EA028164B1 - Слитые белки для облегчения отбора клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины с геном специфического иммуноглобулина - Google Patents
Слитые белки для облегчения отбора клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины с геном специфического иммуноглобулина Download PDFInfo
- Publication number
- EA028164B1 EA028164B1 EA201491965A EA201491965A EA028164B1 EA 028164 B1 EA028164 B1 EA 028164B1 EA 201491965 A EA201491965 A EA 201491965A EA 201491965 A EA201491965 A EA 201491965A EA 028164 B1 EA028164 B1 EA 028164B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- library
- antigen
- virus
- eeu
- Prior art date
Links
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 title claims description 86
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 64
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 64
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 title description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 160
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 160
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 144
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 144
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 144
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 124
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 145
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 145
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 145
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 141
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 132
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 124
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 122
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 65
- 102220542269 Eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit ERF3B_A56K_mutation Human genes 0.000 claims description 49
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 32
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 27
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 23
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 22
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 22
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 19
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 18
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 4
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 26
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 24
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 234
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 117
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 35
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 34
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 31
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 31
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 26
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 18
- 102200091301 rs1114167429 Human genes 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 8
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 8
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- UGDGKPDPIXAUJL-UHFFFAOYSA-N ethyl n-[4-[benzyl(2-phenylethyl)amino]-2-(4-ethylphenyl)-1h-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]carbamate Chemical compound N=1C(NC(=O)OCC)=CC=2NC(C=3C=CC(CC)=CC=3)=NC=2C=1N(CC=1C=CC=CC=1)CCC1=CC=CC=C1 UGDGKPDPIXAUJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101150026794 SHO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-triaminopyrimidine Chemical compound NC1=CC(N)=NC(N)=N1 JTTIOYHBNXDJOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 241000350139 Erythrophleum suaveolens Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000282818 Giraffidae Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101000984653 Homo sapiens Large subunit GTPase 1 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000724418 Homo sapiens Neutral amino acid transporter B(0) Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710111858 Immunoglobulin gamma-1 heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 102100026215 Immunoglobulin gamma-1 heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 102100027113 Large subunit GTPase 1 homolog Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100028267 Neutral amino acid transporter B(0) Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N acetylacetonate Chemical compound CC(=O)[CH-]C(C)=O CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000016063 arterial thoracic outlet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000003918 constitutive secretory pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007446 host cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 241000264288 mixed libraries Species 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 108091005706 peripheral membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Substances [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940124954 vaccinia virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
- C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к высокоэффективному способу экспрессии молекул иммуноглобулинов в эукариотических клетках. Изобретение, кроме того, относится к способу получения библиотек тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, в частности, с использованием способа тримолекулярной рекомбинации, для экспрессии в эукариотических клетках. Изобретение, кроме того, относится к способам отбора и скрининга антигенспецифических молекул иммуноглобулинов и их антигенспецифических фрагментов. Изобретение относится также к наборам для получения, скрининга и отбора антигенспецифических молекул иммуноглобулинов. Наконец, изобретение относится к молекулам иммуноглобулинов и их антигенспецифических фрагментам, полученным способами, представленными в настоящем документе.
Description
Настоящее изобретение относится к высокоэффективному способу экспрессии молекул иммуноглобулинов на частицах вируса осповакцины, например вирионах ЕЕУ, и/или на клетках-хозяевах, к способу получения библиотек тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов для экспрессии в частицах вируса осповакцины, например вирионах ЕЕУ, и/или эукариотических клетках, к способам выделения иммуноглобулинов, связывающих специфические антигены, и к иммуноглобулинам, полученным любым из этих способов. Изобретение также относится к слитым белкам, используемым для экспрессии молекул иммуноглобулинов на частицах вирусах осповакцины, например вирионах ЕЕУ, или на клетках-хозяевах.
Родственная область техники.
Получение иммуноглобулинов.
Антитела определенной специфичности используют в увеличивающемся количестве различных терапевтических применений. Ряд способов использовали для получения пригодных антител для терапевтического применения у человека. Они включают химерные и гуманизированные антитела и полностью человеческие антитела, отобранные из библиотек, например библиотек фагового дисплея, или из трансгенных животных. Библиотеки иммуноглобулинов, сконструированные в бактериофаге, можно получать из продуцирующих антитела клеток наивных или специфически иммунизированных индивидуумов, и они могут, в принципе, включать новые и разнообразные пары тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека. Хотя этот способ не страдает от наследственного ограничения репертуара, он требует, чтобы определяющие комплементарность области (СЭР) экспрессированного фрагмента иммуноглобулина были синтезированы и правильно свернуты в бактериальных клетках. Многие антигенсвязывающие области, однако, сложно правильно собрать в форме слитого белка в бактериальных клетках. Кроме того, белок не может подвергаться нормальным эукариотическим посттрансляционным модификациям. В результате этот способ налагает другой избирательный фильтр на специфичности антител, которые можно получать. Альтернативно, полностью человеческие антитела можно выделять из библиотек в эукариотических системах, например в дрожжевом дисплее, в ретровирусном дисплее, или экспрессией в ДНКвирусах, таких как поксвирусы (см., например, патент США № 7858559, полное содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки).
Настоящее изобретение позволяет эффективную экспрессию библиотеки полностью человеческих антител на поверхности вируса осповакцины, оболочечного вируса млекопитающих. Подобно фаговому дисплею используют условия, где каждый вирион осповакцины экспрессирует отдельный иммуноглобулин, например антитело или 8сРУ, на своей поверхности.
Однако по настоящему изобретению различные способы на основе пэннинга и магнитных бусин разработаны для скрининга библиотек вирионов осповакцины-МЛЪ для отбора рекомбинантного вируса, кодирующего специфические антитела. При инфекции клеток млекопитающих антитело не только встроено во вновь продуцируемый вирус, оно также экспонировано на поверхности клетки-хозяина. Это позволяет эффективные способы отбора, сочетающие преимущества отбора вирионов осповакцины-МАЪ в бесклеточной системе пэннинга, с последующим скринингом на основе клеток по высокой специфичности и оптимизации антитела.
Это отличается от других способов в данной области, в которых экспрессируют отдельные 8сРУ, но не экспрессируют библиотеку. Более того, другие способы разработаны для перенаправления инфекции осповакцины посредством 8сРУ на генотерапию, и их не используют для исследования антител. Кроме того, настоящий способ отличается от предшествующих способов использованием ЕЕУ вместо 1МУ, а также использованием различных слитых белков (например, А56Р).
Краткое изложение сущности изобретения
В конкретных аспектах описание относится к слитому белку, содержащему а) первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи, и Ъ) второй фрагмент полипептида, содержащий трансмембранный домен специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок дополнительно содержит третий фрагмент полипептида, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмент. В другом варианте осуществления специфический для осповакцины ЕЕУ мембранный белок представляет собой А56Р.
- 1 028164
В конкретных аспектах описание относится к полинуклеотиду, кодирующему слитый белок, содержащий а) первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи человека, и Ь) второй фрагмент полипептида, содержащий трансмембранный домен специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид содержит нуклеотиды из 8ЕЦ ГО N0: 10, кодирующие аминокислоты 108-314 из А56К из штамма осповакцины \Уек1егп Кекетуе. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид кодирует аминокислоты 215-421 из 8ЕЦ ГО N0: 11. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид содержит нуклеотиды из 8ЕЦ ГО N0: 10, кодирующие аминокислоты 215-421 из 8ЕЦ ГО N0:11.
В конкретных аспектах описание относится к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий а) первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи человека, и Ь) второй фрагмент полипептида, содержащий трансмембранный домен специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка.
В конкретных аспектах описание относится к рекомбинантному вирусу осповакцины, содержащему полинуклеотид, кодирующий слитый белок, содержащий а) первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи человека, и Ь) второй фрагмент полипептида, содержащий трансмембранный домен специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка. В другом аспекте описание относится к клетке-хозяину, инфицированной рекомбинантным вирусом осповакцины.
В другом аспекте описание относится к библиотеке рекомбинантной осповакцины, содержащей первую библиотеку полинуклеотидов, сконструированных в векторе вируса осповакцины, кодирующем множество слитых с иммуноглобулинами полипептидов, где вектор вируса осповакцины содержит:
a) первый полинуклеотид, кодирующий первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи,
b) второй полинуклеотид, кодирующий второй фрагмент полипептида, содержащий трансмембранный домен специфического для вируса осповакцины ЕЕУ мембранного белка, расположенный ниже домена СН1, и
c) третий полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или его фрагмент, расположенный выше домена СН1.
В одном варианте осуществления первая библиотека дополнительно содержит сигнальный пептид для облегчения экспрессии слитых полипептидов на поверхности ЕЕУ. В другом варианте осуществления специфический для ЕЕУ мембранный белок представляет собой А56К. В другом варианте осуществления специфический для осповакцины ЕЕУ мембранный белок представляет собой А56К. В другом варианте осуществления второй фрагмент полипептида дополнительно содержит внеклеточный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка или его часть. В другом варианте осуществления второй фрагмент полипептида дополнительно содержит внутриклеточный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка или его часть. В конкретных вариантах осуществления слитый белок содержит аминокислоты из 8ЕЦ ГО N0: 11, соответствующие аминокислотам 108-314 полипептидной последовательности А56К из штамма осповакцины \Уек1егп Кекетуе. В конкретных вариантах осуществления слитый белок содержит аминокислоты 215-421 из 8ЕЦ ГО N0: 11. В конкретных вариантах осуществления слитый белок содержит аминокислоты 215-421 из 8ЕЦ ГО N0: 11, представляющие собой аминокислоты 108-314 полипептидной последовательности А56К из штамма осповакцины \Уек1егп Кекетуе.
В другом аспекте описание относится к способам отбора полинуклеотидов, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи антигенспецифического иммуноглобулина или его антигенсвязывающий фрагмент, включающим:
a) введение первой библиотеки по любому из пп.13-18, кодирующей слитые с иммуноглобулинами белки, в популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины;
b) введение одного или более полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина, в популяцию клеток-хозяев, где слитый с иммуноглобулином белок является способным к сочетанию с легкой цепью иммуноглобулина для формирования антигенсвязывающего домена молекулы иммуноглобулина;
c) обеспечение высвобождения внеклеточного оболочечного вируса (ЕЕУ) из клеток-хозяев;
4) сбор высвобожденных ЕЕУ из супернатанта;
е) контакт высвобожденных ЕЕУ с антигеном; и
ί) извлечение из первой библиотеки полинуклеотидов, кодирующих слитые с иммуноглобулинами полипептиды, экспрессированные на поверхности мембраны ЕЕУ и специфические для антигена.
В одном варианте осуществления способы отбора полинуклеотидов, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи антигенспецифического иммуноглобулина или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно включает:
д) введение полинуклеотидов, извлеченных в (ί), во вторую популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины;
й) введение одного или более полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина, в популяцию клеток-хозяев;
- 2 028164
ί) обеспечение высвобождения внеклеточного оболочечного вируса (ЕЕУ) из клеток-хозяев;
_)) сбор высвобожденного ЕЕУ из супернатанта;
k) контакт высвобожденного ЕЕУ с антигеном; и
l) извлечение из первой библиотеки полинуклеотидов, кодирующих слитые с иммуноглобулинами полипептиды, экспрессированные на поверхности мембраны ЕЕУ и специфические для антигена.
В конкретных вариантах осуществления стадии д)-1) повторяют один или более раз, таким образом обогащая по полинуклеотидам из первой библиотеки, кодирующим вариабельные области тяжелых цепей иммуноглобулинов или их антигенспецифические фрагменты в форме части слитого с иммуноглобулином полипептида, специфически связывающего антиген.
В конкретных вариантах осуществления полинуклеотиды, извлеченные из первой библиотеки, являются выделенными.
В другом аспекте описание относится к способу отбора полинуклеотидов, кодирующих антигенспецифическую молекулу иммуноглобулина или ее антигенспецифический фрагмент, включающему:
a) введение первой библиотеки в популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины;
b) введение второй библиотеки в популяцию клеток-хозяев, где вторая библиотека содержит множество полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина, где слитый с иммуноглобулином полипептид является способным к сочетанию с легкой цепью иммуноглобулина для формирования молекулы иммуноглобулина или ее антигенспецифического фрагмента;
c) обеспечение экспрессии слитого с иммуноглобулином полипептида из клеток-хозяев; ά) сбор слитого с иммуноглобулином полипептида из клеток-хозяев;
е) контакт собранного слитого с иммуноглобулином полипептида с антигеном; и
ί) извлечение из первой библиотеки полинуклеотидов, кодирующих слитые с иммуноглобулином полипептиды, являющиеся специфическими для антигена.
В одном варианте осуществления способ отбора полинуклеотидов, кодирующих антигенспецифическую молекулу иммуноглобулина или ее антигенспецифический фрагмент, дополнительно включает:
д) введение полинуклеотидов, извлеченных в ί) во вторую популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины;
й) введение во вторую популяцию клеток-хозяев второй библиотеки полинуклеотидов; ί) обеспечение экспрессии слитого с иммуноглобулином полипептида из клеток-хозяев;
_)) сбор слитого с иммуноглобулином полипептида из клеток-хозяев;
k) контакт собранного слитого с иммуноглобулином полипептида с антигеном; и
l) извлечение полинуклеотидов из первой библиотеки, кодирующих слитые с иммуноглобулинами полипептиды, являющиеся специфическими для антигена.
В конкретных вариантах осуществления стадии д)-1) повторяют один или более раз, таким образом, обогащая по полинуклеотидам из первой библиотеки, кодирующим вариабельные области тяжелых цепей иммуноглобулинов или их антигенспецифические фрагменты, в форме части слитого с иммуноглобулином полипептида, специфически связывающего антиген.
В одном варианте осуществления способ отбора полинуклеотидов, кодирующих антигенспецифическую молекулу иммуноглобулина или ее антигенспецифический фрагмент, дополнительно включает выделение третьего полинуклеотида, извлеченного из первой библиотеки.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1. Показаны элементы плазмиды р1ЕМ1 и их соответствующие последовательности (8Еф ГО N0: 1).
Фиг. 2. Показана иллюстрация общего способа отбора из библиотеки с использованием рекомбинантного вируса осповакцины.
Фиг. 3А-С. Показаны данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и окрашивания СП100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим Н2124-А56К+Ь517 (В) или 2408-А56К-8сРУ (С), по сравнению с клетками, инфицированными диким типом (\УТ) (А).
Фиг. 4А-В. Показаны результаты связывания в ЕЬ18А для ЕЕУ, содержащего специфический для С35 слитый белок (отмеченный А56И ЕЕУ), контроль ('Έ517+07000-Α56Κ. ЕЕУ) и специфическое для С35 антитело в общепринятом формате связанного с мембраной 1дО1 (тЬд ЕЕУ) с С35/Анти-Уас НИР (А) и С35/Анти-РаЬ (В).
Фиг. 5Α-Ό. Показаны результаты анализа бляшек на чашках для связывания С35 через 2 ч (А) и в течение ночи (В), и связывания УЕСР через 2 ч (С) и в течение ночи (Ό).
Фиг. 6. Показана иллюстрация способа отбора антитела против СГО100.
Фиг. 7. Показано выравнивание последовательности УН клона СГО100 С20 (8Еф ГО N0: 19) и идентичной УН клона, идентифицированного отбором из библиотеки рекомбинантной осповакцины.
Фиг. 8. Показаны результаты окрашивания С35 и Нег2 при проточной цитометрии для отбора Нег2.3.2 и Нег2.3.3 с легкими цепями Ь48, Ь116 и Ь9021.
Фиг. 9. Показана иллюстрация способа отбора антитела против Нег2.
- 3 028164
Фиг. 10. Показаны результаты проточной цитометрии для С35+анти-Н18 и Нет2+анти-Н18 для отбора Нег2.3.2 и Нег2.3.3.
Фиг. 11. Показано выравнивание последовательности УН клона Нег2 В10 (8ЕО ГО N0: 20) и идентичной УН клона, идентифицированного отбором из библиотеки рекомбинантной осповакцины.
Фиг. 12. Показана схема конструкций РаЪ, ТК и тяжелая цепь 1дС-гамма.
Фиг. 13. Показаны данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и окрашивания Нег2 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим 8000-РаЪ Ь8000.
Фиг. 14. Показаны данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и окрашивания Нег2 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) 8000-1дС Ь8000 и (В) 8000-ТК Ь8000.
Фиг. 15. Показаны данные анализов активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и окрашивания Нег2 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Н2124-1дС и (В) Н2124-ТК Ь517.
Фиг. 16. Показан контроль для анализа РЬ0^ библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и окрашивания СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) 2368 и (В) 8000.
Фиг. 17. Показаны результаты анализа РЬ0^ для отобранной с тозилом библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и окрашивания СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Ь223, (В) Ь151 и (С) Ь9021.
Фиг. 18. Показаны результаты анализа РЬ0^ для отобранной с тозилом библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и окрашивания СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Ь48, (В) Ь7110, и (С) Ь122.
Фиг. 19. Показаны результаты анализа РЬ0^ для отобранной с тозилом библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и окрашивания СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Ь116, (В) Ь214 и (С) Ь3-1.
Фиг. 20. Показаны результаты анализа РЬ0^ для отобранной с белком С библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и окрашивания СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Ь223, (В) Ь151 и (С) Ь9021.
Фиг. 21. Показаны результаты анализа РЬ0^ для отобранной с белком С библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Ь48, (В) Ь7110 и (С) Ь122.
Фиг. 22. Показаны результаты анализа РЬ0^ для отобранной с белком С библиотеки 10.3 СГО100. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания Нег2 и окрашивания СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) Ь116, (В) Ь214 и (С) Ь3-1.
Фиг. 23. Показан контроль для анализа РЬ0^ для библиотеки 10.3 СП100/Ь3-1. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания прекомплекса Нег2, 2 стадий окрашивания СГО100. и окрашивания прекомплекса СГО100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) 8000 и (В) 2368.
Фиг. 24. Показаны результаты анализа РЬ0^ для библиотеки 10.3 СЭ100 Тозил/Ь3-1. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания прекомплекса Нег2, 2 стадий окрашивания С0100, и окрашивания прекомплекса СЭ100 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) библиотеку 10.3 С0100, предварительно сортированным, отобранным с тозилом, и (В) библиотеку 10.3 С0100, сортированным, отобранным с тозилом.
Фиг. 25. Показаны результаты анализа РЬ0^ для библиотеки 10.3 СЭ100 Рто1С/Ь3-1. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания прекомплекса Нег2, 2 стадий окрашивания СГО100 и окрашивания прекомплекса СГО100 на клеток НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим (А) библиотеку 10.3 С0100, предварительно сортированным, отобранным с белком С, и (В) библиотеку 10.3 С0100, сортированным, отобранным с белком С.
Фиг. 26. Показаны результаты проточной цитометрии, показывающие специфичность для СГО100 на клетках ЧигкаЕ (СГО100+) и клетках ВхРС3 для тАЪ 2050, 2063 и 2110.
Фиг. 27. Показаны результаты ЕЬ18А на (А) покрытых киС0100-Н|5 и (В) покрытых гемоглобином планшетах с тремя специфическими для СГОНЮ антителами (МаЪ2050, МаЪС2063 и МаЪС2110) по срав- 4 028164 нению с положительным и отрицательным контролем.
Фиг. 28. Показана схема способов идентификации специфических 1§-Н/1§-Ь после вакцинного дисплея.
Фиг. 29. Данные анализа активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и Нег2 на клетках НеЬа, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим специфические для Нег2 клоны (А) Ό5, (В) Ό8 и (С) Н2.
Фиг. 30. Показаны результаты ЕЬ1§А для трех специфических для Нег2 антител (МаЬ8287, МаЬ8290 и МаЬ9298).
Фиг. 31. Показаны результаты проточной цитометрии, показывающие специфичность для Нег2 на клетках 8КБК3 (Нег2+++) для МаЬ8289, МаЬ8293 и МаЬ8297.
Подробное описание
Настоящее изобретение в широком смысле относится к способам идентификации и/или получения функциональных, антигенспецифических молекул иммуноглобулинов или их антигенспецифических фрагментов (т.е. антигенсвязывающих фрагментов) в эукариотической системе, экспонированных на поверхности внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ), в форме слитого белка с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка. Кроме того, изобретение относится к способам идентификации полинуклеотидов, кодирующих антигенспецифическую молекулу иммуноглобулина или ее антигенспецифический фрагмент, из комплексных экспрессирующих библиотек полинуклеотидов, кодирующих такие молекулы или фрагменты иммуноглобулинов, где библиотеки конструируют и скринируют в эукариотической системе экспонированными на поверхности внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) в форме слитого белка с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка. Дополнительные варианты осуществления включают слитый белок, содержащий а) первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи человека, Ь) второй фрагмент полипептида, содержащий внеклеточный и трансмембранный домены специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка. В следующих вариантах осуществления слитый белок, как описано в настоящем документе, может включать связывающую молекулу, например антигенспецифическую часть иммуноглобулина или ее часть, например вариабельную область тяжелой цепи, которая при спаривании с подходящей легкой цепью иммуноглобулина связывается с интересующим антигеном.
Одним из аспектов настоящего изобретения является конструирование комплексных библиотек иммуноглобулинов в эукариотической системе, экспонированных на поверхности внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ), в форме слитого белка с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка.
Следует отметить, что единственное число объекта относится к одному или нескольким из этих объектов; например молекулу иммуноглобулина понимают как представляющую одну или более молекул иммуноглобулинов. Как таковые, термины один или более и по меньшей мере один можно использовать в настоящем документе взаимозаменяемо.
Термин эукариота или эукариотический организм предназначен, чтобы включать все организмы царств животных, растений и протистов, включая простейших, грибы, дрожжи, зеленые водоросли, одноклеточные растения, многоклеточные растения и всех животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. Термин не включает бактерии или вирусы. Эукариотическая клетка предназначена, чтобы включать отдельную эукариотическую клетку так же как множество эукариотических клеток, и включает клетки, происходящие из эукариот.
Термин позвоночное предназначен, чтобы включать единственное число позвоночное, так же как множественное позвоночные, и включает млекопитающих и птиц, так же как рыб, рептилий и земноводных.
Термин млекопитающее предназначен, чтобы включать единственное число млекопитающее и множественное млекопитающие, и включает, но без ограничения, человека; приматов, таких как обезьяны, мартышки, орангутанги и шимпанзе; псовых, таких как собаки и волки; кошачьих, таких как кошки, львы и тигры; лошадиных, таких как лошади, ослы и зебры, продовольственных животных, таких как коровы, свиньи и овцы; копытных, такие как олени и жирафы; грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и морские свинки; и медведей. В конкретных вариантах осуществления млекопитающее представляет собой субъекта-человека.
Термины культура тканей, или культура клеток, или культура, или культивирование относятся к поддержанию или выращиванию тканей или клеток растения или животного ίη νίίτο в условиях, позволяющих сохранение архитектуры клеток, сохранение функции клеток, дальнейшую дифференцировку или все три. Клетки первичной культуры представляют собой клетки, взятые непосредственно из ткани, т.е. популяцию клеток одного и того же вида, выполняющие одну и ту же функцию в организме. Обработкой таких клеток ткани протеолитическим ферментом трипсином, например, диссоциируют их на отдельные клетки первичной культуры, которые растут или сохраняют архитектуру клеток при рассеве на планшеты для культивирования.
Термин полинуклеотид относится к любому одному или нескольким фрагментам нуклеиновой
- 5 028164 кислоты или молекулам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в нуклеиновой кислоте или конструкции. Полинуклеотид, кодирующий полипептид субъединицы иммуноглобулина относится к полинуклеотиду, содержащему кодирующую область для такого полипептида. Кроме того, полинуклеотид может кодировать регуляторный элемент, такой как промотор или терминатор транскрипции, или может кодировать специфический элемент полипептида или белка, такой как секреторный сигнальный пептид или функциональный домен.
Как применяют в настоящем документе, термин идентичность относится к способам, в которых желательные молекулы, например полинуклеотиды, кодирующие молекулы иммуноглобулинов с желательной специфичностью или функцией, отделяют от множества или библиотеки таких молекул. Способы идентификации включают отбор и скрининг. Как применяют в настоящем документе, способами отбора являются те, в которых желательные молекулы можно непосредственно отделить от библиотеки. Например, в одном из способов отбора, описанных в настоящем документе, клетки-хозяева, содержащие желательные полинуклеотиды, непосредственно отделяют от клеток-хозяев, содержащих остальную библиотеку, посредством подвергания событию лизиса и, таким образом, высвобождения из субстрата, к которому прикреплены остальные клетки-хозяева. Как применяют в настоящем документе, способами скрининга являются те, в которых пулы, содержащие желательные молекулы, подвергают анализу, в котором можно детектировать желательную молекулу. Аликвоты пулов, в которые детектирована молекула, разделяют затем на последовательные меньшие пулы, которые анализируют сходным образом, пока не достигают пула, высокообогащенного желательной молекулой.
Иммуноглобулины.
Как применяют в настоящем документе, молекулу иммуноглобулина определяют как полный бимолекулярный иммуноглобулин, т.е. в основном содержащий четыре полипептида-субъединицы, т.е. две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи. В некоторых случаях, например, молекулы иммуноглобулинов, полученные из видов верблюдовых или сконструированные на основе иммуноглобулинов верблюдовых, полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей, без легких цепей (см., например, НатекСаМегтап е! а1., Яа1игс 363:446-448 (1993)). Таким образом, под полипептидом субъединицы иммуноглобулина понимают отдельный полипептид тяжелой цепи или отдельный полипептид легкой цепи. Молекулы иммуноглобулинов обозначают также как антитела, и термины используют взаимозаменяемо в настоящем документе. Выделенный иммуноглобулин относится к молекуле иммуноглобулина или двум или нескольким молекулам иммуноглобулинов, которые являются, по существу, удаленными от окружения белков и других веществ и которые связывают специфический антиген.
Тяжелая цепь, определяющая класс молекулы иммуноглобулина, является большей из двух полипептидов субъединиц и содержит вариабельную область и константную область. Под тяжелой цепью понимают либо полноразмерную секретированную форму тяжелой цепи, т.е. форму, высвобожденную из клетки, либо связанную с мембраной форму тяжелой цепи, т.е. содержащую пронизывающий мембрану домен, например слитые белки с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУспецифического мембранного белка. Классы иммуноглобулинов относятся к широким группам иммуноглобулинов, выполняющих различные функции в хозяине, например иммуноглобулины человека разделяют на пять классов, т.е. 1§С, содержащие тяжелую цепь γ, 1дМ, содержащие тяжелую цепь μ, 1дА, содержащие тяжелую цепь α, 1дЕ, содержащие тяжелую цепь ε, и 1§И, содержащие тяжелую цепь δ.
Под легкой цепью понимают меньшую субъединицу иммуноглобулина, связанную с Ν-концевой областью тяжелой цепи. Как и тяжелая цепь, легкая цепь содержит вариабельную область и константную область. Существует два различных вида легких цепей, к и λ, и эта пара может связываться с парой любых из различных тяжелых цепей с формированием молекулы иммуноглобулина.
Полипептиды субъединиц иммуноглобулинов, как правило, содержат константную область и вариабельную область. У большинства видов вариабельная область тяжелой цепи, или домен УН, и вариабельная область легкой цепи, или домен Уь, объединены с формированием определяющей комплементарность области или СИК, части молекулы иммуноглобулина, специфически узнающей антигенный эпитоп. Большой репертуар вариабельных областей, связанных с константными областями тяжелой и легкой цепи, образуется при дифференцировке продуцирующих антитело клеток в животном посредством реаранжировок серий зародышевых фрагментов ДНК, приводящим к образованию гена, кодирующего данную вариабельную область. Дальнейшие варианты вариабельных областей тяжелых и легких цепей имеют место в ходе соматических мутаций в дифференцированных клетках. Структура и образование ίη νίνο молекул иммуноглобулинов хорошо известна специалистам в области иммунологии. Краткие обзоры получения разнообразий иммуноглобулинов можно обнаружить, например, в Наг1оте апб Бапе, АпйЬойек, А ЬаЬога1огу Мапиа1 СоМ §ргшд НагЬог ЬаЬога1огу, СоМ §ргшд НагЬог, Ν.Υ. (1988) (далее в настоящем документе, Наг1о\у) и РоШ. е! а1., 1ттипо1о§у Со\уег Мебюа1 РиЬНкЫпд, ЬЙ., Ьопбоп (1985) (далее в настоящем документе, Кой). Полное содержание Наг1о\у апб Рой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
Как применяют в настоящем документе, антигенспецифический фрагмент молекулы иммуногло- 6 028164 булина представляет собой любой фрагмент или вариант молекулы иммуноглобулина, который остается способным связывать антиген. Антигенспецифические фрагменты включают, но без ограничения, РаЬ, РаЬ' и Р(аЬ')2, Рф одноцепочечные Ρν (δοΡν), одноцепочечные иммуноглобулины (например, где тяжелая цепь или ее часть и легкая цепь или ее часть являются слитыми), Ρν с дисульфидными связями (δάΡν), диатела, тритела, тетратела, минитела δοΡν. минитела РаЬ и димерные δοΡν и любые другие фрагменты, содержащие домен Уь и νΗ в такой конформации, что формируется специфическая СЭР.
Антигенспецифические фрагменты иммуноглобулинов могут содержать вариабельную область(области) отдельно или в сочетании с целой или частичной константной областью, например домен СН1, СН2, СН3 на тяжелой цепи и константный домен легкой цепи, например домен Ск или С%, или его часть на легкой цепи. В конкретных аспектах слитый белок, как описано в настоящем документе, содержит вариабельный домен тяжелой цепи, слитый с константным доменом СН1, слитым с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ΕΕν-специфического мембранного белка, например А56Р.
В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации, т.е. отбора или, альтернативно, скрининга полинуклеотидов, которые по отдельности или вместе кодируют антигенспецифические молекулы иммуноглобулинов или их антигенспецифические фрагменты. В конкретных вариантах осуществления представлен способ отбора молекулы иммуноглобулина с интересующей антигенной специфичностью, где иммуноглобулин или антитело экспонируют на поверхности ΕΕν, ΕΕν выделяют, и полинуклеотид, кодирующий часть иммуноглобулина, например область νΗ, выделяют.
В конкретных аспектах представлен способ отбора полинуклеотидов, кодирующих антигенспецифическую молекулу иммуноглобулина, где способ включает: 1) введение первой библиотеки полинуклеотидов в популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины. Библиотеку можно конструировать в векторе вируса осповакцины, например векторе ΕΕν, кодирующем множество слитых с иммуноглобулином полипептидов, где вектор вируса осповакцины содержит а) первый полинуклеотид, кодирующий первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи человека, например домен СН1-у, Ь) второй полинуклеотид, кодирующий второй фрагмент полипептида, содержащий внеклеточный и трансмембранный домены мембранного белка осповакцины, например фрагмент полипептида, содержащий трансмембранный домен ΕΕν-специфического мембранного белка, например А56Р, и с) третий полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина или его фрагмент. Способ дополнительно включает 2) введение в популяцию клеток-хозяев полинуклеотида, кодирующего легкую цепь, например известную легкую цепь или вторую библиотеку, содержащую множество полинуклеотидов, где каждый кодирует легкую цепь иммуноглобулина. После введения в популяцию клеток-хозяев слитый с иммуноглобулином полипептид можно объединять с легкой цепью иммуноглобулина для формирования антигенсвязывающей части молекулы иммуноглобулина, где молекула может быть экспрессирована или экспонирована на поверхности поддающейся отбору частицы, например вириона ΕΕν, продуцированного и высвобожденного клетками-хозяевами в окружающую среду. Способ далее включает отбор ΕΕν, высвобожденных из клеток-хозяев, которые связывают интересующий антиген, например, посредством антигенспецифического присоединения к планшету или к бусинам, например бусинам с белком О, бусинам со стрептавидином или тозилированным бусинам. ΕΕν, экспрессирующие интересующий антигенсвязывающий домен, можно затем извлекать и использовать для повторной инфекции новых клетки-хозяев, таким образом обогащая по ΕΕν, содержащим полинуклеотиды, кодирующие тяжелую цепь иммуноглобулина, связывающего интересующий антиген. Затем полинуклеотиды можно извлекать. Способ можно повторять, таким образом, обогащая по полинуклеотидам, кодирующим слитые с интересующей тяжелой цепью белки.
Выделенные полинуклеотиды, кодирующие слитые с полипептидом тяжелой цепи иммуноглобулина белки, связывающие интересующий антиген, можно затем переносить в клетки-хозяева и экспрессировать в клетках-хозяевах (в форме слитого белка ΕΕν или нет), в которых библиотеку полинуклеотидов, кодирующих вариабельные области легкой цепи иммуноглобулина, сливают с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ΕΕν-специфического мембранного белка, таким образом, позволяя идентификацию полинуклеотида, кодирующего вариабельную область легкой цепи, которая при объединении с вариабельной областью тяжелой цепи, идентифицированной на первой стадии, формирует функциональную молекулу иммуноглобулина, или ее фрагмент, узнающую специфический антиген.
Как применяют в настоящем документе, библиотека представляет собой репрезентативное семейство полинуклеотидов, т.е. группу полинуклеотидов, родственных через, например, их происхождение из одного вида животного, типа ткани, органа или типа клеток, где библиотека вместе содержит по меньшей мере два различных вида в пределах данного семейства полинуклеотидов. Библиотека полинуклеотидов может содержать по меньшей мере 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 различных видов в пределах данного семейства полинуклеотидов. Семейство может представлять собой родственные молекулы, например вариабельные области иммуноглобулинов, например домены νΗ или домены УЪ имму- 7 028164 ноглобулина человека. Домены УН и УЬ могут представлять весь репертуар вариабельных доменов или могут уже являться антигенспецифическими, например специфическими для одного и того же антигена. Более конкретно, библиотека может кодировать множество полипептидов субъединицы иммуноглобулина, т.е. либо полипептидов субъединицы тяжелой цепи, либо полипептидов субъединицы легкой цепи. В этом контексте библиотека может содержать полинуклеотиды из общего семейства, где семейство представляет собой полинуклеотиды, кодирующие полипептид субъединицы иммуноглобулина конкретного типа и класса, например библиотека может кодировать тяжелую цепь μ, γ-1, γ-2, γ-3, γ-4, α-1, α-2, ε или δ человека, или легкую цепь к или λ человека. Хотя каждый член любой одной библиотеки может кодировать одну и ту же константную область тяжелой или легкой цепи, библиотека совместно может содержать по меньшей мере две или по меньшей мере 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 различных вариабельных областей, т.е. множество вариабельных областей, связанных с общей константной областью.
В других вариантах осуществления библиотека может кодировать множество одноцепочечных фрагментов иммуноглобулинов, содержащих вариабельную область, такую как вариабельная область легкой цепи или вариабельная область тяжелой цепи, или может содержать как вариабельную область легкой цепи, так и вариабельную область тяжелой цепи.
В одном аспекте представлен способ получения библиотек полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц иммуноглобулинов. Кроме того, представлены библиотеки полипептидов субъединиц иммуноглобулинов, сконструированных в форме слитых белков в эукариотических экспрессирующих векторах, например ЕЕУ, где полипептид субъединицы иммуноглобулина слит с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка, например Ά56Κ
Под клеткой-реципиентом, или клеткой-хозяином, или клеткой понимают клетку или популяцию клеток, в которые введены библиотеки полинуклеотидов, как описано в настоящем документе. Пригодными клетками-хозяевами для библиотек, описанных в настоящем документе, являются эукариотические клетки, пермиссивные для инфекции вирусом осповакцины. Пригодные линии клеток могут представлять собой клетки или линии клеток позвоночных, млекопитающих, грызунов, мыши, примата или человека.
Под популяцией клеток-хозяев понимают группу культивированных клеток, в которых библиотека, как представлено в настоящем документе, может быть введена и экспрессирована. Клетки-хозяева для библиотек ЕЕУ, как описано в настоящем документе, могут являться пермиссивными для инфекции вируса осповакцины. Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут являться адгерентными, т.е. клетками-хозяевами, которые растут прикрепленными к твердому субстрату, или, альтернативно, клеткихозяева могут находиться в суспензии.
Как отмечено выше, конкретные способы идентификации молекул иммуноглобулинов включают введение первой библиотеки полинуклеотидов (кодирующей, например, слитый белок УН-СН1-А56К) в популяцию клеток-хозяев, так же как второй библиотеки полинуклеотидов (например, кодирующей область УЬ) в одну и ту же популяцию клеток-хозяев. Первая и вторая библиотеки являются комплементарными, т.е. если первая библиотека кодирует вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, вторая библиотека может кодировать вариабельные домены легкой цепи иммуноглобулина, таким образом, позволяя сборку молекул иммуноглобулинов, или их антигенспецифических фрагментов, в популяции клеток-хозяев, так что иммуноглобулины являются экспрессированными или экспонированными, на поверхности ЕЕУ.
Полинуклеотиды, содержащиеся в библиотеках, описанных в настоящем документе, могут кодировать полипептиды субъединиц иммуноглобулинов посредством функциональной связи с областью контроля транскрипции. Одна или более молекулы нуклеиновой кислоты в данном полинуклеотиде являются функционально связанными, когда они помещены в функциональную взаимосвязь. Эта взаимосвязь может присутствовать между кодирующей областью для полипептида и регуляторной последовательностью(ями), соединенными таким способом, чтобы позволять экспрессию кодирующей области, когда подходящие молекулы (например, белки-активаторы транскрипции, полимеразы и т.д.) связываются с регуляторной последовательностью(ями). Области контроля транскрипции включают, но без ограничения, промоторы, энхансеры, операторы и сигналы терминации транскрипции, и включены в полинуклеотид для управления его транскрипцией. Например, промотор является функционально связанным с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид субъединицы иммуноглобулина, если промотор способен вызывать транскрипцию этой молекулы нуклеиновой кислоты. Как правило, функционально связанный означает, что последовательности ДНК являются соседними или близко соединенными в полинуклеотиде. Однако некоторые области контроля транскрипции, например энхансеры, не обязательно должны являться соседними.
Под контрольными последовательностями или контрольными областями понимают последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанных кодирующих последовательностей в конкретном организме-хозяине. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы,
- 8 028164 сигналы полиаденилирования и/или энхансеры.
Множество областей контроля транскрипции известны специалистам в данной области. Как более подробно обсуждают ниже, пригодные области контроля транскрипции включают промоторы, способные функционировать в цитоплазме инфицированных поксвирусом клеток.
В конкретных вариантах осуществления слитый белок, как описано в настоящем документе, может содержать линкер, например, соединяющий вариабельный домен иммуноглобулина с константным доменом, например доменом СН1, С-κ или С-λ, и/или соединяющий константный домен с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка, например Ά56Κ. Линкер может содержать, например, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 10 или по меньшей мере приблизительно 15 аминокислот. Пригодные линкеры может идентифицировать специалист в данной области.
Когда слитый белок, описанный в настоящем документе, содержит константную область тяжелой цепи, например домен СН1, можно использовать любую константную область тяжелой цепи, включая, но без ограничения, тяжелые цепи иммуноглобулинов из позвоночных, таких как птицы, рыбы или млекопитающие, например тяжелые цепи иммуноглобулина человека. Например, тяжелые цепи иммуноглобулина человека или их часть, например домен СН1, могут представлять собой тяжелую цепь μ или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дМ, тяжелую цепь γ-1 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дС1, тяжелую цепь γ-2 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дС2, тяжелую цепь γ-3 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дС3, тяжелую цепь γ-4 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дС4, тяжелую цепь α-1 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дА1, тяжелую цепь α-2 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дА2, тяжелую цепь 8 или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1дЕ, или тяжелую цепь δ или ее фрагмент, т.е. тяжелую цепь иммуноглобулина 1§Э.
Связанные с мембраной слитые белки, как описано в настоящем документе, могут являться заякоренными на поверхности частицы, например частицы вируса (или вириона) осповакцины, например частицы (или вириона) ЕЕУ, посредством трансмембранного домена, слитого с полипептидом тяжелой цепи. В конкретных вариантах осуществления трансмембранный домен представляет собой часть фрагмента полипептида, содержащего трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка, т.е. белка, экспрессированного на поверхности внеклеточного оболочечного вируса осповакцины, но не на внутриклеточных частицах вируса осповакцины. В конкретных вариантах осуществления ЕЕУспецифический мембранный белок представляет собой А56К, белок НА осповакцины. Под внутриклеточным доменом, цитоплазматическим доменом, цитозольной областью или родственными терминами, которые используют взаимозаменяемо в настоящем документе, понимают часть слитого полипептида, которая находится внутри клетки.
В тех вариантах осуществления, где слитый белок или другой белок библиотеки содержит легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, можно использовать любую легкую цепь иммуноглобулина, из любого вида животных, например легкие цепи иммуноглобулинов из позвоночных, таких как птицы, рыбы, или млекопитающие, например легкие цепи человека, например легкие цепи κ и λ человека. Легкая цепь может связываться с тяжелой цепью с получением антигенсвязывающего белка из молекулы иммуноглобулина.
Каждый член библиотеки полинуклеотидов, кодирующих слитые белки тяжелой цепи, как описано в настоящем документе, может содержать а) первую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую первый фрагмент полипептида, содержащий константную область иммуноглобулина, общую для всех членов библиотеки, например домен СН1, например домен СН1 γ или μ, Ь) вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую второй фрагмент полипептида, содержащий внеклеточный и трансмембранный домены специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка (например, А56К), где вторая молекула нуклеиновой кислоты находится непосредственно ниже и в рамке считывания с первой молекулой нуклеиновой кислоты (либо слитая напрямую, либо соединенная посредством линкера), и с) третью молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую третий фрагмент полипептида, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, где третья молекула нуклеиновой кислоты находится непосредственно ниже и в рамке считывания с первой молекулой нуклеиновой кислоты (либо слитая напрямую, либо соединенная посредством линкера).
Каждый член библиотеки полинуклеотидов, кодирующих слитые с легкой цепью белки, как описано в настоящем документе, может содержать а) первую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую первый фрагмент полипептида, содержащий константную область иммуноглобулина, общую для всех членов библиотеки, например домен С-κ или С-λ, Ь) вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую второй фрагмент полипептида, содержащий внеклеточный и трансмембранный домены специфического для внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ) мембранного белка (например, А56К), где вторая молекула нуклеиновой кислоты находится непосредственно ниже и в рамке считывания с первой молекулой нуклеиновой кислоты (либо слитая напрямую, либо соединенная посредством линкера), и с) третью молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую третий фрагмент полипептида, содержащий
- 9 028164 вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, где третья молекула нуклеиновой кислоты находится непосредственно ниже и в рамке считывания с первой молекулой нуклеиновой кислоты (либо слитая напрямую, либо соединенная посредством линкера).
Библиотеки тяжелых цепей или легких цепей иммуноглобулинов, не слитых с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка, можно использовать для совместной инфекции клеток-хозяев для обеспечения комплементарной цепи иммуноглобулина для получения функционального антигенсвязывающего фрагмента иммуноглобулина. Такие библиотеки подробно описаны, например, в патенте США № 7858559.
Библиотеки полинуклеотидов, кодирующие вариабельные области тяжелой или легкой цепи, могут содержать множество, т.е. по меньшей мере две, или по меньшей мере 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 или 109 различных вариабельных областей. Как хорошо известно специалистам в данной области, вариабельная область легкой цепи кодирована реаранжированными молекулами нуклеиновой кислоты, где каждая содержит область Уъ легкой цепи, конкретно, область Ук или область У и область ί легкой цепи, конкретно, область ίκ или область &. Сходным образом, вариабельная область тяжелой цепи кодирована реаранжированными молекулами нуклеиновой кислоты, где каждая содержит область УН тяжелой цепи, область Ό и область Т Эти реаранжировки имеют место на уровне ДНК при дифференцировке клеток. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, можно получать, например, посредством ПЦР из зрелых В-клеток и плазматических клеток, прошедших терминальную дифференцировку для экспрессии антитела со специфичностью для конкретного эпитопа. Более того, если желательны антитела к специфическому антигену, вариабельные области можно выделять из зрелых В-клеток и плазматических клеток животного, иммунизированного этим антигеном, и вследствие этого продуцирующего расширенный репертуар вариабельных областей антитела, взаимодействующих с антигеном. Альтернативно, если желательна более разнообразная библиотека, вариабельные области можно выделять из клеток-предшественников, например, пре-В-клеток и незрелых В-клеток, которые подверглись реаранжировке генов иммуноглобулинов, но не подвергались воздействию антигена, собственного или несобственного. Например, вариабельные области можно выделять посредством ОТ-ПЦР из нормального костного мозга человека, пулированного от многих доноров. Альтернативно, вариабельные области могут являться синтетическими, например полученными в лаборатории посредством получения синтетических олигонуклеотидов, или могут быть получены посредством манипуляций ίη νίΐτο зародышевой ДНК, приводящим к реаранжировке генов иммуноглобулинов.
В дополнение к первой и второй молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим константные области и вариабельные области иммуноглобулинов соответственно, где каждый член библиотеки полинуклеотидов по настоящему изобретению, как описано выше, может дополнительно содержать дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, непосредственно выше молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область, и в рамке с ней.
Под сигнальным пептидом понимают полипептидную последовательность, которая, например, направляет транспорт образующегося полипептида субъединицы иммуноглобулина к поверхности клеток-хозяев. Сигнальные пептиды обозначают также в данной области как сигнальные последовательности, лидерные последовательности, секреторные сигнальные пептиды или секреторные сигнальные последовательности. Сигнальные пептиды в норме экспрессируются как часть полного или незрелого полипептида и в норме расположены на Ν-конце.
Все клетки, включая клетки-хозяева по настоящему изобретению, обладают конститутивным секреторным путем, где белки, включая секретированные полипептиды субъединиц иммуноглобулинов, предназначенные для экспорта, секретируются из клетки. Эти белки проходят через путь процессинга в ЭРГольджи, где могут происходить модификации. Если дополнительных сигналов не детектировано на белке, он направляется к поверхности клеток для секреции или вставки в качестве интегрального компонента мембраны, экспрессированного на поверхности клетки-хозяина или вирусной частицы, например вириона ЕЕУ. Связанные с мембраной формы полипептидов субъединиц иммуноглобулинов первоначально следуют по тому же самому пути, как секретированные формы, проходя через просвет ЭР, за исключением того, что они остаются в мембране ЭР из-за присутствия сигналов остановки транспорта или трансмембранных доменов. Трансмембранные домены представляют собой гидрофобные фрагменты из приблизительно 20 аминокислотных остатков, принимающие конформацию альфа-спирали при пересечении ими мембраны. Погруженные в мембрану белки заякорены в фосфолипидном бислое плазматической мембраны. Как и у секретируемых белков, Ν-концевые области трансмембранных белков имеют сигнальный пептид, который проходит через мембрану и отщепляется при выходе в просвет ЭР.
Вновь синтезированные тяжелые цепи иммуноглобулинов удерживаются для нахождения в ЭР белком-шапероном, называемым ΒιΡ (член семейства молекулярных шаперонов Н8р70). Спаривание домена СН1 тяжелой цепи с доменом СЬ ее партнера - легкой цепи индуцирует диссоциацию ΒιΡ, окончательное сворачивание и образование дисульфидных связей, и выход собранного антитела из ЭР. Затем антитело использует нормальный путь секреции клетки и движется через аппарат Гольджи к поверхности клетки, где оно либо секретируется, либо остается на поверхности (если антитело обладает трансмембранным
- 10 028164 доменом) (см. Оате1 е1 а1., Мо1еси1аг Се11 34:635-36 (2009)).
Пригодные сигнальные пептиды, представленные в настоящем документе, могут представлять собой либо природные сигнальные пептиды иммуноглобулина, т.е. кодированные последовательностью, являющейся частью природного транскрипта тяжелой или легкой цепи, либо функциональное производное этой последовательности, сохраняющее способность управлять секрецией полипептида субъединицы иммуноглобулина, функционально связанной с ним. Альтернативно, можно использовать гетерологичный сигнальный пептид или его функциональное производное. В конкретных аспектах сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид белка А56К вируса осповакцины или его функциональное производное.
В других аспектах члены библиотеки полинуклеотидов, как описано в настоящем документе, могут, кроме того, содержать дополнительные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие гетерологичные полипептиды. Такие дополнительные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие гетерологичные полипептиды, могут находиться выше или ниже молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих вариабельный или константный домен иммуноглобулина, или ЕЕУ-специфический мембранный белок.
Гетерологичный полипептид, кодируемый дополнительной молекулой нуклеиновой кислоты, может представлять собой последовательность спасения. Последовательность спасения представляет собой последовательность, которую можно использовать для очистки или выделения либо иммуноглобулина, либо его фрагмента, либо кодирующего его полинуклеотида. Таким образом, например, последовательности спасения пептида включают последовательности для очистки, такие как метка 6-Ηίκ для использования с аффинными колонками с №, и метки-эпитопы для детекции, иммунопреципитации или РАС8 (активированной флуоресценцией сортировки клеток). Пригодные метки-эпитопы включают тус (для использования с коммерчески доступным антителом 9Е10), последовательность-мишень для биотинилирования В8Р из бактериального фермента В1тА, метки йи, Ь-асЛ и С8Т. Дополнительная молекула нуклеиновой кислоты может также кодировать пептидный линкер.
Полинуклеотиды, содержащиеся в различных библиотеках, описанных в настоящем документе, можно вводить в пригодные клетки-хозяева. Пригодные клетки-хозяева могут характеризоваться, например, по способности экспрессировать молекулы иммуноглобулинов, присоединенные к их поверхности, или по пермиссивности для инфекционности вируса осповакцины. Полинуклеотиды можно вводить в клетки-хозяева способами, хорошо известными специалистам в данной области. Когда полинуклеотид является частью вирусного вектора, например вируса осповакцины, введение в клетки-хозяева удобно осуществляют посредством общепринятой инфекции.
Первую и вторую библиотеки полинуклеотидов можно вводить в клетки-хозяева в любом порядке или одновременно. Например, если первая и вторая библиотеки полинуклеотидов обе сконструированы в векторах вируса осповакцины, инфекционных или инактивированных, векторы можно вводить посредством одновременной инфекции в форме смеси или можно вводить в последовательных инфекциях. Если одна библиотека сконструирована в векторе вируса осповакцины, и вторая сконструирована в плазмидном векторе, введение можно осуществлять посредством введения одной библиотеки перед другой.
После введения в клетки-хозяева первой и второй библиотек полинуклеотидов обеспечивают появление экспрессии молекул иммуноглобулинов или их антигенспецифических фрагментов на поверхности ЕЕУ. Под обеспечивать появление экспрессии понимают позволять векторам, введенным в клеткихозяева, подвергаться транскрипции и трансляции полипептидов субъединиц иммуноглобулинов, позволяя клеткам-хозяевам транспорт полностью собранных молекул иммуноглобулинов или их антигенспецифических фрагментов к поверхности мембраны в форме слитого белка с фрагментом полипептида, содержащим трансмембранный домен ЕЕУ-специфического мембранного белка. Как правило, обеспечение экспрессии требует инкубации клеток-хозяев, в которые введены полинуклеотиды, в пригодных условиях, чтобы позволять экспрессию. Эти условия и время, необходимое, чтобы позволять экспрессию, могут меняться на основании выбора клетки-хозяина и выбора векторов, как хорошо известно специалистам в данной области.
В конкретных вариантах осуществления затем проводят контакт с антигеном клеток-хозяев и/или вирионов осповакцины, которым позволили экспрессировать молекулы иммуноглобулинов на своей поверхности, или растворимых молекул иммуноглобулинов, секретированных в культуральную среду. Как применяют в настоящем документе, антиген представляет собой любую молекулу, которая может специфически связываться с антителом, молекулой иммуноглобулина или ее антигенспецифическим фрагментом. Под специфически связываться понимают, что антиген связывается с СЭК антитела. Часть антигена, которая специфически взаимодействует с СЭК. представляет собой эпитоп или антигенную детерминанту. Антиген может содержать один эпитоп, но, как правило, антиген содержит по меньшей мере два эпитопа, и может включать любое количество эпитопов в зависимости от размера, конформации и типа антигена.
Антигены, как правило, представляют собой пептиды или полипептиды, но могут представлять собой любую молекулу или соединение. Например, органическое соединение, например динитрофенол или Э\Р, нуклеиновая кислота, углевод или смесь любых из этих соединений либо с пептидом, либо с полипептидом, либо без, может являться пригодным антигеном. Считают, что минимальный размер пептид- 11 028164 ного или полипептидного эпитопа составляет приблизительно четыре-пять аминокислот. Пептидные или полипептидные эпитопы могут содержать по меньшей мере семь, по меньшей мере девять или от по меньшей мере приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот. Поскольку СОК может узнавать антигенный пептид или полипептид в его третичной форме, аминокислоты, содержащие эпитоп, не обязательно должны являться непрерывными, и в некоторых случаях могут даже не находиться на одной и той же пептидной цепи. По настоящему изобретению пептидные или полипептидные антигены могут содержать последовательность из по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 и от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот. В конкретных вариантах осуществления пептиды или полипептиды, содержащие антигенные эпитопы, или, альтернативно, состоящие из антигенных эпитопов, имеют длину по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 аминокислотных остатков. Антиген может находиться в любой форме и может являться свободным, например растворенным в растворе, или может являться присоединенным к какому-либо субстрату. Пригодные субстраты описаны в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления антиген может являться частью экспрессирующего антиген вируса осповакцины, например вириона ЕЕУ, как более подробно описано ниже.
Молекулы иммуноглобулинов, специфические для любого антигена, можно получать способами, описанными в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления антигены представляют собой собственные антигены, т.е. антигены, происходящие из того же вида, что и полученные молекулы иммуноглобулинов. В качестве примера может являться желательным получать антитела человека, нацеленные на антигены опухолей человека. Другие желательные собственные антигены включают, но без ограничения, цитокины, рецепторы, лиганды, гликопротеины и гормоны.
Антитела, нацеленные на антигены инфекционных агентов, также можно идентифицировать и отбирать описанными способами. Примеры таких антигенов включают, но без ограничения, антигены бактерий, антигены вирусов, антигены паразитов и антигены грибов.
В конкретных схемах отбора и скрининга, в которых молекулы иммуноглобулинов экспрессированы на поверхности ЕЕУ, осуществляют контакт рекомбинантных вирионов ЕЕУ, полученных, как описано, с антигеном, способом, который позволяет антигену, специфически узнающему СОК молекулы иммуноглобулина, экспрессированную на поверхности ЕЕУ, связывать СОК, таким образом позволяя отделять рекомбинантные вирионы ЕЕУ, специфически связывающие антиген, от тех вирионов ЕЕУ, которые не связывают антиген. Включен любой способ, позволяющий рекомбинантным вирионам ЕЕУ, экспрессирующим антигенспецифический связывающий домен антитела, взаимодействовать с антигеном. Например, если вирионы ЕЕУ находятся в суспензии, и антиген прикреплен к твердому субстрату, рекомбинантные вирионы ЕЕУ, специфически связывающиеся с антигеном, можно удерживать на твердом субстрате, позволяя отмывку тех вирионов, которые не связывают антиген, и затем извлечение связанных рекомбинантных вирионов ЕЕУ. Способы, посредством которых обеспечивают контакт рекомбинантных вирионов ЕЕУ с антигеном, описаны в настоящем документе.
После извлечения рекомбинантных вирионов ЕЕУ, специфически связывающих антиген, полинуклеотиды из первой библиотеки можно извлекать из этих вирионов ЕЕУ. Под извлечением понимают грубое отделение желательного компонента от тех компонентов, которые не являются желательными. Например, рекомбинантные вирионы ЕЕУ, связывающие антиген, можно извлекать на основании их прикрепления к покрытым антигеном твердым субстратам, например магнитным бусинам, которые затем можно отделять с помощью магнита.
Извлечение полинуклеотидов можно осуществлять любым общепринятым способом, известным специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотиды извлекают посредством сбора инфекционных вирионов ЕЕУ, связывающих антиген.
Как ясно понятно специалисту в данной области, идентификация полинуклеотидов, кодирующих слитые с иммуноглобулином полипептиды, может требовать двух или более циклов отбора, как описано выше, и может обязательно требовать двух или более циклов скрининга, как описано выше. Однократный цикл отбора может не обязательно приводить к выделению чистого набора полинуклеотидов, кодирующих желательные первые слитые с иммуноглобулином полипептиды; смесь, полученная после первого цикла, может являться обогащенной по желательным полинуклеотидам, но может также является загрязненной не являющимися мишенями последовательностями вставок.
Соответственно первую стадию отбора, как описано, можно или нужно повторять один или более раз, таким образом обогащая по полинуклеотидам, кодирующим желательные слитые с иммуноглобулином полипептиды. Для повтора первой стадии этого варианта осуществления ЕЕУ, содержащие эти полинуклеотиды, извлеченные, как описано выше, можно вводить посредством инфекции в популяцию клеток-хозяев. Вторую библиотеку полинуклеотидов также вводят в эти клетки-хозяева, например, посредством инфекции вирусом осповакцины, способным экспрессировать комплементарные молекулы иммуноглобулинов (например, легкие цепи), кодируемые полинуклеотидами в библиотеке, и обеспечивают экспрессию молекул иммуноглобулинов или их антигенспецифических фрагментов на поверхности мембраны рекомбинантных вирионов ЕЕУ. Сходным образом осуществляют контакт рекомбинантных
- 12 028164 вирионов ΕΕν с антигеном, и полинуклеотиды из первой библиотеки снова извлекают из вирионов ΕΕν, экспрессирующих молекулу иммуноглобулина, специфически связывающую антиген. Эти стадии можно повторять один или более раз, получая в результате обогащение по полинуклеотидам, происходящим из первой библиотеки, кодирующим слитый с иммуноглобулином полипептид, который в качестве части молекулы иммуноглобулина или ее антигенспецифического фрагмента, пецифически связывает антиген и/или обладает желательной функциональной характеристикой.
После приемлемого обогащения по желательным полинуклеотидам из первой библиотеки, как описано выше, те полинуклеотиды, которые были извлечены, выделяют, т.е. в основном отделяют от их природного окружения и по большей части отделяют от полинуклеотидов в библиотеке, не кодирующих антигенспецифические слитые с иммуноглобулином полипептиды. Например, клонированные полинуклеотиды, содержащиеся в векторе, считают выделенными. Понятно, что два или более различных слитых с иммуноглобулином полипептидов, которые при сочетании, например, с легкой цепью специфически связывают один и тот же антиген, можно выделять способами, описанными в настоящем документе. Соответственно смесь полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, связывающие один и тот же антиген, также считают выделенными. Дополнительные примеры выделенных полинуклеотидов включают полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах, в рекомбинантной осповакцине, например вирионах ΕΕν, или очищенные (частично или в основном) молекулы ДНК в растворе. Однако полинуклеотид, содержащийся в клоне, который является членом смешанной библиотеки и который не был отделен от других клонов библиотеки, например, посредством кодируемого антигенспецифического слитого с иммуноглобулином полипептида, не является выделенным для целей по этому изобретению. Например, полинуклеотид, содержащийся в вирусном векторе, является выделенным после его извлечения и, необязательно, очистки из отдельной бляшки.
Принимая во внимание, что антиген может содержать два или более эпитопов, и несколько различных молекул иммуноглобулинов могут связывать любой данный эпитоп, предусматривают, что на первой стадии этого варианта осуществления можно выделять несколько подходящих полинуклеотидов, например два, три, четыре, пять, десять, 100 или более полинуклеотидов, все из которых могут кодировать слитый с иммуноглобулином полипептид, который, при сочетании с пригодным полипептидом субъединицы иммуноглобулина, кодируемым предварительно отобранным полинуклеотидом или полинуклеотидом из второй библиотеки, может формировать молекулу иммуноглобулина или ее антигенсвязывающий фрагмент, способный специфически связывать интересующий антиген. Предусматривают, что каждый различный полинуклеотид, извлеченный из первой библиотеки, выделяют отдельно.
После выделения одного или более пригодных полинуклеотидов из первой библиотеки на второй стадии этого варианта осуществления во второй библиотеке идентифицируют один или более полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц иммуноглобулинов, способные связываться со слитым с иммуноглобулином полипептидом(полипептидами), кодируемыми полинуклеотидами, выделенными из первой библиотеки, с формированием молекулы иммуноглобулина или ее антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающего интересующий антиген.
В настоящем документе представлены векторы вируса осповакцины для экспрессии антигенсвязывающих молекул, где антигенсвязывающую молекулу, например вариабельную область тяжелой цепи и СН1 иммуноглобулина, экспрессируют в форме слитого белка с ΕΕν-специфическим мембранным белком. В конкретных вариантах осуществления тяжелые цепи можно извлекать в форме слитых белков ΕΕν, и библиотеки легких цепей, или отдельные предварительно отобранные легкие цепи можно экспрессировать в форме растворимых белков в вирусе осповакцины или других векторах, например плазмидных векторах.
В конкретных аспектах можно проводить инактивацию вирусов, экспрессирующих растворимую комплементарную цепь, например легкую цепь, с помощью 4'-аминометилтриоксалена (псоралена) и затем подвергание вирусного вектора воздействию ультрафиолетового (УФ) света. Инактивация вирусов псораленом и УФ хорошо известна специалистам в данной области (см., например, Ткиид, К., с1 а1., 1. νίτοί. 70:165-171 (1996), содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.
Возможность сборки и экспрессии молекул иммуноглобулинов или их антигенспецифических фрагментов в эукариотических клетках из двух библиотек полинуклеотидов, кодирующих полипептиды субъединиц иммуноглобулинов, где одна субъединица экспрессирована в форме слитого белка с ΕΕνспецифическим мембранным белком, обеспечивает значительное улучшение по сравнению со способами получения одноцепочечных антител в бактериальных системах, в том, что способ двухстадийного отбора может являться основой для отбора молекул иммуноглобулинов или их антигенспецифических фрагментов со множеством специфичностей.
Векторы осповакцины ΕΕν.
Поксвирусы являются уникальными среди ДНК-вирусов, поскольку они реплицируются только в цитоплазме клетки-хозяина вне ядра. В ходе своего цикла репликации вирус осповакцины образует четыре инфекционные формы, различающиеся своими внешними мембранами: внутриклеточный зрелый вирион (ΙΜν), внутриклеточный оболочечный вирион (ΙΕν), ассоциированный с клетками оболочечный
- 13 028164 вирион (СЕУ) и внеклеточный оболочечный вирион (ЕЕУ). Преобладающей точкой зрения является то, что ΣΜΥ состоит из одиночной липопротеиновой мембраны, в то время как СЕУ и ΕΕΥ оба окружены двумя слоями мембраны, и 1ЕУ имеет три оболочки. ЕЕУ слущивается с плазматической мембраны клетки-хозяина, и мембрана ЕЕУ происходит из транс-Г ольджи.
После инфекции вирус теряет свою мембрану(ы) и сердцевина ДНК/белок транспортируется вдоль микротрубочек в клетку. Белки, кодируемые ранними мРНК осповакцины (ранние определяют как репликацию пре-ДНК), приводят к лишенной оболочки сердцевине осповакцины и последующей репликации ДНК. Эта репликация происходит в том, что названо вирусными фабриками, в основном расположенными поверх ЭР. Внутри вирусной фабрики незрелые вирионы (1У) собираются и процессируются для формирования 1МУ (внутриклеточного зрелого вируса). 1МУ содержат мембрану, происходящую из ЭР. Большинство 1МУ высвобождаются из клетки посредством лизиса клетки. Некоторые 1МУ транспортируются по микротрубочкам к участкам оборачивания мембранами транс-сети Гольджи или ранних эндосом. Оборачивание частиц 1МУ двойной мембраной образует форму осповакцины, называемую 1ЕУ (внутриклеточным оболочечным вирусом). Затем 1ЕУ транспортируются к поверхности клеток по микротрубочкам. Внешняя мембрана 1ЕУ сливается с плазматической мембраной для экспонирования СЕУ (ассоциированного с клетками оболочечного вируса) на поверхности клеток. Полимеризация актина из клетки-хозяина может направлять СЕУ на инфекцию соседних клеток или вирус может высвобождаться в форме ЕЕУ (см., например, Ктш Ь. РоЪегй апб СеоГГгеу Ь. Бшйй. Ττβηάδ ίη МютоЪю1оду 16 (10):472-479 (2008); СеоГГгеу Ь. БшйЬ, е! а1., 1оитпа1 оГ Сепега1 У1то1оду 83:2915-2931 (2002).
По меньшей мере шесть кодируемых вирусом белков опубликовано в качестве компонентов оболочки ЕЕУ. Из них четыре белка (Л33К, Л34К, Л56К и В5К) представляют собой гликопротеины, один (Л36К) представляет собой негликозилированный трансмембранный белок, и один (Р13Ь) представляет собой пальмитилированный периферический мембранный белок (см., например, Богеп/о е! а1., 1оитпа1 оГ У1то1оду 74(22) :10535 (2000)). В ходе инфекции эти белки локализуются в комплексе Гольджи, где они встраиваются в инфекционный вирус, который затем транспортируется и высвобождается во внеклеточную среду. Как представлено в настоящем документе, слитые с иммуноглобулином полипептиды, например вариабельные тяжелые цепи, являются связанными с мембраной ЕЕУ, например, в форме слитого белка с ЕЕУ-специфическим мембранным белком, например Л56К
Слитые белки ЕЕУ, как представлено в настоящем документе, можно экспрессировать в любом пригодном вирусе осповакцины. В конкретных вариантах осуществления ДНК, кодирующую слитый белок ЕЕУ, можно вставлять в область генома вируса осповакцины, не являющуюся необходимой для роста и репликации вектора, так что образуются инфекционные вирусы. Хотя охарактеризовано множество не являющихся необходимыми областей генома вируса осповакцины, наиболее широко используемым локусом для вставки чужеродных генов является локус тимидинкиназы, локализованный во фрагменте генома ΗίηάΙΙΙ 1.
Библиотеки полинуклеотидов, кодирующих слитые с иммуноглобулином полипептиды, вставляют в векторы вируса осповакцины с функциональной связью с областью контроля транскрипции, функционирующей в цитоплазме инфицированных поксвирусом клеток.
Области контроля транскрипции поксвируса содержат промотор и сигнал терминации транскрипции. Экспрессия генов в поксвирусах регулируется в зависимости от времени, и промоторы для ранних, промежуточных и поздних генов обладают различными структурами. Конкретные гены поксвируса экспрессируются конститутивно, и промоторы для этих ранне-поздних генов несут гибридные структуры. Разработаны также синтетические ранне-поздние промоторы (см. Наттопб ΕΜ., е! а1., 1, Уио1. МеОюЛ 66:135-8 (1997); СйакгаЪагй 8., е! а1., ВюГесйтдиек 25:1094-7 (1997)). Для вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, можно использовать любой промотор поксвируса, но использование ранних, поздних или конститутивных промоторов может являться желательным на основании выбранных клетки-хозяина и/или схемы отбора. В конкретных вариантах осуществления используют конститутивные промоторы. Пригодным промотором для использования в способах, описанных в настоящем документе, является ранний/поздний промотор 7,5-кДа или ранний/поздний промотор Η5 (или их варианты).
Способ тримолекулярной рекомбинации.
Традиционно, поксвирусные векторы, такие как вирус осповакцины, не использовали для идентификации ранее неизвестных представляющих интерес генов из комплексных библиотек, поскольку высокоэффективный образующий высокие титры способ конструирования и скрининга библиотек не существовал для осповакцин. Общепринятые способы экспрессии гетерологичного белка в вирусе осповакцины включают гомологичную рекомбинацию ίη νί\Ό и прямое лигирование ίη уйго. С использованием гомологичной рекомбинации эффективность получения рекомбинантного вируса лежит в диапазоне приблизительно 0,1% или менее. Хотя эффективность получения рекомбинантного вируса с использованием прямого лигирования выше, получаемого в результате титр, является относительно низким. Таким образом, использование вектора вируса осповакцины было ограничено клонированием ранее выделенной ДНК для целей экспрессии белка и разработки вакцины.
Тримолекулярная рекомбинация, как описано 2аибетет в публикации РСТ № ЛО 00/028016 и в па- 14 028164 тенте США № 7858559, является высокоэффективным образующим высокие титры способом для получения библиотек в вирусе осповакцины. С использованием способа тримолекулярной рекомбинации заявитель настоящего изобретения достиг получения рекомбинантных вирусов с эффективностью по меньшей мере 90% и титрами по меньшей мере на 2 порядка диапазона выше, чем титры, полученные прямым лигированием.
В конкретных вариантах осуществления библиотеки полинуклеотидов, способные экспрессировать слитые с иммуноглобулином полипептиды, как описано в настоящем документе, можно конструировать в поксвирусных векторах, например векторах вируса осповакцины, посредством тримолекулярной рекомбинации.
В конкретных вариантах осуществления представлена транспортная плазмида для получения библиотек слитых полипептидов, содержащая полинуклеотид, кодирующий СН1 тяжелой цепи иммуноглобулина и по меньшей мере трансмембранную часть белка А56К вируса осповакцины посредством функциональной связи с промотором Н5 вируса осповакцины. Иллюстративный вектор представляет собой р1ЕМ1, содержащий последовательность
ААААААТСААААТАААТАСАААССТТСТТ 6А66СТ Т СТ СТТАААТТСАААССдАСАААТААТ САТ АААТ,ТССАТ5С6АТС6АССТ6ТАТСАТССТСТТСТТССТА6СААСАССТАСА.6ССОС0САСТССС А6АТ,ССАССТССТеСАСА6С6ССССТ6АеСТ5АА«дАСССТ«дСДАСАСССТСАСеАТСА6СТдС. ААддссАСсддстАСАСсттсАССААСТАСсссАтдААСтдсетдААССАддсссстдес,ААддд сстбААСтсеАтдддстддАтсААСАсстАСАссддсдАдсстАССТАсдссдссдАСТТСААдА ддАддттсАдсттсАдсстддАдАССАдсдсдАдсАссдсстАССтдсАдАТ.САдсААССтдААд ААддАсдАСАС.сдссАсстАсттстдсдссАА5ТАСсстсАСТАСТАсддсАдсАдссА,с,тдд,тА СТТСдАССТСТСССССССССбСАССАСббГСаСССТСТССТСАдССТССАССААСдССССАТССС ТСТТСССССТ&дСАСиСТССТССААСАССАССТСТССССССАСАбССССССТССеСТСССТССТС АА?л.д.лА.сххс.ссслйААСсйстсАСб5тстсбтсбААСТСАсесбСССТСАССАСС66С6ТССА
СА^дтгссдддстдтсстАСАдтсстсАдсАСтстАСТссстсАССАдсстсстсАссстсссст
ССАеСАбС.ТТббССАСССАСАССТАСАТСТССААССТСААТСАСААССССАССААСАС.СААССТС
САСААСАААСТТАСАТСААСТАСАААТ6АСАСТСАТАААСТАСАТТАТСААСААТАСТССАСАСА СТ ТСАТ ТСТДААТАСАСАТАСТСААТ6САСТАТАСАСАТААТАСТАТ СТТСАТСТАСАСАТ ТСАС ССОАААСТАСТТСТААСАААССТСАТТАТАТАСАТААТТСТААТТССТСЕТСССТАТТССАААТС СССАСТССССААССААТТАСТСАТААТСТАСААСАТСАТАСАСАСАСССТСАСАТАСАСТАСТСА ТАССАТТААТАСАСТААСТССАТСАТСТССАСААТССАСААСАСАССАСАСТССССААССААТТА СТСАТАААСААСАТСАТАСАСТТАСАСАСАСТСТСТСАТАСАСТАСАСТААСТАСАТСАТСТССА
АТТСТСАСТАСТАААТСААССАСССАТСАТССССАТСТТТАТСАТАССТАСААТСАТААТСАТАС
АСТАССАССААСТАСТСТАСССССТАСТАСААССТСТАТТАССААТТАТААААССААССАСТТТС
ТАСАААТАТТТССТАТТАССССАТТААТТАТАТТСТССССССТСССААТТТТСТСТАТТАСАТАТ
ТАТАТАТАТААТАААССТТСАССТАААТАСААААСАСАСААСАААСТСТАС
Двойное подчеркивание - Промотор Н5 Одиночное подчеркивание - Лидерный пептид
Подчеркивание волнистой линией Репрезентативная вариабельная область тяжелой цепи Жирное подчеркивание - Домен СН11д6 Без подчеркивания - А56К осповакцины
Жирный курсив - Участок ΒδδΗΙΙ и ΒδΙΕΙΙ для клонирования вариабельного гена обозначенную в настоящем документе как 81%) ГО N0: 1. Различные отличающиеся ПЦРамплифицированные вариабельные области тяжелой цепи можно вставлять в рамке считывания в уникальные участки ΒδδΙ III и ВδίЕII, показанные выше жирным курсивом.
Плазмида рШМ1 представляет собой производное р7.5Лк, описанной в патенте США № 7858559. р1ЕМ1 сохраняет фланкирующие области гомологии с геномом осповакцины, позволяющие рекомбинацию, как описано в патенте США № 7858559. Однако вместо экспрессирующей кассеты в р7.5Лк (промотор и экспрессированные последовательности) рШМ1 содержит следующие элементы:
Промотор Н5 вируса осповакцины.
Лидерный пептид.
5'-участок клонирования В§§НП для клонирования вариабельных тяжелых цепей.
Вариабельная область тяжелой цепи.
3'-участок клонирования ВδίЕII для клонирования вариабельных тяжелых цепей.
Домен СН1 1§С.
А56К осповакцины.
Эти элементы перечислены на фиг. 1 и в 8Е^ ГО N0: 1. Эту кассету можно получать синтетически.
В другом варианте осуществления транспортная плазмида по настоящему изобретению, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид легкой цепи каппа иммуноглобулина посредством функциональной связи с промотором р7.5 вируса осповакцины, представляет собой рУКЕ, содержащую последовательность
- 15 028164
ООССАААААТТОАААААСТАОАТСТАТТТАТТОСАСОСООССОСССАТОООА
ТООАОСТОТАТСАТССТСТТСТТООТАОСААСАОСТАСАООССТСС4СГТОАС
ГССЛСАТСАААСОААСТОТООСТОСАССАТСТОТСТТСАТСТТСССОССАТСТ
ОАТОАОСАОТТОАААТСТООААСТОССТСТСТТОТОТОССТОСТОААТААСТТ
СТАТСССАОАОАООССАААОТАСАОТООААООТООАТААСОСССТССААТСО
ООТААСТСССАООАОАОТОТСАСАОАОСАООАСАОСААООАСАОСАССТАС
АОССТСАОСАОСАСССТОАСОСТОАОСАААОСАОАСТАСОАОАААСАСААА
ОТСТАСОССТОСОААОТСАСССАТСАОООССТОАОСТСОСССОТСАСАААОА
ОСТТСААСАООООАОАОТОТТАООТСОАС обозначенную в настоящем документе как 8ЕР ΙΌ N0: 2. ПЦР-амплифицированные вариабельные области легкой цепи каппа можно вставлять в рамке считывания в уникальные участки АраЫ и ΧΗοΙ, показанные выше жирным.
Более того, рУКЕ можно использовать в тех вариантах осуществления, где является желательным иметь полинуклеотиды второй библиотеки в плазмидном векторе в ходе отбора полинуклеотидов из первой библиотеки, как описано выше.
В другом варианте осуществления транспортная плазмида по настоящему изобретению, содержащая полинуклеотид, кодирующий полипептид легкой цепи лямбда иммуноглобулина посредством функциональной связи с промотором р7.5 вируса осповакцины, представляет собой рУЬЕ, содержащую последовательность
ООССАААААТТОАААААСТАОАТСТАТТТАТТОСАСОСООССОСССАТОООА
ТООАОСТОТАТСАГССТСТТСТТООТАОСААСАОСТАСАСОССТССАСТТОА
СТСОАОААССТТАССОТССТАСОААСТОТООСТОСАССАТСТОТСТТСАТСТТ
СССОССАТСТОАТОАОСАОТТОАААТСТОСААСТОССТСТОГТОТОТОССТОС
ТОААТААСТТСТАТСССАОАОАООССАААОТАСАСТООААООТООАТААСОС
ССТССААТСОООТААСТСССАООАОАОТОТСАСАОАОСАООАСАОСААООАС
АОСАССТАСАОССТСАОСАССАСССТОАСОСТОАОСАААОСАОАСТАСОАОА
ААСАСАААОТСТАССССТОСОААСТСАСССАТСАОООССТОАОСТСОСССОТ
САСАААОАОСТТСААСАООООАОАОТСТТАООТСОАС обозначенную в настоящем документе как 8ЕР ΙΌ N0: 3. ПЦР-амплифицированные вариабельные области легкой цепи лямбда можно вставлять в рамке считывания в уникальные участки АраЫ и ΗΐπάΙΙΙ, показанные выше жирным.
Более того, рУЬЕ можно использовать в тех вариантах осуществления, где является желательным иметь полинуклеотиды второй библиотеки в плазмидном векторе в ходе отбора полинуклеотидов из первой библиотеки, как описано выше.
В практическом осуществлении настоящего изобретения можно применять, если нет иных указаний, общепринятые способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, находящиеся в компетенции специалистов в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе (см., например, Мо1еси1аг С1ошпд А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб Еб., 8ашЬгоок е! а1., еб., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз: (1989); Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8атЬгоок е! а1., еб., Со1б 8рппдз НагЬог ЬаЬога!огу, Ж\у Уогк (1992), ΟΝΛ С1отпд, Уо1итез Ι апб ΙΙ (Ό. N. О1оуег еб., 1985); 0йдопис1еоббе 8уп!йез1з (М.1. Оай еб., 1984); МиШз е! а1., патент США № 4683195; Жис1ею Ас1б НуЬпб17а!юп (Β.Ό. Натез & 8. 1. Шддтз ебз. 1984); Тгапзспрбоп Апб Тгапз1а!юп (Β.Ό. Натез & 8. 1. Шддтз ебз. 1984); Си1!иге 0Г Атта1 Се11з (Κ.Ι. Тгезйпеу, А1ап К. Ызз, ^с., 1987); йззтоЫП/еб Се11з Апб Еп/утез (ΙΚΕ Ргезз, 1986); Β. РегЬа1, А Ргасбса1 Сшбе То Мо1еси1аг С1оптд (1984); учебник, Ме!йобз Еп/;уто1оду (Асабетю Ргезз, Епс., Ν.Υ.); Сепе ТгапзГег Уес!огз Тог МаттаНап Се11з (1. Н. МШег апб М. Р. Са1оз ебз., 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЕаЬога!огу); Ме!йобз Из Еп/уто1оду, Уо1з. 154 апб 155 (Ж.1 е! а1. ебз.), Iттипοсйет^са1 Ме!йобз Из Се11 Апб Мо1еси1аг ВЫоду (Мауег апб ^а1кег, ебз., Асабетю Ргезз, Ьопбоп, 1987); НапбЬоок 0Г Ехрептеп!а1 Еззтипо1оду, Уо1итез ЫСУ (О.М. Жг апб С. С. В1аскуе11, ебз., 1986); Матри1а!тд !йе Моизе ЕтЬгуо, (Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1986) и в АизиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1з т Мо1еси1аг ВЫоду, 1ойп ΨΐΚν апб 8опз, ВаШтоге, Магу1апб (1989)).
Общие принципы инженерии антител приведены в АпбЬобу Епдтееппд, 2пб ебШоп, С.А.К. ВоггеЬаеск, Еб., 0хГогб иту. Ргезз (1995). Общие принципы инженерии белков приведены в Рго!ет Епдтеегтд, А Ргасбса1 Арргоасй, Кзскмооб, Ό., е! а1., Ебз., ΙΚΕ Ргезз а! 0хГогб иту. Ргезз, 0хГогб, Епд. (1995). Общие принципы связывания антител и связывания антитело-гаптен приведены в: №зопоГГ, А., Мо1еси1аг Еззтипсбоду, 2пб еб., 8таиег Аззоша!ез, 8ипбег1апб, МА (1984) апб 8!еуагб, М.Ж, Ап!1Ьоб1ез, Тйей 8!гис!иге апб Типсбоп, Сйартап апб На11, Ж\у Υο^к, ΝΥ (1984). Кроме того, общепринятые способы иммунологии известны в данной области и не описанные конкретно в основном следуют Сиггеп! Рго!осо1з т Еззтипо1оду, йбзп ΨΐΤν & 8опз, Ж\у Υο^к; 8б!ез е! а1. (ебз), Вазю апб СбтсаЫттипоШду (8!й еб.), Арр1е!оп & Ьапде, Жогутбк, СТ (1994) апб М1зйе11 апб 8йид1 (ебз), 8е1ес!еб Ме!йобз т Се11и1аг Еззтипсбоду, Ж1Н Тгеетап апб Со., Ж\у Υ()ΐ'1< (1980).
Общепринятые справочные издания, описывающие общие принципы иммунологии, включают Сиггеп! Рго!осо1з 1п Еззтипсбоду, йбзп ^беу & 8опз, Ж\у Υο^к; К1ет, 1., Еззтипсбоду: Тйе 8с1епсе оГ 8е1ТЖопзе1Г О1зсптта!юп, йбзп ^беу & 8опз, Ж\у Υο^к (1982); Кеппе!! К., е! а1., ебз., Мопос1опа1 АпбЬоб1ез, НуЬпбота: А Ж\у ОЫепзюп т Вю1одюа1 Апа1узез, Р1епит Ргезз, Ж\у Υο^к (1980); СатрЬе11 А., Мопос1опа1 АпбЬобу Тесйпо1оду т Вигбеп, К., е! а1., ебз., ЬаЬога!огу Тесйшциез т Вюсйет1з!гу апб Мо1еси1аг ВЫоду, уо1. 13, Е1зеуеге, Атз!егбат (1984).
- 16 028164
Примеры
Пример 1.
Получение слитого белка СН1-А56К.
Слитые с тяжелой цепью белки конструировали для облегчения отбора специфических фрагментов иммуноглобулинов, экспрессированных на поверхности клеток с рекомбинантным вирусом осповакцины.
Экспрессирующий вектор, кодирующий слитый белок, включающий домен СН1 тяжелой цепи Су человека, слитый с внеклеточным и трансмембранным доменами А56К из вируса осповакцины Ше51егп Кезегуе, обозначенный в настоящем документе как СН1-А56К, так же как С35-специфическую УН (Н2124), конструировали следующим способом.
рДЕМ1.
Конструировали экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (СН1) иммуноглобулина гамма человека, фрагмент А56К осповакцины и кассету для вставки вариабельной области тяжелой цепи человека (например, Н2124), обозначенный в настоящем документе р!ЕМ1. Кратко, р7.5Лк, полученный, как описано в публикации РСТ № Ш0 00/028016, полное содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки, переводили в р1ЕМ1 следующим способом.
СН1 1дС.
кДНК, кодирующую тяжелую цепь 1дС человека, выделяли из РНК костного мозга с использованием набора для амплификации кДНК 8МАКТ™ КАСЕ, доступного из С1оп1есй, Ра1о АНо, СА. ПЦР проводили с использованием 5'-праймера йиСу1-5В: 5' аттассатсс сстсассстс тсстсассс зг(8Ер ш N0: 4), и З'-праймера НиСу1-38: 5'Аттастссас тсатттассс ссасасассс асас з’(8Ер ГО N0: 5). Продукт ПЦР содержал следующие элементы: ВатН1-В51Е11-(нуклеотиды, кодирующие аминокислоты 111-113 УН)(нуклеотиды, кодирующие аминокислоты 114-478 Су1)-ТСА-8а11. Этот продукт субклонировали в рВ1ие5Спр111/К8 по участкам ВатН1 и 8а11, и второй участок Вз1Е11, соответствующий аминокислотам 191 и 192 внутри домена СН1 С/1, удаляли сайт-направленным мутагенезом без изменения аминокислотной последовательности. Плазмиду рВ1ие5Спр111/К8 расщепляли Вз1Е11 и 8а11, и меньший фрагмент ДНК приблизительно 1 т.п.о. очищали из геля. Этот меньший фрагмент затем использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с использованием прямого праймера СН1(Р)-5'Сааеббдссстбетсдссбтстсстсаесстсс-3'8ЕР ю N0: 6) (участок рестрикции Вз1Е11 показан курсивом и подчеркнут) и обратного праймера СН1 (К) 5'.мстттсттетстассттестетте-з ΙΟ ΝΟ: 7). Полученный продукт ПЦР приблизительно 320 пар оснований очищали из геля.
Полноразмерное 1дС. кДНК, кодирующую тяжелую цепь 1дС человека, выделяли из РНК костного мозга с использованием набора для амплификации кДНК 8МАКТ™ КАСЕ, доступного из С1оп1есй, Ра1о АНо, СА. ПЦР проводили с использованием 5'-праймера йиС/1-5В: (8Ер ГО N0: 4), и З'-праймера йиС/138: (8Ер ГО N0: 5). Продукт ПЦР содержал следующие элементы: ВатН1-В51Е11-(нуклеотиды, кодирующие аминокислоты 111-113 УН)-(нуклеотиды, кодирующие аминокислоты 114-478 С/1)-ТСА-8а11. Этот продукт субклонировали в рВ1ие5СГ1р111/К8 по участкам ВатН1 и 8а11, и второй участок Вз1Е11, соответствующий аминокислотам 191 и 192 внутри домена СН1 С/1 удаляли сайт-направленным мутагенезом без изменения аминокислотной последовательности. Плазмиду рВ1ие5Спр111/К8 расщепляли Вз1Е11 и 8а11, и фрагмент ДНК 993 пар оснований, соответствующий полноразмерному 1§С1, очищали из геля.
А56К (более длинная форма).
Фрагмент ДНК, кодирующий аминокислоты 108-314 белка А56К гемагглютинина из вируса осповакцины (Шез1егп Кезегуе), содержащие стебель, трансмембранный и внутриклеточный домены ^о. доступа в СепЬапк ΥΡ 233063), амплифицировали с выделенной ДНК вируса осповакцины Шез1егп Кезегуе с помощью прямого праймера А56К(Р) 5'саасассаасстссасаасааасттасатсаастасааатсасастсатас-з ’(5В(ф го N0: 8) и обратного праймера А56К(К) 5'.ТАТА^^сстАтастттеттстстеттттетАТТТАСС-3'(^ ш N0: 9) (участок рестрикции 8а11 показан курсивом и подчеркнут). Полученный продукт ПЦР приблизительно 660 пар оснований очищали из геля.
А56К (более короткая форма).
Фрагмент ДНК, кодирующий аминокислоты 240-314 белка А56К гемагглютинина из вируса осповакцины (Шез1егп Кезегуе), содержащие стебель, трансмембранный и внутриклеточный домены ^о. доступа в СепЬапк ΥΡ 233063), амплифицировали с выделенной ДНК вируса осповакцины Шез1егп Кезегуе с помощью прямого праймера А56К(Р2): 5'СААСАССААССТССАСААСАААСТТАССАСССАТСАТССССАТСТТТАТСА-3' (8ЕР ГО N(0 21) И обратного праймера А56К(К): (8Ер ГО N0: 9) Полученный продукт ПЦР приблизительно 263 пар оснований очищали из геля.
Конструкция РаЬ (СН1 1дС с более длинной формой А56К).
Фрагменты 320 и 660 пар оснований затем объединяли посредством 80Е ПЦР с использованием
- 17 028164 прямого праймера СН1 (Ρ) (8ΕΡ ГО N0: 6) и обратного праймера СН1 (Р2) 5'АСААААСТАТТССТААТССТСТСАТААСТТТСТТСТССАССТТССТСТТС-З'(8ΕΡ ΙΌ Ν0: 22) для 5'-продукта, И Α56Κ(Ρ) (8ΕΡ ΙΌ N0: 8) в сочетании с А56Р(Р) (8ΕΡ ГО N0: 9) для З'-продукта. Эти два продукта затем объединяли для получения слитого фрагмента приблизительно 980 пар оснований. Этот фрагмент расщепляли ΒδίΕΙΙ и 8а11, и полученный фрагмент 934 пар оснований очищали из геля.
Конструкция ТР (полноразмерное 1дО1 с более короткой формой А56Р).
Фрагменты 993 и 263 пар оснований объединяли посредством 80Ε ПЦР с использованием прямого праймера СН1 (Ρ): (8ΕΡ ГО N0: 6) и обратного праймера А56Р(Р2): 5'ΤΟΑΤΑΑΑΟΑΤΟΟΟΟΑΤΟΑΤΟΟΟΤΟΟΤΤΤΤΑΟΟΟΟΟΑΟΑΟΑΟΟΟΑΟΑΟΟΟΤΟ-3'(8ΕΡ ΙΌ ^: 23) для 5'-продукта, и А56Р^3): 5'- 3Α+00Τ0Τ000Τ0Τ0Τ00^σΤΑΑΑΑ00Α003ΑΤ0ΑΤ0033ΑΤ0ΤΤΤΑΤ3Α-3^8Ερ Ц) ^: 24) В сочетании с А56Р(Р): (8ΕΡ ГО N0: 9) для 3'-продукта. Эти два продукта затем объединяли для получения слитого фрагмента приблизительно 1256 пар оснований. Этот фрагмент расщепляли ΒδίΕΙΙ и 8аИ, и полученный фрагмент 1235 пар оснований очищали из геля.
Конструкция ΡΕ (полноразмерное Ι&Ο1 с более длинной формой А56Р).
Фрагменты 993 и 660 пар оснований объединяли посредством 80Ε ПЦР с использованием прямого праймера СН1 (Ρ): (8ΕΡ ГО N0: 6) и обратного праймера А56Р (Р3): 5'ТАТСАСТСТСАТТТСТАСТТСАТСТТТТАСССССАСАСАСССАСАСССТС-З' (8Ερ ΙΌ ^: 25) для 5'-продукта, и А56Р (Ρ4): 5'^ассстст'ссст'стстссоеетААААСАТСААСтαοααατθαοαοτοατα-3'(8Ε9 ΙΌ ^: 26) в сочетании с А56Р(Р) (8ΕΡ ГО N0: 9) для 3'-продукта. Эти два продукта затем объединяли для получения слитого фрагмента приблизительно 1653 пар оснований. Этот фрагмент расщепляли ΒδίΕΙΙ и 8аИ, и полученный фрагмент 1632 пар оснований очищали из геля.
Плазмиду р7.5/1к также расщепляли ΒδίΕΙΙ и 8аИ, и более длинный полученный фрагмент приблизительно 5,7 т.п.о. очищали из геля. Эти два фрагмента ΒδίΕΙΙ^ΙΙ затем лигировали для получения плазмиды ρΙΕΜ1.
ρΙΕΜ1 сохраняет фланкирующие области гомологии с геномом осповакцины, позволяющие рекомбинацию. Однако вместо экспрессирующей кассеты в р7.5/1к (промотор и экспрессированные последовательности) ρΙΕΜ1 содержит следующие элементы: промотор Н5 вируса осповакцины; лидерный пептид; 5'-участок клонирования ΒδδΙ ΙΙΙ для клонирования вариабельных тяжелых цепей; вариабельная область тяжелой цепи; 3'-участок клонирования ΒδίΕΙΙ для клонирования вариабельных тяжелых цепей; домен СН1 Ι§Ο; и А56Р осповакцины, последовательность этих элементов ρΙΕΜ1 показана на фиг. 1 и 8ΕΡ ГО N0: 1.
Вариабельную область тяжелой цепи (Н2124), специфическую для С35, вставляли в участки ΒδδΙ ΙΙΙ и ΒδίΕΙΙ ρΙΕΜ1, получая слитую конструкцию VΗ (Н2124)-СН1-А56Р. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности для слитой конструкции VΗ (Н2124)-СН1-А56Р, полученной в ρΙΕΜ1, показаны ниже соответственно.
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая продукт слитый белок VΗ (Н2124)-СН1-А56Р ΡаЬ (8ΕΡ ГО N0: 10)
САООТОСАОСТОСАОСАОТООООСОСАООАСТОСТОААОССТАОСОА
ОАСССТОТСССТСАССТССОСТОТСТАТООСТАСТССАТСАССАОСООСТАТТ
ТСТООААСТООАТССОССАОСССССАСООААООСОСТООАОТООАТТОООТА сатсаостасоасоосаосаосаастссаасссатстстсааааатаооотс
АСААТСАОСАОАОАСАССТССААОААССАОТТСТСССТОААОСТОАОСТСТО
ТОАССОССОССОАСАССОСТОТОТАТТАСТОТОССАОАООААСТАССОООТТТ
ОСТТАСТООООССААОООАСССТООТСАССОТСТССТСАОССТССАССААОО
ОСССАТССОТСТТСССССТООСАСССТССТССААОАОСАССТСТОООООСАСА
ОСОССССТОООСТОССТООТСААОСАСТАСТТССССОААСССОТОАСООТОТ
СОТООААСТСАООСОСССТОАССАОСООСОТССАСАССТТСССООСТОТССТ
АСАОТССТСАООАСТСТАСТСССТСАОСАОСОТСОТОАССОТОСССТССАОСА
ОСТТОООСАСССАОАССТАСАТСТОСААСОТОААТСАСААОСССАОСААСАС
СААООТООАСААОАЛАОХХАеАТСААША.СА
ΤΑΗίΛΛΟΑΑΙ^
ГА(дАСА[алтл(латс:т.(]((А1хласаслш
АССТОАТ1АТАТА(+<ТААГГСТААТТОСТСаТСООТАТХООАААТСОСОАСТС СООААССААТ'ГАСТдАТААТОТЛОААО-АТСАТАСАОАСАССОТСАСАТАСАС ТЛОТС А1АйСАТГААТЛСА0 +
ОАДАСА£СООААОСААТХАОХОА1АААОМЦАТОАТАОАОТТАСАОАСАЩО, тслелтлслстлслотлАОТлеАГСлтс
Λ(;Γ(}Αΐ:(λΑΓ(ίςχί(5ζ\ιςτ'ΐ
СЛЛС1ΑΟχΟΊ^;аоо.СШЕАОХАСААСС1СХАТТАОСААХТАХААААСОААО,ОА (·ΤΙΤ(ίΤΑ(ίΛΛΛ/ΐ;ΑΓΤΤΟ(ίΤΑ/ΓΓΑνθ(ί(·ΑΓΤΛΛΊΓΑ^^^ тттхстш/ахтасататхахатахатааглааштшаштааатасааааса оаоласлллотстло
- 18 028164
Нуклеотидная последовательность, кодирующая УН (Н2124) и домен СН1, подчеркнута, и нуклеотидная последовательность, кодирующая домен А56К, дважды подчеркнута.
Аминокислотная последовательность продукта слитого белка УН (Н2124)-СН1-А56К РаЬ (ЗЕ^ ΙΌ N0: 11)
ОУОЕООАУОАОЕЕКР8ЕТЕ8ЕТСАУУОУ81Т80УР\УК\У1КОРРОКОЕЕ\У1 (ιΥΙ8ΥΡΡ88Ν8ΝΡ8ΕΚ\ΚνΊΊ8ΚΡ Г8КХОГ8ЕК.Е88У ТАЛР ГЛУУУСЛК(П ТРГЛ Υ\νΡ(?(ΐ ГЕУ ГУ88Л8 ГК6Р8У1 РЕАР88К8 Г8(КП'ЛЛЕ0СЕУКРУРРЕ.РУ ΓΥ8ΨΝ8 СЛЕ18(;У1ГП;РЛУЕО88СП.У8Е88УУ1УР888ЕОЮТУ1С\У\НКР8.\ТКУРККУ Т8Т!ХРП^ ндл.пгочпАУР ν8ΥΤΤν8Τ88(ΠΥ.ΓΊ.Κ8ΓΙ'ΡΡΛΙ4ΎΙΚ^
ΙΕίΠΤΛΙ,ΙΙΙ,8ΑγΛΙΙ·(:ΐΙΎΥΙ^
Аминокислотная последовательность УН (Н2124) и домена СН1 подчеркнута, и аминокислотная последовательность домена А56К дважды подчеркнута.
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок конструкции ТК УН (Н2124)1§О-А56К (ЗЕ^ ΙΌ N0: 27)
САООТОСАОСТОСАОСАОТООРОСОСАООАСТОСТОААОССТАРСОА РАСССТОТСССТ САССТОСОСТОТСТА! ООСТАСТССАТСАССАОСООСТАТТ ТСТООААСТООАТССНССАОСССССАОООААСгСгООСТООАОТСгОАТТСгООТА САТСАОСТАСОАСООСАОСАОСААСТССААСССАТСТСТСАААААТАООСТС АСААТСАОСАОАОАСАССТССААОААССАОТТСТСССТОААОСТОАОСТСТО ТОАССОССОССОАСАССОСТОТОТАТТАСТОТОССАОАООААСТАССОООТТТ ОСТТАСТООООССААОООАСССТООТСАССОТСТССТСАОССТССАССААОО ОСССАТСООТСТТСССССТООСАСССТССТССААОАОСАССТСТОССгООСАСА РСООСССТОООСТОССТОРТСААООАСТАСТТССССОААССООТОАСООТОТ СОТООААСТСАООСРСССТОАССАОСРОСОТОСАСАССТТСССООСТОТССТ АСАОТССТСАООАСТСТАСТСССТСАОСАОСОТСОТОАССОТОСССТССАОСА ОСТТОООСАСССАОАССТАСАТСТОСААСОТОААТСАСААРСССАССААСЛС СААООТСтОАСААОАААОТТОАОСССАААТСТТСНОАСААААСТСАСАСАТСгС ССАССОТОСССАОСАССТОААСТССТООООООАССОТСАОТСТТССТСТТССС ССС ААААСССААС САС АСССТСАТОАТСТСССООАССССТОАОСТСАС АТОС СТССТОСТОСЛСО ГСЛОССЛССЛЛОЛСССТОАСОТСЛЛОТТСЛЛС ГОСТЛСС ТСОАССССОТССАССТОСАТААТСССААОАСАААСССОССССАООАССАОТ АСААСАОСАССТАСССТСТССТСАССОТССТСАССОТССТССАССАССАСТС ССТСААТСОСААССАОТАСААОТОСААОСТСТССААСАААОСССТСССАССС СССАТСОАСААААССАТСТССАААОССАААССССАССССССАСААССАСАС СТСТАСАСССТССССССАТССССССАТОАОСТСАССААОААССАОСТСАОСС ТОАССТСССТОСТСАЛАОССТТСТАТСССАОССАСАТСОСССТСОАОТОООА САССААТССССАСССССАСААСААСТАСААОАССАСОССТСССОТОСТСОАС ТСССАССССТССТТСТТССТСТАСАССААССТСАССОТССАСААСАССАССТС ОСАОСАССООААССТСТТСТСАТОСТСССТСАТССАТСАОССТСТССАСААС САСТАСАСОСАСААСАОССТСТСССТСТСТССССОТААААССАС.ССЛТСАТО СрОЛХСХТТЛГСЛТЛСрГАСЛАТРАТА АТСОАСАОТАССАССМРХАСТОТА (}СССС1'АС1АСЛЛСС1СГЛГ'ГА.(1СААГГЛГЛАААССААСС}ЛСГ1 ГСтГАСААА гатгтсс1аттассссл;1хллхтлтлттсксосс^^^ слхлгглтахлхлгллт^
СТАР
Нуклеотидная последовательность, кодирующая УН (Н2124) и полноразмерный домен 1д, подчеркнута, и нуклеотидная последовательность, кодирующая более короткую форму домена А56К, дважды подчеркнута.
Аминокислотная последовательность слитого белка конструкции ТК УН (Н2124)-1§О-А56К (ЗЕ^ ΙΌ N0: 28)
- 19 028164
ОУриЮ\УОАОЕЬКР8ЕТЕ8ЕТСАУУОУ81Т50УР\^\¥1КОРРОКСЬЕ\У1 ΟΥ[8ΥΡ088Ν8ΝΡ8ΕΚΝΚνΤΙ8ΚΡΤ8ΚΝΟΡ8ΕΚΕ88νΤΑΑΡΤΑνΥΥϋΑΚΟΤΤΟΡΑ УУ'СО(РГРУГУ88Л8 РКСР8У1Р1.ЛР88К8 Г8СС ГЛЛкССРУКРУ1Р1:РУ1 Υ8ΨΝ8 СЛ1-Т8СУНТРРАУкО88СкУ81.88УУТУР888кСТОТУ1С\У\|1КР8\ТК.УРККУ ЕРК8СРКТНТСРРСРАРЕккООР8УРкРРРКРКРТкМ18КТРЕУТСУУУРУ8НЕРР ΕνΚΡΝΨΥΥΡΟνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕΟΥΝδΤΥΚΥΥδνΕΤνΕΗΟΡΨΕΝΟΚΕΥΚΕΚΥ 8МКАкРАР1ЕКТ18КАКООРКЕРОУУТкРР8КРЕкТКЖ)У8кТСкУКСРУР8Р1АУ ΕλνΕ8ΝΰΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΡ8ΡΟ8ΡΡΕΥ8ΚΕΤνΡΚ8ΚΛν00ΟΝνΡδϋ8ΥΜΗΕΑΕ ΗΝΗΥΤΟΚ8Ε8Ε8ΡΟΚΤΤ,ΡΡΑΡΕΥΡΤΥΝΡΝΡΤνΡΡΤΤναθ8ΤΤ8Ι8.ΝΥΚ·ΤΚΡΡνΕ1 РСГГАкНк8АУА1ГС1 ΓΎΥΙΥΝΚΚδΚΚΥΚΤΕΝΚν.
Аминокислотная последовательность для УН (Н2124) и полноразмерного домена 1д подчеркнута, и аминокислотная последовательность для более короткой формы домена А56К дважды подчеркнута.
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок конструкции РЬ УН (Н2124)1дС-А56К (8Е^ ΙΌ N0: 29)
САССТССАССТССАОСАСТСССССССАССАСТССТСААСССТАСССА САСССТОТСССТСАССТССССТОТСТАТОССТАСТССАТСАССАОСОССТАТТ ТСТООААСТОСАТССОССАССССССАОССААООСОСТООАОТСОАТТСССТА САТСАССТАССАССССАССАОСААСТССААСССАТСТСТСАААААТАСООТС ЛСЛАТСЛССЛСЛСЛСАССТССЛЛСАЛССАО ГГСТСССТСЛЛССТСЛССТСТС ТСАССОССОССОАСАССОСТСТСТАТТАСТСТОССАСАОСААСТАССООСТТТ ОСТТАСТССООССААОССАСССТООТСАСССТСТССТСАОССТССАССААСС ССССАТСССТСТТСССССТСССАСССТССТССААСАССАССТСТССССССАСА СССОСССТССССТСССТССТСААОСАСТАСТТСССССААССССТСАСССТСТ ССТССААСТСАСССССССТСАССАССООССТССАСАССТТСССООСТОТССТ АСАОТССТСАСОАСТСТАСТСССТСАОСАОСОТСОТСАСССТССССТССАССА ОСТТССССАСССАСАССТАСАТСТССААСОТОААТСАСААССССАССААСАС СААСОТССАСААСАААСТТСАССССААА ГСТТСТСАСААААСТСЛСАСАТСС ССАСССТОСССАССАССТОААСТССТССООССАСССТСАОТСТТССТСТТССС СССААААСССААССАСАСССТСАТСАТСТСССССАССССТОАССТСАСАТСС СТССТСС1ССЛССТСЛСССЛССЛЛСАСССТОЛССТСЛЛС П САЛС1ССТЛСС ТССАСССССТССАССТССАТААТСССААСАСАААСССОСССОАССАОСАОТ АСААСАОСАССТАСССТОТОСТСАССОТССТСАССОТССТОСАССАООАСТС ОСТСААТСССААССАСТАСААСТССААООТСТССААСАААОСССТСССАССС СССАТССАОААААССАТСТССАААОССАААОСОСАСССССОАСААССАСАО ОТСТАСАСССТССССССАТССССООАТСАОСТСАССААОААССАССТСАССС ТОАССТСССГОСТСАААСОСТТСТА ТСССАОСОАСАТССССОТСОАОТСССЛ САССА АТСОССАСССССАСААСААСТАСААСАССАССССТССССГОСТССАС ТСССАССССТССТТСТТССТСТАСАССААССТСАСССТССАСААСАССАССТС ССАССАССССААСОТСТТСТСАТССТСССТСАТОСАТСАСОСТСТОСАСААС САСТАСАСССАСААСАСССТСТСССТОТСТССССОТААААСАТСААСТАСАА АТСАСЛСТ.^
Г.ЛСЛСЛТЛС ГСЛЛЕ^^
СССАААСТАЩтаЛАСААЛССТСАТТАХАТАСАТААТТСТААТТССТССТСО СТАЙЛССЛЛА^
тАттдгсоосстргсосллтттю
САСС ТААА РЛСЛАЛЛСЛСЛСЛЛСАЛЛСПСТЛС.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая УН (Н2124) и полноразмерный домен 1д, подчеркнута, и нуклеотидная последовательность, кодирующая более длинную форму домена А56К, дважды подчеркнута.
Аминокислотная последовательность слитого белка конструкции РЬ УН (Н2124)-1дС-А56К (8Е^ ΙΌ N0: 30)
- 20 028164
0ν0Ε00Ψ0Λ(ιΕΕΚ1:>8ΕΤΕ8ΕΊ СЛУ Υ(1Υ8ΓΓ8(ϊΥ1 ЛУХУЧКуРРСКОЕГЛ! (ίΥ18Υ1)()88\8ΝΡ8ΕΚ.\Κν IΙ8ΚΡ18К!\ТЕ)Г'8ЕКЕ88УЧ АЛ1УГЛУУУСЛКОЧ ТСП А У\У(К>С/П.У 1У88Л81 Κ.(4Ρ8νΐ·ΡΕΛΡ88Κ8Τ8(.Χι 1'ЛЛЕ(лСЧ,УКЧ)У1'РёРУ1У8\У\8 0ΑΡΤ8ΟΥΗΤΡΡΑΥΡ088ΟΡΥ8Ε88νντνΡ888ΕΟΤ0ΤΥΙ€ΝνΝΗΚΡ8ΝΤΚνΡΚΚν ЕРК8С1ЖТН 1 СРРСРЛРЕЁЕ(лОР8У1Ч,1 РРКРКЧ) ЧЁУП8К1 РЕУ 1СУУУРУ8НЕРР Ρ;νΚ1\\νΥνΡ(ίνΐ·:νΐ1\ΛΚ1ΚΡΚΕΕΟΥ\8Ί УНУУ8УЕ ГУЕНОРУ1.\С}К1:УКСКУ
ΕΑΥΕ8ΝΟΟΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΡ8ΡΡ8ΡΡΕΥ8ΚΕΤνΡΚ8ΚννθΟΟΝνΡ8€8νΜΗΕΑΕ Η\ΗΥ 1ΌΚ8Ε8Ε8Ρ(ΐΚ 181 ΓΝΡI ΡΚΥΡΥΕΕ.Υ81ΕΕΙΥΝ I Р8Е811РПЕ8С18 1Ч18Р1· 1'8 8ΚΚΡΡΥΙΡ\8Ν(Έ8ΥΡΕ!Α;η?ΕΡΡΓΡ^
1’Н1’ГПЖЁР1ПУТ^
Аминокислотная последовательность для УН (Н2124) и полноразмерного домена 1д подчеркнута, и аминокислотная последовательность для более длинной формы домена А56Р дважды подчеркнута.
Пример 2.
Экспрессия слитого белка А56Р на поверхности клеток НеРа.
Клетки НеРа инфицировали или совместно инфицировали рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим слитые конструкции иммуноглобулинов, вариабельную тяжелую цепь (Н2124) СН1-А56Р (описанную в примере выше) и 1д-К (А56РН+Ь) или 8сΡν-А56Р (А56Р 8сΡν). Иллюстрация общего способа инфекции клеток рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ и последующих стадий отбора из библиотеки показана на фиг. 2. В настоящем примере вместо использования библиотек клетки НеРа совместно инфицировали рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим слитый белок УН (Н2124) СН1-А56Р, и рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим 1д-К (А56Р Н+Р), или инфицировали рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим 8сΡν-А56Р. Проводили анализ активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и окрашивания С1)100 на клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ. Кратко, 1 мкг/мл С0100-Н18 или 1 мкг/мл С35-Н18 добавляли к образцам и инкубировали в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали и добавляли анти-1ч8 АРС, образцы инкубировали в течение 30 мин на льду, и затем образцы промывали, фиксировали и анализировали. Данные РАС8 показаны на фиг. 3А-С. Эти результаты показывают, что слитые белки А56Р были экспрессированы на поверхности клеток.
Клоны в формате ЕЕУ также тестировали посредством ЕР18А.
Очищенным белком С35 покрывали 96-луночный планшет для ЕЫ8А (96-луночный плоскодонный иммунологический планшет №пс-Мах1$огр Кат # 439454) при 1 мкг/мл в карбонатном буфере. Планшет промывали и затем блокировали с помощью 1χΡΒ8, 10% ΡΒ8. Инактивированный псораленом ЕЕУ затем добавляли в планшет, разведенный в 1χΡΒ8/10% ΡΒδ/0,05% Тлееп-20, в предназначенные лунки, и позволяли связывание. Вирусные частицы детектировали с использованием конъюгированного с НРР антитела кролика против осповакцины (АЪСат, каталожный # 28250), антитело разводили 1:2000 в 1ΧΡΒδ/10% ΡΒδ/0,05% Тлееп-20. Затем субстрат ТМВ (для детекции активности пероксидазы хрена (НРР)) добавляли в планшет; окраске позволяли проявиться, и затем реакцию останавливали равным объемом 2н Н28О4. Планшет считывали на считывателе для планшетов ЕЫ8А, и результаты показаны на фиг. 4А. Второй ЕЫ8А использовали для подтверждения связывания посредством детекции РАЪ с использованием таких же условий, как выше, за исключением того, что вторичное антитело представляло собой конъюгированное с НРΡ антитело козы против 1§С Р(аЪ')2 человека (1аск8оп 1ттипоРе8еагсР, каталожный # 109-036-097) использовали в разведении 1:10000 исходного антитела, с 1Χ ΡΒδ/10% ΡΒδ/0,05% Туееп-20 в качестве буфера для разведения. Результаты показаны на фиг. 4В. Лунки, являющиеся положительными на обоих планшетах, показали, что конструкция антитела была экспрессирована в присутствии вирусного вириона осповакцины. Как показано на фиг. 3А-В, ЕЕУ, содержащий специфический для С35 слитый белок (отмеченный А56Р ЕЕУ), связывался с С35, в то время как контрольный (Ь517+С7000-А56Р ЕЕУ), не связывающий С35 ЕЕУ, не связывался, и специфическое для С35 антитело в общепринятом формате связанного с мембраной 1§С1 (тЪд ЕЕУ) также не связывалось. Данные показали антигенспецифическое связывание ЕЕУ, когда антитело было экспрессировано с А56Р.
Пример 3.
Отбор слитого белка на основе планшетов и на основе раствора.
Рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие слитые белки А56Р с известными связывающими С35 и УЕСР молекулами, тестировали по связыванию с молекулами-мишенями с использованием анализа на основе пэннинга. Рекомбинантные ЕЕУ, экспрессирующие молекулы иммуноглобулинов, известные как специфические для С35 (8ΕΡν2408-Λ56ΙΡ двойной ген Н2124-Б517-А56Р и совместная инфекция Ь517+Н2124-А56Р) или УЕСР (Ь7000+Р17000-А56Р), продуцировали в клетках 1ЛС1 (в течение приблизительно 24 ч). Двойной ген Н2124-Б517-А56Р продуцировал такое же антитело, как Ь517+Н12124-А56Р, за исключением того, что гены 1д-Н и 1д-К были кодированы одним и тем же вирусом с двойного гена, и гены 1д-Н и 1д-К были кодированы отдельными вирусами, использованными для
- 21 028164 совместной инфекции Н212 4-Л56К.
Клоны в формате ЕЕУ тестировали анализом бляшек.
Стерильные 96-луночные планшеты для ЕБ18А покрывали 1 мкг/мл С35 или 1 мкг/мл УЕСР. Содержащий ЕЕУ супернатант Исходный (неразведенный) разводили посредством серийного разведения, образующего разведения 1:10-1:106. 100 мкл различных вирусных конструкций добавляли в предназначенные лунки и позволяли связыванию происходить в течение 2 ч или в течение ночи при комнатной температуре. Клетки промывали 10 раз РВ8 для удаления несвязанного ЕЕУ, затем приблизительно 25000 клеток В8С1 добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали при 37°С в течение ночи. Образование бляшек детектировали по окрашиванию лунок кристаллическим фиолетовым. На фиг. 5Ά-Ό показаны результаты анализа бляшек для связывания С35 через 2 ч и в течение ночи, и связывания УЕСР через 2 ч и в течение ночи соответственно. Эти результаты показали, что слитые белки Л56К были экспрессированы на поверхности вирионов осповакцины. Более того, результаты показали, что известные связывающие фрагменты, полученные с использованием слитых белков Л56К, экспрессированных на ЕЕУ, являлись способными связывать их специфические мишени.
Затем проводили отбор на основе бусин с использованием бусин со стрептавидином, бусин с белком С или активированных тозилом бусин.
Отбор на бусинах со стрептавидином (8АУ).
Отбор на основе магнитных бусин тестировали с использованием рекомбинантных ЕЕУ, экспрессирующих МАЬ 2408 (Н2124-А56К+Б517 (С35-специфическое)) или МАЬ 7000 (Н7000-А56К+Б7000 (УЕСР-специфическое)). Клетки НеБа инфицировали различными вирусными конструкциями в двух флаконах Т175 в течение 2 суток, супернатант собирали, и клетки осаждали. ЕЕУ осаждали центрифугированием в течение 1 ч в роторе 8А-600 при 15000 об/мин. Осадок ЕЕУ ресуспендировали в 1 мл Г)МРМ, дополненной 10% РВ8. Для каждого рекомбинантного вируса использовали 500 мкл супернатанта (~107 КОЕ). Затем 500 мкл Г)МРМ, содержащей 1 мкг биотина-С35, добавляли к каждому образцу (получая раствор объемом 1 мл при концентрации 1 мкг/мл). Раствор инкубировали в холодной комнате во вращающем устройстве в течение 2 ч. 200 мкл магнитных бусин М280 со стрептавидином (8АУ) добавляли к раствору ЕЕУ/С35 (концентрация бусин 8АУ являлась достаточно высокой для связывания всех биотин-С35, так что стадий отмывки не требовалось). Раствор вращали при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы позволить бусинам связаться с биотином-С35. Вирусные конструкции, полученные, как описано выше, добавляли к бусинам. Бусины собирали с использованием магнита, и несвязавшийся вирус собирали отдельно. Бусины промывали 5x1 мл РВ8. Все промывки с несвязавшимся вирусом пулировали (Несвязавшийся). Бусины удаляли с магнита. Добавляли 1 мл ЭМЕМ, дополненной 2,5% РВ8, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Результаты показаны в табл. 1. Эти результаты показывают, что ЕЕУ, экспрессирующие антитело 2408, С35-специфическое, связывались с бусинами, в то время как ЕЕУ, экспрессирующие антитело 7000, УЕСР-специфическое, не связывались.
Таблица 1
Отбор С35-специфических тАЬ с использованием биотина-С35 и магнитных бусин с 8АУ
| Вирус | Титр | % связавшегося |
| МаЬ 7000 Несвязавшийся | 1,45х107 | |
| МаЬ 7000 Связавшийся | 1,2х104 | 0, 1% |
| МаЬ 2408 Несвязавшийся | 7, бхЮ6 | |
| МаЬ 2408 Связавшийся | 7,7х106 | 50% |
Проводили эксперименты с добавкой, где ЕЕУ, экспрессирующие Б517, устанавливали на то1=1 и совместно инфицировали в НеБа со смесью, где ЕЕУ, экспрессирующие Н2124-А56К, разводили до 1:104 и 1:105, с Н7000-А56К (в условиях одной Т175 НеБа на добавку). Кратко, ЕЕУ собирали, и 500 мкл содержащего ЕЕУ супернатанта (5х106 БОЕ) использовали для каждой добавки. 500 мкл Г)МРМ, содержащей 1 мкг биотина-НС35, добавляли к каждому образцу (объем 1 мл и концентрация 1 мкг/мл). Связавшийся и несвязавшийся растворы собирали с использованием способа отбора на 8АУ-бусинах (М280), описанного выше. Связавшийся вирус амплифицировали на В8С1 во флаконах Т75.
Собранные связавшийся и несвязавшийся образцы для каждого эксперимента с добавкой тестировали по обогащению посредством проточной цитометрии. Результаты экспериментов с добавкой показали явное обогащение с бусинами 10-4 и 10-5 и то, что отбор на бусинах являлся более эффективным, чем способ отбора на планшетах (данные не представлены).
Тестировали также другие бусины, бусины с белком С (Эупа1) и активированные тозилом бусины (Эупа1) с использованием способов, сходных со способами, описанными выше для бусин 8АУ. Следующие ранее идентифицированные антитела использовали в ходе анализов отбора: МАЬ 2408 (С35специфическое антитело, гуманизированное антитело 1Р2, содержащее Н2124+Б517), МАЬ 2368 (СЭ100специфическое антитело, описанное в патентной заявке США № 2010/0285036), тАЬ 7000 (УЕСРспецифическое исходное антитело для бевацизумаба) и тАЬ 8000 (Нег2-специфическое исходное анти- 22 028164 тело для трастузумаба).
Отбор на бусинах с белком О.
Использовали ЕЕУ, полученные при инфекциях в малом масштабе клеток НеЬа в 6-луночных планшетах (титр ~5х105/мл). Отбор на основе бусин с белком О тестировали с использованием ЕЕУ, экспрессирующих 2368-А56К (Н2090-А56К+Ь512, обе УН и УЬ экспрессированы в осповакцине): 1 мл вируса (-5х 105 БОЕ) и ЕЕУ, экспрессирующих 2408-А56К (Н2124-А56К+Ь517, обе УН и УЬ экспрессированы в осповакцине): 1 мл вируса (5х 105 БОЕ)). СР100, связанный с бусинами с белком О, получали следующим образом: использовали 300 мкл магнитных бусин с белком О (2х общепринятое количество/образец) и осаждение осуществляли с помощью магнита. 600 мкл РВЗ+18 мкл СР100-Ре (=36 мкг) добавляли к бусинам, которые инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить СР100-Ре связываться с бусинами с белком О. Бусины осаждали с помощью магнита и промывали 1 х 1 мл РВЗ. Затем бусины ресуспендировали в 300 мкл РМЕМ, дополненной 10%. 100 мкл бусин с СР100-Ре/Рго О добавляли к каждому образцу вируса (~2х общепринятое количество бусин Рго-О), что составляло приблизительно 12 мкг/мл СР100-Ре. Раствор инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. 550 мкл (приблизительно 50%) бусин удаляли, и несвязавшиеся собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВЗ. Бусины удаляли с магнита, добавляли 1 мл РМЕМ, дополненной 2,5%, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Оставшимся 550 мкл позволяли продолжать инкубацию при комнатной температуре в течение следующих 1,5 ч (всего 3,5 ч) и затем в течение 18 ч при 4° перед сбором, как описано выше.
Отбор на активированных тозилом бусинах.
ЕЕУ, экспрессирующие такие же антитела 2408 (С35-специфическое) и 2368 (СР100специфическое), используемые в экспериментах отбора на бусинах с белком О выше, использовали для отбора на активированных тозилом магнитных бусинах. 100 мкг С35-Н18 конъюгировали с активированными тозилом магнитными бусинами в РВЗ или в буфере для покрытия (СВ) для ЕР13А. Раствор инкубировали при 37° в течение ночи и блокировали в течение 1 ч при 37° с помощью РВЗ, 10% РВЗ, 0,5% ВЗА. Бусины промывали 1х, ресуспендировали в 160 мкл РМЕМ, дополненной 10%. 50 мкл каждого образца бусин добавляли к каждому образцу вируса и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 ч. Несвязавшиеся собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВЗ. Бусины удаляли с магнита, добавляли 1 мл РМЕМ, дополненной 2,5%, и бусины переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали.
100 мкг СР100-Н18 конъюгировали с активированными тозилом магнитными бусинами в РВЗ для анализа отбора антитела против СР100 с 2368-А56К (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)) и 2408-А56К (1 мл вируса (5х 105 БОЕ)) с использованием таких же способов, описанных выше для анализа отбора антитела против С35.
Результаты использования отбора на бусинах с белком О показаны в табл. 2, и результаты использования отбора на активированных тозилом бусинах показаны в табл. 3 и 4.
Т аблица 2
Отбор СР100-специфических тАЬ с использованием СР 100-Ре и бусин с . белком О
| Вирус/Время связывания | Образец | Титр | % Связавшегося |
| МАЬ 2408 - 2 часа | Несвязавшийся | 100000 | |
| МАЬ 2408 - 2 часа МАЬ 2368 - 2 часа МАЬ 2368 - 2 часа МАЬ 2368 - в течение ночи МАЬ 2368 - в течение ночи | Связавшийся Несвязавшийся Связавшийся Несвязавшийся Связавшийся | 360 64000 88000 130000 90000 | 0,36% 58% 41% |
| МАЬ 2408 - в течение ночи | Несвязавшийся | 320000 | |
| МАЬ 2408 - в течение ночи | Связавшийся | 160 | 0, 05% |
- 23 028164
Таблица 3
Отбор С35-специфических тАЬ с использованием активированных тозилом бусин с С35
| Вирус | Образец | Титр | % Связавшегося |
| МАЬ 2408 | Несвязавшийся | 96000 | |
| МАЬ 2408 | Связавшийся | 160000 | 61% |
| МАЬ 2368 | Несвязавшийся | 240000 | |
| МАЬ 2368 | Связавшийся | 1600 | 0, 6% |
| МАЬ 2408 | Несвязавшийся | 97000 | |
| МАЬ 2408 | Связавшийся | 140000 | 59% |
Таблица 4
Отбор СО100-специфических тАЬ с использованием активированных тозилом бусин с СП100-Н1§
| Вирус | Образец | Титр | % Связавшегося |
| МАЬ 2408 | Несвязавшийся | 384000 | |
| МАЬ 2408 | Связавшийся | 480 | 0, 1% |
| МАЬ 2368 | Несвязавшийся | 264000 | |
| МАЬ 2368 | Связавшийся | 232000 | 46, 7% |
Пример 4.
Получение библиотеки слитого белка СН1-А56К.
Библиотеку полинуклеотидов, кодирующих фрагменты иммуноглобулинов, получали следующим образом. Библиотеку рекомбинантной осповакцины, означенную как наивная тяжелая цепь, слитая с А56К, получали с использованием РНК костного мозга, закупленную у коммерческого поставщика (Ι.ίίο Тесйпо1о§1е§), представляющую более 100 доноров. Обратную транскрипцию проводили с использованием антисмысловых праймеров, специфических для константной области любого иммуноглобулина человека γ или μ. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с одним из двух смысловых праймеров, связывающихся с началом вариабельной тяжелой каркасной области 1 человека и вводящих участок рестрикции ВззНП, в сочетании с пулом антисмысловых праймеров, связывающихся с различными зародышевыми фрагментами I человека и вводящих участок рестрикции В§1ЕП. Последовательности этих праймеров являлись следующими:
Смысловой УН 3: ААТАТОСОСОСАСТССОАООТОСАОСТООТООАОТСТОО (ЗЕр ГО N0: 12).
Смысловой УН 3а: ААТАТОСОСОСАСТССОАООТОСАОСТОТТООАОТСТОО (ЗЕр ГО N0: 13).
Антисмысловой 1Н 1: ОАОАСООТОАССАОООТОСССТООССССА (ЗЕр ГО N0: 14).
Антисмысловой 1Н 2: ОАОАСООТОАССАОООТОССАСООССССА (ЗЕр ГО N0: 15).
Антисмысловой 1Н 3: ОАОАСООТОАССАТТОТСССТТООССССА (ЗЕр ГО N0: 16).
Антисмысловой 1Н 4/5: ОАОАСООТОАССАОООТТСССТООССССА (ЗЕр ГО N0: 17).
Антисмысловой 1Н 6: ОАОАСООТОАССОТООТСССТТООССССА (ЗЕр ГО N0: 18).
Полученные продукты ПЦР клонировали в плазмиду р1ЕМ1, описанную выше, с целью получения рекомбинантного вируса осповакцины. В частности, экспрессирующую кассету вариабельной тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанную в настоящем документе, клонировали в рамке с областью СН1 константного домена иммуноглобулина человека и кДНК интегрального мембранного белка А56К вируса осповакцины. Полученные белки, образованные при экспрессии библиотеки, представляли собой слитые белки, содержащие вариабельный фрагмент тяжелой цепи иммуноглобулина, СН1 тяжелой цепи и часть белка А56К, экспрессированного на поверхности осповакцины ЕЕУ.
Библиотеку наивной тяжелой цепи, слитой с А56К, использовали вместе с осповакциной, экспрессирующей известную 1§-Б, или с вирусом осповакцины, экспрессирующим библиотеку 1§-Б (как описано ранее в патенте США № 7858559, полное содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки), для пэннинга осповакцины, как проиллюстрировано на фиг. 2.
Пример 5.
Скрининг библиотеки слитых белков СН1-А56К для отбора антитела против С0100.
Проводили отбор новых антител против С0100 с использованием —1200000 клонов из библиотеки наивной тяжелой цепи, слитой с А56К (обозначенной так же как библиотека 3), описанной в предыдущем примере, +клонов легкой цепи (Б48, Б116 и Б9021).
Клетки Т-175 НеБа инфицировали ЕЕУ, экспрессирующими библиотеку слитых белков+легкие цепи, описанные выше, в течение 2 суток, после чего супернатант собирали, осаждали 2х центрифугированием с низкой скоростью, и ЕЕУ осаждали при 15000 об/мин в течение 1 ч. ЕЕУ ресуспендировали в 3 мл ΌΜΞΜ, дополненной 10% ЕВЗ.
Цикл 1 отбора.
ЕЕУ, экспрессирующие 23 68-А56К (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)), и ЕЕУ, экспрессирующие 2408А56К (1 мл вируса (5х 105 БОЕ)), использовали в качестве контроля, и библиотеку 3 (1 мл вируса (~108
- 24 028164
БОЕ)) использовали для анализа отбора. Сначала 300 мкл бусин с белком О (2х общепринятое количество/образец) осаждали с помощью магнита, и 600 мкл РВ8+18 мкл СЭ100-Рс (=36 мкг) добавляли к бусинам. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить СЭ100-Рс связываться с бусинами с белком О. Бусины осаждали с помощью магнита, промывали 1 х 1 мл РВ8 и ресуспендировали в 300 мкл ЭМЕМ, дополненной 10%.
Затем 100 мкл СО100-Рс/Рго О на образец (приблизительно 12 мкг/мл С0100-Рс) добавляли к ЕЕУ (контроль 2408 и 2368, и библиотека 3) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. 550 мкл (приблизительно 50%) бусин удаляли, и несвязавшийся вирус собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВ8. Бусины удаляли с магнита, и добавляли 1 мл ОМЕМ, дополненной 2,5%, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Эти образцы после 2 ч инкубации титровали с метилцеллюлозой, добавленной через 45 мин. Для бусин, извлеченных из связавшейся библиотеки, проводили амплификацию на В8С1 в Т75 (этот цикл 1 2-часового отбора назван СО100 3.1А). Оставшимся 550 мкл (приблизительно 50%) бусин позволяли продолжать инкубацию при комнатной температуре в течение следующих 1,5 ч (всего 3,5 ч) и затем в течение 18 ч при 4°С (в течение ночи). Несвязавшийся вирус собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВ8. Бусины удаляли с магнита, добавляли 1 мл ОМЕМ, дополненной 2,5%, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (этот цикл 1 отбора в течение ночи назван СО100 3.1В). Результаты показаны в табл. 5.
Таблица 5
Цикл 1 отбора СО100 АЬ
Для библиотек 3. 1А и 3.1В получены хорошая амплификация на В8С1, сбор и титр (~2х107/мл каждая).
Цикл 2 отбора.
Использовали ЕЕУ, полученные при инфекциях в малом масштабе клеток НеБа в 6-луночных планшетах (титр ~5х105/мл). Библиотеку 3.1А и 3.1В пулировали вместе в один образец. Каждый из ЕЕУ, экспрессирующих 2368-А56К (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)), ЕЕУ, экспрессирующих 2408-А56К (1 мл вируса (5х 105 БОЕ)), и библиотеки 3.1 А/В (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)) объединяли с 300 мкл бусин с белком О (2х общепринятое количество/образец). 600 мкл РВ8+18 мкл С0100-Рс (=36 мкг) добавляли к бусинам. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить С0100-Рс связываться с бусинами с белком О. Бусины промывали и ресуспендировали, как описано выше для цикла 1. 100 мкл СО100-Рс/Рго О на образец (~12 мкг/мл С0100-Рс) добавляли к образцам вируса и инкубировали в течение 4,5 ч при комнатной температуре. Несвязавшийся и Связавшийся собирали и титровали. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (цикл 2 отбора назван СО100 3.2). Результаты цикла 2 отбора показаны в табл. 6.
- 25 028164
Таблица 6
Цикл 2 отбора СЭ100 ЛЬ
| Вирус-Антиген | Образец | Титр | % Связавшегося |
| 2408-СБЮО-Бс | Несвязавшийся | 384000 | |
| 2408-СБЮО-Бс | Связавшийся | 780 | 0,2% |
| 2368-СБ100-Ес | Несвязавшийся | 264000 | |
| 2368-СБ100-Ес | Связавшийся | 224000 | 46% |
| Библиотека 3.2-СБ100-Ес | Несвязавшийся | 780000 | |
| Библиотека 3.2-СБ100-Ес | Связавшийся | 5000 | 0, 6% |
Для библиотек 3.2 получены хорошая амплификация на В8С1, сбор и титр (~3х107/мл), и получена небольшая доля положительных клеток. Проводили третий цикл отбора.
Цикл 3 отбора.
Третий цикл отбора проводили с использованием таких же способов, описанных выше, с использованием библиотеки 3.2А (циклы 1 и 2=С0100-Ес/Рго О). Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (цикл 3 отбора назван СЭ100 3.3А). Результаты цикла 3А отбора тестировали проточной цитометрией. Второй цикл 3 отбора проводили с 100 мкг СЭ100-Н1§, конъюгированным с активированными тозилом магнитными бусинами в РВ8 с использованием способов, описанных выше. 50 мкл на образец добавляли для отбора с использованием той же партии вируса, которую использовали для СЭ100 3.3А (2368-Л56К (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)), 2408-Л56К (1 мл вируса (5х 105 БОЕ)) и 3.2А (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)). Растворы инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч. Несвязавшийся и Связавшийся собирали и титровали. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (цикл 3 отбора с активацией тозилом назван С0100 3.3В). Результаты цикла 3В отбора тестировали проточной цитометрией. Схема, обобщающая способ отбора антитела против С0100, проиллюстрирована на фиг. 6.
Окрашивание проточной цитометрией позволяло предполагать, что существовала вероятность положительной популяции в С0100 3.3А/В при спаривании с Б116. Бляшки из 3.3А (п=27) и 3.3В (п=30) отбирали и амплифицировали в течение 3 суток на В8С1 в 24-луночном планшете (1 бляшка на лунку). Клетки НеЕа инфицировали в 24-луночных планшетах 1/3 от каждой амплифицированной бляшки. Клетки совместно инфицировали Б116 при шо1=1 (контроль: 2368, 2408 и супернатант неинфицированных НеБа). ΕΕν продуцировали в течение 2 суток, собирали и инактивировали псораленом и облучением длинноволновым УФ-светом (РРЛЕУ). Вирус связывали с покрытыми СТ)100 (2 мкг/мл) и С35 (2 мкг/мл) планшетами О/Ν с использованием 50 мкл ΕΕν+50 мкл блокирующего буфера для ΕΕΙδΆ на лунку.
Связывание антитела детектировали добавлением анти-ЕаЬ-НКР. Два клона (3.3.С20 и 3.3.С27) обладали хорошим связыванием с СТ)100 и были секвенированы. Эти клоны дополнительно характеризовали проточной цитометрией по специфичности и аффинности. Клоны амплифицировали на В8С1 в Т75 и титровали. Инфицированные 3.3А/В (с Б116) клетки сортировали по СБ100. Вирус из сортированных клеток (150 клеток) амплифицировали, титровали и тестировали проточной цитометрией (100 мкг/мл СБ100-Н1§: 30 мин на льду, промывали 5 мл, затем анти-Н18-ЛРС + анти-ЕаЬ-ИТС: 30 мин на льду). Оба клона 20 и 27 связывались с СБ100, как определено проточной цитометрией.
Последовательности для двух высокоаффинных клонов УН для СБ100 (3.3.С20 и 3.3.С27) при спаривании с 1.116 являлись идентичными. Выравнивание последовательностей клонов показано на фиг. 7. Аминокислотная последовательность для вариабельной тяжелой цепи является следующей (СБК1-3 νΗ
Е УОЬУЕ 3 СССЪУКРССЗ ЬРЪ 3 СААЗ СЕ1 ЕТРУУЬЗТАГ1 РОАРСКСРЕТлТЬ 3 ΥΙ33Υ3ΡΥΤΝΥΑΡ3 (δΕς ΙΌ ΝΟ: 19).
подчеркнуты): УКСКЕТ13ΗΡΝΤΚΝ5IУЬаМЫЫРКУЕРТАУУУСАКАСЗУУетМСОСТЪУТ
Пример 6.
Скрининг библиотеки слитых белков СН1-Л56К для отбора антитела против Нег2.
Проводили отбор новых антител против Нег2 с использованием 1200000 клонов из библиотеки наивной тяжелой цепи, слитой с Л56К (обозначенной так же как библиотека 3)+клонов легкой цепи (Е48, Е116 и Е9021). Библиотека является такой же, какую использовали для отборов для СБ100, обсуждаемых выше.
Цикл 1 отбора.
Библиотеку 3 (1 мл вируса (~108 БОЕ)) использовали для этого отбора. Сначала 100 мкл РВ8+100 мкл Нег2-Ес (И&1) 8у§1еш§) (=10 мкг) добавляли к бусинам с белком О. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 25 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить Нег2-Ес связываться с бусинами с белком О. Бусины осаждали с помощью магнита, промывали 1 х 1 мл РВ8 и ресуспендировали в 100 мкл ΌΜΕΜ, дополненной 10%.
Затем 100 мкл Нег2-Ес/Рго О (~10 мкг/мл Нег2-Ес) добавляли к 1 мл библиотеки 3 и инкубировали в
- 26 028164 течение 4 ч при комнатной температуре. Бусины удаляли и несвязавшийся вирус собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВ8. Бусины удаляли с магнита, и добавляли 1 мл ΌΜΕΜ, дополненной 2,5%, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Для бусин, извлеченных из связавшейся библиотеки, проводили амплификацию на В8С1 в Т75 (цикл 1 отбора назван Нег2.3.1).
Цикл 2 отбора.
Амплифицированный Нег2.3.1 титровали и амплифицировали в формате 6-луночного планшета (совместно инфицированный с Б48, Б116 и Б9021), и дополнительный цикл отбора Нег2-Бе/РгоС проводили с использованием способов, описанных выше. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (цикл 2 отбора назван Нег2.3.2).
Цикл 3 отбора.
Амплифицированный Нег2.3.2 титровали и повторно амплифицировали в формате 6-луночного планшета (совместно инфицированный с 1.48. 1,116 и Б9021), и дополнительный цикл отбора Нег2Бе/РгоС проводили с использованием способов, описанных выше. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (цикл 3 отбора назван Нег2.3.3). Результаты отбора Нег2.3.2 и Нег2.3.3 тестировали проточной цитометрией. В этом эксперименте 3 мкг/мл С35-Н|з или 10 мкг/мл Нег2-№з инкубировали с анти-Н18-ЛРС МАВ в течение 30 мин на льду для формирования комплексов. Затем добавляли анти-РаЬ-ИТС, и комплексы антиген-анти-Н1з добавляли к клеткам на 30 мин на льду. Затем клетки промывали 2 мл РВ8, 0,5% В8А, 2нМ ЭДТА. Затем анти-Ыз-АРС и анти-РаЬ-ЫТС добавляли на 30 мин на льду, затем клетки промывали, фиксировали и проводили анализ проточной цитометрии. Как показано на фиг. 8, все три легкие цепи были обогащены по специфическим для Нег2 антителам.
Цикл 4 отбора.
Клетки Нека в формате 6-луночного планшета совместно инфицировали Нег2.3.3 и только Б116, ЕЕУ выделяли, как описано выше, и дополнительный цикл отбора Нег2-Ре/РгоС проводили с использованием способов, описанных выше. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на В8С1 в Т75 (цикл 4 отбора назван Нег2.3.4). Схема, обобщающая способ отбора антитела против Нег2, проиллюстрирована на фиг. 9.
Результаты отбора Нег2.3.3 и Нег2.3.4 тестировали проточной цитометрией с использованием способа окрашивания, описанного выше. Использовали контроль Н8000-А56К+Б8000 (8000=химерное 4Ό5; исходное антитело мыши для трастузумаба).
Результаты проточной цитометрии показали 2 популяции в образцах 3.3 и 3.4. Образец Нег2 3.4 совместно инфицировали в клетки Нека, и образец окрашивали по связыванию с Нег2, и сортировали положительные клетки. Клоны отбирали из отсортированного образца, и 30 бляшек после скрининга отбирали из Нег2.3.4/сорт и амплифицировали в течение 2 суток на В8С1 в 24-луночном планшете (1 бляшка на лунку). Клетки Нека инфицировали в 24-луночных планшетах 1/3 от каждой амплифицированной бляшки. Клетки совместно инфицировали Б116 при шо1=1 (контроль: 8000, 2368, 2408 и супернатант неинфицированных Нека). ЕЕУ продуцировали в течение 3 суток, собирали и инактивировали РкАНА'. Вирус связывали с покрытыми СН100 (2 мкг/мл) и Нег2 (2 мкг/мл) планшетами О/Ν с использованием 50 мкл ЕЕУ+50 мкл блокирующего буфера для ЕЫ8А на лунку. Результаты показаны на фиг. 10.
Связывание антитела детектировали добавлением анти-РаЬ-НКР. Пять положительных клонов идентифицировали с хорошим связыванием с Нег2 и секвенировали. Все 5 клонов обладали одной и той же последовательностью (см. фиг. 11).
Последовательность УН клона В10 показана ниже.
Последовательность клона В10 Нег2:
ЕУОЪЪЕЗСССЕУОРССЗЪКЪЗСААЗСЕАЕМЫУАЪЗЖ/КОАРСКСЪКЖЛЗАТЗРОСОУТУУАОЗ
УКСКЕ1ЕЗКОМЗКШЪЗЪОМТЗЪСАЕОТАЪУУСАКОШУКОСАУАСРЪОНИСОСТЪУТ (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 20).
Пример 7.
Скрининг библиотеки слитых белков СН1-А56К для отбора антитела против С35.
Проводили отбор новых антител против С35 с использованием ~1200000 клонов из библиотеки наивной тяжелой цепи, слитой с А56К (обозначенной так же как библиотека 3)+клонов легкой цепи (Б48, Б116 и Б9021). Библиотека является такой же, какую использовали для отборов СО100 и Нег2, обсуждаемых выше.
Цикл 1 отбора.
100 мкг С35 конъюгировали с активированными тозилом магнитными бусинами в РВ8 или в буфере для покрытия (СВ) для ЕЫ8А. Раствор инкубировали при 37°С в течение ночи и блокировали в течение 1 ч при 37°С с помощью РВ8, 10% БВ8, 0,5% В8А. Бусины промывали 1х, ресуспендировали в 160 мкл ΗΜΚΜ, дополненной 10%. 50 мкл каждого образца бусин добавляли к каждому образцу вируса и инкубировали при комнатной температуре в течение 3,5 ч. Несвязавшиеся собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВ8. Бусины удаляли с магнита, добавляли 1 мл ΗΜΚΜ, дополненной 2,5%, и бусины переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали.
Связавшуюся библиотеку амплифицировали на НеБа в Т75 (цикл 1 отбора назван С35 3.1). Ре- 27 028164 зультаты цикла С35 3.1 тестировали проточной цитометрией. Связывание С35 3.1 присутствовало, но являлось низким (данные не представлены).
Цикл 2 отбора.
Амплифицированный С35 3.1 титровали и использовали для продукции рекомбинантного ЕЕУ в формате 6-луночного планшета посредством совместной инфекции С35 3.1 с Ь48, Ь116 и Ь9021 (титр ~5х105/мл), и дополнительный цикл отбора с активированным тозилом С35 проводили с использованием способов, описанных выше. Растворы инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч вместо 3,5, как в цикле 1. Титры связавшегося и несвязавшегося вирусов показаны в табл. 7. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на НеЬа в Т75 (цикл 2 отбора назван С35 3.2), и связывание тестировали проточной цитометрией, как описано выше.
Таблица 7
Цикл 2 отбора с С35-Ш§/активированным тозилом С35 АЪ
Амплифицированный С35 3.2 титровали и использовали для продукции рекомбинантного ЕЕУ в формате 6-луночного планшета посредством совместной инфекции с Р48, Р116 и Р9021 (титр ~5х105/мл), и дополнительный цикл отбора с активированным тозилом С35 проводили с использованием способов, описанных выше для цикла 2. Титры связавшегося и несвязавшегося вирусов показаны в табл. 8. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на НеЬа в Т75 и тестировали по связыванию с С35 проточной цитометрией, как выше (цикл 3 отбора назван С35 3.3).
Таблица 8
Цикл 3 отбора с С35-Ш§/активированным тозилом С35 АЪ
| Вирус | Образец | Титр | % Связавшегося |
| 2368 | Несвязавшийся | 400000 | |
| 2368 | Связавшийся | 480 | 0, 1% |
| 2408 | Несвязавшийся | 228000 | |
| 2408 | Связавшийся | 108000 | 47% |
| Библиотека С35 3.3 | Несвязавшийся | 540000 | |
| Библиотека С35 3.3 | Связавшийся | 2600 | 0,5% |
Можно проводить скрининг клонов из С35 3.3, так же как возможный четвертый цикл отбора. Положительные клоны можно характеризовать проточной цитометрией и тестировать по специфичности, аффинности и функции.
Пример 8.
Избирательная амплификация вируса осповакцины, экспрессирующего тяжелые или легкие цепи.
Комбинированная инфекция отдельными рекомбинантными вирусами осповакцины, несущими либо тяжелую, либо легкую цепь иммуноглобулина, является эффективным способом экспрессии антител для отбора. Однако после отбора во время амплификации и сбора в настоящее время не существует механизма для разделения содержащих тяжелые и легкие цепи вирусов. Таким образом, может являться преимущественным иметь возможность амплифицировать содержащие тяжелые и легкие цепи вирусы осповакцины отдельно, как, например, в случае, когда инфекции как тяжелой, так и легкой цепью, проводят с множественностью более одного, и когда необходима деконволюция после отбора. По этой причине получали рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие либо тяжелую, либо легкую цепь, соединенные с селективным маркером для лекарственного средства (тяжелая цепь с устойчивостью к неомицину и легкая цепь с устойчивостью к гигромицину). Следующий эксперимент показывает полезность избирательной амплификации содержащих тяжелую или легкую цепь рекомбинантных вирусов осповакцины независимо.
Клетки В8С1 рассевали в 15 лунок 6-луночных планшетов при 1,25х106 клеток на лунку и при 2,5 мл на лунку. На следующие сутки серии разведений гигромицина или С418 для отбора получали в соответствии с табл. 9. ЭМЕМ-2,5 представляет собой ЭМЕМ, содержащую 2,5% РВ8.
- 28 028164
Таблица 9А
Получение разведений гигромицина
| Разведения гигромицина [исходная концентрация]=50 мг/мл | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 0,2 | 0,1 | 0, 08 | 0,04 | 0,02 | 0,01 | |
| мг/мл | мг/мл | мг/мл | мг/мл | мг/мл | мг/мл | |
| Необходимый | 6 | 6 | 12 | 0,5 X | 0,5 X | 0,5 X |
| объем | серийное | серийное | серийное | |||
| культуры | ||||||
| (мл) : | ||||||
| Добавить | 24 | 12 | 19,2 | 6 мл из | 6 мл из | 6 мл из |
| гигромицин | 3 в 6 мл | 4 в 6 мл | 5 в 6 мл | |||
| (мкл): | ϋΜΕΜ-2,5 | ϋΜΕΜ-2,5 | ϋΜΕΜ-2,5 | |||
| Для ϋΜΕΜ- | 5,976 | 5,988 | 5,9808 | |||
| 2,5 (мл) : |
Таблица 9В
вирусом осповакцины, содержащим соответствующие селективные маркеры (УНЕ Н5 ЕХ-1КЕ8-НУОК0 или УНЕ Н5 НХ-А56К NЕΟ). Затем разведения гигромицина и О418 вводили в лунки планшета в одно и то же время. ИМЕМ-2,5, не содержащую антибиотиков, добавляли в контрольные лунки. Инфекцию проводили в объеме 0,65 мл на лунку, и клетки инкубировали при 37°С. Через 2 ч объемы среды доводили до 2,65 мл на лунку и дополняли дополнительным гигромицином или О418 для поддержания намеченных концентраций в содержащих лекарственное средство лунках. В то же время новые клетки В8С1 рассевали в 12-луночные планшеты при 2х105 клеток на лунку для определения титра после инфекции.
Через 24 ч после инфекции все образцы собирали в 15 мл конические пробирки для центрифугирования, замораживали-размораживали три раза, встряхивали и ресуспендировали осторожным встряхиванием в 1,8 мл ИМЕМ-2,5. Образцы обрабатывали ультразвуком в течение 2 мин при максимальной интенсивности, и затем переносили в 2,0 мл пробирку 8агк1есН. Серии разведений получали для каждого образца в 7,5 мл полипропиленовых пробирках. Сначала 3 0 мкл из исходного отбирали из каждого образца и объединяли со свободной от антибиотиков ИМЕМ-2,5 до конечного объема 3000 мкл (разведение 1:10). Затем 30 мкл разведения 1:102 добавляли ко второму конечному объему 3000 мкл для получения разведения 1:104. Затем проводили серии разведений 1:10 для получения разведений 1:105-1:109. Все разведения встряхивали в боксе микробиологической безопасности с использованием 5 мл пробирок.
Клетки В8С1 в планшетах для титрования затем инфицировали с использованием шести разведений (1:104-1:109) из каждого образца посредством распределения 0,333 мл каждого разведения для титрования на лунку для анализа в двух повторах. Таким образом, коэффициент для расчета титра равен общему количеству бляшек в 2 повторах лунок, деленному на 0,66 мл. После инфекции инкубировали в течение по меньшей мере 2 ч при 37°С. Дополнительные 1,0 мл ИМЕМ-2,5 добавляли в каждую лунку после исходных 2 ч адсорбции и инфекции.
Через 48 ч после инфекции кристаллический фиолетовый добавляли в 12-луночные планшеты для титрования. Подсчитывали только бляшки диаметром более 1 мм. Дочерние бляшки исключали из подсчета.
Результаты показаны в табл. 10. В экспериментах по устойчивости к гигромицину 0,01-0,08 мг/мл гигромицина значительно ингибировали амплификацию вируса осповакцины, экспрессирующего тяжелую цепь, связанную с маркером устойчивости к неомицину, но оказывали небольшой эффект ингибиро- 29 028164 вания или не оказывали эффекта ингибирования (за исключением точки данных 0,04 мг/мл) на амплификацию вируса осповакцины, экспрессирующего легкую цепь, связанную с маркером устойчивости к гигромицину, пока концентрацию гигромицина не увеличивали до 0,1-0,2 мг/мл. Сходным образом в экспериментах по устойчивости к неомицину 0,125-2 мг/мл О418 значительно ингибировали амплификацию вируса осповакцины дикого типа, но не оказывали эффекта ингибирования на амплификацию вируса осповакцины, экспрессирующего тяжелую цепь, связанную с маркером устойчивости к неомицину.
Таблица 10А
Результаты экспериментов по устойчивости к гигромицину
| УСТОЙЧИВОСТЬ К ГИГРОМИЦИНУ | |||
| Ю образца | Титр | % ингибирования | |
| Гигромицин 0,2 мг/мл УКЕ Н5 | ЬХ-1НЕЗ- | 2,20Е+07 | 53, 0 |
| ΗΥΟΗΟ | |||
| Гигромицин 0,1 мг/мл УКЕ Н5 ηυοκο | ЬХ-1НЕЗ- | 1,70Е+07 | 63, 6 |
| Гигромицин 0,08 мг/мл УКЕ ΙΚΕ5-ΗΥΟΚΟ | Н5 ЬХ- | 4,47Е+07 | 4,5 |
| Гигромицин 0,04 мг/мл УКЕ ΙΚΕ5-ΗΥΟΚΟ | Н5 ЬХ- | 2,77Е+07 | 40, 9 |
| Гигромицин 0,02 мг/мл УКЕ ΙΚΕ5-ΗΥΟΚΟ | Н5 ЬХ- | 4,66Е+07 | 0,4 |
| Гигромицин 0,01 мг/мл УКЕ ΙΚΕ5-ΗΥΟΚΟ | Н5 ЬХ- | 5,98Е+07 | -27,9 |
| Гигромицин 0,08 мг/мл УНЕ Н5 ΝΕΟ | НХ-А56Н | 2,43Е+06 | 89, 1 |
| Гигромицин 0,04 мг/мл УНЕ Н5 ΝΕΟ | НХ-А56Н | 2,66Е+06 | 88, 1 |
| Гигромицин 0,02 мг/мл УНЕ Н5 ΝΕΟ | НХ-А56Н | 2,70Е+06 | 87,9 |
| Гигромицин 0,01 мг/мл УНЕ Н5 ΝΕΟ | НХ-А56Н | 6,86Е+06 | 69, 3 |
| [без антибиотика] УКЕ Н5 ΗΥΟΗΟ | ЬХ-1НЕ5- | 3,86Е+07 | Контроль для гигромицина #1 |
| [без антибиотика] УКЕ Н5 ΗΥΟΗΟ | ЬХ-1НЕ5- | 5,49Е+07 | Контроль для гигромицина #2 |
| [без антибиотика] УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 2,23Е+07 | Контроль для неомицина |
Таблица 10В
Результаты экспериментов по устойчивости к неомицину
| УСТОЙЧИВОСТЬ К НЕОМИЦИНУ | ||
| Ю образца | Титр | % ингибирования |
| 0418 0,125 мг/мл ИТ | 1,58Е+07 | 60, 8 |
| 0418 0,25 мг/мл ИТ | 8,26Е+06 | 79, 4 |
| 0418 0,5 мг/мл ИТ | 2,54Е+06 | 93, 7 |
| 0418 1 мг/мл ИТ | 1,36Е+06 | 96, 6 |
| 0418 2 мг/мл ИТ | 1,59Е+05 | 99, 6 |
| 0418 0,125 мг/мл УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 2,88Е+07 | -26,7 |
| 0418 0,25 мг/мл УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 3,11Е+07 | -36,7 |
| 0418 0,5 мг/мл УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 3,41Е+07 | -50,0 |
| 0418 1 мг/мл УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 3,18Е+07 | -40,0 |
| 0418 2 мг/мл УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 3,03Е+07 | -33,3 |
| 0418 0 мг/мл ИТ | 4,02Е+07 | Контроль для неомицина #1 |
| 0418 0 мг/мл УНЕ Н5 НХ-А56Н ΝΕΟ | 2,27Е+07 | Контроль для неомицина #2 |
- 30 028164
Таким образом, рекомбинантные вирусы осповакцины, экспрессирующие иммуноглобулин и маркеры устойчивости к лекарственному средству, связанные через внутренний участок связывания рибосомы (1КЕ8), обеспечивают защиту против гибели клеток-хозяев при обработке этим лекарственным средством. Это позволяет специфическое для цепи размножение вируса, так же как отбор против вируса осповакцины дикого типа в ходе рекомбинации.
Пример 9.
Экспрессия слитого белка А56К на поверхности клеток НеБа.
Клетки НеБа совместно инфицировали рекомбинантным вирусом осповакцины ЕЕУ, экспрессирующим слитые с иммуноглобулинами конструкции, вариабельную тяжелую (Н8000) СН1-А56К с Б8000 1д-К, которые вместе кодируют РаЬ-фрагмент антитела (РаЬ), вариабельную тяжелую (Н8000) РБ-А56К с Б8000 1д-К, которые вместе кодируют полноразмерное (РБ) 1дС, вариабельную тяжелую (Н8000) РБукороченную-А56К с Б8000 1д-К, которые вместе кодируют полноразмерное 1дС с более коротким А56К (ТК), вариабельную тяжелую (Н2124) РБ-А56К с Б517 1д-К (2408 РБ) и вариабельную тяжелую (Н2124) РБ-укороченную-А56К с Б517 1д-К (2408 ТК) в 12-луночных планшетах. Схема, показывающая конструкции РаЬ, ТК и 1дС, показана на фиг. 12. Проводили анализ активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАС8) для окрашивания С35 и окрашивания Нег2 на клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины. После ~18 ч клетки окрашивали с помощью С35Н18/Н18-АРС и Нег2-Н1з/Н1з-АРС, и анти-РаЬ-Р1ТС; и детектировали анализом Р1.ОШ в Сап1о. Кратко, клетки обрабатывали трипсином и разделяли на два образца; промывали 2 мл буфера для промывки; к одному из двух образцов добавляли 10 мкг/мл Нег2-Н1з или 4 мкг/мл С35-Н1з и инкубировали в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали и добавляли анти-Н1з АРС, и образцы инкубировали в течение 30 мин на льду, окрашивали вторичным реагентом для детекции анти-РаЬ-Р1ТС, и затем образцы промывали, фиксировали (0,5% параформальдегид с 1:100Р1 в течение 20 мин на льду) и анализировали посредством Н.ОШ в Сап1о. Данные РАС8 показаны на фиг. 13-15. Эти результаты показывают, что слитые с А56К белки, экспрессирующие либо РаЬ, либо полноразмерное 1дС, были экспрессированы на поверхности клеток, и что только трансмембранный и внутриклеточный домены А56К являются необходимыми для экспрессии 1дС на поверхности.
Пример 10.
Отбор Уас-1д на основе раствора.
Отбор на активированных тозилом бусинах.
ЕЕУ, экспрессирующие С35-специфические (Н2124) РаЬ, РБ и ТК УН совместно инфицировали вместе с Б517 в клетки НеБа в 6-луночных планшетах, и ЕЕУ собирали из супернатанта посредством центрифугирования при 1200 об/мин и сбора супернатанта (ЕЕУ) после приблизительно 48 ч инфекции. В качестве контроля специфические для Нег2 Н8000-РаЬ+Б8000 получали таким же способом. Для отбора на бусинах 100 мкг С35-Н1з конъюгировали с активированными тозилом магнитными бусинами в РВ8. Раствор инкубировали при 37°С в течение ночи и блокировали в течение 1 ч при 37°С с помощью РВ8, 10% РВ8, 0,5% В8А. Бусины промывали 1х, ресуспендировали в 160 мкл БМЕМ, дополненной 10%. 50 мкл каждого образца бусин добавляли к каждому образцу вируса и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Несвязавшиеся ЕЕУ собирали после общепринятых 5х промывок 1 мл РВ8. Бусины удаляли с магнита, добавляли 1 мл БМЕМ, дополненной 2,5%, и бусины переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали.
Как показано в табл. 11, вирусы осповакцины, экспрессирующие С35-специфические конструкции слитых как с РаЬ, так и с РБ, белков были отобраны, в то время как конструкция со слитым с ТК белком не была отобрана. Эти данные позволяют предполагать, что некоторые внеклеточные последовательности А56К являются необходимыми для включения в ЕЕУ.
Таблица 11
Результаты отбора на активированных тозилом бусинах
| Вирус | % связавшегося |
| МаЬ 2408-ГаЬ | 24% |
| МаЬ 2408-ГЪ | 18% |
| МаЬ 2408-ТН | 2,3% |
| МаЬ 8000-ГаЬ | 0, 8% |
Пример 11.
Скрининг библиотеки слитых белков СН1-А56К для отбора антитела против СБ100.
Проводили отбор новых антител против СБ100 антитела с использованием библиотеки тяжелых цепей, состоящей из ~7000000 клонов, содержащих комбинацию последовательностей наивных УН и синтетических УН, полученных в векторе А56К-РаЬ. Для получения осповакцины, экспрессирующей библиотеку 1д на поверхности ЕЕУ, библиотеку слитых с А56К белков (обозначенную также как библиотека 10) совместно инфицировали в 1 х 109 клеток НеБа вместе с коктейлем из 9 клонов легких цепей (цепи каппа: Б48, Б116, Б122, Б7110 и Б9021 и цепи лямбда: Б3-1, Б151, Б214 и Б223). Общая то1 вируса с тяжелой цепью составляла 1, и общая то1 вируса с легкой цепью составляла 1, где каждая легкая цепь
- 31 028164 составляла приблизительно 1/9 от всего добавленного вируса с легкой цепью.
Клетки ИеБа-З, растущие в суспензии, инфицировали в течение 2 суток, после чего супернатант собирали, осаждали 2х центрифугированием при низкой скорости, и ЕЕУ осаждали при 13000 об/мин в течение 1 ч в роторе Е16/Е250. ЕЕУ ресуспендировали в 3 мл ΌΜΕΜ, дополненной 10% ЕВЗ, и 1 мл использовали для отбора специфических для СЭ100 антител.
Цикл 1 отбора.
ЕЕУ, экспрессирующие 2368-Л56К (1 мл вируса с приблизительно ~5х105 БОЕ)), и ЕЕУ, экспрессирующие 2408-Л56К (1 мл вируса с приблизительно 5х105 БОЕ), использовали в качестве контроля, и библиотеку 10 (1 мл вируса с приблизительно ~108 БОЕ) использовали для анализа отбора. Сначала 300 мкл бусин с белком О (2х общепринятое количество/образец) осаждали с помощью магнита, и 600 мкл РВЗ+18 мкл СЭ100-Ес (=36 мкг) добавляли к бусинам. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить СЭ100-Ес связываться с бусинами с белком О. Бусины осаждали с помощью магнита, промывали 1 х 1 мл РВЗ и ресуспендировали в 300 мкл □МЕМ, дополненной 10% ЕВЗ.
Затем 100 мкл СБ100-Ес/Рго О на образец (приблизительно 12 мкг/мл СБ100-Ес) добавляли к ЕЕУ (контроль 2408 и 2368 и библиотека 10) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Несвязавшийся вирус удаляли после общепринятых 5х промывок 1 мл РВЗ. Бусины удаляли с магнита, и добавляли 1 мл БМЕМ, дополненной 2,5%, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Результаты показаны в табл. 12. Связавшийся вирус амплифицировали на клетках ВЗС1 во флаконах Т175 в течение 3 суток.
Таблица 12
Результаты отбора на активированных тозилом бусинах
| Вирус | Отбор | Титр несвязавшегося | Титр связ авшегося | Процент связ авшего ся |
| Библиотека 10 | СБЮО-Бс | 1,5х10Л8 | 2,2х10л6 | 0, 15 |
| 2368 | СБЮО-Бс | 72000 | 37000 | 34 |
| 2408 | СБЮО-Бс | 338400 | 80 | 0, 12 |
Эти результаты показывают, что для библиотеки 10.1 получены хорошая амплификация на ВЗС1, сбор и титр.
Цикл 2 отбора.
ЕЕУ из 10.1+свежую аликвоту 9 легких цепей получали посредством инфекции клеток ИеБа в многоуровневом культуральном флаконе при шо1=1 для каждого в течение 2 суток, и сбора, как описано выше. Собранный вирус разделяли пополам, где для 50% проводили отбор на бусинах РгоО, и для 50% проводили отбор на покрытых СЭ100 активированных тозилом бусинах.
Цикл 2 с использованием отбора на бусинах с РгоО.
ЕЕУ, экспрессирующие 2368-Л56К (1 мл вируса (~5х 105 БОЕ)), ЕЕУ, экспрессирующие 2408-Л56К (1 мл вируса (5х 105 БОЕ)), и библиотеку 10.1 (1 мл вируса (5х 105 БОЕ)) использовали для отбора. 600 мкл РВЗ+18 мкл СБ100-Ес (=36 мкг) добавляли к бусинам с Рго-О. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить СЭ100-Ес связываться с бусинами с белком О. Бусины промывали и ресуспендировали, как описано выше для цикла 1. 100 мкл СЭ100-Ес/Рго О на образец (~12 мкг/мл СЭ100-Ес) добавляли к образцам вируса и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Несвязавшийся и Связавшийся собирали и титровали. Связавшуюся библиотеку амплифицировали на ВЗС1 в Т75 (цикл 2 отбора назван СЭ100 10.2/РгоО). Результаты цикла 2 отбора показаны в табл. 13А. Связавшийся вирус амплифицировали на ВЗС1 во флаконах Т175 в течение 3 суток.
Цикл 2 с использованием отбора на активированных тозилом бусинах.
ЕЕУ, экспрессирующие такие же антитела 2408 (С35-специфическое), 2368 (СЭ100-специфическое) и библиотеки 10, использованные в экспериментах отбора на бусинах с белком О выше, использовали для отбора на активированных тозилом магнитных бусинах. 100 мкг С0100-И18 конъюгировали с активированными тозилом магнитными бусинами в РВЗ. Раствор инкубировали при 37°С в течение ночи и блокировали в течение 1 ч при 37°С РВЗ, 10% ЕВЗ, 0,5% ВЗА. Бусины промывали IX ЭМЕМ, 10% ЕВЗ, ресуспендировали в 160 мкл ЭМЕМ, дополненной 10% ЕВЗ. 50 мкл каждого образца бусин добавляли к каждому образцу вируса и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Несвязавшийся вирус собирали при общепринятых 5х промывках 1 мл РВЗ. Бусины удаляли с магнита, добавляли 1 мл □МЕМ, дополненной 2,5%, и бусины переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали. Связавшийся вирус амплифицировали на ВЗС1 во флаконах Т175 в течение 3 суток. Результаты цикла 2 отбора показаны в табл. 13В.
- 32 028164
Таблица 13А
Цикл 2 отбора СЭ100 АЬ (отбор на бусинах с белком Θ)
| Вирус | Отбор | Титр несвязавшегося | Титр связ авшегося | Процент связ авшего ся |
| Библиотека 10.1 с белком 6 | СБЮО-Бс | 4,4х10Л7 | 67,000 | 0, 15 |
| 2368 | СБЮО-Бс | 104,400 | 66,000 | 38,7 |
| 2408 | СВЮ0-Бс | 240,000 | 80 | 0, 03 |
Таблица 13В
Цикл 2 отбора СЭ100 АЬ (отбор на активированных тозилом бусинах)
| Вирус | Отбор | Титр не связ авшего ся | Титр связавшегося | Процент связ авшего ся |
| Библиотека 1 0.1 с тозилом | СВ100-Н13 | 2,4х10Л7 | 113000 | 0,47 |
| 2368 | СВ100-Н13 | 56400 | 106000 | 34,4 |
| 2408 | СБЮО-Нтз | 354000 | 0 | 0 |
Эти результаты показывают, что для обеих библиотек как 10.2/РгоО, так и 10.2/тозил, получена хорошая амплификация на ВЗС1.
Циклы 3 отбора.
Третий цикл отбора проводили с использованием таких же способов, описанных выше. Для 10.2/РгоО проводили третий цикл отбора с СЭ100-Ес/РгоО, и для 10.2/тозил проводили третий цикл отбора с СВ100-Н1§/тозил. ЕЕУ из 10.2/РгоО+свежую аликвоту 9 легких цепей получали посредством инфекции клеток НеБа в Т175 при то1=1 для каждого из общего рекомбинантного вируса с тяжелой цепью и общего рекомбинантного вируса с легкой цепью в течение 2 суток, и сбора, как описано выше. ЕЕУ из 10.2/тозил+свежую аликвоту 9 легких цепей получали посредством инфекции клеток НеБа во флаконе Т175 при то1=1 для каждого из общего рекомбинантного вируса с тяжелой цепью и общего рекомбинантного вируса с легкой цепью в течение 2 суток, и сбора, как описано выше. Титры показаны в табл.
14А-В.
Таблица 14А
Цикл 3 отбора СЭ100 АЬ (отбор на бусинах с белком Θ)
| Вирус | Отбор | Титр не связ авшего ся | Титр связавшегося | Процент связ авшего ся |
| Библиотека 10.2 с белком С | СБЮО-Бс | 2,5х10Л7 | 364000 | 1,44 |
| 2368 | СБЮО-Бс | 84000 | 58000 | 48,5 |
| 2408 | СБЮО-Бс | 99600 | 0 | 0 |
Таблица 14В
Цикл 3 отбора СЭ100 АЬ (отбор на активированных тозилом бусинах)
| Вирус | Отбор | Титр несвязавшегося | Титр связ авшего ся | Процент связавшегося |
| Библиотека | СБ100-Н13 | 8,2х10Л6 | 6100 | 0,074 |
| 10.2 с | ||||
| тозилом | ||||
| 2368 | СБ100-Н13 | 69600 | 108000 | 60, 8 |
| 2408 | СБЮО-Нтз | 121000 | 0 | 0 |
Связавшуюся библиотеку амплифицировали на ВЗС1 в Т75 (цикл 3 отбора назван СЭ100 10.3РгоО и СЭ100 10.3/Тозил). Результаты цикла 3 отбора тестировали проточной цитометрией.
В этом эксперименте аликвоты отборов 10.3 совместно инфицировали по отдельности с каждой легкой цепью и затем тестировали по связыванию с СЭ100 и Нег2. Клетки НеБа инфицировали при то1=1. После инфекции в течение ночи клетки собирали и окрашивали по связыванию с СЭ100 и связыванию с Нег2 в качестве контроля. Клетки обрабатывали трипсином, промывали ледяным буфером Е1ом (ЕВ 1ХРВЗ, 0,5%ВЗА, 2 мМ ЭДТА) и детектировали каждым из трех различных способов детекции. В первом способе детекции (2-стадийном) клетки инкубировали в течение 30 мин с 10 мкг/мл ЬиСП100-Н1§ в ЕВ на льду, затем промывали 2 мл ЕВ и инкубировали с 1:50 (2 мкг/мл) анти 6ХН1§-АРС мыши, смешанными с 1:500 (2 мкг/мл) меченных Е1ТС ЕаЬ козы против ЕаЬ человека на льду в течение 30 мин. Во
- 33 028164 втором и третьем способах детекции (с прекомплексами) либо 10 мкг/мл йиСВ100-Н18 или 10 мкг/мл НиНег2-Н1§ предварительно инкубировали с 1:50 (2 мкг/мл) анти-6ХН18-АРС мыши в РВ на льду в течение 30 мин, затем смесь добавляли к клеткам с 1:500 (2 мкг/мл) С1РаЪ против НиРаЪ-Р1ТС и инкубировали в течение 30 мин на льду. После инкубации с реагентами для детекции клетки промывали 1х 2 мл РВ, разводили в 0,5% параформальдегиде и инкубировали на льду в течение 20 мин. 20000 событий считывали на РАСЗ СаЩо. Результаты показаны на фиг. 16-22.
Окрашивание проточной цитометрией показало, что существовала положительная популяция связывающих СБ100 в СБ100 10.3/РгоС и тозил при спаривании с большинством легких цепей. В частности, сильно положительную популяцию наблюдали при совместной инфекции с Ь3-1.
Чтобы выделить специфические УН, клетки НеЬа по отдельности инфицировали 10.3/РгоС или 10.3/тозил, и совместно инфицировали Ь3-1. После инфекции в течение ночи клетки собирали и окрашивали по связыванию с СБ100 способом с образованием прекомплексов, как описано выше. Затем антигенсвязывающие клетки выделяли сортировкой клеток. После сортировки вирус высвобождали из клеток посредством замораживания/размораживания, и затем вирус амплифицировали на клетках ВЗС1. Амплифицированный образец выделенных ЕЕУ-УН цепей тестировали по обогащению посредством аналитического проточного анализа. В этом анализе аликвоту амплифицированного отсортированного образца СБ100 10.3 совместно инфицировали с легкой цепью Ь3-1 и затем тестировали по связыванию с СБ100 и Нег2 с помощью 2-стадийного способа и способа с образованием прекомплексов, описанных выше. Результаты показаны на фиг. 23-25.
После амплификации вирус собирали, и ДНК выделяли из аликвоты вируса с использованием набора ^^а§еη Ι)ΝΛ Ъ1ооб тЫ (кат# 51104). Очищенную ДНК амплифицировали ПЦР со специфическими для тяжелой цепи праймерами 428; 5'-САТАТАТТАААСТССААТАААСТС-3' (ЗЕр ГО N0: 31) и 430; 5'САСАТСАСАТАСТТТАСТТСС-3' (ЗЕр ГО N0: 32). Полученный продукт ПЦР клонировали в плазмидный вектор, содержащий секретируемое полноразмерное 1дС1 человека (ЕРУН), и затем ген У, содержащийся в полученных колониях, секвенировали. Обобщение результатов секвенирования показано в табл. 15. После секвенирования 188 клонов из 10.3/РгоС идентифицировали 44 уникальных клона, и после секвенирования 188 клонов из 10.3/тозил идентифицировали 46 уникальных клонов.
Таблица 15
Обобщение уникальных клонов
| Скрининг | Секвенировано клонов | Уникальные последовательности | Связывание по ЕЫЗА |
| 10.3/РгоС | 188 | 44 | 56, 8% |
| 10.3/тозил | 188 | 46 | 60, 9% |
Плазмидную ДНК для каждой уникальной тяжелой цепи совместно трансфицировали вместе с плазмидным вектором, кодирующим УЬ3-1, в клетки СНО с использованием липофектамина 2000 в течение 3 суток, и затем антитело, содержащееся в среде, тестировали по специфичности для СБ100 посредством проточной цитометрии на СБ100+клетках 1игка1 и посредством ЕЫЗА (фиг. 26 и 27А-В соответственно). Для анализа проточной цитометрии экспериментальное антитело предварительно инкубировали при 1 мкг/мл с 1:400 или [2,5 мкг/мл] вторичного антитела С1 анти Ни РсГОуНдЫ 649 в буфере 1;1о\у (1хРВЗ, 0,5%ВЗА, 2 мМ ЭДТА). Клетки 1игка1 рассевали при 250000/лунку в 96-луночном планшете и инкубировали с предварительно сформированным комплексом АЪ в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали 2х200 мкл буфера 1;1о\у и инкубировали в течение 20 мин с 0,5% параформальдегидом с 1х иодидом пропидия (Р1). Клетки детектировали на РАСЗ СаШо, считывающем 10000 событий, отобранных на популяции живых клеток. Всего показано, что по меньшей мере 75 уникальных антител являются специфическими для СБ100 по ЕЫЗА или проточной цитометрии.
Пример 12.
Скрининг библиотеки слитых белков СН1-А56К для отбора антитела против Нег2.
Библиотеку тяжелых цепей, содержащую ~3000000 клонов, содержащих комбинацию последовательностей наивных УН и синтетических УН, получали в векторе А56К-РаЪ в форме слитого белка с ГОЕЗ-неомицином. Для получения осповакцины, экспрессирующей библиотеку 1д на поверхности ЕЕУ, библиотеку слитых с А56К белков (обозначенную также как библиотека 9) совместно инфицировали вместе с библиотекой из 1000 клонов легкой цепи каппа, содержащих ген устойчивости к гигромицину, в 5х109 клеток НеЬа. Библиотека легких цепей состояла из последовательностей УК, выделенных из костного мозга человека (наивных). Общая то1 вируса с тяжелой цепью составляла 1, и общая то1 вируса с легкой цепью составляла 1.
Клетки НеЬа-З, растущие в суспензии, инфицировали в течение 2 суток, после чего супернатант собирали, осаждали 2х центрифугированием при низкой скорости, и ЕЕУ осаждали при 13000 об/мин в течение 1 ч в роторе Р16/Р250. ЕЕУ ресуспендировали в 3 мл БМЕМ, дополненной 10% РВЗ, и 1 мл использовали для отбора специфических для Ней^еи антител.
Цикл 1 отбора.
Библиотеку 9 использовали для этого отбора. Сначала 100 мкл РВЗ+24 мкг Нег2-Рс добавляли к 600
- 34 028164 мкл бусин с белком О. Раствор инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин (во вращающем устройстве), чтобы позволить Нег2-Ес связываться с бусинами с белком О. Бусины осаждали с помощью магнита, промывали 1 х 1 мл РВ8 и ресуспендировали в 400 мкл ЭМЕМ, дополненной 10% ЕВ8.
Затем 100 мкл Нег2-Ес/Рго О (~6 мкг/мл Нег2-Ес) добавляли к 1 мл библиотеки 9 и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Сходное количество бусин добавляли к положительному контролю МАЬ 8000 ЕЕУ и отрицательному контролю МАЬ 2408 ЕЕУ. Бусины удаляли, и несвязавшийся вирус собирали при общепринятых 5х промывках 1 мл РВ8. Бусины удаляли с магнита, и добавляли 1 мл ЭМЕМ, дополненной 2,5% ЕВ8, и раствор переносили в свежую пробирку (Связавшийся). Несвязавшийся и Связавшийся титровали (см. табл. 16). Бусины, извлеченные из связавшейся библиотеки, амплифицировали на В8С1 в трех флаконах Т175 в присутствии 1 мг/мл О418. При этой амплификации отбирали рекомбинантный вирус с тяжелой цепью. (Цикл 1 отбора назван Нег.9.1).
Таблица 16
Цикл 1 отбора Нег2 АЬ
| Вирус | Отбор | Титр не связ авшегося | Титр связавшегося | Процент связ авшего ся |
| Библиотека 9 | Нег2-Бс | 1,4х10Л9 | 4,6х10Л6 | 0, 32 |
| 2408 | Нег2-Гс | 1,2х10Л5 | 180 | 0, 14 |
| 8000 | Нег2-Бс | Зх10Л5 | 7,2х10Л4 | 19,3 |
Цикл 2 отбора.
Амплифицированный Нег.9.1 титровали, и второй цикл отбора проводили посредством совместной инфекции Нег.9.1 УН и свежей аликвоты библиотеки УК1000 в клетки НеЕа в 2 многоуровневых культуральных флаконах в течение 2 суток. Вирус собирали, как описано выше, и дополнительный цикл отбора Нег2-Ес/РгоО проводили с использованием способов, описанных выше. 50% связавшегося вируса амплифицировали на В8С1 в двух флаконах Т175 с 1 мг/мл О418 (для отбора тяжелых цепей), и 50% связавшегося вируса амплифицировали на В8С1 в двух флаконах Т175 с 0,030 мг/мл гигромицина (для отбора легких цепей). Результаты титрования показаны в табл. 17. Амплифицированные вирусы названы Нег.9.2/УН и Нег.9.2/УК.
Цикл 3 отбора.
Таблица 17
Амплифицированные Нег.9.2/УН и Нег.9.2/УК титровали, совместно инфицировали в клетки НеЬа в многоуровневом культуральном флаконе в течение 2 суток, ЕЕУ очищали, как описано выше, и дополнительный цикл отбора Нег2-Ес/РгоО проводили с использованием способов, описанных выше.
50% связавшегося вируса амплифицировали на В8С1 во флаконе Т175 с 1 мг/мл О418 (для отбора тяжелых цепей), и 50% связавшегося вируса амплифицировали на В8С1 во флаконе Т175 с 0,030 мг/мл гигромицина (для отбора легких цепей). Амплифицированные вирусы названы Нег.9.3/УН и Нег 9.3/УК.
Отбор специфических для Нег2 антител в Нег.9.3/УН и Нег 9.3/УК тестировали проточной цитометрией. Клетки НеЬа совместно инфицировали при то1=1 Нег9.3/УН и Нег9.3/УК в течение ночи и затем окрашивали по связыванию с Нег2 при отсутствии связывания с контрольным антигеном (С35). В этом эксперименте 3 мкг/мл С35-Н1К или 6 мкг/мл Нег2-Нш инкубировали с антителом анти-Шк-АРС в течение 30 мин на льду для формирования комплексов. Затем добавляли анти-РаЬ-ИТС, и комплексы антиген-анти-Нш добавляли к клеткам на 30 мин на льду. Затем клетки промывали 2 мл РВ8, 0,5% В8А, 2 нМ ЭДТА. Клетки фиксировали и проводили анализ проточной цитометрии. Данные показали обогащение как УН, так и УК.
Для дальнейшего обогащения свежие клетки НеЬа инфицировали 9.3УН и УК при то 1=1 каждая, клетки окрашивали, как выше, и затем антигенсвязывающие клетки отсортировывали. Вирус высвобождали из отсортированных клеток посредством трех циклов замораживания/оттаивания, и затем 50% вируса амплифицировали на В8С1 во флаконе Т75 с 1 мг/мл О418 (для отбора тяжелых цепей) и 50% вируса амплифицировали на В8С1 во флаконе Т75 с 0,030 мг/мл гигромицина (для отбора легких цепей). Амплифицированные вирусы титровали и назвали Нег.9.3/УН/сорт и Нег 9.3/УК/сорт.
Отбор специфических для Нег2 антител в Нег.9.3/УН/сорт и Нег 9.3/УК/сорт тестировали проточной цитометрией. Клетки НеЬа совместно инфицировали при то1=1 Нег.9.3/УН/сорт и Нег.9.3/УК/сорт в течение ночи и затем окрашивали по связыванию с Нег2 при отсутствии связывания с контрольным антигеном (С35). В этом эксперименте 3 мкг/мл С35-Н1К или 6 мкг/мл Нег2-Нш инкубировали с антителом анти-НЪ-АРС в течение 30 мин на льду для формирования комплексов. Затем добавляли анти-РаЬ-ИТС,
- 35 028164 и комплексы антиген-анти-НЬ добавляли к клеткам на 30 мин на льду. Затем клетки промывали 2 мл РВЗ, 0,5% ВЗА, 2 нМ ЭДТА. Клетки фиксировали и проводили анализ проточной цитометрии. Данные показали обогащение как УН, так и УК.
Для фиксации антигенспецифического спаривания УН и УК Нег.9.3/УН/сорт и Нег 9.3/УК/сорт совместно инфицировали в клетки НеЬа при то1=0,1 каждая и затем окрашивали, как описано для связывания с Нег2 выше. Клетки снова подвергали сортировке, но в этот раз индивидуальные инфицированные клетки сортировали в индивидуальные лунки 96-луночного планшета. Каждая антигенсвязывающая отсортированная клетка должна содержать фиксированное антигенспецифическое спаривание специфической УН со специфической УК. После сортировки клетки подвергали замораживанию/размораживанию, и затем вирус амплифицировали на ВЗС1 в 96-луночном планшете с амплификацией вируса из одной клетки в одной реципиентной лунке. Через 5 суток планшеты подвергали замораживанию/размораживанию, и затем аликвотой вируса в каждой лунке инфицировали клетки НеЬа в 96луночном планшете. Вирус в каждой лунке должен содержать смесь УН и УК, и инфекция клеток НеЬа должна приводить к экспрессии на поверхности 1дО и связыванию антигена. После связывания в течение ночи клетки собирали и окрашивали по связыванию с Нег2, как описано выше (фиг. 28).
Из скрининга 1 планшета идентифицировали 26 специфических клонов. Повторное тестирование этих клонов показало, что они связываются с Нег2, но не с С35 по проточной цитометрии. Три репрезентативных клона (Ό5, Ό8 и Н2) показаны на фиг. 29А-С. ДНК выделяли из вирусов, и гены УН и УК, содержащиеся в этих вирусах, амплифицировали ПЦР со специфическими для УН и УК праймерами и клонировали в экспрессирующие векторы для млекопитающих, так что они могли быть экспрессированы в форме полноразмерного ЦС1 и полноразмерной каппа. Затем определяли последовательности генов УН и УК. По секвенированию эти 26 клонов содержали 15 уникальных антител. Эти антитела затем экспрессировали в клетках СНО посредством совместной трансфекции экспрессионных плазмид 1дО и каппа, и антитело собирали из клеточного супернатанта через 3 суток. Антитело количественно оценивали посредством ЕЫЗА, и затем тестировали по специфичности посредством ЕЫЗА и проточной цитометрии на клетках ЗКВК3 (Нег2+++). Репрезентативные данные для антител, как показано, обладающих специфичностью по ЕЫЗА и проточной цитометрии, показаны на фиг. 30 и 31 соответственно.
Повтор сортировки отдельных клеток и скрининга дополнительных клонов в соответствии со способами в настоящем документе привел к идентификации дополнительных новых антител анти-Нег2.
Настоящее изобретение не является ограниченным по объему конкретными описанными вариантами осуществления, которые предназначены в качестве отдельных иллюстраций индивидуальных аспектов изобретения, и любые конструкции, вирусы или ферменты, являющиеся функционально эквивалентными, входят в объем этого изобретения. Действительно, различные модификации по изобретению в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе становятся очевидными специалистам в данной области из предшествующего описания и сопровождающих фигур. Такие модификации предназначены, чтобы входить в объем прилагаемой формулы изобретения.
Содержание всех публикаций и патентных заявок, упомянутых в этом описании, приведено в настоящем документе в качестве ссылки в такой же степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что содержание каждой отдельной публикации или патентной заявки приведено в качестве ссылки. Содержание описания и формулы изобретения патентной заявки США № 08/935377, поданной 22 сентября 1997 г., и патентной заявки США № 60/192586, поданной 28 марта 2000 г., приведено в настоящем документе в качестве ссылки.
- 36 028164
Список последовательностей <110> УАССШЕХ, 1ЫС.
<120> СЛИТЫЕ БЕЛКИ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ОТБОРА КЛЕТОК, ИНФИЦИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫМ ВИРУСОМ ОСПОВАКЦИНЫ С ГЕНОМ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА
| <130> | 1843.ОУТРСОг/ЕЗН/ВМС |
| <140> | Для подачи |
| <141> | с настоящим |
| <150> | из 13/844,388 |
| <151> | 2013-03-15 |
| <150> | из 61/732,776 |
| <151> | 2012-12-03 |
| <150> | из 61/639,046 |
| <151> | 2012-04-26 |
| <160> | 32 |
| <170> | Расеппп версии 3.5 |
| <210> | 1 |
| <211> | 1416 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная последовательность |
| <220> | |
| <223> | транспортная плазмида рЗЕМ1 |
| <400> | 1 |
| аааааагдаа | аагааагаса | ааддггсггд | адддггдгдг | гаааггдааа | дсдадааага | 60 |
| агсагааагг | ссагдддагд | дадсгдгагс | агссгсггсг | гддгадсаас | адсгасаддс | 120 |
| дсдсасгссд | адагссадсг | ддгдсададс | ддсссгдадс | гдаадсадсс | гддсдадасс | 180 |
| дгдаддагса | дсгдсааддс | садсддсгас | ассггсасса | асгасддсаг | даасгдддгд | 240 |
| аадсаддссс | сгддсааддд | ссгдаадгдд | агдддсгдда | гсаасассга | сассддсдад | 300 |
| ссгассгасд | ссдссдасгг | саададдадд | ггсассггса | дссгддадас | садсдссадс | 360 |
| ассдссгасс | гдсадагсад | саассгдаад | аасдасдаса | ссдссассга | сггсгдсдсс | 420 |
| аадгасссгс | асгасгасдд | садсадссас | гддгасггсд | асдгдгдддд | сдссддсасс | 480 |
| асддгсассд | гсгссгсадс | сгссассаад | ддсссагсдд | гсггсссссг | ддсасссгсс | 540 |
| гссаададса | ссгсгддддд | сасадсддсс | сгдддсгдсс | гддгсаадда | сгасггсссс | 600 |
| даассддгда | сддгдгсдгд | даасгсаддс | дсссгдасса | дсддсдгдса | сассггсссд | 660 |
| дсгдгссгас | адгссгсадд | асгсгасгсс | сгсадсадсд | гсдгдассдг | дсссгссадс | 720 |
| адсггдддса | сссадассга | сагсгдсаас | дгдаагсаса | адсссадсаа | сассааддгд | 780 |
| дасаадааад | ггасагсаас | гасааагдас | асгдагааад | гадасгагда | адаагасгсс | 840 |
| асададггда | ггдгааагас | адагадгдаа | гсдасгагад | асагаагасг | агсгддагсг | 900 |
| асасаггсас | сддааасгад | ггсгаадааа | ссгдаггага | гадагааггс | гааггдсгсд | 960 |
| гсддгаггсд | ааагсдсдас | гссддаасса | аггасгдага | агдгадаада | гсагасадас | 1020 |
| ассдгсасаг | асасгадгда | гадсаггааг | асадгаадгд | сагсагсгдд | адаагссаса | 1080 |
| асадасдада | сгссддаасс | ааггасгдаг | ааадаадагс | агасадггас | адасасгдгс | 1140 |
| ГсаГасасГа | садгаадгас | агсагсгдда | аггдгсасга | сгааагсаас | сассдагдаг | 1200 |
| дсддагсггг | агдагасдга | саагдагааг | дагасадгас | сассаасгас | гдгаддсддг | 1260 |
| адгасаассг | сгаггадсаа | ггагаааасс | ааддасгггд | гадааагагг | гддгаггасс | 1320 |
| дсатгаатга | гаггдтсддс | сдгддсаатг | ггсгдгатга | сагатгагаг | агагаагааа | 1380 |
| сдггсасдга | аагасаааас | ададаасааа | дгсгад | 1416 |
<210> 2 <211> 446 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> транспортная плазмида ρνκΕ <400> 2
| ддссаааааг гдааааасга дагсгаггга ггдсасдсдд ссдсссагдд дагддадсгд | 60 |
| гагсагссгс ггсггддгад саасадсгас аддсдгдсас ггдасгсдад агсааасдаа | 120 |
| сгдгддсгдс ассагсгдгс ггсагсггсс сдссагсгда гдадсадггд ааагсгддаа | 180 |
| сгдссгсгдг гдгдгдссгд сгдаагаасг гсгагсссад ададдссааа дгасадгдда | 240 |
| аддгддагаа сдсссгссаа гсдддгаасг сссаддадад гдгсасадад саддасадса | 300 |
| аддасадсас сгасадссгс адсадсассс гдасдсгдад сааадсадас гасдадааас | 360 |
| асааадгсга сдссгдсдаа дгсасссагс адддссгдад сгсдсссдгс асааададсг | 420 |
| гсаасадддд ададгдггад дгсдас | 446 |
<210> 3 <211> 455 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> транспортная плазмида ρνι_Ε <400> 3
| ддссаааааг | гдааааасга | дагсгаггга | ггдсасдсдд | ссдсссагдд | дагддадсгд | 60 |
| гагсагссгс | ггсггддгад | саасадсгас | аддсдгдсас | ГГдасГсдад | аадсггассд | 120 |
| гссгасдаас | гдгддсгдса | ссагсгдгсг | гсагсггссс | дссагсгдаг | дадсадггда | 180 |
| аагсгддаас | гдссгсгдгг | дгдгдссгдс | гдаагаасгг | сгагсссада | даддссааад | 240 |
| гасадгддаа | ддгддагаас | дсссгссааг | сдддгаасгс | ссаддададг | дгсасададс | 300 |
| аддасадсаа | ддасадсасс | ГасадссГса | дсадсасссг | дасдсгдадс | ааадсадасг | 360 |
| асдадаааса | сааадгсгас | дссгдсдаад | гсасссагса | дддссгдадс | гсдсссдгса | 420 |
| сааададсгг | саасадддда | дадгдггадд | гсдас | 455 | ||
| <210> 4 |
- 37 028164 <211> 29 ' <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> 5'-праймер КиС?1-5В:
<400> 4 аттаддатсс ддссассдсс сссссадсс 29 <210> 5 <211> 33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> 3'-праймер КиС?1-35:
<400> 5 аттадтсдас тсатттассд дадасаддда дад 33 <210> 6 <211> 33 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> СН1(Р):
<400> 6 саадддассс сддссассдс ссссссадсс ссс 33 <210> 7 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> СН1(Ю:
<400> 7 аасшхггд тссассттдд ьдтд 25 <210> 8 <211> 51 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> А56К(Р):
<400> 8 саасассаад дсддасаада аадттасатс аассасааас дасассдаса д 51 <210> 9 <211> 40 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> А56К(Ю:
<400> 9 гасадссдас стадастттд ггсгсгдт тдтатттасд 40 <210> 10 <211> 1266 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Продукт слитого белка УН (Н2124)-СН1-А56К РаЬ <400> 10
| саддсдсадс | гдсадсадсд | дддсдсадда | ссдссдаадс | сгадсдадас | ссгдгсссгс | 60 |
| асссдсдссд | гссасддсса | сгссагсасс | адсддстатт | гссддаассд | дасссдссад | 120 |
| сссссаддда | аддддсгдда | дгддаггддд | гасагсадсг | асдасддсад | садсаасгсс | 180 |
| аасссагсгс | гсааааасад | ддгсасаасс | адсададаса | ссгссаадаа | ссадттстсс | 240 |
| сгдаадсгда | дсгсгдгдас | сдссдссдас | ассдсгдгдг | аттастдтдс | сададдаасг | 300 |
| ассдддтттд | сттастдддд | ссаадддасс | ссддссассд | гссссссадс | ссссассаад | 360 |
| ддсссагсдд | тспссссст | ддсасссгсс | гссаададса | ссгсгддддд | сасадсддсс | 420 |
| ссдддссдсс | гддссаадда | стасттсссс | даассддсда | сддсдссдсд | даасссаддс | 480 |
| дсссгдасса | дсддсдгдса | сассттсссд | дсгдгссгас | адгссгсадд | асгсгасгсс | 540 |
| сссадсадсд | гсдсдассдс | дсссгссадс | адсттдддса | сссадассса | сасссдсаас | 600 |
| дгдаагсаса | адсссадсаа | сассааддгд | дасаадааад | ттасатсаас | гасааагдас | 660 |
| ассдасааад | тадаттатда | адаасасссс | асададттда | ттдтааатас | адасадсдаа | 720 |
| гсдасгагад | асасаагасг | агсгддагсг | асасаттсас | сддааасгад | ттстаадааа | 780 |
| сстдаттата | тадатааттс | тааттдстсд | тсддтаттсд | ааагсдсдас | гссддаасса | 840 |
| аттастдата | агдсадаада | гсагасадас | ассдгсасаг | асасгадгда | тадсаттаат | 900 |
| асадсаадсд | сассасссдд | адаасссаса | асадасдада | ссссддаасс | ааттастдат | 960 |
| ааадаадагс | атасадттас | адасасгдгс | гсагасасга | садгаадгас | агсагсгдда | 1020 |
| аттдтсаста | сгааагсаас | сассдагдаг | дсддатсттт | агдагасдга | саагдагааг | 1080 |
| дасасадсас | сассаасгас | гдгаддсддс | адсасаассс | статтадсаа | ттатаааасс | 1140 |
| ааддастттд | тадааататт | тддтаттасс | дсаттаатта | таттдтсддс | сдтддсаатт | 1200 |
| ггсгдгагга | сататтатат | асасаасааа | сдттсасдта | аагасаааас | ададаасааа | 1260 |
дгсгад 1266 <210> 11 <211> 421 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Продукт слитого белка УН (Н2124)-СН1-А56К РаЬ <400> 11
С1п Уа! С1п 1_еи С1п С1п тгр С1у А1а С1у 1_еи 1_еи 1_у5 Рго Бег С1и
- 38 028164
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| тКг | |_еи | Бег | |_еи 20 | тКг | Суз | А1а | Уа1 | Туг 25 | С1у | Туг | Бег | 11е | ТКг 30 | Бег | С!у |
| Туг | РКе | тгр | АЗП | тгр | 11е | Агд | С1п | РГО | РГО | С!у | |_уз | С!у | |_еи | С! и | тгр |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| 11е | С1у | туг | 11е | Бег | туг | А5Р | С1у | Бег | Бег | АЗП | Бег | А5П | РГО | Бег | |_еи |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 1_У5 | АЗП | Агд | Уа! | тКг | 11е | Бег | Агд | Азр | тКг | Бег | 1_У5 | АЗП | С1 п | РКе | Бег |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| |_еы | 1_У5 | |_еи | Бег | Бег | уа! | тКг | А1а | а! а | АЗр | тКг | а! а | уа! | Туг | Туг | Суз |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| а! а | Агд | С1у | тКг | тКг | С1у | РКе | А1а | туг | тгр | С!у | С! п | С!у | тКг | |_еи | уа! |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| тКг | Уа! | Бег | Бег | А1 а | Бег | тКг | 1_уЗ | С1у | РГО | Бег | Уа! | РКе | РГО | |_еи | а! а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| РГО | Бег 130 | Бег | |_уз | Бег | тКг | Бег 135 | С1у | С1у | тКг | а! а | а! а 140 | |_еи | б!у | Суз | |_еи |
| Уа! | |_уз | Азр | Туг | РКе | РГО | С! и | Рго | Уа! | тКг | Уа! | Бег | тгр | АЗП | Бег | С!у |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| А1а | |_еи | тКг | Бег | С1у | Уа! | ΗΪ 5 | тКг | РКе | РГО | а! а | Уа! | |_еи | с!п | Бег | Бег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| С1у | |_еи | туг | Бег | |_еи | Бег | Бег | Уа1 | уа! | тКг | уа! | РГО | Бег | Бег | Бег | |_еи |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| С1у | тКг | С1п 195 | тКг | Туг | 11е | Суз | Азп 200 | Уа! | АЗП | НТЗ | 1_У5 | Рго 205 | Бег | АЗП | тКг |
| 1_У5 | Уа1 210 | АЗр | |_уз | |_уз | уа! | тКг 215 | Бег | тКг | тКг | АЗП | АЗр 220 | ТКг | АЗр | |_уз | уа! |
| Азр | Туг | С1и | С! и | Туг | Бег | ТКг | С1 и | |_еи | 1!е | Уа! | АЗП | ТКг | Азр | Бег | С! и |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Бег | тКг | 11е | Азр | 11е | 11е | |_еи | Бег | С!у | Бег | тКг | НТЗ | Бег | РГО | С! и | тКг |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Бег | Бег | |_уз | |_уз | РГО | АЗр | Туг | 11е | АЗр | АЗП | Бег | АЗП | Суз | Бег | Бег | уа! |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| РКе | С! и | 11е | а! а | тКг | РГО | С! и | РГО | 1!е | тКг | А5р | А5П | Уа! | С! и | А5р | НТ 5 |
| 2 | 75 | 280 | 285 |
| тКг | Азр 290 | ТКг | Уа1 | тКг туг | тКг зег Азр 295 | Зег | 11е | АЗП 300 | тКг | Уа1 | зег | А1а | |||
| зег | зег | С1у | С1 и | зег | тКг | ТКг | Азр | С1 и | тКг | РГО | С1и | РГО | 11е | тКг | Азр |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| 1_У5 | С1и | Азр | НТ 5 | тКг | Уа1 | ТКг | Азр | ТКг | Уа1 | Зег | туг | тКг | тКг | Уа1 | зег |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| тКг | Зег | Зег | С1у | 11е | Уа1 | ТКг | тКг | |_уз | Зег | тКг | ТКг | Азр | Азр | А1а | Азр |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| 1_еи | туг | Азр | ТКг | туг | АЗП | Азр | АЗП | Азр | тКг | Уа1 | РГО | РГО | тКг | тКг | Уа1 |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| С1у | С1у | зег | ТКг | ТКг | зег | 11е | Зег | АЗП | туг | |_уз | тКг | |_уз | Азр | РКе | Уа1 |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| С1и | 11е | рКе | С1у | 11е | тКг | А1а | |_еи | 11е | 11е | |_еи | зег | А1а | Уа1 | А1а | 11е |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| РКе | Суз | 11е | ТКг | туг | туг | 11е | туг | АЗП | |_уз | Агд | зег | Агд | |_уз | туг | |_уз |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| тКг | С1и | АЗП | |_уз | Уа! |
420 <210> 12 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Смысловой праймер УН 3 <400> 12 аагагдсдсд сасгссдадд гдсадсгддг ддадгсгдд 39 <210> 13 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Смысловой праймер УН За <400> 13 аагагдсдсд сасгссдадд тдсадстдтт ддадгсгдд 39 <210> 14 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 39 028164 <220>
<223> Антисмысловой праймер зн 1 <400> 14 дадасддьда ссадддьдсс сьддсссса 29 <210> 15 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой праймер зн 2 <400> 15 дадасддьда ссадддьдсс асддсссса 29 <210> 16 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой праймер зн 3 <400> 16 дадасддьда ссаттдтссс ттддсссса 29 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой праймер зн 4/5 <400> 17 дадасддтда ссадддттсс стддсссса 29 <210> 18 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Антисмысловой праймер зн 6 <400> 18 дадасддьда ссдьддьссс ттддсссса 29 <210> 19 <211> 113 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<223> вариабельная тяжелая цепь <400> 19
| С1и | Уа1 с | Я η ьеи Уа' | 1 С1и | Бег | С1у ( | 31у с | 1у ье | :и Уа1 | ЬУ5 | РГО | С1у С1у | ||||
| 1 | 5 | 1 | 0 | 15 | |||||||||||
| Бег | Ьеи | Агд | Ьеи | Бег | СУ5 | А1а | а! а | Бег | С1у | Рпе | 11е | РНе | тНг | АБр | Туг |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Туг | Ьеи | Бег | тгр | 11е | Агд | С1п | а1 а | РГО | С1у | ЬУ5 | С1у | РГО | С1и | тгр | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Бег | туг | 11е | Бег | Бег | туг | Бег | Агд | туг | ТНг | АБП | Туг | А1а | Азр | Бег | Уа1 |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| 1_У5 65 | С1у | Агд | РНе | тНг | 11е 70 | Бег | Агд | АБр | АБП | тНг 75 | Агд | АБП | Бег | 11е | Туг 80 |
| Ьеи | С1п | меь | АБП | АБП 85 | Ьеи | Агд | Уа! | С1и | АБр 90 | ТНг | а! а | Уа1 | Туг | туг 95 | Суз |
| А1а | Агд | а! а | С1у | Бег | Туг | Туг | С1у | Туг | тгр | С1у | С1п | С1у | тпг | Ьеи | Уа! |
| 100 | 105 | 110 |
тНг <210> 20 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Клон нег2 В10 <400> 20
| С1и | Уа! | С1п | ьеи | ьеи | С1и | Бег | С1у | С1у | С1у | РНе | Уа1 | С1п | РГО | С!у | С!у |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Бег | ьеи | Агд | ьеи | Бег | Суз | А1а | А! а | Бег | С1у | РНе | а! а | РНе | АБП | АБП | Туг |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| А1 а | ьеи | Бег 35 | тгр | Уа1 | Агд | С1п | а1 а 40 | РГО | С1у | Агд | С!у | ьеи 45 | ЬУ5 | тгр | Уа1 |
| Бег | А1а | 11е | Бег | РГО | АБр | С1у | АБр | туг | 11е | туг | туг | а! а | АБр | Бег | уа! |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| ьуз 65 | С1у | Агд | РНе | 11е | РНе 70 | Бег | Агд | АБр | АБП | Бег 75 | Агд | АБП | меь | ьеи | Бег 80 |
| Ьеи | С1п | меь | тНг | Бег 85 | Ьеи | С1у | А1 а | С1и | АБр 90 | ТНг | а! а | ьеи | Туг | Туг 95 | Суз |
| А1а | Агд | С1 η | АБП | АБП | Уа1 | Агд | АБр | С1у | А! а | Уа! | а! а | С!у | РГО | Ьеи | АБр |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| НЗ 5 | тгр | С1у | С1 η | С1у | тНг | ьеи | уа! | ТНг |
- 40 028164
115 120 <210> 21 <211> 51 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> А56К(Р2) <400> 21 саасассаад дгддасаада аадттассас сдагдагдсд датстттатд а 51
| <210> | 22 |
| <211> | 50 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная последовательность |
| <220> <223> | СН1 (К2): |
| <400> | 22 |
асаааадгаг гддгаагсдг дгсагаастг тсттдтссас сттддтдттд 50
| <210> | 23 |
| <211> | 51 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная последовательность |
| <220> <223> | А56К(К2): |
| <400> | 23 |
ссагааадас ссдсагсагс ддтддтттта сссддадаса дддададдсг с 51
| <210> | 24 |
| <211> | 51 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная последовательность |
| <220> <223> | А56К(РЗ): |
| <400> | 24 |
дадссгсгсс сгдгсгссдд дгаааассас сдагдагдсд датстттатд а 51
| <210> | 25 |
| <211> | 50 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная последовательность |
| <220> <223> | А56к(кЗ): |
| <400> | 25 |
гагсадгдгс атдгадгг датдттттас ссддадасад ддададдсгс 50
| <210> | 26 |
| <211> | 50 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная последовательность |
| <220> | |
| <223> | А56К (Р4): |
| <400> | 26 |
дадссгсгсс сгдгсгссдд дгаааасагс аасгасаааг дасасгдага 50 <210> 27 <211> 1566 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция УН (Н2124)-1дС-А56К ТК
| <400> 27 саддсдсадс | гдсадсадгд | дддсдсадда | сгдсгдаадс | ссадсдадас | ссгдгсссгс | 60 |
| ассгдсдсгд | гсгагддсга | сгссагсасс | адсддстатт | гсгддаасгд | дагссдссад | 120 |
| сссссаддда | аддддсгдда | дгддаггддд | гасагсадсг | асдасддсад | садсаасгсс | 180 |
| аасссагсгс | гсааааагад | ддгсасаагс | адсададаса | ссгссаадаа | ссадттстсс | 240 |
| сгдаадсгда | дсгсгдгдас | сдссдссдас | ассдсгдгдг | аттастдтдс | сададдаасг | 300 |
| ассдддтттд | сттастдддд | ссаадддасс | сгддгсассд | гсгссгсадс | сгссассаад | 360 |
| ддсссагсдд | тсттссссст | ддсасссгсс | гссаададса | ссгсгддддд | сасадсддсс | 420 |
| сгдддсгдсс | сддссаадда | стасттсссс | даассддгда | сддгдгсдгд | даасгсаддс | 480 |
| дсссгдасса | дсддсдсдса | сассттсссд | дсгдгссгас | адгссгсадд | асгсгасгсс | 540 |
| сгсадсадсд | гсдгдассдг | дсссгссадс | адсттдддса | сссадассга | сагсгдсаас | 600 |
| дгдаагсаса | адсссадсаа | сассааддгд | дасаадааад | ттдадсссаа | атсттдтдас | 660 |
| аааасгсаса | сагдсссасс | дгдсссадса | ссгдаасгсс | Гддддддасс | дтсадтсттс | 720 |
| СТСТТССССС | саааасссаа | ддасасссгс | агдагсгссс | ддассссгда | ддгсасагдс | 780 |
| дгддгддгдд | асдсдадсса | сдаадасссг | даддссаадс | гсаасгддга | сдгддасддс | 840 |
| дгддаддгдс | агаагдссаа | дасааадссд | сдддаддадс | адгасаасад | сасдгассдг | 900 |
| дгддгсадсд | гссгсассдг | ссгдсассад | дасгддсгда | асддсаадда | дгасаадгдс | 960 |
| ааддгсгсса | асааадсссг | сссадссссс | агсдадаааа | ссагсгссаа | адссаааддд | 1020 |
| садссссдад | аассасаддс | дгасасссгд | сссссагссс | дддагдадсг | дассаадаас | 1080 |
| саддгсадсс | сдассгдссг | ддгсаааддс | ттстатссса | дсдасагсдс | сдгддадгдд | 1140 |
| дададсаагд | ддсадссдда | даасаасгас | аадассасдс | сгсссдгдсг | ддасгссдас | 1200 |
| ддстссттст | гссгсгасад | саадсгсасс | дгддасаада | дсаддгддса | дсаддддаас | 1260 |
| дтсттстсат | дсгссдгдаг | дсагдаддсг | сгдсасаасс | ассасасдса | даададссгс | 1320 |
| гсссгдгсгс | сдддгаааас | сассдагдаг | дсддатсттт | асдасасдса | саагдагааг | 1380 |
| дагасадгас | сассаасгас | сдсаддсддг | адгасаассг | статтадсаа | ттатаааасс | 1440 |
| ааддастттд | тадааататт | тддтаттасс | дсаттаатта | таттдтсддс | сдтддсаатт | 1500 |
| ггсгдгагга | сататтатат | агагаагааа | сдттсасдта | аагасаааас | ададаасааа | 1560 |
- 41 028164 дгсгад 1566 <210> 28 <211> 521 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция νΗ (Н2124)-1дС-А56К РЬ <400> 28
С1п Уа1 С1п 1_еи С1п С1п тгр С1у А1а С1у 1_еи 1_еи 1_уз Рго Бег С1и 15 10 15 тКг 1_еи Бег 1_еи тКг Суз А1а Уа1 туг С1у туг Бег 11е тКг Бег С1у 20 25 30 туг РКе тгр Азп тгр 11е Агд С1п Рго Рго С1у 1_уз С1у 1_еи С1и тгр 35 40 45
11е С1у туг 11е Бег туг Азр С1у Бег Бег Азп Бег Азп Рго Бег 1_еи 50 55 60 |_уз Азп Агд Уа1 тКг 11е Бег Агд Азр тКг Бег 1_уз Азп С1п РКе Бег 65 70 75 80 |_еи 1_уз 1_еи Бег Бег Уа1 тКг А1а А1а Азр тКг А1а Уа1 туг туг Суз 85 90 95
А1а Агд С1у тКг тКг С1у РКе А1а туг тгр С1у С1п С1у тКг 1_еи Уа1 100 105 110 тКг Уа1 Бег Бег А1а Бег тКг 1_уз С1у Рго Бег Уа1 РКе Рго 1_еи А1а 115 120 125
Рго Бег Бег 1_уз Бег тКг Бег С1у С1у тКг А1а А1а 1_еи С1у Суз 1_еи 130 135 140
Уа1 1_уз Азр туг РКе Рго С1и Рго Уа1 тКг Уа1 Бег тгр Азп Бег С1у 145 150 155 160
А1а ьеи тКг Бег С1у Уа1 нт 5 тКг РКе Рго А1а Уа1 ьеи С1п Бег Бег 165 170 175
С1у 1_еи туг Бег 1_еи Бег Бег Уа1 Уа1 тКг Уа1 Рго Бег Бег Бег 1_еи 180 185 190
С1у тКг С1п тКг туг IIе Суз Азп Уа1 Азп нт 5 1_уз Рго Бег Азп тКг 195 200 205 |_уз Уа1 Азр 1_уз 1_уз Уа1 С1и Рго 1_уз Бег Суз Азр 1_уз тКг нт 5 тКг 210 215 220
| СУ5 225 | РГО | РГО СУ5 РГО | А1а 230 | рго С1и 1_еи 1_еи С1у С1у рго Зег Уа1 235 | РКе 240 | ||||||||||
| 1_еи | РКе | РГО | РГО | 1_у5 | РГО | 1_у5 | АБр | ТКг | |_еи | Мег | 11е | 5ег | Агд | тКг | РГО |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| С1и | Уа1 | тКг | Су 5 260 | Уа1 | Уа1 | Уа1 | АБр | Уа1 265 | Зег | НТБ | С1и | АБр | РГО 270 | С1и | Уа1 |
| 1_У5 | РКе | АБП | тгр | туг | Уа1 | АБр | С1у | Уа1 | 61и | Уа1 | НТБ | АБП | А1а | 1_У5 | тКг |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| 1_У5 | РГО | Агд | С1 и | С1и | С1п | Туг | АБП | Зег | ТКг | туг | Агд | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| 1_еи | тКг | Уа1 | 1_еи | НТ 5 | С1п | АБр | тгр | |_еи | АБП | С1у | 1_У5 | С1и | Туг | 1_У5 | СУ5 |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| 1_У5 | Уа1 | Зег | АБП | 1_у5 | А1а | |_еи | РГО | А1а | РГО | 11е | С1и | 1_У5 | тКг | 11е | зег |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| 1_У5 | а1 а | 1_У5 | С1у 340 | С1п | РГО | Агд | С1и | РГО 345 | С1п | Уа1 | Туг | ТКг | |_еи 350 | РГО | РГО |
| Зег | Агд | АБр | 61 и | 1_еи | тКг | 1_У5 | АБП | С1п | Уа1 | Зег | |_еи | тКг | СУ5 | |_еи | Уа1 |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| 1_У5 | С1у | Рпе | Туг | РГО | зег | АБр | 11е | А1а | Уа1 | С1и | тгр | С1и | зег | АБП | С1у |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| С1 п | РГО | С1и | АБП | АБП | туг | 1_У5 | тКг | тКг | РГО | РГО | уа! | |_еи | АБр | Зег | АБР |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| С1у | 5ег | РКе | РКе | |_еи | Туг | Зег | 1_У5 | |_еи | тКг | Уа1 | АБР | 1_У5 | Зег | Агд | тгр |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| С1п | С1п | С1у | АБП | Уа1 | РКе | Зег | СУ2 | Зег | Уа1 | ме! | НТБ | С1и | А1а | |_еи | НТБ |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| АБП | НТ 5 | туг | ТКг | С1п | 1_У5 | Зег | |_еи | Зег | |_еи | Зег | РГО | С1у | 1_У5 | тКг | тКг |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| АБр | АБр | а1 а | АБР | |_еи | Туг | АБр | ТКг | Туг | АБП | АБР | АБП | АБр | тКг | Уа1 | РГО |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| РГО | ТКг | тКг | Уа1 | С1у | С1у | Зег | ТКг | тКг | зег | 11е | зег | АБП | туг | 1_У2 | тКг |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| 1_У5 | АБр | РКе | Уа1 | С1и | 11е | РКе | С1у | 11е | тКг | А1а | |_еи | 11е | 11е | |_еи | зег |
| 485 | 490 | 495 |
- 42 028164
А1а Уа1 А1а 11е РКе Суз 11е тКг туг туг 11е туг Азп ьуз Агд Бег 500 505 510
Агд ьуз туг ьуз тКг С1и Азп ьуз Уа1 515 520 <210> 29 <211> 1962 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция УН (Н2124)-1дС-А56К ТК <400> 29
| саддсдсадс сдсадсадсд дддсдсадда ссдссдаадс ссадсдадас сссдсссссс | 60 |
| ассгдсдсгд гсгагддсга сгссагсасс адсддссап гсгддаасгд дагссдссад | 120 |
| сссссаддда аддддссдда дьддаыддд сасассадсс асдасддсад садсаасссс | 180 |
| аасссасссс ссааааасад ддссасаасс адсададаса сссссаадаа ссадысьсс | 240 |
| сгдаадсгда дсгсгдгдас сдссдссдас ассдсгдгдг аыасьдьдс сададдаасг | 300 |
| ассдддьыд сыасьдддд ссаадддасс ссддссассд сссссссадс ссссассаад | 360 |
| ддсссагсдд сспсссссс ддсасссгсс гссаададса ссгсгддддд сасадсддсс | 420 |
| ссдддссдсс сддссаадда сьасысссс даассддсда сддсдссдсд даасссаддс | 480 |
| дсссгдасса дсддсдгдса сассысссд дсгдгссгас адгссгсадд асгсгасгсс | 540 |
| сссадсадсд ссдсдассдс дссссссадс адсыдддса сссадассса сасссдсаас | 600 |
| дгдаагсаса адсссадсаа сассааддсд дасаадааад ыдадсссаа аьсыдьдас | 660 |
| аааасссаса сасдсссасс дгдсссадса сссдаасссс гддддддасс дьсадьсыс | 720 |
| сьсыссссс саааасссаа ддасасссгс агдагсгссс ддассссгда ддгсасагдс | 780 |
| дгддгддгдд асдсдадсса сдаадасссс даддссаадс ссаассддса сдсддасддс | 840 |
| дгддаддгдс агаагдссаа дасааадссд сдддаддадс адгасаасад сасдгассдг | 900 |
| дгддгсадсд сссссассдс сссдсассад дассддссда асддсаадда дсасаадсдс | 960 |
| ааддгсгсса асааадсссг сссадссссс агсдадаааа ссагсгссаа адссаааддд | 1020 |
| садссссдад аассасаддс дсасассссд сссссасссс дддасдадсс дассаадаас | 1080 |
| саддссадсс гдассгдссг ддгсаааддс ысьаьссса дсдасагсдс сдгддадгдд | 1140 |
| дададсаасд ддсадссдда даасаассас аадассасдс сссссдсдсс ддассссдас | 1200 |
| ддсьссььсь гссгсгасад саадсгсасс дгддасаада дсаддгддса дсаддддаас | 1260 |
| дгспсгсаг дссссдсдас дсасдаддсс ссдсасаасс ассасасдса даададсссс | 1320 |
| гсссгдгсгс сдддгаааас ассаассаса аагдасасгд агааадгада ыаьдаадаа | 1380 |
| сассссасад адььдаььдь ааасасадас адсдаассда ссасадасас аасассассс | 1440 |
| ддагсгасас аысассдда аасьадььсь аадааассгд аыаьаьада ьааььсьааь | 1500 |
| гдсгсдгсдд гатгсдаааг сдсдасгссд даассааыа сгдагаагдг адаадагсаг | 1560 |
| асадасассд ссасасасас садсдасадс атгаагасад таадгдсагс агсгддадаа | 1620 |
| гссасаасад асдадасссс ддаассааы ассдасааад аадассасас адыасадас | 1680 |
| астдссссас асассасадс аадсасасса гссддаасгд тсассассаа ассаассасс | 1740 |
| датдагдсдд аьсьыаьда гасдгасааг дагаагдага садгассасс аасгасгдга | 1800 |
| ддсддьадьа саасс1с1а! ЬадсааЬЬаЬ аааассаадд асЫЛдЬада ааЬаЫЛддЬ | 1860 |
| астассдсас саапасап дтсддссдсд дсааппсс дьаыасаьа тгасасасас | 1920 |
| аатааасдп сасдгааага саааасадад аасааадгсг ад | 1962 |
<210> 30 <211> 653 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция УН (Н2124)-1дС-А56« Е1_ <400> 30
| С1п 1 | Уа1 | С1п | ьеи | С1п 5 | С1п тгр С1у А1а С1у 10 | ьеи ьеи ьуз Рго Бег 15 | С1и | ||||||||
| ТКг | ьеи | Бег | ьеи 20 | ТКг | Суз | А1а | Уа1 | Туг 25 | С1у | туг | Бег | Пе | тКг 30 | Бег | С1у |
| Туг | РКе | тгр | АЗП | тгр | 11е | Агд | С1п | РГО | РГО | С1у | ьуз | С1у | ьеи | С1и | тгр |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Не | С1у | туг | Не | Бег | туг | Азр | С1у | Бег | Бег | АЗП | Бег | АЗП | РГО | Бег | ьеи |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| ьуз | АЗП | Агд | Уа1 | тКг | 11е | Бег | Агд | Азр | тКг | Бег | ьуз | АЗП | С1п | РКе | Бег |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| ьеи | ьуз | ьеи | Бег | Бег 85 | Уа1 | тКг | А1а | А1а | Азр 90 | ТКг | А1а | Уа1 | туг | туг 95 | Суз |
| А1а | Агд | С1у | тКг | тКг | С1у | РКе | А1а | туг | тгр | С1у | С1п | С1у | тКг | Ьеи | Уа1 |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| тКг | Уа1 | Бег | Бег | А1а | Бег | тКг | 1_у5 | С1у | РГО | Бег | Уа1 | РКе | РГО | ьеи | А1а |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| РГО | Бег | Бег | ьуз | Бег | тКг | Бег | С1у | С1у | тКг | А1а | А1а | Ьеи | С1у | Суз | ьеи |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Уа1 | ьуз | Азр | туг | РКе | РГО | С1и | РГО | Уа1 | тКг | Уа1 | Бег | тгр | АЗП | Бег | С1у |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| а! а | ьеи | тКг | Бег | С1у | Уа1 | ΗΊ5 | ТКг | РКе | РГО | а! а | Уа1 | ьеи | С1п | Бег | Бег |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| С!у | |_еи | туг | 5ег | |_еи | 5ег | Зег | уа! | Уа! | тНг | Уа! | РГО | Зег | Зег | Зег | |_еи |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| С1у | тНг | С1п | тНг | туг | 11е | Суз | АЗП | Уа! | АЗП | Нтз | |_уз | РГО | 5ег | АЗП | тНг |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| 1_уз | Уа1 | АЗр | |_уз | |_уз | Уа1 | С1и | РГО | |_уз | 5ег | Суз | АЗр | |_уз | тНг | НТЗ | тНг |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| СуЗ | РГО | РГО | Суз | РГО | А1а | РГО | С1и | |_еи | |_еи | С!у | С!у | РГО | зег | Уа! | РНе |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| 1_еи | РНе | РГО | РГО | 1_у5 | РГО | 1_У5 | Азр | ТНг | |_еи | ме! | 1!е | Зег | Агд | ТНг | Рго |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| С!и | Уа! | тНг | Суз 260 | Уа! | Уа! | Уа! | Азр | Уа! 265 | 5ег | НТЗ | С! и | Азр | РГО 270 | С! и | Уа! |
| |_уз | РНе | АЗП | тгр | туг | Уа1 | АЗр | С1у | уа! | С! и | уа! | Нтз | АЗП | а! а | |_уз | тНг |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| 1_У5 | РГО 290 | Агд | С! и | С! и | С1 η | туг 295 | А5П | Зег | ТНг | туг | Агд 300 | Уа! | уа! | Зег | уа! |
| |_еи | ТНг | Уа! | 1_еи | Нтз | С1п | Азр | тгр | |_еи | Азп | С!у | 1_У5 | С! и | Туг | |_уз | Суз |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| |_уз | Уа! | 5ег | АЗП | |_уз | а1 а | |_еи | РГО | а! а | РГО | 1!е | С! и | |_уз | тНг | 1!е | Зег |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| 1_У5 | а! а | |_уз | С1у | С1п | РГО | Агд | С1и | РГО | С!п | Уа! | туг | тНг | |_еи | РГО | РГО |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| 5ег | Агд | А5р 355 | С! и | |_еи | тНг | |_уз | А5П 360 | С! η | Уа! | Зег | |_еи | тНг 365 | Суз | |_еи | уа! |
| |_уз | С1у | РНе | Туг | РГО | 5ег | Азр | 11е | а! а | Уа! | С!и | тгр | С! и | 5ег | АЗП | С!у |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| б!п | РГО | С1и | АЗП | АЗП | туг | |_уз | тНг | тНг | РГО | РГО | Уа! | |_еи | АЗр | зег | АЗр |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| С1у | 5ег | РНе | РНе | |_еи | Туг | Зег | |_уз | |_еи | тНг | Уа! | Азр | |_уз | 5ег | Агд | тгр |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| С!п | б!п | С1у | Азп | Уа! | РНе | Зег | Суз | 5ег | Уа! | мег | нтз | С! и | а! а | |_еи | НТЗ |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| АЗП | НТ 5 | Туг | тНг | С1п | |_уз | 5ег | |_еи | 5ег | |_еи | 5ег | РГО | С!у | 1_уз | ТНг | 5ег |
| 4 | 35 | 440 | 445 |
| тНг | тНг 450 | АЗП | Азр | ТНг Азр | 1_уз 455 | Уа! Азр туг с!и | С1и 460 | туг | Зег | ТНг | С1и | ||||
| 1_еи | 11е | Уа1 | АЗП | тНг | Азр | Зег | С1 и | Зег | ТНг | 11е | Азр | 11е | 11е | |_еи | Зег |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| С1у | Зег | тНг | НТ 5 | зег | РГО | С1 и | ТНг | Зег | Зег | 1_уз | |_уз | РГО | Азр | туг | 11е |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Азр | А5П | Зег | АЗП | Суз | зег | Зег | Уа1 | РНе | С1и | Не | А1а | тНг | РГО | С1и | РГО |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Не | тНг | Азр | АЗП | Уа! | С! и | Азр | нтз | ТНг | Азр | тНг | Уа! | тНг | туг | ТНг | Зег |
| 515 | 520 | 525 |
Азр Зег 11е Азп тНг Уа1 Зег А1а Зег Зег С1у С1и Зег тНг тНг Азр 530 535 540
| С1и | тНг | РГО | С1 и | РГО | 11е | тНг | Азр | |_уз | С1и | Азр | нтз | тНг | Уа1 | тНг | Азр |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| ТНг | Уа1 | зег | туг | ТНг | ТНг | Уа1 | Зег | ТНг | Зег | Зег | С1у | Не | Уа1 | тНг | ТНг |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| |_уз | Зег | тНг | тНг 580 | Азр | Азр | А1а | Азр | |_еи 585 | Туг | Азр | тНг | туг | АЗП 590 | Азр | АЗП |
| Азр | тНг | Уа! | РГО | РГО | тНг | тНг | Уа! | С1у | С1у | зег | тНг | тНг | Зег | 1!е | Зег |
595 600 605
| АЗП | туг | |_уз | тНг | |_уз | Азр | РНе | Уа1 | С1 и | 11е | РНе | С1у | 11е | тНг | А1а | |_еи |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Не | Не | |_еи | Зег | А1а | Уа1 | А1а | Не | РНе | Суз | Не | ТНг | туг | туг | Не | туг |
| 625 | 630 | 635 | 640 | ||||||||||||
| АЗП | |_уз | Агд | Зег | Агд | |_уз | туг | |_уз | ТНг | С1и | АЗП | |_уз | Уа! | |||
| 645 | 650 |
<210> 31 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> специфический для тяжелой цепи праймер 428 <400> 31 датататтаа адтсдаатаа адсд 24 <210> 32
- 44 028164 <211> 21 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> специфический для тяжелой цепи праймер 430 <400> 32 дасассасас адтадггд с 21
Claims (15)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Слитый белок, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, слитую с N концом а) фрагмента полипептида, состоящего из аминокислот 117-421 8Ер ГО N0: 11, который представляет собой домен СН1 1дО1 человека, слитый со стеблем, трансмембранным доменом и внутриклеточным доменом белка А56К вируса осповакцины, или Ь) фрагмента полипептида, состоящего из аминокислот 117-653 8Ер ГО N0: 30, который представляет собой полную константную область 1дО1 человека, слитую со стеблем, трансмембранным доменом и внутриклеточным доменом белка А56К вируса осповакцины; причем слитый белок может экспрессироваться на поверхности частицы внеклеточного оболочечного вируса осповакцины (ЕЕУ), и причем слитый белок, будучи скомбинированным с вариабельным доменом легкой цепи, может формировать антигенсвязывающий домен молекулы иммуноглобулина.
- 2. Полинуклеотид, кодирующий слитый белок по п.1.
- 3. Вектор на основе вируса осповакцины, содержащий полинуклеотид по п.2.
- 4. Клетка-хозяин, инфицированная рекомбинантным вирусом осповакцины по п.3.
- 5. Библиотека рекомбинантной осповакцины, содержащая библиотеку полинуклеотидов, кодирующих множество слитых с иммуноглобулинами полипептидов, где библиотека полинуклеотидов сконструирована в векторе на основе вируса осповакцины, и где каждый полинуклеотид в библиотеке содержит следующие элементы:a) первый полинуклеотид, кодирующий первый фрагмент полипептида, содержащий домен СН1 тяжелой цепи 1дО;b) второй полинуклеотид, кодирующий второй фрагмент полипептида, содержащий стебель, трансмембранный домен и внутриклеточный домен специфического для вируса осповакцины ЕЕУ мембранного белка А56К, расположенный ниже первого полинуклеотида, кодирующего первый фрагмент полипептида, иc) третий полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (УН) или ее фрагмент, расположенный выше первого полинуклеотида, кодирующего первый фрагмент полипептида;причем слитый белок может экспрессироваться на поверхности частицы вируса осповакцины ЕЕУ, и причем слитый белок, будучи скомбинированным с вариабельным доменом легкой цепи, может формировать антигенсвязывающий домен молекулы иммуноглобулина.
- 6. Библиотека по п.5, сгенерированная путем тримолекулярной рекомбинации.
- 7. Библиотека по п.5 или 6, в которой каждый из слитых с иммуноглобулинами полипептидов содержит УН или ее фрагмент, слитую с ^концом аминокислот 117-421 8Ер ГО N0: 11.
- 8. Библиотека по п.5 или 6, в которой первый полинуклеотид согласно а) кодирует первый фрагмент полипептида, содержащий константную область полноразмерного 1дО.
- 9. Библиотека по п.8, в которой каждый из слитых с иммуноглобулинами полипептидов содержит УН или ее фрагмент, слитую с ^концом аминокислот 117-653 8Ер ГО N0: 30.
- 10. Способ отбора полинуклеотидов, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи антигенспецифического иммуноглобулина или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий:a) введение библиотеки полинуклеотидов по любому из пп.5-9 в популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины;b) введение одного или более полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина или ее антигенсвязывающий фрагмент в популяцию клеток-хозяев, где слитый с иммуноглобулином белок является способным к сочетанию с легкой цепью иммуноглобулина для формирования антигенсвязывающего домена молекулы иммуноглобулина;c) обеспечение высвобождения внеклеточного оболочечного вируса (ЕЕУ) из клеток-хозяев;4) контакт высвобожденных ЕЕУ с антигеном; ие) извлечение полинуклеотидов, кодирующих слитые с тяжелой цепью иммуноглобулина полипептиды, экспрессированные на поверхности мембраны ЕЕУ, которые связались с антигеном на стадии 4).
- 11. Способ по п.10, дополнительно включающий:ί) введение полинуклеотидов, извлеченных в е), во вторую популяцию клеток-хозяев, пермиссивных для инфекционности вируса осповакцины;д) введение одного или более полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина или ее антигенсвязывающий фрагмент, во вторую популяцию клеток-хозяев таким образом, что формируется- 45 028164 антигенсвязывающий домен молекулы иммуноглобулина; й) обеспечение высвобождения ΕΕν из клеток-хозяев; ι) контакт высвобожденного ΕΕν с антигеном; и)) извлечение полинуклеотидов, кодирующих слитые с тяжелой цепью иммуноглобулина полипептиды, экспрессированные на поверхности мембраны ΕΕν, которые связались с антигеном на стадии ι).
- 12. Способ по п.11, дополнительно включающий повтор стадий ί)^) один или более раз, таким образом обогащая по полинуклеотидам, кодирующим полипетид, слитый с тяжелой цепью иммуноглобулина, экспрессирующийся на поверхности мембраны ΕΕν, который связывается с антигеном.
- 13. Способ по любому из пп.10-12, дополнительно включающий выделение полинуклеотидов, извлеченных из первой библиотеки.
- 14. Способ по любому из пп.10-13, в котором один или более полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина согласно (Ь), содержатся, каждый, на векторе на основе вируса осповакцины.
- 15. Способ по любому из пп.10-13, в котором один или более полинуклеотидов, кодирующих легкую цепь иммуноглобулина согласно(Ь), содержатся на плазмидном векторе.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261639046P | 2012-04-26 | 2012-04-26 | |
| US201261732776P | 2012-12-03 | 2012-12-03 | |
| US13/844,388 US9708601B2 (en) | 2012-04-26 | 2013-03-15 | Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus |
| PCT/US2013/038497 WO2013163602A1 (en) | 2012-04-26 | 2013-04-26 | Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201491965A1 EA201491965A1 (ru) | 2015-03-31 |
| EA028164B1 true EA028164B1 (ru) | 2017-10-31 |
Family
ID=49477810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201491965A EA028164B1 (ru) | 2012-04-26 | 2013-04-26 | Слитые белки для облегчения отбора клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины с геном специфического иммуноглобулина |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9708601B2 (ru) |
| EP (1) | EP2841606B1 (ru) |
| JP (2) | JP6498599B2 (ru) |
| KR (1) | KR102108589B1 (ru) |
| CN (1) | CN104520444B (ru) |
| AU (1) | AU2013251371B2 (ru) |
| CA (1) | CA2871597C (ru) |
| DK (1) | DK2841606T3 (ru) |
| EA (1) | EA028164B1 (ru) |
| ES (1) | ES2725673T3 (ru) |
| IL (1) | IL235323B (ru) |
| NZ (1) | NZ630854A (ru) |
| PL (1) | PL2841606T3 (ru) |
| PT (1) | PT2841606T (ru) |
| SG (1) | SG11201406974YA (ru) |
| WO (1) | WO2013163602A1 (ru) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2427212B1 (en) | 2009-05-08 | 2017-08-23 | Vaccinex, Inc. | Anti-cd100 antibodies and methods for using the same |
| PT2766093T (pt) | 2011-10-11 | 2018-05-18 | Vaccinex Inc | Utilização de moléculas de ligação a semaforina-4d para modulação da permeabilidade da barreira hematoencefálica |
| US9708601B2 (en) | 2012-04-26 | 2017-07-18 | Vaccinex, Inc. | Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus |
| US10494440B2 (en) | 2012-05-11 | 2019-12-03 | Vaccinex, Inc. | Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke |
| KR102291971B1 (ko) | 2013-06-25 | 2021-08-19 | 백시넥스 인코포레이티드 | 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도 |
| NZ630881A (en) | 2013-10-10 | 2016-03-31 | Vaccinex Inc | Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis |
| NZ630892A (en) | 2013-10-21 | 2016-03-31 | Vaccinex Inc | Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders |
| SG11201606051YA (en) * | 2014-02-19 | 2016-09-29 | Jody Berry | Marburg monoclonal antibodies |
| KR20170019080A (ko) | 2015-08-11 | 2017-02-21 | 주식회사 엘티전자 | 플렉시블 사이니지 장치 |
| CN109069628A (zh) * | 2016-01-14 | 2018-12-21 | Bps生物科学有限公司 | 抗pd-1抗体及其用途 |
| AU2017252427B2 (en) | 2016-04-22 | 2023-07-13 | Vaccinex, Inc. | Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions |
| JP7128177B2 (ja) | 2016-08-02 | 2022-08-30 | バクシネックス インコーポレーティッド | ワクシニアウイルス／真核細胞においてポリヌクレオチドライブラリを生成するための改善された方法 |
| US11427634B2 (en) * | 2017-05-05 | 2022-08-30 | Vaccinex, Inc. | Human anti-semaphorin 4D antibody |
| BR112022022529A2 (pt) | 2020-05-06 | 2023-02-23 | Vaccinex Inc | Exibição de proteína de membrana integral em vírions envelopados extracelulares de poxvírus |
| US20240093177A1 (en) | 2022-06-10 | 2024-03-21 | Vaccinex, Inc. | Methods to select antibodies specific to complex membrane antigens |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050266425A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-12-01 | Vaccinex, Inc. | Methods for producing and identifying multispecific antibodies |
| US20090304627A1 (en) * | 2008-05-28 | 2009-12-10 | Vgx Pharmaceuticals, Inc. | Smallpox dna vaccine and the antigens therein that elicit an immune response |
| US20100081575A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-04-01 | Robert Anthony Williamson | Methods for creating diversity in libraries and libraries, display vectors and methods, and displayed molecules |
Family Cites Families (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5445953A (en) | 1991-08-26 | 1995-08-29 | Immuno Aktiengesellschaft | Direct molecular cloning of a modified poxvirus genome |
| WO1995030018A2 (en) | 1994-04-29 | 1995-11-09 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
| US6576754B2 (en) | 1995-11-09 | 2003-06-10 | Dana-Farber Cancer Institute | CD100 antigen and uses therefor |
| US6872518B2 (en) | 1997-09-22 | 2005-03-29 | University Of Rochester | Methods for selecting polynucleotides encoding T cell epitopes |
| AU776865B2 (en) | 1998-11-10 | 2004-09-23 | University Of Rochester | T cells specific for target antigens and methods and vaccines based thereon |
| JP2003528605A (ja) | 2000-03-28 | 2003-09-30 | ユニヴァーシティー オヴ ロチェスター | ライブラリーを作成する方法および目的のポリヌクレオチドを選択する方法 |
| CA2341356C (en) | 2000-04-14 | 2011-10-11 | Transgene S.A. | Poxvirus with targeted infection specificity |
| AU2001297872B2 (en) * | 2000-11-17 | 2006-11-09 | University Of Rochester | In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells |
| AU2002255495A1 (en) | 2001-02-02 | 2002-08-19 | University Of Rochester | Methods of identifying regulator molecules |
| EP1413316A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-28 | Bruno Robert | Bifunctional conjugates or fusion proteins |
| US9809654B2 (en) | 2002-09-27 | 2017-11-07 | Vaccinex, Inc. | Targeted CD1d molecules |
| EP1442749A1 (en) | 2003-01-31 | 2004-08-04 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Use of anti-CD100 antibodies for the treatment and the diagnosis of inflammatory disorder affecting the central nervous system |
| CA2548180C (en) | 2003-12-04 | 2014-02-04 | Vaccinex, Inc. | Methods of killing tumor cells by targeting internal antigens exposed on apoptotic tumor cells |
| KR101377116B1 (ko) | 2004-08-27 | 2014-03-24 | 알버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신 오브 예쉬바 유니버시티 | 면역 및 자가면역의 조절제로서의 세라마이드 유도체 |
| US8022043B2 (en) | 2004-08-27 | 2011-09-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Ceramide derivatives as modulators of immunity and autoimmunity |
| US7858599B2 (en) | 2005-12-30 | 2010-12-28 | Hander Robert W | Enhancement of urogenital function |
| US9382327B2 (en) | 2006-10-10 | 2016-07-05 | Vaccinex, Inc. | Anti-CD20 antibodies and methods of use |
| DE602008004296D1 (de) | 2007-02-14 | 2011-02-17 | Vaccinex Inc | Humanisierte anti-cd100-antikörper |
| AU2008219020B2 (en) | 2007-02-21 | 2013-08-22 | Vaccinex, Inc. | Modulation of NKT cell activity with antigen-loaded CDId molecules |
| CN101932333A (zh) | 2007-12-26 | 2010-12-29 | 瓦西尼斯公司 | 抗c35抗体联合疗法和方法 |
| PT2385980T (pt) | 2009-01-08 | 2018-06-26 | Albert Einstein College Medicine Inc | Vacinas bacterianas com glicolípidos do tipo ceramida associados à parede celular e utilização dos mesmos |
| EP2427212B1 (en) | 2009-05-08 | 2017-08-23 | Vaccinex, Inc. | Anti-cd100 antibodies and methods for using the same |
| KR101814571B1 (ko) * | 2010-03-10 | 2018-01-04 | 젠맵 에이/에스 | Ｃ―ｍｅｔ에 대한 모노클로날 항체 |
| TW201134488A (en) * | 2010-03-11 | 2011-10-16 | Ucb Pharma Sa | PD-1 antibodies |
| TWI651331B (zh) * | 2010-05-04 | 2019-02-21 | 戊瑞治療有限公司 | 與集落刺激因子１受體（ｃｓｆ１ｒ）結合之抗體類 |
| AU2011253101A1 (en) * | 2010-05-11 | 2013-01-10 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-FGFR2 antibodies |
| NZ604464A (en) | 2010-06-14 | 2014-03-28 | Vaccinex Inc | Anti-vegf antibodies and uses thereof |
| CA2804399A1 (en) * | 2010-07-06 | 2012-01-12 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-ron antibodies |
| EP2404936A1 (en) * | 2010-07-06 | 2012-01-11 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo |
| US20130164325A1 (en) | 2010-07-07 | 2013-06-27 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Ceramide-like glycolipid-associated bacterial vaccines and uses thereof |
| CN103347896B (zh) | 2010-09-02 | 2017-06-13 | 瓦西尼斯公司 | 抗cxcl13抗体和其使用方法 |
| KR102003571B1 (ko) | 2011-05-13 | 2019-07-24 | 고쿠리츠 다이가쿠호우징 도쿄이카시카다이가쿠 | 골형성 촉진제 |
| PT2766093T (pt) | 2011-10-11 | 2018-05-18 | Vaccinex Inc | Utilização de moléculas de ligação a semaforina-4d para modulação da permeabilidade da barreira hematoencefálica |
| US8790652B2 (en) | 2011-12-06 | 2014-07-29 | Vaccinex, Inc. | Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis |
| JP6193275B2 (ja) | 2012-03-02 | 2017-09-06 | ヴァクシネックス， インコーポレイテッド | Ｂ細胞媒介炎症性疾患を治療するための方法 |
| US9090709B2 (en) | 2012-03-28 | 2015-07-28 | Vaccinex, Inc. | Anti-SEMA4D antibodies and epitopes |
| US9708601B2 (en) | 2012-04-26 | 2017-07-18 | Vaccinex, Inc. | Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus |
| US10494440B2 (en) | 2012-05-11 | 2019-12-03 | Vaccinex, Inc. | Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke |
| NZ710744A (en) | 2013-01-31 | 2020-07-31 | Vaccinex Inc | Methods for increasing immunoglobulin a levels |
| US9371352B2 (en) | 2013-02-08 | 2016-06-21 | Vaccinex, Inc. | Modified glycolipids and methods of making and using the same |
| KR102291971B1 (ko) | 2013-06-25 | 2021-08-19 | 백시넥스 인코포레이티드 | 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도 |
| NZ630881A (en) | 2013-10-10 | 2016-03-31 | Vaccinex Inc | Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis |
| NZ630892A (en) | 2013-10-21 | 2016-03-31 | Vaccinex Inc | Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders |
| AU2017252427B2 (en) | 2016-04-22 | 2023-07-13 | Vaccinex, Inc. | Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions |
| JP7128177B2 (ja) | 2016-08-02 | 2022-08-30 | バクシネックス インコーポレーティッド | ワクシニアウイルス／真核細胞においてポリヌクレオチドライブラリを生成するための改善された方法 |
| JP2020510845A (ja) | 2017-02-22 | 2020-04-09 | バクシネックス インコーポレーティッド | 神経変性疾患または神経炎症性疾患におけるグリア細胞活性化の早期検出方法 |
| EP3600419B1 (en) | 2017-03-20 | 2023-08-09 | Vaccinex, Inc. | Treatment of cancer with a semaphorin-4d antibody in combination with an epigenetic modulating agent |
| US11427634B2 (en) | 2017-05-05 | 2022-08-30 | Vaccinex, Inc. | Human anti-semaphorin 4D antibody |
-
2013
- 2013-03-15 US US13/844,388 patent/US9708601B2/en active Active
- 2013-04-26 EA EA201491965A patent/EA028164B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-04-26 CA CA2871597A patent/CA2871597C/en active Active
- 2013-04-26 ES ES13780660T patent/ES2725673T3/es active Active
- 2013-04-26 CN CN201380033060.7A patent/CN104520444B/zh active Active
- 2013-04-26 WO PCT/US2013/038497 patent/WO2013163602A1/en active Application Filing
- 2013-04-26 NZ NZ630854A patent/NZ630854A/en unknown
- 2013-04-26 DK DK13780660.0T patent/DK2841606T3/da active
- 2013-04-26 KR KR1020147033046A patent/KR102108589B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-26 JP JP2015509201A patent/JP6498599B2/ja active Active
- 2013-04-26 PL PL13780660T patent/PL2841606T3/pl unknown
- 2013-04-26 PT PT13780660T patent/PT2841606T/pt unknown
- 2013-04-26 SG SG11201406974YA patent/SG11201406974YA/en unknown
- 2013-04-26 EP EP13780660.0A patent/EP2841606B1/en active Active
- 2013-04-26 AU AU2013251371A patent/AU2013251371B2/en active Active
-
2014
- 2014-10-23 IL IL235323A patent/IL235323B/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-12-21 US US14/977,067 patent/US9701958B2/en active Active
-
2017
- 2017-06-12 US US15/619,790 patent/US10662422B2/en active Active
-
2018
- 2018-11-01 JP JP2018206485A patent/JP2019055956A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050266425A1 (en) * | 2003-12-31 | 2005-12-01 | Vaccinex, Inc. | Methods for producing and identifying multispecific antibodies |
| US20090304627A1 (en) * | 2008-05-28 | 2009-12-10 | Vgx Pharmaceuticals, Inc. | Smallpox dna vaccine and the antigens therein that elicit an immune response |
| US20100081575A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-04-01 | Robert Anthony Williamson | Methods for creating diversity in libraries and libraries, display vectors and methods, and displayed molecules |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GALMICHE et al. "Expression of a functional single chain antibody on the surface of extracellular enveloped vaccinia virus as a step towards selective tumour cell targeting," Journal of General Virology, 01 November 1997 (01.11.1997), vol. 78, pgs. 3019-3027. entire document * |
| SMITH et al. "Nucleotide sequence of 42 kbp of vaccinia virus strain WR from near the right inverted terminal repeat," Journal of General Virology, 01 June 1991 (01.06.1991), vol. 72, pgs. 1349-1376, entire document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104520444B (zh) | 2017-12-12 |
| KR102108589B1 (ko) | 2020-05-07 |
| US9701958B2 (en) | 2017-07-11 |
| PL2841606T3 (pl) | 2019-07-31 |
| JP6498599B2 (ja) | 2019-04-10 |
| CA2871597A1 (en) | 2013-10-31 |
| CA2871597C (en) | 2021-04-20 |
| ES2725673T3 (es) | 2019-09-26 |
| PT2841606T (pt) | 2019-05-17 |
| US20160152971A1 (en) | 2016-06-02 |
| EP2841606B1 (en) | 2019-01-23 |
| US10662422B2 (en) | 2020-05-26 |
| KR20150009560A (ko) | 2015-01-26 |
| JP2019055956A (ja) | 2019-04-11 |
| AU2013251371A1 (en) | 2014-11-13 |
| US20170306318A1 (en) | 2017-10-26 |
| IL235323A0 (en) | 2014-12-31 |
| EP2841606A4 (en) | 2015-12-30 |
| EP2841606A1 (en) | 2015-03-04 |
| NZ630854A (en) | 2017-03-31 |
| DK2841606T3 (da) | 2019-05-06 |
| SG11201406974YA (en) | 2014-11-27 |
| US20130288927A1 (en) | 2013-10-31 |
| WO2013163602A1 (en) | 2013-10-31 |
| IL235323B (en) | 2020-01-30 |
| US9708601B2 (en) | 2017-07-18 |
| JP2015514811A (ja) | 2015-05-21 |
| AU2013251371B2 (en) | 2018-01-04 |
| EA201491965A1 (ru) | 2015-03-31 |
| CN104520444A (zh) | 2015-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA028164B1 (ru) | Слитые белки для облегчения отбора клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины с геном специфического иммуноглобулина | |
| US20240018224A1 (en) | Anti-gpc3 antibody | |
| JP6043431B2 (ja) | 特異的な結合タンパク質または機能性タンパク質の遺伝子転位を利用した同定 | |
| CN107353340B (zh) | 抗h7n9全人源单克隆抗体2l11及其制法与应用 | |
| RU2759846C2 (ru) | Дисплей интегрального мембранного белка на внеклеточных оболочечных вирионах поксвируса | |
| JPH02477A (ja) | 相同組換えによるキメラ抗体の製造 | |
| RU2625033C2 (ru) | Система индикации на основе полноразмерного антитела для эукариотических клеток и ее применение | |
| JP7141154B2 (ja) | 抗体ライブラリーの構築方法およびその使用 | |
| CN101263158A (zh) | 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制 | |
| TW200907059A (en) | Recombinant expression vector elements (rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells | |
| Karachaliou et al. | IgY technology: Methods for developing and evaluating avian immunoglobulins for the in vitro detection of biomolecules | |
| EP3831944A1 (en) | Anti-ror1 monoclonal antibody, functional fragment thereof, gene, drug delivery composition, and pharmaceutical composition | |
| EA003637B1 (ru) | Новые способы идентификации биомолекул лигандов и мишеней | |
| JP2003512860A (ja) | 組換え融合分子 | |
| US20230060376A1 (en) | B cell receptor modification in b cells | |
| JP2022521147A (ja) | ｍＲＮＡディスプレイ抗体ライブラリー及び方法 | |
| CN104507970B (zh) | 通过抑制p68与钙调蛋白相互作用来预防癌症转移及抑制炎症的方法 | |
| KR102266878B1 (ko) | 감자 잎말림 바이러스 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도 | |
| JP2011103876A (ja) | キメラ抗体の一段階作製方法 | |
| EA043515B1 (ru) | Анти-gpc3-антитело | |
| WO2013191199A1 (ja) | タンパク質の迅速改良法 | |
| Deen | Isolation of Human Endoplasmic Reticulum Antibodies Using Phage Display Technology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |