DE19805334A1 - Verfahren zur Entwicklung eines pharmazeutischen Wirkstoffes - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entwicklung eines Wirkstoffes, der, vorzugsweise intrazellulär, direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist. Dabei sollen die entwickelten Wirkstoffe insbesondere mit Hilfe der sogenannten Gentherapie anwendbar sein, und die Beeinflussung der Funktion der Peptide/Proteine soll vorzugsweise in einer Inhibition dieser Funktion liegen.

Zur gentherapeutischen Inhibition von Genprodukten oder der Expression dieser Genprodukte wurden bisher im wesentlichen zwei verschiedene Wege eingeschlagen. Zum einen wurde ver­ sucht, die Inhibition durch kurze Antisense-Oligonukleotide zu bewirken, die in eine Zelle eingeschleust werden, um die sogenannte Messenger-RNA (mRNA) eines bestimmten Gens zu inhibieren. Dieses Konzept hat den Nachteil, daß einerseits eine hohe Konzentration der Oligonukleotide von den Zellen aufgenommen werden muß und andererseits trotzdem meist keine vollständige Inhibition des fraglichen Gens erreicht wird. Der andere vorgeschlagene Weg besteht darin, sogenannte Antisense-Gene, die in virale Vektoren verpackt sind, in die Zelle einzubringen. Diese Antisense-Gene führen zu einer Transkription von Antisense-RNA, welche dann ihrerseits das zu beeinflussende Gen inhibiert. Dieses zweite Konzept hat zwar unter Umständen den Vorteil einer hohen Effektivität, es läßt aber vor allem bei lokaler Applikation eine nicht kontrollierbare Ausbreitung des Vektors befürchten.

Weiter sind sogenannte Peptidbibliotheken bekannt, in denen eine sehr große Anzahl, beispielsweise < 10⁸ Rekombinante enthalten sind. Es bedarf jedoch sinnvoller Strategien, aus solchen Bibliotheken ein oder mehrere Peptide bzw. deren kodierende Nukleinsäuresequenzen auszuwählen. Grundsätzlich bereits bekannte Screening-Verfahren, die sich beispielsweise des sogenannten Yeast-Two-Hybrid-Systems bedienen, lassen sich nämlich vernünftigerweise nur einsetzen, wenn eine gewisse Vorauswahl über die Aminosäuresequenz getroffen ist. Bei üblicherweise 20 verwendbaren Aminosäuren entspricht die Variabilität bei einer Kettenlänge n der Sequenz einem Wert von 20ⁿ Möglichkeiten. In diesem Zusammenhang sei noch erwähnt, daß in neuerer Zeit Proteine auch durch Computer­ simulation (Computer-Molecular-Modelling) entworfen werden. Bei allen Vorgehensweisen kann die endgültige Strukturanalyse einer Peptid-Peptid-Wechselwirkung oder Protein-Protein- Wechselwirkung beispielsweise durch kernmagnetische Resonanz­ spektroskopie (NMR) durchgeführt werden.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die Nachteile des bisherigen Standes der Technik zu vermeiden. Es soll ein Verfahren zur Entwicklung eines oben definierten Wirkstoffs zur Verfügung gestellt werden, bei dem unter systematischer Anwendung bestimmter Verfahrensschritte eine optimierte Aminosäuresequenz mit vergleichsweise geringerem Aufwand erhalten wird. Diese Aminosäuresequenz bzw. der aus ihr resultierende Wirkstoff soll vorzugsweise zur Inhibition von physiologisch aktiven Peptiden/Proteinen geeignet sein.

Weiter ist es das Ziel der Erfindung, die Beeinflussung, insbesondere Inhibition, der Funktion solcher Peptide/Pro­ teine auf gentherapeutischem Wege zu erreichen. In diesem Zusammenhang soll eine möglichst einfache Applikation des Wirkstoffs bei gleichzeitig hoher Effektivität erreicht werden. Die nach dem Verfahren erhaltene Aminosäuresequenz soll dabei an dem physiologisch aktiven Zielpeptid/-protein vorzugsweise mindestens genauso gut wirken, wie dessen physiologischer Wechselwirkungspartner.

Die geschilderten Aufgaben werden gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungs­ formen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 16 darge­ stellt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.

Das eingangs genannte Verfahren ist erfindungsgemäß im wesentlichen durch zwei Verfahrensschritte gekennzeichnet. Zum einen wird ein Zielpeptid oder Zielprotein, das physiolo­ gisch an einer Peptid-Peptid- bzw. Protein-Protein-Wechsel­ wirkung teilnimmt oder teilnehmen kann, identifiziert und ausgewählt. Bevorzugt wird dabei nur einer oder mehrere Teilabschnitte dieses Peptids/Proteins identifiziert oder ausgewählt, wobei an diesem Teilabschnitt oder diesen Teil­ abschnitten dann die entsprechenden Wechselwirkungen statt­ finden. Zum anderen wird eine Aminosäuresequenz abgeleitet bzw. gescreent, die mit dem Zielpeptid/Zielprotein bzw. dessen Teilabschnitt oder Teilabschnitten mit hoher Affinität wechselwirkt. Diese Wechselwirkung ist vorzugsweise minde­ stens genauso gut, insbesondere besser als diejenige des Zielpeptids/Zielproteins/Teilabschnitts mit seinem physiolo­ gischen Wechselwirkungspartner.

Die Ableitung der Aminosäuresequenz umfaßt vorzugsweise die Auswahl mindestens einer Startstruktur einer Aminosäure­ sequenz, wobei diese Auswahl vorzugsweise zu Beginn des Verfahrens oder zu Beginn eines Verfahrensdurchlaufes getrof­ fen wird. Dies hat den Vorteil, daß nicht von einer willkür­ lichen Aminosäuresequenz ausgegangen werden muß.

Bei der Startstruktur kann es sich insbesondere um die Aminosäuresequenz eines physiologischen Wechselwirkungs­ partners des Zielpeptids/Zielproteins bzw. eines seiner Teilabschnitte oder um eine mit Hilfe von Molecular Modelling hergeleitete Aminosäuresequenz handeln. Wenn die Ableitung der Aminosäuresequenz in mehreren Verfahrensdurchläufen erfolgt, ist die Auswahl einer der beiden auf den genannten Wegen ermittelten Startstrukturen insbesondere beim ersten Verfahrensdurchlauf angebracht. Als Startstruktur für die weiteren Verfahrensdurchläufe können dann in diesen Fällen die aus dem jeweils vorhergehenden Verfahrensdurchlauf hervorgehenden (teiloptimierten) Aminosäuresequenzen einge­ setzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiter dadurch gekenn­ zeichnet, daß auf Basis der Startstruktur(en) eine Anzahl degenerierter Nukleinsäuresequenzen bestimmt und ausgewählt werden. Diese kodieren für die entsprechenden Variationen der als Startstruktur ausgewählten Aminosäuresequenz. Durch diese Vorgehensweise wird eine zumindest überschaubare Anzahl an Sequenzen vorgelegt, deren Untersuchung mit Hilfe eines Screening-Verfahrens praktisch möglich ist. Durch die Vorgabe der Startstruktur wird erreicht, daß die Nukleinsäuresequenz nicht vollständig degeneriert werden muß, sondern zumindest in Grenzen geplant werden kann. Die eingangs genannte Varia­ bilität kann damit deutlich reduziert werden. Dabei wird man im Normalfall bei Auswahl der Aminosäuresequenz eines bekann­ ten physiologischen Wechselwirkungspartners als Startstruktur mit niedriger Variabilität auskommen können als im Falle einer aus einem Molecular Modelling hervorgegangenen Amino­ säuresequenz als Startstruktur.

Die erhaltene degenerierte Nukleinsäuresequenz (ggf. auch mehrere) wird anschließend vorzugsweise einem bekannten Screening-Verfahren unterworfen, mit dessen Hilfe die Wech­ selwirkung zwischen Zielpeptid/Zielprotein/Teilabschnitt und den Aminosäuresequenzen, die der einzelnen degenerierten Nukleinsäuresequenz entsprechen, bestimmbar ist. Aufgrund dieses Screening-Schritts wird eine bestimmte Anzahl an Aminosäuresequenzen bzw. deren Nukleinsäuresequenzen ausge­ wählt, bei denen diese Wechselwirkung am stärksten bzw. besten ist.

Die verschiedenen grundsätzlich verwendbaren Screening- Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere ist hier die sogenannte Yeast-Two-Hybrid-Methode zu nennen, die in den letzten Jahren große Bedeutung erlangt hat. Als Literatur sei hier auf die Veröffentlichung von Fields et al., Nature 340, 245-247 (1989) verwiesen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine Abwandlung dieser Methode, die unter dem Stichwort FRET- Yeast-Two-Hybrid-Methode zu nennen ist. Die wesentlichen Merkmale dieses Verfahrens werden im Zusammenhang mit dem Beispiel noch erläutert.

Die Nukleinsäuresequenzen, die die beste Wechselwirkung zeigen und dementsprechend ausgewählt wurden, d. h. bei einem üblichen Screening-Verfahren die entsprechenden Hefezellen, werden, üblicherweise nach einer Klonierung, sequenziert. Diese Sequenzierung ergibt dann zwangsläufig die zugehörigen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise werden die so erhaltenen Sequenzen untereinander und ggf. auch mit bereits vorhandenen Sequenzen verglichen, um Ähnlichkeiten oder gemeinsame Strukturmotive zu erhalten, die für eine mögliche weitere Optimierung der Aminosäuresequenz nützlich sein können.

Zu den ausgewählten sequenzierten Nukleinsäuremolekülen werden dann durch übliche Verfahren die zugehörigen Amino­ säuresequenzen/Peptide/Proteine synthetisiert. Die Peptide können auch in Zellen quantitativ exprimiert werden. Von den so erhaltenen Aminosäuresequenzen wird dann die exakte Wechselwirkungsstruktur mit Hilfe von NMR-Spektroskopie bestimmt. Wie bereits ausgeführt, bildet sich diese Wechsel­ wirkungsstruktur zwischen Zielpeptid/Zielprotein/Teil­ abschnitt und der synthetisierten Aminosäuresequenz aus. Zur besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse kann für diesen oder einen anderen Verfahrensschritt einer oder mehrere der Teilabschnitte des Zielpeptids/Zielproteins ebenfalls synthe­ tisch hergestellt werden.

In Weiterbildung kann das Gesamtverfahren, insbesondere jedoch die Ableitung der Aminosäuresequenz bzw. deren einzel­ ne Verfahrensschritte mindestens zweimal, vorzugsweise mehrfach, durchgeführt werden. Wie bereits dargestellt, kann die gesuchte Aminosäuresequenz dabei schrittweise optimiert werden, bis entweder eine hinreichend hohe Affinität oder sogar eine bessere Affinität als diejenige des physiologi­ schen Wechselwirkungspartners erreicht ist. Dem Nutzer des Verfahrens ist dabei freigestellt, die Verfahrensdurchläufe nach eigener Wahl zu einem bestimmten Zeitpunkt, d. h. bei einem bestimmten Optimierungsgrad der Aminosäuresequenz abzubrechen. In diesem Zusammenhang wird es sich anbieten, die aufgeführten Verfahrensschritte bei der Ableitung der Aminosäuresequenz zwischen drei- und zwanzigmal, vorzugsweise zwischen drei- und zehnmal, durchzuführen, bis eine Amino­ säuresequenz ausreichender Affinität erhalten wird.

Weiter ist es bei der Erfindung bevorzugt, wenn eine aus früheren Verfahrensschritten erhaltene (vorläufig optimierte oder teiloptimierte) Aminosäuresequenz mit bereits guter Wechselwirkung/Affinität in weiteren Verfahrensschritten als sogenannter Kompetitor eingesetzt wird. Dies gilt insbesonde­ re auch für die Durchführung des Screening-Verfahrens, bei dem dann die weiter optimierten Sequenzen mit dem Kompetitor direkt verglichen werden können.

Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Ableitung von Aminosäuresequenzen für mehrere Teil­ abschnitte eines Zielpeptids/Zielproteins durchgeführt werden. Damit kann die Gesamtaffinität und Spezifität der abgeleiteten Struktur weiter verbessert werden, wie dies im folgenden noch erläutert wird. Auch hier werden die erforder­ lichen Verfahrensschritte zur Ableitung der Aminosäuresequenz pro Teilabschnitt mit der bereits genannten Häufigkeit von drei- bis zwanzigmal, vorzugsweise drei bis zehnmal, durch­ laufen.

Nach der Erfindung umfaßt die abgeleitete Aminosäuresequenz üblicherweise eine möglichst geringe Anzahl an Aminosäuren, um die Ableitung der Aminosäuresequenz nicht zu aufwendig werden zu lassen. Andererseits wird in den meisten Fällen eine Mindestzahl an Aminosäuren erforderlich sein, um die erforderliche Wechselwirkung mit dem Zielprotein/Zielpeptid/­ Teilabschnitt zu gewährleisten. Es ist deshalb bevorzugt, daß die abgeleitete Aminosäuresequenz weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 15 Aminosäuren, umfaßt.

Bei der Identifizierung und Auswahl eines oder mehrerer Teilabschnitte des Zielpeptids/Zielproteins können grundsätz­ lich beliebige Aminosäuresequenzen berücksichtigt werden, die an einer entsprechenden physiologischen Protein-Protein- bzw. Peptid-Peptid-Wechselwirkung beteiligt sind. Besonders geeignet sind hier jedoch sogenannte α-Helix- oder β-Falt­ blatt-Strukturen. Wenn wie in vielen Fällen mehrere aktive Teilabschnitte innerhalb eines Zielpeptids/Zielproteins vorhanden sind, können deshalb bevorzugt diese genannten Strukturen ausgewählt und für diese Aminosäuresequenzen abgeleitet werden.

Die wesentlichen Merkmale der Erfindung können dementspre­ chend wie folgt zusammengefaßt werden:

Die Erfindung beruht auf einer Identifizierung und Auswahl eines Zielpeptids/Zielproteins oder eines oder mehrerer seiner Teilabschnitte, die für eine physiologische Wechsel­ wirkung mit anderen Peptiden, Proteinen u. dgl. in Frage kommen. Die bei der Erfindung gewählten Ausdrücke "Peptid" und "Protein" sollen dabei im weitesten Sinn eine jede Aminosäure-Aneinanderreihung umfassen, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Zu dieser identifizierten und ausgewählten Aminosäuresequenz wird nach der Erfindung eine Aminosäure­ sequenz abgeleitet, die zu einer Wechselwirkung in der Lage ist, vorzugsweise zu einer mindestens genauso guten Wechsel­ wirkung wie zwischen der vorgelegten Sequenz und deren physiologischem Wechselwirkungspartner.

Für die Ableitung der gesuchten Aminosäuresequenz werden dann im einzelnen verschiedene Verfahren angewandt, wie sie bereits beschrieben wurden. Diese lassen sich unter den Stichworten Random-Peptid-Library-Screen, insbesondere Yeast- Two-Hybrid-System, NMR-based-Drug-Design und Computer- Molecular-Modelling aufführen. Wie dargestellt ist dabei der Ausgangspunkt der Entwicklung eine bereits bekannte Peptid- Peptid-Wechselwirkung, eine aus einem früheren Verfahrens­ durchgang resultierende Wechselwirkung oder eine rein compu­ termodellierte Struktur. Hintergrund der Erfindung ist mit anderen Worten demzufolge auch eine Kombination aus einem weitgehend zufälligen Screening und einer deterministischen Modelling Strategie. Die Kombination dieser beiden Techniken macht es möglich, aus der unüberschaubaren Vielzahl von möglichen Sequenzen eine Reihe von beispielsweise 10 beson­ ders guten Sequenzen auszuwählen.

Die Vorteile der Erfindung zeigen sich zunächst vor allem bei der eingangs erwähnten Inhibition der Funktion von physiolo­ gisch aktiven Peptiden. So können im Vergleich zu einer Antisense-Strategie, welche bisher höchstens eine 60 bis 80%ige Inhibition erlaubt, durch die erfindungsgemäße Optimierung der Aminosäuresequenz eine im wesentlichen vollständige Blockierung der entsprechenden Peptid-Peptid- Wechselwirkungen bzw. des entsprechenden Rezeptors erreicht werden. Aufgrund seiner spezifischen Wirkung wird die erfin­ dungsgemäß abgeleitete Aminosäuresequenz von den Erfindern als Intraactor® bezeichnet. Durch die so erreichbare hohe Effektivität kann die Situation eintreten, daß auf virale Vektoren im Gegensatz zu den Methoden des Standes der Technik vollständig verzichtet werden kann. Dementsprechend wird die Halbwertszeit eines therapeutischen Effekts durch die Eigen­ schaften des Wirkstoffs und seines Zielmoleküls und nicht durch die des gentherapeutischen Vehikels bestimmt. In diesen Fällen kann die erforderliche, meist im nanomolaren Bereich liegende Konzentration des Wirkstoffs bzw. der Aminosäure­ sequenz bereits mit einer einzigen Kopie einer entsprechenden DNA in einer Zelle erreicht werden.

Weiter umfaßt die Erfindung einen Wirkstoff, vorzugsweise einen intrazellulären Wirkstoff, der direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist. Erfindungsgemäß resultiert dieser Wirkstoff aus dem bereits beschriebenen erfindungs­ gemäßen Verfahren bzw. einem seiner Ausführungsformen. Eine direkte Beeinflussung durch den Wirkstoff liegt beispiels­ weise vor, wenn die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abgeleitete Aminosäuresequenz eingesetzt wird, d. h. diese "direkt" die gewünschte Wechselwirkung eingeht. Eine indirek­ te Beeinflussung liegt beispielsweise in dem Fall vor, wenn als Wirkstoff ein für die gewünschte Aminosäuresequenz kodierendes Nukleinsäuremolekül verwendet wird, das einmal in die entsprechende Zelle eingeschleust, die optimierte Amino­ säuresequenz exprimiert.

Dementsprechend handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Wirkstoff insbesondere um eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oder einem seiner Ausführungsformen erhältliche Aminosäuresequenz. Diese Aminosäuresequenz ist insbesondere ein Peptid, das vorzugsweise weniger als 15 Aminosäuren aufweist. In bevorzugter Weiterbildung kann der Wirkstoff mindestens zwei (optimierte) Aminosäuresequenzen enthalten. Grundsätzlich können diese unabhängig voneinander vorliegen und beispielsweise mit entsprechenden Teilabschnitten eines Zielpeptids wechselwirken. Es ist jedoch bevorzugt, wenn die mindestens zwei Aminosäuresequenzen über physiologisch weitgehend inaktive molekulare Zwischenglieder miteinander verbunden sind. Hierbei handelt es sich insbesondere um eine kovalente Verbindung zwischen den Aminosäuresequenzen und den Zwischengliedern. Durch den Einsatz solcher "kovalenter Linker" wird eine weitere Affinitätssteigerung erreicht. Hat eine der Aminosäuresequenzen ihre zugehörige Wechselwirkungs­ stelle gefunden, so ist die Wahrscheinlichkeit, daß auch die zweite Aminosäuresequenz oder eine weitere ihre entsprechende Bindungsstelle findet, wesentlich erhöht. Die Länge der molekularen Zwischenglieder zwischen den Aminosäuresequenzen ist dabei dem Abstand der aktiven Teilabschnitte im Ziel­ peptid oder unter Umständen auch zwischen verschiedenen Zielpeptiden angepaßt. Diese Anpassung kann die biologischen Gegebenheiten berücksichtigen, so daß der Abstand unter Umständen größer sein kann als dies dem tatsächlichen Abstand entspricht. Letzteres ist allerdings bevorzugt. Das Linker- Molekül läßt sich nach Strukturanalyse einzelner Rezeptor­ bereiche (Teilabschnitt) oder des gesamten Rezeptors (Ziel­ peptid) konstruieren. Wenn, wie im vorliegenden Fall, auf die Ableitung von Aminosäuresequenzen abgestellt ist, lassen sich in einfacher Weise Poly-Glycin- oder Poly-Alanin-Ketten entsprechender Länge einfügen.

Als erfindungsgemäße Wirkstoffe lassen sich weiter Nuklein­ säuremoleküle, vorzugsweise rekombinierte Nukleinsäuremole­ küle, einsetzen, die für mindestens eine nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren erhältliche Aminosäuresequenz kodieren. Hierbei kann es sich um ein DNA-Molekül, cDNA-Molekül oder RNA-Molekül handeln. Im Falle der Verwendung molekularer Zwischenglieder als Linker zwischen mehreren Aminosäure­ sequenzen kodieren die Nukleinsäuremoleküle zusätzlich auch für diese Linker-Ketten.

In Weiterbildung kann der erfindungsgemäße Wirkstoff in Form eines sogenannten Vektors oder Vehikels vorliegen, der mindestens eines der bereits beschriebenen Nukleinsäure­ moleküle, die für die Aminosäuresequenz kodieren, trägt. Bei solchen Vektoren kann es sich um die üblichen viralen und nicht-viralen Vektoren handeln, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Bei Verwendung eines viralen Vektors kann ein Retro­ virus, ein Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus eingesetzt werden. Neben nicht-viralen Vektoren, in der keine virale DNA beteiligt ist, ist die Verpackung der Nuklein­ säuremoleküle in die sogenannten Liposomen oder Lipoplexe hervorzuheben. Der Einsatz von nicht-viralen Vektoren oder Liposomen/Lipoplexen ist grundsätzlich bevorzugt, um die bekannten, eingangs teilweise geschilderten Nachteile viraler Vektoren zu vermeiden. Gemäß den Vorteilen der Erfindung können Wirkstoffes mit sehr hoher Effektivität zur Verfügung gestellt werden, die grundsätzlich ohne Verwendung viraler Vektoren in eine Zelle eingeschleust werden können. Vorteil der Erfindung ist ganz grundsätzlich, daß Wirkstoffe, insbe­ sondere Aminosäuresequenzen mit nanomolarer Affinität, zur Verfügung gestellt werden können.

Schließlich umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusam­ mensetzung oder ein Medikament, daß mindestens einen der beschriebenen Wirkstoffe, d. h. eine optimierte Aminosäure­ sequenz, deren kodierendes Nukleinsäuremolekül oder ein das Nukleinsäuremolekül tragendes Vehikel enthält, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug­ ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen, Beispielen und den Zeichnungen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 die Proteinstruktur eines Komplexes aus der cyclin­ abhängigen Kinase CDK2, dem Cyclin A und ihrem Inhibitor p27^Kip1,

Fig. 2 die Wechselwirkung zwischen einem Teilabschnitt des Cyclin A und einem Teilabschnitt von p27^Kip1 und

Fig. 3 den Ablauf bestimmter Ausführungsformen des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens in schematischer Darstel­ lung.

Beispiel

Ausgehend von der bekannten Struktur eines Proteinkomplexes sollen die Einsatzmöglichkeiten der Erfindung dargestellt werden. Dazu wird der Komplex aus der cyclinabhängigen Kinase CDK2, dem Cyclin A und ihrem Inhibitor p27^Kip1 gewählt. Diese Struktur ist in der Veröffentlichung von A.A. Russo et al in Nature, 382, 325-331 (1996) offenbart und in Fig. 1 darge­ stellt.

Ziel des Einsatzes des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, eine Wechselwirkung des p27^Kip1 mit den beiden anderen Proteinen zu hemmen bzw. zu verhindern. Dazu soll eine Aminosäure­ sequenz abgeleitet werden, die vorzugsweise besser als das p27^Kip1 mit den beiden übrigen Proteinen, vorzugsweise dem Cyclin A wechselwirkt.

In Fig. 1 sind die Stellen, an denen Peptid-Peptid-Wechsel­ wirkung zwischen p27^Kip1 und CDK2 bzw. Cyclin A stattfindet, schwarz hervorgehoben. Bei der mit a bezeichneten Bindung/Interaktion handelt es sich um eine Bindungsstelle, die vorerst als eine Bindungsstelle hoher Affinität identifiziert wurde. Weitere Bindungsstellen existieren

• - zwischen einer α-Helix des Cyclin A und einer α-Helix von p27^Kip1 (Bindung/Interaktion b),
• - einer β-Faltblatt-Struktur von CDK2 und einem β-Turn von p27^Kip1 (Bindung/Interaktion c),
• - einem β-Strang von CDK2 und einem ß-Strang von p27^Kip1 (Bindung/Interaktion d).

Zusätzlich besetzt eine weitere Helix von p27^Kip1 die soge­ nannte ATP-Bindungsstelle.

Ausgehend von Fig. 1 soll nun die Wechselwirkung der Bin­ dung/Interaktion b zur Ableitung einer Aminosäuresequenz nach der Erfindung herausgegriffen werden. Die entsprechende Bindungsstelle ist in Fig. 2 dargestellt. Sie zeigt die Wechselwirkung zwischen den beiden α-Helices des Cyclin A bzw. des p27^Kip1, wobei auf Seiten des p27^Kip1 die Amino­ säuren 38 bis 49 und auf Seiten des Cyclins A die α5-Helix involviert sind.

Fig. 2 zeigt, daß die Passung zwischen den beiden wechsel­ wirkenden Strukturen nicht perfekt ist und daher keine sehr hohe Affinität zwischen den beiden Wechselwirkungspartnern vorliegen wird. Das erfindungsgemäße Verfahren soll nun eine der beiden Helices, insbesondere die Helix von p27^Kip1 durch eine optimierte Peptidstruktur (Aminosäuresequenz) ersetzen, die dann die andere Helix, vorzugsweise diejenige des Cyclin A, mit hoher Affinität bindet. Diese optimierte Peptidstruk­ tur wird dann als Peptid von beispiels- und vorzugsweise bis zu 15 Aminosäurenlänge durch ein künstlich eingebrachtes Gen intrazellulär exprimiert. Durch die hohe Affinität des Peptids wird dann die Wechselwirkung der physiologischen Peptidpartner gestört und mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Inhibition der Kinase durch das p27^Kip1 verhindert. Aufgrund dieses Ansatzes müßte die Konzentration der Aminosäuresequenz in der Zelle nur etwa gleich hoch sein wie die Konzentration von p27^Kip1, die auf 10 nM/l oder etwa 1000 bis 10 000 Moleküle pro Zelle geschätzt werden kann. Zum Erreichen einer solchen Konzentration könnte wie geschildert bereits eine einzige Kopie einer die Aminosäuresequenz kodierenden DNA pro Zelle ausreichen.

In Fig. 3 sind der Verfahrensablauf bzw. die Verfahrens­ abläufe bei einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren schematisch dargestellt.

Es wird entweder von der bekannten Wechselwirkung zwischen zwei Peptid-/Proteinmolekülen (linkes oberes Rechteck) oder von der bekannten Proteinstruktur eines intrazellulären Rezeptors bzw. Zielpeptids (rechtes oberes Rechteck) ausge­ gangen. Auf dieser Grundlage werden im vorliegenden Fall geeignete Subdomänen (Teilabschnitte) ausgewählt, die der Ableitung der gesuchten Aminosäuresequenz zugrundegelegt werden sollen. Bei dem Proteinkomplex von Fig. 1 entspricht dies der Auswahl der Bindung/Interaktion an der Bindungs­ stelle b.

Kann, wie im Falle des Proteinkomplexes der Fig. 1, von der realen Struktur eines physiologischen Wechselwirkungspartners des Zielproteins ausgegangen werden, in diesem Fall der Struktur des p27^Kip1, dann stellt diese Struktur die Start­ struktur für die Ableitung der Aminosäuresequenz dar. Es ist dann, wie in Fig. 3 dargestellt, vorteilhaft, wenn beide Wechselwirkungspartner zunächst als Peptid synthetisiert und die Wechselwirkung mittels NMR-Strukturanalyse vermessen wird. Üblicherweise wird hier keine vollständige Synthese der ganzen Peptide erforderlich sein, sondern es wird genügen, wenn die entsprechenden Teilabschnitte der Peptidsequenzen, die an der Bindungsstelle b wechselwirken, synthetisiert werden.

Zeigt die NMR-Strukturanalyse keine optimale Wechselwirkung (was grundsätzlich erwünscht ist, damit überhaupt eine besser wirkende Aminosäuresequenz erhalten werden kann), so wird die Startstruktur mit Hilfe des sogenannten Molecular Modelling variiert. Dabei wird in an sich bekannter Weise bei minde­ stens einer, vorzugsweise vielen verschiedenen vorgegebenen Aminosäuresequenzen deren (räumliche) Peptidstruktur bestimmt und ihre Passung mit dem entsprechenden Teilabschnitt des Zielpeptids untersucht. Auf Basis des Molecular Modelling wird dann eine Anzahl degenerierter Sequenzen entworfen, aus denen eine oder mehrere für ein Screening-Verfahren ausge­ wählt werden. Im vorliegenden Fall handelt es sich bei dem Screening-Verfahren um das FRET-Yeast-Two-Hybrid-Verfahren. Hierbei werden aus ca. 10⁸ bis 10⁹ Hefezellen mit Klonen unterschiedlicher Sequenz eine Anzahl bester Zellen, vorzugs­ weise etwa 10, ausgewählt, bei denen die Wechselwirkung zwischen den Peptiden, gemessen durch Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer (FRET) am stärksten bzw. besten ist. Die Zellen mit der besten Wechselwirkung werden kloniert, und die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen bzw. die zugehörigen Aminosäuresequenzen werden durch Sequenzierung ermittelt. Vergleicht man nun, wie in Fig. 3 ebenfalls dargestellt, ob Ähnlichkeiten zwischen den ausgewählten Sequenzen erkennbar sind oder ob andere Ansatzpunkte für gemeinsame Struktur­ motive vorliegen, so kann diese Information für die weitere Verfahrensführung genutzt werden. Gibt es Hinweise auf optimierbare Strukturmotive, so werden ausgewählten Sequenzen als Peptide hergestellt und ihre Wechselwirkungsstruktur mittels NMR-Spektroskopie vermessen. Ist die Wechselwirkung noch nicht ausreichend, entweder im Vergleich zu dem natür­ lichen Wechselwirkungspartner des Zielpeptids oder im Hin­ blick auf eine zu erreichende Affinität, wird der mit dem Verfahrensschritt des Molecular Modelling beginnende Verfah­ rensdurchlauf erneut gestartet, um auf diese Weise zu verbes­ serten Affinitäten zu gelangen. Ist aus einem früheren Verfahrensdurchlauf bereits eine Aminosäuresequenz mit guter Wechselwirkung bekannt, so kann diese in den folgenden Verfahrensschritten, insbesondere beim Screening-Verfahren als Kompetitor eingesetzt werden, um auf diese Weise die noch besseren Aminosäuresequenzen zu erkennen. Wie bereits ge­ schildert muß der in Fig. 3 dargestellte Zyklus der Ableitung der Aminosäuresequenz üblicherweise drei- bis zwanzigmal, vorzugsweise drei- bis zehnmal pro Rezeptordomäne (Teil­ abschnitt des Zielpeptids) durchlaufen werden, um Aminosäure­ sequenzen mit ausreichender Affinität zu erhalten. Diese gewünschte Affinität liegt normalerweise im nanomolaren Bereich, wie dies ebenfalls bereits dargestellt wurde.

Eine Verfahrensführung gemäß Fig. 3, die nicht von der realen Struktur eines physiologischen Wechselwirkungspartners als Startstruktur ausgehen kann, unterscheidet sich im wesent­ lichen nur dadurch, daß nach Auswahl der entsprechenden Subdomäne(Teilabschnitt des Zielpeptids) direkt mit Hilfe des Molecular Modelling eine Aminosäuresequenz als Start­ struktur ausgewählt werden muß. Es ist zwar grundsätzlich möglich, diese (simulierte) Startstruktur ebenfalls einer Peptidsynthese und NMR-Strukturanalyse zu unterwerfen, wie dies in Fig. 3 für den Fall des physiologischen Bindungs­ partners dargestellt ist. Dies wird jedoch in den meisten Fällen nicht sinnvoll sein, da die simulierte Startstruktur ohnehin mit großer Wahrscheinlichkeit keine optimale Wechsel­ wirkung zeigen wird. Die simulierte Startstruktur wird deshalb lediglich zur Planung einer degenerierten Nuklein- Säuresequenz herangezogen, die dann in das eigentliche Screening-Verfahren eingesetzt wird. Durch das Molecular Modelling wird jedoch erreicht, daß eine vollständige De­ generation der Nukleinsäuresequenz entfallen kann, was die Variabilität immerhin von Werten um 10²⁰ auf etwa 10¹⁰ herabsetzen kann. Durch weitere Verfahrensdurchläufe kann in der bereits geschilderten Weise die Variabilität sukzessive weiter erniedrigt werden.

Das gemäß Fig. 3 einsetzbare FRET-Yeast-Two-Hybrid-Verfahren beruht im wesentlichen darauf, daß die beiden Peptide, deren Wechselwirkung miteinander untersucht werden soll, an unter­ schiedliche fluoreszierende Komponenten gekoppelt sind. Dabei überlappen die Absorptions- und Emissionsspektren der fluo­ reszierenden Komponenten derart, daß ein Fluoreszenz-Reso­ nanz-Energie-Transfer (FRET) auftritt. Dieser Nachweis kann unter analoger Anwendung des bekannten Yeast-Two-Hybrid- Verfahrens ebenfalls in einer Wirtszelle wie einer Hefezelle durchgeführt werden, wobei das gemessene Fluoreszenzsignal einen unmittelbaren Aufschluß über die Affinität der Bindung bzw. Wechselwirkung zwischen den beiden Peptidbestandteilen gibt. Wie auch im vorliegenden Fall kann der Fluoreszenz- Resonanz-Energie-Transfer (FRET) durch bekannte fluoro­ metrische Methoden, wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortie­ rung (FACS) oder durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Als fluoreszierende Komponenten können vorzugsweise fluores­ zierende Peptide wie das Green Fluorescent Protein (GFP) und das Blue Fluorescent Protein (BFP) eingesetzt werden. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgt bevorzugt durch Laser. In diesem Zusammenhang kann auf den einschlägigen Stand der Technik verwiesen werden.

Wie aus Fig. 3 ebenfalls hervorgeht, erfolgt die endgültige Analyse der Proteinstrukturen und ihrer Wechselwirkung mit Hilfe eines NMR-Spektrometers. Grundsätzlich können auch andere Nachweismethoden verwendet werden, wie beispielsweise die Röntgenstrukturanalyse eines kristallisierten Peptid- oder Proteinkomplexes. Aufgrund der Tatsache, daß die Analyse der Peptidstruktur mit dem NMR-Spektrometer einen vergleichs­ weise hohen Zeitaufwand erfordert, nimmt der entsprechende Verfahrensschritt eine wichtige Stellung im Gesamtverfahren ein. Wie bereits ansatzweise ausgeführt, läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren als Kombination aus einem zufälli­ gen Screening und einer deterministischen Modelling-Strategie verstehen. Diese hier angewandte Vorgehensweise ist an den mathematischen Ablauf bestimmter Fitting-Algorithmen ange­ lehnt, bei denen ebenfalls abwechselnd eine zufällige Varia­ tion und eine gezielte Veränderung der Parameter erfolgt, um die beste Anpassung einer Gleichung mit zahlreichen Para­ metern an eine experimentelle Kurve zu erreichen. Auch hier muß wie im vorliegenden Fall aus einer vergleichbar großen Zahl von Möglichkeiten (hier: mögliche Aminosäuresequenzen) eine beste oder möglichst gute (hier: optimierte Aminosäure­ sequenz) herausgesucht werden. Für diesen strategischen Ansatz ist wichtig, daß in jedem Verfahrenszyklus immer wieder die Abweichung errechnet wird, da sowohl die experi­ mentellen Datenpunkte als auch die mathematische Gleichung exakt bekannt sind. Bei dieser Berechnung wird dann jedes Mal der Einfluß aller variablen Parameter auf diese Abwei­ chung ausprobiert, um die sich anschließende nächste Phase der Variation (Verfahrensdurchlauf) zu planen. Übertragen auf die Erfindung bedeutet dies, daß die Messung mit dem NMR-Spektrometer diese Kontrolle und Festlegung der Abweichung erlaubt.

Da jedoch beispielsweise bei einem 600 MHz-Spektrometer bei völlig unbekannten Strukturen (nach Ablauf mehrerer sogenann­ ter TOCSY- und sogenannter NOESY-Protokolle) ca. 80 bis 120 Stunden reine Meßzeit erforderlich sind, läßt sich der Aufwand am besten durch die geschilderte Strategie erreichen, bei der immer nur bereits optimierte Aminosäuresequenzen in eine NMR-Strukturanalyse eingebracht werden. Selbst unter Anwendung dieser Strategie sind bei drei bis zehn Verfahrens­ durchläufen und Untersuchung von vier Peptiddomänen (Teil­ abschnitten) eines Zielpeptids üblicherweise immer noch ca. 2000 Stunden Meßzeit für die Entwicklung einer optimierten Aminosäuresequenz erforderlich.

Claims (30)

1. Verfahren zur Entwicklung eines Wirkstoffs, der, vor­ zugsweise intrazellulär, direkt oder indirekt zur Beein­ flussung der Funktion von physiologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte:

• - Identifizierung und Auswahl eines Zielpeptids oder Zielproteins, insbesondere mindestens eines Teil­ abschnitts dieses Peptids oder Proteins, wobei das Zielpeptid/Zielprotein bzw. der Teilabschnitt physiologisch an einer Protein-Protein- bzw. Peptid-Peptid-Wechselwirkung teilnimmt oder teil­ nehmen kann
• - Ableitung bzw. Screening einer Aminosäuresequenz, die mit dem Zielpeptid/Zielprotein bzw. dessen Teilabschnitt oder Teilabschnitten mit hoher Affinität wechselwirkt, vorzugsweise mindestens genauso gut wie dessen physiologischer Wechsel­ wirkungspartner.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ableitung der Aminosäuresequenz die Auswahl minde­ stens einer Startstruktur einer Aminosäuresequenz umfaßt, vorzugsweise mit einer solchen Auswahl beginnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Startstruktur um die Aminosäuresequenz eines physiologischen Wechselwirkungspartners des Zielpeptids/Zielproteins bzw. eines seiner Teilabschnit­ te handelt, und/oder um eine aus einer mit Hilfe des sogenannten Molecular Modelling computersimulierten Proteinstruktur abgeleitete Aminosäuresequenz.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß auf Basis der Startstruktur minde­ stens eine, vorzugsweise eine Anzahl, degenerierter Nukleinsäuresequenzen bestimmt und ausgewählt wird, die für Variationen der als Startstruktur ausgewählten Aminosäuresequenz kodiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine degenerierte Nukleinsäuresequenz einem bekannten Screening-Verfahren unterworfen wird, mit dessen Hilfe die Wechselwirkung zwischen Zielpeptid/­ Zielprotein bzw. dessen Teilabschnitt und den Amino­ säuresequenzen, die der degenerierten Nukleinsäure­ sequenz entsprechen, bestimmbar ist, und Aminosäure­ sequenzen mit guter Wechselwirkung ausgewählt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Screening-Verfahren um eine sogenannte Yeast-Two-Hybrid-Methode, vorzugsweise die sogenannte FRET-Yeast-Two-Hybrid-Methode handelt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bestimmte Nukleinsäuresequenzen sequenziert werden, vorzugsweise das Screening-Verfahren eine Sequenzierung der Nukleinsäuresequenzen mit ver­ gleichsweise guter Wechselwirkung umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise die Zellen, die diese Nukleinsäuresequenzen in einem Screening-Verfahren tragen, vor der Sequenzierung geklont werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens teilweise die zu den sequenzierten Nukleinsäuremolekülen gehörenden Amino­ säuresequenzen synthetisiert oder weitgehend quantitativ exprimiert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkungsstruktur zwischen Zielpeptid/Ziel­ protein bzw. dessen Teilabschnitt und der synthetisier­ ten Aminosäuresequenz NMR-spektroskopisch vermessen wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne oder mehrere Verfahrensschritte zur Optimierung der Aminosäuresequenz mindestens zweimal, vorzugsweise mehrfach, durchgeführt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine aus früheren Verfahrensschritten erhal­ tene Aminosäuresequenz mit guter Wechselwirkung in weiteren Verfahrensschritten als Kompetitor eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Ableitung von Aminosäuresequenzen für mehrere Teilabschnitte eines Zielpeptids/Zielproteins durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die erforderlichen Verfah­ rensschritte zur Ableitung einer Aminosäuresequenz pro Teilabschnitt zwischen dreimal und zwanzigmal, vorzugs­ weise zwischen dreimal und zehnmal, durchlaufen werden.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die abgeleitete Aminosäure­ sequenz weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 15 Aminosäuren, umfaßt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei einem Teil­ abschnitt des Zielpeptids/Zielproteins um eine sogenann­ te α-Helix- oder eine sogenannte β-Faltblatt-Struktur handelt.

17. Wirkstoff, der, vorzugsweise intrazellulär, direkt oder indirekt zur Beeinflussung der Funktion von physiolo­ gisch aktiven Peptiden oder Proteinen in der Lage ist, resultierend aus einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16.

18. Wirkstoff nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16 erhältliche Aminosäuresequenz handelt.

19. Wirkstoff nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Peptid, vorzugsweise um ein Peptid mit weniger als 15 Aminosäuren, handelt.

20. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Aminosäuresequenzen über physiologisch weitgehend inaktive molekulare Zwischenglieder miteinander verbunden sind.

21. Wirkstoff nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der molekularen Zwischenglieder dem Abstand zwischen aktiven Teilabschnitten eines oder mehrerer Zielpeptide/Zielproteine angepaßt ist, vorzugsweise diesem Abstand entspricht.

22. Wirkstoff nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zwischenglied um eine Poly-Glycin- oder Poly-Alanin-Kette handelt.

23. Wirkstoff nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise ein rekombiniertes Nukleinsäuremolekül, handelt, das für mindestens eine nach mindestens einem der Verfahrens­ ansprüche 1 bis 16 erhältliche Aminosäuresequenz ko­ diert.

24. Wirkstoff nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül, cDNA-Molekül oder RNA-Molekül ist.

25. Wirkstoff nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form eines sogenannten Vektors vorliegt, der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 23 oder 24 trägt.

26. Wirkstoff nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um einen viralen Vektor handelt.

27. Wirkstoff nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Virus um eine Retrovirus, ein Adenovirus oder ein Adeno-assoziiertes Virus handelt.

28. Wirkstoff nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vektor um einen nicht-viralen Vektor handelt.

29. Wirkstoff nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein in ein Liposom oder einen Lipoplex verpacktes Nukleinsäuremolekül handelt.

30. Pharmazeutische Zusammensetzung oder Medikament, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Wirkstoff nach einem der Ansprüche 17 bis 29 in einer wirksamen Menge und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.