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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Erstellung von Molekül-Modellen.
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Ihr Ziel ist ein neues Verfahren,
bei dem eine bestimmte Anzahl von Ausgangsmolekülen verwendet wird, insbesondere,
aber nicht ausschließlich
durch virtuelle kombinatorische Chemie, um Moleküle bereitzustellen, zu identifizieren
und zu beschreiben, die ein gewünschtes
Verhalten, insbesondere auf dem Gebiet der Pharmakologie, zeigen
können.
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Es ist bekannt, dass für die Suche
nach neuen aktiven Molekülen,
insbesondere auf dem Gebiet der Pharmakologie, die Synthese einer
sehr großen
Anzahl von Molekülen
erforderlich ist, die dann in vitro oder in vivo getestet werden
müssen.
Bestenfalls erweist sich nur eine sehr kleine Anzahl dieser Moleküle als aktiv.
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In dem Bemühen, die Suche nach neuen aktiven
Molekülen
zu rationalisieren, ist die Idee entstanden, auf die Erstellung
von Molekül-Modellen
zurückzugreifen,
indem Informatik-Datenbanken eingesetzt werden. Die bisher bekannten
Ergebnisse, die mit derartigen Techniken erzielt wurden, sind nicht
immer zufrieden stellend, was insbesondere auf eine unzureichende
Definition der Parameter und der Aktivitätskriterien zurückzuführen ist.
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Nach dem Stand der Technik ist auch
das Patent WO 97/27559 bekannt, das ein Verfahren zum Selektieren
von Molekülen
durch Messen des Abstands zwischen zwei Deskriptoren und durch Suche
in der virtuellen kombinatorischen Bibliothek beschreibt.
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Es ist auch das Dokument von YASRI
et al., "Rational
Choice of Molecular Dynamics Simulation Parameters through the Use
of the Three-dimensional Autocorrelation Method: Application to
Calmodulin Flexiblity Study",
PROTEIN ENGINEERING, Band 9, Nr. 11, November 1996, S. 959–976, XP002078077,
ENGLAND, GB, bekannt, das den Einsatz von dreidimensionalen Autokorrelationsvektoren
als Deskriptor, die Suche in Konformationsklassen und den Vergleich
dynamischer Molekülsimulationen
offenbart.
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Die vorliegende Erfindung hat das
Ziel, diese Nachteile zumindest teilweise zu beseitigen.
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Dieses Ziel wird gemäß vorliegender
Erfindung erreicht, die ein Verfahren bereitstellt, um Moleküle mit einem
gewünschten
Verhalten bereitzustellen, zu identifizieren und zu beschreiben,
wobei das Verfahren auf der computergestützten Entwicklung und der ebenfalls
computergestützten
Sichtung virtueller kombinatorischer Datenbanken basiert. Bei diesem
Verfahren werden verschiedene topologische, die Form betreffende, chemische,
physikalische usw. Deskriptoren in Kombination mit einer neuen Analyse
der Bahnen der Moleküldynamik
eingesetzt. Der Begriff "Verhalten" bezeichnet eine "Aktivität" im biologischen
oder pharmakologischen Sinn, wenn die Moleküle pharmazeutische Anwendungsbereiche
betreffen, oder eine "Eigenschaft" im physiochemischen
Sinn, wenn die Moleküle
nichtpharmazeutische Anwendungsbereiche, beispielsweise Materialien
wie etwa Polymere, betreffen.
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Genauer gesagt ist das Ziel der vorliegenden
Erfindung ein computergestütztes
Verfahren zum Bereitstellen, Identifizieren und Beschreiben von
Molekülen
mit einem gewünschten
Verhalten, insbesondere auf dem Gebiet der Pharmakologie, wobei
das Verfahren im Wesentlichen die nachstehenden, aufeinander folgenden
Schritte umfasst:
- 1) das Bereitstellen einer
Lernbasis ausgehend von ähnlichen
bekannten Molekülstrukturen,
die einerseits aus aktiven Molekülstrukturen,
die die gewünschte
Aktivität
aufweisen, und andererseits aus bekannten inaktiven Molekülstrukturen
besteht, denen diese Aktivität
fehlt oder die schwache Aktivität
aufweisen, indem entsprechende Deskriptoren eingesetzt werden;
- 2) das von der Lernbasis ausgehende Schaffen einer Reihe von
Molekülstrukturen,
vorzugsweise ähnlicher Molekülstrukturen,
insbesondere durch kombinatorische Explosion;
- 3) das Durchführen
einer Sichtung der so erzeugten Moleküle auf Basis der Anreicherung
in Bezug auf die molekulare Vielfalt, die jedes Molekül gegenüber ausgewählten Deskriptoren
zeigt;
- 4) das Filtern der so beibehaltenen Moleküle mit statischen Filtern,
die für
Beschränkungen
der strukturellen, physiochemischen und molekularen Schwankung repräsentativ
sind, denen die Moleküle
entsprechen müssen,
um aktiv zu sein, und gegebenenfalls das Synthetisieren und Testen
der selektierten Moleküle;
- 5) das Filtern der vielversprechendsten so ausgewählten Moleküle mit einem
dynamischen Filter, der für Beschränkungen
der Konformationsschwankung repräsentativ
ist, denen die Moleküle
entsprechen müssen,
um aktiv zu sein;
- 6) das Synthetisieren und Testen der so selektierten Moleküle;
- 7) wenn das gewünschte
Resultat nicht oder nur teilweise erzielt wird, das Wiederholen
der Schritte 3) bis 6) mit modifizierten Filtern.
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Die Erfindung betrifft auch ein Molekül, von dem
zuvor nicht bekannt war, dass es ein gewünschtes Verhalten aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass es einen Konformationsraum einnimmt,
der mit dem Konformationsraum eines Bezugsmoleküls identisch oder zumindest
sehr ähnlich
ist, wobei vom Bezugsmolekül im
Voraus bekannt ist, dass es das gewünschte Verhalten aufweist.
Der Begriff "sehr ähnlich" versteht sich im Kontext
der Gesamtheit der Konformationsräume, die den getesteten Molekülen entsprechen.
Als "sehr ähnlich" sind beispielsweise
jene 10% der Konformationsräume
zu betrachten, die dem Konformationsraum der Bezugsmoleküle am nächsten sind.
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Wenn sich das Verfahren auf eine
Vielzahl von Bezugsmolekülen
stützt,
werden die Konformationsräume
der Bezugsmoleküle
als "sehr ähnlich" betrachtet.
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Um eine Lernbasis zu schaffen, werden
verschiedene Deskriptoren verwendet, bei denen es sich um quantitative
und/oder semiquantitative Eigenschaften jeglicher Art handeln kann.
Beispielsweise kann, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt ist, ausgehend von der graphischen Darstellung eines Moleküls, mit
anderen Worten von einer zweidimensionalen Darstellung oder einer
2D-Darstellung einer chemischen Verbindung, eine Gesamtheit numerischer
Werte abgeleitet werden, die als "topologische Deskriptoren" bezeichnet werden.
Außerdem
können
Deskriptoren eingesetzt wer den, die bestimmte physiochemische Eigenschaften
widerspiegeln, beispielsweise der lipophile Charakter oder die Lipophilie,
die als logP ausgedrückt wird,
wobei P der Verteilungskoeffizient der betreffenden Verbindung zwischen
Wasser und n-Octanol ist, oder der Molenbruch. Außerdem können numerische
Deskriptoren eingesetzt werden, die Molekülformen darstellen.
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Die Techniken, die nach dem Stand
der Technik für
die quantitativen Struktur-Aktivitäts-Korrelationen (Quantitative Structure
Activity Relationships: QSAR) eingesetzt werden, basieren auf der
Hypothese, dass, wenn ein Molekül
ein bestimmtes biologisches Verhalten aufweist, alle Informationen,
die notwendig sind, um es zu charakterisieren, weitgehend auf seiner
Struktur basieren, d. h. seinen Atomen, seinen Bindungen und seinen
Formen. Im Gegensatz zum herkömmlichen
linearen QSAR-Paradigma, in dem die biologische Aktivität in Form
einer linearen Kombination der vorherrschenden Deskriptoren ausgedrückt werden
kann, setzt die Anmelderin ein Paradigma der bzw. des variablen,
nichtlinearen Informationsdarstellung oder Mapping ein, bei dem
die Aktivität
eine nichtlineare Funktion der strukturellen, topologischen und
molekularen Deskriptoren ist.
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Gemäß vorliegender Erfindung wird
ein Satz von Deskriptoren für
die aktiven Verbindungen im Gegensatz zu den inaktiven Verbindungen
analysiert, was die Definition von Filtern ermöglicht, um die zwei Klassen von
Molekülen
zu differenzieren [G. Grassy et al., J. Mol. Graphics 13, 356 (1995)].
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Wenn die Lernprobe In-vivo-Tests
entspricht, beschreibt die Filtergruppe die Bedingungen für die Aktivität in vivo.
Im Falle von In-vitro-Tests, beschreibt das Zusammenspiel der Filter
die Aktivitästbedingungen in
vitro.
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Ein Filter ist durch die Variationsbandbreite
eines bestimmten Deskriptors für
alle bekannten aktiven Verbindungen definiert, wenn man sie mit
der Variationsbandbreite des gleichen Deskriptors für alle bekannten inaktiven
Verbindungen vergleicht.
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Wenn die "aktive" Bandbreite die "inaktive" Bandbreite vollständig abdeckt, ist der Filter
nutzlos, was bedeutet, dass die Variation dieses speziellen Deskriptors
in keiner Beziehung zur biologischen Aktivität steht.
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Wenn die "aktive" Bandbreite die "inaktive" Bandbreite nicht vollständig abdeckt,
besteht für
jedes Molekül,
das für
diesen Deskriptor einen Wert aufweist, der in einen Bereich der "aktiven" Bandbreite fällt, der
den "inaktiven" Bereich nicht abdeckt,
hohe Wahrscheinlichkeit, ebenfalls aktiv zu sein.
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Die Vorhersagefähigkeiten dieses Ansatztyps
werden durch den Einsatz mehrerer Filter, vorzugsweise 10 bis 30,
verbessert, die jeweils eine andere Art darstellen, die strukturellen
und physiochemischen Eigenschaften eines Moleküls zu quantifizieren.
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Diese Filter können, sobald sie festgelegt
sind, eingesetzt werden, um die virtuellen Verbindungen zu sichten,
die während
einer kombinatorischen Explosion erzeugt werden, d. h. alle Verbindungen,
die beispielsweise erhalten werden, indem eine Liste von Substituenten
auf vorbestimmte Teile eines als Synthon bezeichneten strukturellen
Kerns aufgesetzt werden. Die vielversprechendsten Verbindungen,
nämlich
jene, die allen von den Filtern definierten Einschränkungen
entsprechen, werden dann durch chemische Synthese oder Genmanipulation
oder auf beliebige andere Weise synthetisiert und in biologischen
Versuchen getestet.
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Die inaktiven Moleküle, die
als aktiv vorhergesagt worden waren, enthalten unerforschte Eigenschaften,
die für
die Aktivität
bestimmend sind. Derartige Eigenschaften werden für die Definition
zusätzlicher
Filter eingesetzt, und nach mehreren Wiederholungen kann der virtuelle
Sichtungsvorgang für
die exakte Identifizierung von Verbindungen eingesetzt werden, die
die gewünschten
Eigenschaften aufweisen.
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In der Praxis wird ausgehend von
Ausgangsstrukturen, deren Aktivität in vitro und/oder in vivo
gemessen werden kann, eine "Lernbasis" geschaffen, indem
die unterschiedli chen physiochemischen, strukturellen und molekularen
Parameter bestimmt werden, die es ermöglichen, aktive Moleküle und inaktive
Moleküle
zu beschreiben.
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Diese Parameter werden in Form von
Variationsbandbreiten oder "Beschränkungen" in Abhängigkeit von
den Aktivitätsklassen
dargestellt. Eine Gruppe oder ein Satz von Beschränkungen
definiert einen Filter.
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Die Qualität der gewählten Deskriptoren wird in
Bezug auf die Variabilität
sowie die Wahl der einzusetzenden Deskriptoren und die Interkorrelation
zwischen den beibehaltenen Deskriptoren kontrolliert.
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Das kann erfolgen, indem eine von
Lahana entwickelte Software, die Software ANODA (ANalysis Of DAta)
eingesetzt wird, die mit einer chemischen Datenbank eine in Bezug
auf Basisdeskriptoren und Analyse der Hauptbestandteile einfache "Visitenkarte" assoziiert. Es werden
verschiedene Techniken zur Selektion der Deskriptoren, wie z. B.
Variabilitäts-,
Interkorrelations-, Repräsentativitätsanalysen
(Regressionen, Neuronennetzwerke, genetische Algorithmen), eingesetzt.
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Eine kombinatorische Explosion wird
ausgehend von der Lernbasis erzeugt, wobei die für jede variable Position nützlichen
Variationsbedingungen berücksichtigt
werden. Zu diesem Zweck können
Datenbanken von Substituenten eingesetzt werden, die durch ihre
Struktur und die sich daraus ergebenden Deskriptoren definiert sind.
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Die kombinatorische Explosion kann
geschaffen werden, indem die LEGION-Software der Firma TRIPOS oder
eine andere von R. Lahana entwickelte Software, die COMBEX-Software, eingesetzt
wird, die eine derartige Explosion ausgehend von einem Verteiler
("Scaffold") oder einer Konsenssequenz
und einer Liste von Beschränkungen
für jeden
der Substitutionspunkte erzeugt. Eine Befehlssprache vom SQL-Typ
(Standard Query Language) ermöglicht
es, alle Arten von Selektionsbedingungen der Substituenten beliebig
zu kombinieren.
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Für
jede erzeugte Kombination ist es möglich, die Anreicherung in
Bezug auf die molekulare Vielfalt zu verifizieren, die das geschaffene
Molekül
gegenüber
ausgewählten
Deskriptoren zeigt. Wenn diese Anreicherung ausreicht, wird das
Molekül
beibehalten, wenn nicht, wird es ausgeschieden.
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Die Anreicherung in Bezug auf die
molekulare Vielfalt kann auch mithilfe einer von R. Lahana entwickelten
Software, der DIVERSER-Software, verifiziert werden, die es ermöglicht,
eine quantitative Bewertung der molekularen Vielfalt durchzuführen, die
eine beliebige chemische Datenbank aufweist, auch wenn die Moleküle, aus
denen sie besteht, hochflexibel sind und wenn diese chemische Datenbank
rein virtuell ist. Diese Software ermöglicht es, Datenbanken in Bezug
auf die Vielfalt zu vergleichen, Vielfalts"Löcher" in einer Datenbank
zu charakterisieren und rational Minimal-Datenbanken mit einer maximalen
Vielfalt zu entwickeln. Die Auswahltechniken können beispielsweise die hierarchische
Klassifizierung (Clusters), Unterteilungen, gleichförmige Konstruktion
(Uniform Design), Zufallsstichproben usw. sein.
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Die "statischen" Filter, d. h. jene, die nicht von der
Konformationsvariabilität
der Moleküle
abhängen, beschrieben
die Intervalle der strukturellen, physiochemischen, molekularen
Werte, denen die Moleküle
entsprechen müssen,
um aktiv zu sein. Durch den Einsatz dieser statischen Filter werden
die Moleküle
abgeleitet, bei denen die größte Chance
besteht, dass sie aktiv sind. Diese Moleküle werden gegebenenfalls synthetisiert und
bezüglich
der gewünschten
Aktivität
getestet.
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In diesem Schritt kann eine von G.
Grassy entwickelte Software eingesetzt werden, die VARIMAP-Software,
die statische Filter ausgehend von Deskriptoren ermittelt, die durch
TSAR erhalten werden, eine Software, die von der Oxford Molecular
Group, Oxford (Großbritannien)
auf den Markt gebracht wurde und die ursprünglich von G. Grassy und R.
Lahana entwickelt wurde.
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Die vielversprechendsten Kandidaten,
die mithilfe der statischen Filter ausgewählt wurden, werden dann mit
einem dynamischen Filter gefiltert, d. h. einem, der für Beschränkungen
der Konformationsvariation repräsentativ
ist, denen die erzeugten Moleküle
entsprechen müssen,
damit die Chance besteht, dass sie aktiv sind, indem sie mit jenen
der Lernbasis verglichen werden.
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Dieses dynamische Filtern kann mithilfe
einer neuen von G. Grassy entwickelten Software erfolgen, der MULTIDYN-Software,
die es ausgehend von Bahnen der Moleküldynamik ermöglicht,
die Konformationsräume
beliebiger Moleküle
zu charakterisieren. So werden die bioaktiven Konformationen der
fraglichen Moleküle
aufgezeigt.
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Die beibehaltenen Moleküle werden
dann synthetisiert und getestet.
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Wenn die festgestellte biologische
Aktivität
nicht oder nur teilweise den erwarteten Kriterien entspricht, werden
die Schritte des Verifizierens der Anreicherung in Bezug auf die
molekulare Vielfalt, das statische Filtern, das dynamische Filtern,
die Synthese und das Testen wiederholt.
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Wenn festgestellt wird, dass die
Moleküle
den festgelegten biologischen Kriterien entsprechen, ist das Ziel
erreicht.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es
somit, neue aktive Moleküle
durch ein vollkommen rationales Verfahren zu definieren, bei dem
zu keiner Zeit eine Hypothese bezüglich ihres möglichen
Wirkmechanismus oder ihres möglichen
Rezeptors eingesetzt wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wurde erfolgreich
im Bereich der Pharmakomodulation von Molekülen eingesetzt, um die Leistungsfähigkeit
dieser Moleküle
in vitro und insbesondere in vivo zu verbessern.
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Das nachstehende detaillierte Ausführungsbeispiel
dient dazu, die Erfindung zu veranschaulichen und besser zu erklären.
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BEISPIEL
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Das Erhalten neuer Immunmodulator-Verbindungen
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Vor Kurzem wurde gezeigt, dass das
Peptid 2702.75–84
(ein Peptid, abgeleitet von HLA-B2702,
Aminosäuren
75 bis 84) bei Mäusen
das Überleben
nach einer Herz-Allotransplantation verlängert (Transplantation 59,
455 (1995)).
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Die Verabreichung von Peptid 2702.75–84 in einer
Menge von 85 mg/kg/Tag über
10 Tage nach der Transplantation von Herzen B6 bei Empfängern CBA
verlängert
das Überleben
mit dem Herz-Allotransplantat bis auf 11,4 ± 2,6 (n = 8) Tage im Vergleich
zu 8,2 ± 1,2
Tage bei nicht behandelten Kontrolltieren (p < 0,01). Nach einer Therapie mit dem
Peptid 2702.75–84
in geringeren Dosen wurde keine Auswirkung auf das Überleben
der Transplantation beobachtet.
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Die Aktivität in vivo von verschiedenen
Peptiden (n = 19), die von Peptid 2702.75–84 und anderen MHC/HLA-Sequenzen
stammten, wurde auf ähnliche
Weise bewertet. Die getesteten Peptide umfassten Peptide aus Aminosäuren des
D- und L-Typs. Bestimmte Peptide unterschieden sich vom Peptid 2702.75–84 an bis
zu sechs Aminosäurepositionen,
andere hatten eine inverse Sequenz.
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Alle diese Peptide, deren Sequenzen
in der nachstehenden Tabelle I angeführt wird, wurden unter Einsatz
der F-moc/Bu-Chemie synthetisiert und dann getestet.
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Die Studien über das Ansprechen auf die
Dosen bei Mäusen,
die eine Herz-Allotransplantation erhalten hatten, wurden durchgeführt, indem
Peptide in Acetat-Form einge setzt wurden, die durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) zu mehr als 90% rein waren.
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Die heterotrope Abdominalherztransplantation
wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt; J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 7, 225 (1969).
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CBA-Mäuse, die Herzen C57B1/6 erhielten,
wurden nach der Organtransplantation täglich mit unterschiedlichen
Peptiddosen behandelt. Die Peptide wurden vor der intraperitonealen
Verabreichung in DMSO gelöst
und in PBS verdünnt
(DMSO-Endkonzentration 10%). Die Tiere wurden beginnend mit dem
Tag der Transplantation bis zum 9. Tag behandelt. Das Überleben
der Transplantation wurde täglich
durch direktes Abtasten überwacht,
und eine Abstoßung
wurde als Ende der ertastbaren Herzkontraktionen definiert. Die
statistische Signifikanz der Verlängerung des Überlebens
der Herz-Allotransplantation wurde unter Einsatz des Mann-Whitney-Tests
berechnet.
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Die Therapie der Empfänger der
Allotransplantat-Mäuseherzen
mit bestimmten dieser Peptide (n = 9; in der nachstehenden Tabelle
I fett gedruckt) ermöglichte
eine beträchtliche
Verlängerung
des Überlebens
der Transplantation, während
die anderen keine signifikante Wirkung zeigten.
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Die Strukturen der eingesetzten Peptide
und die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
I angeführt.
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Ein Satz von 19 Peptiden wurde als
Lernbasis eingesetzt, um die rationale Konzeptionsstrategie zu definieren.
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Obwohl dieser Ausgangssatz sehr klein
ist, war es damit möglich,
wie die anfängliche
Unterscheidung zwischen den aktiven Verbindungen und den inaktiven
Verbindungen zeigt, die Beschränkungen
wirksam zu definieren.
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Zunächst wurden 27 unabhängige Deskriptoren
der Konformation für
jedes Peptid berechnet (siehe nachstehende Tabelle II).
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Die physiochemischen und topologischen
Deskriptoren wurden mit der Software TSAR V2.31 (Oxford Molecular
Group, Oxford, Großbritannien),
erzeugt.
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Diese 27 Deskriptoren umfassten das
dipolare Moment, berechnet auf Basis einer vollständig entwickelten
Konformation eines jeden Peptids. Die statistische Analyse zeigte,
dass 14 Deskriptoren in Korrelation zueinander standen. Folglich
waren sie für
die Definition von Beschränkungen,
die zwischen den aktiven Peptiden und den inaktiven differenzierten,
nicht nützlich.
Die 13 anderen Deskriptoren, die von der Konformation unabhängig waren,
wurden verwendet, um ein statisches Filter für die Sichtung einer virtuellen
kombinatorischen Bibliothek zu konstruieren, wie weiter oben beschrieben.
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TABELLE
II
Die 27 eingesetzten topologischen und physiochemischen Deskriptoren
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Die oben angeführten topologischen Deskriptoren
wurden eingesetzt, um die statischen Filter zu berechnen. 13 Deskriptoren
(nicht kursiv gedruckt) lieferten Informationen über die Eigenschaften von Peptiden mit
immunmodulierender Aktivität
und wurden eingesetzt, um Beschränkungen
zur Sichtung einer virtuellen kombinatorischen Bibliothek zu sichten.
Die 14 anderen Deskriptoren erwiesen sich als miteinander in Korrelation
stehend und wurden von der Analyse ausgeschlossen.
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Unter Einsatz des Programms COMBEX
(Synt:em, Nimes, Frankreich) wurde eine kombinatorische Explosion
auf Basis einer Konsenssequenz RXXXRXXXXY geschaffen, die vom Lernsatz
abgeleitet wurde, nachdem alle aktiven und inaktiven Sequenzen ausgerichtet
worden waren. Diese Sequenz ließ 7
Positionen, die durch "X" bezeichneten Positionen,
um Mutation vorzunehmen, um die Bibliothek zu schaffen.
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Alle Moleküle wurden unter Einsatz der
Konvention SMILES geschaffen, dann in eine 3D-Struktur umgerechnet,
indem die CORINA-Software (Oxford Molecular Group, Oxford, Großbritannien)
verwendet wurde.
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Zunächst waren sowohl natürliche als
auch nicht natürliche
Aminosäuren
in der Datenbank der Substituenten enthalten. Alle Aminosäuren wurden
in Bezug auf ihre physiochemischen Eigenschaften (Lipophilie, Basizität, Aromatizität usw.)
und auch durch topologische Deskriptoren (Kier-Analyse, Balaban-Index
usw.) beschrieben. Unter Einsatz von 35 Aminosäuren ergab das 357 Kombinationen,
das sind 64 Milliarden Verbindungen, was immer noch zuviel für die Kapazität des verwendeten
Computers war.
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Um diese Anzahl zu verringern, wurden
gewisse ergänzende
Daten, wie die Verteilung der Lipophilie, berücksichtigt. Tatsächlich wies
die Struktur der "Leit"-Verbindung (2702.75–84) zwei
lipophile Domänen
auf, die durch hydrophile Reste getrennt waren. Das wies darauf
hin, dass eine derartige Verteilung für die Aktivität wichtig
ist. Um diese Verteilung zu berücksichtigen,
hat die Anmelderin beschlossen, für jede der 7 Positionen die
folgende Liste von Aminosäuren
zu verwenden: V, I, T, W, L, nL, (nL = Nor leucin) zu verwenden.
So wurde die Anzahl der Verbindungen der Bibliothek auf 67 Kombinationen
verringert, das sind 279.936 Verbindungen.
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Um die virtuelle kombinatorische
Bibliothek zu sichten, wurde "im
Vorbeigehen" für jede von
der COMBEX-Software geschaffene Struktur der entsprechende Satz
von Eigenschaften berechnet. Diese Eigenschaften wurden analysiert,
indem die vordefinierten statischen Filter und dynamischen Filter
eingesetzt wurden, die auf den Beschränkungen basierten, und es wurden
nur die Verbindungen beibehalten, die allen Beschränkungen
entsprachen.
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Die durch die Variationsbandbreiten
der beibehaltenen Deskriptoren erhaltenen statischen Filter basierten
auf dem Satz der unabhängigen
Beschränkungen
der Konformation, die definiert wurde, indem der Lernsatz der aktiven
und inaktiven Verbindungen verwendet wurde. Sie wurden unter Einsatz
der VARIMAP-Software (Synt:em, Nimes, Frankreich) entwickelt.
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Durch Sichtung der Bibliothek aus
279.936 Verbindungen mit statischen Filtern wurden 26 Peptide identifiziert,
die allen Beschränkungen
entsprachen. Von diesen wurden die Peptide vom Standpunkt ihrer Konformationsräume (dynamisches
Filter) untersucht, und insbesondere 5 mit der Bezeichnung RDP1257, RDP1258,
RDP1259, RDP1271 bzw. RDP1277 wurden untersucht.
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Die flexible Beschaffenheit der Peptide
wurde analysiert, indem Simulationen der Moleküldynamik (MD) eingesetzt wurden.
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Die MD-Simulationen der solvatisierten
Peptide unter periodischen Bedingungen wurden unter Einsatz der
Software AMBER 4.1 (Oxford Molecular Group, Oxford, Großbritannien)
durchgeführt.
Sie benötigte
einen Zeitraum von 1.015 ps für
jedes solvatisierte Peptid. Die Dielektrizitätskonstante wurde an der Einheit
reguliert. Die Temperatur des Systems wurde zunächst in einem Zeitraum von
15 ps allmählich
von 10 auf 300 K ge bracht. Während
der Simulation wurde eine konstante Temperatur von 300 ± 10 K
beibehalten, indem an ein äußeres Bad
mit einer Entspannungszeit von 0,1 ps gekoppelt wurde. Der gewählte "Zeitschritt" betrug 1 fs. Die
Berechnungszeit betrug etwa 0,5 h pro ps. Es wurde ein "auf den Resten basierender" Cutoff von 10 Å für alle nicht
verbundenen Wechselwirkungen verwendet. Die Liste der nicht verbundenen
Paare wurde alle 10 fs aktualisiert, und die Koordinaten wurden
jede ps im Verlauf der Bahnen aufgenommen, was eine Gruppe von 1.015
Konformationen für
jede Bahn ergab. Auf allen Bahnen wurde den Atomen keine Beschränkung auferlegt,
und im Energieausdruck wurde kein "parasitärer Ausdruck" verwendet.
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Jede Konformation wurde durch einen
Form-Deskriptor dargestellt, der in der Folge als 3D-Autokorrelationsvektor "3D-ACV" bezeichnet wird
[Eur. J. Med. Chem. – Chim.
Theor. 19, 61 (1984)]. Ein 3D-ACV-Satz wurde für jede Reihe von aus der Moleküldynamik
(MD) erhaltenen Konformationen berechnet, der dann unter Einsatz
von multivariablen Statistiken behandelt wurde [Trends in QSAR and
Molecular modelling 92 ES-COM Publishers,
S. 216 (1993)]. Das erfolgte in drei Hauptschritten (i bis iii):
- (i) Für
eine bestimmte Konformation des untersuchten Moleküls, hier
eines Peptids, wird der entsprechende 3D-ACV-Deskriptor wie folgt
berechnet. Die Entfernungen zwischen allen Atompaaren wurden berechnet. Die
Verteilung dieser Entfernungen war ein Vektor, dessen jeweiliger "Topf" ("Bin") die Summe der Atompaare
in einem spezifischen Bereich interatomarer Abstände ist;, d. h. wo zwei bestimmte
Atome eine Entfernung zu einander aufwiesen, die zwischen (r-1)
und r Å liegt.
In der vorliegenden Arbeit ist der Schritt gleich 1 Å. Offensichtlich
führt eine
geringfügige
Modifikation der Konformation des genannten Moleküls zu einer
Veränderung
der Verteilung der Entfernungen zwischen den Atomen, somit zu einer
Modifikation von 3D-ACV. Folglich ist dieser Deskriptor einer der
wirkungsvollsten, um die konformationellen Formen der Moleküle darzustellen.
- (ii) Eine MD-Bahn ist die Gesamtheit der Konformationen, die
ein bestimmtes Molekül
während
der MD-Simulation annimmt. Für
jede Konformation wurde das entsprechende 3D-ACV- "im Vorbeigehen" berechnet und gespeichert.
Dieses 3D-ACV-Vielfache in Abhängigkeit
von der Zeit ist ein Deskriptor des dynamischen Verhaltens des genannten
Moleküls.
- (iii) Für
den Vergleich der 3D-ACV-Vielfachen, die die Bahnen des Satzes analysierter
Moleküle
darstellen, wurde eine Analyse der Hauptbestandteile (PCA) mit jedem
dieser 3D-ACV-Vielfachen vorgenommen. Diese Transformation verringerte
das Ausmaß des
Datensatzes auf eine geringere Zahl (im vorliegenden Fall einen
2D-Raum) und ermöglichte
es auch, alle Bahnen aller Moleküle
auf eine Ebene zu projizieren. In diesem verkleinerten Raum ist
jedes Molekül
durch einen Satz von Punkten dargestellt, d. h. seine Konformationen
während
der gesamten Dauer der MD-Simulation, was seinen Konformationsraum
darstellt. Die Moleküle
konnten dann miteinander in Bezug auf Konformationsräume verglichen
werden. Die Analysen der Bahnen und der Konformationsräume wurden
mithilfe der MULTIDYN-Software (Synt:em, Nimes, Frankreich) berechnet.
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Durch den Einsatz eines dynamischen
Filters zur Sichtung der Peptide in Bezug auf die Konformationsräume schien
es, dass 4 dieser 5 Peptide den gleichen Konformationsraum oder
einen sehr ähnlichen Raum
einnahmen, aber eines, nämlich
RDP1277, in dieser Hinsicht verschieden war.
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Diese 5 Peptide wurden synthetisiert
und in biologischen Tests des Überlebens
bei Herz-Allotransplantation getestet.
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Bei einer Dosis von 10 mg/kg/Tag
waren alle diese Peptid mit Ausnahme von RDP1277 in vivo aktiv. Nach
der Therapie mit RDP1277 (MST = 9,0 1,49 wurde keine signifikante
Verlängerung
des Überlebens
der Transplantation beobachtet. Hingegen ermöglichte die Therapie mit allen
anderen Peptiden eine signifikante Verlängerung des Überlebens
der Transplantation, die 11 bis 13 Tage betrug.
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Ergänzende Tests mit Peptid RDP1258
in Dosen von 1 bis 10 mg/kg/Tag zeigten eine gesteigerte Wirksamkeit
der Therapie bei geringeren Dosen. Bei einer Dosis von 1 mg/ kg/Tag überlebten
30% der Mäuse,
die eine Herz-Allotransplantation erhalten hatten und mit RDP1258
behandelt worden waren, für
mehr als 100 Tage, während
das Bezugspeptid, 2705.75–84,
das Überleben
der Herz-Allotransplantation nach einer Therapie im Ausmaß von 80
mg/kg/Tag verlängerte,
während
bei geringeren Dosen keinerlei Wirkung beobachtet wurde. Außerdem wurde
durch eine Therapie, bei der dieses Bezugspeptid eingesetzt wurde,
kein langfristiges Überleben
der Transplantation bewirkt.
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Die erfindungsgemäße Strategie hat es daher ermöglicht,
auf rationale Weise mehrere bioaktive Verbindungen zu ermitteln,
deren Aktivität
sich als jener der aktiven Moleküle
der Lernbasis überlegen
zeigte.
