JPH04502700A - 新規な結合タンパク質の生成と選択 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 新規な結合タンパク質の生成と適訳 発明の背景 ［発明の分野］ この発明は突然変異誘発、発現、クロマトグラフィー的な選択、そして増幅とい った工程をくり返すことによる新規な結合タンパク質の開発に関するものである 。

［従来の技術］ タンパク質のアミノ酸配列はその三次元（３Ｄ）構造を決定する。このことはま たタンパク質の機能を決定する（　ＥＰＳＴ６３゜ＡＮＦＩ７３）　、　５ｃｂ ｕｌｚとＳｃｈｉｒｍｅｒ　（ＳＣＨＵ７９．　ｃｈ　５）のタンパク質の分頭 系をここで取り入れる。

タンパク質の三次元構造は本質的にはある遺伝子座でアミノ酸が同一であるとい うことには影響を受けない。他の遺伝子座においてはただ１つのタイプ、あるい は２．３のタイプのアミノ厳しか許されないこともあるＣ３ＨＯＲ８Ｓ、　ＥＩ ＳＥ８Ｓ、　ＲＥＩＤ８８）。一般的に、多くの変ったタイプをもつ遺伝子座は 溶媒の方へ向かっているアミノ酸側鎖基を持つ。しかし、側鎖基がタンパク質の 他の方向へ向かっている一定の変型も存在する（ＳＣＨＵ７９．Ｐ１６９〜１７ １；　ＣＲＥＩ８４．　Ｐ２３９−２４５．３１４〜３１５）タンパク質の２次 元構造（ヘリックス、シート、ターン、ループ）は大部分局所の配列により決定 される。ある特定のアミノ酸はある特定の２次元構造に関連する傾向にあり、一 般に用いられるＣｈｏｕ−ｆａｓｍａｎ　（ＣＦＩＯＵ７４．　ＣＨＯＵ７８ａ 、　ＣＨＯＵ７８ｂ）の規則はこれらの関連性に依存するものである。しかしな がら、全てのアミノ酸のタイプがヘリックス中および品行あるいは逆平行シート 田に観察される。同一配列のペンタペプチドが様々なタンパク質中にみられるが 、場合によってペンタペプチドの立体配座は非常に異なる［ＫＡＢＳ８４．　Ａ Ｒｃｏｓ７Ｆ。

ターンとループは他の２次元構造（ヘリックスやシート）よりも容易に挿入、消 去を許す（ＲＩＣＨ８１，丁ＨＯＲ８８，，５ＵＴＣ８７ａ）、ということはよ く似たタンパク質は大抵においループとターンが異なることになる。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｅから得られるズブチリ シンの３つの残基を、Ｂ、１ｉｃｈｅｎｉｆ口ｒｍｉｓから得られるズブチリシ ンの相当する残基と同じになるように変えると、そのアミノ酸配列中残り８２は 差異をそのまま残したままであるが後者の微生物からのズブチリシンとほとんど 同じ活性を有するグロテアーゼになった。それらは活性部位が７人内の相異しか なかったので、この変化した３つの残基が選ｉｆれた［ＷＥＬＬ８７ａ］。

５ｃｈｕｌｚとＳｃｈｉｒｍｅｒはタンパク質の他の分子との結合についての多 くの観察をまとめた（ＳＣＨＵ７９．　Ｐ９８〜１０５）。例えば、ヘモグロビ ンのアルファ鎖はヘモグロビンのベーター鎖に強く結合しくデルタＧは−１１− ＯＫｃａｌ／ｍｏｌｅよりもよりマイナス）、抗体は抗原に強く結合しくＫ、が ｌＯ−′から１０−＋４の範囲で、解離定数Ｋ。

は（Ｃ［Ｂ］　／　ＣＡ　：ｌに等しい）、塩基性ウシ膿厘トリプシンインヒビ タ（ＢＰＴ　Ｉ　）はトリプシンと強く結合し’Ｃｘａ＝６．Ｏｘ　１０−”Ｍ 　（ＴＳＣＨ８７）　、デルタＧ−１８，０Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）、アビジンは ビオチンと結合下る（Ｋａ−１−３ｘ　１０−口Ｍ（ＣＲＥ１８４．Ｐ２Ｓ５） 　）。これらいずれの場合も結合ｌ；、接触する表面の相補性に起因下る。即ち 突起Ｅｂｕｍｐｓ’。

は穴：ｈｏｌｅｓＦにフィツトし、異符号の電荷がくっつき、双極子で整列し、 疎水性原子は他の′Ｒ水性原子と接触するという＾合に。バルクな不は際外され るけれども、個々の不分子がしばしば分子間の境界の充填空間にみられる。これ らの水は通常タンパク質の１つかそれ以上の原子や他の結合木と水素結合する。

タンパク質結合に影響を及ぼすファクターはわかっている（ＣＦｉＯ丁７５．　 ＣＨＯＴ７６、５ＩＪＵ７９．　Ｐ９８−１０７．　ＣＲＥｉ８４．　Ｃｈ８） が、新しし１相補性表面をデザインすることは困難である。側鎖基を置換するい くつかの法則が開発されている（ＳＵＴＣ８７ｂ）がタンパク質の側鎖基は柔軟 なので、新しい側鎖基がどのような立体構造をしているか予想することは困難で ある。さらにタンパク質を他の分子に結合させる力は全て比較的弱いので、これ らの力の効果を予想することも困難である。それ故、理論のみに根ざしてすぐれ た結合タンパク質をデザインすることも困難である（Ｑ［＋１０８７）。

しかしながら、酵素・基質親和性はタンパク質工学により幸運にも増加させられ てさた（ＷＩＬＫ８４Ｅｏ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌｕｓのチロシントランスファーＲＮＡシンセターゼの点突然変異体はＡＴＰ に対する親和性が１００倍増加したことが示されている。

遺伝子座表面に８いて１個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、タ ンパク質の三次元構造に影響を及ぼすことなく、基質結合の他にタンパク質の結 合能力を著しく変えていること！こなろう。例えば、謙状赤血球ＭＥ胞のヘモグ ロビンにおいて、表面残基Ｅ６をベーター鎖！＝おいてＶに変えるとデオキシヘ モグロビン−５となり、自己結合してｍｊ！を形成Ｔる（ＤＩＣＫ８３、　Ｐｉ ２Ｓ〜１４５）　ａその時、ヘモグロビンの３次あるいは４次元構造は変化しな いＣＰＡＤＬ８５．　ＨＩＳＨ７５，ＷＩＳＨ７６）。

ＢＰＴ　Ｉの１個のアミノ酸を変えるとそのトリプシンへの結合能力を大きく弱 めるが、新しい分子のいくつかはもとの性質を維持し、キモトリプシンと結合し 、阻害する。一方他のものはエラスターゼに結合するという新しい性質を示す（ ＴＡＮＫ７７、　ＴＳＣＦＩ８７）、ラムダＣｒｏ受容体の表面の１個のアミノ 酸を変えると天然のオペレーター遺伝子Ｏｒ３に対する親和性が著しく減じるが 、突然変異オペレーター遺伝子に対する突然変異タンパク質の結合を著しく増大 せしめる（ｔｌｓＥ８５）。それ故結合タンパク質の表面を変えることは、結合 能力をなくすることなくその特異性を変えることになる。

最近開発されてきたいわゆる“逆方向の遺伝学“技術は、適性塩基性遺伝子座対 に１個の特定の突然変異を産生ずるのに使用されている（ＯＬＩＰＢ６．０ＬＩ Ｐ８７；　ＡＵＳＵ８７）。突然変異は一般にアミノ酸の配列から、また、ある 場合には野性型機能が失われていることにより探知される。これらの操作は研究 者をしてタンパク質の各残基の機能（ＭＩＬＬ８８）あるいは規範的ＤＮＡ配列 における各塩基対の機能を分析させることとなる［ＣＨＥＮ８８］。これらの分 析で、単一のオールタレーシミンを持つ突然変異体を得；うとする百典釣な目的 に達しようと努力することになった（ＡＵＳＵ８７）。

逆方向の遺伝学はしばしば、どの残基がタンパク質の構造や機能に最も重要なの か決定するため、＝−ドできる域に適用される。即ち単一の突然変異体をタンパ ク質の各残基で単離することＣ；どの残基が重要な役割をしているかという最初 の評価を与えることになる。

本発明の方法以前に、逆遺伝学を用いて新規な突然変異体を生成するため、２つ の一般的方法が開発されてき。１つは、いわゆる“タンパク質手術“　（ＤＩＬ Ｌ８７）と呼ばれ、特定の置換の構造や機能にたいする効果を決定するため、１ つのタンパク質残基に特定の置換をほどこすことである（ＣＲＡＩ８５）　（Ｒ ＡＯ５８７）（ＢＡＳａ８７）　、　Ｌかしながら、多くの望ましいタンパク質 オールタレーシ２ンが多数のアミノ酸置換を必要とし、それ故１つの塩基の変換 をしても、あるいは任意の１つの残基に全ての可能なアミノ酸の置換をしてさえ 、アクセッシブルではない。

他の方法は、突然変異性化学物質や放射線を用い、クローン化した遺伝子内の多 くの遺伝子座で色々な突然変異体をランムダに生成するものである。この変化の 特異な位置や性質はＤＮＡ配列で決定する（ＰＡＫＵ８６）。この方法は検査さ れるべきコロニーの数において限界がある。また、この方法はタンパク質の構造 や結合能に対するその関係についての知識を利用するものでもない。

アミノａ　（ＵＬＭＥ８３）の置換を支配する法則に向かっての発展は、上記方 法のいずれかを使用し、また検査することができるコロニーの数の実際的な限界 を用いることに多大な努力が払われたため大きく遅れてきた（ＲＯＢＥ８６）。

合成りＮＡに関しての“飽和性突然変異”という用語は一般に、ａ）ＤＮＡ制限 領域の遺伝子の７ラグメント内に各々可能な１個の塩基変化が現れていること、 ｂ）大抵の突然変異体遺伝子がただ１つの突然変異を有していること、という集 団の生成を意味するのに用いられている。それ故ＤＮＡの６個の塩基対の長さの ための全ての可能な１つの突然変異のセットは１８個の突然変異体の集団となる 。　０１ｉｐｈａｎｔら（ＯＬＩＰ８６）や０１ｉｐｈａｎｔと５ｔｒｕｈｌ（ ＯＬＩＰ８７）は高度に退化したオリゴヌクレオチドの連結反応やクローニング について述べ、飽和性突然変異をプロモータ配列や機能の研究に適用している。

彼らは同様な方法がタンパク質の遺伝子的発現の研究に用いることができようと 示唆しているが、ａ）変化させるタンパク質残基を選択すること、または、ｂ） 望ましい性質をもつ突然変異体を選択し、あるいにスクリーニングすることを如 何にするか行うかについては述べていない。

Ｒｅ１ｄｈａａｒ−０１ｓｏｎと５ａｕｅｒ（ＲＥＩＤ８８）はラムダバクテリ オファージからのｃｌリプレッザの二量体堺面で全て２０個のアミノ酸を介して ２個あるいは３個の残基を同時に変えるために、合成退化万すゴｎｔｓ（ヌクレ オチドのこと、以下同じ）を用いた。しかし彼らはいくつの残基が一遍に変えら れるかの限界につき述べていないし、ＤＮＡをフードする異なるアミノ酸の存在 率が異なる点については言及していない。彼らは野性型の二量化（ｄｉｍｅｒｉ ｚａｔｉｏｎ：するか二量化しないか、どちらかの性質をもつタンパク質を探し たが、新規な結合特性をもつタンパク質を見つけていないし、報告もしていない 。何人かの研究者が新たにタンパク質をデザインし合成した。これらデザインさ れたタンパク質は／＋１さく、大抵は遺伝子的というよりは試験管内でポリペプ チドとして合成された。Ｇｕｔｔｅとその共同研究者は５５％エタノールロにＤ ＤＴと結合するポリペプチドを合成した（ｘｏｓＥ８３）。最近、Ｍｏ５ｅｒら （ｙｏｓ＋：８７）は、デザインされた２４個の残基のＤＤＴ結合結合タンパ上 質ＬａｃＺｉ：：　ＤＤＴ結合配列が融合したものの両方のＬｃｏｌｉ中での遺 伝子発現について報告している。彼らは生理学的に活士なタンパク質のデザイン は現在までのところ不可能であると述べている。

Ｅｒ１ｃｋｓｏｎら（ＥＲＩＣ８６）はβシートを持つということを意味するべ 一タベリンと名づけだ所の一連のタンパク質をデザインし合成した。彼らは数百 種の同族体ベータベリンを合成するのに混合試薬でポリペプチド合成することと 、カラムに充填した選ばれたターゲット化合物に対して高いアフイニティをもつ 同族体をとり出すのにカラ五使用を示唆している。変ったタンパク質の混合合成 の継続的段階や特異的結合による精製を心に描くいている彼らは、変化に対して 残基がいかに選択されるべきかを述べていない。タンパク質は増幅できないので 、研究者はどの置換が結合能を改良したのかを知るために回収されたタンパク質 を追跡しないといけない。研究者は、タンパク質の各変化種が配列のために単離 したフラクションに充分量存在するように、多様性の＠度を制限しなければなら ない。

種々の物質に対下るその７フイニテｌを介して細胞を分離する方法が誘発されて いる。動物細胞に対して適用された方法は次のような共通の問題を朗らかにする 。即ち、ａ）ｆｆｉ胞とアフィニティ支持体間の非特異的相互作用、ｂ）Ｅｌ胞 のアフィニティマトリツクスへの不可逆的結合（ＢＯＮＮ８５）である。

Ｆｅｒｅｎｃ　ｉとその共同研究者は、　Ｅ、Ｃｏ１１のマルトース運搬タンパ ク質ＬａｍＢの突然変異体のクロマトグラフィ単離に関し一連の論文を発表して いる（ＷＡＮＤ７９．　ＦＥＲＥ８０ａ、　ＦＥＲＥ８０ｂ、　ＦＥＲＥ８０ｃ 。

ＦＥＲＥ８２ａ、　ＦＥＲＥ８２ｂ、　ＦＥＲＥ８３．　ＣＬＵＮ８４．　ＦＥ ＲＥ８６ａ、　ＦＥＲＥ８６ｂ、　ＦＥＲＥ８６ｃ、　ＦＥＲＥ８７ａ、　ＦＥ ＲＥ８７ｂ、　ＨＥＩＮ８７；　ＨＥＩＮ８８）−その論文は、ｌａｍＢｆｆｉ 伝子巨で自然突然変異体と誘発突然変異体とが固定化マルトース、マルトデキス トリンあるいはデンプンを支持層としたカラムでクロマトグラフィ的に単離でき ると報告している。またその報告は他の適用も可能であるが、マルトデキストリ ンのボアや同様のボアのタンパク質と相互作用する残基についてのみ、その適用 は可能であると推測している。突然変異体のタンパク質はキメラではなかったし 、新しいターゲットに結合させようという試みはなされていない。

文献ＦＥＲＥ８６とＣＬＵＮ８４は共に化学物質を代謝できる生きたバクテリア で実験することの困難さを指摘し、クロマトグラフィ英検の間にその生理学的態 度を変化している。

異種遺伝子Ｃｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ］の７ラグメントはバクテリ オファージＦ１の遺伝子ＩＩ＋に導入することができる（ＳＭＩ７８５）。もし も遺伝子かもとの読み込み７レームを保持していると、変換された：ａ！ｔｅｒ ｅａ３遺伝子１１ｉの発現が、その遺伝子ＩＩＩタンパク質に、導入されたドメ インを現わすことになる。その結果生じたｆ１ウィルス粒子の細胞株は、異種Ｄ ＮＡによりコードされたタンパクに対しての抗体により吸着される。その７アー ジはｐＨ２゜２で溶＝し、いくらかの感染能力を１ａ持する。しかしながらｆ１ 遺伝子ＩＩＩのシングルコピーが、遺伝：ｆ　工ＨＩタンパク質の全てのコピー が影響を受けるように、異種遺伝子の挿入に用いられた。

挿入により生じた７アージの感染力は２５倍減少した。

Ｓｍ１ｔｈは遺伝子生成物に対する抗体を月いてクローン化された遺伝子を凰離 する方法を紹介した。しかし彼は挿入された遺伝子物質を突然変異させることや 、挿入されたタンパク質ドメインに新しい結合能力を導入することについそは何 も述べていない。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからのｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚ ｏｉｔｅタンパク質の繰り返し領域の７ラグメントが、遺伝子ＩＩＩタンパク質 内への挿入物としてＭ１３の表面に発現した（ＣＲＵＺ８８）。組み換え７アー ジはウサギにおいて抗原でもあり免疫原でもあった。著者は挿入された物質の突 然変異を示唆していない。

Ｂ型肝炎ウィルス抗原をコードする遺伝子フラグメントが、ＬａｍＢの７ラグメ ントに融合された。そしてもしもその融合がＬａｍＢｇ呈のドメインをフードす る領域内でおこったとすると、ＨＢＶ抗累がＩＥＥ胞表面表面れ免疫原となる（ ＣヨＡＲ８７）。ＣｈａｒｂｉＬら（ＣＨＡＲ８７）はこれら工学的に作られた 細胞株を竺きたバクテリアワクチンの開発に用いられることを示唆したが、彼ら は融合した異種遺伝子フラグメントの突然変異誘発については示唆していないし 、結合能力の開発もしていない。

Ｌａｄｎｅｒは米国特許Ｎｏ、４．７０４．６９２の“２本鎖あるいは多鎖ポリ ペプチドを１本鎖ポリペプチドへの変換に対して可能な化学構造決定、表示する ためのコンピューターを用いたシステムと方法”で本質的に間じ三次元構造を持 ったままで２本鎖あるいはそれ以上の鎖から成り立つタンパク質をより少ないポ リペプチド鎖に変換するためのデザイン法について述べている。しかし変えられ た：ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ３ＤＮＡや遺伝子選択については何も述べていない。

ＬａｄｎｅｒとＢｉｒｄｌ＝Ｖ１０Ｂ８１０１δ４９（公告１９８８年３月１０ Ｂ）でリンカ−ペプチドの１本鎖抗体の調製につきコンピュータによってデザイ ンするという特殊な適用法を述べている。

Ｌａｎｄｎｅｒ、Ｇ１１ｃｈそしてＢｉｒｄｌ：　ＷＯ８ｇ１０６６３０　（公 告１９８８年９月７２）（ＬＧ３）で、１本鎖抗体の結合決定領域をコードする ＤＮＡを変え、５ＣＡＤ／ｇ＄）Ｖキメラがファージの外面に顕示されるように ５ＣＡＤ遺伝子をラムダ７アージのｇｌ）Ｖ遺伝子にサブクローン化し、モして アフィニティークロマトグラフィーで抗原に結合するファージを選択すること、 にょう、種々の１本鎖抗体ドメインを特定の抗原に結合させるためスクリーンし てもよいことを述べている。

そこで述べられている唯一の抗原はウシの成長ホルモンである。

他の結合性物質、ターゲット、担体有機物、その他の外面タンパク質については 議論していない。また突然変異の程度や方法についても何の言及もない。

二ａｔｉ：ｒｅｒとＢｉｒｄｌ：　Ｗ０８ｇ１０６６０１（公告ｉ　９８８５９ 月７６）で、１本鎖の“擬二量化”リプレッサー（ＤＮＡ結合タンパク質）が、 推定上のりンカーペプチドを突然変異させ、ひき続いて不７ｊ％リプレッサーの デザイン用の認識要素辞書を作成するのに突然変異と選択を使うことができるか も知れないという、生体内選択により生成できるかも知れないと示唆している。

リプレッサは有機体の外面に顕示されない。

どの引用文献も先行技術もしくは関連する技術なのかにつき定見はない。また参 考文献表甲に記載のミ付は引例臼であって、実際に公表された日付ではない。

：発明の要約］ 本発明は、所望の結合特性を持つ新規なタンパク質を特定する突然変異遺伝子の 構造、発現、そして選択、ならびにそれらタンパク質自体に関するものである。

これらタンパク質により結合される物質（以下「ターゲット」と呼ぶ）はタンパ ク質であることが多いが、タンパク質である必要はない。ターゲットは有機分子 や無機分子は勿論、他の生物学的あるいは合成的高分子でもよい。

新規な結合タンパク質は、１）！Ｅ知の結合ドメインをコードするサブ配列内に 既知の結合タンパク質をフードする遺伝子を突然変異させるか、または、２）１ １ｔ目のタンパク質に遺伝子のこのようなサブ配列をとり、それを２番目のタン パク質（それ自身既知のこのような結合タンパク質であってもいいし、なくても いい）の遺伝子の全部または一部とＭ結させることにより、３）既知のこのよう な結合能力をもっていないが、それ自身を結合能力（裂片、溝など）に貸す２次 あるいはより高次な構造を有するタンパク質にコードする遺伝子を又然変異さぜ るか、あにはなくて、既知の結合タンパク質をコードする遺伝子を、その結合を 引き起こすことが知られている７ブ配列−ではないところで突然変異させること により、得られる。新規結合タンパク質が得られるタンパク質は、ターゲット物 質に対して特異なアフィニティをもっている必要はない。

１つの具体例として、本発明は、 ａ）複数の複製可能な遺伝子パッケージの変えられた集団を用意する。この遺伝 子パッケージはそれぞれ、（１）該遺伝子パッケージの外面上にタンパク質を顕 示する；う指示する構造シグナル、および（ｉｉ）ターゲットに結合するための 、ボテンシャル結合ドメインからなる被酸構造体を有しており、この核該構造体 は、外面に顕示されるポテンシャル結合タンパク質の発現をコードするものであ り、そしてここでは上記個々の遺伝子パフケージによって、複数の異なるポテン シャル結合ドメインが顕示され、 ｂ）次に上記タンパク質を発現さて、そして上記遺伝子パッケージの外面上で上 記タンパク質の顕示を生じさせ、Ｃ）次に、上記タンパク質のポテンシャル結合 ドメインと上記ターゲット物質とが相互に及応することができるように、上記遺 伝子パッケージをターゲット物質と接触させ、そしてターゲット物質と結合Ｔる ことに成功する照合ドメインを芽つ遺伝子パッケージを、ターゲット物質と結合 しない結合ドメインを持つ遺伝子パッケージから分離し、次いで、と）結合成功 結合ドメインを有する、りなくとも１つの遺伝子パッケージを採取し、次に複製 し、 ｅ）ターゲット物質に結合する遺伝子パッケージの結合成功結合ドメインのアミ ノ酸配列を決定し、ｆ）工程（ａ）に従い、複数の複製可能な遺伝子パッケージ の変えられた新規な集団を調製するが、この（ｆ）工程では、この新規パッケー ジのポテンシャル結合ドメインを生む親のポテンシャル結合ドメインが、工程（ ｅ）で決定された配列を有する決定成功結合ドメインであるようにし、そして上 記工＠（ｂ）〜（ｅ）を、この新規集団を月いて繰り返して行い、そして、所望 の結合特性の結合ドメインを有する遺伝子パッケージが得られたら、 ｇ）その所望の結合ドメインをコードする遺伝子を遺伝子パッケージから抽出し 、それを適尚な発現系に位置づけること（そうすればその結合ドメインは単位タ ンパク質（ｕｎｉｔａｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ：として、即ち、より大きなタンパ ク質のドメインとして発現される） に賀する。

さらに不発明は、複数の複製可能な遺伝子パッケージの雑種集！の調製方法に関 し、タンパク質が遺伝子パッケージの外面に現れるように、ポテンシャル結合タ ンパク質を発現する遺伝子を各遺伝子パッケージが有しているもので、この方法 は、エン　ポテンシャル結合ドメインの発現をコードする基本ε列、お；びコー ドされたタンパク質が選択された複製可能な遺伝子パッケージの外面上に顕示さ れる；うにシグナルを；−ドする第２の配列よりなる、そのそれぞれのＤＮＡ挿 入体の変化集団をｖＲＷ！Ｌ、次いで ｉｉ）生成するＤＮＡ構築物の集団を、選択された複製可能な遺伝子パッケージ 出に組み込むことによって、複製可能な遺伝子パッケージの集団を作る、 ことを含むものである。

好ましい具体例では、ポテンシャル結合タンパク質をコードする挿入体が複製可 能な遺伝子パッケージの外面タンパク質をコードする遺伝子に組み込まれる。

本発明は一定の色々な領域で特徴をもつ一連のポテンシャル結合タンパク質の７ ７ミリイをコードする多４Ｓ：のあるＤＮＡをデザインし合成することを含むも ので、ここでタンパク質は、予め定められたターゲットと結合するタンパク質を 得るｇ的でデザインされるのである。

本発明の目的上、“ポテンシャル結合タンパク質”という用語は変えられたＤＮ Ａ集団内のＤＮＡ分子の一つの種によりコードされたタンパク質を指し、そこで は変化の領域はターゲット物質に結合する結合ドメインとして働く力をもつポリ ペプチドの−まｆニー　１：２以上のセグメントをフードする二′−たは２以二 のサブ配列に現れるものを言う。

場合によってｔ＝、変えられたＤＮＡの“親の配列”について言及することが助 げになろう。みつけた新しい結合ドメインが既知の結合ドメインと同族である場 合には、その親配列はその既知の結合ドメインをコードする配列ということにな る。度えられたＤＮＡは大抵の遺伝子座でこの親の配列と同一であるだろうが、 選んだ遺伝子座では親の配列と同じではない。ポテンシャル結合ドメインが最初 の原理でデザインされた時は、親の配列は所望の結合ドメインを形成するように 予期されたアミノ酸配列をコードする配列であって、変えられたＤＮＡは高度な 配列類似性でもってその親に相関する“娘ＤＮＡ”の集団となる。

本発明の基本原理は、強制される進化の一つである。強制的進化の効率は、との 残基を変化させるかを注意深く選択することにより大きく高められる。ポテンシ ャル結合ドメインの三次−元構造は、この選択における主たる決定要素となる。

最初に、ターゲットの一分子に同時的に接触できる一セットの残基を同定する。

それから、これら残基をコードするコドンの全部または一部が、ＤＮＡの変化集 団を産生ずるように同時に変換される。

ＤＮＡの変化集団は、遺伝子パッケージの変化集団が産生されるように、細胞を 形質転換するため用いられる。

可能な結合タンパク質をコードする遺伝子を持つ遺伝子パッケージの混合集団は 、寅際にターゲットに結合するタンパク質を発現する遺伝子を含むパッケージ（ “成功結合ドメイン”）を増大させる。このような増大過程を−、二回行った後 、選択した遺伝子の一つまたは２以上を試験し、配列する。望むならば、変換の ための新しい遺伝子座も選択される。一つの世代の選択された娘遺伝子はそｈか ら、変えらｒたＤＮＡのための次世代の親配列となり、ひきつづいての次の“又 化サイクル”を初めることになる。このようなサイクル１＝所望のターゲット親 和性をもつタンパク質が得られるまで統けられる。

上記事項に続く　「請求の範囲」記載の事項は、本明細Ｗ雪に組み込んで好まし い寅施例とする。

：図面の簡単な説明］ 図１は種々の結合ドメインのタイプ間の関係を示す概略図である。

区２は予め決めたターゲットに対し親和性を持つ新規なタンパク質を生成するた めに用いられる主要工程を示す流れ図である。

Ｅ３はターゲット物質の分子に接触したＰＢＤ　（ポテンシャル結合ドメイン） を図式的に表わしたものである。

Ｅ４はＭ　ｌ　３　ｍｐ１８とｐＢＲ３２２からのｐＬＧ３の構造の概略図であ る。

図５はｐＬＧ３と合成りＮＡからのｐＬＧ７の構造の概略図である。

二発明の詳細な説明〕 Ｓｅｃ、　０．１　：　概説 本発明は望ましい結合特性をもつ新規なタンパク質を、結合タンパク質を持たな い、あるいは望ましくない結合タンパク質を持つ、よく似た遺伝子から特定の突 然変異遺伝子を分離するもので、次の方法による。Ｔなわち、刀交然変異遺伝子 各々の生成物が、遺伝子を含む複製遺伝子パッケージの外面に顕示される；うに 、アレンジし、２）所望のターゲット物質に改良された結合性をもってタンパク 質特定化遺伝子を含むパンケージに対して、これらパッケージの集！を増スさせ る。ために、その所望のターゲラｒ物質を組み込むアフイニティ分離を行うこと である。

Ｋｏ（ｘ、ｙ）を解離定数とすると、 次に上記「請求の範囲」として記載の寅施例の目的のために、もし く１）一つの分子、イオンあるいは原子種Ａにつき解離定数Ｋｎ（Ｐ　、Ａ）＜ 　ｌ　Ｏ−’　ｍｏｌｅｓ／１ｉｔｅｒ。

（２）異なる分子、イオンあるいは原子種Ｂにつき解離定数ＫＤＣＰ　、Ｂ）＞ 　ｌ　Ｏ−’ｍｏｌｅｓ／１ｉｔｅｒなら、タンパク質Ｐは結合タンパク質であ る。

これら二つの条件の結果として、タンパク質ＰはＢＪ″りもＡに特異性を示し、 Ａに対して最小限の親和性（あるいは結合活性）を示す。

一つのタンパク質のドメインが選ばれたターゲットに特異的に結合するタンパク 質の能力に第１次的に関与するとき、これを以下“結合ドメイン”　（ＢＤ）と 呼ぶ。我々は、安定タンパク質ドメイン、すなわち“最初のポテンシャル結合ド メイン″（ＩＰＢＤ）、を遺伝子パッケージの外面上に＝現させることを遺伝子 的意味に作りと丁。本発明は既知の結合タンパク質の結合ドメインの；うな“親 のポテンシャル結合ドメイン″（Ｐ：’Ｂ：））に関する全ての数多くの色々な 異なった“ポテンシャル結合ドメイン”（２３））の発現に関するものであり、 最も成功的な突然変ＲＰＢＤをコードする遺伝子の選択と増幅に関Ｔるものであ る。ＩＰＢＤは変化の第二回目にＰＰＢＤとして選ばれる０選択から結合への工 程は一つあるいはそれ以との“成功結合ドメイン”　（ＳＢＤ）を単離する。１ 回の変化と選択から結合への工程から得られたＳＢＤは、次！の工程にとっての ＰＰＢ；）とされる。しかしながら、本発明は、この方法が系時的にもまた司時 的にも、タンパク質の任意のあるいは全てのＢＤに適用できることから、嵐−の ＢＤをもつタンパク質に限るものではない。種々のＢＤの関係を図１に示す。

“変えられたＤＮＡ″′、ｖａｒｉｇａｔｅｄＤＮＡＩとは、はぼ全体の鎖を通 じて岡じ塩基配列をもつが、特定の遺伝子座の一定数、好ましくは５〜１０個の コドン、で変化する分子の集団である。変えられたＤＮＡの分子は、それが遺伝 子の一部を構築するようにプラスミド田に導入される。変えられたＤＮＡを含む プラスミドがバクテリアの形質転換に用いられると、各細胞はもとのタンパク質 の異形［ｖｅｒｓ　ｉｏｎ〕を作る。バクテリアの各コロニーは他のいかなるコ ロニーとも異なる異形を産生する。もしもＤＮＡの変化：ｖａｒｉｇａｔｉｏｎ ｓ３がタンパク質の表面上あるいはループ内に存在することが知られた遺伝子！ に集口すると、タンパク質の集！が包成され、その実＝の多くのメンバーは親タ ンパク質とほぼ東じ三次元構造の二に包み込＝れる。しかしながら各メンバーの 特異的結合室はそれぞれ異なるだろう。所望の結合持重をもつタンパク質の遺伝 子を含むコロニーを、望ましい新和性を示さない遺伝子から選り分けることが残 されている。

“二太鎖抗体”は、少なくとも２００のアミノ酸から成るＩＸ鎖ポリペプチドで あり、そのアミノ酸は硯原に結合するため２領域を一緒にさせるペプチドリンカ −に；り連結されｔ；２つの抗原総合領域を形成する。この２つ抗原結合置載の どちらか一方は、既知の抗体の変異ドメインであるか、または、それらの（′、 ）それぞれが既知の抗体の変異軽重ドメインの９本のストランドと同様な方法で 空間的に関係付けられた９Ｘのストランドのベータ管内に畳み込まれるにちがい ないし、（２）上述の既知抗体の可変ドメインがするのと同じように、それぞれ が１つにフィツトするにちがいない。一般的に言えば、このことは超可変部に相 肖するアミノ酸は衆外して、既知の抗体の可変ドメインのアミノ酸には少なくと も８８％の相員性が有ることが要求されるということになる。

“アフィニティ分離手段”とは、ａ）アフィニティカラムクロマトグラフイー、 ｂ）アフイニテイマトリックス物質からのバッチ溶離、Ｃ）プレートにくっつい たアフィニテイ物質からのバッチ溶ｍ　ｄ）蛍光で活性化した細胞選別、ｅ）タ ーゲット物質の存在下での電気泳動等を含むものであるが、これらに限定される ものではない。“親和性物質”とは“被分析体”：ａｎａｌｙｔｅｊと呼ばれる 精製されるべき物質のための親和性をもつ物質を意味するのに月いられる。大砥 の場合、親和ｉ物質と仮分析体のアソーシエーション（＝、一旦不純物が洗浄さ れれば仮分析体を親￥：”：＊質から遊離させることができる；うに可逆的であ る。

アフィニティーカラムクロマトグラフ）−であれ、容器内につめたアフイニティ マトリックス物質からのバッチ溶離であれ、プレートからのバッチ溶離であれ、 非常によく似ているので、以後“アフイニティクロマトグラフイ”と呼ぶ。

蛍光活性の細胞選別は、それ自身蛍光１のものであるか、蛍光分子で標識された 親和性物質を月いる。現在市販されている細胞選別剤は、例えばテキサスレッド のように、各細胞に結合する蛍光色素８００〜１０００分子を必要とする。ＦＡ ＣＳ！ニー秒間に１０１個の細胞あるいはウィルスを選別する。

電気泳動的アフィニテイ分離はターゲット物質の存在下でのウィルスや１ｆＥａ の電気泳動を含むもので、ここでは上述のターゲット物質の結合により、ウィル スのパーティクルや細胞の正味の電荷が変わる。これはバタテリオファージを電 荷に基づいて分離するのに月いられる（ＳＥＲＷ８７）。

本発明は、所望の結合特性を有するタンパク質をコードする遺伝子を持つ細胞と かウィルスの集団を増大させるため、バクテア細胞あるいはバクテリアウィルス （あるいは他の遺伝子パッケージ）のアフィニティ分離を利用するものである。

本発明において”選択”　：５ｅｌｅｃｔＥ、：５ｅｉｅｃｔｉｏｎことは、純 粋に遺伝子的意味、丁なわちバイγロジカルプロセスで月いられるもので、表現 型特性が望ましい表現叉を顕示する有機体の集！を１大するため月いられる。

本発明の工程はミとして次の３部分より成る。

二、遺伝子パッケージ（ＧＰ）の表面正に最初のポテンシャル結合！メイン（Ｉ ＰＢＤ）を顕示Ｔる複製可能なＧ：’−−ＧＰ（ｉＰ’３Ｄ）と呼ぶｍ−のデザ インと生産 ２、既知の親和宣分子を結合するＧ、’（：？３Ｄ）を、既知の親和性分子とは いずれも結合しない所の、野’４Ｇ？、あるいはＧＰ（１ＰＢＤつ、から分離す るアフィニテイ分離のデザインと具体策、３、異なるＧＰ（ＰＢＤ）の１０６ま たはそれ以上の集団−−ＧＰ（ｖｇｒ’Ｂ））と呼ぶ−−が産生されるところの 構造階高性突然変異と呼ぶこととする遺伝子変化（または多様化）法のデザイン と具体策一つのアフィニティ分離を“分離サイクル”と呼ぶ。そして１個のＳＢ Ｄを単離するのに必要な回数の分離サイクルに先立つ変化（または多様化）段階 を“変化（−たは多様化）サイクル”と呼ぶ。一つのラウンドからの１個のＳＢ Ｄのアミノ酸配列は、次の多様化サイクルでＰＰＢＤとなる。我々は５３つと選 ばれたターゲット間を結ぶ望ましい親和性と特異性が得られるまで多様化サーク ルを繰り返し実行した。

ｖｇ１部は、単一のＩＰＢＤ配列を扱う菌株の構築である。ＩＰＢＤ　（最初の ポテンシャル結合ドメイン）が、ＧＰ（遺伝子パッケージ）の表面に表れるよう に、１ｐｂｄ配列に隣接下るＤＮＡ配列甲の０Ｓｐ−ｉｐ’ｐｄ遺伝子内遺伝回 内性εｖａｒｉａｂｉ五ｉｔｙ：が導入されてもよい。

抗体のような正確に折りｔ；たまれだＩ２３つに高い親和性をもつ分子が、ａ） ＧＴ’表面二のＩＰＢＤを探知し、’ｏ）Ｇ？表面上にＸＰＢ’）を顕示するコ ロニーをスフ１じ一ニングし、ｃ）１集！から１ＰＢＤを顕示するＧＰを選択Ｔ るのであるが、その集団のあるメンバーはＣＰ表面に：？３〕を顕示するであろ う、以上のために用いられる。一つの好ま′−い具体例として、このツ二部は次 のことを含む。

二）バクテリア細胞（Ｓｅｃ−ｉ−１−ｉ）、バクテリア胞子（Ｓｅｃ、ｉ、２ −１）、バクテリア胞子（Ｓｅｃ、ｉ、２．１）あるいはファージ（Ｓｅｃ、１ ．３．１）のような適当な外面タンパク質（Ｓｅｃ、　１．１．３．二、２．３ ．１．３．３）を持つＧＰを選択すること、 ２）安定な１ＰＢＤ（Ｓｅｃ、２）を選択すること、３）ａ）サブ配列としてＩ ＰＢＤを含み、ｂ）ＣＰ面正にＩＰＢＤが表れるように下る、アミノ酸配列をデ ザインすること（Ｓｅｃ、ｉ、１２．１．２゜２、　ニ、３２．　４）、 ４）ａ）デザインしたアミノ憩配列をコードし、ｂ）必要な遺伝　゛予約制御を 供給し、Ｃ）遺伝子操作に対する賀利な部位を導入Ｔる、という遺伝子−−ｏｓ ｐ−ｉｐｂｄと呼ぶｍ＝を工学すること（Ｓｅｃ　。

４、ｉ、　４．２．４．３．５．１．５．２）、５）　ａｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子 をＱｐ内にクローニングすること（Ｓｅｃ、６．１）そして ６）形質転換されたＣＰ（Ｓｅｃ、７）を採集し、これを（、ｐ面上でＩＰＢＤ の存在につきＣＰで試験する（Ｓｅｃ、８）、このテストはＡｆＭ（ＩＰＢＤ） で示す、ＩＰＢＤに対し高い親和性のアフィニティ分子で行われる。

他の具体例として上記第１部は次のことを含む。すなわち、と述の１）と２）と 、 ３）ａ）一つのサブ配列としてＩＰＢＤをコードし、ｂ）ランダムＤＮＡが二ｐ コｄ遺云子フラグメンごに操作可能に結合するように適当なｇ、隈部位を含み、 モしてＣ）必要な遺伝子操作を施す、所のＤＮＡ配列をデザインし、−一このＤ ＮＡＥ列は“顕示プローブと呼ばれるＣ３ｅｃ、ｉ、ｉ−３，！、２．３．１− ３．３）４）その顕示プローブを構築し、 ５）顕示プローブをｏＣｖ内にクローニングし、ｏＣｖの適当なテストでそれを 増幅し、 ６）ランダムＤＮＡあるいは擬ランダムＤＮＡを顕示ブロープロの溜：厩部位の １つにクローニングしくＳｅｃ、６．２）、それによってランダムまたは擬ラン ダムＤＮＡをポテンシャル口ｓｐとして機能させ、７）　ＣＰ表面上のＩＰＢＤ の存在に対して形質転換されたＣＰのコロニーをスクリーニングするＧＰ（Ｓｅ ｃ、７）を採取し、（このスクリーニングはＰＢＤに対して高い親和性をもつア フイニティ分子−−Ａｆｔ（ＩＰＢＤ）と呼ぶ−−）　（Ｓｅｃ、８）、または その代わりに、８）　Ａ：′１（ＸｐＢＤ）を用いるアフィニティ分離法でもっ てＩＰＢＤを顕示するＣＰを選択すること（Ｓｅｃ、　８）。

一旦、ＣＰ（ＩＰＢＤ）が層比されたら、種々の異なるターゲットに結合する色 々な新規タンパク質を開発すると発物質としてそのＧＰを河回でも用いることが できる。ＧＰｆｆｉ上に１つのＩＰＢＤを出現させる工学的知識は、異なるＩＰ ＢＤを顕示する他のＣＰ（ＩＰＢＤ）をデザインし産生ずるのに使うことができ る。

第１部は単に単一のＩＰＢＤについて扱っているが、多くの調製法が第３部でな されている。そこでｔ；我々は数多くの突然変異をポテンシャル結合ドメインに 導いている。第１部でＰＢＤやｐｂｄについて言及したこと（＝準備的な意図を 示すものである。

笑２６で（；、我々はＡ？Ｎに：’ＢＤ）に対Ｔる：？ＢＤの親和性に根ざして 、野性型Ｇ？−−１Ｇ？で示すｍ＝からＧＰ（：？Ｂ））を分離することを最適 化し、アフイニティ分離工程の！ｒ、度を確立した。好ましい具体例として、本 発明の第２部は次のことを含む。

１）礎質容量に対するＡｆＭ（ＩＦ’ＢＤ）の色々な濃度でのＡｆＭ（＋、’Ｂ ））を持つアフィニティーカラムを調製する。（Ｓｅｃ−１０−１）２）ＧＰに 対し色々な量のＩＰＢＤを持つＣＰ（！ＰＢｉ））を調製する。

３）カラムの溶離には溶媒組成を段階的５こ変えるグラジェント法を採用する。

４）ａ）ＧＰに対するＩＰＢＤ、　ｂ）担体容量に対するＡｆＭ（ＩＰＢＤ）の 濃度（密度）、Ｃ）最初のイオン強度、ｄ）溶離速度、ｅ）担体容量に対するＧ ｐ量、以上のどの組合せがｗｔＧＰから（、ｐ（ＩＰＢＤ）を分離するのに最も よい結果を与えるかを決定する。（Ｓｅｃ、１０．１）Ｓ）最適化条件を用いて ｗｔＧＰのずっと多量のものから凰離できるＧＰ（ｒｐｓＤ）の最小量を決定す る。（Ｓｅｃ、２Ｏ−２）６）アフイニティ分離操作の効率を決定する（Ｓｅｃ 、ＩＯ，３）第２部は、１個の別のＧＰが多量に過剰であることがら嵐−互のＣ Ｐ（！ＰＢＤ）を分離することを最適化した。この最適化条件はターゲットに結 合するＣＰ（ＰＢＤ）をターゲットを、ターゲットと結合しないＧＰ（ＰＢＤ） から分離するのにａｓ３部で用いられる。この最適化操作は一つの、または２以 上の′４定温度で行われ、また一つまたは２以上の′４定ｐＨにおいて行われる 。第３部では使用者は選択したＳＢＤがターゲットと結合するべき条件を指定し なｔ７しばならない。もし指定した使用条角が７フイニテＩ分離の最適化条件と 著しく異なれば、使用者；＝第２部に戻り、選択した５３Ｄの使用意図条件に近 い条件でアフＩニティ分離を最適化しな１７ればならない。

第３部では、ターゲット物質と第１部で得たターゲット物質に適したＧＰ（ｉＰ ＢＤ）とを選ぶ。ＩＰＢｉ）を多様化の最初のサイクルへの’？’？３Ｄとして 用い、様々な種類のＰＢＤを＝−ジする様々な種類の０３ｐ−ｐｂｄ遺伝子を調 製する。ＰＰＢＤの結合′＃性より優れた結合特性のターゲットに関する結合特 性をもったＰＢＸを顕示するＧＰのためにＣＰ（ｖｇＦ’ＢＤ）集団を増量する ため、第２部で得たアフイニティ分離を月いる。一つの多様化サイクルから選ん だＳＥＤは、次の多様化サイクルではＰＰＢＤとなる。好ましい具体例として、 本発明による処理の第３部は次のことを含む。

１）ターゲット分子を選択しくＳｅｃ二：）、２）ＣＦ’（１ＰＢＤ）を選択（ Ｓｅｃ、１２）　シ、３）ａ）　Ｘ？ＢＤの三次元構造、ｂ）相間タンパク質の 配列、Ｃ）基本的な構造を損なわずに異なったアミノ雅に耐性のあるのはとの残 基かを示すコンピューターあるいは理論的なモデリングをしくＳｅｃ、４３．２ ）、 ４）様々な変異体の数に基づき濁時に変化させるべき残基のサブセットを選択し 、かつ、どの変異ケがアフィニティ分離の探知能力内にあるかを選択（Ｓｅｃ、 ｉ３．２）し、５）次の通りにして多様化を冥施し、Ｔなわち、ａ）多様化の候 補になる残基をコニドする塩基の幾つか、または全部のヌクレオチジ基質の坤足 混合物を月いて変化させられる残基をコードする。５ｐ−ｐコと遺伝子の一部分 を合成し、それに；っでＤＮＡ分子の集Ｘ　−−ＶｇＤＮＡ−−を竺或し、 ’ｏ）通、常法により二のｖｇＤＮＡを操作クローニンベクター（ＱＣＶＸ例え ばプラスミドとか、バクテ・レオファージ）＝に通結二ｌ　ｉ　ｇａｔｅニしく Ｓｅｃ、１４．１）、Ｃ）ａ−胞を形質転換するため、この連結ＤＮＡを使用し 、それにより形質転換細胞の集団を産生しくＳｅｃ、１４．２）、ｄ）形質転換 細胞の集団を培養（即ち数をふやす）し、Ｑｐ（ＰＢＤ）の集団−−ＧＰ（ｂｇ ＰＢＤ）−−を採集しくＳｅｃ、１４．３）、ｅ）選ばれたターゲット分子をア フィニティ分子として第３！５で得たアフィニティ分離を月いてターゲットに結 合するＧｐの集団を増加させ（Ｓｅｃ、　１５）、ｆ）ターゲットに対する改良 された結合能力をもつ（、Ｐ（ＳＢＤ）が単離されるようになるまで工程３．５ ．ｄと工程３．５．ｅをくり返しくＳｅｃ、１５）、そして ｇ）１離された単数または複数の５３つの選ばれたターゲットに対する親和性や 特異性をテストしくＳｅｃ、１５．８）、６）望ましい程度の結合力が得られる まで工程３．３．工程３，４、工＠３，５をくり返す。

第３部が各折しいターゲット物質に対してくり返される。第１５は、もし選ばれ ！ニケーゲ・ントに適当なＣＰ（：ＰＢＤ）がないときだ１７＜り返丁必要があ る。Ｍ２！５は、もし新規結合タンパク質の意ｘした使用条件が以前の最適化条 件と著しく異なるときには、新しく得たＧＰ（［ＰＢＤ）と前に得たＧＰ（：？ ＥＩＤ）に対して繰り返す必要がある。

Ｓｅｃ、　０．２　略号解説 次のような略号が本発明を通して使用される。

略号　意味 ＣＰ　例えばバクテリオ７アージのような遺伝子パッケージ Ｘ　任意のタンパク質 Ｘ　タンパク質Ｘの遺伝子 Ｉ　ＰＢＤ　例えばＢＰＴ　Ｉのような最初のポテンシャル結合ドメイＰＢＤ　 例えばＢＰＴ　Ｉ誘導体のようなポテンシャル結合ドメイＳＢＤ　例えばターゲ ットに結合させるため選ばれたＢＰＴ　Ｉの誘導体のような結合成功結合ドメイ ン ＰＰＢＤ　ｆｉｌえば前に選択されたＩ　ＰＢＤまたはＳＢＤのような、親のポ テンシャル結合ドメイン ｏｓｐ　例えばＥ　、Ｃｏ　ｌ　ｉからのＬａｍＢあるいは７アージのコートタ ンパク質のような、外面タンパク質 ０５Ｐ−ＰＢＤ　Ｏ５ＰとＰＢＤとの融合、融合のオーダーは特定されていない ０５ＴＳ　外面伝送シグナル ＧＦ’（Ｘ）　外面にＸを顕示する遺伝子パッケージ［Ｑ）　例えば［Ｔ、リゾ チーム）と言えば、アフイニティマトリックスに付いたＴ、リゾチームを意味す るように、“Ｑ”を保持するアフイニティマトリックス“Ｗ″に対するアフイニ ティを持つ分子ＸＩＮＤＵＣＥ　例えば１ａｃＵＶ５プロ％−夕に対するＩＰＴ Ｇ（７）、ｌ：うな、ＯＣｖ　オベラティブクローニングベクターＫ　ｔ　Ｋ７ −ｊＴ３　Ｃ３ＢＤＦ／　ｊＴ：５ＢＤ３　（Ｔはターゲット）Ｋｗ　ＫＨ−′ ＬＮ頁５ＢＤｊ／　ＣＮ：ＳＢＤコ（Ｎはターゲットでないもの）ＤｏＡＭｏＭ 　アフイニティマトリックス上のＡｆｌｌｌ（Ｉｔ）の密度Ａｂｕｎ（ｚ）　ア ミノ酸ＸをコードするＤＮＡ分子の存在率ＯＭＰ　外層膜タンパク質 ｎｔ　ヌクレオチド に４　分子解離定数　Ｋ、・［Ａ］　［Ｂコア：ｈ：Ｂ。

Ｓ、、、　ｖｇＤＮＡを合成することにおける誤差レベルＳｅｅ、　０．３　標 準配列決定性 本発明はＤＮＡサブ配列命のヌクレオチド（ｎｔｓ）の配列を決定する方法であ るが、単一の方法に限るものではない。配列決定反応、アガロースゲル電気泳動 法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｆ’ＡＧＥ）が標準的操作で実行される （ＡＵＳＵ８７）。

大発明はタンパク質を決定する単一の方法に限ったものではない。ドメインのア ミノｒ！１配列の決定性ζ５て請求の範囲に記載の！項は、ｆ５的、間接的を實 わず、どんな実際的方法、それら方法の組合せ、を含む。大抵の場合、好ましい 方法は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を決定し、そしてアミノ酸配列を推 論することである。ある場合には、タンパク質配列決定の標準法は翻訳後プロセ スを探る必要があるかもしれない。

ｊ！択したターゲット物質に対し親和士を待つ新規な結合タンパク質の作成と１ 離の過程における主要工程を、！２に示す。

Ｓｅｃ、１　：　遺伝子パッケージの＃性化と外面上Ｉこ異種結合ドメインを顕 示する方法 Ｓｅｃ、　Ｏ，！　：　遺伝子パッケージの一般的要件どの選択〜結合工程でＧ Ｐが実行されるかの問題は、選択後に、ある適当な環境化での成長か、試験管内 でカプセルにされた遺伝子情報の増幅と再生かのどちらか−が可能でなければな らないことを強調しておく。成長の最小段階で、数の増加は時間的に大略、指数 関数的でなければならない。望ましい結合特性を示す集団成分は、例えば１０’ 個田に１個か、それ以下しかないくらい非常に小さい。しかし一旦、この集団成 分が非結合成分から分離されると、それ自身を増幅することは可能であるにちが いない。生きた細胞を培養すること；；既知の遺伝子物質の最も有力な増幅法で あり、またＦましいことでもある。遺伝子情報は試験管内で増幅することもでき るが、これは推められなＧＰは普通、′４殖１バクテリアＥ胞か、バクテリア胞 子かバクテリアＤＮＡウィルスである。どんな竺物り胞、あるいはウィルスのＭ 株でも、その菌株が次のようなものであれば、可能性として有用である。

１）培養液口に維持できる。

２）アフィニティ分離でき、その竺存工を保持できる。

３）現寅的な容易さで遺伝子的に変化：ａＥｔｅｒ；できる。モして４）アフィ ニティ分離の間にターゲラ・物質と相互作用できるポテンシャル結合タンパク質 ドメインを顕示するために操作できる。

＋Ｐ３Ｄ配列をコードするＤＮＡは、Ｉ　ＰＢＤがＧＰの外面に顕示されるよう に、Ｇｐに本天備わっている外面タンパク質（Ｏ１２）の夕なくとも外面輸送シ グナルをコードするＤＮＡＩ：操作的にリンクされる。もし融合がドメイン境界 の近くにあるなら、ＣＰの竺存工、あるいはＬＰＢＤまたはＰＢＤの結合特性に 悪影響を及ぼすことなく、遺伝子パッケージをして、その外面に＋　Ｐ３Ｄある いはＰＢＤを顕示させることが可能となる。

細胞に認識され、タンパク質をして、細胞質から輸送させられ、そして細胞の表 面に顕示させられるタンパク質の特性は、“外面輸送シグナル”と命名されよう 。

選択〜結合工程経田で（ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子から誘導される）ｏｓｐ７ｐ′ Ｏｄ選伝子をもつ複製可能な遺伝子体（ファージあるい（＝プラスミド）　−５ ｅｃ、二４をみよｍ−は、以下、γベラテイブクロ一二ングベクター（ＯＣＶ） と呼ぶ、　ＯＣＶがファージのとき、それは遺伝子パッケージとしても１１１能 する。１つのＧ’３の選択は、Ｍ尚なｏＣＶと、て適当なｏｓｐの入手可能性に よって一部的に決定される。

Ｇ？！＝例えば冷凍により容易に貯蔵ができるのが好ましい。もしもＱｐが細胞 ならば、２０〜４０分のような短い世代時間のものでなければならない。ＧＰが ウィルスであれば、それは例えば感染Ｍ胞に対して少なくとも１００個の乎均放 ＝数を押つような多分裂世なものでなければならない。培養するのに手がかかり 、高くつ＜ＧＰは好ましくない。Ｇ２は好ましく（＝遠心分離により容易に採取 されるものがよい。ＧＰは、好ましくは一７０〜４０℃の温度範！内で安定な（ 数ヨ間または数週間、４℃で安定）ものがよく、ＨＬＰＣで見られるように、剪 断力耐性があり、紫外線にセンシティブでなく、乾燥に強く、ｐＨ２−０〜１０ ．０に耐性で、ＳＤＳやトリーンのような表面活性剤、４Ｍ尿素や２Ｍグアニジ ン塩酸塩のような力γトロープにも耐性で、カリウムイ万ン、ナトリウムイオン 、硫酸イオンのような通常のイオンにもｉｒ＋！性で、エーテルやアセトンのよ うな通常の有機溶媒にも耐性、分解酵素にも耐性なものがよい。最後に適当なＯ Ｃｖがなければならない（Ｓｅｃ、３をみよ）Ｏ１２の三次元構造と、ＯＳＰ遺 伝子の配列（？、４７）は知られていることが好ましい。もしその三次元構造が 知られていなければ、どの残基が細胞表面に！呈しているかとか、Ｏ５Ｐ内のド メインの境界の位置、および／または、Ｏ１２と外部からの挿入物との成功した 融合、等に賀する知識があることが好ましい。Ｏ１２は好まシくはＧＰの外面に 多くのコピーとして表れ、好ましくは非必須、！！能を働く。ｏｓｐ＋＝翻訳後 処理されないか、少なくともこの処理が理解されていることが好ましい。

Ｆ条件なＣＰ、ＯＣＶそしてＯ１２は、一つの規準でｆｉ高得点をするようなも の；りも、致命的津害が最小なものがよい。

次に、ａ）増殖的：ｖｅｇｉｔａｔｉｖｅｌｙ違こ成長したバクテリア細胞（Ｓ ｅｃ、１．１）、ｂ）バクテリア胞子（Ｓｅｃ４．２）８　：びｃ）（ｓｅｃ、 ２．３）の場合に、この工程に投げかけられた疑閘に一般的な答を考えよう。

いくつかのＧＰにとって好ましいＯ１２を表２に挙げる。

Ｓｅｃ、１−１：　遺伝子パッケージとしてのバクテリア細胞培養液で成長した 特性のよくわかているバクテリアＮ株を選ぶことができる。この場合の重要な開 運は、ａ）細胞の外層にタンパク質を局在化：１ｏｃａｌ　ｉｚｅ；する機構に ついて我々は充分に知っているか、ｂ）ＩＰＢＤが外層膜の環境下に折り畳まれ るか、そして、Ｃ）アフィニティ分離で、０５ｐ−４ｐｂｄから導かれたｏｓｐ −ｐｂｄの発現を細胞は変化させるか、である。ある！？３つは、媒体＝にはな くて、細胞田に存在する、Ｆｅ、Ｓ、クラスターのような大きな不溶性な補欠分 子族を必要とするかも知れない。ある鉄毒素−にみられるＦｅ、Ｓ、クラスター の生成は、細胞内にみられる酵素により触媒される（ＢＯＮＯ８５）。このよう な補欠分子族を必要とするＩＰＢＤは、もしバクテリア細胞上に顕示されれば、 折り畳み、すなわち機能しなくなるだろう。

Ｓｅｃ、！、ｉ４：　ＧＰとして好都合なバクテリア細胞Ｅ、Ｃｏ：ｉについて の広範な知識に立脚下ると、組み換えに欠陥のある三、Ｃｏ１１のＭ株は、バク テリアＧ？こして最も強力な候補である。他のＦ；しい候補は、Ｓａ１ｍｏｒ＋ ｅｉｉａ　ｔｙｐｊｉｍｕｒｉｕ＊、　ＢａｃｉｉｉｕＳ　ＳｕＭＬｌ：ｉＳ、 ？ＳｅｕＱＯｍＯｎａＳ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａである。

Ｓｅｃ、’１．−２：バクテリア紀胞にｒＰＢフを顕示するのに好ましい外ブタ ンパフ質 ダラム書ｉバクテリアは、Ｏ１２のサブで７トを生成する外層膜タンパク質（Ｏ ＭＰ）をもつ。ＯＭＰが外層膜に局在化する原因となるシグナルは成熟タンパク 質のアミノ酸配列にコードされてしする。ｏｍｐ遺云子の７ラグメントとＸ遺伝 子の７ラグメントの融合はＸをその外層膜とに親日させる（ＢＥＮＳ８４．　Ｃ ＬＥＭ８ｉ）。もし融合のデータが得られないときは、匣フラグメントを＃遺伝 子の色々なフラグメントに融合させ、＋？３Ｄ顕示の表現をを選択０ｉｉｖｅｒ はバクテリアにおけるタンパク質の分泌機構につき概説している（ＯＬｉＶ８５ ．０ＬｉＶ８７）、ニア４堂とＶａａｒａ（ＮＩＫＡ８７）は、グラム＊ｉバク テリアの外層膜にどのタンパク質が局在化されるかについての機構を概説してい る。例えば、Ｅ、Ｃｏ！ｉのＬａｍＢタンパク賃は、後で取り衆かれる典型的な シグナル配列で合成される。Ｂｅｎ５ｏｎら（ＢＥＮＳ８４）は、成熟ＬａｍＢ タンパク質の１−４９の残基がその融合口に存在するなら、そしてその残基二〜 ４３が３７分であるなら、ＬａｍＢ−ＬａｃＺ！５！合のタンパク質が、三、Ｃ ｏ１１の外層摸口に沈着することを示した。

Ｌ≧’ｊ　（７）　ＬａｍＢはマルｒ−ス、マル〉デモスζりン輸送のホーリン で、ラムダバクテリγファージや：（：Ｏｆ：吸着する受容体としてｉ動く。こ のタンパク質は不モジニニテノに精製され（三Ｎ）Ｅ７８）、三量体としての機 能を示した（ＰＡＬＶ７９）。７アージ耐亡の突然夏異は各ファージを吸着する ＬａＩｎ　Ｂタンパク質部分を決定するために月いられた（ＲＯＡＭ８０．　Ｃ ＬＥＭ８’Ｌ、　Ｃ二ＥＭ８３．　ＧＥＨＲ８７）。

７ア一ジ受容体やマルトデキストリン輸送の機構を示す位相的なモデルが開発さ れた。そのモデルはこれらのドメインや外層膜の表面に関するそれらの位置を示 している（ＣＬ三Ｍ８ｉ、　ＣＬＥＮ８３、　Ｃ；（ＡＲ８４，ＨＥ！Ｎ８８） 　。

Ｌａ！ｌ：３は、もしも機構化したＮ末端配列が存在するなら、外層膜に輸送さ れる。さらに、成熟配列の最初の４９のアミノ酸が輸送の成功に必要である（Ｂ ＥＮＳ８４）。ＬａｍＢタンパク質部分色部分外層膜タンパク質であるＯｍｐＣ ，ＯｍｐＦ及びＰｈｏ三間の相間が検知され（ＮＩＫＡ８４）、そこにはＬａｍ Ｂアミノ酸３９〜４９と他のタンパク質の配列間の相同もあった。これらのサブ 配列器；、外層膜へ輸送のタンパク質を標識することになる。さらに、精製した ＬａｍＢで免疫感作したマウスから得た七ノクロナールｆＣ体は、はっきりした トポロジカルな、また機能的な、４つの領域を識別するのに用いられ、その２つ はマルトース輸送に関係している（ＧＡＢＡ８２）。

Ｓｅｅ、！　、！　、３：バクテリア細胞ｏｓｐ口への；ＰＢＤ挿入部位の選択 膜内在性タンパク質につきコードする配列に劇を融合するために、Ｐｈｏ＆ドメ インが、膜内在世タンパク質のどこに目遺伝子が挿入されたかに従って、局在化 される（ＢＥＣＫ８３．　ＭＡＮＯ８８）。

Ｊ！コち、もしも匹％が、サイトプラズマ不に通常みられるアミノ酸の後に挿入 されるのであれば、ＰｈｏＡはそのザイトブラズムロに＝現する。しかし、もし 凶がペリプラズムに通常見られるアミノ酸の後に挿入されるのであれば、：’ｈ ａＡドメインは膜のペリプラズム側に位置され、そこでアン刀−となる。Ｂｅｃ ｋｗｉｔｈと兵員研究者は（ＢＥＣＸ８３）、腹内在世タンパク質に対する遺伝 子に挿入できる囲還伝子にこの知見を拡張し、ニ遺伝子がどこに挿入されるかに よりサイトプラズマかペリプラズマかどちらか一方にＬａｃＺドメインを発現出 来るようになった。

ＯＳ？−１ＰＢＤ融合タンパク質は、外層膜の一部はよく整列されていないので 、グラム陰性バクテリアの外層膜で構造的役割を勇足させる必要はない。大きな Ｏ５Ｐには、融合を発現する細胞が細胞表面上に１ＰＢＤを顕示するように、士 が先端を切られ箪に融合される１つあるいはそれ以上の部位がありそうである。

もしも細胞上にＸを表示するため！２！Ｊ２７ラグメントと王７ラグメント間の 融合がなされたら、我々はＤＮＡ配列中の五を匣で置き換えることに；り箪遺伝 子をデザインすることができる。

そうでなければ、成９０ＭＰ−ＩＰＢＤ融合は、最良の男７ラグメントを１ｐｂ ｄに融合し、融合された遺伝子を発現させ、そして生じたＧＰをＩＰＢＤｉ！示 の表現型としてテストすることによりみつけられる。我々はＩＰＢＤが顕示され るだろうという可能性を最大にする汐と塵量の融合のポイントを調べるため、Ｏ ＭＰについて得られたデータを用いる。他の方法として我々は、答を数々の部位 で切断し、あるいは色々な長さのＯ５）　７ラグメントを産出するように切断し 、その庄７ラグメントを圧展に融合させる。

そして細胞表面にＩＰＢＤを顕示している所の、上記融合を発現している細胞を スクリーニングし選択する。更に別法として、ｏｍ２フラグメントの組堕への融 合＝のランダムＤＮＡの短いセグメンζを作り、ＩＰＢＤｉｉ示の表現型を示す メンバーの生じた多１１．ｖａｒｉｇａｔｅＣｉ：集団をスクリーニングし選択 する。

ｏｓｐ−１ｐｂｄ遺伝子のプロモータは、例えばイングロビルチオガラクトシド （ＬＰＴＧＸｌａｃ　ＵＶ５プロモータ）のようなり１さな化学誘発物質により 制御されるのか好ましい。それは天然のｏｓｐＸ伝千Ｓ釆である必要はない。い かなる制限バクテリアプロモータも月いることができる（ＭＡＮＩ８２）。

一旦増殖性バクチリア細胞を月いて遺伝子パッケージ系がデザインされたら、次 １：ＪＰＢＤを選択する（Ｓｅｃ、２）。

Ｓｅｃ、］、’１．４：バクテリア細胞に挿入されたランダムＤＮＡから凝ｏｓ ｐ遺伝子をｉｎ　ｖｉｖｏ選択 天然のＯ５？とＯＳ？口の挿入部位を選ぶ変法として、我々番＝次の要素から成 る遺伝子を構築することができる。丁なわち、ａ　）常ｊ隈プロモータ（例えば １ａｃＵＶ５）、ｂ）Ｓｉ１ｉｎｅ−Ｄａｉｇａｒ＊ｏ配列、Ｃ）ペリプラズム 輸送シグナル配列、ｄ）ランダムＤＮＡのセグメントと蛤塁遺伝子の融合（Ｋａ ｉｓｅｒらが行ったように（ＫＡ＋５８７））　、りスミ−７プフドン、そして 、ｆ）転写ターミネータ、以上。９０〜３００の塩基よりなるランダムＤＮＡは 多くのポテンシャル０ＳＴＳをコードする。（ＥＦ、　ＫＡＩＳ８７）　１ｐｂ ａとランダムＤＮＡの融合は、どちらが優位となってもよいが、迂因優位の方が 幾分好ましい。この方法で生成した集団からの嵐離体は、！ＰＢＤ顕示のために スクリーニング下ることができる。結合を介しての選択の方法が、０２面上に二 Ｐ３）を顕示するＱｐを選択下るのに月いられ、したがってこの方法Ｓ；、機能 ０ＳＴＳをコードするＤＮＡ挿入体を含むものである。

あるいは、Ｇｐのクローン単離体がＩＰＢＤｌｉ示の表現型のためにスクリーニ ングされてもよい。

ランダムＤＮＡのｒｐｂｄ優位への指向は、成功ＣＰ（！ＰＢＤ）を用いる方法 を考慮することから生じる。第３部で、我々はｏｓｐ−ｐ’ｏｄ遺伝子の自領域 に多くの突然変異を導入するが、そのあるものは無償性ストップコドンを含んで いる。もしも■がランダムＤＮＡに優先するなら、ｐｂｄの無償性ストップ；ト ンは、細胞表面に０５Ｐ−ＰＢＤタンパク質を何ら発現させないことになる。も しも２ｂｄがランダムＤＮＡの後に続くのなら、醸の無償性ストップコドンは細 胞表面上に不完全ながら０ＳＰ−ＰＢＤタンパク質を出現させることになる。不 完全タンパク質は、しばしば非特異的にステイッキイなので、不完全ＰＢＤを顕 示するＧＰは容易に集団からとり途くことができる。

５ｅｃ４．２＝　バクテリア胞子にｒ　ＰＢＤを顕示バクテリア胞子はＧＰ候補 として好ましい性質をもっている。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子はその表面でタンパク質を活動的に代謝もしないし変化も させない。しかしながら胞子は化学的試剤、物理的試剤に対して、増殖性バクテ リア細胞あるいは７アージよりもずっと抵抗性である。胞子は、胞子形成をひき おこす分子機構がＭ２Ｓの形成やＥ　−ＣＯ！　１の外層膜へのタンパク質輸日 よりも、うまく昨月しないという欠点をもっている。

Ｓｅｃ、ｉ、２．１：　ＧＰとして使用するに好都合なバクテリア胞子Ｂａｃ　 １ｌｕｓ属のバクテリアは、熱、放射線、乾燥そして！Ｉ世化学物質によるダメ ージに対して著しく抵抗左のある内生胞子を生成する（Ｌｏｓｉｃｋらにより概 説（ＬＯ５：８６））。これらの胞子は、種＃ＦＬ性で部分的にしか明らかにさ れていない複雑な構造と形態形成をもっている。下記の観察は遺伝子パフケージ としてＢａａ　１ｆｌｕｓ胞子の使用を受光であると下る。

グラスミドＤＮＡは一般的に胞子に含まれる。タンパク質をフードしたプラスミ ドはＢａｃｉｉｌｕｓ胞子の表面に観察される（ＤＥＢＲ８６）。胞子形成は、 ある程度分かっている複雑な時間統制を含んでいる（ＬＯ５＋８６）。いくつか の胞子形成プロモータの配列が知られておつ、このようなプロモータに操作的に リンクしたコード配列は、胞子形成の間にだけ発現する（ＲＡＹＣ８７）。

Ｄｃｎｏｖａｎらは、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ胞子コートのいくつかのポリペプチ ド組成を同定した（ＤＯＮＯ８７）。即ち、２つの完全なコートタンパク質の配 列と他の２つのアミノ末端フラグメントの配列が決定されている。この胞子のい くつかの組成は、例えば小さな酸可溶胞子タンパク質（ＥＲ］８８）といった前 胞子内で合成され、一方、他の組成は母細胞内で合成され、胞子（例えばコート タンパク質）内に現已する。合成の空間的機構は転写レベルで制御される。

胞子は自己集合するが、胞子の異なった部分に種々のタンパク質を局在させるシ グナルについてはよく理解されていない。

多分、胞子コート上に母細胞のサイトプラズムからコートタンパク質の貯蔵［ｄ ｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；を制御するシグナルがポリペプチド配ダｊ内に埋め込まれ るのであろう。ニートタンパク質の全てではないが、いくつかは前駆体として合 成され、胞子コーごに貯蔵される前に特異釣ボテアーゼにより処理される（ＤＯ ＮＯ８７）。野性型とはほんの少し異なる竺育胞子は、４つのコートタンパク質 のどれかｉつがたとえ欠けていてもＢ、５ｐｂｔｉｌ’ｉｓ内で産已される（） ＯＮＯ８７）。ジスルフィド結合が胞子内に生成される（チγ−ル還元刑が＝− トのタンパク質のいくつかを可溶化するのに必要である）。’５２ｋａのコート タンパク質、ＣｏｔＤ、は５個のシスティンを含む。ＣｏｔＤはまた異常に多く のヒスチジン（１６）とプロリン（７）を含む。１１に、コートタンパク質、Ｃ ０ＬＣ１はたった１個のシスティンと１個のメチオニンを含むのみである。、Ｃ ｏｔＣは９コのに−にジペプチドと１個の孤立したＫとして表れる１９コのリジ ンを（Ｋ）をもつ非常に異常なアミノ酸配列を持っている。その田の１０フば５ コのＹ−Ｙジペプチドとして表れる２０コのチロシン（Ｙ）がある。

Ｙとλに多く存在するペプチドは酸化的環境において交差結合することが知られ ている。ＣｏｔＣは１９債のＫに極めて近い１６ＤとＥのアミノ酸を有する。Ｃ ｏＬＣには、Ａ、Ｆ、Ｒ，＋、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｏ，ＳあるいはＷのアミノ酸はない ｏｃｏｔｃもＣｏＬＤのどちらも翻訳後に開裂しない。

タンパク質ＣｏＬＡ％ＣｏｔＢは、翻訳後開裂する。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ属からの内性胞子はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの外生胞子 よりもより安定である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓは４〜６時間で胞 子を生成するが、ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓの種は胞子形成するのに数日から数 週Ｖを要するだろう。さらに遺伝子の知識や操作法は胞子生成する他のバクテリ アよりもＢ、ｓｕ′Ｏｔ　ｉ　ｌ　ｉｅにつき、より開発されている。それ故Ｂ ａｃｉｉｊｕｓ胞子はＳｔｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓａ子よりもより好ましい。Ｃｌ ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のバクテリアもまた非常に耐性のある内生胞子を生成する が、非常に嫌気性生物であるクロストリゾイア（＝培養には不適である。Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ種の選択はクローニング系の知識を利用により支配され、又いかに容 易に胞子形成が制御されるにも支配される。１Ｍ株がＳｅｃ、　ｉ、ｉｏに挙げ た選択基準で選んである。多くの増殖生化学釣方法は胞子形成が初まるときに閉 ざされるので、補欠分子族が得られなくなる。

Ｓｅｃ、ｌ−２，２：　バクテリア胞子上にＩＰＢＤを顕示するに好都合な外面 タンパク質 もしもＧｐとして胞子が選択されたら、胞子タンパク質のプロモータは胞子コー トタンパク質が胞子上で合成され貯蔵されるとき、そして胞子コートタンパク質 が作られた特殊な場所で最も活性なので、プロモータは庄遺伝子の量もな重要な 部分となる。Ｂ、５ｕｂｌｉｌｉｓにおいていくらかの胞子コートタンパク質は 特定のプロテアーゼにより翻訳後処理される。０５Ｐ−ＩＰＢＤ融合の構築に、 特定のプロテアーゼを認識する配列が混合することを避けるために、前駆体と成 熟コートタンパク質の配列を知ることは価値あることである。成熟胞子コートタ ンパク質の配列は胞子コート内にそのタンパク質を貯蔵させるシグナルをもって いる。それ故成熟コートタンパクの配列のいくらかあるいは全てを含む遺伝子融 合はＩＰＢＤを顕示する表現型をスクリーニングし、選択するのに都合がよい。

部長あるいはｃｃｔＤの７ラグメントに臣西７ラグメントを融合することＣ＝、 ：？３Ｄを胞子コート上に比視させる傾向にある。遺伝子ｃｏｔｃとｃｏｔＤｉ ：：、ＣｏｔＣやＣｏｔＤが翻訳後開裂しないので、好ましい杢遺伝子である。

姐」あるいはｃｏｔＢからのサブ配列はＩＰＢＤがＢ、５ｑｂｔｉｌｉｓ胞子の 表面に表れるのをひきおこ丁ためにも用いられるが、これらのタンパク質では翻 訳後開裂がおこることを考慮しなければならない。ＤＮＡをコードしたＩＰＢＤ はコード化領域の末端かコード化領域の隠れた部位のどちらかにｃｏｔＡあるい はｃｏｔＢの７ラグメントを融合できる。胞子はそれからＩＰＢＤ顕示表現型に 対してスクリーニングされ、選択される。

現在までのところ、Ｅ、Ｃｏ１１のｌａｃプロモータとして外因性化学誘導物質 により誘導されたＢａｃｉｌｌｕｓ胞子形成は示されていない。

それにもかかわらず、胞子形成プロモータにより産巴されたタンパク質の量はＳ ｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列のＤＮＡ配列あるいはコドン使用のような外的 因子により制御される。

Ｓｅｃ、ｉ、２−３：　バクテリア胞子のｏｓｐへの１ＰＢＤの挿入部位の選択 胞子ｏＳＰへの挿入部位を支配する条ＰＩ＝、５ｅｃｔｉｏｎｌ−１，３で述べ たことと同様である。

Ｓｅｃ、１．２−４：　バクテリア胞子に挿入されたランダムＤＮＡから凝ｏｓ ｐ遺伝子のｉｎ　ｖｉｖｏ選択 胞子に関する条件は増殖性バクテリア細胞（Ｓｅｃ、１．１）について考慮した のと同じであるが、タンパク質が胞子上に表れる原因となる機構に関する情報は 不足している。それでランダムＤＮＡの使用はより魅力的である。

我々はａ）胞子形成プロモータを使用、そして、ｂ）ペリプラズムシグナル配列 は存在すべきでないということ、を除いてはＥ、Ｃｏ旦細胞にｒＰＢＤを結合さ せるのに上述のｉ、１．４の寅験法を用いることができる。

Ｓｅｃ、１．３　＝、７　ｙ−ジの外面にＩ　ＰＢＤを顕示Ｓｅｃ、ｌ−３，１ ，：　ＧＰとして用いるのに好都合な７アージバクテリア細胞や胞子とは異なり 、ファージの選択はＯ１２の三次元構造とキャプシド内の他のタンパク質とそれ ぞれがどのように梠互作用するかという知識に大きく依存する。ファージゲノム の大きなパッケージ機構は７アージゲノムそれ自身クローニングベクターなので また重要である。、姐ト止堕遺伝子は７アージゲノムに挿入できるにちがいない 。

それ故、 ｌ）ウィルス粒子は遺伝物質の挿入や置き換えを受けることができるに違いない 。そして ２）７アージのゲノムは扱いやすい操作にとって充分小さいに違いない。

ファージを選択する時ほかに考慮すべきことは、１）７アージの形態形成過程は ＩＰＢＤが折り畳まれる機会があるような環境を決定すること。

２）ｉＥ’ＢＤを含む必須ジスルフィドは細胞内には折り畳まれないこと。

３）ＩＰＢＤを必要とする大きなあるいは不溶性補欠分子族は、補欠分子族が欠 けているので、分泌されても折り畳まないこと。

そ−で ４）多様化（または変化）　：ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ’、が第３部に導入さｔ ’Ｌ６と、多電感染がハイブリッドＧ？を生成することができ、このＧＰはｉつ のＰＢＤに対する遺伝子をもつが、りなくとも異なったＰＢＤのいくつかのコピ ーをその表面に持つ。この確率は最小限にするのが好ましい。

バクテリ不ファージは完全な親７アージと結びつく酵素的能力が小さいか全くな いので、またその遺伝子はバクテリアホストの外部では不活性で、その結果成熟 ７アージ７ラグメントを代謝的に不活性にするので、ＧＰとしてすぐれた候補で ある。線状ファージＭｉ３とバクテリ不ファージＰｈ１Ｘｉ７４は、ことの外典 味がある。

〔線状７アージコ 通常のクローニングそして配列ベクターである線状７アージＭＸ３の全体のライ フサイクルはよく理解されている。Ｍ１３とｆ２は密接に関係しているので、そ れぞれに関することを両方の性質として考慮する（ＲＡＳＣ８６）。いくらか違 いがあるのは歴史的な正確性による。Ｍ１３の遺伝子的構造（完全な配列（ＳＣ ＨＡ７Ｂ）、１０コの遺伝子の同定と機能、そしてプロモータの転写と位置のオ ーダーは、ウィルス粒子の物理的構造同様よく知られている。コートタンパク質 の構造と機能については最近の解説ＲＡＳＣ８８をみよ６Ｍ１３に関連すること がらは例１に示しである。

ニバクテリオファージｐｈｉＸ１７４′Ｊバクテリ万ファージＰｈ１Ｘｉ７４は 遺伝学的にも、生化学的にも電子顕微Ｓ釣にも充分研兄されｔ；非常に小さな二 〒面体のウィルスである（Ｔｈｅ　Ｓｉｎｇｌｅ−５ｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　 Ｐ’＋ａｇｅｓ（ＤＥＮＨ７８）をみよ）。

今ミ；で、Ｐｈ１Ｘ１７４からのタンパク質はｘ＠回折では研究されていない。

Ｆ’ｈｉＸ１７４は殆どどんな追加的ＤＮＡも受け入れないことからクローニン グベクターとして用いられない。このウィルスはいくつかの遺伝子がオーバーラ ツプする程ギッシリと閉じ込められているｅＣｈａｍｂｅｒｓら（ＣＨＡＭ８２ ）は遺伝子且での突然変異体はホストがこのタンパク質を供給するようにプラス ミド上に存在する野性型且遺伝子により救助される。

Ｐｈ１Ｘ１７４の３つの遺伝子生成物は成熟ウィルス粒子の外部に存在する。Ｆ （キャプシド）、Ｃ（ウィルス粒子ｌ偏につき６０コのコピーの大スパイクタン パク質）モしてＨ（ウィルス粒子につき１２コのコピーの小スパイクタンパク質 ）である。Ｇタンパク質は１７５のアミノ酸から成るが、Ｈは３２８のアミノ酸 より成っている。Ｆタンパク質はウィルスの１本鎖ＤＮＡと相互作用する。タン パク質Ｆ、Ｇそして■はウィルス感染細胞の単一のメツセンジャーＲＮＡから翻 訳される。

［大さなりＮＡファージ］ ラムダあるいはＴ、のような７ア一ジｉ＝Ｍ：３あるいはＰｈ１Ｘ１７４よりも 大きなゲノムをもつ。大きなゲノムは小さなゲノムよりも便利には取り扱えない 。しかしながら大きなゲノムをもつ７アージはもしも遺伝的操作が便利に行える のなら用いることができる。ラムダやτ４のファージは、選択できるより多くの Ｏ５？を持つ′ｉ２３やＰｒｒ　ｚ　Ｘ　１ハよりも複雑な三次元キャプシド構 造をもつ。ラムダ７アージフイルス粒子や丁４７アージウイルス粒子は、ＩＰＢ Ｄ要才１の大きな、あるいは不溶性の補欠分子族がこれら７アージの表面に折り 畳まれるように、細胞内的に生成する。しかしながら、ラムダ７アージや７，７ アージはＦ：；シいものではないが、これらファージの誘導体はこうした欠点を 克服するように構築下ることができる。

ＲＮＡ　７アージ ＱベータのようなＲＮＡファージは、ＲＮＡの操作がＤＮＡの操作程筒単ではな いので、好ましくない。コンピテントＲＮＡバクテリオ７アージは好ましくない が、有用な遺伝子的に変化させたＲＮＡ含有のパーティクルは、例えばＭＳ２の ように、ＲＮＡファージから得ることができる。

ＭＳ２をＣＰとして使うため、組ト狂匡遺伝子がタンパク質キャプシドに適合す ることができるように、大抵の天然のウィルス性ゲノムをとり除く必要がある。

もしもコートタンパク質が存在すれば、Ａタンパク質はＲＮＡ含有パーティクル の生成をひきおこす÷ＲＮＡの鎖の５′末端の部位に配列特異的に結合すること が知られている。もしもＡタンパク質結合部位を有するメツセージ、′およびコ ートタンパク質やＰＢＤのキメラに対する遺伝子が、Ａタンパク質や野性型のコ ートタンパク質（両方ともプラスミドのｔＩＩＩ節遺伝子から産出されるが）を も含む細胞内で産＝されたなら、キメラタンパク質をコードするＲＮＡがパッケ ージされることになる。そのＲＮＡによりコードされたタンパク質によりカプセ ル甲にとじこめらｆ−ＲＮＡのパッケージは、そのパッケージ内の遺伝メツセー ジが外部のあるものを特定化する主たる判断基部を満足する。パーティクルその ものは竺きてない。ＳＢＤをもつパッケージを単離した後、次のことをする必要 がある。

二）：？ＮＡをタンパク質キャプシドより分離する２）ＡＭＶあるいはｕＴｖの 逆転写ｉＳ＃素を用いてＤＮＡ内にＲＮＡを逆転写する ３）採取した遺伝メツセージを配列その他の操作のためにプラスミド内にサブク ローン化するのに充分となるまで、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ（Ｒ）を数サイクル 行ってＤＮＡを増幅する。

それともなければ、助人７アージが凰離した７アージを助けるため用いてもよい 。

５ｅｃ−２，３，２：　７アージにＩＰＢＤを顕示するのに好都合な外面タンパ ク質 所与のバクテリオファージに好ましいＯ１２は、ファージ表面に、通常、最多数 でコピーが存在するものがよい。というのは０５Ｐ−ＩＰＢＤの野性型Ｏ５Ｐに 対する比率を変えるのに最も融通性があり、；た、満足できるアフイニティ分離 が得られる可能性が最大だからである。しかも、１または数個のコピーに存在す るタンパク質は、通常、形態形成あるいは感染の本質的な機能を果たすからであ る。付加あるいは挿入で、このようなタンパク質を突然変異させることは、ＣＰ の生存率を減じる結果となる傾向にある。

釣Ｉ：作り已された工遺伝子に挿入することができる。Ｇ？がＭ１３のとき使用 されるのに好ましいＯ１２は、遺伝子ＩＩＩタンパク賃である（例１をみよ）。

Ｓｅｃ、１．３．３：　Ｏ１２へのＩＰＢＤの挿入部位の選択使用者は囲遺伝子 フラグメントを挿入するのに候補Ｏ５Ｐ遺伝子守の部位を選択しなければならな い。多くのバクテリオファージのコートは高度にオーダーされている。それ故バ クテリアや胞子の場合とは異なり、バクテリアファージにおいては工学的に作成 された０５Ｐ−ＩＰＢＤ融合タンパク質口の親のＯ１２の残基の全部あるいは大 部分を保持することが重要である。ファージ蛍遺伝子にニ遺伝子を挿入するのに 好；しい部位は、ａ］ＰＢＤがそのもとの形の千に折り畳まれている、１０）Ｏ ５Ｐドメインかもとの形の口に折り畳まれている、そして、Ｃ）これら２ドメイ ン間に津薔がない、ものであることである。

もしもＯ１２のアミノ末端あるいはカルボキシ末端のどちらかが溶媒中に露呈し ているファージの三次元モデルがあるなら、その成熟ｏＳＰの露出した末端は、 止屡遺伝子の挿入の第一の候補となる。三次元モデルの低い解像で充分である。

三次元構造が欠際しているときは、成熟Ｏ５Ｐのアミノ末端とカルボキシ末端が １ｐｂｄ遺伝子の挿入に最もよい候補となる。機能的な融合は、ドメイン間の好 ましくない相互作用を避けるため、ＸＦ’ＢＤとＯ５Ｐドメイン間に付加的残基 が必要となろう。ＩＰＢＤあるいは０５Ｐｌ：、［同なタンパク質の特異的三列 をコードするランダム配列のＤＮＡやＲＮＡは、もし必要なら、Ｏ５；）７ラグ メントと箪７ラグメンｊ、　Ｓ１１に挿入できる。

Ｏ５？内のドメイン境界での融合も、ａ栃左融合を得るよい方法である。Ｓｍ１ ｔｈは、異種ＤＮＡをｆｌの遺伝子Ｉ１１にサブクローニングしｔことき、その ような境界をみつ１７だ（ＳＭ！丁８５）。

ドメインを蔦定するにはいくつかの方法がある。原子コ万ディネートよる方法は ＪａｎｉｆｌとＣｈｏｔｈｉａ（ｊＡＮｉ８５）により解説されティる（ｊＡＮ ａ５）。ＲＯ５Ｅ８５、Ｆ？ＡＳＨ８４、Ｖ　Ｉ　ＴＡ８４　、　？ＡＢＯ７９ 、ＰＯＴＥ８３．そシテＳＣＯτ８７も参照せよ。

得られる構造情報が候補Ｏ５？アミノ配列だけなら、我々はターンとループの予 想にこの配列を用いることができる。いくつかのループとターンは正確に予想で きる高い可能性がある（、Ｓｈ。

ｕ、　Ｆａｓｉｍａｒｓ　（ＣＨＯＵ７２）　）　＠　これらの位置、−１ｏｃ ａｔｉｏｎｓ；はまた鐵竺選云子７ラグメントの挿入候補となりえる。

Ｓｅｃ、１−３−４：　バクテリア胞子にランダムＤＮＡ挿入体からの凝−〇Ｐ Ｓ遺伝子の生体内選択 別法として、機能挿入部位は、多くの組換構築物を生成し、また表現を特徴確認 により機能菌株を選択することによって決定できるだろう。０５Ｐ−ＩＰＢＤは ７アージコートにおいて構造的役割を充足するにちがいないので、圧展遺伝子に カップリングされるどのような特定のランダムＤＮＡ配列も、機能的にコート内 に適合する融合タンパク質を生成するとは思えない。それにもかかわらず、コー トタンパク遺伝子の大きなフラグメントζ壮大遺伝子間に挿入されたランダムＤ ＮＡは、生きているファージの外部にｉＰＢ、）を顕示する１つあるいはそれ以 正のメンバーを含むｆｉ　（ｃ４にある集＝を産出するだろう。ｉ、１．４で定 義したのと同様、開示プローブが構築されてランダムＤＮＡ配列が適尚な部位に クローン化される。

Ｓｅｃ、２：　！ＰＢＤの選択 １ＰＢＤは天然から得られるタンパク質か、天然にえもれるタンパク質のドメイ ンから選択される。あるいは第一の原理からデザインされる。デザインされたタ ンパク質ば、次の点を有するなら、天然のタンパク質より有利である、即ち、ａ ）デザインされたタンパク質がより安定、ｂ）デザインされたタンパク質がより 小さい、そして、Ｃ）デザインされたタンパク質の電荷分布がもっと当山に特性 化できる。

候補ＩＰＢＤは次のようゝな規準を充足しなければならない。即ち、１）使用し ようとする条件下で安定（ドメインは、たとえばＢＰＴＩのように、挿入される タンパク質全体を成す）、２）アミノ酸配列の知識が得られる、３）外面上の残 基と、その空間的相互関係とを貝定、そして、４］ＰＢＤに扁い特異的親和性を 持つＡｆＭ（ＩＰＢＤ）分子が利用できること、である。

ＩＰＢＤは必要以上に大きくないのが好ましい。というのはその方が、相対的に 小さなアミノ酸配列甲に制限部位をアレンジすることが容易だからである。これ ら要件全てを満足する候補ＩＰＢＤの有用世は、以下に述べる情報が入手可能か どうかにかかつている。

上記ｊＰＢＺｌ適合性を判断するのに月いられる情報は、１）三次元構造（強く 好まれる知識）、２）ＩＰＢＤに相！の１または２以上の配列（相間配列が知ら れていればいる程Ｊい）、３）ＩＰＢＤノｐｉ（する場合には必要な知識）、４ ）温度、ｐ　Ｈｌｉ；：びイオン強度の１関数としての安定性と溶解性（広範囲 に安定で、使用しようとする条件で可溶性であるのが望ましい）、カルシウムイ オンやマグネシウムイオンのような金属イオンに対する結合能（それ自身の結合 能を知っている方が好ましいが、知らなくてもよい）、６）もしあるなら酵素活 性（知っている方が；いが、それ自身の活性が用いられ、問題上なるかも知れな い）、７）もしあるなら結合特性（知っている方がよい、特異的結合もまた知り ている方が好ましい）　、８）ｉＰＢＤｉ：対する特異的で強い親和性（Ｋ、＜ １０つ１Ｍ）をもつ分子が入手可能であること（好ましい）、９）特異的で９く らいの親和性（１０−８Ｍ＜Ｋ、＜’、Ｏ−＠Ｍ）をもつ分子が入手可能（好ま しい）、１０）アフイニティ分子に結合しないＩＰＢＤの突然変異体の配列（好 ましい）、そして、１１）可視のＵＶ、ＮＭＲ等の吸収スペクトル（特性吸収を 知ることは好ましい）といったことである。

もしもＩＰ：ｌＤに対するアフイニティをもつ分子（ＡｆＭ（ＩＰＢＤ））の− スピーシーズだけが入手可能なら、そのスピーシーズは次のことをするのに用い られる。即ち、ａ）（、？表面にＴ　ＰＢＤを検知する、ｂ）！！買上のアフィ ニティ分子の発現レベルと密度を最適化する（Ｓｅｃ、１Ｏ−１）、そして、ｃ ）アフイニティ分離の感度と効果を決定する（Ｓｅｃ、１０．２と１０．３）、 以上である。しかしながら、上に見られるように、ＩＰＢＤに対して１つｔ；高 くもう１つは田くらいのアフイニティをもつＡｒＮ（Ｉｒ’ＢＤ）の２スピーシ ーズが得られることが好ましい。高いアフィニティをもつスど一シーズ１＝、最 初の検知において月いられ、感度と効果とを決定するのに月いられる（Ｓｅｃ、 ｉｏ、２とｉｏ、３）。そして午くらいのアフィニティをもつスピーシーズは最 適化に月いる（１０．１）。

りなくとも２０コの候補１ＰＢＤについて（＝二の清報が得られている、あるい は寅捺上得られている。例えば、ウシの膵臓トリプシン阻害物質（ＢＰＴ　Ｉ　 、　５８〕の残基）、クラムビン（４６コの残基）、オボムコイドの第三のドメ イン（５６コの残基）、Ｔ４リゾチーム（１６４：の残基）、そしてアズリン（ １２８）の残基）である。

本発明の処理によりＰＰＢＤかも得られるＰ３Ｄの多数は、溶媒の方に向いた側 鎖基をもつ残基に影響する。露呈した残基は広範囲のアミノ酸を受け入れるが、 埋もれた残基はこの点に関しては、より制限されている（ＲＥＩＤ８８）。表面 突然変異は典型的にはＰＢＤ（７）　！！！点にり一さな影響を持つだけである が、ＰＢＤの安定性を低下させるだろう。それ故選択されたＩＰＢＤは高い融点 をもつべきである（６０℃なら許容されるが、高ければ高い程よい）。そして広 い範囲のｐＨ域（８，０〜３．０は許容される。１１．０〜２．０なら好ましい ）で安定であるべきで、そうすれば突然変異や選択〜結合工程による選択ＩＰＢ Ｄから得られるＳＢＤは、充分な安定性を保つだろう。種々のＰＢＤを産出する ＩＰＢＤでの置換は５０℃以下にドメインの融点を低めないのが好ましい。

ターゲット分子の２つ一般的特性、即ち大きさと電荷は、ターゲラｉに特異的に 結合する誘導体を生成下るのに他のクラスよりも；ＰＢＤの一定のクラスの方が より有効である。これは極めて一般的特性であるので、全てのターゲットを６ク ラスに分けることができる。即ち、ａ）大きな１ｌｊＩ性、ｂ）大きな９性％Ｃ ）大きな陰性、ｄ）少さな陽性、ｅ）小さな中性、そして、ｆ）小さな陰性であ る。　ＩＰＢＤの小さな集合は、その１つあるいはいくつかは、ターゲットの上 記各クラスに該当するものであるが、選択されたターゲットのいずれにとっても 好都合な候ＭＩＰＢＤを含むだろう。

それともなければ使用者は、特定のターゲットに対するＧＰ（ＩＰＢＤ）を工学 することを選ぶことができる。Ｓｅｃ、２．ｉはＩＰＢＤの選択におけるターゲ ットの大きさと電荷に関する基準を示している。

Ｓｅｃ、２．１＝ＩＰＢＤの選択におけるターゲットの大きさの効果もしもター ゲットがタンパク質や他の高分子であるならば、ＩＰＢＤの好ましい具体例とし てはＢｏｓ　ｔａｕｒｕｓからのＢＰＴＩ（５８個の残基）、プドクの種子から のクラムビン（４６コの残基）、あるいはＣｏｔｕｒｎｉｘ　ｃｏｔｕｒｎｉｘ 　Ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｆ３本のウズラ）からのオボムコイドの３番目のドメイン （５６コの残基ＸＰＡＰＡ８２）のような小さなタンパク質である。なぜならこ のクラスからのターゲットは高い特異性で小さなタンパク質を収容できるフレ７ 　）　［ｃｌｅｆｔＳ］やグループ［ｇｒｏｏｖｅｓ］を持っているからである 。もしもターゲットが例えばデンプンのような簡潔構造を持たない高分子ならば 、あたかも分子として取り扱うべきである。たとえばコラーゲンのような明確な 三次元構造をもつ広がった高分子は、大きな分子として扱われるべきである。

もしもターゲットがステロイドのような小さな分子ならば、（二２４コの残基） 、Ａｓｐｅｒｇｉｌｉｕｓ　ｏｒｙｚａｅからのりボヌクレアーゼ（ｉ０４コの 残基）、Ｇａ１ｌｕｓ　ｇａｌｉｕｓからのニワトリ卵の白いリゾチーム（１２ ９コの残基）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからのアズリン （１２８）の残基）、あるいはＴ４リゾチーム（１６４コの残基）、以上の大き ざのタンパク質である。というのは、これらタンパク質は小さなターゲット分子 に適合するフレツーやグループをもっているからである。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋは、これらタンパク質の三次構造をもっ ている。Ｔ４リゾチーム程大きいタンパク質をコードする遺伝子は、この発明の 目的のため通常の技術で操作することができる。

もしもターゲットが鉱物であって水に不溶だと、その鉱物の分子表面の性質を考 慮しなければならない。（結晶シリコンのように）なめらかな表面は、充分な接 触領域と特異性とを持つように、ＩＰＢＤとして（リボヌクレアーゼのような） 大きなタンパクープがある表面は、小さなタンパク質（ＢＰＴＩ）か、あるいは 大きなタンパク質（Ｔ４リゾチーム）のどちらでも結合できる。

Ｓｅｃ、２．２：　ＩＰＢＤの選択に及ぼすターゲット電荷の効果同符号の電荷 をもつ分子閘の静電気的反発は、高度に相補的表面を持つ分子が結合するのを防 げる。それ故、用いようと思う条件下では、ＩＰＢＤとターゲット分子とは異符 号の電荷をもつかどちらか一方は９性であるか、のどちらかであることが好まし い。異符号のイγンの含有は、静電気反発を軽減するか、あるいは取り除く。

Ｓｅｃ、２．３：　１ＰＢＤの選択に関するその他の見解もしも選択されたＩＰ ＢＤが酵素なら、活性部位の１つあるいはそれ以上の残基を、不活性な酵素機能 に変える必要がある。例えば、もしもＩＰＢＤが１リゾチームで、ＧＰがＥ、Ｃ ｏ１１細胞あるいはＭ２Ｓならば、リゾチームが細胞を溶解させないようにリゾ チームを不活性化する。一方、もしもＧＰがＰｈ１Ｘ１７４であるなら、Ｔ４リ ゾチームは悪影響なしにＥ、Ｃｏ１１＆［Ｉ胸肉で過剰生産でき、また、Ｐｈ１ Ｘｉ７４が細胞内で生成されるので、リゾチームを不活性化する必要がない。Ｃ Ｐまたはそのホストに有害な酵素ＩＰＢＤを、突然変異体アミノ酸で、その活性 部位の１個または２以上の残基で置き換えることにより、不活性化することが好 ましい。ＩＰＢＤののもとの酵素活性を失活させるため変換された残基のＩｌｌ または２以正を変化させることは許される。活性酵素をコードする￥ｐ−ｐｂｄ 遺伝子を受けるＧＰは死ぬかもしれないが、大部分の配列は消失しないだろう。

Ｓｅｃ、３：　ＯＣＶの選択 ＯＣｖは例えばｌ０ＫＢよりも小さい方がよい。カセット式変異誘発がＯＣｖで 実行されるのが望ましい。好ましくは、ＯＣｖをカットしない制限酵素が、少な くとも２５個得ることができるのがよい。

−末鎖変異誘発が実行可能なことも同様に望ましい。最後にｏＣＶは選択マーカ ーをもつのが好ましい。適当なＯＣｖは入手可能であり、あるいは入手可能なベ クターを操作することによって、工学的に作ることもできる。プラスミドとの遺 伝子は、クロモンーム遺伝子よりもずっと容易に構築できるか変異させられるの で、プラスミドの方がバクテリアのクロモソームよりよい。

−ジゲノムに挿入されなければならない。

Ｍｉ３のような７アージについては、抗生物質耐性遺伝子がゲノム内に工学的に 操作される（ＨＩＮＥ８０）。Ｐｈ　ｉ　Ｘ１７４のようなピルレント７アージ （Ｉｇ性７アージ、溶菌ファージ）は、選別でさる識ヌｌノ可能プラークを作る 。この場合は耐性遺伝子は感層でない。さらにＰｈ１Ｘ１７４のウィルス粒子に はいかなる新しい遺伝ることができないということは、スクリーニングできるＧ Ｐの数を制限するので、不利である。

ＣＰ（ＩＰＢＤ）は、ＷＬＧＰにキャリイされていない選択マーカーを持つこと が望ましい。ｖｔＧＰがＣＰ（ＩＰＢＤ）にキャリイされていない選択マーカー を持つこともまた望ましい。

Ｓｅｃ、４：　ａｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子挿入のデザイン我々はＩＰＢＤが発現す るとき、ＩＰＢＤをＧＰ画面上現出させるアミノ酸配列をデザインする。このア ミノ酸配列は姐ト江匡遺伝子のコード領域全体を決定するかも知れないし、ある いは、それはランダムＤＮＡがクローン化される制限部位に隣接した囲配列のみ を含むものかも知れない（Ｓｅｃ、６．２）。

実際の遺伝子はどのような方法でも生産できよう。囲セグメントから誘導したー セグメントは、第３部で述べる方法で容易に遺伝子的に操作できるにちがいない 。合成囲セグメントの方が、耐性部位の置換ｊｐ　Ｉａｃｅｒａｅａ　ｔ　’ｊ を最大限制御できるので、；り好ましい。

ＣＰに必要とする０５Ｐ−ＩＰＢＤはどれくらいの量か、そして、ｂ）どれだけ 正確にその量を制御しなければならないか、ということである。

アフイニティ分離の本質的機能は、ターゲットに対して高いアフイイティのＰＢ Ｄ（ＩＰＢＤから誘導した）をもつＧＰを、ターゲットに対して低いアフイイテ ィのＰＢＤをもつＧＰから分離することである。もしも塩濃度を高めていくとい うような溶出液のグラジェントが条件を変化させるものであるなら、全ての弱結 合性ＰＢＤは、強結合性ＰＢＤのいずれかが結合を止める前に、結合しなくなる だろう。ａｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の制御は、全てのパッケージがＳｅｃ、１５で記 載した良好な分離をもたらすのに十分なＰＢＤを顕示するようなものでなければ ならない。もしもＰＢＤ／ＣＰの量がアフィイティマトリックスからＣＰの溶離 量に影響があるなら、ＧＢＤ／ＧＴ量を正確に制御する必要がある。次の分析は 、溶離量とＩ　ＰＢＤ／ＣＰの強い直線関係はないことを示し、ただ、ａ）全て のＧＰは同じ大きさであること、ｂ）ＰＢＤと７フイイテイマトリツクス間の相 互作用は、ＧＰの異なった溶離を支配すること、ｃ）その系は平衡であること、 そして、ｄ）いかなるＩＧＰ上にあるＰＢＤも全て同じであるということを推測 させる。

もしもＮｐがＣＰ上のＰＢＤと同じなら、各Ｎｐｌ：ターゲット分子にアクセス を持ち、各ＰＢＤはデルタＧ、ターゲットに結合する自由工２ルギーをもち、そ のときの結合の全自Ｓエネルギーは、デルタＱｂ”’ｍＮ、　＊デルタＧ、であ る。

デルタＧ、は、１）イ万ン濃度、２）ｐＨ，３）温度、４）シｌ糖、ブドウ糖、 エタノールのようなＣＦ性溶質濃度、５）カルシウム、酢厳塩、安息香酸塩、ニ コチン謙塩のような特殊なイオン、以上のような溶媒のパラメータの関数である 。もしも条件がアフィニティ分離の開に変えられたら、デルタＧ、はゼロに近付 き、デルタＧ、゛°“はＮｐ倍速くゼロに近づく。デルタＧ、“°′がＯに近付 き、またはそれ以上になるにつれて、パッケージは固定化ターゲット分子から解 離し、溶離する。　゛ より多くのＰＢＤをもつＧＰＩ＝、同じＰＢＤをより少なくもつパッケージより も、結合・非結合間を速く遷移する。平衡条件では、遷移の＝点は個々の相互作 用をゼロの自白エネルギーにもたらす溶液条件だけで決定される。ＰＢＤ／ＧＰ の殻は遷移のシャープさを決定する。

ＰＢＤ／にＰの数は、遺伝子的に同一のＧＰ（ＰＢＤ）のサンプルがＧＰ画面上 様々な数のＰＢＤをもつＧＰを含むように、生理学的条件を整えることにより通 常影響されることにも注意しなければならない。ＧＦ’（ｖｇＰＢＤ）の集団に おいて、各ＰＢＤ配列はｌコ以上のＧＰに現出し、そして実際のＰＢＤ／Ｃ，Ｐ 数は、一定の範囲内で各ＣＰごとに異なる。ＰＢＤの多様化（変えられた）集団 内で、ＰＢＤ、をターゲットに対して最大のアフィイティをもつＰＢＤと仮定し よう。もしもＰＢＤ／ＧＰの数の溶離量にｌ線的影響があるとすると、ＰＢＤ、 の最大数をもつＧｐは、カラム上に最も長く保持される。多くなっＩ；集団を培 養すると、Ｇ？ＣＦ’ＢＤ、）が増幅され、様々な数のＰＢＤＸ／（、Ｐをもつ 新しいＧＰ（ＰＢＤｘ）を増加させる。このように、本発明のアフィニティ分離 処理は、ターゲットに対下る強い結合が偶然的にほんのわずかの数しかＰＢＤを ＣＰ上に顕示させるのでないなら、ＣＰ（ＰＢ））の溶離量に対するＰＢＤ／Ｇ Ｐ数の直線的効果を許容することができる。

ｉ？ＢＤ／ＣＰ数と溶離量には直線的効果はないので、ＩＰＢＤ／ＧＰの高度に 正確な制御の必要性は必要でない。再生できる遺伝子発現は、構築された遺伝子 要素よりは制御された遺伝子要素を用いてより容易に制御できる。上述の分析は ＧＰ（ＩＰＢＤ）はバッファ中の溶液間で平衡で、アフイイティマトリックスに 結合することを推測させる。溶離速度は、アフイニティ力ラムクロマトグラフイ では重要なパラメータであろう。アフィイティマトリックスからのバッチ溶離あ るいはアフイイティプレートからの溶離で、各バッファがアフイイティマトリッ クスと接触している時間は重要な変数である。マトリックス上の７フイイテイ分 子密度は、アフイニティ分離を最適化するのに重要な変数である。

上述の分析は定性的なので、具体例を示したＳｅｃ、１０で我々は実験的に次の 事項を最適化する。即ち、１）ＧＦ面上のＩＰＢＤの密度、２）アフイイティマ トリックス上のアフィイティ分子の密度、３）初期のイオン強度、４）溶離速度 、および、５）カラム上に乗せられる礎質容量に対するＧＰ量、である。

遺伝子発現の転写制御はよく知られ、最も効果的なので、我々はプロモータに焦 点を絞った。多くのプロモータは、培養媒体に加えられる特定の化学物質によっ て制御できることが知られている。例えば、イソプロピルチオガラクトシドが培 養媒体に、例えば１．０μＭから１０　、０ｍＭのＶで加えられると、１ａｅＵ Ｖ５プロモータが導入されることになる。以下、我々Ｃ＝遺伝子の発現を誘発す る化学物質に対する遺伝子的用語としてＸ１ＮＤＵＣＥ“を用いることとする。

もしも姐と江匡遺伝子の転写がＸ１ＮＤＵＣＥで制御されるなら、ｃｐ尚たりの ０ＳＰ−ＩＰＢＤの数は増加下る。これはＸＩＮＤＵＣＥ濃度は生きているパッ ケージの数が減夕するまで増加することが、観察でき、あるいは十分なＩＰＢＤ が採集したＧＰ（ＩＰＢＤ）の表面に観察されるまで。

ＧＰ当たりの０５Ｐ−ＩＰＢＤの最大数に影響する特質は、基本的に性質上構造 的である。もしも０５Ｐ−ＩＰＢＤが全ての野性型ｏｓＰに置き換えられると、 ＩＦ’ＢＤ間に立体軍書や望ましくない相互作用があるだろう。０５Ｐ−ＩＰＢ Ｄの法外なレベルも、ＧＰの溶解性や形態形勢に悪影響するだろう。ｍ胞のＣＰ やウィルスのＧＰに対しては他の１定化分子にアフィニティをもつタンパク質の たった５ｍという僅かなコピーがアフィニティ分離で成功している（ＦＥＲＥ８ ２ａ、　ＦＥＲＥ８２ｂ；ＳＭＩＴ８５）。

プロモータ制御に関して他に考慮することは、匹と並ｂｄ１７）ｆｌｌＪ御範囲 全範囲ことが後で役立つということである。（Ｓｅｃ、８）特に、ＸＩＮＤＵＣ Ｅが存在しないことが、いかにＧＰ画面上ＩＰＢＤの不在を導くか、を決定すべ きである。こぼれないプロモータが好ましいのである。こぼれないということは 有益である。なぜなら、ａ）ＡｆＭ（ＩＰＢＤ）に対するＧ　Ｐ　（旺ト止堕） のアフィニティはｏｓｐ−４ｐｂｄ選云子によるということを示すこと、そして 、ｂ）扛ｊ上閥の発現が不毛なら、Ｘ：ＮＤＥＣＥのないところでＧＰ　（籠り 見回）の成長を許すからであるａ　Ｌａｃ　：　＠リプレッサと連携する＋ａｃ ＵＶ５プロモータは好ま−い例である。

Ｓｅｃ、４．２：ＤＮＡ配列のデザイン本発明は遺伝子デザインの単一の方法に 限ったものではない。

次の！１４１作は本発明の必要性を充足する遺伝子デザインの一つの方法の例で ある。

もしも０５Ｐ−ＩＰＢＯのアミノ酸配列が確定していれば、全体の遺伝子を構築 できる（Ｓｅｃ、ｂ、ｉ）。もしランダムＤＮＡが１ｐｂｄに融合されるのであ れば、いわゆる顕示プローブが最初に構築される。

次に、ランダムＤＮＡは、機能ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子が生体重選択あるいは罵 様の方法で同定される所の推定上のｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子の集団を完成させる ように挿入される（Ｓｅｃ、６．２）−ｐ’ｐｄ　ＤＮＡ配列の特定部位に突然 変異を容易に、正確に導入できる限りにおいてｔ；、正確な遺伝子融合を産生さ せるためいかなる遺伝子工学的方法も用いることができる（Ｓｅｃ、１４．１） 。しかしながら、ここで考慮される突然変異の方法に対しては、０５ｐ−ｉｐｂ ｄ遺伝子のＤＮＡ配列は、ＯＣｖにある他のいかなるＤＮＡとも異なっているに ちがいない。必要な相異の性質と程度は、突然変異の方法により決定できる。Ｆ ＢＩ）をコードするサブ配列をｖｇＤＮＡで置換すると、突然変異されるべきサ ブ配列は、ＯＣｖ内で独特な制限部位に結合させられるにちがいない。もし−末 鎖オリゴヌクレオチドで誘発される突然変異が用いられるのであれば、ＩＰＢＤ をコードするサブ配列のＤＮＡ配列はＯＣｖ内で独特なものになるにちがいない 。

制御要素としては、ａ）プロモータｂ）ＳＴｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列、 モしてＣ）転写ターミネータ、があり、天然から単離されるか、あるいは天然の 制御領域の共通配列の知識からデザインすることができる。

合成されるべき遺伝子フード部分は、そのタンパク質レベルでデザインされ、Ｄ ＮＡにコードされる。アミノ酸配列は次のような種々の目標を達成するために選 択される。即ち、ａ）ＢＰの表面上にＩ　ＰＢＤを表示、ｂ）ＩＰＢＤの電荷の 変化、モしてＣ）１個のＳＢＤを選択するためのＰＢＤ集団の生成、である。遺 伝子フードのａｍｂｉｇｕｏｕｓ（あいまい）さ、は制限部位の最適なプレイス メントを可能にし、変えられたコドンにアミノ酸の色々な分布を作り出すのに利 用される。

Ｓｅｃ、４．３＝特異的ＤＮＡ配列の割り肖てコンピュータプログラムが、使用 者が指定したアミノ酸配列をフードするあらゆる考え得るａｍｂｉｇｕｏｕｓＤ ＮＡ配列を同定するのに、また、どこで部位特異的制限酵素の認識部位がアミノ 酸配列を変えることなく供給され得るのか、その場所を同定するのに、用いられ る。

制限部位は、部位間の最も長いセグメントができるだけ短くなるようにａｓｐ− ｉｐｂｄ遺伝子内に位置される。付着末端を産生ずる酵素が好ましい。意図した ホストのコドン優位性とメツセンジャＲＮＡの二次構造もまた考慮される。

Ｓｅｃ、５．１：　遺伝子合成の組織化遺伝子合成について確定された戦略（＝ 、２０かも５０個のヌクレオチド（ｎｔｓ）の重なり合った（以下、「オーバー ラツプ」とも言う）セグメント田の遺伝子全体の両方のストランドを合成するこ とである（　Ｔ三ＥＲ８８）。我々はｖｇＤＮＡの合成にとってより適切な別法 を選んだ。我々の方法はこれまでの方法（ＯＬＩＰ８６．０ＬＩＰ８７゜ＡＵＳ Ｕ８７）と次の点で異なる。ａ）２つの合成鎖を用いる、そしてｂ）拡大したＤ ＮＡを真田で切断しない、とい点である。我々の目標は、ａ）ｒｉ販のＤＮＡ合 成装置で５ｓＤＮＡとして合成されるものよりもｄｓＤＮＡのより長い一片を生 成すること、そしてｂ）−木調ｖｇＤＮＡに相補的な鎖を生成することである。

２つの合成鎖を用いて３′末端の回文配列要求を取り腺〈。

ＤＮＡ合成装置は１００ｏｔｓｔでのオリゴｏｔｓを首宵できる収率（ＮＯ、、 −：００）で生成することができる。パラメータＮ、（効率的アニーリングを得 るのに必要な重なりの長さ）と、パラメータＮ、（制限酵素が平滑末端ｄｓＤＮ Ａの宋端近くで切断できるに必要なスペーサー塩基の数）とは、ＤＮＡと酵素の 化学により決定される。Ｎ−１０、および、Ｎ、−５がよい値である。

我々は合成されるべきＤＮＡ配列を、はとんど等しい２つの部分に分割した、そ の各々は全体の長さの半分より５〜８塩基長くさせ、多様化塩基を含まないｌＯ から１６ｂｐ（Ｎ、）の２部分間でオーバーラツプがあるようにした。このオー バーラツプは、好ましくは互文でなく、高いＧＯ含量をもつのがよい。我々はそ のオーバーラツプ部分と各鎖の５′拡張鎖を合成する。これらの鎖がアニーリン グされ、Ｘｌｅｎｏｗ酵素と全ての４つのＮＴＰとで完成されると、我々は＝滑 末端ｄｓＤＮＡとしての望ましい配列を得る。

もしもＤＮＡが付着天端をもつ他のＤＮＡに連結されるのであれば、５から二〇 コの（Ｎ、）塩基がその天端に加えられる。合成ｄｓＤＮＡはそれから連光なｆ ｇＩ限酵素で効率よく切断できる（ＯＬＴＰ８７）。

Ｍｏｍｈは厳格に１００に１定されないので、全体としての通常の制１ｉ９０　 （−２Ｎｏ、１Ａ−Ｎ、）ｎｔｓと各７ラグメンごでのｌＯＯという値は厳格な ものではなく、５あるいは１０ｎｔｓのＩ囲で越えることができる。１９０と１ ００の制限を越えると、収率が低くなるが、ある場合には容認できる。

Ｓｅｃ、５．２＝　ＤＮＡ合成と精製法太発明はＤＮＡ合成や構築のいかなる特 定な方法に限ったものではない。好ましい具体例として、ＤＮＡＩ：　Ｍｉ　ｌ 　ｌ　ｉｇｅｎ７５００ＤＮＡ合成機で標準的な方法合成皮できる。Ｍ　ｉ　１ １　ｉ　ｇｅｎ７５００はホスホラミン塩の入った７つの薬ビンを持っている。

即ち、最初の４コはＡ１０％丁、モしてＧを含む、他の３つの薬ビンは、イノシ ンや塩基の混合物のような通常でない塩基を含み、いわゆる“汚れた容器”とい われる。標準のン７ト７エアは２．３あるいは４コの塩基を等量ずつ混合するよ うにプログラムしである。

本発明は遺伝子工学に対してＤＮＡを精製するいかなる特定な方法に制限するも のではない。ＩＢＴ装置（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｎｎｏｌ ｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）でのアガロースゲル電気永動 と電気溶離が大きなｄｓＤＮＡフラグメントを精製するのに好都合である。万す ゴｒｉｔｓに対しては、Ｅｐｉｇｅｎｅ装置　（Ｅｐｉｇｅｎｅ　Ｃｏｒｐ、Ｂ ａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）による電気溶離やＰＡＧＥを’ｒｌ？Ｌｃに代えるこ とができる。

Ｓｓｃ、６．ｉ：　ｏｃｖへの既知Ｏ５？−１ｐｂｄ選伝子のクローニング都合 のよい方法として、合成遺伝子（＝標準法（ＭＡＮＩ８２．　Ｐ２Ｓ５）あるい は少し改良した標準法でバクテリア細胞内に形質転換されたプラスミドを用いて 構築することができる。またΣりに、天然から誘導されたＤＮＡフラグメントは 天然から誘導されたＤＮＡフラグメントやあるいは合成りＮＡ　７ラグメントに 操作的に結合させることができる。好よしい方法の多くの場合遺伝子合成は完全 な遺伝子の大きな７ラグメントをもつ一連のプラスミドの構築を含む。

Ｓｅｃ、６．２：　Ｘｉ示プローブへのラングＡＤＮＡ（ポテンシャルａｓｐ） のクローニング もしもランダムＤＮＡ　（’表現型選択、あるいはスクリーニングが、ＧＰ（Ｉ ＰＢＤ）を得るために用いられるのであれば、顕示プローフ乙にデザインされた 制限部位の１つにランダムＤＮＡラフローン下ることができる。

ランダムＤＮＡは色々な方法で得ることができる。退化した合成りＮＡも１つの 候補である。また、凝ランダムＤＮＡを天然から得ることもできるだろう。例え ば、もしもｓｐｈ　１部位（ＧＣＡＴＧ／Ｃ）がｉｐｉ：＋ｄ７ラグメントの１ つの末端にある顕示プローブにデザインされたら、ＤＮＡを一部消化するため、 ＡＴＧ　３’突出部をもつ多種類の７ラグメントを生成するＮ１ａｉｌｌｒ　（ ＣＡＴＧ）を用いるだろう。

顕示グローブは、ランダムＤＮＡがどちらかの末端にクローン化されるように、 １ｐｂｄ遺伝子の各末端で異なった制限部位を狩つのが好；しい。

２示プローブをもつプラスミドは、：Ａ＝な制限酵素により消化され、７ラグメ ント化されたランダムＤＮＡは、標準的な方法でアニールされ連結される。連結 されたプラスミドは成長した細胞を形質転換するため使用され、また抗竺物質耐 性遺伝子の発現のため選ばれる。プラスミドを持つＧＰは、まるでターゲットで あるかのようにＡｆＭ（４ＰＢＤ）を用いて、本発明のＳｅｃ、１５で述べた方 法により、ＩＰＢＤ顕示の表現監に選ばれる。Ｓｅｃ、１５では、結合しない大 きな集団から、ターゲットに結合するＧＰ（ＰＢＤ）を単離することをデザイン する。

Ｓｅｃ、７：　ＧＰの採集 細胞は、連結した。Ｃｖで形質転換され、ＯＣｖ上の選択性マーカーに、ｌｉな 試剤で連光にインキュベーションした後、ＯＣｖの取り込みに対して選択される 。ＧＰは、例えば、ＧＰを小球状にする遠心分離、その小球にされたものを無菌 媒体（細胞）田、あるいはバッファ（胞子あるいは７アージ）ＣＦで、再懸濁す るという、手元にあるＧＰに連光な方法で採集される。

Ｓｅｃ、３：　！％Ｉ示法の立証 採集されたパッケージは、次に、その表面にＩＰＢＤを顕示するかがテストされ る。その場合、Ｉ　ＰＢＤあるいはＡｆ）ｊ（ＩＰＢＤ）の安定性に必須なもの として知られているイオンや補因子が、適当なレベルで含まれていなければなら ない。テストは、ａ）アフイニティ標識により、ｂ）酵素的に、Ｃ）分光光度的 に、ｄ）アフイニテイ分離により、あるいは、ｅ）アフイニティ沈澱により、な される。

この段階でのＡｆＭ（１：’ＢＤ）は、ＩＰＢＤ分子に強いアフイニテイ　（好 まシくは、Ｋ＝＜ｉｏ−目Ｍ）、ＩＦＬＧＰには−Ｎさいか皆無のアフィニティ を狩りように選ばれる。例えば、もしもＢＰＴ；がＩＰＢＤならば、ごリプ・ン ン、アンヒドロトリプシン、あるいはＢＰ　Ｔ　ｆの抗体が４３ＰＴＩの存在を テストするＡｆＶ（Ｂと１）として用いることができるであろう、１９５番目の セリンが、デヒＪロアラニンに！換されたトリプシンの誘導体であるアンヒドロ トリプシンは、タンパク質分解作用を持たないが、ＢＰＴ　Ｉに対するアフィニ ティを保臂している（ＡＫＯＨ７２；　ＨＵＢＥ７７）。

Ｇ？面正のＩＰＢＤの存在は、ＩＰＢＤに高いアフィニティを秀つ可溶性の！！ されたＡｆＭ（ＩＰＢＤ）の誘導体の使用でもって示すことができる。Ａｆ）ｊ （ＩＰＢＤ）の標識された誘導体は、ＡｆＭ（ＩＰＢＤ）と記載される。

もしもランダムＤＮＡが用いられたなら、Ｓｅｃ、１５の操作がＩＰＢＤ顕示表 現監をもつクローン化された単離体を得るのに使われる。

別の言い方をすればクローン化された凰離体は、ＩＰＢＤ！！示表現型かどうか スクリーニングされる。この段着のテストは、これらクローン化された単離体の １つあるいはそれ以上に適用される。

もしもアフィニテイ分子に結合する単離体がないならば、Ｓｓｃ、９に述べられ ている修正を行う。

１つまたは２以上のテストが、ＩＰＢＤの６２面に顕示されていることを示して いるなら、ＩＰＢＤに既知のアフィニティを持つ分子の結合が、次にかかげるよ うな通常の！！伝子的、生理学的技術を使用してキメラｏｓｐ−１ｐｂＩｉ遺伝 子に依存Ｔることを立証する。

二）口５ｐ−ｉｐＯｄが結合しているかを立証下るため、親のＣＰに。５ｐ−１ ９６遺伝子を転移する。

２）。５ｐ−ｉｐｂｃｉの欠衆が結合能の欠除になるかどうかを立証するため、 単離されたＧＰから０５ｐ−ｉｐ’ｏｄ遺伝子を消量する。

３ＸＰノＡ、ｊ（ＩＰＢＤ）ヘノ結合は、こＸ１ＮＤＵＣＥ〕ｉ：ｇＭｔル（コ ノ場合ｏｓｐ−ｉｐｂａの発現は［：Ｘ１ＮＤＵＣＥ）により制御される）こと を示す。

そして ４）ＡｆＭＣＰＢＤ）に対するＧＰの結合は１定化Ａｆ）ｊ（ＩＰＢＤ）に特異 的で支’４礎質には特異的でないことを示す。

２？ＢＤのＧＰｉｌＩ上での存在は、ＣＸ　Ｊ　ＮＤＵＣＥ二と、次のようなＩ ＰＢＤ量に１線的に関係する作用との間の強い８関関係によって表示される。即 ち、（ａ）可溶性ＡｆＭ（ＩＰＢＤ）によるＣ、Ｐの結合、ｂ、）ＩＰＢＤによ りひきおこされる吸着、モしてｃ）ＩＰＢＤの生化学的反応、である。

結合はＡｆ）Ｊ（ＩＰＢＤ）に対して起こるという記述（４）と、遺伝子テスト （′、）と（２）は重要であるが、Ｌ　ＮＤＵＣＥによるテスト（３）はそれ程 重要ではない。

構築を決定するため、我々はいくつかのクローン化した単離体のそれぞれから関 連する１ｐｂｄ遺伝子７ラグメントの配列を決定する。

我々は選ばれたＡｆＭ（ＩＰＢＤ）にＧＰ（ＩＰＢＤ）が結合する最大塩濃度と ｐＨを決定する。

もしもＩＰＢＤがＣＰの外部に顕示され、その顕示が導入された０Ｓｐ−１ｐ′ ３ｄ遺伝子に；り明らかにひきおこされているなら、我々は第２部に進む、そう でなければその結果を分析し、連光な修正法を採用する。

Ｓｅｃ、９：　Ｈ示系の完成 もしもｉｐＭフラグメントを天然のＯＳＰ　７ラグメントに融合させようと試み るのなら、次のような選択肢がある。

工）ｍ　ｏｓｐに対して異なった融合を次の方法で選択する。即ち、 ａ）ａｓｐの反対の末端を用いる、 ｂ）例えば３フか４コの残基を増やして、融合守にｏｓｐからのより多くのある いはより少ない残基を保つ、ｃ）！Ｅ知のあるいは予想されるドメイン境界を試 みる、ｄ）予想されるループあるいはターンの位置を試みる、２）異なったｏｓ ｐを選択する。あるいは３）ランダムＤＮＡ法に切りかえる。以上である。

もしもランダムＤＮＡ法が不成功に終わったなら、次のような選択肢がある。

１）ｉｐｂｄ７ラグメントとランダムＤＮＡ間の異なった関係を選択する（ｉｐ ｂｄを初めに、ランダムＤＮＡを２番目に、あるいはその逆のＩＩ） ２）部分消化の異なる度合、部分消化のための異なる酵素、せん断の異なる度合 、あるいは天然のＤＮＡの異なる起源を試みる。

あるいは ３）天然ＯＳＰ法に切りかえる。以上である。

もしも現在のＧＰの全ての納得い＜　ＯＳＰを試み、そしてラング１５＼Ａ法を 試み、両方とも成功−ないのなら、新しいＧＰを選択下る。

Ｗｃ２部 Ｓａｃ、二ａ、’、ｏ：　アフイニティ分離法第２部で我々はアフィニティ分離 系を最適化Ｔる。そしてそれは、ターゲット番＝対して増加したアフィニティを もつＰＢＤを顕示する（、Ｆ’（ＰＢ））に対するＧＰ（ｖｇ？ＢＤ）の集！を 増大させるのに第３部で月いられる。

アフイニティクロマトグラフイは好；−い手段であるが、ＦＡＣ５，電気泳動、 その他の方法もまた用いられる。

Ｓｅｃ、ｉｏ、１：　アフイニティクロマトグラフイ分離のｆｋＭ化溶＝溶媒の 濃度を変化させるとカラムからＧＰが溶離される。

しかしながら、溶離量はもっと容易に測定され、特定化される。

溶と溶媒の濃度はＣＰを解離させる試薬であり、溶出溶媒濃度は溶離量と特定の グラジェントから計算できるということを理解すべきである。

特定の溶離状況を用いて、ＡｆＭ（ｉＰＢＤ）を支持するアフィニティーカラム でＣＰ（ＩＰＢＤ）の溶離量をｖｔｃＰの溶離量と比較する。比較は次のような 色々な点につき行われる。ａ）＋ＰＢＤ／（、Ｐ量、ｂ）ＩＩ質容量（ＤｏＡＭ ｏＮ）に対するＡｆＭ（ＩＰＢＤ）の密度、Ｃ）初期のイオン強度、ｄ）溶離速 度、ｅ）担体容積に対するＣＰ量、ｆ）ｐＨ，そしてｇ）温度、である。という のはこれらは分離の感度と効率に最もよく影響するからである。そこで我々は最 もよい分離をする条件を選択した。

我々はｐｈや温度を最適化しない、それよりもむしろｐＨと温度の二またｌ；２ 以上の値のその他のパラメータを最適値を記録下る。使用者により特定化された 意ヌされた使用条件１：（Ｓｅｃ。

１ユ）、ｐＨまたは温度の特定化を含む。もしもｐＨがｓ４足化されているなら 、ｐＨはカラムから溶離＝変化しないだろう。ｐＨをひさくすることは礫質から 結合したＧ２を切り離丁のに使用できるだろう。もしも使用しようとする条件が 温度を特定しているのなら、溶離中その特定した温度でアフィニティカラムを行 うが、回収中では温度を変えるかも知れない。

ＡＦＭ（ＩＰＢＤ）はＩＰＢＤに対して一程度のアフィニティ（Ｋ、は１０−’ Ｍからｓｏ−”Ｍの範囲）をもつことが知られており好ましい。ＧＰ（ｖｇＰＢ Ｄ）の集！がバラバラにされると、大まかに３つのサブ集Ｊになるだろう。即ち 、ａ）結合をもたないサブ集団、ｂ）ある結合をもつが高濃度の塩あるいは低い ｐＨで洗い落とすことができるサブ集団、モしてｃ）Ｌつかつと結合し、それ自 身救助されるサブ集！である。上記Ｃ）からｂ）を分離Ｔるのではなく、上記ｂ ）からａ）を分離するためのパラメータを最適化する。ＰＢＤｗをターゲットに 弱い結合を持つＰＢＤとし、ＰＢＤ、を強い結合を持つＰＢＤと仮定する。例え ば高いＤｏＡＭｏＭは、ＧＰ（ＰＢＤ、）の保持に好影響を与えるかもしれない が、生育できるＧＰ（ＰＢＤ、）を溶離することを非常に困難にする。我々は、 ＧＰ（ＰＢＤ、）の放出を許すのではなく、ＧＰ（ＰＢＤ、）を保持するために 、アフイニティ分離を最適化するだろう。

なぜならしっかりと結合したＧＰ（ＰＢＤｓ）はそれ自身の生育によって救助さ れ得るからである。もしもＤｏＡＭｏＮが溶離量に強く影響するのなら、第３部 で、ＳＢＤがターゲンーに対して中程度に強いアフィニティ（ＬはｒＯ−”Ｍの オーダー）をもつことがわかれば、アフィニティ力うム二のターゲット量を減じ る。

この過程で我々は、Ｕｖ吸収で検出できるシャープなバンドとしてのアフイニテ ィマトリックスから溶離する遺伝釣に純粋なＧＦ’の溶離容量を測定する。溶出 する７ラクシ３ンから得た標品は適当な媒体（細胞あるいは胞子）あるいは感度 のよい細胞（融合）ヤコロニーあるいはプラーク上にプレートされる。

ＩＰＢＤ／ＣＰ、　ＤｏＡＭｏＭ、溶離速度、初期のイオン強度、および、ロー ディングの数個の値が調べられる。我々は、ＩＰＢＤ／ＧＰとＤｏＡＭｏＭの最 適値は相関し、それ故、−緒に最適化すべきであると予想する。初期のイオン強 度、溶離速度、礫質容量に対するＧＰ量の効果は、そんなに強く相関していない ようなので、それらは個々に最適化できる。

テストされるべきパラメータの各セットのために、カラムは一定方法で溶離され る。例えば、我々は溶離法１という方法を用いることができる。これはＫＣＩグ ラジェントが、ＣＰ（ＩＰＢＤ）の生存率を０−０５Ｖ、Ｃｖｏｉｄ　ｖｏｌｕ ｍｅの略で、無効量のこと）の１００フラクシ璽ンを許容する最大値まで１０ｍ Ｍから開始して続け、（使用された量）０、Ｑ５Ｖｖの１００：のフラクション でＧＰ（ＩＰＢＤ）生存率に対してＫＣＩグラジェントが、１００ｍＭから許さ れる最大量、次いで最大許容量のＫＣＩで０．０５Ｖｖの２０コのフラクション をとる。この時のバッファのｐＨは、Ｔｒｉｓのような都合のよいバッファで特 定値に保ｔ；れる。この最適化の条件は、ターゲットへの結合の選択（Ｓｅｃ、 ｉ５．３）に第３部で用いられる条件に類似で、また、クロマこグラフィー系か らの６２の採集に第３部で用いられる条件と寛じであることが重要である（Ｓｅ ｃ、ｉ５．４）。

ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子がＸＩＮＤＵＣＨにより規制されているなら、ＩＰＢＤ ／ＧＰ　！：　Ｘ　：　ＮＤＵＣＥを変化させることにより制御される。χＩＮ ＤＵｃＥの適米僅は、ＸＩＮＤＵＣＥとプロモータを同定することに依存する。

例えば、もしもＸＩＮＤＵＣＥがイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で 、プロモータが１ａｃＵＶ５なら、ＩＰＴＧ濃度１１０．０．１Ｂ、　１．Ｏｕ Ｍ、　１００−ＯｕＭ、　１．（ＬｎＭがテストにとって適当なレベルである。

　ＸＥＤＵＣＥの変化範囲は、最適値が得られるか、発現の許容できるレベルが 得られるまで、拡張できる。

ＤｏＡＭｏｌｊは適切な過程にあるこのレベルの１％あるいは０，１％に優賞物 質が結合できる最大値から変わる。我々は分離効率は粗い調整でＤｏＡＭｏＭの 広範囲の値をカバーし、粗い調整で大まかの最大値の近辺を明らかにするように ＤｏＡ！ｊｏＭのなめらかな関数になるだろうことを予期する。

最初のイオン強度のいくらかの値は１、ＯｗＭ、５．０ｍＭ、１０．０ｍＭそし て２０、ＯｍＭで試験された。

溶離速度を達成できる最大値からその値の１７６まで前の値の１／２づつ変化さ せた。よい分離を与える最も速い溶離が最適値である。

最適化の目標は、塩濃度を増加させるか、ｐＨ値を下げるか、またはこの２つの 組み合わせ、によりひきおこされる結合ＣＰと非結合Ｇ　？　贅のシャープな遷 移を得ることである。この最適化は、ａ）使われる各温度、ｂ）使われる各ｐＨ 、モしてＣ）新しいＣＰ（１ＰＢＤ）が主成した時に対して寅行されるのに必要 である。

規制できるプロモータは多分バクテリア胞子を致いて全ての遺伝子パッケージに 対して得られる。バクテリア胞子に機能的なプロモータは胞子形成プロモータと 規制可能なバクテリアプロモータ（例えば１ａｃ）のハイブリッドを構築するこ とによりあるいは胞子形成プロモータの飽和突然変異ひきつづいて規制できるプ ロモータの活性（ＯＬＩＰ８６．０ＬＩＰ８７）により調整される。

ｏｓｐ−ｉｐｂｃｌ遺伝子のプロモータが得られないのなら我々はＤｏ　ＡＭ　 ｏＭ　ｓ溶離速度、そして礫質容量に対するＧＰ量を最適化する。もしも最適の アフィニティ分離が受け入れられないものであるときは、ＣＰ尚たりのＩＰＢＤ 量を変化させる手段を開発しなければならない。

Ｓｅｃ、１０．２：　アフイニティ分離の感度の測定式々はアフイニティ分離の 感度（Ｃ，、、。）を、大過剰のｗｔＧＰの存在下で検出されるＧＰ（ＩＰＢＤ ）の最小量測定により決定する。

使用者は、増大工程が断念される前に寅行される分離サイクル回数−−Ｎｔｋ＋ ｅ＋ｅａ−一を選択する−　Ｎ、ｈ、−ｌ：６〜ｌＯ回の範囲にあり、４回より も大きくなければならない。増大工程はＮ。２０．回通過する前に、望ましいＣ Ｐ（ＩＰＢＤ）を単離Ｔることにより終了される。

感度の測定はもしもＧＰ（ＩＰＢＤ）とｗｔＧＰが異なった選択マーカーをもつ なら著しく迅速に旭理される。

ＣＰ（ＩＰＢＤ）とｗｔＧＰノ混合物１：ｉｌ：Ｖ、、、比テｆｌｉ整さレル。

：：　ＴＶ。

１．とは受光範囲、通常、ＩＱＩＩ〜ｌＯ４、の該肖因子（例えば１／１０）に わたる。Ｖｌ＋＋ｍの大きな僅がまずテストされる。一旦、１つの値に対して肯 定的な結果が得られるとＬｌ＋ｍのそれより小さな値についてテストする必要は ない。各混合物はＩＰＢＤに高いアフィニティをもつＡＲＭ　（ＩＰＢＤ）であ る最２１！ＤｏＡＭｏＭを保持するカラムに適用される。モしてカラムは特定の 溶日溶媒組成で溶離される。

生きたＧＰをもつ最後の７ラクシ璽ンとカラムの硬質物質の植え°　込みを培養 する。もしもＧＰ（ＩＰＢＤ）とｖｔＧ？が異なった選択マーカーをもっている なら、選択プレートへの転送は各コロニーを同定する。また別にＧＰコロニー単 離体の数（例えば３２）はＳｅｃ、８で議論した手法でＩＰＢＤの存在に対して テストされる。

もしもＩ　ＰＢＤが単離されたどのＣＰの表面でも検出されなければ、ａ）生き たＧＰを含む最後のいくらかの（例えば３から５）のフラクシ璽ン、そしてｂ） カラム硬質から取り出された接種材料から供給される。供給されたＧＰは培養さ れ、同じカラムを通し上述の方法でＧＰ（ＩＰＢＤ）濃度を高める。この工程を Ｌ　ｋ　ｒ　ａ　ｓがカラムから溶離するまで、あるいはＩＰＢＤがＧＰに検出 されるまでくり返される。

もＬｔ　モＮ＠ｋｔａ＊回通過後もＧＰ（ＩＰＢＤ）が検出されなイノナら、Ｌ ｌｍは減少し、この工程がくり返される。

Ｃ，、、、ｌｊｌ、に、、、Ｊ内４：ＧＰ（ＩＰＢＤ）’ｅ使用者が採取できる ｖ１３．の最高値に等しい。ＧＰ（ＩＰＢＤ）を単離するのに必要なりロマトグ ラフイサイクル（Ｋ、、、）数はＣａ１ｆの粗い見積もりを与える。Ｃ１１，は およそｖｌ、の平方根のＫｔｔｇ倍である。

Ｃ，＋　＋　＝　（ａｐｐｒｏｘ）　ｅｘｐｃ（ｌｏｇ＊ｃＶ＋　＋＊）／Ｌ、 を例えば、モシモｖ１１．が４ＸＩＯ暑で、ＧＰ（ＩＰＢＤ）の単離に３つの分 離サイクルが必要ならば、Ｃｅ　＋　＋ＩＩ（ａｐｐｒｏｘ）７３６となる。

Ｓｅｃ、ｉｏ、３：　分離効率の測定 Ｃ１ｌ、をもつと正確に決定するｔ；め、我々は溶離後およそ等しい量のＧＰＣ Ｉ　Ｆ’ＢＤ）とｔｔＧＰを産生するＡｆＭ（Ｊ、’３Ｄ）カラム上ｊ：、！！ 開されたＣＦ’（ＩＰＢＤ）／ｗｔＧＰ比を決定する。

５ｅｅ−１０，４：　他の分離流 値の分離法もアフィニティクロマトグラフィで用いたのと同様な方法で最適化さ れる。

Ｆ　Ａ　Ｃ５（例えばＢｅｃｈｔｏｎ−Ｄｉｃｉｌｎｓｏｎ　Ｍｏｕｎｔａｉｎ 　Ｖｉｅｗ、ＣＡから得られるＦＡＣ５ｔａｒ）は、バクテリヤ細胞や胞子にと って最適である。というのはこの機械の感度が、分離を成就するため各ＣＰに結 合した蛍光標識分子を約１０００コ必要とするからである。ＣＰのＦＡＣ５分離 を最適化するため、我々は蛍光性分子で標識されたＡｆｍ（ＩＰＢＤ）誘導体− −Ａｆｍ（ＩＰＢＤ）＊−−を用いる。最適化されるべき変数はａ）ＩＰＢＤ／ ＣＰ量、ｂ）ムｆｍ（ＩＰＢＤ戸濃度ＮＣ）イオン強度、ｅ）ＧＰ濃度、モして ｅ）ＦＡＣ５装置の操作に関するパラメータである。Ａｆｍ（ＩＰＢＤ）本とＧ Ｐは溶液千で相互作用するので、結合はＡｆｍ（ＩＰＢＤ）＊濃度と表示された ＩＰＢＤ濃度の両方に直線関係にある。これら２つのパラメータは共に変化する 方が好ましい。他のパラメータは個々に最適化される。

バクテリオファージは小さいので電気泳動が最も適している（ＳＥＲＷ８７）、 電気泳動はもしもターゲットが小さくてそのターゲットをカラムあるいは蛍光性 標識物に化学的に結合させることが全体のターゲットを変化させることになると き、好ましい分離いかなる結合によっても必須的に変化する。り四ツ酢酸イオン に結合するＧＦ’はこのイオンに結合しないＧＰより陰性の電荷をもつようにな りこのクラスのＧＰは分離されるだろう。

電気泳動を最適化するパラメータはａ）ｉＰＢＤ／ＧＰ、　ｂ）例えばアガロー スのようなゲル物質の濃度、ｃ）Ａｆｍ（ＩＰＢＤ）の濃度、ｄ）イオン強度、 ｅ）電気泳動装置の大きさ、形、冷却能力、ｆ）電圧と電流、モしてｇ）ＣＰの 濃度を含む。Ｉ　ＰＢＤ／ＧＰ比とＡｆｍ（ＩＰＢＤ）濃度は同時に変化させ他 のパラメータは債々に最適化される。

第３部 Ｓｅｃ、１１−０：　ターゲット物質の選択いかなる物質もターゲット物質とな り得るが、次のような制約を受ける。もしもアフィニティークロマトグラフィー が用いられるのなら、 １）ターゲット物質の分子はアフィニテイ分離に適当な固体の担体に適用される 効果的な大きさと化学反応性をもたなければならない。

２）硬質適用後はターゲット物質は不と反応してはならない。

３）硬質適用後はターゲット物質は非特異的な様式でタンパク質と結合あるいは タンパク質を分解してはいけない、そして４）ターゲット物質の分子はその分子 が優賞に結合してもタンパク結合に必要な表面領域（りンカーに結合する原子を 啄いて、一般的には少なくとも５００人２）を残す程度の大きさでなければなら ない。もしもＦＡＣ５がアフィニティ分離手段に用いられると、ｌ）ターゲット 物質の分子は適当な蛍光色素やそれ自身蛍光剤であるターゲットと共役するに効 果的なλきさと化学反応性を持たなければならない。

２）任意の必要な蛍光剤で標識後は、ターゲットは不と反応してはいけない。

３）任意の必要な蛍光剤で標識後、非特異的な様式でタンパク質と結合あるいは タンパク質を分解してはならない、そして４）ターゲット物質の分子はその分子 が適当な色素に結合してもタンパク質結合に必要な表面領域（りンカーと結合し ている原子を旅いて、一般的には少なくとも５００Åりを残す程度の大きざでな ければならい。もしもアフイニティ電気泳動が用いられたなら １）ターゲットは荷電しているから、タンパク質に対する結合がタンパク質の電 荷を変化させるような性質のどちらかを持っていなければならない。

２）ターゲット物質は水と反応してはいけない。

３）ターゲット物質は非特異的な様式でタンパク質と結合あるいはタンパク質を 分解してはいけない、そして４）ターゲットは適当なゲル物質と一緒に使用でき るものでなければならない。

可能なターゲット物質は次に列挙したものを含むが、それに限定はされない。

ａ）可溶性タンパク質（クマ心朦ミオグロビン、ヒト好田球二うスターゼ、活性 化（血液凝固）因子ｘ１アルファ７ニトタンパク質、アルファインター７ニロン 、メリチン、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、ｐｅｒｔ＊５ｓｉｓのアデニレート、シク ラーゼ＠葉、任意のレトロビールス性ｐ０１プロテアーゼ、あるいはレトロビー ルス性ｇａｇプロテアーゼのようなもの）、 ｂ）リポタンパク質（ヒト低密度リポタンパク質のような）、Ｃ）グリコタンパ ク質（モノクローナル抗体のような）、ｄ）リボポリサッカランド（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｅ；ｎｅｒｉｔｉｄｉｓのＯ抗原のような）、 ｅ）核酸（輸送ＲＮＡ　、リボソマールＲＮＡ、メツセンジャーＲＮＡ、多分配 列特異性をもつｄｓＤＮＡのような）、ｆ）可溶性の有機分子（フレステローノ 呟アスパルテーム、ビリルビン、モルフイン、コディン、シクロロジ７ニニルト リクロロエタン（ＤＤ丁）、ベンゾ（ａ）ピレン、プロスタグランジンＰＧＥ２ 、プロトポルフィリンゴ、あるいはアクチノマイシンＤのような）、ｇ）有機金 属錯体（鉄ヘムやコバルトヘムのような）、ｈ）有機ポリマー（セルロースやチ チンのような）、ｉ）不溶性鉱物（アスベスト、ゼオライト、ヒドロキシルアパ タイトのような、 ｊ）ウィルスあるいはファージのコートタンパク質（インフルエンザへマグチニ ンあるいは７アージラムダキヤプシドのような）ｋ）バクテリア撲あるいは外層 膜タンパク質（Ｅ、ｃ口１１からのＬａｍＢあるいは鞭毛タンパク質のような） 、以上。

純粋なターゲット物質の数ミリグラムの供給が望まれる。不純なターゲット物質 も用いることが可能かも知れないが、そのときはターゲットと結合するかわりに 　雑物と結合するタンパク質が得られるかも知れない。

次に示すようなターゲット物質に閣下る情報が高く要求される。

１）温度、ｐＨ，イオン強度の関数としての安定性、２）尿素や塩化グアニジン のようなイγン不米の大きな陰イオン塩に対する安定性、 ５）ヘムやカルシウムイオンのようなイオンやあるいは補欠分子族の要請、そし て ６）もしあるならタンパク質分解作用 この最も望ましい情報に加えて、１）もしもターゲットが高分子なら、ターゲッ トの配列、２）ターゲットの三次元構造、３）もしあれば酵素活性、モして４） もしあれば毒素を知ってｌ／％ることは有用である。

本発明の使用者は結合タンパク質を使用しようと企てるときあるパラメータを特 定化するべきである。

１）許容できる温度範囲 ２）許容できるｐＨ範囲 ３）イオンや中性溶質の許容濃度 ４）ターゲットとＳＢＤに対する最大許容解離定数ＫＴ富〔ターゲット）（ＳＢ Ｄ）／ニターゲット：　ＳＢＤ〕場合によっては使用者はＴ、即ちターゲットと Ｎ１即ち非ケーゲット開の区別を要求するかも知れなし・。

Ｋア−〔Ｔ　〕Ｃ３ＢＤ二／　ＣＴ　：　５ＢＤＪでＫＮｓｃＮＪ　Ｃ３ＢＤ； ／〔Ｓ　：５ＢＤＪならにア／Ｌ−（：Ｔ）ＣＮ　：５ＢＤＥ）バ（Ｎ　〕ＣＴ 　：ＳＢＤ〕）となる。

使用者はそれからにア／ＫＮ比に対して最大許容値を特定する。

もしもターゲットが通常のプロテアーゼなら、次の点を考慮丁べきである。

Ｘ）高特異的プロテアーゼは他のターゲットと澗じように処理できる。

２）ズブチリシンのような通常のプロテアーゼは０ＳＰ−ＰＢＤを含むＣＰ上の Ｏ５Ｐを分解するかも知れない。通常のプロテアーゼを取り扱ういくつかの別法 はａ）化学阻害物質をタンパク質分解を防ぐために用いる（例えばフェニルメチ ルフルオロスルフアート（ＰＭＦＳ）はゼリンのプロテアーゼを阻害する）、ｂ ）ｉつあるいはそれ以上の活性部位残基を不活性タンパク質を作るために変異さ せることができよう（例えば、活性なぞリンをアラニンに変異させたゼリンプロ テアーゼ）、あるいはｃ）１つあるいはそれ以上のタンパク質の活性部位アミノ 酸を触媒作用をなくするように化学的に修飾することができよう（例えば活性な ゼリンをアンヒトロゼリンに変異したゼリンブロテアーゼ）３）プロテアーゼに 結合するために選ばれたＳＢＤは阻害剤である必要はない。ひょっとしてプロテ アーゼターゲットを阻害するＳＢＤはプロテアーゼターゲットに結合する非常に 小さなサブセットである。４）我々がターゲットプロテアーゼを修飾すればする 程、ターゲットプロテアーゼを阻害するＳＢＤがより得にくくなる。そして ５）もしも使用者がＳＢＤがタープ・７トグロテアーゼを阻害することを要求す るならターゲットプロテアーゼの活性部位は必要以上に修飾してはならない。変 異や化学杓修飾で不活性イヒすることは不活性化の好ましい方法でありタンノく り質のプロテアーゼ阻害剤がＩＰＢＤの第１候補となり、例え１ビ、不発明の方 法で、ＢＰτＩをトリプシン以外のプロテアーゼと結合するよう番；変異させる ことができる（ＴＡＮＫ７７；　ＴＳＣＨ８７）。

Ｓｅｃ、１２．Ｏ：　ＧＰ（ＩＰＢＤ）の選択使用者はＳｅｃ、２に記載事項に より選択されたターゲットに適当なものとしてＣＰ（ＩＰＢＤ）を取り上げるに ちがいない。任意の選ばれたターゲットに対して本発明の方法により選ばれたタ ーゲットに結合するタンパク質を工学する適当な出発点となる少なくとも集合の １メンバーになるようにＣＰ（ＩＰＢＤ）の小さな集合体が集められると期待さ れる。使用者はＷＣ２部で述べた方法により意図された使用に適当な条件のため にアフィニティ分離を最適化すべきである。

Ｓｅｃ、１３．Ｏ：　ＰＰＢＤに関連して生成される？ＢＤ群の同定Ｓｅｃ、１ ３．１：変化させられるＩＰＢＤ（あるいはＰＰＢＤ）上の選択残基式々はａ） 　ＩＰＢＤの三次元構造、ｂ）ＩＰＢＤに相同の配列、ｃ］ＰＢＤのモデリング とＩＰＢＤＫ異体、のような種々の７アクターを考慮して変化させるべきＩ　Ｐ ＢＤの残基を選んだ、結合に強く影響する残基の数は常に同時に変化する数より も多いので、使用者はこれら残基を同時に変えるように条件を設定しなければな らない。

使用者はまた多様さの施行レベルを選定し、種々の配列の存在率を計算しなけれ ばならない。変化される残基のリストと各変化した残基での多様性のレベルは、 複合した多様性がＣ，、、、、とＭａｔｅに等しくなるまで調整される。

重要な概念は構造化したタンパク質のみが、例えば大抵の他のことを衆外して特 定の化学物質と結合できるというように特異的結合を示す。それ故、閲化さぜる 残基は重要なＩＰＢＤ構造を保持するように選ばれる。ＰＢＤが保持されるのを 防げる置換は無差別に結合する遺伝子をＧＰが持つようになるので、集団から容 易にとり陳かれる。バルク基が途外されるように疏水性表面を埋めることは他の 分子にタンパク質が結合する最も強いドライビングフォースの１つとなる。バル ク水は表面が相補的であるときのみに２つの分子間領域から除外される。ターゲ ットに相補的な表面をみつけるため、できるだけ多くの表面をテストしなければ ならない。選択〜結合工程はターゲットのいくつか−の表面により密接に相補的 であるタンパク質を単離する。変えられた集団の寅質的多様性は、タンパク質配 列の数ではなく、むしろ異なった表面の数を測定することによりなされる。それ 故、タンパク質配列の数よりは集団に生成した表面の数を最大にするべきである 。

仮説的な例１において１図３に示したように仮定的ターゲットに結合しする仮定 的ＰＢＤについて考え；う。図３は３次元の対象物の２次元的図式である仮説に より、サークルの間部に示されているけれども、ＩＰＢＤの残基１．２．４．６ ．７．１３．１４．１５．２０．２１．２２．２７．２９、五、３３．３４．３ ６．３７，３８．３９が、ｉＰＢ’）の３次元表面上にあご　る。タンパク質は 明確な数えられる面をもっていない。それ故、我々はセットの全てのメンバーが ターゲットのいかなる原子も２ＰＢＤの主鎖にファンデルワールスの距離以内に 近付くことなくＬ　ターゲット物質の１つの分子と同時に接触できる残基のセッ トト　として“相互作用セット”と定義する。残基がターゲット分子にいわゆる “接触する“という概念は後に議論する。図３の１つの仮定的な相互作用のセッ ト即ちセットＡは残基６．７．２０．２１．２２．３３そして３４から成り、正 方形で表した。他の仮定的相互作テ　用セット、即ちセットＢは残基１．２．４ ．６．３１，３７そして３９より成り、円で表した。

〉　もしも、１つの残基（例えば２１１番目残基）をそれぞれ２０ｍの全てのア ミノ酸に変えると２０個のタンパク質配列と相互作用セラ）Ａの２０の異なった 表面が得られる。残基６は２つの相互作用セットに含まれるので、残基６を全て の２０個のアミノ酸で変換すると２０種類の相互作用セットＡと２０傷の相互作 用セットＢが得られるということに注意せよ。

２つの残基をそれぞれ全ての２０個のアミノ酸で変換すると４００のタンパク質 配列を生成することを考慮せよ。例えば変換される２つの残基が１番目と２００ 番目ら相互作用セットＡは残基１に依存しないし、相互作用セットＢは残基２１ に依存しないので、ただ４０の異なった表面があるだけある。しかしながら７と ２１の残基が変化すると４００の表面が生成されることになる。

２　空貨的に離れたＮ個の残基が同時に関わるならば、２０×Ｎ個の表面が生成 される。同じ相互作用セットでＮ個の残基が変わるなら、２０’個の表面が生成 する。例えばもしもＮ＝７ならば、分れた残基での変換は１４０の表面を生成す るが、一方相互作用する残基の変換は２０”１．２８Ｘ　１０”個の表面を生成 する。それ故、Ｎ個の残基が変わるとき生成する表面の数を最大にするには全て の残基は同じ相互作用セット内にあるべきである。

タンパク質・タンパク質の強い相互作用に埋れた表面領域の量は１０００Ａ”か ら２００ＯＡ”の範囲になる。個々のアミノ酸はアミノ酸のタイプに大部分依存 し、立体配座にはほとんど依存しない全表面領域をもっている。これら領域はグ リシンに対しての１８０人２からトリプトファンに対しての３６０人：の範囲に ある。公表されたタンパク質のアミノ酸の溶媒内への露呈から我々はタンパク質 表面の１００ＱＡ！は４から３０のアミノ酸残基に相当すると計算した。！Ｉ！ 際のタンパク質にみられるようにアミノ酸配列を変えると１００ＯＡＩのタンパ ク質表面を生成するのにＩＯから２５個の残基が必要である。５ｃｈｕｌｙと５ ｃｈｉｉｅｒはタンパク質表面の１００人２は１０００回もの異なった特異性パ ターンを示すと見積もった。

表面パターンは個々に変わることのできる領域に対して指数関数的に増える・例 えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋに記録され ているＢＰＴ　１の１つ（６ＰＴ１）は３９９７λ２の全露呈表面領域をもって いる（ＬｅｅとＲｉｃｈａｒｄｓの方法を使用し、溶媒半径を１．４人２とし、 そして表７に示した原子半径を用いて）。もしもこの表面を自由に父えることが でき、また１００人２が１０００のパターンを生成すへ 一ンを構築することができる。

しかしながら、１つのタンパク質骨格は、単に表面残基の側鎖基を置換するだけ では、特定の１００Ａ”の１表面上に可能な全部のパターンを表示することはで きない。タンパク質骨格はほとんど一定の位置関係で変えられた側鎖基をもつの で、変換は独立ではない。それにもかかわらず我々はタンパク質の外側に面した これらタンパク質の残基を変えることにより、異なるタンパク質外面の大きな集 合体を生成することができる。

ミオグロビンと接触するＢＰＴ　Ｉの１つのモデルの寅験は、残基３．７．８、 ｉｏ、１３．３９．４１そして４２がミオグロビンの大きさと形をもつ分子と全 て同時に接触できることを示している。しかしながら、ターゲット分子のどの部 分が実際にＰＢＤにより結合される部位かを決定するためのモデルを使用するこ とは本発明の意図カセット式変異誘発に対しては、変異させられるべきタンパク 質残基は変異ＤＮＡ（ｖｇＤＮＡ）をコードしたこれらの全てが一団となって作 られる配列に十分近くある方がよい。本発明は合成できるｖｇＤＮＡの特殊な長 さに限ったものではない。現在の技術でもってすると、６０コのアミノ酸の長さ く１８ｏのＤＮＡ塩基）がつながれる。

広く分離した残基を変異させるため、２個あるいはそれ以上の変異プライマーを 用いて１本鎖オリゴヌクレオチド指向の変異誘発のような他の変異方法を用いる ことができる。

別の方法として、６０コ以上の残基で分けられた残基を変換すると、２コのカセ ットが変異される。最初のカセットは変異誘発され、例えば３０．０００以上の メンバーをもつ集団を産生ずる。寂Ａ　ＯＣＶを用いて、２番目のカセットを変 異誘発し望ましい多様性をもつ２番目の変異集団を産生ずることができる。

変異のレベルは、ａ）非常に多数の独立に形質転換された細胞を産生ずる、ある いはｂ）高度に変異した集団内に小さな構成要素を検出する、という一般的能力 をこえるべきではない。変異レベルの制限についてはＳｅｃ、１３．２で議論す る。

我々は１）ＩＰＢＤ外面上の残基の三次元構造、あるいは少なくともそのリスト 、２）ＩＰＢＤに相同の配列リスト、そして３）ターゲット分子のモデルあるい はターゲットの代替品を変えるのはとの残基かを決定するのに有用なＩＰＢＤと ターゲットについてのデータを集めた。

これらのデータとタンパク質の異なったアミノ酸の挙動の理解は次の２つの疑問 に答えるのに用いられる。

１）ｒＰＢＤのどの残基が外側にあり、ターゲットに空間的に同時に接触するの に十分近付いているのか。

２）ＩＰＢＤのどの残基が高い可能性で変化し、重要なＩＰＢＤ構造を保持して いるのか。

Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ等からターゲット物質の原子モデルはこのような英検に好 ましい形であるが、必ずしも必要ではない。例えば、タンパク質が未知の三次元 構造をもつタンパク質であるならば、タンパク質の量と、それが可溶性球状タン パク質、繊維状タンパク質、あるいは膜タンパク質のどちらであるかを知ること で充分である。分子代替品や比較基準として用いるために貝じクラス、：司じ大 きさ、形の既知の構造のタンパク質を選択できる。粗い解像度で（＝、与えられ た大きさやクラスの全てのタンパク質は司じようにみえる。特異的容量は同じで 、全てが多少球状をしており、それゆえ同じ大きさとクラスの全てのタンパク質 はおよそ同じ半径の屈曲を待っている。２つの分子の屈曲の半径は２つの分子の いくつが接触するようになるかを決定する。

アミノシが変化させられるタンパク質の鎖の残基を選択する最もＮ岩な方法は、 相互作用しうるコンビニ−タグラフイックＩこよりＩＰＢＤのモデルを見ること である。ハードウェアの適当なセットはＥｖｅｒｒｓ＆５ｎＬｂｅｒｊａｎｄ　 ＰＳ３９０グラフ（７り天端（Ｅｖｅｎｓ＆５ｎｔｈｅｒｌａｎｄＣｏｒｐｏｒ ａｔｊｏｎ％Ｓａ］ｔ　Ｌａｋｅ　Ｃ３ｔｙ、ＵＴ）とＭｉｃｒｏ　ＶＡＸｎス ーパーミクロコンピュータである。タンパク質モデルを眺め操作するための適当 なプログラムは、ａ）Ｔ、Ａ、ｇｏｎｅｓにより書がれたＲｉｃｅ犬学、（ヒユ ーストン、ＴＸ）の生化学教室で配布されたＰＳ−ＦＲＯＤＯ、そしてｂ）そし てにより開発されたＰＲＯＴＥＵＳである。

タンパク質のダイナミックシミュレーションのような理論計算は親のタンパク質 の三次元構造上の特定のアミノ酸のタイプの特異的残基に対する置換の効果を評 価するのに使われる。このような計算は特定の置換はタンパク質の柔軟性に大い に影響するだろう。

Ｓｅｃ、１３．１−１：　基本のセットどんな残基がｌ　Ｆ’ＢＤの表面にある のかという知識を用いて、我々はいかなるターゲット物質からファンデルワール スの距離（すなわ９４．０から５．０人）以外に近付くいかなるｌ　ＰＢＤの主 鎖原子をもたないで同時にターゲット分子に接触するためｌ　ＰＢＤの表面にτ 分！：接近できる残基を選択する。ＩＰＢＤの残基はもしもａ）主鎖の原子がタ ーゲット分子のどれかの原子にファンデルワースの距１（すなわち４．０から５ ．０人）内にあるとき、あるい１＝ｂ）４１％深子がその原子と接触できるよう にＣｂ　ｒ　！　ａかターデフ２分子のどれかの原子のＤｃ＋＋＋ｌ＋内にある ときターゲットといわば“接触する”。側鎖基は大きさが異なる（表３５参照） ので、Ｄｃ＋＋＊＋＋を選択するにはいくらかの判断が要求される。好ましい具 体例として、我々はり、、　、、、　、　−８，０人を用いるだろうが、６．０ 人から１０人の範囲の他の値も用いることができる。もしもＩＰＢＤが残基にＧ を持つと、我々は正確な結合の長さと角度をもつ凝Ｃｈｅｒｔを構築でき、この 凝Ｃ５０，からターゲットに接触できる残基の能力を判定することができる。

別法として、七７トの残基により境界が定められる表面の屈曲がセットの全ての 残基とターゲットの分子間の接触を妨げる程は大きくないようにＩＰＢＤ表面の 残基のセットを選択する。ＩＰＢＤから誘導されたＰＢＤは高分子の一部にのみ 接触できるので、この方法はもしターゲットが高分子であるとき適当である。

重要なＩＰＢＤの構造は残基の基本セットの各残基での置換に抵抗下るというい くらかの示唆があるが我々も同感である。この示をはａ）１同族配列、ｂ）統計 的コンピュータモデリングあるいはＣ）ダイナミックコンピュータシミュレーシ ２ンといった色々な情報源による。

基本センこの残基はタンパク質配列が連続している必要はない、変化されるべき 残基のアミノ酸が全て原子の重なりなく同時にターゲット物質の分子に接触でき ることが要求される。例えばもしもターゲットがウマ心朦ミγグロビンでまたｌ 　ＰＢりがＢＰτ：ならば、表３４に示したＢｐ″：工の二つの相互作用セット における残基のどのセラｉを選択してもよい。

基本セットは８コから１６コの残基を含むのが好ましい。残基のこの数は表面が ターゲットに対して相補的であることを許容するが、表面の重要なフラクション が、同時に変化することができるのに充分なくらい小さいものである。

Ｓｅｃ、１３−ｉ−２：　２番目のセット２番目のセットは基本の残基に接触Ｔ る残基より成り、残基がａ）５部にある、ｂ）高度に保護されている、あるいは 表面にある、ので残基から豚外される。しかし、１ＰＢＤ表面の屈曲が残基をセ ットの１フあるいはそれ以上の残基としてターゲットに同時に接触することを妨 げている。

内部の残基は、しばしば保護されているにもかかわず、■からＬｌあるいはＦか らＹのようないくらかの保護された変化を妨げる。これらの変化は隣接するタン パク質残基の詳紅な配置とダイナミックスに影響し、一旦、ＳＢＤがみられたな ら、このような変異は有用となろう。

２番目の表面残基は最もしばしばセットの末梢に位置し、セットの全ての他の残 基とターゲットとに寛時に！！接触しない。

１゛（か−ながらこれら残基の１つのアミノ厳正の電荷は結合に強い影響をもつ 。ＳＢＤを改良下るためにこれら残基のいくらかあるい］；全てを変えることは 通光である。例えば塩基ｌで等モルのＡとＧ９塩基２で等モルのＣとＡ１そ、て 塩基３でＡをもつ変異コドンは等しい確率でアミノ酸Ｔ、Ａ、にそしてＥを生成 する。

Ｓｅｃ、、３．、．３：最初に変化させるべき残基の選択漸次保証される変化の 許容レベルはどれだけ多くの残基を一度に変化させ得るかを決定する。即ち幾何 学がどれだけかを決定する。

使用者は多くの方法で変化させるべき残基を選択でき、好；しい方法は次のよう である。基本セットの面に沿って正反対に対比した一対の残基を選択する。この ような対の２つが表面の上／下、右／左の範囲を定めるのに使われる。別法とし て、表面上にできるだけ大きな領域をもつ三角形を形成する３つの残基が選ばれ る。１コから３コの他の残基が相互作用に沿ってチェッカー盤様に選ばれる。広 く別れた残基で好ましい相互作用がおこる前に全ての千渉し合う残基は許容でき る相補性をもつにちがいないので、変化させる空間的により広い残基を選ぶこと は高い特異性を生み出す可能性がある。

選択された残基の数はＳｅｃ、１３．２で議論しｔ二制約でそれぞれが変化する ような範囲で一対にされる。最初の一巡にお−てＩＰＢＤとターゲット間のどの ような結合も確認できない。それで進展は市題とならない。最初の一巡で使用者 ！＝ｖｇＤＮＡの各分子が例レベルを産生する；うに選＝する。ＤＮＡ合成機の １回の工程は約１０ｈｚｓの長さの１０１３コドンの分子を生成する。連続反応 と形質翫換工の非有効性は冥界にテストされるタンパク質数を１０７〜５×１０ ８に減じる。このような非常に高い変異レベルでの過程の多数の相互作用は再現 できる結果を与えない。使用者はこのことが重要なのかどうかを決定しなければ ならない。

Ｓａｃ、１３−２：　突然変異の各部位での変化の度合変化の企レベルは変えら れた各残基の変異体の数の積である。

各変異残基は２〜２０の異なる可能性を産生する変異の異なった！式をもつ。我 々はこの過程が発展的であることを要求する。

即ち、各変異サイクルに対してよい巴発物質を生成するというように。

注意：変化レベルをｐｐ　ｂｄ配列とｐ　ｐ’ｏｄ配列に関係する多くの配列が 検出できる量で存在するようにセットすることはこの過程が発展的であることを 保証する。もしも変化レベルが高すぎて形質転換がＰＰＢＤを顕示しない程の低 レベルでｐｐｂｄ配列が存在するだけなら、次の一巡の最もよいＳＢＤはＰＰＢ Ｄよりも悪くなり得る。極度に高い変化のレベルにおいては、突然変異誘発の各 −巡、−巡は、先の一巡には依存しないし発展性の保証もない。

この方法は価値ある結合タンパク質に導くことができるが、この変化レベルでの 英検の繰り返しは発展性ある結果を生じない。

極度の変異は好ましくないのである。

もしも変化レベルが親の配列と各車−のアミノ酸度化が選択できるように存在す るなら、我々は選択した配列が最適値に近いか、親と貝じであるということを知 ることができる。一方、も巳も非常に高い変化レベルが使われたなら、配列はそ れが親の配列に勝っているからではなく偶然に親と改良された配列が存在しない ので選択されるかも知れない発展性はオールオアナツシングではない。先の変化 （多様化）ブイクルから得られた大部分の１報が係挿され、ＰＰＢＤ表面に関す る多くの異なった表面が産生される限りは、その過程（＝発展的である。もしも 変化レベルがｐ　ｐ’ｏ６遺伝子が検出されなし一程高いのなら発展性の保証は 減少する。もしも回収されたｐｐＢｐの可能性が無視されるのなら、発展的挙動 の可能性もまた無視できる。

我々のデザインの考えに相対する力はＰＢＤは検出できる量；での集団において 有用であるということである。即ち検出量以上は浪費される。それ故、我々はＰ ＰＢＤが検出できる限界内でできるだけ多くのＰＰＢＤＩ：：関する表面を生産 する。

我々はａ）変えられたコドンに対する真のｎｕ分布を特定する、そしてｂ）特定 したｎｔ分布と冥界のｎｔ分布間の相異の効果を試験するまでは正確にどれだけ の多様化が許されるかどうかとし１う特定を遅らせる。

Ｓｅｃ、１３．３：　ｖｇＤＮＡをコードしたＰＢＤファミリーのデザイン我々 はコドン内の変化が、変化させられるべき残基にどのように分配するかを決定し なければならない。この決定は遺伝子フードの性質により影響される。ｖｂＤＮ Ａが合成されたら、コドンるＪうに）遺伝子コード表の岡じカラムのアミノ酸を 含む集団を生成じ、コドンの第２の塩基での変化は遺伝子コード表の鳳じダ］の アミノ謙を含む集団を生成し、＝６−′ンの第３の塩基での変異は圃じ箱のアミ ノ酸を含む集団を生成する。同じコドンの２コあるいは３コの塩基が変化すると 、パターンはもつと複雑になる。タンパク質の三次元構造モデルでの作業は、所 与の残基で！換されるべきアミノ酸のｅ足のでットを示唆するが、この変化方法 は、より多いかより少ない種類のアミノ酸が含まれていることを要求する。例え ばモデルについての考察は、所与の残基にＮあるいはＱの置換を示唆するだろう 。コドンの順列組合せの変化は、１つの場所にＮとＱを混合することが同じ残基 番；、Ｋと五を含むことを可能性として要求する。１）Ｎのみ、２）Ｑのみ、あ るいは３）Ｎ、　Ｋ、　ＨそしてＱの混合したものを入れるのか選択しなければ ならない。不発明はどのアミノ酸が各残基に位置されるのか正確な予想をすると いうよりはむしろ変化させられるべきなのはとの残基かということに焦点を絞っ ている。

タンパク質に相違を生成する多くの方法がある。１の極端な場合はタンパク質の １つあるいは若干の残基をできるだけ多く変化させることである。我々はこうし た制御を“焦点突然変異誘発”とよぶ。焦５く突然変異誘発は新しいターゲット 物質に結合するタンパク質を検索するという最初の段階と同じよう番；、ＩＰＢ Ｄや他のＰＰＢＤがターゲットにほとんどあるいは全く結合しない時、適肖であ る。ＰＰＢＤとターゲット間に結合がなｌｚ’とき、我々は５つから７つの残基 のセットを選択し、全ての２０の可能性を通して各が変化させる。

突然変異誘発の他の計画（“拡散突然変異誘発”）はより限られた選択のでット を通してより多くの残基を変えることである。

このことは１つまたは２以上の他の活性化されたｎｔｓの少量によりＤＮＡ合成 （例えばｎｔ−７オスホラミダイ（）に対して活性化された各々の純粋なｎｔｓ をスパイク″：５ｐｉｆｅ：することにより成就される。一般的慣例とは反対に 、本発朗１＝非常に夕ないパーセント（例えば１％から０．００００１％）の最 終生成物が最初のＤＮＡ配列を含むようにスパイクのレベルをセラミするもので ある。多くの１重、２ｔ、３重の、ざらに多重の突然変異がおこるが、塩基配列 の再現は可能である。Ｎ、を変えられるべき塩基数とし、Ｑを親の配列をもつ全 ての配列の７ラクシ麿ンとすると、主要素である混合物のクラクション、Ｍは Ｍ　＝ｅｘｐ　（Ｑｏｇ、　（Ｑ／　Ｎｂ　）−１０（１２ｏｇ＋ａ（Ｑ）／　 Ｎ　Ｊとなる。

例えば、もしもＤＮＡＮ玉鎖上０＝の塩基対が変化させられ、生成物の１％が親 の配列をもつならば、各混合ｎｔ基質は８６％の親ｎＬ、１４％の他のｎｔを持 つことになる。表８は３０コの塩基が主要素のクラクションＭを含む試薬で合成 されたとき、ｎ個の親でない塩基をもつＤＮＡの７ラクシヨン（ｆΩ）を示して いる。Ｍ＝０．６３０９６のとき、フラクション２４（ｆ２４）やそれ以上のフ ラクションは１Ｏ−６よつ小さい。表８の「最高」［ｍｏｓｔ〕とは、最も高い 可能性をもつ変化の数である。マルチプル置換の相轟な可能性は、親配列いる場 合にのみおこる。この種の突然変異誘発はどのような時でもタンパク質のどの部 分にも適用できるが、ターゲントに対するいくらかの結合が完成する時最も連光 である。混合試薬で合成されたＤＮＡ鎖の塩基対Ｎ′Ｄは隣辺している必要はな い。それらはＮｂ／３からＮｂＶＪでコドンが色々な度合で影響されるように選 択される。変異のために選ばれた残基はもしもわかっているなら２Ｐ３Ｄの三次 元構造との関係で選択される０例えば、基本そして第２のセットにある残基の全 であるいはほとんどを選択できよう。同族体配列あるいは他のデータに根ざした これら各残基び異の程度に制限を課することができよう、［のでないｎｔの混合 物はランダムである必要はない。むしろ混合物は特定のアミノ酸に各コドンに現 れる。特定の可能性を与えるように片腎らぜることができる。例えば、１つの残 基は全ての既知の同族配列に酸基性アミノ酸を含むかも知れない。そのような場 合、コドンの１番目と３番巨の塩基は変化するが、２番目の塩基はＴにセットさ れる。この拡散構造指向の突然変異誘発はタンパク質の２つあるいはそれ以上の 残基で同時におこる変化を要求するようなそれ程微妙ではない変化をするいくら かのものと同じように、例えばＶから工というような、穏やかな間部変化と相関 するタンパク質骨格に可能な微妙な変化を明らかにする。

焦点突然変異誘発に関しては、各変異コドンに挿入されるｎｔＳの分布を考えよ う。各コドンは異なってプログラミングされる。特殊なアミノ酸あるいは１つの クラスのアミ／ａが適轟で塙るという情報がないのなら、１つのｐりｃを検日レ ベル以上に表すことは浪費なので、同等の可能性で全てのアミノ雌萱換Ｔること に努力Ｔべきである。コドンの各位！に全ての４つのｎｔＳの等量は各アミノ酸 がそのアミノ酸を＝−トイとしたコドンの数に二側して存在するようなアミノ酸 分布を与える。この分布は全ての憩性残基に対して与えられた２つの塩基亡残基 について１；不利となる。さらに、Ｒ，Ｓ、そして二はＷあるいはＭに対して６ 倍となる。もしもこの分布をもつ５つのコドンが合成されたなら、５つのＲをエ ンコードした配列＋＝　５つのＷをエンコードした配列よりも７７７６倍より豊 富である。Ｗ−Ｗ−Ｗ−Ｗ−Ｗの存在を検＝できるレベルで得ようとするとＲ− Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｒが７７７６倍も過剰に存在しないといけない。

Ａｂｕｎ（ｘ）を、コドンの各塩基におけるｎｕｓの分布で定義されるアミノ酸 χをコードするＤＮＡ配列の存在工としよう。いかなる分布についても、存在率 Ａｂｕｎ（ｉｌｆａａ）の最も好ましいアミノ酸（ｍｆａａ）と、存在率Ａｂｕ ｎ（］　ｆ　ａａ）の最も好ましくないアミノ酸（Ｈａａ）とがある。我々は全 てのアミノ酸を許容し、酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸の等量ということで、で きるだけ最小のストップコドンという２つの制約条件下で最も大きなＡ’ｏｕｎ （１ｆ　ａａ）／　Ａｂｕｎ（ｚｆａａ）比を与えるｎｔ分布をさがした。そｒ ′Ｌ故Ａｂｕｎ（Ｅ）＋Ａｂｕｎ（Ｄ）＝Ａｂｕｎ（Ｒ）＋Ａｂｕｎ（Ｋ）を与 えるｎｔ分布のみを考えると最大となる関数は次のＪうになる。

ｆ（：　Ａ′０ｕｎ（ストップ乃（Ａｂｕｎ（Ｉｊａａ）／　Ａ’ｐｕｎ（ｍｆ ａａ）））我々は、３番：の塩基をＴあるいｌ：＝ｃｃｃあるいはＧも等価た。

丁べてのアミノ酸が可能であるが、ＴＧＡとＴＡＡのコドンが制限されるので、 寅行されるストップコドンの数は減少する。アミノ酸Ｆ、Ｙ、’Ｃ％Ｈ，Ｎ、１ そ−てＤ１＝３番巨の塩基としてＴを必要とするが、Ｗ％Ｍ、Ｑ、にそしてＥは Ｇを必要とする。それ故、我々は３番目の塩基と、てＴとＧの等モル混合物を用 いた。

本発朋の一部として書かれ“Ｆｉｎｄ　Ｏｐｔｉｍｕｍ　ｖｇＣｏｄｏｎ　最適 ｖｇコドンを発見せよ”　（表９）と名づけられな計算プログラムは二＠０−０ ５で塩基１と２の組成を変えると、量（（Ａｂｕｎ（ｌｆａａ）／　Ａｂｕｎ（ ｚ？ａａＸｌ−Ａｂｕｎ（ｓｔｏｐ））））の最大値を与える組成を知らせる。

ｖｇフコドは各塩基でのｎｔ分布により象徴的に表される。

Ｔ　ＣＡ　Ｇ 塩基　番号１−ｔｌ　ｃｉ　ａｌ　ｇｌ塩基　番号２＝ｔ２　Ｃ２ａ２　ｇ２ 塩基　番号３−　ｔ３　ｔ３　ｔ３　ｔ３ｔ′ｉ−＋−ｃ″ｉ〒ａｉ−ｉ−ｇｌ −１．０ｔ２＋ｃ２＋ａ２＋ｇ２＝１．Ｏ ｔ３−ｇ３−０．５、ｃ３＝ａ３−Ｏ ｔｌ、Ｃ１、ａｌ、ｇｌ、ｔ２、Ｃ２、ａ２、そしてｇ２量の変化は、Ａｂｕｏ ＣＥ　）　＋　Ａｂｕｎ（Ｄ　）がＡｂｕｎ（Ｋ　）　＋　Ａｂｕｎ（Ｒ）に等 しいという式に制約される。

Ａ’ｐ鉗（Ｅ　）　、　Ａｂｕｎ（Ｄ）＝　ｇ　ｌ　Ｘ　ａ　２Ａコｕｎ（Ｋ） 〒ＡＬ＋ｕｎ（Ｒ）−ａ　ｉ　Ｘａ２／２＝ｃ　ｌ　Ｘｇ２　＋　ａ　ｌ　Ｘｇ ２／２ ｇ１Ｘａ２−ａｌＸａ２／２＋ｃ　ＬＸｇ２〒ａｌｘｇ２／２ｇ２について解く と ｇ２＝　（ｇＬｘａ２−０．５ｘａ　１ｘａ２）／（ｃ　ｉ〒ｏ、ｓｘ　ａ　ｌ 　）を得る、さらに ｔｌ＝１−ａｌ−ｃｌ−ｇｌ ｔ２＝１−Ｃ２−Ｃ２−Ｃ２ 我々は、Ｃ１、ｃｌ、ｇｌ、Ｃ２とＣ２を変化ざぜｔｌ、Ｃ２そしてＣ２を計算 した。最初、変化は５％の工程にある。一旦、およそのｎｔ最適分布が決定され ると、領域はさらに１％の工程で拡げられる。このプログラムの論理は表９に示 しである。

最適分布は 最適７ｇコドン Ｔ　ＣＡ　Ｇ 塩基　番号１　−　０．２６　０．Ｃ８０，２６０，３０塩基　番号２　−　０ ．２２　０．１６　０．４０　（Ｌ２２塩基　番号３　−　０．５　０．０　０ ．０　０．５で、表１０に示した存在率で各タイプのアミノ酸をコードするＤＮ Ａ分子を生成する。

ＭｉｉｌｉｇｅΩ７５００のようなりＮＡ合合成管制御するコンピュータはいく らかのｎｔ基質（例えばｎｔホスネルアミダイト）を２つあるいはそれ以上の貯 蔵器からとることによりいかなるｎｔｓ分布をもつオリゴｎｔのいかなる塩基を も合成するようにプログラムすることができる。それともなけば、ｎｔ基質はい かなる割合でも混合できいわゆる“汚染容器“合成に対する余分の貯蔵器の１つ に入れることができる。

得られた実際のｎｔ分布はａ）ｎｔ基賞の異なった本来備わっている反応性、そ してｂ）試薬の悪といった種々の連日により特定化されたｎｔ分布から異なる。

これらの効果を部分的に相殺することはできるが、いくらかの残基のエラーはお こるだろう。我々は特定されたｎｔフラクションと観察されたｎｔ７ラクシ羅ン の平均的相違をＳ、１．として示した。

Ｓ＊ｔｔ−平方根２（平均Ｅ　（ｆ、ｂ、−ｒ、、、、）　／ｒ、、□コここで Ｌｍ、ｉ＝ｔつの塩基にみられるｎ【の１つのタイプの量であり、ｆｌｌｌｌｌ ｌは同じ塩基に特定化されたａｔのタイプの量である。

平均はすべてのｎｔの特定化したタイプと（儒えば１０あるいは２０）の異なっ た度えられた塩基上でなされた。仮説により、変えられた塩基での実際のｎｔ分 布は特定化された分布の５％以内にある。実際のＤＮＡ合成機とＤ　Ｎ　Ａ合成 化学は異なったエラーレベルをもっている。使用したＤＮＡ合成機と化学に対し てＳ、１．を決定するごどは使用者の対応である。

アミノ酸分布上のｎｔ組成におけるエラーの可能な効果を決定するため次の４つ 方法で’Ｆｉｎｄ　Ｏｐｔｉｍｕｍ　ｖｇＣｏｄｏｎ”のプログラムを修正した 。

１）最初の２つの塩基での各ｎｔのフラクションは７つの同じステップでその最 適頭註（１−Ｓ、、、）からｆｋ適値互（ｉ　＋Ｓ、、、）まで開化することが 許される。（Ｓ、、、は使用者がとり入れた仮定的な７ラクシまンレベルである ）。ｉつの塩基でのｎｔ７ラクシ譜ンの合計は常にｌ、Ｑに等しい。

２）Ｃ２はＣ２と同じ様式で変化する。即ちＡ：ｐｕｎ（Ｄ　）　−Ａｂｕｎ（ Ｅ）　＝　Ａｂｕｎ（Ｋ　）÷Ａｂｕｎ（Ｒ）という制服をとる。

３）Ｃ３とＣ３は、３つの等しい工程における０、５Ｘ（ｉ−５９１，）から０ ．５ｘ（１〒５１．）まで変化する。

４）最小のＡｂｕｎ（ｉｆａａ）／　Ａｂｕｎ（ｍｆａａ）比をさがす。

実際の実験では、我々は上に示したｆｋ過Ｄ　Ｎ　Ａ分布の“最適ｖｇフコド” を与えるように合成機を指示した。しかしながらＤＮＡ化学上の不完全な制御は もしも全てのｎｔ７ラクシ１ンが“最適ｖｇゴドン”で特定化した量の５％以内 のとき得られる最悪の次に示したような分布を実際に得る原因となった。相当す る表は、表１１に与えられているようにプログラム“与えられた分布の５３１１ 間で最悪ｖｇコドンを見つけよ、Ｆｉｎｄ　ｗｏｒｓｔ　ｖｇｃｏｄｏ。

ｗ＋ｔｈ１ｎ　ｓｌｌ＋ｆ　Ｏｌ　ｇｚｖｅｎ　Ｃ１１Ｓｔｒｌ’ＤｕｔｌＯｎ ″を用いて与えられたＳｌ、ｔに対して計算することができる。

最適７ｇコドン、最悪５％エラー Ｔ　ＣＡ　Ｇ 塩基　番号１　０．２５１０−１８９　０．２７３　０．２８７塩基　番号２　 ０．２０９　０−１６０　０．４００　０．２３２塩基　番号３　０．４７５　 ０．０　０．０　０．５２５この分布は異なったアミノ酸をコードするＤＮＡを 表１２に示す存在率で与える。

もしもｎｔ分布“最適７ｇコドン”を産竺するよう１こ試薬を混合して５つのコ ドンを合成するなら、あるいは実際にｎｔ分布“最適７ｇコドン、最悪５％エラ ー”が得られたのなら５つのコドンの企てにｍｆａａをコードするＤＮＡ配列Ｃ ＝５つのコドンの全てにＩｆａｘをコードするＤＮＡ配列よりも２７７告Ｅまし くなる。即ちＤＮＡ配列の約２４％は５つのコドンの二つあるいはそれ以上にス トップコドンをもつだろう。

５つののコドンが塩基１としての等モルの混合物を用いて合成されると（Ａｏｕ ｎ（ｍｒａａ）／　Ａｋ＋ｕｎ（１ｆ　ａａ））　’　−７７７６となる。もし も最適ｎｔ分布が５％以内でプログラムされると、（Ａｂｕｎ（ｍｆａａ）／　 Ａｂｕｎ（ｌｆａａ））’　＝　２７７となる。異なるＰＢＤの総数は変わらな いのが、最もｔＦｒましくない配列は約２８倍より存在率を増す。等モルのｎｔ ｓをもつ４つの残基を各々の変化する塩基で変えるとき最も好ましくないアミノ 酸配列を検出することには、最適化されたΩを分布をもつ５つの残基を変えると き最もＦＦましくないアミノ酸を検出するのと同様の感度良い分離系が要求され る。

仮説によると、分布“最適コドン”は仮説的な例２の２番目の変化の２番目のバ ージョンに用いられる。しかしながら各タイプのアミノ酸をフードするＤＮＡの 存在：は表１２かられかる。親のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの存在率は量 （親の配列） Ｆ２４　Ｇ３０　Ｄ３４　三４２　Ｔ４７＝　Ａｂｕｎ（Ｆ　）Ｘ　Ａｂｕｎ（ Ｇ　）Ｘ　Ａ’ｏｕｎ（Ｄ　）Ｘ　Ａ’＋ｕｎ（Ｅ　）Ｘ　Ａｂｕｎ（Ｔ　）＝ 　０．０２４９　Ｘ　Ｏ，０６６３Ｘ　０−０５４５　Ｘ　０．０６０２Ｘ　Ｏ ，０４３７−２，４ｘ　ｉＯ−’ である。

それ故、非常に多くの関係する配列と奥様ＰＰＢＤ配列をコードするＤＮＡは検 ヒされる充分な量で存在するだろうし、我々は、この工程は発展的であると確信 下る。

ＰＰＢＤを採取する変化レベルは次の２つの特性をもつ。

ｉ）Ｐ　Ｐ　Ｂ　Ｄが得られるので、あともどりはできない２）選択に対し、Ｐ ＰＢＤに関する多くの変化が得られるので、これらの変化を検出できるし、それ から利益も得ることもできる。

使用者は計算された変化がＭ、８．とＣ＋ａ＊ｉ１による結合セラｒ内にあるよ うになるまで変化させられる残基のリストと各残基での変化レベルを調節しなけ ればならない。

我々はまた変化部位とそれをとりま＜ＤＮＡ開の相互作用についても考察するの がよい、使用される突然変異誘発の方法がカセットの置換であるなら、変化は無 償制限部位を生成するかどうか、そしてそれらは多様性の意図した導入をきびし く妨げるかどうか考察しなければならない。我々は、変異部位の適当な選択と変 異部位に隣接するコドンの静かな変換ｒｓｉｌｅｎｔ　ａｃｔｓｒａｔｉｏ＋１ ］により無償制限部位を減じるか、とり除く。詳細な例をみよ。

Ｓｅｃ、　１４．３ニブラスミドへの合成りＮＡの挿入カセット式突然変異誘発 に対しては制限部位がデザインされ、合成され、またＱＣＶＩ：：ｖｇ合成りＮ Ａを導入するのに用いられる。制限消化と連結反応は標準的な方法で寅施される 。−末鎖γリゴヌクレオチド指向の突然変異誘発の場合、合成ｖｇＤＮＡがベク ターに多様性を創りだすのに月いられる。

Ｓｅｅ、　１４．２　：　Ｅ胞の形質転換細胞朗はＤＮＡで細胞を形質転換する いかなる１つの方法に限ったものではない。ＭＡＮ　Ｉ　８２で述べられた方法 のような標撫的な方法は特定のホストとｏｃｖｉ：３して最適化されるだろう。

目標は好ましくは１０７かそれ以上の多くの独立した形質転換細胞を産生ずるこ とである。形質転換とアフィニティ分離の内で形質転換細胞を単離する必要はな い。我々は、形質転換細胞が比較的少ない子板に密にコロニーが形成するように 高濃度で形質転換細胞をもつ方が好ましい。

５ｅｃ−１４−３：　Ｇ　Ｐ　（ｖｇＰ　Ｂ　Ｄ、）集団の成長形質転換細胞は 初めプラスミド遺云子の発現を許す非選択的条件下で成長する、それから形質転 換細胞を殺丁ように選択される。形質転換細胞はそれからＳｅｃ、　１０−’ｈ で決定したように、導入の適当なレベルでａｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の発現をひきお こす。Ｉ　ＰＢＤをもつＧＰはパッケージに通光な方法で採集される。

多様性の高レベルは試験管内の変化ＤＮＡ合成により作り出され、この多様性は これといった選択的ε力なしに有機体の数世代にわたり受動的に！！持される。

有害な突然変異の頻度を減するかなく下ることは本発明の目的に有益である。２ ．３の世代が経過する前に選択が寅行されるのが好ましい。更に、ひきつづく研 究のため小さいサンプル（二０％以ズ）を取り衆くことに；つ有ｉ体に４唱を引 きおこす前に変化実丘′ｆ細分することは多様ｉを失うことになる。それ故、全 であるいはほとんどの合成りＮＡやほとんどのあるいは全ての形質転換細胞を用 いるべきである。

５ｅｃ−１５，’ターゲント結合表現型をもつＧＰ’（ＰＢＤ）の凰難採集され たパッケージは硬質に萱定化されたターゲンだ物質を含むアフイニティ分離を用 いることに；リターゲント結合表現型を多くすることができる。ターゲット物質 に結合できなかったパッケージ（＝洗い流される。もしもパッケージがバクテリ γファージか内室胞子ならばバクテリアの成長を方ぐためバンファ午にアジドの ようなバタテリオシン試薬を含むことが望よしいだるう。

Ｓｅｃ、　１５−ｉ　：カラムへのターゲット物質の吸着アフィニティーカラム クロマトグラフィーはアフイニテイ分離の好ましい方法であるが、他のアフィニ ティ分離法も用いることができるだろう。色々な市販品として得られる担体物質 がアフィニティークロマトグラフイーに用いられる。これらにはターゲット物質 が共有結合した誘導されたビーズやターゲット物質が不可逆的に結合した非誘導 物質が含まれる。

アフィニティークロマトグラフィーに体する支持物質の供給者（＝、Ａｐｐｉｉ ｅｄ　Ｐｒｏｔａｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　（Ｃａｚｂｒｉｄｇｅ、　 ）ＪＡ）、　Ｂｉｏ−Ｒａａ−Ｌａ’ｃｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　（Ｒｏｄｅｖｉ ｌｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　ＮＹ）、　Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｃｓｐａ ｎｙ、　（Ｒｏｃｉ＜ｇｏｒｄ、　ＩＬ）がある。ターゲット物質はそのターゲ ソ・のよい発現を考慮して作成された各硬質の意図に一致するように硬質に吸着 させる。

Ｓｅｃ、　ｉ５．２　：非特異的結合による選択の減少我々は、次のような２つ の方法でターゲットに結合する硬質に対するＧＰ　（ＰＢＤ）の非特異的結合を 減少させた。

ｉ）Ｇ　？　（ｖｇＰ　Ｂ　Ｄ　）の集団のクロマトグラフィーをする前に、選 云的欠陥のあるＣＰあるいはタンパク質の溶液のような遮断試薬でカラムを地理 する。

２）アフィニティークロマトグラフィーに先立ちＧＰ（ｖｇＰＢＤ）の集団をタ ーゲットを含まないかあるいは冥界のターゲットと扁じクラスの異なるターゲッ トを含む礫質上に通す。

上のステップ（１）はアフイニテイ礫質が野生型ＧＰあるいは一般のタンパク質 に対して示すいかなる非特異的結合をも飽和し、ステップ（２）は硬質あるいは ターゲットと同じクラスの分るに非特異的結合を示す集団の組成を取り衆〈。例 えばもしもターゲットがウマ心臓ミオグロビンなら、ウシ血清アルブミンを担体 とするカラムはタンパク質に対し強い非特異的結合をするＰＢＤを示すＧＰをト ラップするのに用いることができる。

もしもコレステロールがターゲットなら、ｐ−ｔ−ブチルベンジルアルコールの ような′ＥＩＸ性化合物化合物性化合物に強い非特異的結合をもつＰＢＤを表示 するＧＰを取り凍くのに用いることができる。包み込よれないあるいは時期尚早 に末端化したＰＢＤは非特異的に結合力が強いと予想される。付着性ＰＢＤを熱 差５１ｊに取り途いた最初のカラム容量はターゲット分子を保持しているカラム よりより大きい（例えば、５倍大きい）。

Ｃ貫りをもつクローンの分析において叉′！４！物質（ポリスチレン、ガラス、 アガロース等）の変化はターゲンごというよりは叉符物質と結合下るパッケージ の強化を取り途くのに用いられる。

Ｓｅｅ、　’ｒ５．３　：カラムからの溶離ＧＰの集団は結合タンパク質の意！ した使用を併用できる条件下でアフイニティマトリックスに適用できる、そして この集団はカラムでいくつかの溶出溶媒のグラジェントの過程で分別される。こ の過程はターゲットにアフィニティをもつＰＢＤを高め、ターゲットに対するア フイニティは用いた溶出溶媒ではほとんど影響されない。

（ＩＰＢＤから誘導された）ＰＢＤやターゲットの安定性に必要なイオンあるい は補因子は連光なレベルでバッファに含まれる。我々はまずターゲットに結合し ないＧＰ　（ＰＢＤ）を初めのバッファが（２６０ｒｔｍあるいは２８０ｎｍで ）光学密度がベースラインにもどりそれから１から５の空の量（Ｖｖ）なる量で 硬質を洗浄することにより取り途く。カラムはそれからグラジェントでａ）＃Ｌ 、　ｂ）Ｈ”濃度（ＰＨの減少）　、ｃ）口性溶質、ｄ）温度（上げるかあるい は下げる）、あるいはｅ）これらファクターのいくつかの組合せ、を増加グラジ ェントせしめて溶離する。塩がグラジニンと形成には最もよい溶質である。一般 に非共有性の相互昨月を弱める他の溶質もまた用いられる。“塩”は次のような イγン種のどのようなものをも含む溶液をさす。

Ｎａ’″　Ｋ”　Ｃａ”　ｖｇ″９ Ｆｆ：！４−ＬビＳｒ−”Ｂａ” Ｓｏ、−−ＦＩＳＯ４−Ｆ’０４−−−　Ｆｒ？０ａ−−Ｅ！２Ｆ’０４−　Ｃ ０５−−”１ＣＯｓ−酢Ｈ塩クエン酸塩　標準的１−漂準的　グアニジニウムＣ １アミノ酸　ヌクレオチド 他のイγン性、あるいは口性溶質も使われる。総ての溶質も遺伝子パンケージを 殺さないという必要性が要求される。エタノーノ呟アセトン、エテーノ呟あるい は尿素のようなｅＦ性溶質はときどきタンパク質精製に用いられるが、これらの 多くは低濃度以上はバクテリアやバクテリＴ７アージに害を及ぼす。一方、バク テリア胞子は多くの中性溶質に対して影響をうけない。

Ｓｅｃ、１５の工程が何回か繰り返される。異なる分析では異なる溶質が使われ る、例えばある分析では塩が、次のではｐＨが、という具合である。

Ｓｅｃ、１５−４　：パッケージの回収アフイニティ力ラムに結合を示すパッケ ージの回収は次のような色々な方法で成就される。

１）１述のグラジェントで溶離したフラクション２）可溶性ターゲット物質で溶 離した７ラクシヨン３）硬質で成長した細胞 ４）硬質のいくらかの部分とインキュベートした細胞５）ターゲットと硬質とを 結びつける結合を化学的あるいは酵素的に分解した後溶離する７ラクシヨン６） パッケージの分解後ＧＰの再生と回収されたＯＣＶ　ＤＮＡこれらの方法を組合 わせて用いることも可能である。アフイニチイマトリックスから回収しようと我 々が欲しているものｌ；ＧＰそれ自体ではなく、それらについての情報であるこ とを記憶すべきである。変えられたＧＰの回収（＝非常に強く望まれ、遺伝物質 の回収は必須である。

ＧＰの不意の不活性化は非常に害を及ぼす。ＧＰを不活性化しないあるいはター ゲットやカラムを変性しない溶質の最大垣を決定することは好ましいことである 。ＧＰを溶離するカラムを変性する条件が用いられるかも知れない。ターゲット が変性する前に、アフイニテイ硬質のタンパク質が植え込みとしての可能性のあ る使用を際外される。ＧＰがタンパク質−タンパク質相互作用や他の非共有的分 子の相互昨月で結合しているので、分子パッケージがアフイニテイ礎買上のター ゲット分子にしっかりと結合しているので、ＧＰがウィルスの形で洗い流されな い場合もある。このことは非常に強い結合があるときにのみおこる。このような 場合には、上の方法（３）から（５）が結合パッケージや遺伝清報がアフイニテ イ硬質から得ることができる。

溶離条件の巧みな操作により、あるｐＨ（ｐＨｂ）ではターゲットに結合するが 、他のｐＨ（ｐＨａ）ではターゲットに結合しないｓｂｄを単離することが可能 である。集団はｐＨｂで適用さｎ１カラムはｐ　Ｈｂで充分に洗浄した。カラム はそれからｐＨ，バッファで溶離させ、そして新しいｐＨで溶離したＧＰを集め 培養した。同じような手法が例えば温度のような他の溶液パラメータに用いられ るだろう。例えば、Ｇ　Ｐ　（ｖｇＰＢＤ）かインシュリンを担体としだカラム に通用される。塩でインシュリンに全く結合しないか、はとんど結合しないＧＰ を取り除き、塩あるいはグルコースで溶ｍすることにより、競合的にインシュリ ンあるいはグルコースに結合するＰＢＤを表示のＣＰを単離する。

Ｓｅｃ、　１５−５　：高濃度パッケージの増幅選択された結合特性をもつ生き ているＧＰは連光な媒体の培養液で増幅される。あるいは７アージの場合はその ように培養されたポストに接種することにより増幅される。もしもＧＰがクロマ トグラフィにより不活性化されると、ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子をもつＯＣｖはＧＰ から回収され、新しい生きているホストに導入されるにちがいない。

Ｓｅｃ、　１５．６　＝さらに増加が必要かの決定改良された結合性をもつＧＰ を単離する可能性は各分離サイクルをもつＣ＊＋＋により増加する。Ｎを変異に より産生された明確なアミノ酸配列としよう。我々はＳＢＤの単離を試みる前に 分離サイクルＫを実施しよう。ここでＫは単一のＳＢＤ凰離電離率が０．１０か それ以上である。

Ｋ−最小の整数≧αｏｇ＋ｏ（０，１０Ｎ）／Ｑｏｇ＋ａ（ｃ、＋＋）例えば、 もしもＮが１．ＯＸ　１０’でＣ−＋　−６，３１ｘ　１０”なら（２ｏｇ＋　 ａ（ｉ、ｏ　ｘ　ｉＯ’）／　Ｑｏｇ　１ｏ（６−３１ｘ　１０”）　−６，０ ０００／　２−８０００−２．１４　となる。それ放牧々は第３番目の分離サイ クル後にＳＢつの電離を試みるだろう。ただ２回の分離サイクル後に１個のＳ３ ？Ｉをみつける確率は、（６，３ｉ　Ｘ　１０”）”／　（１，ＯＸ　１０’） 　−０，０４となりＳ３つ単離の試みは有益である。

いかなる生きているＣＰを含むＳｅｃ、１５．３で溶離しｔ；最後のフラクシヨ ンからのクローン化した単離体はアフィニテイ礎質からとった植え付けを培！ｌ Ｔることに；り得られたクローン化した単離体と菌株に培養される。もしも分離 サイクルＫが完成したなら、これらクローン化した電離体の例えば３２といった 番号からのサンプルは、（ターゲット）カラム上の溶離特性につきテストされる 。もしもターゲットに対して改良された結合を示す単離された遺伝子に純粋なＧ Ｐがないのなら、あるいはにサイクルがまだ完成していないのなら、Ｓｅｅ、　 １４．３で設定したのと同じような方法で我々は生きているＧＰを含む溶離した 最後の２，３のフラクションからのＧＰそしてカラムの硬質からとられた植え付 けを培養することにより得られるＧＰからのＧＰをたくわえ、培養する。我々は それから、５ｅｃ−１５に述べた増加操作をくり返す。このサイクルの増加法は 隅１７．７回、ぼたはＳＢＤが単離されるまで続ける。

もしも単離されたＧＰの１つあるい（＝それ以上が（ターゲット）カラムに改良 された保持をもつなら、我々は候ＭＳＢＤの保持はターゲット物質に対するアフ ィニティによるのかどうかを決定下る。ターゲット物質は′Ｍｌ適密度で異なる 支持礫質に結合するそして候補ＧＰ　（ＳＢＤ）の溶離量が測定される。我々（ ＝最も高い溶離量をもつものか、溶離後もカラム上に残るものどちらかの候補を 選択する。もしもＧＰ（このラウンドではＰＰＢＤ）よりもより高い溶１ｌＩｉ 量をもつ候ｍＣＰ　（ＳＢＤ）がないのなら、生きているＧＰを含む最後の２． ３のフラクションからのＧＰとカラム礫質からとられた橿え付けを培養すること により得られるＧＰを貯え、培養する。我々はそれからＳｅｃ、　１５の増加操 作を繰り返す。

もしも全てのＳＢＤがこのラウンドでＰＰＢＤよりも優れている結合を示すなら 、我々は生きているＧＰを含む最後の７ラクシヨンからのＧＰとカラムからとら れた植え付けからのＧＰをたくわえ培養する。この集団はに６に根ざしたＧＰを さらに分Σ１ｊするために少なくとも１回、再度クロマトグラフィされる。

もしもＲＮＡ７アージがＧＰとして用いられたなら、そのＲＮＡは助人ファージ の助けで培養されるか、逆転写される。そしてＤＮＡが増幅する。増幅されたＤ ＮＡはそれから連光なプラスミドに配列されるかサブクローン化される。

Ｓｅｃ、　１５−７　：　集団の特性化成々（＝望ましい結合特性を示す集団の メンバーを遺伝的そして生化学的方法で特徴づけた。我々はクローン化した単離 体を得、そしてこれらの菌株をターゲットへの結合に関する遺伝子型、表現型か を決定するため遺伝的そしてアフィニテイ的方法によりテスト下る。結合を示す 数種の遺伝的に純粋な単離体に対し、結合ば０５１）−ｓｂｄ遺伝子を切除し、 それを親ＧＰに交差させる人工キメラ遺伝子によりひきおこされると提案する。

我々はまたｏｓｐ−ｓ’ｏｄがとり除かれた各ＧＰの欠失した骨格を連結し、各 骨格それだけではＣＰ上のターゲットに結合をもたら丁ことはでさないことを提 案じた。我々は数種のクローン化された電離体からの０５ｐ−５５０選伝遺伝子 列した。

Ｓｅａ、　ｒ５−８　：　結合７フイニｆイ（１’）テス’１つあるいは七Ｍ以 正のクローン化された電離体に対して、我々；；、ｏｓｐ７ラグメントなしに、 各ＳＢＤが遊離タンパク質として産生されるようにＳコｄ遺伝子フラグメントを 表現ベクターにサブクローンする。各ＳＢＤタンパク質はアフィニティクロマト グラフイを含む通常の方法で純化される。結合の強さの物理的測定１；各遊離Ｓ ＢＤタンパク質に対し次の１）ターゲット物質の結合の関数として５ｔｏｋｅｓ ：径の変化がアガロースのような分子サイズのカラムからの溶離のｓＦ！Ｆ性に ；り測定する、２）ターゲット物質を添付したスパンアフイニチイー力うム上の 放射性原子で標識したＳＢＤの保持、あるいは３）ＳＢＤを添付したスパンアフ ィニティーカラム上の放射３ｆｊ（子で標識されたターゲット物質のｆｆｌ持と いった方法のどちらかの１つでなされる。各遊離ＳＢＤに対する結合の測定はＰ ＰＢＤｉ：対する結合の相光する測定と比較される。

各分析で、我々は各タンパク質の濃度、他の関係ある物理的そして化学的パラメ ータの関数として結合の程度を測定する。

さらに、各ラウンドからのターゲットに対して再興のアフィニティをもつＳＢＤ をすぐ前のラウンドの最善のＳＢＤ　（ｇ　１のラウンドに対しては１ＰＢＤ） とそしてターゲット物質にたいするアフィニティに覧してのＩＰＢＤとに二数す る。医然変異誘発のひき就される；で、増工するアフィニティを竺じる。

も巳も結合がまだ充分でないと、との残基を次に変えなければならないかを決定 しないといけない（Ｓｅｃ、　１６．０をみよ）。

Ｓ６（、１５，９＋他のアフィニティ分離方法ＦＡＣがＰａｒｔｆｆで決定した 最通パラメータをもつ蛍光標識したターゲットを結合するＧＰを分離するのに使 われる。我々１；構造的に異なるものとして２つあるいはそれ以上の異なった色 素を月いることにより蛍光標識への人工的結合を区別する。

電気泳動アフィニテ１分離はバッファーの別のイオンのみが人工的結合を与える ような未父化ターゲットを用いる。ゲル物質への人工的結合はフィールド方向に は無関係に遅延を；ねく、それで容易に致来できる。ＧＰの変異集＝は色々な電 荷をもつだろう 最初に、ＧＰの変異集団はターゲット物質を含まないゲルで電気泳動する。電気 泳動はＣＰガレーンの長さに沿って分布されるまで統けられる。最初の電気泳動 が笑施されるターゲットのないレーンは致去できる妨害剤により、ターゲット物 質を含む四角のゲルから分離される。妨害剤をとり腺さ、２回目の電気泳動を最 初のとは回向に行う。ターゲットと結合しないＧＰは変わらない移動性でもって 動くが、−万ターゲットに結合するＧＰはターゲットと結合しない大部分から分 離するだろう。

非結合性ＧＰの斜めの線が生成する。この線は１アずりとり捨てられる。ゲルの 残りの部分を溶解させ培養する。

Ｓｅｃ、　ｉ６．ｏ　：次の多様化（変化）サイクルＰＢＤのどの残基が次の変 化サイクルで変化させるべきだろうか？一般的な法則はできるだけ多くの集積さ れた情報を保存することである。丁度変化したアミノ酸は最もよく決定されるも のである。他の残基の遠視が変わると、それらを再び変化させるのに１’となる 。固持に変化させることができるよりも基本セットやＷｃ２セツトには常に多く の残基があるので、我々は決して変化しない（最優先性）か、１つあるいはそれ 以上のサイクルで変化しないかのどちらかでの残基を選択することから始める。

もしも前のサイクルで変化するものを途いて全ての残基の変化が充分高いレベル の多様性を許さないことをみつけ！；なら前のサイクルで変化した残基は再び変 化するだろう。例えば、もしも産生できる個々の形質転換体の数とアフィニティ 分離の感度が７つの残基が変化する程であるなら、またもしも基本セットとＷｃ ２セツトが１３個の残基を含むなら、たとえいくらかの残基が連続して２旦変化 したとしても、我々は７つの残基を常に変化させるだろう。このような場合、我 々は丁度変化した残基を側層した変化コドンに高い存在率で存在するアミノ酸を 含むものとして選択下る。

ＳＢＤとタープント間の結合を産生ずるタンパク質配列を選択するための過程を 許すのは情報の蓄積である。タンパク質と他の分子の境界は２０あるいはそれ以 上の残基を含む。２０個の残基の完全な変化は１ｏ２６の異なるタンパク質を生 成する。

互いに空覧的に近くにある残基を５個から２０個の残基の重なったグループに分 けることにより、我々は大きな表面を度化さゼえるが、一度にｉ　Ｑ７から１０ ′以三の倶補をテストする必要はないので、ＩＱＩＳから１０１７倍節約になる 。

変化さぐるべき残基を選択し、我々は再び、１３．２で設定した原理により各残 基の変化範囲を設足し、望ましい突然変異体をコードしたｖｇＤ　Ｎ　Ａをデザ インしくＳｅｃ、　１３−３）、ＧＰにＶｇＤＮＡをクローン化しくＳｅａ、　 １４）、そしてＳＢＤをもつＧＰをターゲットに結合させて選択する（Ｓｅｃ、 　ｉ５）。

Ｓｅａ、　１７−０　：　他の考察 Ｓｅａ、　１７．ｉ　：　選択の組合せ物質Ａには結合するが、物質Ｂには結合 しない分子を選択するのに上述の方法のアフィニティ分離を修飾できる。物質Ａ と物質Ｂをもつ２つの分離カラムを調整する必要がある。遺伝子パッケージの集 団は上述の方法で調整するが、その集団をＡに適用する前に、已に対して高いア フイニティをもつ集団のメンバーをとり途くために集団をカラムＢ１：通丁。集 団をＡに通す前にＢに結合しない集団を増幅する必要があるかも知れない。

もしもＡとＢがある意床で同じで、Ａに対すアフイニティをもつものとしてＰＰ ＢＤが選択されたなら増幅が最も必要であるように思われる。

例えばＡには結合下るがＢには結合しないＳＢＤを得るｊ；めに、３つのカラム が一連のａ）ＡでもＢでもないある化合物を支持するカラムあるいは礫質物質の みを安置するカラム、ｂ）Ｂを安置するカラム、モしてｃ）Ａを支持するカラム に連結できる。

Ｇ　Ｐ　（ｖｇＰ　Ｂ　Ｄ）の集団はこの一遍のカラムに適用でき、そのカラム （＝その２月で用いられる一定イオン強度のバッファで洗浄ざｎる。その２つの カラムははなされ、３番目のカラム＋＝Ａには結合するがＢとは結合しないＧＰ 　（ＰＢＤ）を電離するためグラジェントで溶離される。

ＡとＢ両方に結合する分子を生成することもでさる。この場合、我々は三次元モ デルを用い、Ａに結合するように閉居となる分子の１つの面を突然変異させる。

それから、已に結合する異なった面を突然変異させる。

物質ＡとＢは単に１つか２．３の残基が異なるタンパク質かも知れない。例えば 、Ａは遺伝子がクローン化された天然のタンパク質かも知れないし、ＢはＡの全 ての三次元構造を保持したＡの突然変異体かも知れない。Ａに（＝結合するがＢ には結合しないように選択されたＳＢＤはＢで変異された残基の近くでＡと結合 するにちがいない。もしも突然変異がＡの活性部位（Ａが活性部位をもつと仮定 して）でおこったと下ると、Ａとは結合するがＢとは結合しないＳＢＤはＡの活 性部位に結合し、Ａの阻害物質になるように思われる。

ＡとＢ両方に結合するタンパク質を得るために、我々は別々に、まずＡに結合す るＳＢＤと已に結合下る別のＳＢＤを得る。

それから我々はこれらのドメインをコードする遺伝子を２つのドメイン轟−ポリ ペプチドが生成されるよう結びつけることができる。融合タンパク質はＡとＢ両 方にアフノニテＩをもつだろう。

結合タンパク質の！じ部位に競合的なＡとＢＩ：対してア７ノニティをもつ結合 タンパク質を生成できる。ＡとＢに対下る部位を重ね合わ丁ことにより競合を保 証下る。初めにターゲット物質Ａに結合する分子を構築する。それからａ）Ａに 結合するように変化させられた残基、加えてｂ）三次元空間で七ノ）　（ａ）の 残基によく似るが、間約であり、ＡやＢと夏接的には結合するようには思えない 残基として足義される残基の１つのでットを変化させる。セット（ｂ）の残基は Ａと已に対するアフイニテイが９したけ変化するような、セット（ａ）の残基の 位置づけに小さな変化を生み出すように思える。これら集団のメンバーはＡとＢ 両方のアフィニティに選択される。

Ｓｅｃ、　１７．２：非結合の選択 本発明の方法は選択されたターゲットには結合しないタンパク質を選択するのに 用いることができる。ストレプトキナーゼのような望ましくない程度で抗原であ る薬理的に重要なタンパク質について考えてみよう。我々は薬理的に重要なタン パク質をＩ　ＰＢＤとして、またそれに対する抗体をターゲットとすることがで きる。薬理的に重要なタンパク質の表面上の残基を変異し、抗体カラムに結合し ないＧＰ　（ＰＢＤ）を集め、培養した。表面残基はａ）三次元構造から、ｂ） 疎水性の考察から、あるいはＣ）化学的標識のようないくつかの方法で同定した 。薬理的に重要なタンパク質の三次元構造はもとの表面を変化させないままにす るのをできるだけ少なくするように広い範囲で残基を選択下るのを除いては、変 化させるべ、き残基を選択する都合な指慄を残している。

結合のしばしばの切断Ｃ＝結合項界にある轟−のアミノ酸が変化させられること のみを要求下る。もしもポリクロナール抗体が月いられたなら、我々【＝全ての あるいはほとんどの強いニビトープが単一分子間で変化さぜられるという問題に １面する。

それ故、１つのモノクロナール抗体か、狭い範囲の抗体種が望まれる。もしも我 々が一連のモノクロナール抗体のカラムをもつなら各モノクロナール抗体に対す る結合をストップする１つあるいはそれ以上の突然変異を得ることになる。我々 はそれからこれら突然変異のいくつかあるいは全てを１つの分子間に結びつけ、 モノクロナール抗体としては認識されない薬理的に重要なタンパク質を産生ずる 。このような突然変異体は薬理的に興味ある性質が突然変異により許容できない 程度で変化してないかどうかをテストされなげればならない。

典型的には、ポリクロナール抗体は抗原に対する結合定性の範囲を表示する。た とえ、我々が薬理的に重要なタンパク質に結合するポリクロナール抗体のみをも ったとしても、我々は次のように進めるだろう。我々は複写できるＧＰの表面に 表れるよう薬理的に重要なタンパク質を工学的に作る。我々はＧＰの集団が得ら れるように薬理的に重要なタンパク質の表面にある残基にあるいは薬理的に重要 なタンパク質の表面にあると思われる残基に突然変異を導入する。ポリクロナー ル抗体とカラムに接着し、ＧＰの集団を低濃度の塩でカラムに適用する。カラム を塩グラジェントで溶離する。最小の塩濃度で溶離するＧｐ（；薬理的に重要な タンパク質に最大のアフィニティをもつ抗体に結合することをとり猟く方法で突 然変異させられＩ；薬理的に重要なタンパク質をもつものである。最Ｉ、＼塩濃 度で溶離したＧＰＩ：単離され、培養される。単離されたＳＢＤは抗原決定基は ひきつづいてとり途かれるように変異のひきつづいてのラウンドに対してＰＰＢ Ｄになる。

Ｓｅｃ、　１７．３　：構造の保持に対するｐ　１３　Ｄの選択状々は既知の結 合タンパク質の三次元構造を保持する挿入あるいは削凍を選択できる。その表面 にＢＰＴ　Ｉを表現するＧＰについて考えよう。ｂｐｔｉ−ａｓｐ遺伝子で、我 々は５つの変えられ１こコドン（３，２ｘ　ｉＯ＆配列）をもつに２６やＡ２７ でコドンを置換できる。Ｋ２ＳとＡ　２７１：ターンにあり、トリズシン結合表 面からほど遠い。我々はトリプシンに対し高い特異的アフイニチイを保持するＢ ＰＴＩの変異体を発現するＧＰを単離するため結合を通して選択を用いた。

Ｓｅｅ、　ｉＬ４　：珍しくない生成した結合タンパク質各ターゲットに対し、 不発明の方法でみつけることができる多くのＳＢＤがある。集団にあるいくらか のＰＢＤはターゲットに結合するだろうという可能性を１丁ために、我々は我々 が便利に結合を通しての選択に適用できる程大きな集団を生成する。この方法を 管理すり重大な疑問は“いかに多くの形質転換体を我々は生成できるか？“と“ いかにりなく結合を通しての選択を通して我々は要素をみつけられるか“という ことである。

遺伝学者は簡単な強い選択を用いてＢ　□二ａ分の１の頻度で突然変異を臼常約 にみつけることができる。変化の最適レベルは形質転換体の最大数と、選択の感 度により決定される。それでいかなる納得できる感度に対し、我々に選択された ターゲット物質に対してより高いアフイニチイをもつ一連のタンパク質を得るた めに新進的な過程を用いるだろう。アフイニテイプレートから１回の溶離課程で １ｏｏＯ倍の増加が示されている。

異なる変異図式を用いることは異なる結合タンパク質を生成する。いかなる所与 のターゲットに多くのタンパク質が結合するだろう。それ故、もしも１つの結合 タンパク質がいくらかの理由（例えば、余りに抗原性）で適轟となると、操作は 異なる変異パラメータでくり返される。例えば、変化させる異なった残基が選ば れるかも知れないし、新しいアミノ酸の分布が同じ残基でテストされるように変 化コドンでの異なったｎＬ分布が選択される。たとえ残基の同じ基本セットが用 いられたとしても、父上させるサブセットを選択する頭圧が変わると、異なった ＳＢＤが得られるだろう。

Ｓｅｅ、　１７．５　：可能な突然変異誘発の他の様式ここで議論するＧＰの集 団に多様性を創造する様式は可能な唯一の様式ではない。少なくとも１つの選択 から得られる情報の大きな７ラクシヨンを保存し、そして司じドメインに他の突 然変異を導入する突然変異誘発のいかなる方法も効力をもつ。

制限要素は生成される個々の形質転換体の数とアフイニテイ分離を通して成就で きる強化量である。それ故、好ましい具体例１：；　Ｐ　Ｂ　Ｄの結合特注に最 も影響するように思われる残基に突然変異をおこさせ、またＩＰＢＤの重要な構 造をこわすとは忘えない方法を用いることである。

又然夏異の他の様式は考えるべき他のＧＰを許すだろう。例えば、ラムダバクテ リオファージは制限部位過剰のため力セント式突然変異の有用なりローニング伝 達手段ではない。しかしながら、特別な８Ｉ！限部位の必要なしにラムダ上に一 末鎖オリゴーｎＬ指向の突然変異が用いられる。何人といえども大発明に要求さ れる高レベルの多様性を導入するための一末鎖万すゴーｎｔ指向突然変異を用い ることはできないが、もしも可能なら、このような方法はおおきなゲノムをもつ ファージを月いることはＨＨＭ　ｂに結合するＢＰＴＩ派生の結合タンパク質Ｍ １３７アージで表示 下記は通常のＥ、ｃｏｌｉバクテリオ７アージＭｉ３を遺伝子パッケージとして 用いるウマ心臓ミオグロビン（ＨＨＭｂ）のためのアフィニティと結合するＢＰ ＴＩからの新規な結合分子を増殖するプロトコルの仮説的な笑施例である。なお 、所望の結果を得るには、ここに開示された所に従ってより適切な最適化が必要 であることは了解されたい。好ましい方法での可能な変形例はこの仮説的寅施例 の種々のステップの次に続いて論述される。

仮説により我々は次の技術的可能性を設定した。

Ｙ　ｎｏ　５ｓＤＮＡｉｏＯ塩基長の合成６二対して５０ｈｇｓｓ：）ＮＡ６０ 塩基長塩基酸に肛して１０μｇｓｓＤＮＡ２０塩基長の合成に註してｉｍｇＭｏ 、１Ａ１００塩基 Ｙ　＠ｌ　１ｍｇ／ｉ Ｌ、、　ブランｉ・プラントに付き０．二％ステイノキー・プラントに付き４％ スティッキー・スティッキーに付き１１％Ｍ　５ＸｉＯ婁 ０　９００倍の富化 Ｃ４Ｘ’Ｏ”中に１ Ｎ　１０道程：ｐａｓｓｅｓｌ Ｓ　Ｏ，０５ 寅施ｆ１１１ 冨１部 この笑施例では、我々Ｃ；複製可能ＧＰとしてＭｉ３を、そしてＩＰＢＤとして ＢＰＴ　Ｔを用いる。笑二部において、Ｍ！３誘導体の外面上において顕示され たＢＰＴＩを得ることだけを取り扱うこととする。

可変ＤＮＡはｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子山に導入し得ようが、Ｂｐ７　ｊのトリプ シン結合性域をコードする域内には導入できない。ＢＰＴ　：がひとたびＭ１３ 誘導体のＭ１３外面上に顕示したら、アフィニテノ分離の処理を最適化する第２ 部に進む。

この寅施例のために、民々はＥ、ｃｏｌｉ、のフィラメント状バクテリオファー ジ、Ｖ１３を選んでいる。我々は、成長能力のある紐薗の細胞よりも、ファージ は物質代謝力が非常に少ない故にファージを良しとする。我々は、胞子よりもフ ァージを良しとする。それはウィルス粒：Ｆ−主成の分子メカニズム及びウィル ス粒子の三次元構造が、胞子の胞子組成及び構造の相当する成立プロでスの理解 よりも非常によく理解されるからである。

Ｍｉ３は大変よく研究されたバクテリオファージであり、ＤＮＡ配列のためまた 遺伝子ベクターとして広く使用されており、それ１；フィラメント状ファージの 群の典型式メンバーである。ファージの６から選ばれることができるＭ二３及び 他の７アージに関する事項は、Ｓｅｃ、１．３．ｉに引用されている。

他のバクテリオ７アージに比して、フィラメント状７アージは一般に魅力あるも ので、特にＭ２Ｓは次のことがら魅力あるものである。

１）ウィルス粒子の三次元構造が知られている、２）コートタンパク質の処理法 がよく理解されている、３）ゲノムが膨張性である、 ４）ゲノムが小さい、 ５）ゲノムの塩基配列が知られている。

５）ウィルス粒子が物理的にぜん断力、熱、冷却、グアニジニウム　Ｃ１，低ｐ Ｈ及び高置に対して担抗性である、及び７）７アージは、塩基配列化が、特に容 易であるので、配列化ベクターである。

８）抗生物質耐性の遺伝子が予測可能な結果をもってゲノムにクローンされてい る（ＨｉＮＥ８０）。

Ｓｅｃ、ｊ−０，及び１．３に列挙されている他の基塩も同喋に満足される。即 ち、Ｍｉ３は容易に培養され貯蔵され得る（ＦＲＩＴＳ８５）、感染後、各感染 細胞は１００〜１ｏｏｏのｖ１３子孫を竺する。Ｍ２Ｓは異営又１；扁価な媒質 を必要とすることなく、また容易に産生され濃縮される（Ｓ／Ｌｉ６４．　ＹＡ ＭＡ７０．　ＦＲｉＴ８５）。東３１＝物理釣作月、即ち温度（８５°Ｃ１３０ 分で１０％のファージが包子）、せん断（ワーリング　ブレンダーで殺せない） 、デシケータ−（適用Ｔ−能）、放射線（適用本能）、経時（数年間安定）に対 して安定である。

ＭＬ３は化学薬品に対して安定である。；二ち、ｐＨ（＜２−２（ＳＭＩ２−２ （Ｓ、表面活性剤二速用不能、シャオドロープ（グアニジニウムＨＣ１・６．０ Ｍ）、イオン（特に感受ｉなし）、有機溶媒（エーテル及び他の有機溶媒は致死 （ＭＡＲＶ７８）、プロテアーゼ（適用不能、ＨＨＭ’：＋ｌ：、非プロテアー ゼ）。′Ｍ１３は他の酵責に感能するとは知られていない。

Ｍｉ３ゲノムは６４２３’ｏ、ｐ、であって、その配列は公知である（ＳＣＨＡ ７８）。ゲノムは小さく、カセッ）　Ｊｃａｓｓｅｔｔｅｌ、突然変異誘発は一 末鎖万すゴｎｔ支配の変異誘発と同様に、ＲＦ　Ｍｉ３（ＡＵＳＩｉＳ７）正で 笑際的である。Ｍ２Ｓはプラスミドであってそれ自体形質転換システムであり、 そして理想的な配列付ベクターである。薊３はＥ、ｃｏｌｌのＲｅｃ株上で成長 させることができる。Ｍ１３ゲノムは膨張性である（ＭＥＳＳ７８．ＦＲＩＴ８ ５）。Ｍ２Ｓは何等有益とはならないが、細胞を溶解することがない。遺伝子■ の配列（＝知られており、アミノ！Ｉ配列はＬａｃＵＶ５プロモータを用いて合 成遺伝子上にコードすることができ、そしてＬａｃ　Ｉリブレッ７と央同して月 いられる。

′Ｌａ　ｃ’：　Ｖ　５プロモータは！ＰＴ（、により生起される。選伝子■タ ンパク賃（＝−分研究されたプロセスにより分解され、Ａ２３とＡ２４の間で分 子される。逼伝子■タンパク質の残基１８．２１．２２、及び２３（＝分子を制 御する。成熟した遺伝子■タンパク質は円状５ｓ）ＮＡの農つにシース：５ｈｅ ａｔｈ３を作る。ｆ１ウィルス粒子の三次元構造は田程度のリゾルージョンにお いて：ａｕ　ｍｅｃｌｕｍ　ｒｅｓＯＩｕ／Ｌｉｏｎ：知られ、遺云子■タンパ ク質のアミノ天端はウィルス粒子の表面上ある。Ｍｉ３遺伝子■タンパク質への 融合は何ら報告されていない。Ｍ’３コートタンパク質の二次元構造：＝三次元 構造において暗示的である。成熟Ｍ１３遺伝子■タンパク質は１つのドメインの みを冑する。４個の微量な［ｍ１ｎｏ「ｊタンパク質即ち遺伝子■、■、■及び ■がある。これらの微量タンパク質の各々は、ウィルス粒子光り約５フピーであ って、形態形成又は感染に係わっている。主要なコートタンパク質は、ウィルス 粒子光り２５００コピーより多く存在する。

■１遺伝子■の他の遺伝子への融合は報告されていないが、ウィルス粒子三次元 構造の知得は、１ＰＢＤの成熟Ｍｉ３コートタンパク質（Ｍｉ３　ＣＰ）のアミ ノ末端への付加を全く興味深くさせる。ＢＰＴｌのＭｉ３ＣＰへのｔ接的融合が 、ＢＰＴ　！をＭＬ３表面上に顕示させない万一の場合には、ＢＰτ１配列の１ ｆｆｉ及び／またはＢＰＴ　ｉとＭ１３ＣＰとのＶの挿入体の短いランダムＤＮ Ａ配列を変化させる。　スミス（ＳＭＩＴ８５）及びデラクルス等（ＣＲ，［１ Ｚ８８）は、遺伝子１口への挿入は、新しいタンパク質ドメインを生ぜしめ、ウ ィルス粒子外面上に比視することを示した。ｂｐｔｉ遺云子を罰３ｃｐ遺伝子に 融合させることによって、ＢＰＴ１をウィルス粒子外面正に出現させることがで きないならば、我々はｂｐｔ’、を、遺伝子ｍにスミスにより；たデラクルス等 により月いられｔ；部位が、天端の１つに、融合さてるであろう。我々は若二の 変化さてられていない遺伝子■タンパク質が存在Ｔるように、遺伝子工の第２の 合成コピーを使用下るであろう。

遺伝子■タンパク賃は、多くのコピーに存在する故、またウィルス粒子口の位！ 及び配向７ｏｒ　１ｅｎｔａｔ　ｉｏｎ：が知られている故に、Ｏ５？とじて選 ばれる。＝−トタンバク賀自体のアルファ螺線細についてコートタンパク質の方 位のス確かさは重要でないことに留意されたい。

ｉ６の三次元モデルは、ＢＰＴ　ｉのＭｉ３ＣＰの天端への融合が、他の融合部 位よりも可能在高くτ能左タンパク質を生ぜしめることを強調している。（Ｓｅ ａ、　５−３−３．参照）Ｃ３プレコート（５ＣＨＡ７８）のアミノ酸配Ｔ＋： 　（＾Ａ−ｓｅｑ　Ｉと呼ぶ）１＝１次の通りである。

アミノ酸の単一文字コード及び不明覆’、ａｍｂ１ｇｕｏｕｓＪＮＡのための＝ −ドは夏際的に認められているものである（ＧＥＯＲ８７）。新規タンパク質ド メインをＣ３ＣＰに挿入するためｉ＆良の部位はＡ２３のあとであり、これｉ； Ｓｒ’−■がＡ２３の後のズ〉コートタンパク質を切るからである（矢５に示す ）。分泌され得るタンパク質はそのアミノ天端において成熟Ｍ’−３０？に結合 下るであろう、、成熟！Ｊ！３ＣＰのアミノ床端はウィルス粒子の外面に位！す るから、導入ドメインは外側で顕示下るだろう。

３？”Ｅｊ：すべでの基準と合致もしくはそれを越えているので、この寅施例め ＩＰＢＤとして選ばれる。即ちそれはり１さく、周知の三次元構造を有する非常 に安定なタンパク質である。Ｍａｒｋｓ等（ＭＡＲＫ８６）は、ｐｈｏＡシグナ ルペプチド遺伝子７ラグメントとＢＰＴｉの仄熟形をコードするＤＮＡとの融合 は、天然のＢｒ’丁１をＥ、ｃｄｉｉのＥ？ａ肩辺（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に比 視させたと報告し、これはＢＰＴＩの構造においてそれが分泌されることを妨げ るものは何もないことを物語っている。

Ｍａｒｋｓ等（Ｍａｒｋ８７）はまた、ＢＰＴＩの構造藤；シスチン　ブリッジ の１つを凍云しても安定であることを示した。彼らはこれをＣ２４、Ｃ３８の両 者を２個のアラニン又は２個のスレオニンの何れかで置き換えることによって行 った。彼らが撤去したＣｉ４／Ｃ３８シスチン　ブリッジはＢＰＴＩ中の切れ易 い結合に非常に近接しているものであって、驚いたことには、両者の変異分子は トリプシンインヒビターとしての作用があった。このことは、ＢＰＴＩは過剰に 安定であり、そこで数多くの表面の変異にもかかわらず略同じ構造にたたみこま れているようである。相同体の知得を用いて（下記参照）、我々１；、基本のＢ ＰＴ［造が維持されるべきであるとすると、変化されてはいけない残基はどれか を推論することができる。

３？７：の三次元ＩＲ造がＸ−線画折により（ヨニＢニア７、　ＭＡ−ＲＯ８３ 、ＷＬ○Ｄ８４、’２’、０ＤＢ７ａ、　ＷＬＯＤ８７ツ）また＝ｉ子回＝３： （’ｙ！−０Ｄ８４）更にはＮ費（ＷＡＧＮ８７）にｄつ高度分解能イニおいて 測定された。寄託されたＸ一旦折構造の１つ７６ＰＴＩ−の口に、Ａ５８は何ら Ａ５３の電子密度はなく、Ａ５Ｂ！＝′４異的に決足されｊ；一致を有しないこ とを示しｔ；。そこで我々１＝、カルボキシ基がたたみこまｒ、た構造＝でなん らか重要な相互反応をなさないことを知る　Ｂ？７Ｈのアミン末端基はカルボキ シ末端基に非常に近い。ゴリデンベルグとクレートンＣ：、Ｅ形化した：ｃｉｒ ｃ鱈ａｒｉｚｅ６−、ＢＰＴｉと円形に１列を入ｒ′Ｌ換えｒ：：ｃｉｒｃｕｒ ａｊｙ　ｐｅｒｒｎｕｔｅｄ：ＢＰＴ７について報告しｆニー　（ＧＯＬＤ８３ ）。ＢＰＴ　′、に相開なモモのタンパク質は何れかの天端に多りの残基を有す る。

Ｂ？でＩ（＝「タンパク質の折りたたみの不責累子！、ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｇｅ ｎ　ａｔｏｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｌｄｉｎｇ：ｊと呼ばれ、無数の英 検的また理論的研究の主題であった（ＳＴＡＴ８７．５ＣＨＷ８７．　（，０Ｒ Ｄ８３．　ＣＥＩＡＺ８３）。

Ｂ：’Ｔ　＋は、少なくとも３２個の相同タンパク質が知られているという付加 的利点を有する（表１３に示される）。イ万ン性グループの符号：ｔａｌｌｙ： は、表１４に示され、各々の残基に生ずるアミノ酸のタイプの複合体忙。ｍｐｏ ｓｉｔｅ３＋：ｉ　３５に示される。

ＢＰＴ　Ｉは吉日に水に溶は金属イオンとの結合は知られていない。

ＢＰＴ：は何も知られた酵素活性を有しない。ＢＰＴ　Ｉはトリプシンに結合下 る、（スｄＩ＝６．ｏｘ　ｌＯ−”Ｍ（ＴＳＣＨ８７）。３２τ〕は毒性ではな い。ＢＰＴＩのに２５がＬに変化すると、変異ＢＰＴ？とにリプシンとの間に測 定できる結合はなくなる（ＴＳＣＨ８７）。

保？：：ｃｏ＊５ｅｒｖｅ：された残基のすべてＣ＝埋められ、７個の一分保存 された残基のうちＧ３７のみが観察可能の露とを有する。ＢＰＴＩに３ける各残 基のソルベント　アクセスビリティは表１６にあげられ、それはＢｒｏｏｉ＜、 １ａｖｅｎ　Ｆ’ｒｏｔｅｉｒ＋　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋの登録ｒａｐτ１：のツ ルベンｉ−ラジウス’、５ｏｉｖｅｎｔ　ｒａｄｉｕｓ：　１．４　Ａ、　表７ で与えられた原子５径及びり一及びリチャーズの方法（ＬＥＥＢ７４）から計算 された。

氏存されていない５１個の残基は各々、アミノ酸の２種類以上を収容することが できる。各々の残基において、その残基に既に観察されｔ；アミノ酸だけを独立 的に置換することにより、我々（＝略７ｘ］、ｏ４２ｓの異なるアミノ酸配列を 得ることができた。

それら配列の大とは、ＢＰＴＩと非常に類似した構造に重なっているであろう。

ＢＰＴ　Ｉは巨大分子用のＩＰ”ｌＤとして有用であろう（Ｓｅｅ、２．１．１ ）。

ＢＰ’ＴｒとＢＰＴＩ相同体は多くの酵素を、かたくまた高い特異性をもって結 合する。

ＢＦＩＴＩは非常に高いｐＨでは例外だが、強くプラスＩ：荷電され、そこでＢ ＰＴ　１は、意図する使用条件のもとてあ；り強くないプラスのターゲットのた めのＩＰＴＩとして有用である（Ｓｅｃ、２．　ｉ、２）。

かし全く異なる電荷を有するＢＰＴ　Ｉ相河体が存在する（ｊ！Ｏち、−７にお けるＢｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉからのｓｃｒ−ｍ及び−１におけるウシ初乳からの トリプシン　インヒビタ）。表面上にＢＰＴ　；を顕示するＭ２Ｓの誘導体が発 見されたら、ＢＰＴ　Ｉドメインの配列は、酸性またはｃ！：Ｉ性のＢＰＴＩを 産生する相同配列の１つで置き換えるこ２ができる。

ＢＰＴＩ（＝酵素で１＝ない（Ｓｅｃ、２．’−３参照）。ＢＰＴ７は非常に小 さいが、もしこれが薬学的な問題を引き起こすのであれば、２以正のＢ？二ｉ− 誘導ドメインを、２個のドメインを有するヒトのＢＰＴ　ｌ相罵体におけると同 様に、結び付けてもよい。

Ｘ二３誘導体は好ましいＯＣｖである（Ｓｅｃ、３参照）。１−ファーシミμ′ ：ｐｈａｒｇｅｍｉｄ、−ｊは、７アージとプラスミドとのハイブリッドであっ て、この発枦に月いられる。７アージミドを有する細胞から遊離された二本鎖プ ラスミドＤＮＡは標準協約により命名されている（例えばＦ’ＸＹ２４）。これ らの細胞から誠整された７アージはＸＹ２４と表示されたであろう。Ｂｉｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　Ｋ／Ｓ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ発光）のようなファージミドは、 我々の目的には適轟でない。それはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはＭｉ３の全部のゲノ ムを含んでいなくて、助人７アージとともに共感染により救済しなければならな いからである。

このような共感染は、本発明のためには不適当なヘテロジーナスな７アージを生 ずる遺伝子組み換えに導く可能性がある。

バクテリオファージＭ１３　’ｏｌａ　６１　（ＡＴＣＣ３７０３９）は、野生 型Ｍ１３からベータ　ラクタマーゼ遺伝子の挿入を介して導かれる。

このファージはＤＮＡ　８．１３ｋｂを含有する（、　Ｍ’ｒ３　ｂｌａ　ｃａ ｔ　１（ＡＴＣＣ３７０４０）は、ＭＬ３　ｂｌａ　６１から、クロラムフニニ コール耐性遺伝子（ＨＩＮＥ８０）を更に追加挿入することを通じて導かれる。

Ｍ！３　ｂｌａｃａｔ　ｌはＤＮＡ　９．８８　ｋｂを含む。Ｍ１３のこれらの 変異株の何れも複製のＣｏ１Ｅ　ｌ源を含んでいないが、何れも本寅施例のため の有用なりローニング　ベクター構成用のと発物として使用できよう。

この寅施例のＯＣｖは、図４に示された方法によって構築される。Ｘ寅施例のた め構築されたプラシミｙ及びファージミドの丁べてについての蘭凰な記述は表１ ７に見られる。

ｓｓ　ｏｉｉｇｏ−ｎｔ部位指向の変異誘発のためには、多くのプライマーが高 い効率に導く。３種の非夏異誘発性プライマー、ｉｔ　Ｎユ３の２３２６−２３ ５２塩基、ｗｔ　Ｍｉ３の４８３４−４８７５−ＦＫ基、及びｐＢＲ３２２の３ ４３ニー３４５ｉ塩基の補体が使用される。ｐＬＧ　２及びその誘導体は、−Ｄ ＮＡ鎖＝にａｍｐ貢遺伝子のアンチセンススにランドニａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅＳ ｔｒａｎｄｊを含有している。セグメントはＩＢＣ含有量にするため、またｐＬ Ｇ　７ゲノムを略等長の数個のセグメントに分（７るために取りあげられる。

ＯＣｖを構築するのに必要な遺伝子工学手順は、商業的に入手できるｍｌ限酵素 を推奨された茶件で用いる標準的なものである。

ＤＮＡのすべての制限７ラグメントはＨＰＬＣ又は電気泳動法により精製される 。Ｍｉ３及びその工学処理された誘導体は、Ｅ、ｃｏｉｉａＰＥ３８４（Ｆ”、 Ｒｅｃ−１Ｓｕｐ−１Ａｍｐ’）に感染さぜられる。Ｍｉ３の誘導体グラスミド ＤＮＡ１＝、カルチヤー守で多数互の感染を避けるようにＥ、ｃｏｌｉ株ＰＥ３ ８３（Ｆ−１Ｒｅｃ−１Ｓｕｐ”、Ａｍｐｓ）に形質転換される。

Ｍ１３ファージの取り出しは、５ａｌｉｖａｒ　ｅｔ、ａｉ、　（ＳＡＬＴ６４ ）の手続きにより、複製可能の形（ＲＦ）　Ｍｉ３の取り出しはＪａｚｖｉｎｓ ｋｉ　ｅｔ。

ａｉ、　（ＪＡＺＷ７３ａ及びＪＡＺＷ７３）の手段による。複製の源Ｃｏ１Ｅ ｌを含有するプラスミドの遊離は！ｊａｖｉａｔｉｓ　（ＭＡＮｒ８２）の方法 による。

我々は、便利な抗生物質抵抗遺伝子と、て、ｐＢＲ３２２からａｍｐ’遺伝子を 選ぶ。カナマイシンのような５：、の抵抗遺伝子も月い得る。ｐＢＲ３２２のＡ ｃｅ　Ｔ−から−Ａａｔ！［のフラグメントは、ａｎｙＩ′及びＣ０１＝１オリ ジンを便利に得られる源である。

Ｍ：３ｚｐ二８（ＮｅｗＥｒ＋ｇｉａｎｊ　ＢｉｏＬａ′Ｏｓ）はＡａｔＨ５Ａ ｃｃ　Ｉの何れの部位も有しない。それ放牧々は、ａｍｐ”：ｊｉ伝二及びＣｏ ！ＥＩの複製オリジンを有するｐＢＲ３２２のＡａｔｌ［−〜−Ａｃｃエフラグ メン−を挿入することを得しめるアダプターを、Ｍｉ３ｍｐ：８の’Ｆｆ＋望の 位置に挿入するｓ　Ｍ１３ｍｐｉ８は１ａｃＵＶ５グロモータ及び：ａｃＺ遺伝 子を含有し、これらは本発明の目的には、有益でＣ；ない。！ＪＥ３ｉｐ１８を Ａｖａ　Ｉｆ及び３ｓｕ３［３ｉでカットし、略６００の；賀塩基ペアを除くこ とにより、我々；＝、’ｏｐｔｉ遺伝子■遺伝子全遺伝子アために有用な数種の 酵素の認！ａ部位のすべてを途去する。

次のアダプターが合成される。

アンニールしたアダプターはＲＦ　ｖＨ釦２．３で連結される。ＲＦ　ｖ−３ｉ ｐ１ｇはあらかじめＡｖａ　ＩＩ及びＢｓｕ３６１でｉ’！ＦｔされＰＡＧＥ又 Ｂ＝Ｈ？ｒ（にＪつ精製されたものである。形質転換されたＥＶ胞はアンピシリ ンでグラスミド取りこみのためとりあげる。生じた構築はｐｐＧ二と呼ぶ。

ＰＬＧ　ｉからの）ＮＡｆ：、ＡａｔＩ［及びＡｃｃＩ蘭ｆで力・ントされる。

ｐ３Ｒ３２２のＡａｔ■−〜−Ａｃｅ　エフラグメントＣ；、ＬＧＩのバックボ ーンに連結される。正しい構築物をＰＬＧ２と命名する。

Ａｃｚ　ｒ台、頂部位（＝も（＝やベクター構築？こ；＝必要ない。この部位を 家元するため、ＲＦ　ｐＬＧ２　ｄｓ：）ＮＡがＡｃｅ　：でカッ”〜され、ク レノワ　フラグメン−及びｄＡＴＰ及び口ＴＴＰで処理されてプラントとし、次 いで！連結される。クローニング　ベクター（ｐＬＧ３と命名）　＋＝ｏｓｐ− １ｐｂｄ遺伝子の段層的挿入に万全である。

我々は今や３２７：ドメインを東３誘導体、二Ｇ７の外面に＝現させるであろう 遺伝子をデザイン下るに一分である。

Ｃ３の外側に付着した新規タンパク賃−′メインを得るために、我々は、Ｍユ３ のプレコートタンパク質のＡ２３の後に成熟ＢＰＴ４をコーコするＤＮＡを挿入 する。成熟Ｂ？Ｔ　：は向電アルギニン残基で始まり、シグナル　ベプチダーゼ エによる？’ｌｌがかかる場合通常である。シグナル　ペプチダーゼＩ（Ｓ：’ ｉ）は、！ｊ２３コートタンパク質とＢＰＴ　ｉとのキメラをＡ２３の後でカッ −し、そのカルボキシ天端でＭ　二３Ｃ？のアミノ天端に付着された成熟ＢＰＴ 　Ｉを残す。

次のアミノ腋配列（ＡＡ−ｓｅｑ　２と呼ぶ）が、成熟ＢＰτｌのｔ；めの配列 （τ記）をＭｉ３プレフートタンパク５　（矢臼で示す）のシグナル配列の１後 でＭ１３ＣＰ配列の前に挿入することにより構築される。　鮎−ｍ＠ｑ２ ＧＤＤＰＭＳＬＱＡＳＡＴ 融合タンパク賃の配列番号は特記しない限り二一ジされた融合を引用Ｔる。かく して薊３ＣＰ開始のアラニンは、ＶＢ２番」、「Ｎ−３こ？の二番−Ｚ　ｆ：４ ＝　−成熟３２丁！−Ｎ：３融合の５９番２と呼ばれている。

ｏｓｐ−ｉｐ’ｏａ：Ｊｉ伝子は１ａｃＵＶ５プロモータに；り調整され、ｔｒ ｉ）Ａ転写ターミネータにより終結する。ホスＮ株のＥ、ｃｏｉｉは１ａｃＩ＠ 遺云子を入居：ｈａｒ’ｐｏｒ３さぜる。ｏｓｐ−４ｐ’ｏｄＪ伝子が発現され 、野性並遺伝子■と平行に処理される。Ｅ３Ｃ？：：メインとつながった３？罎 よりなる新規タンパク質は、コートの７ラクシヨンのみを形成する。アフイニテ ィ分離はアフイニティマトリックス（ＳＭ！τ８５）に対して高い親和力を有す る５個または６僅のみの分子コピーを含有することができる。キメラタンパク質 の１％組入れは、表面１ｓ＝シた約３０コピーのタンパク質を生ずる。これがｘ −′−分であるなら、追加のコピーは例えばＩＰＴＧを増加下ることにより提供 される。

ＭＡ：１ＶＩＮ及び井、司研究者（ＢＡＮＮ８２　）のｆｌのためのモデルの後 のＭユ３＝−ト及びＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎ ｋ登録ｒ　６ＰＴ−からとられたＢ？τ■ドメインよりなるモデルが標準的モデ ル構築法により構築された。この標準法は共有供給の長さと角度が許容される値 に近いことを確かめる方法である。モデルは融合タンパク質が、Ｍｉ３ＣＰ又は ＢＰＴ　Ｉドメインの何れもの内部構造を損なうことなく立体化学的に受け入れ られる融合における超分子構造に適合し得たことを示す。

ＡＡ−ｓｅｑ　２のためのあいまいなりＮＡ配列コーディングは、制限ｆｌ！Ｉ 素にとっての認識部位がアミノ酸配列を変えることなく何処で創らｒＬ得たか、 その場所をコンビニ−タブログラムによって検査される（Ｓｅｃ、４．．３参照 ）。酵素のマスターテーブルが酵素供給者のカタログから収集される。Ｏｃｖを 切らない酵素である（好ましくは上記のように構成される）。

Ｓｅｃ、４．３において与えられた手順を用いて、我々は、表２５に示されるも ののような１ｐｂｄ遺伝子をデザインする。ある制限酵素（例、Ｂａｎ　Ｉ又は ＨｐｈＩ）はＯＣｖをあまりしばしば切りすぎて価値がない。

注釈付きのｍ１３ｃｐ−ｂｐｔｉ融合の全ＤＮＡ配列は表２５に示される。

有用制限部位及び生物学的に重要な特徴、即ちＩａｃＵＶ５プロモータ、１ａｃ ｏオペレータ、シャインーダルガルノの配列、アミノ酸配列、ストップコドン及 び複写ターミネータ−を示している。

１ｐｂｄ遺伝子は、Ｓｅｅ　、　５　、１記載の方法を用い数段階を経て合成さ れ、１５０〜１９０塩基対のｄｓＤＮ＾７ラグメントを発生する。

我々がｍ１３ｃｐ−ｂｐｔ　ｉ遺伝子（本実施例のｏｓｐ−１ｐｂｄ遺伝子）の 合成フラグメントをｐＬＣ３及びその誘導体にクローンする４つの段階は図５に 図示される。

ｐＬＣ３に導入されるべき配列は、ａ）　ＲｓｒＨからＡｖｒｎｃ表２５）まで のセグメント、ｂ）スペーサー配列（ｇｃｃｇｃｔｃｃ）　、及びｃ）Ａｓｕ■ からＳａｕ　Ｉまでのセグメントよりなっている。セグメントは１５８の塩基長 であって、明細書のＳｅｃ、５．１に記載されているように、２個のより短い合 成ｏ１ｉｇｏ−ｎｔｓから合成される。

表２７は挿入すべき配列のアンチセンス鎖を示す。９９塩基７ラグメントは上方 のケースレター中に示され、次の（５’−ＣＣＧＴＣＣ，、、。

ＣＣＴＣＧ−３’　＝ｏｌ　ｉｇ＃３）が標準方法で合成される。同様にセンス 鎖の二〇〇塩基長フラグメントは下刃のケースに示され、（５’−ｃｇｃｔｃａ 、、、、ａａｌｇ−３’　＝ｏｉｉｇ＃４）が合成される。アニーリングの後、 二本頒領域Ｃ＝、フレノウフラグメン一で既記の手扇にｄり膨張され、全長ニア ９′：ｊＬ基の２本鎖に下る。重複領滅Ｃ＝２３塩基対長であり、！４のＣＧペ アと９のＡ丁ペアを含有する。Ａｖｒ　ｉＩとＡｓｕ　ＩＩとの置のフＮ＾は最 終のｐｂｄ遺伝子において何もニードレない。それ（＝、次の二種で、周枠にＡ ｖｒ　ＩＩとＡｓｕ　ｉＩ両者によつ切られ得るようにそこにある。８塩基がＲ ｓｒＨの左に工えられ、９の塩基がＳａｕ　ｒの左に加えられた（　Ｂｓｕ３６ 　Ｉと司じ特異性と切ｆｒｙ式）。末端におけるこれらの塩基は最終産物の部分 をなさない。これらは、制限酵素が合成りＮＡを縛りそして切って、特定の粘Ｍ 竺ある天端を作るため存在しなければならない。

合成りＮＡはＳａｕ　Ｉ及びＲｓｒｎ両者で切られ、そして河様に切られたｐ工 ３のａｓＤＮＡｌ：連結される。正しい挿入を冑する構築をｐＬＣ４と呼ぶ。

ＯＣｖの構築の第２工程は表２８に示されている。ｐＬＣ４の構築と同様に、− 重鎖ＤＮＡ　２片が合成される６ｐ２５末端のアンチ−センス鎖の９９塩基長７ ラグメント及び（ｐ′１ｇで誘発する）９９塩基長７ラグメントである。両者の 合成ｄｓＤＮＡ及び１ｌｉｓＲＦ　ｐＬＣ４１：’ＡｖＨ及びＡｓｕ　ｉＩ両者 で切られ、そして連結され、モしてＥ、ｃｏｌｉを形質転換するために用いられ る。この第２の挿入を運ぶ構築物をｐＬ北Ｇ６の構築１：ｐＬＣ，５の構築と同 じように進行する。配列Ｊは表３０に示される。２／：５の一重鎖でグメンｉ− （二つはＮ６６で終わるアンチ−センス鎖からのもの、他Ｉ＝Ｙ５Ｂの＝メンの ３各年の塩基で比発下るでンス鎖からなるもの）が合成、アンニールされそして フレアラフラグメントで膨張される。合成りＮＡ及びＴ？Ｆ　ｐＬＣ５の両者は 、Ｂｓ５Ｈｉ及びＡｓｕ　Ｕ両者で切られ、精製され、そして適当な片が連結さ れＥ、Ｃ０Ｊｌの形質転換に用いられる。

ｐＬＣ７の構築は表３２に示され、ｐＬＣ４、ｐＬＣ５及びｐＬＣ５の構築と同 様に行われる。２個の一重鎖セグメント（三つはＶｉ、Ｏのためのコドンの二番 目の塩基で終わるアンチ−センス鎖からのもの、他はＥｌｏｌで始；るもの）が 合成され、アンニールされそしてフレノウフラグメントで膨張される。合Ｉｔ　 ）ＮＡ及びＲＦ　ｐＬＣ６の両者は、Ｂａａ及びＡｓｕ　ＩＩ両者で切られ精製 されそして適当な片が連結されモしてＥ−、ｃｏｉｉの形質転換に用いられる。

正しい４番目の挿入をもつ構築物はｐＬＣ７と呼ばれ、ｐＬＩｌ、７の外面二の ＢＰＴ　Ｉの発現はＳｅｃ、８の方法で証期される。

Ｍｉ３ａｍ４２９は、Ｖｉ３から導かれるファージのためのアフイニティマトリ ックスにより非特異的結合を減りさせるために用いられるＶｉ３のａｍｂｅｒ変 異である。ＭＢａｍ４２９はｗｔＭ；３から標準的遺伝子操作方法によって導か れる。

ファージＬＧ７が、培地に加えられた種々の濃度の！ＰＴＧを含むＬＢ培に口で Ｅ、ｃｏｌｅａ　ＰＥ３８４上で成長され、ｏｓｐ−１ｐｂｄ遺伝子を誘発する 。７アージＬＧ７はＪＰＴ（，０，０，０，１，１−０，１０−０，又は］００ ．ＯＭ又１：ｉ、ｏ＋ｎＭで成長された細胞から得られ、５ａｌｉｖｅｒ法（Ｓ ＡＬＩ６４）により回収され、そシで濃縮されてＭｅｓｓｉｎｇ法（ＭＥＳＳ８ ３）によりｉＱ　ｉ　２　ｐうｙ／ｍαのタイターを得る。

′、Ｇ７がその表面でＢＰＴ　！を発現するかどうかを決定する好；しい方法は 、これらの７アージがトリプシン（ｔｒｐ）又はアンヒｇロミリプシン（ＡＨｔ ｒｐ）の標識誘導体を、非結合のｔｒｐ又はＡＨ：ｒｐの通過を許丁フィルター 上に止めることができるかどうかを試験することである。トリプシンは１０個の チロシン残基を有し、襟準方法により１２５工でヨード化され得る。この標識ト リプシンを我々１＝ｒｔｒｐＪを、そして標識アンヒドロトリプシンをｒＡ三ｔ ｒｐ」で示す。他の型の標識は、例えばビ万チン又は、蛍光標識であり得る＊　 ＡＨｔｒｐ又はｔｒｐｌ：　０．３ｕＣｉ／ｕｇの活性まで標識される。１０” ＬＧ７（１０ｍＭｉＰＴＧ）のサンプルが、ｌｏｍＭＫｃ（ｌバッファ　−ｌ　 、　０ｍ１２９の１、Ｏｕｇのｔｒｐ又はＡＥｌｔｒｐと混合され、１ｍＭスｚ ｉｌｌＰＯ４／　ＫＥ（ＺＰＯ４でｐＨ８，０に調整される。混合物は、Ｍｒ・ ３０Ｑ、ＯＱＯより小のタンパク質を通過せしめる外層漢フィルタを国定したア ミコンＭＳＰＩ系統を通させる。フィルタは分析に先立ちｔｒｉｐ又はＡＢＴｒ ｐを含むバッファに漬けられる。フィルタはｔｒｉｐ又はＡＨＴｒｐを含有する バッファ０゜５１０１で２回洗浄する。フィルタ上に止まった放射活性をシンチ レーシざン　カウンター又は他の適尚な手段で定量する。各ウィルス粒子がＢＰ Ｔｉの１つのコピーを発現するならば、Ｑ、０５ｕｇのタンパク質が結合し、フ ィルタ上で３ｘ　ｉｏ’／ｍｉｎを引き起ニア。

ＢＰＴＩのＬＧ７表面上の定量的発現に対するも１つの方法は、トリプシンとＢ ＰＴ　ｌとの化学光景論釣結合を月いＢＰＴ　Ｉを滴足することである。各ウィ ルス粒子が非感染であるならば７アージ１０１２ｐ　！　ｕ　／　ｍ　Ｑのタイ ター溶液は略１−６×１０−’フアージである。ｐｆｕ対トータル　ファージの 比は、ｗｔＮ二３ｊこ比較した埒のＬＧ７の増加長を補正する２６０ｎｍと２８ ０ｎｍにおける分子吸光係数を使用してスペクトロメごり−により決定下ること ができる。例えば、１．０ｍＭの１ＰＴＧと共に成長した１０１２ｐ（ｕのＬＧ ７７アージを含有する溶液１．０ｍｌが、４．８ｘ　１０−Ｍｒでトリプシン溶 液を阻害するとすれば、我々は略３００Ｂ？″ＴＩ／ＣＰ（即ち（ＢＰＴＩ４． ８Ｘ　１０−’分子／ｉ）／（ファージｉ、５×ｌＱ−’／１））が存在すると 計算する。特足濃度の阻止は、ペプチド−リンク染料、例えばＮ−ベンゾイル− Ａｒｇ−Ｎａｔｔ　（ＴＳＣＨ８７）を用いるスペクトロメトリーにより最も容 易に測定される。

更には、アフイニチイコラムへの結合が、ファージＬＧ７の表面正のＢＯＴ　Ｉ の存在を明らかにするため使用されてもよい。ＢｉｏＲａｄＡｆｆｉ−ゲル１０ マトリツクス及びアフイニテイ材としてのＡＨｔｒｐ３０ｍｇを有する全容２． ０＋ｎ］のアフィニティコラムをＢｉｏＲａｄの方法で調整する。このコラムの 空隙容（Ｖｖ）を１．０としよう。

このコラムを（ＡＨｔｒｐ）で示す。

１０’　”Ｍｉ３ａｚ４２９のサンプルを、ＫＨ！ＰＯ，／ＬＨＰＯ，でｐＨ８ ，０に緩衝化した１０ｍＭＫｃＵ　、Ｑｍα守の（ＡＨｔｒｐ）に適用下る。次 にコラムを同じバッファで、二フルニントの２８０ａｒｎｊ：　８ける光学密度 のベースライン又は４ＸＶｖ（何れが最初としても）への復帰がコラムを通じて 過ぎてしまうまで洗浄する。ＬＧ７又はＬＧｉＯは次に閉鎖した同じパフ　７７ １−０ｍ１ｌｌ：Ｐｌｏ”ｐｆｕ／ｌαにおいて（ＡＨＴｒｐ）コラムに適用下 る。この洗浄の次に、ＫｃＱの（３ＸＶｖにおける）１０ｎＭから２Ｍのグラジ ェントをリン憩塩でｐＨ８，０に緩衝化しコラムに通ずる。

次に最初の７．ｃＱグラジェントを３ＸＶｖ口２Ｍから５ＭのＫｃＱグラジェン ト溶離にかける。第２のＫｃＱグラジニントは５ＭＫｃαｃＦ２ＸＶｖにおける ０、０Ｍから２．０ＭのグアニジウムｃＱのグラジェント溶離（リン載置緩衝化 ｐＨ８，０）を次に行う。５０ｕ４のフランクレヨンを集め、各フランクレヨン ４ｕＱをｉ！ｉ蔓に希釈して怒応細胞上におくことに；す７ア一ジ分析を行う。

コラム二の７アージ保留は、コラムカラコントロールファージＬＧＩＯ又はｖｔ Ｍｉ３．：りも著しく遅く溶ピする７ランクシヨンにおけるＬＧ７の出現により 示される。ＢＰＴＩを表現するＬＧ７の１離の成功は検証され、ｂｐｔｉ挿入及 び供給は五列分析され、そしてこの単離体は以下に示す更なる笑施に用いられる 。

ｖｇＤＮＡをＢＰＹ　Ｉ変異体とＭ１３ＣＰの間の官能融合を得るために使用す るならば（下記参照）、クローン単離体からのＤＮＡは変化を与えられた領域に おいて配列分析する。次に有用な制限酵素には必要のない制限サイトを、できれ ばからコドン変化により、除去する。０ＳＰ−ＩＰＢＤＩＩＰの残基の配列の数 は他からの挿入により変化するであろう。この後攻々は、しかし、残基２３の後 に挿入された残基を２３ａ、２３ｂなどと表す。残基８１の後の挿入体を８１ａ 。

８１ｂなどと表す。これはＣ５と０５５との間の残基の番号付を維持する。ＢＰ Ｔ　Ｉ中の残基Ｃ５は融合体中で常に２８として表示され、残基Ｃ５５は常に７ ８として表示され、そして−間残基は一定の数を有する。

ｉｏｍＭＩＰＴｆｌ；と共に成長した細胞からのＬＧ７フアージがその表面にＢ ＰＴ　Ｔを発現しないならば、我々（；若干の選択を持つ。我々は構築が１可故 に期待するような働きを欠いたかを決めようとする。

色々な可Ｆ！性ある欠損モードがある。それには、ａ）ＢＰＴｉｉ：Ｍｉ３ング フルＥ列から切り離されていない、コ）ＢＦ’ＴｉはＭｉ３ＣＰから切り離され ている、モしてＣ）キメラタンパク質が作られそしてジグアル配列の後で切り離 されるが、生じたタンパク質がＭｉ３フータに組み込まれていない。ＢＰＴ　！ はＥ、ｃ＊ｉｅから分泌された（ＭＡＲＫ８６）が、Ｍ１３コートタンパク質は 使用されなかった。それ故、シグナル配列から白米する問題は一様ではなし・が 可能である。

我々＋＝ｔ　ｒ　ｙ又はＡｎｔｒｙを用いるアッセイに；すＢＰＴ　ＩがＬＧ７ −感染細胞のベリプラスム或は細胞の内幕への境界に存在するかどうかを測定す ることができた。ペリブラスム笛のタンパク質は濃縮スクロース溶液中のりゾチ ーム及びＦＤＴＡを使用するスフェロプラスト生成を介して遊離となり得る（Ｂ ；ＲＤ６７、　ＭＡＬＡ６４）。ＢＰＴ　１がベリプラスム田で遊離となったな らば、上澄中で見出されたであろう。ｔｒｙを上澄と混合し、非変性分子量測定 コラムに通じてラジオアクチブな７ラクシヨンを集めたであろう。次にラジオア クチブ　フラクシ厘ンを５ｉ）Ｓ−ＰＡＧＥにより分析し銀染色によりｌ’Ｔ　 ！−サイズのバンドを試験したであろう。

スフェロプラスト生成は、内裏にアンカーしたタンパク質を露出させる。スフェ ロプラストをＡＨＴｒｔ５と混合し、口過か遠心分離の何れかで未供給のＡＨＴ ｒｐからそれらを分離する。高張／（ツ７アで洗浄した後、スフェロプラストを 、ＡＥＴｒｐ結合の程度をめて分析するか、又はウースターン分析により分析す るかにより分析する。ＢＰＴ　Ｉがベリグラスム中に遊離に見出されるならば、 キメラタンパク質が、Ｂ　ＰＴ　：とＭ１３成熟コート配列との閘及びＢＦ二： とシグナル配列との貨、両者において切り離されつつあつたこζを予測したであ ろう。その場合において、我々はＡＡ−５ｅＱの残基−７８〜８２のためのコド ンｌ：８いてｎｇＤＮＡを挿入Ｔることによって、ＢＰＴＩ／　Ｍｉ３ｃｐ翅合 を寂えたであろう。

Ｂ？Ｔ　ｉが内弧に付加すると見られるならば、２つの期待できそうな説明があ る。第１のものは、キメラタンパク質がシグナル配列の後で切られるがＬＧ７ウ イルス粒子に組み込まれないというものであり、旭理はまたＡＡ−ｓｅｇ２の残 基−７８と８２との間にｖｇＤＮＡを挿入することであろう。別の仮説は、シグ ナル配列が切り離されてもＢＰＴＩはたたむことができそしてトリプシンと反応 することができたということである。細胞の芯モジネートから単離されたトリプ シン−結合性材料のＮ−末端アミノ厳配列付は、どのような過程がおこりつつあ るかを決定する。シグナル配列が妬り離されようとしていたならば、Ｃ７８とＡ ８２との間の残基を変化させるために上記の手段を月いたであろう。続いての道 は残基８１の後に残基を加えることであろう。もしシグナル配列が切り離されて いなかったならば、我々はＡＡ−ｓｅｑ２の２３と２７との間の残基を変化させ よう。次の道程は、プロセスが２３の後に残基を力Ωえることであろう。

ＢＦ’τ工がペリプラズムにも同腹にも見出されなかった場合は、この欠損はシ グナル配列又はシグナル−配列−ＢＦ’Ｔ　Ｉ結合口にあると予想したであろう 。この場合におけるあ理は２３と２７との市のタンパク質を改変することとなろ う、　ｂｐｔｉ−遺伝子■融合に変化を誘発する君子の英検が可能であり、それ らは次のものを包含する： 二）〇二ｉｇ＃ｉ２お；びｏｉｉｇ＃Ｘ３を使用する残基７８と８２の闇の３側 の変化を与えたコドン、 ２＞ｃ：ｉｇ＃三４とｏ１ｉｇ＃：５を使用する残基２３と２７間の３偲の変化 を与えたコドン ３）ｏ：ｉｇ＃′、３お；びｏ１ｉｇ＃１２ａｔ−使用する残基７８と８２の間 の５個の変化を与えたコドン、 ４）ｏ及ｇ＃ｉ５とｏｉＸｇ＃ニ４ａを使用する残基２３と２７３の５１１の変 化を与えたコドン ５）ｏＥｉｇ託３およびｏｉｉｇＨ２！：＋を使用する残基７８と８２の間の７ 個の変イとを与えたコシン、 ６ＪＯ：二ｇ＃ｉ：）ト０１１ｇ１’ｊ’ｉ４ｂを使用する残基２３と２７覧の ７個の変化を与えたコドン ３：ＴニーＭ二３ＣＰ結合を変化するために、我々Ｃ＝７８と８２の間のタンパ ク質のだめのコドンに変化を与えたＤＮＡを、ｐＬＧ７のＳｐｊ＞　工及びＳｉ ：部位に導入する。最後のシスティンの食のタンパク質はＢ２Ｔｉｃ相周のアミ ノ鼓配列において組成並びに長さ両者とも変異性が高い。２５にこれらのタンパ ク質はＣ７９，Ｃ８０及びＡ８ｉとして表示されている。Ｍｉ３ＣＰの最初の部 分はＡ１２、Ｅ８３及びＣ８４で表されている。ｏｌｉｇｏ−ｎｔｓのｉつ、ｏ ｌｉｇ＃ｉ２．　ｏ：ｉｇ＃１２ａ又はｏｌｉｇ１２ｂ及びプライマ−ＯＬ１ｇ Ｏ＃ｉ３は標準方法で合成されるａ　ｏｌｉｇｏ−ｎｔｓは次の通りである。

ｒ＠５ｉｄｕａ　７５　７６　７７　７８　７９　８ｏ　ａ１８２　８３５　’ 　ｑＣｌ　ｑａｃｒｌ　ＣＧＣＩＡＴＧＩ　ＣＧＴＩＡＣＣｌ　ＴＧＣＩ　ｑｆ ｌｃｌ　ｑｆ）ｃｌ　ｑｆｋｌ　ＧＣＴＩＧＡＡＩ　| ８１、ｃ　８１ｄ　８２　８３　８４　８５　８６　８７ｑｔｘ　ｌ　ｑｆ）ｃ 　ｌ　ＧＣＴ　Ｉ　ＧＡＡ　Ｉ　ＧＧＴ　Ｉ　ＧＡＴ　ｌ　ｃ、ｗ　ｌ　ｃｃｃ 　ｌ−ここで、ｑｉ＝（０，２６Ｔ、　０．Ｌ８Ｃ，０，２６Ａ及び０．３Ｇ） の混合物であり、ｆｉ＝（０，２２″：、　Ｏ，ｉ６Ｃ，０，４ＯＡ及び０．２ ２Ｇ）の混合物であり、そしてに、＝Ｔ部と０部の：司部混合物である。下方の ケースにおいて何れかの天＠ｌこ示される塩基はスペーサーであって、クローン した遺伝子にＣ２組み込まれない。プライマーＣ＝長鎖の。′Ｌｉｇｏ−ｎｔｓ の各々の３′−エンドに相補玄である。変異付与。ｌｉｇｏ−ｎｔｓの１つとプ ライマーｏｉｉｇｏ＃ｉ３が尚モル量組合わせられアンニールされる。ｄｓＤＮ Ａはずべての４　（ｎｕ）Ｔ？ｓ及びフレノウフラグメンごをもって完成される 。生成ｄｓＤＮＡ及びＲＦ　ｐＬＧ７１：Ｌ　Ｓｆ　ＩＩ及びＳｐΩ１両看で切 られ、精製され、混合されそして連結される。この連結混合物は５ｅｃ−ｉ５記 載のプロでスを通して進行させる。このプロてス＝で我々は、ｒ　Ｐ　Ｔ　Ｇで 誘発された時庇τｒｐを結合する形質変換−たクローンを選ぶ。

ｖ］３ジグアル配列ＢＦＩＴ　：との闇の結合の５法として、我々は２３と２７ ￥のタンパク質のためのコドンのこころで変化を与えたＤＮＡを？ＬＧ７のＫｐ ｎ　ｒ及びＸｈｏ　工の部位に導入下る。最初の３個のタンパク質１１Ｆ’τ： に相馬なアミノ籠配列において高い変動！である。相、同体配列はアミノ天端に おける長ざにおいても変動する。

ｏ：１（ｏ−ｎｔｓの１つ、ｏｉｉｇｏ＃ｉ４、ｏｉｉｇｏｉ４ａ又！：ｏｌＬ ｇｏ穀４′Ｏ及びプライマー０１１ｇ０ｊ’：ｌ）Ｌ：標準方法で合成される。

これらのｏｌｉｇｏ−ｎｔｓは次に記載される。

５’　ｌｔｃｑｌｃｇｇ１ｇｃｇｌＣ？ＣＩＧＡＧＩＡＣＡＩＧＡＡｌ　３’　 ｏｌｉｇ＃１５ここでｑは（０，２６Ｔ、　Ｏ，ｉ８Ｃ，０，２６Ａ及び０．３ ０Ｇ）の混合物であり、ｆは（０，２２″ｒ、　０−ｒ６ｃ、　０−４０Ａ及び ０．２２Ｇ）１１合物であり、ｋはＴＢと０部との耳部混合物である。下方のケ ースにおいて何れかの天端部に示される塩基はスペー７一である。変えられた０ １１ｇ　Ｏ−ｎ　Ｌ　Ｓの二つとプライマーとが邑モルｉ組合わせられ、そして アンニールされる。ｄｓＤＮＡ器：丁べての４：５の（ｎｔ）Ｔ？ｓとクレノウ ７ラグメントをもって完成される。生成ｄｓＤＮＡ及びＲＦ　ＰＬＧ７Ｋｐｍ　 Ｉ及びｘ、Ｉａ工両看でカットされ、精製され、混合されそして連結される。こ の連結混合物は、Ｓｅｃ、Ｌ５記載のプロセスを通して進行させる。そのプロセ スにおいて、我々はＩＰＴＧで誘発した時、ＡＨＴｒｐまたはｔｒｉｐを結合す る形質変換したクローンを選択する。

これらのアプローチの何れもが作用あるキメラタンパク質を産生じないならば、 我々は異なったシグナル配列、又はｊｊｉ３Ｉ：ｐの異なった０ＳＰ（例えば融 合（フュージョン）データが存在する遺伝子ｍ　（ＣＲＵＺ８８）、又は別の遺 伝子パッケージを試すことができる。

例１ 第２部 ＢＰＴ　Ｉは、トリプシンに（ｋｄ−６，ＯＸ　１０−”Ｍ）およびアンヒドロ トリプシンに非常に堅固に結合するので、これらの武士はＬＧ７上に顕示するた めの量のＢＰＴ　ｌまたはカラムに付着させる量の親和性分子を、最適化するた めには好ましくない。■５ｃｈｅｃｈｅ等は、数種のＢＰＴ　Ｉ誘導体の種々の プロテアーゼへの結合について報告している： ＢＰＴ　ｉ誘導体に係る解離定数、モル残基　トリプシン　キモトリプシン　エ ラスターゼ　エラスターゼ（ウシ膵ｇｌ）（ウシ膵Ｆａ）　（ブタ膵臓）（ヒト 白血球）リジ７　ａ、ｏｘ　１０−”　９−ＯＸ　ｉｏ−”　−３，５Ｘ　１０ −’グリシン　−−〒　７．Ｏｘ　ｉｏ−’アラニン　↑　−２，８Ｘ　ｚＯ− ”　２．５Ｘｉｏ−’バリア　−−５，７ｘ　１０−’　１．ｉＸ　１Ｏ−１ａ ０＜シン　−−１，９Ｘ二Ｏ−”　２．９Ｘ１０−’Ｔｓｃ：ｌｅｃ：１ｅ等の 報答から、我々は、−ｍ＝の印を付けた分子対１：３．５ｘｉＯ−″Ｍ；り大き いｋｃｉ’Ｔｈ有することを意禾し、そして７　。

を付けた分子対は３．５Ｘ　ｉｏ−Ｍよりさらに大きいｋｄを有することを意味 するものとする。ＢＰＴ　’＋お；び種々の交然変異種のトリプシンおよびその 他プロテアーゼに対下る結合に係るデータが豊富であることから（ＴＳＣＥ８７ ）、種々の方法を進めることができる。（その他のＰＢＤに関しては、２種の異 なるモノクローナル抗体を得ることができる。これらのモノクローナル抗体のう ちのｉつはｉｏ−”Ｍの程度のｋｄを有する高い親和性を有し、そして他の１つ は、ｉｏ−’Ｍの程度のｋｄを有下る、千程度の親和性を有する）。この例では 、ａ）ＢＰＴＩとヒト白血球エラスターゼ（ＨｕＬＥｉ）との間の田程度の結合 、ｂ）ブタエラスターゼのＢＰＴＩ　（Ｖ１５）に対する、９位に強い結合、あ るいはｃ）トリプシン（弱いが検知可能）；たはブタ膵臓ニラスターゼに対する ＢＰＴＩ　（Ａｉ５）　Ｃｐｂｄ遺伝子内の残基３８）の結合、を使用すること ができる。

（ＡＥ！Ｔｒｐ）に対する、ＬＧ７ビリγンの保持を野性型Ｍ１３の保持と比較 する。野性型Ｍ１３より多いＤＮＡを有するＭ１３誘導体は相尭して長いピリオ ンを有する。従って、ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子のコドン２およびコドン３に、ス トップコドンを有し、モしてコドン７に変更されたしコドンを有する点でだけｐ ＬＧ　７とは異なっているｐＬＧ　８を創造することにする。ファージＬＧ８は 、ＬＧ７と正確に司−の数のＤＮＡを有するものと考えられ、従って、ＬＧ８ビ レγンは、ＬＧ７ビリオンと、正確に！−の長さを有する。しかしながら、ＬＧ ８１：Ｌその表面上にＢＰＴＩ　’ｉ：　ｍ示することはできない。

ことなるＭｉ３−誘導７アージの固定を促進するために、標準方法によって、Ｌ Ｇ８のａｍｐｒ遺伝子をｐＢＲ３２２からのｔｅｔｒ遺伝子と置き換えた。この ｐＢＲ３２２の７ラグメントを有するＢＳＭＩ−ｔｏ−ＡＣＴＩｆ　ｔｅｔｒを 、Ｘｂａ　ＩおよびＡａｔｌＩで切断したｐＬＧ　８からのＤ　Ｎ　Ａ　−。

にリゲートする。９．２Ｋｂを有するこの正しい構築物はｐＢＲ３２２と容易に 区別される。これをＬＧｉＯと称する。

この７アージＬｆ：、１０を培地田で、種々のｉ？ＴＧレベルで増殖させ、従来 開示されている方法で収穫する。２．０ｍαの床容積を有し、そしてＢｉｏＲａ ｄ　ＡｆｆｉＧｅｌ　１０（ＴＭ）またはＡｆｆｉ−Ｃ，ｅｌ　１５（ＴＭ）　 ｌ　ｍＱ尚たりＯ，１ｍｇ〜３０．０ｍｇの範囲から得られる量のＨｕＬＥ　ｌ を支持しているアクアニテイカラムを選ぶ（ＨｕＬＥｌ）。この方ラムにおける ＥＩｕＬＥ　ｌの適当な一連の濃度は（０−１ｍｇ／ｍＬ　０．５ｍｇ／ｍＱ、 　２．０ｍｇ／ｍＱ、　８．０＋ｎｇ／ｍα、１５．０ｍｇ／ｌｎαおよび３０ ．０ｍｇ／　ｍＱ）である。（ＨｕＬＥｌ）のＶｖは、０．ｉｍａであると仮定 する。ＬＧ７フアージの溶出は、種々の付加量のＨｕＬＥ　１を有する（Ｅｌｕ ＬＥｌ）におけるＬＧＩＯの溶出と比較する。これらのカラムは下記の標準方法 で溶出するｉ）２８０ｎｍにおける光学濃度がベースラインまたは４ＸＶｖまで 降下するまで（どちらか早い方）、リンａ塩でｐＨ８，０に緩衝されているｌｏ ｍＭ　ＫｃＱ。

２）３ＸＶＶで、１０ｍＭ−２Ｍ勾配のＫｃＱｌｐＦｉはリン酸塩で８．０に保 持下る。

３）３ｘＶｖで、２　Ｍ　−５Ｍ勾配のＫｃＱ、リン酸塩でｐｉ（８に緩衝下る 。

４）２ＸＶＶで、一定の５　ＭＫｃＱ〒０−０．８グアニジニウムｃＱ、リン酸 塩でｐｉ（８，０に緩衝下る。

１Ｅましい誘発レベル（ＩＰＴＧｏｐｔｉｍａｌ）およびマトリックス上の親和 性分子の量（ＤｏＡＭｏＭｏｐｔ　ｉｍａ　１　）は、ＢＰＴｉを担持していな い′１．Ｇ８に比較して有意の遅延を示す。最も鋭し壮Ｇ７溶巴ピークを与える ようにセットするａ最良の分離はＢＰＴｉ／ＧＰの量が、細胞が１１０−０ｕ　 ＋ＰＴＧで誘発される場合に生成される量および４．０ｍｇＥｕＬＥ　ｌ　／　 ｒｎＱがＢｉｏＲａｄ　Ａｆｆｉ−Ｃ，ｅｌ　１０（ＴＭ）に適用される場合に 、生成される量であるときに生じるものと仮定する。

Ｂ？ＴＩ／Ｃ，Ｐの量およびＨｕＬＥ　Ｌの量／（支持体の容積）が最適にされ ている場合には、溶出速度、初期イオン強度、およびＧＰの量／（支持体の容積 ）を最適にすること番千頼った。これらのノ（ラメ−ターは、別々に最適にする ことができる。

最適のＢＰＴＩ／ＧＰおよびＨｕＬＥ１／支持体の容積を使用して、溶出速度を 変えて、すなわち最大流速の１倍、ｌ／２倍、１７４倍、１７８倍およびｌ／１ ６倍に変えて、ＬＧ７およびＬＧ８の溶出容積を測定する。最大溶出速度の１７ ４は、１／２よりも良好であるが、１７８はｌ／４とほぼ同一であると予想され る。したがって、ｌ／Ａｆｉ大溶出速度を使用する。

培毛中（１ＰＴＧ：　２．Ｏｍ！ｊ中で増殖された細胞から得られるＬＧ７の溶 出容積を１０″、１０１０．１０”および１０”ｐｆｕの負荷について、最適の ＤｏＡＭｃＭおよび溶出速度で測定下る。純粋なＬＧ７の１０”ｐｆｕ（二カラ ムに負担をかけすぎ、そして格２りの数のファージがＫｃｒｔ勾五におけるそれ らの特徴的位置以前に溶出するものと考えられるａ　１０”ｐｆｕはカラム僅か にだけ負担をかけずぎること、および二〇１°ｐｆｕはカラムに負担をかけ丁ぎ ないことも見いだされる。Ｓｅｃ、　ｉ５におけるアフイニテイ分離を使用する と、シグナル構成員が１０４で１部より多くない集！を含むことになるので、変 えられた集団の１０”ｐｆｕは、いずれの試料に関しても、負担をかけすぎるこ となく、１．ｏｍＱの最大容積を有下るカラムに適用できるものと結論した。こ の１　、ＯｍＱ刀ラムの１０Ｉ２ｐｆｕによる過負担は、無差別に接着する７ア ージを捕獲するための最初のカラムが、ターゲット物質を支持するカラムに対し て５〜１０倍長くあるべきであることをまた示している。ＩＰＴＧＩ：Ｐ２．Ｏ ｍＭである培地中で増殖されたｍ胞から得られるＬＧ７８よびＬＧ）Ｏの溶出容 積を、最適条件において、かつまた、種々のイγン強度、すなわちｉ、ＯｍＮ、 　５．０ｍＭ、　１０−０ｍＭ、２０．０ｍＭおよび５０−０ｍＭで１０１０ｐ ｆｕの負荷の場合について、測定する。これにより、たとえばＬ（，１０１０１ ｉ１−ＯＫｃＱで負荷した場合には、カラムによって僅かに遅延されるが、ＬＧ ７は上記勾配で、その特徴的場所に８いてカラムから常に流巴することを見い出 すことができる。残りのアフィニティ分離の全部で、初期イオン強度としてｌｏ 、ｏｍＭを使用する。

種々のＢＰＴ　ｌがそれらの表面上に顕示する７アージのクロマトグラフィ感度 を測定するために（Ｓｅｅ、　′１０．１）　、ＢＰＴＩドメイン中の残基の１ 個だけが異なっている、２種の密接に関連する７アージの人工混合物を調製する 。これらのファージのうちの１つは、この工程で使用するカラムに対して、Ｓ力 な親和性を有するが、他の１つのファージはカラムに対して親和性を有していな い。これらの混合物をクロマ−グラフィ９！ｊ、理し、カラムに結合しない多量 のファージの＝からどの位にり量のカラムに結合する７アージを、検知すること ができるのかを見いピす。

これらの試験では、ＡｆＭ　（ＢＰＴｒ）としてＡＦ、Ｔｒｐを選択した。２ｏ αの床容積を有するカラムを、（ＤｏＡＭｏＭｏｐｔｉｍａｌ　ＢのＡＨＴｒｐ ）／　（Ａｆｆｉ−Ｇｅ１１０（ＴＭ）ｍ（１）を用いて調製Ｔる。このカラム を（ＡＥＩＴｒｐ）　と記する。こりカラムはＶｖ−１，０ｏαを有する。

？　ＰＢＤとしてＢＰＴＩ（Ｋｉ５、野性型）を顕示するＬＧ７と比較して、１ ？Ｂ’）としてＢＰＴＴ　（Ｖ　１５）を顕示する。新規７アージＬＧ９を調製 する。ＢＰＴ　Ｔの残基１５は、ｏｓｐ−４ｐｂｄ遺伝子の残基３８である。ｏ ｓｐ−４ｐｂｄ遺云子のＡｐａ　ＩとＳｔｕ　Ｉとの間の短いセグメントを置き 換えることによって、Ｖ　ｉｌｍ　Ｋ　３８の変更を導入する。この正しい構築 物をＰＬＧ　９と記する。ＬＧ７７アージとＬＧ９−誘導体７アージとの間の識 別を促進するために、ＬＧ９のａｍｐｒ遺伝子をｐＢＲ３２２からのｔｅｔｒ遺 伝子と置き換える。Ｂｓｍ　Ｉ　（１３５３、プラントされたもの）とＡａｔπ （１４２８）との間の１．ＢＲ３２２からのＤＮＡを、Ｘｂａｌ（プラントされ たもの）およびＡａｔＩＩで切断された、ｐＬＧ９からのｄｓＤ　Ｎ　Ａにリゲ ートする。この三しい構築物は９．２Ｋｂを有し、ｐＢＲ３２２とは、容易に識 別される。この構築物をＬＧＩＩと記する。７アージＬＧＩＩからのＤＮＡの配 列を、新しく挿入されたｔｅｔＲ遺伝子の接合部の近くで測定し、この構築物の 確認を行う。

ＬＧ７およびり、（Ｊｌｌは、最通ｉ？丁Ｇ　（２，０＋ｎＭ）を用いて増殖さ せ、収穫する。混合物は下記の比率で調製する。

ＬＧ７：ＬＣｉｌ−１二Ｖｉｉｍ ここでＶｌｉｍは、ｌＯの７アクターで１０１０〜−ＯＳの範囲にある。まず、 Ｖｉ　ｉｍの大きい方の値を試験する。ＬＧ７を取り戻丁ことを可能にするＶｌ ｉｍが見い巴されたならば、小さい方の値のＶｌ　ｉｍは試験しない。

リン酸塩でｐＨ８に緩衝されている’ｒｏｖａＭＫｃＱ　１００μｍ２（：ｌの Ｍ　１３ａ、Ｈ４２９ｌＯ”ビリ万ンで処理すること、によって、先ずカラム（ ＡＦＩＴｒｐ）をブロックする。このカラムを、０Ｄ２６゜がベースラインに戻 るか、または４ＸＶｖがカラムを通過する；で（どちらか早い方）、同一緩衝液 で洗浄する。同一緩衝液１ｍ１１口にｐｆｕｉｏ”を含有する。ＬＧＩＩとＬＧ ７との混合物のうちの１つを（ＡＨＴｒｐ）に適用する。このカラムは下記の原 準方法で溶比する：ｉ）リン酸塩でｐＨ８に緩衝されている１０ｍ１ｊＫｃＱ； 　２８０ｍＭにおける光学濃度がベースラインまたは４ＸＶｖに達するまで（ど ちらか早い方）、（流出液は捨てる）。

２）３ＸＶｖで、！Ｏ＋ｎＭ−２Ｍ　ＫｃＱ勾配；ｐＨはリン酸塩で８．０に維 狩する（３　ｘ　１００ｔｔα７ラクシコン）。

３）３ＸＶｖで、２　Ｍ−５ＭＫｃαＫｃＱリン酸塩でｐＨ８に緩衝する（３０ 〜１００μα７ラクシヨン）。

４）２ｘｖｖで、一定の５　Ｍ　ＫｃＱ　〒Ｏ−０，８ＭグアニジニウムＣＱ； リン雌装置ｐＨ８，０に緩衝する（、　２　Ｘ　１００μＱ７ラクシヨン）。

５）ｉ、２ｘ　Ｖｖで、一定の５　ＭＫｃＱ＊　０−８ＭグアニジニウムＣａニ リン１３塩でｐＨ８、０に緩衝する（ｉ２ＸｉｏｏμＱフラクション）。

各フラクシヨンからの４μαづつの試料を、７アージ感受性Ｓｕｐ・細胞二に、 過里に希釈して置く（ここでＣ＝、Ｍｉ３ａｍ４２９は増殖しない）。７ア一ジ 感受性Ｓｕｐ↑細胞月の接種には、カラムマド１ノツクスの試料をよだ、使用下 る。プラークをアンピシリン含有Ｌ３寒天に移し、ＡＩ！ｌｐＲコロニイを、ｔ ｒｐＲ：たｌ：ＡＨＴｒｐＲを用いて、ＢＰＴＩ　（Ｋ　２５）の顕示ｌ：関し て試験する。

ＬＧ７を採取することができるＶｌ　ｉｎａ最犬値は４．ＯＸ　ｉｏ’であると 推定される。Ｔなわち、Ｃ５ａｎｓｉ＝　４．ＯＸ　二０”であると推定される 。ＬＧ７の車離には、これらのクロマクグラフィサイクルが必要であり、これに よるＣｅｆｆの最初の推’ｕ　５１ニア４０　（−ｅｘｐ（Ｑｏｇｅ（４，ＯＸ 　１０感）／３））である。

ここで、このアフィニティ分離の効工を測定下る（Ｓｅｃ、　ｉｏ。

２）。これは次のとおりにして行う： ａ）ｉ：Ｑの比率でＬＧ７とＬＧ１１との混合物を調製する。

′ｏ）１亘の分離サイクル毎に、ＬＧ７の集二を富化する。次いで、ｃ）最後の ファージ保有フラクシヨン＝のＬＧ７の７ラクシヨンを決定する。Ｑが１．５Ｘ 　ｉｏ’である場合に（＝、フロニイのうちの３％がＢＦＴＩＷｈ性である。Ｑ が１．５Ｘ　１０”である場合には、コロニイのうちの６０％がＢＰＴＩ陽セで ある。従って、計算により、Ｃｅｆｆ−０，６０ｘ　Ｌ５Ｘ　１ｏ３−９００で ある。

我々が推定したＬＧ７は、各ビリ万ンにおいて、１個または２個以上のＢＦ’Ｔ ７＋″メインを顕示すべきである。ａｓｐ−ｉｐｂａ遺伝子はＩａｃＵＶ　５プ ロモーターの管理下にあり、従りて、発現レベルのＢＰＴニーＭ１３　ＣＰは、 　ｌ　ｉ、”ＴＧ−、を月いて、処理することができる。

この構築物は、多くの異なる結合タンパク質（これらはいずれも３？Ｔ：にもと づくものである）の発現に使用することができる。

誘発のｉｉレベルおよびＡ！［（ＰＢＤ）の量（−ＤｏＡＭｏＭｏｐｔｉｍｕｍ −２゜Ｏｎ＋ｇ／　（支持体ｍＱ）　）を決定しなければならない。Ｓｅｅ、　 ｒ５．’ｒに記載の方法において、ターゲット物質をこの量でカラムに適用する 。これらのｆＩｌ適レベルは、企てのターゲットおよびＬＧ７にもとづくＭ２Ｓ の誘導体とに顕示される全ての種類のＢＭ！に適することができるが、異なるｐ Ｈまたは温度も使用する場合には、若干の追加のｆｋ適化が必要であることもあ る。

新規ＬＧ７誘導体の表面上にＰＢＤが現れるという点で高い可能性を有する。ｐ ＬＧ７：のｂｐｔｉ遺伝子の代わりに、別のｐＭｆｆｉ伝子フラグメンを置き換 えることができる。

例１ 第３部 代表的タンパク質ターゲットとして、Ｈｒｄｉ：を選択する。しかし、他のタン パク質を使用することもできる。ＨＨＭ’ｏは、ターゲットとしての全ての要件 、すなわちｊ）アフイニテイマトす／クスに適用するのに充分の大きさを有する ；２）マトリックスに付着した後に、反応性ではない：そして３）付着した後に 、複数のＰＢＤｉｍ、：る特異約結合を可能にするのＩこ充分のＸ変の表面を有 する、という要件を満たしている。

Ｈ三Ｍｂｉ、：関する基本的清報は濁知である、すなわち″、）三ＦｉＭｂは、 ｐｉ７４．４〜９．３に３し１て、りなくとも７０℃まで、安定である。

２ｎ＝Ｍｂは、１．６ＭグアニンニウムｃＱ；で、安定である。

３）ヨ■ｂの、’１ｌ＝７．０である。

４）ＥＥＭ’ｏニ係ルＭ　、Ｉ＝１６．ｏ００テある。

５）三ＥＭ’ｃはヘムを必要とする。

６）三ＨＭｂｌ：ｊ、タンパク質分解活性を有していない。

さらに富だ、ＢＥＭｂおよびその他のミτグロブリンに関して、下記の情報を得 ることができる： ｉ）ＥＨＭｂの配列、２）マツコラフジラミ万グロブリンの３Ｄ構造（ＢＥＭｂ はＸ９のアミノ酸差異を有し、一般に、その３Ｄ構造はほとんど１司−であると 見放されている）、３）その酵素活性の欠落、４）その毒唖の欠落。

ＳＢＤ仕様の下記のとおりにセットする：１）Ｔ＝２５℃、 ２）ｐｉｉ＝８．０゜ ３）許容溶質： Ａ）結合に係り、 ｉ）緩衝剤として、！Ｊ　７　厳塩０〜２０ｍＭ＊　ヨＵ　ｉ　ｊ＞ＫｃＡ、１ ０＋ｎＭ。

Ｂ）カラム溶出Ｉこ係り、 ｉ）緩衝剤として、リン厳塩０−３０ｍＭ　１ＤＫｃＩ２．５Ｍまで、および１ ｉｉ）グアニジニウムｃＱ、３．８Ｍまで。

４）許容に’Ｄ（１−ＯＸｉＯ−”ＭａＣＦ’　（ＩＰＢＤ）として１ｉＬＧ７ も選択した。

相互ｆ′Ｆ−用性コンピューターグラフィックを使用して、変換しようとＴる残 基を部分的に、取り呂し、その構造を可視化する。

この９Ｊ断において、全ての残基の数はＢＰＴに帰する。全ての残基が１側のタ ーデフ１分子と接触できるように、表面を形成する残基てットを取り巳す。変え るための′１１？Ｔ　ｉ残基の選択に関Ｔる情報には、次の情報が含まれる： 、）その３Ｄ構造、２）各残基の溶剤利月可能左（ＬＥＥＢ７ｉ）　、３）Ｂ？ 三に相同性の別のタンパク質の配列の収集、および異なるアミノ醋タイプの構造 特徴の知識。

表１６および３４には、ＢＰＴ　ｉの残基が、ａ）実質的に表面露呈部を有し、 そしてｂ）その他の密接に関連するタンパク質；の他のアミノ酸を許容すること が知られている、ということを示している。露呈されており、かつまた可変性で ある、８〜２０の残基セットのピックアップに、相互作用性コンピューターグラ フィックを使用する。これらのセットにおいて、１つのセットの＝の全員が一度 に、ターゲット物質の分子に接触できるようにする。

Ｂ？Ｔｉが、与えられた残基において、小さいアミノ酸を有する場合に１＝、こ のアミノ酸は相互作用性セット内の他の残基の全部と開時に、ターゲットと接触 することができないことがあるが、さらに大きいアミノ酸は充分に接触すること ができる。帯電したアミノ酸は、直接に接触しなくても、結合に影響を及ぼすこ とができる。このような場合には、このような残基を相互作用性セット内に包含 させるべきであり、この場合にも、大きい残基が有用でありうることに留意すべ きである。同様に、相互作用性セットの幾何学的＝心近くの大きいアミノ酸は、 この大きいアミノ酸の両側上の残基が同時に接触Ｔるのを防ぐことができる。し かしながら、大きいアミノ酸を、小さいアミノ酸で置き換えると、その表面ｔ： さらに＝坦になり、両側の残基が：同時に接触できるようになる。この；うな残 基ｔ；相互作用世セフｒ番；包含されるべきであり、この場合には、／Ｊ％さい アミノ酸も有用であることがある。

表３５は、凛準モデル部分から作成したものであり、各タイプの側鎖基の断片と Ｃｐｅｔａとの開の最高距離を示している。Ｃ１はタンパク質主鎖に堅固に結合 することから、Ｃ６を使用する。

Ｃ，−Ｃ，結合に関する回転は側鎖基の位！の決定に関して、最も重要な自ミ宣 を有する。

表３４には、−足の条件に適合する５種の表面が示されている。

第１の表面は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎ１＜ に“１ＴＰＡ”として報告されているように、トリプシンζＢ？Ｔ　Ｉとの複合 体田で、トリプシンを接触する残基セットよりなる。このセットは数字「１」で 示されている。このセットの残基のｉ！呈表面（表１６から得られる）は全体で 、１１４８人２であり、そしてＢＰ丁Ｉとトリプシンとの間の接触面積にほぼ等 しい。

２〜５の数字で示されている、その他の表面は、先ず、露呈されている可変性の 残基をピックアップし、次いで表面が確定されるまで、近隣の残基をピックアッ プして行くことによって取り出した。表３４に示される残基セットの選択は、決 定的なものでも、あるいは独特のものでもなく、別の可変性表面の残基セットを 取り二すこともできる。以後の記載において、Ｋ１５は分子の頂＝ｉにあるもの とし、一方、カルボキシおよびアミノ木端は底部にあるものとする。

溶り利用可能ｑ　（ｓｏｌｖｅｎｔ　ａｃｃｅｓｓｉｂｉｉｉｔｅｓ）は、残基 の露呈を示すために、有効で、容烏な指示要素である。溶剤利用可能性（＝、多 少注意して使用しなければならない。すなわち、小さいアミノ酸は下方に示され ており、そして大きいアミノ酸はニオに示されている。ＢＦ’Ｔ　ｉの構造口に 置き換えられた場合に、異種のアミノ酸の溶剤利用可能性がどうなるのかを、使 用者は考えなければならない。

Ｂ：）Ｔ！の誘導体とＨＨＭｂとの閘の特異結合を創造するために、セット＃２ 甲の残基を変えてみた。このセットは、１２個の基本残基を包含している：１７ （Ｒ）、１９（Ｉ）、２ｉ（Ｙ）、２７（Ａ）、２８（Ｇ）、２９（Ｌ）、３ｉ （Ｑ）、３２（Ｔ）、３４（Ｖ）、４８（Ａ）、４９（Ｅ）ｊ（Ｊ−び５２（Ｍ ）　（Ｓｅｃ、　１３．ｉ、ｌ）　、セット＃２の田で、表３４に記載の配列例 を完全に同一の残基は無い。滋賀他って、隠れている構造を保有する可能性が高 いものを変えることができる。この残基に見い出されるアミノ酸タイプの、これ らの１２の残基のそれぞれにおける独立した置き換えが、はぼ４．４Ｘ　１０’ のアミノ酸配列および同数の表面を生成する可能性がある。

ＢＰＴ　Ｉは非常に塩基性のタンパク質である。この性質は、ＢＰＴ　１および その相同体の単離および精製に使用されており、高頻度のアルギニン残基および リジン残基は単離における傾向に反映することはあるが、構造体が必須とするも のではない。Ｂｏｍｂｙｘｍａｒｉからの５ＣＩ−ＩＨＧＡ！基性基よりも７傷 多い酸性基を含有することは確かである（　５ＡＳＡ８４）。

残基１７は、高度に可変性であり、かつまた充分に露呈されており、Ｒ，に％Ａ ％Ｙ、）：、Ｆ％Ｌ１Ｍ、Ｔｓ　Ｇｓ　Ｙ、Ｐまた１＝ｓを含有することかでき る。全てのタイプのアミノ酸に、大きい、小さい、帯電している、ｅＰ性である 、そして’ｉｌ＊性である′４Ｊ亡が見い＝される。見い＝された酸性基の田で 、サンプル田の傾向の要因でありうるものは存在しない。

残基１９はまた、可変性であり、かつまた充分に露呈されており、Ｐ、Ｒ，工、 ５％に、ＱおよびＬを含有する。

残基２１は非常に可変性ではなく、モして３３の場合のうちの３１でＦ；たはＹ を含有し、モしてのこりの場合に、■およびＷを含有する。Ｙ２１の側鎖基は残 基４７および４８の主鎖とＴ３２との間空賀を溝している。Ｙ側鎖基の先端の〇 三は溶剤田に突出する。

明らかにＹまたはＦを置き換えることによって、表面を変えることができ、その 表面を、その領域で、疏水性または親水性のどちらかにすることができる。さら にまた、他の芳瞥族アミノ厳（すなわち、Ｈ）あるいは他のｉｌｌ性アミノ酸（ Ｌ％ＭまたはＶ）が許容されうる可能性もある。

残基２７は、はとんどしばしばＡを含有するが、５％に、ＬおよびＴもまた、見 い出される。構造的に見ると、この残基は多分、いずれの親水性アミノ酸も、そ して多分、いずれのアミノ酸をも許容するものと考えられる。

残基２８は、ＢＰＴＩにおいて、Ｇである。しかしながらこの残基自体は、形状 的にグリシンに特有ではない。６個のその他のタイプのアミノ酸がこの残基に見 い出されている；　Ｋ、Ｎ、Ｑ。

Ｒ，Ｈお；びＮｏこの残基における小さい側鎖基は、残基Ｘ７および３４と二時 には、ＨＦ、Ｍｂと接触しない。大きい＠鎖基は、残基ニア８；び３４とｉＴ１ 時にＥ！ＨＭ　’ｏと相互反応することができる。この残基における帯電した側 鎖基は基本的セフ２ロの他の残基番；よって足められている表面正で、ＨＨ！！ ’ｏの結合に影響を及ぼすこと力ζできる。多分、Ｐをのぞいて、すべてのアミ ノ酸が許容されるべきである。

残基２９は、高度に可変性であり、最もしばしば、Ｌを含有する。この残基の充 分に露呈された部分は、多分Ｐを除く、はとんどすべてのアミノ酸を許容するも のと充放される。

残基３１．３２および３４は、高度に可変性であり、露呈されており、そして延 長した形状を有する：すべでのアミノ酸が許容されるべきである。

残基４８および４９はまた、高度に可変性であり、かつまた充分にＮ呈されてお り、すべてのアミノ酸が許容されるべきである。

残基５２は、アルファへりツクス出に存在する。多分Ｐを険し・て、すべてのア ミノ酸が許容されうる。

ここで、基本セットの近隣にある第２の残基セット（Ｓｅｅ、　１３．１．２） の変更可能性について考えてみる。後続の段階で変えることができる、近隣の残 基には、９（Ｐ）、１１（Ｔ）、！５（Ｋ）、１６（Ａ）、１８（Ｉ）、２０（ Ｒ）、２２（Ｆ）、２４（Ｎ）、２６（Ｋ）、３５（Ｙ）、４７（Ｓ）、５０（ Ｄ）および５３（Ｒ）が含まれる。

残基９は高度に可変性であり、伸びており、そして露呈されている。残基９と残 基４８および４９とは、残基３１〜３４の立ち上っている鎖によって生じる突己 物によって分離されてし−る。残基９と残基４８お；び４９とが！時に、結合に 関与している場合には、ターゲットは、３１〜３４の鎖が適合することができる 溝を有しなければならないか、あるいはこれら３つの残基（９，４８および４９ ）がいずれも、ＢＰＴＩ誘導体のｍｖ−＝径を効果的に減夕させる、大きいアミ ノ酸を有していなければならないかのどちらかである。

残基１１は、高度に可変性であり、伸びており、そして露呈されている。残基１ １は残基９と同様に、基本残基によって定められている表面から僅かに離れてお り、高−環境で結合に関与する。

残基１５は、高度に可変性である。残基１５の側鎖基は、セット＃２によって定 められている面から離れた位置にある。残基１５において電荷を変えると、残基 でット萼２によって定められている表面における結合が影響を受けることがある 。

残基１６は可変性であるが、基本セットによって定められている表面から離れて 位置している。この残基の電荷を変えると、セット＃２によって定められている 表面における結合が影響を受けることがある。

残基１８はＢＰＴｉｌ：ｊ５いて工である。この残基は、伸びている形状であり 、そして露呈されている。この残基には５種のアミノ酸が見い＝されている：　 Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、およびＴ６Ｔだけは親水性である。側鎖基は、残基セット；２ によって定められている表面からｌ接に離れた位置にある。この残基のａｔアミ ノ酸を！き換えると、残基セラ１＃２によって足められてし箋る表面における結 合が影響を受けることがある。

残基２０は、ＢＰＴ　ＩではＩである。この残基は、伸びている形状を有し、モ してｌ！呈されている。この残基には、４種の別のアミノ酸が見い日されている ：Ａ、Ｓ、Ｌ、おＪびＱ、側鎖基は、残基セット声２によって定められている表 面から、Ｉ接に離れた位置にある。この残基で、電荷を変えると残基セット＃２ によって定められている表面における結合が影響を受けることがある。

残基２２は、僅かにだけ可変性であり、３３の場合のうちの３０で、Ｙ％Ｆまた はＨである。しかしながら、この残基には、Ａ、Ｎ。

およびＳが見いｂされる。ここでは、Ｌ％Ｍ％　ＩまたはＱなどのアミノ酸を試 みることができる。残基２２における変換は、残基２１の移動性に影響すること がある；残基２２における電荷の変更は、残基セット＃２によって定められてい る表面における結合に影響を及ぼすことがある。

残基２４は、若干の可変性を示すが、多分、基本セット田の残基の全部と同時に 、ターゲットの分子の１つと相互反応することばできない。この残基の電荷を変 えると、基本セットによって定められている表面における結合に対し、作用を有 することがある。

残基２６は、高度に可変性であり、そして露呈されている。電荷の変更は、残基 セット＃２によって定められている表面における結合に影響下ることがある。置 換は；だ、基本セット口に存在する残基２７の移動性に影響することがある。

残基３５は、最も多くの場合に、Ｙであり、Ｗも見い出されている。残基３５の ｇＡ鎖基は、隠されているが、ＦまたはＷの置換は、残基３４の移動性に影響す ることがある。

残基４７は、使用された配列サンプルにおいて、常に、Ｔまた（＝Ｓである。そ のＤガンマは、アルファへりブクス守の残基５０のＮＨからの水素結合を、多分 受は入れる。しかしながら、この残基から、他のタイプのアミノ酸を排諏する。

不可抗的な立体上の理由は存在しない。特に、その側鎖基が水素結合を受け入れ ることができる別のアミノ酸、すなわちＮ、Ｄ、（ｌよびＥを受け入れることが できる。

残基５０ば、多くの場合に、酸性アミノ酸であるが、他のアミノ酸も可能である 。

残基５３は、多くの場合に、Ｒであるが、この残基には他のアミノ酸も見い−さ れる。電荷の変更は、相互作用セット＃２ｅｉ：Ｉ公開モデル（ＨｕＢＥ７７、 ＷＬＯＤ８４）の場合には、Ｒ３９が、セット＃２中の残基によって定められて いる表面から、ＢＰＴ　Ｔの反対側にあることを見ることができる。従って、七 ット＃２甲の若干の残基を変えると同時に、残基３９を変えると、セットＨ２（ ：ｌの他の残基を変える場合と比較して、表面＃２に沿って生じる結合の改良に はあまり好ましくはない。

１２の茶水残基おＪび１３の第２次残基に加えて、２つの他の残基、すなわち３ ０（Ｃ）および３３（Ｆ）が存在する。これらは、多分変えない、少なくとも後 続の工程まで５えない、表面＃２内に含まれている。これらの残基は、ＢＰＴ　 ：の内側に隠されており、保存されている側鎖基を有する。これらの残基の変更 は、基本セラー＝の残基の変更によって生じるほどの父化を表面に与えない。し かしながら、これらの１されており、保存されている残基（＝、表面＃２の表Ｉ 墳に関係する。残基セｙ　：　井２の表面は、ｒリプシン結合性表面の面積に匹 敵する。基Ａ残基′Ｌ７、！９．２１．２７．２８．２９．３１．３２゜３４． ４８．４９お；び５２は、９４６．９人２の総合溶絨利用可能面積を有する。第 ２次残基９、ｂ、　１５．１６．１８．２０．２２．２４．２６．３５．４７． ５０および５３ば、１ｏ４！、７人２の総表面を有する。残基３０および３３は 、全体で３８．２人２の露呈表面を有下る。従って、これら３つの残基群の総合 表面は、２０２６−８人：である。

残基３０はＢＰＴ　Ｉ　＝でＣであり、丁べての相同配列−に保存されている。

しかしながら、Ｃ１４／　Ｃ３８が丁べての天然配列口に保存されており、しか もＭａｒｋｓ等がＣ１４とＣ３８との両方をＡ、　Ａまたｌ＝Ｔ、Ｔに変えると 、官能性のトリプシンインヒビターが生成されることを示していることに留意下 べきである。従って、Ｃ３０を！き換えた場合には、ＢＰＴ　１様の分子が混じ ることが可能になる。

残基３３は、Ｂｐ刊田およびすべての相（司配列中で１である。ＢＰＴｌｊｊｆ 造を観察すると、ｙ、Ｍ、ｐ＝たは１の置換が許容されうろことが示唆される。

我々の仮定二のアフノ二テノ分屋感受玄、Ｃ５ｅｎｓｉを得るために、我々は６ 個の残基を寂えることに決めたが、多様化塩基の冥捺の塩基組成における誤りに 若干の余；が残ったａ最高の認識を得るために、我々はできるだけ全くかげ離れ ている基本上ツーから残基を選択した。表３６には、基本でツ卜（ｐｒｉｎｃｉ ｐａｉ　５ｅｔ）８よび天梢セット（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　５ｅｔ）　−の残 基のベータ炭素覧の距離が示されている。Ｒｉ７およびｖ３４は、基本表面の一 端にある。残基Ａ２７、Ｇ２９、Ｌ４８、Ｅ４９８．：び　Ｍ５２は他の一端に アリ、約２０大難れている。これの＝で、我々は、残基１７．２７．２９．３４ および４８を変える。残基２８．４９および５２は、後続の工程で変える。

残りの基本残基の田で、２１は後刻に変える。残基Ｘ９．３１および３２の口で は、１９を無作為に取り出し、変える。

６個の残基の無制限の変更は、６．４Ｘ　ｉＯ’のアミノ酸配列をもたらす。Ｃ ５ｅｎｓｉは４ＸＩＯ’命の１であると仮定する。表３７には、選択された残基 の計画された変更が示されている。親配列は５゜５ＸＩＯ’ｃ：の一部として存 在するが、最も好ましくない配列が４゜２Ｘ　ＩＱｌ守の一部にだけ存在する。

ＰＰＢＤから１個だけアミノ酸を置き換えたものの甲で、最も好ましくない配列 は、Ｆ　１７−１１９−Ａ　２７−　Ｌ　２９−　Ｖ　３４−　Ａ　４８ｆあり 、１．６’Ｘ１０’中の一部の計算された存在率を有する。最適ｇｆｋコドンを 使用することにより、親配列を取り戻すことができ、また寅際のｎｔ組戊がプロ グラムされた組成の５％以内に入る場合には、ＰＰＢＤに対する１個のアミノ酸 ！換の全部を取り戻すことができる。形質転換細胞の数はＭｎｔｖ−１，ＯＸ　 １０’であり（仮定である）、プログラムされた配列のうちのほとんどを生成す ることができる。

正記の残基番号は突然変４ＢＰＴＩに関係する。表２５Ｃ＝グレーＭ４３Ｃ：’ −ＢＰＴ　Ｉタンパク質に関するものであるので、突然変異Ｂｐ丁丁巳配列番号 はいずれも、１つの配列２３の長さだけ長くなっている。

従って、我々は、残基４０．４２．５０．５２．５７および７１を変えようと考 えた。これらのコドンの全部を含有するＤＮＡ配列は、ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の 塩基３０９のｓｐｈ　Ｉ部位と塩基′Ｌ９１の（ＡｐａＩ）部位との閘に見い出 される・Ａｐａｌ、Ｄｒλ■およびＰｓｓＩの中では、ＡｐａＩが好ましい。こ れは、ＡｐａＩがいずれの曖昧さも伴わずに６個の塩基を認識し、ｖ　ｇ　Ｄ　 Ｎ　Ａで数少ない配列を切断するからである。遅日のない制限部位は、コドン曖 昧型εａｍｉｔｉｇｕｏｕｓｌを使用することによって、ある場合には回避する ことができる。すなわちＧ（、ＣからＧＧＴまでのｇ５１に係るコの変更は、＝ ５０．５１および６−５２に於けるＡｐａＩｐ位の創成を不可能にする。

合成しようとするｄｓＤＮＡの各断片は、制限酵素による切断を可能にするため に、どちらかの末端に付加されている６〜８個の塩基を必要とし、これは表３７ に示されている。最初の合成塩基（ＡｐａＩおよびＡｐｈＩで切断する前の）は １８４であり、そして最後は３２２である。合成される塩基は１４２である。合 成される断片の中心はＱ５４とＶＳ２どの間にある。

このオーバーラツプは変更された塩基を含むことができないので、１２塩基長い オーバーラツプとして、塩基２４５〜２５６を選択した。Ｆ１ａに係るコドンが ＴＴＣに変えられ、オーバーラツプのＧＣ含量を増加することに留意すべきであ る。変更されるアミノ酸は、その上に十を付けてＫとして印を付ける。

コドン５７お；び７１は、センスｊｓｅｎｓｅ：　（底部）ストランド上に合成 される。このデザインをアンチセンスＥａｎｔＩｓｅｎｓｅ３ストランドで、ｇ ｆｋ”と称する。したがって、このでンスストランド（５°から３′まで）は、 ａ）等しい部分ＣおよびＡ（すなわちＫの相補）、およびｃ）（０，２６Ｔ、０ ．２６Ａ、０．３０Ｃ，Ｏ，Ｌ　８Ｇ）を含有する。

“ｇ？ｋ“によってフードされる各残基は、２１の可能な結果を有する。これら のアミノ酸はそれぞれ、ストップコドンを加えて育する。表１２には、ｇｆｋ” によってコードされるアミノ酸の分布が、誤差を５％と仮定して示されている。

親配列の存在率は、ＲＸＩＸＡＸＬＸＶＸＡの存在率の積である。最も好ましく ない配列の存在率は、４．２ＸＩＯ″のうちの１である。

ｏ１ｉｇ＃２７およびｏｌｉｇ＃２８をアニーリングし、次いでフレノウフラグ メントおよび全部で４つの（ａｔ）ＴＰで延長する。ｄ　ｓ　＠ｒ　ＲＤＮＡお よびＲＦ　ｐＬＧ７の両方を、Ａｐａｌ、およびＳｐｈ工の両方で切断する。切 断ＤＮＡを精製し、相当する断片をリゲー）　Ｌ　（Ｓｅｅ、　１４．２）　、 正当なＰＥ３８３の形質転換に使用する（Ｓｅｃ、１４−２）。十分の数の形質 転換細胞を生成するために、５．０リツトルの細胞を用いて開始する。

１）ＬＢブロス５．０リツトル甲で、３７℃に８いて）：、ｃｏｌｉを培養し、 細胞濃度を５Ｘ１０’〜７Ｘ　１０’細胞／ｍｌにする。

２）氷上で６５分間冷却し、この細胞懸濁液を４°Ｃで５分間、４０００ｇで遠 心処理する。

３）正澄液を捨て、細胞を６０ｍＭ　Ｃａｃｌｘの水冷無菌溶液１６６７＋ｎｌ ：ｌに再懸濁する。

４）氷上で１５分間冷却させ、次いで４°Ｃで５分間、４０００ｇで遠心処理す る。

５）Ｂ胞を水冷無菌の６０ｍＭ　Ｃａｃｌｘ　２　Ｘ　４００＋＋１’：’に再 懸濁し、細胞を４℃で２４時間保存する。

６）リチゲーシ遊ン［１ｉｔｉｇａｔｉｏｎｉまたはＴＥバフ　７７２０＋Ｔｌ １（Ｐ　１ｍ　ＤＮＡ（１００μｇ）を加え、混合し氷上で数分間インキュベー トする。

７）２００μｍづつに分け、細胞に４２℃で２０秒間、熱ショックを与える。

８）Ｌ　ｂ　ｃブス２００ｍ１を加え、３７℃で１時間、インキュベートする。

９）３５〜１００μｇ／ｍｌのアンピリジンを含有するＬＢブロス２゜０１に、 培養物を加え、次いで３７℃で１夜にわたり培養する。

１０）６時間後に２００ｍ１を取り出し、軟寒天上塗技法でＬｂ寒天上に１０ｇ ７アージＪＪＯ７で、０．５ｍｌづつ板状に塗布する。ファージは軟寒天から調 整する。

１１）１夜培養物を遠心処理し、細胞を除去証、７アージをペレット化する。

１２）Ｓａｌ　１ｖａｒ等の方法によってウィルス粒子を収穫する。

次の点が重要である。リゲーションで合成されるｖｇＤＮＡの全部または殆ど全 部を使用する、’ｏ）リゲーション混合物の全部または殆ど全部をＥＥ胞の形質 転換に使用する、および・０）形１ｉ転換細胞の全部または殆ど全部を培養する 。これらの尺度は、可変３子の維脅に関するものである。

形質転換細胞の全部または殆ど全部を試料にする方法で、ウィルス粒子を採取す ることは重要である。形質転換にＦ′細胞が使用されることから、複数の感染は １夜ファージ産生では、問題にならない。Ｆ′細胞は寒天中における７アージ産 生に使用される。

ＨＨＭ　ｉ）は、７．０のｐＨを有するので、ＨＨＭｂが僅かに塩性であり、一 方、ＢＰＴＩおよびその突然変異体の殆どが陽性であるように、ｐＨ８，０でク ロマトグラフィを行う。ＨＨＭ　ｂを２．０ｍｌカラムのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１ ０”’またはＡｆｆｉ−Ｇｅｔ　１３’丁ゞ）にＭ４類　せっけん頚（薬剤に属 するものを衆＜）歯みがき　化粧品（薬剤に属するものを、Ｏｍｇ／支持マトリ ックスｍｌの割合出固定する。この濃度は、カラム支持ｔｒｐに最適の濃度突然 同じである。

いずれのタンパク質に対しても、あるいは支持マトリックスに対して、強力な無 差別の結合性を有する種々のＢＰｔＩを除去するために（Ｓｅｃ、　１５．２） ウィルス粒子の変えられている集団をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する カラムに通し、その後で（ＨＨＭ　ｂ　）カラムに、この集団を加える。Ａｆｆ ｉ−Ｇｅｌ　１０°ＴＭＩ　ｇたはＡｆｆｉ−Ｇｅｔ　１５”’を使用し、マト リックスが最高レベルでＢＳＡを支持するレベルで、ＢＳＡを不動化する。１０ −０ｗ１のカラムに、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ結合−ＢＳＡ５．Ｏｍｌを入れる。この カラムを（ＢＳＡ）と記す。こりカラムは、Ｖｖ＝５．Ｏｍｌを有する。１０＋ ｎＭ　Ｋｃｌ、　１ｍＭリン酸塩、ｐＨ８，０バツフ　ア１ｍ１（０，２Ｘ　Ｖ 、）９にｐｆｕ　ｉｏ”を含有する、このウィルス粒子の変えられている集団を 、ｆＢＳＡ）に適用する。（ＢＳＡ）を、５．０ｍＭ　Ｋｃｌ、　１ｍＭリン酸 塩、ｐＨ８，０バツク７４．５ｍ１（０−９Ｘ　Ｖｖ）で洗浄する。この５０ｍ Ｍ塩を用いる洗浄によって、ＢＳＡ　ｊ、：僅かい５蒼するウィルス粒子は溶出 され、一方、強力に結合するウィルス粒子は溶＝されない。（ＢＳＡ）カラムの 其めれらた溶出液は、約１３ｍＭ　Ｋｃｌ　５．５ｍｌである。

カラム（ＨＨＭｂ）は、まづリン酸塩で、ｐＨ８，０に緩衝されているｌ　Ｏｍ ＭＫｃ　１１００μｌ中のＭ１３（ａｍ４２９）のウィルス粒子１０″′で処理 することによってブロックする。この方ラムを、ＯＤ２．。がベースラインに戻 るかまたは２ＸＶｖがカラムを通過する裏で（どちらか早い方）、同一バッ７ア で洗浄Ｔる。（ＢＳＡ）から集められた溶出液を２３ｍＭＫｃ　１．１ｍＭリン 酸塩、ｐＨ８，０のバー／　７７５．５ｍ１ｃ：の（ＨＨＭｂ）に加える。この カラムを次の方法で溶出する（Ｓｅａ、　１５．３）　：１）リン酸塩でｐＨ８ ，０に緩衝えている１　０　ｍＭ　Ｋ　ｃ　１　：　２８０ｎｍにおける光学濃 度がベースラインまたは２ＸＶＶに達するまで（どちらが早い方）、（溶出液は 捨てる）、２）３ＸＶｖで、１０ｍＭ−２ＭＫｃ　ｌ勾配：ｐＨはリン酸塩で８ ．０に維持する（３０Ｘ１００ＩＬ１７ラクシミン）３）３ＸＶｖで、２Ｍ〜５ ＭＫｃｌ勾配；リン酸塩でｐＨ８，０に緩衝（３０Ｘ１００μｍ７ラクシヨン） ４）２ＸＶＶで、一定の５　Ｍ　Ｋ　ｃ　＋　＋０−０．８ＭグアニジウムＣ１ ；リン酸塩でｐＨ８，０に緩衝（２０Ｘ１００μ１７ラクシコン）および ５）ｉｘｖｖで、一定の５ＭＫｃｌ＋０．８ＭグアニジウムＣ１；リン酸塩でｐ Ｈ８，０に緩衝、（１０Ｘ　１００ｕｌ　７ラク’ｙ鱈７）。

これらの溶出７ラクシ厘ンに加えて、カラムから試料を採取し、ファージ感受性 Ｓｕｐ”細胞用の接種物として使用する（Ｓｅｅ。

２５．４）。各クラクションからの４μｌの試料をファージからＳｕｐ”Ｅｐ上 に板状に付与する。かなり多丁ぎるコロニーを生成するクラクションは、さらに 低い希釈度にして、再付与する。各７ラクシヨンの大体の力価を計算する。力価 を測定した最後のクラクシ１ンから開始し、最初のフラクシヨンに向かって順次 操作し、約１０″のファージが集まるまで、丁なわちカラムに適用されたファー ジ１０００のうちの約１が集まるまで、７ラクシヨンを集める。この集団を１１ ３０ブシス３０００ｍｌ〒の３　×　１０”ファージ感受性ＰＥ３８４中に感染 させる。多様度が低い感染物を選び、多種感染の可能性を排除する。、３０分後 に、生存している７アージは、受容細胞に入れるが、まだ新しいファージを産出 しはじめない。

ファージ産出遺伝子をこの７アージで発現させる。非感染細胞を殺すアンピシリ ンを添加することができる。これらの細胞は依然として、Ｆ−ｐｉｌｉを有して おり、７アージを吸着して多種感染を防止する。

ド細胞における低い多種感染度での増殖によっては解決することができない問題 を、多種感染が持ち込まざるを得ない場合には、この問題の解決に、次の方法を 使用することができる。アフイニティ分離から得られるウィルス粒子をＦゝＥ、 ｃ口１ｉ：に感染さぜ、次いで培養して、遺伝情報を増幅させる（Ｓｅｃ、　１ ５．５）。ＲＦＤＮＡを収穫することによって、あるいはＳＳファージＤＮＡに アニーリングされたプライマーのインビトロ拡張によってＣＣＣＤＮＡを得る。

このＣＣＣＤＮＡを使用し、高い細胞対ＤＮＡ比で、Ｆ−細胞を形質転換させる 。この方法で得られる各ピリオンは、その中のＤＮＡによってだけコードされる タンパク質を有していなければならないものとなる。

この変更は６．４Ｘ　１０’はどのかなりの異なるアミノ酸配列を生成する。Ｃ ｅｆｆは９００である。従って、２回分の分離サイクルの後に、１つだけのＳＢ Ｄが単離される確率は、０，１０より少ない。

３回のサイクルの後では、この確翠は０．１０以上に高められる。

このファージミド（ｐｈａｒｇｅｍｉｄ）集団を増殖させ、３回、クロマトグラ フィ処理し、次いでＳＢＤに係し検資する。各分離サイクルにおいて、生きてい る７アージを含有する、最後の３つの７ラクシヨンからの７アージを、支持マト リックスの若干を除去することによって接種物として得られるファージと一緒に 集める。各サイクルでは、約１０１２のファージをカラムに加え、次回の分離サ イクル用に、約１０’のファージを培養する。３回の分離サイクルの後に、生き ているファージを含有する最後の７ラクシヨンから、３２のコロニイを取り出す 。これらのコロニイからのファージを５ＢＤ１１ＳＢＤ２・・・および５ＢＤ３ ２で表わす。

これらのＳＢＳをそれぞれ、培養し、ＦＩＩ（Ｍｂを含有しているＰｅｐ−Ｔｉ ｅカラムにおける保持に関して試験する（Ｓｅｅ、　１５．８）。７アージＬＧ ７（ＳＢＤＩ　ｌ）は、Ｐｅｐ−Ｔｉｅ（ＨＦＩＭｂＪカラムで最大の保持を示 し、これは、３６７ｍＭ　Ｋｃｌで溶出する。一方、ｗｔ　Ｍ］３は２０ｍＭ　 Ｋｃｌで溶出する。５ＢＤＩＩは、２回目の変化サイクルに対する親のアミノ酸 配列になる。

この仮定の実験の結果が表３８に示されている。Ｒ４０はＤに変更され、Ｌ４２ はＱに変更され、Ａｓ２はＥｌ：変更され、Ｌ５２はＬのまま残され、そしてＡ ７１はＷに変更された。

次回の変化工程（Ｓｅｃ、１６）が表３９に示されている。変換しようとする残 基は、ａ）親セット内の、１回目の工程で変更されなかった残基のうちのいくつ かを選択しくすなわち、この融合体の残基４２．４４．５１．５４．５５．７２ または７５）、次いで、第２次セット内の、いくつかの残基を選択することによ って、選び出す。全部で２０のアミノ酸および不可避のストップを通して、残基 ５１．５４．５５および７２を変える。残基４４は、ＹとＦとの間でだけ変える 。第２次セット内の若干の残基は制限範囲の中でだけ変える、これによって、第 一に異なる電荷（＋、０、−）が明らかになる。残基３８は、Ｋ、　Ｒ，Ｅまた はＧの中で変える。残基４１は、Ｉ、　Ｖ、　ＫまたはＨの中で変える。残基４ ３ハ、Ｒ，Ｓ、　Ｇ、　Ｎ、　Ｋ。

Ｄ、　Ｅ、　丁またはＡの中で変える。

ｏ１ｉｇ＃２９およびｏｌ　ｉｇ＃３０を合成し、アニーリングし、拡張し、次 いでＡｐａ　Ｉ　／　Ｓｐｈ　Ｉ部位で、ｐＬＧ７中にクローン形成させる。こ のリゲーション混合物を使用し、可能性を有するＰＥ３８３細胞５αを形質転換 させ、１０′の形質転換細胞を得る。工程１で使用した支持マトリックスと同一 の支持マトリックスを使用し、新しい（ＨＨＭｂ）を構築する。収穫されたＬＧ ７のうちの１０１２の試料を（ＨＦＩＭｂｌに適用し、アフイニティ分離する。

カラムから流出する最後の１０’の７アージと接種物とを集め、培養する。この 培養された７アージミドを、３回の分離サイクルで再クロマトグラフ処理する。

３回の分離サイクルの流出液から、３２のクローン単離物（ＳＢＤＩＩ−１，５ ＢＤＩＩ−２、・・・５ＢＤＩＩ−３２で表わす）を得る。

これらの単離物をＰｅｐ−Ｔ　ｉｅ　ｆ）ＩＨＭｂｌカラムＩ；おける結合に関 して試験する。このセットの甲で、５ＢＤＩＩ−１３はＰｅｐ＝Ｔｉｒ（ＨＨＭ ｂｌカラムで最大保持を示す。これは６９２ｍＫ　Ｋｃｌで溶出する。

この仮定上の選択の結果が表４０に示されている。残基３８（ＢＰＴＩ（７）Ｋ １５）ハｌｊｌ：変えられ、４１はｖになり、４３はＮになり、４４ハＦになり 、５１はＦになり、５４は５１こなり、５５はＡになり、そして７２はＱになっ ている。

￥Σ上ｂｄ遺伝子のうちの５ｂｄｌｌ−２３部分を発現ベクター中にクロー　ン 形ＫＬ、ヘリフラズム中で、ＢＰＴｒ（Ｆ１５．　ＤＩ７．　、Ｎ１８．０１９ ゜Ｎ２０．　Ｆ２１．　Ｋ２７．　Ｆ２８．　Ｌ２９　、Ｓ３１．　Ａ３２．　 Ｓ３４．　Ｋ７１．　Ｑ７２）を発現させる。このタンパク質を標準方法によっ て単離し、そのＯＨＭｂに対する結合を試験する。Ｋｂは４．５Ｘ　１０−’Ｍ であることが見い出される。

３回目の変化工程では、ＰＰＢＤとして５ＢＤＩＩ−２３を使用する。この工程 は表４１に示されており、ここで８個のアミノ酸が変えられる。基本上ノド内で 、残基４０．５５および５７は、全部で２０のアミノ酸を通して変えられている 。残基３２は、Ｐ、　Ｑ、　Ｔ、　Ｋ、　ＡまたはＥの中で変えられている。残 基３４は、Ｔ、　Ｐ、　Ｑ、　Ｋ、　Ａ、またはＥの中で変えられている。残基 ４４は、Ｆ、　Ｌ、　Ｙ、　Ｃ，Ｗまたはストップの中で変えられている。残基 ５０は、Ｅ、　ＫまたはＱの中で変えられている。残基５２は、Ｌ、　Ｆ、　ｌ 、　ＭまたはＶの中で変えらィ　れている。

この変更の結果が表４２に示されている。選ばれたＳＢＤは、５ＢＤ１１−２３ −５で表わされており、これは９８０＋ｎＫ　Ｋｃｌで、Ｐｅｐ−Ｔ　ｉ　ｅ　 （ＨＦＩＭｂｌカラムから溶出する。この５ＢＤＩＩ−２３−５セグメントを発 現ベタ９−中ニ’ＣＩ−ン形成し、ＢＰＴＪ（Ｋ９．０１１．　Ｅｒ５．　Ａ１ ７．　Ｖ］８．　Ｑ１９、　Ｎ２０．　Ｋ２１．０２７．　Ｆ２８．　Ｎ２９． 　Ｓ３１．　Ｌ３２．　Ｋ３４．　Ｗ７］、　０７２）を１　産生させる。この 時点で、そのＫｂは７．３Ｘ　１０−’Ｍである。

この実験は仮説によるものである。１０−’Ｍの解離定数を得るためには、さら に多くの変化サイクルが必要であると予想される。若干の変化サイクルにおいて は、３回より多くの分離サイクルが、必要であることもある。実際のＤＮＡ化学 およびＤＮＡ合成では、我々が仮定した５％より大きい誤差があることがある。

５ｅｒｒ＞０．０５である場合には、一度に６個の残基を変えることはｌ　でき ないかもしれない。一度に５個の残基の変化は、確実に可能である。

Ｓｃｉ＠ｎｃｅ　（１９）３）、ユ旦ユ（９６）２２３−３０゜入ｕｄｉｔｏｒ ｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖａｓ、Ｋ。

Ｕｎｉｔａｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐａｔｅｎｔ　４，４７０，９２５．　Ｓａｐｔ ａｍｂｅｒ　１１．１９８４゜Ａｕｄｉｔｏｒｓ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ、Ｋ。

Ｕｎｉｔａｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐａｔｅｎｔ　４，４７９，８９５．０ｃｔｏｂ ａｒ　３０．１９８４゜Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ、ａｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　１９８７゜Ｂａｎｎｅｒ、　ＤＷ、　ＣＮａｖａ、　ａｎｄ　ＤＡ　 Ｍａｒｖｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９８，１）、２ＬＬ＝８１４−８１６゜５ｃｉｅｎｃｅ　（ １９８））、ｚユｆｉ　（４８０１）　ｐ５６４−８゜Ｍｅ廿５ｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８３）、ｊｉｊｌ：３−１１Ｍ３−１ｌ。

ａｎｎｕａｌ　ｍａｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ＡＡＡＳ　ｉｎ　Ｂｏｓｔｏｎ。

ＢＥＮＳ８６： Ｂａｎｍｏｎ、　Ｎ、　Ｐ　Ｓｕｇｉｏｎｏ、　５　Ｂａ５ｓ、　ＬＶ　Ｍａｎ ｄａｌｍａｎ、　ＰＹｏｕｄａｒｉａｎ　。

Ｇ＠ｎｔｓｔＬｃＢ　（Ｘ９８６）　、１ｌ（１）ｌ−１４゜ＢＥＴ′ｒｌｉ８ ： Ｂａｔｔ＠ｒ、　Ｍ、　ＣＰ　Ｃｈａｎｇ、　ＲＲＲｏｂｉｎｓｏｎ、　ａｎｄ 　ＡＨＨｏｒｗｉｔｚ。

５ｃｉａｎｃ’ｅ　（１９８８）、　２ｉＱ＝１０４１−１０４３゜ＢＩＲＤ６ ７： Ｂｉｒｄｓｅｌｌ、　ＤＣ，、、ａｎｄ　ＥＨＣｏｔａ−Ｒｏｂｌｅｓ。

ｙ　Ｂａｃｔ＠ｒｉｏｌ　（１９６７）、　ＬＬ：４２７−４３７゜ＢＬＵＮ８ Ｂ＝ Ｂｌｕｎｄａｌｌ、　Ｔ、　Ｄ　Ｃａｒｎａｙ、　Ｓ　Ｇａｒｄｎｅｒ、　Ｆ　 Ｈａｙｅｓ、　Ｂ　Ｈｏｗｌｉｎ、　ＴＨｕｂｂａｒｄ、　Ｊ　Ｏｖｅｒｉｎｇ ｔｏｎ、　ＤＡ　Ｓｉｎｇｈ、　ＢＬ　５ｉｂａｎｄａ、　ａｎｄ　ＭＳｕｔｃ ｌｉｆｆｅ。

Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈａｍ　（１５Ｍａｒｃｈ　１９８Ｂ）、ｒｕ（３）　ｐ ５１３−２０゜ＢＯＥＫ８０： Ｂｏｅｋａ、　ＪＤ、　Ｍ　Ｒｕ５ｓｅｌ、　ａｎｄ　Ｐ　Ｍｏｄｅｌ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８０）、　ｋｕ＝１０３−１１６゜ＢＯＮＮ ８５： Ｂｏｎｎａｆｏｕｓ、　ＪＣ，Ｊ　Ｆｏｒｎａｎｄ、　Ｊ　Ｆａｖｅｒｏ、　ａ ｎｄ　Ｊ−ＣＭａｎｉ。

Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　ＰＤＧ　Ｄａａｎ、　ＷＳＪｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　ＦＡ 　Ｍｉｄｄｌｅ。

工ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、ＵＸ　１９８５ＢＯＮＯ８５： Ｂｏｎｏｍｉ、　Ｆ、　Ｓ　Ｐａｇａｎｉ、　ＤＭ　Ｋｕｒｔｚ　Ｊｒ。

Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８５）　、　ｋ謹（１）６７−７３゜ＢＯ ＱＵ８７： Ｂｏｑｕａｔ、ＰＬ、ＣＭａｎｏｉｌ、ａｎｄ　ＪＢｅｅ）ｃｗｉｔｈ。

Ｊ、　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、（１１９８７）、　ｍ＝１６６３（６６９゜ＢＯＴ Ｓ８５： Ｂｏｔｓｔａｉｎ、Ｄ、ａｎｄ　Ｄ　５ｈｏｒｔｌａ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）、　ｍ：１１９３−１２０１゜ＢＲ工Ｇ８７： Ｂｒ１ｇｇ５．　ＭＲ，ＪＴ　Ｋａｄｏｎａｑａ、　ＳＰ　Ｂａ１ｌ、　ａｎｄ 　ＲＴコｉａｎ　。

５ｃｉｅｎｃｅ　（Ｏｃｔ　３１９８６）、ｍ（４７７２）　４７−５２゜Ｃ入 ＮＴ８７： Ｃａｎｔａｒｓ、ＧＷ。

ＦＥＢＳＬａｔｔｅｒｓ　（１９８７）、、１ｊｊ（１）１６８−１７２゜Ｃλ ＲＵ８３： Ｃａｒｕｔｈａｒｓ、ＭＩＨ，ＳＬ　Ｂａａｕｃａｇｅ、、ｒＷ　Ｅｆｃａｖｉ ｔｃｈ、ＥＦ　Ｆｉｓｈｅｒ。

ＲＡ　Ｇｏｌｄｍａｎ、　ＰＬ　ＤａＨａｓａｔｈ、　Ｗ　Ｍａｎｄａｃｋｉ、 　ＭＤ　Ｍａｔｔ＠ｕｃｃｉ。

ＭＳ　Ｒｏｓａｎｄａｈｌ、ａｎｄ　Ｙ　５ｔａｂｉｎｓｋｉ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ、　Ｈａｒｂ＋Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、（１９ ８３）、　〔：４１１−４１８゜ＣＡＲＤ８５： Ｃａｒｕｔｈａｒｓ、ＭＩＨ。

５ｃｉａｎｃａ（１９８５ン＋２１：２ａｌ−２１３５゜ＣＡＲＤ８７： Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍｌｌ、　Ｐ　Ｇｏｔｔｌｉａｂ、　ＬＰ　Ｂｒａｃｃ ｏ、　ａｎｄ　Ｌ　Ｃｕｎｎｉｎｇｓ。

ｉｎ　’　ａｄ　ｅｓ’　、１９１ｉ１７゜Ｅｄ、Ｄ　０ｘａｎｄｅｒ　（Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ、ＡＲＬｉ５ｓ工ｎｃ、）ｐ、９ｆｆ。

ＣＨＡＭ８２： Ｃｈａｍｂｅｒｓ、ＲＷ、工Ｘｕｃａｎ、ａｎｄ　Ｚ　Ｘｕｃａｎ。

Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、（１９Ｂ２）、ｌΩ（２０）６４６５− ７３゜ＣＨＡＮ７９： Ｃ）ＬＡＲ８４： Ｃｈａｒｂｉｔ、入、Ｊ−Ｍ　Ｃｌｅｍａｎｔ、ａｎｄ　Ｍ　Ｈｏｆｎｕｎｇ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９８４）、　忌：３９５−４０１゜Ｍ　ＨＯｆ ｎｕｎ９゜ Ｊ工ｍｍｕｎｏｌ　（１９８７）、　工＝１６５１３−６４゜ＣＭ入ｚ８５： Ｃｈａｚｉｎ、　ＷＪ、　ＤＰ　Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、　ＴΣｃｒｅｉｇｈｔ ｏｎ、　ａｎｄ　ＸＷｕｔｈｒｉｃｈ。

Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８５）、　ＬＬ２Ｌ：（２ン４２９−３７ ゜ＣＨＥＮ８８： ＣＨＯＴ７５： Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ，ａｎｄ　ＪＪａｎｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）、　ｌｊｊニア０５−７０８゜ＣＨＯＴ７６゜ Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ，Ｓ　Ｗｏｄａｋ、　ａｎｄ　：Ｉ　Ｊａｎｉｎ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入Ｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ　（１９７６）、ヱユ：３７９ ３−７゜ＣＨＯＴ８６： Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ，ａｎｄ　ＡＭ　Ｌ＠ｓｋ。

ＥＭＢＯ、ｒ　（１９８６）、旦：８２３−８２６゜ＣＨＯＵ７４： ｃｈｏｕ、ＰＹ、ａｎｄ　ＧＤ　ＦａｓｒＩＩａｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７４）、ＬＬ（２）２２２−４５゜ＣＨＯ０ ７８ａ！： ｃｈｏｕ、ＰＹ、ａｎｄ　ＧＤ　′Ｆａｓｍａｎ。

Ｍｖ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　（ｌり７８）；４ヱ：４５４４Ｂ−Ｃ）！０Ｕ７８ｂ： Ｃｈｏｕ、ＰＹ、ａｎｄ　ＧＤ　Ｆａｓｍａｎ。

Ａｎｎｕ　Ｒａｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９７８）、４２：２５１−７６゜Ｇ（ ＵＮ８６： Ｃｈｕｎｇ、　ＤＷ、　Ｋ　Ｆｕｊｉｋａｗａ、　ＢＡ　ＭｃＭｕｌｌｅｎ、　 ａｎｄ　ＥＷ　Ｄａｖｉａ。

Ｂｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ　（１９８６）、、Ｑ：２４１０−２４１７゜ＣＬΣ に８１； Ｃｌａｍａｎｔ、ＪＭ、ａｎｄ　Ｍ　Ｈｏｆｎｕｎｇ。

Ｃａ１ｌ　（１９８１）、２ヱ：５０７−５１４゜ＣＬＥＭ８３： Ｃｌｅｍｅｎｔ　：Ｉ’Ｍ、Ｅ　Ｌａｐｏｕｃｅ、ＣＭａｒｃｈａｌ、ａｎｄ　 Ｍ　Ｈｏｆｎｕｎｇ。

ＥＭＢＯＪ　（１９８３）、、ｉ−ニア７−８０゜ＣＬＯＲ８７： Ｃ１ｏｒｅ、　ＧＭ、　ＡＭ　ｃｒｏｎａｎｂｏｒｎ、　Ｍ　ＩＫｊａａｒ、　 ａｎｄ　ＦＭ　Ｐｏｕｌｓａｎ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎ＠ｅｒｉｎｇ　（１９ｓ７）、λ：３０５−３１１ ゜ＣＬＵＮ８４： Ｃｌｕｎｇ、　Ａ、　’に−５Ｌｅｅ、　ａｎｄ　Ｔ　Ｆａｒｅｎｃｉ。

Ｂｉｏｃｈａｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、（１９Ｂ ４）、　二ホ：３４−４０゜ＣＲＡ工８５： Ｃｒａｉｋ、Ｃ５，ＣＩａｒｇｍａｎ、Ｔ　Ｆｌｅｔｃｈａｒ、Ｓ　Ｒｏｃｚｎ ｉａｌｃ、Ｐ、７　Ｂａｒｒ。

ＲＦｌａｔｔａｒｉｃｋ、ａｎｄ　Ｗ、７　Ｒｕｔｔａｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）、２ｊＪＬ＝２９１−７＋Ｃｒａｗｆｏｒｄ、　 ＩＰ、Ｍ　Ｃ１ａｒｋｅ、Ｍ　ｖａｎ　Ｃｌｅａｍｐｕｔ、ａｎｄ　ＣＹａｎｏ ｆｓｋｙ。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８７）、　ムス（１）２３９−２４４゜ＣＲＥ 工８４： Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９Ｂ４＋ＣＲＵＺ ８Ｂ： ｄａ　ｌａ　Ｃｒｕｚ、ＶＦ、ＡＡＬａｌ、ａｎｄ　ＴＦ　ＭｃＣｕｔｃｈａｎ 。

ＪＢｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８Ｂ）、　瓜（９）４３１１１−４３２２゜Ｄｋ ＸＲ８０： Ｄａｉｒｓ、　ＲＷ、　Ｄ　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　ａｎｄ　ＪＲＲｏｔｈ。

ＤＡＷＸ８６： Ｄａｗｋｉｎｓ、Ｒ。

Ｗ、Ｗ、Ｎ０ｒｔＯｎ　＆　Ｃｏ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８６゜１９８６゜ ＤＥＢＲＥ１６： Ｄｅｂｒｏ、Ｌ、ＰＣＦｉｔｚ−Ｊａｍｅｓ、ａｎｄ　Ａ　Ａｒｏｎｓｏｎ。

Ｓ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９８６）、耳１：２５８−６Ｅｌ。

ＤＥＮＨ７８： Ｄａｎｈａｒｄｔ、　ＤＴ、　Ｄ　Ｄｒａｓｓｌａｒ、　ａｎｄ　０５　Ｒａｙ 　ｅｄｉｔｏｒｓ。

−Ｎ　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＩａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９フ ８゜ ＤＥＶＯ７ｇ＝ ＤａＶｏｒａ、ＤＰ、ａｎｄ　ＲＪ　Ｇｒｕａｂｅ工。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｇ　Ｒａｇ　Ｃｏｍｍｕｎ　（１９７８）、　ｊ ｌＱ（４）９９３−９−Ｄ工ＣＫ８３： Ｄｉｃｋａｒｓｏｎ、ＲＥ、ａｎｄ工Ｇａ１ｓ。

”　ｃ　’　ｏ’。

ＤＩＬｌぶフ： Ｄｉｌｌ、ＫＡ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９８７）、Ａ：３６９−３７１ ゜ＤＯＮＯ８フ Ｄｏｎｏｖａｎ、　Ｗ、　Ｚ　Ｌｉａｎｇｂｉａｏ、　Ｋ　Ｓａｎｄｍａｎ、　 ａｎｄ　ＲＬｏｓｉｃｋ。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８７）、１ｊ１４＝１−ユ００ＤＵＦ’Ｔ８５： １）ｕｆｔｏｎ　ＨＦｉｅｆ　ｇ Ｅｕｒ　Ｓ　Ｂｉｏｃｈａｍ　（１９８５）、耳ｉ、ｌ：６４７−６５４゜ＦＥ ＢＳ　Ｌａｔｔａｒｓ　（１９７８）、　旦ｉ：２１−２４゜ＦＥＲＥ８０ｂ： ＦＩＲΣ８０ｃ： Ｆｅｒａｎｃｉ、Ｔ＃ Ｅｕｒ　ＪＢｉｏｃｈａｍ　（１９８０）、二瓜：６３エーロ。

ＦＥＲＥＩｉ２ａ： Ｆｅｒａｎｃｉ、Ｔ。

Ａｎｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（工ｎａｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ）　（１９８２ ）、　□＝１６７−１６９゜１’ＥＲＸ８２ｂ： Ｆ＠ｒａｎｃｉ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｋ−５し■。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９Ｂ２）、　１ＪｊＱ＝４３１−４４４゜ＦＥ ＲＥ８３： Ｆｅｒａｎｃｉ、’ｒ、　ａｎｄ　ｘｓ　Ｌｅｅ。

Ｊ　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、（１９８３）、　ＭＩ：９８４−９８７゜ＦＥＲＥ８ ６ａ： Ｆ＠ｒ＠ｎｃｉｔ　Ｔｙ　＆ｎ（Ｉ　Ｋ−５ＴＡａ。

Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８６）、　２＆ｆ！ｆＬ＝９５−９９゜ＦＥＲ Ｅ８６ｂ： Ｆａｒａｎｃａｉ、Ｔ、ａｎｄ　Ｋ−５Ｌｅｅ。

Ｊ、　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、（１９８６）、　ハユ：１０８１−１０８２゜ＦＥ ＲＥ８６ｃ： Ｆａｒｅｎｃｉ、Ｔ、Ｍ　Ｍｕｉｒ、に−５Ｌｅｅ、ａｎｄ　Ｄ　Ｍａｒｉｓ。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ａｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　（１９８６） 　、　搬：４４−５０゜ＦＥＲＥ８７ａ： Ｆｅｒａｎｃｉ、Ｔ、ａｎｄ　ＫＳ　Ｌｅｅ。

Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　（１９８７）、Ｊ８：３１−９− ２２゜ＦＥＲＥ８７ｂ： Ｆｅｒａｎｃｉ、Ｔ、ＴＪ　５ｉｌｈａｖｙ。

Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９８７）、誰：５３３９−４２゜Ｆ工０Ｒ８５： Ｆｉｏｒａｔｔｉ、　Ｅ、　Ｇ工ａｃｏｐｉｎｏ、　Ｍ　Ａｎｇ＠１ａｔｔｉ、 　Ｄ　Ｂａｒｒａ、　Ｆ　Ｂｏｓｓａ。

ａｎｄ　Ｆ　Ａｓｅｏｌｉ。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８５）、　２ｉＱ：１１４５１−１１４５５゜ ＦＲ工Ｔ８５： Ｆｒ１ｔｚ、　Ｈ−Ｊ、ｉｎ 以Ａ≦オ四シ逗ｔ　Ｅｄｉｔｏｒ：　ＤＭ　Ｇｌｏｖｅｒ、工ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ 、　０ｘｆｏｒｄ、　ＵＫ。

Ｖｏｌｕｍａ工、Ｃｈａｐｔｅｒ　８．ｐ１５１−１６３゜ＧＡＢＡ８２： ｃａｂａｙ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｎ　（１９８２）、　訂ユ（１２）６６２７−６６３０゜ Ｇ入ＲＡ８３： Ｇａｒａｖｉｔｏ、　ＲＭ、　：ｒ　Ｊｅｎｋｉｎｓ、　ＪＮ　、：ｒｏｎｓｏ ｎｉｕｓ、　ＲＫａｒｌｓｓｏｎ、　ａｎｄＪＰ　Ｒｏｓｅｎｂｕｓｃｈ。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）、　に浪＝３Ｄ−３２７゜ＧＥＨＲ８７： Ｇｅｈｒｉｎｇ、　Ｋ、入Ｃｈａｒｂｉｔ、　Ｅ　Ｂｒ１ｓｓａｕｄ、　ａｎｄ 　Ｍ　Ｈｏｆｎｕｎｇ。

Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９８７）、　暉況（５）２１０３−２１０６゜Ｇ ＯＬＤ８３： ｃｏｌｄｅｎｂａｒｇ、　ＤＰ、　ａｎｄ　ＴＥ　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８コＬ　ｌｕ：　（２）　ｐ４０７−１３゜ＧＯ ＬＤ８７： Ｇｏｌｄ、Ｌ、ａｎｄ　Ｇ　Ｓｔｏｒｍｏ。

Ｖｏｌｕｍａ　２．　Ｃｈａｐｔａｒ　７Ｂ、　ｐ、　１３０２−１３０７．　 ｉｎ’　ｏａ　ｏ　”ｕ：ｃｅｕａ ｅｕ　。

Ｎａ１ｄｈａｒｄｔ、　ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ。

Ａｍａｒ＋Ｓｏｃ、ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ、　ＤＣ，１９８７゜ＧＯＴＴ８７： Ｇｏｔｔａｓｍａｎ、Ｓ。

Ｖｏｌｕｍｅ　２．　Ｃｈａｐｔ＠ｒ　７９．　ｐ、　１３０８−：Ｌ３１２． １ｎｃｅ”ｃｏ’　°ｕ′＋Ｃ Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ、　ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ。

Ａｍｅｒ＋Ｓｏｃ、ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ、ＤＣ，１９８７゜ＨＡＹＡ７６： ）！ａｙａｓｈｉ、　Ｋ、　Ｍ　Ｔａｋｅｃｈｉ、　Ｎ　Ｋａｎｅｄａ、　ａｎ ｄ　Ｔ　５ａｓａｋｉ。

ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔ　（１９７６）、社（２）２１０−４゜ＨＥＩＮ８７： Ｈｅ１ｎｅ、　ＨＧ、　Ｊ　Ｋｙｎｇｄｏｎ、　ａｎｄ　Ｔ　Ｆａｒｅｎｃｉ。

ＧｅＭ　（１９８７）、ｐ：２８７−９２゜ＨＥ工Ｎ８８： Ｈｅ１ｎｅ、　ＨＧ、　Ｇ　Ｆｒａｎｃｉｓ、　ＫＳ　Ｌｅｅ、　ａｎｄ　Ｔ　 Ｆｅｒ、ｅｎｃｉ。

Ｊ　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ　（入ｐｒｉｌ　１９８８）、　ｌ、ヱＯ：１７３０− ８゜ＨＥＲＲ７８： Ｈｅｒｒｍａｎｎ、Ｒ，Ｋ　Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ、Ｈ５ｃｈａｌｌａｒ、ａｎ ｄ　ＨＺｅｎｔｇｒａｆ。

３、ｎ　−ｄ　ｅｓ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ、、ＤＴ。

Ｄ　Ｄｒａｓｓｌｅｒ、　ａｎｄ　ＤＳ　Ｒａｙ　ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＩａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７Ｂ、、ｐ４７３−４ ７６゜Ｈ工ＣＫ８８： Ｈｉｃｋｍａｎ、ＲＸ、ａｎｄ　ＳＢ　Ｌｅｖｙ。

Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９８８）、　ｆ曵（４）１７１５−１７２０゜Ｗ ＩＮΣ８０： Ｈｉｎｅｓ、ＪＣ，ａｎｄ　ＤＳ　Ｒａｙ。

Ｇｅｎｅ　（１９８０）、　、ｌｌ：（３−４）２０７−１８゜ＨＯＧＬ８：ｌ ： Ｈｏｇｌｅ、　Ｊ、　Ｔ　Ｋｉｒｃｈｈａｕｓａｎ、　ａｎｄ　ＳＣＨａｒｒｉ ｓｏｎ。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９８３）、エム：９５（００゜ＨＯＬＬ８３： Ｈｏ１ｌａｃｋａｒ、　Ｍ、　ａｎｄ　ＴＥ　Ｃｒａｉｇｈｔｏｎ。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９８３）、護：４０９−４３７−ＨＯＯＰ８７： Ｈｏｏｐｅｓ、ＢＣ，ａｎｄ　ＷＲＭｃＣｌｕｒｅ。

Ｖｏｌｕｍｅ　２．　Ｃｈａｐｔｅｒ　７５．　ｐ　１２３１−：Ｌ２４０．　 ｉｎｓ　ｅ”ａｃｏ’　ｏｓ　’ｕ　ｕｍ：　ｅ　ａＯｏ　。

Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ、　ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ。

ｂａｒ、　Ｓｏｃ、ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ、　ＤＣ，１９８７゜ＨＵＢＥ７７： Ｈｕｂｅｒ、Ｒ，Ｗ　Ｂｏｄｅ、Ｄ、Ｋｕｋｌａ、Ｕ　Ｋｏｈｌ、ＣＡ　Ｒｙａ ｎ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ　５ｔｒｕｅｔ　Ｍａｃｈ　（１９７５）、）（３）１８９−２ ０１工Ｎ００８６： Ａｃａｄａｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８６゜工ＴＯＫ７９： 工ｔｏ、　Ｋ、　Ｇ　Ｍａｎｄａｌ、　ａｎｄ　Ｗ　Ｗｉｃｋｎａｒ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７９）、　７ ６：ｌ：Ｌ９９−１２０３゜ＪＡＮ工８５： Ｊａｎｉｎ、　＋：ｒ、　ａｎｄ　ＣＣｈｏｔｈｉａ。

Ｍａｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８５）、　二重（２８） ４２０−４３０゜ＪＡＺＷ７３ａ＝ Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ、　ＳＭ、　ＲＭａｒｃｏ、　ａｎｄ　Ａ　Ｋｏｒｎｂｅｒ ｇ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　入ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７３）、　ヱ０（１） ２０５−９゜ＪＡＺ賢７３ｂ： Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ、　ＳＭ、　ＲＭａｒｃｏ、　ａｎｄ　Ａ　Ｋｏｒｎｂａｒ ｇ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９７５）、剋（：Ｌ）２９４−３０５゜ＪＡＺＷ７４： Ｍａｒｃｏ、Ｒ，ＳＭ　Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ、ａｎｄ　Ａ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９７４）、、ｊＱ＝（１）２０９−２３゜ＪＯＮＥ８５ ： Ｊｏｎａｓ、ＴＡ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　（１９８５）、Ｌ５：１５７−７１゜３ＯＮ ＥＢ７： ｆｆｏｎａｓ、　ＫＡ、　＋：ｒＴ　Ｋａｄｏｎａｇａ、’　ｐ、ｙ　Ｒｏｓｅ ｎｆａｌｄ、　ＴＪ　ＩＫｅｌｌｙ、　ａｎｄ　ＲＴｊ　ｉａｎ　。

Ｃａ１ｌ　（Ｊａｎ　１６１９８７）、■ニア９−８９゜、７００Ｂ８０： Ｊｏｕｂａｒｔ、　ＦＪ、　ａｎｄ　Ｎ　Ｔａ１ｊａａｒｄ。

Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌａｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（：ｈｅｍ、（１９８ ０）、　瓜：６６１−６７４゜ＫＡＢＳ８４： Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ、ａｎｄ　Ｃ５ａｎｄａｒ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　入ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８４）、ｊｌｌ（４） １０７５−８゜ｎＤＯ８６： Ｋａｄｏｎａｇａ、　＋：ｒＴ、　ａｎｄ　ＲＴｊｉａｎ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（入ｕｇ　１９８６）、　旦 ユ　（１６）　５８８９−９３゜ＫＡ工Ｓ８７： Ｋａｉｓａｒ、　ＣＡ、　Ｄ　Ｐｒｅｕｓｓ、　Ｐ　Ｇｒｉａａｆｉ、　ａｎｄ 　Ｄ　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）、、ｊｊ：３１２−３１７゜ＫへＮＥ７６： Ｋａｎａｄａ、　Ｎ、　Ｔ　５ａｓａｋｉ、ａｎｄ　ＩＣ）Ｉａｙａｓｈｉ。

ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔ　（１９７６）、ヱＱ（１）２１７−２２゜ＫＡＰＬ７８： Ｋａｐｌａｎ、ＤＡ、Ｌ　Ｇｒａａｎｆｉｅｌｄ、　ａｎｄ　Ｇ　Ｗｉｌｃｏｘ 。

４ｎ’　＠−ｔｄ　、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　ＤＴ。

Ｄ　Ｄｒｅｓｓｌｅｒ、　ａｎｄ　ＤＳ　Ｒａｙ　＠ｄｉｔｏｒｓ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７８．、ｐ４６１− ４６７゜）ＣＵＨＮ１３５ａ： Ｋｕｈｎ、Ａ、ａｎｄ　Ｗ　Ｗｉｃｋｎｅｒ。

：ｆ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、（１９８５）、　２ｉＱ：１５９１４　（５９１８ ゜［８５ｂ： Ｋｕｈｎ、Ａ、ａｎｄ　Ｗ　Ｗｉｃ）ｃｎｅｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、（１９８５）、２旦Ω：１５９０７−１５９１３゜［ ８７： に廿ｙ、Ａ。

Ｓｃｉ＠ｎｃｅ　（１９８７）、　２；現＝１４１３−１４１５゜ＬＡＮＤ８７ ： Ｌａｎｄｉｃｋ、　Ｒ，ａｎｄ　ＣＹａｎｏｆｓ）ｃｙ。

Ｖｏｌｕｍｅ　２．Ｃｈａｐｔｅｒ　７７、ｐ　１２７６−１３０１゜ｅ　１　 １　°　ｏ　ｔ　”　ｕ：ｃｅｕｏ　。

Ｎａ１ｄｈａｒｄｔ、ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉａｆ。

Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ、　ＤＣ，１９８７゜Ｔ２ＥＢ７１： ’Ｌａ＠、Ｂ、ａｎｄ　ＦＭ　Ｒｉｃｈａｒｄｓ。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９７１）、３ｆｉ＝（３）３７９−４００゜ＬＥＥ Ｃ８６： Ｌｅａ、Ｃ，ａｎｄ　３　Ｂａｃｋｗｉｔｈ。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１９８６）、　、１＝３１５−３３ ６゜ＬＯ５工８６： Ｌｏｓｉｃｋ、　Ｒ，Ｐ　Ｙｏｕｎｇｍａｎ、　ａｎｄ　ＰＪ　Ｐｉｇｇｏｔ。

Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８６）、、２４；ｌ：６２５−６６９゜Ｍ ＡＫＥ８０： Ｍａｋａｌａ、Ｏ，Ｈ５ａｒｖａｓ、ａｎｄ工５ｅｐｐａｌａ。

Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８０）、、；ｌ：：２１３−２２ ３゜Ｋ入ｘｏａｏ＝ Ｍａｋｏｗｓｋｉ、Ｌ、ＤＬＤ　Ｃａ５ｐａｒ、ａｎｌ　ＤＡ　Ｍａｒｖｉｎ。

Ｊ＋Ｍｏｂ、Ｂｉｏｌ、（１９８０）、　ｋ徨：１４９−１８１゜に入ＬＡ６４ ： Ｍａｌａｍａｙ、　ＭＷ、　ａｎｄ　ＢＬ　Ｈｏｒｅｃｋａｒ。

Ｂｉｏｃｈａｍ　（１９６４）、ユニ１８８９−１８９３゜Ｘ入Ｎ工８２： Ｍａｎｉａｔｉｓ、？、ΣＦ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、ａｎｄ　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 。

“　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２゜に 入Ｎ０８６： Ｍａｎｏｉｌ、Ｃ，ａｎｄ　Ｊ　Ｂｅｃｋｗｉｔｈ。

５ｃｉａｎｃａ　（１９８６）、、ｊｌ：１４０３−１４０８゜ＫＡＲＣ８３： Ｍａｒｃｈａｌ、Ｃ，ａｎｄ　Ｍ　Ｈｏｆｎｕｎｇ。

ＥＭＢＯＪ　（１９８３）、７．＝８１−８６゜ＫＡＲＫ８６： Ｍａｒｋｓ、ＣＢ、Ｍ　Ｖａｓｓａｒ、Ｐ　Ｎｇ、　％＋ｉ　Ｈｅｎｚａｌ、ａ ｎｄ　Ｓ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８６）、　ハムニア１５−７１１８゜ＭＡＲＫ ８７： Ｍａｒｋｓ、ＣＢ、ＨＮａｄａｒｉ、ＰＡ　Ｋｏｓｅｎ、より　Ｋｕｎｔｚ、ａ ｎｄ　５Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）、Ｌ匝：１３７０−１３７３゜五υＱ８３； Ｍａｒｑｕａｒｔ、　Ｍ、　Ｊ　Ｗａｌｔａｒ、　３　Ｄａｉｓｉｎｈｏｆｆｅ ｒ、　Ｗ　Ｂｏｄｅ、ａｎｄ　ＲＨｕｂａｒ。

Ａｅｔａ　Ｃｒｙｓｔ、Ｂ　（１９８３）、　３ｊｉ：４８Ｏｆｆ。

ＭＡＲＶ７８： Ｍａｒｖｉｎ、ＤＡ。

ｉｎ　−、Ｄａｎｈａｒｄｔ、　ＤＴ。

Ｄ　Ｄｒａｓｓｌｅｒ、　ａｎｄ　ＤＳ　Ｒａｙ　ｅｄｉｔｏｒｓ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７Ｂ、、ｐ５８３− ６０３゜ＭＣＰＨ８６： ＭｃＰｈｅ＊ｔａｒｓ、　ＤＳ、入Ｃｈｒｉｓｔａｎｓａｎ、　ＥＴ　Ｙｏｕｎ ｇ、　Ｇ　Ｓｔｏｒｍｏ、　ａｎｄＬ　Ｇｏｌｄ。

Ｎｕｃｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ　（１９８６）、旦：５８１３−２６゜Ｍ ＥＳＳフ７： Ｍａｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　Ｂ　Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、　Ｂ　Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈ ｉｌｌ、　ａｎｄ　ＰＭＨｏｆｓｃｈｎａｉｄａｒ。

Ｐｒｏｃ　Ｍａｔｅ　入ｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７７）、ヱ４：３６４ ２−６−とΣ５Ｂ７８： Ｍａｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｂ　Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ。

ｉｎ　’　−ｅｄ　ｅ　、　Ｄａｎｈａｒｄｔ、　ＤＴ。

Ｄ　Ｄｒａｓｓｌａｒ、　ａｎｄ　ＤＳＲａｙ　ｅｄｉｔｏｒｓ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７Ｂ、、ｐ４４９−４ ５３゜に工ＣＨ３６： Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ、　Ｓ、　ＪＰ　Ｈｕｎｔ、　ａｎｄ　Ｊ　Ｂｅｃｋｗｉｔ ｈ。

Ｊ、Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、（１９８６）、　環ユニ１６０（６７゜Ｍ工ＬＬ７２ ： Ｍｉｌｌｅｒ、ＪＨ。

シー虹山匹ＪＩｉｎ比江東現り匡急ｍ畦お１゜Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　！！ａｒｂｏｒ、 　ＮＹ。

に工ＬＬ＋３７　ａ　： Ｍｉｌｌａｒ、　ｓ、　Ｊ　Ｊａｎｉｎ、　ＡＭシｉｓｋ、　ａｎｄ　ＣＣｈｏ ｔｈｉａ。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８７）、　」瓜：６４１−６５６゜Ｋ１ＬＬ８７ ｂ： Ｍｉｌｌｅｒ、　ＥＳ、　Ｊ　Ｋａｒａｍ、　Ｍ　Ｄａｗｓｏｎ、　Ｍ　Ｔｒａ ｊａｎｏｗｓｌｃａ、　Ｐ　Ｇａｕｓｓ。

ａｎｄ　Ｌ　Ｇｏｌａ。

、７　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９ｓ７）、　ユ２丘：３９７−４１０゜に工ＬＬ ８８： Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ、ＪＡ　Ｈａｔｃｈ、Ｓ　Ｓｉｍｏｎｉｓ、ａｎｄ　ＢＥ　Ｃ ｕ１ｌｅｎ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８８）、旦５：１３５ ９−１３６３゜ＭＯ５Ｅ８３： Ｍａｓｅｒ、　Ｒ，ＲＭ　Ｔｈｏｍａｓ、　ａｎｄ　Ｂ　Ｇｕｔｔｅ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８３）、　ＬＬＬ：２４７−２５１゜ＭＯ５ Ｅ８５： Ｍｏ５ｅｒ、　Ｒ，Ｓ　Ｋｌａｕｓｅｒ、　Ｔ　Ｌｅｉｓｔ、　ＨＬａｎｇｅｎ 、　Ｔ　Ｅｐｐｒｅｃｈｔ、　ａｎｄＢ　ｃｕｔｔａ。

Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍｉｅ、工ｎｔｅｒｎａｔｌ　Ｅｎｇ　Ｅｄ　＋　（コ、９ ８５）、２ｉニア１９−７９８゜ＭＯ５Ｅ８７： Ｍｏ５ａｒ、　Ｒ，Ｓ　Ｆｒａｙ、　’Ｋ　Ｍｕｅｎｇｅｒ、　Ｔ　Ｈｅｈｌｇ ａｎｓ、　Ｓ　Ｋｌａｕｓｅｒ、　ＨＬａｎｇｅｎ、　Ｅ−Ｌ　Ｗｉｎｎａｃｋ ｅｒ、　ＲＭｅｒｔｚ、　ａｎｄ　Ｂ　Ｇｕｔｔｅ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９８７）、　）：３３９−３４ ３゜ＮλＸＡ３６： Ｎａｋａａ、Ｔ、　Ｊ、工５ｈｉｉ、ａｎｄ　Ｔ　Ｆａｒｅｎｃｉ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、（ｌり８６）、ｌｌ：６２２−６２６−ＮＡＸ入８７ ： Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ、　Ｔ　）Ｉｉｒａｉ、Ｆ　Ｔｏｋｕｎａｇａ、　Ｓ　 Ｘａｗａｂａｔａ、　ａｎｄ　Ｓ工ｗａｎａｇａ。

、ｒ　Ｂｉｏｃｈａｍ＋（１９８７）、　皿：１２９７−１３０６゜ＮＥより８ ７： Ｎａ１ｄｈａｒｄｔ、ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ。

’Ｃ”　’ｕ”ｅ ａ　ｃ　’　。

Ａｍａｒ、５ｏｃ、ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ 、ＤＣ，１９８７゜ＮＥＴ）Ｈ６５： Ｎａｕ、ＨＣ，ａｎｄ　ＬＡ　Ｈｅｐｐａｌ。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９６５）、　２ｉＱ：３６８５−３６９２゜Ｎ工 ＫＡ８４： Ｎ１ｋａｉｄｏ、Ｈ，ａｎｄ　ＨＣＰ　Ｍｕ。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１１９８４）、Ｊｌｌ：１ ０４８−１０５２＋ＮＩＫＡ８７： Ｎ１ｋａｉｄｏ、Ｈ，ａｎｄ　Ｍ　Ｖａａｒａ。

Ｖｏｌｕｍｅ　ｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ　３．ｐ７−２２゜Ｅｓｃｅ’ｃ’ａｃｏ　 ａｄｓａｍ　ｅ　ｔ　’ｕｒ’ｕｍ：Ｃｅ　ｕａａ　ｅｃ　’　。

Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ、ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ。

Ａｍｅｒ、Ｓｏｃ、ｆｏｒ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ ｎ、ＤＣ，１９８フ。

Ｎ０Ｍ０７８： Ｎｏｍｕｒａ、　Ｎ、　Ａ　Ｏｋａ、　Ｍ　Ｔａｋａｎａｍｉ、　ａｎｄ　ＨＹ ａｍａｇｉｓｈｉ。

Ｉａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７Ｂ、、ｐ４６７−４７２゜ＯＨＫ八８へ： Ｏｈｌｃａｗａ　、工、ａｎｄ　ＲＥ　Ｗａｂｓｔｅｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、（１９８１）、　２ｊ２ｉ＝９９５１−９９５８゜Ｏ ＨＴλ７６： ０ｈｔａ、　Ｍ、　Ｔ　５ａｓａｋｉ、　ａｎｄ　Ｋ　Ｈａｙａｓｈｉ。

ＦＥＢＳ　しｐｔｔ　（１９７６）、１（１）１６１−６゜０ＬＩＰ８６： ０１ｉｐｈａｎｔ、　ＡＲ，ＡＬ　Ｎｕｓｓｂａｕｍ、　ａｎｄ　Ｋ　５ｔｒｕ ｈｌ。

Ｇａｎｅ　（１９８６）、１＝１７７−１８３゜ＯＬ工Ｐ８７： ０１ｉｐｈａｎｔ、　ＡＲ，ａｎｄ　Ｙ、　５ｔｒｕｈｌ°　０　ツ（１９８７ ）ｐ　５６Ｂ−５８２゜Ｅｄｉｔｏｒ　Ｗｕ、Ｒ；　入ｃａｄａｍｉｃ　Ｐｒａ ｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ＯＬ工ｖ８５： ０１ｉｖａｒ、Ｄ。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８５）、Ｊ３：６１５−６４８゜ ＯＬ工ｖ８７： ０１ｉｖｅｒ、ＤＢ。

Ｖｏｌｕｍｅ　１．　Ｃｈａｐｔｅｒ　６．　ｐ　５６−６９．１ｎｓｃｅ’ｃ ’ａｃｉ°　ａｒｄ　Ｓ　ｏ　ｅ　１　ｔ　’　ｕ　’ｕｒ：　Ｃｅ　ｕｌａａ ｄ　ｕａ’ｏｏ。

Ｎｅ１ｄｈａｒｄｔ、ＦＣ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−Ｃｈｉｅｆ。

Ａｍｅｒ、　Ｓｏｃ、ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ、ＤＣ，１９８７゜ＰＡＢＯ７９： Ｐａｂｏ、Ｃｏ、ＲＴ　５ａｕａｒ、＋：ｒＭ　５ｔｕｒｔａｖａｎｔ、ａｎｄ ＭＰｔａｓｈｎａ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（ｉ９７９）、ヱ４１：１６ ０８−１６１２゜ＰＡＤＬ８５： Ｐａｄｌａｎ、ＥＡ、ａｎｄ　ＷＥ　Ｌｏｖｅ。

、ｒ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８５）、２ＪＩＱ　（１４）ｐ８２７２−９ ゜ＰＡＫＵ８６： Ｐａｋｕｌａ、ＡＡ、ＶＢ　Ｙｏｕｎｇ、ａｎｄ　ＲＴ　５ａｕｅｒ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８６）、８３：８Ｂ２ ９−１１８３３゜ＰＡＬＶ７９： Ｐａ１ｖａ、ＥＴ、ａｎｄ　Ｐ　Ｗｅｓｔａｒｍａｎｎ。

ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔｅｒｓ　（１９７９）、　江ニア７−８０゜ＰＡＰＡ８２： Ｐａｐａｍｏｋｏｓ、　Ｅ、　Ｅ　Ｗｅｂａｒ、　Ｗ　Ｂｏｄｅ、　ＲＨｕｂｅ ｒ、　ＭＷ　Ｅｍｐｉａ、工Ｋａｔｏ、　ａｎｄ　Ｍ　Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ　Ｊ ｒ、。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８２）、ツ：５１５゜ＰＡＲＤ８ｘ： Ｐａｒｄｏａ、工Ｕ、ａｎｄ　ＡＴＨＢｕｒｎｅｓｓ。

、Ｔ　Ｇｉｎ　ＶｉｒｏｌＬ　（１９８１）　、’２−ヱ：２３９−２４３゜Ｐ ＯＴＥ８３： Ｐｏｔｅｅｔｅ、λｋ。

Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９ｓ３）、　＝ユニ４０１−４１８゜ＰＲ工ｖ８６ ： Ｐｒ１ｖａｌｏｖ、　ＰＬ、　ＹＶ　Ｇｒｉｋｏ、　ＳＹ　Ｖｅｎｙａｍｉｎｏ ｖ、　ａｎｄ　ＶＰ妃、、　ａｄｉｔｏｒｓ、　Ｐｌａｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、１ ９８７゜ＲＡＯ９８フ＝ Ｒａｏ　ＳＮ、　ＵＣＳｉｎｇｈ、　ＰＡ　Ｂａ５ｈ、　ａｎｄ　ＰＡ　Ｋｏｌ ｌｍａｎＮａｔｕｒｅ　（１９８７）、畠（６１３０）　ｐ５５１−４゜ＲＡＳ Ｃ８６： Ｒａ５ｃｈａｄ、工、ａｎｄ　Ｅ　０ｂａｒａｒ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、（１９８６）　、ｌ：４０１−４２７゜ＲＡｓＨ ８４： Ｒａ５ｈｉｎ、入。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８４）、　３１：５５１Ｂ。

ＲＡＹＧ８６： Ｒａｙ、　ＧＬ、　ａｎｄ　ＷＧ　Ｈａｌｃｌｅｎｗａｎｑ。

Ｊ　Ｂａｃｔ　（１９８６）、　２ＪＬｆＬ＝４７２−７８゜ＲＥより８日： Ｒｅ１ｄｈａａｒ−０１ｓｏｎ、ＪＦ、ａｎｄ　ＲＴ　５ａｕａｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）、７４４：５３−５７゜ｋ工ＣＨ３１： Ｒ工Ｃ）ｆ８６： Ｒｉｃｈａｒｄｓ、ＪＨ。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）、　２２Ｍ＝１８７゜１０１Ｍ８０： Ｒｏａ、Ｍ、ａｎｄ　ｕ　Ｃｌｅｍａｎｔ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８０）、　Ｌｕ：１２７−１２９゜ＲＯＢＥ ８６： Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｓ、ａｎｄ　ＡＲＲｅｅｓＰｒｏｔａｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅａｒ ｉｎｇ　（１９８６）、　１：５９−６５゜ＲＯＤＲ８２： Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、　ＲＸａｔ Ｇａｎｇ　（１９８２）、ｉと３０５−３１６゜ＲＯ５Ｅ８５： Ｒｏｓｅ、ＧＤ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｌｇｙ　（１９８５）、　＝１（２９ ）４３０−４４０゜ＲＯ５Ｓ８１： Ｒｏｓｓｍａｎ、Ｍ、ＥＬＭ　Ｐ　Ａｒｇｏｓ。

Ａｎｎ、Ｒｅｄ、Ｂｉｏｃｈａｍ、（１ｓｓｎ）、　区：４９７ｆｆ。

ＲＵＳＳ８１： Ｒｕ５ｓ＠ｌ、Ｍ、ａｎｄ　Ｐ　Ｍｏｄｅｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８１ン１．ニー」シ、： １７１７−１７２１゜ＳへＢＢ８８： ５ｕｂｂａｒａｏ、ＭＮ、ａｎｄ　Ｄ　Ｋａｎｎａｌｌ。

ＪＢａｃｔ　（１９８Ｂ）、　Ｙｍ：２８６０−２８６５゜Ｓλ工ｘ８５： ５ａｉｋｉ、　ＲＸ、　Ｓ　５ｃｈａｒｆ、　Ｐ　Ｆａｌｏｏｎａ、　ＫＢ　Ｍ ｕｌｌｉｓ、　ＧＴ　ａｏｒｎ、　ＨＡＥｒｌｉｃｈ、　ａｎｄ　Ｎ　Ａｒｎｈ ａｉｍ。

５ｃｉａｎｃａ　（１９８５）、　７ｊｉ＝１３５０−１３５４゜Ｓ入り工６４ ： ５ａｌｉｖａｒ、　Ｎｏ、　ＨＴｚａｇｏｌｏｆｆ、　ａｎｄ　Ｄ　Ｐｒａｔｔ 。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（１９６４）、２１＝３５９−７１゜５ＡＳＡ８４： ５ａｓａｋｉ、Ｔｔ ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔ、（１９８４）、工亙旦：２２７−２３０゜５ＯＩＡ７８： ５ｃｈａｌｌａｒ、Ｈ，Ｅ　Ｂ＠ｃｋ、ａｎｄ　Ｍ　Ｔａｋａｎａｍｉ。

’　−ｄ　Ｎ　ａ　ｅ　、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ、Ｄ、Ｔ、、　Ｄ。

Ｄｒａｓｓｌｅｒ、　ａｎｄ　Ｄ、Ｓ、　Ｒａｙ　ａｄｉｔｏｒｓ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　）！ａｒｂｏｒＩＪａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９７Ｂ、、ｐ１３ ９−１６３゜５ＣＦｔ八８６： ５ｃｈａｒｆ、ＳＪ、Ｇ″Ｔ　）ｉｏｒｎ、ａｎｄ　）ＬＡ　Ｅｒ１ｉｃｈ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）、　７Ｊｕ＝１０７６−１０７８゜５ＣＨＯ８４ ゜ ５ｃｈｏｌｄ、　Ｍ、　Ａ　Ｃｏｌｏｍｂ＠ｒｏ、　ＡＡ　Ｒｅｙａｓ、　ａｎ ｄ　ＲＢ　Ｗａｌｌａｃｅ。

ＤＮＡ　（１９８４）、　２（６）４６９−４７７゜Ｓ（”ＨＵ７９： ５ｃｈｕｌｚ、ＧＥ、ａｎｄ　ＲＨＳｃｈｉｒｍｅｒ。

５Ｃ）ｒＷ８フ： Ｓｃｈｗａｒｚ、　Ｈ，Ｈ：ｆ　Ｈｉｎｚ、　Ａ　Ｍａｈｌｉｃｈ、　ＨＴｓｃ ｈｔｓｃｈａ、　ａｎｄ　’ＫＲｗｅｎｚａ１゜ Ｂｉｏｃｈａｍｉｇｔｒｙ　（１９８））、　ａ：　（１２）ｐ３５４４−５１ ゜５ＣＯＴ８７： ５ｃｏｔｔ、Ｆ１３．Ｃ５Ｈｕｃｋａｂｙ、　工Ｋａｔｏ、Ｗｊ　Ｋｏｈｒ、Ｍ 　Ｉａｓｋｏｗｓｋｉ＋ｙｒ、　、　Ｍ−３Ｔｉａｉ　＆ｎｄ　ＢＷ　Ｏ’Ｍａ ｌｌａｙ。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＴｎ（１９８７）、　２Ｊ２２（１２）５８９９−５９０ ７＋５ＥＲＷ８フ： Ｓｓ四ｓｒ、Ｐ。

Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　（１９８７）、　ｉｕ：３４５−３５７゜ ５ＨＯＲ８１： ５ｈｏｒｔｌｅ、Ｄ、Ｄ　ＤｉＭａｉｏ、ａｎｄ　Ｄ　Ｎａｔｈａｎｓ。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎａｔ、（１９８１）、１＝２６５−２９４゜５ＨＯＲ８ ５： ５ｈｏｒｔｌｅ、Ｄ、　ａｎｃｌ　Ｂ　Ｌｉｎ。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（１９８５）、　９友：５３９−５５５゜ＳＭ工Ｔ８５： Ｓｍ１ｔ上ＧＰ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）、　２２Ｊｌ：１３１５−１３１７゜ＳＭ工Ｔ８ ７ａ＝ Ｓｍｉｔｈ　Ｍ。

ｓｙ、工Ｔ８７ｂ： ５ｍ１ｔｈ、Ｈ，Ｓ　Ｂｒａｎ、Ｊ　ｖａｎ　Ｅａ、ａｎｄ　Ｇ　Ｖｅｎｅｍａ 。

ＪＢａｃｔａｒｉｏｌ、（１９８７）、　に況：３３２１−３３２ｓ。

５ＴＡＴ８７： ５ｔａｔａｓ、ＤＪ、ＴＥ　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、ＣＭ　Ｄｏｂｓｏｎ、ａｎｄ 　Ｍ　Ｋａｒｐｌｕｓ。

：Ｉ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８７）、　１旦コニ　（３）　ｐ７３１−９゜ ５ＴＲＹ８１： Ｓｔｒｙｄｏｍ、ＤＪ、ａｎｄ　ＦＪ　Ｊｏｕｂａｒｔ。

Ｈｏｐｐｅ−５ａｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８ １）、　ト迄：１３７７−１３８４゜５ＵＤＨ８５： ５ｕｄｈｏｆ、ＴＣ，ＪＬ　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、ＭＳ　Ｂｒｏｗｎ、ａｎｄ　 ＤＷ　Ｒｕ５ｓｅｌｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）、　２ＪＪｌ：８１５−８２２゜５ＵＲＥ８７： Ｓｕｒｅｗｉｃｚ、ＷＫ、ＡＧ　５ｚａｂｏ、ＭＷ　Ｍａｎｔｓｃｈ。

Ｅｕｒ　ニア　Ｂｉｏｃｈｅｍ　（１９８７）、　北ユ（３）５１９−５２３゜ ５ＵＴＣ８７ａ： ５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　ＭＪｔ　工Ｈａｎｅｅｆ、Ｄ　Ｃａｒｎｅｙ、　ａｎｄ 　ＴＬ　Ｂｌｕｎｄａｌｌ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９８７）、ユニ３７７−３８４ ゜５ＵＴＣ８７ｂ： ５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、　ＭＪ、　ＦＲＦ　Ｈａｙｅｓ、ａｎｄ　ＴＬ　Ｂｌｕｎ ｄｅｌｌ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９８７）、　、ｌ：３８５−３ ９２゜５ＵＺＵ８３： ５ｕｚｕｋｉ、Ｔ　ａｎｄ　ＹＣＳｈｉｋａｍａ。

Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　（１９８３）、　２２ｉ（２）６ ９５−９゜ＴＡＸ入７４： Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｈ，Ｓ　Ｉｗａｎａｇｅ、　Ｔ　Ｋｉｔａｇａｗａ、　 Ｙ　Ｈｏｋａｍａ、　ａｎｄ　ＴＳｕｚｕｋｉ。

Ｊ　Ｂｉｏｃｈａｍ　（１９７４）、７６：７２１−７３３゜ＴＡＮＫ７７： Ｔａｎ、　ＮＨ，ａｎｄ　ＥＴ　Ｋａｉｓａｒ。

Ｂｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ　（１９７７）、　旦＝１５３１−１５４１ＴＨＥ１ ８８： Ｔｈａｒｉａｕｌｔ、　ＮＹ、　ＪＢ　Ｃａｒｔａｒ、　ａｎｄ　ＳＰ　Ｐｕ１ ａｓｋｉ。

ＢｉｏＴａｃｈｎｉｑｕａｓ　（１９８Ｂ）、　１（５）４７０−４７３゜ＴＨ Ｏ１８８： Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、　ノｔＢＬ　５ｉｂｉｎｄａ、　ＭＳＥｄｗａｒｄｓ、　ａ ｎｄ　ＤＪ　Ｂａｒｌｏｗ。

Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　Ｆｅｂ−Ｍａｒ　１９８８．　旦（２）　６３−９゜ＴＯ ＴＨ８６： Ｔｏｔｈ　ＭＪ、　ａｎｄ　Ｐ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌ。

ＪＢｉｏｌ、Ｃｈａｍ＋　（１９８６）、２Ｈ＝ｒ；６４３−６ｅ４６゜ＴＳＣ Ｈ８７： Ｔｓｃｈｅｓｃｈ、　Ｈ，：Ｉ　Ｂｅｃｋｍａｎｎ、　Ａ　Ｍｅｈｌｉｃｈ、　 Ｅ　５ｃｈｎａｂｅｌ、　ＥＴｒｕｓｃｈｅｉｔ、ａｎｄ　ＨＲＷａｎｚａｌ。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　（１９８７） 　、　Ｌユニ９７−ｍｏｌ。

ＵＬＭＥ８３： Ｕｌｍａｒ、ＫＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８３）、　Ｌユ（４５８５）６６６−７１゜Ｖ工ＴＡ８ ４： Ｖｉｔａ、　Ｃ，Ｄ　Ｄａｌｚｏｐｐｏ、　ａｎｄ　Ａ　Ｆｏｎｔａｎａ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８４）、　λ、ｌ：５５１２−５５１９゜Ｎ ａｔｕｒｅ　（１９８４）、コΩｚ：１８７−１８８゜Ｗ工ＮＴ８７： Ｗｉｎｔｅｒ、　ＲＢ、　Ｌ　Ｍｏｒｒｉｓｓａｙ、　Ｐ　Ｇａｕｓｓ、　Ｌ　 Ｇｏｌｄ、　Ｔ　Ｈｇｕ、　ａｎｄＫａｒａｍ。

ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ｘｃａａ　Ｓｅｉ　ＵＳＡ　（１９Ｂ？）、ｊ１４ニア８ ２２−６゜Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９）５）、５ＩＪＬ：１７９−１９４゜ ％ｆＬＯＤ８７に： Ｗｌｏｄａｗ＠ｒ、　Ａ、　Ｊ　Ｎａｃｈｍａｎ、　ＧＬ　Ｇ１１ｌｉｌａｎｄ 、　Ｗ　Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、　ａＹＡＧＥ８７： ｄσ 、：ｆ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、（１，９８２）、正＝６５２９−６５３６゜Ｚｏ ｌｌｅｒ、　Ｍ：ｆ、　ａｎｄ　Ｍ　Ｓｍ１ｔｈ。

ＤＮＡ　（１９８４）、ユ（６）　４７９−４８８゜ＹＡ？Ｑ７０： ｙａｍａｍｏｔｏ、　ＫＲ，ＢＭλ１ｂａｒｔｓ、　ＲＢｅｎｚｉｎｇｅｒ、　 Ｌ　Ｉａｗｈｏｒｎａ、　ａｎｄｎｄ 表　２　好ましい外面タンパク質 Ｍ１３　コートタンパク質　ａ）アミン末端が露出している（ｇｐ■）　ｂ）翻 訳後の処理が予想可能Ｃ）ウィルス粒子中に多数のコ Ｐｈ１Ｘ１７４　Ｇタンパク質　ａ）ウィルス粒子外面正に存在することが知ら れている ｂ）Ｇ−ｉｐｂｄ遺伝子がＨＪ伝子と 置き換わることができる程 Ｂ　、５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｃｏ　ｔ　Ｃａ）翻訳後の処理が不要ｂ）タンパク質 を胞子コート中 に局限的に存在せしめる顕 著な配列がある 表　７　原子半径（Ａ） Ｃアルファ　１．７０ ０カルボニル その他の原子　１．８０ 表　８ 試薬が親のｎｔのうちのフラクションＭを有する場合における、ｎ個の非親塩基 を有するＤ　Ｎ　Ａ分子のフラクションｆａ　０．　２ｘ１０−７．ＯＯ０９６ ．０３３６　、１１８２　、０８０１６５ｆ１６　０．　Ｏ．　０．　５ｘ１０ −７．Ｏｏｏ０６　、０２７２８１表　９　最良のｖｇコドン プログラム名　「最適ｖｇコドンを発見せよ」存在率のメモリを初期化せよ りｏ（０，０１のステップ内ではｔｌ＝０．２１〜０．３１）”　Ｄ　０ＣＯ− ０１のステップ内ではｃｌ−０，１３−Ｏ−２３）・−Ｄｏ（０，０１のステッ プ内ではａｌ＝０．２３−０．３３）コメント　その他の濃度からｇｌを計算せ よ・・・ｇｌ＝１．０−ｔｌ−ｃｌ−ａｌ−−−Ｉ　Ｆ（ｇｌ　−ｇｅ、　０− １５）−−−−Ｄｏ（０，０１のステップ内でａ２−０．３７−０．５０）−− −−−ＤＯ（０，０１のステップ内でｃ２−０．１２−０．２０）コメント　Ｄ ＋Ｅ−Ｒ＋にとせよ ・　−・　・・　・ｇ２−（ｇｌ＊ａ２−．５＊ａ　ｌ＊ａ２）／（ｃ　１＋０ ．５本ａｌ）コメント　その他の濃度からｔ２を計算せよ−−−−−・ｔ２−１ −ａ２−ｃ２−ｇ２・・・・・・ＩＦ（ｇ２．ｇｔ、０．１−およびｔ　２．ｇ 　ｔ、ｏ、ｌ）・・・・・・・存在率を計算せよ ・・・・・・・前の存在率と対比せよ ・・・・・・・、ＩＦブロックを終了 ・・・・・・、ＤＯループ終了ＩＣ２ ・・・・・、ＤＯループ終了！ａ２ ・・・・、もしｇｌが十分に大きかったら、ＩＦブロフク終了！・・・、ＤＯル ープ終了！ａｌ ・・−Ｄｏループ終了１ｃｌ ・、ＤＯループ終了ｆｉｌ 最良の分布率および存在率を記入せよ 表　１０　最適ｖｇコドンから得られる存在率Ｗ　Ｙ　５．２０ｔ ストツプコドン 存在比−存在＊（Ｗ）／存在率（Ｓ）−０，４０７，１１ｆａａ−最も好ましく ないアミノ酸 ｍｆａａ−最も好ましいアミノ酸 表　１１　ｆ悪のコドンを計算せよ プログラム名・１所定の分布玉の５ｅｒｒ申のｉＩ！に悪ｖｇコドンを発見せよ Σ存在稟のメモリを初期化せよ コメント　５ｅｒｒは％誤差レベル ５ｅｒｒを読め コメント　Ｔｌｉ、Ｃ１ｉ、Ａｌｉ、Ｇｌｉ、Ｔ２ｉ、Ｃ２ｉ、Ａ２ｊ、Ｃ２ｉ 、Ｔ３ｉ、Ｃ３ｉコメントは所定のｎｔ分配工 Ｔｌｉ、Ｃ１ｉ、Ａｉｉ、Ｇｌｉを読めＴ２ｉ　、Ｃ２ｉ　、Ａ２ｉ　、Ｃ，２ ｉを読めＴ３ｉ、Ｃ３ｉを読め ＤＯ（７ステソプ中でｔ１４１ｉ下げ〜Ｔ１１上げ）−Ｄｏ（７ステツプ中でｃ ｌ＜Ｉｉ下げ−Ｃ１ｉ上げ）・・Ｄｏ（７ステノブ中でａｌ＝Ａ１　ｉ下げ〜Ａ ｌｉ上げ）・・・ｇｌ−１，−Ｌｌ−ｃｌ−ａｌ ・・・Ｉ　Ｆ（（ｇｌ−Ｇｌｉ）／Ｇｌｉ　、ｂ、　−５ｅｒｒ）コメント　ｇ ｌがＧｌｉのずっと下にあるなら、それを押し戻せ・・・・ｇｌ＝Ｇ］ｉ下げ ・・・・因子（１，−ｇｌ）／Ｑｉ↓ｃｌ↓ａｌ）・・・Ｉ　Ｆ（（ｇｌ−Ｇｌ ｉ）／Ｇ１＋　４ｔ、　５ｅｒｒ）コメントｇｌが６１１のずっと上にあるなら 、それを押し戻せ・・・・ｇｌ＝Ｇｌｉ上げ ・・・・因子（１−−ｇｌ）／（ｔｉ＋ｃｌ＋ａｌ）・・・・、ＩＦブロック終 了 ・・・Ｄｏ（７ステツプ中でａ２ｇＡ２ｉ下げ〜Ａ２ｉ上げ）・・・・Ｄｏ（７ ステツプ中でｃ２＜２　ｉ下げ〜Ｃ２１上げ）・・・・・・Ｄｏ（７ステツプ中 でｇ２＝Ｇ２ｉ下げ〜Ｇ２ｉ上げ）コメント　その他の濃度からｔ２を計算せよ ・・・・・・ｔ２・１．−ａ２−ｃ２−ｇ２・・・・・・Ｔ　Ｆ　（（ｔ２−Ｔ ２ｊ）／Ｔ２ｉ　、ｌｔ、　−５ｅｒｒ）フメン）　Ｚ２がＴ２ｉのずっと下に あるなら、それを押し戻せ・・・・ｔ２・Ｔ２ｉ下げ ・・・・因子＝（１、−ｔ２）／　（ａ２＋ｃ２＋ｇ２）・・・・ａ２；ａ２因 子 ・・・・ｃ２＝ｌｃ２因子 ・・・・ｇ２＝ｇ２因子 ・・・・、ＩＦブロック終了 ・・・Ｉ　Ｆ（（ｔ２−Ｔ２ｉ）／Ｔ２ｉ　、ｇｔ、　５ｅｒｒ）コメント　ｔ ２がＴ２ｉのずっと上にあるなら、それを押し戻せ・・・・・・・ｔ２４２ｉ上 げ ・・・・・・・因子＝（１，−ｔｌ）／　（ａ２＋ｃ２↓ｇ２）・・・・・・・ ａ２□ａ２因子 ・・・・・・・ｃ２−ｃ２因子 ・・・・・・・ｇ＞ｇ２因子 ・・・・・・・、ＩＦ’；’（７ンク終了−−・−−−Ｉ　Ｆ　（ｇ２．ｇｔ、 　０．０　、ａｎｄ、　Ｉ２．ｇｔ、ｏ、ｏ）・・・・・・・Ｉ３−０．５＊（ １，−５ｅｒｒ）・・・・・・・ｇ３＝１．−Ｉ３ ・・・・・・・存在工を計算せよ ・・・・・・・前の存在率と比較せよ ・・・・・・・存在率を計算せよ ・・・・・・・前の存在率と比較せよ ・・・・・・・ｔ３１Ｉ０．５本（１，＋Ｓｅ「「）・・・・・・・ｇ３・１． −Ｉ３ ・・・・・・・存在稟を計算せよ ・・・・・・−・前の存在率と比較せよ・・・・・・・ＩＦプａツクを終了 ・・・・・・Ｄｏループを終了！ｇ２ ・・・・・Ｄｏループを終了１ｃ２ ・・・・Ｄｏループを終了！ａ２ ・・・Ｄｏループを終了！ａ１ ・・Ｄｏループを終了＋０１ ・ＤＯループを終了Ｉｔｌ 最悪の分布率と存在率を記入せよ 表１２ アミノ酸　存在案　アミノ酸　存在率 Ｋ　５．７３士　Ｌ　６．フ１智 Ｍ　３．ＯＯ４Ｎ　５．１９を 存在比−存在率（Ｆ）／存在呂（Ｒ）−０，３２４８表　１３　８ＰＴＩ［同体 ２　ＭＡＲＫ８７から操作され？：ＢＰＴＩ３　Ｍ、ＡＲＫ８７から操作された ＢＰＴ　Ｉ４　ウシ初乳（ＤＵＦτ８５） ５　ラン血清（ＤＵＦＴ８５） ６　半合成りＰＴＩ％ＴＳＣ）（８７ ７半合ｆｆＢＰＴ１．ＴＳＣＨ８７ ８半合成りＰＴＩ％ＴＳＣＨ８７ ９半合成ＢＰＴＩ、ＴＳＣ）（８７ １０半合成りＰＴＴ、ＴＳＣＨ８７ １１操作されｆ：ＢＰＴｌ、ＡｔＪＥＲ８７１２　Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ　ｐ ｏｌｙｌｅｐｉｓ　ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ　（黒マンバ〕ヘビ雪１　（ＤＵＦＴ８ ５）！　３　Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ　ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ　ｐｏｌｙｌｅｐｉ ｓ　（黒マンバ）ヘビＩＩＫ　（ＤＵＦＴ８５）１４　）（ｅｍａｃｈａｔｕｓ 　ｈｅｍａｃｈａｔｅｓ　（リン力ルスコプラ）ＨＨ■■（ＤＵＦＴ８５）１５ 　＼ａｊａ　Ｎ１ｖｅａ　（ケープコブラ）ＮＮＶＩ［（ＤｔＪＦＴ８５）１５ 　Ｖｉｐｅｒａ　ｒｕｓｓｅｌｌｉ　（ラノセルクサリヘビ）ＲＶＶＩＩ　（Ｔ ＡＫＡ７４）１７　紅海亀卵白（ＤＵＦＴ８５） １８　カタツムリの粘液（）ｌｅｌｉｘｐｏｍａｎｉａ）　（ＷＡＧＮ７８）表 　１３（続き）　ＢＰＴＩ相同体 残基数　２０　２１　２２　２３　２４　２５　２６　２７　２８　２タ　コ０ ３１　コ２３コ２０　Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ　ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ（東部 グリーンマンバ）　Ｃ１０Ｓ２　Ｃ３１！素（Ｄ［ＪＦＴ８５）２１　Ｄｅｎｄ ｒｏａｓｐｉｓ　ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ　ｐｏｌｙｌｅｐｅｓ　（黒マン／すＢ１ １素（ＤＵＦＴ８５）２２　Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ　ｐｏｌｙｌｅｐｉｓ　ｐ ｏｌｙｌｅｐｅｓ　（黒マンバ）ＥＷ素（ＤＵＦＴ８５）２３　Ｖｉｐｅｒａ　 ａｍｍｏｄｙｔｅｓＴ　１ｍｌ素（ＤＵＦＴ８５）２４　Ｖｉｐｅｒａ　ａｍｍ ｏｄｙｔｅｓｃ　Ｔ　Ｉ　毒素（ＤＵＦＴＩ’３５）２５　Ｂｕｎｇａｒｕｓ　 ｆａｓｃｉａｔｕｓＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｂ１ｍ素（ＤＵＦＴ８５）２６　Ａｎｅｍ ｏｎｉａ　５ｕｌｃａｔａ　（イソギンチャフ）５　Ｔ　Ｉ　（ＤｔＪＦＴ８５ ）２７　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓＨＴ　−１４不活性ドメイン（ＤＵＦＴ８５ ）２８　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｒ＋ｓＨｒ　−１４活性ドメイン（ＤＵＦＴ８５ ）２９　β−ブンガロトキンンＢｌ　（ＤＵＦＴ８５）３０　β−ブンガロトキ シンＢ２　（ＤＵＦＴ８５）３１　ウシ牌［ＴＩ　ｎ　（Ｆ　ＴＯＲ８５）３２ 　Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｒ＋ｔａｔｕｓ　（カブトガニ）血球イン ヒビター（ＮＡＫＡ８７）３３　Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　（蚕）　５ＣＩＩ　 Ｔ　Ｔ　（ＳＡＳＡ８４）注釈： ａ）βブンガロトキンンは両者ともＮ５個の残基が削除される。

ｂ）Ｂ、ｍｏ　ｒ　ｉはＣ５とＣ１４との間に余分な残基１個を有する。我々は ＦとＧとを残基９に割り尚てた。

Ｃ）自然界のタンパク質はいずれも、５．１４．３０１３８．５ｏ及び５５にＣ を有する。

ｄ）相同体はいずれもＦ３３とＧ３７とを有する。

ｅ）ジンガロトキシン中の余分なＣ残基は白錆のシスチン架橋を形成している。

表１４ イオン化可能基の符合 ＢＰＴＩ相同体 表１０に示されている配列 ＋　ｉｔ　Ｋ　＝　Ｒ十Ｎ　Ｈ−Ｄ　−Ｅ　ＣＯ２の合計、ｐＨ７，ｏｌｍおけ る分子でほぼ帯電。

＃ｌｔＫ＋Ｒ−’、ＮＨ−Ｉ−Ｄ＋Ｅ’−、Ｃｏ２＋７）合計、すなわちｐ　Ｈ ７、０４：おけるイオン化した基の数。

表１５ 各残基ＢＰＴＩ相同体に見い出されるアミノ酸残基　異なるア　内　容　ＢＰＴ Ｉ 表　１６　ＢＰＴＩ中の露出 Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ記録の６ＰＴＩか ら取られた配位Ｐｒｃｔｅｌｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋに示されている位置「全面 積」とは、残基中の原子だけを考慮した場合の、半径１．４人の回転面で測定さ れた領域を意味する。これには形状が考慮される。

ｒＭ／Ｃにより被覆されていない」とは、ミ鎖中の全原子を考慮した場合の、半 径１．４人の回転面で測定された面積を意味し、フラクションは露出面積／全面 積である。主鎖原子によって埋もれている表面は側鎖原子で被覆されている表面 よりも確実に被覆される。

「全く被覆されていない」とは、タンパク質の全原子を考慮した場合の′、半径 １４人の回転面で測定された領域を意味する。

表　１７　具体例中で使用されたプラスミド７アージ　内容 Ｌ　Ｇ　Ｉ　Ａｖａ　ｎ　／Ａａｔ　ＩＩ　／Ａｃｅ　Ｉ　／Ｒｓｒ　Ｉ［／Ｓ ａｕ　Ｉアダプターを有するＭ１３ｍｐ１８ｐ　Ｌ　Ｇ　２Ａｃｅ　Ｉ部位でＡ ａＬＩｌにクローン化されたａｍｐおよびｐＢＲ３２２のＣｏ１Ｅ１を有するＬ Ｇｌ ｐ　Ｌ　Ｇ　３　Ａｃｅ　Ｉ部位が除去されているｐＬＧ２Ｐ　Ｌ　Ｇ　４　ｏ ｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の第１の部分がＲｓｒｌ／５ａｕ１部位中にクローン化され ているｐＬＧ３ ｐ　Ｌ　Ｇ　５　ａｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の第２の部分がＡｖｒｌ／＾ｓｕ１部位 中にクローン化されており、Ｂｓ５Ｆ１１部位が創造されているｐＬＧ４ｐＬ　 Ｇ　６　ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の第３の部分がＡｓｕｌ／Ｂｓ５）１１部位中に クローン化されており、Ｂｂｅ　１部位が創造されているｐＬＧ５ｐＬ　Ｇ　７ 　ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の最後の部分がＢｂｅｌ／Ａｓｕ１部位中にクローン化 されているｐＬＧ６ ｐＬＧ８　無能にされたｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子を有するｐＬＧ７、ＤＮＡの長さ は同−ｐ　Ｌ　Ｇ　９　ＢＰＴＩ（Ｖ１５ＢＰＴＩ）を顕示するように突然変異 されテイルｐＬＧ７ｐ　Ｌ　Ｇ　１０　ｐＬＧ８＋　ｔｅｔ”遺伝子−ａｍｐ” 遺伝子ｐ　Ｌ　Ｇ　ｌ　ｌ　ｐＬＧ９＋　ｔｅｔ”遺伝子−ａｍｐ”遺伝子表　 ２５　１ｐｂｄ遺伝子の注釈付配列５／−ｃｌＧＧＡｌｃｃｃｌＴｘｒｌｃｃｘ ｌＧＧｃｌＴｒＴｌｘＣＡｌｃＴＴｌｒｘＴｌＩＣＣＴＩＡＧＧＩＡＧＧＩＣＴ ＣＩＡＣＴ＋　８８ＬＬ」二重 ｌ　Ｃｌ　ｒ　ｌ　ａ　＋ｋ　ｌ　ｒ　Ｉ　・ｎ　ｌ　ｎ　Ｉ　ｆ　Ｉ　ｋ　ｌ ＋　６１１６２１６３１６４１６５１−６６１６７１６８１６９１１ｒＧＣＩＣ ＧＴＩＧＣＴＩＡＡＧＩＣＧＴＩＭＣＩＡＡＣＩＴＴＴＩＡＡＡｌ　２９５＝五 匹」二重 ｌ　ＴＣＧ　Ｉ　ＧＣＣｌ　ＧＡＡ　Ｉ　ＧＡＴ　Ｉ　ＴＧＣＩ　ＡＴＧ　ｌ　 ＣＧＴ　Ｉ　ＡＣＣｌ　ＴＧＣＩ　ＧＧＴ　ｌ　３２５二一一りは　Ｌ玉曲二は １ｑｌａ　１ａｌｅ１９−１５１−ｄｉｌ　８０１８１１８２１８３１８４１８ ５１８６１１　ＧＧＣＩ　ＧＣＣＩ　ＧＣＴ　Ｉ　ＧＡＡ　Ｉ　ＧＧＴ　Ｉ　Ｇ λＴＩＧＡＴＩ　３４６１ｐｌａｌｋｌａｌａｌ ｌ　ａ７１　ｓ８１　ｓ９１９０１９：ＬＩＩＣＣＧＩＧＣＣＩＡＡＡＩＧＣＧ ＩＧＣＣＩ　３６１ＩｆｌｎｌｓｌｌｌｑｌａｌｓｌａｌｔｌＴａｂｌａ’２５ ．　ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ。

＋　９２１９３１９４１９５１９６１９７１９８１９９１１００１１　ＴＴＴ　 Ｉ　ＡＡＣＩ　ＴＣＴ　Ｉ　ＣＴＧ　Ｉ　ＣＡＡ　Ｉ　ＧごＩＴσＩＧｃＴＩＡ ｃｃＩ　３Ｂ８」山上≦は １・ｌｙｌｉｉｑｉｙｌａｉｗｌ １ＧＡＡＩＴＡＴＩＡＴＣＩＧＧＴｌ’Ｉ’ＡＣＩＧＣＧＩＴＧＧｌ　４０９＝ 五−二は １−１ｍ１ｖＩｖｌｖ１ １１０８１１０９１　ｕｏ　ｌ　ｕｌｌ　１１２１１ＧＣＣＩλＴＧＩＧＴＧＩ ＧＴＧＩＧＴＴＩ　４２４ＩｃｃＴＩＧＡＧＩＧ　−３’　５］９、Ｌ担ＬＬ」 。

注：下記の酵素は等価である 入ｌエエエ　寓シは工 １八Ｑ９エエエ　寓紐閤工エ シ１エエ　禽七メ山冴工 とＩ１工　奪ｎ１ニ ジＩ工　冨シ乱匝工 表　２７　ＤＮＡ合成１ ５’　ＣＩ ｏｌｉｇ：４　ｍ　３’　−ｇｔ　ｔａａ七口山臆牡 ｑｑａ　ｔｃｃ ／　コｌ　雪　ｏｌｉｇ：３ １　ＴＣＴ　Ｉ　ＴＡＡ　Ｉ　ＴＡＧ　Ｉ　ＴＧＡ　Ｉ　ＧＧＴ　Ｉ　ＴＡＣＩ 　ＣＡＧ　Ｉ　ＴＣＴ　１ａｑａ　ａｔｔ　ａｔｅ　ａｃｔ　ｃｃａ　ａｔｇ　 ｇｔＣａｌ（Ｊ！ＩＡＡＧ　Ｉ　ＣＣＣＩｃ、ｃｃ　Ｉ　ＴＡＡ　Ｉ　ＴＧＡ　 Ｉ　ＧＣＧ　Ｉ　ＧＧＣＩ　ＴＴＴ　Ｉ　ＴＴＴ　Ｉ　ＴＴＴ　１ｔｔＣ９９ｅ ｉ　Ｃｑｑ　ａｔｔ　ａｃｔ　ＣｑＣＣＣ９ａａａ　ａａａ　ａａａｌｃｃｒ： ＩＧＡＧＩＧＣＡＩＧＧＴＩＧＡＧＩＣＧｇｇａ　ｅｔｃ　ｃｇｔ　ｃｃａ　ａ ｔｅ　ｇｃ　−５’トツプ　ストランド　９９ 重複　２３（１４ｃ／ｇおよび９ａ／ｌ）真の長さ　１５８ 表　２８　ＤＮＡ配列２ １　ｃｃｒ　ｌ　ＡＧＧ　Ｉ　ＡＧＧ　Ｉ　ｃｒｃ　Ｉ　ＡＣＴ　＋１ｍ１ｋｌ ｋｌＳＩｌｌＶｌｌＩｋｌａｌＳｌｌｘ１２１３１４１５１６１７１ｓｌｓ１１ ｏ１１　ＡＴＧＩＡＡＧＩＭＡＩＴＣＴＩＣＴＧＩＧＴＴＩＣＴＴＩＡＡＧｌｃ ｃＴＩＡＧＣ＋Ｉｖｌａｌｖｌａｌｔｌｌｌｖｌｐｌｍｌｌｌｌ　１１１　ｘ２ １１３１１４１１ｓｌ　１６１１７１１Ｂ１　ｘ９１２０１１　ＧＴＴｌ　ｃｃ ｒ　ｌ　ＧＴＣＩ　ＧＣＧ　Ｉ　ＡＣＣＩ　ＣＴＧ　Ｉ　ＧＴＡ　ｌ　ｃｃｃ　 ｌ　ＡＴＧ　Ｉ　ＣＴＧ　に工１ニド　Ｌ五凹二Ｌ ＩｓｌｆｌａＤＩｐｌｄｌｆｌｃｌｌｌｅｌｌ　：ｕｌ　２２１　２コ＋　２４ １　２５１　２６１　２７１　２８１　２９１　３０１１　ＴＣＴ　Ｉ　ＴＴＴ 　Ｉ　ＧＣＴ　Ｉ　ＣＧＴ　Ｉ　ＣＣＧ　Ｉ　ＧＡＴ　Ｉ　ＴＴＣＩ　ＴＧＴ　 Ｉ　ＣＴＣＩ　ＧＡＧ　ＩＩｐｌｐｌｙｌｔｌｑｌｐｌｃｌ）ｅｌａｌｒｌｌ　 コ１１　３２１　３３１　３４１　３５１　３６１　３７１　３８１　３９１　 ４０１１　ｃｃｃ　Ｉ　ＣＣＡ　Ｉ　ＴＡＴ　Ｉ　ＡＣＴ　ｌ　ｃｃｃ　ｌ　ａ ｃｅ　Ｉ　ＴＧＣＩ　ＡＡＡ　Ｉ　Ｇｃｅ　ｌ　ｃｃｃ　ｌＬ二と−ＬＬ−−ユ 　」■旦工壮 りん直ユユ ニヱ担」二重 １ｉ１ｉ１ｒｌ ｌ　ｕｌ　４２１４３１ １　ａｔｅ　ｌ　ａｔｅ　ｌ　ｃｇｔ　１Ｉｔｌ−１ｋ１ １１２７１１２８１１２り１ 表　３３　ＤＮＡ配列３ Ｉｉｌｉｌｒｌｙｌｆｌｙｌｎｌａｌ−ｋｌｌ　４ｘｌ　４２１４３１４４１４ ５１４６１４７１−４８１４９１１ｍｃｌλ、ＴＣＩ　ＣＧＴ　Ｉ　ＴＡＴ　Ｉ 　ｌｌｌＴｃ　ｌ　ＴＡＣＩ　ＡＡＣＩ　ＧＣＴ　Ｉ　ＡＡＡ　１１ＧＣＡＩＧ ＧＣ＋ＣＴＧＩＴＧＣＩＣＡＧＩＡＣＣＩ　ＴＴＴＩＧＴλ１τ入Ｃ１ＧＧＴｌ ＧＧＴｌ二ｍエユ ｌ　ＴＧＣＩ　ＣＧＴ　Ｉ　ＧＣＴ　Ｉ　ＡＡＧ　Ｉ　ＣＧＴ　Ｉ　ＡＡＣＩ　 ＡＡＣＩ　ＩｒＴｒＩ　ＡＡＡ　＋、ＬシＵ Ｉｓｌａｌａｌｄｌｃ１ｍｌｒｌｔｌｃｌｑｌ＋　７０１７１１７２１７３１７ ４１７５１７６１７７１７１７９１１ＴＣＧＩＧＣＣ１ｃλＡＩＧＡＴＩＴＧＣ １入ＴＧＩＣＧＴＩＡＣＣＩＴＧＣＩＧＧＴに均二二二 表　３２　ＤＮＡ配列４ ムシにユニ ニ」江ＬＬ−一一シュ 」山モ二り と五−シュ １ｉ１ｖｌｃｒｌａｌｔｌｉｌｃｒｌｉｌＩｋｌｌｌｆｌｋｌｋｌｆｌｔｌＳＩ ｋ１表　３４　ＢＰＴＩ中のいくつかの相互反応セ・ント−５２Ｄ−３２＋ −３５ＴＰＦＺ−２９− −２１０Ｆ３　Ｒ３Ｇ２　Ｆ２　ＨＧ　Ｌ　Ｋ　Ｅ　−１８−−１ＬＯＤ４　Ｆ ２　Ｆ２　Ｇ２　Ｅ　Ｇ　Ｎ　Ｋ　Ｒ−４８−１１０Ｒ２１Ａ２に２Ｈ２ＰＬｒ ＴＧＤ　Ｒ５２９Ｆ２０Ｒ４Ａ２Ｈ２ＮＥ１７ＦＬ　Ｐ　Ｆ５３　１０　Ｃ１５ Ｆ６　Ｆ３　Ｒ２Ｆ２５　Ｙ　Ｇ　Ａ　Ｌ　Ｄ　４　Ｆ４　７　Ｆ１９　Ｄ４　 Ａ３　Ｔ２　工２　人２Ｓ　Ｆ　Ｆ５５　１Ｃコ３　ＣＸＸ ６　１０　Ｌｌｌ　Ｆ５　Ｆ４　Ｆ３　Ｇ２　工２Ｙ２Ｄ２ＴＲＬ　４７　５　 Ｌ１８Ｅ１１：に２ＳＱ　Ｅ　５４８７Ｐ２６Ｈ２人２　工ＬＧＦ　Ｐ　３４９ 　９　Ｆ１７　Ａ６　Ｔ３　Ｒ２Ｑ　Ｌ　Ｋ　Ｙ　Ｆ　Ｐ　ｓ　３　４１０　１ ０　Ｙｍｌ　Ｆ７　Ｄ４　Ａ２　Ｎ２　Ｒ２Ｔ２　Ｓ　工　Ｄ　Ｙｓｓ４１１　 １０　Ｔ１７　Ｆ５　Ａ３　Ｒ２工５ＱＹＶＫ　Ｔ　１ｓ３４：Ａ２２Ｇコ２１ 　Ｇｘｘｘ １コ　５　Ｆ２２　Ｒ６Ａ３　Ｎ　工　Ｐ　１　５４ｓ１４　コ　Ｃ３１ＴＡ　 Ｃｌ　５ｓ５ １５　１２　Ｋ１５　Ｒ４Ｔ２　Ｆ２　Ａ２−２　Ｖ　Ｇ　Ａ　工Ｎ　Ｆ　Ｋ　 ｌ　ｓ　３４　Ｆ１６　′７　Ａ２２　Ｇ５　Ｇ２　ＲＩＣＤ　Ｆ　Ａ　１ｓ　 ｓ　ｓ　５１フ　１２　Ｒユ２に５　人２　Ｔ３　ＸＸ２　５２　Ｆ２　Ｌ　Ｍ 　Ｔ　Ｇ　Ｐ　Ｒｌ　２　３　Ｆ１８　６　工２１　Ｆ４　Ｆ３　Ａ２　Ｔ２　 Ｔ　工１　ｓ　ｓ　５１９　７　工１１　Ｐｌｏ　Ｒ６５２Ｆ２　Ｌ　Ｑ　Ｘ　 ｌ　２３　５２０５Ｒ１９Ａフ　５４Ｌ２Ｑ　Ｒｓｓｓ　５２１　４　Ｙｌｌｉ ｌ　Ｆ１３　Ｗ工　Ｙ　２Ｓ５５２２　６　Ｆ１４　Ｔ１４　Ｋ２　Ａ　Ｎ　Ｓ 　Ｆ　ｓ　３４２３　２Ｙ３２Ｆ　Ｙ　５ｓ ２４　４　１Ｊ２６）Ｃ３Ｄ３Ｓ　Ｎ　５３２５　１０　Ａ１２５５　Ｇ３　Ｆ ３　Ｋ３　Ａ２　Ｆ２１！、　Ｇ　ＲＡ　ｓ　５２６９に１６λ６　Ｆ２　Ｆ２ ５２　Ｒ２Ｇ　ＨＶ　Ｋ　ｓ　３４２フ　５　λユ８５Ｂ　Ｆ３　Ａ２　Ｆ２　 Ａ　２　３　４２ｇ７Ｇ１３二ＯＦ５　Ｇ２　ＲＨＭ　Ｇ　２　ｓ　Ｆ２９　１ ０　Ａ９　Ｇ７　Ｆ７　Ａ２　Ｆ２　Ｒ２Ｍ　Ｇ　Ｔ　Ｎ　Ｌ　２３３０１Ｃ３ コ　Ｃｘｘｘ ３１　フ　Ｇ１２　Ｅｅｌ　Ａ４　Ｌ！　Ｔ２　Ｙ　Ｎ　Ｑ　２　３　４３２　 １１　Ｔ１２　Ｆ５　Ｆ４　Ｇ３　Ｆ２　Ａ２　Ｇ　Ｖ　Ｓ　ＲＡ　−Ｔ　２３ 　Ｆ３３　１Ｔ３３　Ｆ　ｘｘｘｘ ３４　１１　Ｖｌｌ工８Ｔ３Ｄ２Ｎ２Ｑ２ＦＨＰＲＫ　Ｖ　１２３ｓコ５　２　 Ｙ３１Ｗ２　Ｙ　ｓｓｓ　５３６３Ｇ２フ　Ｓ５ＲＧ１ ３フ　１Ｇ３３　ＧＸ　Ｘ ３８　３　ＣコＩ　ＴＡ　Ｃ１５５ ３９フ　Ｒ１３Ｇ９に４Ｇ３Ｄ２ＰＭ　Ｒ１４ｓ４０２Ｇ２２　Ａ１１　人　ｓ 　５５ ４１　３　Ｎ２０ＫｌＩＤ２　Ｋ　４ｇ４２　９　Ａ１１　Ｒ９５４Ｇ３　Ｒ２ Ｄ　Ｑ　Ｋ　Ｎ　Ｒｓ　５４３　２Ｎ３１Ｇ２　Ｎ　ｇ ４４　３　Ｎ２Ｌ１１Ｋ　Ｎ　ｓ ４５　２　Ｆ３２Ｙ　Ｆ　ｓ ４６　８　Ｒ２４Ｅ２Ｓ２ＤＨＶＹＲＫ　５４フ　２　Ｔ１ｃｊｓ１４　ｓ　ｓ 　５４８９λ１１工９Ｔ＋４τ２Ｗ２Ｌ２ＲＫＤλ２ｓｓ４９　７　Ｅ１９Ｄ６ Ａ２Ｑ２に２ＴＥ　Ｅ　２　ｇ５０　６　Ｅ１６Ｄ１２Ｌ２ＭＱＩＣＤ　ｓ　５ ５１１Ｃ３コ　Ｃｘｘ ５２　７　Ｒ１３Ｍｌ０Ｌ３Ｅ３Ｑ２Ｈｖ　Ｍ　２　ｇ５３　８　Ｒ２１Ｑ３Ｅ ２Ｅ２Ｃ２ＧＫＤ　Ｒｓ　５５４　７　Ｎ２３　Ａ３　Ｎ２１２　工ＹＫ　Ｔ　 ５５５　１　Ｃコ３　ＣＸ ５６　８　Ｇ１５Ｖ８工３　Ｒ２Ｒ２Ａ　Ｉ、　Ｓ　Ｇ５７　８　Ｇ１１７４Ａ ３Ｐ２−２１ＬＮ　Ｇ５８　ｇ　Ａｌ１−１０Ｐ３に３５２Ｙ２１Ｆ入５９ター ２４Ｇ２ＱΣλＹＳＰＲ，− ６０６−２８ＱＲ工ＧＤ　− ６１３−３１ＴＰ　− ６２２−３２Ｄ　− ６３２−３２１Ｃ− ５は第２のセットを示す Ｘは表面申または表面に近いが埋もれているかおよび（または）きわめて微弱に しか表れていないことを意味する 表３５ Ｃ，から側鎖基端までの距離（人） アミノ酸のタイプ　距離 λ　ｏ＋Ｏ Ｃ（還元型）１．８ 注記二上記の距離は側鎖基が全部完全に伸びきった標準モデル部分につき計算さ れたものである 表　３６　距離、ＢＰＴＩ残基のセント＃２複数のＣ，間の距離（人） 仮定のＣ４を各グリシンに付加させｔ；１ｉｕ７　工１９　Ｎ２１　Ａ２７　Ｇ ２８　Ｃ２９Ｇ３１　Ｎ３２　Ｎ３４　Ａ４８工１タ　７．７ Ｎ２１　１５．１　８．４ 人２７　２２．６　１７．１　１２．２Ｇ２８　２６．６　２０．４　１３．８ 　５．３Ｌ２９　２２．５　１５．８　９＋６　ｋｌ　５＋２０３１　１６＋１ １０．４　６．８　６．８１０．６　６．８τ３２　１１．７　５．２　６＋１ １２．ＯＣ５，５１０，９５，４Ｖ３４　５．６　６．５　１１−６　１７．６ 　２１．７　Ａ８．ｏ　１１．４　８．２λ４８　１Ｂ、５　１１．０　５．４ 　１２．６　１コ、３　８．４　８．８　Ｂ、３　１５．７Ｅ４９’　２２−０ １４．７　Ｂ、９１１６．９１６，４１２．２１３Ｊ　１３．３　Ｌ９Ｊ　５． ５、　．６．、　フ、、、、０６゜ Ｆ９　１４．０　１１３　９．０　１２．２　Ｃ５，４１３ｊ　７．９　９．２ ．１７　１３．９τ工１　９＋５１１．２１３．５１８．８２２．５１９．１１ １３．５　Ｌｍ、ｌ　５．７１Ｌ５二５　７．９１４．６２０−１２７．４３Ｌ ３２７．９２１４１８．１　ｍｏ、３２４．６Ａ１６　５．５１０．１１５．９ ２５．２２ｇ、５２４．６１ｇ、６１４．５　８．６１９．８工１Ｂ　６．１　 ６．０１１．２２１．３２４．４２０．２１４．７１０．４　７＋０１５−０勉 ０　１０＋６　５．９　５．４１６．０１１ｇ、５１４．６　９．８　６．９　 ７．８１０．２Ｆ２２　１５．６１０Ｊ　５．６１０．５　：Ｌｍ、８１０．３ 　６．２　ｇ、１１０．８１０．３Ｎ２４　１９．９　Ｃ４，７９，４４，１７ ，３６，１４，８１０，０１４，７１１，４ＩＣ２６２４，４２０，１１５，２ ５，４７，７９，８１０，１１５，３１９＋０１７．０Ｃ３０１Ｌ９　１２．１ 　４．６　１ｉ１４　９．５　５．３　５．９　ｇ、２　１４．９　４．９Ｆ３ ３　１０．８　７−４　７．７　１２．６　１６．４　１３．０　６．６　５． ６　５．５　１２．２Ｍ３５　８．４　７．４　Ｃ４：Ｃ８−４２１，４１７， ９１２，２９，５５，８１４，４Ｓ４フ　１７．６　１０．６　６．６　ｉフ、 ３　１７−９１３．４　１２．６　１０．４　１５−９　５．３Ｄ５０　２（Ｌ Ｏ１３，６７，２１７，２１６，８１３，５１３，５１２，９１７，６）、６Ｃ ５１１ｇ、９１２．２　４．Ｏ１２，１１２，２８，８Ｂ、Ｓ　Ｃ７１５，３５ ，４Ｒ５３２５，４１８，６１１，０１７，２１５，０１３，０１５，７１６， フ　２２．３　９．フＲ３９１５，４１Ｌ６Ｊ　１７．１２４．９２７．２２４ ．９２０．１１８．７１３．８２２．３Ｅ４９　Ｌｉ２　Ｆ９　Ｔｅｌ　Ｋユ５ 　Ａ１６　工１８　Ｒ２０Ｆ２２　Ｎ２４区シＬｊ＝二 Ｆ９　１７−７　：Ｃ５，５ τ１１　２２．１２１．５　７．２ ×１５　２７．５　２８．７　１６．４　９．５λユ６　２２．２　２４．２　 １４．９　９．８　６．２工１８１７．４　１９．５　１２．２　９．５　ｍｏ 、４　４．９Ｒ２０１３，０１３，８８，０’９−４　１４．９　１０．６　６ ．２Ｆ２２　Ｃ３，８１１＋４　４．１　１０．６　１９．１　１６．３　１２ ．７　６．９Ｎ２４　Ｃ５，６１１，２８，４１５，３２４，１２１，９１８＋ ２１２＋７　Ｃ６に２６　２０．９１５．７１２．１　Ｃ８，６２７，９２６， ６２３，３１！　１１．６　５．９Ｃ３０Ｂ、フ　５．６　１０．６　１６．６ 　２４．１　２０．２　１５．７　９．８　６＋８　６．９Ｆ３３　：Ｃ６，５ １５，４４，２７，１１５，０！、２．８　９．６　Ｌｍ　Ｃ６９，３Ｙ３５　 １７．２　１７．８　フ、８　５．８　１１．０　７．６　４．９　４．３．． ８＋８　１４．８５４７　４．７　９．１１５．３１ｇ、５２３．１１７．６１ ２．８　９．１１２．０１５．３Ｄ５０　５．５　７．フ　：Ｃ４，７１Ｂ、６ ２４．２　１９．２　１４．フ　９．９１１．０　１４−７Ｃ５１７，１５−４ １１，０１６，４２３＋５　１９．２　１４．６　１１．７　６．９　９．６Ｒ ５３６，３５，６Ｃ７，９２３，１２９，６２４，８２０，３１５，０１３，８ １Ｌ５．５Ｒ３９２３，９２４＋０１３．０　９．５１２．０１１．８１２．５ １２＋８１４＋７２０．８に２６　Ｃ３０Ｆ３コ　Ｎ３５　５４７　Ｄ５０　Ｃ ５１Ｒ５３Ｃ３０１２，４ Ｆ３３　１３．９　：Ｌｏ、Ｉ Ｙ３５　１９．５　１３．５　６．４ ５４７　２１．０　Ｂ、８　１３．５　１３．２Ｄ５０　２０．１　８．６　１ ４．３　１コ、７　５．０Ｃ５１１５，０３，７ｉｏ、９　１２．５　６．９　 ５．２Ｒ５３１り、９　９．９　１８．２　１８．８　９＋４　５．８　７．４ Ｒ３９２４＋３２０．６　１４＋４　９．６　２０．４　１９．０　：Ｃ８，８ ２３，４表　３７　ＢＰＴＩの＃２．１セットを変化させるためのｖ　ｇ　Ｄ　 Ｎ　Ａ最も好ましくないクリアミノ酸−１／（４，２Ｘ１０″）ＰＰＢＤから最 も好ましくない１１ｗ１のアミノ酸の置き換えが１．６Ｘ１０’のうちの１つに 存在する 表　３８　８Ｐ７１２．１のセット＝２の変化結果表　３９　ＢＰＴＩ２．２の セット＃２を変化させるためのｖｇＤＮＡオーパーラ７プ菖ユ５　（１ユＣＧ、 ４Ａτ）親　諺１／（４，４ｘ　１０’） 最もこのましくないアミノａ−１／　（１，２５ｘ　１０’）ＰＰＢＤから最も 好ましくなし１個のアミノ酸の置き換え力’１．２ｘ１０７のうちの１つに存在 する。

表　４０　ＢＰＴＩ２．２のセント＝２の変化結果表　４１　８ＰＴＩ２．３の セット＃２を変化させるＩ；めのｖｇＤＮＡオーバーラツプ■１３　（７ＣＧ、 　６人τ）親　−１７（１ｘ　１０））　−１／（４ｘ　１ｏＩｉ’）最もこの ましくないアミノ酸−１／（４Ｘ１０”）ＰＰＢＤから最も好ましくないアミノ 酸の置き換えが３ＸｌＯ’のうちの１つに存在する。

表　４２　ＢＰＴＴ２．３のセ・ント−２の変イヒ結果親のポテンシャル結合ド メイン　ＰＰＢＤ　親から次の多様化サイクル−・終了 Ｆ／に、５Ｃ。

手続補正書 平５５４年２月１０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 子の定められたターゲットと結合するタンパク質を得る方法であって、 ａ）複数の複製可能な遺伝子パッケージの（多様性ある）変えられた集団を用意 し、この遺伝子バフケージはそれぞれ、（１）該還伝子パッケージの外面上にタ ンパク質を顕示するよう指示する構造シグナル、および（ｉｉ）ターゲットに結 合するための、ポテンシャル結合ドメインからなる核酸構造体を有しており、こ の核酸構造体は、一本鎖抗体を除く、外面に顕示されるポテンシャル結合タンパ ク質の発現をコードするものであり、そしてここでは上記集団によって、複数の 異なるポテンシャル結合ドメインが顕示される、ｂ）次に上記タンパク質を発現 させ、そして上記遺伝子パッケージの外面上で上記タンばク質の顕示を生じさせ 、ｃ）次に、上記タンパク質のポテンシャル結合ドメインと上記ターゲット物質 とが相互に反応することができるように、上記遺伝子パッケージをターゲット物 質と接触させ、そしてターゲット物質と結合する結合ドメインを持つ遺伝子パッ ケージを、ターゲット物質と結合しない結合ドメインを持つ遺伝子パッケージか ら分離し、次いで、 ｄ）結合成功結合ドメインを有する、少なぐとも１つの遺伝子パフケージを採取 し、次に複製することからなり、好ましくはさらに、 ｅ）上記の結合成功結合ドメインのアミノ酸配列を決定し、さらにより好ましく は、 ｆ）工程（３）に従い、複数の複製可能な遺伝子パッケージの（多様性を有する ）変えられた新規な集団を調製するが、この（ｆ）工程では、この新規パッケー ジのポテンシャル結合ドメインを生む親のポテンシャル結合ドメインが、工程（ ｅ）で限定された配列を有する決定成功結合ドメインであるようにし、 そして上記工程（ｂ）〜（ｅ）を、この新規集団を用いて繰り返して行うことを 包含する方法。 ２．上記工程（ａ）の複数の複製可能な遺伝子パッケージの集団が、 １）ポテンシャル結合ドメインの発現をコードする第１の配列、３よびコードさ れたタンパク質が選択された複製可能な遺伝子パッケージの外面上に顕示される ようにシグナルをコードする第２の配列よりなる、そのそれぞれのＤＮＡ挿入体 の（多様性を有する）変えられた集団を調製し、次いでｉｉ）生成するＤＮＡ構 築物の集団を、選択された複製可能な遺伝子パッケージ中に組み込むことによっ て、複製可能な遺伝子パッケージの集団を作る、 ことによって街られるものであり、 これらの工程において、好ましくは、 （１）上記集団は、少なくとも１０′であるが、１０′より多くない数の異なる ポテンシャル結合ドメインを顕示するという特徴を有しており、そして（または ）（２）上記集団の複数の遺伝子パッケージの１０′のうちの１個一１０′のう ちの１個が同一ポテンシャル結合ドメインを顕示するものである、 請求項１の方法。 ３．工程（ａ）において、核酸構造体によってゴードされるポテンシャル結合ド メインが、親のポテンシャル結合ドメインのアミノ酸配列の中の限定された数の アミノ酸を置き換えることによって、親のポテンシャル結合ドメインと配列的に 各々関連性を有しており、好ましくは該集団の（多様性）変化のレベルが、親の ポテンシャル結合ドメインのアミノ酸配列中のアミノ酸を１個だけ置き換えるこ とによって得られるポテンシャル結合ドメインを顕示する遺伝子パッケージが探 知可能な量でだけ存在するレベルに選択し、そして好ましくは、初期に選択され る親のポテンシャル結合ドメインは少なくとも１個の安定した結合ドメインを持 ち、この結合ドメインが少なくとも６０℃の融点を有し、かつまた少なくとも３ ．０〜８．０のｐＨ域で安定である請求項１の方法。 ４．顕示可能なポテンシャル結合タンパク質がキメラタンパク質であり、そして 好ましくは上記シグナルが、上記キメラタンパク質のうちの、上記遺伝子パッケ ージまたは遺伝子パッケージにより自然に感染された細胞によってコードされた 自然の外面タンパク質のうちの少なくとも機能的部分、およびアミノ酸配列上で 本質的に同一のセグメントにより発信され、そして、上記機能的部分は、上記キ メラタンパク質を遺伝子パッケージの外面へ運搬することを指示するものである 、請求項１の方法。 ５．初期に、親のポテンシャル結合ドメインを少なくとも約６０℃の融点を有す る既知のタンパク質のドメインに対して５０％以上の相同性を有するように選択 する、請求項３の方法。 ６．初期に選択される親の結合タンパク質が予め定められたターゲットに対して 優先的に結合しないものである請求項５の方法。 ７．上記ターゲット物質が１個または２個以上の別個の分子から構成されており 、上記親のポテンシャル結合ドメインはアミノ酸の配列上で特徴を有し、さらに 、親のポテンシャル結合ドメインの外面上に有在し、同時に上記ターゲット物質 のうちの１個だけの分子に全部が接触することができるアミノ酸の相互反応セッ トを同定し、この相互反応セット中のアミノ酸のうちの１個または２個以上を異 なるアミノ酸で置き換えることによってポテンシャル結合ドメインを得るをさら に含む、請求項３の方法。 ８．上記ターゲット物質が非高分子有機化合物であり、そして該ポテンシャル結 合ドメインが、約８０個以上のアミノ酸残基から成るものである請求項１の方法 。 ９．上記ターデット物質が非高分子有機化合物であり、そして該ポテンシャル結 合ドメインが約８０個以上のアミノ残基から成るものである請求項１の方法。 １０．上記ターゲット物質が水溶液に不溶解性の鉱物である、請求項１の方法。 １１．上記ターゲット物質が水溶夜中で安定な無機分子または鉱イオンである、 請求項１の方法。 １２．上記ターゲット物質が水溶液中で安定な存機金属化合物である、請求項１ の方法。 １３．上記ターゲット物質が一般的なプロテアーゼであり、そして不動化（固定 化）されている、このターゲット物質を、不可逆阻害剤または共有結合阻害剤と ともにまづインキュベートして、該プロテアーゼを不活性化する、請求項１の方 法。 １４．上記複製可能な遺伝子パッケージがアフィニティー分離することができ、 かつまた生存率を維持することができる、細胞またはウイルスである、請求項１ の方法。 １５．上記既知の結合タンパク質が酵素であって、この酵素の活性が上記複製可 能な遺伝子パッケージ、またはこの複製可能な遺伝子パッケージの宿主、または 上記ターゲット、に対して有害な作用を有するものであり、上記核酸構造体の大 半がこのような有害な酵素活性を持たない既知の結合タンパク質の類縁体の発現 をコードするものである、請求項５の方法１６．上記ターゲットがイオン化可能 な基を有しており、上記ポテンシャル結合タンパク質とこのターゲットとの双方 がともに安定に維持されるように、使用しようとする溶液のｐＨおよびアフィニ ティ分離のｐＨを選訳する請求項１の方法。 １７．上記ターゲットがイオン化可能な基を有しており、上記ポテンシャル結合 タンパク質とこのターゲットとの間の静電気反発が減少されるように、反対のイ オンを供給することをさらに包含する請求項１の方法。 １８．所望の結合タンパク質を使用しようとする条件の下で、またアフィニティ 分離の条件の下で、上記ポテンシャル結合ドメインと上記ターゲソトとが相対す る電荷を有するか、またはそのいずれか一方は中性であるように、初期のポテン シャルドメインを選択する、請求項１の方法。 １９．上記複製可能な遺伝子パッケージが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ 株のような細菌細胞である請求項２８の方法。 ２０．上記複製可能な遺伝子パッケージがＢａｃｉｌｌｕｓの内生胞子のような 細菌胞子、より好ましくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の内生胞子である、請求項１ の方法。 ２１．上記複製可能な遺伝子パッケージが線状ファージのようなバクテリオファ ージ、好ましくは重Ｍｌ３　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉパ．クテリオＺ ＃ージの誘導体、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ線状ファ ージＰｆ１の誘導体である、請求項１の方法。 ２２．シグナルがＭｌ３のコートタンパク質または外面輸送シグナルを具有して いるそのセグメントにより発信される、請求項２１の方法。 ２３．シグナルがＭｌ３の遺伝子ＩＩＩタンパク質または外面輸送シグナルを具 有しているそのセグメントにより発信される請求項２１の方法。 ２４．（多様性を有する）変えられたコドンの各々に組み込まれているヌクレオ チドの分布を、実質的に等量の酸性アミノ酸ぢよび塩基性アミノ酸が産生される ように選択する、好ましくは（多様性を有する）変えられたコドンの各々に組み 込まれているヌクレオチドの分布を、量的に最大値｛（１．−存在率（ストップ コドン））Ｘ（最小存在率のアミノ酸の存在率）／（最大存在率のアミノ酸の存 在率）１が産生されるように、さらに■択する、請求項２の方法。 ２５．工程（ｃ）が、パッケージを第２の物質と接触させ、次いで二の第２物質 に結合しないパッケージを分離することをさらに包含する、請求項１の方法。 ２６．第１の予め定められたターゲットを認識する新規な結合タンパク質を得た 後に、この新規な結合タンパク質を、第２の予め定められたターゲットにも結合 する誘導タンパク質を分離するための親のポテンシャル結合タンパク質として選 択する、請求項１の方法。 ２７．初期に選択する親のポテンシャル結合ドメインを、（ａ）クシ膵臓トリプ シンインヒビター、クランビン、オボムコイド、Ｔ４リゾチーム、ニワトリ卵白 リゾチーム、リポヌクレアーゼ、およびアズリンの結合ドメイン、および（ｂ） 上記ドメインのいずれとも少なくとも５０％は相同性を有し、かつまた少なくと も６０℃の融点を有する結合ドメインから成る群から選択する、請求項３の方法 。 ２３．上記外面輸送シグナルが、１ａｍＢタンパク質または外面輸送シグナルを 具有するそのセグメントによって発信される、請求項３６の方法。 ２９．上記外面輸送シグナルが１ａｍＢタンパク質または外面輸送シグナルを具 有するそのセグメントによって発信される、請求項３６の方法。 ３０．（ｉ）上記細胞またはウイルスによって認識される外面輸送シグナルを発 信する少なくとも１つのセグメントである、細胞またはウイルスの外面タンパク 質のセグメントおよび、（ｉｉ）上記外面タンパク質とは異質のドメイン、好ま しくは上記外面タンパク質に優先的に結合するものではなく、ターゲット物質に 結合するものである異質のドメインよりなるキメラタンパク質。 ３１．請求項３０のキメラタンパク質の発現をコードする核酸構造体を含有する 複製可能な遺伝子パッケージ。 ３２．少なくとも１例においてポテンシャル結合ドメインの第１分類中で変えら れたアミノ酸残基がポテンシャル結合ドメインの次の分類中で不変にされている 、請求項１の方法。 ３３．（多様性を有する）変えられたＤＮＡの集団の調製方法であって、（多様 性を有する）変えられたコドンの各々に組み込まれているヌクレオチドの分布を 、実質的に等量の酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸が産生されるように選択す る、好ましくは（多様性を有する）変えられたコドンの各々に組み込まれている ヌクレオチドの分布を、さらに量的に最大値｛（１．−存在率（ストップコドン ））Ｘ（最小存在率のアミノ酸の存在率）／（最大存在率のアミノ酸の存在率） ｝が産生されるように選択する、調製法。 ３４．タンパク質が第１のターゲット物質を認識する第１の異質ドメインおよび 第２のターゲット物質を認識する第２の異質ドメインとからなる請求項６６のタ ンパク質。 ３５．初期に選択する親のポテンシャル結合ドメインが、ウシ膵臓トリプシンイ ンヒビターの結合ドメインと少なくとも５０％の相同性を有するものである、請 求項３の方法。