DE60130488T2

DE60130488T2 - Verfahren zur identifizierung von ein physiologisch aktives polypeptid kodierender dna in einem nagetier

Info

Publication number: DE60130488T2
Application number: DE60130488T
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Gotenba-shi HABU; Kou-ichi Gotenba-shi JISHAGE; Hiroshi Hokkaido SUZUKI
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2001-12-26
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2021-12-27
Also published as: EP1870461A3; EP1354945B1; DE60130488D1; US20090092995A1; US20100329988A1; EP1354945A1; EP1354945A4; JPWO2002052001A1; ATE373088T1; EP1870461A2; US20040067509A1; JP4012821B2; WO2002052001A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizierung eine DNA in einem Nagetier, die ein physiologisch aktives Polypeptid codiert, und ein dazu verwendetes Kit.
Stand der Technik
Traditionell ist die Proteinreinigung ein wesentliches Verfahren für die Identifizierung einer ein physiologisch aktives Polypeptid codierenden DNA aus Geweben oder Zellen. Alternativ lässt sich die Nukleotidsequenz eines Gens mittels Bioinformatik vorhersagen, und die reale Funktion des Gens lässt sich durch Erzeugung von Knockout-Mäusen oder transgenen Mäusen und deren Analyse identifizieren.
Einige menschliche Tumorzellen, die physiologisch aktive Substanzen produzieren, können in vitro oder in immundefizienten Tieren (beispielsweise in Nacktmäusen oder SCID-Mäusen) jedoch nicht gehalten werden, da sie sonst ihre Eigenschaften während der Passage verändern und manchmal keine physiologisch aktiven Substanzen mehr produzieren. In solchen Fällen können die klassischen Ansätze die physiologisch aktiven Substanzen nicht identifizieren.
Wenn eine solche physiologisch aktive Substanz aus einem Pool vieler Gene identifiziert wurde, ist es darüber hinaus unpraktisch, Knockout-Mäuse oder transgene Tiere für die jeweiligen Gene zu erzeugen, um deren physiologische Aktivität festzustellen, da dies viel Zeit und Arbeit erfordert.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde unter solchen Umständen geschaffen, und ihre Aufgabe ist es, ein Verfahren bereitzustellen, um eine DNA, die eine physiologische Aktivität aufweist, in einem Pool von vielen DNAs effektiv zu identifizieren.
Um die obigen Sachverhalte zu lösen, untersuchten die vorliegenden Erfinder, ob es möglich ist, in Säugetieren eine DNA aus einem Pool vieler DNAs zu identifizieren, die eine bestimmte physiologische Aktivität aufweist.
Insbesondere wurden Gene, die EPO oder IL-6 codieren, separat in Vektoren eingesetzt, welche den Zytomegalievirus-Enhancer und Promotor-Sequenzen von β-Aktin des Huhns enthalten, die in Säugetierzellen eingesetzte Gene sehr gut exprimieren können. Die resultierenden Vektoren wurden zusammen mit einem leeren Vektor in über die Schwanzvene in Mäuse injiziert, und es wurden die Wirkungen von EPO und IL-6 untersucht.
Das Ergebnis zeigte überraschenderweise, dass die Effekte von EPO und IL-6 sich gegenseitig nicht stören und in Mäusen unabhängig aufgefunden werden können. Die Effekte von EPO und IL-6 wurden auch aufgefunden, wenn der leere Vektor in dem Vektorpool 100 Mal häufiger vorhanden war als der EPO-Genexpressionsvektor oder der IL-6-Genexpressionsvektor.
Die vorliegenden Erfinder stellten also fest, dass es möglich ist, einen physiologischen Effekt einer bestimmten, in verschiedenen Mengen in einem DNA-Pool, der verschiedenen DNAs enthält, enthaltenen DNA, in einem Nagetier unabhängig aufzufinden. Diese Befunde legen nahe, dass es möglich ist, eine DNA zu identifizieren, die einen besonderen physiologischen Effekt verleiht, indem ein Pool verschiedener DNAs in verschiedenen Mengen sequenziell zu fraktionieren, wobei der jeweilige physiologische Effekt in vivo als Index herangezogen wird. Da ein solches Verfahren einen Nagetierkörper verwendet, hat es den Vorteil, auch dann die Identifizierung einer einen physiologischen Effekt verleihenden DNA zu ermöglichen, wenn beispielsweise die die physiologisch aktive Substanz produzierenden Zellen in vitro oder in immundefizienten Tieren nicht gehalten werden können, oder wenn die Zellen während der Passage ihre Eigenschaften verlieren. Darüber hinaus das das Screening-Verfahren den weiteren Vorzug, viel Zeit und Arbeit zu sparen, die bei klassischen Screenings, wie beispielsweise bei solchen, bei denen transgene Mäuse und Knockout-Mäuse herangezogen werden, erforderlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur effektiven Identifizierung einer DNA in einem Nagetier, die eine physiologische Aktivität aufweist. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Folgendes bereit:

(1) Ein Verfahren zum Identifizieren einer ein physiologisch aktives Polypeptid codierenden DNA, aufweisend die Schritte:
(a) Einführen von zumindest zwei Arten von Polypeptide codierende DNAs in ein Nagetier und Expression der DNAs in dem Nagetier,
(b) Auffinden einer physiologischen Veränderung bei dem Nagetier,
(c) Fraktionieren der bei Schritt (a) verwendeten DNAs, wenn eine physiologische Veränderung bei Schritt (b) aufgefunden wird, und Auffinden der physiologischen Veränderung bei dem Nagetier gemäß Schritt (b) für jede fraktionierte DNA, und
(d) Identifizieren einer fraktionierten DNA, die die physiologische Änderung bei dem Nagetier bedingt.
(2) das Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die Schritte aufweist:
(e) Wiederholen (i) des Fraktionierens der DNAs, (ii) des Auffindens der physiologischen Veränderung bei dem Nagetier für jede fraktionierte DNA und (iii) des Identifizierens einer fraktionierten DNA, die die physiologische Veränderung bei dem Nagetier bedingt, bis eine DNA identifiziert wird, die die physiologische Veränderung bei dem Nagetier bedingt.
(3) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei die DNAs intravenös in das Nagetier injiziert werden;
(4) das Verfahren nach (3), wobei die intravenöse Injektion durch die Schwanzvene ausgeführt wird;
(5) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei zumindest 10 Arten von Polypeptide codierende DNAs bei Schritt (a) in das Nagetier eingeführt werden;
(6) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei zumindest 100 Arten von Polypeptide codierende DNAs bei Schritt (a) in das Nagetier eingeführt werden;
(7) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei zumindest 1000 Arten von Polypeptide codierende DNAs bei Schritt (a) in das Nagetier eingeführt werden;
(8) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei die DNA aus einer Tierzelle, einem Tiergewebe oder einer Zelllinie eines Tieres gewonnen wird;
(9) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei die DNA aus einer Tumorzelle, einem Tumorgewebe oder einer Zelllinie eines Tumors gewonnen wird;
(10) das Verfahren nach (1) oder (2), wobei die Gesamtmenge der in das Nagetier auf einmal injizierten DNA 100 μg oder weniger beträgt;
(ii) das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Gesamtmenge der in das Nagetier auf einmal injizierten DNA 10 μg oder weniger beträgt.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer DNA in einem Nagetier bereist, die ein physiologisch aktives Polypeptid codiert.
Zunächst werden in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung DNAs, die mindestens zwei Arten von Polypeptiden kodieren, in ein Nagetier eingeführt und in vivo in dem Nagetier exprimiert ((1) Schritt (a)).
In Bezug auf die in der vorliegenden Erfindung in Nagetiere eingeführten DNA gibt es keine besondere Einschränkung; es kann eine DNA verwendet werden, die ein beliebiges Polypeptid codiert und deren physiologische Aktivität identifiziert werden soll. Beispielsweise kann eine aus einer Tierzelle, einem Tiergewebe oder einer Tierzelllinie stammende DNA geeignet verwendet werden. Insbesondere kann je nach dem Zweck des Experimentes jede DNA verwendet werden, beispielsweise kann eine aus T-Zellen, hämatopoietischen Zellen oder hämatopoietischen Stammzellen stammende DNA verwendet werden, wenn eine DNA in Verbindung mit einer Blutkrankheit oder einer Autoimmunkrank heit identifiziert werden soll, oder eine aus einer Tumorzelle, einem Tumorgewebe oder einer Tumorzelllinie stammende DNA; wenn eine DNA identifiziert werden soll, die an der Tumorentwicklung beteiligt ist.
Die vorliegenden Erfinder haben entdeckt, dass es sogar dann, wenn viele DNAs, die verschiedene Arten physiologisch aktiver Polypeptide kodieren, gleichzeitig in einem Nagetier exprimiert sind, möglich ist, die physiologische Aktivität einer jeden DNA unabhängig aufzufinden. Das Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist daher, dass DNAs, die mindestens zwei Arten von Polypeptiden codieren, in ein Säugetier eingeführt werden. Es ist möglich, DNAs in ein Nagetier einzuführen, die 10 oder mehr (beispielsweise 100 oder mehr, 1000 oder mehr) Arten von Polypeptiden codieren.
Bezüglich der Einzeldosis an DNA, die in ein Nagetier eingeführt wird, gibt es keine besondere Einschränkung, so lange wie die physiologische Aktivität des Expressionsproduktes der DNA auffindbar ist; vorzugsweise beträgt sie aber 100 μg oder weniger. Da die vorliegende Erfindung die Auffindung eines exprimierten Polypeptids auch dann ermöglicht, wenn die DNA-Gesamtmenge, die in das Nagetier injiziert wird, 10 μg oder weniger betrug, ist es möglich, DNA in einer Dosis von 10 μg oder weniger zu injizieren. Die Injektion von DNA in ein Nagetier kann, falls erforderlich, mehrere Male wiederholt werden.
Eine in ein Nagetier einzuführende DNA ist normalerweise in einen Säugetierzellexpressionsvektor eingesetzt. Was Säugetierzellexpressionsvektoren angeht, gibt es keine besonderen Einschränkungen, so lange wie sie die Expression der eingesetzten DNA „in Zellen" sicherstellen. Beispielsweise können ein Vektor, der beispielsweise den β-Aktinpromotor des Huhns (beispielsweise pCAGGS; Niwa H. et al., Gene 108: 193-200 (1991)), den CMV-Promotor (beispielsweise pCMV-Script; Stratagene, pcDNA3.1/His; Invitrogen), den EF-1α-Promoter (beispielsweise pEFI/His; Invitrogen) oder den SRα-Promoter (beispielsweise pME18SFL3; Maruyama K. and Sugano S., Gene 138: 171 (1994)) verwendet, verwendet werden. Insbesondere kann der pCAGGS-Vektor, welcher den Zytomegalievirus-Enhancer und die β-Aktinpromotorsequenzen des Huhns aufweist, in der vorliegenden Erfindung geeignet verwendet werden. Wenn ein Säugetierzellexpressionsvektor in vivo in ein Nagetier eingeführt wird, kann der Vektor auch mit einem Polymer, Liposom, PEI (Polyethylenimin) oder dergleichen gemischt werden, um die Effizienz der DNA-Expression zu verbessern. Alternativ kann anstelle von Säugetierzellexpressionsvektoren ein Virusvektor verwendet werden, der von einem bekannten Retrovirusvektor oder Adenovirusvektor wiedergegeben ist.
Es gibt keine besondere Einschränkung, was die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nagetiere anbelangt; beispielsweise können Nagetiere wie Ratten, Mäuse und dergleichen geeignet verwendet werden. DNA kann in Nagetiere mithilfe verschiedener Verfahren eingeführt werden, beispielsweise durch intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion, orale Verabreichung, subkutane oder intrakutane Injektion, intranasale Verabreichung, direkte Injektion in ein Organ wie beispielsweise die Leber oder das Herz, etc. Für Nagetiere wie Ratten und Mäuse kann geeignet eine Injektion über die Schwanzvene verwendet werden. Die Expressionseffizienz lässt sich durch Verwendung der „Gene Gun" (Bio-Rad) oder durch elektrische Stimulation verbessern, wenn DNAs eingeführt werden.
Als nächstes wird in der vorliegenden Erfindung eine physiologische Veränderung in dem obigen Nagetier aufgefunden (Schritt (b)).
Es gibt keine Einschränkung, was die aufzufindende physiologische Veränderung anbelangt, und diese kann eine Veränderung der Blutzellen (beispielsweise die Veränderung der Anzahl der Erythrozyten, der Lymphozyten oder der Thrombozyten), eine Veränderung der biochemischen Werte im Blut (beispielsweise die Veränderung des GOT- oder GTP-Wertes oder die Veränderung der Menge von Glukose, Kalzium oder Phosphat) oder eine Veränderung der Harnstoffmenge im Harn umfassen. Eine relevante physiologische Veränderung kann von den Personen, die das Experiment durchführen, im Voraus festgesetzt werden. Alterna tiv kann eine relevante physiologische Veränderung nach Einführen der DNA in Nagetiere gefunden werden.
Als nächstes wird in der vorliegenden Erfindung, wenn eine physiologische Veränderung in Schritt (b) aufgefunden wurde, die in Schritt (a) verwendete DNA fraktioniert, und jede fraktionierte DNA wird verwendet, um die physiologische Veränderung in dem Nagetier aufzufinden (Schritt (c)).
Der obige Schritt lässt sich folgenderweise durchführen. Wenn E. coli als Wirt zur Konstruktion einer Bibliothek von DNA verwendet wird, die in vivo in ein Nagetier eingeführt wurde, wird ein Pool von E. coli-Zellen identifiziert, die der DNA-Fraktion entsprechen, mit der die physiologische Aktivität aufgefunden worden ist, und dann auf Platten ausgestrichen, um einzelne E. coli-Zellen zu klonieren.
Die klonierten E. coli-Zellen werden fraktioniert, und von jeder Fraktion wird eine DNA (Vektor) hergestellt. Jede hergestellte DNA-Fraktion wird in das Nagetier eingeführt, um die relevante physiologische Veränderung aufzufinden.
Als nächstes wird in der vorliegenden Erfindung eine DNA-Fraktion identifiziert, welche die physiologische Veränderung in dem Nagetier induziert (Schritt (d)).
Wenn die im obigen Schritt identifizierte DNA-Fraktion mehrere DNAs umfasst, ist es, je nach Bedarf, möglich, (i) die DNA-Fraktionierung weiter zu wiederholen, (ii) zu untersuchen, ob jede fraktionierte DNA die physiologische Veränderung in dem Nagetier bewirkt, und (iii) eine DNA zu identifizieren, die die physiologische Veränderung in dem Nagetier bewirkt, bis eine DNA identifiziert ist, welche die physiologische Veränderung bewirkt (Schritt (e)). Die Nukleotidsequenz der identifizierten DNA lässt sich je nach Bedarf der anschließenden Experimente bestimmen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schaubild, welches die Effekte der Expression von in Mäusen eingeführten Genen zeigt.
2 ist eine Fotografie, welche die Expression der eingeführten Gene in Mausleber zeigt. In der Northern-Blot-Analyse wurden jeweils 6 μg PolyA+-RNA verwendet.
3 ist ein Schaubild, welches den Effekt von in Mäusen exprimiertem EPO zeigt.
4 ist ein Schaubild, welches den Effekt von in Mäusen exprimiertem IL-6 zeigt.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Diese Erfindung wird unten unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlich erklärt, ist aber nicht so zu verstehen, dass sie auf diese beschränkt sei.
[Beispiel 1] Ein Verfahren zum Screening auf eine DNA anhand von Mauskörpern
Die vorliegenden Erfinder suchten nach einem Verfahren, bei dem, wenn ein Pool von 100 oder 1000 Genen mit unbekannter Funktion gleichzeitig in eine Maus eingeführt wird und ein gewisser physiologischer Effekt beobachtet wird, ein Gen identifiziert wird, das die physiologische Aktivität aufweist, indem der Schritt der Fraktionierung des ursprünglichen Genpools wiederholt wird, die dann anschließend wieder in Mäuse eingeführt werden.
Das Verfahren verwendet den von Miyazaki et al. (Niwa H. et al., Gene 108: 193-200 (1991)) entwickelten pCAGGS-Vektor, um ein Gen in Mäusen zu überexprimieren. Der pCAGGS-Vektor, in dem der Zytomegalievirus-Enhancer und der β-Aktinpromotor des Huhns kombiniert sind, ist in der Lage, ein in Säugetierzellen eingeführtes Gen stark zu exprimieren. Die vorliegenden Erfindung bauten ein relevantes Gen in den Vektor ein und resuspendierten diesen in einer Lösung, die ein Kit für die Gentransfektion in vivo (Handelsname: TransIt In Vivo Gene Delivery System, TaKaRa) aufwies, und injizierten den Vektor durch die Schwanzvene in Mäuse.
(1) Analyse der Expression einer DNA in Mäusen
Wenn ein das GFP-Gen enthaltender Vektor injiziert wurde (normalerweise wurden 10 μg Vektor je Maus injiziert), wurde sechs Tage nach der Injektion eine starke GFP-Expression in der Leber festgestellt. Wenn entsprechend ein Vektor injiziert wurde, der das EPO-Mausgen oder das IL-6-Mausgen enthielt, wurde das entsprechende Zytokin im Blut festgestellt (1), und die mRNA wurde in der Leber festgestellt (2).
(2) Anwendung für das Screening

Bei Screenings, bei denen für gewöhnlich eine große Zahl von Genen zu screenen ist, ist es unpraktisch, jeden, ein Gen enthaltenden Vektor (Klon) nacheinander in Mäuse zu injizieren, da viel Zeit und Arbeit erforderlich wäre. Die vorliegenden Erfinder überlegten sich daher, dass bei einem effektiven Screening der Effekt eines einzelnen Vektors festgestellt werden sollte, auch wenn ein Gemisch von mindestens 100 Vektorar ten gleichzeitig in eine Maus injiziert wird. Die vorliegenden Erfinder untersuchten daher, wie sehr DNA verdünnt werden kann (auch wenn andere Vektoren als die, die das relevante Gen tragen, im Überschuss vorhanden sind), um den Effekt des EPO-Gens und des IL-6-Gens festzustellen, indem Vektoren, die diese beiden Gene enthalten, gemischt wurde. Das Experiment wurde folgenderweise durchgeführt (Tabelle 1). Tabelle 1

Gruppe	Geschätzte Anzahl von Klonen	CAG	EPO	IL-6
1	-	100 μg	0	0
2	1000	99,8 μg	0,1	0,1
3	100	98 μg	1	1
4		80 μg	10	10
5		9,8 μg	0,1	0,1
6		GFP 98 μg	1	1
7	Keine Behandlung	-

Für jede Gruppe wurde eine Gruppe männlicher ICR-Mäuse im Alter von 12 Wochen (n = 4 oder 5) verwendet, und am Tag nach der Injektion (Tag 1) und nach einer Woche (Tag 7) wurden Proben gesammelt. Die Klonnummern zeigen die geschätzte Anzahl an Klonen an, die zum Screening-Zeitpunkt gemischt wurden. In Gruppe 2 beispielsweise repräsentiert der EPO-Vektor oder IL-6-Vektor 1/1000 der Gesamt-DNA. Wird daher der Effekt von EPO oder IL-6 in dem Experiment aufgefunden, zeigt dies an, dass 0,1 μg je Klon ausreichend sein könnten, um den Effekt aufzufinden. Es zeigt auch an, dass der Effekt eines relevanten Gens ohne Störung verschiedener Kontaminanten aufgefunden werden kann, sogar dann, wenn 99,8 μg Vektoren vorhanden waren, bei denen es sich nicht um den relevanten Vektor handelte (d. h. bei Vorhandensein von 1000 solcher Vektoren).
Gruppe 1 dient der Bestimmung des Hintergrunds des Effektes einer DNA-Injektion. Gruppe 4, in der die EPO- und IL-6-Vektoren in einer Dosis injiziert werden, die normalerweise verwendet wird, um nur den jeweiligen Vektor in Mäuse zu injizieren, ist ausgelegt, um zu untersuchen, ob ein Effekt, der nicht beobachtet wurde, wenn jeder Vektor alleine verwendet wurde, induziert werden kann oder ob sich die jeweiligen Effekte gegenseitig beeinflussen, wenn die beiden Vektoren gemischt werden. Gruppe 5 ist eine Kontrolle, in der insgesamt 10 μg DNA injiziert werden, d. h. die normalerweise in Mäuse injizierte Dosis. Gruppe 6 ist eine Kontrolle, welche den Effekt der Überexpression eines Proteins abschätzt, bei dem es sich nicht um das relevante Protein handelt (in diesem Fall GFP). Gruppe 7 ist eine Kontrolle, bei der die Mäuse keiner Behandlung unterzogen wurden.
Die Ergebnisse sind in 3 und 4 gezeigt. Das Ergebnis der Injektion von 10 μg eines jeden Vektors (1) zeigte, dass es in der mit dem EPO-Vektor injizierten Gruppe einen Anstieg der Anzahl von Erythrozyten und in der mit dem IL-6-Vektor injizierten Gruppe eine signifikante Verminderung des Körpergewichtes gab (IL-6 ist ein Gen, das in ursächlichem Zusammenhang mit Kachexie steht). Unter Heranziehung dieser Effekte der respektiven Gene als Indizes wurden die Daten folgenderweise interpretiert.
In Gruppe 3, die mit einem Pool von 100 Klonen injiziert wurde (98 μg CAG, 1 μg EPO und 1 μg IL-6), der schätzungsweise normalerweise in Screenings auf Gene mit unbekannter Funktion verwendet wird, gab es einen signifikanten Anstieg des HCT-Wertes im Vergleich zur Kontrollgruppe (Gruppe 1) und eine verstärkte Tendenz für unterdrücktes Körpergewicht. Fast dieselben Effekte wurden in Gruppe 5 beobachtet (9,8 μg CAG, 0,1 μg EPO und 0,1 μg IL-6), was darauf hindeutet, dass es möglich ist, insgesamt 10 μg DNA zu verwenden und die Dosis auf 0,1 μg je Klon zu verringern.
Die obigen Ergebnisse bestätigten, dass es möglich ist, den Effekt jedes einzelnen Gens ohne gegenseitige Beeinflussung aufzufinden, auch wenn ein Pool verschiedener Gene gleichzeitig eingeführt wird. Darüber hinaus wird angenommen, dass das Verfahren des In-vivo-Screenings der vorliegenden Erfindung sogar mit einem Pool von 1.000 Klonen funktioniert, wenn es ein geeignetes System gibt, welches den Effekt des Zielgens wiedergibt.
Industrielle Anwendbarkeit
Das generelle Verfahren ist herkömmlicherweise die Reinigung aktiver Substanzen (Proteine), beispielsweise aus dem Kulturüberstand von Zellen, die diese produzieren. Wenn die Nukleotidsequenz eines Gens mit unbekannter Funktion bekannt ist, lässt sich in CHO-Zellen oder dergleichen ein rekombinantes Protein des Gens herstellen und verwenden, um Tiere wie beispielsweise Mäuse zu immunisieren, um einen Antikörper gegen das Protein herzustellen. Ein solches rekombinantes Protein und ein solcher Antikörper können in Kombination verwendet werden, um die Genfunktion zu analysieren. Es ist außerdem möglich, die Nukleotidsequenz eines Gens mithilfe eines Rechners vorherzusagen und sie zu verwenden, um ein transgenes Tier herzustellen, was dann zur Analyse der Genfunktion verwendet wird. Kürzlich hat eine Reihe von Sättigungs-Mutagenese-Verfahren die Herstellung einer Bibliothek mutanter Mäuse ermöglicht, mit denen beispielsweise ein Gen (Mutation), das in ursächlichem Zusammenhang mit einer relevanten Krank heit steht, bei Mäusen, die diese Krankheit haben, identifiziert werden kann. All diese Verfahren erfordern jedoch viel Zeit und Mühe zur Proteinreinigung, Herstellung von Antikörpern oder Tieren, etc. Es ist zwar möglich, ein auf zeltspezifische Weise exprimiertes Gen zu identifizieren, indem ein DNA-Chip oder dergleichen verwendet wird, aber durch alleinige Berufung auf das Expressionsprofil ist es schwierig, das Gen als Ziel für die Wirkstoffentwicklung oder Funktionsanalyse einzuengen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders effektiv, wenn (1) kein geeignetes Testsystem in vitro, sondern nur in vivo, verfügbar ist, oder (2) die Zellen oder Gewebe, welche die aktive Substanz produzieren, eingeschränkt sind, oder wenn die Möglichkeit besteht, dass die Aktivität während der Passage verloren geht. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung, das funktionelle Gen schneller zu isolieren als mit konventionellen Verfahren, da die Schritte für die Proteinreinigung oder Herstellung von Tieren, etc. wegfallen. Es ist möglich, Antikörper gegen viele Antigene auf einmal zu erhalten, indem das Verfahren der vorliegenden Erfindung wiederholt wird. Es ist daher beispielsweise möglich, eine Bibliothek von Antikörpern gegen einen Tumor zu konstruieren, indem wiederholt ein Pool von Genen, die in Tumorzellen exprimiert werden, eingeführt wird, Somit ist es auch möglich, aus der Bibliothek einen gegen die Tumorzellen effektiven Antikörper auszuwählen und ein Antigen zu identifizieren, an das der Antikörper bindet.

Claims

Ein Verfahren zum Identifizieren einer ein physiologisch aktives Polypeptid codierenden DNA, aufweisend die Schritte: (a) Einführen von zumindest zwei Arten von Polypeptide codierende DNAs in ein Nagetier und Expression der DNAs in dem Nagetier, (b) Auffinden einer physiologischen Veränderung bei dem Nagetier, (c) Fraktionieren der bei Schritt (a) verwendeten DNAs wenn eine physiologische Veränderung bei Schritt (b) aufgefunden wird, und Auffinden der physiologischen Veränderung bei dem Nagetier gemäß Schritt (b) für jede fraktionierte DNA, und (d) Identifizieren einer fraktionierten DNA, die die physiologische Änderung bei dem Nagetier bedingt.
Das Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die Schritte aufweist: (e) Wiederholen (i) des Fraktionierens der DNAs, (ii) des Auffindens der physiologischen Veränderung bei dem Nagetier für jede fraktionierte DNA und (iii) des Identifizierens einer fraktionierten DNA, die die physiologische Veränderung bei dem Nagetier bedingt, bis eine DNA identifiziert wird, die die physiologische Veränderung bei dem Nagetier bedingt.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNAs intravenös in das Nagetier injiziert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei die intravenöse Injektion durch die Schwanzvene ausgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest 10 Arten von Polypeptide codierende DNAs bei Schritt (a) in das Nagetier eingeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest 100 Arten von Polypeptide codierende DNAs bei Schritt (a) in das Nagetier eingeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest 1000 Arten von Polypeptide codierende DNAs bei Schritt (a) in das Nagetier eingeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA aus einer Tierzelle, einem Tiergewebe oder einer Zelllinie eines Tieres gewonnen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA aus einer Tumorzelle, einem Tumorgewebe oder einer Zelllinie eines Tumors gewonnen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Gesamtmenge der in das Nagetier auf einmal injizierten DNA 100 μg oder weniger beträgt.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Gesamtmenge der in das Nagetier auf einmal injizierten DNA 10 μg oder weniger beträgt.