KR102003571B1

KR102003571B1 - 골형성 촉진제

Info

Publication number: KR102003571B1
Application number: KR1020137033039A
Authority: KR
Inventors: 히로시 타카야나기; 타카코 네기시
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠호우징 도쿄이카시카다이가쿠
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2019-07-24
Also published as: US9447191B2; CA2835599C; JP5925768B2; JPWO2012157237A1; CA2835599A1; US20140303358A1; EP2711023A1; DK2711023T3; MX2013013207A; AU2012257254B2; MX343640B; SG194913A1; CN103945868B; AU2012257254A1; ES2640567T3; NZ618900A; CN103945868A; BR112013029348A2; WO2012157237A1; PT2711023T

Abstract

본 발명은, 골아세포에 의한 골형성을 직접 촉진하는 골형성 촉진제, 또는 골질환의 예방 및 치료제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다. 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질을 이용하는 것을 특징으로 한다. 이러한 결합 저해물질로서는 항-세마포린 4D 항체, 항플렉신 B1 항체, 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질 등을 적합하게 예시할 수 있다.

Description

골형성 촉진제{OSTEOGENESIS PROMOTER}

본 발명은, 골형성 촉진제 또는 골질환의 예방 및 치료제에 관한 것이다. 보다 상세히는, 세마포린(semaphorin) 4D와 플렉신(plexin) B1과의 결합 저해물질을 유효성분으로 하는 골형성 촉진제나, 골질환의 예방 및 치료제에 관한 것이다.

고령화 사회에 따른 골절, 골다공증, 관절 류머티즘, 허리 통증 등의 골질환 환자가 증가하고 있다. 골조직에서는, 골형성을 담당하는 골아세포(osteoblast)와, 골흡수를 담당하는 파골세포(osteoclast)가 협조하여 활동하여, 골형성과 골흡수를 균형있게 유지하는 것에 의해, 골조직의 기능을 유지하고 있다. 이 골대사의 균형이, 노화나 난소 기능의 저하 등의 요인에 의해서 무너져 골형성이 저하하거나, 혹은 골흡수가 이상항진되면 골의 양(골밀도)이 감소하여 여러가지 골질환이 생긴다. 이러한 골질환으로서, 골절, 골결손, 골다공증, 골연화증, 골감소증, 허리 통증, 골페젯트병, 경직성 척수염, 관절 류머티즘, 변형성 관절증 등이 알려져 있다. 특히 고령자가 골질환으로 피해를 입으면 일상생활에 필요한 레벨의 운동조차 곤란하여 지거나, 경우에 따라서는 그대로 병들어 눕게 되는 위험성도 있다. 그 때문에 고령화가 진행하는 현대사회에서 골질환을 예방·치료하는 것에는 중요한 의의가 있다.

현재, 골질환의 치료제로서, 활성형 비타민 D3제, 비스포스포네이트제, 칼시토닌 제제, 에스트라디올 함유의 호르몬 제제, 비타민 K2제 등이 일반적으로 이용되고 있다. 또한, 부작용이 보다 적고 보다 효과적인 치료제로서, 에스트라디올 유도체, 활성형 비타민 D3 유도체, 비스포스포네이트 유도체 등의 개발이 행하여지고 있다(특허문헌1 참조). 그러나, 비타민 D3는 혈중의 칼슘농도를 높이는 작용을 갖고 있고, 또한, 에스트라디올이나 비스포스포네이트는 골흡수의 저해 작용을 갖고 있지만, 어느 것이나 골아세포에 의한 골형성을 직접 촉진하는 작용은 없다. 골질환, 특히 골대사 질환의 치료에는, 다제 병용요법이 주류로 되고 있으므로, 종래의 예방 및 치료제와는 다른 작용기전(기작)을 갖는 신규한 예방 및 치료제의 개발이 기대되고 있다.

골은, 골의 흡수 단계와, 그에 연속되는, 골의 형성 단계를 반복하는 골 리모델링(골재구축)으로 불리는 공정에 의해서 연속적으로 재생되어 있다. 각 단계 및 단계의 이행은, 파골세포-골아세포 사이의 커뮤니케이션에 관여하는 골세포로부터 분비되거나, 또는 골기질로부터 방출되는 골재구축 인자에 의해서 미세하게 제어되어야 하다. 골흡수의 사이에 방출된 TGF-β 및 IGF-1은, 골형성을 자극하는 것이 알려지고 있고, 그 때문에 커플링 인자로 알려져 있다. 골 리모델링에 중요한 후보 분자의 시험관내(in vitro) 데이터는 충분히 많이 있지만, 생체내(in vivo)의 증거는 충분히 제공되어 있지 않다.

축삭 가이던스 분자는, 신경계의 외측에서 널리 발현하고 있고, 따라서 세포 이주, 면역 응답, 조직 발달 및 혈관 형성 등을 제어하고 있다(비특허문헌1 및 2 참조). 최근의 연구에 의해, 세마포린 및 에프린(ephrin) 등의 축삭 가이던스 분자가 파골세포와 골아세포 사이의 세포간 커뮤니케이션에 관여하고 있다는 것이 시사되어 있다(비특허문헌3∼5 참조).

세마포린 4D는, 올리고덴드로사이트에서 분비되어 중추신경계에서 성장 원추의 붕괴를 유도하는 것이 알려져 있다. 또한, 세마포린 4D는 면역 응답 및 면역계의 항상성의 유지에 중요한 것이 분명하여지고 있다. 세마포린 4D의 수용체의 하나로서 플렉신 B1이 알려져 있다(비특허문헌6 참조). 또한, 비특허문헌7에는 파골세포 유래의 세마포린 4D가 골아세포 분화 억제작용 및 골아세포를 통한 파골세포 형성을 촉진할 가능성이 시사되어 있다. 또한, 비특허문헌8에는, 세마포린 4D가 골아세포로서는 검출되지 않고, 파골세포의 표면에 존재하는 것 및 세마포린 4D(Sema4D)을 호모(homo) 결손시킨 암컷의 sema4D-/-마우스에서 야생형 마우스와 비교하여 골량의 증가가 인정을 받은 것이 개시되어 있다.

특허문헌1 : 특표 2005-509629호 공보

비특허문헌1 : B. J. Dickson, Science 298, 1959 (Dec 6, 2002) 비특허문헌2 : A. B. Huber, A. L. Kolodkin, D. D. Ginty, J. F. Cloutier, Annu Rev Neurosci 26, 509 (2003) 비특허문헌3 : N. Takegahara et al., Nat Cell Biol 8, 615 (Jun, 2006) 비특허문헌4 : N. Irie et al., J Biol Chem 284, 14637 (May 22, 2009) 비특허문헌5 : C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (Aug, 2006) 비특허문헌6 : I. Oinuma et al., Science, Vol. 305, no. 5685, pp. 862-865 (August 6 2004) 비특허문헌7 : Ishida Masanari, Kaneda Toshio, Yoshida Masashi, 일본 골 대사학회 학술집회 프로그램 초록집, 25권, 266페이지, 2007년 6월 발행, 「파골세포 유래 세마포린 4D의 골대사에 있어서의 생리작용의 해석」 비특허문헌8 : Romain DACQUIN, Chantal Domenget, Pierre Jurdic, Irma Machuca-Gayet, ASBMR 2010 Annual Meeting Abstracts, Presentation Number MO0152, "Physiological Control of Bone Resorption by semaphorin4D is Dependent on Ovarian Function"

본 발명의 과제는, 골아세포에 의한 골형성을 직접 촉진하는 골형성 촉진제나, 골질환의 예방 및 치료제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 배경기술에 기재된 것과 같은 상황에서 예의 연구를 한 결과, (a) 파골세포 유래의 세마포린 4D가, 골아세포 상의 플렉신 B1 수용체에 결합하면, 골아세포 분화를 저해하는 스몰(small) G 단백질 RhoA를 활성화하여 IRS 시그널(골아세포의 분화를 촉진하는 시그널)을 저하시키고, 골아세포의 분화를 억제함으로써 골형성을 저해하는 것 및 (b) 항세마포린 4D 항체나 항플렉신 B1 항체 등이 골아세포에 의한 골형성을 직접 촉진하는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, (1) 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질을 유효성분으로 하는 골형성 촉진제 또는, (2) 결합 저해물질이 항세마포린 4D 항체인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 골형성 촉진제 또는, (3) 결합 저해물질이 항플렉신 B1 항체 또는 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질인 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 골형성 촉진제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, (4) 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질을 유효성분으로 하는 골질환의 예방 및 치료제 또는, (5) 결합 저해물질이 항세마포린 4D 항체인 것을 특징으로 하는 상기 (4)에 기재된 골질환의 예방 및 치료제 또는, (6) 결합 저해물질이 항플렉신 B1 항체 또는 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질 인것을 특징으로 하는 상기 (4)에 기재된 골질환의 예방 및 치료제 또는, (7) 골질환이 골절, 골결손, 골다공증, 골연화증, 골감소증, 허리 통증, 골페젯트병, 경직성 척수염, 관절 류머티즘, 및, 변형성 관절증으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 (4)∼(6)중 어느 것에 기재된 골질환의 예방 및 치료제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, (8) 피검물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부를 결정하여, 상기 피검물질이 상기 결합 저해물질인 경우에, 상기 피검물질을 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질이라고 판정하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질의 판정방법 또는, (9) 피검물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부를 결정하는 방법이 이하의 공정 (A)∼(D)을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 (8)에 기재된 판정방법: (A) 피검물질의 존재하에서, 세마포린 4D와 플렉신 B1을 접촉시키는 공정: (B) 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합의 정도를 측정하는 공정: (C) 상기 공정 (B)로 측정한 정도를, 피검물질 비존재하의 그 정도와 비교하는 공정: (D) 상기 공정 (B)로 측정한 정도가 피검물질 비존재하의 그 정도보다도 낮은 경우에 그 피검물질을 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질로 결정하는 공정: 또는, (10) 상기 (8) 또는 상기 (9)에 기재된 판정방법을 사용하여 피검물질 중에서 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질을 탐색하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 골아세포에 의한 골형성을 직접 촉진하거나, 골질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다.

[도 1]은 마이크로 CT(μCT)분석으로 측정한 야생형(WT) 마우스 및 세마포린 4D 넉아웃(Sema4d-/-) 마우스에 있어서의 골량을 도시한 도면이다.
[도 2]는 μCT 분석으로 측정한 WT 마우스 및 Sema4d-/- 마우스에 있어서의 골해면질(骨梁) 두께를 도시한 도면이다.
[도 3]은 4일 마다의 칼세인 이중표지를 행한 WT 마우스 및 Sema4d-/- 마우스에 있어서의 골형태형성 해석(骨形態形成解析)에 의해 측정한 골형성[골아세포 표면적(좌측),석회화한 골 표면적(중앙) 및 골 형성율(우측)]을 도시한 도면이다.
[도 4]는 WT 마우스 및 Sema4d-/-마우스에 있어서의 골형태형성 해석에 의해 측정한, 파골세포 표면적과 세포수(좌측 및 중앙) 및 골흡수의 파라미터(우측)를 도시한 도면이다.
[도 5]는 WT 마우스 또는 Sema4d-/-마우스의 골수세포를 적응 면역 세포 이식한 마우스의 골량을 도시한 도면이다. 좌측으로부터 2개의 그래프는, WT 마우스에게 이식한 경우에서의 마우스의 골량을 도시한 것이고, 우측으로부터 2개의 그래프는, Sema4d-/-마우스에게 이식한 경우에서의 마우스의 골량을 도시한 것이다.
[도 6]은 골형성 조건하에서 배양한 두개관 세포에 Fc-sema4D(IgG1의 Fc 영역과 융합한 조직 전환된 세마포린 4D)을 첨가했을 때의 골 결절수를 도시한 도면이다.
[도 7]은 골아세포 분화중인 플렉신 B형 및 분화군 72(CD72)의 mRNA의 발현을 도시한 도면이다.
[도 8]은 Fc-sema4D를 이용한 풀다운 해석의 결과를 도시한 도면이다. 우측 패널은 풀다운 전의 샘플의 해석 결과를 나타내고, 좌측 패널은 풀다운 후의 샘플의 해석 결과를 나타낸다.
[도 9]는 μCT 분석으로 측정한 WT 마우스 및 플렉신 B1 넉아웃(Plxnb1-/-)마우스에 있어서의 골량을 도시한 도면이다.
[도 10]은 μCT 분석으로 측정한 WT 마우스 및 Plxnb1-/-마우스에 있어서의 골해면질 두께를 도시한 도면이다.
[도 11]은 골형태형성 해석으로 측정한 WT 마우스 및 Plxnb1-/-마우스에 있어서의 골아세포 표면적을 도시한 도면이다.
[도 12]는 골형태형성 해석으로 측정한 WT 마우스 및 Plxnb1-/-마우스에 있어서의 석회화한 골 표면적을 도시한 도면이다.
[도 13]은 골형태형성 해석으로 측정한 WT 마우스 및 Plxnb1-/-마우스에 있어서의 골 형성율을 도시한 도면이다.
[도 14]는 플렉신 B1, GAP 도메인에 변이를 갖는 플렉신 B1의 RA 돌연변이체(R1661/1662/1968A), 및 PDZ 결합 도메인이 결여하고 있는(ΔPDZ) 플렉신 B1의 절단된 돌연변이체의 개략을 도시한 도면이다.
[도 15]는 μCT 분석으로 측정한 WT 마우스(컨트롤 마우스) 및 우성(dominant)네가티브 RhoA(RhoA DN^OB)마우스에 있어서의 골량을 도시한 도면이다.
[도 16]은 μCT 분석으로 측정한 WT 마우스(컨트롤) 및 RhoA DN^OB 마우스에 있어서의 골해면질 두께를 도시한 도면이다.
[도 17]은 골형태형성 해석으로 측정한 WT 마우스(컨트롤) 및 RhoA DN^OB 마우스에 있어서의 골형성[골아세포 표면적]을 도시한 도면이다.
[도 18]은 골형태형성 해석으로 측정한 WT 마우스(컨트롤) 및 RhoA DN^OB 마우스에 있어서의 골형성[석회화한 골 표면적]을 도시한 도면이다.
[도 19]는 골형태형성 해석으로 측정한 WT 마우스(컨트롤) 및 RhoA DN^OB 마우스에 있어서의 골형성[골 형성율]을 도시한 도면이다.
[도 20]은 골형태형성 해석으로 측정된 난소적출(OVX) 마우스 및 항-Sema4D 항체로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골아세포 표면적을 도시한 도면이다.
[도 21]은 μCT 분석으로 측정한 OVX 마우스 및 항세마포린 4D 항체(항-Sema4D 항체)로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골량을 도시한 도면이다.
[도 22]는 골형태형성 해석으로 측정한 OVX 마우스 및 항-Sema4D 항체로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골형성[골 형성율]을 도시한 도면이다.
[도 23]은 μCT 분석으로 측정한 OVX 마우스 및 항-Sema4D 항체로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골해면질 간격을 도시한 도면이다.
[도 24]에서 도 24의 위 패널은 마우스 골아세포를 WT 마우스 또는 Sema4d-/- 마우스의 파골세포 및 항-Sema4D 항체의 존재하에 배양한 경우의 석회화 형성을 조사한 결과를 도시한 도면이다. 도 24의 아래 패널은 마우스 골아세포를 Fc-sema4d 및/또는 항플렉신 B1 항체의 존재하에 배양한 경우의 석회화 형성을 조사한 결과를 도시한 도면이다.
[도 25]는 인간 골아세포(HOS)를 파골세포 존재 하에서 상청 및/또는 항-Sema4D 항체 등의 존재하로 배양한 경우의 석회화 형성을 조사한 결과를 도시한 도면이다.
[도 26]은 골형태형성 해석으로 측정한 난소 적출(OVX) 마우스 및 OVX 처리후 6주로부터 항세마포린 4D 항체(항-Sema4D 항체)로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골아세포 표면적을 도시한 도면이다.
[도 27]은 μCT 분석으로 측정한 OVX 마우스 및 OVX 처리후 6주로부터 항-Sema4D 항체로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골량을 도시한 도면이다.
[도 28]은 골형태형성 해석으로 측정한 OVX 마우스 및 OVX 처리후 6주로부터 항-Sema4D 항체로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골형성[골 형성율]을 도시한 도면이다.
[도 29]는 μCT 분석으로 측정한 OVX 마우스 및 OVX 처리후 6주로부터 항-Sema4D 항체로 처리한 OVX 마우스에 있어서의 골해면질 간격을 도시한 도면이다.

본 발명의「골형성 촉진제」나, 본 발명의「골질환의 예방 및 치료제」(이하, 통합하여 「본 발명의 제」라고도 표시한다.)에 있어서는, 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질(이하, 단순히「본 발명에 있어서의 결합 저해물질」이라고도 표시한다.)을 유효성분으로 하고 있는 한 특히 제한되지 않고, 또한, 이러한 본 발명에 있어서의 결합 저해물질로서는, 임의의 척추동물의 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합을 저해하는 물질인 한 특히 제한되지 않지만, 항세마포린 4D 항체, 항플렉신 B1 항체, 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질을 적합하게 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서의 결합 저해물질은 파골세포 유래의 세마포린 4D와 골아세포 상의 플렉신 B1 수용체와의 결합을 저해하여, RhoA의 활성화 저해와 IRS 시그널의 저하 저해를 통해, 골아세포의 분화 억제를 저해함으로써 골아세포에 의한 골형성을 촉진한다고 생각된다. 또, 본 명세서에 있어서, 「저해」라는 단어와, 「억제」라는 단어는 특별히 구별 없이 이용된다.

상기의 항세마포린 4D 항체나, 항플렉신 B1 항체(이하, 「본 발명의 항체」)는 폴리클로날 항체이어도 좋고, 모노클로날 항체 및 그 기능적 단편의 어느 것이어도 좋지만, 특이성이 높다는 등의 점에서 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 상기의 항세마포린 4D 항체나 항플렉신 B1 항체는 세마포린 4D나 플렉신 B1을 이용하여 종래 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 본 발명의 항체인 기능적 단편이란 본 발명의 항체가 특이적으로 결합하는 항원인 세마포린 4D나 플렉신 B1에 대하여 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 의미하며, 보다 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, 이황화-결합된 FV, 단일-사슬 FV(scFV) 및 이것들의 중합체 등을 들 수 있다(D.J.King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998 T.J.International Ltd). 이러한 항체 단편은 관용법, 예컨대 파파인, 펩신 등의 프로테아제에 의한 항체 분자의 소화, 혹은 공지의 유전자 공학적수법에 의해 얻을 수 있다. 또, 본 발명의 항체에는 항체 또는 그의 기능적 단편의 항체 결합능을 방해하지 않는 한, 항체 또는 그의 기능적 단편에 펩티드 또는 단백질을 부가한 것도 편의상 포함된다.

또한, 본 발명의 항체는 인간 항체를 포함한다. 여기서 본 발명에 있어서「인간 항체」란, 인간 유래의 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다. 인간 항체는 인간 항체 유전자 자리를 도입하여 인간 유래 항체를 생산할 수 있는 능력을 갖는 트랜스제닉 동물에게 세마포린 4D나 플렉신 B1을 투여함으로써 얻을 수 있다. 해당 트랜스제닉 동물의 예로서 예컨대, 마우스를 들 수 있다. 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스로서 예컨대, 내재성 마우스 면역 글로불린(Ig) 중쇄 및 마우스 κ 경쇄를 결손하고 있고, 또한, 인간 Ig 중쇄 유전자를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 동시에 유지하는 마우스를 예로 들 수 있다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자 자리를 갖는 계통 A의 마우스와 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자를 갖는 계통 B의 마우스와의 교배에 의해 제작된다. 계통 A는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ 경쇄 파괴의 양자에 관해서 호모접합체이며, 자손 전달가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 계통(Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97:722)이다. 또한, 계통 B는 내재성 마우스 Ig 중쇄및 κ 경쇄 결손의 양자에 관해서 호모접합체이며, 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 유지하는 마우스 계통(Nat Biotechnol., 1996 Vol14:845)이다.

본 발명의 폴리클로날 항체는 예컨대, 이하에 진술하는 방법에 의해서 제조할 수 있다. 세마포린 4D나 플렉신 B1을 필요에 따라서 면역부활제(Freund' s Adjuvant 등)와 함께 마우스, 토끼, 염소, 말 등의 비인간 포유동물에게 면역함으로써 얻어진다. 본 발명의 모노클로날 항체는 면역 감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와 자기 항체 생산 능력이 없는 골수종계세포(myeloma 세포)로부터 하이브리도마(hybridoma)를 조제하고 하이브리도마를 클론화하여, 면역에 이용한 항원에 대하여 특이적 친화성을 나타내는 모노클로날 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 취득할 수 있다. 해당 하이브리도마의 조제는 켈러 및 밀슈타인 방법(Nature, 1975 Vol.256:495-497) 및 그것에 준하여 행할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하리브리도마 클론의 스크리닝은 하이브리도마를 예컨대, 마이크로 타이터 플레이트(micro-titer plate) 중에서 배양하여 증식이 보인 웰의 중앙 배양 상청의 면역 항원에 대한 반응성을, 예컨대, ELISA 등의 효소면역측정법, 방사면역측정법, 형광항체법 등의 면역학적 방법을 이용하여 측정함으로써 행할 수 있다.

하이브리도마로부터의 모노클로날 항체의 제조는 하이브리도마를 시험관내 로 배양하여 배양상청으로부터 단리할 수 있다. 또한, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터 또는 토끼 등의 복수 내 등에서의 생체내에서 배양하여 복수로부터 단리할 수도 있다. 또한, 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝하고 적당한 벡터에 내장하여, 이것을 숙주(예컨대 차이니즈 햄스터난소(CHO) 세포 등의 포유류 세포주, 대장균, 효모세포, 곤충세포, 식물세포 등)에 도입하여, 유전자 재조합 기술을 이용하여 재조합 항체를 조제할 수 있다(P.J.Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY, P.Shepherd and C.Dean, Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding, Monoclonal Antibodies:principles and practice, 1993 ACADEMIC PRESS).

또한, 트랜스제닉 동물제작 기술을 이용할 목적 항체의 유전자가 내재성 유전자에게 삽입된 트랜스제닉인 소, 염소, 양 또는 돼지를 제작하여, 그 트랜스제닉 동물의 유액 중에서 그 항체 유전자로부터 유래하는 항체를 대량으로 취득하는 것도 가능하다.

생산된 항체는, 해당 분야에서 주지의 방법, 예컨대 프로테인 A 컬럼에 의한 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 유안염석법, 겔여과, 친화성 크로마토그래피 등을 적절하게 조합하는 것에 의해 정제할 수 있다.

전술의 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질은 세마포린 4D를 트랩함으로써 세마포린 4D와 플렉신 B1의 결합을 저해할 수 있다. 이러한 단백질로서는 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질이면 특히 제한되지 않지만, 또한,항체의 정상영역(바람직하게는, 임의의 면역 글로불린의 Fc 단편)으로 융합하고 있는 단백질을 적합하게 예시할 수 있다.

상기한 세마포린 4D, 플렉신 B1, 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질은 예컨대, 이들의 단백질의 배열 정보에 기초로 하여, 그 배열을 포함하는 발현 벡터를 제작하고, 그 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 형질전환하여 세포내에서 목적 단백질을 생성시켜, 그 목적 단백질을 단리하는 방법 등의 종래 공지의 방법에 의해 입수할 수 있다. 예컨대 인간의 세마포린 4D의 DNA 배열(서열번호 1)이나 아미노산 배열(서열번호 2)은, 예컨대 진뱅크(GenBank)의 입수 번호(Accession Number) NM_001142287에, 또한, 인간의 플렉신 B1의 DNA 배열(서열번호 3)이나 아미노산배열(서열번호 4)은, 예컨대 진뱅크의 입수 번호 NM_001130082에 개시되어 있다. 또한, 인간의 플렉신 B1의 세포밖 영역은, 전술의 입수 번호 NM_001130082의 아미노산 배열의 아미노산 번호 1∼1490에 해당한다.

어떤 물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부는 예컨대, 그 물질의 존재하 및 비존재하에, 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합을 면역 블롯 해석 등으로 측정하여, 그 물질의 존재하에서 그 결합이 저하하는지 여부를 조사하는 것에 따라 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서의 골형성 촉진 효과란 골형성을 촉진하는 효과를 의미하며, 보다 적합하게는, 골아세포의 분화억제를 저해함으로써 골아세포에 의한 골형성을 촉진하는 효과를 포함한다. 어떤 물질이 골형성 촉진 효과를 가지고 있는지의 여부는, 골량이 통상보다도 낮은 척추동물(바람직하게는, 골다공증 환자, 골다공증 모델 척추동물)에 그 물질을 투여하여 골량이 증가하는지 여부를 조사하는 것에 따라 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서의 골질환의 예방·치료 효과란, 본 발명에 있어서의 임의의 골질환을 예방 및/또는 치료하는 효과, 혹은 그 증상을 개선하는 효과를 의미한다. 어떤 물질이 골질환의 치료 효과를 가지고 있는지의 여부는, 골질환이 있는 환자 또는 척추동물(바람직하게는, 골다공증 환자, 골다공증 모델 척추동물)에 그 물질을 투여하여, 그 골질환이 치유되는지 또는 개선되는지 여부를 조사하는 것에 따라 확인할 수 있다.

본 발명의 제는, 본 발명에 있어서의 결합 저해물질만을 함유하고 있어도 되지만, 약학적으로 허용되는 통상의 담체, 항산화제, 결합제, 안정화제, 부형제, 희석제, pH 완충제, 붕괴제, 가용화제, 용해보조제, 등장제 등의 각종 조제용 배합성분을 첨가하여도 좋다. 본 발명의 저감제의 제형으로서는, 분말제, 과립제, 캡슐제 등의 고형제제이어도 좋고, 용액제, 유제, 현탁제 등의 액제이어도 좋다. 이것들의 제제는 본 발명에 있어서의 결합 저해물질에 관해서 통상법으로 하고자 하는 처리를 하는 것에 따라 적절하게 제작할 수 있다.

본 발명의 제의 투여방법으로서는 원하는 골형성 촉진 효과나, 원하는 골질환의 예방·치료 효과를 얻을 수 있는 한 특히 제한되지 않고, 비경구 투여이어도 경구 투여이어도 좋다. 비경구 투여의 방법으로서는, 혈관내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경피 투여, 경비(鼻) 투여, 경폐 투여 등을 예시할 수 있고, 그 중에서도, 혈관내 투여를 적합하게 예시할 수 있고, 그 중에서도, 정맥내 투여를 보다 적합하게 예시할 수 있다. 또한 본 발명의 제의 투여량이나 투여횟수나 투여농도는 투여 대상의 체중이나, 골질환의 종류, 골질환의 증상의 정도 등에 따라서 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 제의 투여대상으로서는 척추동물을 예시할 수 있고, 그 중에서도, 포유류에 속하는 동물이나 조류에 속하는 동물을 적합하게 예시할 수 있고, 그 중에서도, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 몰모트, 소, 돼지, 말, 토끼, 양, 염소, 고양이, 개, 닭, 메추리 등을 적합하게 예시할 수 있고, 그 중에서도 인간이나 가축·가금류를 보다 적합하게 예시할 수 있다. 또한, 본 발명의 제에 포함되는 본 발명에 있어서의 결합 저해물질이 결합 저해 작용을 발휘하는 세마포린 4D나 플렉신 B1의 유래인 척추동물의 종류는, 본 발명의 제의 투여대상이 되는 척추동물의 종류와 일치하고 있는 것이 보다 안정하고, 우수한 골형성 촉진 효과나 골질환의 예방·치료 효과를 얻는 관점에서 바람직하다. 또, 세마포린 4D의 유래가 되는 척추동물과, 플렉신 B1의 유래가 되는 척추동물의 종류는 동일하여도 좋고, 다르더라도 좋다.

본 발명에 있어서의 골질환의 종류로서는 골형성의 저하를 기인으로 하는 골질환 혹은 골형성의 저하에 관련되는 골질환인 한 특히 제한되지 않지만, 골절, 골결손, 골다공증, 골연화증, 골감소증, 허리 통증, 골페젯트병, 경직성 척수염, 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 골형성 부전증, 골다공증을 적합하게 예시할 수 있고, 그 중에서도, 골다공증, 골연화증, 골감소증, 골형성 부전증을 보다 적합하게 예시할 수 있다.

본 발명의 판정방법은 피검물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부를 결정하여, 상기 피검물질이 상기 결합 저해물질인 경우에, 상기 피검물질을 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질이라고 판정하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질의 판정방법이다. 상기한 판정방법에 있어서, 피검물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부를 결정하는 방법으로서는 이하의 공정(A)∼(D)을 갖는 방법을 적합하게 예시할 수 있다.

(A) 피검물질의 존재하에서, 세마포린 4D와 플렉신 B1을 접촉시키는 공정;

(B) 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합의 정도를 측정하는 공정;

(C) 상기 공정 (B)로 측정한 정도를, 피검물질 비존재하의 그 정도와 비교하는 공정;

(D) 상기 공정 (B)로 측정한 정도가 피검물질 비존재하의 그 정도보다도 낮은 경우에 그 피검물질을 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질로 결정하는 공정.

상기 판정방법에서는, 세마포린 4D로서, 표지화한, 세마포린 4D 세포밖 영역이나 세마포린 4D 세포밖 영역과 면역 글로불린Fc 영역 등과의 융합 단백질을, 플렉신 B1으로서, 그것이 세포표면에 발현하고 있는 것을, 각각 이용하여 결합의 정도를 측정하여도 좋다. 또는 플렉신 B1으로서, 표지화한, 플렉신 B1 세포밖 영역이나 플렉신 B1 세포밖 영역과 면역 글로불린 Fc 영역 등과의 융합 단백질을, 세마포린 4D로서, 그것이 세포표면에 발현하고 있는 것을, 각각 이용하여 결합의 정도를 측정하여도 좋다.

본 발명의 판정방법에 있어서의 피검물질로서는 특히 제한되지 않고, 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합을 저해하는 활성을 갖는 물질인 것이 미리 판명된 물질이어도 좋고, 이러한 활성을 갖는지 여부가 불명인 물질이어도 좋다. 또한, 피검물질로서 복수의 피검물질을 동시에 이용하여도 좋다. 복수의 피검물질을 동시에 이용할 때는, 단독의 피검물질을 각각 별도의 샘플 내에서 동시에 이용하여도 좋고, 복수의 피검물질을 단일 샘플 내에서 동시에 이용하여도 좋고, 복수의 피검물질을 이용하는 단일의 샘플을 복수준비하여 동시에 이용하여도 좋다. 복수의 피검물질을 단일 샘플내에서 동시에 이용할 때는, 이들의 피검물질의 어느 것이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인가를 1회의 시험으로 결정할 수 없는 경우도 있지만, 피검물질을 단계적으로 집광하여 시험을 복수회 수행하면 어느쪽의 피검물질이 그 결합 저해물질인가를 결정할 수 있다. 본 발명의 판정방법은 피검물질 중에서 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질을 탐색하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질의 스크리닝 방법으로서 사용할 수도 있다.

또, 본 발명의 다른 양태로서, (a) 상기한 골형성 촉진제나 골질환의 예방 및 치료제의 조제에 있어서의 본 발명에 있어서의 결합 저해물질의 사용, (b) 골형성 촉진이나 골질환의 예방·치료에 있어서의 사용을 위한, 본 발명에 있어서의 결합 저해물질, (c) 본 발명에 있어서의 결합 저해물질을, 골형성의 촉진이나, 골질환의 예방·치료에 사용하는 방법, (d) 본 발명에 있어서의 결합 저해물질을 대상 척추동물에게 투여함으로써, 골형성을 촉진하는 방법, (e) 본 발명에 있어서의 결합 저해물질을 대상 척추동물에게 투여함으로써, 골질환을 예방·치료하는 방법을 들 수 있다.

이하에 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이것들의 실시예에 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

[마우스와 골 표현형의 해석]

Sema4d-/-, Plxnb1-/-, 플렉신 B2 넉아웃(Plxnb2-/-), CAT-RhoA DN 및 α1(I)-Cre 마우스의 제작은 문헌에 기재된 방법에 따라서 수행하였다(W. Shi et al., Immunity 13, 633 (Nov, 2000), R. H. Friedel et al., J Neurosci 27, 3921 (Apr 4, 2007), R. H. Friedel et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13188 (Sep 13, 2005), K. Kobayashi et al., J Neurosci 24, 3480 (Apr 7, 2004), R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke, G. Karsenty, Dev Dyn 224, 245 (Jun, 2002)). 모든 마우스는 C57BL/6 마우스와 8회 이상 역교배(backcross)시켰다. 모든 마우스는 특이적 병원균이 없는 상태로 유지했다. 모든 동물실험은 동경 의과치과대학의 동물실험위원회에 승인되어, 관련 가이드라인 및 법률에 합치하고 있다. 골 표현형은 각각의 유전자 개변마우스와 그 동배마우스를 컨트롤로 하여 자웅 각각 8마리 이상을 해석했다. 삼차원 마이크로 CT(μCT) 분석 및 조직 형태계측적분석은 문헌에 기재된 방법에 따라서 수행하였다(K. Nishikawa et al., J Clin Invest 120, 3455 (Oct 1,2010), T. Koga et al., Nature 428, 758 (Apr 15, 2004)).

[골수 키메라 마우스]

골수 키메라 마우스의 제작은 문헌(B. Zhao et al., Nat Med 15, 1066 (Sep, 2009))에 기재된 방법을 일부 변경하여 수행했다. 즉, 야생형 Sema4d-/-동배자 마우스의 도너 골수세포(C57BL6-Ly5.2백그라운드)를 채취하여, 각 도너로부터 얻어진 2×10⁶ 세포를 치사적인 방사선에 노출시킨 야생형 수취인 마우스(3주 나이, C57BL/6-Ly5.1백그라운드) 또는 Sema4d-/-마우스의 꼬리정맥으로 정맥내 투여했다. 골수이식의 8주후, 높은 레벨의 도너형 키메리즘(chimerism)(> 95%)이 달성되었다.

[유전차칩(GeneChip) 해석]

유전자칩 해석은 문헌(K. Nishikawa et al., J Clin Invest 120, 3455 (Oct 1,2010))에 기재된 방법에 따라서 수행했다. 즉, 전체 RNA를 이용한 역전사에 의한 cDNA 합성을 한 후, 시험관내에서 전사시킴으로써 비오틴화 표지한 cRNA를 합성했다. cRNA를 단편화한 후, 마우스 A430 유전자칩(Affymetrix사 제조)을 이용한 하이브리다이제이션을 문헌(T. Koga et al., Nat Med 11, 880 (Aug, 2005), H. Takayanagi et al., Dev Cell 3, 889 (Dec, 2002)의 기재에 따라서 수행했다.

[시험관내에서의 골아세포에의 분화유도]

시험관내에서의 골아세포 및 파골세포에의 분화유도는 문헌(T. Koga et al., Nat Med 11, 880 (Aug, 2005), H. Takayanagi et al., Dev Cell 3, 889 (Dec, 2002))에 기재된 방법에 따라서 수행했다. 즉, 두개관 유래의 세포를 골형성 배지(50 μM의 아스코르빈산, 10 nM의 덱사메타손, 및 10 mM의 β-글리세로린산염) 속에서 배양을 하는 것에 의해 분화 유도를 하고, 분화 유도의 확인은 알칼리성 포스파타제(ALP) 분석(7일 후) 및 골결절형성 해석(21일 후, 알리자린레드염색)에 의해 수행했다. Fc-sema4D, 항-Sema4d 항체 및 항플렉신 B1 항체(항-Plexin-B1 항체)는 3일마다 첨가했다. 파골세포 상청은 핵내인자 κB 활성화 수용체 리간드(RANKL; Peprotech사 제조) 자극 후에 야생형 및 Sema4d-/-세포의 각 배양액으로부터 회수했다. 배양 파골세포를 콜라겐코트 디쉬(IWAKI사 제조)로 배양하여 랭클(RANKL) 자극의 2일 후에 트립신 처리에 의해 회수했다. 파골세포 상청은 상기 시약을 포함하는 골형성 배지로서 사용되어, 3일 마다 배양 파골세포(1× 10⁵세포/웰, 24웰 플레이트)에 첨가했다.

[정량적 리얼 타임 RT-PCR 해석]

정량적 리얼 타임 RT-PCR은, Light Cycler(Roche사 제조) 장치와 SYBRGreen(TOYOBO사 제조)를 이용하여 제품 프로토콜에 따라서 수행했다. 이하의 프라이머를 사용했다.

Plxnb1센스: 5’-tgggtcatgtgcagtacgat-3’(서열번호 5),

Plxnb1안티센스: 5’-cactgctctccaggttctcc-3’(서열번호 6),

Plxnb2센스: 5’-aggggagcctctctacaagc-3’(서열번호 7),

Plxnb2안티센스: 5’-tcgatcccttcatcctgaac-3’(서열번호 8),

Plxnb3센스: 5’-atatgctgagcgtgccttct-3’(서열번호 9),

Plxnb3안티센스: 5’-tgctgttgagcaaattggag-3’(서열번호 10),

CD72센스: 5’-gccttctcctgtcctgtctg-3’(서열번호 11),

CD72안티센스: 5’-cctcctggaactgctgagac-3’(서열번호 12),

Alpl 센스: 5’-aacccagacacaagcattcc-3’(서열번호 13),

Alpl 안티센스: 5’-gcctttgaggtttttggtca-3’(서열번호 14),

Bglap 센스: 5’-gcgctctgtctctctgacct-3’(서열번호 15),

Bglap 안티센스: 5’-accttattgccctcctgctt-3’(서열번호 16),

Col1a1센스: 5’-gagcggagagtactggatcg-3’(서열번호 17),

Col1a1안티센스: 5’-gttcgggctgatgtaccagt-3’(서열번호 18),

Gapdh 센스: 5’-acccagaagactgtggatgg-3’(서열번호 19),

Gapdh 안티센스: 5’-cacattgggggtaggaacac-3’(서열번호 20).

mRNA 발현의 레벨은, Gapdh 발현의 레벨에 의해 표준화했다.

[아데노바이러스 및 레트로바이러스 유전자 도입]

RhoA(Myc-V14Rho) 및 Rac1(hRac1 V12)의 구성적 활성형(CA)으로, RhoA(Myc-N19Rho) 및 Rac1(hRac1 V12)의 우성네가티브형(DN)을 지니는 아데노바이러스 벡터의 제작방법 및 이들의 도입방법은 문헌(Bito, H. et al. A critical role for a Rho-associated Kinase, p160 ROCK, in determining axonoutgrowth in mammalian CNS neurons. Neuron 26, 431-441 (2000))에 기재된 방법에 따라서 수행했다. 녹색 형광단백질(EGFP)로 동시에 3종류의 플렉신 B1(야생형[플렉신-B1], R-Ras의 GTP아제(GTPase) 활성화를 야기하지 않는 돌연변이체[플렉신-B1 RA] 및 RhoA를 활성화할 수 없는 돌연변이체[플렉신-B1 DPDZ-EGFP])가 발현되는 레트로바이러스 벡터(pMXs-플렉신-B1-EGFP, pMXs-플렉신-B1 RA-EGFP 및 pMXs-플렉신-B1 DPDZ-EGFP)의 제작은, pMXs-IRES-EGFP로 각각 플렉신-B1, 플렉신-B1 RA(I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305, 862 (Aug6, 2004)) 및 플렉신-B1 DPDZ(V. Perrot, J. Vazquez-Prado, J. S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002))의 cDNA 단편을 삽입함으로써 수행했다. 재조합 레트로바이러스의 제작은 문헌(S. Morita, T. Kojima, T. Kitamura, Gene Ther 7, 1063 (Jun, 2000))에 기재된 방법에 따라서 수행했다. 즉, 제작한 레트로바이러스 벡터를 Plat-E 세포에 도입함으로써 레트로바이러스의 패키징을 수행했다.

[OVX 유도 골량 감소에 대한 항-Sema4D 항체 처리]

OVX(난소적출)에 의해서 유도된 골다공증 모델 마우스의 제작은 문헌(M.Shinohara et al., J Biol Chem 282, 17640 (Jun 15, 2007))에 기재된 방법에 따라서 수행했다. 즉, 7주 나이의 암컷 마우스에게 난소 적출 또는 공수술을 했다. 이것들의 모델 마우스로서는 각 그룹 6마리를 넘는 마우스를 검사했다. 골량 감소에 대하여 예방 효과가 있는지 여부를 조사하기 위해서, 이하에 나타낸 방법을 따라서 검증했다. 즉, OVX 마우스에게 방법 후 3일부터 8주까지, 일주일에 한번 미정맥으로부터 20 μg의 항-Sema4D 항체(MBL사 제조) 또는 생리식염수를 정맥주입했다. 방법 후 8주 후에 모든 마우스를 희생하여 μCT 분석 및 골형태형성 해석을 했다. 또한, 감소한 골량에 대하여 촉진 효과가 있는지 여부를 조사하기 위해서 이하에 나타낸 방법에 따라서 검증했다. 즉, OVX의 6주 후, OVX 마우스에게 3일 마다 3주간 미정맥으로부터 20 μg의 항-Sema4D 항체(MBL사 제조) 또는 생리식염수를 정맥주입했다. 방법 후 9주 후에 모든 마우스를 희생하여 μCT 분석에 제공하였다.

[면역 블롯 해석, 풀다운 해석 및 면역형광 염색]

두개관 세포를 골형성 배지(50 μM의 아스코르빈산, 10 nM의 덱사메타손, 및 10 mM의β-글리세로린산염)로 2일간 배양하여, 그 후 Fc-Sema4D에서 자극했다. 정제한 인간 IgG(Fc 부분)(BECKMAN COULTER사 제조)를 풀다운 해석의 네가티브 컨트롤에 사용하였다(time 0). 표시된 시점에서 세포를 채취하고, 항-플렉신-B1 항체(clone A-8, Santa Cruz사 제조), 항-PDZ-RhoGEF 항체(폴리클로날, ProteinExpress사 제조), 항-LARG 항체(폴리클로날, LIFESPAN CIOSCIENCES사 제조), 항포스포(phospho)-Akt 항체(Thr308)(폴리클로날, Cell Signaling사 제조), 항-Akt 항체(폴리클로날, Cell Signaling사 제조), 항포스포르(phosphor)-ERK 항체(Thr202/Tyr204)(폴리클로날, Cell Signaling사 제조), 항-ERK 항체(폴리클로날, Cell Signaling사 제조), 항-Met 항체(clone 25H2)(Cell Signaling사 제조),항-ErbB2 항체(clone 29D8)(Cell Signaling사 제조), 항-Rac1 항체(clone 102/Rac1)(BD Transduction laboratories사 제조), 항-RhoA 항체(clone55/Rho)(BD Transduction laboratories사 제조), 항카드헤린(cadherin)-11 항체(폴리클로날, Invitrogen사 제조), 항-IRS1 항체(clone 58-10C-31)(MILLIPORE사 제조), 및 항-b-액틴(actin) 항체(clone AC40)(Sigma-Aldrich사 제조)를 이용한 면역 블롯 해석 또는 풀다운 해석을 했다. 플렉신 B1, Met, ErbB2 및 IRS1의 인산화는 각각에 대한 특이적 항체를 이용한 면역 침강 후에 항포스포티로신 항체(4G10, Upstate사 제조)에 의해서 검출되었다. 세마포린 4D에 결합한 플렉신 B1을 검출하기 위해서, 세포 용해물은 프로테인 A-아가로스비드에 결합한 Fc-sema4D(500 ng)으로 배양하여, 항-플렉신-B1 항체를 이용하여 면역 블롯 해석을 했다. GTP아제의 활성화의 검출은 문헌(M. Shinohara et al., J Biol Chem 282, 17640(Jun 15, 2007))의 기재대로 수행했다. 즉, 두개관 세포를 Fc-sema4D로 처리하여 표시된 시점에서 채취했다. 세포 용해물을 글루타치온 세파로즈(glutathione sepharose)에 결합한 GST-RBD(RhoA 용) 또는 GST-PAK1(Rac1용)(2 μg)으로 배양하여, 각각 항-RhoA 항체 또는 항-Rac1 항체를 이용한 면역 블롯 해석을 했다. 면역형광염색용에, 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정한 후, 투과 처리하여, 그 후 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 표지 이차 항체 및 로다민 컨쥬게이트 팔로이딘(rhodamine conjugate phalloidin)(Molecular Probes사 제조)로 염색했다.

[유동 세포 계수법]

골수 유래 세포 및 두개관 세포를 해석하기 위해서, 골수 및 두개관으로부터 조제된 단일 세포 부유액을, 8종류의 형광색소가 컨쥬게이트된(conjugated) 모노클로날 항체[PerCP.Cy5.5가 컨쥬게이트된 항-CD45.2 항체, FITC가 컨쥬게이트된 항-CD45.2 항체(clone 104), eFluor450가 컨쥬게이트된 항-CD11b 항체(clone M1/70), PE가 컨쥬게이트된 항-CD105 항체(clone MJ7/18), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647이 컨쥬게이트된 항-CD106 항체(clone 4.29E+02), APC-알렉사 플루오르 750가 컨쥬게이트된 항-CD44 항체, AC-Cy7가 컨쥬게이트된 항-CD44 항체(clone IM7), 및 APC가 컨쥬게이트된 항-Sca-1 항체(clone D7)(eBioscience사 제조)]로 염색했다. 그 후, 디바 소프트웨어(Diva software)(BD Biosciences사 제조)로 FACSCant II를 이용하여 유동 세포 계수법 해석을 했다.

[세포증식 해석]

골수 유래 간질세포를 골형성 조건 배지로 배양하여, 골아세포 분화 전(Day 0) 또는 세마포린 4D 자극에 의한 골아세포 분화 과정(Day 14)에 있어서의 세포증식율을, 인간 IgG의 Fc 부분 또는 Fc-Sema4D의 존재하에 세포증식 효소면역분석(ELISA) 키트(Roche사 제조)를 이용하고 해석하여, 5-브로모-2’디옥시우리딘(5-bromo-2' deoxyuridine)(BrdU)의 혼입을 검출했다.

[콜로니 형성 유닛(CFU) 해석]

골수세포를, 24웰 플레이트에 1웰당 3×10⁶ 세포를 플레이팅한 후, 10% 우태혈청 함유 α-MEM에서 3일간 배양하여, 그 후 골형성 조건 배지로 바꾸었다. 콜로니 형성 유닛-알칼리 포스파타제(CFU-ALP)가, 7일째(day 7)에 ALP 양성 콜로니로서 검출되어, CFU-골아세포(CFU-Ob)가 21일째(day 21)에 알리자린 레드 양성 콜로니로서 검출되었다. 콜로니의 총수(CFU-섬유아세포(CFU-F))를 7일째 및 21일째에 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색으로 검출했다.

[통계적 분석]

모든 데이터는, 평균±SEM(n= 5)으로 나타나 있다. 통계적 분석은, 스튜던트 테스트 아노바(Student's t test ANOVA)와, 가능한 경우에는 본페로니 시험(Bonferroni test)을 이용하여 수행하였다(* p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005; n.s.,유의가 아님). 결과는, 4회 이상의 별개의 실험의 대표예이다.

[결과]

축삭 가이던스 분자인 세마포린, 에프린, 슬릿 및 네트린이 골의 리모델링에 관여하고 있는지 여부를 조사하기 위해서, 파골세포 및 골아세포에 있어서의 mRNA의 게놈 와이드(wide)인 스크리닝을 유전자칩 해석에 의해 수행했다. 즉, 20종류의 세마포린, 16종류의 에프린, 6종류의 슬릿 및 6종류의 네트린에 관해서 해석한 결과, 파골세포에 있어서 매우 높은 세마포린 4D의 발현이 인정을 받았다. 한편, 골아세포에서는 이러한 발현은 인정을 받을 수 없었다. 이것들의 결과는 파골세포 형성 과정에 있어서 세마포린 4D가 선택적으로 발현 유도되는 것을 보이고 있다.

파골세포 형성 과정에 있어서 선택적으로 발현유도되는 세마포린 4D의 기능을 조사하기 위해서 Sema4d-/-마우스를 이용한 골격계의 기능 해석을 했다. μCT 및 골형태형성 해석에 의해, Sema4d-/-마우스에 있어서의 골량(도 1) 및 골해면질 두께(도 2)는 야생형 마우스(WT 마우스)에 비교하여 현저히 증가하고 있는 것이 나타났다. 또한, Sema4d-/-마우스의 골아세포 표면적(도 3, 좌측), 석회화한 골 표면적(도 3, 중앙) 및 골 형성율(도 3, 우측)은, 야생형 마우스와 비교하여 각각 현저히 상승했지만, 파골세포의 골흡수를 나타내는 파라미터(파골세포 표면적(도 4, 좌측), 파골세포 수(도 4, 중앙) 및 침식된 골 표면적(도 4, 우측))에 변화는 없었다. 또한, Sema4d-/-세포에 있어서의 시험관내의 파골세포 형성도, 정상적으로 관찰되었다. 이것의 결과는 세마포린 4D는 파골세포 특이적으로 발현하고 있음에도 불구하고 Sema4d-/-마우스에 있어서의 고(高)골량의 표현형은 골아세포에 의한 골형성의 증가에 의한 것을 시사하고 있다.

Sema4d-/-마우스의 골 표현형이, 골수세포 계열의 이상에 기초를 둔 것인지 아닌지를 조사하기 위해서, 파골전구세포를 포함하는 골수세포를 이용하여 적응 면역 세포 이식을 했다. 그 결과, 야생형 마우스에게 Sema4d 결손 골수세포를 이식한 경우, 야생형 골수세포를 이식한 경우와 비교하여 골량은 증가하고 있었다(도 5의 좌측 2개의 그래프). 한편, Sema4d-/-마우스에게 야생형 골수세포를 이식한 경우, Sema4d 결손 골수세포를 이식한 경우와 비교하여 골량은 감소하여 정상적으로 되돌아가고 있었다(도 5의 우측 2개의 그래프). 이 결과로부터 Sema4d-/-마우스에 있어서의 골 표현형은, 파골세포를 포함하는 조혈계 세포에 있어서의 이상이 원인 인 것이 나타났다. 또한, Sema4d-/-두개관 세포의 골결절 형성에 있어서 Sema4d-/-두개관 세포의 골결절이 분명한 증가는 인정을 받을 수 없었다. 이것들의 결과는 파골세포에 있어서 발현되는 세마포린 4D는 골아세포에 의한 골형성을 저해하는 골의 리모델링 인자로서 기능하는 것을 시사하고 있다.

골아세포에 대한 세마포린 4D의 저해 효과를 상세히 조사하기 위해서, Fc-sema4D(I. Ishida et al., Int Immunol 15, 1027 (Aug, 2003))을 제작한 후, 이러한 Fc-sema4D를 골형성 조건하에서 배양한 두개관 세포에 첨가했다. Fc-sema4D의 첨가는 골결절 형성(도 6) 및 골아세포 마커 유전자(ALP의 활성화, 오스테오칼신[Bglap] 및 콜라겐 I형[Col1a1])의 발현을 농도 의존적으로 억제했다. 이것들의 결과는 Sema4D가 골아세포의 분화유도를 저해한 결과, 골결절 형성이 저해된 것을 보이고 있다. 또한, 파골세포 유래의 세마포린 4D가 골형성의 조절에 관여하고 있는지 여부를 조사하기 위해서, 파골세포의 배양상청 또는 파골세포의 존재하에 두개관 세포를 배양했다. 야생형의 파골세포의 배양상청 또는 파골세포와의 공동배양에서는 골결절 형성에 영향은 없는 것에 대하여, Sema4d-/-파골세포의 배양상청 또는 Sema4d-/-파골세포와의 공동배양에서는 골결절 형성이 현저히 촉진되었다. 이들 결과로부터 파골세포는 적어도 부분적으로 가용성으로서 생산되는 세마포린 4D를 통해 골형성을 억제하는 것을 보이고 있다. 또한, 파골세포의 상청에는 골형성을 촉진하는 1개 또는 복수의 인자가 포함되어 있는 것도 주목하여야 할 점이다. 이러한 인자에 의한 골형성 촉진 효과는 세마포린 4D가 존재하지 않는 경우에 발휘된다고 생각된다.

골아세포가 발현되는 세마포린 4D 수용체를 특정하기 위해서, 비 림프세포 및 림프세포에 있어서의 세마포린 4D 수용체로서 알려져 있는(K. Suzuki, A. Kumanogoh, H. Kikutani, Nat Immunol 9, 17 (Jan, 2008)) 플렉신 B형 및 CD72의 mRNA의 발현을 정량적 리얼 타임 RT-PCR에 의해 해석했다. 그 결과, 플렉신 B1 발현량은 골아세포 분화중에 현저히 증가하고 있었다(도 7). 한편, 플렉신 B2의 발현량은 다소 낮게, 또한 플렉신 B3 및 CD72의 발현은 거의 검출되지 않았다(도 7). 또한, Fc-sema4D를 이용한 풀다운 해석을 한 결과, 세마포린 4D가 플렉신 B1과 상호작용하는 것이 나타났다(도 8). 또한, Fc-sema4D는, 플렉신 B1의 인산화를 유도하는 것도 나타났다. 세마포린 4D는, 플렉신 B1과 결합할 때에 티로신 키나제 ErbB2와 복합체를 형성하여, ErbB2가 세마포린 4D 의존적으로 자신과 플렉신 B1을 인산화하는 것이 알려져 있다. 골아세포에 있어서, ErbB2의 키나제 활성을 저해한 결과, 플렉신 B1의 세마포린 4D 자극 의존적인 인산화가 감소했다. 이것들의 결과로부터 플렉신 B1이 골아세포에 있어서 세마포린 4D의 주요 수용체로서 작용하는 것이 시사되었다. 그래서, Plxnb1-/-마우스의 골 표현형을 해석했다. Sema4d-/-마우스와 같이 Plxnb1-/-마우스의 골량(도 9) 및 골해면질 두께(도 10)는 야생형 마우스와 비교하여 골아세포 골형성의 상승에 의해 현저히 증가했다. 또한, Plxnb1-/-마우스의 골아세포 표면적(도 11), 석회화한 골 표면적(도 12) 및 골 형성율(도 13)도, 야생형마우스와 비교하여 각각 현저히 상승했지만, 파골세포의 골흡수를 나타내는 파라미터(파골세포 표면적, 파골세포 수 및 침식된 골 표면적)에 변화는 없었다. 이것들의 결과로부터, Plxnb1-/-마우스에 있어서의 고(高)골량의 표현형은 Sema4d-/-마우스의 고골량의 표현형과 같이, 골아세포에 의한 골형성의 증가에 의한 것이 시사되었다. Sema4d-/-파골세포로 인정을 받은, 야생형 골아세포에 의한 골결절 형성에의 자극 효과는 Plxnb1-/-세포로서는 인정을 받을 수 없었다. 이 결과는, 플렉신 B1은 주로 세마포린 4D를 통해 골아세포를 인식하고 있는 것을 시사하고 있다.

세마포린 4D-플렉신 B1은 어떻게 하여, 골아세포에 있어서 저해 시그널로 변환하는 것인가. 세마포린-프리 키신시스템은, 주로 Rho 패밀리 저분자 GTP아제를 통해 액틴 세포골격의 재편성을 조절함으로써 세포 형태 형성 및 세포 이주를 조절하는 것이 알려져 있다. 또한, 세마포린 4D가 플렉신 B2에 결합하면 티로신 키나제 ErbB2의 존재하에 RhoA 활성이 자극되는데 대하여, 세마포린 4D는 다른 티로신 키나제 Met의 존재하에서는 반대의 작용을 발휘하는 것이 알려져 있다(J. M. Swiercz, T. Worzfeld, S. Offermanns, J Biol Chem 283, 1893 (Jan 25, 2008)). 그래서, 세마포린 4D가 RhoA를 활성화할 가능성에 관해서 조사했다. 골아세포에 있어서의 ErbB2와 Met의 발현량을 해석한 바, ErbB2는 Met과 비교하여 상당히 많이 발현하고 있는 것이 나타났다. 또한, 세마포린 4D 자극은 ErbB2의 인산화를 유도했지만, Met의 인산화는 유도하지 않았다. 또한, 면역 블롯 해석 및 풀다운 해석으로부터, 세마포린 4D는 RhoA의 GTP 결합 활성형을 증가시켜, 이 활성은 특히 Plxnb1-/-세포로 억제되는 것이 나타났다. 한편, 별도의 Rho 패밀리인 Rac1의 활성은 세마포린 4D 자극에 영향받지 않았다. 이 결과와 일치하여, 아데노바이러스를 이용하여 구성적 활성형 RhoA를 도입한 경우, 두개관 세포에 있어서의 골결절 형성은 억제된데 대하여, 우성네가티브 RhoA를 도입한 경우, 골결절 형성은 촉진되었다. 한편, 구성적 활성형 Rac1이나 우성네가티브 Rac1는 골형성에 영향을 부여하지 않았다. 이것들의 결과로부터, RhoA가 세마포린 4D-플렉신 B1의 골형성에의 저해 효과를 선택적으로 중개하는 것이 시사되었다. 플렉신 B1은 2개의 RhoGTP 아제 조절도메인, 즉, GTP아제 활성화 단백질(GAP) 도메인 및 Rho-GEF에 결합하는 PDZ-결합 도메인을 갖는다(I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305,862 (Aug 6, 2004), J. M. Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35, 51 (Jul 3, 2002), V. Perrot, J. Vazquez-Prado, J. S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002), M. H. Driessens, C. Olivo, K. Nagata, M. Inagaki, J. G. Collard, FEBS Lett 529, 168 (Oct 9, 2002)). 실제로, 풀다운 해석 및 면역 블롯 해석으로부터, Rho-GEF로서 알려져 있는 PDZ-RhoGEF나 LARG(leukemia associated RhoGEF)는, 골아세포에 있어서도 플렉신 B1과 결합하는 것이 나타났다. 그래서, 상기 GAP 도메인 및 PDZ-결합 도메인이 골형성의 억제에 중요한가를 판단하기 위해서, 두 종류의 플렉신 B1의 돌연변이체(플렉신 B1-ΔPDZ 및 플렉신 B1-RA)(I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305, 862 (Aug 6, 2004))를 제작하였다(도 14). 이러한 두 종류의 플렉신 B1의 돌연변이체와 컨트롤인 야생형 플렉신 B1(WT-플렉신-B1)이 각각 과잉 발현한 Plxnb1-/-두개관 세포를 제작한 후, Fc-sema4D에 의해서 자극하여 골아세포 분화의 저해 효과를 평가했다. Plxnb1-/-세포에 있어서, 골아세포 마커(Alpl, Bglap 및 Col1a1)의 mRNA 발현으로 표시되는 Fc-Sema4d의 저해 효과는 WT-플렉신 B1 및 플렉신 B1-RA의 과잉 발현에 의해 회복했지만, 플렉신 B1-ΔPDZ의 과잉 발현으로서는 회복하지 않았다. 이것들의 결과는 RhoA가 세마포린 4D에 의한 골형성의 저해를 특이적으로 매개하는 것을 시사한다.

골아세포에 있어서의 RhoA의 생체내에서의 역할을 조사하기 위해서, CAT-RhoA DN 트랜스제닉 마우스(K. Kobayashi et al., J Neurosci 24, 3480 (Apr 7, 2004))로 콜라겐α1(I)-Cre 트랜스제닉 마우스(R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke, G. Karsenty, Dev Dyn 224, 245 (Jun, 2002))를 교배하여, 골아세포로 우성네가티브 RhoA가 특이적으로 발현되는(RhoA DN^OB) 마우스를 제작했다. 골아세포에 의한 골형성이 촉진한 것에 의해, RhoA DN^OB 마우스의 골량(도 15) 및 골해면질 두께(도 16)는, 야생형 마우스와 비교하여 증가했다. 또한, RhoA DN^OB 마우스의 골아세포 표면적(도 17), 석회화한 골 표면적(도 18) 및 골 형성율(도 19)은 야생형마우스와 비교하여 현저히 상승했지만, 파골세포의 골흡수를 나타내는 파라미터(파골세포 표면적, 파골세포 수 및 침식된 골 표면적)에 변화는 없었다. 이러한 골 표현형은 Sema4d-/- 및 Plxnb1-/-마우스의 골 표현형과 동일양상이었다. RhoA DN^OB의 발현이 골아세포 분화중에 증가함에 따라서, 골결절 형성 및 골아세포 마커 유전자(Alpl, Bglap 및 Col1a1)의 발현은 RhoA DN^OB 마우스 유래의 두개관 세포로 현저히 상승했다. 또한, RhoA DN^OB 세포에 있어서 증가한 골결절 형성은, Fc-sema4d에 의해서 억제되어 없는 것으로부터, RhoA가 세마포린 4D-플렉신 B1의 하류에서 저해 시그널을 매개하고 있는 것을 시사하고 있다.

Sema4d의 기능 저해가 골다공증에 있어서 유효한지 여부를 조사하기 위해서, OVX(난소적출) 처리하여 폐경 후 골다공증의 모델 마우스를 이용하여 검증했다. 즉, OVX 처리 후의 마우스에게 항-Sema4d 항체를 매주 정맥내 투여하여, 골량의 감소에 대하여 예방 효과가 있는지 여부를 조사했다. 골조직을 해석한 결과, 항-Sema4d 항체를 투여하지 않는 경우, 골량이 감소하는데 대하여, 항-Sema4d 항체를 투여함으로써, 골형성의 촉진(골아세포 표면적(도 20), 골량의 증가(도 21) 및 골 형성율(도 22)의 증가, 및 골 해면질 간격의 감소(도 23))이 인정을 받았다. 한편, 파골세포의 골흡수를 나타내는 파라미터(파골세포 수 및 침식된 골 표면적)에 변화는 없었다. 이것들의 결과로부터, 항-Sema4d 항체 처리에 의해 세마포린 4D의 기능을 저해시키면, 골다공증에 있어서의 골량 저하를 예방하는 효과가 있는 것이 나타났다. 또한, 세마포린 4D의 기능 저해가 이미 감소한 골량의 치료에 대하여도 효과가 있는지 여부를 조사했다. 즉, OVX 처리 후, 골량이 감소한 6주간 후에 항-Sema4d 항체를 주에 3일 3주간, 꼬리정맥으로 투여했다. 골형성을 나타내는 파라미터(골아세포 표면적, 골량의 증가 및 골 형성율의 증가, 및 골 해면질 간격의 감소)를 해석한 결과, 골형성의 촉진(골아세포 표면적(도 26), 골량의 증가(도 27) 및 골 형성율(도 28)의 증가, 및 골 해면질 간격의 감소(도 29))이 인정을 받았다. 따라서, 한번 감소한 골은, 상기 OVX 처리 후, 매주 항-Sema4d 항체를 투여한 경우와 동일 레벨까지 회복하고 있는 것이 분명하여졌다. 즉 골량 저하를 예방한 경우와 같은 정도의 회복을 인정했다. 한편, 파골세포의 골흡수를 나타내는 파라미터(침식된 골 표면적)에 변화는 없었다. 또한, 세마포린 4D와 플렉신 B1의 기능 저해가 골결절 형성에 부여하는 영향을 조사했다. 마우스 골아세포와 WT 마우스의 파골세포를 이용한 경우는, 항-Sema4D 항체의 농도 의존적으로 골결절 형성이 촉진되었다(도 24의 위 패널의 좌측으로부터 1번째로부터 3번째까지의 플레이트). 한편, Fc-sema4d에 의해서 억제된 골결절 형성은 항플렉신 B1 항체의 농도의존적으로 촉진되었다(도 24의 아래 패널). 이것들의 결과로부터, 항-Sema4d 항체 처리 또는 항플렉신 B1 항체 처리에 의해, 세마포린 4D-플렉신 B1 상호작용을 저해시키면, 골다공증에 있어서의 골량저하를 억제할 뿐 아니고, 골량증가를 재촉하는 효과가 있는 것이 나타났다. 또한, 인간 골아세포에 있어서의 세마포린 4D의 기능 저해가 골결절 형성에 부여하는 영향을 조사했다. 즉, 인간 말초혈단구 유래의 CD14 양성세포로부터 분화된 파골세포(도 25, 하단)나 그 배양상청(도 25, 상단)을 이용하여 검증한 바, 관련된 파골세포나 그 배양상청에 더하여 항-Sema4d 항체를 골아세포에 첨가하면, 항-Sema4d 항체의 농도의존적으로 골결절 형성이 촉진되었다(도 25). 이 결과는, 상기 폐경 후 골다공증의 모델 마우스에 있어서의 결과를 인간 세포에 있어서도 지지함과 함께, 세마포린 4D-플렉신 B1 상호작용을 저해하는 것이, 골형성을 증가하기 위한 새로운 전략이 되는 것을 보이고 있다.

세마포린 4D의 골아세포 분화 저해의 작용점에 관해서 상세히 해석했다. 즉, 유동 세포 계수법 해석에 의해, Sema4d-/-마우스에 있어서의 골수중 조혈줄기세포(Sca-1+CD105+CD106+CD44+CD45.2-CD11b) 수를 야생형 마우스와 비교한 바, 다름은 없었다. 또한, 세포증식 해석을 한 바, 골수 중앙 골아전구세포 수는 골아세포 분화 이전에는 Sema4d에 의해서 약간 증가하지만(Day 0), 골아세포 분화 과정에서는, 세마포린 4D 자극에 의해서 변화하지 않는다(Day 14). 또, CFU 해석으로부터, 세마포린 4D 자극에 의해서 ALP 발현이나 알리자린에서 표시되고 누골 형성은 억제되어 있다. 이것들의 결과는 세마포린 4D가 골아세포 분화 단계에 작용하고 있는 것을 시사하고 있다.

인슐린유사성장인자(Insulin-like growth factors)(IGF)-1에 의한 인슐린 수용체 기질(IRS) 시그널은 골아세포 분화를 촉진하는 것이 알려져 있다. 그래서, 세마포린 4D 자극으로 IRS 시그널에 관한 Akt 및 ERK의 인산화를 조사한 바, 이러한 인산화 레벨은 내려져 있었다. 또한, IRS의 활성화 지표가 되는 Tyr 인산화도 저하하고 있어, 이것들의 결과는, 세마포린 4D 자극은 IRS 시그널을 저하시키는 것을 시사하고 있다. 또한 활성화형 RhoA는, Akt 및 ERK의 인산화를 저하시켜, 반대로 RhoA 저해제인 Y-27632 및 RKI는 이것들의 인산화를 항진시키는 것이 분명하여졌다. 또한, 이러한 RhoA 저해제는 IRS 시그널에 있어서의 활성화형 인산화의 항진를 유도하는 것도 분명하여졌다. 이것들의 결과로부터, 세마포린 4D는 RhoA를 활성화함으로써, IRS 시그널의 저하를 유도하여, 골아세포 분화를 억제하는 것이 시사되었다.

[요약]

이상의 실험에 의해, 파골세포 유래의 세마포린 4D를, 골 재구축에 있어서 파골세포-골아세포 사이의 전달에 중요한 매개자로 확인했다. 골 재구축은, 3가지의 단계(파골세포에 의한 골흡수의 개시, 골아세포에 의한 새로운 골형성에의 이행, 및 새로운 골의 합성의 종료(K. Matsuo, N. Irie, Arch Biochem Biophys 473, 201 (May 15, 2008))로 이루어지는 사이클로 행해진다. 파골세포에 있어서 발현된 Sema4d는, 파골세포 흡수가 완료할 때까지, 골아세포의 분화가 억제되는 초기단계에서의 골형성의 저해인자로서 기능할 수 있다. 또한, RhoA의 활성화가 생체내로 골아세포 골형성을 저해하는 것도 도시했다. 이행단계에 관여하는 것이 표시되고 있는 에프린 B2/EphB4는, 골형성을 조절하기 위해서 RhoA도 이용하고(C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (Aug, 2006)), Rho 패밀리 저분자 GTP아제가, 골 재구축 시그널 전달의 조정자로서 작용하는 것을 시사하고 있다. 유전자칩 해석에 의해, PDZ 함유 RhoA 특이적 GEFArfgef12(LARG)(J. M. Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35, 51 (Jul 3, 2002), V. Perrot, J. Vazquez-Prado, J. S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (Nov 8, 2002))가, 골아세포로 고발현하는 것도 나타났다. 이 결과는 세마포린 4D-플렉신 B1-RhoA 경로의 중요성을 뒷받침하고 있다. 또한, 면역 형광 염색에 의한 해석으로부터, Fc-sema4D 자극 후에 카드헤린11의 하향 조절(down regulation)이 관찰되어, 조절된 갭 결합 기능의 관여가 시사되었다. 간헐적인 부갑상선 호르몬(PTH) 처리는, 골형성을 증가시키는 것이 현재 증명되어 있는 유일한 유효한 방법이다. 개발중의 항-Sost 항체는 새로운 골형성제로서 주목받고 있는데 대하여, 세마포린 4D-플렉신 B1-RhoA 경로에 관여하는 인자를 타겟으로 하는 항체, 저해제 등은 골감소성 질환에의 새로운 치료제로서 기대할 수 있다.

산업상의 이용가능성

본 발명은, 골형성의 촉진이나, 골질환의 예방 및/또는 치료의 분야에 적합하게 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> National University Corporation Tokyo Medical and Dental University <120> Agent for promoting osteogenesis <130> P11-005P <150> 2011-108642 <151> 2011-05-13 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2217 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Inventor: Takayanagi, Hiroshi ;Negishi, Takako <400> 1 atgaggatgt gcacccccat tagggggctg ctcatggccc ttgcagtgat gtttgggaca 60 gcgatggcat ttgcacccat accccggatc acctgggagc acagagaggt gcacctggtg 120 cagtttcatg agccagacat ctacaactac tcagccttgc tgctgagcga ggacaaggac 180 accttgtaca taggtgcccg ggaggcggtc ttcgctgtga acgcactcaa catctccgag 240 aagcagcatg aggtgtattg gaaggtctca gaagacaaaa aagcaaaatg tgcagaaaag 300 gggaaatcaa aacagacaga gtgcctcaac tacatccggg tgctgcagcc actcagcgcc 360 acttcccttt acgtgtgtgg gaccaacgca ttccagccgg cctgtgacca cctgaactta 420 acatccttta agtttctggg gaaaaatgaa gatggcaaag gaagatgtcc ctttgaccca 480 gcacacagct acacatccgt catggttgat ggagaacttt attcggggac gtcgtataat 540 tttttgggaa gtgaacccat catctcccga 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Val Val Val Gly Asp Gln Pro 1190 1195 1200 Cys His Leu Leu Pro Glu Gln Gln Ser Glu Gln Leu Arg Cys Glu 1205 1210 1215 Thr Ser Pro Arg Pro Thr Pro Ala Thr Leu Pro Val Ala Val Trp 1220 1225 1230 Phe Gly Ala Thr Glu Arg Arg Leu Gln Arg Gly Gln Phe Lys Tyr 1235 1240 1245 Thr Leu Asp Pro Asn Ile Thr Ser Ala Gly Pro Thr Lys Ser Phe 1250 1255 1260 Leu Ser Gly Gly Arg Glu Ile Cys Val Arg Gly Gln Asn Leu Asp 1265 1270 1275 Val Val Gln Thr Pro Arg Ile Arg Val Thr Val Val Ser Arg Met 1280 1285 1290 Leu Gln Pro Ser Gln Gly Leu Gly Arg Arg Arg Arg Val Val Pro 1295 1300 1305 Glu Thr Ala Cys Ser Leu Gly Pro Ser Cys Ser Ser Gln Gln Phe 1310 1315 1320 Glu Glu Pro Cys His Val Asn Ser Ser Gln Leu Ile Thr Cys Arg 1325 1330 1335 Thr Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Glu Asp Pro Trp Val Arg Val 1340 1345 1350 Glu Phe Ile Leu Asp Asn Leu Val Phe Asp Phe Ala Thr Leu Asn 1355 1360 1365 Pro Thr Pro Phe Ser Tyr Glu Ala Asp Pro Thr Leu Gln Pro Leu 1370 1375 1380 Asn Pro Glu Asp Pro Thr Met Pro Phe Arg His Lys Pro Gly Ser 1385 1390 1395 Val Phe Ser Val Glu Gly Glu Asn Leu Asp Leu Ala Met Ser Lys 1400 1405 1410 Glu Glu Val Val Ala Met Ile Gly Asp Gly Pro Cys Val Val Lys 1415 1420 1425 Thr Leu Thr Arg His His Leu Tyr Cys Glu Pro Pro Val Glu Gln 1430 1435 1440 Pro Leu Pro Arg His His Ala Leu Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu 1445 1450 1455 Pro Glu Phe Thr Val Gln Met Gly Asn Leu Arg Phe Ser Leu Gly 1460 1465 1470 His Val Gln Tyr Asp Gly Glu Ser Pro Gly Ala Phe Pro Val Ala 1475 1480 1485 Ala Gln Val Gly Leu Gly Val Gly Thr Ser Leu Leu Ala Leu Gly 1490 1495 1500 Val Ile Ile Ile Val Leu Met Tyr Arg Arg Lys Ser Lys Gln Ala 1505 1510 1515 Leu Arg Asp Tyr Lys Lys Val Gln Ile Gln Leu Glu Asn Leu Glu 1520 1525 1530 Ser Ser Val Arg Asp Arg Cys Lys Lys Glu Phe Thr Asp Leu Met 1535 1540 1545 Thr Glu Met Thr Asp Leu Thr Ser Asp Leu Leu Gly Ser Gly Ile 1550 1555 1560 Pro Phe Leu Asp Tyr Lys Val Tyr Ala Glu Arg Ile Phe Phe Pro 1565 1570 1575 Gly His Arg Glu Ser Pro Leu His Arg Asp Leu Gly Val Pro Glu 1580 1585 1590 Ser Arg Arg Pro Thr Val Glu Gln Gly Leu Gly Gln Leu Ser Asn 1595 1600 1605 Leu Leu Asn Ser Lys Leu Phe Leu Thr Lys Phe Ile His Thr Leu 1610 1615 1620 Glu Ser Gln Arg Thr Phe Ser Ala Arg Asp Arg Ala Tyr Val Ala 1625 1630 1635 Ser Leu Leu Thr Val Ala Leu His Gly Lys Leu Glu Tyr Phe Thr 1640 1645 1650 Asp Ile Leu Arg Thr Leu Leu Ser Asp Leu Val Ala Gln Tyr Val 1655 1660 1665 Ala Lys Asn Pro Lys Leu Met Leu Arg Arg Thr Glu Thr Val Val 1670 1675 1680 Glu Lys Leu Leu Thr Asn Trp Met Ser Ile Cys Leu Tyr Thr Phe 1685 1690 1695 Val Arg Asp Ser Val Gly Glu Pro Leu Tyr Met Leu Phe Arg Gly 1700 1705 1710 Ile Lys His Gln Val Asp Lys Gly Pro Val Asp Ser Val Thr Gly 1715 1720 1725 Lys Ala Lys Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Arg Leu Leu Arg Glu Asp 1730 1735 1740 Val Glu Tyr Arg Pro Leu Thr Leu Asn Ala Leu Leu Ala Val Gly 1745 1750 1755 Pro Gly Ala Gly Glu Ala Gln Gly Val Pro Val Lys Val Leu Asp 1760 1765 1770 Cys Asp Thr Ile Ser Gln Ala Lys Glu Lys Met Leu Asp Gln Leu 1775 1780 1785 Tyr Lys Gly Val Pro Leu Thr Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Leu 1790 1795 1800 Asp Val Glu Trp Arg Ser Gly Val Ala Gly His Leu Ile Leu Ser 1805 1810 1815 Asp Glu Asp Val Thr Ser Glu Val Gln Gly Leu Trp Arg Arg Leu 1820 1825 1830 Asn Thr Leu Gln His Tyr Lys Val Pro Asp Gly Ala Thr Val Ala 1835 1840 1845 Leu Val Pro Cys Leu Thr Lys His Val Leu Arg Glu Asn Gln Asp 1850 1855 1860 Tyr Val Pro Gly Glu Arg Thr Pro Met Leu Glu Asp Val Asp Glu 1865 1870 1875 Gly Gly Ile Arg Pro Trp His Leu Val Lys Pro Ser Asp Glu Pro 1880 1885 1890 Glu Pro Pro Arg Pro Arg Arg Gly Ser Leu Arg Gly Gly Glu Arg 1895 1900 1905 Glu Arg Ala Lys Ala Ile Pro Glu Ile Tyr Leu Thr Arg Leu Leu 1910 1915 1920 Ser Met Lys Gly Thr Leu Gln Lys Phe Val Asp Asp Leu Phe Gln 1925 1930 1935 Val Ile Leu Ser Thr Ser Arg Pro Val Pro Leu Ala Val Lys Tyr 1940 1945 1950 Phe Phe Asp Leu Leu Asp Glu Gln Ala Gln Gln His Gly Ile Ser 1955 1960 1965 Asp Gln Asp Thr Ile His Ile Trp Lys Thr Asn Ser Leu Pro Leu 1970 1975 1980 Arg Phe Trp Ile Asn Ile Ile Lys Asn Pro Gln Phe Val Phe Asp 1985 1990 1995 Val Gln Thr Ser Asp Asn Met Asp Ala Val Leu Leu Val Ile Ala 2000 2005 2010 Gln Thr Phe Met Asp Ala Cys Thr Leu Ala Asp His Lys Leu Gly 2015 2020 2025 Arg Asp Ser Pro Ile Asn Lys Leu Leu Tyr Ala Arg Asp Ile Pro 2030 2035 2040 Arg Tyr Lys Arg Met Val Glu Arg Tyr Tyr Ala Asp Ile Arg Gln 2045 2050 2055 Thr Val Pro Ala Ser Asp Gln Glu Met Asn Ser Val Leu Ala Glu 2060 2065 2070 Leu Ser Trp Asn Tyr Ser Gly Asp Leu Gly Ala Arg Val Ala Leu 2075 2080 2085 His Glu Leu Tyr Lys Tyr Ile Asn Lys Tyr Tyr Asp Gln Ile Ile 2090 2095 2100 Thr Ala Leu Glu Glu Asp Gly Thr Ala Gln Lys Met Gln Leu Gly 2105 2110 2115 Tyr Arg Leu Gln Gln Ile Ala Ala Ala Val Glu Asn Lys Val Thr 2120 2125 2130 Asp Leu 2135 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plxnb1 sense <400> 5 tgggtcatgt gcagtacgat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plxnb1 antisense <400> 6 cactgctctc caggttctcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plxnb2 sense <400> 7 aggggagcct ctctacaagc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plxnb2 antisense <400> 8 tcgatccctt catcctgaac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plxnb3 sense <400> 9 atatgctgag cgtgccttct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plxnb3 antisense <400> 10 tgctgttgag caaattggag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CD72 sense <400> 11 gccttctcct gtcctgtctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CD72 antisense <400> 12 cctcctggaa ctgctgagac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Alpl sense <400> 13 aacccagaca caagcattcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Alpl antisense <400> 14 gcctttgagg tttttggtca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bglap sense <400> 15 gcgctctgtc tctctgacct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bglap antisense <400> 16 accttattgc cctcctgctt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Col1a1 sense <400> 17 gagcggagag tactggatcg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Col1a1 antisense <400> 18 gttcgggctg atgtaccagt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Gapdh sense <400> 19 acccagaaga ctgtggatgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Gapdh antisense <400> 20 cacattgggg gtaggaacac 20

Claims

세마포린(semaphorin) 4D와 플렉신(plexin) B1과의 결합 저해물질을 유효성분으로 하는 골형성 촉진제로서,
상기 결합 저해물질이 항세마포린 4D 항체 또는 이의 기능적 단편, 항플렉신 B1 항체 또는 이의 기능적 단편, 또는 플렉신 B1의 세포밖 영역을 포함하는 단백질인 골형성 촉진제.
제1항에 있어서, 상기 항체가 인간 항체 또는 이의 기능적 단편인 골형성 촉진제.
제1항에 있어서, 상기 항체의 기능적 단편이 F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fab 단편, Fv 단편, 이황화-결합된 Fv 단편, 단일-사슬 Fv(scFv) 단편 또는 상기 단편 중 하나 이상의 중합체인 골형성 촉진제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 골형성 촉진제를 유효성분으로 하는 골질환의 예방 및 치료제로서, 상기 골질환은 골절, 골결손, 골다공증 및 골감소증으로부터 선택되는 것인 골질환의 예방 및 치료제.
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피검물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부를 결정하여, 상기 피검물질이 상기 결합 저해물질인 경우에, 상기 피검물질을 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질이라고 판정하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질의 판정방법.
제6항에 있어서, 피검물질이 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질인지 여부를 결정하는 방법이 이하의 공정(A)∼(D)를 포함하는 것을 특징으로 하는 판정방법:
(A) 피검물질의 존재하에서, 세마포린 4D와 플렉신 B1을 접촉시키는 공정;
(B) 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합의 정도를 측정하는 공정;
(C) 상기 공정 (B)로 측정한 정도를, 피검물질 비존재하의 그 정도와 비교하는 공정;
(D) 상기 공정 (B)로 측정한 정도가 피검물질 비존재하의 그 정도보다도 낮은 경우에 그 피검물질을 세마포린 4D와 플렉신 B1과의 결합 저해물질로 결정하는 공정.
제6항 또는 제7항에 기재된 판정방법을 사용하여 피검물질 중에서 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질을 탐색하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제의 유효성분의 후보물질의 스크리닝 방법.
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