肿瘤药物的其它实例为玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物、埃坡霉素(epothilone)、细胞内激酶抑制剂以及喜树碱(camptothecin)。
用于治疗与升高的甘油三酯、胆固醇和/或葡萄糖相关的脂质疾病或病症的降脂剂的非限制性实例包括他汀类药物、贝特类药物、依泽替米贝、噻唑烷二酮、烟酸、β-阻断剂、硝化甘油、钙拮抗剂、鱼油及其混合物。
抗病毒药物的实例包括但不限于阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(aciclovir)、无环鸟苷(acyclovir)、阿德福韦(adefovir)、金刚烷胺(amantadine)、安泼那韦(amprenavir)、阿比多尔(arbidol)、阿扎那韦(atazanavir)、立普妥(atripla)、西多福韦(cidofovir)、可比韦(combivir)、达芦那韦(darunavir)、地拉韦啶(delavirdine)、地达诺新(didanosine)、二十二烷醇、依度尿苷(edoxudine)、依法韦仑(efavirenz)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦地(enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、进入抑制剂、泛昔洛韦(famciclovir)、固定剂量组合、福米韦生(fomivirsen)、福沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、膦乙酸(fosfonet)、融合抑制剂、更昔洛韦(ganciclovir)、伊巴他滨(ibacitabine)、异丙肌苷(imunovir)、碘苷(idoxuridine)、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韦(indinavir)、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素(例如，IFN-λ分子如IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3)、II型干扰素(例如，IFN-γ)、I型干扰素(例如，IFN-α如PEG化的IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ)、干扰素、拉米夫定(lamivudine)、洛匹那韦(lopinavir)、洛韦胺(loviride)、MK-0518、马拉韦罗(maraviroc)、吗啉胍(moroxydine)、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、nexavir、核苷类似物、奥塞米韦(oseltamivir)、喷昔洛韦(penciclovir)、帕拉米韦(peramivir)、普来可那立(pleconaril)、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、利巴韦林(ribavirin)、金刚乙烷、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、协同增强剂、替诺福韦(tenofovir)、替诺福韦酯(tenofovir disoproxil)、替拉那韦(tipranavir)、曲氟尿苷(trifluridine)、三协唯(trizivir)、曲金刚胺(tromantadine)、特鲁瓦达(truvada)、伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、维立韦罗(vicriviroc)、阿糖腺苷、韦拉米定(viramidine)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、齐多夫定(zidovudine)、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物及其混合物。
V.脂质颗粒
在某些方面中，本发明提供了包含本文描述的一种或多种阳离子(氨基)脂质或其盐的脂质颗粒。在一些实施方案中，本发明的脂质颗粒进一步包含一种或多种非阳离子脂质。在其它实施方案中，脂质颗粒进一步包含一种或多种能够减少或抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在额外的实施方案中，脂质颗粒进一步包含一种或多种活性剂或治疗剂如治疗性核酸(例如，干扰RNA如siRNA)。
脂质颗粒包括但不限于脂囊泡如脂质体。如本文所使用，脂囊泡包括具有封闭水性内部的含脂质的膜的结构。在具体实施方案中，包含本文描述的一种或多种阳离子脂质的脂囊泡用来包囊脂囊泡内的核酸。在其它实施方案中，包含本文描述的一种或多种阳离子脂质的脂囊泡与核酸复合以形成脂质复合物。
本发明的脂质颗粒通常包含活性剂或治疗剂、阳离子脂质、非阳离子脂质以及抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在一些实施方案中，活性剂或治疗剂被完全包囊在脂质颗粒的脂质部分内，使得脂质颗粒中的活性剂或治疗剂在水溶液中对例如由核酸酶或蛋白酶引起的酶促降解有抗性。在其它实施方案中，本文描述的脂质颗粒对哺乳动物如人基本无毒。本发明的脂质颗粒的平均直径通常为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm或约70nm至约90nm。本发明的脂质颗粒还通常具有脂质:治疗剂(例如，脂质:核酸)比率(质量/质量比率)为约1:1至约100:1、约1:1至约50:1、约2:1至约25:1、约3:1至约20:1、约5:1至约15:1或约5:1至约10:1。
在优选的实施方案中，本发明的脂质颗粒为血清稳定的核酸-脂质颗粒(LNP)，其包含干扰RNA(例如，siRNA、切酶-底物dsRNA、shRNA、aiRNA和/或miRNA)、阳离子脂质(例如，本文所列出的式I的一种或多种阳离子脂质或其盐)、非阳离子脂质(例如，一种或多种磷脂和胆固醇的混合物)以及抑制颗粒聚集的缀合的脂质(例如，一种或多种PEG-脂质和/或POZ-脂质缀合物)。LNP可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个未修饰和/或修饰的干扰RNA分子。核酸-脂质颗粒和其制备方法在例如美国专利号5,753,613；5,785,992；5,705,385；5,976,567；5,981,501；6,110,745和6,320,017以及PCT公布号WO 96/40964中描述，所述专利的公开内容出于所有目的各自以引用的方式整体并入本文。
在本发明的核酸-脂质颗粒中，核酸可以被完全包囊在颗粒的脂质部分内，从而保护核酸不受核酸酶降解。在优选的实施方案中，包含核酸如干扰RNA的LNP被完全包囊在颗粒的脂质部分内，从而保护核酸不受核酸酶降解。在某些例子中，在37℃下将颗粒暴露于核酸酶至少约20、30、45或60分钟之后LNP中的核酸基本上不降解。在某些其它例子中，在37℃下将颗粒在血清中孵育至少约30、45或60分钟或至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小时之后LNP中的核酸基本上不降解。在其它实施方案中，核酸与颗粒的脂质部分复合。本发明的制剂的益处之一为核酸-脂质颗粒组合物对哺乳动物如人基本无毒。
术语“完全包囊的”指明核酸-脂质颗粒中的核酸在暴露于血清或将显著降解游离DNA或RNA的核酸酶测定之后没有显著降解。在完全包囊的系统中，在将通常降解100％的游离核酸的处理中降解优选地小于约25％的颗粒中的核酸，更优选地小于约10％，并且最优选地小于约5％的颗粒中的核酸被降解。“完全包囊的”还指明核酸-脂质颗粒为血清稳定的，也就是说当体内施用时它们不会快速分解为其组分部分。
在核酸的背景下，可以通过进行不可透过膜的荧光染料排除测定来确定完全包囊，所述测定使用了在与核酸缔合时具有增强的荧光的染料。具体染料如和(Invitrogen Corp；Carlsbad,CA)可供用于定量确定质粒DNA、单链脱氧核糖核苷酸和/或单链或双链核糖核苷酸。通过将染料加入到脂质体制剂中测量所得到的荧光并且将其与在加入少量非离子洗涤剂时观察到的荧光比较来确定包囊。脂质体双层的洗涤剂介导的破裂释放出包囊的核酸，允许其与不可透过膜的染料相互作用。核酸包囊可以计算为E＝(Io–I)/Io，其中I和Io是指在加入洗涤剂之前和之后的荧光强度(参见，Wheeler等,Gene Ther.,6:271-281(1999))。
在其它实施方案中，本发明提供了包含多个核酸-脂质颗粒的核酸-脂质颗粒(例如，LNP)组合物。
在一些例子中，LNP组合物包含完全包囊在颗粒的脂质部分内的核酸，使得约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％或至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何部分或其中的范围)的颗粒在其中包囊核酸。
在其它例子中，LNP组合物包含完全包囊在颗粒的脂质部分内的核酸，使得约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约30％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％、约80％至约95％、约85％至约95％、约90％至约95％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％或至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何部分或其中的范围)的进料(input)核酸包囊在颗粒中。
取决于本发明的脂质颗粒的预期用途，可以改变组分的比例并且可以使用例如内体释放参数(ERP)测定来测量具体制剂的递送效率。
在具体实施方案中，本发明提供了包含多个本文描述的脂质颗粒和抗氧化剂的脂质颗粒(例如，LNP)组合物。在某些例子中，脂质颗粒组合物中的抗氧化剂减少、防止和/或抑制存在于脂质颗粒中的阳离子脂质的降解。在其中活性剂为治疗性核酸如干扰RNA(例如，siRNA)的例子中，脂质颗粒组合物中的抗氧化剂例如通过减少、防止和/或抑制核酸与阳离子脂质之间形成加合物来减少、防止和/或抑制核酸有效负荷降解。抗氧化剂的非限制性实例包括亲水性抗氧化剂如螯合剂(例如，金属螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐等)、亲脂抗氧化剂(例如，维生素E异构体、多酚等)、其盐及其混合物。如果需要，抗氧化剂通常以足够防止、抑制和/或减少存在于颗粒中的阳离子脂质和/或活性剂降解的量存在，例如至少约20mM EDTA或其盐、或至少约100mM柠檬酸盐或其盐。抗氧化剂如EDTA和/或柠檬酸盐可以在任何步骤或以多步包括在第VI节中描述的脂质颗粒形成方法中(例如，在脂质颗粒形成之前、期间和/或之后)。
与防止存在于脂质颗粒中的阳离子脂质和/或活性剂(例如，治疗性核酸)降解的方法、包含通过这些方法稳定的脂质颗粒的组合物、制造这些脂质颗粒的方法以及递送和/或施用这些脂质颗粒的方法相关的额外实施方案在2010年12月1日提交的名称为“SNALPFormulations Containing Antioxidants”的国际专利申请号PCT/CA2010/001919中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
A.阳离子脂质
本文所列出的式I的任何新型阳离子脂质或其盐可以单独或与一种或多种其它阳离子脂质种类或非阳离子脂质种类组合用于本发明的脂质颗粒(例如，LNP)中。
还可以包括在本发明的脂质颗粒中的其它阳离子脂质或其盐包括但不限于1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、1,2-二亚油基氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDMA)、1,2-二亚油酰基氧基-(N,N-二甲基)-丁基-4-胺(C2-DLinDAP)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C2-DMA；又称为“XTC2”或“C2K”)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C3-DMA；“C3K”)、2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-C4-DMA；“C4K”)、2,2-二亚油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环己烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基哌嗪并(pepiazino)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-MPZ)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、2,2-二油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DO-K-DMA)、2,2-二硬脂酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DS-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-吗啉代-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-MA)、2,2-二亚油基-4-三甲基氨基-[1,3]-二氧杂环戊烷氯化物(DLin-K-TMA.Cl)、2,2-二亚油基-4,5-双(二甲基氨基甲基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K2-DMA)、2,2-二亚油基-4-甲基哌嗪-[1,3]-二氧杂环戊烷(D-Lin-K-N-甲基哌嗪)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-M-C3-DMA；“MC3”)、二亚油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(DLin-M-C2-DMA；又称为DLin-M-K-DMA或DLin-M-DMA)、1,2-二油酰基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DO-C-DAP)、1，2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基氨基丙烷(DMDAP)、1，2-二油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物(DOTAP.Cl)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油酰氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA.Cl)、1，2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油酰基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、3-二甲基氨基-2-(胆甾基-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾基-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,1-2’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油酰基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二油酰基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、2，3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸盐(DOSPA)、双十八烷基氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine)(DOGS)、其类似物及其混合物。
可以存在于本文描述的脂质颗粒中的额外阳离子脂质或其盐包括新型阳离子脂质如CP-LenMC3、CP-γ-LenMC3、CP-MC3、CP-DLen-C2K-DMA、CP-γDLen-C2K-DMA、CP-C2K-DMA、CP-DODMA、CP-DPetroDMA、CP-DLinDMA、CP-DLenDMA、CP-γDLenDMA、其类似物及其组合。可以存在于本文描述的脂质颗粒中的额外阳离子脂质或其盐包括MC3类似物如LenMC3、γ-LenMC3、MC3MC、MC2C、MC2MC、MC3硫酯、MC3醚、MC4醚、MC3炔烃、MC3酰胺、Pan-MC3、Pan-MC4、Pan-MC5及其组合。可以存在于本文描述的脂质颗粒中的额外阳离子脂质或其盐包括在2010年6月30日提交的名称为“Improved Cationic Lipids and Methods for theDelivery of Nucleic Acids”的国际专利申请号PCT/CA2010/001029中描述的新型阳离子脂质。可以存在于本文描述的脂质颗粒中的额外阳离子脂质或其盐包括在美国专利申请公布号2009/0023673中描述的阳离子脂质。每个这些专利文件的公开内容均出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，额外的阳离子脂质与一种或多种阴离子形成盐(优选地结晶盐)。在一个具体实施方案中，额外的阳离子脂质为其草酸根(例如，半草酸根)盐，其优选地为结晶盐。
阳离子脂质如DLinDMA和DLenDMA以及额外的阳离子脂质的合成在美国专利申请公布号2006/0083780中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
阳离子脂质如γ-DLenDMA、C2-DLinDMA和C2-DLinDAP以及额外的阳离子脂质的合成在2010年6月30日提交的名称为“Improved Cationic Lipids and Methods for theDelivery of Nucleic Acids”的国际专利申请号PCT/CA2010/001029中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
阳离子脂质如DLin-K-DMA以及额外的阳离子脂质的合成在PCT公布号WO 09/086558中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
阳离子脂质如DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLin-K6-DMA、DLin-K-MPZ、DO-K-DMA、DS-K-DMA、DLin-K-MA、DLin-K-TMA.Cl、DLin-K2-DMA、D-Lin-K-N-甲基哌嗪、DLin-M-C2-DMA、DO-C-DAP、DMDAP和DOTAP.Cl以及额外的阳离子脂质的合成在2009年10月9日提交的名称为“Improved Amino Lipids and Methods for the Delivery ofNucleic Acids”的PCT公布号WO 2010/042877中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
DLin-M-C3-DMA以及额外的阳离子脂质的合成例如在2010年9月17日提交的名称为“Novel Cationic Lipids and Methods of Use Thereof”的美国临时申请号61/384,050中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
阳离子脂质如DLin-C-DAP、DLinDAC、DLinMA、DLinDAP、DLin-S-DMA、DLin-2-DMAP、DLinTMA.Cl、DLinTAP.Cl、DLinMPZ、DLinAP、DOAP和DLin-EG-DMA以及额外的阳离子脂质的合成在PCT公布号WO 09/086558中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
阳离子脂质如CLinDMA以及额外的阳离子脂质的合成在美国专利申请公布号2006/0240554中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
许多其它阳离子脂质和相关的类似物的合成已描述于美国专利号5,208,036；5,264,618；5,279,833；5,283,185；5,753,613和5,785,992；以及PCT公布号WO 96/10390中，所述专利的公开内容出于所有目的各自以引用的方式整体并入本文。另外，可以使用许多阳离子脂质的商业制剂，例如像(包括DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)；(包括DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)以及(包括DOGS，可从Promega Corp.获得)。
在一些实施方案中，阳离子脂质构成存在于颗粒中的总脂质的约50mol％至约90mol％、约50mol％至约85mol％、约50mol％至约80mol％、约50mol％至约75mol％、约50mol％至约70mol％、约50mol％至约65mol％、约50mol％至约60mol％、约55mol％至约65mol％或约55mol％至约70mol％(或其任何部分或其中的范围)。在具体实施方案中，阳离子脂质构成存在于颗粒中的总脂质的约50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％、55mol％、56mol％、57mol％、58mol％、59mol％、60mol％、61mol％、62mol％、63mol％、64mol％或65mol％(或其任何部分)。
在其它实施方案中，阳离子脂质构成存在于颗粒中的总脂质的约2mol％至约60mol％、约5mol％至约50mol％、约10mol％至约50mol％、约20mol％至约50mol％、约20mol％至约40mol％、约30mol％至约40mol％或约40mol％(或其任何部分或其中的范围)。
适合用于本发明的脂质颗粒中的阳离子脂质的额外百分比和范围例如在PCT公布号WO 09/127060中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
应该理解，存在于本发明的脂质颗粒中的阳离子脂质的百分比为目标量，并且存在于制剂中的阳离子脂质的实际量可以变化例如±5mol％。例如，在1:57脂质颗粒(例如，LNP)制剂中，阳离子脂质的目标量为57.1mol％，但是阳离子脂质的实际量可为所述目标量的±5mol％、±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1mol％、±0.75mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.1mol％，其中制剂的其余量由其它脂质组分构成(添加高达至存在于颗粒中的总脂质的100mol％)。
B.非阳离子脂质
用于本发明的脂质颗粒(例如，LNP)中的非阳离子脂质可为能够产生稳定复合体的任何各种中性不带电荷、两性离子或阴离子脂质。
非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰基-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反式油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱及其混合物。还可以使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选地为衍生自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
非阳离子脂质的其它实例包括固醇如胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物如5α-胆固醇、5β-粪甾醇、胆甾醇基-(2’-羟基)-乙基醚、胆甾醇基-(4’-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在优选的实施方案中，胆固醇衍生物为极性类似物如胆甾醇基-(4’-羟基)-丁基醚。胆甾醇基-(2’-羟基)-乙基醚的合成在PCT公布号WO09/127060中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，存在于脂质颗粒(例如，LNP)中的非阳离子脂质包含一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物或由其组成。在其它实施方案中，存在于脂质颗粒(例如，LNP)中的非阳离子脂质包含一种或多种磷脂或由其组成，例如不含胆固醇的脂质颗粒制剂。在又其它实施方案中，存在于脂质颗粒(例如，LNP)中的非阳离子脂质包含胆固醇或其衍生物或由其组成，例如不含磷脂的脂质颗粒制剂。
适合用于本发明的非阳离子脂质的其它实例包括不含磷的脂质例如像硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻醇酸酯(glycerolricinoleate)、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、十二烷基硫酸三乙醇胺、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。
在一些实施方案中，非阳离子脂质构成存在于颗粒中的总脂质的约10mol％至约60mol％、约20mol％至约55mol％、约20mol％至约45mol％、约20mol％至约40mol％、约25mol％至约50mol％、约25mol％至约45mol％、约30mol％至约50mol％、约30mol％至约45mol％、约30mol％至约40mol％、约35mol％至约45mol％、约37mol％至约42mol％或约35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％或45mol％(或其任何部分或其中的范围)。
在其中脂质颗粒含有磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物的实施方案中，混合物可以构成存在于颗粒中的总脂质的高达至约40mol％、45mol％、50mol％、55mol％或60mol％。
在一些实施方案中，混合物中的磷脂组分可以构成存在于颗粒中的总脂质的约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约12mol％、约4mol％至约15mol％或约4mol％至约10mol％(或其任何部分或其中的范围)。在某些优选的实施方案中，混合物中的磷脂组分构成存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约10mol％、约5mol％至约9mol％、约5mol％至约8mol％、约6mol％至约9mol％、约6mol％至约8mol％或约5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％(或其任何部分或其中的范围)。作为一个非限制实例，包含磷脂和胆固醇的混合物的1:57脂质颗粒制剂可以例如在含有以存在于颗粒中的总脂质的约34mol％(或其任何部分)的胆固醇或胆固醇衍生物的混合物中包含约7mol％(或其任何部分)的磷脂如DPPC或DSPC。作为另一个非限制实例，包含磷脂和胆固醇的混合物的7:54脂质颗粒制剂可以例如在含有以存在于颗粒中的总脂质的约32mol％(或其任何部分)的胆固醇或胆固醇衍生物的混合物中包含约7mol％(或其任何部分)的磷脂如DPPC或DSPC。
在其它实施方案中，混合物中的胆固醇组分可以构成存在于颗粒中的总脂质的约25mol％至约45mol％、约25mol％至约40mol％、约30mol％至约45mol％、约30mol％至约40mol％、约27mol％至约37mol％、约25mol％至约30mol％或约35mol％至约40mol％(或其任何部分或其中的范围)。在某些优选的实施方案中，混合物中的胆固醇组分构成存在于颗粒中的总脂质的约25mol％至约35mol％、约27mol％至约35mol％、约29mol％至约35mol％、约30mol％至约35mol％、约30mol％至约34mol％、约31mol％至约33mol％或约30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％或35mol％(或其任何部分或其中的范围)。通常，包含磷脂和胆固醇的混合物的1:57脂质颗粒制剂可以例如在含有以存在于颗粒中的总脂质的约7mol％(或其任何部分)的磷脂如DPPC或DSPC的混合物中包含约34mol％(或其任何部分)的胆固醇或胆固醇衍生物。通常，包含磷脂和胆固醇的混合物的7:54脂质颗粒制剂可以例如在含有以存在于颗粒中的总脂质的约7mol％(或其任何部分)的磷脂如DPPC或DSPC的混合物中约32mol％(或其任何部分)的胆固醇或胆固醇衍生物。
在其中脂质颗粒为不含磷脂的实施方案中，胆固醇或其衍生物可以构成存在于颗粒中的总脂质的高达至约25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％、55mol％或60mol％。
在一些实施方案中，不含磷脂的脂质颗粒制剂中的胆固醇或其衍生物可以构成存在于颗粒中的总脂质的约25mol％至约45mol％、约25mol％至约40mol％、约30mol％至约45mol％、约30mol％至约40mol％、约31mol％至约39mol％、约32mol％至约38mol％、约33mol％至约37mol％、约35mol％至约45mol％、约30mol％至约35mol％、约35mol％至约40mol％、或约30mol％、31mol％、32mol％、33mol％、34mol％、35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％或40mol％(或其任何部分或其中的范围)。作为一个非限制性实例，1:62脂质颗粒制剂可以包含以存在于颗粒中的总脂质的约37mol％(或其任何部分)的胆固醇。作为另一个非限制性实例，7:58脂质颗粒制剂可以包含以存在于颗粒中的总脂质的约35mol％(或其任何部分)的胆固醇。
在其它实施方案中，非阳离子脂质构成存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％至约85mol％、约20mol％至约80mol％、约10mol％(例如，仅有磷脂)或约60mol％(例如，磷脂和胆固醇或其衍生物)(或其任何部分或其中的范围)。
适合用于本发明的脂质颗粒中的非阳离子脂质的额外百分比和范围例如在PCT公布号WO 09/127060中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
应该理解，存在于本发明的脂质颗粒中的非阳离子脂质的百分比为目标量，并且存在于制剂中的非阳离子脂质的实际量可以变化例如±5mol％。例如，在1:57脂质颗粒(例如，LNP)制剂中，磷脂的目标量为7.1mol％并且胆固醇的目标量为34.3mol％，但是磷脂的实际量可为目标量的±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.75mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.1mol％，并且胆固醇的实际量可为目标量的±3mol％、±2mol％、±1mol％、±0.75mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.1mol％，其中制剂的其余量由其它脂质组分构成(添加高达至存在于颗粒中的总脂质的100mol％)。类似地，在7:54脂质颗粒(例如，LNP)制剂中，磷脂的目标量为6.75mol％并且胆固醇的目标量为32.43mol％，但是磷脂的实际量可为目标量的±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.75mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.1mol％，并且胆固醇的实际量可为目标量的±3mol％、±2mol％、±1mol％、±0.75mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.1mol％，其中制剂的其余量由其它脂质组分构成(添加高达至存在于颗粒中的总脂质的100mol％)。
C.脂质缀合物
除了阳离子脂质和非阳离子脂质之外，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可以进一步包含脂质缀合物。缀合的脂质是有用的，因为它防止了颗粒的聚集。适合的缀合的脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、POZ-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物、阳离子聚合物-脂质缀合物(CPL)及其混合物。在某些实施方案中，颗粒包含PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物连同CPL。
在优选的实施方案中，脂质缀合物为PEG-脂质。PEG-脂质的实例包括但不限于如在例如PCT公布号WO 05/026372中所描述的偶联至二烷氧基丙基的PEG(PEG-DAA)、如在例如美国专利申请公布号2003/0077829和2005/008689中所描述的偶联至二酰基甘油的PEG(PEG-DAG)、偶联至磷脂如磷脂酰乙醇胺的PEG(PEG-PE)、如在例如美国专利号5,885,613中所描述的缀合至神经酰胺的PEG、缀合至胆固醇或其衍生物的PEG及其混合物。这些专利文件的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
适合用于本发明的额外PEG-脂质包括但不限于mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰基甘油酯(PEG-C-DOMG)。PEG-C-DOMG的合成在PCT公布号WO 09/086558中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。又一额外适合的PEG-脂质缀合物包括但不限于1-[8’-(1,2-二肉豆蔻酰基-3-丙氧基)-甲酰胺基-3’,6’-二氧杂辛基]氨基甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2KPEG-DMG)。2KPEG-DMG的合成在美国专利号7,404,969中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
PEG为具有两个末端羟基的亚乙基PEG重复单元的线性、水溶性聚合物。通过其分子量对PEG分类；例如PEG 2000的平均分子量为约2,000道尔顿，并且PEG 5000的平均分子量为约5,000道尔顿。PEG可从Sigma Chemical Co.和其它公司商业上获得并且包括但不限于以下：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)、以及含有末端羟基而不是末端甲氧基的此类化合物(例如，HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2等)。如在美国专利号6,774,180和7,053,150中描述的那些的其它PEG(例如，mPEG(20KDa)胺)也有用于制备本发明的PEG-脂质缀合物。这些专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。另外，单甲氧基聚乙二醇-乙酸(MePEG-CH2COOH)特别有用于制备PEG-脂质缀合物包括例如PEG-DAA缀合物。
本文描述的PEG-脂质缀合物的PEG部分可以包含平均分子量为约550道尔顿至约10,000道尔顿的范围内。在某些例子中，PEG部分的平均分子量为约750道尔顿至约5,000道尔顿(例如，约1,000道尔顿至约5,000道尔顿、约1,500道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至约2,000道尔顿等)。在优选的实施方案中，PEG部分的平均分子量为约2,000道尔顿或约750道尔顿。
在某些例子中，PEG可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。PEG可以直接缀合至脂质或可以经由接头部分连接至脂质。可以使用适合用于将PEG偶联至脂质的任何接头部分，包括例如含有非酯的接头部分和含酯接头部分。在优选的实施方案中，接头部分为含有非酯的接头部分。如本文所使用，术语“含有非酯的接头部分”是指不含有羧酸酯键(-OC(O)-)的接头部分。适合的含有非酯的接头部分包括但不限于酰胺基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀酰胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物及其组合(如含有氨基甲酸酯接头部分和酰胺基接头部分的接头)。在优选的实施方案中，氨基甲酸酯接头用来将PEG偶联至脂质。
在其它实施方案中，含酯接头部分用来将PEG偶联至脂质。适合的含酯接头部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀酰基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其组合。
具有不同链长度和饱和度的各种酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可以缀合至PEG以形成脂质缀合物。此类磷脂酰乙醇胺为商业上可获得的，或可以使用本领域技术人员已知的常规技术分离或合成。含有碳链长度在C10至C20范围内的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺为优选的。还可以使用具有单不饱和脂肪酸或双不饱和脂肪酸以及饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的混合物的磷脂酰乙醇胺。适合的磷脂酰乙醇胺包括但不限于二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)以及二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
术语“ATTA”或“聚酰胺”包括但不限于在美国专利号6，320,017和6,586,559中描述的化合物，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。这些化合物包括具有下式的化合物：
其中R为选自由氢、烷基和酰基组成的组的成员；R1为选自由氢和烷基组成的组的成员；或任选地，R和R1以及它们结合的氮形成叠氮基部分；R2为选自氢、任选取代的烷基、任选取代的芳基以及氨基酸的侧链的组的成员；R3为选自由氢、卤素、羟基、烷氧基、巯基、肼基、氨基和NR4R5组成的组的成员，其中R4和R5独立地为氢或烷基；n为4至80；m为2至6；p为1至4；并且q为0或1。本领域技术人员将清楚其它聚酰胺可以用于本发明的化合物中。
术语“二酰基甘油”或“DAG”包括具有2个脂肪酰基链R1和R2(所述脂肪酰基链均独立地具有通过酯键结合甘油的1-位置和2-位置的介于2个与30个之间的碳)的化合物。酰基可为饱和的或具有不同的不饱和度。适合的酰基包括但不限于月桂酰基(C12)、肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)、硬脂酰基(C18)以及二十碳酰基(icosoyl)(C20)。在优选的实施方案中，R1和R2为相同的，即R1和R2均为肉豆蔻酰基(即，二肉豆蔻酰基)，R1和R2均为硬脂酰基(即，二硬脂酰基)等。二酰基甘油具有以下通式：
术语“二烷氧基丙基”或“DAA”包括具有2个烷基链R1和R2(所述烷基链均独立地具有介于2个与30个之间的碳)的化合物。烷基可为饱和的或具有不同的不饱和度。二烷氧基丙基具有以下通式：
在优选的实施方案中，PEG-脂质为具有下式的PEG-DAA缀合物：
其中R1和R2被独立地选择并且为具有约10至约22个碳原子的长链烷基；PEG为聚乙二醇；并且L为如上所述的含有非酯的接头部分或含酯接头部分。长链烷基可为饱和或不饱和的。适合的烷基包括但不限于癸基(C10)、月桂基(C12)、肉豆蔻基(C14)、棕榈基(C16)、硬脂基(C18)以及二十烷基(C20)。在优选的实施方案中，R1和R2为相同的，即R1和R2均为肉豆蔻基(即，二肉豆蔻基)，R1和R2均为硬脂基(即，二硬脂基)等。
在以上的式V中，PEG的平均分子量在约550道尔顿至约10,000道尔顿范围内。在某些例子中，PEG的平均分子量为约750道尔顿至约5,000道尔顿(例如，约1,000道尔顿至约5,000道尔顿、约1,500道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至约3,000道尔顿、约750道尔顿至约2,000道尔顿等)。在优选的实施方案中，PEG的平均分子量为约2,000道尔顿或约750道尔顿。PEG可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在某些实施方案中，末端羟基被甲氧基或甲基取代。
在优选的实施方案中，“L”为含有非酯的接头部分。适合的含有非酯的接头包括但不限于酰胺基接头部分、氨基接头部分、羰基接头部分、氨基甲酸酯接头部分、脲接头部分、醚接头部分、二硫化物接头部分、琥珀酰胺基接头部分及其组合。在优选的实施方案中，含有非酯的接头部分为氨基甲酸酯接头部分(即，PEG-C-DAA缀合物)。在另一个优选的实施方案中，含有非酯的接头部分为酰胺基接头部分(即，PEG-A-DAA缀合物)。在又另一个优选的实施方案中，含有非酯的接头部分为琥珀酰胺基接头部分(即，PEG-S-DAA缀合物)。
在具体实施方案中，PEG-脂质缀合物选自：
使用本领域技术人员已知的标准技术和试剂合成PEG-DAA缀合物。将认识到PEG-DAA缀合物将含有各种酰胺、胺、醚、硫基、氨基甲酸酯和脲键。本领域技术人员将认识到用于形成这些键的方法和试剂为熟知的并且容易获得。参见，例如March,ADVANCED ORGANICCHEMISTRY(Wiley 1992)；Larock,COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(VCH 1989)；以及Furniss,VOGEL’S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY,第5版(Longman1989)。还将了解，存在的任何官能团可以在合成PEG-DAA缀合物中的不同点处需要保护和去保护。本领域技术人员将认识到此类技术为熟知的。参见，例如Green和Wuts,PROTECTIVEGROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(Wiley 1991)。
优选地，PEG-DAA缀合物为PEG-二癸氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)缀合物、PEG-二棕榈氧基丙基(C16)缀合物或PEG-二硬脂氧基丙基(C18)缀合物。在这些实施方案中，PEG的平均分子量优选地为约750或约2,000道尔顿。在一个特别优选的实施方案中，PEG-脂质缀合物包含PEG2000-C-DMA，其中“2000”指代PEG的平均分子量，“C”指代氨基甲酸酯接头部分，并且“DMA”指代二肉豆蔻氧基丙基。在另一个特别优选的实施方案中，PEG-脂质缀合物包含PEG750-C-DMA，其中“750”指代PEG的平均分子量，“C”指代氨基甲酸酯接头部分，并且“DMA”指代二肉豆蔻氧基丙基。在具体实施方案中，PEG的末端羟基被甲基取代。本领域技术人员将很容易了解到，其它二烷氧基丙基可以用于本发明的PEG-DAA缀合物中。
除了上述内容之外，本领域技术人员将很容易清楚其它亲水聚合物可以代替PEG而使用。可以代替PEG而使用的适合的聚合物的实例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸以及衍生的纤维素如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
除了上述组分之外，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可以进一步包含阳离子聚(乙二醇)(PEG)脂质或CPL(参见，例如Chen等,Bioconj.Chem.,11:433-437(2000)；美国专利号6,852,334；PCT公布号WO 00/62813，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。
适合的CPL包括式VI的化合物：
A-W-Y (VI)，
其中A、W和Y如下所述。
参考式VI，“A”为脂质部分如两亲脂质、中性脂质或用作脂质锚的疏水脂质。适合的脂质实例包括但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷以及1,2-二烷基-3-氨基丙烷。
“W”为聚合物或低聚物如亲水聚合物或低聚物。优选地，亲水聚合物为作为非免疫原性或拥有低的固有免疫原性的生物相容聚合物。或者，如果与适当的佐剂一起使用，亲水聚合物可为弱抗原性的。适合的非免疫原性聚合物包括但不限于PEG、聚酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物及其组合。在优选的实施方案中，聚合物的分子量为约250至约7,000道尔顿。
“Y”为聚阳离子部分。术语聚阳离子部分是指在选择的pH，优选地生理pH下具有正电荷，优选地至少2个正电荷的化合物、衍生物或官能团。适合的聚阳离子部分包括碱性氨基酸及其衍生物如精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和组氨酸；精胺；亚精胺；阳离子树枝状聚合物；多胺；多胺糖；以及氨基多糖。聚阳离子部分在结构上可为线性的，如线性四赖氨酸、支链或树枝状。聚阳离子部分在选择的pH值下具有约2至约15个之间的正电荷，优选地约2至约12个之间的正电荷，并且更优选地约2至约8个之间的正电荷。选择采用何种聚阳离子部分可以通过所需的颗粒应用的类型来确定。
聚阳离子部分上的电荷可以分布在整个颗粒部分周围，或可选地，它们可以在颗粒部分的一个具体区域中为不连续浓度的电荷密度，例如电荷尖峰(charge spike)。如果电荷密度分布在颗粒上，电荷密度可以均匀分布或不均匀分布。本发明涵盖聚阳离子部分的电荷分布的所有变化。
脂质“A”和非免疫原性聚合物“W”可以通过各种方法并且优选地通过共价附接来附接。本领域技术人员已知的方法可以用于“A”和“W”的共价附接。适合的键包括但不限于酰胺、胺、羧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、酯和腙键。本领域技术人员将清楚“A”和“W”必须具有实现键联的互补官能团。这两个基团(一个在脂质上并且另一个在聚合物上)的反应将得到所需的键。例如，当脂质为二酰基甘油并且例如用NHS和DCC活化末端羟基以形成活性酯，并且然后与含有氨基的聚合物如与聚酰胺反应(参见，例如美国专利号6,320,017和6,586,559，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文)时，酰胺键将在两个基团之间形成。
在某些例子中，聚阳离子部分可以具有附接的配体，如用于络合钙的靶向配体或螯合部分。优选地，在配体附接之后，阳离子部分维持正电荷。在某些例子中，附接的配体具有正电荷。适合的配体包括但不限于具有反应性官能团的化合物或装置并且包括脂质、两亲脂质、载体化合物、生物亲和性化合物、生物材料、生物聚合物、生物医学装置、分析可检测化合物、治疗活性化合物、酶、肽、蛋白质、抗体、免疫刺激剂、放射性标记、荧光团、生物素、药物、半抗原、DNA、RNA、多糖、脂质体、病毒体、胶束、免疫球蛋白、官能团、其它靶向部分或毒素。
在一些实施方案中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)构成存在于颗粒中的总脂质的约0.1mol％至约2mol％、约0.5mol％至约2mol％、约1mol％至约2mol％、约0.6mol％至约1.9mol％、约0.7mol％至约1.8mol％、约0.8mol％至约1.7mol％、约0.9mol％至约1.6mol％、约0.9mol％至约1.8mol％、约1mol％至约1.8mol％、约1mol％至约1.7mol％、约1.2mol％至约1.8mol％、约1.2mol％至约1.7mol％、约1.3mol％至约1.6mol％或约1.4mol％至约1.5mol％(或其任何部分或其中的范围)。
在其它实施方案中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)构成存在于颗粒中的总脂质的约0mol％至约20mol％、约0.5mol％至约20mol％、约2mol％至约20mol％、约1.5mol％至约18mol％、约2mol％至约15mol％、约4mol％至约15mol％、约2mol％至约12mol％、约5mol％至约12mol％或约2mol％(或其任何部分或其中的范围)。
在另外的实施方案中，脂质缀合物(例如，PEG-脂质)构成存在于颗粒中的总脂质的约4mol％至约10mol％、约5mol％至约10mol％、约5mol％至约9mol％、约5mol％至约8mol％、约6mol％至约9mol％、约6mol％至约8mol％或约5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％(或其任何部分或其中的范围)。
适合用于本发明的脂质颗粒中的脂质缀合物的其它实例、百分比和/或范围在例如PCT公布号WO 09/127060和PCT公布号WO2010/006282中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
应该理解，存在于本发明的脂质颗粒中的脂质缀合物(例如，PEG-脂质)的百分比为目标量，并且存在于制剂中的脂质缀合物的实际量可以变化例如±2mol％。例如，在1:57脂质颗粒(例如，LNP)制剂中，脂质缀合物的目标量为1.4mol％，但是脂质缀合物的实际量可为所述目标量的±0.5mol％、±0.4mol％、±0.3mol％、±0.2mol％、±0.1mol％或±0.05mol％，其中制剂的其余量由其它脂质组分构成(添加高达至存在于颗粒中的总脂质的100mol％)。类似地，在7:54脂质颗粒(例如，LNP)制剂中，脂质缀合物的目标量为6.76mol％，但是脂质缀合物的实际量可为所述目标量的±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.75mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.1mol％，其中制剂的其余量由其它脂质组分构成(添加高达至存在于颗粒中的总脂质的100mol％)。
本领域技术人员将了解，脂质缀合物的浓度可以取决于所采用的脂质缀合物和脂质颗粒变为融合性的速率而改变。
通过控制脂质缀合物的组成和浓度，人们可以控制从脂质颗粒交换出脂质缀合物的速率，并且反过来控制脂质颗粒变为融合性的速率。例如，当PEG-DAA缀合物用作脂质缀合物时，脂质颗粒变为融合性的速率可以例如通过改变脂质缀合物的浓度、通过改变PEG的分子量或通过改变PEG-DAA缀合物上的烷基的链长和饱和度来改变。另外，其它变量包括例如pH、温度、离子强度等可以用来改变和/或控制脂质颗粒变为融合性的速率。当阅读本公开内容时，可以用来控制脂质颗粒变为融合性的速率的其它方法将对本领域技术人员而言变得清楚。同样，通过控制脂质缀合物的组成和浓度，人们可以控制脂质颗粒(例如，LNP)大小。
VI.脂质颗粒的制备
本发明的脂质颗粒例如LNP可以通过本领域中已知的任何方法来形成，其中活性剂或治疗剂如干扰RNA(例如，siRNA)被捕获在颗粒的脂质部分内并且保护不受降解，所述方法包括但不限于连续混合方法、直接稀释方法和在线稀释方法。
在具体实施方案中，阳离子脂质可以单独地或与其它阳离子脂质组合包含式I的脂质或其盐。在其它实施方案中，非阳离子脂质为卵鞘磷脂(ESM)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(DPPC)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、14:0PE(1,2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE))、16:0PE(1,2-二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE))、18:0PE(1,2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE))、18:1PE(1,2-二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE))、18:1反式PE(1,2-二反式油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE))、18:0-18:1PE(1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE))、16:0-18:1PE(1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE))、基于聚乙二醇的聚合物(例如，PEG 2000、PEG 5000、PEG-改性的二酰基甘油或PEG-改性的二烷氧基丙基)、胆固醇、其衍生物或其组合。
在某些实施方案中，本发明提供了经由连续混合方法产生的核酸-脂质颗粒(例如，LNP)，所述连续混合物方法例如包括以下步骤的方法：在第一储罐中提供包含核酸(例如，干扰RNA)的水溶液，在第二储罐中提供有机脂质溶液(其中存在于有机脂质溶液中的脂质溶解在有机溶剂例如低级烷醇如乙醇中)，以及使水溶液与有机脂质溶液混合使得有机脂质溶液与水溶液混合以便基本上瞬时产生将核酸包囊在脂囊泡内的脂囊泡(例如，脂质体)。此方法和用于进行此方法的装置在美国专利申请公布号2004/0142025中详细描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
连续将脂质和缓冲溶液引入到混合环境中如在混合室中的动作引起用缓冲溶液连续稀释脂质溶液，从而当混合时基本上瞬时产生脂囊泡。如本文所使用，短语“用缓冲溶液连续稀释脂质溶液”(和变化)通常意指用足够实现囊泡产生的力在水合过程中充分快速地稀释脂质溶液。在存在缓冲溶液(即，水溶液)的情况下通过使包含核酸的水溶液与有机脂质溶液混合有机脂质溶液经历连续逐步稀释以产生核酸-脂质颗粒。
使用连续混合方法形成的核酸-脂质颗粒的大小通常为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、小于约120nm、110nm、100nm、90nm或80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm(或其任何部分或其中的范围)。因此所形成的颗粒不会聚集并且任选地大小设定为实现均匀的颗粒大小。
在另一个实施方案中，本发明提供了经由直接稀释方法产生的核酸-脂质颗粒(例如，LNP)，所述直接稀释方法包括形成脂囊泡(例如，脂质体)溶液和立即并直接将脂囊泡溶液引入到含有控制的量的稀释缓冲液的收集容器中。在优选的方面中，收集容器包括一个或多个被配置成搅拌收集容器的内容物以促进稀释的元件。在一个方面中，存在于收集容器中的稀释缓冲液的量基本上等于引入其中的脂囊泡溶液的体积。作为一个非限制性实例，当引入到含有相等体积的稀释缓冲液的收集容器中时，在45％乙醇中的脂囊泡溶液将有利地产生更小的颗粒。
在又另一个实施方案中，本发明提供了经由在线稀释方法产生的核酸-脂质颗粒(例如，LNP)，其中含有稀释缓冲液的第三储罐流体偶联至第二混合区。在此实施方案中，在第一混合区中形成的脂囊泡(例如，脂质体)溶液立即并直接与第二混合区中的稀释缓冲液混合。在优选的方面中，第二混合区包括T-连接器，所述T-连接器被布置以使得脂囊泡溶液流和稀释缓冲液流相遇呈反向180°流动；然而，可以使用例如约27°至约180°(例如，约90°)的提供更小角度的连接器。泵机构将可控流量的缓冲液递送至第二混合区。在一个方面中，提供至第二混合区的稀释缓冲液的流速控制为基本上等于从第一混合区将脂囊泡溶液引入其中的流速。此实施方案有利地允许对与第二混合区中的脂囊泡溶液混合的稀释缓冲液的流量的更多控制，并且因此还控制整个第二混合过程中的缓冲液中的脂囊泡溶液的浓度。对稀释缓冲液流速的此种控制有利地允许在减少的浓度下的小的颗粒大小形成。
这些方法和用于进行这些直接稀释和在线稀释方法的装置在美国专利申请公布号2007/0042031中详细描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
使用直接稀释和在线稀释方法形成的核酸-脂质颗粒的大小通常为约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约80nm至约100nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm、小于约120nm、110nm、100nm、90nm或80nm、或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm(或其任何部分或其中的范围)。因此所形成的颗粒不会聚集并且任选地大小设定为实现均匀的颗粒大小。
如果需要，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可以通过可供用于设定脂质体大小的任何方法来设定大小。可以进行设定大小以便实现所需的大小范围和相对窄的颗粒大小分布。
若干技术可供用于将颗粒的大小设定为所需的大小。用于脂质体并且同等可适用于本发明颗粒的一种设定大小的方法在美国专利号4,737,323中描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。通过浴或探针超声对颗粒悬浮液超声产生了大小逐渐减小至大小小于约50nm的颗粒。均质化为依赖于剪切能量将更大的颗粒破碎成更小的颗粒的另一种方法。在通常的均质化工序中，颗粒流通穿过标准的乳液均化器直到观察到选择的颗粒大小，通常在约60nm与约80nm之间。在这两种方法中，颗粒大小分布可以通过常规的激光束颗粒大小鉴别或QELS来监测。
通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜将颗粒挤出也是用于将颗粒大小减小至相对明确定义的大小分布的有效方法。通常，悬浮液循环穿过膜一次或多次直到实现所需的颗粒大小分布。可以通过孔越来越小的膜挤出颗粒来实现大小逐渐减小。
在一些实施方案中，如在例如美国专利申请号09/744,103中所描述预缩合存在于颗粒中的核酸，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在其它实施方案中，该方法可以进一步包括使用本发明组合物加入有用于实现细胞脂转染的非脂质聚阳离子。适合的非脂质聚阳离子的实例包括海美溴铵(hexadimethrine bromide)(以商品名出售，来自Aldrich ChemicalCo.,Milwaukee,Wisconsin,USA)或己二甲胺的其它盐。其它适合的聚阳离子包括例如聚-L-鸟氨酸、聚-L-精氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚丙烯胺以及聚乙烯亚胺的盐。这些盐的加入优选地在颗粒已形成之后。
在一些实施方案中，形成的核酸-脂质颗粒(例如，LNP)中的核酸与脂质比率(质量/质量比率)将在约0.01至约0.2、约0.05至约0.2、约0.02至约0.1、约0.03至约0.1或约0.01至约0.08的范围内。起始材料(进料)的比率也落于此范围内。在其它实施方案中，颗粒制备使用了每10mg总脂质约400μg核酸或约0.01至约0.08的核酸与脂质质量比率，并且更优选地约0.04，其相应于每50μg核酸1.25mg总脂质。在其它优选的实施方案中，颗粒的核酸:脂质质量比为约0.08。
在其它实施方案中，形成的核酸-脂质颗粒(例如，LNP)中的脂质与核酸比率(质量/质量比率)将在约1(1:1)至约100(100:1)、约5(5:1)至约100(100:1)、约1(1:1)至约50(50:1)、约2(2:1)至约50(50:1)、约3(3:1)至约50(50:1)、约4(4:1)至约50(50:1)、约5(5:1)至约50(50:1)、约1(1:1)至约25(25:1)、约2(2:1)至约25(25:1)、约3(3:1)至约25(25:1)、约4(4:1)至约25(25:1)、约5(5:1)至约25(25:1)、约5(5:1)至约20(20:1)、约5(5:1)至约15(15:1)、约5(5:1)至约10(10:1)的范围内或约5(5:1)、6(6:1)、7(7:1)、8(8:1)、9(9:1)、10(10:1)、11(11:1)、12(12:1)、13(13:1)、14(14:1)、15(15:1)、16(16:1)、17(17:1)、18(18:1)、19(19:1)、20(20:1)、21(21:1)、22(22:1)、23(23:1)、24(24:1)或25(25:1)或其任何部分或其中的范围。起始材料(进料)的比率也落于此范围内。
如先前所讨论，缀合的脂质可以进一步包括CPL。本文讨论了用于制造LNP-CPL(含CPL的LNP)的各种通用方法。两种通用技术包括：“后插入”技术，即将CPL插入到例如预先形成的LNP中；和“标准”技术，其中CPL在例如LNP形成步骤过程中包括在脂质混合物中。后插入技术产生主要在LNP双层膜的外表面中具有CPL的LNP，而标准技术提供在内表面和外表面均具有CPL的LNP。所述方法尤其有用于从磷脂(其可以含有胆固醇)制得的囊泡并且还有用于含有PEG-脂质(如PEG-DAA和PEG-DAG)的囊泡。制造LNP-CPL的方法例如在美国专利号5,705,385；6,586,410；5,981,501；6,534,484和6,852,334；美国专利申请公布号2002/0072121；以及PCT公布号WO00/62813中教导，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
VII.试剂盒
本发明还提供了呈试剂盒形式的脂质颗粒(例如，LNP)。在一些实施方案中，试剂盒包括被分成隔间用于容纳脂质颗粒的各种元件(例如，活性剂或治疗剂如核酸和颗粒的单独脂质组分)的容器。优选地，试剂盒包括容纳本发明的脂质颗粒(例如，LNP)的容器(例如，小瓶或安瓿)，其中颗粒由本文列出的方法之一产生。在某些实施方案中，试剂盒可以进一步包含内体膜去稳定剂(例如，钙离子)。试剂盒通常含有呈药学上可接受的载体中的悬浮液或以脱水形式存在的本发明的颗粒组合物与用于其再水合(如果冻干)和施用的说明书。
本发明的脂质颗粒可以定制为优选靶向感兴趣的具体组织、器官或肿瘤。在一些例子中，1:57脂质颗粒(例如，LNP)制剂可以用来优选靶向肝脏(例如，正常的肝脏组织)。在其它例子中，7:54脂质颗粒(例如，LNP)制剂可以用来优选靶向实体瘤如肝脏肿瘤和肝脏外部的肿瘤。在优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含这些肝脏定向和/或肿瘤定向的脂质颗粒，其中颗粒呈悬浮液或以脱水形式存在于容器中。
在某些其它例子中，可以让靶向部分附接至脂质颗粒的表面以进一步增强颗粒的靶向是可取的。将靶向部分(例如，抗体、蛋白质等)附接至脂质(如用于本发明颗粒中的那些)的方法为本领域技术人员所已知。
VIII.脂质颗粒的施用
一旦形成，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)有用于将活性剂或治疗剂(例如，核酸如干扰RNA)引入到细胞中。因此，本发明还提供了用于将活性剂或治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)引入到细胞中的方法。在一些例子中，细胞为肝脏细胞，例如像存在于肝脏组织中的肝细胞。在其它例子中，细胞为肿瘤细胞，例如像存在于实体瘤中的肿瘤细胞。通过首先形成如上所述的颗粒并且然后使颗粒与细胞接触足够用于活性剂或治疗剂递送至细胞的一段时间来体外或体内进行所述方法。
本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可以被吸收至几乎与其混合或接触的任何细胞类型中。一旦吸收，颗粒可以被细胞的一部分内吞，与细胞膜交换脂质，或与细胞融合。颗粒的活性剂或治疗剂(例如，核酸)部分的转移或掺入可以经由这些途径中的任何一种来发生。具体地说，当融合发生时，颗粒膜并入细胞膜中并且颗粒的内容物与细胞内流体组合。
本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可以单独地或与根据施用途径和标准药物实践选择的药学上可接受的载体(例如，生理盐水或磷酸盐缓冲液)混合施用。通常，生理缓冲盐水(例如，135mM-150mM NaCl)将采用作为药学上可接受的载体。其它适合的载体包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于增强的稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。额外的适合载体在例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,MackPublishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)中描述。如本文所使用，“载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。短语“药学上可接受的”是指当向人施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。
药学上可接受的载体通常在脂质颗粒形成之后加入。因此，在脂质颗粒(例如，LNP)形成之后，可以将颗粒稀释到药学上可接受的载体如生理缓冲盐水中。
药物制剂中的颗粒浓度可以广泛变化，即从小于约0.05重量％，通常在或至少约2重量％至5重量％至多达约10重量％至90重量％，并且将根据所选择的具体施用方式主要通过流体体积、粘度等来选择。例如，可以增加浓度以降低与治疗相关的流体负荷。这可以在患有动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重高血压的患者中是特别可取的。或者，可以将主要由刺激性脂质组成的颗粒稀释至低浓度以减少施用部位上的炎症。
本发明的药物组合物可以通过常规熟知的灭菌技术来灭菌。水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并且冻干，冻干的制剂在施用之前与无菌水溶液组合。当需要接近生理条件时，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾以及氯化钙。另外，颗粒悬浮液可以包括在储存时保护脂质不受自由基和脂质过氧化损害的脂质保护剂。亲脂性自由基淬灭剂如α生育酚和水溶性铁特异性螯合剂如铁草胺为适合的。
在一些实施方案中，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)在用于治疗性递送包含干扰RNA序列(例如，siRNA)的一种或多种核酸的方法中特别有用。具体地说，本发明的目的为提供用于通过下调或沉默感兴趣的一个或多个靶核酸序列或基因的转录和/或翻译来治疗哺乳动物(例如，啮齿动物如小鼠或灵长类动物如人、黑猩猩或猴)体内的疾病或病症的体外和体内方法。作为一个非限制性实例，本发明的方法有用于将干扰RNA(例如，siRNA)体内递送至哺乳动物受试者的肝脏和/或肿瘤。在某些实施方案中，疾病或病症与基因的表达和/或过表达相关，并且基因的表达或过表达通过干扰RNA(例如，siRNA)减少。在某些其它实施方案中，可以向哺乳动物施用治疗有效量的脂质颗粒。在一些例子中，将干扰RNA(例如，siRNA)配制到LNP中，并且向需要此种治疗的患者施用颗粒。在其它例子中，从患者中去除细胞，体外(例如，使用本文描述的LNP)递送干扰RNA，并且将细胞再注入患者中。
A.体内施用
使用核酸-脂质颗粒如在PCT公布号WO 05/007196、WO 05/121348、WO 05/120152和WO 04/002453中描述的那些已实现了用于体内疗法的系统递送，例如经由身体系统如循环将治疗性核酸递送至远端靶细胞，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。本发明还提供了完全包囊的脂质颗粒，其保护核酸不受血清中的核酸酶降解、为非免疫原性的、尺寸小的并且适用于重复给药。
针对体内施用，施用可以本领域中已知的任何方式，例如通过注射、口服施用、吸入(例如，鼻内或气管内)、透皮涂敷或直肠施用。施用可以经由单次剂量或分开剂量来完成。药物组合物可以肠胃外即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内施用。在一些实施方案中，药物组合物通过弹丸注射静脉内或腹膜内施用(参见，例如美国专利号5,286,634)。细胞内核酸递送还讨论于Straubringer等,Methods Enzymol.,101:512(1983)；Mannino等,Biotechniques,6:682(1988)；Nicolau等,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.,6:239(1989)；以及Behr,Acc.Chem.Res.,26:274(1993)。施用基于脂质的治疗剂的其它方法在例如美国专利号3,993,754；4,145,410；4,235,871；4,224,179；4,522,803以及4,588,578中描述。脂质颗粒可以通过在疾病部位处直接注射或通过在远离疾病部位的部位处注射来施用(参见，例如Culver,HUMAN GENE THERAPY,MaryAnn Liebert Inc.,Publishers,NewYork.第70-71页(1994))。上述参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
在其中静脉内施用本发明的脂质颗粒(例如，LNP)的实施方案中，在注射之后约8、12、24、36或48小时，至少约5％、10％、15％、20％或25％的颗粒的总注射剂量存在于血浆中。在其它实施方案中，在注射之后约8、12、24、36或48小时，多于约20％、30％、40％以及多达约60％、70％或80％的脂质颗粒的总注射剂量存在于血浆中。在某些例子中，在施用之后约1小时，多于约10％的多个颗粒存在于哺乳动物的血浆中。在某些其它例子中，在施用颗粒之后至少约1小时可检测到脂质颗粒的存在。在某些实施方案中，在施用之后约8、12、24、36、48、60、72或96小时下，在肺、肝脏、肿瘤的细胞中或在炎症的部位处可检测到治疗剂如核酸的存在。在其它实施方案中，在施用之后约8、12、24、36、48、60、72或96小时下可检测到通过干扰RNA(例如，siRNA)的靶序列表达的下调。在又其它实施方案中，通过干扰RNA(例如，siRNA)的靶序列表达的下调优选发生在肝脏细胞(例如，肝细胞)、肿瘤细胞中或在炎症部位处的细胞中。在另外的实施方案中，在施用之后约12、24、48、72或96小时下或约6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26或28天下可检测到施用部位近端或远端部位处的细胞中或肺、肝脏或肿瘤细胞中的干扰RNA(例如，siRNA)的存在或作用。在额外实施方案中，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)肠胃外或腹膜内施用。
单独或与其它适合的组分组合的本发明组合物可以制成有待经由吸入(例如，鼻内或气管内)施用的气溶胶制剂(即，它们可以被“雾化”)(参见，Brigham等,Am.J.Sci.,298:278(1989))。气雾剂制剂可以置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
在某些实施方案中，药物组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气雾剂递送媒介物来递送。用于经由鼻气雾剂喷雾直接将核酸组合物递送至肺的方法已描述于例如美国专利号5,756,353和5,804,212中。同样，使用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰-甘油化合物递送药物(美国专利5,725,871)在药学领域中也是熟知的。类似地，以聚四氟乙烯载体基质形式的透粘膜药物递送在美国专利号5,780,045中描述。上述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
适用于肠胃外施用例如像通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内以及皮下途径的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与所预期的受体的血液等渗的溶质；和水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，组合物优选地例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内施用。
通常，当静脉内施用时，脂质颗粒制剂用适合的药物载体配制。许多药学上可接受的载体可以在本发明的组合物和方法中采用。用于本发明的适合制剂例如在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)中找到。可以使用各种水性载体，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等，并且可以包括用于增强的稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，生理缓冲盐水(135mM-150mM NaCl)将采用作为药学上可接受的载体，但其它适合的载体也将满足需要。这些组合物可以通过常规脂质体灭菌技术如过滤来灭菌。当需要接近生理条件时，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。可以使用以上提到的技术灭菌这些组合物，或可选地其可以在无菌条件下产生。所得到的水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并且冻干，冻干的制剂在施用之前与无菌水溶液组合。
在某些应用中，本文公开的脂质颗粒可以经由口服施用向个体递送。颗粒可以与赋形剂合并并且以可摄取片剂、颊部片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂、糖锭、酏剂、漱口水、混悬剂、口服喷雾剂、糖浆剂、晶片等形式使用(参见，例如美国专利号5,641,515、5,580,579以及5,792,451，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文)。这些口服剂型还可以含有以下物质：粘合剂、明胶；赋形剂、润滑剂和/或调味剂。当单位剂型为胶囊剂时，它可以含有除了以上描述的材料以外的液体载体。各种其它材料可以呈包衣或以另外的方式修改剂量单位的物理形式存在。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该为药物纯的并且在所采用的量的情况下基本上无毒。
通常，这些口服制剂可以含有至少约0.1％的脂质颗粒或更多，虽然颗粒的百分比当然可以改变并且可以常规上为总制剂的重量或体积的约1％或2％与约60％或70％或更多之间。自然地，可以适合剂量将在化合物的任何给定单位剂量中获得的方式制备每个治疗有用的组合物中的颗粒的量。制备此类药物制剂的领域中的技术人员将想到如溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途径、产品保质期的因素以及其它药理学考虑，并且同样地，各种剂量和治疗方案可以是可取的。
适用于口服施用的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，如有效量的悬浮在稀释剂如水、盐水或PEG 400中的包装的治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)；(b)胶囊剂、小药囊剂或片剂，每种均含有呈液体、固体、细粒或明胶形式的预先确定的量的治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)；(c)在适当液体中的悬浮液；以及(d)适合的乳液。片剂形式可以包括以下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药学上相容的载体。糖锭形式可以包含在香料例如蔗糖中的治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)以及在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖中包含治疗剂的锭剂和除了治疗剂以外含有本领域中已知的载体的阿拉伯树胶乳液、凝胶等。
在其使用的另一个实例中，脂质颗粒可以并入广范围的局部剂型中。例如，含有核酸-脂质颗粒如LNP的悬浮液可以配制成凝胶、油、乳液、局部霜剂、糊剂、软膏、洗剂、泡沫、摩丝等形式并且以所述形式施用。
当制备本发明的脂质颗粒的药物制剂时，优选使用大量已纯化减少或消除空颗粒或具有治疗剂如与外表面缔合的核酸的颗粒的这些颗粒。
本发明的方法可以在各种宿主中实践。优选的宿主包括哺乳动物种类，如灵长类动物(例如，人和黑猩猩以及其它非人灵长类动物)、犬、猫、马、牛、绵羊、山羊、啮齿动物(例如，大鼠和小鼠)、兔类动物以及猪。
所施用的颗粒的量将取决于治疗剂(例如，核酸)与脂质的比率、所使用的具体治疗剂(例如，核酸)、治疗的疾病或病症、患者的年龄、重量和病状以及临床医生的判断，但是通常将在约0.01mg/Kg体重与约50mg/Kg体重之间，优选地约0.1mg/Kg体重与约5mg/Kg体重之间，或每次施用(例如，注射)约108-1010个颗粒。
B.体外施用
针对体外应用，治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)可以递送至培养生长的任何细胞，无论具有植物或动物来源、脊椎动物或无脊椎动物以及具有任何组织或类型。在优选的实施方案中，细胞为动物细胞，更优选地为哺乳动物细胞，并且最优选地为人细胞(例如，肿瘤细胞或肝细胞)。
当体外进行时细胞与脂质颗粒之间的接触发生在生物相容的培养基中。颗粒的浓度广泛取决于具体应用而改变，但是通常在约1μmol与约10mmol之间。通常在生理温度(约37℃)下进行用脂质颗粒对细胞的治疗，持续约1至48小时、优选地约2至4小时的时间段。
在一组优选的实施方案中，将脂质颗粒悬浮液加入到细胞密度为约103至约105个细胞/毫升、更优选地约2x104个细胞/毫升的60％-80％汇合的涂铺的细胞中。加入到细胞中的悬浮液的浓度优选地为约0.01μg/ml至0.2μg/ml，更优选地约0.1μg/ml。
根据细胞的组织培养可能需要的程度，它为本领域中熟知的。例如，Freshney,Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique,第3版,Wiley-Liss,New York(1994)；Kuchler等,Biochemical Methods in Cell Culture and Virology,Dowden,Hutchinson and Ross Inc.(1977)以及在其中引用的参考文献提供了细胞培养的一般指导。培养的细胞系统常常将呈细胞单层的形式，虽然也使用细胞悬浮液。
使用内体释放参数(ERP)测定，可以优化本发明的LNP或其它脂质颗粒的递送效率。ERP测定在美国专利申请公布号2003/0077829中详细描述，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。更具体地说，ERP测定的目的在于基于其对内体膜的结合/吸收或融合/去稳定的相对作用区分LNP或其它脂质颗粒的各种阳离子脂质和协助脂质组分的作用。此测定允许人们定量确定LNP或其它脂质颗粒的每种组分如何影响递送效率，从而优化LNP或其它脂质颗粒。通常，ERP测定测量报告蛋白质(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)等)的表达，并且在一些例子中，针对表达质粒优化的LNP制剂也将适用于包囊干扰RNA。在其它例子中，ERP测定可以适用于测量干扰RNA(例如，siRNA)存在或不存在情况下的靶序列的转录或翻译的下调。通过比较各种LNP或其它脂质颗粒中的每一种的ERP，人们可以容易地确定优化的系统，例如在细胞中具有最大吸收的LNP或其它脂质颗粒。
C.用于递送脂质颗粒的细胞
本发明的组合物和方法用来体内和体外治疗各种各样的细胞类型。适合的细胞包括但不限于肝细胞、网状内皮细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞等)、成纤维细胞、内皮细胞、血小板细胞、感染和/或易被病毒感染的其它细胞类型、造血前体(干)细胞、角质细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞、成骨细胞、神经元、休眠淋巴细胞、终末分化细胞、慢循环或不循环原代细胞、实质细胞、淋巴样细胞、上皮细胞、骨细胞等。
在具体实施方案中，将活性剂或治疗剂如核酸(例如，干扰RNA)递送至癌细胞(例如，实体瘤的细胞)，包括但不限于肝癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肛门癌细胞、胆管癌细胞、小肠癌细胞、胃(胃的)癌细胞、食管癌细胞、胆囊癌细胞、胰腺癌细胞、阑尾癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、中枢神经系统的癌细胞、成胶质细胞瘤肿瘤细胞、皮肤癌细胞、淋巴瘤细胞、绒毛膜癌肿瘤细胞、头颈癌细胞、骨原性肉瘤肿瘤细胞以及血癌细胞。
体内递送脂质颗粒如包囊核酸(例如，干扰RNA)的LNP适用于靶向任何细胞类型的细胞。可以针对各种各样的脊椎动物采用本发明的方法和组合物，所述脊椎动物包括哺乳动物例如像犬、猫、马、牛、绵羊、山羊、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和豚鼠)、兔类动物、猪以及灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人)。
D.脂质颗粒的检测
在一些实施方案中，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可在约1、2、3、4、5、6、7、8或更多小时下在受试者体内检测到。在其它实施方案中，本发明的脂质颗粒(例如，LNP)可在颗粒施用之后约8、12、24、48、60、72或96小时或约6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25或28天时在受试者体内检测到。可以在来自受试者的细胞、组织或其它生物样品中检测到颗粒的存在。可以例如通过直接检测颗粒、检测治疗性核酸如干扰RNA(例如，siRNA)序列、检测感兴趣的靶序列(即，通过检测感兴趣的序列的表达或减少的表达)或其组合来检测颗粒。
1.颗粒的检测
可以使用本领域中已知的任何方法检测本发明的脂质颗粒如LNP。例如，可以使用本领域中熟知的方法直接或间接地将标记偶联至脂质颗粒的组分。可以使用各种各样的标记，其中标记的选择取决于所需要的灵敏度、与脂质颗粒组分缀合的容易性、稳定性要求以及可供使用的仪器和防护条件。适合的标记包括但不限于光谱标记如荧光染料(例如，荧光素和衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)和Oregon GreenTM；罗丹明和衍生物如德克萨斯红、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)等、地高辛(digoxigenin)、生物素、藻红蛋白、AMCA、CyDyesTM等；放射性标记如3H、125I、35S、14C、32P、33P等；酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等；光谱比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料珠如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等。可以使用本领域中已知的任何方式检测标记。
2.核酸的检测
通过本领域技术人员熟知的许多方式中的任一种在本文中检测和定量核酸(例如，干扰RNA)。可以通过熟知的方法如DNA分析、RNA分析、凝胶电泳、PCR、放射性标记、闪烁计数以及亲和色谱法来进行核酸的检测。还可以采用额外的分析生物化学方法如分光光度法、放射显影法、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)以及高扩散色谱法。
核酸杂交形式的选择不是关键性的。各种核酸杂交形式为本领域技术人员已知的。例如，常见形式包括夹心测定和竞争或置换测定。杂交技术通常描述于例如“NucleicAcid Hybridization,A Practical Approach,”编著Hames和Higgins,IRL Press(1985)中。
可以通过使用使所检测到的靶核酸倍增的核酸扩增系统来增强杂交测定的灵敏度。适用于扩增用作分子探针的序列或用于产生用于随后亚克隆的核酸片段的体外扩增技术为已知的。通过包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增以及其它RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBATM)的此类体外扩增方法足够指导技术人员的技术的实例在Sambrook等,在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press(2000)；和Ausubel等,SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY编著,Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc和John Wiley&Sons,Inc(2002)；以及美国专利号4,683,202；PCR Protocols,A Guide to Methods andApplications(Innis等编著)Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)；Arnheim&Levinson(1990年10月1日),C&EN 36；The Journal Of NIH Research,3:81(1991)；Kwoh等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173(1989)；Guatelli等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874(1990)；Lomell等,J.Clin.Chem.,35:1826(1989)；Landegren等,Science,241:1077(1988)；Van Brunt,Biotechnology,8:291(1990)；Wu和Wallace,Gene,4:560(1989)；Barringer等,Gene,89:117(1990)；以及Sooknanan和Malek,Biotechnology,13:563(1995)中找到。体外克隆扩增的核酸的改进方法描述于美国专利号5,426,039中。在本领域中描述的其它方法为基于核酸序列的扩增(NASBATM,Cangene,Mississauga,Ontario)和Qβ-复制酶系统。这些系统可以用来直接鉴定其中存在选择序列时PCR或LCR引物仅设计为延伸或连接的突变体。或者，通常可以使用例如非特异性PCR引物和后来探测指明突变的特异性序列的扩增的靶区来扩增选择序列。上述参考文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
用作例如在体外扩增方法中的探针、用作基因探针或作为抑制剂组分的核酸通常根据Beaucage等,Tetrahedron Letts.,22:1859 1862(1981)所描述的固相亚磷酰胺三酯方法，例如使用如在Needham VanDevanter等,Nucleic Acids Res.,12:6159(1984)中描述的自动合成器来化学合成。在必要的情况下，通常通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过如在Pearson等,J.Chrom.,255:137 149(1983)中描述的阴离子交换HPLC来进行多核苷酸的纯化。可以使用在Grossman和Moldave(编著)Academic Press,New York,Methods inEnzymology,65:499中的Maxam和Gilbert(1980)的化学降解方法验证合成多核苷酸的序列。
用于确定转录水平的替代方式为原位杂交。原位杂交测定为熟知的并且通常描述于Angerer等,Methods Enzymol.,152:649(1987)中。在原位杂交测定中，细胞被固定至固体载体，通常为载玻片。如果探测DNA，用加热或碱使细胞变性。然后在中等温度下使细胞与杂交溶液接触以容许标记的特异性探针退火。探针优选地用放射性同位素或荧光报告分子标记。
IX.实施例
将通过具体实施例来更详细地描述本发明。以下实施例出于说明的目的而提供，并不旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将很容易地认识到，可改变或修改各种非关键性参数以产生基本上相同的结果。
一般方法：除非另有说明，否则所有反应均在室温下于氮气正压下进行。所有试剂均购自商业来源并且不需要进一步纯化即使用。通过在硅胶60F254(0.25mm，E.Merck)上的TLC监测反应进程。在UV光下或通过用茴香醛或硫酸铜染色剂炭化检测斑点。所有柱色谱法均在硅胶60(40-60μM)上进行。硅胶和粗产物之间的比率在100到50:1的范围内。在300MHz或400MHz下记录1H NMR光谱并且化学位移内部参考残余质子化溶剂(7.27ppm CHCl3)。在小于40℃下、在真空下浓缩有机溶液。
实施例1
本实施例描述了本发明示例性的三烷基阳离子脂质的合成。
化合物9的合成方案
化合物2的合成
向(Z)-癸-4-烯-1-醇9(20g，128.0mmol)和三乙胺(26.7mL，191.9mmol)在无水二氯甲烷(200mL)中的冷却溶液(0℃)中缓慢加入甲烷磺酰氯(14.9mL，191.9mmol)。在室温下将溶液搅拌30分钟然后用二氯甲烷(100mL)稀释。用饱和碳酸氢钠(3x 150mL)洗涤溶液并且然后用二氯甲烷(150mL)萃取合并的水洗涤液。将合并的二氯甲烷萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过二氧化硅垫(100％二氯甲烷)过滤残余物，得到呈黄色油状物的(Z)-甲磺酸癸-4-烯基酯2(28.5g，95％)。Rf 0.5(100％CH2Cl2)。
化合物3的合成
向(Z)-甲磺酸癸-4-烯基酯2(28.5g，121.1mmol)在2-甲基四氢呋喃(280mL)中的溶液中加入四丁基溴化铵(48.8g，151.4mmol)。在氮气下，在80℃下将溶液搅拌30分钟，然后用乙醚(150mL)稀释并且用水(75mL)和盐水(75mL)洗涤。将乙醚溶液用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过二氧化硅垫(100％己烷)过滤浅黄色油状物，得到呈无色油状物的(Z)-1-溴癸-4-烯3(23.0g，87％)。Rf 0.9(10％EtOAc-己烷)。
化合物4的合成
在氮气下，向镁屑(1.4g，55.1mmol)在无水THF(6mL)中的悬浮液中缓慢加入(Z)-1-溴癸-4-烯3(11.5g，52.5mmol)在THF(12mL)中的溶液。在氮气下，在45℃下将反应混合物搅拌30分钟。将溶液冷却至0℃并且在5分钟内逐滴加入甲酸乙酯(4.1g，55.1mmol)在THF(12mL)中的溶液。在室温下将溶液搅拌2小时，然后冷却至-15℃并且缓慢地用水(10mL)接着用5M盐酸(15mL)淬灭。一旦镁完全溶解，用水(50mL)稀释溶液并且用己烷(3x 75mL)萃取。将合并萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。将所获得的残余物溶解于乙醇(40mL)中并且加入氢氧化钾(4.4g，78.7mmol)在水(10mL)中的溶液。将反应混合物剧烈搅拌30分钟，然后在真空中浓缩以除去乙醇。然后用5M盐酸(15mL)将溶液调成酸性并且用己烷(3x 75mL)萃取。将合并的己烷萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(100％己烷至2.5％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化粗产物，得到呈浅黄色油状物的(6Z,15Z)-二十一-6,15-二烯-11-醇4(5.6g，35％)。Rf 0.4(10％EtOAc-己烷)。
化合物5的合成
向(6Z,15Z)-二十一-6,15-二烯-11-醇4(5.6g，18.2mmol)和三乙胺(3.8mL，27.2mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的冷却溶液(0℃)中缓慢加入甲磺酰氯(2.1mL，27.2mmol)。在室温下将反应混合物搅拌2小时然后用二氯甲烷(50mL)稀释。用饱和碳酸氢钠(3x 25mL)洗涤溶液，然后用二氯甲烷(50mL)萃取合并的水洗涤液。将合并的二氯甲烷萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过二氧化硅垫(100％DCM)过滤浅黄色油状物，得到呈无色原油状的(6Z,15Z)-甲磺酸二十一-6,15-二烯-11-基酯5(7.6g)。Rf0.8(100％CH2Cl2)。
化合物6的合成
将(6Z,15Z)-甲磺酸二十一-6,15-二烯-11-基酯5(7.6g，19.6mmol)和氰化钠(4.8g，98.1mmol)在无水DMF(60mL)中的溶液加热至60℃过夜。当完成时，将反应混合物倒入水(200mL)中并且用乙酸乙酯(3x100mL)萃取。用盐水(3x 100mL)洗涤合并的乙酸乙酯萃取物，用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(100％己烷至1％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化产物，得到呈无色油状物的(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯腈6(6.6g，97％)。Rf 0.75(10％EtOAc-己烷)。
化合物7的合成
向(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯腈6(4.0g，12.6mmol)在无水二氯甲烷(125mL)中的冷却溶液(-78℃)中缓慢加入1M二异丁基氢化铝的己烷溶液(5.6mL，31.5mmol)。将溶液温热至-15℃并且搅拌1小时。当完成时，用5％盐酸(30mL)淬灭反应并且在-15℃下搅拌直至氢气停止放出。然后用二氯甲烷(75mL)稀释溶液并且用5M盐酸(100mL)洗涤有机层。将二氯甲烷萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(100％己烷至2％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化残余物，得到呈无色油状物的(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯醛7(3.9g，97％)。Rf 0.65(5％EtOAc-己烷)。
化合物8的合成
向镁屑(0.6g，23.9mmol)在四氢呋喃(5mL)中的悬浮液中缓慢加入(Z)-1-溴癸-4-烯3(4.5g，20.5mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液。在室温下将反应混合物搅拌30分钟，然后加入(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯醛7在四氢呋喃(5mL)中的溶液。在室温下将溶液搅拌15分钟然后倒入5％盐酸(50mL)和冰(100mL)中。用乙醚(2x 150mL)萃取溶液。将合并的乙醚萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(1％乙酸乙酯的己烷溶液)纯化残余物，得到呈无色油状物的(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(4.8g，76％)。Rf 0.45(10％EtOAc-己烷)。
化合物9的合成
向(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(0.4g，0.9mmol)、4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.2g，1.3mmol)、EDCI盐酸盐(0.25g，1.3mmol)、二异丙基乙胺(0.4mL，2.6mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入二甲基氨基吡啶(5mg)。将溶液回流2小时然后在室温下搅拌2小时。在真空中浓缩混合物至干燥并且通过柱色谱法(100％乙酸乙酯)纯化，得到呈浅黄色油状物的(6Z,16Z)-4-(二甲基氨基)丁酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯9。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.36(m,6H),4.93(m,1H),2.30(m,4H),2.22(s,6H),2.03(m,12H),1.88(m,2H),1.66-1.18(m,31H),0.90(m,9H)。Rf0.3(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物11和化合物13的合成方案
化合物10的合成
向(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(2.4g，5.2mmol)、6-溴己酸(1.5g，7.8mmol)、EDCI盐酸盐(1.5g，7.8mmol)、二异丙基乙胺(2.0g，15.6mmol)在无水二氯甲烷(25mL)中的溶液中加入二甲基氨基吡啶(15mg)。将溶液回流2小时，冷却至室温并且在真空中浓缩至干燥。通过在硅胶60(2”W x 10”L；用5％EtOAc/Hex洗脱)上的柱色谱法纯化反应混合物，得到呈无色油状物的(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯10(3.1g，94％)。Rf 0.5(10％EtOAc-己烷)。
化合物11的合成
向在特氟隆(teflon)密封的压力容器中的(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11-基酯10(3.1g，4.9mmol)中加入5.6M二甲胺在乙醇(20mL)中的溶液并且将反应加热至70℃并且搅拌过夜。一旦完成，在真空中浓缩反应物至干燥。将残余物溶解于乙酸乙酯(100mL)中并且用碳酸氢钠溶液(2x 50mL)洗涤。将乙酸乙酯层用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(100％EtOAc)纯化残余物，得到呈浅黄色油状物的(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11(2.0g，69％)，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.36(m,6H),4.93(m,1H),2.27(m,10H),2.00(m,12H),1.63(m,6H),1.51(m,6H),1.28(m,25H),0.90(m,9H)。Rf 0.3(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物12的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯10的工序类似的工序，从(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(4.0g，8.7mmol)、6-溴-正戊酸(2.4g，13.0mmol)、EDCI盐酸盐(2.5g，13.0mmol)、二异丙基乙胺(3.4g，26.0mmol)和二甲基氨基吡啶(10mg)获得呈无色油状物的(6Z,16Z)-5-溴戊酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯12(3.3g，61％)。Rf 0.5(10％EtOAc-己烷)。
化合物13的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11的工序类似的工序，从5.6M二甲胺在乙醇(20mL)中的溶液获得呈浅黄色油状物的(6Z,16Z)-5-(二甲基氨基)戊酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯13(1.9g，62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45-5.28(m,6H),4.95-4.90(m,1H),2.34-2.23(m,4H),2.23-2.20(s,6H),2.06-1.92(m,12H),1.70-1.58(m,5H),1.58-1.44(m,5H),1.44-1.15(m,25H),0.92-0.87(m,9H)。Rf0.4(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物14的合成方案
化合物14的合成
抽空含有(6Z,16Z)-5-(二甲基氨基)戊酸12-((Z)-壬-4-烯-1-基)二十三-6,16-二烯-11-基酯13(200mg，0.34mmol)的烧瓶并且用氮气回填(两次)，然后用Pd/C(150mg，10％w/w)处理并且随后悬浮在EtOAc(10mL)中。然后抽空反应烧瓶并且用H2(3x)回填，并且剧烈搅拌混合物(18h)。然后抽空H2并且用N2回填烧瓶。通过硅藻土(Celite)过滤反应混合物，用EtOAc冲洗滤饼，并且浓缩滤液。使粗料经受色谱法(EtOAc)，产生呈无色油状物的5-(二甲基氨基)戊酸12-壬基二十三-11-基酯14(100mg，50％)。Rf 0.35(10％CH3OH-CH2Cl2)；1H NMR(400MHz,CDCl3,δH)4.95-4.90(m,1H),2.31(t,2H),2.27(t,2H),2.21(s,6H),1.68-1.60(m,3H),1.58-1.42(m,5H),1.38-1.16(m,54H),0.88(t,6H)。
化合物19和化合物21的合成方案
化合物15的合成
使用与描述用于合成(Z)-甲磺酸癸-4-烯基酯2的工序类似的工序，从(Z)-壬-3-烯-1-醇(20.0g，128.0mmol)、三乙胺(26.7mL，191.9mmol)和甲磺酰氯(14.9mL，191.9mmol)获得呈黄色油状物的(Z)-甲磺酸壬-3-烯基酯15(28.5g，92％)。Rf 0.15(30％乙酸乙酯-己烷)。
化合物16的合成
使用与描述用于合成(Z)-1-溴癸-4-烯3的工序类似的工序，从(Z)-癸-4-烯基甲磺酰酯15(28.5g，129mmol)和四丁基溴化铵(52.0g，161.4mmol)获得呈无色油状物的(Z)-1-溴壬-3-烯16(27.0g，定量)。Rf 0.6(10％EtOAc-己烷)。
化合物17的合成
向100mL圆底烧瓶中装入镁屑(0.6g，25.7mmol)并且装上搅拌棒。用热气枪干燥烧瓶5分钟。向烧瓶中装入THF(5mL)和单粒碘。将(Z)-1-溴壬-3-烯(4.5g，22.0mmol)在THF(5mL)中的溶液缓慢加入混合物中并且在氮气下将反应物回流30分钟。将溶液冷却至室温并且加入(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯醛7(4.7g，14.7mmol)在THF(5mL)中的溶液。在室温下将溶液搅拌过夜，并且当完成时将混合物倒入5％HCl(50mL)和冰(100mL)中。用醚(2x 150mL)萃取溶液并且将合并的醚萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(柱：2”W x 8”L；用100％己烷至5％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱)纯化残余物，得到呈无色油状物的(6Z,15Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-醇17(5.4g，82％)。Rf 0.5(10％EtOAc-己烷)。
化合物18的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯10的工序类似的工序，从(6Z,15Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-醇17(0.35g，0.7mmol)、5-溴-正戊酸(0.60g，3.4mmol)、EDCI(0.60g，3.4mmol)、二异丙基乙胺(0.90g，6.7mmol)和DMAP(5mg，催化剂)获得呈无色油状物的(6Z,15Z)-5-溴戊酸11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-基酯18(0.9g，66％)。Rf 0.5(10％EtOAc-己烷)。
化合物19的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11的工序类似的工序，从5.6M二甲胺在乙醇(10mL)中的溶液和(6Z,15Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-醇17(0.35g，0.7mmol)获得呈无色油状物的(6Z,15Z)-5-(二甲基氨基)戊酸11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-基酯19(0.2g，24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40-5.28(m,6H),4.97-4.88(m,1H),2.35-2.24(m,4H),2.24-2.19(m,6H),2.08-1.93(m,12H),1.70-1.55(m,3H),1.55-1.45(m,5H),1.45-1.13(m,25H),0.93-0.82(m,9H)。Rf 0.4(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物20的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯10的工序类似的工序，从(6Z,15Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-醇17(0.35g，0.7mmol)、6-溴-正己酸(0.70g，3.4mmol)、EDCI(0.60g，3.4mmol)、二异丙基乙胺(0.90g，6.7mmol)和DMAP(5mg，催化剂)获得呈无色油状物的(6Z,15Z)-6-溴己酸11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-基酯20(1.4g，99％)。Rf 0.6(10％EtOAc-己烷)。
化合物21的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11的工序类似的工序，从5.6M二甲胺在乙醇(15mL)中的溶液获得呈无色油状物的(6Z,15Z)-6-(二甲基氨基)己酸11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-基酯21(1.2g，92％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44-5.28(m,6H),4.95-4.88(m,1H),2.33-2.19(m,10H),2.08-1.90(m,12H),1.70-1.23(m,9H),1.23-1.14(m,26H),0.93-0.85(m,9H)。Rf 0.15(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物22的合成方案
化合物22的合成
向(6Z,15Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-醇17(0.5g，1.1mmol)、4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.3g，1.7mmol)、EDCI盐酸盐(0.3g，1.7mmol)、DIPEA(0.4g，3.4mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入DMAP(5mg)。在氮气气氛下，在室温下将溶液搅拌过夜。在真空中浓缩混合物至干燥，然后吸收在DCM(150mL)中并且用饱和碳酸氢钠萃取。通过在硅胶60(1:1乙酸乙酯/己烷)上的柱色谱法纯化反应混合物，得到呈无色油状物的(6Z,15Z)-4-(二甲基氨基)丁酸11-((Z)-癸-4-烯基)二十一-6,15-二烯-10-基酯22(0.4g,67％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40-5.28(m,6H),4.97-4.90(m,1H),2.36-2.25(m,4H),2.25-2.19(m,6H),2.07-1.95(m,12H),1.85-1.73(m,2H),1.58-1.45(m,3H),1.45-1.10(m,24H),0.93-0.85(m，9H)。Rf 0.4(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物23、化合物24和化合物25的合成方案
化合物23的合成
将(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(0.5g，1.1mmol)在无水乙醚(10mL)中的溶液缓慢加入冷却至约-15℃的双光气(0.2mL，1.8mmol)在无水乙醚中的溶液。将溶液搅拌1小时然后在-15℃下加入N,N,N’-三甲基-1,3-丙二胺(1.3mL，8.7mmol)。将溶液温热至室温，搅拌1小时，并且然后过滤以除去铵盐和尿素。在真空中浓缩乙醚滤液至干燥。通过柱色谱法(100％乙酸乙酯)纯化残余物，得到呈无色油状物的(6Z,16Z)-3-(二甲基氨基)丙基(甲基)氨基甲酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯23(0.15g，23％)，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.41-5.29(m,6H),4.85-4.77(m,1H),3.35-3.21(m,2H),2.93-2.81(m,3H),2.31-2.17(m,8H),2.08-1.92(m,12H),1.75-1.64(m,2H),1.64-1.15(m,31H),0.92-0.85(m,9H)。Rf 0.45(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物24的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-3-(二甲基氨基)丙基(甲基)氨基甲酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯23的工序类似的工序，从(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(0.5g，1.1mmol)、双光气(0.2mL，1.8mmol)、吡啶和3-(二甲基氨基)-1-丙胺(0.9g，8.7mmol)获得呈无色油状物的(6Z,16Z)-3-(二甲基氨基)丙基氨基甲酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯24(0.1g，17％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44-5.28(m,6H),4.81-4.72(bs,1H),4.55-4.45(bs,1H),3.34-3.15(m,3H),2.45-2.13(m,7H),2.10-1.86(m,12H),1.75-1.57(m,3H),1.57-1.03(m,30H),0.93-0.85(m,9H)。Rf 0.2(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物25的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯23的工序类似的工序，从(6Z,16Z)-3-(二甲基氨基)丙基(甲基)氨基甲酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(0.5g，1.1mmol)、双光气(0.2mL，1.8mmol)和N,N-二甲基乙二胺(0.8g,8.7mmol)获得呈无色油状物的(6Z,16Z)-2-(二甲基氨基)乙基氨基甲酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯25(0.20g，33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40-5.28(m,6H),5.08-5.01(bs,1H),4.82-4.73(bs,1H),3.30-3.18(m,2H),2.44-2.35(m,2H),2.30-2.20(m,6H),2.07-1.91(m,12H),1.65-1.11(m,31H),0.93-0.85(m,9H)。Rf0.4(10％MeOH-DCM)。
化合物26、化合物27和化合物28的合成方案
化合物26的合成
将(6Z,15Z)-11-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,15-二烯-10-醇17(2.25g，5.036mmol)和吡啶(611μL，7.6mmol)在无水Et2O(15mL)中的溶液加入到双光气(910μL，7.6mmol)在Et2O(15mL)中的冷却(0℃)溶液中。在搅拌(10min)之后过滤反应混合物并且浓缩以除去溶剂和残留光气。将三分之一的此氯甲酸酯(0.879g，1.679mmol)吸收在Et2O(5mL)中并且加入到N,N二甲基乙二胺(367μL，3.4mmol)在无水Et2O(5mL)中的冷却(0℃)溶液中。在搅拌(20min)之后，过滤混合物，浓缩并且经受色谱法(100％EtOAc)以产生呈澄清无色油状物的(6Z,15Z)-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸11-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,15-二烯-10-基酯26(603mg，64％)。Rf 0.28(10％MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(400MHz,CDCl3,δH)5.45-5.36(m,6H),5.30(br s,1H),4.89-4.78(m,1H),3.32-3.21(m,2H),2.42(t,2H),2.25(s,6H),2.16-1.94(m,12H),1.63-1.19(m,29H),0.92(t,9H)。
化合物27的合成
将氯甲酸酯(0.88g，1.7mmol)(如在(6Z,15Z)-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸11-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,15-二烯-10-基酯26的合成中所制备)的冷却(0℃)溶液溶解在无水Et2O(5mL)中并且加入到N,N二甲基丙二胺(422μL，3.4mmol)在无水Et2O(5mL)中的溶液中。当完成时(20min)，过滤溶液，浓缩并且然后通过柱色谱法(100％EtOAc)纯化粗料，产生呈澄清无色油状物的(6Z,15Z)-(3-(二甲基氨基)丙基)氨基甲酸11-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,15-二烯-10-基酯27(675mg，70％)。Rf 0.32(10％MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(400MHz,CDCl3,δH)5.44-5.33(m,6H),4.86-4.78(m,1H),3.32-3.21(m,2H),2.36(t,2H),2.24(s,6H),2.14-1.97(m,12H),1.69(明显p,2H),1.61-1.50(m,3H),1.50-1.20(m,27H),0.91(t,9H)。
化合物28的合成
将氯甲酸酯(0.88g，1.7mmol)(如在(6Z,15Z)-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基甲酸11-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,15-二烯-10-基酯26的合成中所制备)的冷却(0℃)溶液溶解在无水Et2O(5mL)中并且加入到N,N,N’三甲基丙二胺(492μL，3.4mmol)在无水Et2O(5mL)中的溶液中。当完成时(20min)，过滤溶液，浓缩并且然后通过柱色谱法(100％EtOAc)纯化粗料，产生呈澄清无色油状物的(6Z,15Z)-(3-(二甲基氨基)丙基)(甲基)氨基甲酸11-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十一-6，15-二烯-10-基酯28(672mg，68％)。Rf 0.44(10％MeOH/CH2Cl2)；1H NMR(400MHz，CDCl3，δH)5.43-5.32(m，6H)，4.85(br.s，1H)，3.38-3.27(m，2H)，2.95-2.87(m，3H)，2.28(t，2H)，2.24(s，6H)，2.14-1.96(m，12H)，1.72(明显p，2H)，1.67-1.49(m，3H)，1.49-1.20(m，26H)，0.91(t，9H)。
化合物30和化合物31的合成方案
化合物29的合成
向100mL圆底烧瓶中装入镁屑(263mg，10.9mmol)并且装上搅拌棒。在加入THF(5mL)和小粒碘之前，用热气枪干燥烧瓶5分钟，在氮气下冷却。缓慢加入(Z)-1-溴癸-4-烯3(2g，9.1mmol)在THF(5mL)中的溶液。在室温下将溶液搅拌2小时，然后加入乙醛酸乙酯(0.375mL，1.82mmol，50％甲苯溶液)。当完成时，用饱和的氯化铵溶液(5mL)淬灭溶液并且搅拌直到过量的镁溶解。用水稀释溶液并且用乙酸乙酯(3x 50mL)萃取。将合并的萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过柱色谱法(100％己烷至20％EtOAc的己烷溶液)纯化残余物，得到呈无色油状物的(6Z,16Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11，12-二醇29(700mg，48％)。
化合物30的合成
使用与描述用于合成(6Z，16Z)-4-(二甲基氨基)丁酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11-基酯9的工序类似的工序，从(6Z，16Z)-11-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11，12-二醇(0.35g，0.7mmol)、4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.20g，1.1mmol)、EDCI(0.20g，1.1mmol)、二异丙基乙胺(0.3g，2.2mmol)和DMAP(5mg，催化剂)获得呈无色油状物的(6Z,16Z)-4-(二甲基氨基)丁酸12-((Z)-癸-4-烯基)-12-羟基二十二-6,16-二烯-11-基酯30(0.10g，25％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.44-5.28(m,6H),5.03-4.95(m,1H),2.25-2.17(m,6H),2.14-1.65(m,14H),1.65-1.10(m,33H),0.93-0.82(m,9H)。Rf 0.2(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物31的合成
使用与描述用于合成6Z,16Z)-4-(二甲基氨基)丁酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯9的工序类似的工序，从(6Z,16Z)-4-(二甲基氨基)丁酸11-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11,12-二醇(1.0g，2.1mmol)、4-(二甲基氨基)丁酸盐酸盐(0.50g，3.1mmol)、EDCI(0.60g，3.1mmol)、二异丙基乙胺(0.80g，6.3mmol)和DMAP(5mg，催化剂)获得呈无色油状物的(6Z,16Z)-3-(二甲基氨基)丙酸12-((Z)-癸-4-烯基)-12-羟基二十二-6,16-二烯-11-基酯31(0.4g，33％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.40-5.28(m,6H),5.12-5.07(m,1H),4.75-4.55(bs,1H),2.77-2.65(m,1H),2.65-2.41(m,3H),2.28-2.15(m,6H),2.15-1.92(m,12H),1.67-1.10(m,30H),0.93-0.82(m,9H)。Rf0.5(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物40的合成方案
化合物33的合成
使用与描述用于合成2的工序类似的工序，从(Z)-壬-3-烯-1-醇32(25.0g，176mmol)、三乙胺(25.0mL)和甲磺酰氯(27.2mL，352mmol)获得呈黄色油状物的(Z)-甲磺酸壬-3-烯基酯33(33g，85％)。Rf 0.68(CH2Cl2)。
化合物34的合成
使用与描述用于合成3的工序类似的工序，从(Z)-甲磺酸壬-3-烯基酯(25.7g，117mmol)和四丁基溴化铵(52.6g，163mmol)获得呈黄色油状物的(Z)-壬-3-烯基溴化物34(20.2g，85％)。Rf 0.73(己烷)。
化合物35的合成
使用与描述用于合成4的工序类似的工序，从(Z)-壬-3-烯基溴化物(15.8g，76.8mmol)、镁屑(2.0g，82mmol)、甲酸乙酯(6.36mL，79.1mmol)和氢氧化钾(3.88g，69.1mmol)获得呈无色油状物的(6Z,13Z)-十九-6,13-二烯-10-醇35(9.11g，85％)。Rf0.43(10％EtOAc-己烷)。
化合物36的合成
使用与描述用于合成5的工序类似的工序，从(6Z,13Z)-十九-6,13-二烯-10-醇(9.11g，32.5mmol)、三乙胺(10mL)和甲磺酰氯(5.0mL，65mmol)获得呈无色油状物的(6Z,13Z)-甲磺酸十九-6,13-二烯-10-基酯36(11.6g，99％)。Rf 0.73(CH2Cl2)。
化合物37的合成
使用与描述用于合成6的工序类似的工序，从(6Z,13Z)-甲磺酸十九-6,13-二烯-10-基酯(11.6g，32.3mmol)和氰化钠(3.96g，80.9mmol)获得呈无色油状物的(Z)-2-((Z)-壬-3-烯-1-基)十一-5-烯腈37(7.2g，77％)。Rf 0.75(10％EtOAc-己烷)。
化合物38的合成
使用与描述用于合成7的工序类似的工序，从(Z)-2-((Z)-壬-3-烯-1-基)十一-5-烯腈(7.2g，24.9mmol)和DIBAL(49.7mL，呈1M己烷溶液，49.7mmol)获得呈无色油状物的(Z)-2-((Z)-壬-3-烯-1-基)十一-5-烯醛38(5.0g，69％)。Rf 0.69(10EtOAc-己烷)。
化合物39的合成
使用与描述用于合成8的工序类似的工序，从(Z)-2-((Z)-壬-3-烯-1-基)十一-5-烯醛(1.5g，5.1mmol)、(Z)-壬-3-烯基溴化物(1.58g，7.7mmol)和镁屑(206mg，8.5mmol)获得呈无色油状物的(6Z,14Z)-11-((Z)-壬-3-烯-1-基)二十-6,14-二烯-10-醇39(1.64g，76％)。Rf 0.46(10％EtOAc-己烷)。
化合物40的合成
使用与描述用于合成9的工序类似的工序，从(6Z,14Z)-11-((Z)-壬-3-烯-1-基)二十-6,14-二烯-10-醇(500mg，1.19mmol)、EDC(686mg，3.58mmol)、Hünig碱(726μL，4.17mmol)和N,N二甲基氨基丁酸盐酸盐(600mg，3.58mmol)获得呈无色油状物的(6Z,16Z)-4-(二甲基氨基)丁酸12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,16-二烯-11-基酯40(483mg，76％)。Rf 0.43(10％CH3OH-CH2Cl2)。
化合物42的合成方案
化合物41的合成
使用与描述用于合成10的工序类似的工序，从(6Z,14Z)-11-((Z)-壬-3-烯-1-基)二十-6,14-二烯-10-醇(500mg，1.19mmol)、EDC(686mg，3.58mmol)和5-溴戊酸(649mg，3.58mmol)获得呈无色油状物的(6Z,14Z)-5-溴戊酸11-((Z)-壬-3-烯-1-基)二十-6,14-二烯-10-基酯41(655mg，95％)。Rf 0.54(5％EtOAc-己烷)。
化合物42的合成
使用与描述用于合成11的工序类似的工序，从(6Z,14Z)-5-溴戊酸11-((Z)-壬-3-烯-1-基)二十-6,14-二烯-10-基酯(655mg，1.13mmol)和二甲胺(25mL，呈5.6M EtOH溶液)获得呈无色油状物的(6Z,14Z)-5-(二甲基氨基)戊酸11-((Z)-壬-3-烯-1-基)二十-6,14-二烯-10-基酯42(421mg，68％)。Rf 0.4(10％CH3OH-CH2Cl2)。
化合物50的合成方案
化合物44的合成
使用与描述用于合成4的工序类似的工序，从溴癸烷(9.4mL，45.2mmol)、镁屑(1.18g，48.4mmol)、甲酸乙酯(3.74mL，46.6mmol)和氢氧化钾(2.28g，40.7mmol)获得呈无色油状物的二十一-11-醇44(7.06g，99％)。Rf 0.36(10％EtOAc-己烷)，FW 312.57，C21H44O。
化合物45的合成
使用与描述用于合成5的工序类似的工序，从二十一-11-醇(7.06g，22.6mmol)，三乙胺(22mL)和甲磺酰氯(3.5mL，45mmol)获得呈无色油状物的甲磺酸二十一-11-基酯45(6.87g，78％)。Rf 0.86(CH2Cl2)。
化合物46的合成
使用与描述用于合成6的工序类似的工序，从甲磺酸二十一-11-基酯(6.87g，17.6mmol)和氰化钠(4.31g，87.9mmol)获得呈无色油状物的2-癸基十二腈46(2.25g，40％)。Rf 0.84(10％EtOAc-己烷)。
化合物47的合成
使用与描述用于合成7的工序类似的工序，从2-癸基十二腈(2.25g，7.0mmol)和DIBAL(14mL，呈1M己烷溶液，14mmol)获得呈无色油状物的2-癸基十二醛47(1.91g，84％)。Rf 0.51(5％EtOAc-己烷)。
化合物48的合成
使用与描述用于合成8的工序类似的工序，从2-癸基十二醛(1.91g，5.87mmol)、(Z)-癸-4-烯基溴化物(1.45g，7.05mmol)和镁屑(183mg，7.54mmol)获得呈无色油状物的(Z)-12-癸基二十二-6-烯-11-醇48(1.08g，40％)。Rf 0.26(10％EtOAc-己烷)。
化合物49的合成
使用与描述用于合成10的工序类似的工序，从(Z)-12-癸基二十二-6-烯-11-醇(1.08g，2.33mmol)、EDC(804mg，4.19mmol)和5-溴戊酸(1.27g，6.99mmol)获得呈无色油状物的(Z)-5-溴戊酸12-癸基二十二-6-烯-11-基酯49(916mg，63％)。Rf 0.29(5％EtOAc-己烷)。
化合物50的合成
使用与描述用于合成11的工序类似的工序，从(Z)-5-溴戊酸12-癸基二十二-6-烯-11-基酯(916mg，1.16mmol)和二甲胺(27mL，呈5.6M EtOH溶液)获得呈无色油状物的(Z)-5-(二甲基氨基)戊酸12-癸基二十二-6-烯-11-基酯50(662mg，80％)。Rf 0.51(10％CH3OH-CH2Cl2)。
化合物53的合成方案
化合物51的合成
使用与描述用于合成8的工序类似的工序，从(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯醛7(3.6g，11.2mmol)、1-溴癸烷(3.5mL，16.9mmol)和镁屑(438mg，18.0mmol)获得呈无色油状物的(Z)-12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-16-烯-11-醇51(3.37g，65％)。Rf 0.31(5％EtOAc-己烷)。
化合物52的合成
使用与描述用于合成10的工序类似的工序，从(Z)-12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-16-烯-11-醇(3.37g，7.29mmol)、EDC(2.51g，13.1mmol)和5-溴戊酸(3.96g，21.8mmol)获得呈无色油状物的(Z)-5-溴戊酸12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-16-烯-11-基酯52(4.69g，99％)。Rf0.56(5％EtOAc-己烷)。
化合物53的合成
使用与描述用于合成11的工序类似的工序，从(Z)-5-溴戊酸12-癸基二十二-6-烯-11-基酯(1.0g，1.6mmol)和二甲胺(30mL，呈5.6M EtOH溶液)获得呈无色油状物的(Z)-5-(二甲基氨基)戊酸12-癸基二十二-6-烯-11-基酯53(943mg，99％)。Rf 0.50(10％CH3OH-CH2Cl2)。
实施例2
本实施例比较了本发明的短链三烷基脂质和具有较长烷基链但其它结构与短链三烷基脂质相同的脂质在鼠ApoB siRNA活性模型中的有效性。
评估含有阳离子脂质的核酸-脂质颗粒制剂对敲除7至9周龄雌性BALB/c小鼠肝脏中的ApoB表达的能力。三只一组，以0.02mg/kg、0.03mg/kg或0.05mg/kg静脉内(尾静脉)向小鼠给药。相对于作为阴性对照的PBS，测量ApoB敲除(标准化为管家基因GAPDH)。在给药之后48小时终止每个实验。
为了与阳性对照相比，将本发明的短链三烷基脂质的性能与有效的阳离子脂质(称为C2K，已知其有利于体内传送核酸-脂质颗粒中的核酸(Nature Biotech.，第28卷(2),172(2010))比较。C2K具有以下结构：
如在表1中所示，在注射剂量为0.02mg/kg时，本发明11个阳离子脂质中的10个(化合物9、13、14、19、22、27、40、42、50和53)表现出比C2K更强的活性。
表1：本发明的各种三烷基阳离子脂质的ApoB沉默(0.02mg/kg siRNA)。
如在表2中所示，在独立的实验中，在注射剂量为0.03mg/kg时，本发明7个阳离子脂质中的5个(化合物11、13、19、23和25)表现出比C2K更强的活性。
表2：各种短链三烷基阳离子脂质的ApoB沉默(0.03mg/kg siRNA)
还将本发明的阳离子脂质的活性与相应的除了烷基链较长而结构上与本发明的脂质相同的三烷基阳离子脂质比较。这些较长链三烷基阳离子脂质(被鉴定为化合物54、55、56、57、58、59和60)的结构如在表3中所示。
表3：长链三烷基阳离子脂质的结构
根据2011年9月16日提交的美国专利申请号13/235,253中描述的工序制备化合物54、55、56、57、58、59和60，所述专利以引用的方式整体并入本文。
如在表4中所示，以0.05mg/kg的剂量(表1中所述剂量的2.5倍)给药较长链脂质54、55、56、57、58、59、60，并且与对于C2K的60％相比表现出ApoB敲除在+25％至-69％范围内(即一些化合物表现出比C2K有适度改进)。
表4：各种三亚油基阳离子脂质的ApoB沉默(0.05mg/kg siRNA)
a四次研究中ApoB沉默的平均值
一般来说，当与相应的较长链三亚油基(C18)对应部分的脂质相比时，本发明的较短链(C9至C10)三烷基阳离子脂质的活性基本上有所提高。例如，化合物13与其三亚油基变体54的直接比较显示出ApoB敲除从-6％(0.05mg/kg)提高至-80％(0.02mg/kg)，尽管事实上化合物13的剂量低2.5倍。当将化合物55与化合物11、化合物56与化合物24以及化合物57与化合物25比较时也观察到相同的趋势。
实施例3
鼠ApoB模型中的另外实验使用不同阳离子脂质作为阳性对照；DLin-MP-DMA.DLin-MP-DMA描述于专利申请WO 2011/141705中，并且具有以下结构：
如在表5中所示，在相同鼠ApoB模型中，在3个独立的实验中，DLin-MP-DMA显示比C2K更有效，并且因此为有效的阳性对照：
表5.C2K与作为阳性对照的Dlin-MP-DMA之间的比较
在另一个实验中，将本发明的另外两种脂质(化合物62和化合物71)配制成具有siRNA的脂质纳米颗粒以靶向ApoB。静脉内(尾静脉)向小鼠给药并且在给药之后48h处死小鼠。收获肝脏并且均质化，并且然后经由Quantigene测定测量ApoB沉默的水平(标准化为管家基因GAPDH)。结果在表6中示出，并且相对于经过PBS处理的阴性对照组以百分比形式表示。本实验中使用的siRNA序列为不同的，并且比实施例2中使用的siRNA序列效力低。因此实验之间的比较是不可能的：
表6：本发明的各种三烷基阳离子脂质的ApoB沉默。
化合物71具有与DLin-MP-DMA对照类似的活性。化合物62明显更有活性。实施例4中描述了这些和其它化合物的合成。
实施例4
本实施例描述了本发明的额外化合物的合成。
化合物62的合成方案
化合物61的合成
使用与描述用于合成5的工序类似的工序，从(6Z，16Z)-12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6，16-二烯-11-醇8(1.12g，2.43mmol)、三乙胺(8mL)和甲磺酰氯(0.38mL，4.9mmol)获得呈无色油状物的(6Z，16Z)-甲磺酸12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,16-二烯-11-基酯61(1.18g，90％)。Rf 0.91(CH2Cl2)。
化合物62的合成
依次用N,N-二甲基氨基丁醇(1.34mL，10.1mmol)和NaH(442mg，呈60％在油中的分散液，11.1mmol)处理甲磺酸酯61(1.09g，2.01mmol)在甲苯(30mL)中的溶液。一旦气体停止释放，将反应混合物回流(115℃浴温)并且搅拌(50h)。然后将反应混合物冷却(室温)，倒入冷水中，并且然后用EtOAc萃取。用水和盐水洗涤合并的有机物，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩并且经由色谱法(100％EtOAc)纯化，产生呈浅黄色油状物的4-(((6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,16-二烯-11-基)氧基)-N,N-二甲基丁-1-胺62(143mg，13％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.41-5.30(m,6H),3.46-3.35(m,2H),3.19-3.14(m,1H),2.34(t,2H),2.24(s,6H),2.10-1.93(m,12H),1.60-1.09(m,35H),0.90(t,9H)。Rf 0.54(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物71的合成方案
化合物63的合成
使用与描述用于合成5的工序类似的工序，从3,7-二甲基辛-1-醇(5.0g，31.6mmol)、三乙胺(8mL)和甲磺酰氯(4.89mL，63.2mmol)获得呈无色油状物的甲磺酸3,7-二甲基辛基酯63(7.47g，>99％)。Rf 0.69(CH2Cl2)。
化合物64的合成
使用与描述用于合成3的工序类似的工序，从甲磺酸3,7-二甲基辛基酯63(7.47g，31.6mmol)和四丁基溴化铵(13.2g，41.1mmol)获得呈无色油状物的1-溴-3,7-二甲基辛烷64(6.0g，86％)。Rf 0.92(己烷)。
化合物65的合成
使用与描述用于合成4的工序类似的工序，从1-溴-3,7-二甲基辛烷64(10g，45.2mmol)、镁屑(1.21g，49.8mmol)、甲酸乙酯(3.8mL，47.5mmol)和氢氧化钾(3.8g，67.8mmol)获得呈无色油状物的2,6,12,16-四甲基十七-9-醇65(7.0g，定量)。Rf 0.38(10％EtOAc-己烷)。
化合物66的合成
使用与描述用于合成5的工序类似的工序，从2,6,12,16-四甲基十七-9-醇65(1.39g，5.14mmol)、三乙胺(3mL)和甲磺酰氯(0.8mL，10.3mmol)获得呈无色油状物的甲磺酸2,6,12,16-四甲基十七-9-基酯66(1.56g，87％)。Rf 0.8(CH2Cl2)。
化合物67的合成
使用与描述用于合成6的工序类似的工序，从甲磺酸2,6,12,16-四甲基十七-9-基酯66(1.56g，4.48mmol)和氰化钠(0.55g，11.2mmol)获得呈无色油状物的2-(3,7-二甲基辛基)-5,9-二甲基癸腈67(0.8g，56％)。Rf 0.8(10％EtOAc-己烷)。
化合物68的合成
使用与描述用于合成7的工序类似的工序，从2-(3,7-二甲基辛基)-5,9-二甲基癸腈67(0.8g，2.49mmol)和DIBAL(5.74mL，呈1M己烷溶液，5.74mmol)获得呈无色油状物的2-(3,7-二甲基辛基)-5,9-二甲基癸醛68(0.63g，78％)。Rf 0.6(10％EtOAc-己烷)。
化合物69的合成
使用与描述用于合成8的工序类似的工序，从2-(3,7-二甲基辛基)-5,9-二甲基癸醛68(0.6g，1.85mmol)、1-溴-3,7-二甲基辛烷64(2.0g，9.0mmol)和镁屑(232mg，9.67mmol)获得呈无色油状物的10-(3,7-二甲基辛基)-2,6,13,17-四甲基十八-9-醇69(0.53g，62％)。Rf 0.37(10％EtOAc-己烷)。
化合物70的合成
使用与描述用于合成10的工序类似的工序，从10-(3，7-二甲基辛基)-2，6，13，17-四甲基十八-9-醇69(200mg，0.43mmol)、EDC(246mg，1.28mmol)和5-溴戊酸(246mg，1.28mmol)获得呈黄色油状物的5-溴戊酸10-(3，7-二甲基辛基)-2，6，13，17-四甲基十八-9-基酯68(450mg，粗品)。Rf 0.49(5％EtOAc-己烷)。
化合物71的合成
使用与描述用于合成11的工序类似的工序，从5-溴戊酸(10-(3,7-二甲基辛基)-2,6,13,17-四甲基十八-9-基酯68(450mg，粗品)和二甲胺(10mL，呈2.0M EtOH溶液)获得呈无色油状物的5-(二甲基氨基)戊酸10-(3,7-二甲基辛基)-2,6,13,17-四甲基十八-9-基酯71(184mg，2步72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.95-4.87(m,1H)，2.33(t，2H)，2.28(t，2H)，2.23(s，6H)，1.74-1.60(m，4H)，1.58-0.99(m,37H),0.93-0.79(m,27H)。Rf 0.43(10％CH3OH-CH2Cl2)。
化合物74的合成方案
化合物72的合成
使用与描述用于合成8的工序类似的工序，从(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯醛7(0.6g，1.87mmol)、1-溴-3,7-二甲基辛烷64(3.9g，17.5mmol)和镁屑(454mg，18.7mmol)获得呈无色油状物的(Z)-10-((Z)-癸-4-烯-1-基)-2,6-二甲基二十-14-烯-9-醇72(0.62g，72％)。Rf 0.61(10％EtOAc-己烷)。
化合物73的合成
使用与描述用于合成10的工序类似的工序，从(Z)-10-((Z)-癸-4-烯-1-基)-2,6-二甲基二十-14-烯-9-醇72(620mg，1.34mmol)、EDC(500mg，2.6mmol)和5-溴戊酸(500mg，2.56mmol)获得呈黄色油状物的(Z)-5-溴戊酸10-((Z)-癸-4-烯-1-基)-2,6-二甲基二十-14-烯-9-基酯73(900mg，粗品)。Rf 0.72(10％EtOAc-己烷)。
化合物74的合成
使用与描述用于合成11的工序类似的工序，从(Z)-5-溴戊酸10-((Z)-癸-4-烯-1-基)-2,6-二甲基二十-14-烯-9-基酯73(900mg，粗品)和二甲胺(15mL，呈2.0M EtOH溶液)获得呈无色油状物的(Z)-5-(二甲基氨基)戊酸10-((Z)-癸-4-烯-1-基)-2,6-二甲基二十-14-烯-9-基酯74(466mg，2步58％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43-5.29(m,4H),4.94-4.88(m,1H),2.32(t,2H),2.26(t,2H),2.15(s,6H),2.08-1.93(m,8H),1.70-1.00(m,43H),0.95-0.83(m,15H)。Rf 0.42(10％CH3OH-CH2Cl2)。
化合物76的合成方案
化合物75的合成
在密封容器中用二甲胺(10mL，呈2M EtOH溶液)制备5-溴戊-1-醇(1.0g，5.99mmol)并且加热(80℃)。在搅拌(16h)之后，在减压下除去二甲胺和EtOH，产生呈黄橙色固体的5-(二甲基氨基)戊-1-醇氢溴酸盐75(1.26g，定量)。Rf 0.25(10％CH3OH-CH2Cl2)。
化合物76的合成
使用与描述用于合成62的工序类似的工序，从(6Z,16Z)-甲磺酸12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,16-二烯-11-基酯61(1.86g，3.45mmol)、5-(二甲基氨基)戊-1-醇氢溴酸盐75(1.26g，5.99mmol)和NaH(288mg，呈油中的60％分散液，7.2mmol)获得呈浅黄色油状物的5-(((6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二-6,16-二烯-11-基)氧基)-N,N-二甲基戊-1-胺76(864mg，37％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43-5.32(m,6H),3.46-3.33(m,2H),3.18-3.12(m,1H),2.30-2.18(m,8H),2.07-1.93(m,12H),1.61-1.04(m,37H),0.89(t,9H)。Rf 0.47(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物79的合成方案
化合物77的合成
在氮气下，在20分钟内向(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-醇8(5g，10.9mmol)在无水二氯甲烷(125mL)中的冷却溶液(-15℃)中逐滴加入二乙基锌(1M己烷溶液，82mL，81.8mmol)。在0℃下，将溶液搅拌70分钟然后小心地加入二碘甲烷(6.6mL，81.8mmol)。将溶液搅拌过夜，允许其温热至室温。当完成时，将溶液倒入冰水(350mL)中并且用乙酸乙酯(450mL)稀释。然后加入5％HCl(350mL)以帮助减少形成的乳液。用NaHCO3(饱和水溶液500mL)、水(500mL)和盐水(500mL)洗涤有机层。用乙酸乙酯反萃取合并的水层。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥。通过在硅胶(2.5％乙酸乙酯的己烷溶液)上的柱色谱法纯化残余物，得到粉红色油状物。为了除去颜色(I2)，将纯化的产物溶解在二氯甲烷(150mL)中并且用Na2S2O3(饱和水溶液2x40mL)洗涤，得到呈浅黄色油状物的1,8-双(2-戊基环丙基)-5-(3-(2-戊基环丙基)丙基)辛-4-醇77(5.54g，96.5％)。
化合物78的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯10的工序类似的工序，从6-(二甲基氨基)己酸1,8-双(2-戊基环丙基)-5-(3-(2-戊基环丙基)丙基)辛-4-基酯(0.75g，1.5mmol)、无水二氯甲烷(5.2ml)、6-溴己酸(0.88g，4.5mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.87g，4.5mmol)和4-二甲基氨基吡啶(5mg)获得呈原油状的6-溴己酸1,8-双(2-戊基环丙基)-5-(3-(2-戊基环丙基)丙基)辛-4-基酯。产物不需要进一步纯化即可用于下一步中。
化合物79的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11的工序的类似的工序，从6-溴己酸1,8-双(2-戊基环丙基)-5-(3-(2-戊基环丙基)丙基)辛-4-基酯(1.0g，1.5mmol)和2.0M二甲胺的乙醇溶液(3.5ml)得到呈油状物的(0.56g,59％)。Rf 0.50(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物83的合成方案
化合物80的合成
向2-辛基十二-1-醇(20g，67.0mmol)在无水二氯甲烷(500mL)中的溶液中加入氯铬酸吡啶(43.2g，200mmol)。在室温下将溶液搅拌3小时然后通过二氧化硅垫过滤并且用二氯甲烷洗脱，得到呈无色油状物的2-辛基十二醛80(10.5g,50％)。
化合物81的合成
使用与描述用于合成(6Z,15Z)-二十一-6,15-二烯-11-醇4的工序类似的工序，从2-辛基十二醛80(0.5g，1.6mmol)、(Z)-1-溴癸-4-烯(0.7g，3.1mmol)、镁(80mg，3.4mmol)、无水四氢呋喃(0.5mL)、水(2mL)、EtOH(2mL)和KOH(0.2g，2.8mmol)获得呈无色油状物的(Z)-12-辛基二十二-6-烯-11-醇81(0.67g，92％)。
化合物82的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯10的工序类似的工序，从(Z)-12-辛基二十二-6-烯-11-醇81(0.67g，1.5mmol)、无水二氯甲烷(5mL)、6-溴己酸(0.80g，4.4mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.85g，4.4mmol)和4-二甲基氨基吡啶(5mg)获得呈无色油状物的(Z)-6-溴己酸12-辛基二十二-6-烯-11-基酯82(0.78g，85％)。产物不需要进一步纯化即可用于下一步中。
化合物83的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11的工序类似的工序，从(Z)-6-溴己酸12-辛基二十二-6-烯-11-基酯82(0.78g，1.3mmol)和2.0M二甲胺的乙醇溶液(3mL)获得呈油状物的(Z)-6-(二甲胺)己酸12-辛基二十二-6-烯-11-基酯83(103mg,14％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.43-5.26(m,2H),4.96-4.91(m,1H),2.33(t,4H),2.26(s,6H),2.08-1.93(m,4H),1.70-1.60(m,2H),1.57-1.43(m,4H),1.40-1.15(m,43H),0.94-0.85(m,9H)。
化合物89的合成方案
化合物84的合成
在氮气下，向(E)-癸-4-烯酸乙酯(20g，101mmol)在无水乙醚(350mL)中的冷却溶液(0℃)中加入氢化铝锂(8.9g，212mmol)。在室温下将溶液搅拌1小时然后冷却至0℃并且缓慢地用5M NaOH(30mL)淬灭并且用乙醚(100mL)稀释。将溶液搅拌30分钟并且用硫酸镁干燥，过滤并且在真空中浓缩至干燥，得到呈油状物的(E)-癸-4-烯-1-醇84(16.1g，定量)。
化合物85的合成
使用与描述用于合成(Z)-甲磺酸癸-4-烯基酯2的工序类似的工序，从(E)-癸-4-烯-1-醇(16.1g，94.7mmol)、三乙胺(15.5mL，111.7mmol)和甲磺酰氯(15.6mL，201.7mmol)获得呈橙色油状物的(E)-甲磺酸癸-4-烯基酯85(32.7g)。Rf 0.65(100％CH2Cl2)。
化合物86的合成
使用与描述用于合成(Z)-1-溴癸-4-烯3的工序类似的工序，从(E)-甲磺酸癸-4-烯基酯85(23.5g，94.7mmol)和四丁基溴化铵(40.0g，124.1mmol)获得呈油状物的(E)-1-溴癸-4-烯86(17.9g，81％)。Rf 0.85(10％EtOAc-己烷)。
化合物87的合成
使用与描述用于合成得到(6Z，15Z)-二十一-6，15-二烯-11-醇4的工序类似的工序，从(E)-1-溴癸-4-烯86(1.7g，7.8mmol)、镁屑(0.19g，7.8mmol)、(Z)-2-((Z)-癸-4-烯基)十二-6-烯醛7(1.25g，3.9mmol)和氢氧化钾(0.66g，11.7mmol)获得呈油状物的(6E,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11-醇87(1.28g，71％)。Rf 0.43(10％EtOAc-己烷)。
化合物88的合成
使用与描述用于合成(6Z，16Z)-6-溴己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11-基酯10的工序类似的工序，从(6E，16Z)-12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6，16-二烯-11-醇87(1.28g，2.8mmol)和5-溴-正戊酸(1.00g，5.6mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.06g，5.6mmol)、二异丙基乙胺(1.1g，83.0mmol)和二甲基氨基吡啶(10mg)获得呈油状物的(6E,16Z)-5-溴戊酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯88(1.36g，78％)。
化合物89的合成
使用与描述用于合成(6Z,16Z)-6-(二甲基氨基)己酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯11的工序类似的工序，从(6E,16Z)-5-溴戊酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯88(1.36g，2.2mmol)和2M二甲胺的乙醇溶液(5mL)获得呈油状物的(6E,16Z)-5-(二甲基氨基)戊酸12-((Z)-癸-4-烯基)二十二-6,16-二烯-11-基酯89(0.45g，35％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.45-5.28(m,6H),4.96-4.91(m,1H),2.34-2.25(m,2H),2.06-1.90(m,12H),1.68-1.61(m,2H),1.55-1.45(m,5H),1.45-1.16(m,28H),0.95-0.84(m,9H)。Rf 0.46(10％MeOH-CH2Cl2)。
化合物90的合成方案
化合物89的合成
使用与描述用于合成5的工序类似的工序，获得呈无色油状物的甲磺酸1,8-双(2-戊基环丙基)-5-(3-(2-戊基环丙基)丙基)辛-4-基酯89。
化合物90的合成
使用与描述用于合成62的工序类似的工序，获得呈浅黄色油状物的5-((1,8-双(2-戊基环丙基)-5-(3-(2-戊基环丙基)丙基)辛-4-基)氧基)-N,N-二甲基戊-1-胺90(580mg)。Rf 0.48(10％MeOH-CH2Cl2)。
应当理解，以上描述旨在是说明性的而非限制性的。通过阅读以上描述，许多实施方案对于本领域技术人员而言将为显而易见的。因此不应参照以上描述来确定本发明的范围，而应参照所附权利要求连同所述权利要求赋予的等效物的全部范围来确定。所有文章和参考文献的公开内容，包括其中描述的专利申请、专利、PCT出版物和Genbank登记号以及序列出于所有目的以引用的方式并入本文。

Claims (39)

1.一种具有结构式(I)的脂质：
X-A-Y-Z；
(I)
或其盐，其中：
X为烷基氨基；
A为C1至C6任选取代的烷基，其中所述C1至C6任选取代的烷基可为饱和或不饱和的，并且其中A可能存在或可能不存在；
Y选自由缩酮、酯、任选取代的氨基甲酸酯、醚和任选取代的酰胺组成的组；并且
Z为由三个烷基链组成的疏水部分，其中所述烷基链中的每一个的长度均为C8至C11，其中所述三个烷基链中的每一个均可独立地为饱和或不饱和的，并且其中所述三个烷基链中的每一个均为任选取代的。
2.如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的每一个的长度均为C9至C10。
3.如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的至少一个具有双键。
4.如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的至少一个具有顺式双键。
5.如权利要求1所述的脂质，其中所述烷基链中的至少一个包含环烷基部分。
6.如权利要求1所述的脂质，其中X选自由二甲基氨基、二乙基氨基和乙基甲基氨基组成的组。
7.如权利要求1所述的脂质，其中A为存在的。
8.如权利要求1所述的脂质，其中Y为酯或缩酮。
9.如权利要求1所述的脂质，其中Y为任选取代的氨基甲酸酯。
10.如权利要求1所述的脂质，其中Y为醚。
11.如权利要求1所述的脂质，其中Y为任选取代的酰胺。
12.如权利要求1所述的脂质，其中Z具有下式：
其中，R1、R2和R3各自独立地选自由C8至C11烷基组成的组，其中R1、R2和R3中的每一个均可独立地为饱和或不饱和的，并且其中R1、R2和R3中的每一个均为任选取代的。
13.如权利要求1所述的脂质，其中所述脂质选自由以下组成的组：
14.一种包含如前述权利要求中任一项所述的脂质的脂质颗粒。
15.如权利要求14所述的脂质颗粒，其中所述颗粒进一步包含非阳离子脂质。
16.如权利要求15所述的脂质颗粒，其中所述非阳离子脂质选自由磷脂、胆固醇或磷脂和胆固醇的混合物组成的组。
17.如权利要求16所述的脂质颗粒，其中所述磷脂包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其混合物。
18.如权利要求16所述的脂质颗粒，其中所述胆固醇为胆固醇衍生物。
19.如权利要求14至18中任一项所述的脂质颗粒，其中所述颗粒进一步包含抑制颗粒聚集的缀合的脂质。
20.如权利要求19所述的脂质颗粒，其中所述抑制颗粒聚集的缀合的脂质包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
21.如权利要求20所述的脂质颗粒，其中所述PEG-脂质缀合物包含PEG-二酰基甘油(PEG-DAG)缀合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物或其混合物。
22.如权利要求14至21中任一项所述的脂质颗粒，其中所述颗粒进一步包含治疗剂。
23.如权利要求22所述的脂质颗粒，其中所述治疗剂为核酸。
24.如权利要求23所述的脂质颗粒，其中所述核酸为干扰RNA。
25.如权利要求24所述的脂质颗粒，其中所述干扰RNA选自由以下组成的组：小的干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、切酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)及其混合物。
26.如权利要求25所述的脂质颗粒，其中所述干扰RNA为siRNA。
27.如权利要求22所述的脂质颗粒，其中在37℃下于血清中孵育所述颗粒30分钟之后，所述治疗剂基本上没有降解。
28.如权利要求22所述的脂质颗粒，其中所述治疗剂被完全包囊在所述颗粒中。
29.如权利要求22所述的脂质颗粒，其中所述颗粒的脂质:治疗剂质量比为约5:1至约15:1。
30.如权利要求14至29中任一项所述的脂质颗粒，其中所述颗粒的中值直径为约30nm至约150nm。
31.一种包含如权利要求14至30中任一项所述的脂质颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。
32.一种用于将治疗剂引入到细胞中的方法，所述方法包括：使所述细胞与如权利要求14所述的脂质颗粒接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞在哺乳动物体内。
34.一种用于体内递送治疗剂的方法，所述方法包括：向哺乳动物施用如权利要求14所述的脂质颗粒。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述施用选自由口服、鼻内、静脉内、腹膜内、肌肉内、关节内、病灶内、气管内、皮下和皮内组成的组。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
37.一种用于治疗有需求的哺乳动物体内的疾病或病症的方法，所述方法包括：
向所述哺乳动物施用治疗有效量的如权利要求14所述的脂质颗粒。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述疾病或病症选自由病毒感染、肝脏疾病或病症以及癌症组成的组。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述哺乳动物为人。
CN201910048388.5A 2012-02-24 2013-02-22 三烷基阳离子脂质及其使用方法 Pending CN110003030A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261602990P 2012-02-24 2012-02-24
US61/602,990 2012-02-24
CN201380020104.2A CN104321304A (zh) 2012-02-24 2013-02-22 三烷基阳离子脂质及其使用方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380020104.2A Division CN104321304A (zh) 2012-02-24 2013-02-22 三烷基阳离子脂质及其使用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110003030A true CN110003030A (zh) 2019-07-12

Family

ID=47884528

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380020104.2A Pending CN104321304A (zh) 2012-02-24 2013-02-22 三烷基阳离子脂质及其使用方法
CN201910048388.5A Pending CN110003030A (zh) 2012-02-24 2013-02-22 三烷基阳离子脂质及其使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380020104.2A Pending CN104321304A (zh) 2012-02-24 2013-02-22 三烷基阳离子脂质及其使用方法

Country Status (28)

Country Link
US (4) US9352042B2 (zh)
EP (3) EP3473611B1 (zh)
JP (4) JP6275655B2 (zh)
KR (4) KR102384791B1 (zh)
CN (2) CN104321304A (zh)
AU (1) AU2013222179B2 (zh)
BR (1) BR112014020824B1 (zh)
CA (1) CA2865412C (zh)
CY (1) CY1121232T1 (zh)
DK (1) DK2817287T3 (zh)
ES (2) ES2702874T3 (zh)
HK (1) HK1202855A1 (zh)
HR (1) HRP20182156T1 (zh)
HU (1) HUE041494T2 (zh)
IL (3) IL234266B (zh)
LT (1) LT2817287T (zh)
MX (2) MX356904B (zh)
NZ (1) NZ700075A (zh)
PH (1) PH12014501901B1 (zh)
PL (1) PL2817287T3 (zh)
PT (1) PT2817287T (zh)
RS (1) RS58077B1 (zh)
RU (2) RU2718053C2 (zh)
SG (1) SG11201405157PA (zh)
SI (1) SI2817287T1 (zh)
UA (1) UA120026C2 (zh)
WO (1) WO2013126803A1 (zh)
ZA (1) ZA201406896B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113402405A (zh) * 2021-04-08 2021-09-17 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种阳离子脂质、含该阳离子脂质的脂质体、含该脂质体的核酸药物组合物及其制剂和应用

Families Citing this family (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS58405B1 (sr) 2009-12-01 2019-04-30 Translate Bio Inc Stereoidni derivati za isporuku irnk u humanim genetskim oboljenjima
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
RS59037B1 (sr) 2011-06-08 2019-08-30 Translate Bio Inc Kompozicije lipidnih nanočestica i postupci za isporuku irnk
CN103748078B (zh) 2011-06-08 2016-11-09 夏尔人类遗传性治疗公司 可裂解脂质
WO2013126803A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
AU2013237874B2 (en) 2012-03-29 2018-01-18 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
JP6283655B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-21 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド イオン化可能なカチオン性脂質
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
EA201492055A1 (ru) 2012-06-08 2015-11-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ИНГАЛЯЦИОННАЯ ДОСТАВКА мРНК В НЕЛЕГОЧНЫЕ КЛЕТКИ-МИШЕНИ
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP3446712A1 (en) 2013-03-14 2019-02-27 Translate Bio Ma, Inc. Cftr mrna compositions and related methods and uses
AU2014236396A1 (en) 2013-03-14 2015-08-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger RNA
CA2903880A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
ES2967701T3 (es) 2013-03-15 2024-05-03 Translate Bio Inc Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas
WO2015011633A1 (en) * 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
US11224642B2 (en) 2013-10-22 2022-01-18 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
WO2015061461A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
EA034103B1 (ru) 2013-10-22 2019-12-27 Транслейт Био, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
MX2016005238A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Formulaciones de lipidos para la administracion de acido ribonucleico mensajero.
BR112016024632A2 (pt) 2014-04-25 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies métodos de purificação de rna mensageiro
EP3148552B1 (en) 2014-05-30 2019-07-31 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
AU2015279968B2 (en) 2014-06-24 2019-11-14 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
CN106795096B (zh) 2014-06-25 2020-05-29 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
CN114344275A (zh) 2014-07-02 2022-04-15 川斯勒佰尔公司 信使rna的包封
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2016014846A1 (en) 2014-07-23 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
AU2015300046B2 (en) * 2014-08-07 2019-05-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cationic lipid
WO2016036966A1 (en) 2014-09-04 2016-03-10 Preceres Inc. Hydrazinyl lipidoids and uses thereof
EP3226912B1 (en) 2014-12-05 2021-01-20 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for treatment of articular disease
EP3268473B1 (en) * 2015-03-11 2020-05-13 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of filovirus infections
US10172924B2 (en) 2015-03-19 2019-01-08 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for pompe disease
DK3313829T3 (da) 2015-06-29 2024-06-17 Acuitas Therapeutics Inc Lipider og lipide nanopartikelformuleringer til levering af nukleinsyrer
CA3001852A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Translate Bio, Inc. Modification of rna-related enzymes for enhanced production
WO2017070613A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
CA3201644A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
ES2919552T3 (es) 2015-12-23 2022-07-27 Modernatx Inc Procedimientos de utilización de polinucleotidos codificadores de ligando ox40
US20190241658A1 (en) 2016-01-10 2019-08-08 Modernatx, Inc. Therapeutic mRNAs encoding anti CTLA-4 antibodies
KR102369898B1 (ko) 2016-04-08 2022-03-03 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 다량체 코딩 핵산 및 그 용도
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
EP3469074B1 (en) 2016-06-13 2020-12-09 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP3478838A1 (en) 2016-06-30 2019-05-08 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for delivering messenger rna
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP3601576A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 CureVac AG Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
WO2018191657A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
MA49138A (fr) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio Inc Traitement de la fibrose kystique par administration d'arnm à codons optimisés codant pour la cftr
EP3625246A1 (en) 2017-05-18 2020-03-25 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
WO2018232006A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
US11786607B2 (en) 2017-06-15 2023-10-17 Modernatx, Inc. RNA formulations
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US11524932B2 (en) 2017-08-17 2022-12-13 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US11866696B2 (en) 2017-08-18 2024-01-09 Modernatx, Inc. Analytical HPLC methods
AU2018326799A1 (en) 2017-08-31 2020-02-27 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
AU2018392716A1 (en) 2017-12-20 2020-06-18 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
SG11202006033YA (en) * 2017-12-27 2020-07-29 Takeda Pharmaceuticals Co Nucleic acid-containing lipid nano-particle and use thereof
AU2019325702A1 (en) 2018-08-24 2021-02-25 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
EP3852732A1 (en) 2018-09-19 2021-07-28 ModernaTX, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
RS65449B1 (sr) 2018-10-09 2024-05-31 The Univ Of British Columbia Supstance i sistemi koji obuhvataju vezikule kompetentne za transfekciju bez organskih rastvarača i deterdženata i metode za to
WO2020080475A1 (ja) 2018-10-18 2020-04-23 武田薬品工業株式会社 Ｔ細胞の活性化／増殖方法
AU2019377131A1 (en) * 2018-11-09 2021-06-03 Arbutus Biopharma Corporation Lipid nanoparticle formulations
JP2022506956A (ja) * 2018-11-09 2022-01-17 アルブータス・バイオファーマー・コーポレイション 脂質ナノ粒子製剤
JP2022536945A (ja) 2019-06-18 2022-08-22 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ワクチンおよびＨＢＶを標的化するＲＮＡｉの組合せ
WO2020255010A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
MA56533A (fr) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Combinaison de vaccins contre le virus de l'hépatite b (vhb) et d'anticorps anti-pd-1
MA56520A (fr) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Construction de l'interleukine 12 recombinante et ses utilisations
EP3986454A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
EP3986563A1 (en) 2019-06-20 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
CA3143578A1 (en) * 2019-06-29 2021-01-07 Precision Nanosystems Inc. Ionizable lipids for nucleic acid delivery
JP2022542839A (ja) 2019-07-19 2022-10-07 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
BR112022004771A2 (pt) * 2019-09-19 2022-06-21 Modernatx Inc Compostos e composições de lipídio de grupo de cabeça para entrega intracelular de agentes terapêuticos
WO2021061707A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
AU2020352552A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating hepatocyte nuclear factor 4-alpha (HNF4α) gene expression
EP4118207A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
WO2021195214A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
CA3172591A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Douglas Anthony KERR Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing gaucher therapeutics
TW202208629A (zh) 2020-05-20 2022-03-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 免疫原性組成物及其用途
EP4153224A1 (en) 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Coronavirus antigen compositions and their uses
CA3180101A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
EP4158032A2 (en) 2020-05-29 2023-04-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and methods relating thereto
CN116367854A (zh) 2020-07-08 2023-06-30 杨森科学爱尔兰无限公司 针对hbv的rna复制子疫苗
EP4182297A1 (en) 2020-07-16 2023-05-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022023284A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules, methods of making therefor, and methods of use thereof
CA3189854A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
MX2023002439A (es) 2020-09-03 2023-05-09 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones immunogénicas y usos de las mismas.
WO2022081589A1 (en) * 2020-10-12 2022-04-21 The Regents Of The University Of California Endosomal escape domains for delivery of macromolecules into cells
WO2022133230A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
EP4267732A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions of modified trems and uses thereof
JP2024501022A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 アークトゥルス セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｈｂｖを標的とする転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔａｌｅｎ）
AU2022226409A1 (en) 2021-02-26 2023-08-10 Ethris Gmbh Formulations for aerosol formation and aerosols for the delivery of nucleic acid
US11952461B2 (en) 2021-03-22 2024-04-09 Sunbio, Inc. Siloxy polyethylene glycol and derivatives thereof
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
KR20240012370A (ko) 2021-04-20 2024-01-29 안자리움 바이오사이언시스 아게 아밀로-알파-1, 6-글루코시다제, 4-알파-글루카노트랜스퍼라제를 인코딩하는 dna 분자의 조성물, 이를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법
WO2022232289A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
WO2022232286A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
EP4330404A1 (en) 2021-04-28 2024-03-06 Genevant Sciences Gmbh Mrna delivery constructs and methods of using the same
CN112979483B (zh) * 2021-05-14 2021-08-06 苏州艾博生物科技有限公司 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及应用
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
CA3226019A1 (en) 2021-07-20 2023-01-26 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their preparation, and uses
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
AR127073A1 (es) 2021-09-17 2023-12-13 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones y métodos para producir polirribonucleótidos circulares
TW202322826A (zh) 2021-10-18 2023-06-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物及方法
CA3236235A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Orna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions for delivering circular polynucleotides
WO2023086465A1 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Modernatx, Inc. Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
CA3238735A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Jennifer A. Nelson Immunogenic compositions and their uses
AU2022398478A1 (en) 2021-11-24 2024-06-13 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
AU2022397292A1 (en) 2021-11-24 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
TW202340460A (zh) 2021-12-17 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於在變性條件下富集環狀ｒｎａ之方法
TW202340461A (zh) 2021-12-22 2023-10-16 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法
TW202342064A (zh) 2021-12-23 2023-11-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
CN114044741B (zh) * 2022-01-13 2022-04-15 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023144127A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon administration, and uses
WO2023154818A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Modernatx, Inc. Mucosal administration methods and formulations
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023160702A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 深圳深信生物科技有限公司 氨基脂质化合物、其制备方法、组合物和应用
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
CN114380724B (zh) * 2022-03-23 2022-05-24 深圳市瑞吉生物科技有限公司 用于递送核酸的阳离子脂质化合物和组合物及用途
WO2023183616A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
CN114685784B (zh) * 2022-04-26 2023-09-15 北京清科胜因生物科技有限公司 一种用于核酸递送的聚(2-噁唑啉)脂质与脂质纳米颗粒及应用
CN115626983A (zh) * 2022-04-27 2023-01-20 北京清科胜因生物科技有限公司 一种聚(2-噁唑啉)脂质及脂质纳米颗粒
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023233290A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rnai agents targeting pd-l1
CN114940756B (zh) * 2022-06-02 2023-11-07 北京清科胜因生物科技有限公司 一种聚（2-噁唑啉）脂质与脂质纳米颗粒及应用
WO2023232976A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
CN117263818A (zh) * 2022-06-14 2023-12-22 杭州高田生物医药有限公司 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
US20240042021A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
EP4327829A1 (en) 2022-08-26 2024-02-28 Ethris GmbH Stabilization of lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024042236A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Ethris Gmbh Stable lipid or lipidoid nanoparticle suspensions
WO2024049979A2 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024088808A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from microalgae, their biodistribution upon intranasal administration, and uses thereof
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024119051A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024119039A2 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticles and uses thereof
WO2024121814A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Modified immunomodulators

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1882693A (zh) * 2003-09-15 2006-12-20 普洛体维生物治疗公司 聚乙二醇修饰的脂质化合物及其应用
US20110097720A1 (en) * 2008-01-02 2011-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
CN102119217A (zh) * 2008-04-15 2011-07-06 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
WO2011141704A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
WO2011143230A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Alnylam Pharmaceuticals Methods and compositions for delivery of active agents

Family Cites Families (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3817827A (en) 1972-03-30 1974-06-18 Scott Paper Co Soft absorbent fibrous webs containing elastomeric bonding material and formed by creping and embossing
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3993754A (en) 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4086257A (en) 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
CH624011A5 (zh) 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4452901A (en) 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US5725871A (en) 1989-08-18 1998-03-10 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions comprising lysophosphoglycerolipid
WO1991003162A1 (en) 1989-08-31 1991-03-21 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5707644A (en) 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6365730B1 (en) 1990-06-19 2002-04-02 Gene Shears Pty. Limited DNA-Armed ribozymes and minizymes
US5068120A (en) * 1990-08-01 1991-11-26 Nabisco Brands, Inc. Amine ester derivatives as low calorie fat mimetics
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
ES2061416T3 (es) 1990-10-12 1997-03-01 Max Planck Gesellschaft Ribozimas modificadas.
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US6831166B2 (en) 1992-10-23 2004-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5756353A (en) 1991-12-17 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol-and liposome-based delivery
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
JPH08500481A (ja) 1992-05-11 1996-01-23 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ウイルスの複製を阻害するための方法および薬剤
DK0641192T3 (da) 1992-05-18 1998-03-02 Minnesota Mining & Mfg Anordning til transmucosal lægemiddelafgivelse
US5792451A (en) 1994-03-02 1998-08-11 Emisphere Technologies, Inc. Oral drug delivery compositions and methods
CA2140343A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Sean M. Sullivan Method and reagent for treatment of animal diseases
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5591317A (en) 1994-02-16 1997-01-07 Pitts, Jr.; M. Michael Electrostatic device for water treatment
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5753613A (en) 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
EP1179340A3 (en) 1994-09-30 2003-05-07 INEX Pharmaceutical Corp. Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
AU3889595A (en) 1994-10-05 1996-05-02 Amgen, Inc. Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein
US5783683A (en) 1995-01-10 1998-07-21 Genta Inc. Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene
US5580579A (en) 1995-02-15 1996-12-03 Nano Systems L.L.C. Site-specific adhesion within the GI tract using nanoparticles stabilized by high molecular weight, linear poly (ethylene oxide) polymers
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
US5646241A (en) * 1995-05-12 1997-07-08 Quantum Materials, Inc. Bleed resistant cyanate ester-containing compositions
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
ES2231819T3 (es) 1995-06-07 2005-05-16 Inex Pharmaceuticals Corp Particulas de lipido-acido nucleico preparadas a traves de un intermedio complejo de lipido-acido nucleico hidrofobo y uso para transferir genes.
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5747470A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US20040142895A1 (en) 1995-10-26 2004-07-22 Sirna Therapeutics, Inc. Nucleic acid-based modulation of gene expression in the vascular endothelial growth factor pathway
US20030216335A1 (en) 2001-11-30 2003-11-20 Jennifer Lockridge Method and reagent for the modulation of female reproductive diseases and conditions
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US6713069B1 (en) 1996-04-16 2004-03-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and methods for detecting, preventing, and treating African Hemorrhagic Fever
US20050119470A1 (en) 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
AU8428998A (en) 1997-07-24 1999-02-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
DE69906977T2 (de) 1998-07-20 2004-05-19 Protiva Biotherapeutics Inc., Burnaby In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
US6852334B1 (en) 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
CA2370690A1 (en) 1999-04-20 2000-10-26 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
HUP0202327A3 (en) 1999-08-27 2004-07-28 Inex Pharmaceuticals Corp Burn Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
EP1350262B8 (en) 2000-12-08 2008-08-13 Coley Pharmaceuticals GmbH Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US20050282188A1 (en) 2001-05-18 2005-12-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030130186A1 (en) 2001-07-20 2003-07-10 Chandra Vargeese Conjugates and compositions for cellular delivery
GB0118517D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Mitsubishi Tokyo Pharm Inc Compound
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US20050107316A1 (en) 2002-02-22 2005-05-19 Klaus Strebhardt Agent for inhibiting development or progress of proliferative diseases and especially cancer diseases and pharmaceutical composition containing said agent
DK1519714T3 (da) 2002-06-28 2011-01-31 Protiva Biotherapeutics Inc Fremgangsmåde og apparat til fremstilling af liposomer
JP4709545B2 (ja) 2002-07-26 2011-06-22 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 修飾された低分子干渉ｒｎａ分子および使用方法
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US20040167090A1 (en) 2003-02-21 2004-08-26 Monahan Sean D. Covalent modification of RNA for in vitro and in vivo delivery
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
CA2488224A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
CA2521464C (en) 2003-04-09 2013-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna conjugates
EP1620544B1 (en) 2003-04-17 2018-09-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
NZ544637A (en) 2003-07-16 2010-04-30 Protiva Biotherapeutics Inc Lipid encapsulated interfering RNA
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
US20070265220A1 (en) 2004-03-15 2007-11-15 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
US8084599B2 (en) 2004-03-15 2011-12-27 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
US20090170794A1 (en) 2004-09-10 2009-07-02 Somagenics Inc. Small interfering rnas that efficiently inhibit viral expression and methods of use thereof
WO2006036916A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of apob and uses thereof
WO2006053430A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of apolipoprotein b
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2007086883A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
US9005654B2 (en) 2005-07-27 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
US7838658B2 (en) 2005-10-20 2010-11-23 Ian Maclachlan siRNA silencing of filovirus gene expression
CA2628300C (en) 2005-11-02 2018-04-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified sirna molecules and uses thereof
US20070218122A1 (en) 2005-11-18 2007-09-20 Protiva Biotherapeutics, Inc. siRNA silencing of influenza virus gene expression
GB0605900D0 (en) * 2006-03-23 2006-05-03 Lipigen As Modulators of nuclear receptors
CN101484588B (zh) 2006-05-11 2013-11-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
KR100996975B1 (ko) * 2007-08-24 2010-11-29 한국화학연구원 혈류 내 순환시간 증가를 위한 단백질로 수식된 리포솜 및이의 제조방법
WO2009082817A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
EP2281041B1 (en) 2008-04-15 2014-07-02 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of csn5 gene expression using interfering rna
KR101647334B1 (ko) 2008-07-10 2016-08-10 세리나 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 불활성 말단기를 가진 폴리옥사졸린, 보호된 개시기로부터 제조된 폴리옥사졸린 및 그와 관련된 화합물
KR100996976B1 (ko) 2008-08-27 2010-11-29 현대엔지니어링 주식회사 장수명 ｍｔｏ 반응용 촉매 및 이의 제조방법
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
KR102264822B1 (ko) * 2008-11-10 2021-06-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
EA028860B1 (ru) * 2009-06-10 2018-01-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
WO2011000106A1 (en) * 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
JP5766188B2 (ja) * 2009-07-01 2015-08-19 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 固形腫瘍に治療剤を送達するための脂質製剤
AU2010330814B2 (en) * 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011141703A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
EP2575767B1 (en) * 2010-06-04 2017-01-04 Sirna Therapeutics, Inc. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
CN103153347A (zh) * 2010-10-21 2013-06-12 默沙东公司 用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质
WO2013126803A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US9744103B1 (en) 2013-03-08 2017-08-29 Chad Ricker Infant teething apparatus
WO2015011633A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
US10561723B2 (en) 2015-07-21 2020-02-18 Theodore C. Marbley Treatment and prevention of anal conditions

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1882693A (zh) * 2003-09-15 2006-12-20 普洛体维生物治疗公司 聚乙二醇修饰的脂质化合物及其应用
US20110097720A1 (en) * 2008-01-02 2011-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
CN102119217A (zh) * 2008-04-15 2011-07-06 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
WO2011143230A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Alnylam Pharmaceuticals Methods and compositions for delivery of active agents
WO2011141704A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113402405A (zh) * 2021-04-08 2021-09-17 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种阳离子脂质、含该阳离子脂质的脂质体、含该脂质体的核酸药物组合物及其制剂和应用

Also Published As

Publication number Publication date
BR112014020824B1 (pt) 2022-10-04
KR20140129263A (ko) 2014-11-06
KR20220045089A (ko) 2022-04-12
UA120026C2 (uk) 2019-09-25
PH12014501901A1 (en) 2014-11-24
HRP20182156T1 (hr) 2019-02-22
MX2014010211A (es) 2015-08-10
KR20200016396A (ko) 2020-02-14
LT2817287T (lt) 2018-12-27
ES2898912T3 (es) 2022-03-09
EP2817287A1 (en) 2014-12-31
ZA201406896B (en) 2016-05-25
EP2817287B1 (en) 2018-10-03
IL234266B (en) 2020-09-30
PT2817287T (pt) 2018-12-28
JP2018039844A (ja) 2018-03-15
KR102239887B1 (ko) 2021-04-13
JP2015509505A (ja) 2015-03-30
US11395854B2 (en) 2022-07-26
CY1121232T1 (el) 2020-05-29
IL234266A0 (en) 2014-11-02
PL2817287T3 (pl) 2019-10-31
US20200306378A1 (en) 2020-10-01
EP3988104A1 (en) 2022-04-27
KR20210041135A (ko) 2021-04-14
US20230109183A1 (en) 2023-04-06
US20150064242A1 (en) 2015-03-05
US20170007702A1 (en) 2017-01-12
CA2865412A1 (en) 2013-08-29
US9352042B2 (en) 2016-05-31
ES2702874T3 (es) 2019-03-06
HUE041494T2 (hu) 2019-05-28
EP3473611A1 (en) 2019-04-24
CA2865412C (en) 2022-07-19
US10561732B2 (en) 2020-02-18
NZ700075A (en) 2016-05-27
IL276924A (en) 2020-10-29
EP3473611B1 (en) 2021-10-20
DK2817287T3 (da) 2019-01-02
SI2817287T1 (sl) 2019-02-28
RU2014138476A (ru) 2016-04-10
JP2022140533A (ja) 2022-09-26
IL290931A (en) 2022-04-01
RU2718053C2 (ru) 2020-03-30
PH12014501901B1 (en) 2014-11-24
MX356904B (es) 2018-06-07
BR112014020824A2 (zh) 2017-06-20
RU2020111326A (ru) 2020-04-29
KR102075810B1 (ko) 2020-02-10
JP7110297B2 (ja) 2022-08-01
CN104321304A (zh) 2015-01-28
RS58077B1 (sr) 2019-02-28
JP2021014462A (ja) 2021-02-12
JP6789918B2 (ja) 2020-11-25
SG11201405157PA (en) 2014-10-30
AU2013222179B2 (en) 2017-08-24
MX2022006512A (es) 2022-07-11
AU2013222179A1 (en) 2014-10-09
WO2013126803A1 (en) 2013-08-29
KR102384791B1 (ko) 2022-04-08
HK1202855A1 (zh) 2015-10-09
JP6275655B2 (ja) 2018-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11718852B2 (en) Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US11395854B2 (en) Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US8466122B2 (en) Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US9126966B2 (en) Cationic lipids and methods of use thereof
US20110313017A1 (en) Snalp formulations containing polyoxazoline-dialkyloxypropyl conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination