JPH0330675A - アイメリア・テネラワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎ
ｅｌｌａ　）ポリペプチドをコードする核酸配列、この
ような核酸配列からなる組換え核酸分子、前記核酸配列
を含有しているベクター又は宿主細胞、アイメリア・テ
ネラのポリペプチド、これらの産生物をベースとするコ
クシジウム症に対するワクチン、及び前記ポリペプチド
と免疫反応性の抗体又は抗血清に関する。

コクシジウム症（ｃｏｃｃｌｄｌｏｓｉｓ）はアビコン
プレクサ（＾ｐｌｅｏｍｐｌｅｘａ）亜門及びアイメリ
ア（Ｅｌｍｅｒｌａ　）属の細胞内寄生虫、原虫類によ
り引き起こされる病気である。これらの寄生虫は宿主間
する。

集約生産が増加しているために、最近の数十年間に家禽
業界ではこれらの寄生虫による損害が危機的に増加して
いる。オランダでは家禽農家での毎年の損害が数百万ギ
ルダーであり、１９８６年の損害は約１３００万ギルダ
ーに上った。同年、米国ではコクシジウム症を抑制する
薬剤（ｃｏｃｃｉｄｌｏｓｔａｔｓ）が使用されている
にもかかわらず、３億米ドルの損害であった。

鶏のコクシジウム症の病原菌は９つの異なる型、すなわ
ち、Ｅｉｍｅｒｉａ　ａｅｅｒｖｕｌｉｎａ、　Ｅ、ｍ
ａｘｌｍａ。

Ｅ、ｔｃｎｅｌｌａ　、　Ｅ、ｎｅｃａｔｒｌｘ、　Ｅ
、ｂｒｕｎｅｔｔｌ、　Ｅ、ｌｌ１ｉｔｉｓ　。

Ｅ、ｐｒａｅｃｏｘ　、　Ｅ、ｍ１ｖａｔｌ及びＬ旦■
旦に分類することができる。しかしながら、最後の２つ
の型の存在に疑いを持つ人もいる。これらの型の全ては
鶏のみを宿主とし、高い組織特異性を示す。しかしなが
ら、前記の生活環は類似している。

その生活環の間に、アイメリア（Ｅｉｓｅｒｌａ　）寄
生虫は多くの段階を経る。感染段階（胞子形成卵母細胞
）が鶏の口から取り込まれ、胃の中へ入る。

ここでの摩砕作用の結果、嚢子（ｃｙｓｔ）の殻が破れ
て開く。この卵母細胞が含有する４つのスポロキストが
放出され、十二指腸内に入り、そこで胆汁や消化酵素に
さらされる。その結果、スボロキスト壁が開口し、スボ
ロキスト中に存在する稚虫（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ）
が放出される。これらの稚虫は移動性があり、侵入し且
つ増殖するための好適な宿主細胞、例えば上皮細胞を探
す。型に応じて、この最初の増殖期は２０〜４８時間持
続し、数十〜数百のメロゾイト（ＩｌｅｒｏｚｏｉＬｅ
ｓ）が形成され、その各々が再び新しい宿主細胞に侵入
し、増殖する。２回又は時に５回のこれらの無性生殖サ
イクルの後、細胞内のメロゾイトは生殖形態、すなわち
雄性及び雌性の配偶子母細胞に成長する。雄性配偶子に
より雌が受精した後、接合体が形成され、これはその周
囲に嚢子璧をつくる。この卵母細胞は宿主細胞を離れ、
糞と共に排出される。鶏の体外の温度及び湿度が比較的
高いと同時に空気中に十分な酸素があると、卵母細胞は
胞子形成して感染段階となる。

このように、鶏から鶏への寄生虫の移行には中間宿主が
必要とされない。従って、利用できる表面積の占有率が
高いと養鶏場の感染率が急速に増加すると考えられる。

種々の方法で、寄生虫を撲滅することができる。

管理を良くすることに加え、飼料や飲料水にしばしば混
合される撲滅剤を使用してコクシジウム症を、撲滅する
ことができる。しかしながら、最近、これらの薬剤の効
果が低下してきている。その原因の一部は、種々の撲滅
剤に対して耐性となるような寄生虫の高い遺伝能力によ
る。更に、これらの薬剤の多くは肉に残留し、消費上の
問題を生じさせうる。

従って、免疫学的な予防がはるかに良い撲滅方法を構成
するであろう。十分に高い病原菌中で生活してきた鶏は
同型のアイメリア（ＩＥｉｍｅｒｌａ　）とその後の接
触に対して抵抗しうろことが知られている。アイメリア
（Ｅｌｍｅｒｉａ　）に対する耐性は、少投与量の卵母
細胞又は弱体化した（非病原性）株の卵母細胞で烏を数
回感染させることによっても誘導しうる。しかしながら
、この場合、特に、屠殺するための大量の鶏に調節投与
することは実際困難な問題である。従って、不活性化し
たワクチンが唯−残された解決法と思われる。

不活性化したワクチンは寄生虫由来の抗原と、おそらく
アジュバントとからなりうる。

寄生虫から単離した抗原の代替物としては、公知の方法
に従って実施しうる手法である／組換えＤＮＡ法で製造
した生成物を使用することができる。

更に、抗原をコードする遺伝子を導入した細菌、真菌又
はウィルスのような生きている宿主有機体を投与して予
防接種することもできる。次に、この有機体は十分長期
間に亘り確実に抗原を合成し、そのために鶏の免疫系が
十分刺激される。

同時に、合成的に抗原又はその一部を再生することがで
き、これをアジュバントの存在下で例えば担体蛋白質に
結合したような免疫学的に認識可能な刺激形感で鳥に投
与することができる。

本発明によれば、アイメリア・テネラ （ＥＩＩｌｃｒｌａ　ｔｅｎｅｌｌａ　）の蛋白質の一
部が第２図に示すアミノ酸配列によって定職される該蛋
白質の少なくとも一部を実質的にコードする核酸配列を
、コクシジウム症に対して家禽を免疫するためのワクチ
ンの製造に使用することができる。

本明細書中の「核酸配列」は任意の長さの〆クレオチド
のポリマー型、すなわち、リボ核酸配列及びデオキシリ
ボ核酸配列の両者を意味している。

主として、この用語は分子の一次構造を意味する。

従って、この用語は二本鎖及び−本鎖ＤＮＡ並びに二本
鎖及び−本鎖ＲＮＡ及びその修飾したもの中 を含んでいる。

第２図に示すアミノ酸配列を有する、アイメリア・テネ
ラ（Ｅｌｍｅｒｌａ　ｔｅｎｅｌｌａ　）の蛋白質の一
部分をコードする核酸配列（ＥｔｌＡｌと命名される）
はファージλｇｔｌＯＩ’：ｔｌＡｌ内に存在する。上
記のファージは大腸−閃Ｂ　Ｎ　Ｎ　１０２株と共に第
ＣＢ　３２８８．８９号としてＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕ
ｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ
ｓＳＢａａｒｎ　　（オランダ）に寄託されている。

ファージλｇｔ１．０ＥｔｌＡ１を、先ず、胞子形成さ
れたアイメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ）卵母
細胞からｃＤＮＡライブラリーを構築することにより作
製する。大腸菌Ｋ　１２Ｊ　Ａ　２２１株を形質転換さ
せ且つ第ＣＢ　Ｓ　１４３．８８号としてＣｅｎｔｒａ
ａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｌａａ＋ｅｌ　ｃ
ｕｌｔｕｒｅｓ、　Ｂａａｒｎ　　（オランダ）に寄託
しであるプラスミツドｐＥａ　１＾中に存在する標識さ
れた２９６塩基対ＥｃｏＲＩプローブを用いて、このｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。

次に、本発明の核酸配列を含むアイメリア・テネラ（Ｅ
、　ｔｅｎｅｌ　ｌａ）クローンをプラーク精製した。

λｇＬＩＯＥＬｌ＾１内に挿入したＤＮＡ配列はこのフ
ァージクローンから単離できる。ＥｔｌＡｌの制限酵素
地図を作成する（第１図）。

上記挿入のｃＤＮＡ部分について決定したヌクレオチド
配列を、それから得られるアミノ酸配列と共に第２図に
示す。

前記配列はアイメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌ
ａ）の蛋白質の一部だけを表わしている。ヌクレオチド
配列については、アイメリア・テネラ質のアミノ酸配列
のＮ−↓二がおそらく存在しないであろう。

本発明は、第２図に示すアミノ酸配列を有するポリペプ
チド又はその抗原性フラグメントをコードする核酸配列
及び、アイメリア・テネラ（肛駐ｒｌａ　ｔｅｎｅｌｌ
ａ　）蛋白質の一部が前記アミノ酸配列によって定職さ
れている該蛋白質の全体又はその抗原性フラグメントを
コードする核酸配列を含んでいる。

第２図に存在しないアイメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎ
ｃｌ　Ｉａ）蛋白質の５′核酸配列は、例えばアイメリ
ア・テネラのＲＮＡを単離し、そのＲＮＡを、存在する
核酸配列の５′側から誘導したブライマーとハイブリッ
ド形成させ、例えば逆転写酵素によりこのブライマーを
伸長させることによる標準の分子生物学的手法によって
得ることができる。その後、新規に合成したＤＮＡを標
準の分子生物学的手法を使用して二本鎖型に変換し、好
適ベクター中でクローン化し、次いで配列決定しうる。

別の可能性は、存在する核酸配列の５′側に由来する制
限フラグメントを用いて上記のｃ　ＤＮＡライブラリー
をスクリーニングし、第２図に示す核酸配列と重り合う
が、更に５′配列も有するＤＮＡ配列を含有するクロー
ンを単離することである。

アイメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａ）蛋白質
の一部をコードするデオキシ核酸配列を第２図に示して
いる。このｃＤＮＡ配列は（停止コドンも含めて）長さ
１９７０ヌクレオチドである。実質的に前記ｃＤＮＡ配
列又はそのフラグメントを包含する核酸配列及び、前記
ｃＤＮＡ又はそのフラグメントの他に、アイメリア・テ
ネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａ）蛋白質に対応する他の
ヌクレオチドを包含する核酸配列、例えばアイメリア・
テネラ蛋白質をコードする完全な遺伝子は本発明の一部
を形成している。

当業界で良く知られているように、遺伝子コードの縮退
はコドン中の塩基置換を可能にし、同じアミノ酸をコー
ドする他のコドン、例えばアミノ酸であるグルタミン酸
のコドンはＧＡＴとＧＡＡの両者である、になりうる。

従って、第２図に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド又はその抗原性フラグメントの発現には、第２図に示
す核酸配列とは異なる代替可能なコドン組成を有する核
酸配列を使用できることは明らかである。

少なくとも配列の一部が第２図に示す核酸配列又はその
フラグメントと実質的に相同であるが、ヌクレオチドの
置換、突然変異、挿入、欠失、逆位等を含んでもよく、
及び第２図に示すポリペプチド又はそのフラグメントに
機能的に等価である蛋白質又はポリペプチドをコードす
る核酸配列も本発明の範囲に含まれる。

本発明はまた、上記の核酸配列によってコードされる且
つコクシジウム症に対する家禽の免疫化に使用しうるポ
リペプチドも含んでいる。

更に、実質的に第２図に示すアミノ酸配列の少なくとも
一部からなるポリペプチドも本発明に含まれる。

意味するものであって、−１の特定の長さをさすもので
はない；従って、特にペプチド、オリゴペプチド及び蛋
白質がポリペプチドの定職に含まれる。

本明細書に含まれる第２図に示した特定のポリペプチド
には、天然の変異が存在しうろことが理解されよう。こ
れらの変異は、全配列中のアミノ酸の相違により、即ち
前記ポリペプチド中のアミノ酸の欠損、置換、挿入、転
位又は付加により立証され得る。

更に、得られた１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠損、
付加又は交換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）により様々に
修飾した、第２図に示すポリペプチドの種々の誘導体の
製造に組換えＤＮＡ技術を使用すると有利である。第２
図に示すポリペプチド又はその抗原性フラグメントの本
質的、特徴的活性が重大な影響を受けていないのであれ
ば、上記の全ての修飾によって得られる第２図に示すポ
リペプチド又はそのフラグメントの誘導体及びこのよう
な誘導体を包含するポリペプチド又はそのフラグメント
も本発明の範囲に入いる。

また、コクシジウム症に対する家禽の免疫化に使用しつ
るこれらポリペプチドのフラグメントも本発明の一部を
形成する。公知の又は未知のアミノ酸配列中のこのよう
に有用なポリペプチドフラグメント（エピトープと称す
る）を検出するための種々の方法が知られている。公知
のアミノ酸配列を基にして、例えば、これらのエピトー
プは特許曾０８４１０３５６４及びＷＯ３８１０８４８
７に記載のスクリーニング法を用いて実験的に決定する
ことができる。

更に、ポリペプチドの多数の領域は、理論的な考察及び
公知のエピトープとの構造上の一致に基づいて、エピト
ープと呼ぶことができる。これらの領域は、Ｊ、Ｐ、１
Ｉｏｐｐとに、Ｐ、Ｗｏｏｄｓが記載した疎水性規＄（
参照文献５）とＰ、Ｙ、Ｃｈｏｎ及びＧ、Ｄ、Ｐａｓｍ
ａｎが記載した二次構造アスペクト（参照文献６）との
組合わせをベースとして決定した。

必要となるであろうＴ細胞エピトープも同様にＢｅｒｚ
ｏｌ’ｓｋｙの両親媒性規準（参照文献７）を用いて理
論的に推論できる。

本発明のコクシジウム感染症に対する免疫化には、例え
ば抗イデイオタイプ抗体又はその抗原結合フラグメント
を使用することも可能である。このような抗体はイディ
オタイプ抗体に対するものであり、そしてこのイディオ
タイプ抗体は本発明のポリペプチドに対するものである
。上記の本発明ポリペプチドの免疫原性等価物は特にこ
のタイプの抗イデイオタイプ抗体を意味するものと理解
される。

本発明の核酸配列を、場合によってβ−ガラクシ トｌダーゼのようなポリペプチドをコードする配列部分
を含有している、種々の発現を導＜　ＤＮＡ配列と連結
して、好適な宿主の形質転換に使用しつる所謂組換え核
酸分子となすことができる。このようなハイブリッドＤ
ＮＡ分子は好ましくは、例えばプラスミツドから又は、
バクテリオファージ又はウィルス中に存在する核酸配列
から誘導される。本明細書で使用する「形質転換」とは
、例えば直接的な取り込み又は形質導入のような使用す
る方法とは無関係に、宿主細胞内に異種核酸配列を導入
することを意味している。異種核酸配列は独自複製（ａ
ｕｔｏｎｏ＋ｅｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を通
して維持されつるか、又は宿主ゲノム内に組み込まれう
る。組換えＤＮＡ分子は、好ましくは、挿入された核酸
配列の発現を調節できる表示の宿主と相性のよい適切な
調節配列（ｃｏｎｔｒｏｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を含ん
でいる。

好適な宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列
により又はこのような核酸配列を含む組換え核酸分子に
より形質転換することができる細胞であり、且つ前記核
酸配列によってコードされた前記ポリペプチドを発現す
るために使用しうる細胞である。宿主細胞は原核生物起
源例えば大腸菌、枯草菌及びシュードモナス属のような
細菌；又はｔ専＝；与４真核生物起源例えば 細胞例えば昆虫、植物若しくはｌ１ｅｌａ細胞及びモル
モットの卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む補乳類細胞でありう
る。

意図した免疫化は、例えば本発明ペプチド若しくはその
免疫原性部分若しくは等価物を例えば鳥に投与すること
により又は、免疫すべき鳥に、組換えＤＮＡで遺伝学的
に修飾された且つポリペプチド若しくはその免疫原性部
分もしくはＡぜ１を産生しうる微生習ｖの場（ｉｎ　５
ｌｔｕ　）投与することにより実施しうる。

本発明によるコクシジウム症に対する家禽の免疫化につ
いては、一方において、例えば鳥に本発明ポリペプチド
、フラグメント又は免疫原性等価物を投与することがで
き、又は他方において、遺伝子操作により本発明ポリペ
プチド等を産生ずる能力を獲得した微生物を所望に応じ
て投与することができる。その最初の例には「サブユニ
ットワクチン」という用語がよく使われ、二番目の例に
は「ベクターワクチン」という用語が通常使われている
。本発明者はこの命名を本明細書中で使用する。

本発明のサブユニットワクチンは一般に、場合により医
薬上許容され得る賦形剤の存在中で、精製形態のポリペ
プチドを含有している。このポリペプチドを場合により
非関連性の蛋白質と共有結合することができ、このこと
は例えば融合ｉ−のシ 精製に有利である。具体例としてβ−ガラクトｌダーゼ
、プロティンＡ１プロキモシン、血液凝固因子Ｘａ等が
ある。

このような用途のポリペプチドは公知の方法、例えばア
イメリアφテネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　Ｉａ）がらの単
離、組換えＤＮＡ技術又はペプチド合成によって製造す
ることができる。

所望であれば、例えばグリコジル化、アミド化、カルボ
キシル化又はリン酸化によりこのポリペプチドを修飾す
ることもできる。

ベクターワクチンでは、本発明のポリペプチド−１は遺
伝子操作した有機体によって作られ、この有機体はそれ
自身免疫すべき個体に投与され、且つその個体の体内で
しばらくの間それ自身を。

維持し又は増殖することさえある。この目的には、例え
ば大腸菌、バチルス若しくはサルモネラのような細菌又
は牛痘つィルス若しくは鳥の天然痘ウィルスのようなウ
ィルスといった広範な有機体を宿主として使用すること
ができる。このタイプの宿主有機体を用いると、ポリペ
プチドはそれ自身表面抗原として発現しうる。これに関
しては、ＯＭＰ蛋白質もしくは大腸菌の毛蛋白質又は有
機体によって認識されるシグナル及びアンカー配列の合
成的供給物と前記ポリペプチドとの融合が考えられる。

また前記免疫原性ポリペプチドは、所望によりより大き
な全体の一部として、免疫すべき動物の体内に放出され
る。これらの場合の全て−し において、１種以上の免疫原性産物が、種々の病原体に
対する及び／又は所与の病原体の種々の抗原に対する防
御を生じさせる発現を見出すであろう。

本発明の核酸配列と、アイメリア・アセルブリナ（Ｅ、
ａｃｅｒｖｕｌ　１ｎａ）由来の防御用ポリペプチドを
コードするＤＮＡフラグメント（実施例２）との間の実
質的な相同を考慮すれば、前記核酸配列又は対応のポリ
ペプチドを使用して他の種のアイメリア、特にアイメリ
ア・アセルブリナに対し家禽を免疫しうることが予想さ
れる。

アイメリア・テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｔ　ｌａ）に既に感
染している鳥を、前記アイメリア・テネラに対する抗体
で治療できることは言うまでもない。本発明謔 のポリペプチドに特徴的なメ血清又は抗体はコクシジウ
ム症の治療に使用しうる。前記ポリペブチに ドで動物を免疫し、その動物からＡ血清を単離す枕 ることにより前記Ａ血清又は抗体が得られる。

本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体もア
イメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ）に感染し
た鳥の治療に使用できる。前記モノクローナル抗体は、
この目的で当業界に公知の方法、例えば、前記ポリペプ
チドでマウスを免疫し、マウス牌細胞に永久増殖性をも
たせ、有用な抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する
ことにより製造することができる。腫瘍形成性ＤＮＡで
Ｂリンパ球を直接形質転換することにより、又は、エプ
スタイン−バーウィルスでトランスフェクションするこ
とにより永久増殖性抗体産生細胞系を作製することもで
きる。

当業界で公知の方法により、特にモノクローナル抗体を
使用して抗イデイオタイプ抗体を生じさせることができ
る。これらの抗イデイオタイプ抗体は鳥におけるコクシ
ジウム症の予防にも有用であり得る。

上記の抗血清及びモノクローナル抗体はアイメリア・テ
ネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｔ　ｌａ）に感染した鳥の免疫学
的診断にも使用し得る。

実施例１ アイメリア・テネラ（Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ）卵母細胞
の胞子形成 １０−４Ｍの亜ニチオン酸ナトリウム８０ｍ１にアイメ
リア・テネラ５Ｘ１０８個を含有する懸濁液を遠心分離
し、その後、ペレットを１００ｍ１の滅菌水で１回洗浄
した。細胞を２％重クロム酸カリウム５００ｍ１に再懸
濁させた後、強力な曝気の影響下に３０℃で７時間イン
キュベーションした。次に、遠心分離により卵母細胞を
集め、２００ｍ１滅菌で３回洗浄した。

ＲＮＡの単離 ＲＮＡを単離するために（参照文献１　）　、１０ｍＭ
Ｔｒ１ｓ酢酸（ｐＨ７，６）、７５ｍＭ酢酸ナトリウム
、１％ＳＤＳ、２ｉＭＥＤＴＡ、０．２＋＊ｇ／ｍｌプ
ロティナーゼＫ及びｌＯＩＩＩＭのバナジルリボヌクレ
オシド複合体を含有するバッファ　２．８ｍｌ中に該細
胞ペレットを入れた。ガラスピーズ（直径０，５關）　
１３ｇの存在下で（最大）６０秒間激しく撹拌すること
により卵母細胞を破壊した。全抽出物にフェノール５　
ｍｌを加え、混合物を更に６０秒間激しく撹拌した。遠
心分離後、上清液をピペットで取り出し、等量のフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２
４：ｌ）で再度抽出した。２．５容のエタノールを加え
た後にＲＮＡが沈殿し、得られた沈殿物を８００μｇの
Ｔｒ［５１０ｍ１　ＳＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｏ，１ｍＭ　、
ｐｌ！７．０（ＴＥ）に溶解した後、等容量のフェノ−
１００，１ ル／クロロホルム／イソアミルアルコール次にエタノー
ルで沈殿させた。オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロロマ
ドグラフィでポリＡ　　−ＲＮＡ酵素ＭＭＬＶ逆転写酵
素によりポリＡ＋ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。この目
的のために、２５μｇのポリＡ　　−ＲＮＡを水９０μ
Ωに溶解し、ｌｈＭとなるまで水酸化メチル水銀を加え
ることにより２０℃で５分間変性させ、次に、β−メル
カプトエタノールをｔ５ｍＭとなるまで加え、混合物を
２０℃で更に３分間インキュベーションした。４ｕｇ（
Ｒ） のオリゴ（ｄＴ）　　、　１５０　ＵのＲＮ　Ａｓ１ｎ
　　、　２０ｍＭＴｒｌｓ（ｐＨ７，０）、３０ＩＩＭ
　　ＫＣＲ、４ａ＋Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）　
、２ｍＭ　　ＭｇＣΩ　、各ｄＮＴＰｌｍＭ及び３００
０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素ヲ含ムバッファ１９０μｇ中
で酵素反応を行った。３７℃で１時間インキュベーショ
ンした後、０．５Ｍ　　Ｅ　Ｄ　ＴＡＩＯμｇを加えて
反応を止めた。等容量のフェノ−ル／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５：２４：ｌ）で抽出した後、
２Ｍとなるまで酢酸アンモニウムを加え、及び２．５容
のエタノールを加えることによりＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッドを沈殿させた。酵素ＤＮＡポリメラーゼ■とＲＮ
ａｓｃＨ（参照文献３）の作用を組合せると第二の鎖が
合ＵのＲＮ　ａｓｅ　Ｈ，２００ＵのＤＮＡポリメラー
ゼＩ及び２０ＵのＤＮＡ−リガーゼ（大腸菌）を含有す
るバッファ９６０μｇ中にペレットを溶解した。１２℃
で１時間、次に２２℃で１時間インキュベーションし、
その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２５：２４：ｌ）を等容量加え、エタノールで沈
殿させることにより反応を止めた。

この目的に適したベクター内でｃＤＮＡをクローン化す
る前に、先ず、ｃＤＮＡを修飾した。３０ＩＩＩＭ酢酸
す（・リウム（ｐＨ５，８）、５０ｍＭ　　ＮａＣＮ、
　ＩＩＩＭ　　ＺｎＳＯ４及び２１Ｕのヤエナリヌクレ
アーゼ（Ｈｕｎｇ　Ｂｅａｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）を含
むバッファｌＯＯμｇにｃＤＮＡ　（５μｇ）を溶解し
た。３７℃で３０分間インキュベーションした後、ＥＤ
ＴＡを１０ｍＭとなるまで及びＴｒｌｓを２５＋ａＭと
なるまで加えることによって反応を止めた。フェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：
ｌ）で抽出した後、混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０
カラムで脱塩した。

溶出液（１２５μｇ）に次のものを加えた：　Ｔｒｉｓ
（ｐＨ７，６）　５０＋ａＭまで、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　２
．５ｍＭまで、ＤＴＴ５腸間まで、Ｓ′−アデノシルメ
チオニン０．５μＸまで及び１００　ＵのＥｃｏＲＩ−
メチラーゼ。３７℃で３０分間インキュベーションした
後、６５℃に１５分間加熱して反応を止め、次に、Ｔｒ
ｌｓ　−ＨＣＤ　ｌｏＯｍＭ、Ｍ　ｇ　Ｃ１２１１００
ＩＩ及びＮ　ａ　Ｃ、！！　５００ａ＋Ｍを含む溶液（
ｐＨ７，５）　ｌ／１０容を加え、同時に各ｄ　Ｎ　Ｔ
　Ｐ　１　ａ＋Ｍ及び１２．５ＵのＫ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ
　Ｎ　Ａ−ポリメラーゼを加えた。２２℃で６０分間イ
ンキュベーションした後、等容量のフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加
えることにより反応を上滑液を沈殿させた。ペレットを
Ｈ２Ｏ２４μｇに溶解させた後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
５０で脱塩し、溶出液をエタノールで沈殿させた。

Ｈ２Ｏ２４μｇでペレットを溶解した後、Ｅｃｏ１ロリ
ンカー２　ｕ　ｇ　５Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩＩ　（ｐ１１
８．０）　３０ｍＭまで、Ｍ　ｇ　ＣＩＩ　２　ＬＯｍ
Ｍ！　テ、ジチオスレイトールｌｈＭまで、Ａ　Ｔ　Ｐ
　ｌｌＩＭまで、ゼラチン０．１Ｂ／ｍｌまで及び１０
Ｕの’ｒ４ＤＮＡ−リガーゼを加え、５０μΩ中で連結
を行った。４℃で１６時間インキュベーションした後、
（７０℃で１５分間）加熱することにより反応を止めた
。次に、ｌｏＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩＩ　（ｐＨ７
，６）、５０５ＭＮａＣｆｆ、１０ｍＭＭｇＣＮ　　　
　、２．５ｍＭＤＴＴ　及び５００ＵのＥｃｏＲＩを含
有するバッファ２１０μｇ中で制限エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩで切断した。３７゛℃で９０分間インキュベ
ーションした後、等容量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：２４：ｌ）で抽出するこ
とにより反応を止めた。

酢酸ナトリウム（ｐｌ＋５．６）を３００ＩＩＭまで加
えた後、２．５容のエタノールで上滑液を沈殿させ、Ｂ
ｉｏｇｅｔＡ１５ｍカラムでｃＤＮＡとリンカ−を分離
した。

エタノールでｃＤＮＡを沈殿させ、次にＴｒｉｓ−ＨＣ
ｊｌｌＯｓＭ、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｏ，ｌａ＋Ｍ（ｐＨ７
゜Ｂ）に沈殿物を溶解した。次いで、ｃＤＮＡ分子をフ
ァージλｇｔｌ。

（参照文献４）内にクローン化した。

実施例２ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｌ＋＋＋）のｒ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＭＡ識及び検出
キット、非放射性」　（カタログ番号１０９３８５７）
に付随のプロトコールに正確に従って、ランダムプライ
ミング（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｌｍｔｎｇ）することによ
り、ｐＵｃ１８／　ＥａｌＡからの２９６塩基対Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントをジゴキシゲニン（ｄｌｇｏｘＩｇｅ
ｎｌｎ）　−ｄ　Ｕ　Ｔ　Ｐで標識した。

上記のアイメリア・テネラｃ　ＤＮＡライブラリーから
の固定化されたＤＮＡを含むフィルターを、Ｍａｎｉａ
ｔｌｓら（参照文献２）が記載したように調メし、（９
５℃で１０分間）変性させたばかりの標識アてフィルタ
ーを洗浄した：２ＸＳＳＣＳ０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ
　（ＩＸＳＳＣはｐ１１７．０のクエン酸すトリウム０
．Ｏｉ５モル／　１　＋　Ｎ　ａ、７　Ｉ　Ｏ，１５モ
ル／ＩＩ）で室温で１５分間洗浄を２回、ｌＸ５ＳＣ，
０，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで８８℃で１５分間洗浄を２
回、　　０．１ＸＳＳＣ，０，１％（ｖ／ｖ）　Ｓ　Ｄ
　Ｓで６８℃で３０分間洗浄を２回及び１５分間洗浄を
１回；　Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｖｅｅｎ（７，６５ｇ／ΩＮ
ａ１ｌ　、　　０．９１ｇ／ΩＮ　ａ　２ＨＰ０　　・
２Ｈ２０，０，２１ｇ／Ｉ　ＫＨＰｏ　　。

０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０　、ｐＨ７Ｊ　）
で室温で１５分間洗浄を２回行う。

次に、該フィルターを、アルカリ性ホスファターゼに結
合したポリクローナルヒツジ抗／シゴキシゲニンＦａｂ
フラグメントのＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎ中イ の５００　ｏｐ希釈物と室温で３０分間反応させた。こ
のフィルターを室温でＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｖｅｅｎで１５分
間４回と０．０１Ｍ　Ｔｒｅｓ　−ＨＣｆＩ（ｐＨ１８
，０）　、０．１５ＭＮ　ａ　Ｃ（！で１５分間１回洗
浄した後、０．３３ｇ／ｉ）のニトロブルーテトラゾリ
ウム及びＯ，１Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＤ（ｐＨ９，６）
、０．１Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ４）　−０，０１Ｍ　Ｍ　ｇ　
ＣＮ　２中０．１７ｇ−／Ωの５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−ホスフェートの溶液と共にインキュ
ベーションしてフィルターへのアルカリ性ホスファター
ゼの結合を検出した。４００個のλｇｔｌｏアイメリア
・テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ　）クローンのうち１個
がアイメリア・アセルブリナ（Ｅ、ａｃｅｒｖｕｌ　Ｉ
ｎａ）プローブと反応した；アイメリア・テネラＩＡＩ
　−１０（λｇｔｌＯＥｔｌＡ１〜１０）と呼ばれる、
前記クローンのうちの１０個をプラーク精製した。λｇ
ｔｌＯＥｔｌＡ１は大腸菌Ｂ　Ｎ　Ｎ　１０２株と共に
、第ＣＢ　Ｓ　２８６．８９号としてＣｅｎｔｒａａｌ
　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃ旧ｉｍｅｌｃｕｌｔｕ
ｒｅ。

Ｂａａｒｎ（オランダ）に寄託されている。プラスミツ
ドｐＧＥＭ４Ｚ又はバクテリオファージＭ１３（参照文
献２）内で作製されたこのｃＤＮＡ挿入物のサブクロー
ンから、メーカーの指示０ＩＳＢ配列キット）に従って
完全なヌクレオチド配列を決定した。

下記の文献は明細書中に引用されたものである。

１）Ｊ、Ｐａ５ｔｅｒｎａｋら：　Ｍｏ１．＆　Ｂｉｏ
ｅｈ、Ｐａｒ、３（１９８１）、　ｊノｊ−）４２・ ２）Ｔ、Ｍａｎｉａｌｓ　　ら　：　　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　　Ｃｌｏｎｌｎｇ　　　（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１９８２　。

３）Ｕ、Ｇｕｂｂｌｅｒら：　Ｇｅｎｅ２５（１９８３
）、２Ｈ−２６９゜４）Ｔ、Ｖ、１ｌｕｙｎｋ　　ら　
：　　ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｄ、
Ｇｌｏｖｅｒ　０ｘｆｏｒｄ（１９８４）。

５）Ｊ　：Ｐ、Ｈｏｐｐら：　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃ１．Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７８（１９８１）、
　　　、３？、２４−ｊ？Ｉ。

８）Ｐ、Ｙ、ＣｈＯｕら：＾ｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　
ＥｎｚｙＩＩｌｏｌｏｇｙ　　４７（１９８７）、　　
４ケー／４Ｊ？。

７）Ｍ、Ｆ、Ｇｏｏｄら：　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５（
１９ｇ？）、１０５９−１０Ｂ２゜ ４、 図面の簡単な説明 り紅但ｒｅユ（せ 第１図は、 フ ァージλｇｔｌＯＥｔｌＡｌ 中に挿入され たＤＮＡフラグメン ）　ＥｔｌＡｌ の制限酵素地図であ る。

第２図は、 フ ァージλｇｔｌＯＥｔｌＡｌ 中に挿入され ＤＮＡのヌクレオチ ド配列及びＥｔｉＡｉ の推定アミ ノ酸配列を示す。

Ｍれ アクン゛″−１７・ケに− ＴＣ？Ｇｅ？ＧＣＣＣＧＴＧｋＴＣＡＣＣＴＣＧＡＡＧ
Ｃ’ｒＧＧＡＣＴＡＣＴＴＧ入Ｇ’Ｉ”ｌ’ｃＣＡＴＡ
ＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧ丁ＧＴｓ ＳＬ１【＾１ｍ　Ａｌａ＾ｒ９＾ＩＩｐ　Ａｍｐ　Ｌｊ
ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＸＡｕ　ｔａｕ　Ｇｌ
ｕ　Ｐｈｓ＾−ｐ　Ａｒｇ　ｆｌｕ　Ｇｉｕ＾ｒｑ　Ｖ
ａ１ ＣＡＴ　　ＣＣＣＴＣＴ　　ＴＣＴ　ＴＧＧ　　ＣＣＡ
　？ＡＴ　ＣＣＣＡＧＧ　ｋＴＧ　　ＧｃＴ　ＧＴＴ　
ＧＧＴ　Ｇ’ｎ　ＣＴＣＡＧ　ＧＡＣＴＣＣＡＡ？　Ｇ
ＧＣ ＾ＩＩｐＰｒｏ　Ｓｏｒ　ｓａｒ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｙＶａｌ−ｕλｒ９＾ｓｐ　唐≠秩＊ｎ　Ｇｌｙ 賀：？　ＧＴＴ　ｋＴＧ　ＧＴｌｌｉ　ｅｅＡ　ＧＴＡ
　ＧＣＴ　ｅｃＧ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＣＣＣＡ
ＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＡｆ　’ｒ’ｆ’Ｇ　ＧＣＡ
　ＴＴＣｅＧＴｊ＠ｒ　Ｖａｌ　Ｍ＠ｔ　Ｖａｌ　Ｐｒ
ｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒ６　Ｌｙｆｉ　Ｐｈａ　Ｖａ
ｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ＾ｒ９　ＬＹ＠Ｌｌａｕ＾
ｌａ　Ｐｈ−＾ｒ９ ＧＴＣ＾ＡＴ　ＣＴＣＧＡＧ　　ＴＣＴ　　ＧＧＴ　Ｇ
ＣＴ　　ＧＧＣＧｅｅ　ＧＡ’ｒ　ＧＣＣＧＧｅ　ｍ　
ＡＣＴ　ＧｋＣＧＡＡ　　ＧＧ　　ＴＡｃ　ＡＧＧ　Ａ
ＧＧ Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｖａｔ　　Ｇｌｕ　　Ｓａｔ　Ｇ
ｕｙ　　Ａｌａ　　ａｌｙ　　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ
　　Ｇｌｙ　　Ｐｈ＠　？ｈ秩Ａｍｐ　Ｇｌｕ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　＾ｒｇＧＣＴ　　ｃａＡ　ＯＣ
Ａ　　ＧＡＡ　　ＧＴＣＣＴＣＴＣＧ　　ＧＧＣＣＣＣ
ＣＡＴ　ＧＣＡ　　ＧＴＣＡ’ｌ”ｒ　ＡＡＣＣＡＧ　
ＴＣｓ　　ＣＡＡ　　ＧＴＣＣＴＧ　　ＣＴＣ＾１ａ　
Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｌｊｕ　Ｓｉｒ　Ｇ
１ｙＰｒ６　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　１１＠　Ａａｎ
　Ｇｉｎ　Ｓｉｒ　ｆｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｓｕ　Ｌｅｕ ＣＧＣＧＴＴ　ＴＣＡ　　ＧＣＧ　　ＣｅＧ　　ＴＣＧ
　　ＣＣＡ　　にＡＴ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　　ＴＣＧ　　
ＣＧＣＡＴＴ　　ＣｃＴ　ＡｆＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＴ
ＣＣＴ’Ｔ　　ＡＴＣＡ【９νａｌＳ＠ｒＡｌａＰｒｏ
ＳａｒＰｒｏＡｓｐｔＪｕＶａｌＳａｒＡｒｑ工１＠Ｐ
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＋１少

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）アイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌ
   ｌａ）の蛋白質の少なくとも一部を実質的にコードする
   核酸配列であって、前記蛋白質の一部分が第２図に示さ
   れたアミノ酸配列によって定職されるものである核酸配
   列。
2. （２）前記蛋白質の一部分が第２図に示されたデオキシ
   核酸配列によってコードされていることを特徴とする請
   求項１に記載の核酸配列。
3. （３）前記核酸配列の発現を可能にする調節配列に遺伝
   子操作により結合させた請求項１又は２に記載の核酸配
   列から成る組換え核酸分子。
4. （４）請求項３に記載の組換え核酸分子を含有するベク
   ターウィルス。
5. （５）請求項１又は２に記載の核酸配列、請求項３に記
   載の組換え核酸分子又は請求項４に記載のベクターウィ
   ルスを含有する宿主細胞。
6. （６）少なくとも一部が請求項１又は２に記載の核酸配
   列によってコードされているアミノ酸配列を有するポリ
   ペプチド。
7. （７）第２図に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を
   包含するポリペプチド。
8. （８）請求項１もしくは２に記載の核酸配列、請求項３
   に記載の組換え核酸分子、請求項４に記載のベクターウ
   ィルス、請求項５に記載の宿主細胞又は請求項６もしく
   は７に記載のポリペプチドを包含する、コクシジウム症
   に対する家禽を保護するためのワクチン。
9. （９）請求項６又は７に記載のポリペプチドと免疫反応
   性の抗体又は抗血清。