TWI301066B - Methods for predicting and overcoming resistance to chemotherapy in ovarian cancer and for predicting colon cancer occurrence - Google Patents

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Description

1301066 九、發明說明： 相關專利之交叉參考資料 本申請案係關於及主張2〇〇3年12月31曰申請之美國臨時 專利申請案第_33,5〇5號之優先權，該案之揭示以 方式併入本文中。 、 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於用以預測_巢癌患者之腫瘤是否對化療抗 性之方法及用幻夬定一個體病患是否有大腸癌的方法:、： 發明亦關於用以監測對於治療印巢癌的病患之治療的有效 性之方法。本發明更關於用以治療卵巢癌及大腸癌之； 法。此外，本發明係關於用以篩選可以抑制膜瘤細胞，尤 其是印巢癌或大腸癌細胞的生長之化合物的方法。本發明 亦關於用《降低或抑制對於化療藥物治療或療法抗 法，特別是於對習見化療處理法有抗性的卵巢癌細胞中。 【先前技術】 印巢癌為具有60%死亡率之最致命的婦科惡性腫瘤。此 疾病於不同臨床階段之五年存活率為如下：第一期， 第二期=80% ’第三期養及第四期=1 〇% ;於此疾病的晚 期存活率㈣著的下降。對此疾病後期之照護標準治療包 括減積手術（cytoreductive surgery)接著化療。 對於大部分患者，有低存活概率’因為所有病患之大約 75%於疾病的第三及四期被診斷出，及不良預後與於其後 期時疾病的過遲診斷有關。對於現在可行的化療藥劑之抗 性為另-個主要問題。雖然於開始治療後在75%病患中達 98729.doc 1301066 到完全臨床反應，大部分將逐漸產生復發疾病及需要再治 療。不幸的是，絕大多數將終於逐漸產生化學抗性及屈服 於此疾病。 化學抗性為一種複雜的現象，其包含數種基因及基因產 物在表現及生物活性之改變。可使用不同地表現於反應的 及不反應的個體之基因或基因家族作為分子標記來預測何 者病患可能對特定化學療法藥劑或其組合有抗性，如同臨 床上典型使用。此外，於化學抗性的個體中過量表現的基 口可為抑制的目標，其可能降低癌細胞對化療試劑的抗性。 如同具有卵巢癌，當疾病於早期被診斷時，具有結腸直 腸癌的病患之存活率為最佳。若將癌症早期偵測出，大腸 癌病患的5年存活率大約為9()%;不幸的是，雖然增加的檢 查及預防措施，僅有37%癌症於此早期發現。當癌症已區 域地展開至包含其他器冑，存活率降低至大約“％，在癌 症已轉移後，其劇烈地降低（8%)(Caneer以咖_以咖 2〇〇2; American Cancer Society publication) 〇 囚此’有需要於疾病過程 癌’且特別需要鑑定為化學抗性的癌症。更明確而言， 為技藝中已知癌細胞的行為，關於其腫瘤生成能 (t_rigenieity)及其對化療藥物的抗性兩者係由尚 :楚的特定基因組合之表現居間作用，技藝中有需要笋 =卵巢癌化學抗性之有效分子標記之基因及集合或基 =门以及提供印巢癌及大腸癌臨床上有效治療目標之 矢員基因或基因組合。 98729.doc 1301066 【發明内容】 本發明提供方法及試劑以鑑定基因涉及(或其表現受其 °或’、中_ & 5周控的表現有關於或負責）對化療藥物治 療之抗性。特別是，本發明提供與化療藥物治療之抗性有 關的基因（或其表現受如此調控，或其中該受調控的表現有 關或負貝化療藥物治療之抗性），以及多個基因之受調控基 因表現模式，其中該模式為化療藥物抗性細胞之特性，特 別是藥物抗性印巢癌細胞。本發明更提供方法用以鑑定與 一或多個該基因交互作用或影響其表現或活性之化合物。 同時提供的是該化合物，其有用於作為用以治療卵巢癌之 化療藥劑之另一選擇或結合使用，特別是對已變成或為對 習見化療處理有抗性的癌症。本發明更提供用以監測化療 處理之方法及試劑以鑑定病患的腫瘤為或已變成對化療藥 劑有抗性。 本發明提供方法以鑑定降低化療藥物抗性及抑制、延遲 或避免對化療試劑有抗性之腫瘤細胞（最佳的是卵巢癌細 胞）生長之化合物，此方法包含步驟有··（勾使在化療藥物存 在中生長的化療藥物抗性細胞與測試化合物接觸一段時間 或於一濃度，其中細胞對藥物有抗性及其中細胞表現於化 學抗性卵巢癌細胞中過量表現之至少一種基因，其中過量 表現的基因為S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、 SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合 的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAIU、Grancalcin、NBR1、 98729.doc 1301066 SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 ΜγΜ、hya22、MRpL4、 Vinexinp、G-CSFR、IGFBp_7、FAST激酶、tesk2、srbi 或KIAA0082(如由表i中提出的基因庫登錄號確認）；（b)分 析該細胞在有或無測試化合物存在中一或多種該基因或基 因產物之表現或活性；及/或⑷比較在有或無測試化合物存 在中細胞生長及/或至少一種基因或基因產物之表現或活 性，其中若在測試化合物存在中基因或基因產物之表現或 活性相對於在無測試化合物中基因表現降低，或若在化合 物存在中細胞生長受抑制，或兩者，將化合物鑑定為抑制 化學抗性腫瘤細胞生長之化合物。於某些具體實施例中， 藉由分析生物樣品，尤其是利用一系列對本文中確認的多 種基因產物專一的核酸（基因）探針或抗體，偵測基因表現。 再者，本發明提供方法以鑑定降低藥物抗性及抑制、延 遲或避免對化療試劑有抗性之腫瘤細胞（最佳的是卵巢癌 細胞）生長之化合物，此方法包含步驟有··（a)使在化療藥物 存在中生長的化療藥物抗性細胞與測試化合物接觸一段時 間或於一濃度，其中細胞對藥物有抗性及其中相較於測試 化合物細胞表現於化學抗性卵巢癌細胞中以少於正常量表 現的基因’其中基因為HMT1、NAIP、eEFU、RABUA、 NCOR2、MT1或MPP10(如由表！中提出的基因庫登錄號確 認）；（b)分析該細胞在有或無測試化合物存在中之細胞生長 及/或基因表現或基因產物活性；及（c)比較在有或無測試化 合物存在中基因表現或基因產物活性，其中若⑴在測試化 合物存在中基因表現或基因產物活性相對於在無測試化合 98729.doc 1301066 物中基因表現或基因產物活性增加，及/或（π)若在化合物存 在中細胞生長受抑制，或（iii)若細胞生長受抑制同時基因的 表現及/或活性增加，將化合物鑑定為抑制化學抗性腫瘤細 胞生長之化合物。於某些具體實施例中，藉由分析生物樣 品，尤其是利用一系列對本文中確認的多種基因產物專一 的核酸（基因）探針或抗體，偵測基因表現。 本發明提供方法以降低藥物抗性，或抑制、延遲或避免 腫瘤細胞之生長，或兩者，其包含步驟有：使腫瘤細胞與 細胞基因的至少一種抑制劑接觸，其中細胞基因為 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、 NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指 狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin 冷、 G-CSFR、IGFBP-7、FAST 激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082 在化療藥物存在中一段時間或以一濃度，其中細胞在不存 在細胞基因抑制劑時對藥物有抗性。於較佳具體實施例 ‘中，腫瘤細胞為人類腫瘤細胞，及更佳的是為卵巢癌細胞。 於特別的觀點中，將根據本發明確認的一或多個基因用專 門設計來鎖定一或多種該基因之反意義RNA或siRNA分子 來抑制。於其他的觀點中，將該基因的基因產物利用此等 蛋白質之抑制劑來抑制。 本發明提供用以降低腫瘤細胞之藥物抗性的方法，包含 步驟有使腫瘤細胞與至少一種化合物接觸，其增加細胞基 98729.doc 1301066 因的表現或活性，其中細胞基因為HMTl、ΝΑΙΡ、eEFls、 RAB22A、NCOR2、MT1或MPP10，在化療藥物存在或不存 在一段時間或以一濃度，其中在不存在增加HMT1、NAIP、 eEFls、RAB22A、NCOR2、MT1 或 MPP10之表現或活性的 化合物時細胞對藥物有抗性。於較佳具體實施例中，腫瘤 細胞為人類腫瘤細胞，及更佳的是為卵巢癌細胞。 本發明也提供用以抑制、延遲或避免腫瘤細胞生長之方 法，包含步驟有使腫瘤細胞與至少一種化合物接觸，其增 加細胞基因的表現或活性，其中細胞基因為HMT1、NAIP、 eEFls、RAB22A、NCOR2、MT1或 MPP10，在化療藥物存 在或不存在一段時間或以一濃度，其中在存在增加HMT1、 NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2、MT1 或 MPP10之表現或 活性的化合物時與不存在該化合物時細胞增殖相較，細胞 增殖減緩或受抑制。於較佳具體實施例中，腫瘤細胞為人 類腫瘤細胞，及更佳的是為卵巢癌細胞。 於另一個觀點中，本發明提供用以抑制、延遲或避免腫 瘤細胞（最佳的是卵巢癌細胞）生長之方法，方法包含步驟有 使腫瘤細胞與化療藥物及細胞基因的至少一種抑制劑之組 合接觸，其中細胞基因為S100A10、S100A11、鈣活化酶 (Calpain)2、SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結 合蛋白（Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、WDR1、融合 的腳趾（Fused toes)、NM23D、Grancalcin、SAPK/Erkl、鋅 指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、Vinexin β、G-CSFR、 IGFBP-7、或KIAA0082。於特別的觀點中，細胞基因為 98729.doc -10- 1301066
MetAP2，化療藥物為以鉑為基礎，及至少一種抑制劑為煙 曲黴素（fumagillin)或煙曲黴素的衍生物。於另一個特別的 觀點中，細胞基因為鈣活化酶（Calpain)2，化療藥物為以鉑 為基礎，及至少一種抑制劑為N-乙醯基-白胺醯基-白胺醯 基-正白胺酸（ALLN，N-acetyMeucyMeucyl-norleucinal)或 其衍生物。示於表1中的細胞基因之抑制劑可為例如專門設 計來鎖定示於表1中的基因之siRNA分子或shRNA分子，或 小分子抑制劑。 於另一個觀點中，本發明提供用以抑制、延遲或避免腫 瘤細胞（最佳的是卵巢癌細胞）生長之方法，方法包含步驟有 使腫瘤細胞與化療藥物及增加細胞基因的表現或活性之至 少一種化合物之組合接觸，其中細胞基因為HMT1、NAIP、 eEFls、RAB22A、NCOR2、MT1 或 MPP10。於較佳具體實 施例中，腫瘤細胞為人類腫瘤細胞，及更佳的是為卵巢癌 細胞。 本發明也提供用以預測卵巢癌患者的腫瘤是否將對化療 處理有抗性之方法，包含步驟有：（a)於取自患者的生物樣 品中偵測一或多個表現的基因或由此編碼的基因產物之 量，其中表現的基因為S100A10、S100A11、鈣活化酶 (Calpain)2、SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結 合蛋白（Calponin)2、RNPS卜 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、 融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、Grancalcin、 NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、 MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、 98729.doc -11 - 1301066 SRB1或KIAA0082 ; (b)於包含有非腫瘤組織樣品之控制組 樣品（最佳的是來自腫瘤起源的組織）中偵測一或多個表現 的基因或由此編碼的基因產物之量，相當於在子部件（a)中 偵測的一或多個表現的基因或基因產物，其中表現的基因 為 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、 MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、 RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、 鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、 G-CSFR、IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082 ; 及（c)比較於步驟（a)中測量的表現的基因或基因產物之量 與於步驟（b)中偵測的表現的基因或基因產物之量，其中若 於步驟（a)中偵測的量比步驟（b)中偵測的量大至少20%，則 預測患者將對化療有抗性。於特別的觀點中，生物樣品為 腫瘤樣品。於特別的觀點中，控制組樣品為取自對化療有 反應的癌症病患之生物樣品。於某些具體實施例中，藉由 分析生物樣品，尤其是利用一系列對本文中確認的多種基 因產物專一的核酸（基因）探針或抗體，偵測基因表現。 於特別的觀點中，當表現於來自癌症患者的生物樣品中 的MetAP2之測量量大於有反應的個體或於來自無卵巢癌 的個體之卵巢組織中偵測的量，本方法預測患者將對以鉑 為基礎的化療有抗性。 本發明也提供用以預測卵巢癌患者的腫瘤是否將對化療 處理有抗性之方法，包含步驟有：（a)於取自患者的生物樣 98729.doc -12- 1301066 品中偵測一或多個表現的基因或由此編碼的基因產物之 量，其中表現的基因為HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、 NCOR2、MT1或MPP10 ; (b)於控制組樣品中偵測一或多個 表現的基因或由此編碼的基因產物之量，相當於在子部件 (a)中偵測的一或多個表現的基因或基因產物，其中表現的 基因為 HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2、MT1 或 MPP10 ;及（c)比較於步驟（a)中測量的表現的基因或基因產 物之量與於步驟（b)中偵測的表現的基因或基因產物之量， 其中若於步驟（a)中偵測的量比步驟（b)中偵測的量小至少 20%，更佳至少50%，則預測患者將對化療有抗性。於特別 的觀點中，控制組樣品為取自對化療有反應的癌症病患之 生物樣品。於特別的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。於某 些具體實施例中，藉由分析生物樣品，尤其是利用一系列 對本文中確認的多種基因產物專一的核酸（基因）探針或抗 體’债測基因表現。 本發明更提供用以監測卵巢癌患者的疾病發展之方法， 特別是以化療處理治療的卵巢癌病患，包含步驟有：（a)於 取自患者的生物樣品中债測一或多個表現的基因或由此編 碼的基因產物之量，其中表現的基因為S100A10、 S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、KLK6、 ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、eIF5、 eIF2Bs、HSF2、WDIU、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 ADAR1、Grancalcin、ΝΒΙΠ、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質 _262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、 98729.doc 13- 1301066 FAST激酶、TESK2、SRBwKIAA〇〇82 ;⑻利用取自患者 隨後收集的生物樣品重複步驟0);及（〇)比較於步驟（a)中測 S的表現的基因或基因產物之量與於步驟中偵測的表現 的基因或基因產物之量，其中藉由偵測於隨後收集的生物 樣品中表現的基因或基因產物之量與取自步驟0)中的生物 樣品比較之變化而監測疾病的發展，及當於步驟（b)中偵測 的表現的基因或基因產物之量大於在步驟（a)中偵測的表現 的基因或基因產物之量，藉而偵測到疾病發展。於某些具 體實施例中，病患於步驟（a)中偵測基因表現量及於步驟 中偵測基因表現量之間的時期中接受化療或其他治療。於 特別的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。於較佳具體實施例 中，藉由分析生物樣品，尤其是利用一系列對本文中確認 的多種基因產物專一的核酸（基因）探針或抗體，偵測基因表 現。 本發明更提供用以監測卵巢癌患者的疾病發展之方法， 特別是以化療處理治療的印巢癌病患，包含步驟有：（勾於 取自患者的生物i品中#測一 &多個纟現的基因或由此編 碼的基因產物之量，其中表現的基因為HMT1、NAlp、 eEFls、RAB22A、NC〇R2、Μτι 或 Μρρι〇 ;⑻利用取自患 者隨，收集的生物樣品重複步驟⑷；及⑷比較於步驟（:) 中測S的表現的基因或基因產物之量與於步驟⑻中偵測的 表現的基ID或基因產物之量，其中藉由偵測於隨後收集的 物樣中表現的基因或基因產物之量與取自步驟⑷中的 生物樣品比較之變化而監測疾病的發展，及當於步驟(b)中 98729.doc -14- 1301066 偵測的表現的基因或基因產物之量小於或等於在步驟（a)中 偵測的表現的基因或基因產物之量，藉而偵測到疾病發 展。於某些具體實施例中，病患於步驟（a)中偵測基因表現 量及於步驟（b)中偵測基因表現量之間的時期中接受化療或 其他治療。於特別的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。於某 些具體實施例中，藉由分析生物樣品，尤其是利用一系列 對本文中確認的多種基因產物專一的核酸（基因）探針或抗 體，偵測基因表現。 此外，本發明提供用以監測醫藥組合物作為治療癌症藥 劑的有效性之方法，特別是卵巢或大腸癌於病患中，包含 步驟有：（a)於取自患者的生物樣品中偵測一或多個表現的 基因或由此編碼的基因產物之量，其中表現的基因為 S100A10、S100A1卜鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、 NM23D、ADAR1、Gmncalcin、NBR1、SAPK/Erkl、辞指 狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、 IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082 ; (b)給 予患者適當量之醫藥組合物；（c)利用取自患者隨後收集的 生物樣品重複步驟（a);及（d)比較於步驟（a)中測量的表現的 基因或基因產物之量與於步驟（c)中偵測的表現的基因或基 因產物之量，其中藉由偵測於隨後收集的生物樣品中表現 的基因或基因產物之量與取自步驟（a)中的生物樣品比較之 變化而監測醫藥組合物之有效性，及當於步驟（c)中偵測的 98729.doc -15· 1301066 表現的基因或基因產物之量小於在步驟⑷中横測的表現的 基因或基因產物之量及當醫藥組合物存在時腫瘤的生長減 ^ (即減緩、延遲或抑制），因此醫藥組合物為有效。於特別 的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。於某些具體實施例中， 藉由刀析生物樣品，尤其是利用一系列對本文中確認的多 種基1產物專一的核酸（基因）探針或抗體，侧基因表現。 本毛明也提供用以監測醫藥組合物作為治療癌症藥劑的 有效丨生之方法’特別是卵巢或大腸癌於病患中，包含步驟 有⑷於取自患者的生物樣品中债測一或多個表現的基因 或由此、扁碼的基因產物之量，其中表現的基因為聰丁 1、 eEFls、rAB22a、NC〇R2、;⑻給予 心者適當1之醫藥組合物，·⑷利用取自患者隨後收集的生 物樣品重複步驟⑷；及⑷比較於步驟⑷中測量的表現的基 因或基=產物之量與於步驟⑷中偵測的表現的基因或基因 $物之量’其中藉由偵測於隨後收集的生物樣品中表現的 土因或基因產物之量與取自步驟⑷中的生物樣品比較之變 測醫藥組合物之有效性，及當於步驟⑷⑷ ^因或基因產物之量大於在步驟⑷中價測的表現的基 U或基因產物之量及當醫攀把人 ❿^ a及“ ^α物存在時腫瘤的生長減少 L::、：遲或抑制)，因此醫藥組合物為有效。於特別的 由分析生物=品為㈣樣品。於某些具體實施例中，藉 旯因彦物直…’尤其疋利用一系列對本文中確認的多種 土 ^物專-的核酸（基因）探針或抗體，偵测基因表現。 ♦明也提供偵測大腸癌之方法，包含步驟有：⑷自動 98729.doc -16- 1301066 物（較佳為人類）得到生物樣品；（b)於生物樣品中偵測一或 多個表現的基因或由此編碼的基因產物之量，其中表現的 基因為 S100A10、S100A1卜鈣活化酶（calpain)2、SpARC、 或MetAP2; (c)於包含有非腫瘤大腸組織樣品之控制組樣品 中偵測一或多個表現的基因或由此編碼的基因產物之量； =)比較來自步驟（13)中一或多個表現的基因或基因產物之 量與於步驟（c)中的量，其中若與步驟（c)中的量相較，於步 驟（b)中的畺有差異，偵測到大腸癌。於步驟（心中取得的生 物樣品中與於步驟（c)中取得的生物樣品比較，偵測的差異 可為或夕個該基因之過度表現，或可為一或多個該基因 之缺乏或過少表現。例如，若sl〇〇A1〇、sl〇〇AU、spARc、 及/或MetAP2之量於步驟（b)中比於步驟（(〇中的量大，及/或 若鈣活化酶（Calpain)2之量於步驟（b)中比於步驟（c)中的量 小，偵測到大腸癌。於某些具體實施例中，動物為人類， 較佳的是，具有大腸癌的人類。較佳的是，生物樣品為大 腸組織樣品，更佳的是息肉及再更佳的是腺瘤性息肉 (Adematous polyp)，其一般用於本技藝中作為大腸筛選活 動的組織樣品。於某些具體實施例中，藉由分析生物樣品， 尤其是利用一系列對本文中確認的多種基因產物專一的核 酸（基因）探針或抗體，偵測基因表現。 於再另一個具體實施例中，本發明提供用以在動物中（較 佳的是人類）診斷癌症及/或化療藥物抗性之方法，包含步驟 有偵測於二或多個表現的基因或由此編碼的基因產物之量 的k化杈式。於特別的具體實施例中，表現的基因為示於 98729.doc -17- 1301066 表1中的基因。-般而言，本發明的此等方法包含步驟有: ⑷自動物（較佳為人類）得到生物樣品；（b)於生物樣品中偵 、J或夕個表現的基因或由此編碼的基因產物之量，其中 表現的基因為示於表1中;⑷於控制組樣品中偵測二或多個 表現的基因或基因產物之量；（d)藉由比較來自步驟（b)之二 或夕個表現的基因或基因產物之量與於步驟（c)中的量，決 疋一或夕個表現的基因或由此編碼的基因產物之量的變化 模式，其中模式與癌症例如大腸或卵巢癌，或藥物抗性例 如對順鉑的抗性有關。於某些具體實施例中，藉由分析生 物樣品，尤其是利用一系列對本文中確認的多種基因產物 專一的核酸（基因）探針或於體，偵測基因表現。 本發明也提供用以於具有卵巢癌動物中偵測化療藥物抗 性之方法’方法包含步驟有：（a)於取自動物的生物樣品中 债測多個表現的基因或由此編碼的基因產物之量，其中表 現的基因為S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、 SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合 ‘的腳趾（Fused toes) ' NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、 SAPK/Erkl、辞指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、 Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、FAST激酶、丁ESK2、SRB1 或KIAA0082 ; (b)於包含有非腫瘤卵巢組織或來自對化療有 反應的病患之腫瘤組織之控制組樣品中偵測該多個表現的 基因或由此編碼的基因產物之量，相當於在子部件（a)中 貞 測的多個表現的基因或基因產物，其中表現的基因為 98729.doc •18- 1301066 S 100A10、S100A1 卜鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、 NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、辞指 狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、 IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082 ;及（c) 比較於步驟（a)中測量的表現的基因或基因產物之量與於步 驟（b)中偵測的表現的基因或基因產物之量，其中若於步驟 (a)中偵測的量比步驟（b)中偵測的量大至少20%，則預測患 者將對化療有抗性。如本文中提供，多個該基因其中於步 驟（a)中偵測的量比步驟（b)中偵測的量大至少1.2倍定義為 腫瘤樣品之對化療藥物有抗性之特定基因表現模式。於特 別的觀點中，控制組樣品為取自對化療有反應的癌症病患 之生物樣品。較佳的是，一或多種該基因之表現於步驟（a) 中偵測的腫瘤樣品中比於步驟（b)中偵測的控制組樣品為 大。於較佳具體實施例中，動物為人類，最佳的是人類癌 症患者。如本文中揭示，本發明更提供一種基因表現模式， ‘當偵測到該基因表現模式，其預測對該化療藥物的抗性。 於較佳具體實施例中，藉由分析生物樣品，尤其是利用一 系列對本文中確認的多種基因產物專一的核酸（基因）探針 或抗體，偵測基因表現。 有利地，一些本文中鑑定的基因從未確認為與卵巢或大 腸癌相關且可證實為用於介入此等疾病之新穎目標。 本發明之明確較佳具體實施例由下列某些較佳具體實施 98729.doc -19- 1301066 例之更詳細說明及專利申請範圍將變成更明白。 【實施方式】 本發明提供用以抑制、延遲或避免腫瘤細胞生長之方 法’包含步驟有使腫瘤細胞在細胞有抗性的濃度之化療藥 物存在中與一或多種細胞基因之表現或活性的至少一種調 控劑接觸，其中細胞基因為示於表丨中的基因，及其中使腫 瘤細胞與該基因表現調控劑接觸降低、抑制、延遲或避免 腫瘤細胞中的藥物抗性。腫瘤細胞可為例如卵巢癌。於一 個具體實施例中，可將腫瘤細胞於活體内接觸（如未曾自病 患取出的細胞）。 使用於本文中之用詞”生物樣品”包括（但不限於）得自動 物的組織或體液，較佳的是哺乳類及最佳的是人類。例如， 生物樣品可為切片材料、骨髓樣品、血液、血漿、血清或 其細胞部分、尿、唾液、眼淚、或衍生自生物來源的細胞。 於個具體實施例中，哺乳類為可能具有或先前診斷為具 有或需要篩選癌症的人類，特別是㈣或大腸癌。於某些 具體實施例中，生物樣品為腫瘤樣品。 如本文中使用，將知用詞”印巢癌，，普遍地意指上皮卵巢 癌八0 3由印巢組織所有診斷的人類癌症之約80%。其 餘（包含生殖細胞衍生的印巢癌Μ亮細”巢癌）為i 見：及常被誤診。在這個範圍内，如本文中揭示的基因表 現變化也見於此等較少腫瘤類型巾，本發明之方法及組合 物也適用。 如本文中使用，其 巷因表現或基因產物活性之”調控劑，，可 98729.doc -20 - 1301066 為可造成基因表現或基因產物之活性增加或減少之任何化 學化合物、核酸分子、胜肽或多胜肽。於某些具體實施例 中，本發明的調控劑為造成一或多種細胞基因之表現或活 性增加之化合物，其表現或活性於對化療試劑有抗性的腫 瘤細胞中為降低，·此類調控劑於本文中稱為"活化劑"。於 其他具體實施例中，調控劑為一或多種細胞基因之表現或 活性之抑制劑，特別是其表現於對化療試劑有抗性的腫瘤 細胞中為增加之基因；此類調控劑於本文中稱為”抑制劑"。 如本文中使用，"抑制劑，，可為可降低基因產物活性或直 接干擾基因表現之任何化學化合物、核酸分子、胜肽或多 胜肽，如針對-基因產物之抗體。例如，本發明之抑制劑 可直接或間接抑制由一基因編碼的蛋白質之活性。例如， 藉由結合蛋白質及因而避免蛋白質與其原先的目標（如受 體）結合，可達到直接抑制。例如，藉由結合至蛋白質原先 的目標’如受體或結合伴但’因而阻擋或降低蛋白質活性， 可達到間接抑制。再者，本發 心# %月的抑制劑可猎由降低或抑
2基因的表現而抑制基因，尤其是藉由干擾基因表現(轉 ^加工、轉譯、轉譯後修飾），例如，藉由干擾基因的mRNA 乂且：基因產物的轉譯或藉由基因產物之轉譯後修飾，或 糟由造成細胞内定位的改變。 如本文中使用，”活化劑”可 了為可增加基因產物活性（如藉 由私疋基因產物、避免其蛋白 姓人 水解y刀解或增加其酵素或 性或直接活化基因之表現）之任何化學化合物、核酸 刀子、胜肽或多胜肽。本發明之活化劑可直接或間接增加 98729.doc 1301066 由-基因編碼的蛋白質之活性。例如，藉由結合蛋白質及 因而〜強蛋白質與其原先的目標（如受體）之結合，可達到直 接活化。例如’藉由結合至蛋白質原先的目標，如受體或 結合伴侣，及增強活性，如藉由增加目標的有效濃度，可 達到間接活化。再者，本發明的活化劑可藉由增加基因的 表現而活化基因’如藉由增加基因表現（轉錄、加工、轉譯、
轉譯後修飾），例如，藉由穩定基因的mRNA及阻擋mRNA 轉錄體的分解’或藉由基因產物之轉譯後修饰，或藉由造 成細胞内定位的故變。 如本文中所述，於有化療抗性的卵巢腫瘤細胞中的數種 基因之表現實質上不同於化療敏感性卵巢腫瘤細胞中的表 現。表1提供利用說明於以下實例中的方法確認的此類基因 /月單。表也摘要此等基因於對廣泛使用的化療藥劑順鉑敏 感性或有抗性細胞中之表現模式。 98729.doc 1301066 基因庫 登錄 # 名稱 表1 染色體 位置 蛋白質 資訊 當於細胞株中有效時的 表現模式 BC015973
S100A10 P11 CLP 11 依鈣結合蛋白 (Calpactin)l I!鏈 42C lq21.3 細胞外96個 胺基酸 隨之增加而增加 對順鉑抗性 BC001410 S100A11 S100C Calgizzarin lq21.3 細胞外 105個胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 AF261089
舞活化酶(Calpain)2 CANPL2 MCANP lq41_ q42.11 細胞質及細 胞膜 700個胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 BC004974 SPARC 骨聯蛋白 (Osteonectin) BM-40 5q31.3-q33.1 細胞外 303個胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 BC013782
MetAP2 p67eIF2 MNPEP 12q22 細胞質 478個胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 BC015525 KLK6 Zyme Neurosin 質分解酶Μ 19ql3.33 細胞外 244個胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 AF222689 HMT1 HMT2 ANM1 HCP1 19ql3.33 核 361個胺基酸 隨之減少而增加對順鉑 抗性 U31913 D83735 ARA9 XAP2 肌動ϋ結合蛋^ (Calp〇nin)2 llql3.319ql3.3 細胞質 330個胺基酸 細胞質 309個胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 隨之增^對順鉑 抗性 U19251
NAIP 5ql3.1-13.2 細胞質 1403個胺基 酸 隨之減少而增加對順鉑 抗性 BC005291 AF015608 eEFls 复 RNPS1 U49436 BC013590 98729.doc eIF5 eIF5A eIF2Bs 6p24.3-p25.1 16ρ13·3 14q32.32 3q27] 細胞質 174個胺基酸 細胞質 細胞質 431個胺基酸 細胞質 隨之減少而增加對順鉑 左 隨之增 隨之 -23- 1301066 基因庫 登錄 # 名稱 染色體 位置 蛋白質 資訊 當於 表現模式 721個 胺基酸 1ST"^^ M65217 HSF2 HSTF2 6q22.31 細胞質及核 536個 胺基酸 抗性 AB010427 WDR1 norm 4ρ16·1 細胞質 606個 胺基酸 ~^^ 炚之增加而增加對順鉑 抗性 BC001134 融合的腳趾 (Ftl) 16ql2.2 未知 292個 胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 BC004880 NM23D mn23-H4 16pl3.3 粒腺體内膜 空間 187個胺基酸 左~~^ 隨之增加而增加對順鉑 抗性 U10439 adari Iq21.1-q21.2 核 1226個胺基 酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 Λ BC005214 Grancalcin 2q24.2 細胞質/膜 217個 隨之增 抗性 BC009808 NBR1 17q21.1-q21. 31 966個胺基酸 Ik之增加而增加對順鉑 抗性 L36870 SAPK/Erkl JNKK1 MEK4 MKK4 MAPKK4 17pll.2-pl2 細胞質 399個 胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 > AB007885 鋅指狀蛋白質-262 MYM Ip32-p34.3 未知 隨之增加而增加對順鉑 _ 抗性 D88153 HYA22 3p21.3 未知 隨之增加而增加對順 抗性 AB049635 MRPL4 CGI-28 19pl3.2 粒腺體 隨之增加而增加對順磊 抗性 ' AF037261 Vinexin β 8ρ21·3 與細胞骨架 結合 隨之增加而增加對順鉑 抗性 M59818 G-CSFR lp35-34.3 細胞膜或可 溶形式 836個 胺基酸 隨之增加而增加對順鉑 抗性 BC015710 RAB22A 20ql3.32 與膜結合 194個 胺基酸 隨之減少而增加對順鉑 抗性 BC017201 IGFBP-7 MAC25 4ql2 分泌的 282個 隨之增加而增加對順鉑 抗性 98729.doc -24- 1301066 基因庫 登錄 # 名稱 FSTL2 染色體 位置 BC011770 FAST激酶 7q36.1 蛋白質 資訊 細皰質 S49個 當於細胞株中有效時的 表現模式 AB057597 TESK2 1ρ34·1 BC022087 SRB1 CLA1 CD36L1 12q24.31 BC031890 KIAA0082 6p21.1 006312 NCOR2 12q24 胺甚®念
隨之增加而增加對順鉬 抗性 ' 隨之增加而增加對順銷 抗性 ~ 2517個 隨之增加而增加對順銷 抗性 隨之增加而增 抗性 BC032338 MT1 16ql3 X98494 MPP10 2pl2-2pl3.2 大妹可 大可 分泌 隨之減少而增加對順鉑 抗性 抗性 隨之》 抗性 於表I中以粗體表現的染色體位置已拙^反報導為與卵巢癌相關（Pejoic，1995, Ann. Med. 27:73-78) 〇 於一個具體實施例中，示於表I中的細胞美 I丞因之抑制劑可 為例如小分子抑制劑、抗體、核酸如反咅nW我极0夂、短干擾 RNA(siRNA，short interfering RNA)分子、 或短法夾 RNA(shRNA，short hairpin RNA)分子。此外，利用本文 | 說明的方法或利用技藝中已知的方法可明確地設計此類_ 制劑。例如，針對由示於表I的基因編碼的蛋白質之抗體 特別是中和抗體及較佳的是單株抗體，可由習見的方< i 生，如說明於例如由Harlow及Lane所著的"Antibodies A Laboratory Manualn(Cold Spring Harbor Press，1988)，將其 以參考資料併於本文中。 98729.doc -25- 1301066 於特別的具體實施例中，本發明的抑制劑為結合至編碼 目標基因之mRNA的siRNA，其中目標基因為示於表I中的 基因。
於較佳具體實施例中，由本發明提供的某些抑制劑為短 干擾 RNA(siRNA, short interfering RNA)類另J。如本文中使 用的用詞’’短干擾RNA”或”siRNA”意指能夠RNA干擾或 nRNAi”的雙股核酸分子，如揭示於例如Bass，2001，Nature 411:428-429; Elbashir 等人，2001, Nature 411:494-498;^ Kreutzer等人，世界專利編號WO 00/44895; Zernicka-Goetz 等人，世界專利編號WO 01/36646; Fire，世界專利編號WO 99/32619; Plaetinck等人，世界專利編號WO 00/01846; Mello 及 Fire，世界專利編號 WO 01/29058; Deschamps-Depaillette，世界專利編號WO 99/07409 ;及Li等人，世界 專利編號WO 00/44914。如本文中使用，siRNA分子不一定 限制於僅含有RNA的分子，也更包含具有RNAi能力或活性 之經化學改質的核苷酸及非核苷酸。 短干擾RNA介導的RNAi已於許多系統中被研究。Fire等 人為第一個觀察到RNAi於線蟲（C· elegans)中（1998，Nature 391:806)。Wianny及Goetz說明由dsRNA介導的RNAi於老鼠 胚胎（1999，Nature Cell Biol· 2:70)。Hammond等人說明 RNAi於以 dsRNA(2000，Nature 404:293)轉染的果蠅細胞 中。Elbashir等人說明藉由導入雙股合成的21個核苷酸之 RNA於培養的哺乳類細胞，包括人類胚胎腎臟及子宮頸癌 細胞株（HeLa)細胞而引發RNAi(2001，Nature 411:494)。此 98729.doc -26- 1301066 等研究已證實當含有2個核苷酸3’突出時，包含有21個核苷 酸之siRNA雙股為最有活性。再者，用2’-去氧或2^0-甲基 核苷酸取代siRNA股的一或兩股徹底破壞RNAi活性，而以 去氧核苷酸取代3’端siRNA核苷酸則證實為可容忍。也證實 於siRNA雙股中心的錯誤配對序列破壞RNAi活性。此外， 此等研究也指出目標RNA中斷裂處的位置係由siRNA引導 序列之5’端界定而非3’端（Elbashir等人，2001，EMBO J· 20:6877)。其他研究已指出siRNA雙股之目標互補股上的5’-磷酸為siRNA活性所必須及於細胞中利用ATP來維持siRNA 上的 51-磷酸部分（Nykanen等人，2001，Cell 107:309)。然 而，缺少5’·磷酸的siRNA分子當外生地導入時為有活性， 暗示siRNA構體之5’-磷酸化可能於活體内發生。可將經化 學改質的siRNA直接注入血液中做某些應用。 於某些具體實施例中，本發明提供表現載體，包含有編 碼至少一種本發明siRNA分子之核酸序列，其方式為允許 siRNA分子之表現。例如，載體可含有編碼包含有雙股之 siRNA分子的兩股之序列。載體也可含有編碼為自身互補及 因此形成siRNA分子之單一核酸分子的序列。此表現載體之 非限制性實例係說明於Paul等人，2002，Nature Biotechology 19:505; Miyagishi 及 Taira，2002，Nature Biotechnology 19:497; Lee等人，2002, Nature Biotechnology 19:500;及 Novina等人，2002, Nature Medicine，線上發行， 2003年6月3日。 於某些具體實施例中，根據本發明之siRNA分子可包含 98729.doc -27- 1301066 傳遞媒介，尤其包括微脂粒、載子及稀釋劑及其鹽類，以 給予對象，及可存在於醫藥組合物中。傳遞核酸分子之方 法係說明於例如 Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio· 2:139; 反意義寡核苷酸療法用的傳遞策略，Akhtar編著，1995， Maurer等人，1999, Mol· Membr. Biol· 16:129- 140; Hofland 及 Huang，1999, Handb. Exp· Pharmacol·，137:165-192;及 Lee 等人，2000, ACS Symp. Ser· 752:184· 192，其皆以參考資 料併於本文中。丑6丨8€1111^11等人之美國專利編號6,395,713及 Sullivan等人之世界專利WO 94/02595更說明用以傳遞核酸 分子之一般方法。可利用此等規範來傳遞幾乎任何核酸分 子。藉由許多熟悉本技藝者已知的方法可將核酸分子給予 細胞，包括（但不限於）裝入微脂粒内、藉電離子透入法、或 藉併入其他傳遞媒介，如水膠、環糊精、生物可分解的奈 米膠囊、及生物黏附性微球、或藉由蛋白質載體（見例如 O’Hare 及 Normand世界專利 WO 00/53722)。 或者，核酸/媒介組合可藉由直接注射或藉由利用灌流泵 局部傳遞。本發明核酸分子之直接注射，無論是皮下、肌 f肉内、或皮膚内，利用標準針頭及針筒方法可進行，或藉 由無針頭技術如說明於Conry等人，1999，Clin. Cancer Res· 5:2330-2337及Barry等人，世界專利編號WO 99/31262中 者。技藝中許多實例說明寡核苷酸之傳遞方法，藉由滲透 泵（見 Chun等人，1998，Neuroscience Letters 257:135-138, D’Aldin等人，1998, Mol· Brain Research 55:15 1-164, Dryden 等人，1998，J. Endocrinol. 157:169-175，Ghirnikar等人， 98729.doc -28- 1301066 1998， Neuroscience Letters 247:21-24)或直接灌流 (Broaddus等人，1997，Neurosurg. Focus 3條文 4)。其他傳 遞途徑包括（但不限於）口服傳遞（如以藥片或藥丸形式）及/ 或腦脊髓膜内傳遞（Gold， 1997， Neuroscience 76:1 153-1158)。核酸傳遞及給予的更詳細說明係提供於 Sullivan等人世界專利WO 94/02595, Draper等人，世界專利 WO 93/23569，Beigelman等人，世界專利 WO 99/05094,及 Klimuk等人，世界專利WO 99/04819，將其皆以參考資料併 入本文中。 或者，可將本發明的某些siRNA分子由真核生物啟動子 表現於細胞内（見例如，Izant及Weintraub，1985，Science 229:345; McGarry及 Lindquist，1986，Proc. Natl· Acad. Sci· USA 83:399; Scanlon等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 88:1591-5; Kashani-Sabet 等人，1992，Antisense Res·
Dev.:3-5; Dorpulic 等人，1992，J· Virol. 66:1432-41; Weerasinghe等人，1991，J· Virol. 65:553 1-4; Ojwang等人， 1992, Proc· Natl. Acad· Sci. USA 89:10802- 6; Chen等人， 1992，Nucleic Acids Res. 20:4581-9; Sarver等人，1990, Science 247: 1222-1225; Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res. 23:2259; Good等人，1997? Gene Therapy 4:45; Miyagishi等人，2001，Nucleic Acids Research 29:2502;及 Kunkel及 Pederson，1989 Nucleic Acids Research 17:7371)。 熟悉本技藝者將知利用適當DNA/RNA載體可將任何核酸 表現於真核細胞中。此核酸的活性可由其藉酵素的核酸自 98729.doc -29- 1301066 原始轉錄體釋放而增加（Draper等人，世界專利WO 93/23569,及 Sullivan等人，世界專利 WO 94/02595; Ohkawa 等人，1992, Nucleic Acids Symp. Ser· 27:15-6; Taira等人， 1991，Nucleic Acids Res. 19:5125-30; Ventura等人，1993, Nucleic Acids Res. 21:3249-55; Chowrira等人，1994, J. Biol. Chem. 269: 25856) ° 於本發明的另一個觀點中，可將本發明的RNA分子表現 自插入DNA或RNA載體的轉錄單元（見例如，Couture等人， 1996, TIG 12:510)。重組載體可為DNA質體或病毒載體。可 將siRNA表現病毒載體基於例如（但不限於）腺相關病毒、反 轉錄病毒、腺病毒、慢病毒（lentivirus)或α病毒。於另一個 具體實施例中，使用ρ〇1 III為基礎的構體來表現本發明的核 酸分子（見例如Thompson，美國專利編號5,902,880及 6，146,8 86)。可將能夠表現siRNA分子的重組載體如上述傳 遞，及存留於目標細胞中。或者，可使用病毒載體提供核 酸分子的短暫表現。可將此載體視需要重複給予。一旦表 現，siRNA分子與目標mRNA交互作用及產生RNAi反應。 siRNA分子表現載體之傳遞可為全身性，如藉靜脈内或肌肉 内給予，藉由給予自對象外植的目標細胞之後重新導入對 象，或藉由允許導入理想目標細胞的任何其他方式（回顧見 Couture等人，1996，TIG.12:510)〇 於一個具體實施例中，本發明提供一種表現載體，包含 有編碼至少一種本發明siRNA分子之核酸序列。表現載體可 編碼siRNA雙股之一或兩股，或自身雜交成為siRNA雙股之 98729.doc -30- 1301066 單一自身互補股。可將編碼siRNA分子之核酸序列可操作地 連接使得siRNA分子得以表現（見例如paui等人，2〇〇2,
Nature Biotechnology 19:505; Miyagishi 及 Taira，2002, Nature Biotechnology 19:497; Lee 等人，2002，Nature Biotechnology 19:500;及Novina等人，2002, Nature Medicine， 線上發表6月3日）。於本文中使用用詞”可操作地連接”來意 指側邊序列的排列，其中將如此說明的側邊序列配置或組 合以便實施其平常功能。因此，可操作地連接至編碼序列 的側邊序列可能可以影響編碼序列的複製、轉錄及/或轉 譯。例如，當啟動子能夠指揮該編碼序列的轉錄時，將編 碼序列可操作地連接至啟動子。側邊序列不一定與編碼序 列連績’只要其正確地作用。因此，例如，介於未轉譯但 轉錄的序列可存在於啟動子序列及編碼序列之間，啟動子 序列仍可被視為”可操作地連接”至編碼序列。 於另一個觀點中’本發明提供一種表現載體，包含有： a)轉錄起始區域（如真核p〇l I，卩或⑴起始區域）；b)轉錄終 止區域（如真核p〇l I，II或III終止區域及幻編碼至少一種 本發明siRNA分子之核酸序列；其中將該序列可操作地連接 至δ亥起始區域及該終止區域，使得允許siRNA分子之表現及 /或傳遞。視情況載體可包括蛋白質的開放讀碼區（〇rf， open reading frame)可操作地連接至編碼本發明siRNA之序 列的5’側或3’側；及/或内含子（介入序列）。 siRNA分子序列之轉錄可由真核rnA聚合酶I (pol RNA聚合酶π (ρ〇ι Π)、或rna聚合酶III (ρ〇ΐ πΐ)之啟動子 98729.doc -31 - 1301066 驅動。由pol II或pol III啟動子之轉錄於所有細胞中以高量 表現；於特定細胞類型中之特定pol II啟動子量視附近存在 的基因調控序列（增強子、沉默子等）的性質而定。也使用原 核RNA聚合酶啟動，其限制條件為將原核RNA聚合酶酵素 表現於適當細胞中（Elroy-Stein&Moss，1990，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87:6743-7; Goa及 Huang 1993, Nucleic Acids Res. 21:2867-72; Lieber 等人，1993，Methods Enzymol· 217:47-66; Zhou等人，1990, Mol· Cell. Biol· 10:4529-37)。 數個研究員已證實由此啟動子表現的核酸分子可於哺乳類 細胞中作用（如 Kashani-Sabet 等人，1992，Antisense Res·
Dev. 2:3-15; Ojwang等人，1992, Proc· Natl· Acad. Sci· USA 89:10802- 6; Chen等人，1992, Nucleic Acids Res. 20:4581-9; Yu等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-4; L，Huillier 等人，1992，EMBO J. 11:4411-8; Lisziewicz 等 人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8000-4; Thompson 等人，1995，Nucleic Acids Res. 23:2259; Sullenger 及 Cech， 1993, Science 262:1566)。更明確而言，轉錄單元如由編碼 ，U6小核（snRNA)、轉移RNA(tRNA)及腺病毒VARNA的基因 衍生者有用於細胞中產生高濃度理想RNA分子如siRNA
Thompson等人，1995, Nucleic Acids Res. 23:2259; Couture 等人，1996, TIG.12: 510; Noonberg等人，1994, Nucleic Acid Res. 22:2830; Noonberg 等人，美國專利編號 5,624,803; Good等人，1997, Gene Ther 4:45; Beigelman等人，世界專 利編號WO 96/18736)。可將上述siRNA轉錄單元併入許多載 98729.doc -32- 1301066 體以導入哺乳類細胞中，包括但不限於質體dna载體、病 毋DNA載體（如腺病毒或腺相關病毒載體）、或病毒rnA載 體（如反轉錄或α病毒；回顧見Couture等人，1996，TIG. 12: 510)。 · 於另一個具體實施例中，本發明提供一種表現載體，包 含有編碼至少一種本發明siRNA分子之核酸序列，其方式為 允許該siRNA分子之表現。於特別的具體實施例中，表現載 體包含有：a)轉錄起始區域；…轉錄終止區域；及❹）編碼 s 1R N A分子之至少一股之核酸序列；其中將序列可操作地連 接至起始區域及終止區域，使得允許siRNA分子之表現及/ 或傳遞。 於另一個具體實施例中，表現載體包含有：勾轉錄起始 區域；b)轉錄終止區域；c)開放讀碼區；及幻編碼siRNA分子 之至少一股之核酸序列，其中將序列可操作地連接至開放 。貝碼區的3’端；及其中將序列可操作地連接至起始區域、開 放讀碼區及終止區域，使得允許siRNA分子之表現及/或傳 遞。 於再另一個具體實施例中，表現載體包含有：a)轉錄起 始區域，b)轉錄終止區域；c)内含子；及d)編碼至少一種 s 1R N A分子之核酸序列，其中將序列可操作地連接至起始區 域、内含子及終止區域，使得允許siRNA分子之表現及/或 傳遞。 於另一個具體實施例中，表現載體包含有：勾轉錄起始 區域；b)轉錄終止區域；c)内含子；d)開放讀碼區；及幻編碼 98729.doc 1301066 siRNA分子之至少一股之核酸序列，其中將序列可操作地連 接至開放讀碼區的3’端；及其中將序列可操作地連接至起始 區域、内含子、開放讀碼區及終止區域，使得允許siRNA 分子之表現及/或傳遞。 於一個具體實施例中，藉由使腫瘤細胞與抑制SPARC的 siRNA接觸而抑制腫瘤細胞的生長。或者，可將腫瘤細胞在 腫瘤細胞有抗性的濃度之化療藥物存在下與siRNA接觸。為 SPARC抑制劑之siRNA分子實例包括例如： AATCC TGT CCA GGT GGA AGT A (SEQ ID ΝΟ··1); AAGCT CCA CCT GGA CTA CAT C (SEQ ID ΝΟ··2);及 AATGA CAA GTA CAT CGC CCT G(SEQ ID ΝΟ··3)。 於另一個具體實施例中，藉由使腫瘤細胞與抑制 MetAP2/p67的siRNA接觸而抑制腫瘤細胞的生長。或者， 可將腫瘤細胞在腫瘤細胞有抗性的濃度之化療藥物存在下 與siRNA接觸。為MetAP2/p67抑制劑之siRNA分子實例包括 例如： AAAGA TCA GCA TTG GAA GAT A (SEQ ID NO:4)； AAGCA CAT CGA CAA GTT AGA A (SEQ ID NO:5);及 AAACA GTG CCG ATT GTG AAA G (SEQ ID NO:6)。 於另一個具體實施例中，藉由使腫瘤細胞與抑制鈣活化 酶（Calpain)2的siRNA接觸而抑制腫瘤細胞的生長。或者， 可將腫瘤細胞在腫瘤細胞有抗性的濃度之化療藥物存在下 與siRNA接觸。為妈活化酶（Calpain)2抑制劑之siRNA分子 實例包括例如： 98729,doc -34- 1301066 AAGGC ΑΤΑ CGC CAA GAT CAA C (SEQ ID NO:7)； AAACT TCT TCC TGA CGA ATC G (SEQ ID NO:8);及 AAACG CTA TTC AAG ΑΤΑ TTT A (SEQ ID NO:9) 〇 於另一個具體實施例中，藉由使腫瘤細胞與S100A10的 siRNA接觸而抑制腫瘤細胞的生長。或者，可將腫瘤細胞在 腫瘤細胞有抗性的濃度之化療藥物存在下與siRNA接觸。為 S100A10抑制劑之siRNA分子實例包括例如： AAATG GAA CAC GCC ATG GAA A (SEQ ID NO:59)； AAATT CGC TGG GGA TAA AGG (SEQ ID NO:60);及 AATAA TGA AGG ACC TGG ACC A (SEQ ID N0.61) 〇 本發明提供用以抑制、延遲或避免腫瘤細胞生長之方 法，包含步驟有使腫瘤細胞與化療藥物及至少一種細胞基 因的抑制劑之組合接觸，其中細胞基因為示於表1中的基 因。較佳的是，腫瘤細胞為卵巢癌細胞。化療藥物為技藝 中已知，包括例如順翻、太平洋紫杉醇（paclitaxel)、卡i白 (carboplatin)、依託泊苦（etoposide)、六甲基胺、威克瘤 (melphalan)及蒽環黴素（anthracyclines)。 於一個具體實施例中，示於表1中的細胞基因抑制劑可為 小分子抑制劑。如本文中使用，用詞”小分子”意指具有分 子量小於約1500 g/Mol之分子。小分子可為例如小有機分 子、胜肽或似胜肽分子。藉由實例，適用於本發明方法中 的小分子抑制劑可為舞活化酶（Calpain)抑制劑，如PD 147631、（25,35)-反-環氧基琥珀醯基白胺醯基-胺基-3-甲基丁烷乙基醚（E-64-d)、N-乙醯基-白胺醯基·白胺醯基- 98729.doc -35- 1301066 正白胺醛（ALLN，N-Acetyl-Leucyl-Leucyl-Norleucinal)、N-乙醯基-Leu-Leu-Met-al(ALLM 或 C19H35N3O4S)、或 MDL 18270 ;或 MetAP-2 抑制劑，如TNP-470(也已知為 AGM 1170 或 C19H28C1N06)、煙曲黴素（fumagillin)(C26H3407)、順-煙曲 黴素（見 Kwon 等人，2000，J· Antibiot· 53:799-806)、 fumagalone(見 Zhou 等人，2003， J. Med. Chem. 46:3452-3454)、或卵假散囊菌素（ovalicin)(C16H2404)。也見 Han 等人，2000，Bioorganic & Medicinal Chem. Letters 10:39-43。 於一個具體實施例中，示於表1中的細胞基因抑制劑可為 如上述界定之抑制劑。可使用抑制劑之任何組合，例如示 於表1中特定基因之多重抑制劑、各抑制一或多個特定基因 之抑制劑組合、或抑制示於表1中的多重基因之一種抑制 劑，或其任何組合。 於特別的具體實施例中，發明的方法包含步驟有使腫瘤 細胞與MetAP2抑制劑及以鉑為基礎的化療藥物之組合接 觸。若藥物的主要成分為順鉑或卡鉑，視情況與紫杉醇或 環填琉胺（cyclophosphamide)組合，化療藥物為n以I自為基 礎"。MetAP2之抑制劑可為例如煙曲黴素或煙曲黴素的衍生 物，或 MetAP2 siRNA如不限於 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、或 SEQ ID NO:6。 本發明也提供用以預測卵巢癌病患的腫瘤是否對化療處 理有抗性的方法。於此等具體實施例中，方法包含步驟有： (a)於取自患者的生物樣品中偵測一或多個表現的基因或由 98729.doc -36- 1301066 此編碼的基因產物之量，其中表現的基因為示於表1中；（b) 於控制組樣品中摘測一或多個表現的基因或由此編碼的基 因產物之量，其中表現的基因為示於表1中；及（c)比較於步 驟（a)中測量的表現的基因或基因產物之量與於步驟（b)中 偵測的表現的基因或基因產物之量，其中若於步驟（a)中偵 測的量比步驟（b)中偵測的量相差至少20%，則預測患者將 對化療有抗性。於一個具體實施例中，偵測的量為可為示 於表1基因之mRNA量或由示於表1中的基因編碼的蛋白質 量。於另一個具體實施例中，控制組樣品為取自有反應或 正常的對象之生物樣品，即對治療有反應的個體或無癌症 如卵巢癌者。於特別的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。 於一個具體實施例中，於步驟（a)及步驟（b)中表現的基因 為一或多個 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、 SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合 的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、 SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、 Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或KIAA0082，及若於步驟（a)中表現基因的量比步驟（b)中 表現基因的量高至少約20%，則預測患者的腫瘤將對化療 處理有抗性。 於特別的具體實施例中，於步驟（a)及步驟（b)中表現的基 因為一或多個 Vinexin β、G-CSFR、KLK6、SPARC、HYA22、 約活化酶（Calpain)2、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 98729.doc -37- 1301066 (Calponin)2、MRPL4、eIF5、eIF2Bs、IGFBP-7、FAST激 酶、WDIU、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、Grancalcin、 鋅指狀蛋白質-262 MYM、RNPS1、KIAA0082、S100A10、 S100A11、或MetAP2，及若於步驟（a)中表現基因的量比步 驟（b)中表現基因的量高至少約2〇%，則預測患者的腫瘤將 對化療處理有抗性。 於另一個具體實施例中，於步驟（a)及步驟中表現的基
因為或多個 HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2、 MPP10或MT1，及若於步驟（a)中表現基因的量比步驟（^中 表現基因的里少至少約20%，較佳5〇%，則預測患者的腫瘤 將對化療處理有抗性。 於特別的具體實施例中，於步驟⑷及步驟（b)中表現的基 因為一或多個 HMTi、eEFls、Mppi〇、RAB22^mt卜及 右於步驟⑷中表現基因的量比步驟(b)中表現基因的量少 至v、力20 /。，較佳5〇%，則預測患者的腫瘤將對化療處理有 抗性。
因此如本文中揭示，本發明提供一或多種基因表現或 口產物核式，包含於化療藥物抗性_巢癌細胞中比正常（ 瘤）、·田胞中有不同（即以較大或較小量）表現的多個該 :或其中由該基因編碼的蛋白質產物具有不同活性。根 =的方法使用該不同基因表現模式或蛋白f =生物(最佳的是腫瘤)樣品中有化療藥物 :死亡及因=於個體在臨床醫生開始關於重要㈣ '、 的治療過程前預測腫射藥物抗性。 98729.doc -38- 1301066 普通熟悉本技藝者將知於本發明方法的實行中，可將病 患的腫瘤樣品評估本文中確認的一或多個基因之表現。本 文中確認的多個基因各預期顯示利用立即揭示的方法偵測 的不同基因表現於自特定卵巢癌病患分離的個別腫瘤之比 例，最佳的是高比例。也預期利用發明的預測方法所得的 結果之正確性將隨顯示本文中揭示的不同基因表現分析的 該基因數目增加而增加。 於一個具體實施例中，可使用本發明的方法於實際用化 療藥物處理該病患前篩選需要化療處理的人類病患。因 此，可使用發明的方法來篩選病患以使照護提供者決定用 特定化療藥物治療該病患是否會無效。基於發明的方法預 測為對化療無抗性的病患為用化療及/或示於表丨中的基因 抑制劑治療的人選。基於發明的方法預測為對化療有抗性 的病患為用手術及/或化療處理結合示於表1中的基因抑制 劑’或其他治療方法的人選。 於本發明方法的實行中，基因表現之偵測係藉由侦測編 碼本文中確認的任何基因之mRNA表現於生物樣品中之 量，例如藉由雜交分析如北方墨點或點潰墨點，或藉由放 大:法:聚合酶鏈反應（PCR，polymerase仏如跳㈣， 更佳的是與mRNA反轉錄成cDNA結合（RT_pcR)，及再更佳 :疋利用技藝中已知的定量即時RT_pCR方法，如本文中更 j、’、田的况明。其他方式包括偵測該基因的蛋白質產物之 量γ於非限制性實例中藉由分析生物樣品利用蛋白質專一 的k血清’更佳的是抗體及再更佳的的是專_於本文中確 98729.doc 1301066 認的任何特定基因之單株抗體。也可藉由分析生物樣品之 蛋白質產物的酵素或抗原活性決定蛋白質表現量。本發明 也提供基因或抗體陣列來偵測於化療藥物抗性腫瘤（特別 是卵巢及大腸腫瘤）中過量或過低表現之基因表現，其中核 酸探針或抗體於陣列中的排列產生可識別的，較佳為機器 可讀的模式顯示腫瘤樣品為化療藥物有抗性，及/或不同 的、可識別的模式顯示腫瘤樣品為化療藥物敏感性。 例如’根據發明的方法決定表現於病患生物樣品中之 MetAP2量並與具有卵巢癌並對化療有反應的人或具有印 巢癌及對化療無反應的人表現之MetAP2量比較。如本文中 使用，若化療具有降低腫瘤大小或停止腫瘤生長的作用， 人對”化療”具有”反應”。再者，用詞，，有反應的病患”用來意 指在手術切除後用化療處理並保持無臨床疾病徵兆至少6 個月的病患。若於病患中MetAP2量等於或小於具有卵巢癌 及對化療有反應的人表現的MetAP2量，預測病患對某些化 療藥物（如以鉑為基礎的化合物）有反應。若於病患中 MetAP2量大於具有卵巢癌及對化療有反應的人表現的 MetAP2量，預測病患對化療藥物有抗性。類似地，若於病 患中MetAP2量大於具有癌症但對化療無反應的人表現的 MetAP2量’預測病患對化療藥物有抗性。 如表1及以下實例中所示，於卵巢癌中增加的MetAP2表 現係相關於對順鉑（一種以鉑為基礎的化療藥物）增加的抗 性。因此，於一個具體實施例中，當來自癌症病患的生物 樣品中測K的Met AP2表現量大於在有反應的個體中偵測 98729.doc •40- 1301066 的預定量時，本發明的方法可預測病患的腫瘤將對以鉑為 基礎的化療有抗性。於另一個具體實施例中，當來自癌症 病患的生物樣品中測量的Met AP2表現量等於在有反應的 個體中偵測的預定量但一或多種基因之表現（其中基因 為：S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、 NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指 狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、 IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082)增加超 過有反應的病患中之表現，及/或一或多個HMT1、ΝΑΙΡ、 eEFls、RAB22A、NC0R2、ΜΤ1或 ΜΡΡ10基因之表現相較 於有反應病患中之表現減少，本發明的方法可預測病患的 腫瘤將對以鉑為基礎的化療有抗性。 本發明更提供用以監測卵巢癌患者的疾病發展之方法， 特別是以化療處理治療的卵巢癌病患，包含步驟有：（a)於 取自患者的生物樣品中偵測一或多個表現的基因或由此編 碼的基因產物之量，其中表現的基因為S100A10、 S100AU、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、KLK6、 ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、eIF5、 eIF2Bs、HSF2、WDIU、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、 FAST激酶、TESK2、SRB1、KIAA0082、MPP10、HMT1、 98729.doc -41- 1301066 ΝΑΙΡ、eEFls、RAB22A、NCOR2或 MTl ; (b)利用取自患者 隨後收集的生物樣品重複步驟（a);及（c)比較於步驟（a)中偵 測的表現基因或基因產物之量與於步驟（b)中偵測的表現基 因或基因產物之量，其中藉由偵測於隨後收集的生物樣品 中表現的基因或基因產物之量與取自步驟（a)中的生物樣品 比較之差異而監測疾病的發展。於特別的觀點中，生物樣 品為腫瘤樣品。 如本文中提出，當於步驟（a)及（b)中表現的基因為 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、 NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指 狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、 IGFBP-7、FAST 激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082，及於步 驟（b)中偵測的表現基因或基因產物之量大於在步驟（a)中 表現的基因或基因產物之量時，偵測到疾病的發展。於某 些具體實施例中，病患於步驟（a)中偵測基因表現量及於步 *驟（b)中偵測的量之間的時期中接受化療或其他治療。 如本文中提出，當於步驟（a)及（b)中表現的基因為 HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2、MT1 或 MPP10， 及於步驟（b)中偵測的表現基因或基因產物之量小於在步驟 (a)中表現的基因或基因產物之量時，偵測到疾病的發展。 於某些具體實施例中，病患於步驟（a)中偵測基因表現量 及於步驟（b)中偵測的量之間的時期中接受化療或其他治 98729.doc -42- 1301066 療。於某些具體實施例中，偵測的量可為示於表1中基因之 mRNA量或由示於表1中基因編碼之蛋白質量。 例如，可使用根據本發明用以於患者中監測卵巢癌的發 展之方法來決定是否患者對某些治療方式如化療處理方式 有或無反應。 例如，當 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、 SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合 的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、 SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、 Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或KIAA0082之表現在病患開始某一處理方式後一段時間 取自病患的生物樣品相較於處理方式開始之時或之前取出 的生物樣品中基因表現量相等或更高，病患為無反應。於 另一個實例中，當 HMT卜 NAIP、eEFls、RAB22A、NC0R2、 MT1或MPP10之表現在病患開始某一處理方式後一段時間 取自病患的生物樣品相較於處理方式開始之時或之前取出 的生物樣品中基因表現量相等或更少，病患為無反應。於 此種情況中，照護提供者可決定治療方式為無效。 或者，當 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、 SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合 的腳趾（Fused toes)、NM23D、AD AR1、Grancalcin、NBR1、 SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、 98729.doc -43- 1301066
Vinexin β、G_CSFR、IGFBP-7、FAST激酶、TESK2、SRBl 或KIAA0082之表現在病患開始某一處理方式後一段時間 取自病患的生物樣品相較於處理方式開始之時或之前取出 的生物樣品中基因表現量更小，病患為有反應，不需改變 治療。再者，當HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2、 MT1或MPP10之表現在病患開始某一處理方式後一段時間 取自病患的生物樣品相較於處理方式開始之時或之前取出 的生物樣品中基因表現量更多，病患為有反應。 此外，本發明提供用以監測醫藥組合物於病患中作為治 療癌症藥劑的有效性之方法，包含步驟有：（a)於取自患者 的生物樣品中偵測一或多個表現的基因或由此編碼的基因 產物之量，其中表現的基因為S100A10、S100A11、鈣活化 酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、KLK6、ARA9、肌動蛋白 結合蛋白（Calponin)2、RNPS 卜 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDIU、 融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、Grancalcin、 NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、 MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP_7、FAST激酶、TESK2、 ‘ SRBl或KIAA0082 ; (b)給予患者適當量之醫藥組合物；（c) 利用取自患者隨後收集的生物樣品重複步驟（a);及（d)比較 於步驟（a)中測量的表現的基因或基因產物之量與於步驟（c) 中偵測的表現的基因或基因產物之量，其中藉由偵測於隨 後收集的生物樣品中表現的基因或基因產物之量與取自步 驟（a)中的生物樣品比較之變化而監測醫藥組合物之有效 性。若基因表現於在以醫藥組合物治療後收集的生物樣品 98729.doc -44- 1301066 中局於在以醫樂組合物治療前收集的生物樣品中及 藥組合物治療期間遁瘤生長未曾被減緩、延遲或抑制，可 將醫樂組合物視為無效於治療患者的癌症。例如，若 S1〇〇A1GmRNA量於病患已用醫藥組合物治療後更高，預期 病患用該醫藥組合物進一步治療將有抗性。因此，將醫藥 組合物視為對病患的癌症無效。於特別的觀點中，生^樣 品為腫瘤樣品。 本發明更提供用以監測醫藥組合物於病患中作為治療癌 症樂劑的有效性之方法，包含步驟有：⑷於取自患者的生 物樣品中❹卜或多個表現的基因或由此編瑪的基因產物 之量’其中表現的基因為職卜NAIp、娜丨ε、驗22 A、 NC〇R2、MT1或MPP1G;(b)給予患者適當量之醫藥組合物； ⑷利用取自患者隨後收集的生物樣品重複步驟⑷；及⑷ 比較於步驟⑷中偵測的表現基因或基因產物之量與於步驟 ⑷中偵測的表現基因或基因產物之量，其中藉由债測於用 醫，組合物治療後收集的生物樣品中表現基因或基因產物 之量與取自步驟⑷中（即於用醫藥組合物治療前收集）的生 物樣品比較之變化而監測醫藥組合物之有效性。若一或多 個該基因的基因表現於隨後收集的生物樣品中（即用醫藥 組合物治療後收集）低於先前收集的生物樣品（即用醫藥組 ，物療4收集）’及於以醫藥組合物治療期間腫瘤生長未 :被減緩、延遲或抑制’可將醫藥組合物視為無效於治療 患者的癌症’及預期病患用該醫藥組合物進一步治療將有 抗性。因此’將醫藥組合物視為對病患的癌症無效。於特 98729.doc -45- 1301066 別的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。 如本文中使用，”醫藥組合物’’可為包含有用來治療或測 試治療癌症（如大腸或卵巢癌）能力之化合物（如蛋白質、胜 肽或擬胜肽分子、非胜肽有機分子、無機小分子、或核酸 分子）之任何配方。 本發明也提供方法以鑑定抑制腫瘤細胞生長之化合物， 特別是有化療抗性的腫瘤細胞，最特別的是有化療抗性的 卵巢癌細胞。於此等具體實施例中，方法包含步驟有：（a) 使表現在有化療抗性的卵巢癌細胞中為過度表現的一或多 個基因之細胞與測試化合物接觸，其中基因為S100A10、 S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP2、KLK6、 ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、eIF5、 eIF2Bs、HSF2、WDIU、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP-7、 FAST激酶、TESK2、SRB1或KIAA0082 ; (b)偵測在有或無 測試化合物存在中基因之表現；及（c)比較在測試化合物存 。在中基因表現與無測試化合物存在中基因表現，其中若在 測試化合物存在中基因表現相對於在無測試化合物中基因 表現降低，將化合物鑑定為抑制化療抗性腫瘤細胞生長之 化合物。於特別的觀點中，生物樣品為腫瘤樣品。於某些 具體實施例中，化合物在化療藥物存在中可抑制腫瘤細胞 的生長。 此外，本發明提供方法以鑑定抑制腫瘤細胞生長之化合 98729.doc -46- 1301066 物，特別是有化療抗性的腫瘤細胞，最特別的是有化療抗 性的卵巢癌細胞，包含步驟有：（a)使表現在有化療抗性的 卵巢癌細胞中為比正常量少的一或多個基因之細胞與測試 化合物接觸，其中基因為HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、 NCOR2、MT1或MPP10 ; (b)偵測在有或無測試化合物存在 中基因之表現；及（c)比較在有及無測試化合物存在中的基 因表現，其中若在測試化合物存在中基因表現相對於在無 測試化合物中基因表現增加，將化合物鑑定為抑制化療抗 性腫瘤細胞生長之化合物。於一個具體實施例中，化合物 在化療藥物存在中可抑制腫瘤細胞的生長。 下列實例，包括實施的實驗及達到的結果僅為說明的目 的提出’不應將其視為限制本發明。 實例 實例1 MTT細胞增殖分析 利用標準MTT細胞增殖分析法，將五個卵巢癌細胞株 (OVCA 429、OVCA 433、OVCA 432、HEY 及 HEYA8)根據 f其對順鉑敏感性程度而評級。 將細胞生長於 Minimal Eagle’s Media(MEMa，得自 Invitrogen Corp·，Carlsbad，CA)、5%胎牛血清（FBS，fetal bovine serum，經加熱去活性）、1%抗生素/抗真菌劑混合物 (Invitrogen)中。將 MTT原液（5 mg/mL; CALBIOCHEM，San Diego，CA)藉由溶解染料於Hank’s平衡的鹽溶液（HBSS， Hank’s Balanced Salt Solution)，過滤該混合物而製備及以1 98729.doc -47· 1301066 ml份量儲存於-20°C。使用1 ml MTT原液於每9 ml培養基（總 體積為10 ml)。將盤子以不透明蓋子覆蓋以保護細胞免於光 線。 將各細胞株以5、25、50、100及200 μΜ順鉑處理4、8及 24小時。在順始處理後96小時，將ΜΤΤ分析法實施於96孔 盤上。將培養基自細胞移除並將200微升新鮮ΜΤΤ培養基加 至細胞及至空白孔作為控制組。於正常細胞培養條件下將 細胞培養3_4小時。而後檢查細胞假臢（Formazan)晶體之形 成（代謝活性之指示）。將培養基去除並將200微升2-丙醇加 至孔及控制組孔中。在所有晶體均衡地溶解後，將細胞於 室溫黑暗中培養20分鐘。將結果於微量盤讀取機上於570 nm讀取。 圖3 9(上圖）顯示在暴露至不同濃度之順鉑4小時後於此 等研究中使用的5個卵巢癌細胞株之MTT分析結果。在考慮 各細胞株對順鉑濃度及使用的處理時間之整個範圍的表現 後，將細胞以減少抗性程度評等為OVCA 429<OVCA 433 <HEY A8<OVCA 432<HEY(下圖）。 將包含暴露細胞至對特定基因之siRNA或藥物抑制劑之 MTT分析法以基本上如上述之方式實施。將細胞在以0、 3.12、6.25、12.5、25、50、100 及 200 μΜ 順鉑處理 24 小時 前預先以siRNA處理48小時。對於組合藥物處理實驗（煙曲 黴素或ALLN)，將細胞暴露至增加待測藥物濃度及0、3.12、 6.25、12.5、25、50、100及200 μΜ順鉑之組合處理24小時。 實例2 98729.doc -48- 1301066 cDNA微量陣列、北方墨點、及定量即時PCR分析 使用於實例1中定性的細胞株來進行微量陣列分析。自各 細胞株收集細胞沉澱及藉由溶解沉澱於1 ml TRI試劑（得自 Molecular Research Center， Inc., Cincinnati, OH)或 Trizol(Invitrogen)中自細胞分離RNA。而後使樣品靜置5分 鐘。藉由加入100微升1-溴-3-氣丙烷（BCP，l-bromo-3-chloropropane)至樣品達到相分離。搖動15秒後，將樣品於 室溫培養15分鐘及而後以13,000 RCF於4-25°C離心16分 鐘。藉移液管將上層清液取出及放入新的微量離心管中。 而後藉由混合上層清液與500微升新鮮異丙醇而將RNA沉 澱，於室溫培養10分鐘，及以13,000 1^?於4-251離心9分 鐘。而後將上層清液自管子取出及藉加入1 ml 75%乙醇至 管子、漩渦震盪、及而後以13,000 110?於4-25°(：離心6分鐘 而清洗沉澱物。將液體去除，將沉澱物風乾約8分鐘。而後 將沉澱物溶解於無RNase水及置於冰上立即使用或儲存於 -80〇C。 使用含有超過5000個序列證實的cDNA純系之微量陣列 (得自Research Genetics Inc.)來審視此等細胞中的基因表 現；根據製造商的操作指南進行所有的微量陣列分析法。 已知各純系被表現於卵巢組織中。使用最有抗性的細胞株 (OVCA 429)作為其他細胞株中基因表現比較的標準。數據 分析顯示相較於更敏感的細胞株，OVCA 429有196個基因 以增加量表現及有8 3個基因以減少的量表現。 將基因選擇做進一步分析，只要其滿足下列標準··於二 98729.doc -49- 1301066 重複膜上偵測到相較於標準至少2倍表現差異；相較於標準 (OVCA 429)於4個細胞株中有3個偵測到差異表現；及表現 量與各細胞株對順鉑的敏感性一致。過度表現的基因為在 OVCA 429細胞中最高度表現及表現逐漸減少直到表現最 低量到達於最少抗性的細胞株HEY(及對於在OVCA 429細 胞中較低量表現之基因反之亦然）。 當相較於其他細胞株，於最有抗性的細胞株（OVCA 429) 中不同表現（更高或更低量）的基因之北方墨點及定量即時 PCR分析被用來確認微量陣列數據及鑑定有興趣做進一步 分析的基因。將確認的基因列於表2中，其顯示基因名稱、 細胞株中表現模式的摘要、及代表表現分析結果的圖。 表2 基因庫 登錄# 基因卡 cDNAid# 名稱 當於細胞株中有效 時的表現模式 圖 BC015973 756595 S100A10 P11 CLP11 依#5結合蛋白(Calpactin) 1 輕鏈 42C 隨之增加而增加對 順鉑抗性 1 BC001410 810612 S100A11 S100C Calgizzarin 隨之增加而增加對 順鉑抗性 2 AF261089 549728 媽活化酶(Calpain)2 CANPL2 mCANP 隨之增加而增加對 順1自抗性 6 BC004974 250654 SPARC 骨聯蛋白(osteonectin) BM-40 隨之增加而增加對 順鉑抗性 4 BC013782 39093 MetAP2 p67eIF2 MNPEP 隨之增加而増加對 順鉑抗性 8 98729.doc -50- 1301066 基因庫 登錄# 基因卡 cDNAid# 名稱 當於細胞株中有效 時的表現模式 圖 BC015525 809784 KLK6 Zyme Neurosin 蛋白質分解酶Μ 隨之增加而增加對 順鉑抗性 17 AF222689 246120 ΗΜΤ1 ΗΜΤ2 ΑΝΜ1 HCP1 隨之減少而增加對 順鉑抗性 18 U31913 814731 ARA9 ΧΑΡ2 隨之增加而增加對 順鉑抗性 19 D83735 713886 肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2 隨之增加而增加對 順鉑抗性 20 U19251 1046522 NAIP 隨之減少而增加對 順鉑抗性 21 BC005291 306921 eEFls P18 隨之減少而增加對 順鉑抗性 13 AF015608 897594 RNPS1 隨之增加而增加對 順鉑抗性 22 U49436 884867 eIF5 eIF5A 隨之增加而增加對 順鉑抗性 10 BC013590 1630998 eIF2Bs 隨之增加而增加對 順鉑抗性 12 M65217 669443 HSF2 HSTF2 隨之增加而增加對 順鉑抗性 23 AB010427 714196 WDR1 NORI-1 隨之增加而增加對 順鉑抗性 24 BC001134 321247 融合的腳趾 (Ftl) 隨之增加而增加對 順鉑抗性 25 BC004880 203003 NM23D mn23-H4 隨之增加而增加對 順鉑抗性 26 U10439 950367 ADAR1 隨之增加而增加對 順鉑抗性 27 BC005214 34140 Grancalcin 隨之增加而增加對 順鉑抗性 7 BC009808 882511 NBR1 隨之增加而增加對 順鉑抗性 28 L36870 726147 SAPK/Erkl JNKK1 MEK4 MKK4 MAPKK4 隨之增加而增加對 順舶抗性 14 98729.doc -51 - 1301066 基因庫 登錄# 基因卡 cDNAid# ------- 名稱 隨之增加而增加對 —— 圖 29 ———. 31 AB007885 427980 鋅指狀蛋白質-262 MYM D88153 123980 HYA22 隨之增 順鉑抗性 AB049635 824568 MRPL4 ___CGI-28 i之增力 順鉑抗蛙 ---- 30 AF037261 1636620 Vinexin β 隨之增加^^^: —--- 32 M59818 809639 G-CSFR 隨之增加而增加對 順始抗拇 ~---- 33 BC015710 838636 RAB22A ^ ^/\a __順翻抗性 ----—. 36 BC017201 68605 IGFBP-7 MAC25 FSTL2 隨之增加而增加對 順鉑抗性 ——. 35 BC011770 345077 FAST激酶 隨之增加 順鉑抗性 ------ 16 AB057597 845441 TESK2 隨之增^^^： 順鉑抗性 15 BC022087 756687 SRB1 CLA1 CD36L1 一 ~~——— 隨之增加而增加對 順鉑抗性 ----- 34 BC031890 825293 KIAA0082 隨之增加 順鉑抗性 —---- 37 NM—006312 743230 NCOR2 隨之減少* 順鉑抗性 38 BC032338 297392 MT1 隨之減少 順始抗性 51 X98494 825214 MPP10 隨之減 _座鉑抗性 ~~~~---- 52 北方墨點分析 為了確認由微陣列分析確認的表現模式，根據製造商％ 操作指南，利用 NorthernMax Protocol(Ambion Corp. AUsti TX)進行北方墨點分析及利用Strip-EZ DNA標記套組 (Ambion)將DNA探針標記。
定量即時PCR 98729.doc -52- 1301066 cDNA之合成係藉由混合1微克自印巢癌細胞株分離的總 細胞RNA、1微克寡dT、及水至最終體積12微升，於70°C培 養此混合物10分鐘，及而後加入至混合物5微升2X反應混 合、2微升〇丁丁、及1微升8叩€^(：1^1:11酵素（111¥11：1：〇8611)。而 後將反應混合物於42°C培養60分鐘。製備由1 : 4至1 : 256 之 cDNA稀釋。利用 Qiagen QuantiTect SYBR Green PCR Handbook(Qiagen Corp·，Valencia CA)將主混合以最終體積 50微升/孔準備。對使用的盤之各孔，將25微升2X QuantiTect SYBR Green PCR主混合（Qiagen)、0.3 μΜ正向 引子、0·3 μΜ反向引子、及無RNase水加至最終體積45微升。 將各基因的主混合徹底混合及如下列將適當體積分配入 PCR試管或盤：無糢板（控制組）=45微升主基因混合+5微升 水；緩衝液空白=25微升水+25微升SYBR混合；及測試樣品 =45微升主基因混合+5微升cDNA(如上述稀釋）。 利用 ABI Prism 7700(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)序列偵測系統或 MJ研究（Waltham，MA)Opticon II 系統如下列決定序列偵測：將PCR起始活化步驟於95°C實 施15分鐘；將樣品於94°C變性15秒，於53°C煉合30秒（當使 用Opticon II系統時為55°C)，及於72°C延伸30秒（於此步驟 期間得到資料）；將PCR反應重複50個循環。藉由加入於下 列步驟：15秒於95°C，20秒於60°C，及20秒於95°C準備融 化曲線分析。 此外，RNA之製備係由得自已用以鉑為基礎的化療藥物 治療之化療敏感性（即有反應的）及有化療抗性（即無反應的） 98729.doc •53- 1301066 卵巢癌病患的組織樣品。RNA之分離係藉由均質化50-100 毫克組織樣品於1毫升TRI試劑或Trizol直到組織被液化。而 後使樣品靜置5分鐘。藉由加入100微升BCP至樣品達到相 分離。搖動15秒後，將樣品於室溫培養1 5分鐘及而後以 13000xg(相對離心力，RCF)於4-25°C離心9分鐘。藉移液管 將上層清液取出及放入新的微量離心管中。而後藉由混合 上層清液與500微升新鮮異丙醇而將RNA沉澱，於室溫培養 20分鐘，及以13000 RCF於4-25°C離心9分鐘。而後將上層 清液自管子取出及藉加入1 ml 75%乙醇至管子、漩渦震 盪、及而後以13000 RCF於4-25 °C離心6分鐘而清洗沉澱 物。將液體去除，將沉澱物風乾約8分鐘。而後將沉澱物溶 解於無RNase水及置於冰上立即使用或儲存於-80°C。 利用示於表3中基因的引子進行定量即時PCR來偵測化 療敏感性及化療抗性的病患之間基因表現改變。使用18S RNA之表現來校正表現的基因之值。將結果示於下表3中。 結果證實以來自細胞株之RNA進行的實驗之觀察。 表3 基因名稱 基因庫 登錄# 於化療敏感性病患 中表現倍數 於化療抗性病患 中表現倍數 倍數差異 Vinexin β AF037261 1.4 2.8 2.0 G-CSFR M59818 1.7 2.6 1.5 KLK6 BC015525 0.3 3.3 11.0 SPARC BC004974 3.6 6.0 1.7 HYA22 D88153 1.75 2.4 1.4 MRPL4 AB049635 0.3 0.8 2.7 eIF5 U49436 0.8 1.3 1.6 RAB22A BC015710 0.15 0.075 2.0* MT1 BC032338 0.9 0.6 1.5* MYM AB007885 0.6 1.5 2.5 RNPS1 AF015608 0.7 1.4 2.0 S100A11 BC001410 1.0 2.0 2.0 98729.doc -54- 1301066
MetAP2 BC013782 0.175 0.21 1.2 S100A10 BC015973 0.15 0.25 1.7 SAPK L36870 0.40 0.95 2.4 #5 活化酶Calpain)2 AF261089 0.12 0.19 1.6 NM23D BC004880 0.70 1.3 1.9 NIAP U19251 4 2 2.0* SRB1 BC022087 0.08 0.13 1.6 WDR1 AB010427 1.5 5 3.3 HMT1 AF222689 0.19 0.05 3.8* eEFIS BC005291 0.65 0.15 4.3* eIF2Bs BC013590 0.40 0.75 1.9 ADAR1 U10439 0.65 0.8 1.2 *此差異反映於化療抗性的病患中基因表現之減少。 利用即時PCR使用下列引子序列來確認基因表現： 250654(起始將此基因以特定分子信標探針確認，然而，用 SYBR綠進行隨後的研究） 分子信標確認： 信標：FAM-CGCGTATGAACTGGGCTTATGTGACGCG-DABCYL (SEQ ID NO:13) 側邊正向弓丨子：CTGGGCTCTGCCTTAAACAC (SEQ ID NO:14) 侧邊反向弓丨子：GCTCCCAAAAGTTTGAACCA (SEQ ID NO:15) 内告p 正向弓I 子：TTGCCTGAGGCTGTAACTGA (SEQ ID NO:16) 内部反向引子：GCTCCCAAAAGTTTGAACCA (SEQ ID NO:62) 對SYBR綠： 正向：CCA CTT CTT TGC CAC AAA GT (SEQ ID NO:17) 反向：GAA TTC GGT CAG CTC AGA GT (SEQ ID NO:18) 98729.doc -55- 1301066 810612(將此基因以特定分子信標探針確認） 信標：FAM-CGCCTGGGTGGGTTTGAAGGAGGCG-DABCYL (SEQ ID NO:19) 偵！邊正向弓丨子：ATCGAGTCCCTGATTGCTGT (SEQ ID NO:20) 側邊反向引子：GCCTGCATGAGGTGGTTAGT (SEQ ID NO:21) 内吾P 正向弓丨子：CTTGCCATGACTCCTTCCTC (SEQ ID NO:22) 内部反向引子：GCCTGCATGAGGTGGTTAGT (SEQ ID NO:63) 39093 正向·· GCA GAA GCA CAT CGA CAA GT (SEQ ID NO:23) 反向：GCC TGC ATT TAA TCC ATT CTC (SEQ ID NO:24) 882511 正向：TAA CCA CGT CCT GCT GAA GT (SEQ ID NO:25) 反向：GCT TTA AGA AAG TTC TTA TCA AC (SEQ ID NO:26) 950367 正向：GCA CAG CGG AGT GGT AAG A (SEQ ID NO:27) 反向·· CAG AGG AGT CAG ACA CAT TG (SEQ ID ΝΟ··28) 34140 正向：GAT TAC TTA CTT CAG TGC TGT T (SEQ ID NO:29) 98729.doc 56- 1301066 反向·· CAT TCT TGC TAT AAC GTT TAA CA (SEQ ID NO:30) 726147 正向：CTC TGT GAC TTC GGC ATC A (SEQ ID NO:31) 反向：CAG ACA TCA GAG GGG ACA T (SEQ ID NO:32) 427980 正向：AAG AAC TGG GTT CAG TGG AAA (SEQ ID NO:33) 反向：GAG AGT GCA TGG TCT TGA GA (SEQ ID NO:34) 123980 正向·· AGC CAC CAG CTA AGT ACC TT (SEQ ID NO:35) 反向：CAT CGA TTT CAA CCG GAA CAA (SEQ ID NO:36) 824568 正向：GTG TGT GGA CCT CCA TGT TA (SEQ ID NO:37) 反向：AGC ACA CCA TTA CAG ACA AGT (SEQ ID NO:38) 1636620 正向：GGA ACC AGT TTC TGC AGG AA (SEQ ID NO:39) 反向：CTC CAG CAG CAC CTC AAT G (SEQ ID NO:40) 809639 正向·· ATC CAA GGT TAT GTG GTT TCT T (SEQ ID NO:41) 反向：CAC CTC CTG GGC TTC TGA A (SEQ ID NO:42) 98729.doc -57- 1301066 786687 正向：GAT CCA TGA AGC TAA TGT ACA A (SEQ ID NO:43) 反向：ACG GGC AGA AGC CTT CGT T (SEQ ID NO:44) 845441 正向：CCT GAG GTT CTC CGA GAT G (SEQ ID NO:45) 反向：TCC AGC CCG AAA TTC TCT GT (SEQ ID NO:46) 68605 正向：CAA GAG GCG GAA GGG TAA A (SEQ ID NO:47) 反向 1 : CAG CCG CTC GGG TAG GT (SEQ ID NO:48) 反向 2: CAC TAT GGA AGG ACC TTG CT (SEQ ID NO:49) 838636 正向：GGA TAC AGG TGT AGG TAA ATC (SEQ ID NO:50) 反向：TCC CAG ATT AGG AAT TTA TGT A (SEQ ID NO:51) 345077 正向：CTT CTG GAA CAG GCG AAG A (SEQ ID NO:52) 反向 1 : GCT GGC CCA GAC GAC GAA (SEQ ID NO:53) 反向 2 : GCA GAC ACA CGT GGA TGG T (SEQ ID NO:54) 825214 正向·· GAT GAA GTT AAA TCC TCC TTT G (SEQ ID NO:55) 反向：CCT CTT CTG TGC TGT CAC TT (SEQ ID NO:56) 98729.doc -58- 1301066 297392 正向：CCT GCA AGA AGA GCT GCT G (SEQ ID NO:57) 反向：CAC AGC TGT CCT GGC ATC A (SEQ ID NO:58) 897594 正向：AGC ACC AGC ACT GGC TCA TCA A (SEQ ID NO:109) 反向：AGA GCC AGA AGA GCT GCT A (SEQ ID NO:110) 713886 正向：AAC CGA CAA GTG TGA CAA CT (SEQ ID NO:lll)， 反向：TGT GCC TTG CGG GCA GTA (SEQ ID NO:112) 884867 正向：C ACC ACC ACC ACC AAA TGA A (SEQ ID NO:113) 反向 CA TCC ATT CGA CGC CTT TGA (SEQ ID NO:114) 321247 正向：CCA GCA GCA CAG TCA ACA AA (SEQ ID NO:115) 反向：TGG TAG CTT CTG CTT CAC AA (SEQ ID NO:116) 1630998 正向：CCA GAG CTG CAC TCA TTC C (SEQ ID NO.117) 反向：CAC TGT TGG TGA TAA AGC AAT T(SEQ ID NO:118) 756595 98729.doc 59- 1301066 正向·· GGA TAA AGG CTA CTT AAC AAA G (SEQ ID NO:119) 反向：CCA CTT TGC CAT CTC TAC AC (SEQ ID NO:120) 549728 正向：GAG CCG AGG AGG TTG AAA G (SEQ ID NO:121) 反向：CTC CTC TGG GTC TAT AGT GT (SEQ ID NO:122) 203003 正向·· GAC CCT GGT GGC GGT GAA (SEQ ID NO:123) 反向：GGT GCC TGC AGC ATC TTC A (SEQ ID NO:124) 814731 正向：GGA GAG CCC TGG CAC GTA (SEQ ID NO:125) 反向：CCT TCA TCT GCA GGT TCT TG (SEQ ID NO:126) 714196 正向·· ACG ACG GAC ACA TTA ATT ACT (SEQ ID NO:127) 反向：TCCATGCTGCAGCTGATGA(SEQIDNO:128) 809784 正向：C CTT CGG CAA AGG GAG AGT (SEQ ID NO:129) 反向：CTG GAT GAG TTC AGA GAG TTT (SEQ ID NO:130) 825293 正向·· GCC TCG ACT GGC AGA GAT (SEQ ID NO:131) 反向：CTT GTA GCT GAA GAT GTC AAT (SEQ ID NO:132) 98729.doc -60- 1301066
246120 正向：CTC TAT GCC CGG GAC AAG T (SEQ ID NO:133) 反向：AAG ACA TGT CGA AGC CAT ACA (SEQ ID NO:134)f 於對順鉑有抗性的卵巢癌細胞中向上或向下調控的基因之 摘要 編碼EF-手蛋白質之基因： 將編碼鈣活化的EF-手蛋白質的五個基因鑑定，亦即 S100A10、S100A11、SPARC、鈣活化酶（Calpain)2 及 Grancalcin。四個基因的其中兩者S100A10及S100A11係位 於染色體1上lq21處彼此相鄰（Pejovic，1995，Ann. Med· 27:73-78; Ridinger等人，1998，Biochimica et Biophysica Acta 1448··254-263)。染色體1之此區域曾被報導為卵巢癌 中染色體重排的一個溫床（Pejovic，1995，Ann. Med. 27:73睡78)〇 S100A10及S100A11的實際生物功能為未知。 S100A10及S100A11兩者於更有抗性的卵巢癌細胞株中以 較高程度表現（分別見圖1及圖2)。圖3顯示相較於來自更有 ‘反應的病患，在對化療更有抗性之病患中Sl〇〇A10及 S100A11 之 mRNA 提高。 SPARC(也稱為骨聯蛋白（osteonectin)及BM-40)為一種分 泌的蛋白質（Lane及 Sage，1994, FASEB J· 8: 163-173)。已證 實SPARC於瘤性卵巢之基質中高度表現（Paley等人，2〇〇〇, Gynecologic Oncology 78:336-341)及已證實在卵巢癌細胞 中引發細胞凋亡（Yiu等人，2001，Am· je Path〇1 98729.doc -61 - 1301066 159:609-622)。然而，曾偵測到高量SPARC於黑色素瘤中 (Ledda等人，1997, J· Invest. Dermatol· 108:210_214)及結腸 直腸癌中（Porte等人，1995, Int. J· Cancer 64:70-5)，及也曾 被報導促進細胞遷移及入侵於前列腺癌中（Thomas等人， 2000，Clin. Cancer Res. 6:1140 -9)及神經膠母細胞瘤 (glioblastoma)(Golembieski等人，1999，Int· J. Dev. Neurosci 17:463-72)。SPARC過度表現也促成乳癌細胞增加的移動性 及入侵（Briggs等人，2002，Oncogene 21:7077-91)。如本文 中顯示，發現SPARC在更有化療抗性的卵巢癌細胞株中以 較高程度表現（圖4)。SPARC mRNA也升高於取自腫瘤復發 的病患之樣品中，如圖5中所示。 1弓活化酶（Calpain)2為一種#5活化的蛋白酶。最近，報導 一種鈣活化酶（Calpain)2活性的抑制劑引發細胞凋亡於人 類急性淋巴性血癌及非霍奇金氏淋巴瘤以及實體腫瘤細胞 (Huang 及 Wang，2001，TRENDS in Molecular Medicine 7··355)。鈣活化酶（Calpain)2 mRNA於更有化療抗性的卵巢 研細胞株中為增加（圖6)。
Grancalcin為最近說明的Ca2+結合蛋白質，其屬於EF-手 蛋白質之五-EF-手亞族及在Ca2+結合時改變位置至膜 (Lolike等人，2001，J. Biol. Chem. 276:17762-9)。發現相較 於對以順I自處理更有反應的細胞株，Grancalcin mRNA於對 順鉑更有抗性的細胞株中為升高（圖7)。 編碼蛋白質涉及蛋白質轉譯及轉譯控制之基因：
MetAP2 :甲硫胺酸胺基胜肽酶（也稱為eIF-2相關的p67) 98729.doc -62- 1301066 之表現從未曾與卵巢癌連結。由此基因編碼的蛋白質似乎 有兩個功能。其自新近合成的蛋白質去除第一個甲硫胺酸 (Li 及 Chang，1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:152-9)及也與真核起始因子 2a(eIF-2a，eukaryotic initiation factor 2α;—種GTP結合蛋白質）相關及抑制其磷 酸化（Wu等人，1993, J· Biol. Chem. 268:10796-10801)。利 用針對MetAP2的抗體，顯見MetAP2表現於最有抗性的細胞 株OVCA 429中升高及於Hey(對順鉑最敏感的細胞株）中向 下調控（見圖8)。再者，當於得自對順鉑為基礎的化療有不 同程度抗性的三個病患之組織樣品中檢視MetAP2 mRNA 表現，相較於對化療抗性具有中等（圖9中的CAP2)及低等 (圖9中的CAP1)程度之病患，MetAP2顯見於最有抗性的病 患的樣品中最為提高（圖9中的CAP3)。一種藥物TNP-470， 其專一地針對MetAP2，目前正於臨床測試作為數種人類腫 瘤的血管新生抑制劑（Kruger及Figg，2000，Expert Opin. Investig. Drugs 9:1383-96)。再者，利用反意義寡核苷酸降 低MetAP2的細胞濃度已被證實引發細胞凋亡（Datta及Datta， ‘ 1999, Exp. Cell Res· 246:376-83)。此等觀察建議此蛋白質 可能為卵巢癌的治療中重要的目標。 eIF5為另一個用於轉譯起始及蛋白質合成之中心蛋白 質，其作用為GTPase活化因子蛋白質（Paulin等人，2001， Current Biol. 11:55塵9; Das 等人，2001，J· Bio. Chem. 276:6720-6)。偵測到兩個轉錄體及兩者的表現程度提高於 對順鉑具有最高抗性程度的卵巢癌細胞株中（圖10)及於更 98729.doc -63· 1301066 有抗性的病患中（圖11)。 eI㈣心麗向上調控☆顯示對順麵最高抗性的印巢 癌細胞株中（圖12)。*此基因編碼的蛋白質為包含有5個次 單元之鳥糞嗓呤核苦酸交換因子複合物之調控ε次單元 (Proud，2001，Prog· Mol. Subcell. Biol· 26:95- 114)。 eEFle mRNA於顯示對順#最高抗性程度的卵巢癌細胞 株中為向下調控（圖丨3)。EEF有關於多胜肽排列（Br〇wne及 Proud, 2002, Eur. J. Biochem. 269:5360-8) 〇 激酶： SAPK/Erk激酶1為一種雙重專一性的激酶，其活化 JNK1、JNK2及 P38但非 Erkl 或 Erk2(C_da，2000, lnt· j·
Biochem· Cell Biol· 32:581_7)。此基因及其蛋白質在此以前 尚未冒與卵巢癌相關。相較於更敏感的細胞株，發現此基 因的mRNA濃度於更有抗性的細胞株中更為提高（圖14)。 TESK2 ·此絲胺酸/經丁胺酸激酶主要位於細胞核中。然 而’當無活性時，其移動位置至細胞質。TESK2專一地碟 0 酉文化肌動蛋白素（cofilin)(於Ser_3)，此蛋白質與肌動蛋白去 聚合因子一起藉由刺激肌動蛋白細絲之去聚合及分離而在 肌動蛋白細絲的快速更替及以肌動蛋白為基礎的辨識扮演 重要角色（Toshima，2001，J· Biol· Chem· 276: 31449-58)。先 前未曾有報導與卵巢癌有連結。TESK2 mRNA於更有抗性 的細胞株中為升高（圖15)。 ： FAST激酶：此為Fas-活化的絲胺酸/經丁胺酸激酶，吾人 認為其涉及由Fas媒介的細胞凋亡（Tian等人，1995, J. Exp· 98729.doc •64- 1301066
Med· 182:865-74)。FAST激酶mRNA於更有化療抗性的細胞 株中為升高（圖16)。 其他： KLK6 ··此為一種絲胺酸蛋白酶，也稱為Zyme及 Neurosin。此基因屬於人類kallilrein基因家族，其也包括較 了解的分子如前列腺專一的抗原（PSA，prostate specific antigen)早已被用作為前列腺癌的標記及也被研究為卵巢 癌的標記（Diamandis，2000，Clinical Biochem. 33:579_83) 〇 已報導於具有卵巢癌的病患中相較於正常控制組KLK6之 血清濃度升高（Diamandis，2000，Clinical Biochem. 33:579-83)。此基因之表現程度於測試的更有化療抗性的細 胞株中為更高（圖17)。也值得注意的是此基因位於卵巢癌中 時常染色體重新排列之另一個區域（Pejovic，1995，Ann. Med.27:73-78) 〇 ΗΜΤ1(也稱為PRMT1):此基因編碼一種蛋白質精胺酸Ν-甲基轉移酶，發現其兩個變體之表現於乳癌中為向下調控 (Scorlis 等人，2000，Biochem. Biophys. Res. Commun. 278:349-5 9)。HMT1表現於對順鉑更有抗性的細胞中為向下 調控（見圖18)。同時令人感興趣注意的是HMT1係位於染色 體19的19q 13.3處與編碼KLK6基因之存在處相同的染色體 區域。 ARA9(也稱為芳基烴受體-交互作用蛋白質（AIP, Aryl hydrocarbon receptor-interacting protein)及 XAP2)被視為在 AHR_媒介的信號傳遞中扮演角色（Kazlauskas等人，2002, J. 98729.doc -65- 1301066
Biol· Chem. 277:11795-801)。來自此基因的mRNA於對順鉑 更有抗性的細胞株中為升高（圖19)。其也位於染色體11(於 11 ql 3.3處），此為與卵巢癌相關的增加的頻率之染色體重排 的另一個區域（Pejovic，1995, Ann· Med· 27:73-78)。 肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2曾於肌肉上皮癌中被研究 (Mosunjac等人，2000, Diagn· Cytophathol· 23:151-5)但未於 卵巢癌中。相較於更敏感的卵巢癌細胞株，於對順鉑更有 抗性的細胞株中肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2的表現為稍 微升高（圖20)。 發現神經細胞凋亡抑制蛋白質（NAIP，neuronal apoptosis inhibitory protein)於對順麵最有抗性的細胞株中為稍微向 下調控（圖21)。NAIP從未被連結至卵巢癌（Tamm等人，2000, Clin. Cancer Res. 6:1796-1803) 〇 RNA結合蛋白質Sl(RNPSl)為前-mRNA接合之普遍活化 因子及可與涉及促進細胞凋亡的ASAP及SART3腫瘤排斥 抗原形成複合物（Schwerk等人，2003，Mol. Cell Biol. 23:2981-90; Harada等人，2001，Int· J. Cancer 93: 623-8)。 發現於對順鉑有抗性的細胞株中其量升高（圖22)。 熱休克轉錄因子2(HSF2，Heat Shock Transcription Factor 2)調控熱休克蛋白質基因之表現（Mathew等人，1998，Mol. Cell Biol. 18:5091 _8)。HSF2也似乎能夠與蛋白質填解酶 2A(PP2A，protein phosphatase 2A)之催化次單元競爭結合 其調控次單元PR65,及被認為作用為新穎PP2A調控蛋白質 (Hong 等人，2000，Biochem. Biophys· Res. Commun. 98729.doc -66- 1301066 272:84-9)。HSF2的mRNA量於更有抗性的細胞株中升高（圖 23)。 WDR1 :發現WD重複蛋白質於所有真核細胞中及在許多 細胞功能包括信號傳導、轉錄及增殖之調控中扮演重要角 色（Li 等人，2000，Biochem· Biophys. Res. Commun. 274:117-23)。然而，WDR1之實際功能為未知。相較於更敏 感的細胞株，此基因之mRNA於更有抗性的細胞株中為升高 (圖 24)。
Ftl :此基因的開放讀碼區呈現與泛素（ubiquitin)-結合的 酵素類似及於老鼠中其基因圖譜靠近Rb相關的pl30基因 (Lesche等人，1997，Mamm. Genome 8:879-83)。細胞遺傳 學上，Ftl定位於染色體16之區域16ql2.2，此區域於人類癌 症中反覆地改變。於卵巢癌中失去異質性（heterozygosity) 已被報導於此染色體位置。Ftl mRNA之量於對順鉑更有抗 性之細胞株中為更高（圖25)。 nme4(也稱為nm24-h4)為一種核苷二磷酸激酶，其適度 地ii§ 4表現於腎臟細胞癌中及強烈過量表現於結腸直腸癌 中（Hayer等人，2〇〇1，Anticancer Res· 21:2821 -5)。NME4 mRNA於更有抗性的細胞株中為升高（圖26)。 ADAR1 :由腺苦酸去胺酶包括ADAR1編輯的腺苦-至·肌 核# RNA造成交替接合位置的產生或密碼子的改變，因此 導致蛋白質功能的改變（Wang等人’ 2000，Science 290:1765>。同時令人感興趣注意的是ADAR1基因係位於染 色體丨的lq2l.l-q21.2處，於如同S100A10及S100A11之時常 98729.doc -67- 1301066 重排的染色體區域（Pejoic，1995，Ann. Med. 27:73-78)。 ADAR1 mRNA於對順鉑更有抗性的細胞株中為升高（圖 27)。 NBR1 : NBR1的實際分子功能為未知。（熟悉本技藝者將 知於本發明方法中的基因之有效並非依賴基因的功能性質 之細節或實際概念。）基因定位研究已顯示NBR1基因與 BRCA1基因頭對頭排列（Whitehouse等人，2002，Eur. J. Biochem. 269:538-45)。NBR1未曾被報導與卵巢癌相關。 NBR1 mRNA於對順鉑最有抗性的細胞株OVCA 429中為升 高（圖28)。 鋅指狀蛋白質262/MYM :編碼含有MYM鋅結合序基 (motif)蛋白質的基因家族之一員（Smedley等人，1999, Genomics 60:244-7)。此蛋白質未曾與卵巢癌有關；然而， 相較於其他測試的細胞株，此基因的mRNA於最有化療抗性 的細胞中為升高（圖29)。 MRPL4 :此基因及其蛋白質從未與卵巢癌有關。然而， 此基因係位於染色體19的19p 13.2處，於卵巢癌中時常重排 的區域（Pejoic，1995, Ann. Med. 27··73-78)。MRPL4 mRNA 於有化療抗性的細胞株中為升高（圖30)。 HYA22 ··此基因及其蛋白質從未與卵巢癌有關。然而， 此基因係位於染色體3的3p2 1.3處，於卵巢癌中與染色體重 排有關的區域（Pejoic， 1995， Ann. Med. 27:73-78; Protopopov等人，2003，Cancer Res· 63:404-12; Senchenko 等人，2003，Oncogene 22:2984-92)。相較於更敏感的細胞 98729.doc -68 - 1301066 株，HYA22 mRNA於對順鉑更有抗性的細胞株中為升高（圖 31)〇
Vinexin β :也稱為SCAM-1，此基因編碼適應子蛋白質， 屬於也包括Vinexin β、CAP/Ponsin及ArgBP2之蛋白質家族 (Kioka等人，2002，Cell Structure and Function 27:1-7) 〇 先 前技藝中不知道Vinexin與卵巢癌有關聯。Vinexin β mRNA 於有化療抗性的細胞株中為升高（圖32)。 G-CSFR :有粒細胞菌落-刺激因子受體（G-CSFR， Granulocyte colony-stimulating factor receptor)於初期印巢 癌中為幾乎普遍地表現。然而，僅於研究的案例之一半發 現其配體（G-CSF)之表現於相同細胞中，暗示自體内分泌 (autocrine)系統之存在（Savarese等人，2001，Cancer Letters 162:105-15)。於研究案例的另三分之一中發現G-CSF全部 於基質，暗示可能存在旁體内分泌（paracrine)系統，其中間 葉（mesenchymal)細胞可能提供配體制表現受體的癌細胞 (Savarese等人，2001，Cancer Letters 162:105· 1 5)。一個初 步、回顧的評估建議相較於卵巢癌表現自體内分泌軸心的 病患，單獨表現旁體内分泌環的病患中整體存活率更差 (Savarese等人，2001，Cancer Letters 162:105-15)。G-CSF 及其受體也可共同表現於正常卵巢及一些良性卵巢腫瘍 中。G-CSFR mRNA於有化療抗性的細胞株中為升高（圖33)。 SRB 1 :也稱為CLA-1，此基因編碼辨識負電荷微脂粒及 細胞凋亡細胞兩者的受體。曾報導腫瘤細胞參與細胞凋亡 細胞及組織的攝取及去除（Fukasawa等人，1996，Exp. Cell 98729.doc -69- 1301066
Res· 222:246-50)。此等觀察的生物重要性不為人們了解。 於SRB 1及卵巢癌之間沒有先前揭示的連結。SRB 1 mRNA . 於有化療抗性的細胞株中為升高（圖34)。 . IGFBP-7 : —個更近來確認的IGF結合蛋白質之一員，此 蛋白質以較低親合力結合IGF-I及IGF-II(Oh，1998，Breast Cancer Res· Treat· 47:283-93)。IGFBP-7 mRNA於有化療抗 性的細胞株中為升高（圖35)。 RAB22A屬於Ras蛋白質之RAB亞族（Kauppi等人，2002, J· _ Cell Science 115:899-911)。RAB22A mRNA於有化療抗性的 細胞株中為降低及於對順鉑更有反應的細胞株中為升高 (圖 36)。 KIAA0082 : KIAA0082為一個全長基因，對於其沒有發 表的資訊。此基因的mRNA表現於對順鉑有抗性的細胞株中 為升高（圖37)。 NCOR2 :此為於SMRT緊密相關的共同抑制子蛋白質，具 有對甲狀腺荷爾蒙受體專一的交互作用區塊（Jepsen及 籲 Rosenfeld，2002, J. Cell Science 115:689- 98)。相較於對順 始敏感的細胞株，於有化療抗性的細胞株中此基因的mRNA 表現為降低（圖38)。 MT1 :金屬硫蛋白1L(MT1，Metallothionein L)之確實生角 m 色為未知，然而，先前的研究已報導MT量於順鉑抗性的人 崎 Λ 類卵巢癌細胞中為升高（Andrews and Howell，1990，Cancer , Cells 2:35-43)及以MT基因轉染的細胞變成對順鉑有抗性 (Nakano等人，2003，Anticancer Res. 23:299-304)。吾人認 98729.doc -70- 1301066 為MT作用於在細胞質中隔離順鉑，所以增加細胞對藥物的 抗性（Nakano等人，2003，Anticancer Res· 23:299-304)。矛 盾的是，MT1 mRNA的量似乎於對順鉑最敏感的細胞中 (Hey)為高度地升高（圖51)。 MPP10 ·· M-相填蛋白（MPP10，M-phase phosphoprotein) 為大部分細胞質蛋白質但可被分泌及為人類U3小核仁核醣 蛋白質的的成分。多數此蛋白質與核仁纖維蛋白（fibrillarin) 同在一起（Baserga等人，1997，Nucleic Acids Symp. Ser. 3 6:64-7)，及涉及rRNA加工。從未有報導此基因或其產物 與卵巢癌有關。隨著對順鈾敏感度的增加MPP1 〇表現量增 加（圖5 2)。 實例3 試管内測試SPARC作為治療目標 相較於其他測試的細胞株，SPARC於最有順鉑抗性的細 胞株（OVCA 429)中以最高量表現（圖4)。於技藝中已知此蛋 白吳為一種約結合釀蛋白’其調控黏著及可於組織重建及 血管新生促進腫瘤發展及侵入扮演重要角色（Le(ida等人， 1997，J. Invest. Dermatol. 108:210-214)。 將SPARC表現測試於人類腹水體液樣品中，其得自當病 患的腫瘤已復發時個體之細胞縮減手術前及手術後9個月 (圖5 ; SPARC觀察到兩個轉錄體係由於不同的多腺普化；
Ledda等人，1997, J· Invest. Dermatol. l〇8:21〇- 214)。手術 後SPARC表現量大幅增加並與此病患之不良結果相關聯。 此觀察也與其他團體研究其他實體癌症形式所發現的一致 98729.doc -71 - 1301066 (Golembieski等人，1999，Int. J. Dev. Neurosci· 17:463-72; Briggs 等人，2002，Oncogene 21:7077-91; Huang及 Wang， 2001，TRENDS in Molecular Medicine 7:355; Lollike等人， 2001，J. Biol· Chem_ 276:17762-9)，代表增加的 SPARC表現 可為除了卵巢癌，於其他類型實體腫瘤中化療處理成功及 疾病發展的預兆。 為了測試於OVCA 429(最有抗性的卵巢癌細胞株）中是否 降低SPARC蛋白質表現可降低其對順鉑的抗性，設計三種 siRNA針對SPARC信息之不同區域。使用的SPARC siRNA 為： #1 目標序歹丨J : AATCC TGT CCA GGT GGA AGT A (SEQ ID ΝΟ:1)； #2 目標序列：AAGCT CCA CCT GGA CTA CAT C (SEQ ID ΝΟ·2);及 #3 目標序列：AATGA CAA GTA CAT CGC CCT G (SEQ ID NO:3)。 利用siPORT脂質流程（Ambion)進行本文中說明的 ‘ siRNA實驗。轉染前，將細胞植入含有10% FBS的ΜΕΜα培 養基中24小時，以便在進行實驗之時細胞為30-70%緻密度 (confluent)。利用無FBS或抗生素之培養基製備siPORT及 siRNA複合物。對於siPORT，將6孔盤每孔4微升及96孔盤 每孔0.5微升加至培養基，由漩渦震盪混合，及於室溫培養 25分鐘。對於siRNA，使用稀釋於培養基1-25 nM(普通使用 12·5 nM)濃度之siRNA。將siPORT加至siRNA混合物，溫和 98729.doc -72- 1301066 地混合，及於室溫培養20分鐘。將細胞以無血清培養基清 洗後，將細胞加至盤中（當使用96孔盤，將細胞以4.5xl04 之密度植入；當使用6孔盤，將細胞以1-5x105之密度植入）。 siPORT/siRNA複合物加至各盤/孔及將盤溫和地搖動以分 散複合物遍佈細胞表面。於正常細胞培養條件下4小時後， 將額外含10% FBS的培養基加至細胞。48小時後，萃取總 RNA。 遵守供應商（Ambion)的操作指南將細胞以siRNA構體轉 染。對於6孔盤，使用12·5 nM siRNA/孔於轉染。以1 : 100 稀釋二重複進行siRNA的OD26〇讀值。將讀值平均，而後乘 上稀釋因子及而後乘上40(1之OD26〇等於40微克/毫升RNA) 以得到單位為微克/毫升之siRNA最終濃度。將數字除以 14(RNA之微克數於1 nmole平均21員dsRNA)以得到最終 siRNA濃度（單位μΜ)，及而後轉變使得濃度以nM呈現。 將此等研究之結果示於圖48中。所有三個siRNA皆降低 於此等細胞中之SPARC mRNA量。僅以siPORT或單獨以 siRNA #2之有意義股處理的細胞於SPARC mRNA表現未顯 示任何顯著降低。然而，包括所有三種siRNA之組合處理確 實具有些效果（圖48)。 也研究在SPARC siRNA存在中對OVCA 429細胞對抗順 鉑之能力。將細胞以單獨siPORT處理或以單獨siRNA #2之 有意義股或完整siRNA #2轉染。在轉染後48小時使細胞復 原及而後以增加濃度順鉑或相對應濃度DMOS作為控制組 處理。將細胞暴露至藥物24小時，之後將藥物去除及使細 98729.doc -73 - 1301066 胞復原再72小時。而後藉MTT分析法評估此處理對細胞生 存力之影響。將結果示於圖49中；圖50顯示定量對細胞效 果後之此等結果。數據建議在暴露至順鉑前以完整siRNA #2處理細胞降低其抗性程度一半（僅以siPORT或僅以有意 義股處理的控制組之IC5G〜25-50 μΜ至以siRNA #2處理後之 IC50〜12·5 μΜ) 〇 此等實驗的結果指出SPARC為卵巢癌的治療目標及標記 物。 實例4 試管内測試MetAP2/p67作為治療目標
MetAP2/p67為一種雙功能蛋白質，其兩個功能對細胞生 長皆為重要（Li 及 Chang, 1996，Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:152-9; Wu 等人，1993，J· Biol. Chem. 268:10796-10801)。於一個角色中，蛋白質結合至真核起始 因子 2(eIF-2，eukaryotic initiation factor 2)及抑制其構酸 化，及於其另一個角色中其C-端區塊具有酵素活性催化N-端甲硫胺酸自許多細胞蛋白質水解（Wu等人，1993, J. Biol. Chem. 268:10796-10801)° eIF-2之磷酸化改變其轉譯結果使 得不同信息於不同磷酸化位置被轉譯。此外，甲硫胺酸胺 基胜肽酶活性普遍地對蛋白質活性為重要及無法去除N-端 甲硫胺酸常製造無活性的蛋白質（Li及Chang，1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:152-9) 〇 來自煙曲黴菌（Aspergillus fumigatus)的煙曲黴素及其合 成的類似物TNP-470共價鍵地結合至及抑制MetAP-2的甲 98729.doc -74- 1301066 硫胺酸胺基胜肽酶活性但不影響密切相關的MetAP-l之活 性（Griffith 等人，1998，Proc. Natl. Acad. Sci, USA 95: 15183-8)。同樣重要需注意的是以煙曲黴素處理數種不同細 胞類型造成MetAP-2之增加表現（Wang等人，2000，J· Cell Biochem· 77:465-73);吾人認為細胞藉由增加其表現量而適 應MetAP-2的功能喪失。 說明於本文中的實驗建議〇VC A 429表現比對順鉑最敏 感的細胞株（Hey)多大約7倍Met AP-2(圖8)。北方墨點分析 也證實MetAP-2表現量於臨床上對順鉑為基礎的化療更有 抗性之病患中也為升高。圖9顯示MetAP-2 mRNA之量於最 有抗性的病患（CAP3)中比最小抗性的病患（CAPi)中高大約 3倍。對以順始為基礎的化療具有中等抗性程度之病患也呈 現MetAP-2 mRNA中等量。 將以MTT為基礎的分析法進行於將〇vcA 429細胞以單 獨煙曲黴素、單獨順鉑、及以不同濃度順鉑及煙曲黴素組 合處理4、8及24小時。將結果示於圖4〇、41及42。圖4〇(上 圖）顯示增加煙曲黴素濃度對〇VCA 429細胞存活之影響。 觀察到一些細胞死亡但高達8〇%細胞存活，即使於非常高 浪度煙曲黴素。單獨以順麵處理細胞（下圖）造成％。大約為 100 μΜ順舶。除了增加順銘量，〇1微克/毫升煙曲黴素的 存在降低ic5G至大約為50 μΜ。然而，在微克/毫升煙曲徽 素存在中以順#處理細胞造成增加的細胞存活，其A。大約 為 200 μΜ。 無論培養時間的長度，在01微克/毫升煙曲徽素存在中順 98729.doc 1301066 鉑的效果增強但是當在ίο微克/毫升煙曲黴素存在中以順 #處理細胞時效果相反（圖41及42)。此等觀察建議低量煙曲 黴素時，達到有利的平衡及藥物與順鉑協同地作用導致更 _ 多細胞死亡。 設計三種siRNA針對MetAP-2信息之不同區域（圖43)以決 定抑制MetAP-2表現之效果。MetAP_2 siRNA為：
#1 目標序列：AAAGA TCA GCA TTG GAA GAT A (SEQ ID N〇：4) ^ #2 目標序列：AAGCA CAT CGA CAA GTT AGA A (SEQ ID N〇:5) #3 目標序歹丨J : AAACA GTG CCG ATT GTG AAA G (SEQ ID NO：6) 圖44顯示siRNA #1對OVCA 429中MetAP-2之量的影響。 將控制組細胞以單獨相同siRNA之有意義股轉染或以轉染 試劑（siPort脂質）處理。以siRNA #1轉染細胞降低MetAP-2 表現量一半，即使轉染效率不是100%。於彼等細胞中未觀 _ 察到對GAPDH表現量之影響，代表由此處理未普遍地影響 基因表現。再者，以siRNA #2及#3處理細胞未造成MetAP-2 表現之降低。 藉由以siRNA #1、單獨有意義股#1、或單獨siPort脂質處 k
理OVCA 429細胞，測試當阻止MetAP-2表現時OVCA 429 抵抗順鉑之能力。與siRNA培養48小時後，將細胞暴露至不 ^ 同濃度順鉑或其溶劑DMSO相對應濃度24小時。將此實驗之 結果定量及示於圖45。結果指出siRNA #1之存在降低OVCA 98729.doc -76- 1301066 429之IC5〇由25 μΜ至大約3 μΜ。圖46顯示進行MTT分析後 96孔盤之照片。 綜合結果指出MetΑΡ-2為卵巢癌中治療介入之有用目標。 實例5 試管内測試作鈣活化酶（Calpain)2及S100A10為治療目標 及降低S100A11表現於OVCA 429細胞 549728(转活化酶（€31卩“11)2) 利用上述方法設計三種siRNA針對鈣活化酶（Calpain)2信 息之不同區域。妈活化酶（Calpain)2 siRNA為： #1 AA GGC ΑΤΑ CGA CAA GAT CAA C (SEQ ID NO:7)； #2 AA ACT TCT TCC TGA CGA ATC G (SEQ ID NO:8);及 #3 AA ACG CTA TTC AAG ΑΤΑ TTT A (SEQ ID NCh9)。 如上述將各siRNA導入OVCA 429中。圖53顯示於OVCA 429細胞中利用此等序列破壞實驗之結果。利用上述流程， 序列#1及#3破壞基因表現量約50%。此外，將包含有siRNA #3之OVCA 429細胞以不同濃度順鉑處理。通常，在暴露至 藥物24小時後OVCA 429細胞之IC5〇為大約25 μΜ順鉑。如 圖54中所示，鈣活化酶（Calpain)2 siRNA #3降低IC50至3.12 μΜ順鉑，因而增加細胞對順鉑的敏感性數倍。同樣地，將 OVCA 429細胞在順鉑的存在或不存在下以增加濃度之鈣 活化酶（Calpain)抑制劑I(ALLN)處理。如圖55中所示，ALLN 在順鉑的存在中降低此等細胞的IC50至12.5 μΜ。因此，鈣 活化酶（Calpain)2 siRNA #3 比 ALLN對於 OVCA 429細胞對 順鉑的敏感性具有更大效果。 98729.doc -77- 1301066 756595(S100A10) 產生三種siRNA針對S100A10信息： #1 AA ATG GAA CAC GCC ATG GAA A(SEQ ID NO:59)； #2 AA ATT CGC TGG GGA TAA AGG C (SEQ ID NO:60);及 #3 AA TAA TGA AGG ACC TGG ACC A (SEQ ID NO:61)。 如圖56中顯示，siRNA #3降低OVCA 429之IC50由25 μΜ 至6.25 μΜ順鉑，因而增加細胞對順鉑的敏感性。 810612(S100A11) 利用上述方法設計三種siRNA針對S100A11信息之不同 區域。S100A11 siRNA為： #1 AA AGG ATG GTT ATA ACT ACA C (SEQ ID NO:10)； #2 AA GAA ACT GGA CAC CAA CAG T (SEQ ID NO:ll);及 #3 AA TCT GAT TGG TGG CCT AGC T (SEQ ID NO:12)。 如上述將各siRNA導入OVCA 429中。圖57顯示利用上述 方法siRNA #1及#2分別破壞OVCA 429細胞中基因表現量 ^ 50%及 25% 〇 實例6
MetAP-2、SPARC、鈣活化酶（Calpain)2、S100A10 及 S100A11之表現於大腸癌 大腸cDNA之市售配對組合係得自BD Biosciences， Inc.(San Jose，CA)，其係由得自非腫瘤組織及也自相鄰腫 瘤組織之五個個體分離。 98729.doc -78 - 1301066 進行定量即時PCR實驗以決定於正常及腫瘤大腸組織中 MetAP-2、SPARC、S100A10、S100A11及鈣活化酶（Calpain)2 之表現量。圖58顯示MetAP-2之表現量於5對配對的大腸 cDNA中。資料指出兩個病患具有高度升高的表現量於腫瘤 cDNA相較於其配對的#腫瘤cDNA(病患B及C ;圖58)。另 一個病患僅顯示稍微升高的表現於腫瘤cDNA相較於其配 對的非腫瘤cDNA(病患A ;圖58)。使用OVCA 429中的表現 量作為參考。先前報告已證實人類大腸癌之肝轉移可由 MetAP-2 抑制劑 TNP-470 避免（Tanaka 等人，1995，Cancer Res. 55:836-9) 〇 圖59顯示SPARC mRNA之表現量於5個配對的腫瘤樣品 的其中4個相較於其配對的非腫瘤cDNA為升高。圖60顯示 S100A11 mRNA之表現量於所有的配對腫瘤樣品相較於其 配對的非腫瘤cDNA為升高。圖61顯示S100A10 mRNA之表 現量於5個配對的腫瘤樣品的其中4個相較於其配對的非腫 瘤cDNA為升高。圖62顯示辦活化酶（Calpain)2 mRNA之表 現量於所有的配對腫瘤樣品相較於其配對的非腫瘤cDNA 為升南。 綜合此等觀察建議MetAP_2以及SPARC、S100A10、 S100A11及i弓活化酶（Calpain)2為大腸癌病患的治療目標。 實例7 三明治ELISA用以偵測血清中分泌的蛋白質 將96孔微量滴定盤之孔塗佈針對研究的基因產物培養的 抗體。將純化的重組目標基因產物之部分連續稀釋及用來 98729.doc -79- 1301066 產生定量的標準曲線。而後將病患血清的部分加至各孔。 將盤子加蓋以避免蒸發及於4°C培養數小時至隔夜。將抗原 取出，及將孔以碌酸緩衝的鹽水（PBS，phosphate buffered saline)清洗3次。將300微升阻播溶液（3% w/v魚膠溶液於 PBS)加至H及&室溫支吾# 2小日寺。將阻播$液去除及將孔 以PBS清洗3次。而後將連結辣根過氧化酶之適當抗體加至 各孔（每孔100微升）及於室溫培養1-2小時。而後將抗體去除 及將孔以ΝΡ-40溶液（0.05% ν/ν ΝΡ-40於PBS)清洗3次。藉由 加入 ABTS(Rockland Immunochemicals)至各孔（以每孑L 100 微升）於室溫30分鐘及利用微量盤讀值器於405 nm讀吸收 值而偵測結合。若使用鹼性磷酸連結取代過氧化酶，使用 pNPP(Rockland Immunochemicals)代替 ABTS憤測結合。 一旦由利用純化的蛋白質產生的標準曲線決定偵測極 限，測試一些沒有癌症的對象及一些曾被診斷具有癌症或 良性症狀的病患以決定特定研究的基因產物之預期濃度範 圍。具有癌症的病患之預期範圍定義可用來鑑定或區分具 有卵巢癌的病患或具有復發疾病的病患與有反應的病患或 不具癌症的健康對象之界線。 實例8 siRNA媒介的基因表現”破壞”： 遵照上述流程測試針對數種基因的siRNA於卵巢癌細胞 株中降低（或π破壞’’）其個別基因的能力。於各例中，將數個 siRNA針對 GC -内容配對（來自 Dharmacon，Inc，Lafayette， CO)於測試的siRNA的控制組（非專一性）siRNA測試。於一 98729.doc -80- 1301066 些情況中，也包括負控制組（無處理）。表現破壞量隨不同 siRNA改變。將特定的基因及對各特定基因之siRNA序列說 明於下： 1·將兩個 siRNA產生 SAPK/Erkl(L36870): L36870(726147) 目標序列 #1(SEQ ID NO:64): AAA TGG GAC GAG GAG CTT ATG (開始於編碼序列中的bp 320) 目標序列 #2(SEQ ID NO:65) : AAG CGC ATC ACG ACA AGG ATA (開始於編碼序列中的bp 831) 兩序列皆成功降低SAPK的表現，其中序列#2產生mRNA 量之6 0 %降低。 2.為 eEFls(BC005291)將三個 siRNA產生： BC005291(306921) 目標序列 #1(SEQ ID NO:66) : AAC AGG ATT GAC TAC TAT AGC(開始於編碼序列中的bp 123) 目標序列 #2(SEQ ID NO:67) : AAT ACA GGG TCA CTC AAG TAG (開始於編碼序列中的bp 227)1 目標序列 #3(SEQ ID NO:68) : AAA TAT CTT AAT GTG TCT CGC (開始於編碼序列中的bp 412) 目標序列#1及2皆成功降低eEF 1ε的表現，其中序列#1產 生mRNA量之65%降低。 3·為 G-CSFR(M59818)將三個 siRNA產生： M59818(809639)
目標序列 #1(SEQ ID NO:69): AAG TGT GAG CTG GCG 98729.doc -81 _ 1301066 CAC AAG (開始於編碼序列中的bp 793) 目標序列 #2(SEQ ID NO:70) ·· AAG AGC CCC CTT ACC CAC TAC (開始於編碼序列中的bp 1666) · 目標序列 #3(SEQ ID NO:71) ·· AAC AGG AAG AAT CCC CTC TGG (開始於編碼序列中的bp 1957) 目標序列#1及3降低G-CSFR的表現程度，其中序列#1產生 mRNA量之53%降低。 4·為 ARA9/XAP2(U31913)將三個 siRNA產生： φ U31913(814731) 目標序列 #l(SEQIDNO:72) : AAACGTGTG ATACAG GAA GGC (開始於編碼序列中的bp 48) 目標序列 #2(SEQ ID NO:73) : AAC AAG TAC GAC GAC AAC GTC (開始於編碼序列中的bp 775) 目標序列 #3(SEQ ID NO:74) : AAC GTC AAG GCC TAC TTC AAG (開始於編碼序列中的bp 790) 目標序列#2及3造成ARA9表現的降低，其中序列#3產生 φ mRNA量之50%降低。 ^ 5·為 RNPS1(AF015608)將三個 siRNA產生： AF015608(897594) 目標序列 #1(SEQ ID NO:75) ·· AAT ATT CAT ACG GCA TGG ACT (開始於編碼序列中的bp 327) 目標序列 #2(SEQ ID NO:76) : AAC CTA AAA TAG AAG ACC CCT (開始於編碼序列中的bp 680)
目標序列 #3(SEQ ID NO:77) : AAA AGA TGC TGA CTC 98729.doc -82- 1301066 AGA AAA (開始於編碼序列中的bp 752) 所有三個序列皆成功降低RNPS1之表現，其中序列#1產生 mRNA量之35%降低。 6·為融合的腳趾（BC001134)將三個siRNA產生： BC001134(321247) 目標序列 #1(SEQ ID NO:78) : AAC CTA AAA TAG AAG ACC CCT (開始於編碼序列中的bp 680) 目標序歹4 #2(SEQ ID NO:79) : AAG ACC CCT ATG CAA TTA GCT (開始於編碼序列中的bp 692) 目標序列 #3(SEQ ID NCh80) : AAA AAG CCT GAA GAA CAG CAC (開始於編碼序列中的bp 769) 所有三個序列皆成功降低融合的腳趾之表現，其中序列#2 產生mRNA量之43%降低。 7·為 Grancalcin(BC005214)將三個 siRNA產生： BC005214(34140) 目標序列#1(SEQ ID ΝΟ··81) ·· AAA TGG GAT TTA ATG CAT TCA (開始於編碼序列中的bp 323) 目標序列 #2(SEQ ID NO:82) : AAC TTC ATG ACT GTT GAT CAA (開始於編碼序列中的bp 379) 目標序列 #3(SEQ ID NO:83) : AAC ATC ATG AGT TGC GTC AAG (開始於編碼序列中的bp 419) 所有三個序列皆成功降低Grancalcin之表現，其中序列 #2產生mRNA量之83%降低。 8.為 SRB1/CLA1/CD3611(BC022087)將三個 siRNA產生： 98729.doc -83 - 1301066 BC022087(756687) 目標序列 #1(SEQ ID NO:84) : AAG CAG CAG GTC CTT AAG A AC (開始於編碼序列中的bp 109) 目標序列 #2(SEQ ID NO:85) : AAT CTC ATC AAC AAG TAC TTT (開始於編碼序列中的bp 565) 目標序列 #3(SEQ ID NO:86) : AAT TCA GAA CGT CAG CAC CTG (開始於編碼序列中的bp 981) 目標序列#1及3成功降低SRB1之表現，其中序列#1產生 mRNA量之60%降低。 9.為〖1八八0082(6(3031890)將三個8丨1^^產生： BC031890(825293) 目標序列 #1(SEQ ID NO:87): AAG AGG AGA ACT GAC CCA GAA (開始於編碼序列中的bp 4) 目標序列 #2(SEQ ID NO:88) : AAA TGA GCG ATT GGA TGG TGG (開始於編碼序列中的bp 509) 目標序列 #3(SEQ ID NO:89) : AAG ATC ATC AAG GGC TCC AGT (開始於編碼序列中的bp 2164) 序列#1產生mRNA量之65%降低。序列#2及#3對mRNA量 無影響。 10·為 eIF2Bs(BC013590)將三個 siRNA產生： BC013590(1630998) 目標序列 #1(SEQ ID NO:90) : AAT GTG GTT CGA ΑΤΑ ATT ACA (開始於編碼序列中的bp 352)
目標序列 #2(SEQ ID NO:91) : AAA CTC GAG ATG ACT 98729.doc -84- 1301066 TTG TGC (開始於編碼序列中的bp 800) 目標序列 #3(SEQ ID NO:92) : AAT CAA CAG CTG CAG AGG TTC (開始於編碼序列中的bp 2098) 序列#1產生mRNA量之57°/。降低，序列#2產生mRNA量之 54%降低，及序列#3產生mRNA量之43%降低。 11·為肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2(D83735)將三個siRNA 產生： D83735(713886) 目標序列 #1(SEQ ID NO:93) : AAG GAT GGA ACT ATC TTA TGC (開始於編碼序列中的bp 163) 目標序列 #2(SEQ ID NO:94) : AAT TTC GAC GAT GCC ACC ATG (開始於編碼序列中的bp 457) 目標序列 #3(SEQ ID NO:95) : AAC CGA CAA GTG TGA CAA CTC開始於編碼序列中的bp 708) 所有三個序列皆降低基因表現程度，其中序列#3產生 mRNA量之75%降低。 12.為 HYA22(D88153)將三個 siRNA產生： D88153(123980) 目標序列 #l(SEQIDNO:96) : AAAGAAATGTGTGGT CAT TGA (開始於編碼序列中的bp 507) 目標序列 #2(SEQ ID NO:97) : AAA TCG ATG GAA CTA TAC ATC (開始於編碼序列中的bp 596) 目標序列 #3(SEQ ID NO:98) : AAC TAT ACA TCA GGT GTA TGT (開始於編碼序列中的bp 606) 98729.doc -85- 1301066 所有三個序列皆降低基因表現程度，其中序列#3產生 mRNA量之60%降低。 13·為 CA125(BC009808)將三個 siRNA產生： BC009808(CA 125) 目標序列 #1(SEQ ID NO:99) : AAT GGT TTC ACC CAT CAG AGC (開始於編碼序列中的bp 235) 目標序列 #2(SEQ ID N0:100) : AAG GGC TCA GCT ACA TTC AAC (開始於編碼序列中的bp 2203) 目標序列 #3(SEQ ID NO:101) ·· AAT ACA ACG TCC AGC AAC AGT (開始於編碼序列中的bp 3380) 序列#3產生mRNA量之50%降低。 14. 為HMT1(AF222689)將兩個siRNA產生及於Hey細胞中測 試： AF222689 目標序列 #1(SEQ ID ΝΟ··102) ·· AAC TCC ATG TTT CAT AAAC CGG (開始於編碼序列中的bp 202) 目標序列#2(SEQ ID NO:103): AAC GTG TAT GGC TTC GAC ATG (開始於編碼序列中的bp 619) 兩序列皆成功降低HMT1 mRNA的表現，其中序列#1產 生大約70%降低及#2恰巧超過60%降低。 15. 為MPP10(X98494)將三個siRNA產生及於Hey細胞中測 試： X98494
目標序列 #1(SEQ ID NO:104) : AAG TTC CAG AAA 98729.doc -86- 1301066 TCT GAAATA(開始於編碼序列中的bp 357) 目標序列#2(SEQ ID NO:105) ·· AAG AAA ATC CAG AAC ATG TAG (開始於編碼序列中的bp 1043) 目標序列#3(SEQ ID NO:106): AAA ACA GTA GCT TCG GAG AAG (開始於編碼序列中的bp 1414) 所有三個序列皆產生mRNA表現降低，其中序列#1產生 幾乎90%降低，及序列#2及3分別具有大約30%及40%降 低。 16.為 IGFBP -7(BC017201)將兩個 siRNA 產生及於 OVCA 429中測試： BC017201 目標序列 #1 : AAG GTA AAA AGG GGT CAC TAT (開 始於編碼序列中的bp 583)(SEQ ID ΝΟ··107) 目標序列 #2 : AAA GGG GTC ACT ATG GAG TTC (開 始於編碼序列中的bp 590)(SEQ ID NO:108) 僅有序列# 1產生mRNA量降低，相較於控制組其為大約 60% ° ^ 17.為 NM23-D(BC004880)將一個 siRNA產生及於 OVCA 429 細胞中測試： BC004880(203003) 目標序列 #3 AAT GTC ATC CAC GCC AGC GAC (開始 自第一個 ATG 之 bp 442)(SEQ ID NO:135) 僅有目標序列#3降低mRNA量，相較於控制組大約50%。 18.為 WDR1(AB010427)將三個 siRNA產生及於 OVCA 429細 98729.doc 87- 1301066 胞中測試： AB010427 目標序列 #1 : AAT GGA AAG TGC GTC ATC CTA (開始 自第一個 ATG 之 bp 106)(SEQ ID NO:13 6) 目標序列 #2 : AAG TTC ACA ATT GGC GAC CAC (開 始自第一個 ATG 之 bp 544)(SEQ ID NO:13 7) 目標序列 #3 : AAG TGC TTC AGC ATC GAC AAC (開 始自第一個 ATG 之 bp 13 09)(SEQ ID NO:13 8) 所有目標序列皆降低mRNA量，相較於控制組#1為大約 85%，#2為大約75°/。及#3為大約70%。 19.為 Vinexin p(AF037261)將一個 siRNA 產生及於 OVCA 429細胞中測試： AF037261 目標序列 #2 ·· AAG AGT TAC CTA GAA GCA CCT (SEQ ID NO:139) 相較於控制組，目標序列#1及#3不降低mRNA量，而 #2降低mRNA大約50%。 ‘ 20.為 KLK6(BC015 525)將三個 siRNA產生及於 OVCA 429細 胞中測試： BC015525 目標序歹丨]#1 : AAA AAA CCG AAT CTT CAG GTC (SEQ ID NO:140) 目標序歹"2 : AAA CTC TCT GAA CTC ATC CAG (SEQ ID NO:141) 98729.doc -88 - 1301066 目標序列 #3 ·· AAC TGG ATC CAA AAA ACC ATT (SEQ ID NO:142) 相較於控制組，目標序列# 1不降低mRNA量，而#2降 低mRNA大約42%及#3降低大約55%。 21·為eIF5(U4943 6)將一個siRNA產生及於OVCA 429細胞中 測試： U49436 目標序列#1 mRNA目楳序列：AAT GAC CGT TAC ATT GTC AAT (SEQ ID NO:143) 相較於控制組，目標序列#2及#3不降低mRNA量，而 #1降低mRNA大約59%。 22.為鋅指狀蛋白質262/MYM(AB007885)將一個siRNA產生 及於OVCA 429細胞中測試： AB007885 目標序列 #3 ·· AAA ATA TGG GAA CCT ACA ΑΤΑ (開始 自第一個 ATG 之 bp 3058)(SEQ ID ΝΟ:144) 相較於控制組，目標序列# 1及#2不降低mRNA量，而#3 降低mRNA大約45%。 實例9 有效的基因之試管内功能測試： 將特定siRNA增加OVCA 429及OVCAR-3細胞對於順鉑 敏感度之能力如上述實例3-5中所揭示大體上檢視。於各例 中，在特定siRNA存在中順韵敏感性增加及以非專一的（控 制組）siRNA或負控制組（無處理）則不會。數據指出測試的 98729.doc -89- 1301066 基因可能功能上涉及卵巢癌細胞株中順鉑抗性的發展。將 結果摘要於表4中。 表4 :試管中順鉑敏感度測試 登錄 號 名稱 siRNA序列 於 OVCA429細 胞中測試 429 :對順鉑增 加的敏感度 於 OVCAR-3 細 胞中測試 OVCAR-3 ： η 順鉑增加的敏 感度 M59818 G-CSFR 是 是 U31913 ARA9 XAP2 #3 是 是 是 是 AF015608 RNPS1 #1 是 是 BC001134 融合的腳趾 #2 是 是 是 是 BC005214 Grancalcin #2 是 是 是 是 BC022087 SRB1 #1 是 是 是 是 BC031890 KIAA0082 #1 是 是 是 是 AB007885 鋅指狀蛋白質 #3 是 是 是 是 < BC004880 NM23D #3 是 是 是 是 ΑΒ010427 WDR1 #1 卜非 是 是 U49436 eIF5 eIF5A #1 是 是 是 是 D83735 肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2 #3 是 是 是 是 BC015525 KLK6 #3 是 是 是 是 AF037261 Vinexin β #2 非 是 是 BC017201 IGFBP -7 #1 是 是 是 是 D88153 HYA22 #3 是 微小 是 是 BC013590 eIF2B8 #1 是 是 是 是 L36870 SAPK/Erkl #2 是 是 是 是 實例10 活體内實驗： 利用OVCAR-3細胞及裸鼠發展下列流程於檢視腫瘤生 長：將OVCAR-3細胞（15百萬/注射）接種於裸鼠的上臂區 域。25天後可見的腫塊出現。接種後約35天時測量腫瘤及 而後將動物以4微克順鉑/公斤體重IP注射每週給予3次共2 週，之後1週不處理或僅以鹽水溶液作為控制組處理。圖63 顯示腫瘤體積為兩隻小鼠體重之函數。數據證實帶有腫瘤 的控制組動物在無任何化療中繼續生長腫瘤（小鼠# 1 )。相反 地，接受順鉑處理的動物呈現腫瘤大小的穩定（小鼠#2)。也 -90-
98729.doc 1301066 顯示順鉑處理前及後腫瘤的照片。 利用表現針對本文中確認基因（MetAP-2、SPARC、 S100A10、S100A11及鈣活化酶（Calpain)2)之 siRNA的穩定 細胞株將此流程重複。已發展表現約活化酶（Calpain)2或 S100A11 siRNA之穩定OVCAR-3細胞株以及表現穩定針對 綠螢光蛋白質（GFP，green fluorescent protein，一種生長無 關標記蛋白質）siRNA之控制組OVCAR-3細胞株；將由即時 定量PCR測量之鈣活化酶（Calpain)-2及S100A11的表現及 siRNA表現之作用示於圖64中。將15隻小鼠分成5隻之三 組。將一組作為控制組處理，注射無siRNA表現的OVCAR-3 細胞，第二組注射siRNA表現的OVCAR-3細胞及第三組注 射GFP專一的siRNA表現的OVCAR-3細胞。在可測量的腫瘤 變成明顯後，控制組接受鹽水注射，而第二及第三組接受 標準順鉑治療。如上述將腫瘤生長觀察為體重的函數。 可將實例中揭示的資訊摘要如下： _ 表 5 登錄 # 名稱 於卵巢癌病患組 織樣品小組中測 試 通過試管内功能確 認於OVCA429、 OVCAR-3(或兩者） 或 Hey* BC015973 S100A10 P11 CLP 11 依#5結合蛋白 (Calpactin)l 1 呈鏈 42C 是 是 BC001410 S100A11 S100C Calgizzarin 是 是 98729.doc -91 - 1301066 登錄 # 名稱 於卵巢癌病患組 織樣品小組中測 試 通過試管内功能確 認於OVCA429、 OVCAR-3(或兩者） 或 Hey* AF261089 1弓活化酶(Calpain)2 CANPL2 MCANP 是 是 BC004974 SPARC 骨聯蛋白(osteonectin) BM-40 是 是 BC013782 MetAP-2 p67eIF2 MNPEP 是 是 BC015525 KLK6 Zyme Neurosin 蛋白質分解酶M 是 是 AF222689 HMT1 HMT2 ANM1 HCP1 是 # U31913 ARA9 XAP2 非 是 D83735 肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2 非 是 U19251 ΝΑΙΡ 是 非 BC005291 eEFIS pl8 是 非 AFO15608 RNPS1 是 是 U49436 eIF5 eIF5A 是 是 BC013590 eIF2B8 是 是 M65217 HSF2 HSTF2 非 非 AB010427 WDR1 NORI-1 是 是 BC001134 融合的腳趾 非 是 BC004880 NM23D mn23-H4 是 是 U10439 ADAR1 是 非 BC005214 Grancalcin 非 是 BC009808 NBR1 非 非 L36870 SAPK/Erkl JNKK1 MEK4 MKK4 MAPKK4 是 是 98729.doc -92- 1301066 登錄 # 圓· 一·· --- 名稱 ^—___ 於卵巢癌病患組 織樣品小組中測 試 通過試管内功能確 認於OVCA429、 OVCAR-3(或兩者） 或 Hey* AB007885 D88153 竚相狀蛋白質-262 MYM 是 是 HYA22 是 是 AB049635 MRPL4 CGI-28 是 非 AF037261 Vinexin β Γ是 是 M59818 G-CSFR 是 是 BC015710 RAB22A 是 非 BC017201 IGFBP-7 MAC25 FSTL2 是 BC011770 FAST激酶 非 非 AB057597 TESK2 非 非 BC022087 SRB1 CLA1 CD36L1 是 是 BC031890 KIAA0082 # 是 NM一006312 NCOR2 非 非 BC032338 MT1 是 非 X98494 MPP10 非 * :在有藥物抗性的腫瘤細胞中表現升高的所有基因 (KLK6、ARA9、药活化酶（Calponin)2、RNPS1、eIF5、 eIF2Bs、WDR1、融合的腳趾、NM23D、Grancalcin、 SAPK/Erk卜鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、Vinexin β、 G-CSFR、IGFBP -7、SRB1 或 ΚΙΑΑ0082)皆於 OVCAR-3 或 O VC A 429細胞中測試，及在最有抗性的腫瘤細胞中表現降 低的所有基因（MPP10、HMT1、NAIP、Eefls、RAB22A、 NCOR2或MT1)皆於Hey細胞中測試。 應了解前述揭示強調本發明之某些特定具體實施例及其 所有修飾或替代的相等件皆於如隨附專利申請範圍中提出 的本發明精神及範圍内。 98729.doc -93- 1301066 【圖式簡單說明】 圖ί為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 及北方墨點結果之圖表代表，說明S100A10在對化療藥物具 有增加的抗性之卵巢癌細胞株中以增加的程度表現。 圖2為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 及北方墨點結果之圖表代表，說明^⑼八丨丨在對化療藥物具 有增加的抗性之卵巢癌細胞株中以增加的程度表現。 圖3為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 及北方墨點結果之圖表代表，說明相較於來自更有反應的 病患之樣品’在對化療更有抗性之病患腫瘤樣品中sl〇〇A1〇 及S100A11之mRNA量提高。 圖4為代表定量即時pCR結果之圖表，說明spARC於有化 療抗性細胞株中以增加的程度表現。 圖5為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 說明取自癌症復發的病患之樣品中spARC mRNA升高。 圖6為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 及北方墨點結果之圖表代表，說明鈣活化酶（Calpain)2 mRNA之量在有化療抗性的卵巢癌細胞株中增加。 圖7為北方墨點分析之圖表代表，說明相較於對順鉑治療 敏感的細胞株，於有化療抗性之細胞株中Grancalcini mRNA量提高。 圖8為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 及北方墨點結果之圖表代表，說明MetAp_22表現於高度化 療抗性之細胞株0VCA 429中升高及於對仙治療敏感的 98729.doc -94- 1301066
Hey細胞中下向調節。 圖9為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結果， 及北方墨點結果之圖表代表，說明於得自對幻義為基礎 的化療具有不同程度之抗性的三個病患之組織樣品中 MetAP 2 mRNA之表現。在來自具有最有抗性腫瘤（CAp3) 之病患相較於具有中等（CAP2)及低（CApi)程度之化療抗性 之病患之樣品中]Viet ΑΡ·2最為提高。 圖1〇為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明偵測到兩個^11?5轉 錄體及於對順鉑具有最高程度抗性之卵巢癌細胞株中兩者 的表現程度升高。 圖11為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於化療抗性病患腫 瘤樣品中於腫瘤的復發前（CAP2)及之後（CAP2+)eIF5之表 現。 圖12為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性的細 胞株中eIF2Bs之mRNA升高。 圖13為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果’及北方墨點結果之圖表代表’說明於對順鉑最有抗性 的卵巢癌細胞株中eEF 1 ε mRNA受到向下調節。 圖14顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於對順鉬有抗 性的細胞株中相較於敏感性細胞株，SAPK/Erkl mRNA量升 南。 98729.doc •95- 1301066 說明於對順鉑有抗 說明於對順鉑有抗 圖1 5顯不北方墨點結果之圖表代表 性的細胞株中TESK2 mRNA升高。 圖16顯示北方墨點結果之圖表代表， 性的細胞株中FAST激酶mRNA升高。 圖17為自動放射攝影之照片，顯示北 北方墨點分析之钟 果’及北方墨點結果之圖表代表’說明於測試的對順麵 抗性的細胞株中KLK6表現程度升高。 、、有 圖18為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之处 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於對順鉑有抗性： 細胞中HMT1之表現受到向下調節。 、 圖19為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表’說明於對順鉑有抗性的 細胞株中來自ARA9之mRNA升高。 圖20為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表’說明於有化療抗性的： 胞株中相較於化療敏感性即巢癌細胞株，肌動蛋白結合蛋 白（Calponin)2之表現升高。 圖21為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表’說明於對順鉑最有抗性 的細胞株中神經細胞洞亡抑制蛋白質基因表現減少。 圖22為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於對順始有抗性的 細胞株中RNPS1量升高。 圖23為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 98729.doc -96- 1301066 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性的細 胞株中HSF2之mRNA量升高。 圖24為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性的細 胞株中相較於化療敏感性細胞株，WDR1之mRNA升高。 圖25為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於對順鉑有抗性的 細胞株中Ftl mRNA量升高。 圖26為自動放射攝影之照片，顯示北方墨點分析之結 果，及北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性的細 胞株中NME4 mRNA升高。 圖27顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於對順鉑有抗 性的細胞株中ADAR1 mRNA升高。 圖28顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於相較於其他 測試的細胞株最有化療抗性之細胞株OVCA 429中NBR1 mRNA升高。 圖29顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於相較於其他 ‘測試的細胞株最有順鉑抗性之細胞株中鋅指狀蛋白質262 之mRNA升高。 圖30顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性 的細胞株中MRPL4 mRNA升高。 圖3 1顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性 的細胞株中相較於化療敏感性細胞株，HTYA22 mRNA升 南0 98729.doc -97- 1301066 圖3 2顯不北方墨點結果之圖表代表，句 衣忒明於有化療抗性 的細胞株中Vinexin β之mRNA升高。 圖33顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性 的細胞株中G-CSFR之mRNA升高。 圖3 4顯不北方墨點結果之圖表代表，#日 〜衣况明於有化療抗性 的細胞株中SRB 1 mRNA升高。 圖35顯示北方墨點結果之圖表代表，說明於有化療抗性 的細胞株中IGFBP -7 mRNA升高。 圖36顯示北方墨點結果之圖表代表，說明rab22A mRNA 於有化療抗性的細胞株中減少及於更有反應的細胞株中升 高。 圖37顯示北方墨點結果之圖表代表，說明kiaa〇〇82 mRNA之表現於有化療抗性的細胞株中升高。 圖3 8顯示北方墨點分析及結果之圖表代表，說明nc〇r2 之mRNA於對順紐有抗性的細胞株中相較於敏感性細胞株 減少。 圖3 9顯示基於MTT分析結果，根據對於順始敏感性的程 度，五種卵巢癌細胞株之等級。 圖40(上圖）描繪一圖表，顯示在暴露至藥物4小時後，增 加煙曲黴素濃度對OVCA 429細胞存活之影響。下圖描繪一 圖表，顯示在0·1微克/毫升煙曲黴素存在中順鉑的效果有增 強但當細胞於10微克/毫升煙曲黴素存在中以順鉑治療4小 時則無。 圖41 (上圖）描繪一圖表，顯示在暴露至藥物8小時後，增 98729.doc -98- 1301066 加煙曲黴素濃度對OVCA 429細胞存活之影響。 圖41(下圖）描繪一圖表，顯示在0.1微克/毫升煙曲黴素存 在中順鉑的效果有增強但當細胞於10微克/毫升煙曲黴素 存在中以順鉑治療8小時則無。 圖42(上圖）描繪一圖表，顯示在暴露至藥物24小時後， 增加煙曲黴素濃度對OVCA 429細胞存活之影響。 圖42(下圖）描繪一圖表，顯示在0.1微克/毫升煙曲黴素存 在中順鉑的細胞毒性效果有增強但當細胞於10微克/毫升 煙曲黴素存在中以順鉑治療24小時則無。 圖43為設計來鎖定Met AP-2傳訊RNA之不同區域之三種 siRNA(#l，SEQ ID NO:4; #2，SEQ ID NO:5;及 #3，SEQ ID NO:6)的概略代表。 圖44顯示siRNA #1對OVCA 429中MetAP-2表現量的影 響，由定量即時PCR決定。 圖45為一圖表，代表在siRNA#l存在中暴露OVCA 429至 順翻後由MTT分析決定的細胞存活量。 圖46為含有進行MTT分析後（量係示於圖45中）之OVCA 429細胞的96孔盤照片，顯示順鉑對以MetAP-2 siRNA #1轉 染的此等細胞之作用。 圖47為設計來鎖定SPARC傳訊RNA之不同區域的三種 siRNA(#l，SEQ ID ΝΟ:1; #2，SEQ ID NO:2;及 #3，SEQ ID NO:3)的概略代表。 圖48為一圖表，代表以示於圖47中的siRNA轉染的OVCA 429細胞中SPARC表現之定量即時PCR分析的結果。 98729.doc •99· 1301066 圖49為含有進行MTT分析後之OVCA 429細胞的96孔盤 照片，以決定在SPARC siRNA #2存在中順始對OVCA 429 · 細胞之作用。 . 圖50為一圖表，代表於OVCA 429細胞中經siRNA介導的 . SPARC基因表現降低對順鉑敏感性之影響。 圖5 1顯示北方墨點結果之圖表代表，說明MT1 mRNA於 對順鉑最敏感的細胞株（Hey)中大大升高。 圖52顯示北方墨點結果之圖表代表，說明MPP10 mRNA _ 隨著對順鉑的敏感性增加而增加。 圖53為一圖表，代表於OVCA 429細胞中經siRNA介導的 鈣活化酶（Calpain)2基因表現降低之影響。 圖54為一圖表，代表於〇vCA 429細胞中鈣活化酶 (Calpain)2 siRNA #3對順鉑敏感度之影響。 圖55為一圖表，代表於〇vCA 429細胞中鈣活化酶 (Calpain)2抑制劑ALLN對順鉑敏感度之影響。 圖56為一圖表，代表於OVCA 429細胞中經siRNA介導的 籲 SA100A10基因表現降低對順鉑敏感度之影響。 圖57為一圖表，代表於OVCA 429細胞中siRNA對 SA100A1基因mRNA表現程度之影響。 圖58為一圖表，代表於正常及大腸癌細胞CDNA中 鶬
MetAp_2 mRNA之表現量。 圖59為一圖表，代表於正常及大腸癌細胞cDNA中SPARC mRNA之表現量。 圖60為一圖表，代表於正常及大腸癌細胞cDNA中 98729.doc -100- 1301066 S100A11 mRNA之表現量。 圖61為一圖表，代表於正常及大腸癌細胞cDNA中 SlOOAlOmRNA之表現量。 圖62為一圖表，代表於正常及大腸癌細胞cDNA中鈣活化 酶（Calpain)-2 mRNA之表現量。 圖63顯示腫瘤體積為兩隻裸鼠體重之函數，將其以 OVCAR-3細胞注射（15百萬個/注射，得自美國典型培養物 保藏中心（American Type Culture Collection，Manassas, VA)， 登錄號碼HTB-161)及35天後以4微克/公斤體重之順鉑用IP 注射一週給予3次共2週，接著1週無治療或僅以鹽水溶液治 療作為控制組。 圖64為一圖表，顯示於OVCAR-3細胞中針對鈣活化酶 (Calpain)-2或S100A11之siRNA的穩定表現。於控制組行 中，測量兩者mRNA之表現於完全無治療的細胞中，#5活化 酶（Calpain)-2及S100A11之mRNA表現於相關的siRNA行中 大幅降低。 98729.doc 101 - 1301066 序列表 <110> 賓州研究基金會 <120> 預測並克服卵巢癌中化療抗性及預測大腸癌發生的方法 <130> 03-303-B <140> 093141829 <141> 2004-12-31 <150〉 US 60/533,505 <151> 2003-12-31 <160> 144 <170> Patentln version 3.3版 <210> <211> 1 21 <212> DNA <213> <400> 現代人 1 aatcctgtcc aggtggaagt a <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 2 aagctccacc tggactacat c 98729.doc <210> <210>1301066 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400〉 3 aatgacaagt acatcgccct g <210> 4 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 4 aaagatcagc attggaagat a <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213〉 現代人 <400> 5 aagcacatcg acaagttaga a <210> 6 <211> 21 <212〉 DNA <213> 現代人 <400> 6 aaacagtgcc gattgtgaaa g <210> 7
<211> 21 <212> DNA 98729.doc 1301066 <213> 現代人 <400> 7 aaggcatacg ccaagatcaa c <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 8 aaacttcttc ctgacgaatc g <210〉 9 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 9 aaacgctatt caagatattt a <210> 10 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 10 aaaggatggt tataactaca c <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 11 98729.doc 1301066 2 1 aagaaactgg acaccaacag t <210> 12 <211〉 21 <212> DNA <213〉 現代人 <400> 12 aatctgattg gtggcctagc t 21 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> 分子信標探針 <210> 14 <211〉 20 <212> DNA <213> 人造 -4- 98729.doc
<220> <221> Unsure <222> (1)..(1) <223> c連接至FAM <220> <221> Unsure <222> (28)..(28) <223> g連接至DABCYL <400> 13 cgcgtatgaa ctgggcttat gtgacgcg
28 20 1301066 <220> <223〉 PCR弓1 子 <400> 14 ctgggctctg ccttaaacac <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223〉 PCR弓| 子 <400> 15 gctcccaaaa gtttgaacca <210> 16 <211〉 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR弓| 子 <400> 16 ttgcctgagg ctgtaactga <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR 引子 98729.doc 20 20
1301066 <400> 17 ccacttcttt gccacaaagt <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 18 gaattcggtc agctcagagt <210> 19 <211> 25 <212〉 DNA <213> 人造 <220> <223> 分子信標探針 <220> <221> Unsure <222> (1)..(1) <223> c連接至FAM <220> <221> Unsure <222> (25)..(25) <223> g連接至DABCYL <400> 19 cgcctgggtg ggtttgaagg aggcg 98729.doc 1301066 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 20 atcgagtccc tgattgctgt <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 21 gcctgcatga ggtggttagt <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 22 cttgccatga ctccttcctc <210> 23 <211> 20 98729.doc 1301066 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 23 gcagaagcac atcgacaagt <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 24 gcctgcattt aatccattct c <210> 25 <211> 20 <212〉 DNA <213> 人造 <220〉 <223〉 PCR引子 <400> 25 taaccacgtc ctgctgaagt <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> 人造 98729.doc 231301066 <220> <223> PCR引子 <400> 26 gctttaagaa agttcttatc aac <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 27 gcacagcgga gtggtaaga <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 28 cagaggagtc agacacattg <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子
19
20 98729.doc 1301066 <400> 29 gtatacttac ttcagtgctg tt <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 30 cattcttgct ataacgttta aca <210> 3 1 <211〉 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 31 ctctgtgact tcggcatca <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 32 cagacatcag agcggacat 98729.doc 1301066 <210> 33 <211〉 21 <212〉 DNA <213> 人造 <220> <223〉 PCR弓1 子 <400> 33 aagaactggg ttcagtggaa a <210〉 34 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR弓1 子 <400> 34 gagagtgcat ggtcttgagt <210> 35 <211〉 20 <212> DNA <2 1 3> 人造 <220> <223> PCR弓I 子 <400> 35 agccaccagc taagtacctt <210> 36 <211> 21 21 20 98729.doc -11 - 20 1301066 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 36 catcgatttc aaccggaaca a <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 37 gtgtgtggac ctccatgtta <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 38 agcacaccat tacagacaag <210> 39 <211〉 20 <212> DNA <213> 人造 98729.doc 1301066 <220> <223> PCR引子 <400> 39 ggaaccagtt tctgcaggaa <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 40 ctccagcagc acctcaatg <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 41 atccaaggtt atgtggtttc tt <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 98729.doc 1301066 <400> 42 cacctcctgg gcttctgaa <210> 43 <211〉 22 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 43 gatccatgaa gctaatgtac aa <210> 44 <211〉 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 44 acgggcagaa gccttcgtt <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 45 cctgaggttc tccgagatg 98729.doc 1301066 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 46 tccagcccga aattctctgt <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 47 caagaggcgg aagggtaaa <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 48 cagccgctcg ggtaggt <210> 49 <211> 20 20
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98729.doc -15- 17 1301066 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 49 cactatggaa ggaccttgct <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 50 ggatacaggt gtaggtaaat <210〉 51 <211> 22 <212> DNA <213> 人造 <220> <223〉 PCR引子 <400> 51 tcccagatta ggaatttatg <210> 52 <211> 19 <2 12> DNA <213> 人造 20
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22 98729.doc -16- 191301066 <220> <223> PCR引子 <400> 52 cttctggaac aggcgaaga <210〉 53 <211> 18 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 53 gctggcccag acgacgaa <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 54 gcagacacac gtggatggt <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子
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19 98729.doc -17- 1301066 <400> 55 gatgaagtta aatcctcctt tg <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 56 cctcttctgt gctgtcactt <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 57 cctgcaagaa gagctgctg <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 58 cacagctgtc ctggcatca 98729.doc 1301066 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 59 aaatggaaca cgccatggaa a <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 60 aaattcgctg gggataaagg c <210> 61 <211> 21 <212〉 DNA <213> 現代人 <400> 61 aataatgaag gacctggacc a <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213〉 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 62 gctcccaaaa gtttgaacca 98729.doc 1301066 <210> 63 <211〉 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 63 gcctgcatga ggtggttagt 20 <210> 64 <211> 21 <212〉 DNA <213> 現代人 <400> 64 aaatgggacg aggagcttat
21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 65 aagcgcatca cgacaaggat
21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 66 aacaggattg actactatag c 21 98729.doc -20- 1301066 <210> 67 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 67 aatacagggt cactcaagta g <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 68 aaatatctta atgtgtctcg c <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 69 aagtgtgagc tgcgccacaa g <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 70 aagagccccc ttacccacta c
<210> 71 <211> 21 <212> DNA 98729.doc 1301066 <213> 現代人 <400> 71 aacaggaaga atcccctctg g <210〉 72 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 72 aaacgtgtga tacaggaagg c <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 73 aacaagtacg acgacaacgt c <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 74 aacgtcaagg cctacttcaa g <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> 現代人 98729.doc 1301066 <220> <221> miscfeature <222> (3)..(3) <223> n is a, c， g， or t <400> 75 sdnaatattc atacggcatg gact <210〉 76 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 76 aacctaaaat agaagacccc <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 77 aaaagatgct gactcagaaa a <210> 78 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 78 aacctaaaat agaagacccc
<210> 79 <211> 21 <212> DNA 98729.doc 1301066 <213> 現代人 <400> 79 aagaccccta tgcaattagc t <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 80 aaaaagcctg aagaacagca c <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 81 aaatgggatt taatgcattc a <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 82 aacttcatga ctgttgatca a <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 83 98729.doc 1301066 aacatcatga gttgcgtcaa g <210> 84 <2 11> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 84 aagcagcagg tccttaagaa c <210> 85 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 85 aatctcatca acaagtactt t <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 86 aattcagaac gtcagcacct g <210> 87 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 87 aagaggagaa ctgacccaga a 98729.doc 1301066 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 88 aaatgagcga ttggatggtg g <210> 89 <21 1> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 89 aagatcatca agggctccag <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 90 aatgtggttc gaataattac a <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 91 aaactcgaga tgactttgtg c
<210> 92 <211〉 21 <212> DNA 98729.doc 1301066 <213> 現代人 <400> 92 aatcaacagc tgcagaggtt c <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 93 aaggatggaa ctatcttatg c <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 94 aatttcgacg atgccaccat g <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 95 aaccgacaag tgtgacaact c <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 96 98729.doc 1301066 aaagaaatgt gtggtcattg a <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 97 aaatcgatgg aactatacat c <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 98 aactatacat caggtgtatg t <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 99 aatggtttca cccatcagag c <210> 100 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 100 aagggctcag ctacattcaa c 98729.doc 1301066 <210> 101 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 101 aatacaacgt ccagcaacag t <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> 現代人 <400> 102 aactccatgt ttcataaacc gg <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 103 aacgtgtatg gcttcgacat g <210> 104 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 104 aagttccaga aatctgaaat a
<210> 105 <211> 21 <212> DNA 98729.doc 1301066 <213> 現代人 <400> 105 aagaaaatcc agaacatgta g <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 106 aaaacagtag cttcggagaa g <210> 107 <21 1> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 107 aaggtaaaaa ggggtcacta t <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 108 aaaggggtca ctatggagtt c <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> 現代人 <400> 109 98729.doc 1301066 agcaccagca ctggctcatc <210> 110 <211> 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 110 agagccagaa gagctgcta <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 111 aaccgacaag tgtgacaact <210> 112 <211> 18 <212> DNA <213> 現代人 <400> 112 tgtgccttgc gggcagta <210> 113 <211〉 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 113 caccaccacc accaaatgaa 98729.doc 1301066 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 114 catccattcg acgcctttga <210> 115 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 115 ccagcagcac agtcaacaa a <210> 116 <211〉 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 116 tggtagcttc tgcttcacaa <210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 117 ccagagctgc actcattcc
<210> 118 <211> 22 <212> DNA 98729.doc 1301066 <213> 現代人 <400> 118 cactgttggt gataaagcaa tt <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> 現代人 <400> 119 ggataaaggc tacttaacaa ag <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 120 ccactttgcc atctctacac <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 121 gagccgagga ggttgaa g <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 122 98729.doc 1301066 20 ctcctctggg tctatagtgt <210> 123 <211> 18 <212> DNA <213> 現代人 <400> 123 gaccctggtg gcggtgaa 18 <210> 124 <211> 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 124 ggtgcctgca gcatcttca 19 <210> 125 <211〉 18 <212> DNA <213> 現代人 <400> 125 ggagagccct ggcacgta 18 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> 現代人 <400> 126 ccttcatctg caggttcttg 20 98729.doc -34- 1301066 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 127 acgacggaca cattaattac 21 <210> 128 <211〉 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 128 tccatgctgc agctgatga
19 <210> 129 <211> 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 129 ccttcggcaa agggagag 19
<210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400〉 130 ctggatgagt tcagagagtt t <210> 131
<211> 18 <212> DNA 98729.doc -35- 21 1301066 <213> 現代人 <400> 131 gcctcgacag gcagagat <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 132 cttgtagctg aagatgtcaa <210> 133 <211> 19 <212> DNA <213> 現代人 <400> 133 ctctatgcc gggacaagt <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 134 aagacatgtc gaagccatac a <210> 135 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 135 aatgtcatcc acgccagcga c 98729.doc 1301066 <210> 136 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 136 aatggaaagt gcgtcatcct a <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 137 aagttcacaa ttggcgacca c <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 138 aagtgcttca gcatcgacaa c <210> 139 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 139 aagagttacc tagaagcacc <210> 140 98729.doc 1301066 <21 1> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 140 aaaaaaccga atcttcaggt c <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 141 aaactctctg aactcatcca g <2 10> 142 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 142 aactggatcc aaaaaaccat t <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> 現代人 <400> 143 aatgaccgtt acattgtcaa <210> 144 <211〉 21 <212> DNA <213> 現代人 98729.doc 1301066 <400> 144 aaaatatggg aacctacaat a
98729.doc 39-

Claims (1)

13 01 141829 號專pyif ’中文申請專利範圍设 十、申請專矛龙
Ά) db 年月日谈（更)正本 1 · 一種細胞基因的調控劑之用途，其係用以製備用於降低 腫瘤細胞中化療藥物抗性之藥物，其中該細胞基因為 S100A1卜鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP-2、KLK6、 ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、eIF5、 eIF2Bs、HSF2、WDfU、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 ADAR1、Grancalcin、NBIU、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質 -262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、FAST激酶、TESK2、SRB 卜 KIAA0082、MPP10、HMT卜 NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2 或 MT1 ;其中在調控劑 存在的細胞比調控劑不存在的細胞對化療藥物較無抗 性。 2.如請求項1之用途，其中化療藥物為順鉑。 3·如請求項1之用途，其中調控劑為抑制劑及基因為 MetAP-2 〇 4·如請求項3之用途，其中抑制劑為siRNA。 5.如請求項4之用途，其中siRNA為SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，或 SEQ ID NO:6。 6·如請求項3之用途，其中抑制劑為煙曲黴素（fumagillin)或 煙曲黴素的衍生物。 7·如請求項1之用途，其中腫瘤細胞為卵巢癌腫瘤細胞。 8 ·如請求項1之用途，其中調控劑為抑制劑及基因為 SPARC。 9·如請求項8之用途，其中抑制劑為siRNA。 98729-970423.doc 1301066 10·如請求項9之用途，其中siRNA為SEQ ID ΝΟ:1，SEQ ID NO:2，或 SEQ ID NO:3。 11 ·如請求項1之用途，其中調控劑為抑制劑及基因為鈣活化 酶（Calpain)2 〇 12.如請求項11之用途，其中抑制劑為ALLN或ALLN的衍生 物0 13·如請求項11之用途，其中抑制劑為siRNA。 14.如請求項13之用途，其中siRNA為SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，或 SEQ ID NO:9。 15·如請求項1之用途，其中調控劑為抑制劑及基因為 S100A11 〇 16. 如請求項15之用途，其中抑制劑為siRNA。 17. 如請求項16之用途，其中siRNA為SEQ ID NO: 10，SEQ ID ΝΟ:11，或 SEQ ID NO:12。 18. 如請求項1之用途，其中調控劑為抑制劑及基因為 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS 1、 eIF5、eIF2B8、WDIU、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 Grancalcin、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、 HYA22、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、SRB1、或 KIAA0082。 19. 如請求項18之用途，其中抑制劑為siRNA。 20. 如請求項19之用途，其中siRNA為SEQ ID NO:64_108或 134-144之任一者。 2 1 · —種細胞基因的抑制劑與化療試劑（類）組合之用途，其係 98729-970423.doc 1301066 用以製備用於抑制腫瘤細胞生長之藥物，其中該細胞基 因為 SPARC、鈣活化酶（Calpain)2、S100A11、MetAP-2、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、 eIF5、eIF2Bs、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 Grancalcin、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、 HYA22、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、SRB1、或 KIAA0082。 22. 如請求項21之用途，其中化療試劑為以鉑為基礎。 23. 如請求項21之用途，其中至少一種抑制劑為MetAP-2活性 之抑制劑。 24. 如請求項23之用途，其中至少一種抑制劑為煙曲黴素或 煙曲黴素的衍生物。 25·如請求項2 1之用途，其中腫瘤細胞為卵巢癌細胞。 26·如請求項21之用途，其中抑制劑為siRNA。 27·如請求項26之用途，其中siRNA係確認為SEQ ID N0:1， SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:65 SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, 或 SEQ ID NO:64-108或 SEQ ID NO:134-144之任一者。 28. —種預測卵巢癌患者的腫瘤是否將對化療藥物有抗性之 方法，其包含下列步驟： (a)於取自患者的生物樣品中偵測一或多個表現的基因或 由該表現的基因編碼的基因產物之量，其中表現的基 因為 S100A10、S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、 MetAP-2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 98729-970423.doc 1301066 '、 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、 融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、 Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、FAST激酶、TESK2、SRB1、KIAA0082、MPP10、 HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2或 MT1 ; (b) 於控制組樣品中偵測一或多個相對應表現的基因或由 此編碼的基因產物之量，其中表現的基因為S100A10、 S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、MetAP-2、 KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS 1、 eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、 NM23D、ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、 鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、 G-CSFR、IGFBP -7、FAST 激酶、TESK2、SRB1、 KIAA0082、MPP10、HMT卜 NAIP、eEFls、RAB22A、 NCOR2 或 MT1 ; (c) 比較步驟（a)中偵測的表現的基因或基因產物之量與步 驟（b)中偵測的表現的基因或基因產物之量， 其中當步驟（a)中偵測的量與步驟（b)中偵測的量相差至少 20%之因子時，則預測患者將對化療藥物有抗性。 29. 如請求項28之方法，其中化療為以鉑為基礎的化療。 30. 如請求項28之方法，其中表現的基因為MetAP-2或 SPARC。 3 1 · —種監測卵巢癌患者的疾病發展之方法，其包含下列步 98729-970423.doc 1301066 (a) 於取自患者的生物腫瘤樣品中偵測一或多個表現的基 因或由表現的基因編碼的基因產物之量，其中表現的 基因為 S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、 MetAP-2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、eIF5、eIF2Bs、HSF2、WDR1、 融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、 Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、FAST激酶、TESK2、SRB1、KIAA0082、MPP10、 HMT1、NAIP、eEFls、RAB22A、NCOR2或 MT1 ; (b) 利用取自患者隨後收集的生物腫瘤樣品重複步驟（a);及 (c) 比較步驟（a)中測量的表現的基因或基因產物之量與步 驟（b)中偵測的表現的基因或基因產物之量，其中當於 步驟（b)中偵測的量 i·對於 S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、 MetAP-2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS 卜 Eif5、Eif2Bs、HSF2、WDR1、 融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、 Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、FAST激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082為不小於 在步驟（a)中偵測的量；及 ii 對於 MPP10、HMT卜 NAIP、Eefls、RAB22A、NCOR2 98729-970423.doc 1301066 ‘ 或MT1為不大於在步驟（a)中偵測的量時， 癌症已進展。 32. 如請求項31之方法，其中表現的基因為eIF5或SPARC。 33. —種用以鑑定降低化療抗性的腫瘤細胞藥物抗性之化合 物的方法，其包含下列步驟： (a) 使測試化合物與細胞可耐受的濃度之化療藥物一起與 表現在有化療抗性的卵巢癌細胞中為過度表現的基因 之細胞接觸，其中基因為S100A10、S100A11、鈣活化 酶（Calpain)2、SPARC、MetAP-2、KLK6、ARA9、肌 動蛋白結合蛋白（Calponin)2、RNPS1、Eif5、Eif2Bs、 HSF2、WDR1、融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、 ADAR1、Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、鋅指狀蛋白 質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、 IGFBP -7、FAST 激酶、TESK2、SRB1 或 KIAA0082 ; (b) 偵測在有或無測試化合物存在中基因之表現；及 (c) 比較在有或無測試化合物存在中基因之表現，其中若 在測試化合物存在中基因表現相對於在無測試化合物 中基因表現降低，及在化合物存在中腫瘤細胞生長減 少’將化合物鑑定為抑制化療抗性腫瘤細胞生長之化 合物。 34. —種用以鑑定降低化療抗性的腫瘤細胞藥物抗性之化合 物的方法’其包含下列步驟： (a)使測試化合物與細胞可耐受的濃度之化療藥物一起與 表現在有化療抗性的卵巢癌細胞中以低於正常量表現 98729-970423.doc •6- 1301066 的基因之細胞接觸，其中基因為HMTl、ΝΑΙΡ、Eefls、 RAB22A、NCOR2、MT1 或 MPP10 ; (b) 偵測在有或無測試化合物存在中基因之表現；及 (c) 比較在有或無測試化合物存在中基因之表現，其中若 在測試化合物存在中基因表現相對於在無測試化合物 中基因表現增加，及在化合物存在中腫瘤細胞生長減 少，將化合物鑑定為抑制化療抗性腫瘤細胞生長之化 合物。 35. —種用以監測醫藥組合物作為治療病患癌症之藥劑的有 效性之方法，其包含下列步驟： (a) 於取自患者於投予醫藥組合物前的生物樣品中偵測一 或多個表現的基因或由此編碼的基因產物之量，其中 表現的基因為S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、SPARC、 MetAP-2、KLK6、ARA9、肌動蛋白結合蛋白 (Calponin)2、RNPS1、Eif5、Eif2Bs、HSF2、WDR1、 融合的腳趾（Fused toes)、NM23D、ADAR1、 Grancalcin、NBR1、SAPK/Erkl、辞指狀蛋白質-262 MYM、HYA22、MRPL4、Vinexin β、G-CSFR、IGFBP -7、FAST 激酶、TESK2、SRB1、KIAA0082 或 MPP10、 HMT1、NAIP、Eefls、RAB22A、NCOR2、MT1 ; (b) 利用取自患者於投予一劑量醫藥組合物後接續收集的 生物樣品重複步驟（a);及 (c) 比較步驟（a)中债測的表現的基因或基因產物之量與步 驟（b)中偵測的表現的基因或基因產物之量，其中藉由 98729-970423.doc 1301066 偵測於隨後收集的生物樣品中表現的基因或基因產物 之篁與取自步驟（a)中的生物樣品比較之變化而監測醫 藥組合物之有效性，及當組合物存在時腫瘤細胞的生 長減少。 3 6 · —種偵測大腸癌之方法，其包含下列步驟： 0)得到病患於投予醫藥組合物前的生物樣品； (b) 於取自病患生物樣品中债測一或多個表現的基因或由 此編碼的基因產物之量，其中表現的基因為sl〇〇A1〇、 S100A11、鈣活化酶（Calpain)2、spARC、或MetAP-2 ; (c) 偵測於控制組樣品中偵測的一或多個表現的基因或基 因產物之量； (d) 比較來自步驟（b)中一或多個表現的基因或基因產物 之量與步驟（c)中的量； /、中若與步驟（b)中偵測的一或多個基因量不同於步驟（〇 中偵測的一或多個基因量，則偵測到大腸癌。 3 7·如清求項36之方法，其中若si〇〇ai〇、SPAR。' 或MetAP-2之量於步驟⑻中比於步驟⑷中的量有增加，· 則偵測到大腸癌。 38·如凊求項36之方法，其中若@活化酶（Calp叫2之量於步 驟（b)中比於步驟（c)中的量有減少，則憤測到大腸癌。 39_如明求項丨之用途，其中調控劑為siRNA或〇 如明求項39之用途’其中調控劑為19、2〇、或“個核苦 酸長之siRNA。 如π求項39之用途，其中調控劑為形成具有臂長、^、 98729-970423.doc 1301066 或2 1個核苷酸之髮夾環的shRNA。 9- 98729-970423.doc
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