CN102321584B

CN102321584B - 预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法

Info

Publication number: CN102321584B
Application number: CN201110195193.7A
Authority: CN
Inventors: 萨默.阿尔-穆拉尼
Original assignee: Penn State Research Foundation
Current assignee: Penn State Research Foundation
Priority date: 2003-12-31
Filing date: 2004-12-30
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2024-12-30
Also published as: EP2395112B1; CN102321584A; US20100221729A1; JP2007517058A; US7700280B2; US20050176669A1; JP2013079261A; US8192935B2; CN102989009A; US20100221731A1; CN1922332A; CN102989009B; WO2005066371A2; TW200531682A; EP1704250B1; JP5789591B2; CN1922332B; US20100221730A1; TWI301066B; US20160348180A1

Abstract

本申请涉及预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法。本发明提供了预测卵巢癌患者的肿瘤是否对化疗有抗性的方法。本发明也提供了检测治疗、具体为化疗在治疗卵巢癌的患者中的有效性的方法。本发明还提供了通过降低所述细胞中化疗药物抗性来治疗卵巢癌的方法。另外，本发明提供了筛选化合物的方法来鉴定对传统化疗方案有抗性的肿瘤细胞的肿瘤细胞生长抑制剂。

Description

预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法

本申请是申请日为2004年12月30日、中国申请号为200480042148.6、发明名称为“预测并克服对卵巢癌化疗的抗性的方法及预测结肠癌发生的方法”的发明申请的分案申请。本申请涉及并权利要求2003年12月31日提交的系列号为60/533,505的美国临时申请的优先权，其公开在此全文引入作为参考。

发明背景

本发明涉及预测卵巢癌患者是否会对化疗有抗性的方法及确定是否个体患者患结肠癌的方法。本发明也涉及监测在接受卵巢癌治疗的患者中的治疗有效性的方法。本发明还涉及治疗卵巢癌及结肠癌的方法。另外，本发明涉及筛选能抑制肿瘤细胞，具体是卵巢癌细胞或结肠癌细胞的生长的化合物的方法。本发明也涉及具体在对常用化疗方案有抗性的卵巢癌细胞中，降低或抑制对化疗药物治疗或疗法的抗性的方法。

背景技术

卵巢癌是死亡率达60％的致死性最强的妇科恶性肿瘤。对于此疾病的多个临床阶段的五年存活率如下：阶段I＞90％，阶段II＝80％，阶段III＝20％和阶段IV＝10％；在此疾病的较晚阶段存活率有显著的降低。对于此疾病的晚期(advanced)阶段的标准(Standard-of-care)治疗包括减少细胞数的手术后化疗。

大多数患者存活的可能性低，因为所有患者中的大约75％是在疾病的阶段III和IV诊断的，且预后差与疾病在晚期阶段的晚诊断相关。对于现存的化疗剂的抗性是另一个主要问题。尽管在最初的治疗后75％的患者出现了完全临床反应(complete clinical response)，大多数会疾病复发并需要再治疗。不幸的是，绝大多数会最终患化学抗性并死于此疾病。

化学抗性是一种复杂的现象，它涉及多种基因和基因产物的表达和生物活性的改变。所述在反应性和非反应性个体差异表达的基因或基因家族可被用作分子标记物，来预测哪位患者可能会对在临床中通常所用的具体化疗剂或其组合有抗性。另外，在化学抗性个体过表达的基因可以是抑制作用的靶标，它可能降低癌细胞对化疗剂或药剂(agents)的抗性。

与卵巢癌一样，当疾病诊断得早时，患结肠直肠癌的患者的存活最好。如果癌症检出早，结肠癌患者的5年存活率大约为90％；不幸的是，尽管监测和预防手段增多，只有37％的癌症发现于早期阶段。当癌症在区域(regionally)扩散涉及到其他器官时，存活率降到大约64％，并且在癌症转移后存活率急剧降低(8％)(Cancer Facts and Figures 2002；American CancerSociety publication)。

因此，在疾病进行的过程中需要及早鉴定出结肠癌和卵巢癌，并具体需要鉴定出化学抗性的癌症。更具体地，因为癌细胞的表现在本领域公知，考虑到它们的致瘤性(tumorigenicity)及它们对化疗药物的抗性是由具体基因的不完全确定的组和(defined set)的表达所介导的，所以本领域需要鉴定可作为卵巢癌中化学抗性的有效分子标记物的基因及基因的集合(collection)或组，以及为卵巢癌和结肠癌提供临床有效的治疗靶标的基因或基因组。

发明概述

本发明提供了鉴定这样的基因的方法和试剂，所述基因涉及对化疗药物治疗的抗性、或其表达受对化疗药物治疗的抗性的调控、或其中所述受调控的表达与对化疗药物治疗的抗性有关或导致该抗性。具体地，本发明提供了这样的基因，所述基因涉及对化疗药物治疗的抗性、或其表达受对化疗药物治疗的抗性调控，或其中所述受调控的表达与对化疗药物治疗的抗性有关或导致该抗性，以及多种基因的受调控基因表达的模式，其中所述模式是化疗药物抗性细胞，具体为药物抗性卵巢癌细胞的特征。本发明还提供了鉴定与一或多种所述基因的表达或活性相互作用或对其有影响的化合物的方法。本发明还提供了用作化疗剂的替代或与其联用的所述化合物，所述化疗剂治疗卵巢癌，具体治疗对通常的化疗有抗性或发展出抗性的癌症。本发明还提供了监测化疗的方法和试剂来鉴别其肿瘤对化疗剂是有抗性的或已变为有抗性的患者。

本发明提供了鉴定化合物的方法，所述化合物降低化疗药物抗性并抑制、推迟或预防有化疗剂抗性的肿瘤细胞、最优选卵巢癌细胞的生长，所述方法包含如下步骤：(a)使化疗药物抗性细胞接触被试化合物，所述细胞在化疗药物存在的条件下生长了一段时间或在使得所述细胞对所述药物有抗性的化疗药物浓度条件下生长，并且其中所述细胞表达至少一种在化学抗性卵巢癌细胞中过表达的基因，其中所述过表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶(Calpain)2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白(Calponin)2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白(Grancalcin)，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082(如表1所列GenBank登录号所鉴定)；(b)测定所述细胞的一或多种所述基因或基因产物在被试化合物存在或缺无时的表达或活性；和/或(c)比较细胞生长和/或至少一种所述基因或基因产物在被试化合物存在或缺无时的表达或活性，其中如果所述基因或基因产物在被试化合物存在时的表达或活性相对于所述基因在被试化合物缺无时的表达降低，或如果细胞生长在所述化合物存在时受抑制，或两种情况都出现，那么该化合物被鉴定为抑制化学抗性肿瘤细胞生长的化合物。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明还提供鉴定这样的化合物的方法，所述化合物可降低药物抗性并抑制、推迟或预防有化疗剂抗性的肿瘤细胞、最优选卵巢癌细胞的生长，所述方法包含如下步骤：a)使细胞接触被试化合物，其中所述细胞在化疗药物存在的条件下生长了一段时间或在使得所述细胞对所述药物有抗性的化疗药物浓度下生长，并且其中所述细胞表达与在化学敏感性细胞中的情况相比在化学抗性卵巢癌细胞中以较低水平表达的基因，其中所述基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10(如表1所列GenBank登录号所鉴定)；b)测定在被试化合物存在或缺无时所述细胞的细胞生长和/或基因表达或基因产物活性；和c)比较在被试化合物存在或缺无时的基因表达或基因产物活性，其中如果(i)所述基因的表达或基因产物的活性在被试化合物存在时相比所述基因的表达或基因产物的活性在被试化合物缺无时升高，和/或(ii)如果细胞生长在所述化合物存在时受抑制，和/或(iii)如果细胞生长受抑制且所述基因表达和/或活性升高，那么该化合物被鉴定为抑制化学抗性肿瘤细胞生长的化合物。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明提供了降低化疗药物抗性和/或抑制、推迟或预防肿瘤细胞生长的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞与细胞基因的至少一种抑制剂接触的步骤，所述步骤在化疗药物存在一段时间、或该化疗药物的浓度使得所述细胞在缺乏细胞基因抑制剂时对所述药物有抗性的条件下进行，其中所述细胞基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082。在优选的具体实施方案中，所述肿瘤细胞是人肿瘤细胞，更优选卵巢癌细胞。在具体方面，根据本发明鉴定的一或多种基因用具体设计为靶向一或多种所述基因的反义RNA或siRNA分子来抑制。其他方面，所述基因的基因产物用这些蛋白的抑制剂来抑制。

本发明提供了降低肿瘤细胞的药物抗性的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞与至少一种提高细胞基因的表达或活性的化合物接触的步骤，其中所述细胞基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10，所述步骤中的条件为化疗药物缺无或存在一段时间或该药物以使得可提高HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10的表达或活性的化合物缺无时所述细胞对其有抗性的浓度存在。在优选的具体实施方案中，所述肿瘤细胞是人肿瘤细胞，更优选卵巢癌细胞。

本发明也提供了抑制、推迟或预防肿瘤细胞生长的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞与至少一种提高细胞基因的表达或活性的化合物接触的步骤，其中所述细胞基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10，所述步骤中的条件为在化疗药物缺无或存在一段时间或该化疗药物以使得存在所述提高HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10的表达或活性的化合物时的细胞增殖相对于该所述化合物缺无时的细胞增殖变慢或受抑制的浓度存在。在优选的具体实施方案中，所述肿瘤细胞是人肿瘤细胞，更优选卵巢癌细胞。

另一方面，本发明提供了抑制、推迟或预防肿瘤细胞、最优选卵巢癌细胞生长的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞接触一或多种化疗剂与细胞基因的至少一种抑制剂的组合的步骤，其中所述细胞基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，Fused toes，NM23D，粒钙蛋白，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，或KIAA0082。在一个具体方面，所述细胞基因是MetAP2，所述化疗剂是基于铂的化疗剂(platinum-based)，并且所述至少一种抑制剂是烟曲霉素(fumagillin)或烟曲霉素的衍生物。在另一个具体方面，所述细胞基因是需钙蛋白酶2，所述化疗剂是基于铂的化疗剂，并且所述至少一种抑制剂是N-乙酰基-亮氨酰基-亮氨酰基-正亮氨酸(N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal，ALLN)或其衍生物。表1所示细胞基因的抑制剂可以是，例如具体设计为靶向表1所示基因的siRNA分子或shRNA分子，或小分子抑制剂。

另一方面，本发明提供了抑制、推迟或预防肿瘤细胞、最优选卵巢癌细胞生长的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞接触化疗剂或药剂与至少一种提高细胞基因的表达或活性的化合物的步骤，其中所述细胞基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10。在优选的具体实施方案中，所述肿瘤细胞是人肿瘤细胞，更优选卵巢癌细胞。

本发明也提供预测卵巢癌患者的肿瘤是否对化疗有抗性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)对应于在亚部分(a)中检测的一或多种被表达的基因或基因产物，检测所述一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在对照样本中的量，所述样本包括非肿瘤组织样本，最优选来自肿瘤来源的组织或来自对化疗反应良好的患者的组织样本，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；和(c)比较在步骤(a)中测定的所述被表达的基因或基因产物的量和在步骤(b)中检测的所述被表达的基因或基因产物的量，其中如果步骤(a)中的检出量比步骤(b)中的检出量高至少20％的因数，那么预测所述患者对化疗有抗性。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在具体方面，所述对照样本是得自对化疗有反应的癌症患者的生物样本。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

在具体方面，当在来自癌症患者的生物样本中表达的MetAP2的测得量高于在对化疗药物有反应的个体中或在来自不患卵巢癌的个体的卵巢组织中的检出量时，所述方法可预测所述患者会对基于铂的化疗有抗性。

本发明也提供预测卵巢癌患者的肿瘤是否对化疗有抗性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1，或MPP10；(b)对应于在亚部分(a)中检测的一或多种被表达的基因或基因产物，检测所述一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在对照样本中的量，其中所述被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；和(c)比较在步骤(a)中测定的被表达的基因或基因产物的量和在步骤(b)中检测的被表达的基因或基因产物的量，其中如果在步骤(a)中的检出量比在步骤(b)中的检出量高至少20％、更优选至少50％的因数，那么预测所述患者对化疗有抗性。在具体方面，所述对照样本是得自对化疗有反应的癌症患者的生物样本。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明还提供监测在卵巢癌患者、具体为接受化疗的卵巢癌患者中的疾病进展的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(c)比较步骤(a)中被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(b)中被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测被表达的基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于其在步骤(a)中的生物样本中的量的变化来监测疾病进展，并且在步骤(b)中所述被表达的基因或表达的基因产物的检出量高于步骤(a)中所述被表达的基因或基因产物的检出量时检测到疾病的进展。在某些具体实施方案中，所述患者在检测步骤(a)中的基因表达量与检测步骤(b)中的检出量之间的时期接受化疗或其他治疗。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在优选具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明还提供监测在卵巢癌患者、具体为接受化疗的卵巢癌患者中的疾病进展的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(c)比较步骤(a)中被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(b)中被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测被表达的基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于其在步骤(a)中的生物样本中的量的变化来监测疾病进展，并且在步骤(b)中所述被表达的基因或表达的基因产物的检出量低于或等于步骤(a)中所述被表达的基因或基因产物的检出量时检测到疾病的进展。在某些具体实施方案中，所述患者在检测步骤(a)中的基因表达量与检测步骤(b)中的检出量之间的时期接受化疗或其他治疗。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

另外，本发明提供监测药物组合物作为治疗患者的癌症、具体为卵巢癌或结肠癌的药剂的有效性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)将一定量的药物组合物给予所述患者；(c)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(d)比较步骤(a)中被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(c)中被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测被表达的基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于其在步骤(a)中的生物样本中的量的变化来监测所述药物组合物的有效性，并且其中在步骤(c)中所述被表达的基因或基因产物的检出量低于步骤(a)中所述被表达的基因或基因产物的检出量时，且在所述药物组合物存在时肿瘤生长下降(即减慢、推迟或抑制)时，所述药物组合物是有效的。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明也提供监测药物组合物作为治疗患者的癌症、具体为卵巢癌或结肠癌的药剂的有效性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)将一定量的药物组合物给予所述患者；(c)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(d)比较步骤(a)中被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(c)中被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测被表达的基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于其在步骤(a)中的生物样本中的量的变化来监测所述药物组合物的有效性，并且其中如果步骤(c)中所述被表达的基因或表达的基因产物的检出量高于步骤(a)中所述被表达的基因或基因产物的检出量，且在所述药物组合物存在时肿瘤生长下降(即减慢、推迟或抑制)，所述药物组合物是有效的。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明也提供检测检测结肠癌的方法，所述方法包含如下步骤：(a)从动物、优选人获得生物样本；(b)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在所述生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，或MetAP2；(c)检测在对照样本中检出的所述一或多种被表达的基因或基因产物的量，所述对照样本包括非肿瘤结肠组织样本；(d)比较所述一或多种被表达的基因或基因产物在步骤(b)中的量和在步骤(c)中的量，其中如果步骤(b)中的量与步骤(c)中的量相比有差别，则可检出结肠癌。在步骤(a)中用的生物样本和步骤(c)中用的生物样本中检出的差别可以是一或多种所述基因的过表达，或可以是一或多种所述基因的缺乏或不足表达(underexpression)。例如，如果S100A10，S100A11，SPARC和/或MetAP2在步骤(b)中的量比步骤(c)中的量高，和/或如果需钙蛋白酶2在步骤(b)中的量低于在步骤(c)中的量，则检出了结肠癌。在某些具体实施方案中，所述动物是人，优选患结肠癌的人。优选，所述生物样本是结肠组织样本，更优选息肉并更优选腺癌性息肉(adematous polyp)，它们在本领域常用作结肠筛选活性的组织样本。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

在另一具体实施方案中，本发明提供了诊断动物、优选人的癌症和/或化疗药物抗性的方法，所述方法包含检测两或多种被表达基因或由其编码的基因产物的量的改变模式的步骤。在具体的具体实施方案中，所述被表达的基因是表1所示的基因。通常地，本发明的这些方法包含如下步骤：(a)从动物、优选人获得生物样本；(b)检测两或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在所述生物样本中的量，其中所述被表达的基因如表1所示；(c)检测两或多种被表达的基因或基因产物在对照样本中的检出量；(d)通过比较两或多种被表达的基因或基因产物在步骤(b)中的量和在步骤(c)中的量，确定所述两或多种被表达基因或由其编码的基因产物的量的改变模式，其中所述模式与癌症例如结肠或卵巢癌、或药物抗性例如顺铂(cis-platin)抗性相关。在某些具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

本发明也提供了检测患卵巢癌的动物的化疗药物抗性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述动物的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)对应于在亚部分(a)中检测的所述多种被表达的基因或基因产物，检测所述多种被表达的基因或由其编码的基因产物在对照样本中的量，所述对照样本包含非肿瘤卵巢组织或来自对化疗有反应的患者的肿瘤组织，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；和(c)比较在步骤(a)中测定的所述被表达的基因或基因产物的量和步骤(b)中所述被表达的基因或基因产物的检出量，其中如果步骤(a)中的检出量比步骤(b)中的检出量高至少20％的因数，则预测所述患者对化疗有抗性。如本文所公开，其中在步骤(a)中的检出量比在步骤(b)中的检出量高至少20％的因数的多种所述基因，可限定对化疗药物有抗性的肿瘤样本所特有的基因表达模式。在具体方面，所述对照样本是得自对化疗有反应的患者的生物样本。优选地，一或多种所述基因的表达在步骤(a)中所检测的肿瘤样本中的水平比在步骤(b)中所检测的对照样本中的水平高。在优选的具体实施方案中，所述动物是人，最优选人癌症患者。如本文所公开，本发明还提供了预测对所述化疗药物的抗性的基因表达模式，条件是所述基因表达模式被检出。在优选的具体实施方案中，通过用对本发明所鉴定的多种基因产物特异的核酸(基因)探针或抗体等的阵列测定生物样本来检测基因表达。

有利地，一些本文鉴定的基因从未被认识到与卵巢癌或结肠癌有关，并可证明是其干涉这些疾病的新靶标。

通过下面对某些优选的具体实施方案及权利要求书更具体的描述，本发明的具体优选的具体实施方案将会变得明显。

本发明涉及下述各项。

1.一种降低肿瘤细胞对化疗药物的抗性的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞接触细胞基因的至少一种调节剂的步骤，其中所述细胞基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；其中所述细胞对所述化疗药物的抗性在所述调节剂存在时比所述调节剂缺无时弱。

2.项1所述的方法，其中所述化疗药物是顺铂。

3.项1所述的方法，其中所述调节剂是抑制剂并且所述基因是MetAP-2。

4.项3所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

5.项4所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。

6.项3所述的方法，其中所述抑制剂是烟曲霉素或烟曲霉素的衍生物。

7.项1所述的方法，其中所述肿瘤细胞是卵巢癌肿瘤细胞。

8.项1所述的方法，其中所述调节剂是抑制剂并且所述基因是SPARC。

9.项8所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

10.项9所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

11.项1所述的方法，其中所述调节剂是抑制剂并且所述基因是需钙蛋白酶2。

12.项11所述的方法，其中所述抑制剂是ALLN或ALLN的衍生物。

13.项11所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

14.项13所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。

15.项1所述的方法，其中所述调节剂是抑制剂并且所述基因是S100A11。

16.项15所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

17.项16所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。

18.项1所述的方法，其中所述调节剂是抑制剂并且所述基因是S100A10。

19.项18所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

20.项19所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61。

21.项1所述的方法，其中所述调节剂是抑制剂并且所述基因是KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，Fused toes，NM23D，粒钙蛋白，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，SRB1，或KIAA0082。

22.项21所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

23.项22所述的方法，其中所述siRNA是SEQ ID NO：64-108或134-144之一。

24.一种抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包含使所述肿瘤细胞接触一或多种化疗剂与细胞基因的至少一种抑制剂的组合的步骤，其中所述细胞基因是SPARC，需钙蛋白酶2，S100A10，S100A11，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，Fused toes，NM23D，粒钙蛋白，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，SRB1，或KIAA0082。

25.项24所述的方法，其中所述化疗剂是基于铂的化疗剂。

26.项24所述的方法，其中所述至少一种抑制剂是MetAP-2活性的抑制剂。

27.项26所述的方法，其中所述至少一种抑制剂是烟曲霉素或烟曲霉素的衍生物。

28.项24所述的方法，其中所述肿瘤细胞是卵巢癌细胞。

29.项24所述的方法，其中所述抑制剂是siRNA。

30.项29所述的方法，其中所述siRNA被鉴定为SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQID NO：61，或SEQ ID NO：64-108或SEQ ID NO：134-144之一。

31.一种预测卵巢癌患者的肿瘤是否对化疗药物有抗性的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)检测一或多种被表达的基因或由该被表达的基因编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；

(b)检测一种或对应的多种被表达的基因或由其编码的基因产物在对照样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；

(c)比较所述被表达的基因或基因产物在步骤(a)中的检出量和所述被表达的基因或基因产物在步骤(b)中的检出量，

其中当步骤(a)中的检出量与步骤(b)中的检出量相差至少20％的因数时，预测所述患者对所述化疗药物有抗性。

32.项31所述的方法，其中所述化疗是基于铂的化疗。

33.项31所述的方法，其中所述被表达的基因是MetAP2或SPARC。

34.一种监测患者中卵巢癌的疾病进展的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)检测一或多种被表达的基因或由该被表达的基因编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，或MT1；

(b)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和

(c)比较所述被表达的基因或基因产物在步骤(a)中的检出量和所述被表达的基因或基因产物在步骤(b)中的检出量，其中如果所述步骤(b)中的检出量

i)不低于步骤(a)中S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，Eif5，Eif2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082的检出量；并且

ii)不超过步骤(a)中MPP10，HMT1，NAIP，Eef1ε，RAB22A，NCOR2，或MT1的检出量，

则认为所述癌症有进展。

35.项34所述的方法，其中所述被表达的基因是Eif5或SPARC。

36.一种鉴定降低化学抗性肿瘤细胞的药物抗性的化合物的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)使细胞接触被试化合物及使细胞对其产生抗性的浓度的化疗药物，所述细胞表达在化学抗性卵巢癌细胞中过表达的基因，其中所述基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，Eif5，Eif2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；

(b)检测所述基因在所述被试化合物存在和缺无时的表达；和

(c)比较所述基因在所述被试化合物存在和缺无时的表达，其中如果所述基因在所述被试化合物存在时的表达相对于所述基因在所述被试化合物缺无时的表达降低，且肿瘤细胞生长在所述化合物存在时下降，则该化合物被鉴定为抑制化学抗性肿瘤细胞生长的化合物。

37.一种鉴定降低化学抗性肿瘤细胞的药物抗性的化合物的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)使细胞接触被试化合物及使细胞对其产生抗性的浓度的化疗药物，所述细胞表达在化学抗性卵巢癌细胞中以低于正常的水平表达的基因，其中所述基因是HMT1，NAIP，Eef1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；

(b)检测所述基因在所述被试化合物存在和缺无时的表达；和

(c)比较所述基因在所述被试化合物存在和缺无时的表达，其中当所述基因在所述被试化合物存在时的表达相对于所述基因在所述被试化合物缺无时的表达升高，且肿瘤细胞生长在所述化合物存在时下降，该化合物被鉴定为抑制化学抗性肿瘤细胞生长的化合物。

38.一种监测药物组合物作为治疗患者中癌症的药剂的有效性的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，Eif5，Eif2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，或MPP10，HMT1，NAIP，Eef1ε，RAB22A，NCOR2，MT1；

(b)给予所述患者一定量的所述药物组合物；

(c)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和

(d)比较所述被表达基因或基因产物在步骤(a)中的检出量和所述被表达基因或基因产物在步骤(c)中的检出量，其中所述药物组合物的有效性通过检测所述被表达基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于在步骤(a)中所述生物样本中的量的变化来进行监测，且肿瘤细胞生长在所述组合物存在时下降。

39.一种检测结肠癌的方法，所述方法包含如下步骤：

(a)从患者获得生物样本；

(b)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在所述生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，或MetAP2；

(c)检测在对照样本中检出的所述一或多种被表达的基因或基因产物的量；

(d)比较所述一或多种被表达的基因或基因产物在步骤(b)中的检出量和其在步骤(c)中的检出量；

其中如果所述一或多种基因在步骤(b)中的检出量与所述一或多种基因在步骤(c)中的检出量不同，则认为检出结肠癌。

40.项39所述的方法，其中如果S100A10，S100A11，SPARC，或MetAP2在步骤(b)中的检出量相对于其在步骤(c)中的检出量增加，则认为检出结肠癌。

41.项39所述的方法，其中如果需钙蛋白酶2在步骤(b)中的检出量相比在步骤(c)中的检出量降低，则认为检出结肠癌。

42.项1所述的方法，其中所述调节剂是siRNA或shRNA。

43.项42所述的方法，其中所述调节剂是19，20或21个核苷酸长的siRNA。

44.项42所述的方法，其中所述调节剂是形成发夹环且臂是19，20或21个核苷酸长的shRNA。

附图简述

图1是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示S100A10在对化疗药物抗性增加的卵巢癌细胞系中以升高的水平表达。

图2是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示S100A11在对化疗药物抗性增加的卵巢癌细胞系中以升高的水平表达。

图3是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示S100A10和S100A11的mRNA在对化疗抗性较强的患者肿瘤样本中水平相对在来自反应性较强的患者的样本中的水平升高。

图4是定量实时PCR结果的图示，其显示SPARC在化学抗性细胞系中以升高的水平表达。

图5是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片，其显示SPARCmRNA在取自癌症已经复发的患者的样品中升高。

图6是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示需钙蛋白酶2mRNA的水平在化学抗性卵巢癌细胞系中升高。

图7是Northern印迹结果的图示，显示粒钙蛋白mRNA在化学抗性细胞系中的水平相对于在对顺铂处理敏感的细胞系中的水平升高。

图8是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示MetAP2蛋白质的表达在高度化学抗性的细胞系OVCA429中升高，并在对顺铂处理敏感的Hey细胞系中下调。

图9是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示在组织样本中的MetAP2蛋白质的表达，所述组织样本得自三个对基于顺铂的化疗抗性水平不同的患者。相比具有中等(CAP2)和低(CAP1)化疗抗性水平的患者，在患抗性最强的肿瘤(CAP3)的患者样本中MetAP2升高得最多。

图10是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示可检出eIF5的两种转录物，并且这两者的表达水平在对顺铂抗性水平最高的卵巢癌细胞系中是升高的。

图11是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示在肿瘤复发前(CAP2)和肿瘤复发后(CAP2+)的化学抗性患者肿瘤样本中的eIF5表达。

图12是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示eIF2Bε的mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图13是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示eEF1ε mRNA在对顺铂抗性最强的卵巢癌细胞系中下调。

图14显示了Northern印迹结果的图示，显示相对于敏感细胞系，SAPK/Erk1mRNA水平在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图15显示了Northern印迹结果的图示，显示TESK2 mRNA在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图16显示了Northern印迹结果的图示，显示FAST激酶mRNA在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图17是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示KLK6的表达水平在被试的对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图18是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示HMT1的表达水平在对顺铂有抗性的细胞中下调。

图19是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示ARA9的mRNA在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图20是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示钙调理蛋白2的表达在化学抗性细胞系中与在化学敏感的卵巢癌细胞系中相比升高。

图21是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示神经元细胞凋亡抑制型蛋白(neuronal apoptosis inhibitoryprotein)的基因表达在对顺铂抗性最强的细胞系中降低。

图22是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示RNPS1水平在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图23是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示HSF2的mRNA水平在化学抗性细胞系中升高。

图24是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示WDR1的mRNA在化学抗性细胞系中的水平与在化学敏感细胞系中的水平相比升高。

图25是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示Ft1 mRNA的水平在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图26是显示Northern印迹分析结果的放射自显影照片及该Northern印迹结果的图示，显示NME4mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图27显示了Northern印迹结果的图示，显示ADAR1 mRNA在对顺铂有抗性的细胞系中升高。

图28显示了Northern印迹结果的图示，显示NBR1 mRNA在化学抗性最强的细胞系OVCA 429中的水平与在其他被试细胞系中的水平相比升高。

图29显示了Northern印迹结果的图示，显示锌指蛋白262的mRNA在顺铂抗性最强的细胞系中相比其他被试细胞系升高。

图30显示了Northern印迹结果的图示，显示MRPL4 mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图31显示了Northern印迹结果的图示，显示HYA22 mRNA在化学抗性细胞系中相比化学敏感的细胞系升高。

图32显示了Northern印迹结果的图示，显示vinexinβ的mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图33显示了Northern印迹结果的图示，显示G-CSFR的mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图34显示了Northern印迹结果的图示，显示SRB1 mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图35显示了Northern印迹结果的图示，显示IGFBP-7 mRNA在化学抗性细胞系中升高。

图36显示了Northern印迹结果的图示，显示RAB22A mRNA在化学抗性细胞系中降低并在反应性更强的细胞系中升高。

图37显示了Northern印迹结果的图示，显示KIAA0082 mRNA的表达在化学抗性细胞系中升高。

图38显示了Northern印迹结果的图示，显示NCOR2的mRNA在对顺铂有抗性的细胞系中的水平与敏感的细胞系中的水平相比降低。

图39显示了基于MTT分析结果，根据五个卵巢癌细胞系对顺铂的敏感性水平对其进行的等级划分。

图40(上图)图示了浓度升高的烟曲霉素对暴露于该药物4小时后的OVCA429细胞存活的影响。下图图示在0.1μg/ml烟曲霉素存在时顺铂的作用增强，但当在10μg/ml烟曲霉素存在时用顺铂处理所述细胞4小时不导致顺铂作用的增强。

图41(上图)图示了浓度升高的烟曲霉素对暴露于该药物8小时后的OVCA429细胞存活的影响。

图41(下图)图示在0.1μg/ml烟曲霉素存在时顺铂的作用增强，但存在10μg/ml烟曲霉素时用顺铂处理所述细胞8小时不导致顺铂作用的增强。

图42(上图)图示了浓度升高的烟曲霉素对暴露于该药物24小时后的OVCA429细胞存活的作用。

图42(下图)图示在0.1μg/ml烟曲霉素存在时顺铂的细胞毒性作用增强，但当存在10μg/ml烟曲霉素时用顺铂处理细胞24小时不导致顺铂作用的增强。

图43是三种siRNA(#1，SEQ ID NO：4；#2，SEQ ID NO：5；和#3，SEQ IDNO：6)的示意图，所述三种siRNA被设计为靶向MetAP-2信使RNA的不同区域。

图44显示了通过定量实时PCR测定的siRNA#1对于MetAP-2在OVCA429中的表达水平的影响。

图45图示在siRNA#1存在时将OVCA 429暴露于顺铂后，通过MTT分析测定对细胞存活定量。

图46是进行MTT分析后含OVCA429细胞的96孔板的照片(定量显示在图45)，该照片显示顺铂对用MetAP-2siRNA#1转染的这些细胞的作用。

图47是三种siRNA(#1，SEQ ID NO：1；#2，SEQ ID NO：2；和#3，SEQ IDNO：3)的示意图，所述三种siRNA被设计为靶向SPARC信使的不同区域。

图48图示在用图47所示的siRNAs转染的OVCA 429细胞中的SPARC表达的定量实时PCR分析结果。

图49是进行MTT分析后含OVCA 429细胞的96孔板的照片，来确定顺铂在SPARC siRNA#2存在时对OVCA 429细胞的作用。

图50图示siRNA-介导的SPARC基因表达降低对OVCA 429细胞的顺铂敏感性的影响。

图51显示了Northern印迹结果的图示，显示MT1 mRNA在对顺铂最敏感的细胞系(Hey)中显著升高。

图52显示了Northern印迹结果的图示，显示MPP10 mRNA随着对顺铂的敏感性的提高而增加。

图53图示siRNA-介导的需钙蛋白酶2基因表达降低在OVCA 429细胞中的影响。

图54图示需钙蛋白酶2siRNA#3对OVCA 429细胞的顺铂敏感性的影响。

图55图示需钙蛋白酶2抑制剂ALLN对OVCA 429细胞的顺铂敏感性的影响。

图56图示siRNA-介导的SA100A10基因表达降低对OVCA 429细胞的顺铂敏感性的影响。

图57图示siRNAs对OVCA429细胞中的S100A11基因mRNA表达水平的影响。

图58图示在正常和结肠癌细胞cDNA中的MetAp-2mRNA表达水平。

图59图示在正常和结肠癌细胞cDNA中的SPARC mRNA表达水平。

图60图示在正常和结肠癌细胞cDNA中的S100A11 mRNA表达水平。

图61图示在正常和结肠癌细胞cDNA中的S100A10 mRNA表达水平。

图62图示在正常和结肠癌细胞cDNA中的需钙蛋白酶-2mRNA表达水平。

图63显示肿瘤体积为两只裸鼠体重的函数，这两只裸鼠注射了OVCAR-3细胞(15百万/每次注射，得自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)，Manassas，VA，保藏号HTB-161)，并在35天后用顺铂以4μg/kg体重、通过IP注射、每周三次、持续处理2周，之后的1周不处理或用单独的生理盐水溶液作为对照来处理。

图64是显示针对需钙蛋白酶2或S100A11的siRNAs在OVCAR-3细胞中的稳定表达的图。在对照道(lane)，在无处理或含有无关GFP siRNA的细胞(cells without treatment or the irrelevant GFPsiRNA)中测定两种mRNA的表达。需钙蛋白酶2和S100A11的mRNA表达在相关的siRNA道中明显降低。

发明内容

本发明提供了抑制、推迟或预防肿瘤细胞生长的方法，所述方法包含在化疗药物以所述细胞产生抗性的浓度存在时使所述肿瘤细胞接触一或多种细胞基因的表达或活性的至少一种调节剂的步骤，其中所述细胞基因是表1所示的基因，并且其中使所述肿瘤细胞接触所述基因表达的调节剂会降低、抑制、推迟或预防所述肿瘤细胞的药物抗性。所述肿瘤细胞可以是例如，卵巢癌。在一个具体实施方案中，可以在体内接触所述肿瘤细胞(例如未从患者取出的细胞)。

本文所用术语“生物样本”包括但不限于得自动物、优选哺乳动物、最优选人的组织或体液。例如，生物样本可以是活体解剖材料、骨髓样本、血、血浆、血清或或其细胞级分，尿、唾液、泪液或来自生物来源的细胞。在一个具体实施方案中，所述哺乳动物是疑似患有或以前诊断出患有或需要筛查癌症、具体为卵巢癌或结肠癌的人。在某些具体实施方案中，生物样本是组织样本。

本文所用术语“卵巢癌”据理解通常指上皮卵巢癌，其包括所有诊断为来自卵巢组织的人癌症的几乎80％的一些癌症。其余的癌症，包括源自种系(germline)的卵巢癌和透明细胞(clear cell)卵巢癌，是罕见并通常被误诊的。鉴于在这些少数肿瘤类型中也发现本文公开的基因表达的改变，本发明的方法和组合物可以适用于所述疾病。

本文所用的基因表达或基因产物活性的“调节剂”可以是任何会造成基因表达或基因产物活性升高或降低的化学化合物、核酸分子、肽或多肽。在某些具体实施方案中，本发明的调节剂是造成一或多种细胞基因的表达或活性升高的化合物，所述一或多种细胞基因的表达或活性在对化疗剂有抗性的肿瘤细胞中是降低的；这些调节剂在本文被称为“活化剂”。在其他具体实施方案中，调节剂是一或多种细胞基因、具体为其表达在对化疗剂有抗性的肿瘤细胞中升高的基因的表达或活性的抑制剂；这些调节剂在本文被称为“抑制剂”。

本文所用的“抑制剂”可以是任何能降低基因产物活性或直接干扰基因表达的化学化合物、核酸分子、肽或多肽，如抗基因产物的抗体。例如本发明的抑制剂能直接或间接地抑制基因编码的蛋白质的活性。直接抑制可通过，诸如结合蛋白质从而预防该蛋白质结合意向的靶标，如受体进行来实现。间接抑制可通过，诸如结合蛋白质的意向靶标，如受体或结合配偶体，从而阻断或降低所述蛋白质的活性来实现。并且，本发明的抑制剂可通过降低或抑制所述基因的表达等来抑制基因，这可通过干扰基因表达(转录、加工、翻译、翻译后修饰)，例如通过干扰所述基因的mRNA并阻断所述基因产物的翻译或通过基因产物的翻译后修饰，或通过造成细胞内定位的改变来进行。

本文所用的“活化剂”可以是任何能提高基因产物活性(例如通过稳定化所述基因产物，预防其蛋白水解降解或增强其酶活性或结合活性或直接活化基因表达)的化学化合物、核酸分子、肽或多肽。本发明的活化剂可直接或间接地增强基因编码的蛋白质的活性。直接活化可通过，诸如结合蛋白质从而增强该蛋白质与意向靶标，如受体的结合来实现。间接活化可通过，诸如结合蛋白质的意向靶标，如受体或结合配偶体，并增强活性，例如通过提高所述靶标的有效浓度来实现。并且，本发明的活化剂可通过，提高所述基因的表达来活化基因，这可通过例如提高基因表达(转录、加工、翻译、翻译后修饰)，例如通过稳定化所述基因的mRNA或阻断所述mRNA转录物的降解，或通过基因产物的翻译后修饰，或通过造成细胞内定位的改变来进行。

如本文所述，在化学抗性卵巢肿瘤细胞中的数种基因的表达显著不同于其在化学敏感卵巢肿瘤细胞中的表达。表1提供了用下面实施例中所述的方法鉴定的所述基因的列表。该表也汇总了在对广泛使用的化疗剂顺铂敏感或有抗性的细胞中的这些基因的表达模式。

表1

已经报道在表1中以粗体显示的染色体位置与卵巢癌有关(Pejoic，1995，Ann.Med.27：73-78)。

在一个具体实施方案中，表1所示细胞基因的抑制剂可以是，例如，小分子抑制剂，抗体，核酸如反义核酸，短干扰RNA(siRNA)分子，或短发夹RNA(shRNA)分子。另外，这些抑制剂可以用本文所述的方法或用本领域已知方法具体地设计。例如针对表1所示的基因所编码的蛋白质的抗体，具体为中和抗体并优选单克隆抗体，可用如“Antibodies：A Laboratory Manual”byHarlow and Lane(Cold Spring Harbor Press，1988)所述的常用手段来产生，其引入本文作为参考。

在具体的具体实施方案中，本发明的抑制剂是结合编码靶基因的mRNA的siRNA，其中所述靶基因是表1所示的基因。

在优选具体实施方案中，本发明提供的某些抑制剂是短干扰RNA(siRNA)种类(species)。本文所用术语“短干扰RNA”或“siRNA”指能够起RNA干扰作用的双链核酸分子或“RNAi”，如下所述，例如Bass，2001，Nature411：428-429；Elbashir et al.，2001，Nature 411：494-498；和Kreutzer等，国际PCT公开号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等，国际PCT公开号WO00/01846；Mello and Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等，国际PCT公开号WO 00/44914。本文所用的siRNA分子不需被限制为那些仅包含RNA的分子，其还包括具有RNAi能力或活性的经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

已经在多种体系中研究了短干扰RNA介导的RNAi。Fire等首先在C.elegans中观察RNAi(1998，Nature 391：806)。Wianny and Goetz描述了在小鼠胚胎中通过dsRNA介导的RNAi(1999，Nature Cell Biol.2：70)。Hammond等描述了用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi(2000，Nature 404：293)。Elbashir等描述了通过向培养的哺乳动物细胞(包括人胚胎肾细胞和HeLa细胞)中引入合成的21个核苷酸的RNAs的双链体而诱导的RNAi(2001，Nature411：494)。这些研究已经显示包含21个核苷酸的siRNA双链体在含有两个核苷酸3′-突出端时是最活跃的。而且，用2′-脱氧或2′-O-甲基核苷酸取代一或两条siRNA链会消除(abolish)RNAi活性，而用脱氧核苷酸取代3′-末端siRNA核苷酸显示是可耐受的。在siRNA双链体中心的错配序列也显示会消除RNAi活性。另外，这些研究也表明切割点在靶RNA中的位置是由siRNA引导序列的5′-末端而不是3′-末端来限定的(Elbashir等，2001，EMBO J.20：6877)。其他研究表明siRNA双链体的靶-互补链上的5′-磷酸是siRNA活性所需的并且ATP在细胞中用于维持所述siRNA上的5′-磷酸部分(Nykanen等，2001，Cell 107：309)。然而，缺乏5′-磷酸的siRNA分子在外源性引入时是有活性的，这提示siRNA构建体的5′-磷酸化可能在体内出现。化学修饰的siRNA可为了某种应用被直接注射到血流中。

在某些具体实施方案中，本发明以允许本发明siRNA分子表达的方式，提供了包含编码至少一个所述siRNA分子的核酸序列的表达载体。例如所述载体可包含编码包含双链体的siRNA分子双链的序列。所述载体也可包含编码自身互补从而形成siRNA分子的单个核酸分子的序列。这些表达载体的非限制性实施例见下所述，Paul等，2002，Nature Biotechnology 19：505；Miyagishi and Taira，2002，Nature Biotechnology 19：497；Lee等，2002，NatureBiotechnology 19：500；和Novina等，2002，Nature Medicine，June 3，2003网上公开。

在某些具体实施方案中，本发明的siRNA分子可包含递送载体，包括给予受试者的脂质体、载体和稀释剂及其盐等，并可在药物组合物中存在。递送核酸分子的方法如下所述，例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.2：139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer等，1999，Mol.Membr.Biol.16：129-140；Hofland and Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137：165-192；和Lee等，2000，ACS Symp.Ser.752：184-192，其全部引入本文作为参考。Beigelman等，美国专利6,395,713和Sullivan等，PCT WO 94/02595进一步描述了递送核酸分子的常用方法。这些方案可用于递送几乎任何核酸分子。核酸分子可通过多种本领域技术人员已知的方法给予细胞，包括但不限于包裹在脂质体中、通过离子电渗(iontophoresis)、或通过掺入其他递送载体，诸如水凝胶、环糊精(cyclodextrins)、生物降解纳米胶囊(nanocapsules)及生物胶粘微球(bioadhesivemicrospheres)，或通过蛋白质性载体(见例如O′Hare and Normand，国际PCT公开号WO 00/53722)。

或者，核酸/载体的组合可通过直接注射或通过使用输注泵来局部递送。直接注射本发明的核酸分子，无论是皮下、肌内还是皮内，都可用标准针头和注射器方法进行，或通过无针头技术如Conry等，1999，Clin.CancerRes.5：2330-2337和Barry等，国际PCT公开号WO 99/31262所述的那些。很多本领域内的实施例描述了通过渗透泵(见Chun等，1998，NeuroscienceLetters 257：135-138，D′Aldin等，1998，Mol.Brain Research 55：151-164，Dryden等，1998，J.Endocrinol.157：169-175，Ghirnikar等，1998，Neuroscience Letters247：21-24)或直接输注(Broaddus等，1997，Neurosurg.Focus 3，article 4)递送寡核苷酸的方法。其他递送途径包括但不限于口服递送(如以药片或药丸的形式)和/或经鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience 76：1153-1158)。对于核酸递送和给予的更具体的描述见Sullivan等，PCT WO 94/02595，Draper等，PCTWO93/23569，Beigelman等，PCT WO99/05094，和Klimuk等，PCTWO99/04819，其全部引入本文作为参考。

或者，本发明的某些siRNA分子可以在细胞内从真核生物启动子表达(见例如Izant and Weintraub，1985，Science 229：345；McGarry and Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 83：399；Scanlon等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10591-5；Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.2：3-15；Dropulic等，1992，J.Virol.66：1432-41；Weerasinghe等，1991，J.Virol.65：5531-4；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10802-6；Chen等，1992，NucleicAcids Res.20：4581-9；Sarver等，1990，Science 247：1222-1225；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.23：2259；Good等，1997，Gene Therapy 4：45；Miyagishi等，2001，Nucleic Acids Research 29：2502；and Kunkel and Pederson，1989 Nucleic Acids Research 17：7371)。那些本领域技术人员可认识到任何核酸都可用合适的DNA/RNA载体在真核生物细胞中表达。这些核酸的活性可通过它们通过有酶活性的核酸(enzymatic nucleic acid)从原始转录物释放而得到加强(Draper等，PCT WO 93/23569，和Sullivan等，PCT WO 94/02595；Ohkawa等，1992，Nucleic Acids Symp.Ser.27：15-6；Taira等，1991，NucleicAcids Res.19：5125-30；Ventura等，1993，Nucleic Acids Res.21：3249-55；Chowrira等，1994，J.Biol.Chem.269：25856)。

在本发明的另一方面，本发明的RNA分子可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(见例如，Couture等，1996，TIG 12：510)。所述重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达病毒载体的siRNA可以基于如下病毒来构建，例如但不限于腺伴随病毒、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒或甲病毒(alphavirus)。在另一具体实施方案中，基于pol III的构建体用来表达本发明的核酸分子(见例如，Thompson，美国专利5,902,880和6,146,886)。能表达所述siRNA分子的重组载体可以如上递送并保持在靶细胞中。或者，可用提供核酸分子瞬时表达的病毒载体。必要时可重复给予这些载体。一旦表达，所述siRNA分子与靶mRNA相互作用并产生RNAi反应。可以全身给予表达siRNA分子的载体，如通过静脉内或肌内给予，通过给予从受试者取出(ex-planted)之后重新导入(reintroduction)所述受试者的靶细胞，或通过任何其他可引入理想靶细胞的方法(综述见Couture等，1996，TIG.12：510)。

在一个具体实施方案中，本发明提供了包含编码至少一个本发明siRNA分子的核酸序列的表达载体。所述表达载体可编码siRNA双链体的一或两条链，或单条自身杂交成siRNA双链体的自身互补链。编码所述siRNA分子的核酸序列可以允许所述siRNA分子表达的方式可操作地连接(见例如Paul等，2002，Nature Biotechnology 19：505；Miyagishi and Taira，2002，NatureBiotechnology 19：497；Lee等，2002，Nature Biotechnology 19：500；和Novina等，2002，Nature Medicine，online publication June 3)。本文所用术语“可操作地连接”指侧翼序列的排列，其中所述侧翼序列被构型或装配以执行它们通常的功能。因此，可操作地连接于编码序列的侧翼序列可以影响所述编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能指导编码序列的转录时，该编码序列可操作地与所述启动子连接。只要编码序列正确地发挥功能，侧翼序列就不需要与编码序列邻接。因此，例如间插型未翻译的但已转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，并且所述启动子序列仍被认为是“可操作地连接于”所述编码序列。

在另一方面，本发明提供了表达载体，其包含：a)转录起始区(例如真核生物polI、II或III起始区)；b)转录终止区(例如真核生物polI、II或III终止区)；和c)编码至少一个本发明siRNA分子的核酸序列；其中所述序列以允许所述siRNA分子表达和/或递送的方式可操作地连接于所述起始区和所述终止区。所述载体任选包括可操作地连接在编码本发明siRNA的序列的5′侧或3′-侧的蛋白质的开放阅读框架(ORF)；和/或内含子(间插序列)。

所述siRNA分子序列的转录可以源自真核生物RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子。pol II或pol III启动子的转录物在所有细胞都以高水平表达；在已知细胞类型中已知的polII启动子的水平依赖于存在于其旁边的基因调节序列(增强子、沉默基因等等)的性质。也使用原核生物RNA聚合酶启动子，前提是该原核生物RNA聚合酶在合适的细胞中表达(Elroy-Stein and Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6743-7；Gao and Huang 1993，Nucleic Acids Res.21：2867-72；Lieber等，1993，Methods Enzymol.217：47-66；Zhou等，1990，Mol.Cell.Biol.10：4529-37)。多个研究者已经阐述了从这些启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中发挥功能(例如Kashani-Sabet等，1992，Antisense Res.Dev.2：3-15；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10802-6；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.20：4581-9；Yu等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6340-4；L′Huillier等，1992，EMBO J.11：4411-8；Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A90：8000-4；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.23：2259；Sullenger and Cech，1993，Science 262：1566)。更具体地，转录单元如源自编码U6小核(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的那些，可用于在细胞中产生高浓度的所需RNA分子如siRNA(Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.23：2259；Couture等，1996，TIG 12：510；Noonberg等，1994，Nucleic Acid Res.22：2830；Noonberg等，美国专利5,624,803；Good等，1997，Gene Ther.b45；Beigelman等，国际PCT公开号WO 96/18736。上述siRNA转录单元可被掺入多种引入哺乳动物细胞的载体中，包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺伴随病毒载体)、或病毒RNA载体(如逆转录病毒或甲病毒载体；综述见Couture等，1996，TIG 12：510)。

在另一具体实施方案中，本发明以允许本发明siRNA分子表达的方式提供了包含编码至少一个所述siRNA分子的核酸序列的表达载体。在具体的具体实施方案中，所述表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；和c)编码所述siRNA分子的至少一条链的核酸序列；其中所述序列以允许所述siRNA分子表达和/或递送的方式可操作地连接于所述起始区和所述终止区。

在另一具体实施方案中，所述表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)开放阅读框架；和d)编码siRNA分子的至少一条链的核酸序列；其中所述序列可操作地连接到所述开放阅读框架的3′-末端；并且其中所述序列以允许所述siRNA分子表达和/或递送的方式可操作地连接于所述起始区、所述开放阅读框架和所述终止区。

在另一具体实施方案中，所述表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；和d)编码至少一个siRNA分子的核酸序列；其中所述序列以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接于所述起始区、所述内含子和所述终止区。

在另一具体实施方案中，所述表达载体包含：a)转录起始区；b)转录终止区；c)内含子；d)开放阅读框架；和e)编码siRNA分子的至少一条链的核酸序列；其中所述序列可操作地连接到所述开放阅读框架的3′-末端；并且其中所述序列以允许所述siRNA分子表达和/或递送的方式可操作地连接于所述起始区、所述内含子、所述开放阅读框架和所述终止区。

在一个具体实施方案中，肿瘤细胞的生长通过使所述肿瘤细胞接触抑制SPARC的siRNA而受抑制。或者，所述肿瘤细胞可在化疗药物以所述肿瘤细胞有抗性的浓度存在时与siRNA接触。作为SPARC抑制剂的siRNA分子实例包括，例如：

AATCC TGT CCA GGT GGA AGT A(SEQ ID NO：1)；

AAGCT CCA CCT GGA CTA CAT C(SEQ ID NO：2)；和

AATGA CAA GTA CAT CGC CCT G.(SEQ ID NO：3)。

在另一具体实施方案中，肿瘤细胞的生长通过使所述肿瘤细胞接触抑制MetAP2/p67的siRNA而受抑制。或者，所述肿瘤细胞可在化疗药物以所述肿瘤细胞有抗性的浓度存在时接触所述siRNA。作为MetAP2/p67抑制剂的siRNA分子实例包括，例如：

AAAGA TCA GCA TTG GAA GAT A(SEQ ID NO：4)；

AAGCA CAT CGA CAA GTT AGA A(SEQ ID NO：5)；和

AAACA GTG CCG ATT GTG AAA G(SEQ ID NO：6)。

在另一具体实施方案中，肿瘤细胞的生长通过使所述肿瘤细胞接触抑制需钙蛋白酶2的siRNA而受抑制。或者，所述肿瘤细胞可在化疗药物以所述肿瘤细胞有抗性的浓度存在时接触所述siRNA。作为需钙蛋白酶2抑制剂的siRNA分子实例包括，例如：

AAGGC ATA CGC CAA GAT CAA C(SEQ ID NO：7)；

AAACT TCT TCC TGA CGA ATC G(SEQ ID NO：8)；和

AAACG CTA TTC AAG ATA TTT A(SEQ ID NO：9)。

在另一具体实施方案中，肿瘤细胞的生长通过使所述肿瘤细胞接触抑制S100A10的siRNA而受抑制。或者，所述肿瘤细胞可在化疗药物以所述肿瘤细胞有抗性的浓度存在时接触所述siRNA。作为S100A10抑制剂的siRNA分子实例包括，例如：

AAATG GAA CAC GCC ATG GAA A(SEQ ID NO：59)；

AAATT CGC TGG GGA TAA AGG C(SEQ ID NO：60)；和

AATAA TGA AGG ACC TGG ACC A(SEQ ID NO：61)。

本发明也提供抑制、推迟或预防肿瘤细胞的生长的方法，该方法包括使所述肿瘤细胞接触一或多种化疗剂与细胞基因的至少一种抑制剂的组合的步骤，其中所述细胞基因是表1所示的基因.优选，所述肿瘤细胞是卵巢癌细胞。化疗剂在本领域已知，其包括例如，顺铂、紫杉醇(paclitaxel)、脱羧铂氨、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、六甲基胺(hexamethylamine)、苯丙氨酸氮芥和蒽环类。

在一个具体实施方案中，表1所示的细胞基因的抑制剂可以是小分子抑制剂。本文所用的术语“小分子”指具有小于大约1500g/Mol的分子量的分子。小分子可以是例如，小的有机分子、肽或肽样分子。举个例子，适合于本发明方法的小分子抑制剂可以是需钙蛋白酶抑制剂，如PD 147631、(25，35)-反-环氧琥珀酰-L-亮氨酰-酰胺基-3-甲基丁烷乙酯((25，35)-trans-epoxysuccinyl-L-leucy-lamido-3-methylbutane ethyl ester)，(E-64-d)、N-乙酰基-亮氨酰基-亮氨酰基-正亮氨酸(ALLN)、N-乙酰基-Leu-Leu-Met-al(ALLM或C₁₉H₃₅N₃O₄S)、或MDL 18270；或MetAP-2抑制剂，如TNP-470(也称为AGM 1470或C₁₉H₂₈ClNO₆)、烟曲霉素(C₂₆H₃₄O₇)、顺-烟曲霉素(见Kwon等，2000，J.Antibiot.53：799-806)、fumagalone(见Zhou等，2003，J.Med.Chem.46：3452-3454)、或ovalicin(C₁₆H₂₄O₄)。也见Han等，2000，Bioorganic & Medicinal Chem.Letters 10：39-43。

在一个具体实施方案中，表1所示的细胞基因的抑制剂可以是如上所限定的抑制剂。可用抑制剂的任何组合，例如表1所示的具体基因的多重(multiple)抑制剂、每种抑制一或多种具体基因的抑制剂组合、或抑制表1所示多种基因的抑制剂、或其任意组合。

在具体的具体实施方案中，本发明方法包含使肿瘤细胞接触MetAP2的抑制剂和基于铂的化疗剂的组合的步骤。如果药剂的主要组分是任选与紫杉醇(taxol)或环磷酰胺组合的顺铂或脱羧铂氨，那么化疗剂是“基于铂的化疗剂”。MetAP2的抑制剂可以是，例如烟曲霉素或烟曲霉素的衍生物、或MetAP2 siRNA诸如但不限于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6。

本发明也提供了预测卵巢癌患者的肿瘤是否对化疗有抗性的方法。在这些具体实施方案中，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因如表1所示；(b)检测所述一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在对照样本中的量，其中所述被表达的基因是表1所示的基因；和(c)比较在步骤(a)中测定的被表达的基因或基因产物的量和步骤(b)中被表达的基因或基因产物的检出量，其中如果步骤(a)中的检出量与步骤(b)中的检出量相差达至少20％的因数，那么预测所述患者对化疗有抗性。在一个具体实施方案中，该检出量可以是表1所示基因的mRNA的量或由表1所示基因编码的蛋白质的量。在另一具体实施方案中，所述对照样本是来自有反应的或正常的受试者的生物样本，即对治疗有反应的个体或无癌症如卵巢癌的个体。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。

在一个具体实施方案中，步骤(a)和步骤(b)中被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082的一或多种，并且如果步骤(a)中所述被表达基因的量比步骤(b)中所述被表达基因的量高至少约20％，则预测患者的肿瘤对化疗有抗性。

在具体的具体实施方案中，步骤(a)和步骤(b)中被表达的基因是Vinexinβ，G-CSFR，KLK6，SPARC，HYA22，需钙蛋白酶2，SAPK/Erk1，SRB1，ADAR1，MRPL4，eIF5，eIF2Bε，WDR1，NM23D，锌指蛋白-262 MYM，RNPS1，S100A10，S100A11，或MetAP2的一或多种，并且如果步骤(a)中所述被表达基因的量比步骤(b)中所述被表达基因的量高至少约20％，则预测患者的肿瘤对化疗有抗性。

在另一具体实施方案中，步骤(a)和步骤(b)中被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MPP10，或MT1的一或多种，并且如果步骤(a)中所述被表达基因的量比步骤(b)中所述被表达基因的量低至少约20％、优选约50％，则预测患者的肿瘤对化疗有抗性。

在具体的具体实施方案中，步骤(a)和步骤(b)中被表达的基因是HMT1，eEF1ε，NAIP，RAB22A或MT1的一或多种，并且如果步骤(a)中所述被表达基因的量比步骤(b)中所述被表达基因的量低至少20％、优选50％，则预测患者的肿瘤对化疗有抗性。

因此，如本文所公开，本发明提供了基因表达或基因产物活性的一或多种模式，其包含多种差异(即以较高或较低量)表达的所述基因，或其中由所述基因编码的蛋白质产物在化疗药物抗性卵巢肿瘤细胞中的活性与在正常(即非肿瘤或化学敏感的)细胞中的活性不同。根据本发明方法，用所述差异的基因表达或蛋白质产物活性的模式来检测生物样本、最优选肿瘤样本中的化疗药物抗性细胞，并因此在医生开始与高发病率和死亡率有关的无效疗程之前可用于预测来自个体的肿瘤的药物抗性。

那些本领域一般技术人员应理解在本发明方法的实施中，可评估在患者肿瘤样本中本发明鉴定的一或多种基因的表达。预计本发明鉴定的多种基因中的每一种都会显示在一部分、最优选很大一部分的分离自具体卵巢癌患者的个体肿瘤中用本文公开的方法检测到的差异性基因表达。也希望随显示本发明公开的差异性基因表达的所述被分析基因的数量的增加，用本发明预测方法获得的结果的可信度会增加。

在一个具体实施方案中，本发明方法可用于在实际上用化疗剂治疗病人之前筛选需要化疗的所述病人。因此，本发明方法可用于筛选患者，从而使护理者确定是否用具体化疗剂治疗该患者会无效。根据本发明方法预测为对化疗无抗性的患者是用化疗和/或表1所示基因的抑制剂治疗的候选者。根据本发明方法预测对化疗有抗性的患者可以是手术及其他和/或化疗联合表1所示基因的抑制剂、或其他治疗方法的候选者。

在本发明方法的实施中，检测基因表达可通过检测编码本发明鉴定的任何基因的mRNA在生物样本中表达的量，例如通过杂交分析如Northern印迹或斑点印迹，或通过扩增方法如聚合酶链式反应(PCR)，更优选与mRNA到cDNA的逆转录(RT-PCR)结合，甚更优选用本领域已知的方法作定量实时RT-PCR，这些在本文都具体作了描述。其它方法包括检测所述一或多种基因的蛋白质产物的量，在非限制性实施例中通过用蛋白质特异性抗血清、更优选对本发明鉴定的任何具体基因特异的抗体、更优选单克隆抗体来分析生物样本。蛋白质表达水平也可通过分析生物样本中所述蛋白质产物的酶或抗原活性来确定。本发明也提供了基因或抗体阵列来检测基因在化疗药物抗性肿瘤、具体为卵巢和结肠肿瘤中的过表达或不足表达，其中在所述阵列中的核酸探针或抗体的排列在肿瘤样本对化疗药物有抗性的时候产生了可识别的、优选机器可读的模式，和/或在肿瘤样本对化疗药物敏感的时候产生不同的可识别模式。

例如，根据本发明方法，确定在来自患者的生物样本中表达的MetAP2的量，并与在患卵巢癌并对化疗有反应的人或患卵巢癌但不对化疗有反应的人中表达的MetAP2的量作比较。根据本文，如果化疗具有减小肿瘤体积或停止肿瘤生长的作用，那么此人对化疗“有反应”。另外，术语“有反应的患者”意指在手术切除后用化疗治疗并保持没有疾病的临床症状达至少6个月的个体。如果MetAP2在患者中的表达量等于或低于MetAP2在患卵巢癌并对化疗有反应的人中表达的量时，那么预测该患者对某种化疗剂(例如基于铂的化合物)有反应。如果MetAP2在患者中的表达量高于MetAP2在患卵巢癌并对化疗有反应的人中表达的量时，那么预测该患者对化疗剂有抗性。同样，如果MetAP2在患者中的表达量高于MetAP2在患有癌症但不对化疗有反应的人中表达的量时，那么预测该患者对化疗剂有抗性。

如表1及下面的实施例所示，MetAP2在卵巢癌中的表达增加与对基于铂的化疗剂顺铂的抗性增加有关。所以，在一个具体实施方案中，当MetAP2在来自癌症患者的生物样本中表达的测得量高于在有反应个体中检出的预确定量时，本发明方法可预测患者的肿瘤会对基于铂的化疗有抗性。在另一具体实施方案中，当测定的MetAP2在来自癌症患者的生物样本中的表达量等于在有反应个体中检出的预确定量，但其中一或多种基因的表达比在有反应患者中的表达增加，其中所述基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082，和/或一或多种HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10基因的表达相比在有反应患者中的表达降低时，本发明方法可预测患者的肿瘤会对基于铂的化疗有抗性。

本发明还提供监测在卵巢癌患者、具体为接受化疗的卵巢癌患者中的疾病进展的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，KIAA0082，MPP10，HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2或MT1；(b)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(c)比较步骤(a)中被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(b)中被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测被表达的基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于其在步骤(a)中的生物样本中的量的变化来监测疾病进展。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。

如本文所述，当步骤(a)和(b)中被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1或KIAA0082，并且步骤(b)中所述被表达基因或基因产物的检出量高于步骤(a)中所述被表达基因或基因产物的量时，检测到疾病的进展。在某些具体实施方案中，所述患者在检测步骤(a)中的基因表达量与检测步骤(b)中的检出量之间的时期接受化疗或其他治疗。

如本文所述，当步骤(a)和(b)中被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10，并且步骤(b)中所述被表达基因或基因产物的检出量低于步骤(a)中所述被表达基因或基因产物的量时，检测疾病的进展。

在某些具体实施方案中，所述患者在检测步骤(a)中的基因表达量与检测步骤(b)中的检出量之间的时期接受化疗或其他治疗。在某些具体实施方案中，所述检出量可以是表1所示的基因的mRNA的量或表1所示的基因编码的蛋白质的量。

根据本发明监测患者的卵巢癌进展的方法可用于，例如确定患者是否对某种治疗方案，如化疗方案有正或负反应(responding positively ornegatively)。

例如，当S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082在取自开始某治疗方案后患者的生物样本中的表达量与在所述治疗方案开始前或开始时所取的生物样本中所述基因的表达量相比相等或较高时，该患者有负反应。另一实施例中，当HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10在患者开始某治疗方案后取自该患者的生物样本中的表达与所述被表达基因在所述治疗方案开始前或开始时所取的生物样本中的量相比相等或较低时，该患者有负反应。此时，护理者可确定该治疗方案不太有效。

或者，当S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082在患者开始某治疗方案后一段时间取自该患者的生物样本中的表达比所述被表达基因在所述治疗方案开始前或开始时所取的生物样本中的量低时，该患者有正反应，并且不需要改变治疗。另外，当HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10在患者开始某治疗方案后一段时间取自该患者的生物样本中的表达比所述被表达基因在所述治疗方案开始前或开始时所取的生物样本中的量高时，该患者有正反应。

另外，本发明提供监测药物组合物作为治疗患者癌症的药剂的有效性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)将一定量的药物组合物给予所述患者；(c)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(d)比较步骤(a)中所述被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(c)中所述被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测所述被表达的基因或基因产物在随后收集的生物样本中的量相对于其在步骤(a)中的生物样本中的量的变化来监测所述药物组合物的有效性。如果基因表达在用所述药物组合物治疗后收集的生物样本中相比在用所述药物组合物治疗前收集的生物样本中较高或相等，并且在用所述药物组合物治疗过程中肿瘤生长未变慢、推迟或被抑制，所述药物组合物可被认为对于治疗所述患者的癌症是无效的。例如，如果S100A10 mRNA在取自用药物组合物治疗后的患者的样本中的量较高，那么预测该患者对于用该药物组合物进一步治疗是有抗性的。因此，该药物组合物被认为对于所述患者的癌症无效。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。

本发明还提供监测药物组合物作为治疗患者癌症的药剂的有效性的方法，所述方法包含如下步骤：(a)检测一或多种被表达的基因或由其编码的基因产物在取自所述患者的生物样本中的量，其中所述被表达的基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)将一定量的药物组合物给予所述患者；(c)用随后收集自所述患者的生物样本重复步骤(a)；和(d)比较步骤(a)中所述被表达的基因或基因产物的检出量和步骤(c)中所述被表达的基因或基因产物的检出量，其中通过检测所述被表达的基因或基因产物在用所述药物组合物治疗后收集的生物样本中相对于在步骤(a)中用的生物样本(即在用所述药物组合物治疗前)中的量的变化来监测所述药物组合物的有效性。如果一或多种所述基因的基因表达在随后收集的生物样本(即在用所述药物组合物治疗后收集)中相比在之前收集(即在用所述药物组合物治疗前收集)的生物样本中较低或相等，并且在用所述药物组合物治疗中肿瘤生长未变慢、推迟或被抑制，所述药物组合物可被认为对于治疗所述患者的癌症无效，并且预测该患者对于用该药物组合物进一步治疗有抗性。因此，该药物组合物被认为对于该患者的癌症无效。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。

本文所用的“药物组合物”可以是包含化合物的任何配制剂(例如蛋白质、肽、肽模拟物、非肽有机分子、无机小分子、或核酸分子)，所述化合物用于治疗或检测治疗癌症如结肠或卵巢癌的能力。

本发明也提供鉴定抑制肿瘤细胞、具体为化学抗性肿瘤细胞、最具体为化学抗性卵巢癌细胞的生长的化合物的方法。在这些具体实施方案中，所述方法包含如下步骤：(a)使表达在化学抗性卵巢癌细胞中过表达的一或多种基因的细胞接触被试化合物，其中所述基因是S100A10，S100A11，需钙蛋白酶2，SPARC，MetAP2，KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，HSF2，WDR1，Fused toes，NM23D，ADAR1，粒钙蛋白，NBR1，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262 MYM，HYA22，MRPL4，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，FAST激酶，TESK2，SRB1，或KIAA0082；(b)检测所述基因在所述被试化合物存在和缺无时的表达；和(c)比较所述基因在所述化合物存在时的表达和所述基因在所述被试化合物缺无时的表达，其中当所述基因在所述被试化合物存在时的表达相对所述基因在所述被试化合物缺无时的表达降低时，该化合物被鉴定为抑制化学抗性肿瘤细胞生长的化合物。在具体方面，所述生物样本是肿瘤样本。在某些具体实施方案中，所述化合物能在化疗药物存在时抑制肿瘤细胞的生长。

另外，本发明提供了鉴定抑制肿瘤细胞、具体为化学抗性肿瘤细胞、最具体为化学抗性卵巢癌细胞的生长的化合物的方法，所述方法包含如下步骤：(a)使表达在化学抗性卵巢癌细胞中以低于正常的水平表达的一或多种基因的细胞接触被试化合物，其中所述基因是HMT1，NAIP，eEF1ε，RAB22A，NCOR2，MT1或MPP10；(b)检测所述基因在所述被试化合物存在和缺无时的表达；和(c)比较所述基因在所述被试化合物存在时和缺无时的表达，其中当所述基因在所述被试化合物存在时的表达相对所述基因在所述被试化合物缺无时的表达升高时，该化合物被鉴定为抑制化学抗性肿瘤细胞生长的化合物。在一个具体实施方案中，所述化合物能在化疗药物存在时抑制肿瘤细胞的生长。

如下实施例，包括所进行的试验及获得的结果，均仅为举例的目的来提供，并非旨在限制本发明。

实施例

实施例1

MTT细胞增殖分析

利用MTT细胞增殖分析，根据五种卵巢癌细胞系(OVCA 429，OVCA 433，OVCA 432，HEY和HEYA8)对顺铂的敏感性水平来对其进行分级。

使细胞在含5％胎牛血清(FBS，热灭活)，1％抗生素/抗真菌的混合物(Invitrogen)的极限Eagle’s培养基(Minimal Eagle’s Media，MEMα，得自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)中生长。通过将染料溶解于HBSS(Hank’s平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution))、过滤该混合物并在-20℃以1ml等份贮存，来制备MTT母液(5mg/mL；CALBIOCHEM，San Diego，CA)。每9ml培养基使用1ml的MTT母液(总体积10ml)。用不透明的盖覆盖平板来使细胞避光。

将每个细胞系用5，25，50，100和200μM顺铂处理4，8和24小时。在96孔板上用顺铂处理后96小时后进行MTT分析。从所述细胞中取出培养基并将200μl新鲜MTT培养基加入所述细胞以及作对照的空白孔。在正常细胞培养条件温育细胞3-4小时。然后检查细胞的甲月替晶体形成，这是代谢活性的指标。取出培养基并向孔和对照孔加入200μl的2-丙醇。在所有晶体都均匀溶解后，在黑暗中于室温温育所述细胞20分钟。在570nm在微量培养板读数器(reader)上读结果。

图39(上图)显示了在这些研究中使用的5个卵巢癌细胞系暴露于不同浓度的顺铂4小时之后的MTT分析结果。根据每个细胞系在整个顺铂浓度范围及所用的处理时间中的表现，以降低的抗性水平将这些细胞划分等级为OVCA 429＜OVCA 433＜HEYA8＜OVCA 432＜HEY(下图)。

对于具体基因，基本如上述进行包括使细胞暴露于siRNA或药物抑制剂的MTT分析。所述细胞在用0，3.12，6.25，12.5，25，50，100和200μM顺铂处理24小时前预先用siRNAs处理48小时。对于组合型药物处理试验(烟曲霉素或ALLN)，使所述细胞接受浓度增加的所述被试药物及0，3.12，6.25，12.5，25，50，100和200μM顺铂的组合治疗24小时。

实施例2

cDNA微阵列，Northern印迹，和定量实时PCR分析

用实施例1所述的细胞系进行微阵列分析。从每个细胞系收集细胞沉淀物(pellet)，并通过将沉淀物溶解在1ml TRI-Reagent(得自Molecular ResearchCenter，Inc，Cincinnati，OH)或Trizol(Invitrogen)中来从所述细胞分离RNA。然后将样本静置5分钟。通过向样本加入100μl的1-溴-3-氯丙酮(BCP)来完成相分离。振摇15秒后，在室温温育样本15分钟，然后在4-25℃以13,000RCF离心16分钟。用移液管移取上清并置于新的微量离心(microfuge)管中。然后通过将此上清与500μ新鲜异丙酮混合、在室温温育10分钟、再在4-25℃以13,000RCF离心9分钟来沉淀RNA。然后从试管中取出上清，通过向试管加入1ml的75％乙醇、涡旋振荡、再在4-25℃以13,000RCF离心6分钟来洗涤沉淀物。取出液体并空气干燥所述沉淀物约8分钟。所述然后将沉淀物溶解于无RNase的水中并置于冰上待用或贮存于-80℃。

用包含已确认超过5000个序列的cDNA克隆的微阵列(得自ResearchGenetics Inc.)来研究(interrogate)在这些细胞中的基因表达；根据生产者的说明书进行所有的微阵列分析。已知在卵巢组织中表达每个克隆。用在抗性最强的细胞系(OVCA 429)中的基因表达作为在其他所比较细胞系中的基因表达的标准。这些数据的分析表明OVCA 429相对于更敏感的细胞系以升高的水平表达了196个基因并以降低的水平表达了83个基因。

选择满足如下标准的基因作进一步分析：其表达与在双份膜上检出的标准相比有至少2-倍的差异；在4个细胞系中的3个检出其相对于标准(OVCA429)的差异表达；和其表达水平与每个细胞系对顺铂的敏感性一致。过表达的基因在OVCA429细胞中表达很高，并且表达通常递减(tapered off)直到在抗性最弱的细胞系HEY中达到了最低的表达水平(对于在OVCA 429细胞中以较低水平表达的基因反之亦然)。

将与在其它细胞系中的情况相比在抗性最强的细胞系(OVCA 429)中差异表达(较高或较低的水平)的基因的Northern印迹分析和定量实时PCR分析用于确认微阵列的数据并鉴定目的基因来作进一步分析。所鉴定出的基因列于表2，表中显示了基因名称，在细胞系中的表达模式的总结，及显示表达分析结果的图。

表2

*GeneCard是在Rehovot，以色列的Weizmann Institute of Science的注册商标，并且在任何时候可以做多次转让。

Northern印迹分析

为确认微阵列分析鉴定的表达模式，根据生产商的说明书，用NorthernMax Protocol(Ambion Corp.，Austin，TX)来进行Northern印迹分析，且DNA探针用Strip-EZ DNA标记试剂盒(Ambion)来标记。

定量实时PCR

合成cDNA是通过将1μg从卵巢癌细胞系分离的总细胞RNA，1μl oligodT和水混合至最终体积12μl，在70℃温育此混合物10分钟，然后向该混合物加入5μl 2X Reaction Mix，2μl DTT，和1μl的Superscript II Enzyme(Invitrogen)。然后在42℃温育此反应混合物60分钟。制备从1∶4到1∶256的cDNA稀释物。用Qiagen QuantiTect SYBR Green PCR Handbook(QiagenCorp.，Valencia，CA)制备终体积为50μl/孔的主混合物(master mixes)。对于平板所用的每个孔，将25μl 2X QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen)，0.3μM正向引物，0.3μM反向引物，和无RNase的水加至终体积45μl。

将每个基因的主混合物充分混合，并将合适的体积如下分散到PCR试管或平板中：无模板(对照)＝45μl主基因混合物+5μl H₂O；缓冲液空白＝25μl H₂O+25μl SYBR混合物；及被试样本＝45μl主基因混合物+5μl cDNA(如上稀释)。

用ABI Prism 7700(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)序列检测系统或MJ Research(Waltham，MA)Opticon II系统如下确定序列：在95℃进行PCR起始活化步骤15分钟；将样本在94℃变性15秒，在53℃退火30秒(使用Opticon II系统时是55℃)，并在72℃延伸30秒(在此步骤获得数据)；重复此PCR反应50个循环。通过加入如下步骤：95℃15秒，60℃20秒，和95℃20秒来进行解链曲线分析。

另外，从得自化学敏感的(即有反应的)和化学抗性的(即无反应的)卵巢癌患者的组织样本制备RNA，所述患者已经用基于铂的化疗剂治疗过。通过在1ml TRI-Reagent或Trizol中匀浆化50-100mg组织样本直至该组织液化来分离RNA。然后将所述样本静置5分钟。通过向该样本加入100μl BCP来完成相分离。振摇15秒后，在室温温育样本15分钟，再在4-25℃以13,000xg(相对离心力，RCF)离心9分钟。用移液管取出上清并置于新的微量离心管。然后通过将此上清与500μl新鲜异丙酮混合、在室温温育20分钟、再在4-25℃以13,000RCF离心9分钟来沉淀RNA。然后从试管中取出上清，通过向试管加入1ml的75％乙醇、涡旋振荡、再在4-25℃以13,000RCF离心6分钟来洗涤沉淀物。取出液体并空气干燥所述沉淀物约8分钟。然后将该沉淀物溶解于无RNase的水中并置于冰上待用或贮存于-80℃。

用针对表3所示基因的引物进行定量实时PCR来检测化学敏感和化学抗性患者的基因表达改变。用18S RNA的表达来校对被表达基因的值。结果见下表3所示。这些结果证明了用细胞系的RNA进行实验的观察结果。

表3

*此差异反映了在化学抗性患者中的基因表达降低

用下述引物序列通过实时PCR来证实基因表达：

250654(此基因最初用特异的分子信标(beacon)探针来证实，但随后的研究是用SYBR green进行的)

分子信标证实：

信标：FAM-CGCGTATGAACTGGGCTTATGTGACGCG-DABCYL(SEQ ID NO：13)

侧接的正向引物：CTGGGCTCTGCCTTAAACAC(SEQ ID NO：14)

侧接的反向引物：GCTCCCAAAAGTTTGAACCA(SEQ ID NO：15)

内部的正向引物：TTGCCTGAGGCTGTAACTGA(SEQ ID NO：16)

内部的反向引物：GCTCCCAAAAGTTTGAACCA(SEQ ID NO：62)

对于SYBR green：

正向：CCA CTT CTT TGC CAC AAA GT(SEQ ID NO：17)

反向：GAA TTC GGT CAG CTC AGA GT(SEQ ID NO：18)

810612(此基因用特异的分子信标探针来证实)

信标：FAM-CGCCTGGGTGGGTTTGAAGGAGGCG-DABCYL(SEQID NO：19)

侧接的正向引物：ATCGAGTCCCTGATTGCTGT(SEQ ID NO：20)

侧接的反向引物：GCCTGCATGAGGTGGTTAGT(SEQ ID NO：21)

内部正向引物：CTTGCCATGACTCCTTCCTC(SEQ ID NO：22)

内部反向引物：GCCTGCATGAGGTGGTTAGT(SEQ ID NO：63)

39093

正向：GCA GAA GCA CAT CGA CAA GT(SEQ ID NO：23)

反向：GCC TGC ATT TAA TCC ATT CTC(SEQ ID NO：24)

882511

正向：TAA CCA CGT CCT GCT GAA GT(SEQ ID NO：25)

反向：GCT TTA AGA AAG TTC TTA TCA AC(SEQ ID NO：26)

950367

正向：GCA CAG CGG AGT GGT AAG A(SEQ ID NO：27)

反向：CAG AGG AGT CAG ACA CAT TG(SEQ ID NO：28)

34140

正向：GTA TAC TTA CTT CAG TGC TGT T(SEQ ID NO：29)

反向：CAT TCT TGC TAT AAC GTT TAA CA(SEQ ID NO：30)

726147

正向：CTC TGT GAC TTC GGC ATC A(SEQ ID NO：31)

反向：CAG ACA TCA GAG CGG ACA T(SEQ ID NO：32)

427980

正向：AAG AAC TGG GTT CAG TGG AAA(SEQ ID NO：33)

反向：GAG AGT GCA TGG TCT TGA GT(SEQ ID NO：34)

123980

正向：AGC CAC CAG CTA AGT ACC TT(SEQ ID NO：35)

反向：CAT CGA TTT CAA CCG GAA CAA(SEQ ID NO：36)

824568

正向：GTG TGT GGA CCT CCA TGT TA(SEQ ID NO：37)

反向：AGC ACA CCA TTA CAG ACA AGT(SEQ ID NO：38)

1636620

正向：GGA ACC AGT TTC TGC AGG AA(SEQ ID NO：39)

反向：CTC CAG CAG CAC CTC AAT G(SEQ ID NO：40)

809639

正向：ATC CAA GGT TAT GTG GTT TCT T(SEQ ID NO：41)

反向：CAC CTC CTG GGC TTC TGA A(SEQ ID NO：42)

756687

正向：GAT CCA TGA AGC TAA TGT ACA A(SEQ ID NO：43)

反向：ACG GGC AGA AGC CTT CGT T(SEQ ID NO：44)

845441

正向：CCT GAG GTT CTC CGA GAT G(SEQ ID NO：45)

反向：TCC AGC CCG AAA TTC TCT GT(SEQ ID NO：46)

68605

正向：CAA GAG GCG GAA GGG TAA A(SEQ ID NO：47)

反向1：CAG CCG CTC GGG TAG GT(SEQ ID NO：48)

反向2：CAC TAT GGA AGG ACC TTG CT(SEQ ID NO：49)

838636

正向：GGA TAC AGG TGT AGG TAA ATC(SEQ ID NO：50)

反向：TCC CAG ATT AGG AAT TTA TGT A(SEQ ID NO：51)

345077

正向：CTT CTG GAA CAG GCG AAG A(SEQ ID NO：52)

反向1：GCT GGC CCA GAC GAC GAA(SEQ ID NO：53)

反向2：GCA GAC ACA CGT GGA TGG T(SEQ ID NO：54)

825214

正向：GAT GAA GTT AAA TCC TCC TTT G(SEQ ID NO：55)

反向：CCT CTT CTG TGC TGT CAC TT(SEQ ID NO：56)

297392

正向：CCT GCA AGA AGA GCT GCT G(SEQ ID NO：57)

反向：CAC AGC TGT CCT GGC ATC A(SEQ ID NO：58)

897594

正向：AGC ACC AGC ACT GGC TCA TCAA(SEQ ID NO 109)

反向：AGA GCC AGA AGA GCT GCT A(SEQ ID NO 110)

713886

正向：AAC CGA CAA GTG TGA CAA CT(SEQ ID NO 111)’

反向：TGT GCC TTG CGG GCA GTA(SEQ ID NO 112)

884867

正向：C ACC ACC ACC ACC AAA TGA A(SEQ ID NO 113)

反向：CA TCC ATT CGA CGC CTT TGA(SEQ ID NO 114)

321247

正向：CCA GCA GCA CAG TCA ACA AA(SEQ ID NO 115)

反向：TGG TAG CTT CTG CTT CAC AA(SEQ ID NO 116)

1630998

正向：CCA GAG CTG CAC TCA TTC C(SEQ ID NO 117)

反向：CAC TGT TGG TGA TAA AGC AAT T(SEQ ID NO 118)

756595

正向：GGA TAA AGG CTA CTT AAC AAA G(SEQ ID NO 119)

反向：CCA CTT TGC CAT CTC TAC AC(SEQ ID NO 120)

549728

正向：GAG CCG AGG AGG TTG AAA G(SEQ ID NO 121)

反向：CTC CTC TGG GTC TAT AGT GT(SEQ ID NO 122)

203003

正向：GAC CCT GGT GGC GGT GAA(SEQ ID NO 123)

反向：GGT GCC TGC AGC ATC TTC A(SEQ ID NO 124)

814731

正向：GGA GAG CCC TGG CAC GTA(SEQ ID NO 125)

反向：CCT TCA TCT GCA GGT TCT TG(SEQ ID NO 126)

714196

正向：ACG ACG GAC ACA TTA ATT ACT(SEQ ID NO 127)

反向：TCC ATG CTG CAG CTG ATG A(SEQ ID NO 128)

809784

正向：C CTT CGG CAA AGG GAG AGT(SEQ ID NO 128)

反向：CTG GAT GAG TTC AGA GAG TTT(SEQ ID NO 130)

825293

正向：GCC TCG ACA GGC AGA GAT(SEQ ID NO 131)

反向：CTT GTA GCT GAA GAT GTC AAT(SEQ ID NO 132)

246120

正向：CTC TAT GCC CGG GAC AAG T(SEQ ID NO 133)

反向：AAG ACA TGT CGA AGC CAT ACA(SEQ ID NO 134)’

在对顺铂有抗性的卵巢癌细胞中上调或下调的基因的总结

编码EF-手性(Hand)蛋白质的基因：

鉴定五个编码钙-活化性EF-手性蛋白质的基因，即S100A10，S100A11，SPARC，需钙蛋白酶2和粒钙蛋白。四个基因中的两个，S100A10和S100A11的位置在第1条染色体的1q21彼此毗连(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78；Ridinger等，1998，Biochimica et Biophysica Acta 1448：254-263)。第1条染色体的此区域已经被报道为卵巢癌中染色体重排的温床(hotbed)之一(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78)。S100A10和S100A11的确切生物学功能未知。S100A10和S100A11都在抗性较强的卵巢癌细胞系中以较高水平表达(分别见图1和图2)。图3显示S100A10和S100A11的mRNA在对化疗抗性较强的患者中相对于对化疗反应性较强的患者中也是升高的。

SPARC(也称为骨粘连蛋白和BM40)是分泌型蛋白质(Lane and Sage，1994，FASEB J.8：163-173)。已经显示SPARC在患肿瘤的卵巢(neoplasticovaries)的基质中是高表达的(Paley等，2000，Gynecologic Oncology78：336-341)，并会诱导卵巢癌细胞的凋亡(Yiu等，2001，Am.J.Pathol.159：609-622)。然而，已经在黑素瘤(Ledda等，1997，J.Invest.Dermatol.108：210-214)和结肠直肠癌(Porte等，1995，Int.J.Cancer 64：70-5)中检出SPARC的高水平，还已经报道它在前列腺癌(Thomas等，2000，Clin.CancerRes.6：1140-9)和成胶质细胞瘤(Golembieski等，1999，Int.J.Dev.Neurosci.17：463-72)中促进细胞的迁移和侵入。SPARC的过表达也有助于乳腺癌细胞的移动性和侵入性增强(Briggs等，2002，Oncogene 21：7077-91)。如本文所示，发现SPARC在化学抗性较强的卵巢癌细胞系中以较高水平表达(图4)。如图5所示，SPARC mRNA在取自肿瘤复发的患者的样本中也是升高的。

需钙蛋白酶2是钙-活化性蛋白酶。近来报道需钙蛋白酶2活性的抑制剂诱导了在人急性成淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤以及实体肿瘤细胞中的凋亡(Huang and Wang，2001，TRENDS in Molecular Medicine 7：355)。需钙蛋白酶2mRNA的水平在化学抗性较强的卵巢癌细胞系中是升高的(图6)。

粒钙蛋白是近来描述的Ca²⁺-结合型蛋白质，其属于EF-手性蛋白质的五(penta)-EF-手性亚家族，并经Ca²⁺结合易位到膜(Lollike等，2001，J.Biol.Chem.276：17762-9)。发现与对用顺铂处理反应性较强的细胞系相比，粒钙蛋白mRNA在对顺铂抗性较强的细胞系中是升高的(图7)。

编码参与蛋白质翻译和翻译控制的蛋白质的基因：

MetAP2：蛋氨酸氨基肽酶2(也称为eIF-2相关的p67)的表达从未与卵巢癌有关。此基因编码的蛋白质似乎具有两种功能。它从新合成的蛋白质除去了第一个蛋氨酸(Li and Chang，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.227：152-9)，并且它也与真核生物起始因子2(eIF-2；GTP结合蛋白质)相关并抑制其磷酸化(Wu等，1993，J.Biol.Chem.268：10796-10801)。用针对MetAP2的抗体，显示MetAP2表达在抗性最强的细胞系OVCA 429中是升高的并且在Hey(对顺铂最敏感的细胞系；见图8)中是下调的。并且，在检查组织样本中的MetAP2 mRNA表达时，所述样本来自对基于顺铂的化疗具有不同抗性水平的三名患者，显示出相对于对化疗具有中等(CAP2；图9)和低(CAP1；图9)水平抗性的患者，MetAP2在来自抗性最强的患者(CAP3；图9)的样本中升高得最多。特异性靶向MetAP2的药物TNP-470现在是临床试验中对于多种人类肿瘤的血管生成抑制剂(Kruger and Figg，2000，Expert Opin.Investig.Drugs 9：1383-96)。并且，用反义寡核苷酸降低MetAP2的细胞水平已经显示诱导凋亡(Datta and Datta，1999，Exp.Cell Res.246：376-83)。这些观察结果提示此蛋白质可以是卵巢癌疗法的重要靶标。

eIF5是起GTPase-活化剂蛋白质作用的翻译起始和蛋白质合成的另一种中心(central)蛋白质(Paulin等，2001，Current Biol.11：55-9；Das等，2001，J.Bio.Chem.276：6720-6)。检出两种转录物且它们的表达水平在对顺铂抗性水平最强的卵巢癌细胞系(图10)和抗性较强的患者(图11)中都是升高的。

eIF2Bε的mRNA在显示对顺铂抗性最强的卵巢癌细胞系中上调(图12)。由此基因编码的蛋白质是由5个亚单位组成(comprised of)的鸟苷酸交换因子复合物的调节性ε-亚单元(Proud，2001，Prog.Mol.Subcell.Biol.26：95-114)。

eEF1εmRNA在显示了对顺铂的最高抗性水平的卵巢癌细胞系中下调(图13)。eEFs涉及多肽装配(Browne and Proud，2002，Eur.J.Biochem.269：5360-8)。

激酶：

SAPK/Erk激酶1是活化JNK1，JNK2和p38但不活化Erk1或Erk2的双特异性激酶(Cuenda，2000，Int.J.Biochem.Cell Biol.32：581-7)。目前未发现此基因及其蛋白质至今都不与卵巢癌有关。发现此基因的mRNA水平在抗性较强的细胞系中相对于较敏感的细胞系中是升高的(图14)。

TESK2：此丝氨酸/苏氨酸激酶主要位于细胞核。然而它在未活化时易位到胞质。TESK2特异性磷酸化肌动蛋白丝切蛋白(cofilin)(在Ser-3)，肌动蛋白丝切蛋白是与肌动蛋白解聚因子一起通过刺激肌动蛋白纤丝的解聚和切割(severance)在肌动蛋白纤丝的快速转换(turnover)和基于肌动蛋白的再组织中起主要作用的蛋白质(Toshima，2001，J.Biol.Chem.276：31449-58)。以前没有报道过TESK2与卵巢癌的联系。TESK2 mRNA在抗性较强的细胞系中升高(图15)。

FAST激酶：这是Fas-活化的丝氨酸/苏氨酸激酶，它被认为与Fas介导的凋亡有关(Tian等，1995，J.Exp.Med.182：865-74)。FAST激酶mRNA在化学抗性较强的细胞系中升高(图16)。

其他：

KLK6：这是也称作酶和甘油磷酸钙的丝氨酸蛋白酶。此基因属于人激肽释放酶(kallilrein)基因家族，该家族也包括了解得较多的分子，如前列腺特异性基因(PSA)，该基因已经被用作前列腺癌的标记物并且也作为卵巢癌的标记物被研究过(Diamandis，2000，Clinical Biochem.33：579-83)。已经报道在患卵巢癌的患者中KLK6的血清水平相对于正常对照升高(Diamandis，2000，Clinical Biochem.33：579-83)。此基因的表达水平在化学抗性较强的被试细胞系中升高(图17)。也应注意到此基因位于在卵巢癌中通常发生染色体重排的另一区域(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78)。

HMT1(也称作PRMT1)：此基因编码蛋白质精氨酸N-甲基转移酶，发现其两种变体的表达在乳腺癌中下调(Scorlis等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.278：349-59)。HMT1的表达在对顺铂抗性较强的细胞中下调(见图18)。有趣的是注意到HMT1位于第19条染色体19q13.3上与编码KLK6残基的基因相同的染色体区域。

ARA9(也称作芳香烃受体相互作用蛋白质(AIP)和XAP2)据认为在AHR-介导的信号传导中起作用(Kazlauskas等，2002，J.Biol.Chem.277：11795-801)。此基因的mRNA在对顺铂抗性较强的细胞系中升高(图19)。它也位于与卵巢癌相关的、染色体重排频率升高的另一个区域，即第11条染色体(在11q13.3)(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78)。

钙调理蛋白2已经在肌上皮癌中但未在卵巢癌中被研究过(Mosunjac等，2000，Diagn.Cytophathol.23：151-5)。相对于较敏感的卵巢癌细胞系中的情况，钙调理蛋白2的表达在对顺铂抗性较强的细胞系中轻微升高(图20)。

神经元凋亡抑制性蛋白质(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)据发现在对顺铂抗性最强的细胞系中轻微下调(图21)。NAIP从未与卵巢癌有联系(Tamm等，2000，Clin.Cancer Res.6：1796-1803)。

RNA结合性蛋白质S1(RNPS1)是前信使mRNA剪接的常用活化剂并可形成参与促进凋亡的ASAP及SART3肿瘤抵抗抗原(tumor rejection antigen)的复合体(Schwerk等，2003，Mol.Cell Biol.23：2981-90；Harada等，2001，Int.J.Cancer 93：623-8)。据发现其水平在对顺铂有抗性的细胞系中升高(图22)。

热休克转录因子2(HSF2)调节热休克蛋白质基因的表达(Mathew等，1998，Mol.Cell Biol.18：5091-8)。HSF2也显示能够与蛋白磷酸酶2A(PP2A)的催化亚单元竞争结合其调节亚单元PR65，并被认为作为新的PP2A调节蛋白质(Hong等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.272：84-9)。HSF2的mRNA水平在抗性较强的细胞系中升高(图23)。

WDR1：WD-重复蛋白质发现于所有真核生物中，并在调节广泛的细胞功能包括信号转导、转录和增殖中起重要作用(Li等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.274：117-23)。然而，WDR1的确切功能未知。此基因的mRNA在抗性较强的细胞系中相对较敏感的细胞系升高(图24)。

Ft1：此基因的开放阅读框架显示了与遍在蛋白结合酶的相似性，且在小鼠中它的位置与Rb-相关的p130基因邻近(Lesche等，1997，Mamm.Genome8：879-83)。从细胞遗传学角度，Ft1位于第16条染色体的区域16q12.2，此区域在人类癌症中反复发生改变。已经报道了在卵巢癌中此染色体区域出现了杂合性的丢失。Ft1 mRNA的水平在对顺铂抗性较强的细胞系中升高(图25)。

NME4(也称作nm23-h4)是在肾细胞癌中中度过表达并且在结肠直肠癌中高度过表达的二磷酸核苷激酶(Hayer等，2001，Anticancer Res.21：2821-5)。NME4 mRNA在抗性较强的细胞系中升高(图26)。

ADAR1：包括ADAR1腺苷脱氨酶所编辑的腺苷到肌苷(adenosine-to-inosine)RNA导致旁路剪接位点产生或密码子改变，从而导致蛋白质的功能改变(Wang等，2000，Science 290：1765)。有意思的是还注意到ADAR1基因位于第1条染色体的1q21.1-q21.2上与S100A10和S100A11相同的频繁重排的染色体区域中(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78)。ADAR1mRNA在对顺铂抗性较强的细胞系中升高(图27)。

NBR1：NBR1的确切分子功能未知。(那些本领域技术人员会认识到在本发明方法中基因的有用性不依赖于基因的具体或确切概念或功能特征)。作图研究显示NBR1基因与BRCA1基因头对头(Whitehouse等，2002，Eur.J.Biochem.269：538-45)。NBR1未报道与卵巢癌相关。NBR1 mRNA在顺铂抗性最强的细胞系OVCA 429中升高(图28)。

锌指蛋白262/MYM：编码包含MYM锌结合基序的蛋白质的基因家族的成员(Smedley等，1999，Genomics 60：244-7)。此蛋白质从未与卵巢癌相关；然而，与其他被试的细胞系中的情况相比，此基因的mRNA在化学抗性最强的细胞系中升高(图29)。

MRPL4：此基因及其蛋白质从未与卵巢癌相关。然而，此基因位于在卵巢癌中频繁重排的染色体区域，第19条染色体的19p13.2(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78)。MRPL4mRNA在化学抗性细胞系中升高(图30)。

HYA22：此基因及其蛋白质从未与卵巢癌相关。然而，此基因位于在卵巢癌中与染色体重排有关的区域，第3条染色体的3p21.3(Pejovic，1995，Ann.Med.27：73-78；Protopopov等，2003，Cancer Res.63：404-12；Senchenko等，2003，Oncogene 22：2984-92)。HYA22 mRNA在对顺铂抗性较强的细胞系中相对较敏感的细胞系升高(图31)。

Vinexinβ：也称作SCAM-1，此基因编码衔接蛋白质，该蛋白质属于也包括Vinexinβ、CAP/Ponsin和ArgBP2的蛋白质家族(Kioka等，2002，CellStructure and Function 27：1-7)。现有技术不知道Vinexin与卵巢癌有联系。VinexinβmRNA在化学抗性细胞系中升高(图32)。

G-CSFR：粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)差不多在原发的卵巢癌中广泛表达。然而，在只有一半的研究的病例中发现其配体G-CSF表达在相同细胞中，这表明存在自分泌系统(Savarese等，2001，Cancer Letters162：105-15)。在另外三分之一的病例研究中，发现G-CSF全部在基质中，这表明可能存在旁分泌系统，其中间充质细胞可向表达所述受体的癌性细胞提供配体(Savarese等，2001，Cancer Letters 162：105-15)。原先的回顾性评估显示仅表达旁分泌环(loop)的患者的总体存活与卵巢癌表达自分泌轴(axis)的患者的情况相比较差(Savarese等，2001，Cancer Letters 162：105-15)。G-CSF及其受体也可以在正常卵巢和一些良性卵巢肿瘤中共同表达。G-CSFR mRNA在化学抗性细胞系中升高(图33)。

SRB1：也称作CLA-1，此基因编码了识别带负电荷的脂质体和凋亡细胞的受体。已经报道肿瘤细胞参与了凋亡细胞和小体的摄入和去除(Fukasawa等，1996，Exp.Cell Res.222：246-50)。对这些观察结果的生物显著性了解得不多。从未披露过SRB1的表达和卵巢癌之间的联系。SRB1 mRNA在化学抗性细胞系中升高(图34)。

IGFBP-7：IGF结合蛋白质的最近鉴定的成员，此蛋白质以相对低的亲和力结合IGF-I和IGF-II(Oh，1998，Breast Cancer Res.Treat.47：283-93)。IGFBP-7mRNA在化学抗性细胞系中升高(图35)。

RAB22A属于Ras蛋白质的RAB亚家族(Kauppi等，2002，J.Cell Science115：899-911)。RAB22A mRNA在化学抗性细胞系中降低并在对顺铂反应性较强的细胞系中升高(图36)。

KIAA0082：KIAA0082是没有公开信息的全长基因。此基因的mRNA表达在对顺铂有抗性的细胞系中升高(图37)。

NCOR2：这是与SMRT紧密相关的共抑制蛋白质，其带有对甲状腺激素受体特异的相互作用结构域(Jepsen and Rosenfeld，2002，J.Cell Science115：689-98)。此基因的mRNA表达在化学抗性细胞系中的水平相对于对顺铂敏感的细胞系中的水平降低(图38)。

MT1：金属硫蛋白1L(MT1)的精确生理功能未知，但以前的研究已经报道MT水平在对顺铂有抗性的人类卵巢癌细胞中升高(Andrews and Howell，1990，Cancer Cells 2：35-43)并且用MT基因转染的细胞变成对顺铂有抗性(Nakano等，2003，Anticancer Res.23：299-304)。据认为MT对于将顺铂螯合在胞质中、从而增强细胞对所述药物产生抗性的能力有作用(Nakano等，2003，Anticancer Res.23：299-304)。矛盾的是，MT1 mRNA的水平显示在对顺铂最敏感的细胞(Hey)中显著升高(图51)。

MPP10：M期磷蛋白(MPP10)大多数是胞浆(is mostly cytoplasmic)蛋白质，但它可以被分泌并且是人类U3核仁小核糖核蛋白的组分。此蛋白质的大部分与核仁纤维蛋白(fibrillarin)共定位(Baserga等，1997，Nucleic AcidsSymp.Ser.36：64-7)并涉及rRNA的加工。从未有报道此基因或其产物与卵巢癌相关。MPP10表达水平随对顺铂的敏感性增加而增加(图52)。

实施例3

SPARC作为治疗靶标的体外试验

SPARC在顺铂抗性最强的细胞系(OVCA 429)中的表达水平相对在其他被试细胞系中的表达水平而言是最高的(图4)。本领域已知此蛋白质是调节粘附(adhesion)并能够在促进肿瘤发展和侵入性的组织重构和血管生成中起重要作用的钙-结合糖蛋白(Ledda等，1997，J.Invest.Dermatol.108：210-214)。

检测在取自肿瘤大部切除术(cyto-reductive surgery)前的个体及术后9个月患者肿瘤已经复发时的人腹水样本中SPARC的表达(图5；观察到由于差异性聚腺苷酸化而出现(arise)SPARC的两种转录物；Ledda等，1997，J.Invest.Dermatol.108：210-214)。术后SPARC的表达水平显著升高并与此患者的预后差相关。此观察结果也与其他组研究其他形式的实体癌的发现一致(Golembieski等，1999，Int.J.Dev.Neurosci.17：463-72；Briggs等，2002，Oncogene 21：7077-91；Huang and Wang，2001，TRENDS in Molecular Medicine7：355；Lollike等，2001，J.Biol.Chem.276：17762-9)，这表明升高的SPARC表达可以是化疗成功和疾病在除卵巢癌外的其他类型的实体癌中的发展的预测物(predictive)。

为了测试是否降低在抗性最强的卵巢癌细胞系OVCA 429中的SPARC蛋白质表达水平会降低其对顺铂的抗性的能力，设计三种针对SPARC信使不同区域的siRNAs。所用的SPARC siRNA是：

#1靶序列：AATCC TGT CCA GGT GGA AGT A(SEQ ID NO：1)；

#2靶序列：AAGCT CCA CCT GGA CTA CAT C(SEQ ID NO：2)；和

#3靶序列：AATGA CAA GTA CAT CGC CCT G(SEQ ID NO：3)。

本发明描述的siRNA试验用siPORT Lipid方案(Ambion)来进行。在转染前24小时将细胞接种(plate)在含10％FBS的MEM∝培养基中，所以细胞在进行试验时30-70％满底(confluent)。用无FBS或抗生素的培养基制备siPORT和siRNA复合物。对于siPORT，对于6孔板以每孔4微升或对于96孔板以每孔0.5微升加入培养基，通过涡旋振荡混合，并在室温温育25分钟。对于siRNA，使用在培养基中稀释的1-25nM(常使用12.5nM)浓度的siRNA。将所述siPORT加入所述siRNA混合物，并在室温温育20分钟。在用无血清培养基洗涤细胞后，将所述细胞加入平板(使用96孔板时，以密度4.5x10⁴接种细胞；使用6孔板时，以密度1-5x10⁵接种细胞)。将siPORT/siRNA复合物加到每个平板/孔并轻柔摇动(rock)平板来使复合物分散在细胞表面。在于正常细胞培养条件温育4小时后，将另外含10％FBS的培养基加入所述细胞。48小时后，提取总RNA。

根据生产者的说明书(Ambion)用所述siRNA构建体转染细胞。对于6-孔板，用12.5nM siRNA/孔来转染。在1∶100的稀释度一式两份读取siRNA的OD₂₆₀读数。将所述读数取均数，然后乘以稀释系数然后乘以40(OD₂₆₀为1等于40μg/ml的RNA)来得到siRNA的μg/ml最终浓度。将该数字除以14(在1nmole平均为21mer的dsRNA中的RNA的μg数)来得到siRNA的μM最终浓度，然后转变为浓度用nM表示。

这些研究的结果见图48所示。所有三种siRNAs降低这些细胞中的SPARC mRNA水平。仅用siPORT或仅用siRNA#2有义链处理细胞不显示任何SPARC mRNA表达的显著降低。然而，包括所有三种siRNAs的组合处理却有一些效果(图48)。

也研究了在SPARC siRNAs存在时OVCA 429细胞对顺铂有抗性的能力。所述细胞仅用siPORT处理或仅用siRNA#2有义链或完整的siRNA#2转染。让所述细胞在转染后恢复(recover)48小时，然后用浓度增加的顺铂或作为对照的相应浓度的DMSO进行处理。使所述细胞暴露于所述药物24小时，之后去除所述药物，并让所述细胞再恢复72小时。用MTT分析来评估此处理对细胞生存力的影响。结果见图49所示；图50显示了在定量对所述细胞的影响后的结果。所述数据提示在暴露于顺铂前用完整的siRNA#2处理所述细胞可使它们的抗性水平减半(仅用siPORT或有义链处理的对照的IC₅₀～25-50μM到在用siRNA#2处理后IC₅₀为～12.5μM)。

这些试验的结果表明SPARC是卵巢癌的治疗性靶标及标记物。

实施例4

MetAP2/p67作为治疗靶标的体外实验

MetAP-2/p67是双功能蛋白质，其两种功能对细胞生长都重要(Li andChang，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.227：152-9；Wu等，1993，J.Biol.Chem.268：10796-10801)。在一种功能中，所述蛋白质结合真核生物起始因子2(eIF-2)并抑制其磷酸化，而在另一种功能中它的C-末端结构域具有催化多种细胞蛋白质的N-末端蛋氨酸水解的酶活性(Wu等，1993，J.Biol.Chem.268：10796-10801)。eIF-2的磷酸化改变了它的翻译库(repertoire)，这允许在不同的磷酸化状态翻译不同的信使。另外，蛋氨酸氨肽酶活性通常对于蛋白质功能是重要的，且不去除N-末端蛋氨酸常导致蛋白质失活(Li and Chang，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.227：152-9)。

来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的烟曲霉素与其合成的同系物TNP-470共价结合并抑制MetAP-2但不是紧密相关的MetAP-1的蛋氨酸氨肽酶活性(Griffith等，2998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：15183-8)。意识到用烟曲霉素处理多种不同细胞类型导致MetAP-2表达升高也是重要的(Wang等，2000，J.Cell.Biochem.77：465-73)；据认为该细胞通过升高其表达水平来适应MetAP-2功能丧失。

本文描述的试验提示OVCA 429比对顺铂最敏感的细胞系Hey多表达了大约7倍的MetAP-2(图8)。Northern印迹分析也证明在临床上MetAP-2的表达水平对于基于顺铂的化疗抗性较强的患者而言也是升高的。图9显示MetAP-2 mRNA在抗性最强的患者(CAP3)中的水平比抗性最弱的患者(CAP1)中的水平高大约3倍。针对基于顺铂的化疗具有中等抗性水平的患者也表现出中等的MetAP-2 mRNA水平。

进行基于MTT的分析，其中用单独的烟曲霉素、用单独的顺铂以及用不同浓度的顺铂和烟曲霉素的组合处理OVCA 429细胞达4，8和24小时。所述结果见图40、41和42所示。图40(上图)显示了浓度增加的烟曲霉素对OVCA 429细胞存活的作用。观察到一些细胞死亡，但多达80％的所述细胞甚至在很高的烟曲霉素浓度存活。用单独的顺铂处理所述细胞(下图)使IC₅₀为大约100μM顺铂。除了顺铂水平升高之外0.1μg/ml烟曲霉素的存在使IC₅₀降低至大约50μM。然而，在10μg/ml烟曲霉素存在时用顺铂处理细胞使所述细胞的存活增强，IC₅₀达大约200μM。

不考虑温育时间的长度，顺铂在0.1μg/ml烟曲霉素存在时作用增强，但在10μg/ml烟曲霉素存在时用顺铂处理所述细胞时作用相反(图41和42)。这些观察结果提示在烟曲霉素的低水平达到了有利的平衡，并且所述药物与顺铂的协同作用导致了更多细胞的死亡。

设计靶向MetAP-2信使的不同区域的三种siRNAs(图43)，来确定抑制MetAP-2表达的效果。MetAp-2 siRNAs是：

#1靶序列：AAAGA TCA GCA TTG GAA GAT A(SEQ ID NO：4)

#2靶序列：AAGCA CAT CGA CAA GTT AGA A(SEQ ID NO：5)

#3靶序列：AAACA GTG CCG ATT GTG AAA G(SEQ ID NO：6)

图44显示了siRNA#1对于OVCA429中的MetAP-2表达水平的影响。对照细胞用单独的相同siRNA的有义链转染或用转染剂(siPort脂质)处理。即使转染有效性并不是100％，用siRNA#1转染所述细胞也会使MetAP-2表达水平减半。对于GAPDH在那些细胞中的表达水平几乎观察不到影响，这表明基因表达通常不受这些处理的影响。另外，用siRNAs#2和#3处理所述细胞不会使MetAP-2表达降低。

当阻断MetAP-2的表达时，通过用siRNA#1、单独的有义链#1、或单独的siPort脂质自身来处理OVCA 429细胞来检测OVCA 429对顺铂产生抗性的能力。用所述siRNA温育48小时后，所述细胞暴露于不同浓度的顺铂或对应浓度的溶剂DMSO达24小时。定量此试验的结果并见图45所示。这些结果表明siRNA#1的存在使OVCA 429的IC₅₀从25μM降低到大约3μM。图46显示在进行MTT分析后的96孔板的照片。

总体考虑这些结果表明MetAP-2是治疗干扰卵巢癌的有用靶标。

实施例5

在OVCA 429细胞中需钙蛋白酶2和S100A10作为治疗性靶标及S100A11表达降低的体外试验

549728(需钙蛋白酶2)

用上述方法设计了靶向需钙蛋白酶2信使的不同区域的三种siRNAs。需钙蛋白酶2siRNAs是：

#1AA GGC ATA CGC CAA GAT CAA C(SEQ ID NO：7)；

#2AA ACT TCT TCC TGA CGA ATC G(SEQ ID NO：8)；和

#3AA ACG CTA TTC AAG ATA TTT A(SEQ ID NO：9)。

如上所述将每个siRNA引入OVCA 429细胞。图53显示在OVCA 429细胞中击倒(knockdown)试验的结果。用上述方案，序列#1和#3击倒了基因表达水平的大约50％。另外，用多种浓度的顺铂处理包含siRNA#3的OVCA429细胞。通常OVCA 429细胞的IC₅₀在暴露于所述药物24小时后是大约25μM顺铂。如图54所示，需钙蛋白酶2siRNA#3使IC₅₀降低到3.12μM，从而提高所述细胞对顺铂的敏感度数倍。并且，用浓度升高的需钙蛋白酶抑制剂I(ALLN)在顺铂存在或缺无时处理OVCA 429细胞。如图55所示，在顺铂存在时ALLN使这些细胞的IC₅₀降低到12.5μM。因此对于OVCA 429细胞对顺铂的敏感性，需钙蛋白酶2siRNA#3具有比ALLN强的影响。

756595(S100A10)

针对S100A10信使制备了三种siRNAs：

#1AA ATG GAA CAC GCC ATG GAA A(SEQ ID NO：59)；

#2AA ATT CGC TGG GGA TAA AGG C(SEQ ID NO：60)；和

#3AA TAA TGA AGG ACC TGG ACC A(SEQ ID NO：61)。

如图56所示，siRNA#3将OVCA 429细胞的IC₅₀从25μM降低到6.25μM顺铂，从而提高了所述细胞对顺铂的敏感性。

810612(S100A11)

用上述方法设计了靶向S100A11信使的不同区域的三种siRNAs。所述S100A11 siRNAs是：

#1AA AGG ATG GTT ATA ACT ACA C(SEQ ID NO：10)；

#2AA GAA ACT GGA CAC CAA CAG T(SEQ ID NO：11)；和

#3AA TCT GAT TGG TGG CCT AGC T(SEQ ID NO：12)。

如上所述将每个siRNA引入OVCA 429细胞。图57显示用上述方法siRNAs#1和2分别击倒了OVCA 429细胞中的基因表达水平的达50％和25％。

实施例6

MetAP-2，SPARC，需钙蛋白酶-2，S100A10和S100A11在结肠癌中的表达

从BD Biosciences，Inc.(San Jose，CA)获得结肠cDNAs的可商购的匹配组，它们分离自得自非肿瘤组织及邻近的肿瘤组织的五个个体。

进行定量实时PCR试验来确定MetAP-2，SPARC，S100A10，S100A11和需钙蛋白酶-2在正常结肠组织和肿瘤结肠组织中的表达水平。图58显示了MetAP-2在5对匹配的结肠cDNAs中的表达水平。该数据表明其中两名患者的肿瘤cDNA的表达水平相对于其匹配的非肿瘤cDNA有显著升高(患者B和C；图58)。另一名患者显示肿瘤cDNA相对于它的匹配非肿瘤cDNA仅有轻微的表达升高(患者A；图58)。在OVCA 429中的表达水平被用作参照。以前的报道显示了人类结肠癌的肝转移可以通过MetAP-2抑制剂TNP-470来预防(Tanaka等，1995，Cancer Res.55：836-9)。

图59显示相对于它们的匹配非肿瘤cDNA而言，SPARC mRNA的表达水平在5个匹配肿瘤样本中的4个升高。图60显示在所有匹配肿瘤样本中，S100A11 mRNA的表达水平相对于它们的匹配非肿瘤cDNA升高。图61显示在5个匹配肿瘤样本中的4个中，S100A10 mRNA的表达水平相对于它们的匹配非肿瘤cDNA升高。图62显示在所有匹配肿瘤样本中，需钙蛋白酶-2mRNA的表达水平相对于它们的匹配非肿瘤cDNA升高。

总体考虑这些观察结果显示MetAP-2以及SPARC，S100A11，S100A10和需钙蛋白酶-2是结肠癌患者的治疗靶标。

实施例7

检测血清中分泌型蛋白的夹心ELISA

用针对目的基因产物的抗体包被96孔微滴板的孔。等份的经纯化的重组靶基因产物被连续稀释，并用于产生定量用的标准曲线。然后将等份的患者血清加到每个孔中。盖住平板以使蒸发最小化并在4℃温育几小时过夜。将抗原取出并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述孔3次。将300μl的封闭溶液(PBS的3％w/v鱼胶溶液(fish gel solution))加入每个孔并在室温温育2小时。取出封闭溶液并用PBS洗涤所述孔3次。然后将与辣根过氧化物酶偶联的合适抗体加入每个孔(每孔100μl)并在室温温育1-2小时。取出所述抗体并用NP-40溶液(PBS中的0.05％v/v NP-40)洗涤所述孔3次。结合的检测通过在室温向每个孔加入ABTS(Rockland Immunochemicals)(每孔100μl)30分钟，并用微量培养板读数器在405nm读取吸光度来进行的。如果使用碱性磷酸酶偶联物(alkaline phosphate conjugate)而不是过氧化物酶，那么用pNPP (Rockland Immunochemicals)而不是ABTS来检测结合。

一旦根据用纯化蛋白质产生的标准曲线确定了检出限，就对一些不患癌症的受试者和一些被诊断患有癌症或良性疾病的患者进行检验，来确定具体所需基因产物的预测浓度范围。癌症患者的预测范围决定该范围可用于鉴别患卵巢癌的患者或患复发疾病的患者或将他们与相应的患者或无癌症的健康受试者相区分。

实施例8

siRNA-介导的基因表达“敲除”：

根据如上述的方案，检验对多种基因特异的siRNAs在卵巢癌细胞系中降低(或“击倒”)它们分别的基因的能力。在每项试验中，相对于与被试siRNAGC-含量匹配的对照(非特异性)siRNA(来自Dharmacon，Inc，Lafayette，CO)检验几种siRNA。有些试验中，也包括阴性对照(无处理)。表达被击倒的水平随siRNA不同而变化。所述具体基因及针对每个具体基因的siRNA序列见下：

1.制备了针对SAPK/Erk1的两种siRNAs(L36870)：

L36870(726147)

#1靶序列(SEQ ID NO：64)：AAA TGG GAC GAG GAG CTT ATG(始于编码序列的320bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：65)：AAG CGC ATC ACG ACA AGG ATA(始于编码序列的831bp处)

这两个序列均成功降低了SAPK的表达，#2序列使mRNA水平降低了60％。

2.制备了针对eEF1ε的三种siRNAs(BC005291)：

BC005291(306921)

#1靶序列(SEQ ID NO：66)：AAC AGG ATT GAC TAC TAT AGC(始于编码序列的123bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：67)：AAT ACA GGG TCA CTC AAG TAG(始于编码序列的227bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：68)：AAA TAT CTT AAT GTG TCT CGC(始于编码序列的412bp处)

#1和#2靶序列成功降低了eEF1ε的表达，#1序列使mRNA水平降低了65％。

3.制备了针对G-CSFR的三种siRNAs(M59818)：

M59818(809639)

#1靶序列(SEQ ID NO：69)：AAG TGT GAG CTG CGC CAC AAG(始于编码序列的793bp处)。

#2靶序列(SEQ ID NO：70)：AAG AGC CCC CTT ACC CAC TAC(始于编码序列的1666bp处)。

#3靶序列(SEQ ID NO：71)：AAC AGG AAG AAT CCC CTC TGG(始于编码序列的1957bp处)。

#1和#3靶序列降低了G-CSFR的表达水平，#1序列使mRNA水平降低了53％。

4.制备了针对ARA9/XAP2的三种siRNAs(U31913)：

U31913(814731)

#1靶序列(SEQ ID NO：72)：AAA CGT GTG ATA CAG GAA GGC(始于编码序列的48bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：73)：AAC AAG TAC GAC GAC AAC GTC(始于编码序列的775bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：74)：AAC GTC AAG GCC TAC TTC AAG(始于编码序列的790bp处)

#2和#3靶序列使得ARA9表达降低，#3序列使mRNA水平降低了50％。

5.制备了针对RNPS1的三种siRNAs(AF015608)：

AF015608(897594)

#1靶序列(SEQ ID NO：75)：AAT ATT CAT ACG GCA TGG ACT(始于编码序列的327bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：76)：AAC CTA AAA TAG AAG ACC CCT(始于编码序列的680bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：77)：AAA AGA TGC TGA CTC AGA AAA(始于编码序列的752bp处)

所有三个序列均成功降低了RNPS1的表达，#1序列使mRNA水平降低了35％。

6.制备了针对Fused toes的三种siRNAs(BC001134)：

BC001134(321247)

#1靶序列(SEQ ID NO：78)：AAC CTA AAA TAG AAG ACC CCT(始于编码序列的680bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：79)：AAG ACC CCT ATG CAA TTA GCT(始于编码序列的692bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：80)：AAA AAG CCT GAA GAA CAG CAC(始于编码序列的769bp处)

所有三个序列均成功降低了Fused toes的表达，#2序列使mRNA水平降低了43％。

7.制备了针对粒钙蛋白的三种siRNAs(BC005214)：

BC005214(34140)

#1靶序列(SEQ ID NO：81)：AAA TGG GAT TTA ATG CAT TCA(始于编码序列的323bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：82)：AAC TTC ATG ACT GTT GAT CAA(始于编码序列的379bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：83)：AAC ATC ATG AGT TGC GTC AAG(始于编码序列的419bp处)

所有三个序列均成功降低了粒钙蛋白的表达，#2序列使mRNA水平降低了83％。

8.制备了针对SRB1/CLA1/CD3611的三种siRNAs(BC022087)：

BC022087(756687)

#1靶序列(SEQ ID NO：84)：AAG CAG CAG GTC CTT AAG AAC(始于编码序列的109bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：85)：AAT CTC ATC AAC AAG TAC TTT(始于编码序列的565bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：86)：AAT TCA GAA CGT CAG CAC CTG(始于编码序列的981bp处)

#1和#3靶序列使得SRB1表达降低，#1序列使mRNA水平降低了60％。

9.制备了针对KIAA0082的三种siRNAs(BC031890)：

BC031890(825293)

#1靶序列(SEQ ID NO：87)：AAG AGG AGA ACT GAC CCA GAA(始于编码序列的4bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：88)：AAA TGA GCG ATT GGA TGG TGG(始于编码序列的509bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：89)：AAG ATC ATC AAG GGC TCC AGT(始于编码序列的2164bp处)

#1序列使mRNA水平降低了65％。#2和#3序列对mRNA水平无作用。

10.制备了针对eIF2Bε的三种siRNAs(BC013590)：

BC013590(1630998)

#1靶序列(SEQ ID NO：90)：AAT GTG GTT CGA ATA ATT ACA(始于编码序列的352bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：91)：AAA CTC GAG ATG ACT TTG TGC(始于编码序列的800bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：92)：AAT CAA CAG CTG CAG AGG TTC(始于编码序列的2098bp处)

#1序列使mRNA水平降低了57％，#2序列使mRNA水平降低了54％，而#3序列使mRNA水平降低了43％。

11.制备了针对钙调理蛋白2的三种siRNAs(D83735)：

D83735(713886)

#1靶序列(SEQ ID NO：93)：AAG GAT GGA ACT ATC TTA TGC(始于编码序列的163bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：94)：AAT TTC GAC GAT GCC ACC ATG(始于编码序列的457bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：95)：AAC CGA CAA GTG TGA CAA CTC(始于编码序列的708bp处)

所有三个序列均使基因表达水平降低，#3序列使mRNA水平降低了75％。

12.制备了针对HYA22的三种siRNAs(D88153)：

D88153(123980)

#1靶序列(SEQ ID NO：96)：AAA GAA ATG TGT GGT CAT TGA(始于编码序列的507bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：97)：AAA TCG ATG GAA CTA TAC ATC(始于编码序列的596bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：98)：AAC TAT ACA TCA GGT GTA TGT(始于编码序列的606bp处)

所有三个序列均使基因表达水平降低，#3序列使mRNA水平降低了60％。

13.制备了针对CA 125的三种siRNAs(BC009808)：

BC009808(CA 125)

#1靶序列(SEQ ID NO：99)：AAT GGT TTC ACC CAT CAG AGC(始于编码序列的235bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：100)：AAG GGC TCA GCT ACA TTC AAC(始于编码序列的2203bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：101)：AAT ACA ACG TCC AGC AAC AGT(始于编码序列的3380bp处)

#3序列使mRNA水平降低了50％。

14.制备了针对HMT1的两个siRNAs(AF222689)并在Hey细胞中进行试验：

AF222689

#1靶序列(SEQ ID NO：102)：AAC TCC ATG TTT CAT AAAC CGG(始于编码序列的202bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：103)：AAC GTG TAT GGC TTC GAC ATG(始于编码序列的619bp处)

两个序列成功降低了HMT1mRNA的表达，#1序列降低了大约70％而#2序列仅降低了刚超过60％。

15.制备了针对MPP10的三种siRNAs(X98494)并在Hey细胞中进行试验：

X98494

#1靶序列(SEQ ID NO：104)：AAG TTC CAG AAA TCT GAA ATA(始于编码序列的357bp处)

#2靶序列(SEQ ID NO：105)：AAG AAA ATC CAG AAC ATG TAG(始于编码序列的1043bp处)

#3靶序列(SEQ ID NO：106)：AAA ACA GTA GCT TCG GAG AAG始于编码序列的1414bp处)

所有三个序列均降低了mRNA的表达，#1序列降低了将近90％，而#2和#3序列分别降低了大约30％和40％。

16.制备了针对IGFBP-7的两个siRNAs(BC017201)并在OVCA 429中进行试验。

BC017201

#1靶序列：AAG GTA AAA AGG GGT CAC TAT(始于编码序列的583bp处).(SEQ ID NO.107)

#2靶序列：AAA GGG GTC ACT ATG GAG TTC(始于编码序列的590bp处).(SEQ ID NO.108)

与对照相比，仅#1序列使mRNA水平降低了大约60％。

17.制备了针对NM23-D的一个siRNA(BC004880)并在OVCA 429细胞中进行试验：

BC004880(203003)

#3靶序列AAT GTC ATC CAC GCC AGC GAC(始于自第一个ATG起的442bp处)(SEQ ID NO 135)

与对照相比，仅#3序列使mRNA水平降低了大约50％。

18.制备了针对WDR1的三种siRNA(AB010427)并在OVCA 429细胞中进行试验：

AB010427

#1靶序列：AAT GGA AAG TGC GTC ATC CTA(始于自第一个ATG起的106bp处)(SEQ ID NO 136)

#2靶序列：AAG TTC ACA ATT GGC GAC CAC(始于自第一个ATG起的544bp)(SEQ ID NO 137)

#3靶序列：AAG TGC TTC AGC ATC GAC AAC(始于自第一个ATG起的1309bp)(SEQ ID NO 138)

与对照相比所有的靶序列都降低了mRNA水平，#1降低了大约85％，#2降低了大约75％而#3降低了大约70％。

19.制备了针对Vinexinβ的一种siRNA(AF037261)并在OVCA 429细胞中进行试验：

AF037261

#2靶序列：AAG AGT TAC CTA GAA GCA CCT(SEQ ID NO 139)

#1和#3靶序列与对照相比不降低mRNA的水平，但与对照相比#2使mRNA降低了大约50％。

20.制备了针对KLK6的三种siRNA(BC015525)并在OVCA 429细胞中进行试验：

BC015525

#1靶序列：AAAAAA CCG AAT CTT CAG GTC(SEQ ID NO 140)

#2靶序列：AAACTC TCT GAA CTC ATC CAG(SEQ ID NO 141)

#3靶序列：AAC TGG ATC CAA AAA ACC ATT(SEQ ID NO 142)

#1靶序列与对照相比没有降低mRNA水平，但与对照相比#2使mRNA降低了大约42％而#3使mRNA降低了大约55％。

21.制备了针对eIF5的一种siRNA(U49436)并在OVCA 429细胞中进行试验：

U49436

#1mRNA靶序列：AAT GAC CGT TAC ATT GTC AAT(SEQ ID NO 143)

#2和#3靶序列与对照相比不降低mRNA的水平，但与对照相比#1使mRNA降低了大约59％。

22.制备了针对锌指蛋白262/MYM的一个siRNA(AB007885)并在OVCA 429细胞中进行试验：

AB007885

#3靶序列：AAA ATA TGG GAA CCT ACA ATA(始于自第一个ATG起的3058bp处)(SEQ ID NO 144)

#1和#2靶序列与对照相比不降低mRNA的水平，但与对照相比#3使mRNA降低了大约45％。

实施例9

已被证实的基因的体外功能试验：

具体siRNAs增强OVCA429和OVCAR-3细胞对顺铂的敏感性的能力，基本如上面实施例3-5所述来进行检测。在每个例子中，对顺铂的敏感性都在特异性siRNAs存在时增强，但不在非特异性(对照)siRNA存在时或在阴性对照(未处理)中增强。此数据表明被试基因可以在功能上与卵巢癌细胞系产生对顺铂的抗性有关。结果汇总见表4。

表4：体外顺铂敏感性试验

实施例10

体内试验：

用OVCAR-3细胞和裸鼠开发如下方案来检测肿瘤生长：OVCAR-3细胞(15百万/注射)接种到裸鼠上臂区下(under upper arm region)。25天后出现可见肿块。在接种后大约35天测定所述肿瘤，然后要么将动物用4μg/kg体重的顺铂通过IP注射一周3次、持续2周进行治疗，之后1周不进行处理，要么仅用作为对照的生理盐水溶液来处理。图63显示肿瘤体积为两只小鼠体重的函数。此数据表明，在无任何化疗时，肿瘤在仍有肿瘤的对照动物中持续生长(小鼠#1)。接受顺铂处理的动物与此相比，显示出肿瘤尺寸的稳定化(小鼠#2)。也显示了顺铂治疗前后的肿瘤照片。

用表达针对本发明所鉴定基因(MetAP-2，SPARC，S100A10，S100A11和需钙蛋白酶-2)的siRNAs的稳定细胞系重复此方案。已经开发了表达需钙蛋白酶2或S100A11的siRNAs的稳定OVCAR-3细胞系，以及表达针对绿色荧光蛋白(GFP，细胞生长-无关的标记蛋白)的稳定siRNA的对照OVCAR-3细胞系；通过实时定量PCR测定的需钙蛋白酶2和S100A11的表达及siRNA表达的影响见图64所示。十五只小鼠被分成五只一组的三组。第一组作为对照来处理，被注射无siRNA表达的OVCAR-3细胞，第二组被注射表达siRNA的OVCAR-3细胞，而第三组被注射表达GFP-特异性siRNA的OVCAR-3细胞。在可测定的肿瘤变得明显后，对照组接受了生理盐水注射，而第二和第三组接受了标准的顺铂处理。如上所述，可观察到肿瘤生长是体重的函数。

另一个实验中，分成五只一组的十五只小鼠接种了未掺杂(即未重组的)的OVCAR-3细胞，并允许肿瘤生长。第一组作为对照来处理。在可测定的肿瘤变得明显后，对照组接受了生理盐水注射，第二组如上述接受了标准的顺铂处理，第三组接受了与TNP-470(临床可识别的烟曲霉素衍生物)联合的标准顺铂处理。如上所述，可观察到肿瘤生长是体重的函数。

实施例中公开的信息可汇总如下：

表5

*：所有其表达在药物抗性的肿瘤细胞中升高的基因(KLK6，ARA9，钙调理蛋白2，RNPS1，eIF5，eIF2Bε，WDR1，Fused toes，NM23D，粒钙蛋白，SAPK/Erk1，锌指蛋白-262MYM，HYA22，Vinexinβ，G-CSFR，IGFBP-7，SRB1，或KIAA0082)都在OVCAR-3或OVCA 429细胞中进行试验，并且所有其表达在抗性最强的肿瘤细胞中降低的基因(MPP10，HMT1，NAIP，EEF1E，RAB22A，NCOR2，或MT1)都在Hey细胞中进行试验。

应该认识到前面的说明书着重公开了本发明的某些具体具体实施方案，对其所做的等同改变或替换都是在所附权利要求书所述的精神和范围内。